JP2023534466A - 造血幹細胞の可動のためのサブスタンスpの併用療法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、サブスタンスP及びAMD3100又はその薬学的に許容される塩を含む血中の大量の造血幹細胞を可動化するための併用療法(combination therapy)及び併用製品(combination product);サブスタンスP及びAMD3100又はその薬学的に許容される塩を順次投与した個体から得た末梢血から可動化造血幹細胞を含む血液分画を分離する工程を含む、大量の可動化造血幹細胞を採取する方法;及びサブスタンスP及びAMD3100又はその薬学的に許容される塩を含む配合物の血中の大量の造血幹細胞を可動化するための使用に関する。
Description
本発明は、サブスタンスP(substance P)及びAMD3100又はその薬学的に許容される塩を含む血中の大量の造血幹細胞を可動化するための併用療法(combination therapy)及び併用製品(combination product);サブスタンスP及びAMD3100又はその薬学的に許容される塩を順次投与した個体から得た末梢血から可動化造血幹細胞を含む血液分画を分離する工程を含む、大量の可動化造血幹細胞を採取する方法;及びサブスタンスP及びAMD3100又はその薬学的に許容される塩を含む配合物の血中の大量の造血幹細胞を可動化するための使用に関するものである。
骨髄から末梢血に動員又は移動した造血幹細胞(HSC)を、血液疾患に苦しむ患者に移植することが、従来の骨髓移植に取って代わった。骨髄から末梢血への造血幹細胞の動員のためのいくつかの臨床的実施は、CXCR4/SDF-1相互作用を切断するプロテアーゼの産生を刺激すると考えられる組換え顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)(Granulocyte colony stimulating factor)の少なくとも5日間連続して投与する療法で達成される。顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)は、好中性顆粒球(neutrophil granulocyte)前駆細胞及び成熟好中球(mature neutrophils)の生存、増殖、分化及び機能を刺激する糖タンパク質である。
しかし、G-CSFは、大規模の患者コホートでは効果がなく、いくつかの副作用、例えば、骨の痛み、脾臓の肥大、まれに脾臓の破裂、心筋梗塞及び脳血管疾患などを伴うことが報告されている。また、G-CSFは、強い炎症反応を誘発し、幹細胞以外にも様々な種類の血液細胞の末梢血への動員を誘導することが確認されており、長期間投与すると血栓性合併症を引き起こす危険性が報告されている。特に、G-CSFは少なくとも連続5日間の皮下注射が必要であり、その間、患者の大腿部の痛みを伴うため、G-CSFの臨床使用には注意が必要である。また、G-CSFの主な機序は、好中球(neutrophil)産生の促進であり、好中球減少症の治療が主要な標的となっている。
G-CSFの本質的な欠点は、小分子に基づく代替動員方法を特定する努力につながっている。例えば、FDA承認のCXCR4拮抗剤AMD3100(プレリキサフォル(Plerixafor);Mozobil(登録商標))は毒性の問題が限定的であり、造血幹細胞を迅速に動員することが知られている。しかし、AMD3100を用いた臨床的動員は、G-CSFと併用される場合にのみに有効であることが明らかになった。G-CSFとADM3100の併用療法の現在の臨床用法/用量は、皮下注射によりG-CSFを1日1回、連続5日間注射し、AMD3100投与から1時間後に採血し、このとき、造血幹細胞の末梢血への移動が最大になることが知られている。
しかし、G-CSFとADM3100の併用療法に対する反応は患者によって異なり、血中の造血幹細胞のレベルに変化がない患者(non-responder)が存在することが知られている。また、臨床的にG-CSFが最も広く使用されている動員剤(migrator)であるとしても、G-CSFにはさらなる欠点がある(例えば、毒性の副作用の可能性、強い炎症反応の誘発、比較的長い治療過程(例:5~7日の連続注射)及び患者間で反応が異なる)。
したがって、迅速で選択的且つG-CSFに依存しない動員方式に対する検索は、依然として臨床的関心の対象となっている。G-CSFに代わる動員剤の研究開発が現在進行中である。
