KR960000395B1

KR960000395B1 - 혈소판감소증 치료제

Info

Publication number: KR960000395B1
Application number: KR1019900000271A
Authority: KR
Inventors: 다다미쓰 기시모토; 도시오 히라노; 히데오 기무라; 도시유키 이시바시; 유키오 아키야마; 아키라 오카노
Original assignee: 아지노모토 가부시키가이샤; 도바 다다스; 다다미쓰 기시모토
Priority date: 1989-01-13
Filing date: 1990-01-11
Publication date: 1996-01-06
Also published as: EP0378171A3; DE69001484D1; US5126325A; DE69001484T2; EP0378171A2; EP0378171B1; US5310550A; KR900011474A; JP2805224B2; JPH03101624A

Abstract

내용 없음.

Description

혈소판감소증 치료제

본 발명은 혈소판감소증 치료제에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 사람 BCDF(B cell differentiation factor)를 유효 성분으로 하는 혈소판감소증 치료제에 관한 것이다.

사람 및 마우스에 있어서 성숙 B세포를 항체생산 세포로 분화시키는 인자를 B세포 분화인자(BCDF)라고 총칭한다.

인체 내에서 이러한 중요한 작용을 하는 사람 BCDF에 대해서, 본 발명자들은 연구를 거듭하여 이의 DNA 서열 및 아미노산 서열을 결정하였으며(일본국 공개특허공보 제42688/88호 및 제56291/88호), 이. 콜 라이(E.coli)를 사용하여 사람 BCDF를 생산하는데 성공하였다(일본국 공개특허공보 제157996/88호). 또한, 본 발명자들은 사람 BCDF가 감염증 및 암의 치료에 유효한 면역 치료제일 수 있으며 골수이식 치료법에 유효한 지지제일 수 있음을 발견하였다(일본국 특허원 제289007/87호 및 제147594/88호). 그러나, 이제까지 사람 BCDF의 혈소판 조혈에 대한 약효에 관해서는 보고된 바 없다.

또한, 사람 BCDF를 BSF-2 또는 인터루킨 6(IL-6)으로 호칭하는 것도 제안된 바 있다[참조 : Nature, 324, 73(1986), ENBO. J., 6, 1219(1987)]. 그러나, 본 명세서에서는 종래부터의 용어인 “BCDF”를 사용한다. 또한, 본 명세서에서 사용하는 사람 BCDF는 인터페론 활설을 갖지 않음으로써, 인터페론 활성을 갖는 IFN-β2표준품(유럽 공개특허공보 제0220574호)과는 상이하다.

여기에서는 우선 사람 BCDF를 함유하는 혈소판감소증 치료제가 효과를 나타내는 혈소판감소증에 대해서 개략적으로 설명하는 동시에 현재 실시되고 있는 치료법에 대하여 간단히 설명한다.

혈소판은 생체의 지혈기구에 있어서 중요한 역할을 하는 혈구 성분이며, 손상조직에 점착 및 응집하는 동시에 세포내 성분을 방출시켜 일련의 응고반응을 야기한다.

현재, 혈소판의 수가 감소하는 혈소판감소증으로는, 유전성 혈소판감소증, 특발성 혈소판감소성 자반병, 재생불량설 빈혈 등이 알려져 있으나, 임상적으로 중요한 혈소판감소증은 방사선 전신조사 또는 조혈 억제 작용을 하는 약제에 의한 2차성 혈소판감소증이다.

이러한 2차성 혈소판감소증은 암 환자에게 실시되는 화학요법, 방사선요법, 골수이식 치료법 등에 의해 유발되며, 많은 경우에 있어서 골수 거핵구의 형성이 저조해지는 일이 발생하며, 환자의 예후의 회복을 지연시키며, 경우에 따라 출혈에 의한 사망을 일으키는 위험한 질병이다.

혈소판감소증에 대하여 현재 가장 빈번히 사용되고 있는 치료법은 혈소판 수가 20,000개/㎕ 이상으로 유지되도록 혈소판을 수형하는 것이다. 그러나, 예를 들면, 골수이식의 경우, 혈소판 수가 정상수준으로 회복되는 데에는 수 개월이 소요되므로, 수회에 걸쳐 HLA 불일치의 혈소판 수혈이 필요하게 된다. 그 결과, 항혈소판 항체가 형성되며 혈소판 수혈후에도 혈소판 수가 증가하지 않는 예가 많다. 또한, 수혈시 시토메 갈로바이러스(Cytomegalovirus) 등의 감염을 일으킬 위험도 있으며, 시토메갈로바이러스에 의한 간질성 폐염이 수술후 사망의 3대 요인 중의 하나인 점을 고려할 때, 될 수 있는 한 혈소판 수혈횟수를 감소시키는 것이 바람직하다. 그런데, 혈소판조혈은 다능성 조혈 간 세포로부터 유래하는 거핵구계 전구세포가 거핵아구를 경유하여 거핵구로 되며, 그후 거액구로부터 혈소판이 생산되는 과정을 의미한다.

