KR102171363B1 - 전구세포 또는 줄기세포 동원 활성을 가지는 물질 p 유사체 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 전구세포 또는 줄기세포 동원 활성을 가지는 물질 P 유사체(Substance P Analog) 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 내재성 전구세포 또는 내재성 줄기세포를 질환 발생 부위로 동원할 수 있는 효과가 있는 물질 P 유사체 및 이를 포함하는 전구세포 또는 줄기세포 동원용 조성물, 손상된 장기 또는 조직의 재생 또는 치료용 약학적 조성물, 또는 상처 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 전구세포 또는 줄기세포 동원 활성을 가지는 물질 P 유사체(Substance P Analog) 및 이를 포함하는 조성물은 생체 외에서 물질 P에 비해 줄기세포 이동 활성이 우수한 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 생체 내로 물질 P 유사체를 투여하였을 때, 기존 물질 P에 비해 줄기세포 동원 효능이 더 우수한 것을 확인하였므로, 전구세포 또는 줄기세포 동원용 조성물, 손상된 장기 또는 조직의 재생 또는 치료용 약학적 조성물, 또는 상처 치료용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.

Description

전구세포 또는 줄기세포 동원 활성을 가지는 물질 P 유사체 및 이를 포함하는 조성물{Substance P Analog having Progenitor cell or Stem cell Recruiting Activity and Composition Comprising the Same}

본 발명은 전구세포 또는 줄기세포 동원 활성을 가지는 물질 P 유사체(Substance P Analog) 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 내재성 전구세포 또는 내재성 줄기세포를 질환 발생 부위로 동원할 수 있는 효과가 있는 물질 P 유사체 및 이를 포함하는 전구세포 또는 줄기세포 동원용 조성물, 손상된 장기 또는 조직의 재생 또는 치료용 약학적 조성물, 또는 상처 치료용 조성물에 관한 것이다.

중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cells; MSC)는 성체 줄기세포로서 자가 재생능과 골, 지방 및 연골과 같은 중간엽 계통의 조직들로 분화할 수 있는 다분화능을 가지고 있다. 게다가 이와 같은 중간엽 줄기세포는 손상된 조직 및 염증 부위로 이동할 수 있는 지향성(tropism)을 갖고 있어서 질환 치유에 도움을 주며, 여러 조건에서 면역억제 특성을 보인다. 그러나 줄기세포가 질환 부위로 이동하기 위한 케모카인(chemokine) 수용체 및 인자들은 상대적으로 소량 발현되는 문제가 있으며, 이를 해결하기 위해 줄기세포 유도 인자들이 필요하다.

기존 보고된 물질 P(Substance P; SP)는 신경전달 및 신경조절 역할을 하는 11개의 아미노산(Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂)의 신경 펩타이드로서, 물질 P에 대한 내인성 수용체는 NK1R(neurokinin 1 receptor)로, NK1R은 G-단백질 결합 수용체인 타키키닌(tachykinin) 수용체 서브패밀리이다. NK1R은 다양한 조직 및 기관의 많은 세포 유형(뉴런, 신경아교세포, 모세혈관, 임파선, 섬유아세포, 줄기세포 및 백혈구)에 분포하고 있고, 물질 P는 대부분의 세포신호 과정을 증폭시키거나 활성화시키며 잘 연구된 줄기세포 동원(recruiting) 인자 중 하나이다.

이에, 본 발명에서는 전구세포 및/또는 줄기세포 동원 활성을 가지는 펩타이드를 제조하기 위해, 물질 P(Substance P) 및 NK1R(neurokinin 1 receptor)의 인터페이스 구조를 활용하여 NK1R 결합 펩타이드 리간드인 물질 P 유사체를 선별하였으며, 상기 선별된 물질 P 유사체가 기존 물질 P에 비해 줄기세포 동원활성이 우수한 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 전구세포 또는 줄기세포 동원 활성을 가지는 물질 P 유사체(Substance P Analog)를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 물질 P 유사체(Substance P Analog)를 유효성분으로 포함하는 전구세포 또는 줄기세포 동원용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 물질 P 유사체(Substance P Analog)를 유효성분으로 포함하는 손상된 장기 또는 조직의 재생 또는 치료용 약학적 조성물, 상처 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위해,

