CN104603293A - 工程的皮革和其制造方法 - Google Patents

Abstract

工程的动物毛皮、生皮和皮革包括多个通过培养的产生动物胶原蛋白(例如，皮肤)的细胞所形成的胶原蛋白的层。层可以通过包括粘附和/或粘合到彼此的多个培养的动物细胞的细长的多细胞主体而形成；其中，所述细长的多细胞主体被布置以形成用于形成工程的动物毛皮、生皮和皮革的大致平面层。本文还描述了利用产生动物胶原蛋白的细胞的所述层，形成工程的动物毛皮、生皮和皮革的方法。

Description

工程的皮革和其制造方法

相关申请的交叉引用

该申请是要求在2012年3月28日递交的题目为“ENGINEERED LEATHERAND METHODS OF MANUFACTURE THEREOF”的第61/616,888号美国临时专利申请的优先权，其以全文引用的方式并入本文。

通过引用方式并入

在该说明书中提到的所有出版物和专利申请通过引用并入本文如同各个单独的出版物或者专利申请专门地或者单独通过引用并入。

背景技术

皮革用于大量的广泛用途，包括家具套垫、服装、鞋类、皮箱、手提包和配饰以及汽车应用。当前，动物毛皮被用作用于天然皮革的原材料。然而，来自牲畜的毛皮产生环境问题，这是因为饲养牲畜需要大量的饲料、牧场、水和化石燃料。牲畜还对空气和水道产生明显的污染。

另外，社会上有识人士反对将动物毛皮用于产生皮革。全球皮革行业每年屠杀十多亿的动物。大多数皮革来自于没有动物福利法规或者具有大部分或者完全未实施的法规的国家。没有杀害动物而制备的皮革会具有极大的时尚新颖性和吸引力。

尽管合成皮革被开发以解决这些问题，然而其缺乏天然皮革的质量、耐久性和声望。迄今，还没有开发出科学上合理且产业上可行的过程来制备天然皮革。因此，需要从活的动物制备皮革的替选方案。

天然皮革通常是通过动物生皮和皮肤(通常是牛生皮)的鞣制产生的耐用和柔软的材料。鞣制通常被理解成处理动物毛皮以制备皮革的过程。鞣制可以以下任一数量的容易理解的方式来执行，包括：植物鞣制(例如，使用丹宁酸)、铬鞣制(铬盐包括硫酸铬)、醛鞣制(使用戊二醛或者恶唑烷化合物)、合成鞣剂(合成丹宁酸，利用芳香聚合物)等。

天然皮革通常分三个主要步骤制备：准备阶段、鞣制和结壳。还可以包括表面涂层。准备阶段制备用于鞣制的生皮/皮肤，以及去除不需要的生皮成分。准备阶段可包括：保鲜、浸水(再水合)、浸灰、脱毛、刮肉(去除皮下物质)、片皮、再浸灰、脱灰(以去除去毛和浸灰化学物质)、软化(蛋白质水解)、脱脂、正面起绒、漂白、浸酸(改变pH值)、脱酸等。

鞣制被执行以将生皮/皮肤中的蛋白质转变成将不会腐烂的稳定材料，同时允许该材料保持柔软。铬是最常用的鞣制材料。皮肤/生皮的pH值可以被调整(例如，降低到2.8至3.2的pH值)以增强鞣制；随后的鞣制可以升高pH值(“碱化”到略高的水平，例如，3.8至4.2的pH值)。

结壳是指鞣制后处理，可包括着色(染色)、打薄、干燥或者水合等。结壳技术的示例包括：润湿(再水合)、挤水(干燥)、片皮(成为更薄的层)、剃毛、中和(将pH值调整到较中性水平)、再鞣制、染色、加脂、加注、填充、剥离、白化、未结合的化学物质的固定、定形、精整、软化、抛光等。

在实践中，将动物毛皮转变成皮革的过程可包括连续步骤，例如：拔毛/脱毛、浸灰、脱灰和柔化、浸酸、鞣制、中和/染色和加脂、干燥和整饰。脱毛过程可以在化学上去除毛发(例如，使用碱性溶液)，同时浸灰步骤(例如，使用碱和硫化物溶液)可以进一步完成脱毛过程以及时胶原蛋白溶胀(“展开”)。在鞣制期间，通过采用铬的络合离子代替一些胶原蛋白，皮肤结构可以以“展开”形式被稳定化。根据所用的化合物，皮革的颜色和质地可以改变。鞣制的皮革可以比未处理的生皮更柔软且还可以更持久。

皮肤或者动物生皮基本上由胶原蛋白、纤维状蛋白形成。胶原蛋白是用于至少28个不同的胶原蛋白类型的族的通用术语；动物毛皮通常是1型胶原蛋白(因此，术语胶原蛋白通常假定为1型胶原蛋白)，尽管其他类型的胶原蛋白可以用于形成皮革。胶原蛋白的特征在于：重复的三重态氨基酸，-(Gly-X-Y)_n-，使得在胶原蛋白中大约三分之一的氨基酸残留物是甘氨酸。X通常是脯氨酸且Y通常是羟脯氨酸。因此，胶原蛋白的结构可由不同长度的肽链的缠绕的三重态单元组成。不同的动物可产生胶原蛋白的不同的氨基酸组成，其可以导致不同的性能(以及在得到的皮革中的差异)。胶原蛋白纤维单体可以从约1050氨基酸长度的α链来制备，使得三重螺旋体采用约300nm长度且具有1.5nm直径的棒的形式。在通过成纤维细胞皮肤细胞制备细胞外基质中，三重螺旋单体可以被合成且单体可以自组装成纤维形式。这些三重螺旋体可以通过盐链节、氢键、疏水键和共价键被保持到一起。三重螺旋体可以以所谓的原纤维的胶束被结合到一起，原纤维胶束结合到一起以产生纤维。纤维通常通过皮肤的层划分且与彼此结合。交联或者连接可以对材料提供强度。纤维可以具有一系列直径。除了I型胶原蛋白之外，皮肤(生皮)还可包括其他类型的胶原蛋白，包括：III型胶原蛋白(网硬蛋白)、IV型胶原蛋白、以及VII型胶原蛋白。

本文描述了复制天然皮革的大量的结构以及性能的人工皮革，但是可以以更简单的方式来处理，且可以解决上述指出的天然的和前述人工皮革的多个问题。

发明内容

本文公开了工程的动物毛皮、生皮和皮革，及制备其的方法。在一些实施方式中，本文公开了工程的动物毛皮、生皮和皮革，其包括由培养细胞形成的细胞外基质、ECM(例如，胶原蛋白)的多个层。例如，培养细胞(具有和没有ECM)可以在包括一个或多个类型的皮肤细胞的多细胞主体内，其中所述动物细胞在体外培养。在一些实施方式中，本文公开了工程的动物毛皮、生皮和皮革，其包括具有一个或多个类型的皮肤细胞的动物细胞的多个层，其中所述动物细胞在体外培养。在一些实施方式中，本文提供的动物细胞是非人类的细胞。应该理解，尽管本文描述和例证了皮肤细胞，然而任何产生胶原蛋白的细胞(例如，可以产生或者被诱导以产生胶原蛋白ECM的细胞)可以与本文描述的任一方法结合使用以制备所描述的工程的皮革。产生胶原蛋白ECM的细胞可包括肌细胞(包括平滑肌细胞)等。

例如，利用诸如本文描述的那些过程，本文描述的工程的皮革可以非常类似于(如果不同)天然皮革。然而，利用培养的细胞，这些工程的皮革可包括来自形成方法而产生的大量差异。例如，如本文描述的形成和堆叠的(且完全地或者部分地融合)细胞外基质的薄片可以由培养的皮肤细胞形成，使得各个层在层内基本上是均匀的。与天然皮革不同，本文描述的工程的皮革可以完全不含肌肉(例如，乳头状肌)、毛发和毛囊、血管等，由于形成皮革的材料由培养细胞长成。在形成过程期间，工程的皮革可以被形成为精确的尺寸(包括厚度)，而无需制备按照天然生皮所必须的样子来备料，包括浸灰、脱毛、片皮、刮肉等。

