KR102398968B1

KR102398968B1 - 조혈 줄기세포의 가동을 위한 물질-p의 배합 요법

Info

Publication number: KR102398968B1
Application number: KR1020200086108A
Authority: KR
Inventors: 손영숙; 홍현숙; 박정섭
Original assignee: (주) 엘피스셀테라퓨틱스
Priority date: 2020-07-13
Filing date: 2020-07-13
Publication date: 2022-05-17
Also published as: JP2023534466A; KR20220008041A; EP4180054A1; CN116056696A; US20230248799A1; WO2022014985A1

Abstract

본 발명은 물질-P 및 AMD3100 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 혈중 대량의 조혈 줄기세포 가동화를 위한 배합 요법(combination therapy) 및 배합 제품(combination product); 물질-P 및 AMD3100 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 순차적으로 투여한 개체로부터 수득한 말초 혈액으로부터 가동화 조혈 줄기세포를 포함하는 혈액 분획을 분리하는 단계를 포함하는, 대량의 가동화 조혈 줄기세포를 수집하는 방법; 및 물질-P 및 AMD3100 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 배합물의 혈중 대량의 조혈 줄기세포 가동화용 용도에 관한 것이다.

Description

조혈 줄기세포의 가동을 위한 물질-P의 배합 요법{Combination therapy of Substance P for hematopoietic stem cell mobilization}

골수로부터 말초 혈액으로 동원 또는 이동된(migrated) 조혈 줄기세포(hematopoietic stem cell, HSC)를 혈액 질환을 앓고 있는 환자 내로 이식하는 것은 전통적인 골수 이식을 대체하였다. 골수로부터 말초 혈액으로의 조혈 줄기세포의 동원을 위한 일부 임상적 실시는 CXCR4/SDF-1 상호작용을 절단하는 프로테아제의 생성을 자극하는 것으로 생각되는 재조합 과립구-콜로니 자극 인자(Granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)의 최소 5일 연속의 투여 요법으로 달성된다. 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)는 호중성 과립구(neutrophil granulocyte) 프로제니터 세포 및 성숙 호중구(mature neutrophils)의 생존, 증식, 분화 및 기능을 자극하는 당단백질이다.

그러나 G-CSF는 규모가 큰 환자 코호트에서 비효과적이고 여러 부작용들, 예컨대, 골 통증, 비장 확장 및 드물게 비장 파열, 심근 경색 및 뇌혈관 질환과 관련되는 것으로 보고되고 있다. 또한 G-CSF는 강한 염증 반응 유도가 확인되었고, 줄기세포 이외에도 여러 종류의 혈액세포의 말초혈액으로 동원을 유도하므로, 장기간 투여시 혈전성 합병증의 위험성이 있는 것으로 보고되고 있다. 특히, G-CSF는 최소 5일 연속의 피하 주사가 필요한데, 이 과정 동안 환자의 대퇴부 통증이 동반되어 임상 시 사용에 주의가 필요하다. 또한 G-CSF의 주요 기전은 호중구(neutrophil) 생성의 촉진으로서, 호중구 감소증(neutrophenia)의 치료가 주요 타겟이다.

G-CSF의 상기 고유의 단점들은 소분자에 기초한 대안적 동원 방법을 확인하고자 하는 노력을 이끌어내었다. 예를 들면, FDA에 의해 승인된 CXCR4 길항제 AMD3100(플레릭사포르(Plerixafor); Mozobil^TM)은 제한된 독성 문제를 가지면서 조혈 줄기세포를 신속히 동원하는 것으로 알려져 있다. 그러나 AMD3100을 사용한 임상적 동원은 G-CSF와 병용될 때에만 효과적인 것으로 밝혀졌다. 현재 임상에서 G-CSF와 ADM3100 병용 요법의 용법/용량은 G-CSF를 피하 주사로 1일 1회 연속 5일 주사하고, 마지막 주사 후 대략 4-6시간 후 AMD3100을 복강 내 주사하고, AMD3100 투여 후 1시간째에 혈액을 수집하는데(apheresis), 이때 말초 혈액으로의 조혈 줄기세포의 이동이 최대인 것으로 알려져 있다.

