JP2003073300A - 造血前駆細胞動員増強剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 マクロファージコロニー刺激因子を有効成分
とする、造血系の再構築を目的とした移植に供される造
血前駆細胞の動員を増強するための薬剤を提供する。 【解決手段】 マクロファージコロニー刺激因子類、及
び該因子類の薬学的に許容される塩類からなる群より選
択される１種又は２種以上の混合物を、造血前駆細胞動
員増強剤の有効成分とし、顆粒球コロニー刺激因子と組
合せて使用すること、又は顆粒球コロニー刺激因子をさ
らに含有することを望ましい態様とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、薬学及び医薬分野
に関し、具体的には造血前駆細胞の動員を増強するため
の薬剤に関する。本発明の造血前駆細胞動員増強剤は、
造血系の再構築を目的とした移植に供される造血前駆細
胞の動員の増強に好適に用いことができる。

【０００２】

【従来の技術】造血幹細胞は、すべての血液細胞に分化
できる「多分化能」と自分自身を複製できる「自己複製
能」を有する未分化な細胞として定義される。この自己
複製能を応用して、造血幹細胞を移植し造血機能を再構
築させる方法が、白血病のような難治性疾患に対する有
効な治療法となっている。造血幹細胞移植は、一般的に
全身放射線照射や大量の抗癌剤投与により、患者自身の
造血能を消失させた状態で行なわれる。このような骨髄
破壊的前処置によって、移植された造血幹細胞から白血
球が供給されてくるまでにかなりの日数を要することに
なる。その間、感染の危険を避けるために無菌室での管
理が必要になり、移植後の白血球をできるだけ早く回復
させる目的で、顆粒球コロニー刺激因子（以下、Ｇ−Ｃ
ＳＦと略記することがある。）などのサイトカインが使
用されてきた。

【０００３】一方、造血幹細胞の供給源としては、今ま
では骨髄細胞を使用する骨髄移植が主流であったが、近
年、臍帯血中にも豊富に存在する造血幹細胞を利用する
臍帯血移植や、顆粒球コロニー刺激因子などのサイトカ
インを投与することによって末梢血に流出してくる骨髄
由来の造血幹細胞を利用する末梢血幹細胞移植などの方
法が急速に増えつつある。特に、末梢血幹細胞は採取が
容易であることに加え、顆粒球コロニー刺激因子を用い
た末梢血への造血幹細胞の動員に保険の適用が承認され
たことによって、自家及び同種ともに今後さらに普及す
るものと予想される。

【０００４】従来から末梢血幹細胞の動員効率を上げる
目的として、顆粒球コロニー刺激因子とともにそれ以外
のサイトカイン等のタンパク質との併用投与による効果
が検討されている。

【０００５】特開平８−１２７５３９号公報（以下、従
来技術１と記載する。）には、ヒトインターロイキン−
１１、及びヒトインターロイキン−１１とヒト顆粒球コ
ロニー刺激因子の両者、を含有する末梢血幹細胞増加剤
に関する技術が開示されている。

【０００６】また、ステムセルファクター（stem cell
factor：以下、ＳＣＦと略記する。）は、単独では造血
刺激効果は低いが、インターロイキン−３、顆粒球コロ
ニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
（以下、ＧＭ−ＣＳＦと略記することがある。）、エリ
スロポエチン（以下、ＥＰＯと略記することがある。）
等との共存下で、その効果は相乗的に増加すること等
（「末梢血幹細胞移植の実際」、原田実根ら編、南江
堂、第６０ページ、２００１年：以下、従来技術２と記
載する。）が報告されている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前記従
来技術１に使用されているインターロイキン−１１は、
現在まで医薬品としての認可はなされておらず、直ぐに
ヒトへ応用するには安全性の面など問題点は残されたま
まである。

【０００８】また、従来技術２のＳＣＦには肥満細胞を
刺激するために注射部位の発赤、硬結、さらにはアナフ
ィラキシー様症状の発現があったため、本臨床試験は中
断されている状態である。

