KR101382484B1 - 줄기세포 동원 활성을 가지는 폴리펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 친수성 아미노산과 소수성 아미노산이 순차적으로 결합된 자가조립 펩타이드와 물질 P(Substance P)가 결합된 줄기세포 동원(recruiting) 활성을 가지는 폴리펩타이드에 관한 것으로, 소재 자체에 면역반응이 없고, 생체 복원 후 무해하게 분해되는 소재로서 물질 P로 인하여 줄기세포 동원 활성을 나타냄으로써, 비침습적인 방법으로 원하는 생체 조직이나 부위에 줄기세포가 생체이동하여 줄기세포에 의한 치료효과를 달성할 수 있도록 한다. 본 발명의 줄기세포 동원(recruiting) 활성을 가지는 폴리펩타이드는 특히 신생혈관 형성 및 조직 재생에 효과적으로 작용하므로 혈관 폐색으로 나타나는 질환, 특히 하지허혈증, 심근경색, 근경색, 뇌혈관질화, 말초혈관성 질환등의 허혈성 질환 치료제로 활용될 수 있다.

Description

줄기세포 동원 활성을 가지는 폴리펩타이드{Polypeptide with recruiting activity of stem cell}
본 발명은 줄기세포 동원(recruiting) 활성을 가지는 생체 적합성 펩타이드 소재에 관한 것이다.
줄기세포는 더욱 분화된 세포로 분화될 수 있는 체조직으로부터 유래한 전분화능 세포이다. 예를 들면, 조혈모세포(hematopoietic stem cells)는 적혈구, 혈소판 및 백혈구를 포함하는 많은 상이한 유형의 혈구 세포로 분화될 수 있다.
줄기세포가 근세포(myocytes), 간세포(hepatocytes), 골세포(osteocytes), 신경교세포(glial cells) 및 뉴런과 같은 다양한 조직-특이 세포 유형으로 분화되는 것이 발견되었다. 예를 들면, 줄기세포는 혈액뇌장벽(blood-brain barrier)을 통과하고(Willams and Hickey, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 202:221-245, 1995) 뉴런으로 분화되는 것(Mezey, Science 290:1779-82, 2000)으로 나타났다. 그러므로, 줄기세포가 파킨슨씨병(Polli, Haematologica 85:1009-10, 2000), 알츠하이머(Mattson, Exp. Gerontol. 35:489-502, 2000) 및 외상성 뇌손상(Magavi, Nature 405: 892-3, 895, 2000)의 치료에 사용될 수 있는 것이 가능하다.
줄기세포는 또한 섬유아세포 또는 섬유아세포-유사세포로 분화하고, 콜라겐을 발현하는 것으로 나타났다(Periera et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95:1142-7, 1998). 그러므로 줄기세포가 골형성부전증(osteogenesis imperfecta) 및 뼈골절(bone fractures) 치료에 사용될 수 있는 것이 가능하다.
Peterson외(Science 284:1168-70, 1999)는 또한 간세포가 줄기세포로부터도 발생할 수 있는 것을 보여주었다. 그러므로 줄기세포는 간의 다양한 병상(경화(cirrhosis)를 포함하나 이에 제한되지 않는다)의 치료에 사용될 것이다.
또한 줄기세포 유래의 골수는 심근경색증(myocardial infarction) 부위의 이식 및 심근(myocardium) 형성을 위해 실제로 사용되고 있다(Orlic, Nature 410:701-5, 2000). 그러므로 줄기세포는 심근경색증의 치료에 사용될 것이다.
줄기세포가 넓은 다양한 세포유형으로 분화될 수 있기 때문에, 이들은 다양한 조직 및 기관의 재생 과정 및 치료에서 중요한 역할을 수행한다(Koc et al., Bone marrow Transplant, 27(3):235-39, 2001 참조).
많은 연구결과들은 표적 조직에서 골수 줄기세포의 동원, 이식 및 분화가 인체에서의 자연적 치료 현상을 구성한다는 것을 제안하였다(Spencer et al., Thorax 60(1):60-2, 2005; Ishikawa et al., FASEB J. 18(15):1958-60, 2004; Mattsson et al., Transplantation 15;78(1):154-7, 2004; Thiele Jet al., Transplantation 77(12):1902-5, 2004; Cogle et al., The Lancet 363(9419):1432-7, 2004; Deb et al., Circulation 107(9):1247-9, 2003; Korbling et al., N Engl J Med 346(10):738-46, 2002; Adams et al., Blood 102(10):3845-7, 2002; Krause et al., Cell 105(3):369-77, 2001).