在一些变型中，工程的皮革由通过生物制造形成层本身而制成。例如，在一些实施方式中，本文提供的多细胞体的各个层被沉积。在一些实施方式中，多细胞主体的各个层的沉积被自动化。在一些实施方式中本文提供的多细胞主体的各个层被沉积而无需结构支架。

在一些实施方式中，生物制造方法使用多细胞主体。例如，多个层可以由多细胞主体形成，条件是包括动物上皮、基底膜、真皮、下皮、鳞皮、鳞甲、外胚层、或者其组合。在一些实施方式中，本文提供的动物上皮包括角质层、透明层、颗粒层、棘细胞层、生发层、基底层、或者其组合。

例如，本文描述了工程的皮革，其包括：具有体积的主体；其中，所述主体包括多个层，其中各个层包括通过培养细胞释放的胶原蛋白；其中所述主体完全没有毛发、毛囊和血管。

所述层被至少部分地融合。在一些变型中，各个层包括胶原蛋白在所述层内的均匀分布，这是通过以下制备方法的结果：形成薄片和在彼此的顶部上分层以制备被鞣制以形成工程的皮革的主体。

产生胶原蛋白的细胞可包括上皮细胞、成纤维细胞、角化细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞、或者其组合。上皮细胞可包括鳞状细胞、立方细胞、柱状细胞、基底细胞、或者其组合。所述成纤维细胞可以是真皮成纤维细胞。所述角化细胞可以是上皮角化细胞、基底角化细胞、增生基底角化细胞、分化型上基底角化细胞、或者其组合。如权利要求1所述的工程的皮革，还包括细胞外基质或者结缔组织。

在一些变型中，所述工程的皮革还包括选自角蛋白、弹性蛋白、明胶、蛋白多糖、硫酸皮肤素蛋白多糖、糖胺聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、皮连蛋白、脂质、脂肪酸、糖、和其组合中的一种或多种成分。

所述动物细胞可以源自于选自羚羊、熊、海狸、北美野牛、公猪、骆驼、驯鹿、猫、牛、鹿、狗、大象、麋鹿、狐狸、长颈鹿、山羊、野兔、马、野生山羊、袋鼠、狮子、美洲驼、山猫、貂、驼鹿、公牛、野猪、家猪、家兔、海豹、绵羊、松鼠、老虎、鲸、狼、牦牛和斑马、和其组合中的哺乳动物。所述动物细胞可以源自于选自龟、蛇、鳄鱼和短吻鳄、或其组合的爬行动物。所述动物细胞可以源自于选自鸡、鸭、鸸鹋、鹅、松鸡、鸵鸟、野鸡、鸽子、鹌鹑和火鸡、或其组合的鸟类。所述动物细胞可以源自于选自凤尾鱼、鲈鱼、鲶鱼、鲤鱼、鳕鱼、鳗鱼、比目鱼、河豚、石斑鱼、黑线鳕、大比目鱼、鲱鱼、鲭鱼、鲯鳅、蝠鲼、枪鱼、新西兰红鱼、河鲈鱼、梭子鱼、绿青鳕、三文鱼、沙丁鱼、鲨鱼、鲷鱼、鳎目鱼、黄貂鱼、剑鱼、罗非鱼、鳟鱼、金枪鱼、和白斑鱼、或其组合的鱼类。

通常，所述工程的皮革可以被形成而不需要结构支架。

工程的皮革的至少一个层可包括动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约20:1至约3:1。工程的皮革层可以基本上不含未分化的角化细胞、成纤维细胞或者上皮细胞。

通常，工程的皮革可以被图案化。例如，工程的皮革可以仿造动物的毛皮图案，所述动物选自羚羊、熊、海狸、北美野牛、公猪、骆驼、驯鹿、猫、牛、鹿、狗、大象、麋鹿、狐狸、长颈鹿、山羊、野兔、马、野生山羊、袋鼠、狮子、美洲驼、山猫、貂、驼鹿、公牛、野猪、家猪、家兔、海豹、绵羊、松鼠、老虎、鲸、狼、牦牛、斑马、龟、蛇、鳄鱼、短吻鳄、恐龙、青蛙、蟾蜍、火蜥蜴、蝾螈、鸡、鸭、鸸鹋、鹅、松鸡、鸵鸟、野鸡、鸽子、鹌鹑、火鸡、凤尾鱼、鲈鱼、鲶鱼、鲤鱼、鳕鱼、鳗鱼、比目鱼、河豚、石斑鱼、黑线鳕、大比目鱼、鲱鱼、鲭鱼、鲯鳅、蝠鲼、枪鱼、新西兰红鱼、河鲈鱼、梭子鱼、绿青鳕、三文鱼、沙丁鱼、鲨鱼、鲷鱼、鳎目鱼、黄貂鱼、剑鱼、罗非鱼、鳟鱼、金枪鱼、白斑鱼、和其组合。所述图案是选自龙、独角兽(unicorn)、狮鹫(griffin)、塞壬(siren)、凤凰(phoenix)、天蛾(sphinx)、独眼龙(Cyclops)、眼蝶(satyr)、美杜莎(Medusa)、飞马(Pegasus)、地狱犬(Cerberus)、百头巨怪(Typhoeus)、蛇发女怪(gorgon)、卡律布迪斯(Charybdis)、恩浦萨(empusa)、奇美拉(chimera)、牛头人(Minotaur)、天鲸(Cetus)、九头蛇(hydra)、半人马(centaur)、仙女(fairy)、美人鱼(mermaid)、尼斯湖水怪(Loch Ness monster)、北美野人(Sasquatch)、雷鸟(thunderbird)、雪人(yeti)、山羊吸血怪(chupacabra)、和其组合的虚幻动物的毛皮图案。

通常，所述工程的皮革可包括具有厚度的层，该厚度特征在于，厚度适于允许扩散以充分地支持所述动物细胞在培养基中的维持和生长。各个薄片的厚度可以是约50μm至约200μm。例如，各个所述层的厚度可以是约50μm至约150μm。

可以使用任何合适数量的层，且可以基于所需的厚度来选择。当薄片被形成且在彼此上方分层时，在一些变型中，在一个层中的细胞或者在多个层中的细胞可以被杀死或者允许死亡。例如，在主体中已经分层的在薄片中的细胞可以允许死亡(例如，由于缺乏养分)同时在顶部或者外层中的细胞是活着的且可以辅助粘附到相邻层(例如，通过ECM的释放/重构)。例如，工程的皮革可包括多个层，例如，包括约2个至约50个层，约2个至约40个层，约2个至约30个层等。

本文描述的任一工程的皮革可以被着色，例如，包括一种或多种着色剂或者颜料，或者被图案化。

本文还描述了生产工程的皮革的方法。通常，这些方法允许由培养的产生胶原蛋白(例如，皮肤)的细胞制备工程的皮革至任何所需的厚度，消除了与传统的制备皮革关联的一些或多个资源密集和污染的步骤，例如，脱毛、浸水、刮肉、浸灰/脱灰、片皮和漂白。

例如，在一些变型中，该方法包括：在体外培养一个或多个类型的皮肤细胞；形成所述一个或多个类型的皮肤细胞和包括胶原蛋白的细胞外基质的多个薄片；将所述多个薄片分层以形成具有体积的主体；和通过鞣制，处理所述主体。

在一些变型中，所述方法包括通过生物制造形成薄片或者层。例如，所述方法还可包括制备多个细长的或者球形的多细胞主体，其包括一个或多个类型的皮肤细胞，其中所述细胞被粘附到彼此。这些多细胞主体可以用于在层内定位这些多细胞主体的生物制造技术中，且允许它们融合以形成细胞外基质，尤其是胶原蛋白。例如，形成多个薄片可包括通过相邻地布置多个细长的多细胞主体而形成多个平面层，其中所述细长的多细胞主体被融合以形成平面层。布置的步骤可包括将多细胞主体放置在支撑基材上，其允许所述多细胞主体融合以形成大致平面层。

