CN116056696A - 物质p组合疗法用于动员造血干细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及：用于动员血液中大量造血干细胞的组合疗法和组合产品，其包含物质P和AMD3100或其药学上可接受的盐；收集大量动员造血干细胞的方法，其包括：从依次施用物质P和AMD3100或其药学上可接受的盐的个体获得的外周血中分离含有动员造血干细胞的血液级分的步骤；及含有物质P和AMD3100或其药学上可接受的盐的组合产品用于动员血液中大量造血干细胞的用途。

Description

物质P组合疗法用于动员造血干细胞
【技术领域】
本发明提供用于动员血液中大量造血干细胞的组合疗法(combination therapy)和组合产品(combination product)，其包含物质P和AMD3100或其药学上可接受的盐；收集大量动员造血干细胞的方法，其包括：从依次施用物质P和AMD3100或其药学上可接受的盐的受试者获得的外周血中分离含有动员造血干细胞的血液级分；以及包含物质P和AMD3100或其药学上可接受的盐的组合在动员血液中大量造血干细胞中的用途。
【背景技术】
将从骨髓动员或迁移到外周血中的造血干细胞(HSCs)移植到患有疾病的患者内已经取代了传统的骨髓移植。一些将造血干细胞从骨髓动员到外周血的临床实施已经进行了至少连续5天的被认为可以刺激切割CXCR4/SDF-1相互作用的蛋白酶的产生的重组粒细胞集落刺激因子(G-CSF)施用方案。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种糖蛋白，可刺激嗜中性粒细胞祖细胞和成熟嗜中性粒细胞的存活、增殖、分化和功能。
然而，G-CSF已被报道在大型患者队列中无效，并且与几种副作用(例如，骨痛、脾脏肿大和罕见的脾破裂、心肌梗死和脑血管疾病)相关。此外，据报道，因为G-CSF被证实具有强烈的炎症反应诱导，且可诱导干细胞外的各种类型的血细胞动员到外周血中，从而在长时间施用时具有引起血栓并发症的风险。特别是，由于G-CSF需要至少连续5天皮下注射，而在此过程中伴随患者的大腿疼痛，因此临床使用G-CSF需要谨慎。此外，G-CSF的主要机制是刺激嗜中性粒细胞的产生，而嗜中性粒细胞减少症的治疗是其主要靶点。
G-CSF的内在缺点导致了基于小分子的替代动员方法的确定的努力。例如，FDA批准的CXCR4拮抗剂AMD3100(普乐沙福(Plerixafor)；MozobilTM)已知毒性问题有限，可快速动员造血干细胞。然而，发现使用AMD3100的临床动员仅在与G-CSF联合使用时才有效。目前，G-CSF和ADM3100组合疗法的临床方案/剂量为：连续5天皮下注射G-CSF，在最后一次注射后约4～6小时腹腔注射AMD3100。在施用AMD3100后1小时收集血液，此时造血干细胞向外周血的迁移已知最大。
然而，对G-CSF和ADM3100组合疗法的反应因患者而异，并且已知存在血液中造血干细胞水平没有变化的无应答者。此外，即使G-CSF是临床上使用最广泛的动员剂，G-CSF也有其他缺点(例如，潜在的毒副作用，诱导强烈的炎症反应，相对较长的疗程(例如，连续注射5～7天)和患者之间的反应不同)。
因此，寻找一种快速的、选择性的和G-CSF非依赖性的动员模式仍然是临床感兴趣的课题。目前正在研究和开发取代G-CSF的动员剂。
Shun He等报道，在鼠中FLT3配体(FLT3L)和AMD3100的联合施用增加了造血干细胞的动员(参见Shun He等人，“FLT3L and Plerixafor Combination IncreasesHematopoietic Stem Cell Mobilization and Leads to Improved TransplantationOutcome”,Biol Blood Marrow Transplant.2014March；20(3):309-313)。