【０００９】従って、前述の問題点を解決すべく、造血
系の再構築に有用な造血前駆細胞を安全かつ効果的に大
量に動員する方法の開発が待望されていた。本発明者ら
は、従来よりマクロファージコロニー刺激因子（以下、
Ｍ−ＣＳＦと略記することがある。）の持つ作用につい
て鋭意研究を重ねた結果、顆粒球コロニー刺激因子と併
せてマクロファージコロニー刺激因子を投与することに
より、末梢血中に造血前駆細胞に特徴的な表面抗原を表
出する細胞群の割合を増加させることができることを見
出した。また、顆粒球コロニー刺激因子とマクロファー
ジコロニー刺激因子を併せて投与することにより、顆粒
球やマクロファージからなるコロニー、及び更に未熟な
初期造血系高増殖能を有するコロニーを形成しうる未分
化な細胞である造血前駆細胞を末梢血中に動員する効果
を高め、従来技術に比して副作用が伴わずより安全に末
梢血中に、造血前駆細胞の動員を増強することを見い出
し、本発明を完成した。

【００１０】本発明の目的は、安全性が高く様々な成熟
血液細胞に分化しうる造血前駆細胞を、効果的且つ簡便
に末梢血に動員することが可能な造血前駆細胞動員増強
剤を提供することである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】前記課題を解決する本発
明は、以下のとおりである。 （１）マクロファージコロニー刺激因子類、及び該因子
類の薬学的に許容される塩類からなる群より選択される
１種又は２種以上の混合物を有効成分として含有する造
血前駆細胞動員増強剤。

【００１２】（２）顆粒球コロニー刺激因子と組合せて
使用されることを特徴とする（１）に記載の造血前駆細
胞動員増強剤。

【００１３】（３）顆粒球コロニー刺激因子をさらに含
有する（１）に記載の造血前駆細胞動員増強剤。

【００１４】

【発明の実施の形態】次に、本発明について具体的に説
明する。本明細書において百分率は、特に断りのない限
り重量による表示である。本発明において、「動員」と
は、生体内に分散されている細胞を特定の部位に移動お
よび集約させることを意味し、「増強」とは、この作用
をさらに高めることを意味する。従って、動員増強剤
は、生体内に分散されている細胞を特定の部位に移動お
よび集約させる効果を増強する薬剤を表す。

【００１５】本発明の造血前駆細胞動員増強剤（以下、
「本発明の動員増強剤」と略記する。）の有効成分は、
マクロファージコロニー刺激因子類、及び該因子類の薬
学的に許容される塩類からなる群より選択される１種又
は２種以上の混合物である。マクロファージコロニー刺
激因子類は、マクロファージコロニー刺激因子又はマク
ロファージコロニー刺激因子の薬理学的に許容される誘
導体であり、好ましくはマクロファージコロニー刺激因
子そのものである。更に、マクロファージコロニー刺激
因子はヒト由来のものが好ましい。前記誘導体として
は、例えばマクロファージコロニー刺激因子のアミノ酸
配列を有するペプチド、当該アミノ酸配列の一部が脱落
又は置換したペプチド、及び当該アミノ酸配列の一部に
他のアミノ酸が挿入又は付加したペプチド等が挙げられ
る。

【００１６】マクロファージコロニー刺激因子の製造法
としては、特に制限されるものではないが、例えば、ヒ
ト尿中から物理化学的方法により単離することも可能で
あり、また、遺伝子工学的に製造することもできる。

【００１７】例えば、マクロファージコロニー刺激因子
は、ヒト尿から物理化学的に単離する方法として特開昭
６３−１９８７００号公報、特開昭６３−２５０４００
号公報、特表昭６２−５０１６０７号公報等、また遺伝
子工学的に製造する方法として特表平１−５０２３９７
号公報等に記載された方法により製造することが出来
る。

【００１８】前記の方法により製造されたマクロファー
ジコロニー刺激因子は、軟寒天中で哺乳動物の骨髄細胞
に作用し、単球・マクロファージ系細胞からなるコロニ
ーの形成を促進する活性（以下コロニー刺激活性と記載
することがある。）を有している。本発明において使用
するマクロファージコロニー刺激因子類としては、これ
と同様のコロニー刺激活性を有するタンパク因子であれ
ば使用可能であり、その種類は特に限定されない。具体
的には、特開昭６３−１９８７００号公報の製造法によ
るヒト尿から物理化学的に単離したマクロファージコロ
ニー刺激因子、及び特表平１−５０２３９７号公報の製
造法で製造される組換え型マクロファージコロニー刺激
因子が好ましい。また、これらのマクロファージコロニ
ー刺激因子のアミノ酸配列を有するペプチド、当該アミ
ノ酸配列の一部が脱落又は置換したペプチド、当該アミ
ノ酸配列の一部に他のアミノ酸が挿入又は付加したペプ
チド等も、本発明に用いることのできるマクロファージ
コロニー刺激因子類として例示することができるが、こ
れらに限定されず、前記コロニー刺激活性を有するもの
であれば全て本発明に使用することができる。