그러나 G-CSF와 ADM3100 병용 요법은 환자간의 반응이 매우 다르고, 혈중 조혈 줄기세포 수준에 변화가 없는 환자(non-responder)가 존재하는 것으로 알려져 있다. 또한 임상적으로 G-CSF가 가장 광범위하게 사용되는 동원제(migrator)일지라도, 그의 단점은 잠재적으로 독성 부작용, 강한 염증 반응 유도, 상대적으로 긴 치료 과정(5일 내지 7일의 연속 주사) 및 환자의 가변적인 반응을 추가로 포함한다.

따라서 신속하고 선택적이며 G-CSF 독립적인 동원 방식에 대한 검색은 임상적 관심의 주제로 남아있다. 현재 G-CSF를 대체하는 동원제의 연구 개발이 진행중이다.

Shun He 등은 뮤린에서 FLT3 리간드(FLT3L)와 AMD3100의 병용 투여가 조혈 줄기세포의 동원을 증가시키는 것으로 보고하고 있다(Biol Blood Marrow Transplant. "FLT3L and Plerixafor Combination Increases Hematopoietic Stem Cell Mobilization and Leads to Improved Transplantation Outcome", 2014 March; 20(3): 309-313).

또한 MP Rettig 등은 인테그린 α₄β₁ (very late antigen 4 (VLA-4)) 저해제와 CXCR4 저해제를 병용 투여하여 조혈 줄기세포(HSC) 및 조혈 전구세포(HSPC)를 동원시키는 방법에 대해 개시하고 있으며, 특히 뮤린에서 VLA-4 길항제인 BIO5192와 AMD3100의 병용 투여가 조혈 전구세포(HPSC) 동원에 상가 효과를 나타내는 것으로 보고하고 있다(Leukemia, "Mobilization of hematopoietic stem and progenitor cells using inhibitors of CXCR4 and VLA-4", 2012; 26; 34-53).

또한 Kasia Mierzejewska 등은 마우스에서 페닐하이드라진(PHZ)과 CXCR4 저해제인 AMD3100의 병용 투여가 조혈 줄기세포의 동원을 증가시키는 것으로 보고하고 있다(Hindawi Publishing Corporation, BioMed Research International, "Sphingosine-1-phosphate-Mediated Mobilization of Hematopoietic Stem/Progenitor Cells during Intravascular Hemolysis Requires Attenuation of SDF-1-CXCR4 Retention Signaling in Bone Marrow", Volume 2013, Article ID 814549, 5 pages).

또한 대한민국특허공개 제10-2017-0105514호는 α₉ (알파 9) 인테그린 길항제 및 CXCR4 길항제를 사용한 HSC의 이탈 및 방출 방법에 관해 개시하고 있다.

그러나 이러한 G-CSF를 대체하는 동원제에 관한 연구 개발에도 불구하고, 현재 G-CSF와 AMD3100의 병용 투여만이 유일하게 표준 치료법으로 인정되고 있는 실정이다.

한편, 물질-P (substance P)는 감각 뉴우런, 대식세포, 호산구, 내피세포와, 상피세포 및 케라토사이트와 같은 각막 세포, 및 육아조직에서 발현되는 11개의 아미노산으로 이루어진 뉴로펩티드이다. 물질-P가 조혈 조절에 대한 신경-면역 커뮤니케이션에 관여하고 있음이 몇몇 보고서에서 제안된 바 있다. 물질-P 신경의 신경 섬유가 골수 기질에 분포하고 있으며, 물질-P는 골수 기질세포의 표면 수용체 NK-1을 통해 신호를 전달하여 골수 기질세포를 자극함으로써, 골수 기질세포가 공급자로서 조혈 촉진에 유리한 줄기세포 인자 및 인터류킨-1을 생산하도록 한다.

본 발명자들은 앞선 연구에서 물질-P의 중배엽 줄기세포(mesenchymal stem cell) 이동 및 중배엽 줄기세포의 재증식(repopulation)에서의 역할과 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-593397호에서 물질-P의 상처 치유 또는 상처 치유 촉진제로서의 용도, 물질-P의 중배엽 줄기세포 유리 또는 유리촉진제로서의 용도, 물질-P의 중배엽 줄기세포 증식 또는 증식 촉진제로서의 용도, 및 이를 통한 상처 치유 또는 상처 치유 촉진제로서의 용도를 밝힌 바 있다.