본 발명은 전구세포 또는 줄기세포 동원 활성을 가지며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 물질 P 유사체(Substance P analog)일 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 전구세포 또는 줄기세포는 내재성 전구세포 또는 내재성 줄기세포일 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 일실시예 있어서, 상기 내재성 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 각막줄기세포, 심근줄기세포 및 신경줄기세포로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cells)일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 1의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 전구세포 또는 줄기세포 동원용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 1의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 손상된 장기 또는 조직의 재생 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 1의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 피부계 질환, 뇌신경계 질환, 심혈관계 질환, 소화기계 질환, 호흡기계 질환, 비뇨기계 질환, 운동기관계 질환, 혈관계 질환, 내분비계 질환 및 안과계 질환으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 1의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 상처 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 전구세포 또는 줄기세포 동원 활성을 가지는 물질 P 유사체(Substance P Analog) 및 이를 포함하는 조성물은 생체 외에서 물질 P에 비해 줄기세포 이동 활성이 우수한 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 생체 내로 물질 P 유사체를 투여하였을 때, 기존 물질 P에 비해 줄기세포 동원 효능이 더 우수한 것을 확인하였므로, 전구세포 또는 줄기세포 동원용 조성물, 손상된 장기 또는 조직의 재생 또는 치료용 약학적 조성물, 또는 상처 치료용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 물질 P(SP)-NKR1의 인터페이스(a) 및 본 발명의 물질 P 유사체(SP1)-NKR1의 인터페이스(b)를 분석한 모식도이다.
도 2는 물질 P 및 본 발명의 물질 P 유사체의 줄기세포 이동능을 평가한 데이터이다.
도 3은 마우스 꼬리 정맥에 인도시아닌그린으로 표지한 인간유래 중간엽 줄기세포를 주입한 사진이다.
도 4는 물질 P를 함유한 히알루론산 하이드로젤 제형을 마우스 한쪽 옆구리에 주입하였을 때, 시간에 따른 줄기세포 이동 정도를 관찰한 사진이다.
도 5는 본 발명의 물질 P 유사체를 함유한 히알루론산 하이드로젤 제형을 마우스 한쪽 옆구리에 주입하였을 때, 시간에 따른 줄기세포 이동 정도를 관찰한 사진이다.
도 6은 물질 P 및 본 발명의 물질 P 유사체를 함유한 히알루론산 하이드로젤 제형을 마우스 한쪽 옆구리에 주입하였을 때, 줄기세포의 이동 정도를 수치로 나타낸 데이터이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 전구세포 또는 줄기세포 동원 활성을 가지며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 물질 P 유사체(Substance P Analog)인 것을 특징으로 할 수 있다.

물질 P(Substance P, 이하 "SP"로 혼용 표기함)는 RPKPQQFFGLM의 11개의 아미노산 서열로 이루어진 포유류의 타키키닌의 하나로서, 조직내 상처가 발생했을 때 과량 분비되고, 이는 상처 회복을 위해 다분화능이 있는 줄기세포의 동원(또는 '포집', '이동 촉진')을 유도할 수 있는 능력을 지닌 물질이다. 본 발명에서는 보다 우수한 줄기세포 동원 활성을 가지는 펩타이드를 제조하기 위해, 물질 P(Substance P) 및 NK1R(neurokinin 1 receptor)의 인터페이스 구조를 활용하여 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 물질 P 유사체를 선별하였다.

본 발명에 있어서, 상기 전구세포 또는 줄기세포는 내재성 세포로, 중간엽 줄기세포, 각막줄기세포, 심근줄기세포, 신경줄기세포 및 혈관 내피 전구세포로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cells)인 것을 특징으로 할 수 있다.

내재성 전구세포 또는 내재성 줄기세포는 특정의 장기 및/또는 조직에 원래 존재하여, 해당 장기 및/또는 조직이 손상을 입었을 경우에 그 조직 및/또는 장기의 재생에 공헌하는, 자기 복제능 및 다분화능을 가진 세포를 말한다. 구체적인 예로서는, 중간엽 줄기세포, 각막줄기세포, 심근줄기세포, 신경줄기세포 및 혈관 내피 전구세포 등을 들 수 있다.