【００１９】前記のとおり物理化学的方法又は遺伝子工
学的方法により得られたマクロファージコロニー刺激因
子に、必要により安定剤としてヒト血清アルブミン、糖
類等を含む緩衝液を添加し、マクロファージコロニー刺
激因子を溶解し、以下、常法により無菌濾過し、凍結乾
燥し、本発明の動員増強剤を製造することができる。
尚、ヒト血清アルブミン及び糖類の他に、薬理学的に許
容される成分を添加することも可能である。

【００２０】また、本発明においては、マクロファージ
コロニー刺激因子類の薬学的に許容される塩類も使用す
ることが可能であり、酸付加塩、金属錯体等の無毒性の
塩、カルボン酸塩等を例示することができる。より具体
的には、酸付加塩としては塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、
シュウ酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、
酒石酸塩等を、金属錯体としては亜鉛、鉄、カルシウ
ム、マグネシウム、アルミニウム等の錯体を、カルボン
酸塩としてはナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金
属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類
金属塩、アンモニウム塩等を例示することができる。こ
れらの塩類は常法により製造することができる。

【００２１】本発明の動員増強剤は、上記のようなマク
ロファージコロニー刺激因子類、又は該因子類の薬学的
に許容される塩類の１種を単独で使用してもよく、任意
の２種またはそれ以上の混合物として使用してもよい。

【００２２】本発明に使用するマクロファージコロニー
刺激因子類及び／又はマクロファージコロニー刺激因子
類の薬学的に許容される塩類からなる群より選択される
１種又は２種以上の混合物を、医薬的に許容可能な担
体、賦形剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、安定剤等と組み合わ
せて製剤にすることが可能である。例えば常法により滅
菌して注射用生理食塩水、注射用蒸留水等に溶解し、製
剤にすることが可能である。点滴、静注、皮下注、腹腔
内投与等適宜の投与形態及び投与量に応じて製剤中の有
効成分の量は適宜選択される。

【００２３】マクロファージコロニー刺激因子は元来ヒ
トの体液中に含有されている天然の物質であるので、こ
れを有効成分とする動員増強剤は、副作用が極めて少な
い利点がある。尚、マクロファージコロニー刺激因子の
急性毒性については、既に特公平６−１１７０５号公報
の実験例１に具体的に試験データとして記載されている
とおり、Ｃ５７ＢＬ系雄性マウスを用いた試験におい
て、ＬＤ₅₀が、腹腔内投与では４ｇ／ｋｇ体重、静脈内
投与では２ｇ／ｋｇ体重、皮下投与では４ｇ／ｋｇ体重
であることが確認されている。

【００２４】また、本発明の動員増強剤の投与量は、そ
の投与形態、年齢、症状等により異なるが、具体的に
は、マクロファージコロニー刺激因子換算で体重１ｋｇ
当たり１０μｇから１ｍｇの範囲が挙げられる。本発明
の動員増強剤は、静脈内に投与することが好ましく、１
日１回を数日間連日投与することが可能であり、該本発
明の動員増強剤と顆粒球コロニー刺激因子とを併用投与
することにより、造血前駆細胞の末梢血への動員が増強
される。尚、本発明の動員増強剤の投与のタイミング
は、顆粒球コロニー刺激因子の投与の前後及び同時期の
いずれも可能である。あるいは、本発明の動員増強剤
は、マクロファージコロニー刺激因子類及び／又はマク
ロファージコロニー刺激因子類の薬学的に許容される塩
類とともに、顆粒球コロニー刺激因子を含有していても
よい。その場合は、本発明の動員増強剤と顆粒球コロニ
ー刺激因子とを併用投与する必要はない。

【００２５】マクロファージコロニー刺激因子と顆粒球
コロニー刺激因子を投与することによって、造血前駆細
胞を主として末梢血へ効果的に動員することができる。
マクロファージコロニー刺激因子と顆粒球コロニー刺激
因子の投与量の比は、動員する細胞の種類に応じて、適
宜設定することが望ましい。