Granulocytes-colony stimulating factor를 통하여 동원된 말초혈액줄기세포가 심근경색증에 적용되어 줄기세포가 허혈 조직으로 직접 회기하여 혈관 신생과 심근재생을 유발하고, 결과적으로 심기능 호전과 개체의 생존까지 호전시킨다는 보고가 있으므로(Orlic D, Kajstura J, Chimenti S et al. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 10344-9), 비침습적인 줄기세포의 동원은 자연적 생리적 과정을 강화할 수 있고 다양한 병상에 대해 가능성 있는 치료법을 제공할 수 있다. 그러므로 줄기세포 동원 활성을 증가시키는 물질이 필요하다.
본 발명은 소재 자체에 면역반응이 없고, 생체 복원 후 무해하게 분해되면서, 줄기세포 동원 활성을 나타냄으로써, 비침습적인 방법으로 원하는 생체 조직이나 부위에 줄기세포가 생체이동하여 줄기세포에 의한 치료효과를 달성할 수 있도록 하는 폴리펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다. 이러한 줄기세포 동원 활성을 지닌 펩타이드는 신생혈관 유도 및 조직 재생에 효과적으로 작용하여 허혈성 질환 치료제로 활용될 수 있다.
본 발명은 다음 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 자가조립 펩타이드 및 물질 P(Substance P)가 결합된 줄기세포 동원(recruiting) 활성을 가지는 폴리펩타이드를 제공한다:
[일반식 1]
(βα)n
상기 α는 알라닌(A), 로이신(L) 및 페닐알라닌(F) 중에서 선택되는 어느 하나의 소수성 아미노산이고, 상기 β는 아르기닌(R), 아스파르트산(D), 라이신(K), 글루타민산(E) 및 히스티딘(H) 중에서 선택되는 어느 하나의 친수성 아미노산이며, 상기 n은 4 내지 16 중의 어느 하나의 정수이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 일반식 1의 자가조립 펩타이드는 RADARADARADARADA, RARADADARARADADA, RARARARADADADADA, DADADADARARARARA, RADARADA, RARADADA, KLDLKLDLKLDL, AEAKAEAKAEAKAEAK, AEAKAEAK, RAEARAEARAEARAEA, RAEARAEA, KADAKADAKADAKADA, KADAKADA, EAEAHAHAEAEAHAHA, EAEAHAHA, EFEFKFKFEFEFKFKF, EFEFKFKF, EAEAEAEAKAKA, EAEAKAKA, KAKAKAKAEAEAEAEA 및 EAEAEAEAKAKAKAKA 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 물질 P(Substance P)는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 줄기세포 동원(recruiting) 활성을 가지는 폴리펩타이드는 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
또한 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 생분해성 지지체를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 생분해성 지지체는 폴리글리콜산, 폴리락트산 및 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA) 중에서 선택되는 합성재료를 사용하여 만든 지지체 또는 아가로오스, 셀룰로오스, 키토산, 히알우론산 및 피브린 중에서 선택되는 천연재료를 사용하여 만든 지지체일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 허혈성 질환은 하지허혈증일 수 있다.
본 발명은 친수성 아미노산과 소수성 아미노산이 순차적으로 결합된 자가조립 펩타이드 및 물질 P(Substance P)는 이들 단독으로 또는 이를 병용사용하더라도 줄기세포 동원 활성이 미약하다는 한계를 극복하기 위하여, 생체 적합성이 뛰어난 지지체 형성을 위한 생체 재료인 상기 자가조립 펩타이드에 물질 P가 결합된 폴리펩타이드를 제공하는 것으로, 본 발명의 폴리펩타이드는 소재 자체에 면역반응이 없고, 생체 복원 후 무해하게 분해되는 소재로서 물질 P로 인하여 비침습적인 방법으로 원하는 생체 조직이나 부위에 줄기세포가 생체이동하여 줄기세포에 의한 치료효과를 달성할 수 있도록 한다. 이러한 줄기세포 동원 활성을 지닌 펩타이드는 특히 혈관의 폐색으로 조직이 괴사된 병변에서 신생혈관 유도 및 조직 재생에 효과적으로 작용하여 허혈성 질환 치료제로 활용될 수 있다.
