KR20180050755A

KR20180050755A - 사이클릭 폴리펩타이드, 그것의 제조 방법 및 치료학적 용도

Info

Publication number: KR20180050755A
Application number: KR1020187011559A
Authority: KR
Inventors: 도미닉 브리든; 스테판 고브론
Original assignee: 뉴로낙스
Priority date: 2015-09-25
Filing date: 2016-09-23
Publication date: 2018-05-15
Also published as: PL3353191T3; ES2952519T3; DK3353191T3; FR3041644B1; EP3353191B1; AU2016328916A1; EP3353191A1; JP2018531284A; US10501497B2; CN108350035A; AU2016328916B2; JP6998878B2; CA2999797A1; WO2017051135A1; US20180265549A1; FR3041644A1

Abstract

본 발명은, X1, X2 및 X3가 서로 독립적으로 S 또는 G이고; X4가 R-S 또는 V-S 또는 V-T 또는 R-T이고; 2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성된, 아미노산 서열: W-S-X1-W-X2-X3-C-S-X4-C-G (서열번호 59)를 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.

Description

사이클릭 폴리펩타이드, 그것의 제조 방법 및 치료학적 용도

본 발명은 새로운 사이클릭 폴리펩타이드, 이를 포함하는 약학적 조성물 및 이의 약제로서의 용도에 관한 것이며, 보다 상세하게는 신경퇴행성 질환의 치료 및 중추신경계와 말초신경계의 세포 재생에서의 용도 및 이들 사이클릭 폴리펩타이드를 수득하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 폴리펩타이드는 트롬보스폰딘 타입 1 리피트 (thrombospondin type 1 repeat) 또는 TSR로 지칭되는 SCO-스폰딘의 보존된 컨센서스 도메인들 중 하나로부터 유래되는 아미노산 서열을 가진다.

트롬보스폰딘의 구조로부터 추정되는 여러가지 합성 펩타이드들이 다양한 세포 타입들에 흥미로운 작용을 한다는 것은 잘 알려져 있으며, 특히 포유류에서 종양을 저해하고, 혈전 용해 및 혈관신생에 영향을 미치며, 보완적인 모듈레이터일 수 있으며, 또는 심지어 세포 부착을 촉진할 수 있다 [Sipes JM et al., J Cell Biol, 121, 469-77, 1993; Rusnati M et al. Pharmaceuticals 3, 1241-1278, 2010; Lopez-Dee Z et al., Mediators of Inflammation, Volume 2011, Article ID 296069,10 pages, 201i].

SCO-스폰딘의 일반적인 특징은, 특히, Meiniel et al., Microsc Res Tech. 2, 484-95, 2001 및 Gobron et al. Glia 32,177-91, 2000의 논문에 기술되어 있다.

아미노산 서열 폴리펩타이드의 용도:

W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G [서열번호 58]는 SCO-스폰딘 TSR 모티프들 중 하나의 모티프의 가장 대표적인 아미노산 서열로서, 랫 신경모세포종 유래의 B104 세포에서 세포 분화를 유발하여 신경돌기 성장 및 세포 응집을 유도한다 [F. EI-Bitar et al., Cell Tissue Res., Vol. 304, p. 361-369.2001]. 이 폴리펩타이드는 2개의 시스테인 사이에 이황화 결합이 존재하지 않는다.

이 폴리펩타이드 뿐만 아니라 서열번호 70, 특히 서열번호 57의 환원된 형태의 폴리펩타이드는, 국제 특허 출원 공개 WO 1999/03890 (US 6,995,140에 대응) 및 WO2009027350에 기술 및 청구되어 있는 것이거나, 또는 이들 특허의 내용과 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법에 기반하여 제조될 수 있다.

그러나, 폴리펩타이드 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G [서열번호 58]의 안정성이 수용액 중에서 경시적으로 감소한다. 즉, 이 폴리펩타이드는 치료에 사용시 즉석에서 준비하여야 하므로 이의 투여가 복잡해질 수 있으며, 그래서 직접 주사 또는 예를 들어 환자에게 약제를 점진적으로 전달하기 위한 펌프를 이용한 치료를 수행할 수 있는 가능성을 제한한다. 일반적으로, 이러한 낮은 안정성은 이 폴리펩타이드에 기반한 치료 컨셉을 개발하는데 일부 제약이 될 것이다.

특허 출원 공개 WO 2008/090285는 폴리펩타이드 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G [서열번호 58]의 펩티도-모방체 유사체를 개시한다. 그러나, 이 방식에는 2가지 문제가 존재하는데, 이들 폴리펩타이드는 면역원성 현상을 유발할 가능성이 있는 비-천연적인 아미노산을 함유하고, 제조 비용이 현저하게 높으며, 비-천연 아미노산은 천연 아미노산 보다 훨씬 더 비싸고, 이는 상업적인 관심을 떨어뜨린다.

본 발명의 한가지 목적은, 용액 중에서, 특히 척수강내 투여 (intrathecal administration)에 사용가능한 용액 중에서, 특히 서열번호 67의 폴리펩타이드, 특히 서열번호 57의 폴리펩타이드, 특히 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G [서열번호 58]의 폴리펩타이드의 특성을 보존 또는 개선하면서도, 안정적이고 용해성인 펩타이드 화합물을 제공하는 것이다.

실제, 국제 특허 출원 공개 WO 1999/03890에 언급된 아미노산 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G [서열번호 58]을 가진 폴리펩타이드에 대한 보다 용해성인 형태를 개발하는 것이 몇가지 원하는 임상적인 증상들에서는 특히 중요한 일이다.

또한, 척수강내 주사 (IT)의 경우, 화합물을 투여하는데 사용되는 용액의 선택 폭이 매우 제한적이다. 실제, 사용되는 용액은 생리 유체, 인공 뇌척수액 및 5% 글루코스 용액으로 3종에 불과하다. 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 그외 용액들도, 뇌실내, 경막외, 척수내, 뇌실질내, 정맥내, 강내 (intraluminal), 유리체강내 (intravitreal), 경접형동 (transphenoidal) 또는 국소 경로 등의 다른 투여 수단이 사용되는 경우에는, 사용될 수 있다. 또한, 약학적 조성물은 임의 형태로, 특히 액체, 특히 용액, 현탁액 또는 에멀젼 형태의 주사용 제제, 주입 제제 또는 고체로 제조될 수 있으며, 임의 타입의 지지체, 특히 겔, 바이오폴리머 또는 생물물질 (biomaterial) 또는 이식물 또는 예를 들어 제어 방출 또는 벡터화 (vectorization) 시스템을 허용하는 이식가능한 펌프와 같은 임의의 의료 기구를 포함할 수 있다.

수용액은 투여 경로에 적절한 다양한 용매들을 이용해 제조될 수 있으며, 이상적으로는 0.9% 염화나트륨 또는 5% 글루코스 등의 등장성 용매를 이용해 제조될 수 있지만, 용매는 또한 물, 식염수, 포스페이트 완충제, 사이트레이트 또는 아세테이트 또는 그 외의 것 등일 수도 있다. 선택적으로, 조제물은 임의의 부형제, 보강제 또는 첨가제, 예를 들어 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 또는 임의의 계면활성제, 습윤제, 점증제 (viscosifying agent), 킬레이트제, 등장화제, 항산화제 또는 안정화제를 포함하거나, 이와 조합되거나 또는 그렇지 않을 수 있다.

용액 형태의 조제물은 볼루스 주사 (bolus injection) 또는 주입에 의해 투여될 수 있다.

아미노산 서열: W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G [서열번호 58]의 폴리펩타이드의 경우, 생리 액체에 대한 용해성이 낮고, 즉, 1-2 mg/ml 수준이며, 따라서 10 mg/ml 수준의 바람직한 최고 임상 용량을 달성하기가 더 곤란하다. 용해도는 IT 주사액일 경우 특히 중요한데, 그 이유는 주사액 부피에 제한이 있고, 말초 주사액의 경우 훨씬 더 제한적이며, 예를 들어 사용될 수 있는 용매와 용액에 제한이 있기 때문이다. 5% 글루코스 용액의 사용은, 아미노산 서열: W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G [서열번호 58]의 폴리펩타이드를 약 10 mg/ml에 도달하게 함으로써, 이의 용해도를 개선시키게 되며, 이 용액은 IT 주사에 적절한 등장성 용액으로 유지된다.

그러나, 글루코스는 폴리펩타이드와 접촉시 아래 반응식에 따라 글루코스의 알데하이드가 폴리펩타이드의 1차 아민과 반응함으로써 쉬프 염기를 형성하는 것으로 알려져 있다:

이론적으로, 이들 쉬프 염기는 약학적 조성물의 제조와 구현을 복잡하게 만들 수 있다. 그러나, 본 발명의 폴리펩타이드의 경우, 이들 염기는 생체내에서 가역적이다.