此外，MP Rettig等人公开了一种通过联合施用整合素α4β1(极晚期抗原4(VLA-4))抑制剂和CXCR4抑制剂来动员造血干细胞(HSC)和造血祖细胞(HSPC)的方法。特别是，据报道，在鼠中联合施用VLA-4拮抗剂BIO5192和AMD3100对造血祖细胞(HPSC)的动员具有累加作用(参见MP Rettig等人，“Mobilization of hematopoietic stem and progenitorcells using inhibitors of CXCR4 and VLA-4”,Leukemia,2012；26；34-53)。
此外，Kasia Mierzejewska等报道，在小鼠中苯肼(PHZ)和CXCR4抑制剂AMD3100的组合施用增加了造血干细胞的动员(参见Kasia Mierzejewska等人，“Sphingosine-1-phosphate-Mediated Mobilization of Hematopoietic Stem/Progenitor Cells duringIntravascular Hemolysis Requires Attenuation of SDF-1-CXCR4 RetentionSignaling in Bone Marrow”,Hindawi Publishing Corporation,BioMed ResearchInternational,Volume 2013,Article ID 814549,5页)。
此外，韩国专利公开2017-0105514公开了一种使用α9(α9)整合素拮抗剂和CXCR4拮抗剂离去和释放HSC的方法。
然而，尽管对替代G-CSF的动员剂进行了研究和开发，但G-CSF和AMD3100的组合施用是目前公认的唯一标准治疗方法。
物质P是在感觉神经元、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、内皮细胞、上皮细胞和角膜细胞(如角质细胞)以及肉芽组织中表达的由11个氨基酸组成的神经肽。一些报告表明，物质P参与造血调节的神经免疫通讯。物质P神经的神经纤维分布在骨髓基质中，物质P通过骨髓基质细胞的表面受体NK-1传递信号，刺激骨髓基质细胞，使骨髓基质细胞作为供体产生有利于促进造血的干细胞因子和白细胞介素-1。
关于上述研究中物质P在间充质干细胞迁移和间充质干细胞再增殖中的作用，本发明人在韩国专利10-593397中确定了物质P作为伤口愈合剂或伤口愈合促进剂的用途、物质P作为间充质干细胞释放剂或释放促进剂的用途，物质P作为间充质干细胞增殖剂或增殖促进剂的用途，以及由此作为伤口愈合剂或伤口愈合促进剂的用途。
然而，关于物质P和AMD3100的组合疗法，直到现在还一无所知。
【发明概述】
【技术问题】
由于用于动员血液中的造血干细胞的传统的G-CSF和ADM3100组合疗法中G-CSF需要相对较长的治疗过程(例如，连续注射5～7天)，还具有诱导强烈炎症反应的副作用，本发明人旨在提供一种取代性的组合疗法。
【问题的解决方案】
本发明的发明人为了解决上述问题而进行了锐意研究，发现当代替G-CSF而将物质P与AMD3100组合使用时，仅通过静脉注射一次物质P即可达到与动员造血干细胞到外周血的相同效果，并且由于物质P不具有G-CSF拥有的强嗜中性粒细胞动员剂的功能，所以炎症反应的副作用要小得多，并且与传统的G-CSF和ADM3100组合疗法相比，可以动员更多的造血干细胞进入血液，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的是提供用于动员血液中大量造血干细胞的组合疗法，包含物质P和AMD3100或其药学上可接受的盐。
本发明的另一个目的是提供用于动员血液中大量造血干细胞的组合产品，其包含物质P和AMD3100或其药学上可接受的盐。
本发明的另一个目的是提供收集大量动员造血干细胞的方法，起包括从依次施用物质P和AMD3100或其药学上可接受的盐的受试者获得的外周血分离含有动员造血干细胞的血液级分。
本发明的另一个目的是提供包含物质P和AMD3100或其药学上可接受的盐的组合在动员血液中大量造血干细胞中的用途。
【发明效果】