Shun Heらは、マウスにおけるFLT3リガンド(FLT3L)とAMD3100の併用投与が造血幹細胞の動員を増加させることを報告した(非特許文献1)。
また、MP Rettigらは、インテグリンα4β1(非常に遅い抗原4(VLA-4))阻害剤とCXCR4阻害剤の併用投与により、造血幹細胞(HSC)及び造血前駆細胞(HSPC)を動員する方法を開示している。特に、マウスにおけるVLA-4拮抗剤であるBIO5192とAMD3100の併用投与は、造血前駆細胞(HPSC)の動員に相加効果があることが報告されている(非特許文献2)。
さらに、Kasia Mierzejewskaらは、マウスにおけるフェニルヒドラジン(PHZ)とCXCR4阻害剤であるAMD3100の併用投与により、造血幹細胞の動員を増加したことを報告した(非特許文献3)。
また、特許文献1は、α9(アルファ9)インテグリン拮抗剤とCXCR4拮抗剤を用いてHSCの離脱及び放出させる方法を開示している。
しかし、このようなG-CSFに代わる動員剤に関する研究開発にもかかわらず、G-CSFとAMD3100の併用投与が現在唯一の標準治療法として認定されている実状である。
一方、サブスタンスPは、感覚ニューロン、マクロファージ、好酸球、内皮細胞、上皮細胞及び角膜実質細胞などの角膜細胞、及び肉芽組織で発現する11個のアミノ酸を含む神経ペプチドである。いくつかの報告は、サブスタンスPが造血調節のための神経免疫コミュニケーションに関与していることを示唆している。サブスタンスP神経の神経線維は骨髄基質に分布しており、サブスタンスPは骨髄基質細胞の表面受容体NK-1を介して信号を伝達し、骨髄基質細胞を刺激して、骨髄基質細胞が供給者として造血の促進に有利な幹細胞因子及びインターロイキン-1を産生するようにする。
本発明者らは、前記の研究における間葉系幹細胞の移動及び間葉系幹細胞の再増殖(repopulation)におけるサブスタンスPの役割と関して、特許文献2においてサブスタンスPの創傷治癒剤又は創傷治癒促進剤としての使用、サブスタンスPの間葉系幹細胞放出又は放出促進剤としての使用、サブスタンスPの間葉系幹細胞増殖又は増殖促進剤としての使用、及びそれからの創傷治癒剤又は創傷治癒促進剤としての使用を明らかにした。
しかし、これまでサブスタンスPとAMD3100の併用療法については何も知られていなかった。
Shun He et al., "FLT3L and Plerixafor Combination Increases Hematopoietic Stem Cell Mobilization and Leads to Improved Transplantation Outcome," Biol Blood Marrow Transplant (2014), 20(3): 309-313
MP Rettig et al., "Mobilization of hematopoietic stem and progenitor cells using inhibitors of CXCR4 and VLA-4," Leukemia (2012), 26: 34-53
Kasia Mierzejewska et al., "Sphingosine-1-phosphate-Mediated Mobilization of Hematopoietic Stem/Progenitor Cells during Intravascular Hemolysis Requires Attenuation of SDF-1-CXCR4 Retention Signaling in Bone Marrow," Hindawi Publishing Corporation, BioMed Research International (2013), Article ID 814549, p. 5
本発明者らは、G-CSFは、比較的長い治療過程(例えば、5日~7日間の連続注射)を必要とし、また、強い炎症反応を誘発する副作用が有するため、血中の造血幹細胞の動員のための従来のG-CSFとADM3100併用療法に取って代わることができる併用療法を提供することを目的としている。