如此形成的支撑薄片的结构(例如，支撑基材，例如，培养皿)可透过液体和养分以允许细胞培养基接触所述层的所有表面。

因此，在一些变型中，形成薄片包括将多细胞主体自动沉积进入所述层而没有结构支架。所述多细胞主体可以相邻于彼此水平地和/或竖向地布置。多细胞主体的融合可以发生超过约2小时至约24小时。细胞外基质(例如，胶原蛋白)可以具有相同的时段或者超过较长的时间(例如，1天到3天，1天到4天，1天到5天，1天到6天，1天到7天等)。当通过生物制造形成薄片时，皮肤细胞的细长多细胞主体可以被形成为具有相同的长度。例如，细长多细胞主体可以具有的长度范围为约1mm至约10m、约1cm至约1m、约1cm至约50cm等。

在形成本文描述的工程的皮革的任一方法中，除了鞣制步骤之外，该方法可包括一个或多个处理步骤。鞣制布置可以以任何合适的方式来执行，例如，铬鞣制法(使用铬盐)。该方法还可包括：利用一个或多个另外的处理步骤来处理分层的主体。另外的处理步骤可包括：保鲜、浸水、软化、浸酸、脱酸、打薄、复鞣、润滑、结壳、润湿、均湿、剃毛、再次铬处理、中和、染色、加脂、填充、剥离、填塞(stuffing)、白化、固定、定形、精整(conditioning)、碾磨、刮软、抛光、整饰(finishing)、上油、刷涂、填补、浸渍、喷涂、辊涂、淋涂、打磨、电镀、压花、熨烫、上釉和滚揉。

形成工程的皮革方法可以使用任何合适的皮肤细胞。例如，皮肤细胞可包括上皮细胞、成纤维细胞、角化细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞、或者其组合。上皮细胞可包括鳞状细胞、立方细胞、柱状细胞、基底细胞、或者其组合。成纤维细胞可以是真皮成纤维细胞。角化细胞可以是上皮角化细胞、基底角化细胞、增生基底角化细胞、分化型上基底角化细胞、或者其组合。

在一些变型中，形成所述多个薄片的步骤包括：形成所述一个或多个类型的产生胶原蛋白的细胞和包括胶原蛋白和选自角蛋白、弹性蛋白、明胶、蛋白多糖、硫酸皮肤素蛋白多糖、糖胺聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、皮连蛋白、脂质、脂肪酸、糖、和其组合中的细胞外基质材料的多个薄片。

形成所述多个薄片可包括：以动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约20:1至约3:1，形成所述一个或多个类型的皮肤细胞的多个薄片。通常，所用的皮肤细胞可以基本上不含未分化的角化细胞、成纤维细胞或者上皮细胞。

所述产生胶原蛋白的细胞可以源自于选自羚羊、熊、海狸、北美野牛、公猪、骆驼、驯鹿、猫、牛、鹿、狗、大象、麋鹿、狐狸、长颈鹿、山羊、野兔、马、野生山羊、袋鼠、狮子、美洲驼、山猫、貂、驼鹿、公牛、野猪、家猪、家兔、海豹、绵羊、松鼠、老虎、鲸、狼、牦牛和斑马、和其组合中的哺乳动物。动物毛皮细胞可以源自于选自龟、蛇、鳄鱼和短吻鳄、或其组合的爬行动物。动物毛皮细胞可以源自于选自鸡、鸭、鸸鹋、鹅、松鸡、鸵鸟、野鸡、鸽子、鹌鹑和火鸡、或其组合的鸟类。动物毛皮细胞可以源自于选自凤尾鱼、鲈鱼、鲶鱼、鲤鱼、鳕鱼、鳗鱼、比目鱼、河豚、石斑鱼、黑线鳕、大比目鱼、鲱鱼、鲭鱼、鲯鳅、蝠鲼、枪鱼、新西兰红鱼、河鲈鱼、梭子鱼、绿青鳕、三文鱼、沙丁鱼、鲨鱼、鲷鱼、鳎目鱼、黄貂鱼、剑鱼、罗非鱼、鳟鱼、金枪鱼、和白斑鱼、或其组合的鱼类。

如所述的，本文描述的工程的皮革可以被图案化。例如，该方法可包括将皮肤细胞对齐以形成图案。

通常，形成层的步骤可包括自动沉积多细胞主体以形成所述薄片。

所形成的薄片或者层可以是任何合适的薄度/厚度。在一些变型中，多个薄片的各个层的厚度的特征在于，厚度适于允许扩散以充分地支持所述动物细胞在培养基中的维持和生长。例如，各个所述薄片的厚度可以为约50μm至约200μm、约50μm至约150μm、约50μm至约100μm、等。

类似地，任何合适数量的层可以被选定，其可以确定工程的皮革的厚度。例如，工程的皮革可包括约2个至约50个层、约2个至约40个层、约2个至约30个层、等。

本文描述的任一方法还可以包括工程的皮革的着色或染色。例如，该方法可包括利用一种或多种着色剂或者颜料，将所述分层的主体染色。

附图说明

图1示出了细长的多细胞主体的非限制性示例；在该情况中，细长多细胞主体1具有的宽度Wl近似等于高度HI，且具有的长度LI基本上大于宽度Wl或高度HI。

图2示出了大致球形的多细胞主体的非限制性示例；在该情况中，大致球形多细胞主体2具有的宽度W1近似等于高度HI。

图3示出了细长的多细胞主体的非限制性示例；在该情况中，细长多细胞主体1位于支撑基材3上。

图4示出了大致球形的多细胞主体的非限制性示例；在该情况中，大致球形多细胞主体2位于支撑基材3上。

图5示出了在图1至图4中所示的制备多细胞主体的一个方法的非限制性示例；在该情况中，方法涉及将混合的细胞团块4移入毛细管5中。

图6示出了多个细长多细胞主体的非限制性示例；在该情况中，多个细长多细胞主体1相邻地放置在支撑基材3上使得允许它们融合。

图7示出了多个大致球形多细胞主体的非限制性示例；在该情况中，多个基本上球形的多细胞主体2相邻地放置在支撑基材3上使得允许它们融合。

图8示出了制备包括多个细长多细胞主体的层的一个方法的非限制性示例；在该情况中，方法涉及从包括毛细管5的压力操作的机械挤出机将多细胞主体6挤出到支撑基材3上。

图9示出了制备工程的动物毛皮、生皮或皮革的一个方法的非限制性示例；在该情况中，方法涉及将一个以上的包括多个细长的多细胞主体7、8的层相邻地放置在支撑基材3上。

图10示出了制备工程的动物毛皮、生皮或皮革的一个方法的非限制性示例；在该情况中，方法涉及将一个以上的包括多个细长的多细胞主体9和多个大致球形的多细胞主体10的层相邻地放置在支撑基材3上。

图11示出了制备工程的动物毛皮、生皮或皮革的一个方法的非限制性示例；在该情况中，方法涉及堆叠一个以上的层，其中，继第一层之后的层相对于下面的层被旋转90度。

图12示出形成如本文所述的工程的皮革的方法的示意性原理图。

具体实施方式

组织工程的技术提供了对制备动物毛皮、生皮或者皮革的新的机遇，这些机遇不关联于畜牧的环境恶化。组织工程已经被限定为交叉学科领域，其应用朝向生物替代品的发展的工程的和生命科学的原理，其恢复、保持或改善组织功能或者整个器官。Langer R，Vacanti JP，Tissue Engineering，Science 260(5110)：920-926(May 1993)。

利用传统材料和方法制成的组织工程的产品在尺寸上被限制，这是由于短距离的气体和养分可以扩散以养育内部细胞。此外，现有技术没有提供用于工程的产品的批量生产的足够的速度和生产能力。因此，现有的组织工程的方法导致没有吸引力的薄的薄片且关联于商业上不可行的规模。

因此，本文公开的动物毛皮、生皮或皮革和其制备方法的目的是提供商业上可行且有吸引力的动物毛皮、生皮或皮革。另一目的是提供高产量的方法，其可靠地、精确地和可再生产地扩展到商业水平。本文公开的动物毛皮、生皮或皮革和其制备方法的优点包括但不限于，在可再生的、高产量和容易扩展的方式中的定制组织的生产且同时保持精确地控制图案形成、尤其是多细胞类型的情况，其可以导致工程的动物毛皮、生皮或皮革，其具有吸引力的外观、质地、厚度和耐久性。