本发明的包含物质P和AMD3100或其药学上可接受的盐的组合疗法可以通过仅静脉注射一次物质P来动员造血干细胞到外周血，从而与需要较长治疗过程(例如，注射连续5～7天)的传统的G-CSF和ADM3100组合疗法相比，显著减轻治疗期间患者的负担。物质P不具有G-CSF所具有的强嗜中性粒细胞动员剂的功能，从而炎症反应的副作用要小得多，不仅如此，与传统的G-CSF和ADM3100组合疗法相比，还可以动员血液中更多的造血干细胞。此外，通过本发明的收集方法收集的血液级分包含大量动员的造血干细胞，因此，可以移植或重新注射到患有血液疾病的患者体内并用于预防或治疗需要造血干细胞的各种疾病。
【附图简述】
图1显示分别向兔体内静脉注射物质P(SP)和G-CSF后，经3天比较同一动物血液中造血干细胞水平的结果。
图2显示分别向兔体内静脉注射物质P(SP)和G-CSF后，经3天比较同一动物血液中免疫细胞的比例的结果。
图3是示出常规G-CSF和ADM3100组合疗法的施用时间表以及本发明的物质P和AMD3100组合疗法的施用时间表的示意图。
图4分别示出根据常规G-CSF和ADM3100组合疗法的施用方案以及本发明的物质P和AMD3100组合疗法的施用方案施用小鼠后，比较采集的血液中造血干细胞的水平的结果。
【发明实施实施例】
本发明的发明人发现，当代替G-CSF而将物质P与AMD3100组合使用时，仅通过静脉注射一次物质P产生动员造血干细胞到外周血的相同效果，并且物质P不具有G-CSF所具有的强嗜中性粒细胞动员剂的功能，使得炎症反应的副作用要小得多，不仅如此，与传统的G-CSF和ADM3100组合疗法相比，还可以动员更多的造血干细胞进入血液。
因此，本发明提供用于动员血液中大量造血干细胞的组合疗法，包含物质P和AMD3100或其药学上可接受的盐。
本发明还提供用于动员血液中大量造血干细胞的组合产品，其包含物质P和AMD3100或其药学上可接受的盐。
本发明还提供收集大量动员造血干细胞的方法，包括从依次施用物质P和AMD3100或其药学上可接受的盐的受试者获得的外周血中分离含有动员造血干细胞的血液级分。
本发明还提供了包含物质P和AMD3100或其药学上可接受的盐的组合在动员血液中大量造血干细胞中的用途。
本文所用的术语“物质P”与术语“物质-P”或“SP”具有相同的意义。
本文所用的术语“造血干细胞”与术语“造血母细胞”或“造血干和祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cell)”具有相同的意义。
如本文所用，术语“迁移”和“动员”具有相同的含义。
本文所用的术语“组合疗法(combined therapy)”与“组合(combination)”的含义相同。术语“组合疗法”是指2种以上药物一起使用。因此，2种以上药物不一定作为组合物混合，还可以用作单独的制剂。因此，“组合疗法”包括2种以上药物的单独制剂，使得可以同时、单独或依次施用2种以上药物。
本发明中使用的术语“组合产品(combination product)”是指“组合疗法(combination therapy)”的成品形式。例如，当存在2种或2种以上药物时，组合产品是指以组合形式包含这些药物的成品。2种以上的药物可以包装成单一制剂在成品中并同时施用，也可以包装在成品中的2种单独制剂中并同时、单独或依次施用。这种成品的一个例子是“试剂盒”。
本发明中使用的术语“受试者”是适用于本发明的收集大量动员造血干细胞的方法的动物，优选脊椎动物，更优选哺乳动物，例如包括人、猴、狗、猫、山羊、猪、大鼠、豚鼠、仓鼠、黑猩猩或大猩猩的动物。最优选的是，受试者是人。
在本发明的一个实施方式中，在包含物质P和AMD3100或其药学上可接受的盐的用于动员血液中大量造血干细胞的组合疗法中，物质P和AMD3100可以依次施用。具体来说，首先施用物质P，然后施用AMD3100。更具体地说，施用一次或连续2天施用2次物质P，在约1～2天后施用一次AMD3100。