本発明者らは、前記課題を解決するために研究を重ねた結果、G-CSFの代わりにサブスタンスPをAMD3100と併用すると、サブスタンスPの1回の静脈注射で造血幹細胞を末梢血に稼動するのと同じ効果あり、サブスタンスPは、G-CSFが有する強力な好中球動員剤(neutrophil mobilizer)の機能を持たないため、炎症反応の副作用がはるかに少なく、従来のG-CSFとADM3100の併用療法と比較して、より多くの造血幹細胞を血中に稼動する可能性があることを見出し、本発明を完成に至った。
そこで、本発明の目的は、サブスタンスP及びAMD3100又はその薬学的に許容される塩を含む血中の大量の造血幹細胞を可動化するための併用療法(combined therapy)を提供することである。
本発明の別の目的は、サブスタンスP及びAMD3100又はその薬学的に許容される塩を含む血中の大量の造血幹細胞を可動化するのための併用製品(combination product)を提供することである。
本発明の別の目的は、サブスタンスP及びAMD3100又はその薬学的に許容される塩を順次投与した個体から得た末梢血から可動化造血幹細胞を含む血液分画を分離する工程を含む、大量の可動化造血幹細胞を採取する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、サブスタンスP及びAMD3100又はその薬学的に許容される塩を含む配合物の血中の大量の造血幹細胞を可動化するための使用を提供することである。
本発明のサブスタンスP及びAMD3100又はその薬学的に許容される塩を含む併用療法は、サブスタンスPの1回の静脈注射のみで造血幹細胞を末梢血に稼動させ、5~7日間の連続注射の長い治療過程を必要とする従来のG-CSFとADM3100併用療法と比較して、治療中の患者の負担を大幅に軽減し、サブスタンスPは、G-CSFが有する強力な好中球動員剤(neutrophil mobilizer)の機能を持たないため、炎症反応の副作用がはるかに少なく、従来のG-CSFとADM3100の併用療法と比較して、血中の造血幹細胞をより多く稼動できる可能性がある。また、本発明の採取方法により採取された血液分画は、可動化造血幹細胞を大量に含んでいるため、血液疾患を罹患している患者に移植又は再注入して、造血幹細胞を必要とする様々な疾患の予防又は治療に使用することができる。
本発明者らは、G-CSFの代わりにサブスタンスPをAMD3100と併用すると、サブスタンスPが1回の静脈注射のみで造血幹細胞を末梢血に稼動させるという同様の効果を示し、サブスタンスPは、G-CSFが有する強力な好中球動員剤(neutrophil mobilizer)の機能を持たないため、炎症反応の副作用がはるかに少なく、従来のG-CSFとADM3100の併用療法と比較して、より多くの造血幹細胞を血中に稼動する可能性があることを見出した。
従って、本発明は、サブスタンスPとAMD3100又はその薬学的に許容される塩を含む血中の大量の造血幹細胞可動化のための併用療法(combined therapy)を提供する。
本発明はまた、サブスタンスPとAMD3100又はその薬学的に許容される塩を含む血中の大量の造血幹細胞可動化のための併用製品(combination product)を提供する。
本発明はまた、サブスタンスP及びAMD3100又はその薬学的に許容される塩を順次投与した個体から得た末梢血から可動化造血幹細胞を含む血液分画を分離する工程を含む、大量の可動化造血幹細胞を採取する方法を提供する。
本発明はまた、サブスタンスP及びAMD3100又はその薬学的に許容される塩を含む配合物の血中の大量の造血幹細胞を可動化するための使用を提供する。
本明細書で使用される用語「物質P(substance P)」は、「サブスタンスP」又は「SP」と同じ意味で使用される。
本明細書で使用される用語「造血幹細胞」は、「造血幹細胞」又は「造血幹細胞及び前駆細胞」と同じ意味で使用される。
本明細書で使用される用語「動員(migration)」、「移動(migration)」及び「可動(mobilization)」は、すべて同じ意味で使用される。
本明細書で使用される用語「併用療法(combined therapy)」は、「配合物又は組合わせ物(combination)」と同じ意味で使用される。「併用療法」は、2つ以上の薬物を一緒に使用することを意味する。従って、2つ以上の薬物が組成物として混合される必要はなく、個々の製剤として使用されてもよい。このように、「併用療法」は、2つ以上の薬物の同時、個別又は順次投与が可能であるように、2つ以上の薬物の個々の製剤を含む。