本文公开了工程的动物生皮和皮革以及其制备方法。在一些实施方式中，本文公开了工程的动物毛皮、生皮或皮革，其包括具有一个或多个类型的皮肤细胞的动物细胞的多个层，其中所述动物细胞在体外培养。在一些实施方式中，本文提供的各个动物细胞层被生物制造。在一些实施方式中，本文提供的各个动物细胞层被生物制造而没有结构支架。

在一些实施方式中，本文提供了多个多细胞主体，其具有细长的或球形形状，和一个或多个类型的动物毛皮细胞，其中，细胞在体外培养且在多细胞主体内被粘合到彼此，其中所述多细胞主体被布置在一个或多个基本上平面的形成工程的动物毛皮、生皮或皮革的层中。在一些实施方式中，本文提供的各个动物细胞的层被生物制造。在一些实施方式中，本文提供的各个动物细胞的层被生物制造而没有结构支架。

在一些实施方式中，本文提供了制备工程的动物毛皮、生皮或皮革的方法，包括：体外培养包括一种或多种类型的皮肤细胞的动物细胞，制备多个细长的或球形的包括所述动物细胞的多细胞主体，其中，所述细胞被粘附到彼此，且形成多个相邻地布置多个细长的多细胞主体的平面层，其中所述细长的多细胞主体被融合以形成平面层。在一些实施方式中，所述制备步骤包括生物制造以定位多细胞主体或所述层。在一些实施方式中，所述制备步骤包括生物制造以定位多细胞主体或所述层而没有结构支架。

当提到多细胞主体的布置时，如本文所用的术语“相邻”是指相对于支撑基材接触、在其顶部、下方或者紧靠支撑基材，或者相对于支撑基材是水平的或者竖向的。

生物制造

以传统的组织工程的为基础的基本观点是将活细胞接种到生物相容且最终可生物降解的支架中，然后在生物反应器中培养系统使得最初的细胞群体可以扩展成组织。传统的组织工程的具有多个缺点，尤其是当应用到动物毛皮、生皮或皮革产品的生产时。首先，接种细胞的过程通常涉及接触具有支架的细胞的溶液，使得细胞被陷入孔、纤维或者支架的其他微结构内。关于将细胞放置到支架内以及细胞相对于彼此的放置，该过程基本上是随机的。因此，所接种的支架不是立即有益于制备三维结构的制备，该三维结构具有细胞或细胞粘合体的平面的或预订的放置或图案。第二，对于给定细胞类型的理想生物材料支架的选择是悬而未决的且通常通过反复试验来完成。即使合适的生物材料是可用的，但支架仍可以妨碍实现高的细胞密度。此外，基于支架的组织工程的化不容易或者未可靠地扩展到工业规模。

在一些实施方式中，工程的动物毛皮、生皮、皮革、层和多细胞主体采用利用快速成型技术的方法来制备，该方法基于通过三维输送装置(例如，生物加工器)的多细胞主体(例如，圆柱体和球体)以及生物相容的支撑结构(例如，包括琼脂糖)的三维的、自动的、计算机辅助的沉积。如本文所用的，在一些实施方式中，当术语“工程的”用来指动物毛皮、生皮和皮革时，是指动物细胞的多细胞主体和/或层被定位以根据计算机脚本程序通过计算机辅助装置(例如，生物制造器)来形成工程的动物毛皮、生皮和皮革。在另一些实施方式中，计算机脚本程序例如是一个或多个计算机程序、计算机应用程序、或者计算机模块。在另一些实施方式中，通过多细胞主体的后定位融合的三维的组织结构形式类似于在早期形态发生中的自组装现象。

尽管大量的方法可用于布置在支撑基材上的多细胞主体以制备包括人工放置的三维结构，然而通过自动的计算机辅助的机器(例如制造器)的定位是有利的。采用该技术的多细胞主体的交付的优点包括：多细胞主体的快速、精确和重复放置以产生呈现计划的或预定方向的结构或多细胞主体和/或各种组成的层的图案。优点还包括保证了高的细胞密度，同时最小化关注于结合水凝胶定位/放置细胞的基于沉积法的其他可靠的任意形式的制造关联的细胞损伤。

本文所公开的发明包括商业方法。在一些实施方式中，本文所公开的技术和方法的速度和可扩展性被用来设计、构件和操作用于生产工程的动物毛皮、生皮和皮革的工业和/或商业设施。在另一些实施方式中，工程的动物毛皮、生皮和皮革被生产、包装、存储、分发、市场推广、广告，以及例如作为家具装饰材料、服装、鞋类、皮箱、手提包和配饰以及汽车应用来销售。

在一些实施方式中，本文提供的动物毛皮、生皮和皮革被图案化。在一些实施方式中，本文提供的图案是选自以下动物毛皮图案：羚羊、熊、海狸、北美野牛、公猪、骆驼、驯鹿、猫、牛、鹿、狗、大象、麋鹿、狐狸、长颈鹿、山羊、野兔、马、野生山羊、袋鼠、狮子、美洲驼、山猫、貂、驼鹿、公牛、野猪、家猪、家兔、海豹、绵羊、松鼠、老虎、鲸、狼、牦牛、斑马、龟、蛇、鳄鱼、短吻鳄、恐龙、青蛙、蟾蜍、火蜥蜴、蝾螈、鸡、鸭、鸸鹋、鹅、松鸡、鸵鸟、野鸡、鸽子、鹌鹑、火鸡、凤尾鱼、鲈鱼、鲶鱼、鲤鱼、鳕鱼、鳗鱼、比目鱼、河豚、石斑鱼、黑线鳕、大比目鱼、鲱鱼、鲭鱼、鲯鳅、蝠鲼、枪鱼、新西兰红鱼、河鲈鱼、梭子鱼、绿青鳕、三文鱼、沙丁鱼、鲨鱼、鲷鱼、鳎目鱼、黄貂鱼、剑鱼、罗非鱼、鳟鱼、金枪鱼、白斑鱼、和其组合。在一些实施方式中，本文提供的图案是选自以下虚幻动物毛皮图案：龙、独角兽、狮鹫、塞壬、凤凰、天蛾、独眼龙、眼蝶、美杜莎、飞马、地狱犬、百头巨怪、蛇发女怪、卡律布迪斯、恩浦萨、奇美拉、牛头人、天鲸、九头蛇、半人马、仙女、美人鱼、尼斯湖水怪、北美野人、雷鸟、雪人、山羊吸血怪和其组合。

在一些实施方式中，本文提供的工程的动物毛皮、生皮或皮革还包括一种或多种着色剂或者颜料。

细胞

多种自粘附细胞类型可以用来形成多细胞主体、层、和本文描述的工程的皮肤、生皮和皮革产品。在一些实施方式中，工程的动物毛皮、生皮和皮革产品被设计成类似于传统的动物毛皮、生皮和皮革产品，以及细胞类型被选择成近似于在传统的动物毛皮、生皮和皮革产品中所发现的那些细胞类型。在另一些实施方式中，工程的动物毛皮、生皮和皮革产品、层、和多细胞主体包括动物上皮、基底膜、真皮、下皮、鳞皮、鳞甲、外胚层、或者其组合。在一些实施方式中，本文提供的动物上皮包括角质层、透明层、颗粒层、棘细胞层、生发层、基底层、或者其组合。在一些实施方式中，本文提供的动物真皮包括乳头层、网状层、或者其组合。在一些实施方式中，本文提供的动物鳞皮包括盾鳞、整列鳞、硬鳞、圆鳞及栉鳞、圆鳞、栉鳞、钝齿鳞、刺状鳞、或者其组合。

在一些实施方式中，本文提供的动物细胞包括上皮细胞、成纤维细胞、角化细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞、或者其组合。在一些实施方式中，本文提供的上皮细胞包括鳞状细胞、立方细胞、柱状细胞、基底细胞、或者其组合。在一些实施方式中，本文提供的成纤维细胞是真皮成纤维细胞。在一些实施方式中，本文提供的角化细胞是上皮角化细胞、基底角化细胞、增生基底角化细胞、分化型上基底角化细胞、或者其组合。