그러나 지금까지 물질-P와 AMD3100의 병용 요법에 대해서는 알려진 바가 없다.

본 발명자들은 혈중 조혈 줄기세포의 동원을 위한 기존의 G-CSF와 ADM3100 병용 요법에 있어서, G-CSF가 상대적으로 긴 치료 과정(5일 내지 7일의 연속 주사)을 필요로 하고, 또한 강한 염증 반응을 유도하는 부작용이 있어, 이를 대체할 수 있는 병용 요법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명자들은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 연구하였으며, 그 결과 G-CSF 대신 물질-P를 AMD3100과 병용할 경우, 물질-P의 1회 정맥 주사만으로도 조혈 줄기세포를 말초 혈액으로 가동시키는 동일한 효과를 나타내며, 물질-P는 G-CSF가 보유한 강력한 호중구 동원제(neutrophil mobilizer)의 기능이 없어 염증 반응의 부작용이 훨씬 적을 뿐만 아니라, 기존의 G-CSF와 ADM3100 병용 요법에 비하여 조혈 줄기세포를 혈중으로 더 많이 대량으로 가동할 수 있음을 발견하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 목적은 물질-P 및 AMD3100 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 혈중 대량의 조혈 줄기세포 가동화를 위한 배합 요법(combined therapy)을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 물질-P 및 AMD3100 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 혈중 대량의 조혈 줄기세포 가동화를 위한 배합 제품(combination product)을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 물질-P 및 AMD3100 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 순차적으로 투여한 개체로부터 수득한 말초 혈액으로부터 가동화 조혈 줄기세포를 포함하는 혈액 분획을 분리하는 단계를 포함하는, 대량의 가동화 조혈 줄기세포를 수집하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 물질-P 및 AMD3100 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 배합물의 혈중 대량의 조혈 줄기세포 가동화용 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 물질-P 및 AMD3100 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 배합 요법은, 물질-P의 1회 정맥 주사만으로도 조혈 줄기세포를 말초 혈액으로 가동시킬 수 있어 5일 내지 7일의 연속 주사의 긴 치료 과정을 필요로 하는 기존의 G-CSF와 ADM3100 병용 요법에 비하여 환자의 치료 부담(burden)을 현저하게 감소시키고, 물질-P는 G-CSF가 보유한 강력한 호중구 동원제(neutrophil mobilizer)의 기능이 없어 염증 반응의 부작용이 훨씬 적을 뿐만 아니라, 기존의 G-CSF와 ADM3100 병용 요법에 비하여 조혈 줄기세포를 혈중으로 더 많이 대량으로 가동할 수 있다. 또한 본 발명의 수집 방법에 의하여 수집된 혈액 분획은 대량의 가동화 조혈 줄기세포를 포함하고 있는바, 혈액 질환을 앓고 있는 환자에 이식되거나 또는 다시 주입되어 조혈 줄기세포가 필요한 각종 질환의 예방 또는 치료 목적으로 사용될 수 있다.

도 1은 물질-P (SP) 및 G-CSF를 각각 래빗에 정맥 주사한 후 동일 동물에서 3일간 혈액 내 조혈 줄기세포의 수준을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 물질-P (SP) 및 G-CSF를 각각 래빗에 정맥 주사한 후 동일 동물에서 3일간 혈액 내 면역세포 비율을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다(neutrophil: 호중구, monocyte: 단핵구, lymphocyte: 림프구, B+E (basophil + eosinophil): 호염기구 + 호산구).
도 3은 기존의 G-CSF와 ADM3100 병용 요법의 투여 스케줄 및 본 발명의 물질-P와 AMD3100 병용 요법의 투여 스케줄을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 4는 기존의 G-CSF와 ADM3100 병용 요법의 투여 스케줄 및 본 발명의 물질-P와 AMD3100 병용 요법의 투여 스케줄에 따라 각각 마우스에 투여한 후 수집한 혈액 내 조혈 줄기세포의 수준을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명자들은 G-CSF 대신 물질-P를 AMD3100과 병용할 경우, 물질-P의 1회 정맥 주사만으로도 조혈 줄기세포를 말초 혈액으로 가동시키는 동일한 효과를 나타내며, 물질-P는 G-CSF가 보유한 강력한 호중구 동원제(neutrophil mobilizer)의 기능이 없어 염증 반응의 부작용이 훨씬 적을 뿐만 아니라, 기존의 G-CSF와 ADM3100 병용 요법에 비하여 조혈 줄기세포를 혈중으로 더 많이 대량으로 가동할 수 있음을 발견하였다.