本明細書で使用される用語「併用製品(combination product)」は、前記「併用療法(combination therapy)」の完製品(finished product)の形態を意味する。例えば、2つ以上の薬物がある場合、併用製品は、これらの薬物を配合物の形態で含む完製品を意味する。2つ以上の薬物は、完製品内の単一の製剤として包装され、同時に投与されてもよいし、又は完製品の2つの個々の製剤に包装され、同時に、別々に又は順次投与されてもよい。そのような完製品の例は、「キット(kit-of-parts)」が挙げられる。
本発明で使用される用語「個体」は、本発明の可動化造血幹細胞の大量採取する方法に適用可能な動物であり、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳類動物であり、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ヤギ、ブタ、ラット、モルモット、ハムスター、チンパンジー又はゴリラを含む動物である。最も好ましくは、前記個体はヒトである。
本発明の一実施形態において、サブスタンスP及びAMD3100又はその薬学的に許容される塩を含む血中の大量の造血幹細胞可動化のための併用療法(combined therapy)において、サブスタンスP及びAMD3100は順次投与することができる。具体的には、まずサブスタンスPを投与し、次にAMD3100が投与される。より具体的には、サブスタンスPを1回投与又は2日間連続して2回投与し、約1~2日後にAMD3100を1回投与する。
本発明の一実施形態において、サブスタンスP及びAMD3100又はその薬学的に許容される塩を含む血中の大量の造血幹細胞可動化のための併用製品(combination product)において、サブスタンスP及びAMD3100を順次投与することができる。具体的には、まずサブスタンスPを投与し、次にAMD3100が投与される。より具体的には、サブスタンスPを1回又は2回投与又は2日間連続して2回投与し、約1~2日後にAMD3100を1回投与する。
本発明の一実施形態において、サブスタンスP及びAMD3100の投与形態は特に限定されず、好ましくは注射などによって非経口投与することができる。具体的には、サブスタンスPを静脈内投与し、AMD3100は腹膜内投与する。また、サブスタンスP及びAMD3100は、投与対象の種類と状態などを考慮して、造血幹細胞を末梢血に可動化させるのに十分な量を1回又は数回投与することができる。
本発明の一実施形態において、サブスタンスPは、0.1~100μg/kg、好ましくは1~20μg/kgの用量で1回又は2日間連続して2回投与することができ、AMD3100は、100~500μg/kg、好ましくは250μg/kgの用量で1回又は数回投与することができる。しかし、前記投与形態、投与回数、及び投与量は当業者の判断により適宜変更することができる。
本発明の一実施形態において、サブスタンスP及びAMD3100又はその薬学的に許容される塩を含む血中の大量の造血幹細胞可動化のための併用製品(combination product)はキット(kit-of-parts)形態であってもよい。
本発明の一実施形態において、サブスタンスP及びAMD3100又はその薬学的に許容される塩を順次投与した個体から得た末梢血から可動化造血幹細胞を含む血液分画を分離する工程を含む、大量の可動化造血幹細胞を採取する方法において、前記血液分画を分離する工程は、アフェレーシス(apheresis)を用いて行うことができる。
サブスタンスPは、感覚ニューロン、マクロファージ、好酸球、内皮細胞、上皮細胞及び角膜実質細胞などの角膜細胞、及び肉芽組織で発現する11個のアミノ酸を含む神経ペプチドである。本発明で使用するサブスタンスPは、既知のアミノ酸配列情報からの合成、使用個体からの分離、市販製剤からの入手など、様々な経路を経て得ることができる。例えば、市販のサブスタンスPには、サブスタンスP酢酸塩水和物(sigma社)、サブスタンスP(Anygen社)、ブスタンスP(Merck Millipore社)などが含まれる。
AMD3100は、プレリキサフォル(Plerixafor)とも呼ばれ、その化合物名が1,1’-[1,4-フェニレンビス(メチレン)]ビス[1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン]リン化合物であり、ケモカイン受容体であるCXCR4の拮抗剤(antagonist)として機能することが知られている(米国特許第5,612,478号を参照)。