도 1의 a는 피브린 단독 투여군, 피브린 및 물질 P 복합 투여군, 피브린 및 RADA16-II 복합 투여군, 그리고 피브린과 RADA16-II-SP 복합 투여군을 SD 랫트의 피하에 이식하여 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 CD105 및 CD90 마커의 면역형광 염색 사진이고, 도 1의 b는 역시 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 CD29 및 CD90 마커의 면역형광 염색 사진이다.
도 2의 a는 피브린 단독 투여군, 피브린 및 물질 P 복합 투여군, 그리고 피브린 및 KLD12-SP 복합 투여군을 SD 랫트의 피하에 이식하여 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 CD105 및 CD90 마커의 면역형광 염색 사진이고, 도 2의 b는 역시 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 CD29 및 CD90 마커의 면역형광 염색 사진이다.
도 3의 a는 무투여군, 물질 P 단독 투여군, RADA16-II 단독 투여군, RADA16-II 및 물질 P 복합 투여군, 그리고 RADA16-II 및 RADA16-II-SP 복합 투여군을 Balb/C 누드 마우스 하지허혈을 유도시킨 후 각각 시험군을 투입하여 줄기세포의 동원 활성을 확인하기 위해 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 CD105 및 CD90 마커의 면역형광 염색 사진이고, 도 3의 b는 역시 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 CD29 및 CD90 마커의 면역형광 염색 사진이다.
도 4의 a는 Balb/C 누드 마우스 하지허혈을 유도시킨 후 RADA16-II 및 RADA16-II-SP 복합 투여 또는 아무것도 투여하지 않고 7일 후의 마우스 세마리의 모습이다. 도 4의 b는 무투여군, 물질 P 단독 투여군, RADA16-II 단독 투여군, RADA16-II 및 물질 P 복합 투여군, 그리고 RADA16-II-SP 단독 투여군을 Balb/C 누드 마우스 하지허혈을 유도시킨 후 각각 시험군을 투입하여 신생혈관 형성을 확인하기 위해 혈관에서 특이적으로 발현되는 von Willebrand factor 및 alpha-smooth muscle actin 마커의 면역형광 염색 사진이다.
본 발명은 다음 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 자가조립 펩타이드 및 물질 P(Substance P)가 결합된 줄기세포 동원(recruiting) 활성을 가지는 폴리펩타이드를 제공한다:
[일반식 1]
(αβ)n
상기 α는 알라닌(A), 로이신(L) 및 페닐알라닌(F) 중에서 선택되는 어느 하나의 소수성 아미노산이고, 상기 β는 아르기닌(R), 아스파르트산(D), 라이신(K), 글루타민산(E) 및 히스티딘(H) 중에서 선택되는 어느 하나의 친수성 아미노산이며, 상기 n은 4 내지 16 중의 어느 하나의 정수이다.
상기 n이 상한치를 초과하는 경우, 펩타이드 합성 및 정제면에서 바람직하지 않고, 하한치 미만인 경우 고차구조의 자기조립체 생성 면에서 바람직하지 않다.
참고로, 대표적인 아미노산과 각각의 약어는, 알라닌(Ala, A), 이소류신(Ile, I), 류신(Leu, L), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 프롤린(Pro, P), 트립토판(Trp, W), 발린(Val, V), 아스파라긴(Asn, N), 시스테인(Cys, C), 글루타민(Gln, Q), 글리신(Gly, G), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 티로신(Try, Y), 아스파르트산 (Asp, D), 글루탐산(Glu, E), 아르기닌(Arg, R), 히스티딘(His, H), 라이신(Lys, K), 글루타민(Gln, Q)과 같다.
본 발명에서, 펩타이드란 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.
본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis technique)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).