在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约20:1至约3:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约20:1至约4:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约20:1至约5:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约20:1至约10:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约20:1至约15:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约25:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约24:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约23:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约22:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约21:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约20:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约19:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约18:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约17:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约16:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约15:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约14:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约13:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约12:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约11:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约10:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约9:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约8:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约7:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约6:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约5:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约4:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约3:1。在一些实施方式中，本文提供的动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约2:1。

在一些实施方式中，本文提供的动物细胞基本上不含未分化的角化细胞、成纤维细胞或者上皮细胞。

在其他实施方式中，工程的动物毛皮、生皮或皮革产品包括：神经细胞、结缔组织(包括骨、软骨、分化成成骨细胞和软骨细胞的细胞、和淋巴组织)、上皮细胞(包括形成腔和血管或通道中的内层的内皮细胞、外分泌上皮细胞、上皮吸收细胞、角蛋白上皮细胞、和细胞外基质分泌细胞)、和未分化的细胞(例如，胚细胞、干细胞、和其他前体细胞)等。

在一些实施方式中，工程的动物毛皮、生皮或皮革还包括细胞外基质或结缔组织。在一些实施方式中，工程的动物毛皮、生皮或皮革还包括选自胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白、明胶、蛋白多糖、硫酸皮肤素蛋白多糖、糖胺聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、皮连蛋白、脂质、脂肪酸、糖、和其组合中的一种或多种组分。

在一些实施方式中，用来形成多细胞主体的细胞从活的动物获取且培养作为原细胞系。例如，在另一些实施方式中，细胞通过活体组织切片获取以及体外培养。在其他实施方式中，细胞从商业资源获取。

在一些实施方式中，通过非限制性示例，多细胞主体、包括多细胞主体的层、和工程的动物毛皮、生皮或皮革产品包括来源于哺乳动物、鸟类、爬行动物、鱼类、甲壳类、软体动物类、头足类动物、昆虫、非节肢动物的无脊椎动物类和其组合的动物细胞。在一些实施方式中，动物细胞是人类细胞。

在一些实施方式中，本文提供的动物细胞不是人类细胞。在一些实施方式中，合适的细胞源自于哺乳动物，例如，羚羊、熊、海狸、北美野牛、公猪、骆驼、驯鹿、猫、牛、鹿、狗、大象、麋鹿、狐狸、长颈鹿、山羊、野兔、马、野生山羊、袋鼠、狮子、美洲驼、山猫、貂、驼鹿、公牛、野猪、家猪、家兔、海豹、绵羊、松鼠、老虎、鲸、狼、牦牛和斑马、和其组合。在一些实施方式中，合适的细胞源自于鸟类，例如，鸡、鸭、鸸鹋、鹅、松鸡、鸵鸟、野鸡、鸽子、鹌鹑和火鸡、或其组合。

在一些实施方式中，合适的细胞源自于爬行动物，例如，龟、蛇、鳄鱼和短吻鳄、或其组合。

在一些实施方式中，合适的源自于鱼类，例如，凤尾鱼、鲈鱼、鲶鱼、鲤鱼、鳕鱼、鳗鱼、比目鱼、河豚、石斑鱼、黑线鳕、大比目鱼、鲱鱼、鲭鱼、鲯鳅、蝠鲼、枪鱼、新西兰红鱼、河鲈鱼、梭子鱼、绿青鳕、三文鱼、沙丁鱼、鲨鱼、鲷鱼、鳎目鱼、黄貂鱼、剑鱼、罗非鱼、鳟鱼、金枪鱼、和白斑鱼、或其组合的。

在一些实施方式中，合适的细胞源自于两栖动物类，例如，青蛙、蟾蜍、火蜥蜴、蝾螈或其组合。

在一些实施方式中，合适的细胞源自于甲壳类动物，例如，螃蟹、小龙虾、龙虾、对虾和小虾、或其组合。

在一些实施方式中，合适的细胞源自于软体动物，例如，鲍鱼、蛤蜊、海螺、蚌、牡蛎、扇贝和蜗牛、或其组合。

在一些实施方式中，合适的细胞源自于头足类动物，例如，乌贼、章鱼、和鱿鱼、或其组合。

在一些实施方式中，合适的细胞源自于昆虫类，例如，蚂蚁、蜜蜂、甲壳虫、蝴蝶、蟑螂、蟋蟀、豆娘、蜻蜓、地蜈蚣、跳蚤、苍蝇、草蜢、螳螂、蜉蝣、飞蛾、蠹虫、白蚁、黄蜂、或其组合。

在一些实施方式中，合适的细胞源自于非节肢动物的无脊椎动物类(例如，蠕虫)，例如，扁形虫、绦虫、吸虫、线虫、蛔虫、钩虫、分节蠕虫(例如，蚯蚓、毛虫等)，或其组合。

多细胞主体

本文公开了包括多个活的动物细胞的多细胞主体，其中，细胞被粘附和/或粘合到彼此。在一些实施方式中，多细胞主体包括多个以所需的三维形状粘附和/或粘合到一起的细胞，该三维形状具有粘弹一致性和充分的完整性用于在生物工程(例如，组织工程)过程中容易制造和处理。在一些实施方式中，充分的完整性是指在后续处理期间，多细胞主体能够保持其不是刚性的物理形状，但是具有具有粘弹一致性，且保持细胞的活力。

在一些实施方式中，多细胞主体是同细胞的。在其他实施方式中，多细胞主体是异细胞的。在同细胞的多细胞主体中，多个活细胞包括单一细胞类型的多个活细胞。在同细胞的多细胞主体中的基本上所有的活细胞基本上是单一细胞类型的细胞。与此相反，异细胞的多细胞主体包括大量的大于一种细胞类型的细胞。在异细胞主体中的活细胞在融合过程期间可以保持未分类的或者可以"整理"(例如，自组装)以形成用于工程的组织的特定内部结构或图案。细胞的分类与差别粘附假设(DAH)的预测一致。DAH解释了通过在组成细胞之间的粘附和粘合作用所产生的组织表面和界面张力方面的细胞种群的液态状性能。通常，细胞可以基于细胞的粘附强度上的差别来分类。例如，与分类到多细胞主体的外部的细胞相比，分类到异细胞的多细胞主体的内部的细胞类型通常具有较强的粘附强度(因此，较高的表面张力)。

在一些实施方式中，本发明的多细胞主体除了包括多个细胞之外，还包括一种或多种细胞外基质(ECM)组分或者一种或多种ECM组分的一种或火种衍生物。例如，多细胞主体可含有多种ECM蛋白质，其包括：通过非限制性示例，明胶、纤维蛋白原、纤维蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白和蛋白多糖。ECM组分或者ECM组分的衍生物可以被添加到用来形成多细胞主体的细胞糊剂。添加到细胞糊剂的ECM组分或者ECM组分的衍生物可以从动物来源来提纯、或者通过本领域中已知的重组方法来生产。可替选地，ECM组分或者ECM组分的衍生物可以通过多细胞主体中的细胞天然地分泌。

在一些实施方式中，多细胞主体包括组织培养基。在另一些实施方式中，组织培养基可以是任一生理上相容的介质且将通常根据如本领域中已知的所涉及的细胞类型来选择。在一些情况中，合适的组织培养介质包括：例如，基础养分(例如，糖和氨基酸)、生长因子、抗生素(以最小化污染)、等。

在多细胞主体中的细胞的粘附和/或粘合适当地足够强以允许多细胞主体保持三维形状，同时将其本身支撑在平坦表面上。例如，在一些情况中，在平坦基材上支撑本身的多细胞主体可呈现一些次要的变形(例如，其中，多细胞主体接触该表面)，然而，多细胞主体有充分的粘附力以保持至少为其宽度的一半的高度，在一些情况中，高度约等于宽度。在一些实施方式中，两个或多个在平坦基材上关于彼此相邻地并排放置的多细胞主体在它们的两侧且高于工作面形成空隙空间。例如，参见图3和图4。在另一些实施方式中，当多细胞主体被组装在多细胞主体层叠在彼此的顶部的结构中时，在多细胞主体中的细胞的粘合力足够强以允许多细胞主体支撑至少一个类似尺寸和形状的多细胞主体的重量。例如，参见图9和图10。在另一些实施方式中，在多细胞主体中的细胞的粘附和/或粘合也适于足够强以允许多细胞主体通过工具(毛细微量吸液管)被获取。