【００２６】本発明の動員増強剤によって動員が増強さ
れる造血前駆細胞としては、好中球・マクロファージ系
前駆細胞、単球・マクロファージ系前駆細胞、巨核球系
前駆細胞、早期赤芽球系前駆細胞、初期造血系高増殖能
コロニー形成細胞等が挙げられる。動員された造血前駆
細胞は、一般的に行なわれているように、血球比重分離
液等を用いて回収するという方法の他に、適切な表面抗
原に対する特異抗体を利用して、フローサイトメーター
により、選択的に目的の細胞群を濃縮することも可能で
ある。

【００２７】前記の方法に従って得られた造血前駆細胞
は、未熟な造血幹細胞を検出する方法によって確認し、
及びその種類を特定することが可能である。例えば、in
vitroにおけるコロニー形成試験では、未熟な造血幹細
胞を各種サイトカインの存在下にメチルセルロース又は
軟寒天などの半固形培地中で培養することによって、形
成される細胞集塊（コロニー）から、造血幹細胞の数や
性質を推定する方法である。このコロニーを分析するこ
とにより、in vitroにおいて種々の造血幹細胞や造血前
駆細胞の分化・増殖過程を捉えることができる。また、
in vivoにおける長期骨髄再構築能は、致死量放射線照
射したマウスに造血幹細胞を移植することによって、マ
ウスの造血系を再構築し、長期間維持することができる
かを調べる方法であり、造血幹細胞の多分化能と自己複
製能を評価する上で信頼性が高いとされている。

【００２８】また、末梢血中に動員された造血前駆細胞
は、採取後にサイトカインの添加培養によって、増幅あ
るいは分化誘導を行なった後、目的に応じて使用するこ
とができる。例えば、造血幹細胞移植に使用する細胞と
して用いることができる。

【００２９】

〔実施例１〕

次の組成の注射剤を常法により製造した。 マクロファージコロニー刺激因子（森永乳業社製） ０．６２５（％） 塩化ナトリウム（和光純薬社製） ０．９ 注射用蒸留水（大塚製薬社製） ９８．４７５

【００３０】〔実施例２〕天然型マクロファージコロニ
ー刺激因子０．４ｍｇ、ヒト血清アルブミン（ウェルフ
ァイド社製）３２０ｍｇ、マンニトール（関東化学社
製）４ｇ、リン酸水素二ナトリウム（関東化学社製）
１．２ｇ、及びリン酸二水素ナトリウム（関東化学社
製）０．１２ｇを、注射用蒸留水（大塚製薬社製）１０
０ｍｌに溶解し、０．２２μｍ滅菌済みメンブランフィ
ルターを用いて濾過滅菌した後、滅菌済みバイアルビン
に１０ｍｌずつ分注し、常法により凍結乾燥してマクロ
ファージコロニー刺激因子製剤（注射剤）を１０本製造
した。

【００３１】〔試験例１〕この試験は、本発明の動員増
強剤及び／又はＧ−ＣＳＦの投与後、末梢血中の白血球
数の変化及び末梢血への造血前駆細胞の動員を確認する
ために行った。 （１）試験動物 体重２０〜２５ｇの７〜９週齢Ｃ５７ＢＬ／６系雄性マ
ウス（日本チャールスリバーから購入）を、無作為に４
群（１群５匹）に分けて使用した。

【００３２】（２）試料の調製 １日当たり、実施例１の造血前駆細胞動員増強剤を生理
食塩水で１００倍希釈した試験溶液２００μｌの用量の
静脈投与、及び生理食塩水で６２．５μｇ／ｍｌに希釈
した組換え型ヒトＧ−ＣＳＦ（商品名ノイトロジン：中
外製薬社製）２００μｌの用量の皮下投与の併用投与
を、２日間連日行ったマウスを試験試料群とした。

【００３３】また、１日当たり、実施例１の造血前駆細
胞動員増強剤を生理食塩水で１００倍希釈した試験溶液
を２００μｌの用量で２日間連日静脈投与したマウスを
対照試料群１とした。更に、生理食塩水で６２．５μｇ
／ｍｌに希釈した組換え型ヒトＧ−ＣＳＦ（商品名ノイ
トロジン：中外製薬社製）を２００μｌの用量で２日間
連日皮下投与したマウスを対照試料群２とした。陰性コ
ントロールとして、１日当たり、生理食塩水２００μｌ
を２日間連日投与したマウスを陰性試料群とした。