이러한 생리적 혈소판조혈은 액성 인자에 의해 제어되는 것으로 여겨진다.

따라서, 이러한 액성 인자를 외부로부터 보충함으로써 환자 자신의 혈소판조혈을 항진시킬 수 있다면, 혈소판 수혈을 행하지 않고 출혈을 방지할 수 있으며, 나아가서는 혈소판감소증의 근본적인 치료에 유효하리라고 기대할 수 있다.

혈소판조혈에 관계하는 액성 인자로서 지금까지 트롬보포이에틴 (Thrombopo ietin : TOP), 거핵구 자극인자(MSF) 또는 혈소판조혈 자극인자(TSF) 등의 인자가 생체내 실험에서 거핵구의 성숙 및 분화를 항진시키는 것으로 되어 있으나, 그 실체는 명백하지 않다[참조 : 의학의 진보(Progness in Medicine), 143,528(1987)].

한편, 시험관내 실험에서 거핵구 콜로니의 형성에는 거핵구 콜로니 자극인자 (Meg-CSF)와 거핵구 콜로니 증폭인자(Meg-POT)가 필요하다는 보고도 있다[참조 : Medical Immunology, 14, 463(1987)].

최근, Meg-CSF에 대해서는 시험관내 실험에서 IL-3, GM-CSF, EPO 등이 Meg-CSF 활성을 갖는 다는 사실이 밝혀졌으나[참조 : 실험의학(Experimental Medicine) , 5, 822(1987)]. 그 밖의 인자에 대해서는 이들의 존재는 다양한 생리적 활성 측정계에 의해서만 시사된다.

물론, 아미노산 배열, DNA 배열 등도 불분명하며, 따라서 의약으로서 사용할 수 있는 순품을 공업적으로 생산하지는 못한다. 보다 중요한 것은 이러한 인자를 생체내 투여해도 말초혈 혈소판의 수가 증가한다는 보고는 아직 없다.

즉, 환자에게 투여함으로써 환자 자신의 혈소판 수를 증가시키도록 혈소판조혈을 항진시키는 작용을 하는 인자는 아직 없다.

따라서, 본 발명이 목적은 혈소판감소증 환자 자신의 혈소판조혈을 항진시켜, 결과적으로 혈소판감소증을 치료하는, 종래에 없는 약제를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, ① 사람 BCDF가 시험관내 실험에서 IL-3등과 상승적으로 거핵구를 증식시키고 단독으로 거핵구의 성숙 및 분화를 유도할 수 있으며, ②사람 BCDF가 생체내 투여시 말초혈에서 혈소판 수를 증가시킨다는 사실을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 사람 BCDF를 유효성분으로 하는 혈소판감소증 치료제에 관한 것이다.

본 발명과 관련하여 사람 BCDF는, 예를 들면, 일본국 공개특허공보 제42688 /88호 및 제56291/88호 및 일본국 특허원 제289007/87호에 기재되어 있는 바와 같은 하기의 아미노산 배열(I) 또는 (II)를 갖는다.

아미노산 배열(I) :

아미노산 배열(II) :

아미노산 배열(I)은 천연형 사람 BCDF이며, 아미노산 배열(II)는 천연형 사람 BCDF의 N 말단에 Ala가 1개 부가된 폴리펩티드(이하 사람 Ala-BCDF라고 한다)이다. 그러나, 본 발명에서 사용하는 사람 BCDF는 반드시 상기한 아미노산 배열(I) 또는 (II)로 나타낸 구조를 가질 필요는 없다.

즉, 천연형 사람 BCDF의 N 말단 및/또는 C 말단에 1개 또는 복수개의 아미노산이 부가된 구조를 갖는 것, 천연형 사람 BCDF의 구조중 1개 또는 복수개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 구조를 갖는 것도 사람 BCDF 활성을 갖는 한 본 발명의 사람 BCDF로서 사용할 수 있다. 바람직하게는, 천연형 사람 BCDF 또는 사람 Ala-BCDF를 사용한다. 본 발명과 관련하여 사람 BCDF의 함량은 당해 혈소판감소증 치료제 중 0.001 내지 100중량%, 바람직하게는 0.1 내지 1.0중량%이다.