전구세포 또는 줄기세포 동원 활성은 전구세포 또는 줄기세포의 이동을 촉진하는 것으로, 이동은 전구세포 또는 줄기세포가 골수, 장기 및/또는 조직으로부터 순환하는 혈액으로 유통되고; 순환하는 혈액으로부터 손상된 장기 및/또는 조직에 축적되며; 또는 장기 및/또는 조직의 내부로 움직이는 것을 말한다.

또한, 본 발명의 전구세포 또는 줄기세포 동원 활성을 가지는 폴리펩타이드는 동원 활성(이동 촉진)뿐만 아니라, 전구세포 또는 줄기세포의 증식 또는 분화를 촉진 시킬 수 있다.

본 발명의 구체적인 일실시예에서, 물질 P에 대한 내인성 수용체이며, 줄기세포에 분포하고 있는 것으로 알려진 NK1R(neurokinin 1 receptor)과 물질 P(Substance P)의 인터페이스 구조 및 컴퓨터 시뮬레이션 시스템을 활용하여, 수용체를 최적으로 활성화시킬 수 있는 NK1R 결합 펩타이드 리간드인, 물질 P 유사체(이하 "SP1"으로 혼용 표기함)를 선별하였다. 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 선별한 물질 P 유사체인 SP1은 RISPQQRDALA의 11개의 아미노산 서열(서열번호 1)로 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명의 구체적인 다른 일실시예에서, SP와 본 발명의 SP1의 줄기세포 동원 활성을 비교하기 위해, 생체 외 환경에서 줄기세포 이동능(stem cell migration)을 평가하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, SP에 비해 SP1의 줄기세포 이동이 증가된 것을 확인하였다.

최근 줄기세포 치료제가 다양한 질환의 치료제로 각광받고 있으나, 환자의 체외로부터 줄기세포를 도입하는 방법은 이식된 세포의 과잉 재생 및/또는 과잉 복구에 기인하는 합병증 발생의 위험성이 있다. 반면, "자발적 재생(self-regeneration)"을 이용하는 방법은 환자 자신의 체내에 원래 존재하고 있는 줄기세포를 활성화시킴으로써, 손상된 장기 및/또는 조직을 재생시킬 수 있다.

본 발명의 줄기세포 동원 활성을 가지는 폴리펩타이드는 재생이 필요한 조직 또는 상처 부위로 줄기세포를 이동시킬 수 있는 효과가 있으므로, 전구세포 또는 줄기세포 동원용 조성물, 장기 및/또는 조직의 재생 또는 치료용 조성물, 상처 치료용 조성물로 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 서열번호 1의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 줄기세포 동원용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 서열번호 1의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 손상된 장기 또는 조직의 재생 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 서열번호 1의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 상처 치료용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 서열번호 1의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 피부계 질환, 뇌신경계 질환, 심혈관계 질환, 소화기계 질환, 호흡기계 질환, 비뇨기계 질환, 운동기관계 질환, 혈관계 질환, 내분비계 질환 및 안과계 질환으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 1의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드인 SP1(물질 P 유사체) 이외에 줄기세포 동원활성을 가지는 물질 P 또는 이의 유사체, NK1R 결합 펩타이드 리간드 또는 줄기세포 동원능을 가지는 것으로 알려진 물질 등과 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 줄기세포와 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 줄기세포 동원 인자인 서열번호 1의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드(SP1)를 물리적 또는 화학적으로 포함하는 천연 생체 물질의 하이드로겔로 제조되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 당업계에 공지된 펩타이드 투여방법을 제한 없이 사용할 수 있다.

구체적으로, SP1을 물리적으로 포함하는 천연 생체물질의 하이드로겔은

i) 제 1 화학 작용기를 가지는 화합물이 결합된 천연 생체물질과, 줄기세포 동원 인자를 혼합한 제 1 반응액을 준비하는 단계;

ii) 제 2 화학 작용기를 가지는 화합물이 결합된 천연 생체 물질과, 줄기세포 동원 인자를 혼합한 제 2 반응액을 준비하는 단계; 및

iii) 상기 단계 i)에서 준비한 제 1반응액 및 상기 단계 ii)에서 준비한 제 2 반응액을 혼합하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.