【００３４】３日目に、クロロホルム麻酔下にて各試料
群の血液を採取し、血液の１／１０量の３．８％クエン
酸ナトリウム溶液（赤沈用チトラール：山之内製薬社
製）を添加して、試験試料群、陰性試料群および対照試
料群２種類の末梢血溶液を調製した。

【００３５】（３）試験方法 各試料群の末梢血溶液中の白血球の数は、自動血球計数
装置（シスメックス社製）を用いて計測した。更に前記
白血球中に含まれる未熟な造血前駆細胞の数を測定する
ために、未熟な造血前駆細胞の表面マーカーとされるＳ
ｃａ−１及びｃ−ｋｉｔを指標として、フィコエリスリ
ン（以下、「ＰＥ」と略記することがある。）標識のＳ
ｃａ−１抗体（ファーミンジェン社製）、及びフルオレ
セインイソチオシアネート（以下、「ＦＩＴＣ」と略記
することがある。）標識のｃ−ｋｉｔ抗体（ファーミン
ジェン社製）を用いて各試料群の末梢血白血球を３０分
間染色した。染色した細胞は、固定及び洗浄した後、Ｆ
ＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社
製）による解析を行って算出した。

【００３６】（４）試験結果 本試験の結果は表１に示すとおりである。表１は、末梢
血中１ｍｌ当たりに含まれる白血球数およびマウスにお
ける未熟な造血前駆細胞の表面マーカーとされるＳｃａ
−１陽性ｃ−ｋｉｔ陽性細胞の数を表わす。表１から明
らかなとおり、従来の造血前駆細胞動員剤であるＧ−Ｃ
ＳＦを投与した対照試料群２では、白血球数の増加及び
Ｓｃａ−１陽性ｃ−ｋｉｔ陽性細胞の数の増加が認めら
れた。更に、Ｇ−ＣＳＦに本発明の動員増強剤を併せて
投与した試験試料群においては、白血球数及びＳｃａ−
１陽性ｃ−ｋｉｔ陽性細胞の数が、対照試料群２に比し
て更に増加する結果が確認された。尚、本発明の動員増
強剤の単独投与である対照試料群１では、陰性試料群に
比べて白血球数及びＳｃａ−１陽性ｃ−ｋｉｔ陽性細胞
の数の増加は認められなかった。

【００３７】従って、本発明の動員増強剤はＧ−ＣＳＦ
と併用投与することによって、Ｇ−ＣＳＦによる造血前
駆細胞の末梢血への動員作用を更に増強することが明ら
かとなった。

【００３８】

【表１】

【００３９】〔試験例２〕この試験は、本発明の動員増
強剤及び／又はＧ−ＣＳＦの投与後、末梢血単核球中に
コロニー形成能を有する好中球・マクロファージ系前駆
細胞（以下、「ＣＦＵ−ＧＭ」と略記する。）が動員さ
れていることを確認するために行った。

【００４０】（１）試料の調製 試験例１と同様の方法で調製した試験試料群、対照試料
群２種類、及び陰性試料群の各末梢血溶液に、各々等量
の０．５％ウシ血清アルブミン及び０．２ｍＭエチレン
ジアミン四酢酸二ナトリウムを含むダルベッコリン酸緩
衝液を加えて、リンホライト−Ｍ（セダレーン社）に重
層し、１９００回転で、４℃、３０分間遠心分離して単
核球層の細胞を回収した。末梢血から分離した単核球
は、７．５％牛胎児血清（以下、「ＦＣＳ」と略記する
ことがある。）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（ア
イシーエヌ社製）に１ｍｌ当たり５×１０⁶個となるよ
うに懸濁して、試験試料群、対照試料群２種類、及び陰
性試料群の単核球懸濁液を調製した。