또한, 본 발명의 사람 BCDF를 유효성분으로 하는 혈소판감소증 치료제에는 혈청 감소증 치료제에는 혈청 알부민 등의 안정화제와 만니톨 등의 부형제를 함유시켜도 좋다.

또한, 본 발명의 혈소판감소증 치료제에는 사람 BCDF 이외에 보조제로서 BCDF 이외의 시토킨, 예를 들면, IL-3, IL-1, IL-4, IL-5, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO 및 Meg-CSF를 1종류 이상 함유시켜도 좋다.

이와 같은 보조제를 함유시키면, 혈소판감소증 치료제로서의 효과가 상승적으로 증가한다. 즉, IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO 및 Meg-CSF는 조혈기능의 항진을 증강시킬 수 있기 때문이다. 이러한 보조제의 첨가량은 특별히 한정되지는 않으나, 사람 BCDF를 100으로 한 경우에 각각 0.001 내지 200000중량%를 첨가하면 좋다.

부연하면, 이러한 보조제의 첨가량은 상기한 값으로 반드시 한정될 필요는 없으나, 증상, 환자의 나이 등에 따라서 적절히 결정하는 것이 좋다.

물론, IL-3 등의 보조제는 반드시 사람 BCDF와 동시에 약제로서 투여되는 것은 아니다. 즉, 사람 BCDF를 유효성분으로 하는 혈소판감소증 치료제의 투여 전 또는 후의 적절한 시기에 이러한 보조제를 투여해도 상관없다.

물론, 본 발명의 혈소판감소증 치료제는 혈소판 수혈 치료법과 병용해도 상관없다.

본 발명의 혈소판감소증 치료제는 정맥내 주사로 사용해도 좋고, 근육내 주사 또는 피하주사로 사용해도 좋다. 즉, 어떠한 방법을 이용하여 투여해도 상관없다.

사람 BCDF의 제제법에 대해서는 일본국 특허원 제289007/87호 및 제1475 94/88호에 준하면 좋다.

본 발명에서 사용하는 사람 BCDF는 사람 T세포, B세포, 섬유아세포 등으로부터 공지의 방법[참조 : Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 5490(1985)]으로 생산되어 정제된 것 또는 이.콜라이. 효모, 원숭이 세포(COS 세포), 햄스터, 세균 등의 적당한 숙주에 사람 BCDF를 코드하는 유전자를 적당한 벡터를 사용하여 형질전환 주를 배양함으로써 생산 정제한 사람 BCDF를 사용해도 좋다.

또한, 사람의 혈액 또는 요 등으로부터 정제한 것도 좋다.

또한, 이러한 제조법의 상세한 내용에 대해서는 일본국 공개특허공보 제115,02 4/86호, 제42,688/88호, 제56,291/88호 및 제157,996/88호를 참고하기 바란다.

본 발명의 사람 BCDF를 유효성분으로서 함유하는 혈소판감소증 치료제는 거핵구계의 성숙 분화를 촉진하고 말초혈에서 혈소판의 수를 증가시키는 작용에 의해 혈소판감소증 환자, 특히 화학요법, 방사선요법 및 골수이식요법후의 암환자 또는 혈소판 수혈시 바이러스 감염 등에 대한 저항력이 약한 환자 등을 치료하는데는 유용하다.

[실시예 1]

사람 BCDF에 의한 거핵구 콜로니 형성의 촉진 C57BL/6 마우스 대퇴골로부터 통상적인 방법에 따라 골수세포를 조제한다.

골수세포 중에서 비부착성 세포 7.5×104개를 1% 소혈청 알부민, 360㎍/㎖ 철 포화사람 트랜스페린, 0.98㎍/㎖ 콜레스테롤, 100U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신 및 0.3% 한천을 함유하는 이스코브 변형법 둘베코 배지 1㎖ 중에서 배양한다. 배지에는 표 1에 기재한 바오 같은 각종 농도의 사람 BCDF 및 2.5% 포크워드 미토겐 자극 마우스 비장세포 배양 상등물(PWM-SCM이라고 함 ; Meg-CSF 활성을 함유함)을 가한다.

배양 7일째에 아세틸콜린에스터라제(AchE)의 염색에 의해 거핵구 콜로니의 수를 동정한 결과를 표 1에 나타낸다.