이에, 본 발명은 물질-P 및 AMD3100 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 혈중 대량의 조혈 줄기세포 가동화를 위한 배합 요법(combined therapy)을 제공한다.

본 발명은 또한 물질-P 및 AMD3100 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 혈중 대량의 조혈 줄기세포 가동화를 위한 배합 제품(combination product)을 제공한다.

본 발명은 또한 물질-P 및 AMD3100 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 순차적으로 투여한 개체로부터 수득한 말초 혈액으로부터 가동화 조혈 줄기세포를 포함하는 혈액 분획을 분리하는 단계를 포함하는, 대량의 가동화 조혈 줄기세포를 수집하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 물질-P 및 AMD3100 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 배합물의 혈중 대량의 조혈 줄기세포 가동화용 용도를 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "물질 P(substance P)"는 "물질-P" 또는 "SP"와 동일한 의미로 사용된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "조혈 줄기세포(hematopoietic stem cell)"는 "조혈 모세포" 또는 "조혈 줄기세포 및 전구세포(hematopoietic stem and progenitor cell)"와 동일한 의미로 사용된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "동원(migration)", "이동(migration)" 및 "가동(mobilization)"은 모두 동일한 의미로 사용된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "배합 요법(combined therapy)"은 "배합물 또는 조합물(combination)" 과 동일한 의미로 사용된다. "배합 요법"은 2개 이상의 약물을 같이 사용한다는 의미일 뿐 2개 이상의 약물이 반드시 혼합된 상태(composition)를 의미하는 것이 아니며, 2개 이상의 약물이 각각 별개의 제제로 사용되어도 무방한 경우를 의미한다. 따라서 "배합 요법"은 2개 이상의 약물의 각각 별개의 제제를 포함하므로, 2개 이상의 약물의 동시, 별개 또는 순차적 투여가 가능하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "배합 제품(combination product)"은 상기 "배합 요법(combination therapy)"의 완제품(finished product)의 형태를 의미한다. 예를 들어, 약물이 2개 이상인 경우 배합 제품은 이들 약물을 배합물의 형태로 포함하는 완제품을 의미한다. 2개 이상의 약물은 완제품 내에 단일 제제로 포장되어 동시에 투여될 수도 있고, 또는 완제품 내에 2개의 별개의 제제로 포장되어 동시에, 별개로 또는 순차적으로도 투여될 수도 있다. 이러한 완제품의 예로는 "키트(kit-of-parts)"를 들 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "개체"는 본 발명의 대량의 가동화 조혈 줄기세포를 수집하는 방법에 적용할 수 있는 동물로, 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 포유동물이며, 예컨대 인간, 원숭이, 개, 고양이, 염소, 돼지, 쥐, 기니아피그, 햄스터, 침팬지 또는 고릴라 등 모든 동물을 의미한다. 가장 바람직하게는 상기 개체는 인간이다.

본 발명의 일 구체예에서, 물질-P 및 AMD3100 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 혈중 대량의 조혈 줄기세포 가동화를 위한 배합 요법(combined therapy)에 있어서, 물질-P 및 AMD3100은 순차적으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 물질-P가 먼저 투여되고, 이후에 AMD3100이 투여된다. 보다 구체적으로, 물질-P가 1회 투여되거나 또는 2일 연속으로 2회 투여된 후, 약 1일 내지 2일 후에 AMD3100이 1회 투여된다.