【００４１】（２）試験方法 ３０ｍｍシャーレ（ファルコン社製）１枚当たりに、予
め、成長因子として組換え型マウス顆粒球・マクロファ
ージコロニー刺激因子（ベーリンガーマンハイム社製）
を５０単位ずつ添加し、次いで５×１０⁶個／ｍｌとな
るように調製した前記試験試料群、対照試料群２種類、
及び陰性試料群の単核球懸濁液を、それぞれ細胞数が５
×１０⁵個となるように１００μｌずつ添加した。更
に、２２％ＦＣＳを含むマッコイ５Ａ培地（ギブコ社
製）に、終濃度が０．３３％になるように寒天（ディフ
コ社製）を溶解した軟寒天培地溶液９００μｌずつをシ
ャーレに添加して、炭酸ガスインキュベータにて３７℃
で培養し、７日後に形成されるコロニーを倒立顕微鏡下
で計数した。

【００４２】（３）試験結果 本試験の結果は表２に示すとおりである。表２は形成さ
れたＣＦＵ−ＧＭのコロニー数の結果である。表２から
明らかなとおり、本発明の動員増強剤とＧ−ＣＳＦを併
用投与した試験試料群と、Ｇ−ＣＳＦのみを投与した対
照試料群２ではＣＦＵ−ＧＭが効果的に末梢血中に動員
されていることが確認された。更に、試験試料群は、対
照試料群２に比して、より多くのＣＦＵ−ＧＭを動員す
ることが確認された。陰性試料群及び本発明の動員増強
剤単独投与の対照試料群１では、末梢血中にＣＦＵ−Ｇ
Ｍを動員する作用は確認されなかった。

【００４３】従って、本発明の動員増強剤は、Ｇ−ＣＳ
Ｆと併用して投与することにより、Ｇ−ＣＳＦが有する
造血前駆細胞動員効果を増強するとともに、コロニー形
成能を有するＣＦＵ−ＧＭを末梢血に動員する作用を増
強することが明らかとなった。

【００４４】

【表２】

【００４５】〔試験例３〕この試験は、本発明の動員増
強剤及び／又はＧ−ＣＳＦの投与後、末梢血単核球中に
コロニー形成能を有する単球・マクロファージ系前駆細
胞（以下、「ＣＦＵ−Ｍ」と略記する。）が動員されて
いることを確認するために行った。 （１）試料の調製 試験例２の試料の調製方法と同様の方法で試験試料群、
対照試料群２種類、及び陰性試料群の単核球懸濁液を調
製した。

【００４６】（２）試験方法 試験例２の成長因子を組換え型ヒトＭ−ＣＳＦ（森永乳
業社製：以下、「ｒｈＭ−ＣＳＦ」と略記することがあ
る。）に変更し、シャーレ１枚当たり１０００単位ずつ
添加したこと以外は、試験例２の試験方法と同様に行っ
た。

【００４７】（３）試験結果 本試験の結果は表３に示すとおりである。表３は形成さ
れたＣＦＵ−Ｍのコロニー数の結果である。表３から明
らかなとおり、本発明の動員増強剤とＧ−ＣＳＦを併用
投与した試験試料群と、Ｇ−ＣＳＦのみを投与した対照
試料群２ではＣＦＵ−Ｍが効果的に末梢血中に動員され
ていることが確認された。更に、試験試料群は、対照試
料群２に比して、より多くのＣＦＵ−Ｍを動員すること
が確認された。陰性試料群及び本発明の動員増強剤単独
投与の対照試料群１では、末梢血中にＣＦＵ−Ｍを動員
する作用は確認されなかった。

【００４８】従って、本発明の動員増強剤は、Ｇ−ＣＳ
Ｆと併用して投与することにより、Ｇ−ＣＳＦが有する
造血前駆細胞動員効果を増強するとともに、試験例２で
明らかとなったコロニー形成能を有するＣＦＵ−ＧＭへ
の効果以外に、ＣＦＵ−Ｍも末梢血に動員する作用を増
強することが明らかとなった。

【００４９】

【表３】

【００５０】〔試験例４〕この試験は、本発明の動員増
強剤及び／又はＧ−ＣＳＦの投与後、末梢血単核球中に
コロニー形成能を有する巨核球系前駆細胞（以下、「Ｃ
ＦＵ−Ｍｅｇ」と略記する。）が動員されていることを
確認するために行った。 （１）試料の調製 試験例２の試料の調製方法と同様の方法で試験試料群、
対照試料群２種類、及び陰性試料群の単核球懸濁液を調
製した。