본 발명의 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 자가조립 펩타이드는 친수성 아미노산과 소수성 아미노산이 순차적 결합으로 8개 내지 32개까지 반복되는 것으로, RADA16-I은 RADARADARADARADA의 아미노산 서열을 가지고 있으며, RADA16-II는 RARADADARARADADA, RAD16은 RARARARADADADADA, DAR16은 DADADADARARARARA, RADA8-I은 RADARADA, RADA8-II는 RARADADA, KLD12는 KLDLKLDLKLDL, EAKA16-1은 AEAKAEAKAEAKAEAK, EAKA8-1은 AEAKAEAK, RAEA16-I는 RAEARAEARAEARAEA, RAEA8-I은 RAEARAEA, KADA16-I은 KADAKADAKADAKADA, KADA8-I은 KADAKADA, EAH16-II는 EAEAHAHAEAEAHAHA, EAH8-II는 EAEAHAHA, EFK16-II는 EFEFKFKFEFEFKFKF, EFK8-II는 EFEFKFKF, EAK12는 EAEAEAEAKAKA, EAK8-II는 EAEAKAKA, KAEA는 KAKAKAKAEAEAEAEA, EAK16는 EAEAEAEAKAKAKAKA의 아미노산 서열이다.
본 발명의 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 자가조립 펩타이드는 양친매성 펩타이드로서, 베타쉬트 구조를 형성하며, 생체이온의 존재 하에서 겔화될 수 있다.
본 발명의 줄기세포 동원(recruiting) 활성을 가지는 폴리펩타이드는 상기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 자가조립 펩타이드에 물질 P(Substance P)가 펩타이드 결합된다.
물질 P는 RPKPQQFFGLM의 11개의 아미노산 서열로 이루어진 포유류의 타키키닌의 하나로서, 조직내 상처가 발생했을 때 과량 분비되고, 이는 상처 회복을 위해 다분화능이 있는 줄기세포의 동원을 유도할 수 있는 능력을 지닌 물질이다. 상기 물질 P의 N말단에는 글리신(G) 또는 글루탐산(E)이 2 내지 10 개 반복되는 서열의 스페이서가 결합되어 물질 P와 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 자가조립 펩타이드와의 사이에 위치할 수 있다.
본 발명은 상기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 자가조립 펩타이드 및 물질 P(Substance P)가 결합된 줄기세포 동원 활성을 가지는 폴리펩타이드를 포함하는 생분해성 지지체일 수 있다.
조직공학에 쓰이는 생체 이식용 지지체는 크게 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA)와 같은 합성재료를 사용하여 만든 지지체와 아가로오스, 셀룰로오스, 키토산, 히알우론산, 피브린 등의 천연재료를 사용하는 지지체 및 자가조립 펩타이드 지지체로 분류할 수 있다. 본 발명은 합성생체재료로서 일정 부피 이상의 상처를 수복 및 기계적 강도를 유지해 줄수 있는 생분해성 고분자 다공성 지지체 또는 주입형으로 사용될 수 있는 하이드로 젤 형태의 피브린과 상기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 자가조립 펩타이드 및 물질 P가 결합된 줄기세포 동원 활성을 가지는 폴리펩타이드를 포함하는 생분해성 지지체일 수 있다.
본 발명의 줄기세포 동원(recruiting) 활성을 가지는 폴리펩타이드는 특히 신생혈관 형성 및 조직 재생에 효과적으로 작용하므로 혈관 폐색으로 나타나는 질환, 특히 하지허혈증, 심근경색, 근경색, 뇌혈관질화, 말초혈관성 질환등의 허혈성 질환 치료제로 활용될 수 있다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
제조예 : 줄기세포 동원 활성을 가지는 폴리펩타이드(RADA16-II-SP 및 KDL12-SP)의 제조
본 발명의 일반식 1의 자가조립 펩타이드의 한 예인, KDL12 즉, KLDLKLDLKLDL(서열번호 1) 또는 RADA16-II 즉, RARADADARARADADA(서열번호 2)과 이들 자가조립 펩타이드에 물질 P, 즉 RPKPQQFFGLM(서열번호 3)가 결합된 줄기세포 동원 활성을 가지는 폴리펩타이드 KDL12-SP(서열번호 4) 및 RADA16-II-SP(서열번호 5)를 고체상(Solid-phase) 방법으로 아래와 같이 합성하였다.