또한 PWM-SCM 대신, 20U/㎖의 마우스 IL-3(Genzyme사 제품)을 첨가한다. 그 결과를 표 2에 나타낸다, 사람 BCDF 단독의 경우, 거핵구 콜로니 형성능은 미약하였으나, 사람 BCDF는 Meg-CSF 활성을 갖는 PWM-SCM 또는 마우스 IL-3와 공존하도록 함으로써 농도 의존적으로 거핵구 콜로니의 형성을 유도한다.

또한, 유사한 결과가 사람 골수세포에 대해서도 확인되었다. 즉, 사람 IL-3(100U/㎖) 단독 첨가와 비교하여, 사람 BCDF(100ng/㎖)를 사람 IL-3(100U/㎖)와 공존시킴으로써 거핵구 콜로니의 수는 2.5배 증가한다.

[표 1]

[표 2]

[실시예 2]

사람 BCDF에 의한 거핵구의 성숙분화유도 실시예 1의 방법에서 제조한 마우스 골수세포를 내인성 콜리에스터라제로 불활성화 처리하고, 1×10⁵개의 세포를 각종 농도의 사람 BCDF를 함유하는 무혈청 액체 배지 0.2㎖ 중에서 3일간 배양한다.

4일후, 골수세포중의 거핵구의 수를 마우스 거핵구에 특이적인 효소인 아세틸콜린에스터라제(AchE)에 양성인 세포의 수로 구한다. 또한, 성숙/분화도를 거핵구의 직경과 AchE 활성을 지표로 조사한다. 표 3 및 표 4에 나타낸 바와 같이, 사람 BCDF는 단독으로 농도 의존적으로 거핵구의 직경과 AchE 활성을 증가 시킨다.

또한, 다만 1개의 거핵구를 1㎕의 액체 배지속에서 1일간 배양한 시스템에 있어서도, 200ng/㎖의 사람 BCDF를 첨가함으로써 표 5에 나타낸 바와 같이 거핵구의 직경은 유의적으로 증가한다.

이상으로부터, 사람 BCDF는 단독으로 직접 거핵구에 작용하여 거핵구의 성숙/분화를 유도한다.

또한, 액체 배양법, AchE 활성 측정법 및 단일 세포 배양법은 문헌[참조 : BLO OD 67, 1512(1986) 및 J. Clin. Invest., 79, 286(1987)]의 방법에 따라 수행한다.

[표 3]

[표 4]

[표 5]

* 직경이 증가한 세포의 수/총 세포의 수

[실시예 3]

사람 BCDF의 생체내 투여에 의한 마우스 골수 거핵구의 성숙 및 말초혈에서 혈소판 수의 증가

사람 BCDF 5 내지 10㎍을 100㎕의 1% 마우스 혈청-함유 PBS에 용해시키고, 12시간 간격으로 1일 2회씩 5일간 C57BL/6 마우스(수컷, 6 내지 7주된 것) 4 내지 7마리에게 복강내 투여하다. 대조군에게는 100℃에서 40분간 가열 처리하여 불활성화된 사람 BCDF를 같은 방법으로 투여한다. 최종 투여후 4시간 후에 마우스로부터 대퇴골을 적출하고, 포르말린 고정후 절편 표본을 작성한 다음, 헤마톡실린-에오신 염색시켜, 사람 BCDF의 골수 거핵구에 대한 결과를 검토한다.

그 결과, 표 6처럼 대조군에 비하여 거핵구 수의 증가는 유의적이지 않았으나, 거핵구의 직경은 사람 BCDF 투여시 유의적으로 증가하였으며, 거핵구의 성숙이 인지된다.

[표 6]

* : 위험률 5%에서 유의적임

또한, 동일하게 사람 BCDF 0.5 내지 10㎍을 5일간 마우스 4 내지 8마리에게 복강내 투여하고, 최종 투여후 4시간 후에 EDTA로 처리한 주사기로 심장으로부터 혈액을 채취한 다음, 혈액 자동분석기(콜터사 제품)로 혈소판의 수를 측정한다. 표 7에 나타낸 바와 같이, 사람 BCDF의 투여량에 의존하여 혈소판의 수가 증가한다. 또한, 경시적 채혈의 결과, 표 8에 나타낸 바와 같이, 투여후 4일째부터 사람 BCDF의 효과는 현저하게 되었다.