【００５１】（２）試験方法 試験例２の成長因子を、シャーレ１枚当たり、組換え型
マウストロンボポエチン（ジェンザイム社製：以下、
「ｒｍＴＰＯ」と略記することがある。）２５ｎｇ、組
換え型マウスステムセルファクター （バイオソース社
製：以下、「ｒｍＳＣＦ」と略記することがある。）１
００ｎｇ、及び組換え型マウスインターロイキン−３
（バイオソース社製：以下、「ｒｍＩＬ−３」と略記す
ることがある。）２０ｎｇの３種類に変更して併せて添
加したこと以外は、試験例２の試験方法と同様に行っ
た。

【００５２】（３）試験結果 本試験の結果は表４に示すとおりである。表４は形成さ
れたＣＦＵ−Ｍｅｇのコロニー数の結果である。表４か
ら明らかなとおり、本発明の動員増強剤とＧ−ＣＳＦを
併用投与した試験試料群と、Ｇ−ＣＳＦのみを投与した
対照試料群２ではＣＦＵ−Ｍｅｇが効果的に末梢血中に
動員されていることが確認された。更に、試験試料群
は、対照試料群２に比して、より多くのＣＦＵ−Ｍｅｇ
を動員することが確認された。陰性試料群及び本発明の
動員増強剤単独投与の対照試料群１では、末梢血中にＣ
ＦＵ−Ｍｅｇを動員する作用は確認されなかった。

【００５３】従って、本発明の動員増強剤は、Ｇ−ＣＳ
Ｆと併用して投与することにより、Ｇ−ＣＳＦが有する
造血前駆細胞動員効果を増強するとともに、ＣＦＵ−Ｇ
ＭやＣＦＵ−Ｍへの効果以外に、ＣＦＵ−Ｍｅｇも末梢
血に動員する作用を増強することが明らかとなった。

【００５４】

【表４】

【００５５】〔試験例５〕この試験は、本発明の動員増
強剤及び／又はＧ−ＣＳＦの投与後、末梢血単核球中に
コロニー形成能を有する早期赤芽球系前駆細胞（以下、
「ＢＦＵ−Ｅ」と略記する。）が動員されていることを
確認するために行った。 （１）試料の調製 試験例２の試料の調製方法と同様の方法で試験試料群、
対照試料群２種類、及び陰性試料群の単核球懸濁液を調
製した。

【００５６】（２）試験方法 試験例２の成長因子を、シャーレ１枚当たり、組換え型
ヒトエリスロポエチン（中外製薬社製：以下、「ｒｈＥ
ＰＯ」と略記することがある。）を２単位、及びｒｍＳ
ＣＦ（バイオソース社製）を１００ｎｇの２種類に変更
して併せて添加したこと以外は、試験例２の試験方法と
同様に行った。

【００５７】（３）試験結果 本試験の結果は表５に示すとおりである。表５は形成さ
れたＢＦＵ−Ｅのコロニー数の結果である。表５から明
らかなとおり、本発明の動員増強剤とＧ−ＣＳＦを併用
投与した試験試料群と、Ｇ−ＣＳＦのみを投与した対照
試料群２ではＢＦＵ−Ｅが効果的に末梢血中に動員され
ていることが確認された。更に、試験試料群は、対照試
料群２に比して、より多くのＢＦＵ−Ｅを動員すること
が確認された。陰性試料群及び本発明の動員増強剤単独
投与の対照試料群１では、末梢血中にＢＦＵ−Ｅを動員
する作用は確認されなかった。

【００５８】従って、本発明の動員増強剤は、Ｇ−ＣＳ
Ｆと併用して投与することにより、Ｇ−ＣＳＦが有する
造血前駆細胞動員効果を増強するとともに、ＣＦＵ−Ｇ
ＭやＣＦＵ−Ｍ、及びＣＦＵ−Ｍｅｇへの効果以外に、
ＢＦＵ−Ｅも末梢血に動員する作用を増強することが
明らかとなった。

【００５９】

【表５】

【００６０】〔試験例６〕この試験は、本発明の動員増
強剤及び／又はＧ−ＣＳＦの投与後、骨髄系細胞コロニ
ーよりもさらに未分化な初期造血系高増殖能コロニー形
成細胞（以下、「ＨＰＰ−ＣＦＣ」と略記する。）が動
員されていることを確認するために行った。 （１）試料の調製 試験例２の試料の調製の単核球の調製と同様の方法で、
試験試料群、対照試料群２種類、及び陰性試料群の単核
球懸濁液を調製した。