구체적으로, 0.06 mmol의 글루탐산-Wang 레진을 표준 반응용기 (Standard reaction vessel)에 넣고, 레진의 Fmoc을 염기(20% 피페리딘)로 제거하고, 합성하려는 펩타이드의 카르복시 말단의 Fmoc-아미노산을 넣고 1-히드록시-벤조트리아졸(HOBT), 디아이소프로필 카보다이이미드(DIC)을 혼합하여 활성시킨후 합성을 시작하였다. 이후 같은 방법으로 아미노산 배열 순서대로 합성을 하고, 커플링이 끝난 후 N-메틸피롤리돈과 디클로로메탄으로 여러 번 세척한 다음 건조시켰다. 여기에 트리플루오로아세트산 : 페놀 : 티오아니솔 : 물 : 에탄디티올(Trifluoroacetic acid : Phenol :Thioanisole : H2O : Ethandithiol)의 82.5 : 5: 5 : 5: 2.5 (v/v)용액으로 2 내지 3시간 반응시켜 펩타이드의 보호기를 제거하고, 레진으로부터 펩타이드를 분리한 후 용액에 차가운 에틸에테르를 첨가하여 흰색 침전된 펩타이드를 얻었다. 이렇게 하여 얻어진 펩타이드를 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 정제하였고, 이때 칼럼은 C4 semi-prep column(Phenomenex)을 사용하였으며, 완충용액 A는 물 및 0.1 % TFA를 사용하여 평형화시키고, 완충용액 B는 아세토나이트릴 및 0.1 % TFA를 사용하여 펩타이드를 용출시켜, 각각 KDL12, RADA16-II, SP(물질 P), KDL12-SP 및 RADA16-II-SP를 제조하였다.
실험예 1: 피하 모델에서의 RADA16 - II - SP 의 줄기세포 동원 활성
상기 제조예에서 제조한 RADA16-II, SP 와 RADA16-II-SP를 각각 수크로오스 용액에 녹여 1%의 펩타이드 용액을 만들고, 생분해성 지지체인 피브린과 1 % 펩타이드 용액, 즉 RADA16-II, SP 또는 RADA16-II-SP를 500 : 1 중량비로 혼합하여 피하 이식용 생체재료를 제조하였다. 또한 RADA16-II, SP 와 RADA16-II-SP 어느 것도 혼합하지 않은 피브린만을 피하 이식용 생체재료로 이용한 군을 대조군으로 하였다.
상기 피하 이식용 생체재료들을 각각 6주령 SD 랫트의 피하에 0.5 ml 이식하고, 7일 후 적출하여 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 CD105, CD90 및 CD29 마커의 면역형광 염색 사진을 통해 줄기세포 동원 활성을 확인하였다.
도 1의 a는 피브린 단독 투여군, 피브린 및 물질 P 복합 투여군, 피브린 및 RADA16-II 복합 투여군, 그리고 피브린과 RADA16-II-SP 복합 투여군을 SD 랫트의 피하에 이식하여 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 CD105 및 CD90 마커의 면역형광 염색 사진이고, 도 1의 b는 역시 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 CD29 및 CD90 마커의 면역형광 염색 사진이다.
피브린 단독 투여군에서는 줄기세포 동원이 이루어지지 않았고, 피브린 및 물질 P 복합 투여군, 그리고 피브린 및 RADA16-II 복합 투여군에서는 CD29 및 CD90 마커의 염색이 일부 나타나 줄기세포 동원 활성이 미약하게 나타났으나, 피브린과 RADA16-II-SP 복합 투여군에서는 CD29, CD90 및 CD105 마커 모두에서 현저하게 발색되어 줄기세포 동원 활성이 RADA16-II-SP에서 현저히 증진됨을 확인하였다.
실험예 2: 피하 모델에서의 KLD12 - SP 의 줄기세포 동원 활성
상기 제조예에서 제조한 SP 와 KLD12-SP를 각각 수크로오스 용액에 녹여 1%의 펩타이드 용액을 만들고, 생분해성 지지체인 피브린과 1 %의 SP 또는 KLD12-SP를 500 : 1 중량비로 혼합하여 피하 이식용 생체재료를 제조하였다. 또한 SP 와 KLD12-SP 어느 것도 혼합하지 않은 피브린만을 피하 이식용 생체재료로 이용한 군을 대조군으로 하였다.
실험예 1과 동일하게 상기 피하 이식용 생체재료들을 각각 6주령 SD 랫트의 피하에 이식하여 줄기세포 동원 활성을 확인하였다.
도 2의 a는 피브린 단독 투여군, 피브린 및 물질 P 복합 투여군, 그리고 피브린 및 KLD12-SP 복합 투여군을 SD 랫트의 피하에 이식하여 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 CD105 및 CD90 마커의 면역형광 염색 사진이고, 도 2의 b는 역시 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 CD29 및 CD90 마커의 면역형광 염색 사진이다.