在本发明的一个实施方式中，在包含物质P和AMD3100或其药学上可接受的盐的用于动员血液中大量造血干细胞的组合产品中，物质P和AMD3100可以依次施用。具体来说，首先施用物质P，然后施用AMD3100。更具体地说，施用一次或连续2天施用2次物质P，在约1～2天后施用一次AMD3100。
在本发明的一个实施方式中，物质P和AMD3100的施用形式没有特别限制，可以，优选通过注射等肠胃外方式施用，具体地，物质P静脉内施用，AMD3100腹膜内施用。此外，考虑到要施用的受试者的类型和状况，物质P和AMD3100可以施用一次或多次，以达到足以动员造血干细胞到外周血中的量。
在本发明的一个实施方式中，物质P可以0.1～100μg/kg，优选1～20μg/kg的剂量施用一次或连续2天施用2次，并且AMD3100可以100～500μg/kg，优选250μg/kg的剂量施用一次或多次。但是，施用形式、施用频率和剂量可以根据本领域技术人员的判断适当改变。
在本发明的一个实施方式中，包含物质P和AMD3100或其药学上可接受的盐的用于动员血液中大量造血干细胞的组合产品可以是试剂盒的形式。
在本发明的一个实施方式中，在包括从依次施用物质P和AMD3100或其药学上可接受的盐的受试者获得的外周血分离含有动员造血干细胞的血液级分的步骤的收集大量动员造血干细胞的方法中，所述分离血液级分的步骤可以使用单采血液成分法(apheresis)进行。
物质P是在感觉神经元、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、内皮细胞、上皮细胞和角膜细胞(如角质细胞)以及肉芽组织中表达的由11个氨基酸组成的神经肽。本发明中使用的物质P可以通过各种途径获得，例如，通过已知的氨基酸序列信息合成，从使用对象中分离出来，以及从市售制剂中获取。例如，市售物质P包括：物质P的乙酸盐水合物(Sigma)、物质P(Anygen)、物质P(Merck Millipore)等。
AMD3100，也称为普乐沙福(Plerixafor)，是一种化合物名称为1,1'-[1,4-亚苯基双(亚甲基)]双[1,4,8,11-四氮杂环十四烷]的化合物，并且已知作为趋化因子受体CXCR4的拮抗剂起作用(参见美国专利5,612,478)。
用于本发明的AMD3100可以通过各种途径获得，例如，通过本领域已知的化学合成方法和从市售制剂中获取。例如，市售AMD3100包括MozobilTM(Sanofi-Aventis)等。
此外，本发明中使用的AMD3100可以以药学上可接受的盐的形式使用。例如，合适的酸加成盐包括生物相容性无机酸(例如，HCl、HBr、硫酸和磷酸)、有机酸(例如乙酸、丙酸和丁酸)和含有一个或多个羧基的酸(例如草酸、戊二酸和己二酸)的盐。
此外，本发明中使用的AMD3100可以制备成前药的形式，即施用给受试者后释放本发明化合物的受保护的形式使用。此外，当以纯化形式制备时，化合物可以结晶为水合物。
使用包含物质P和AMD3100或其药学上可接受的盐的组合疗法收集大量动员造血干细胞的方法，具体包括下列步骤：(a)从依次施用物质P和AMD3100或其药学上可接受的盐的受试者获得的外周血分离含有动员造血干细胞的血液级分；及(b)浓缩所述血液成分。
在本发明的一个实施方式中，受试者可以是脊椎动物，更优选是包括人类的哺乳动物。在本发明中大量收集的造血干细胞用于预防或治疗血管疾病，因此，最优选地从待治疗的患者获得。
在本发明的一个实施方式中，在上述收集方法中，首先施用物质P，然后施用AMD3100，并在施用AMD3100后约1～5小时收集血液。更具体地说，在施用一次或连续2天施用2次物质P后，在约1～2天后施用一次AMD3100，并在施用AMD3100后约1～3小时收集血液。
在步骤(a)中，从外周血分离血液级分可以使用本领域常规已知的血液成分的收集方法进行，例如，通过使外周血通过单采机(apheresis machine)来收集血液成分。本领域广泛使用的血液分离机的例子可以是MCS 3p、CS-3000+、COBESpectra等，但本发明并不局限于此。当血液通过中心静脉导管进入血液分离机时，血液成分被机器收集，剩余的血液可以通过导管返回体内。这个过程可能需要约4到10小时，并且可以连续重复2到10天，以收集足以用于治疗目的的细胞组分。