따라서, 5% 글루코스 이외의 용매 중에, 바람직하게는 생리 체액 또는 인공적인 뇌척수액 중에서, 아미노산 서열: W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G [서열번호 58]의 폴리펩타이드가 더욱 용해된 형태를 개발하는 것이 매우 중요하다.

본 발명의 다른 측면은 신경 세포의 재생이 요구되는 신경퇴행성 질환 또는 신경 외상을 치료하는데 효과적인 펩타이드 화합물과 이를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 이들 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 하기 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다:

W-S-X1-W-X2-X3-C-S-X4-C-G (서열번호 59)

상기 서열에서,

X1, X2 및 X3는 서로 독립적으로 S 또는 G이고,

X4는 R-S 또는 V-S 또는 V-T 또는 R-T이고,

2개의 시스테인은 이황화 결합을 형성한다.

본 발명은, 특히 하기 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것으로서:

W-S-X1-W-X2-X3-C-S-X4-C-G (서열번호 59)

상기 서열에서,

X1, X2 및 X3는 서로 독립적으로 S 또는 G이고,

X4는 R-S 또는 V-S 또는 V-T 또는 R-T이고,

2개의 시스테인은 이황화 결합을 형성하고,

폴리펩타이드에는 폴리펩타이드의 환원된 형태 또는 폴리펩타이드의 이량체 또는 올리고머 형태 뿐만 아니라 티올 기가 설폭사이드 또는 설폰 형태인 폴리펩타이드의 유도체가 실질적으로 존재하지 않는다.

상기 서열번호 59의 서열에서, X4는 R-S 또는 V-S 또는 V-T 또는 R-T이다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, X4는 또한 R-S 또는 V-S 또는 V-T일 수 있다.

이에, 본 발명의 과제는 하기 아미노산 서열을 포함하는 전술한 폴리펩타이드를 제공하는 것이다:

W-S-X1-W-X2-X3-C-S-X4-C-G (서열번호 1)

상기 서열에서,

X1, X2 및 X3는 전술한 의미로 정의되며,

X4는 R-S 또는 V-S 또는 V-T이며,

2개의 시스테인이 이황화 결합을 형성한다.

본 발명의 목적에 따라, 용어 "아미노산"은 천연 아미노산 및 비-천연 아미노산 둘다를 의미한다.

"천연 아미노산"은 천연 단백질에서 발견될 수 있는 L 형태의 아미노산, 즉, 즉 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인; 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린을 의미한다.

"비-천연 아미노산"은 D 형태의 상기한 아미노산 뿐만 아니라, 아르기닌, 라이신, 페닐알라닌 및 세린과 같은 특정 아미노산의 호모 형태 (homo form) 또는 루신 또는 발린의 비-호모 형태 (nor form)를 의미한다.

또한, 이러한 정의는 α 아미노부티르산, 아그마틴 (agmatine), α-아미노이소부티르산, 사르코신 (sarcosine), 스타틴, 오르니틴, 데아미노티로신 (deaminotyrosine) 등의 다른 아미노산들도 포함한다.

펩타이드 서열을 설명하는데 사용되는 명칭은 1문자를 이용한 국제 명명법에 따르며, 아미노산 말단은 좌측이고, 카르복시 말단은 우측에 나타낸다.

대쉬 "-"는 서열의 아미노산을 연결하는 일반적인 펩타이드 결합을 의미한다.

본 발명에서, 용어 "폴리펩타이드"는 길이에 상관없이 펩타이드 결합을 통해 서로 연결된 아미노산들로 구성된 임의의 폴리머를 의미하는 것으로 의도된다. 즉, 본 발명에서, 용어 폴리펩타이드는 또한 펩타이드 및 단백질을 포괄한다.

본 발명은 하기 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드에 관한 것이다:

W-S-X1-W-X2-X3-C-S-X4-C-G (서열번호 59)

상기 서열에서,

X1, X2 및 X3는 서로 독립적으로 S 또는 G이고,

X4는 R-S 또는 V-S 또는 V-T 또는 R-T이고,

2개의 시스테인은 이황화 결합을 형성한다.

산물 서열번호 59는 하기 구조를 가지며:

3문자를 이용한 국제 명명으로 하기 식으로:

또는 하기 식으로 표시될 수 있다:

이러한 구현예에서, 본 발명은 하기 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것으로서:

상기한 서열에서 2개의 시스테인은 서로 이황화 결합을 형성한다.

유익한 구현예에서, 본 발명은 2개의 시스테인이 이황화 결합을 형성한 하기 아미노산 서열을 포함하는 전술한 폴리펩타이드에 관한 것이다.

W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 2).

산물 서열번호 2는 하기 구조를 가지며;

3문자를 이용한 국제 명명으로 하기 식으로:

또는 하기 식으로 표시될 수 있다:

놀랍게도, 본 발명자들은, 시스테인 2개 사이의 이황화 결합의 형성이 아미노산 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G [서열번호 2]의 폴리펩타이드에 존재하여, 신경돌기 성장과 시냅스 접촉의 증가를 유도하는데 있어 폴리펩타이드의 효능을 유지할 뿐만 아니라 투여에, 특히 척수강내 투여에 적절한 용액에서 우수한 안정성 및 용해성을 가진 폴리펩타이드를 수득할 수 있다는 것을 알게 되었다.

본 발명에서, 펩타이드 서열이 유래된 SCO-스폰딘 단백질에서, 전술한 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G [서열번호 2]에 존재하는 2개의 시스테인이 서로 이황화 결합을 형성하지 않으며, 대신 단백질에 존재하는 다른 시스테인과 이황화 결합을 형성하는데 참여한다는 것 역시 모두 놀라운 일이었다.

특정 구현예에서, 본 발명은 하기 아미노산 서열로 구성되는 전술한 바와 같이 정의되는 폴리펩타이드에 관한 것이다:

X7-W-S-X1-W-X2-X3-C-S-X4-C-G-X8 (서열번호 68)

상기 서열에서:

X1, X2 및 X3는 서로 독립적으로 S 또는 G이고,

X4는 R-S 또는 V-S 또는 V-T 또는 R-T이고,

2개의 시스테인은 이황화 결합을 형성하고,

X7은 수소 원자 또는 아미노산 0-4개의 아미노산 체인이고,

X8은 수소 원자 또는 아미노산 0-5개의 아미노산 체인이다.

다른 구체적인 구현예에서, 본 발명은 하기 아미노산 서열로 구성되는 전술한 바와 같이 정의되는 폴리펩타이드에 관한 것이다:

X5-W-S-X1-W-X2-X3-C-S-X4-C-G-X6 (서열번호 69)

상기 서열에서,

X1, X2 및 X3는 서로 독립적으로 S 또는 G이고

X4는 R-S 또는 V-S 또는 V-T 또는 R-T이고,

2개의 시스테인은 이황화 결합을 형성하고,

X5는 수소 원자 또는 P 또는 A-P 또는 L-A-P 또는 V-L-A-P이고,

X6는 수소 원자 또는 L 또는 L-G 또는 L-G-L 또는 L-G-L-I 또는 L-G-L-I-F이다.

전술한 서열번호 68 및 서열번호 69에서, X4는 R-S 또는 V-S 또는 V-T 또는 R-T이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, X4는 또한 R-S 또는 V-S 또는 V-T일 수 있다. 해당 서열은 서열번호 8 및 서열번호 3의 서열이다.

이러한 구현예에서, 본 발명은, 특히 폴리펩타이드 서열:

W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 2)

및 하기 아미노산 서열의 폴리펩타이드에 관한 것으로서,

이들 서열에서 2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성되어 있다.

보다 더 유익한 구현예에서, 본 발명은, 2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성된, 하기 아미노산 서열로 구성되는, 전술한 폴리펩타이드에 관한 것이다:

W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 2)

유익한 구현예에서, 본 발명은 하기 아미노산 서열로 구성되는, 전술한 폴리펩타이드에 관한 것으로서:

W-S-X1-W-X2-X3-C-S-X4-C-G (서열번호 59)

상기 서열에서,

X1, X2 및 X3는 서로 독립적으로 S 또는 G이고,

X4는 R-S 또는 V-S 또는 V-T 또는 R-T이고,

2개의 시스테인은 이황화 결합을 형성하며,

상기 폴리펩타이드에는 폴리펩타이드의 환원된 형태 또는 폴리펩타이드의 이량체 또는 올리고머 형태 뿐만 아니라 티올 기가 설폭사이드 또는 설폰 형태인 폴리펩타이드의 유도체가 실질적으로 존재하지 않는다.

용어 "실질적으로 없는"은, 전술한 바람직한 구현예에 따른 폴리펩타이드가 본 발명의 발명자들에 의해 동정된 불순물을 매우 최소량으로 포함한다는 것을 의미한다. 이들 불순물은 2개의 시스테인의 2개의 티올기들이 유리 형태인 환원된 구조, 이량체 (또는 폴리머) 또는 티올 기들이 설폭사이드 또는 설폰 형태로 존재하는 산화된 형태를 포함한다. 이러한 실질적으로 순수한 형태를 수득하는 방법은 바람직하게는 후술한 방법을 실행함으로써 달성된다. 이들 조건 하에 수득되는 산물의 순도는 최소 80% 수준이다. 순도는 85%, 90% 또는 심지어 95% 이상에 달할 수 있다.