本発明で使用されるAMD3100は、様々な経路、例えば、当該技術分野で知られている化学的合成方法及び市販製剤から入手するすることができる。例えば、市販のMD3100には、Mozobil(登録商標)(Sanofi-Aventis社製)などがある。
また、本発明で使用されるAMD3100は、薬学的に許容される塩の形態で使用することができる。例えば、適切な酸付加塩は、生体適合性の無機酸(例えば、HCl、HBr、硫酸及びリン酸など)、有機酸(例えば、酢酸、プロピオン酸及び酪酸など)及び一つ以上のカルボキシル基を含有する酸(例えば、シュウ酸、グルタル酸、アジピン酸など)の塩を含むことができる。
さらに、本発明で使用されるAMD3100は、プロドラッグの形態、即ち、対象体への投与後に本発明の化合物を放出させる保護形態で製造及び使用することができる。また、精製された形態で製造した場合、化合物は水和物として結晶化することができる。
本発明のサブスタンスP及びAMD3100又はその薬学的に許容される塩を含む併用療法を使用した大量の可動化造血幹細胞を採取する方法は、具体的には、(a)サブスタンスP及びAMD3100又はその薬学的に許容される塩を順次投与した個体の末梢血から血液分画を分離する工程;及び(b)前記血液分画を濃縮する工程;を含むことができる。
本発明の一実施形態において、前記個体は、脊椎動物、より好ましくはヒトを含む哺乳動物であってもよい。本発明において、大量採取された造血幹細胞は、血管疾患の予防又は治療に使用されるため、治療対象の患者から取得することが最も好ましい。
本発明の一実施形態において、前記採取方法において、まずサブスタンスPを投与し、次いでAMD3100を投与し、AMD3100の投与から約1~5時間後に採血した。より具体的には、サブスタンスPを1回投与し、又は2日間連続して2回投与した後、約1~2日後にAMD3100を1回投与し、AMD3100の投与後、約1~3時間後に採血した。
前記工程(a)における末梢血から血液分画を分離は、従来から知られている血液成分の採取方法、例えば、末梢血をアフェレーシス装置(apheresis machine)に通して採取することにより行うことができる。当該技術分野で広く使用されているアフェレーシス装置の例は、MCS 3p、CS-3000 plus、COBE Spectraなどであるが、本発明はこれらに制限されない。血液が中心静脈カテーテルを介してアフェレーシス装置に入ると、血液分画が装置によって採集され、残りの血液はカテーテルを介して体内に戻すことができる。この過程は、約4~10時間かかる場合があり、治療目的に使用するのに十分な細胞分画を採集するために、2~10日間連続して繰り返される場合がある。
本発明の一実施形態において、前記工程(b)は、工程(a)で分離された血液分画を濃縮する工程である。好ましくは、血液分画の濃縮は、血液遠心分離機を使用して行うことができる。遠心分離条件は当業者が状況に応じて適宜調整し、血漿成分を除去して赤血球を除いた単球成分からなる濃縮液(血液細胞層画分)を得ることができる。本発明の特定の実施形態では、血液分画をフィコール(Ficoll)層上に置き、20分間遠心分離して(813g、Megafuge8R;Thermo Scientific社)、合計4つの層を得た。最上層が血漿で、二層目が赤血球を除いた血液細胞層、3層目がフィコール、最下層が赤血球層であった。このうちの血液細胞層が大量の可動化造血幹細胞を含む濃縮液として得られたが、本発明はそれに限定されない。
以下、実施例を用いて本発明の構成及び効果をより詳細に説明する。これらの実施例は、本発明の理解を助けるための例示に過ぎず、本発明の範囲がそれらに限定されるもののではない。
実施例1:SP単独による造血幹細胞の可動化(mobilization)
正常な生理学的状態のみで投与された薬剤の効果を確認するために、傷のない正常群を使用してSPの効果をテストした。これは、負傷した動物の場合、傷から分泌される他の多くの因子があるため、そのような因子を投与された動物の効果と区別することは困難であり、特に、SPとG-CSFの両方が体内の内因性物質であるためである。
正常な生理学的状態のみで投与された薬剤の効果を確認するために、傷のない正常群を使用してSPの効果をテストした。これは、負傷した動物の場合、傷から分泌される他の多くの因子があるため、そのような因子を投与された動物の効果と区別することは困難であり、特に、SPとG-CSFの両方が体内の内因性物質であるためである。