在本发明的一个实施方式中，步骤(b)是浓缩步骤(a)中分离的血液级分的步骤。优选地，可以使用血液离心机进行血液分数的浓缩。离心的条件可以由本领域技术人员根据情况适当调整，并且可以除去血浆组分以获得包含不包括红细胞的单核细胞组分的浓缩物(血细胞层级分)。在本发明的具体实施方式中，将血液级分置于Ficoll层上并离心(813g，Megafuge 8R，Thermo Scientific)20分钟，得到共4层，最上层是血浆，第二层是不包括红细胞的血细胞层，第三层是Ficoll，最下层是红细胞层。其中，作为浓缩物获得的血细胞层包含大量动员造血干细胞，但本发明不限于此。
在下文中，将通过使用工作实施例更详细地描述本发明的构成和效果。这些实施例仅仅是有助于理解本发明的示例，本发明的保护范围不限于此。
【实施例1：仅通过SP动员造血干细胞】
为了确认在正常生理状态下施用的药物的效果，使用没有伤口的正常组测试SP的效果。因为在受伤动物的情况下，伤口分泌了许多其他因子，因此很难将这些因子与施用药物的作用区分开来，特别是因为SP和G-CSF都是体内的内源性物质。
为了确认单独SP对造血干细胞动员的作用，为每组准备5只NW兔。经耳静脉施用2次SP(6.7μg/kg，σ奥尔德里奇)后，比较同一动物血液中造血干细胞水平3天。以常规临床剂量使用G-CSF(10μg/kg，JW Pham)，用与SP相同的方法(即静脉内施用)处理。
注射药物后，每天收集一次5ml血液，放入15ml管(Falcon)中，并通过加入PBS(Welgene)稀释2次。为了分离血细胞，每个新管中放入5ml Ficoll-Paque(Amersham)，并将稀释的血液放在其上部。小心处理试管，以免将Ficoll层和血层混合，在将血层完全放入试管中后，进行20分钟离心(813g，Megafuge 8R，Thermo Scientific)。离心后，将各层分离，总共产生4层。最上层是血浆，第二层是不包括红细胞的血细胞层，第三层是Ficoll，最下层是红细胞层。在其中，仅分离血细胞层并放入试管中，然后将PBS加入其中进行离心。将5×106个血细胞置于35mm板中，并在HSC-CFU培养基(造血干细胞-集落形成单位培养基，购自Miltenyi)中培养。不更换培养基地在初始状态下培养细胞2周，每天观察集落数并最终计数。结果如图1所示。
如图1所示，注射SP后，在第二天显示造血干细胞动员的最高水平，其维持到第三天。另一方面，用相同方法(即静脉内施用)施用的G-CSF对造血干细胞动员的影响可以忽略不计。具体来说，它在第1天看起来增加，但没有进一步增加，同时保持与第0天(就在施用前)相似的水平。具体显示，基于第0天的1倍，在第1天，SP为3倍(3倍)，GCSF为2倍(2倍)；在第2天，SP为7倍(7倍)，GCSF为2.5倍(2.5倍)；在第3天，SP为6倍(6倍)，GCSF为0.6倍(0.6倍)。
G-CSF的主要机制是刺激嗜中性粒细胞的产生。在对于将嗜中性粒细胞动员到外周血而言有效的G-CSF浓度下，将造血干细胞动员到血液中的程度与SP进行比较时，发现SP比G-CSF更有效诱导血液中造血干细胞的动员。
【实施例2：SP对血液免疫细胞的影响】
为了确认SP对血液中免疫细胞的比率的影响，为每组准备5只NW兔。通过耳静脉施用2次SP(6.7μg/kg)后，比较相同动物血液中免疫细胞的比率3天。以常规临床剂量使用G-CSF(10μg/kg，JW Pham)，并用与SP相同的方法(即静脉内施用)处理。施用后，每隔一天收集1ml血液，转移到含有EDTA的管中，并使用诊断设备进行分析。
通过CBC计数分析血液中淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞在总白细胞中的比率，结果如图2所示。
如图2所示，尽管SP的施用对血液中免疫细胞的分布没有显著影响，但G-CSF从施用后第1天开始增加了作为血液中代表性的炎症细胞的嗜中性粒细胞的百分比，在第2天增加了约65％。