다른 유익한 구현예에서, 본 발명은 하기 아미노산 서열로 구성되는, 폴리펩타이드에 관한 것으로서,

W-S-X1-W-X2-X3-C-S-X4-C-G (서열번호 59)

상기 서열에서,

X1, X2 및 X3는 서로 독립적으로 S 또는 G이고,

X4는 R-S 또는 V-S 또는 V-T 또는 R-T이고,

2개의 시스테인은 이황화 결합을 형성하며,

상기 폴리펩타이드는 >80%, 바람직하게는 >85%, 더 바람직하게는 >90%, 보다 더 바람직하게는 95% 이상의 순도를 가진다.

더 구체적인 구현예에서, 본 발명은 2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성된 하기 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드에 관한 것으로서,

W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 2)

통상적인 정제 방법, 예를 들어 크로마토그래피에 의한 방법을 이용해 바람직한 이황화 결합을 포함하는 산물을 정제할 수 있다.

예를 들어, 서열번호 2의 서열에 해당되는 화합물의 합성은 알부민의 부재 하에 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 방법으로 수행되며, 일부가 바람직한 산물인 약 60종의 산물들로 구성된 혼합물이 제조되며, HPLC에 의한 측정에 따르면 순도는 44.51%이다. 0.1% TFA/물/아세토니트릴 농도 구배를 이용한 연속적인 수회 HPLC 수행 후 동일 분획들을 혼합물로 모아 (풀링), 서열번호 2의 서열에 해당되는 화합물을 최종 순도 99%로 분리할 수 있다.

또 다른 구체적인 구현예에서, 이에 본 발명은 2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성된 하기 아미노산 서열로 구성되는 전술한 폴리펩타이드에 관한 것으로서:

W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 2),

다른 측면에서, 본 발명은, 알부민의 존재 하에 서열번호 70의 폴리펩타이드내에 이황화 결합을 형성하는 단계를 포함하며, 서열번호 70의 폴리펩타이드가 용액 중에, 바람직하게는 수용액 중에 존재하는, 서열번호 59의 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다:

W-S-X1-W-X2-X3-C-S-X4-C-G (서열번호 59)

상기 서열에서,

X1, X2 및 X3는 서로 독립적으로 S 또는 G이고,

X4는 R-S 또는 V-S 또는 V-T 또는 R-T이고,

2개의 시스테인은 이황화 결합을 형성한다.

W-S-X1-W-X2-X3-C-S-X4-C-G (서열번호 70)

상기 서열에서,

X1, X2 및 X3는 서로 독립적으로 S 또는 G이고,

X4는 R-S 또는 V-S 또는 V-T 또는 R-T이다.

서열번호 70의 폴리펩타이드 서열에는 이황화 결합이 존재하지 않는다.

본 발명의 상기한 구현예에서, 아미노산 서열에서 시스테인 2개 간의 이황화 결합의 형성은 시스테인의 산화에 의해 달성된다.

전술한 서열번호 70의 서열에서, X4는 R-S 또는 V-S 또는 V-T 또는 R-T이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, X4가 R-S 또는 V-S 또는 V-T인 서열번호 57의 서열을 가진 산물로부터 상기한 방법이 구현될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 알부민의 존재 하에 서열번호 58의 폴리펩타이드내에 이황화 결합을 형성하는 단계를 포함하는, 2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성된 서열번호 2의 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다.

W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 2)

W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 58)

본 발명의 발명자들은 이황화 결합을 형성하는 진보적이고 예상치못한 방법을 개발하게 되었다. 본 방법은, 펩타이드의 공업적인 생산에 늘 유익한, 불순물의 생성을 줄이거나 또는 회피하기 위해, 또한 반응 속도를 높이기 위해, 산화 촉매로서 알부민을 이용하는 것으로 구성된다.

반응에서 알부민의 존재가, 특히 출발 산물의 산화를 가속화할 수 있다. 산화 반응에서, 부적절한 산물이 통제되지 않은 산화로부터 생성되지 않도록 반응을 서서히 가속화하는 것이 종종 바람직하다. 실시예에 제시된 결과들은, 알부민의 존재 하에서 반응이 이루어지는 산물 (특히 서열번호 2의 폴리펩타이드)에 대한 보다 나은 제어가 가능하며, 따라서 보다 높은 순도를 제공할 수 있음을, 입증해준다.

보다 구체적으로, 본 발명은, 알부민 및 서열번호 70의 폴리펩타이드 또는 서열번호 58의 폴리펩타이드가 1:1 내지 1:100, 바람직하게는 1:1 내지 1:10, 더 바람직하게는 1:1의 비율로 존재하는 것을 특징으로 하는, 전술한 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 서열번호 2의 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

다른 구체적인 구현예에서, 본 발명은, 서열번호 70의 폴리펩타이드 또는 서열번호 58의 폴리펩타이드에서 알부민의 존재 하에 이황화 결합을 형성하는 단계가 주위 공기 중에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 전술한 서열번호 59의 폴리펩타이드 또는 서열번호 2의 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

다른 구체적인 구현예에서, 본 발명은, 알부민의 존재 하에 서열번호 57의 폴리펩타이드내에 이황화 결합을 형성하는 단계가 주위 공기 중에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 전술한 서열번호 1의 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

다른 유익한 구현예에서, 본 발명은, 알부민의 존재 하에 서열번호 70의 폴리펩타이드 또는 서열번호 58의 폴리펩타이드내에 이황화 결합을 형성하는 단계가, 서열번호 70의 폴리펩타이드 서열 또는 서열번호 58의 폴리펩타이드 서열이 이들 폴리펩타이드의 펩타이드 합성시 사용되는 수지로부터 탈착되지 않은 상태로 수행되며, 그런 후 서열번호 59의 폴리펩타이드 또는 서열번호 2의 폴리펩타이드의 이황화 결합 단계를 거친 다음 수지로부터 이들 폴리펩타이드를 분리시킴으로써 수득하는 것을 특징으로 하는, 전술한 서열번호 59의 폴리펩타이드 또는 서열번호 2의 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한, 동일한 조건 하에, 서열번호 57 서열의 폴리펩타이드로부터 서열번호 1 서열의 폴리펩타이드를 수득하는 것도 가능하다.

서열번호 58 서열의 폴리펩타이드를 제조하는 방법은 폴리펩타이드를 구축하기 위한 신톤으로서 N-α-Fmoc에 의해 보호된 아미노산을 이용한 고상 펩타이드 합성을 기초로 한다.

C-말단 위치에서 글리실 (glycyl) 잔기는 Fmoc-Gly-MPPA-OH 링커의 일부로서 MBHA 수지에 커플링된다. 아미노산의 Fmoc 탈보호 및 아미노산의 커플링으로 구성되는 사이클의 순서로 또 다른 아미노산 잔기들이 조립되어, 수지에 연결된 보호된 폴리펩타이드가 제조된다. 폴리펩타이드의 고상 조립 후, 수지의 폴리펩타이드의 절단 반응 및 폴리펩타이드의 탈보호가, 트리플루오로아세트산 (TFA)/물 혼합물을 이용한 한 단계로 동시에 수행되어, 폴리펩타이드 조산물이 제조되며, 이는 MTBE/헥산 혼합물을 이용해 석출 후 여과 및 건조된다.

서열번호 58 서열의 폴리펩타이드 조산물은, 정제 후, 아세토니트릴/물/아세트산 (AcOH) 혼합물에 용해된다. 정제는 제1 트리플루오로아세트산 (TFA) 용리제를 이용한 다음 아세테이트 용리제를 이용하여 분취용 역상 크로마토그래피에 의해 수행된다. 용액 중의 수득되는 정제된 폴리펩타이드 (아세테이트 염으로서)는 물에 의해 희석 후 농축된다. 여기에 5% 아세토니트릴이 첨가되고, 수득되는 용액은 여과 및 동결건조처리되어, 서열번호 58 서열의 폴리펩타이드가 약제 형태 (medicament form)로 수득된다.