根据本文提供的公开内容，本领域的技术人员可以看出：具有不同尺寸和形状的多细胞主体在本发明的范围内。在一些实施方式中，多细胞主体基本上是圆柱形且基本上具有圆形的截面。例如，在多个实施方式中，多细胞主体具有细长的形状(例如，圆柱形状)，其具有方形、矩形、三角形或者其他非圆形的截面形状。同样，在多个实施方式中，多细胞主体具有大致球形形状、非细长的圆柱形状、或者立方体形状。

在多个实施方式中，多细胞主体的直径是约50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1000μm、或其中可量化的更大的数值。在一些实施方式中，多细胞主体被构造成限制通过氧气和/或营养素不能扩散进入多细胞主体的中心部分导致的细胞坏死。例如，多细胞主体适当地被构造成使得其中的所有的活细胞距多细胞主体的外表面不超过约250μm，更适当地使得其中的所有的活细胞距多细胞主体的外表面不超过约200μm。

在一些实施方式中，多细胞主体是细长的且具有不同的长度。在其他实施方式中，细长的多细胞主体基本上为类似的长度。在多个实施方式中，细长的多细胞主体的长度大约是0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm、4.5mm、5.0mm、5.5mm、6.0mm、6.5mm、7.0mm、7.5mm、8.0mm、8.5mm、9.0mm、9.5mm、或10mm，或者其中可量化的更大的数值。在其他多个实施方式中，细长的多细胞主体的长度大约是1.0cm、1.5cm、2.0cm、2.5cm、3.0cm、3.5cm、4.0cm、4.5cm、5.0cm、5.5cm、6.0cm、6.5cm、7.0cm、7.5cm、8.0cm、8.5cm、9.0cm、9.5cm、或10cm，或者其中可量化的更大的数值。在一些实施方式中，细长的多细胞主体的长度被选择以得到工程的动物毛皮、生皮或皮革产品的形成和/或尺寸，其近似等于传统的动物毛皮、生皮或皮革产品的形成和/或尺寸。

在一些实施方式中，本文提供的各个层的特征在于：厚度适于允许扩散以充分地支持所述动物细胞在培养基中的维持和生长。在一些实施方式中，各个所述层的厚度是约50μm至约1000μm。在一些实施方式中，各个所述层的厚度是约100μm至约900μm。在一些实施方式中，各个所述层的厚度是约100μm至约800μm。在一些实施方式中，各个所述层的厚度是约100μm至约700μm。在一些实施方式中，各个所述层的厚度是约100μm至约600μm。在一些实施方式中，各个所述层的厚度是约100μm至约500μm。在一些实施方式中，各个所述层的厚度是约150μm至约900μm。在一些实施方式中，各个所述层的厚度是约150μm至约800μm。在一些实施方式中，各个所述层的厚度是约150μm至约700μm。在一些实施方式中，各个所述层的厚度是约150μm至约600μm。在一些实施方式中，各个所述层的厚度是约150μm至约550μm。在一些实施方式中，各个所述层的厚度是约150μm至约500μm。在一些实施方式中，各个所述层的厚度是约200μm至约800μm。在一些实施方式中，各个所述层的厚度是约200μm至约700μm。在一些实施方式中，各个所述层的厚度是约200μm至约600μm。在一些实施方式中，各个所述层的厚度是约200μm至约500μm。在一些实施方式中，各个所述层的厚度是约200μm至约400μm。在一些实施方式中，各个所述层的厚度是约250μm至约700μm。在一些实施方式中，各个所述层的厚度是约250μm至约600μm。在一些实施方式中，各个所述层的厚度是约250μm至约500μm。在一些实施方式中，各个所述层的厚度是约250μm至约450μm。在一些实施方式中，各个所述层的厚度是约250μm至约400μm。在一些实施方式中，各个所述层的厚度是约300μm至约600μm。在一些实施方式中，各个所述层的厚度是约300μm至约500μm。在一些实施方式中，各个所述层的厚度是约300μm至约400μm。

在一些实施方式中，本文提供的多个层包括约2个至约100个层。在一些实施方式中，本文提供的多个层包括约2个至约90个层。在一些实施方式中，本文提供的多个层包括约2个至约80个层。在一些实施方式中，本文提供的多个层包括约2个至约70个层。在一些实施方式中，本文提供的多个层包括约2个至约60个层。在一些实施方式中，本文提供的多个层包括约2个至约50个层。在一些实施方式中，本文提供的多个层包括约10个至约40个层。在一些实施方式中，本文提供的多个层包括约10个至约30个层。在一些实施方式中，本文提供的多个层包括约20个至约80个层。在一些实施方式中，本文提供的多个层包括约20个至约70个层。在一些实施方式中，本文提供的多个层包括约20个至约60个层。在一些实施方式中，本文提供的多个层包括约20个至约50个层。在一些实施方式中，本文提供的多个层包括约20个至约40个层。在一些实施方式中，本文提供的多个层包括约30个至约60个层。在一些实施方式中，本文提供的多个层包括约30个至约50个层。在一些实施方式中，本文提供的多个层包括约30个至约40个层。在一些实施方式中，本文提供的多个层包括约40个至约60个层。在一些实施方式中，本文提供的多个层包括约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个层。

在一些实施方式中，本文提供的多细胞主体被布置在支撑基材上，该支撑基材允许多细胞主体融合以形成大体平面层。在一些实施方式中，支撑基材能透过液体和养分以允许细胞培养基接触所述层的所有表面。

在一些实施方式中，本文提供的动物毛皮细胞的细长的多细胞主体具有相同的或不同的长度。在一些实施方式中，本文提供的动物毛皮细胞的细长的多细胞主体是任意的长度。在一些实施方式中，细长的多细胞主体具有的长度范围为约1mm至约10m。在一些实施方式中，细长的多细胞主体具有的长度范围为约1cm至约10m。在一些实施方式中，细长的多细胞主体具有的长度范围为约1cm至约9m。在一些实施方式中，细长的多细胞主体具有的长度范围为约1cm至约8m。在一些实施方式中，细长的多细胞主体具有的长度范围为约1cm至约7m。在一些实施方式中，细长的多细胞主体具有的长度范围为约1cm至约6m。在一些实施方式中，细长的多细胞主体具有的长度范围为约1cm至约5m。在一些实施方式中，细长的多细胞主体具有的长度范围为约1cm至约4m。在一些实施方式中，细长的多细胞主体具有的长度范围为约1cm至约3m。在一些实施方式中，细长的多细胞主体具有的长度范围为约1cm至约2m。在一些实施方式中，细长的多细胞主体具有的长度范围为约1cm至约1m。在一些实施方式中，细长的多细胞主体具有的长度范围为约1cm至约90cm。在一些实施方式中，细长的多细胞主体具有的长度范围为约1cm至约80cm。在一些实施方式中，细长的多细胞主体具有的长度范围为约1cm至约70cm。在一些实施方式中，细长的多细胞主体具有的长度范围为约1cm至约60cm。在一些实施方式中，细长的多细胞主体具有的长度范围为约1cm至约50cm。在一些实施方式中，细长的多细胞主体具有的长度范围为约1cm至约40cm。在一些实施方式中，细长的多细胞主体具有的长度范围为约1cm至约30cm。在一些实施方式中，细长的多细胞主体具有的长度范围为约1cm至约20cm。在一些实施方式中，细长的多细胞主体具有的长度范围为约1cm至约10cm。在一些实施方式中，细长的多细胞主体具有的长度范围为约2cm至约6cm。在一些实施方式中，细长的多细胞主体具有的长度为约1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm。在一些实施方式中，细长的多细胞主体具有的长度为约1cm、2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、9cm或10cm。在一些实施方式中，细长的多细胞主体具有的长度为约1m、2m、3m、4m、5m、6m、7m、8m、9m或10m。

在一些实施方式中，多细胞主体具有的直径为约100μm、200μm、300μm、400μm或500μm。在一些实施方式中，多细胞主体具有的直径为约100μm至约500μm。在另一些实施方式中，多细胞主体具有的直径为约200μm至约400μm。

在一些实施方式中，本文提供的工程的动物毛皮、生皮或皮革的特征在于其组成为：大体60％至80％的水性流体、14％至35％的蛋白质、和1％至25％的脂肪。

参考图1，在一些实施方式中，多细胞主体1大体是宽度Wl大致等于高度HI的圆柱状，且具有大体圆形截面。在另一些实施方式中，多细胞主体1是细长的，其具有的长度为LI。在另一些实施方式中，Wl和HI适当地为约300μm至约600μm且LI适当地为约2cm至约6cm.