본 발명의 일 구체예에서, 물질-P 및 AMD3100 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 혈중 대량의 조혈 줄기세포 가동화를 위한 배합 제품(combination product)에 있어서, 물질-P 및 AMD3100은 순차적으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 물질-P가 먼저 투여되고, 이후에 AMD3100이 투여된다. 보다 구체적으로, 물질-P가 1회 투여되거나 또는 2일 연속으로 2회 투여된 후, 약 1일 내지 2일 후에 AMD3100이 1회 투여된다.

본 발명의 일 구체예에서, 물질-P 및 AMD3100의 투여 형태는 특별한 제한은 없으며, 바람직하게는 주사 등으로 비경구 투여될 수 있다. 구체적으로, 물질-P는 정맥 투여되고, AMD3100은 복막 내 투여된다. 또한, 투여 대상의 종류와 상태 등을 고려하여 조혈 줄기세포를 말초 혈액에 가동화시키기에 충분한 양으로 1회 또는 수회에 걸쳐 투여될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 물질-P는 0.1 내지 100 ㎍/㎏, 바람직하게는 1 내지 20 ㎍/㎏의 용량으로 1회 또는 2일 연속으로 2회 투여될 수 있으며, AMD3100은 1 내지 10 mg/kg, 바람직하게는 5 mg/kg의 용량으로 1회 또는 수회에 걸쳐 투여될 수 있다. 그러나 상기 투여 형태, 투여 횟수, 및 투여량은 당업자의 판단에 의하여 적절히 변경될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 물질-P 및 AMD3100 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 혈중 대량의 조혈 줄기세포 가동화를 위한 배합 제품(combination product)은 키트(kit-of-parts) 형태일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 물질-P 및 AMD3100 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 순차적으로 투여한 개체로부터 수득한 말초 혈액으로부터 가동화 조혈 줄기세포를 포함하는 혈액 분획을 분리하는 단계를 포함하는, 대량의 가동화 조혈 줄기세포를 수집하는 방법에 있어서, 상기 혈액 분획을 분리하는 단계는 혈액성분채집기(apheresis)를 이용하여 수행될 수 있다.

물질-P (substance P)는 감각 뉴우런, 대식세포, 호산구, 내피세포와, 상피세포 및 케라토사이트와 같은 각막 세포, 및 육아조직에서 발현되는 11개의 아미노산으로 이루어진 뉴로펩티드이다. 본 발명에서 사용되는 물질-P는 공지된 아미노산 서열 정보를 통하여 합성하거나, 개체로부터 분리하여 사용하거나, 시판 제제로부터 입수하는 등, 다양한 경로를 통하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 시판되는 물질-P로는 substance P 아세테이트염 수화물(sigma), substance p (Anygen), substance p (Merck Millipore) 등을 들 수 있다.

AMD3100는 플레릭사포르 (Plerixafor)라고도 불리우며, 그 화합물명이 1,1'-[1,4-페닐렌비스(메틸렌)]비스[1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸] 인 화합물로서, 케모카인 수용체인 CXCR4의 길항제(antagonist)로서 기능하는 것으로 알려져 있다(미국특허 제5,612,478호 참조).

본 발명에서 사용되는 AMD3100는 당업계에 알려진 화학적 합성 방법에 의해 합성하거나 시판 제제로부터 입수하는 등, 다양한 경로를 통하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 시판되는 AMD3100으로는 상품명 모조빌주(사노피-아벤티스) 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용되는 AMD3100는 약제학적으로 허용되는 염의 형태로도 사용이 가능하다. 예를 들어, 적합한 산 부가염으로는 생체적합성인 무기 산(예: HCl, HBr, 황산, 인산 등) 뿐만 아니라 유기 산(예: 아세트산, 프로피온산, 부티르산 등) 및 하나 이상의 카복실 그룹을 함유하는 산(예: 옥살산, 글루타르산, 아디프산 등)의 염을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용되는 AMD3100는 프로드럭의 형태, 즉 대상체에게 투여한 후에 본 발명의 화합물을 방출시키는 보호 형태로 제조되어 사용될 수도 있다. 또한, 정제된 형태로 제조될 경우, 화합물은 수화물로서 결정화될 수도 있다.