이 방법은 몇가지 이점을 가진다. 수지 상에서 직접 수행되는 실험은 제어하기 더 쉽고, 따라서 더 깔끔하다. 불순물이 적게 생성되어, 몇가지 중간 단계들 (서열번호 70, 서열번호 58 또는 서열번호 57의 폴리펩타이드의 복잡한 정제 등)이 생략된다. 농도, 용매 및 인큐베이션 시간 측면에서 최적화된 실험 조건들은 당해 기술 분야의 당업자들에 의해 결정될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 정의된 방법에 의해 수득되는 서열번호 59 서열의 폴리펩타이드에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 정의된 방법에 의해 수득되는 서열번호 1 서열의 폴리펩타이드에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 정의된 방법에 의해 수득되는 서열번호 2 서열의 폴리펩타이드에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 활성 성분으로서 전술한 바와 같은 폴리펩타이드 및 선택적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 펩타이드 화합물은 약학적 조성물에 또는 약제의 제조에 사용될 수 있다. 이러한 조성물 또는 약제에서, 활성 성분은 다양한 형태, 즉 용액 형태, 일반적으로 수용액 또는 동결건조된 형태, 또는 겔 또는 하이드로겔 형태, 또는 에멀젼 또는 임의의 다른 약제학적으로 및 생리학적으로 허용가능한 형태로 조성물에 통합될 수 있다.

사용되는 투여량은 1 ㎍/kg 내지 1,000 ㎍/kg의 범위일 수 있으며, 사용가능한 투여 경로는 척수내, 척수강내, 뇌실내, 경막외, 뇌실질내, 유리체강내, 경접형동 또는 국소 경로로부터 선택될 수 있다.

피하, 정맥내, 강내 또는 비강내 경로 등의 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 또 다른 투여 경로도 이용될 수 있다. 이러한 투여 경로들 중 한가지를 사용할 경우, 사용되는 투여량은 1 ㎍/kg 내지 50 mg/kg 범위일 수 있다.

이들 약제 또는 조성물은, 특히 신경퇴행성 질환의 치료 및/또는 중추 신경 세포 (뇌, 축수) 또는 말초 신경의 외상 후 재생용으로 의도된다. 신경계 세포의 재생을 위한 이의 사용은 환자에 직접 투여되거나 또는 체외 투여에 의해 실현될 수 있다. 이들 약제 또는 조성물은 특히 알츠하이머 질환, 다발성 경화증, 파킨슨병 또는 임의의 다른 신경퇴행성 병태, 또는 척수 병변, 두부 외상 또는 뇌졸증과 같은 사고 또는 외상 타입의 병태를 치료하는데 이용될 수 있다. 이들 제제 또는 조성물은 또한 청각신경, 시신경, 후각신경, 임의의 뇌신경 또는 말초신경의 병변을 외상, 사고 또는 퇴행성으로 인한 것인지와 상관없이 이들을 치료하는데 사용할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 중추 신경계의 재생이 필요한 신경퇴행성 병태 또는 외상을 치료하는데 사용하기 위한 전술한 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 병변, 외상 또는 비-외상성 말초신경계의 손상을 치료하는데 사용할 수 있다.

다른 유익한 구현예에서, 본 발명은 사고, 외상 또는 퇴행성 타입의 병태, 특히 알츠하이머 질환, 다발성 경화증, 파킨슨병, 뇌졸증, 척수 상해, 두부 외상 또는 청각신경, 시신경, 후각신경, 임의의 뇌신경 또는 말초신경의 손상을 치료하는데 사용하기 위한 전술한 폴리펩타이드에 관한 것이다.

도 1은 서열번호 2 서열의 폴리펩타이드 (A, 배율 X25, B, 배율 X100) 및 서열번호 2 서열의 폴리펩타이드 (C, 배율 X25)의, 0.9% NaCl 중에 농도 29.4 mg/ml인 용액 한 방울을 광 현미경으로 관찰한 것이다.
도 2는 고리화 반응 초기 (T0분) 및 60분 후 (T60분) 인간 알부민 존재 하에 서열번호 2 서열의 폴리펩타이드의 고리화 반응의 크로마토그램을 서열번호 58 서열의 폴리펩타이드의 고리화 반응의 크로마토그램과 겹친 것이다.
도 3은 48시간 후 B104 세포에 대한 서열번호 2 서열의 사이클릭 폴리펩타이드의 효과를 관찰한 광 위상차 현미경 사진 (배율 x 400)이다. 세포를 무-혈청 배지에서 서열번호 2 서열의 사이클릭 폴리펩타이드 1 mg/ml (A) 부재 또는 (B) 존재 하에 2일간 배양한다.
도 4는 72시간 후 B104 세포에 대한 서열번호 2 서열의 사이클릭 폴리펩타이드의 효과를 관찰한 광 위상차 현미경 사진 (배율 x 400)이다. 세포를 무-혈청 배지에서 서열번호 2 서열의 사이클릭 폴리펩타이드 500 ㎍/ml (A) 부재 또는 (B) 존재 하에 3일간 배양한다.
도 5는 세포의 개수에 대한 서열번호 2 서열의 사이클릭 폴리펩타이드의 효과를 정량한 것이다. B104 세포의 평균 수를 배양 1일, 2일 또는 3일 후 분석한다. 값은 평균 ± SEM (n=3)이다. 세포를 무-혈청 배지 (대조군) 또는 서열번호 2 서열의 사이클릭 폴리펩타이드가 1 mg/ml 또는 500 ㎍/ml 농도로 함유된 무-혈청 배지에서 배양한다. 용어 SEM은 평균의 표준 오차이다.
도 6은 신경돌기의 개수에 대한 서열번호 2 서열의 사이클릭 폴리펩타이드의 효과를 정량한 것이다. B104 세포 당 돌기의 평균 수를 배양 1일, 2일 또는 3일 후 분석한다. 값은 평균 ± SEM (n=3)이다. 세포를 무-혈청 배지 (대조군) 또는 서열번호 2 서열의 사이클릭 폴리펩타이드가 1 mg/ml 또는 500 ㎍/ml 농도로 함유된 무-혈청 배지에서 배양한다.
도 7은 신경돌기 길이에 대한 서열번호 2 서열의 사이클릭 폴리펩타이드의 효과를 정량한 것이다. B104 세포 당 신경돌기의 평균 길이를 배양 1일, 2일 또는 3일 후 분석한다. 값은 평균 ± SEM (n=3)이다. 세포를 무-혈청 배지 (대조군) 또는 서열번호 2 서열의 사이클릭 폴리펩타이드가 1 mg/ml 또는 500 ㎍/ml 농도로 함유된 무-혈청 배지에서 배양한다.
도 8은 Basso, Beattie, Bresnahan (BBB) 스케일을 이용한 운동력 평가 결과를 도시한 것이다 (Basso DM et al. Neurotrauma, 12, 1-21, 1995, Basso DM et al. Exp Neurol, 139, 244-256, 1996). 값은 평균 ± SEM이다. BBB 점수는 0 (하지 운동 불능)에서 21 (다리의 협력 및 평행 배치가 가능한 정상적인 걸음) 범위이다.
도 9는 BBB 점수가 14 이상인 랫의 %이다.
도 10은 BBB 점수가 8 이상 및 14 미만인 랫의 %이다.
도 11은 발가락 배치 간격의 반사 활성을 평가한 결과이다. 평가한 점수는 다음과 같다: 0 = 반사 활성 없음, 1 = 정상 보다 매우 약함, 2 = 정상 보다 약간 약함, 3 = 정상.
도 12는 뒷다리 배치 (leg placement)에 대한 평가 결과이다. 평가한 점수는 다음과 같다: 0 = 반사 활성 없음, 1 = 정상 보다 매우 약함, 2 = 정상 보다 약간 약함, 3 = 정상.
도 13은 뒷다리 배치 점수가 3 (정상)인 랫의 %이다.
도 14는 랫의 방광 통제가 회복된 평균 일수를 나타낸 것이다. 값은 평균 ± SEM이다.

실시예:

실시예 1: 시스테인 2개가 이황화 결합을 형성한 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 2)의 폴리펩타이드 합성 방법:

1) 인간 알부민 존재 하에 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 58)의 폴리펩타이드의 산화

합성을 수행하기 위해, 서열번호 58 서열의 폴리펩타이드: 인간 알부민 (HSA)의 비율 1:100, 1:10 및 1:1로, 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 58)의 폴리펩타이드를 여러가지 함량의 알부민과 함께 사용하였다.

서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 58)의 폴리펩타이드를 HSA와 1:1 비율로 HSA 존재 하에 투입하여 실온에서 공기 중에 교반하면서 1-3시간 인큐베이션하였으며, HPLC로 관찰하여, 2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성된 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 2) 폴리펩타이드에 대응되는 피크 형성을 확인하였다. 석출을 통해 알부민을 제거한 다음, 산물을 HPLC에 의해 정제 및 분석하였다. 알부민을, 서열번호 58의 서열에 해당되는 폴리펩타이드와 다른 비율로 사용하여, 고리화 비율과 최종 고리화 수율에 대한 효과를 확인할 수 있게 하였으며, 알부민을 적게 사용할수록 제거하기 더 용이하였다.