参考图2，在一些实施方式中，多细胞主体2大体上为宽度Wl大致等于高度HI的球形。在另一些实施方式中，Wl和HI适当地为约300μm至约600μm。

层

本文所公开的工程的动物毛皮、生皮或皮革包括多个层。在一些实施方式中，层包括多个多细胞主体，该多细胞主体包括多个培养的动物细胞，其中，细胞被粘附和/或粘合到彼此。另外，本文公开了包括下列步骤的方法：将多细胞主体相邻地铺设在支撑支撑基材上且允许多细胞主体融合以形成大致平面层，用于工程的动物毛皮、生皮或皮革产品的形成。在一些实施方式中，利用本文描述的技术，各个层被生物制造。

在一些实施方式中，层包括同细胞的多细胞主体。在其他实施方式中，层包括异细胞的多细胞主体。在另一些实施方式中，层包括同细胞的多细胞主体和异细胞的多细胞主体两者。在另一些实施方式中，层包括动物上皮细胞、成纤维细胞、角化细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞、或者其组合。

在多个实施方式中，层包括动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例在约30:1、29:1、28:1、27:1、26:1、25:1、24:1、23:1、22:1、21:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、和1:1、或其中的更大的比例。在一些实施方式中，层包含动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例为约20:1至约3:1。在多个实施方式中，层包括动物成纤维细胞，该动物成纤维细胞包括总的细胞种群的约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％和25％或者其中的更大的百分比。在一些实施方式中，层包括动物成纤维细胞，该动物成纤维细胞包括总的细胞种群的约50％至约95％。

在多个实施方式中，各个层的厚度为约10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1000μm、2000μm、3000μm、4000μm、或5000μm、或者其中可量化的更大的数值。在一些实施方式中，各个层的厚度被选择为允许扩散以充分地支撑大体所有细胞在培养基的层中的维持和生长。

在多个实施方式中，多个层包括约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、或500个层、或者其中的更多的层。在一些实施方式中，层的数量被选择成产生厚度近似等于传统的动物毛皮、生皮或皮革产品的厚度的工程的动物毛皮、生皮或皮革。

在一些实施方式中，工程的层被设计成类似于传统的动物毛皮、生皮或皮革产品，以及设计参数(例如，细胞类型、添加剂、尺寸、形状等)被选择以类似于在传统的动物毛皮、生皮或皮革产品中发现的那些设计参数。在另一些实施方式中，层的特征在于基本上类似于传统的动物毛皮、生皮或皮革产品的组成。在另一些实施方式中，层的特征在于，组成基本上为60％至80％的液体水、14％至35％的蛋白质、1％至25％的脂肪。在一些实施方式中，工程的层的角化细胞被对齐。在一些实施方式中，角化细胞通过应用本领域中已知的电场被对齐。在一些实施方式中，角化细胞通过应用机械刺激被对齐，该机械刺激例如为本领域中已知的周期性伸展和放松基层。在另一些实施方式中，对齐的(例如，电定向的和机械定向的)角化细胞基本上具有与如在多种动物毛皮组织中发现的关于彼此的相同的方向。

添加剂

在一些实施方式中，工程的动物毛皮、生皮或皮革产品、工程的层、和/或多细胞主体包括一种或多种添加剂。在另一些实施方式中，一种或多种添加剂选自：矿物质、纤维、脂肪酸和氨基酸。在一些实施方式中，工程的动物毛皮、生皮或皮革产品、层、和/或多细胞主体包括一种或多种添加剂以增强商业吸引力(例如，外观、颜色、气味等)。在另一些实施方式中，工程的皮肤、生皮和皮革产品、层、和/或多细胞主体包括一种或多种着色剂、和/或一种或多种着嗅剂。

在一些实施方式中，工程的动物毛皮、生皮或皮革产品、工程的层，和/或多细胞主体包括下列物质的一种或多种：基质蛋白、蛋白多糖、抗氧化剂、全氟化碳和生长因子。如本文所用的术语“生长因子”是指蛋白质、多肽、或多肽的复合体，其包括通过细胞产生且可以影响自身和/或各种相邻的或远程的细胞的细胞因子。通常生长因子影响细胞的具体类型的生长和/或分化，其发育性地或者响应于大量的生理或环境刺激。一些生长因子(但不是全部)是荷尔蒙。示例性生长因子是胰岛素、类胰岛素生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、角化细胞生长因子(KGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)(其包括基本FGF(bFGF))、血小板源生长因子(PDGF)(包括PDGF-AA和PDGF-AB)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子α(TGF-a)、转化生长因子β(TGF-P)(包括TGFpi和TGFP3)、表皮生长因子(EGF)、粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-8等。

在一些实施方式中，工程的动物毛皮、生皮或皮革产品、工程的层、和/或多细胞主体包括一种或多种本领域中已知的防腐剂。在一些实施方式中，防腐剂为抗菌性防腐剂，通过非限制性示例，其包括丙酸钙、硝酸钠、亚硝酸钠、亚硫酸盐(例如，二氧化硫、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾等)和乙二胺四乙酸(EDTA)二钠。在一些实施方式中，防腐剂为抗氧化防腐剂，通过非限制性示例，其包括：丁基羟基茴香醚(BHA)和丁基羟基甲苯(BHT)。

支撑基材

在一些实施方式中，本文公开了多个在支撑基材上相邻地布置的多细胞主体以形成用于形成工程的动物毛皮、生皮或皮革的大致平面层。另外，在一些实施方式中，本文还公开了多个方法，这些方法包括：在支撑基材上相邻地布置多细胞主体以形成大致平面层，在支撑基材上相邻地铺设一个以上的层，以及允许层融合以形成工程的动物毛皮、生皮或皮革。在另一些实施方式中，各个多细胞主体和各个层包括动物毛皮细胞。在这些结构的中央部分中的细胞通常通过扩散供给氧和营养素；然而，气体和养分通常扩散约200微米至300微米进入三维细胞结构。

在一些实施方式中，本文所公开的多细胞主体具有的直径适于允许扩散以充分地支持在培养基中所述动物毛皮细胞的维持和生长。因此，在另一些实施方式中，本文所公开的层具有的厚度适于允许扩散以充分地支持所述动物毛皮细胞在培养基中的维持和生长。

为了方便和增强扩散，在一些实施方式中，支撑基材可透过液体、气体和营养素，其允许细胞培养基在例如生长、熟化和融合期间接触多细胞主体和/或层的所有表面。在多个实施方式中，支撑基材由天然生物材料、合成生物材料和其组合制成。在一些实施方式中，通过非限制性示例，天然生物材料包括，胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白和其他细胞外基质。在一些实施方式中，通过非限制性示例，合成生物材料可包括，羟基磷灰石、藻朊酸盐、琼脂糖、聚乙醇酸、聚乳酸和它们的共聚物。在一些实施方式中，支撑基材是固态。在一些实施方式中，支撑基材是半固态的。在另一些实施方式中，支撑基材是固态和半固态的支撑元件的组合。

在一些实施方式中，支撑基材是在不能渗透的表面上方突起或者上升的，例如，细胞培养环境的一部分(例如，皮氏培养皿、细胞培养瓶、等)或者生物反应器。在另一些实施方式中，上升的支撑基材还方便细胞培养基的流通且增强与多细胞主体和/或层的所有表面的接触。