SP単独による造血幹細胞可動化効果を確認するために、各群5匹のウサギを準備した。SP(6.7μg/kg、Sigma Aldrich社)を耳静脈から2回投与し、同じ動物の血中の造血幹細胞のレベルを3日間比較した。G-CSF(10μg/kg、JW Pham社)は、従来の臨床用量で使用されたが、SPと同じ用法(つまり、静脈注射)で処理した。薬物注射後、1日1回5mL採血し、15mLチューブ(Falcon社)に添加し、PBS(welgene社)で2倍希釈した。血液細胞を分離するためにFicoll-paque(Amersham社)を新しいチューブに5mLずつ入れ、その上に希釈した血液を載せた。Ficoll層と血液層が混ざらないようチューブの取り扱いに注意し、血液層を完全にチューブに入った後、遠心分離(813g、Megafuge 8R、Thermo scientific社)を20分間行った。遠心分離後、層を分離し、合計4層を得た。最上層は血漿、二層目は赤血球を除いた血液細胞層、三層目がフィコール、最下層は赤血球層であった。このうち、血液細胞層のみ分離してチューブに入れ、PBSを加えて遠心分離した。5×106個の血液細胞を35mププレートに入れ、HSC-CFU培地(Hematopoietic stem cells-colony forming unit media、購入先:Miltenyi社)で培養した。培地を交換せずに初期状態で2週間培養しながら、コロニー数を毎日観察し、最終的にカウントした。その結果を図1に示した。
図1に示すように、SP注射後、造血幹細胞可動化は2日目に最も高く、3日目まで維持された。一方、同じ用法(静脈注射)ので投与されたG-CSFは、造血幹細胞可動化においてごくわずかな効果を示した。特に、0日目(投与直前)と同様のレベルを維持しながら、1日目に増加したように見え、それ以上増加することはなかった。具体的には、0日目の1Xに基づいて、1日目のSPは3X(3倍)、CSFは2X(2倍);2日目のSPは7X(7倍)、CSFは2.5X(2.5倍);3日目のSPは6X(6倍)、CSFは0.6X(0.6倍)を示した。
G-CSFの主な機序は、好中球産生の刺激である。好中球を末梢血に可動化するのに有効な濃度のG-CSFによる造血幹細胞の血中への可動化する程度をSPと比較すると、SPは、G-CSFよりも効率的に血中の造血幹細胞可動化を誘導することが分かった。
実施例2:血中免疫細胞に対するSPの効果
血中の免疫細胞の比率に対するSPの効果を確認するために、各群に5匹のウサギを用意した。SP(6.7μg/kg)を耳静脈から2回投与した後、同じ動物の血液中の免疫細胞の比率を3日間比較した。G-CSF(10μg/kg、JW Pham社)を従来の臨床用量で使用し、SPと同じ用法(静脈注射)で処理した。投与後、1日間隔で1mLの血液を採血し、EDTAを含むチューブに移し、診断機器を用いて分析した。
血中の免疫細胞の比率に対するSPの効果を確認するために、各群に5匹のウサギを用意した。SP(6.7μg/kg)を耳静脈から2回投与した後、同じ動物の血液中の免疫細胞の比率を3日間比較した。G-CSF(10μg/kg、JW Pham社)を従来の臨床用量で使用し、SPと同じ用法(静脈注射)で処理した。投与後、1日間隔で1mLの血液を採血し、EDTAを含むチューブに移し、診断機器を用いて分析した。
血中の総白血球中のリンパ球、単球、好中球、好塩基球、好酸球の比率をCBC Countで分析し、その結果を図2に示した。
図2に示すように、SPの投与は、血中の免疫細胞の分布に有意に影響を与えなかったが、G-CSFは、血中の代表的な炎症細胞である好中球の比率を投与後1日目から増加させ、2日目には約65%まで増加させた。
これらは傷のない正常群の結果であり、患者は、すでに高レベルの炎症を起こしているため、G-CSFを使用すると副作用が大きくなる可能性があることを示している。
実施例3:SPとAMD3100併用療法による造血幹細胞の可動化
臨床用量/用法に基づいて、G-CSFとSPの効果を比較するために、8週齢のC57Bl/6の5匹のマウスを群ごとに用意した。ビヒクル(生理食塩水)投与群、G-CSF+AMD3100投与群、SP+AMD3100投与群の3群に分けた。