2) 선형 폴리펩타이드 (서열번호 58 서열에 해당되는 폴리펩타이드)의 분리 및 사전 정제없이, 서열번호 2 서열에 해당되는 폴리펩타이드를 제조하는 또 다른 방법

서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 58)의 폴리펩타이드는 국제 특허 출원 공개 WO 1999/03890에 기술된 기존 방법과 유사한 방식으로 수지 상에서 합성하며, 이를 수지에서 절단 또는 탈착시키지 않고 진행한다. 이로써 시간과 비용이 소요되고, 분리 후 폴리펩타이드를 정제하여 이를 서열번호 1의 서열에 해당되는 원하는 산물로 이를 산화시키기 위해 용액에 다시 넣는, 2가지 단계를 생략할 수 있다. 알부민의 존재 하에 이루어지는 산화는 수지에 결합된 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 58) 폴리펩타이드를 사용해 직접 수행한다. 정제는 상기 예에 기술된 방법과 유사하며, 단 알부민 분리 단계는 폴리펩타이드가 여전히 수지에 부착된 상태로 단순 헹굼에 의해 제거되기 때문에, 보다 용이하다. 알부민을 제거하면, 폴리펩타이드를 통상적인 방법으로 수지에서 탈착시킬 수 있다.

실시예 2: 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 58)의 폴리펩타이드의 고리화에 대한 알부민 효과, 즉 2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성된 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 2)의 폴리펩타이드로의 변환에 대한 알부민 효과

인간 알부민 (HSA)의 존재 및 부재 하에 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 58)의 폴리펩타이드의 거동을 조사하고, 2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성된 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 2)의 폴리펩타이드를 제조하였다.

그 방법은 다음과 같다:

서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 58)의 폴리펩타이드를 50 ㎍/ml 농도로 포함하는 용액을 PBS 및 5% 글루코스 중에 HSA 2.5 mg/ml 존재 또는 부재 하에 제조하였다.

서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 58) 폴리펩타이드:HSA의 비율은 1:1이며, 즉 동일한 몰수이다.

이들 용액을 혼합하고, Phenomenex Jupiter 300 Å 컬럼을 이용해 HPLC 워터 + 0.1% 트리플루오로아세트산 및 아세토니트릴 + 0.1% 트리플루오로아세트산으로 구성된 용출 용매를 이용한 역상 HPLC에 의해 직접 정제하여, HSA 피크, 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 58)의 폴리펩타이드 및 2개의 시스테인이 이황화 결합된 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 2) 폴리펩타이드를 분리시켰다.

이 과정은 T=0분 및 T=60분에 반복 실시한다.

크로마토그래피 프로파일에서 하기 결과가 관찰되었다:

- 60분에, 알부민 (HSA) 무첨가한 경우, 공기 산화에 의해, 2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성된 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 2)의 폴리펩타이드 피크가 서열번호 58 서열 폴리펩타이드의 오리지날 서열에 비해 9.1% 증가하였다.

- 동일한 조건에서, 알부민을 첨가한 경우, T = 60분에, 2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성된 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 2)의 폴리펩타이드 피크가 서열번호 58의 폴리펩타이드의 출발 피크 보다 38% 증가하였다.

이 결과는 2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성된 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 2)의 폴리펩타이드 형성을 유도하는 서열번호 58의 폴리펩타이드의 고리화에 대한 알부민의 가속 효과를 입증해다.

- 알부민 무첨가한 경우, 60분에, 서열번호 58의 폴리펩타이드 피크의 25%가 2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성된 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 2)의 폴리펩타이드로 변환된다.

- 알부민을 첨가하고 동일한 조건일 경우, 60분에, 서열번호 58의 폴리펩타이드 피크의 54%가 2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성된 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 2) 폴리펩타이드로 변환된다.

이러한 결과는, 알부민의 존재시, 서열번호 2에 해당되는 산물이 공기 중 산화와 비교해 더 많이 생성됨을 보여주며, 이는 알부민에 대한 특이성과 순도를 의미한다.

고찰:

본 실시예에 기술된 2가지 실험들은, 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 58)의 폴리펩타이드로부터 2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성된 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 2)의 폴리펩타이드를 제조하는데, 공기 중 산화와 비교되는, 알부민의 중요한 역할을 입증해준다. 반응은, 공기 중에서 펩타이드/알부민 비율에 따라 실제 2배, 바람직하게는 5배, 더 바람직하게는 10배 더 빠르다. 전술한 실시예에서, 알부민 무첨가시 생성율 9.1% 대 알부민 첨가시 생성율 38%가 관찰되어, 반응이 약 4배 빠르며, 또한 높은 순도에 해당되는 높은 특이성으로 반응이 이루어진다 (알부민 무첨가시 25% 대비 알부민 첨가시 54%). 실제, 60분에, 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 58) 폴리펩타이드의 경우, 알부민 무첨가 시 변형율 25%라는 것은 불순물 생성 가능성 75%라는 것이며, 알부민 첨가시 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 58) 폴리펩타이드의 변형율이 54%라는 것은 불순물이 불과 46%로 생성됨을 의미한다.

실시예 3: 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 58)의 폴리펩타이드에서 2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성된 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 2)의 폴리펩타이드로의 고리화 효율에 작용하는, 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 58) 대 알부민의 비율 효과

실시예 2에서, 등가의 몰비 (동일한 몰비)의 알부민과 폴리펩타이드로 서열번호 58의 폴리펩타이드로부터 서열번호 2의 서열에 해당되는 폴리펩타이드를 더 많이 수득할 수 있으며, 순도가 우수하다는 것이, 입증되었다. 본 실험에서는 여러가지 비율의 알부민 및 폴리펩타이드가 이황화 결합 형성율과 서열번호 2의 폴리펩타이드의 순도에 얼마나 영향을 미치는 지를 기술한다.

서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 58)의 폴리펩타이드를 3가지 함량으로, 일정한 생리학적인 양으로 알부민이 존재하는 동일 부피의 랫 뇌척수액에 넣어 37℃에서 약 1시간 인큐베이션하고, 2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성된 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 58)인 사이클릭 폴리펩타이드의 형성율을 HPLC에 의해 관찰한다. 본 실험에서는 서열번호 58의 선형 폴리펩타이드가 고리화되는 비율에 대해 폴리펩타이드:알부민 비율이 미치는 영향을 Tmax로 측정하여 확인하고자 하였다.

2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성된 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 2)인 사이클릭 폴리펩타이드가 형성되는 시간인 Tmax를 표 1에 나타낸다.

서열번호 58의 폴리펩타이드의 여러가지 첨가량에 따른 비율을 표 1에 열거한다.

표 1: 서열번호 58의 폴리펩타이드:알부민 비율이, 서열번호 2의 폴리펩타이드 중에서 서열번호 58의 폴리펩타이드로 고리화되는 반응의 Tmax에 미치는 효과

	알부민 존재 하에 고리화 반응 실시
서열번호 58의 폴리펩타이드의 첨가량 (mg)	6.00	60	600
폴리펩타이드: 알부민 비율	2:1	20:1	200:1
Tmax (분)	10	30	120

결론: 표 1에 제시된 비율들로 예시되는 바와 같이, 알부민이 고리화 반응의 가속화에 관여함을 입증해주는, 알부민의 촉매 효과가 관찰된다. 실제, 폴리펩타이드의 존재 하에 존재하는 알부민의 매우 적은 양적 차이가 (20:1 및 200:1 비율) 고리화 반응을 가속화할 수 있으며, 따라서 Tmax를 120분에서 30분으로 단축시킬 수 있다.

결론적으로, 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 58)의 폴리펩타이드:알부민 비율과 고리화 속도 간에 상관성이 존재한다. 실제, 폴리펩타이드:알부민의 비율이 낮을 수록 반응은 더 빨라진다. 다시 말해, 폴리펩타이드:알부민이 비율이 1:1에 가까울 수록 반응은 더 빨라진다. 마지막으로, 고리화 반응과 이황화 결합 형성을 가속화하는데에는 소량의 알부민으로도 충분하다 (촉매 효과).

다른 예로, 알부민의 존재 하에 이황화 결합 형성 및 고리화는 극소량의 공기 또는 공기, 즉 산소가 완전히 없는 조건에서 수행될 수 있으며, 이로써 제어되지 않은 산화 반응으로부터 오염성 산물이 형성되는 것을 방지할 수 있다.

실시예 4: 2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성된 서 열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 2)의 사이클릭 폴리펩타이드의 , NaCl 수용액에서의 용해도 검사

서열번호 58 및 서열번호 2의 2종의 폴리펩타이드를 각각 0.5 mg 씩 측정하여 1.5 ml 마이크로 튜브에 넣는다.

W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 58)

(서열번호 2).

미리 준비한 0.9% NaCl 용액 17 ㎕를 각 튜브에 첨가하여, 29.4 mg/ml의 펩타이드 용액을 제조한다. 이들 튜브는 수초간 볼텍싱하고, 수득한 각 폴리펩타이드 용액 1 방울을 광학 현미경 검경을 위해 유리 슬라이드 위에 떨어뜨린다. 이러한 조건에서, 서열번호 2의 폴리펩타이드만 용해되어, 어떠한 가시적인 입자 또는 클러스터는 보이지 않았다 (도 1). 서열번호 58의 폴리펩타이드에서는 다수의 입자가 관찰되었다.