这些是没有伤口的正常组的结果，这表明患者已经具有高水平的炎症，因此在使用G-CSF时可能遭受更大的副作用。
【实施例3：SP和AMD3100组合疗法动员造血干细胞】
为了在临床剂量和方案基础上比较G-CSF和SP的效果，每组准备5只8周龄的C57Bl/6小鼠。总共分为3组：一组施用载体(盐水)，一组施用G-CSF+AMD3100，一组施用SP+AMD3100。
分别向小鼠施用G-CSF(250μg/kg，皮下，干细胞)或SP(6.7μg/kg，静脉内，SigmaAldrich)。按常规临床方案连续5天皮下注射G-CSF，连续2天静脉注射SP。在每次施用的最后一天或一天后按照常规临床时间表施用AMD3100，并在施用AMD3100后1小时采集血液。
图3是示出常规G-CSF和ADM3100组合疗法的施用时间表以及本发明的物质P和AMD3100组合疗法的施用时间表的示意图。
在施用AMD3100之后，使用注射器(含肝素)分离1ml小鼠的全血。将血液置于15ml管中，并通过加入PBS(Welgene)稀释至2倍。为了分离血细胞，每个新管中放入3ml Ficoll-Paque(Amersham)，并将稀释的血液放在其上部。小心处理试管，以免Ficoll层和血层混合，在将血层完全放入试管中后，进行20分钟离心(813g，Megafuge 8R，Thermo Scientific)。离心后，将各层分离，总共产生4层。最上层是血浆，第二层是不包括红细胞的血细胞层，第三层是Ficoll，最下层是红细胞层。其中，仅分离血细胞层并放入试管中，然后将PBS加入其中进行离心。将2×106个血细胞置于35mm平板中，并在HSC-CFU培养基(造血干细胞-集落形成单位培养基，购自Miltenyi)中培养。不更换培养基地在初始状态下培养细胞2周，每天观察集落数并最终计数。结果如图4所示。
如图4所示，G-CSF和AMD3100的组合如临床所示，促进了许多造血干细胞向血液中的迁移。然而，SP和AMD3100的组合显示出更多造血干细胞的迁移。特别是，考虑到G-CSF在本实验中施用了5次，而SP仅施用了2次，这表明，与G-CSF和AMD3100的组合相比，SP和AMD3100的组合显示出更大的根据剂量动员血液中造血干细胞的效果。

Claims (14)

1.用于动员血液中大量造血干细胞的组合疗法，其包含物质P和AMD3100或其药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的组合疗法，其中物质P和AMD3100依次施用。
3.根据权利要求1所述的组合疗法，其中在施用物质P一次之后约1～2天后施用一次AMD3100。
4.根据权利要求1所述的组合疗法，其中在连续2天施用2次物质P之后约1～2天后施用一次AMD3100。
5.根据权利要求1～4之任一项所述的组合疗法，其中物质P通过静脉注射施用。
6.用于动员血液中大量造血干细胞的组合产品，其包含物质P和AMD3100或其药学上可接受的盐。
7.根据权利要求6所述的组合产品，其中物质P和AMD3100依次施用。
8.根据权利要求6所述的组合产品，其中在施用物质P一次之后约1～2天后施用一次AMD3100。
9.根据权利要求6所述的组合产品，其中在连续2天施用2次物质P之后约1～2天后施用一次AMD3100。
10.根据权利要求6～9之任一项所述的组合产品，其中物质P通过静脉注射施用。
11.根据权利要求6～9之任一项所述的组合产品，其中所述组合产品是试剂盒的形式。
12.收集大量动员造血干细胞的方法，其包括从依次施用物质P和AMD3100或其药学上可接受的盐的受试者获得的外周血中分离含有动员造血干细胞的血液级分的步骤。
13.根据权利要求12所述的方法，其中首先施用物质P，然后施用AMD3100，并在施用AMD3100后约1～5小时收集血液。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述分离血液级分的步骤是使用单采血液成分法进行的。
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