본 발명의 물질-P 및 AMD3100 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 배합 요법을 이용하여 대량의 가동화 조혈 줄기세포를 수집하는 방법은, 구체적으로는 (a) 물질-P 및 AMD3100 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 순차적으로 투여한 개체의 말초 혈액으로부터 혈액 분획을 분리하는 단계; 및 (b) 상기 혈액 분획을 농축하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 개체는 척추동물, 보다 바람직하게는 인간을 포함한 포유동물일 수 있다. 본 발명에서 대량 수집된 조혈 줄기세포는 혈관 질환의 예방 또는 치료 목적으로 사용되므로, 가장 바람직하게는 치료 대상인 환자로부터 수득하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 수집 방법에 있어서, 물질-P가 먼저 투여되고, 이후에 AMD3100이 투여되며, AMD3100 투여 후 약 1 내지 5 시간 후 혈액을 수집한다. 보다 구체적으로, 물질-P가 1회 투여되거나 또는 2일 연속으로 2회 투여된 후, 약 1일 내지 2일 후에 AMD3100이 1회 투여되며, AMD3100 투여 후 약 1 내지 3 시간 후 혈액을 수집한다.

상기 단계 (a)에서 말초 혈액으로부터 혈액 분획을 분리하는 것은 당업계에 알려진 혈액성분 채집 방법을 이용하여 수행할 수 있으며, 예를 들어, 말초 혈액을 혈액성분채집기(apheresis machine)에 통과시켜 수집할 수 있다. 당업계에 많이 사용되는 혈액성분채집기로는 MCS 3p,CS-3000 plus,COBE Spectra 등을 예시할 수 있으나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다. 중심 정맥 카테터를 통해 혈액이 혈액성분채집기로 들어가면 혈액 분획이 기계에 의해 채집이 되고 남은 혈액들은 카테터를 통해 다시 체내로 들어갈 수 있다. 이 과정은 약 4 내지 10시간 정도 걸릴 수 있으며, 치료학적 목적으로 사용하기에 충분한 세포 분획을 채집하려면 2 내지 10일간 연속적으로 반복할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 단계 (b) 는 단계 (a) 에서 분리한 혈액 분획을 농축하는 단계이다. 바람직하게, 혈액 분획의 농축은 혈액 원심분리기를 이용하여 수행될 수 있다. 원심분리 조건은 당업자가 상황에 따라 적절하게 조절할 수 있으며, 혈장 성분을 제거하고 적혈구를 제외한 단핵구 성분들이 포함된 농축액(혈액 세포층 분획)을 수득할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 혈액 분획을 Ficoll 층에 올려, 20분 동안 원심분리(813g, Megafuge 8R, Thermo scientific)를 수행하여 총 4개의 층을 수득하였는데, 가장 위층이 플라즈마(plasma), 두 번째 층이 적혈구를 제외한 혈액 세포층, 세 번째 층이 ficoll, 가장 아래 층에 모인 것이 적혈구 층이었고, 이 중 혈액 세포층이 대량의 가동화 조혈 줄기세포를 포함하는 농축액으로 수득하였으나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: SP 단독에 의한 조혈 줄기세포 가동화(mobilization)

정상적인 생리적 상태(Normal physiological state)에서 투약한 약물만의 효과를 확인해보기 위하여 상처가 없는 정상군을 이용하여 SP의 효과를 시험하였다. 손상 동물의 경우 상처에 의해 분비되는 다른 인자들이 많기 때문에, 투약한 약물의 효과와 구분이 어려우며, 특히 SP와 G-CSF는 양자 모두 체내 내인성 물질이기 때문에 더욱 그러하다.

SP 단독에 의한 조혈 줄기세포 가동화 효과를 확인하기 위해 NW rabbit을 각 그룹당 5마리씩 준비하였다. SP (6.7 ㎍/kg, sigma Aldrich)를 귀 정맥 (Ear vein)으로 2회 투여 후 동일 동물에서 3일간 혈액 내 조혈 줄기세포 수준을 비교하였다. G-CSF (10 ㎍/kg, JW Pham)는 기존 임상 용량으로 이용하되, SP와 같은 용법 (정맥투여)으로 처리하였다.