또한, SP1을 화학적으로 포함하는 천연 생체물질의 하이드로겔은

i) 줄기세포 동원 인자 및 제 1 화학 작용기를 가지는 화합물이 결합된 천연 생체 물질을 포함하는 제 1 반응액을 준비하는 단계;

ii) 줄기세포 동원 인자 및 제 2 화학 작용기를 가지는 화합물이 결합된 천연 생체 물질을 포함하는 제 2 반응액을 준비하는 단계; 및

iii) 상기 단계 i)에서 준비한 제 1반응액 및 상기 단계 ii)에서 준비한 제 2 반응액을 혼합하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.

상기 i) 단계의 '제 1 화학 작용기'는 테트라진, 알카인기, 에폭시기 및 아크로일기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 구체적으로 테트라진인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 ii) 단계의 '제 2 화학 작용기'는 사이클로옥텐, 아자이드기, 티올기 및 아민기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 구체적으로 사이클로옥텐인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

보다 구체적으로, 상기 제 1 화학 작용기 및 제 2 화학 작용기는 다음의 조합으로 구성되어 하이드로겔 제조에 적용되는 것이 가장 바람직하다: (테트라진, 사이클로옥텐), (알카인기, 아자이드기), (알카인기, 티올기), (에폭시기, 아민기), (에폭시기, 티올기), (아크로일기, 아민기) 또는 (아크로일기, 티올기).

또한, 상기 i) 단계 또는 ii) 단계의 '천연 생체물질'은 카르복실기(carboxyl group)을 포함하는 것이 바람직하다. 카르복실기를 포함하는 천연 생체물질은 아마이드 결합을 통해 화학 작용기를 포함하는 화합물과 결합될 수 있다. 구체적으로, 상기 천연 생체물질은 히알루론산, 카복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose, CMC) 및 알지네이트(alginate, AGNT)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

보다 구체적으로, 상기 천연 생체물질이 히알루론산인 경우, 이의 분자량은 500,000 Da 내지 6,000,000 Da 범위에 해당하는 것이 바람직하다. 이 때, 히알루론산의 분자량이 500,000 Da 미만인 경우, 물성이 너무 낮아져 유의적으로 하이드로겔을 이룰 수 없으며, 6,000,000 Da 초과인 경우, 점도가 상승하여 주사 제형으로서의 적용에 한계를 가져올 수 있으므로, 바람직하지 않다.

상기 i) 단계 또는 ii) 단계의 '결합'은 천연 생체 물질을 포함하는 용액에 축합제를 추가로 첨가함으로서, 축합 반응, 바람직하게는 아마이드 반응이 유도되는 것으로 수행되는 것이 바람직하다. 상기 축합제는 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride; DMTMM)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 당업자에 의해 천연 생체물질에 대하여 축합 반응을 유도할 수 있는 것으로 이해될 수 있는 축합제라면 제한없이 적용될 수 있다. 상기 축합제의 양은, 축합 반응의 정도를 제어하기 위해 당업자가 임의적으로 조절할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일실시예에 있어서, 생체 내에서 SP1의 줄기세포 동원 활성을 확인하기 위해, SP 또는 SP1을 물리적으로 포함하는 천연 생체물질을 제조하였다. 구체적으로 실시예 3에 나타난 바와 같이, SP 또는 SP1을 함유한 히알루론산 하이드로젤(Cx-HA) 제형을 제조하였으며, 이를 누드 마우스 한쪽 옆구리에 각각 주입하였다. 인간 유래 중간엽 줄기세포는 인도시아닌 그린으로 표지하여 도 3에 나타난 바와 같이, 마우스 꼬리 정맥을 통해 주입하였다. 모든 실험군에서 대조군(Cx-HA)에서는 형광이 관찰 되지 않았으며, SP 또는 SP1을 주입한 쪽에서만 형광이 관찰되었다. 도 4(SP) 및 도 5(SP1)를 비교한 결과, SP1이 더 우수한 줄기세포 동원 활성을 나타내는 것을 확인하였으며, 이는 생체 외에서 줄기세포 이동능을 확인한 결과와 유사하다.