서열번호 58의 폴리펩타이드의 0.9% NaCl 수용액에서의 용해도 한계가 현미경 및 육안 검사를 통해 약 2 mg/ml에서 결정되었다.

서열번호 2의 폴리펩타이드의 경우, 0.9% NaCl 수용액에서의 용해도가 육안 검사를 통해 29 mg/ml 보다 높게 추정되었다.

따라서, 서열번호 2의 폴리펩타이드는 0.9% NaCl 수용액에서의 용해도가 동일 용액에서의 서열번호 58의 폴리펩타이드 보다 적어도 15배 높다.

실시예 5: 2개의 시스테인이 이황화 결합에 의해 연결된 폴리펩타이드 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G는, 효소의 존재 하 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C (서열번호 58)와 비교해 더 높은 용해성을 가진다.

대상 폴리펩타이드를 선형 형태 (서열번호 58) 또는 사이클릭 형태 (서열번호 2)의 정제된 형태로, 네프리라이신 (neprylysine)과 함께 인큐베이션하여, 효소적 분해를 수행하였다. 시간 파라미터 (t=0 및 t=30분)를 물로 1/10로 희석한 효소를 사용해 조사하였다. 효소 첨가하지 않은 소위 "대조군"을 함께 수행하여 조사한 각 파라미터에 대한 분석 기준을 확립하였다.

이들 2가지 형태의 안정성을 경시적으로 유지시키기 위해, 폴리펩타이드를 탈산소수에서 희석하였다. 효소 분해물을 LC/MS/MS 분광측정 기법으로 분석하였다.

결과 (곡선 하 면적 및 분해율)를 표 2에 나타낸다. 해당 폴리펩타이드에 대해 분해율은 동일 폴리펩타이드에 대한 대조군 곡선 하 면역에 대한 효소 존재시의 곡선 하 면적의 %에 해당된다.

표 2: 네프리라이신에 의한 폴리펩타이드 분해를 LC/MS/MS로 분석하여 측정한 곡선 하 면적과, 서열번호 58의 폴리펩타이드 및 서열번호 2의 폴리펩타이드의 분해%

		서열번호 58의 폴리펩타이드	서열번호 2의 폴리펩타이드
T=0분	대조군 곡선 하 면적 (효소 무첨가)	788400	3008000
	효소 존재시 곡선 하 면적	797200	3220000
	분해%	x	x
T=30분	대조군 곡선 하 면적 (효소 무첨가)	802800	3722000
	효소 존재시 곡선 하 면적	576500	3401000
	분해%	28%	8.5%

결론: t=0에, 2종의 폴리펩타이드는 네프리라이신의 존재 시 안정적인 것으로 보인다. t=30분에, 사이클릭 펩타이드 (서열번호 2)는 선형 폴리펩타이드 (서열번호 58) 보다 더 안정적이었다 (분해율 28% 대 8.5%).

실시예 6: 구조 차이가 있는 서열번호 2의 폴리펩타이드 및 서열번호 58의 폴리펩타이드의 해당 2종의 피크 분리

인간 알부민의 존재 하에 서열번호 58의 폴리펩타이드에서 서열번호 2의 폴리펩타이드로의 합성을 수행한다. 이들 화합물에 대해 합성 반응 중에 2번의 HPLC 분석을 수행한다: 1차 T=0분, 2차 T=60분. 수득한 크로마토그램들을 도 2에 겹쳐 도시한다.

화합물을 분리하기 위해 사용한 분석 조건은 다음과 같다:

● 컬럼: XBridge^® C18, 2.1 x 100 mm, 3.5 ㎛

● 이동상: A: 아세토니트릴 + 0.1% TFA (트리플루오로아세트산)

B: 증류수 + 0.1% TFA

● 용출 속도: 0.500 mL/분

● 농도 구배:

시간 (분)	A%	B%
0	10	90
11	25	75
21	10	90

도 2는 서열번호 2의 폴리펩타이드 (사이클릭) 및 서열번호 58의 폴리펩타이드 (선형, 비-사이클릭)에 해당되는 피크들이 쉽게 분리될 수 있음을 보여준다.

실시예 7: 시험관내 약동학적 특성

B104 세포주의 신경모세포종 세포를 75 cm² 플라스크에서 2 mM 글루타민, 50 U/ml 페니실린 G, 50 ㎍/ml 스트렙토마이신 설페이트 및 10% 소 태아 혈청 (FBS)이 첨가된 둘베코의 변형된 이글스 배지 (DMEM) 중에 37℃ 및 5% CO₂ 하에 배양한다. 세포를 폴리-D-라이신 10 ㎍/ml로 코팅된 48웰 플레이트에 최종 세포 밀도 5000개 세포/웰로 접종한다. 배양 4시간 후, 배양 배지를, 서열번호 2의 사이클릭 폴리펩타이드를 1000, 500, 375 또는 150 ㎍/ml 농도로 함유하거나 또는 함유하지 않은, FBS 무첨가 배지로, 200 ㎕/웰 비율로 교체한다. 전체 실험 중에는 배양 배지를 더 이상 교체하지 않는다. 이후, 무혈청 조건이 B104의 분화 개시를 유도하게 될 것이며, 다소간의 주요한 신경돌기의 신장이 이루어질 것이다.

배양시 서열번호 2의 사이클릭 폴리펩타이드의 효과를 정량하기 위해, 그리드 렌즈 (1x1 cm, 1x10 cm²로 분할, x400 배율)를 이용한 위상차 현미경 하에 무작위 선택 필드에서 배양 1, 2 및 3일 후 세포를 관찰한다. 각 웰은 각각의 실험에서 3세트로 계수하며, 웰 당 필드 3개를 조사한다. 분석 파라미터는 세포 수, 세포 당 신경돌기 수 (세포 신장은 적어도 세포 직경 보다 김) 및 제일 긴 신경돌기 10개의 평균 길이이다.

● 이들 조건 하에, 서열번호 2의 사이클릭 펩타이드가 B104 세포의 수에 영향을 미친다는 것이 관찰되었다:

표준 조건 하에, 즉 서열번호 2의 폴리펩타이드의 부재시, 혈청 무첨가 및 배양 배지 고갈로 인해 세포 수가 감소되기 시작한 지 48시간 동안 B104 세포의 증식은 증가한다. 그러나, 서열번호 2의 사이클릭 폴리펩타이드의 존재 시, 세포의 수는 대조군 조건과 비교해 5배 이상 24시간부터 증가한다.

B104 세포의 증식 예는 도 2, 3, 4 및 5에 도시한다.

● 서열번호 2의 사이클릭 폴리펩타이드는 B104 세포의 형태에 영향을 미친다:

B104 세포는 혈청 하에 배양하면 섬유모세포 형태를 가지며, 혈청 무첨가 조건에서 배양하였을 때에는 신경 분화로 진행된다. 24시간에, 무혈청 배양시, 분화 인자의 존재 또는 부재와 무관하게, B104 세포는 단극성 또는 양극성 확장 (mono 또는 bipolar expansion)과 축삭 발아 (sprouting) (세포 본체의 직경 보다 짧은 길이로 소폭 신장) 및 신경돌기 (적어도 세포 본체 크기로 세포 신장)를 나타내며, 즉, 이들 상황의 전형적인 형태를 나타낸다 (Schubert D et al., Nature 249 (454), 224-227 1974).

서열번호 2의 사이클릭 폴리펩타이드는 어떤 농도에서도 발아한 축삭 수에 영향을 미치지 않는다. 그러나, 서열번호 2의 사이클릭 폴리펩타이드는 세포 당 신경돌기의 수 (도 6) 및 길이 (도 7)를 증가시킨다.

배양 3일 후, 처리된 B104는 배양 시간 경과에 따라 길어진 현저한 신경돌기 신장을 나타낸다. 신경돌기 길이에 대한 효과는 농도-의존적인 것으로 보인다.

실시예 8: 생체내 약동학적 특성 - 수질부 병변 ( medullary lesion) 모델에 대한 평가

인간에서 관찰되는 척수 손상을 모방하기 위해 좌상 모델을 인지하여 활용한다 (Young W., Prog Brain Res., 137, 231-55, 2002).

이 모델을 이용해, 기능 회복에 대한 활성 물질의 효능을 조사한다. 실험은 약 250 g의 암컷 스프레그-다울리 암컷 랫을 대상으로 수행하였다. 외과적 시술은 5% 이소플루란으로 전신 마취하여 수행한다 (70% N₂O 및 30% O₂, 주입 속도 300 ml/min).