약물 주사 후 1일 1회 5ml의 혈액을 채취하여, 15ml 튜브 (Falcon)에 넣고 PBS(welgene)를 첨가하여 2배 희석되도록 하였다. 혈액 세포를 분리하기 위해 Ficoll paque (Amersham)을 새 튜브에 5ml씩 담아두고 그 위에 희석된 혈액을 얹어 놓듯이 올렸다. Ficoll 층과 혈액 층이 섞이지 않도록 조심스럽게 다루고 혈액 층을 다 넣은 후에는 20분 동안 원심분리(813g, Megafuge 8R, Thermo scientific)를 하였다. 원심분리가 끝나면 층 분리가 되는데 총 네 개 층이 생겼다. 가장 위층이 플라즈마 (plasma), 두 번째 층이 적혈구를 제외한 혈액 세포층, 세 번째 층이 ficoll, 가장 아래 층에 모인 것이 적혈구 층이었다. 그 중 혈액 세포층만을 분리하여 튜브에 담고 PBS를 넣은 후 원심분리하였다. 혈액세포 5×10⁶ 세포를 35mm 플레이트에 넣고 HSC-CFU 배지(Hematopoietic stem cells-colony forming unit media, 구입처: Miltenyi)에서 배양하였다. 배지 교환 없이 2주간 처음 상태로 배양하면서 매일매일 콜로니 수를 관찰하여 최종 카운팅하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, SP 주사 후, 약 2일째에 가장 높은 수준의 조혈 줄기세포 가동화를 보였고 이는 3일까지 유지되었다. 반면 동일 용법(정맥투여)의 G-CSF는 조혈 줄기세포 가동화에 있어서 미미한 효과를 보였고, 특히, 1일째에 증가하는 듯 보였으나 더 올라가지 못하고 day 0 (투약직전) 과 비슷한 수준을 유지하였다. 구체적으로, 0 day: 1x 기준으로, 1 day: SP: 3X (3배), GCSF: 2x (2배); 2 day: SP: 7X (7배), GCSF: 2.5X (2.5배); 3 day: SP: 6X (6배), GCSF: 0.6X (0.6배)를 나타내었다.

G-CSF의 주요 기전은 호중구(neutrophil) 생성의 촉진으로서 호중구를 말초 혈액에 가동화하는데 효과적인 G-CSF 농도에서, 혈중으로 조혈 줄기세포를 가동화하는 정도를 SP와 비교하였을 때 SP가 G-CSF 보다 효율적으로 혈중 조혈 줄기세포 가동화를 유도함을 알 수 있었다.

실시예 2: 혈중 면역세포에 대한 SP의 영향

혈중 면역세포 비율에 대한 SP의 효과를 확인하기 위해 NW rabbit을 각 그룹당 5마리씩 준비하였다. SP (6.7 ㎍/kg)를 귀 정맥 (Ear vein)으로 2회 투여 후 동일 동물에서 3일간 혈액 내 면역세포의 비율을 비교하였다. G-CSF (10 ㎍/kg, JW Pham)는 기존 임상 용량으로 이용하되, SP와 같은 용법 (정맥투여)으로 처리하였다. 투여 후 1일 간격으로 1ml을 채혈하여, EDTA가 들어있는 튜브로 이동시키고, 진단 기기를 통해 분석하였다.

혈중 전체 백혈구 내 lymphocyte(림프구), monocyte(단핵구), neutrophil(호중구), basophil(호염기구), eosinophil(호산구)의 비율을 CBC Count로 분석하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, SP 투여는 혈중 면역세포 분포에 크게 영향을 주지 않았으나, G-CSF는 투약 후 1일부터 혈중 대표적인 염증 세포인 Neutrophil(호중구)의 비율을 증가시키고 2일째에 약 65%까지 증가시켰다.

이는 상처가 없는 정상군의 결과인데, 환자의 경우 이미 염증 수치가 높기 때문에 G-CSF 사용 시 부작용이 더 커질 수 있음을 나타낸다.

실시예 3: SP와 AMD3100 배합 요법에 의한 조혈 줄기세포 가동화

임상 용량/용법을 기초로 하여 G-CSF와 SP의 효과를 비교하기 위해 8주령 C57Bl/6 마우스를 그룹당 5마리씩 준비하였다. 비히클 (saline) 투여 그룹, G-CSF+AMD3100 투여 그룹, SP+AMD3100 투여 그룹의 총 3 그룹으로 나누었다.