또한, 도 6에 나타난 바와 같이, SP 또는 SP1이 주입된 곳으로 이동한 줄기세포의 양을 수치화한 결과, 기존 SP에 비해 SP1의 줄기세포 동원 활성이 더 우수한 것을 확인할 수 있었을 뿐만 아니라, 줄기세포 동원 활성 유지 시간도 더 긴 것을 확인하였다.

즉, 생체 내로 본 발명의 서열번호 1의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드(SP1)를 투여하였을 때, 기존 물질 P에 비해 줄기세포 동원 효능이 더 우수한 것을 확인하였으므로, 줄기세포 동원용 조성물, 장기 및/또는 조직의 재생 또는 치료용 약학적 조성물, 상처 치료용 약학적 조성물로 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 줄기세포 동원 인자를 포함하는 하이드로겔을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 60 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000 ㎎/일이며, 바람직하게는 0.01 ~ 500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 장기 및/또는 조직 재생 또는 치료가 필요한 질환에 적용할 수 있다. 구체적으로, 피부계 질환, 뇌신경계 질환, 심혈관계 질환, 소화기계 질환, 호흡기계 질환, 비뇨기계 질환, 운동기관계 질환, 혈관계 질환, 내분비계 질환 및 안과계 질환 등이 있다.

상기 피부계 질환은 상처, 화상, 방사선 장해, 동상, 자외선 장해, 전기충격, 외상, 피부궤양, 욕창, 접촉성 피부염, 수포성 피부염, 아토피성 피부염, 피부건조증, 당뇨병성 피부궤양, 자가민감 피부염, 홍피증, 탈락 피부염, 수포성 표피박리증, 광선피부염, 만성 색소성 자색반증(샴버그 질병(Schamberg's disease)), 구강 점막 손상, 구내염, 구위피부염, 피부의 노화 증상, 탈모증, 조갑주위염, 조갑감입증, 소화관 점막진무름, 소화성 궤장, 각막 진무름, 각막 궤장, 우식, 치수염, 연변성 치주염, 화분증, 봄철결막염, 치질, 소화관 점막 장해, 소화관 점막 화상, 설염, 재발성 아프타, 구강내 아프타, 구취, 구강 이상 감각증, 이빨성감염증, 구강 점막 교상, 혀의 교상, 구강 점막 화상 및 구강 점막 궤양 등으로 구성된 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있다.

상기 뇌신경계 질환은 뇌졸중, 알츠하이머병, 파킨슨병, 각종 중추 신경계 질환(예를 들면, 척수염), 각종 말초 신경 질환(예를 들면, 다발 말초 신경병), 척수병증 및 각종 뇌염 등으로 구성된 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있다.

상기 심혈관계 질환은 심근경색증, 협심증, 불안정 협심증, 각종 심근염(예를 들면, 바이러스성 심근염), 급성 심부전증, 만성 심부전증, 죽상동맥경화증, 고혈압증, 류마티스성 심장병, 부정맥, 심장 판막증, 감염성 심내막염, 심장막염, 경피적심장동맥 중재술 (percutaneous coronary artery intervention), 및 PTCA 수술 후의 재협착 및 재폐쇄 등으로 구성된 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있다.

상기 소화기계 질환은 식도염, 급성 위염, 만성 위염, 위궤양, 십이지장 궤양, 각종 대장염(예를 들면, 궤양성 대장염), 창자결핵, 바이러스성 간염, 알코올성 간염, 약물성 간염, 지방간, 경화증, 췌장염 및 각종 소화기암(예를 들면, 간암, 대장암, 위암)의 수술에 의한 장기 장해 등으로 구성된 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있다.

상기 호흡기계 질환은 각종 기관지염(예를 들면, 세균성 기관지염), 감염성 폐렴, 흡입성 폐렴, 폐색전증, 기흉 및 폐기능부전 등으로 구성된 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있다.

상기 비뇨기계 질환은 방광염, 각종 신장염(예를 들면, 만성 신장염 증후군, 원발성 사구체 질환 (primary glomerular disease)), 부신염, 요도염, 세균성 및 비세균성의 전립선염, 고혈압성 신장병, 당뇨병성 신장병 및 신장 기능 부전등으로 구성된 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있다.