흉추 T9 및 T10에서 척추후궁절제술을 수행한 후, 캘리브레이션된 좌상 (깊이 2 mm, 충격기 직경 2 mm, 임팩터 (impactor) 직경 2 mm, 이동 속도 85 ms 간 1.5 m/s)을 만들기 위해 전기자극 기구 (PinPoint system, Hatteras Inc., USA)를 이용해 척수 손상을 야기한다 (Bilgen M. Neurorehab et al., 19(3), 2005).

외상 발생 후 15분 이내에, 7 ㎍/ml 농도호 서열번호 2의 사이클릭 폴리펩타이드 3 ㎕ 또는 비히클을 해밀톤 주사기 (10 pi, model 1701)와 마이크로-주입 시스템 (Harvard Apparatus)을 사용해 주입하여, 척추 공간내로 주입시킨다. 주입 후, 바늘은 5분간 그대로 둔다. 바늘을 제거한 후 즉시 세포 접착제를 주사 부위에 적용하여 dura를 실링하고, 생체 유체가 누출되지 않게 한다. 봉합 후, 랫을 표준 케이지 안에 각각 넣고, 22℃ ± 1℃의 온도에서 빛 조절 하에 (12시간/일), 물과 사료를 자유롭게 섭취가능하게 둔다. 2차 주사는 2일 후에 수행한다. 맹검 방식으로 동물 각각에서 거동 검사를 수행한다.

운동력은 Basso, Beattie, Bresnahan (BBB) 스케일을 이용해 평가한다 (Bassa DM et al., J. Neurotrauma, 12, 1-21, 1995, Basso DM et al., Exp Neurol, 139, 244-256, 1996).

각 동물은 외상 전과 이후 주당 1회로 검사한다. 동일 시기에, 각 동물을 외상 전과 이후 주당 1회로 체중을 측정한다.

운동 평가 스케일에서: BBB 점수, 즉 통계 데이타는 평균 ± SEM으로 나타낸다.

BBB 점수는 0 (하지 운동 불능) - 21 (다리의 협력 및 평행 이동을 수반한 정상적인 걸음)의 범위이다. 점수 0 - 7은 뒷다리 3곳 (발목, 무릎, 엉덩이)의 독립적인 움직임 (isolated movement)이 회복되는 것을 의미하며, 8 - 13은 뒷다리 배치와 앞다리와의 협력이 회복되는 것을 의미하고, 14 - 21은 발가락 간격, 다리와 꼬리의 자세 및 몸통의 안정성이 회복되는 것을 의미한다.

BBB 점수 평가는 상해 전과 치료 후 1일, 7일, 14일, 21일 및 28일에 2명의 독립적인 관찰자에 의해 수행한다 (도 8, 9, 10).

발가락 간격 배치의 반사 활성 (도 11) 및 뒷다리 배치 (도 12 및 13)를 처리 후 1일, 7일, 14일, 21일 및 28일에 분석한다. 평가한 점수는 다음과 같다: 0 = 반사 활성 없음, 1 = 정상 보다 매우 약함, 2 = 정상 보다 약간 약함, 3 = 정상.

방광 통제력이 회복된 날도 파라미터로서 측정한다 (도 14).

SEQUENCE LISTING <110> Neuronax <120> POLYPEPTIDES CYCLIQUES, LEUR PROCEDE D'OBTENTION ET LEUR APPLICATION EN THERAPEUTIQUE <130> IFB 15 BR NEU N218 <150> FR15/59084 <151> 2015-09-25 <160> 70 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa = Ser or Gly <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa = Ser or Gly <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa = Ser or Gly <220> <221> DISULFID <222> (7)..(10) <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa = Arg-Ser or Val-Ser or Val-Thr <400> 1 Trp Ser Xaa Trp Xaa Xaa Cys Ser Xaa Cys Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 2 Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa = a hydrogen atom or Pro or Ala-Pro or Leu-Ala-Pro or Val-Leu-Ala-Pro <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa = Ser or Gly <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa = Ser or Gly <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa = Ser or Gly <220> <221> DISULFID <222> (8)..(11) <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa = Arg-Ser or Val-Ser or Val-Thr <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa = a hydrogen atom or Leu or Leu-Gly or Leu-Gly-Leu or Leu-Gly-Leu-Ile or Leu-Gly-Leu-Ile-Phe <400> 3 Xaa Trp Ser Xaa Trp Xaa Xaa Cys Ser Xaa Cys Gly Xaa 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 4 Trp Ser Ser Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 5 Trp Ser Ser Trp Ser Gly Cys Ser Arg Ser Cys Gly 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 6 Trp Ser Ser Trp Gly Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 7 Trp Ser Ser Trp Gly Gly Cys Ser Arg Ser Cys Gly 1 5 10 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = a hydrogen atom or an amino acid chain with 0 to 4 amino acids <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = Ser or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = Ser or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa = Ser or Gly <220> <221> DISULFID <222> (8)..(11) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa = Arg-Ser or Val-Ser or Val-Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa = a hydrogen atom or an amino acid chain with 0 to 5 amino acids <400> 8 Xaa Trp Ser Xaa Trp Xaa Xaa Cys Ser Xaa Cys Gly Xaa 1 5 10 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 9 Trp Ser Gly Trp Ser Gly Cys Ser Arg Ser Cys Gly 1 5 10 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 10 Trp Ser Gly Trp Gly Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly 1 5 10 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 11 Trp Ser Gly Trp Gly Gly Cys Ser Arg Ser Cys Gly 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 12 Trp Ser Ser Trp Ser Ser Cys Ser Val Ser Cys Gly 1 5 10 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 13 Trp Ser Ser Trp Ser Gly Cys Ser Val Ser Cys Gly 1 5 10 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 14 Trp Ser Ser Trp Gly Ser Cys Ser Val Ser Cys Gly 1 5 10 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 15 Trp Ser Ser Trp Gly Gly Cys Ser Val Ser Cys Gly 1 5 10 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 16 Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Val Ser Cys Gly 1 5 10 <210> 17 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 17 Trp Ser Gly Trp Ser Gly Cys Ser Val Ser Cys Gly 1 5 10 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 18 Trp Ser Gly Trp Gly Ser Cys Ser Val Ser Cys Gly 1 5 10 <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 19 Trp Ser Gly Trp Gly Gly Cys Ser Val Ser Cys Gly 1 5 10 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 20 Trp Ser Ser Trp Ser Ser Cys Ser Val Thr Cys Gly 1 5 10 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 21 Trp Ser Ser Trp Ser Gly Cys Ser Val Thr Cys Gly 1 5 10 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 22 Trp Ser Ser Trp Gly Ser Cys Ser Val Thr Cys Gly 1 5 10 <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence 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sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (8)..(12) <400> 28 Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly 1 5 10 <210> 29 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (9)..(13) <400> 29 Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly 1 5 10 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (10)..(14) <400> 30 Leu Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly 1 5 10 15 <210> 31 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (11)..(15) <400> 31 Val Leu Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly 1 5 10 15 <210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 32 Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu 1 5 10 <210> 33 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 33 Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu Gly 1 5 10 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 34 Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu Gly Leu 1 5 10 15 <210> 35 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 35 Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu Gly Leu Ile 1 5 10 15 <210> 36 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 36 Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu Gly Leu Ile 1 5 10 15 Phe <210> 37 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (8)..(12) <400> 37 Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu 1 5 10 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (8)..(12) <400> 38 Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu Gly 1 5 10 15 <210> 39 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (8)..(12) <400> 39 Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu Gly Leu 1 5 10 15 <210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (8)..(12) <400> 40 Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu Gly Leu 1 5 10 15 Ile <210> 41 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (8)..(12) <400> 41 Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu Gly Leu 1 5 10 15 Ile Phe <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (9)..(13) <400> 42 Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu 1 5 10 15 <210> 43 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (9)..(13) <400> 43 Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu Gly 1 5 10 15 <210> 44 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (9)..(13) <400> 44 Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu Gly 1 5 10 15 Leu <210> 45 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (9)..(13) <400> 45 Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu Gly 1 5 10 15 Leu Ile <210> 46 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (9)..(13) <400> 46 Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu Gly 1 5 10 15 Leu Ile Phe <210> 47 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (10)..(14) <400> 47 Leu Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu 1 5 10 15 <210> 48 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (10)..(14) <400> 48 Leu Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu 1 5 10 15 Gly <210> 49 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (10)..(14) <400> 49 Leu Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu 1 5 10 15 Gly Leu <210> 50 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (10)..(14) <400> 50 Leu Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu 1 5 10 15 Gly Leu Ile <210> 51 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (10)..(14) <400> 51 Leu Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu 1 5 10 15 Gly Leu Ile Phe 20 <210> 52 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (11)..(15) <400> 52 Val Leu Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly 1 5 10 15 Leu <210> 53 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (11)..(15) <400> 53 Val Leu Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly 1 5 10 15 Leu Gly <210> 54 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (11)..(15) <400> 54 Val Leu Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly 1 5 10 15 Leu Gly Leu <210> 55 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (11)..(15) <400> 55 Val Leu Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly 1 5 10 15 Leu Gly Leu Ile 20 <210> 56 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (11)..(15) <400> 56 Val Leu Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly 1 5 10 15 Leu Gly Leu Ile Phe 20 <210> 57 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa = Ser or Gly <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa = Ser or Gly <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa = Ser or Gly <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa = Arg-Ser or Val-Ser or Val-Thr <400> 57 Trp Ser Xaa Trp Xaa Xaa Cys Ser Xaa Cys Gly 1 5 10 <210> 58 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly 1 5 10 <210> 59 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = Ser or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = Ser or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = Ser or Gly <220> <221> DISULFID <222> (7)..(10) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa = Arg-Ser or Val-Ser or Val-Thr or Arg-Thr <400> 59 Trp Ser Xaa Trp Xaa Xaa Cys Ser Xaa Cys Gly 1 5 10 <210> 60 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 60 Trp Ser Ser Trp Ser Ser Cys Ser Arg Thr Cys Gly 1 5 10 <210> 61 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 61 Trp Ser Ser Trp Ser Gly Cys Ser Arg Thr Cys Gly 1 5 10 <210> 62 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 62 Trp Ser Ser Trp Gly Ser Cys Ser Arg Thr Cys Gly 1 5 10 <210> 63 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 63 Trp Ser Ser Trp Gly Gly Cys Ser Arg Thr Cys Gly 1 5 10 <210> 64 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 64 Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Thr Cys Gly 1 5 10 <210> 65 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 65 Trp Ser Gly Trp Ser Gly Cys Ser Arg Thr Cys Gly 1 5 10 <210> 66 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 66 Trp Ser Gly Trp Gly Ser Cys Ser Arg Thr Cys Gly 1 5 10 <210> 67 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> DISULFID <222> (7)..(11) <400> 67 Trp Ser Gly Trp Gly Gly Cys Ser Arg Thr Cys Gly 1 5 10 <210> 68 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = a hydrogen atom or an amino acid chain with 0 to 4 amino acids <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = Ser or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = Ser or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa = Ser or Gly <220> <221> DISULFID <222> (8)..(11) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa = Arg-Ser or Val-Ser or Val-Thr or Arg-Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa = a hydrogen atom or an amino acid chain with 0 to 5 amino acids <400> 68 Xaa Trp Ser Xaa Trp Xaa Xaa Cys Ser Xaa Cys Gly Xaa 1 5 10 <210> 69 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> fragment of the human SCO-spondin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = a hydrogen atom or Pro or Ala-Pro or Leu-Ala-Pro or Val-Leu-Ala-Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = Ser or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = Ser or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa = Ser or Gly <220> <221> DISULFID <222> (8)..(11) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa = Arg-Ser or Val-Ser or Val-Thr or Arg-Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa = a hydrogen atom or Leu or Leu-Gly or Leu-Gly-Leu or Leu-Gly-Leu-Ile or Leu-Gly-Leu-Ile-Phe <400> 69 Xaa Trp Ser Xaa Trp Xaa Xaa Cys Ser Xaa Cys Gly Xaa 1 5 10 <210> 70 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = Ser or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = Ser or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = Ser or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa = Arg-Ser or Val-Ser or Val-Thr or Arg-Thr <400> 70 Trp Ser Xaa Trp Xaa Xaa Cys Ser Xaa Cys Gly 1 5 10