피브린 단독 투여군에서는 줄기세포 동원이 이루어지지 않았고, 피브린 및 물질 P 복합 투여군에서는 줄기세포 동원 활성이 미약하게 나타났으나, 피브린과 KLD12-SP 복합 투여군에서는 CD29, CD90 및 CD105 마커 모두에서 현저하게 발색되어 줄기세포 동원 활성이 현저히 증진됨을 확인하였다.
실험예 3: 하지허혈 모델에서의 RADA16 - II - SP 의 줄기세포 동원 활성
상기 제조예에서 제조한 RADA16-II, SP 와 RADA16-II-SP를 각각 수크로오스 용액에 녹여 1%의 펩타이드 용액을 만들고, RADA16-II와 RADA16-II-SP를 200 : 1 부피비로 혼합하여 이식용 생체재료를 제조하였다.
대조군으로 무투여군, 물질 P 단독 투여군, RADA16-II 단독 투여군, RADA16-II 및 물질 P 복합 투여군을 각각 상기 RADA16-II 및 RADA16-II-SP 복합투여군의 RADA16-II 펩타이드의 양 또는 물질 P의 양과 동일하게 사용하였다.
상기 각각의 이식용 생체재료를 Balb/C 누드 마우스 하지허혈을 유도시킨 후 투여한 후 7일 후 적출하여 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 CD105, CD90 및 CD29 마커의 면역형광 염색 사진을 통해 줄기세포 동원 활성을 확인하였다.
도 3의 a는 무투여군, 물질 P 단독 투여군, RADA16-II 단독 투여군, RADA16-II 및 물질 P 복합 투여군, 그리고 RADA16-II-SP 단독 투여군을 Balb/C 누드 마우스 하지허혈을 유도시킨 후 각각 시험군을 투입하여 줄기세포의 동원 활성을 확인하기 위해 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 CD105 및 CD90 마커의 면역형광 염색 사진이고, 도 3의 b는 역시 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 CD29 및 CD90 마커의 면역형광 염색 사진이다.
다른 군과 달리 RADA16-II 및 RADA16-II-SP 복합 투여군에서는 CD29, CD90 및 CD105 마커 모두에서 현저하게 발색되어 줄기세포 동원 활성이 현저히 증진됨을 확인하였다.
도 4의 a는 Balb/C 누드 마우스 하지허혈을 유도시킨 후 RADA16-II 및 RADA16-II-SP 복합 투여 또는 아무것도 투여하지 않고 7일 후의 마우스 세마리의 모습이다.
도 4의 b는 무투여군, 물질 P 단독 투여군, RADA16-II 단독 투여군, RADA16-II 및 물질 P 복합 투여군, 그리고 RADA16-II-SP 단독 투여군을 Balb/C 누드 마우스 하지허혈을 유도시킨 후 각각 시험군을 투입하여 신생혈관 형성을 확인하기 위해 혈관에서 특이적으로 발현되는 von Willebrand factor 및 alpha-smooth muscle actin 마커의 면역형광 염색 사진이다.
도 4의 a 및 b에서 볼수 있듯이 하지허혈 모델에서의 동원된 줄기세포에 의한 신생혈관 유도능을 확인한 결과 RADA16-II 및 RADA16-II-SP 복합 투여군에서 마우스의 하지허혈 병변이 더 이상 진행되지 않는 것을 확인 하였으며 염색 사진을 통해 하지허혈조직에서 신생혈관 개수가 다른 군에 비하여 현저하게 증가하였음을 확인하였다.
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  2. 삭제
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  5. 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 줄기세포 동원(recruiting) 활성을 가지는 폴리펩타이드.
  6. 청구항 제 5 항의 폴리펩타이드를 포함하는 생분해성 지지체.
  7. 제 6 항에 있어서, 폴리글리콜산, 폴리락트산 및 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA) 중에서 선택되는 합성재료를 사용하여 만든 지지체 또는 아가로오스, 셀룰로오스, 키토산, 히알우론산 및 피브린 중에서 선택되는 천연재료를 사용하여 만든 지지체인 것을 특징으로 하는 생분해성 지지체.

  8. 청구항 제 5 항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 치료용 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 하지허혈증 치료용 조성물인 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 조성물.
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