상기 운동기관계 질환은 각종 관절염(예를 들면, 류마티스 관절염), 근육 위축증, 신경외과에서의 개두 수술 후의 뼈 결손, 정형외과에서의 종양절제수술 후의 뼈 결손, 골절 후의 뼈 결손, 치의학 분야에서의 치주증에 의한 뼈 결손, 연골염, 각종관절의 연골 결손 및 각종 손상(예를 들면, 외상, 염좌)에 의한 인대 손상 등으로 구성된 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있다.

상기 혈관계 질환은 각종 동맥 질환(예를 들면, 폐색성 동맥경화증(ASO), 폐쇄혈전혈관염(TAO)), 각종 정맥 질환(예를 들면, 혈전성 정맥염), 혈전증, 혈류장해, 깊은정맥혈전증 (deep vein thrombosis : DVT), 말초 순환 장해에 수반하는 각종 질환(예를 들면, 돌발성 난청 및 진동병(vibration disease)) 및 심장동맥성형술 후의 재협착 및 재폐색 등으로 구성된 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있다.

상기 내분비계 질환은 당뇨병 및 각종 합병증(예를 들면, 당뇨성 말초 신경증, 당뇨성 족부 (diabetic foot), 당뇨병성 궤양), 고지혈증, 갑상선염 및 비만증 등으로 구성된 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있다.

상기 안과계 질환은 각종 각막염(예를 들면, 알칼리성 또는 산성 화합물에 의한 각막염, 외상성 각막염) 또는 당뇨병성 망막염일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

줄기세포 동원 활성이 우수한 물질 P 유사체 선별

본 발명에서는 물질 P에 대한 내인성 수용체이며, 줄기세포에 분포하고 있는 것으로 알려진 NK1R(neurokinin 1 receptor)과 물질 P(Substance P)의 인터페이스 구조 및 컴퓨터 시뮬레이션 시스템을 활용하여, 수용체를 최적으로 활성화시킬 수 있는 NK1R 결합 펩타이드 리간드인, 물질 P 유사체(SP1)를 선별하였다.

구체적으로, 물질 P와 이것의 수용체인 NK1R (PDB ID; 2KSA, 20937248)의 구조적 분석을 위해 MOE (Molecular Operating Environment.) 프로그램의 모티브 검색 패키지(motif search package)를 사용하였다. 모티브 검색 패키지는 문의 구조(이 경우, SP)의 정보를 이용하여 비다중(non-redundant) 항목을 포함하는 단백질 데이터베이스를 검색함으로써 이와 유사한 2차 구조를 수집하였다.

30,000종 이하의 비다중 체인이 포함된 80,000종 이하의 구조 데이터베이스를 SP 관련 모티브 선별에 활용하였다. 가장 높은 점수를 보인 12종을 선별하여 NKR1에 대한 친화성 분석을 위해 단백질 대 단백질 도킹 절차를 실행하였다. 각 도킹에 대한 시도에서 NKR1은 수용체로 SP 군은 리간드로 사용하였고, MOE 프로그램을 이용하여 각 SP 당 약 500종의 도킹 형태를 얻었으며, MOE 프로그램내 PLIF(Protein Ligand Interaction Fingerprint - 단백질-리간드 상호작용 지문)을 기반으로 일관된 도킹 형태를 선별하였다.

표 1에 나타난 바와 같이, 최종적으로 RISPQQRDALA의 11개의 아미노산 서열(서열번호 1)로 구성된 SP 유사체를 선별하였으며, 이를 "SP1"으로 명명하였다.

SP1 및 SP 서열정보

줄기세포 동원 인자	아미노산 서열	서열번호
SP1	RISPQQRDALA	1
Substance P (SP)	RPKPQQFFGLM	2

또한, 도 1에 나타난 바와 같이, SP1은 SP가 NKR1와 상호작용하는 것과 매우 유사한 형태로 상호작용하는 것을 확인하였으며, 이는 본 발명의 SP1이 NKR1 및 그 하위 신호를 활성화시킬 가능성이 높음을 의미한다.

SP와 SP1의 줄기세포 이동능(stem cell migration) 평가

본 발명에서는 SP와 본 발명의 SP1의 줄기세포 동원 활성을 비교하기 위해, 생체 외 환경에서 줄기세포 이동능(stem cell migration)을 평가하였다.