【００６１】（２）試験方法 ３０ｍｍシャーレ（ファルコン社製）に成長因子とし
て、ｒｍＳＣＦ（バイオソース社製）１００ｎｇ、ｒｍ
ＩＬ−３（バイオソース社製）２０ｎｇ、組換え型ヒト
インターロイキン−１（ジェンザイム社製：以下、「ｒ
ｈＩＬ−１」と略記することがある。）５ｎｇ、及びｒ
ｈＭ−ＣＳＦ（森永乳業社製）１００ｎｇを添加した。
次いで、３７℃に保温した、ビタミンおよびグルタミン
を添加した２０％ＦＣＳを含むマッコイ５Ａ培地（ギブ
コ社製）に、終濃度が０．５％になるように寒天（ディ
フコ社製）を溶解した軟寒天培地溶液を１ｍｌずつを加
えて混和し、寒天培地下層とした。

【００６２】前記試験試料群、対照試料群２種類、及び
陰性試料群の各単核球懸濁液を、０．３３％寒天溶液で
５倍に希釈（１×１０⁶個／ｍｌ）して単核球寒天培地
懸濁液を調製し、これを前記シャーレ中の寒天培地下層
の上に０．５ｍ流し込み、均一に広げて固めた後、炭酸
ガスインキュベータにて３７℃で培養した。１４日後、
形成されたコロニー数を肉眼で計数した。

【００６３】（３）試験結果 この試験の結果は表６に示すとおりである。表６は、形
成されたＨＰＰ−ＣＦＣのコロニー数の結果である。表
６から明らかなとおり、陰性試料群に比して、対照試料
群２である従来の造血前駆細胞の動員剤Ｇ−ＣＳＦによ
ってＨＰＰ−ＣＦＣは増加し、対照試料群１である本発
明の動員増強剤を単独で投与することでも、ＨＰＰ−Ｃ
ＦＣは若干増加することが確認された。更に、試験試料
群である本発明の動員増強剤とＧ−ＣＳＦを併せて投与
することにより、ＨＰＰ−ＣＦＣの動員作用は顕著に増
強された。

【００６４】従って、本発明の動員増強剤は、Ｇ−ＣＳ
Ｆと併用して投与することにより、Ｇ−ＣＳＦが有する
ＨＰＰ−ＣＦＣの末梢血中への動員を効果的に増強する
ことが明らかとなった。

【００６５】

【表６】

【００６６】

【発明の効果】以上詳記したとおり、本発明は造血前駆
細胞の動員増強剤に関し、本発明によって奏される効果
は次のとおりである。 （１）本発明の造血前駆細胞動員増強剤は、従来の造血
前駆細胞動員剤と併用することにより、その動員効果を
確実に増強し、コロニー形成能を有する未熟な造血前駆
細胞を効果的且つ簡便に末梢血中に動員することが可能
である。 （２）本発明の造血前駆細胞動員増強剤の有効成分であ
るマクロファージコロニー刺激因子は、医薬品としてす
でに認可されており、安全に使用することが可能であ
る。 （３）本発明の造血前駆細胞動員増強剤は、末梢血幹細
胞移植及び末梢血前駆細胞移植に有効な医薬品として利
用することが可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 桜井 琢磨 神奈川県座間市東原５丁目１番83号 森永 乳業株式会社生物科学研究所内 (72)発明者 三澤 江里子 神奈川県座間市東原５丁目１番83号 森永 乳業株式会社生物科学研究所内 Ｆターム(参考） 4C084 AA01 AA16 DA19 MA02 NA05 ZA512

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 マクロファージコロニー刺激因子類、及
   び該因子類の薬学的に許容される塩類からなる群より選
   択される１種又は２種以上の混合物を有効成分として含
   有する造血前駆細胞動員増強剤。
2. 【請求項２】 顆粒球コロニー刺激因子と組合せて使用
   されることを特徴とする請求項１に記載の造血前駆細胞
   動員増強剤。
3. 【請求項３】 顆粒球コロニー刺激因子をさらに含有す
   る請求項１に記載の造血前駆細胞動員増強剤。