G-CSF (250 ㎍/kg, 피하, STEM CELL) 또는 SP (6.7 ㎍/kg, 정맥, Sigma Aldrich)를 마우스에 각각 투여하였다. G-CSF는 기존 임상 스케줄대로 피하주사로 연속 5일 투여하였고, SP는 정맥주사로 연속 2일 투여하였다. 각 투여의 마지막 날 또는 1일 후에 임상 스케줄대로 AMD3100을 투여하고, AMD3100 투여 후 1시간뒤 채혈하였다.

도 3은 기존의 G-CSF와 ADM3100 병용 요법의 투여 스케줄 및 본 발명의 물질-P와 AMD3100 병용 요법의 투여 스케줄을 개략적으로 나타낸 모식도이다.

AMD3100 투약 후 마우스 전혈 1ml을 주사기 (헤파린 포함)로 분리하였다. 혈액을 15ml 튜브에 넣고 PBS (welgene)를 첨가하여 2배 희석되도록 하였다. 혈액 세포를 분리하기 위해 Ficoll paque (Amersham)을 새 튜브에 3ml씩 담아두고 그 위에 희석된 혈액을 얹어 놓듯이 올렸다. Ficoll 층과 혈액 층이 섞이지 않도록 조심스럽게 다루고 혈액 층을 다 넣은 후에는 20분 동안 원심분리(813g, Megafuge 8R, Thermo scientific)를 하였다. 원심분리가 끝나면 층 분리가 되는데 총 네 개 층이 생겼다. 가장 위층이 플라즈마 (plasma), 두 번째 층이 적혈구를 제외한 혈액 세포층, 세 번째 층이 ficoll, 가장 아래 층에 모인 것이 적혈구 층이었다. 그 중 혈액 세포층만을 분리하여 튜브에 담고 PBS를 넣은 후 원심분리하였다. 혈액세포 2×10⁶ 세포를 35mm 플레이트에 넣고 HSC-CFU 배지(Hematopoietic stem cells-colony forming unit media, 구입처: Miltenyi)에서 배양하였다. 배지 교환 없이 2주간 처음 상태로 배양하면서 매일매일 콜로니 수를 관찰하여 최종 카운팅하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, G-CSF와 AMD3100 조합은 임상에서 보여준대로, 혈중으로 많은 조혈 줄기세포 이동을 촉진하였다. 그러나 SP+AMD3100의 조합이 더 많은 조혈 줄기세포 이동을 보여주었으며, 특히 본 실험에서 G-CSF의 투여는 5회인데 반해 SP의 투여는 2회인 점을 감안하면, SP+AMD3100의 조합이 G-CSF+AMD3100 조합에 비하여 용량 대비 혈중 조혈 줄기세포 가동화 효과가 더 크다는 것을 알 수 있다.

Claims

물질-P 및 AMD3100 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 혈중 대량의 조혈 줄기세포 가동화를 위한 배합 제제.
제1항에 있어서, 물질-P 및 AMD3100가 순차적으로 투여되는 배합 제제.
제1항에 있어서, 물질-P가 1회 투여된 후 1일 내지 2일 후에 AMD3100이 1회 투여되는 배합 제제.
제1항에 있어서, 물질-P가 2일 연속으로 2회 투여된 후 1일 내지 2일 후에 AMD3100이 1회 투여되는 배합 제제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 물질-P가 정맥 투여로 투여되는 배합 제제.
물질-P 및 AMD3100 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 혈중 대량의 조혈 줄기세포 가동화를 위한 배합 제품(combination product).
제6항에 있어서, 물질-P 및 AMD3100가 순차적으로 투여되는 배합 제품.
제6항에 있어서, 물질-P가 1회 투여된 후 1일 내지 2일 후에 AMD3100이 1회 투여되는 배합 제품.
제6항에 있어서, 물질-P가 2일 연속으로 2회 투여된 후 1일 내지 2일 후에 AMD3100이 1회 투여되는 배합 제품.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 물질-P가 정맥 투여로 투여되는 배합 제품.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 키트(kit-of-parts) 형태인 배합 제품.
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