먼저, 인간 유래 중간엽 줄기세포(hMSC)를 PKH 26 염료 (Sigma, 미국)로 표지한 후, 5 Х 10⁴ 마리씩 24 웰 트랜스 웰 플레이트(24 well transe well plate; SPL, 한국)의 상부 챔버(Upper chamber; 8.0 μm pore size)에 넣었다. 혈청이 없는 DMEM(Gibco, 미국) 배지를 이용해 48 시간 동안 상부 챔버에서 hMSC를 배양한 후, 하기 표 2의 조건으로 제조한 배지를 바닥 웰(bottom well)에 첨가한 다음, 3일 마다 배지를 교체하면서 형광 현미경을 통해 바닥 웰의 hMSC를 관찰하였다.

줄기세포 동원 인자 포함 배지 조성

실험 군	배지 조성
대조군	DMEM + 1% FBS
SP	DMEM + 1% FBS+ 1 ug/mL SP
SP1	DMEM + 1% FBS+ 1 ug/mL SP1

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 대조군보다 SP 또는 SP1이 포함된 실험군에서 줄기세포가 이동한 것을 확인할 수 있었으며, 특히 SP에 비해 SP1를 처리한 군에서 이동된 줄기세포의 수가 많은 것을 확인하였다.

SP 또는 SP1을 함유한 제형 제조

3-1 : 가교제를 도입한 히알루론산 제조

히알루론산 용액은 15 ㎖의 멸균 증류수(distilled water; DW)에 150 ㎎ 히알루론산(HA)(분자량: 1, 000, 000 Da)을 첨가한 다음, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여 제조하였다. 상기 용액을 두 바이알에 6 ㎖ 씩 나눠 담았다 (각각 60 ㎎의 HA가 녹아있다).

바이알 1(HA-Tet) : 히알루론산 용액에, 축합제인 4-(4, 6-디메톡시-1, 3, 5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(4-(4, 6-Dimethoxy-1, 3, 5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride; DMTMM) 41.5 ㎎ 및 테트라진(Tetrazine) 11.9 ㎎(95.2 ㎕)을 투입한 다음, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여 반응시켰다. 그런 다음, 72 시간 동안 투석하여 용액을 농축시킨 후, -80℃에서 동결건조시켜, 히알루론산에 TET가 도입된, HA-TET를 제조하였다.

바이알 2(HA-TCO) : 히알루론산 용액에, 축합제인 4-(4, 6-디메톡시-1, 3, 5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(4-(4, 6-Dimethoxy-1, 3, 5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride; DMTMM) 41.5 ㎎ 및 트랜스-사이클로옥텐(trans-cyclooctene; TCO) 7.88 ㎎(63.04 ㎕) 을 투입한 다음, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여 반응시켰다. 그런 다음, 72 시간 동안 투석하여 용액을 농축시킨 후, -80℃에서 동결건조시켜, 히알루론산에 TCO가 도입된, HA-TCO를 제조하였다.

3-2 : 줄기세포 동원 인자를 함유한 히알루론산 하이드로젤 (Cx-HA) 제형 제조 및 생체 내 주입

상기 실시예 3-1에서 제조한 HA-Tet와 HA-TCO를 각각 20 ㎎/㎖이 되도록 각각 2% 생리식염수에 녹여 수용액으로 제조한 다음, 각각의 용액에 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 SP 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 SP1을 1 ㎍/㎖를 첨가하였다. 1 시간 동안 교반한 후, 각각 교반된 혼합액을, 듀얼실린지를 통해 혼합하여 줄기세포 동원 인자를 포함하는 히알루론산 하이드로겔 용액을 수득하였다. 각 조성은 하기 표 3에 나타내었다.

줄기세포 동원 인자를 함유한 제형 조성

실험 군	조성
Cx-HA	HA-Tet, HA-TCO
Cx-HA+SP	HA-Tet + 1 ㎍/㎖ SP, HA-TCO + 1 ㎍/㎖ SP
Cx-HA+SP1	HA-Tet + 1 ㎍/㎖ SP1, HA-TCO + 1 ㎍/㎖ SP1

상기 표 3과 같은 조성으로 누드 마우스의 옆구리에 한 쪽은 Cx-HA를 주입하고 다른 한쪽에는 줄기세포 동원 인자를 함유한 Cx-HA를 주입하였다.