Claims

하기 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로서,
상기 폴리펩타이드에는 폴리펩타이드의 환원된 형태 또는 폴리펩타이드의 이량체 또는 올리고머 형태 뿐만 아니라 티올 기가 설폭사이드 또는 설폰 형태인 폴리펩타이드의 유도체가 실질적으로 존재하지 않는, 폴리펩타이드:
W-S-X1-W-X2-X3-C-S-X4-C-G (서열번호 59)
상기 서열에서,
X1, X2 및 X3는 서로 독립적으로 S 또는 G이고,
X4는 R-S 또는 V-S 또는 V-T 또는 R-T이고,
2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성됨.
제1항에 있어서,
하기 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드:
W-S-X1-W-X2-X3-C-S-X4-C-G (서열번호 1)
상기 서열에서,
X1, X2 및 X3는 제1항에 따라 정의되며,
X4는 R-S 또는 V-S 또는 V-T이고,
2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성됨.
제1항에 있어서,
2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성된 하기 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드:
W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 2).
제1항에 있어서,
하기 아미노산 서열로 구성되는, 폴리펩타이드:
X5-W-S-X1-W-X2-X3-C-S-X4-C-G-X6 (서열번호 69)
상기 서열에서,
X1, X2 및 X3는 서로 독립적으로 S 또는 G이고,
X4는 R-S 또는 V-S 또는 V-T 또는 R-T이고,
2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성되어 있으며,
X5는 수소 원자 또는 P 또는 A-P 또는 L-A-P 또는 V-L-A-P이고, 및
X6는 수소 원자 또는 L 또는 L-G 또는 L-G-L 또는 L-G-L-I 또는 L-G-L-I-F임.
제1항에 있어서,
2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성된 하기 아미노산 서열로 구성되며,
상기 폴리펩타이드에는 폴리펩타이드의 환원된 형태 또는 폴리펩타이드의 이량체 또는 올리고머 형태 뿐만 아니라 티올 기가 설폭사이드 또는 설폰 형태인 폴리펩타이드의 유도체가 실질적으로 존재하지 않는, 폴리펩타이드:
W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 2).
제1항에 있어서,
하기 아미노산 서열로 구성되며,
상기 폴리펩타이드는 >80%, 바람직하게는 >85%, 더 바람직하게는 >90%, 보다 더 바람직하게는 95% 이상의 순도를 가지는, 폴리펩타이드:
W-S-X1-W-X2-X3-C-S-X4-C-G (서열번호 59)
상기 서열에서,
X1, X2, X3 및 X4는 제1항에 따라 정의되며, 2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성됨.
제5항에 있어서,
하기 아미노산 서열로 구성되며,
상기 폴리펩타이드는 >80%, 바람직하게는 >85%, 더 바람직하게는 >90%, 보다 더 바람직하게는 95% 이상의 순도를 가지는, 폴리펩타이드:
W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 2)
상기 서열에서, 2개의 시스테인은 이황화 결합을 형성함.
서열번호 59의 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드를 수득하는 방법으로서,
알부민의 존재 하에 서열번호 70의 폴리펩타이드내에 이황화 결합을 형성하는 단계를 포함하며,
상기 서열번호 70의 폴리펩타이드가 용액 중에, 바람직하게는 수용액 중에 존재하는, 방법:
W-S-X1-W-X2-X3-C-S-X4-C-G (서열번호 59)
상기 서열번호 59에서,
X1, X2 및 X3는 서로 독립적으로 S 또는 G이고,
X4는 R-S 또는 V-S 또는 V-T 또는 R-T임,
W-S-X1-W-X2-X3-C-S-X4-C-G (서열번호 70),
상기 서열번호 70에서, X1, X2, X3 및 X4는 제1항에 따라 정의됨.
서열번호 2의 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드를 수득하는 방법으로서,
알부민의 존재 하에 서열번호 58의 폴리펩타이드내에 이황화 결합을 형성하는 단계를 포함하는, 방법:
W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 2)
상기 서열번호 2에서, 2개의 시스테인 간에 이황화 결합이 형성됨,
W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 58).
제8항 또는 제9항에 있어서,
상기 알부민 및 서열번호 70의 폴리펩타이드 또는 알부민 및 서열번호 58의 폴리펩타이드가 1:1 내지 1:100, 바람직하게는 1:1 내지 1:10, 더 바람직하게는 1:1의 비율로 존재하는, 방법.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 알부민의 존재 하에 상기 서열번호 70의 폴리펩타이드 또는 상기 서열번호 58의 폴리펩타이드내에 이황화 결합을 형성하는 단계가 주위 공기 중에서 수행되는, 방법
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 알부민의 존재 하에 상기 서열번호 70의 폴리펩타이드 또는 상기 서열번호 58의 폴리펩타이드내에 이황화 결합을 형성하는 단계가, 서열번호 70의 서열의 폴리펩타이드 또는 서열번호 58의 서열의 폴리펩타이드가 펩타이드 합성시 사용되는 수지로부터 탈착되지 않은 상태로 수행되며, 이후 이황화 결합 단계를 거친 다음 상기 수지로부터 폴리펩타이드를 분리시킴으로써 서열번호 59의 폴리펩타이드 서열 또는 서열번호 2의 폴리펩타이드를 수득하는 것인, 방법.
활성 성분으로서 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 및 선택적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 약학적 조성물.
중추 신경계의 재생이 요구되는 신경퇴행성 병태 또는 외상의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드.
알츠하이머 질환, 다발성 경화증, 파킨슨 질환, 병변, 두부 외상 또는 시신경 병변, 후각신경 병변, 청신경 병변, 뇌신경 병변 또는 말초신경 병변을 비롯하여 사고, 외상 또는 퇴행 타입의 병태를 치료하는데 사용하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드.