[표 7]

* : 위험률 5%에서 유의적임

** : 위험률 1%에서 유의적임

[표 8]

* : 위험률 1%에서 유의적임

[실시예 4]

사람 BCDF의 생체내 투여에 의한 혈소판감소증 마우스의 말초혈에서 혈소판 수의 회복

사람 BCDF 70㎍(10㎍/마우스/일×7일)을 삼투압 펌프(알자사 제품)에 충진시키고, DBA/2 마우스(암컷, 8주된 것) 5마리에게 피하로 연속 투여한다. 경시적으로 마우스의 심장으로부터 말초혈을 채취하여 혈액중의 혈소판 수를 자동 혈구 계측장치(동아의용 전자사 제품)로 측정한다. 사람 알부민을 투여한 대조군(80±6×10⁴/㎕)과 비교하여, 사람 BCDF를 7일 동안 투여한 군에서는 혈소판 수가 97±14×10⁴/㎕로 통계학적으로 유의적인 증가를 나타낸다.

또한, 100℃에서 40분 동안 열처리하여 불활성화된 사람 BCDF를 투여한 경우에는 혈소판 수의 유의적인 증가는 인지되지 않았다.

또한, 사람 BCDF의 연속투여에 의한 효과는 화학 요법체의 투여에 의해 유도된 혈소판감소증 마우스에서도 인지되었다.

즉, 5-FU 150㎎/㎏을 정맥내 주사한 마우스에 있어서도 대조군에 비하여 5-FU 투여후 5시간째부터 사람 BCDF를 삼투압 펌프로 피하투여한 군에서 혈소판의 수는 표 9처럼 증가한다.

또한, 4.0Gy의 X선 조사한 마우스에서도 대조군에 비하여 X서 조사후 사람 BCDF를 삼투압 펌프로 피하투여한 군에서 혈소판 수의 회복을 유의적으로 촉진시키는 것이 인지되었다.

[표 9]

* : 위험률 5%에서 유의적임

[표 10]

* : 위험률 5%에서 유의적임

[실시예 5]

사람 BCDF 생체내 투여에 의한 원숭이 말초혈에서 혈소판 수의 증가

사람 BCDF를 1% 가열-불활성화된 자기 혈청 함유 PBS에 용해시키고, 붉은털 원숭이(Macaca fascicularis)(암컷, 체중 : 2.8 내지 3.8kg)에게 피하로 2㎖/회씩 12시간 간격으로 1일 2회, 14일 동안 연속적으로 투여한다. 경시적으로 정맥으로부터 채혈하고, 자동 혈구 계측장치(동아의용전자사 제품)로 혈구의 수를 측정한다. 표11에 나타낸 바와 같이, 사람 BCDF 5㎍/㎏/일 및 10㎍/㎏/일 투여(2회/일로 분할투여)에 의해 혈소판의 수는 경사적으로 증가하며, 최고 투여전 값의 2 내지 2.3배로 증가한다. 이러한 증가는 투여 종료후 약 2주내에 투여전 값으로 되돌아간다. 20 내지 80㎍/㎏/일 이상의 투여에서도, 혈소판의 수는 유사하게 2.2 내지 2.5배 증가한다. BCDF 투여 원숭이로부터 유래된 혈소판 정상 응집능을 나타낸다.

또한, 골수 병리상의 해석에 의해 사람 BCDF 투여에 의한 골수 거핵구조혈의 항진이 인지된다.

한편, 5 내지 40㎍/㎏/일 이상의 투여량에서는 표 11에 나타난 바와 같이 백혈구 수의 증가가 인지되지 않으며, 과립구등의 백혈구의 증가에는 80㎍/㎏/일 이상의 투여가 필요하다.

또한, 적혈구 수의 증가는 5내지 500㎍/㎏/일의 어떠한 투여량에서도 인지되지 않았다.

이러한 사람 BCDF의 혈소판 특이적 증가작용은 정맥내 투여에서도 인지된다.

이상, 사람 BCDF는 생체내 투여에 의해 혈소판 수를 증가시키는 작용이 있다는 것이 원숭이에 있어서도 명백하게 되었다.

[표 11]

0일째부터 13일째까지 총 14일간 사람 BCDF을 매일 일일 2회 피하주사 투여한다.

Claims

하기 아미노산 배열(I) 또는 (II)를 갖는 사람 B세포 분화인자(이하, 사람 BCD F라고 함)를 유효성분으로 하는 혈소판감소증 치료제.

아미노산 배열(I) :

아미노산 배열(II) :
제1항에 있어서, 사람 BCDF가 당쇄를 갖지 않는 것인 혈소판감소증 치로제.
제1항에 있어서, 사람 BCDF가 원핵생물에서 생산되는 것인 혈소판감소증 치료제.
제1항에 있어서, 혈소판감소증 치료제가 사람 BCDF 이외에 보조제로서 인터루킨 3(IL-3)를 행함을 특징으로 하는 혈소판감소증 치료제.