인도시아닌그린(Indocyanine Green)으로 표지한 인간유래 중간엽 줄기세포 주입

본 발명에서는 SP1의 줄기세포 동원 정도를 시각적으로 확인하기 위해, 인간유래 중간엽 줄기세포(hMCS)를 인도시아닌그린으로 표지하여 마우스 꼬리 정맥에 주입하였다.

먼저, 인도시아닌그린(Indocyanine Green; ICG) 2 ㎎을 DMSO 200 ㎕에 녹인 후 800 ㎕ 배양 배지(DMEM(low-glucose) + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin)와 혼합하여 ICG 용액을 제조하였다. 10 ㎕ 프로타민(protamine) 용액 10 ㎎/㎖, ICG 용액 600 ㎕ 및 MEM-α600 ㎕을 혼합한 다음, 5분 동안 가볍게 흔들어 주었다. 그 후 hMSC를 배양하고 있는 플라스크에서 배지를 제거하고 무혈청 DMEDM(low-glucose) 배지 10 ㎖로 교체한 다음, 프로타민/ICG 용액을 첨가하여 1 시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

그 후 배지를 제거하고 10 ㎖ PBS로 세척한 다음, 트립신 처리하여 hMSC를 수득하였다. 상기 hMSC가 1 Х 10⁶ 세포/100 ㎕가 되도록 제조한 다음, 30 게이지 주사를 이용하여 상기 실시예 3에서 Cx-HA들을 주입한 누드마우스의 꼬리 정맥에 주입하였다 (도 3). 정해진 시간에 FOBI (NeoScience, Suwon, Korea)로 730 nm 광원을 사용하여 노출(exposure); 2000 ms, 게인(gain); 5 조건에서 NIR 형광사진을 촬영하였다.

SP1에 의한 인간유래 중간엽 줄기세포의 생체 내 이동 관찰

본 발명에서는 생체 내에서 SP1에 의한 인간유래 중간엽 줄기세포 이동 촉진 정도를 확인하기 위해, 상기 실시예 4에서 hMSC가 주입된 누드마우스들을 FOBI (NeoScience, Suwon, Korea)로 730 nm 광원을 사용하여 노출(exposure); 2000 ms, 게인(gain); 5 조건에서 NIR 형광사진을 촬영하였다.

모든 실험군에서 대조군(Cx-HA)에서는 형광이 관찰 되지 않았으며, SP 또는 SP1을 주입한 쪽에서만 형광이 관찰되었다. 도 4(SP) 및 도 5(SP1)를 비교한 결과, SP1이 더 우수한 줄기세포 동원 활성을 나타내는 것을 확인하였으며, 이는 생체 외에서 줄기세포 이동능을 확인한 결과와 유사하다.

또한, 도 6에 나타난 바와 같이, SP 또는 SP1이 주입된 곳으로 이동한 줄기세포의 양을 수치화한 결과, 기존 SP에 비해 SP1의 줄기세포 동원 활성이 더 우수한 것을 확인할 수 있었을 뿐만 아니라, 줄기세포 동원 활성 유지 시간도 더 긴 것을 확인하였다

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Substance P Analog having Progenitor cell or Stem cell Recruiting Activity and Composition Comprising the Same <130> 1065298 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SP1 <400> 1 Arg Ile Ser Pro Gln Gln Arg Asp Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SP <400> 2 Arg Pro Lys Pro Gln Gln Phe Phe Gly Leu Met 1 5 10

Claims (8)

1. 전구세포 또는 줄기세포 동원 활성을 가지며, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 물질 P 유사체(Substance P analog)인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 전구세포 또는 줄기세포는 내재성 전구세포 또는 내재성 줄기세포인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 내재성 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 각막줄기세포, 심근줄기세포 및 신경줄기세포로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 전구세포 또는 줄기세포 동원용 조성물.
   
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 조직의 재생 또는 치료용 약학적 조성물.
   
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 각막염, 중추 신경 질환, 말초 신경 질환 및 심혈관계 질환으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 질환 치료용 약학적 조성물.
   
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 상처 치료용 약학적 조성물.

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