臨床用量/用法に基づいて、G-CSFとSPの効果を比較するために、8週齢のC57Bl/6の5匹のマウスを群ごとに用意した。ビヒクル(生理食塩水)投与群、G-CSF+AMD3100投与群、SP+AMD3100投与群の3群に分けた。
G-CSF(250μg/kg、皮下、STEM CELL社)又はSP(6.7μg/kg、静脈内、Sigma Aldrich社)をそれぞれマウスに投与した。G-CSFは、従来の臨床スケジュールに従って連続して5日間皮下投与し、SPは連続2日間静脈内投与した。AMD3100は、通常の臨床スケジュールに従って各投与の最終日又は1日後に投与され、投与の1時間後に採血した。
図3は、従来のG-CSFとADM3100の併用療法の投与スケジュール及び本発明のサブスタンスPとAMD3100の併用療法の投与スケジュールを概略的に示した模式図である。
AMD3100投与後、マウス全血1mLを注射器(ヘパリン入り)で分取 した。血液を15mLチューブに入れ、PBS(welgene社)を加えて2倍希釈した。血液細胞を分離するために、Ficoll-paque(Amersham社)を新しいチューブに3mLずつ入れ、その上に希釈さした血液を載せた。フィコール層と血液層が混ざらないようにチューブの取り扱いに注意し、血液層を完全にチューブに入った後、遠心分離(813g、Megafuge 8R、Thermo scientific社)を20分間行った。遠心分離後、層を分離し、合計4層を得た。最上層は血漿、二層目は赤血球を除いた血液細胞層、三層目がフィコール、最下層は赤血球層であった。このうち、血液細胞層のみ分離してチューブに入れ、PBSを加えて遠心分離した。5×106個の血液細胞を35mププレートに入れ、HSC-CFU培地(Hematopoietic stem cells-colony forming unit media、購入先:Miltenyi社)で培養した。培地を交換せずに初期状態で2週間培養しながら、コロニー数を毎日観察し、最終的にカウントした。その結果を図4に示した。
図4に示すように、G-CSFとAMD3100の組み合わせは、臨床的に実証されているように、多くの造血幹細胞の血液への移動を促進した。但し、SP+AMD3100の組み合わせは、より多くの造血幹細胞の移動を示した。特に、本発明の実験ではG-CSFの投与を5回、SPを2回投与したことから、SP+AMD3100の組み合わせは、G-CSF+AMD3100組み合わせと比較して、用量に応じて血中の造血幹細胞の可動化効果がより大きいことが分かった。
Claims (14)
- サブスタンスP及びAMD3100又はその薬学的に許容される塩を含む血中の大量の造血幹細胞を可動化するための併用療法(combined therapy)。
- サブスタンスP及びAMD3100を順次投与する請求項1に記載の併用療法。
- サブスタンスPを1回投与した後、約1~2日後にAMD3100を1回投与する請求項1に記載の併用療法。
- サブスタンスPを2日連続で2回投与した後、約1~2日後にAMD3100を1回投与する請求項1に記載の併用療法。
- サブスタンスPが、静脈注射により投与される請求項1~4のいずれか1項に記載の併用療法。
- サブスタンスP及びAMD3100又はその薬学的に許容される塩を含む血中の大量の造血幹細胞を可動化するのための併用製品(combination product)。
- サブスタンスP及びAMD3100を順次投与する請求項6に記載の併用製品。
- サブスタンスPを1回投与した後、約1~2日後にAMD3100を1回投与する請求項6に記載の併用製品。
- サブスタンスPを2日連続で2回投与した後、約1~2日後にAMD3100を1回投与する請求項6に記載の併用製品。
- サブスタンスPが、静脈注射により投与される請求項6~9のいずれか1項に記載の併用製品。
- 併用製品がキット(kit-of-parts)形態である請求項6~9のいずれか1項に記載の併用製品。
- サブスタンスP及びAMD3100又はその薬学的に許容される塩を順次投与した個体から得た末梢血から可動化造血幹細胞を含む血液分画を分離する工程を含む、大量の可動化造血幹細胞を採取する方法。
- まずサブスタンスPを投与し、次にAMD3100を投与し、AMD3100投与後の約1~5時間後に血液を採取する請求項12に記載の方法。
- 血液分画を分離する工程が、アフェレーシス(apheresis)を用いて行われる請求項12に記載の方法。
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