形成多细胞主体的方法

另外本文公开了制备工程的动物毛皮、生皮或皮革的方法，包括：在体外培养包括一种或多种类型的皮肤细胞的动物细胞，制备多个细长的或者球形的包括所述动物细胞的多细胞主体，其中，这些细胞被粘合到彼此，且形成多个包括相邻地布置多个细长的多细胞主体的平面层，其中所述细长的多细胞主体被融合以形成平面层。

在一些实施方式中，本文提供的方法还包括一种或多种在传统皮革形成中所用的皮革处理步骤。在传统的皮革制备中所用的处理步骤的示例为：保鲜、浸水、浸灰、脱毛、刮肉、片皮、脱灰、再浸灰、软化、脱脂、正面起绒、漂白、浸酸、脱酸、鞣制、打薄、复鞣、润滑、结壳、润湿、均湿、剃毛、再次铬处理、中和、染色、加脂、填充、剥离、填塞、白化、固定、定形、干燥、精整、碾磨、刮软、抛光、整饰、上油、刷涂、填补、浸渍、喷涂、辊涂、淋涂、打磨、电镀、压花、熨烫、上釉和滚揉。通常，针对处理传统的动物生皮的过程(例如，脱毛、刮肉、片皮等)不需要执行。

在一些实施方式中，所述制备步骤包括生物制造多细胞主体或所述层。在一些实施方式中，所述制备步骤包括生物制造多细胞主体或所述层而没有结构支架。

在一些实施方式中，形成步骤包括在支撑基材上布置或放置多细胞主体，其允许多细胞主体融合以形成大致平面层。在一些实施方式中，所述多细胞主体或所述层被水平地和/或竖向地彼此相邻布置。

在一些实施方式中，所述融合进行约2小时至约24小时。

存在多种途径制备具有本文描述的特征的多细胞主体。在一些实施方式中，多细胞主体可以由包含多个活细胞或者具有所需的细胞密度和粘度的细胞糊剂来制造。在另一些实施方式中，细胞糊剂可以被成型为所需的形状以及通过熟化(例如，孵化)所形成的多细胞主体。在具体实施方式中，细长的多细胞主体通过包括多个活细胞的细胞糊剂成型为细长的形状(例如，圆柱体)来制备。在另一些实施方式中，细胞糊剂在受控的环境中被孵化以允许细胞粘附和/或粘合到彼此以形成细长的多细胞主体。在另一具体实施方式中，通过将包括多个活细胞的细胞糊剂在盛放细胞糊剂的装置中成型为三维形状，来制备多细胞主体。在另一些实施方式中，细胞糊剂在受控的环境中被孵化，同时其保持为三维形状用于充足的时间以制备主体，如本文所描述，该主体具有足够的粘合力以在平坦表面上支撑本身。

在多个实施方式中，细胞糊剂通过以下步骤来提供：(A)混合细胞或细胞聚集体(一种或多种细胞类型的聚集体)和细胞培养基(例如，以预定的比例)，得到细胞悬浮液，和(B)，压缩细胞悬浮液以制备具有所需细胞密度和粘度的细胞糊剂。在多个实施方式中，通过大量的方法实现压缩，例如，通过浓缩由细胞培养物得到的特定细胞悬浮液，以实现所需的细胞浓度(密度)、粘度和对于细胞糊剂所需的稠度。在具体实施方式中，来自细胞培养物的较稀的细胞悬浮液离心分离预定的时间以实现在小球中的细胞浓度可以在模具中成型。切向流过滤("TFF")是浓缩或压缩细胞的另一合适的方法。在一些实施方式中，化合物与细胞悬浮液组合以提供所需的挤出性能。通过非限制性示例，合适的化合物包括胶原蛋白、水凝胶、人工基底膜、纳米纤维、自组装纳米纤维、明胶、纤维蛋白原等。

在一些实施方式中，通过将多个活细胞与细胞培养基混合，以及压缩活细胞(例如，通过离心分离)，来制备细胞糊剂。一种或多种ECM成分(或者ECM成分的衍生物)可选地包括：重新悬浮在含有ECM成分(或者ECM成分的衍生物)的一种或多种生理上可接受的缓冲液中的细胞团块，以及再次得到离心分离的细胞悬浮液以形成细胞糊剂.

在一些实施方式中，用于进一步处理所需的细胞糊剂的细胞密度可以随着细胞类型而变化。在另一些实施方式中，细胞之间的相互作用决定细胞糊剂的性能，以及不同的细胞类型将具有在细胞密度和细胞与细胞的相互作用之间的不同关系。在另一些实施方式中，在成型细胞糊剂之前，细胞可以被预处理以增大细胞相互作用。例如，在离心分离之后，细胞可以在离心管内被孵化以便增强在成型细胞糊剂之前的细胞与细胞之间的相互作用。

在多个实施方式中，多种方法用来成型细胞糊剂。例如，在具体实施方式中，细胞糊剂被手工模制或者加压(例如，在浓缩/压缩之后)以实现所需的形状。通过另一示例，细胞糊剂可以被送入(例如，送气)预成型工具，例如，微量吸液管(例如，毛细吸管)，其将细胞糊剂成型以符合工具的内表面。微量吸液管(例如，毛细吸管)的界面形状可替选地是圆形、方形、矩形、三角形或者其他非圆形的截面形状。在一些实施方式中，细胞糊剂通过存放于预成型模具(例如，塑料模具、金属模具或凝胶模具)中来成型。在一些实施方式中，离心浇注或者连续浇注用来成型细胞糊剂。

参考图5，在具体示例中，成型包括在成型装置(例如，毛细吸管)5中保持细胞糊剂4以允许细胞在成型装置中部分地粘附和/或粘合到彼此。通过另一示例，细胞糊剂可以送气进入成型装置中且保持在成型装置中持续熟化时段(本文也称为孵化时段)以允许细胞至少部分地粘附和/或粘合到彼此。在一些实施方式中，成型装置(例如，毛细吸管)是用来将多细胞主体可操作以自动地防止在三维结构中的打印头的一部分。然而，存在时间量的限制，细胞可以保持在诸如毛细吸管的成型装置中，其在细胞的生存能力被压缩之前，其提供了对细胞仅限制最佳地接近氧和/或营养素。

在一些实施方式中，部分粘附和/或粘合的细胞糊剂从成型装置(例如，毛细吸管)被转移到允许营养素和/或氧被供给到细胞的第二成型装置(例如，模具)，同时它们被保持在第二成型装置中用于另外的熟化时段。合适的成型装置(其允许细胞被供给营养素和/或氧)的一个示例是用于制备多个多细胞主体(例如，大致相同的多细胞主体)的模具。通过另一示例，该模具包括由耐迁移且细胞不能在基板中生长以及耐细胞附着到基材的材料制成的生物相容的基材。在多个实施方式中，基材可以适当地由(PTFE)、不锈钢、琼脂糖、聚乙二醇、玻璃、金属、塑料或凝胶材料(例如，琼脂糖凝胶或其他水凝胶)和类似材料制成。在一些实施方式中，模具还合适地构造为允许将组织培养基供给到细胞糊剂(例如，通过将组织培养基分配到模具的顶部)。

在具体实施方式中，多个细长的沟槽形成在基材中。在另一具体实施方式中，各个沟槽的深度在约500微米至约1000微米的范围内，各个沟槽的底部具有用于形成细长的圆柱状多细胞主体的半圆形截面形状，该多细胞主体具有大致圆形截面的形状。在另一具体实施方式中，沟槽的宽度合适地略大于在模具中待制备的多细胞主体的宽度。例如，沟槽的宽度合适地在约300微米至约1000微米的范围内。

因此，在使用第二成型装置的实施方式中，部分地粘附和/或粘合的细胞糊剂从第一成型装置(例如，毛细吸管)转移到第二成型装置(例如，模具)。在另一些实施方式中，部分地粘附和/或粘合的细胞糊剂可以通过第一成型装置(例如，毛细吸管)被转移到模具的沟槽中。在另一些实施方式中，在熟化期(其中，模具伴随保持在其中的细胞糊剂在受控的环境中被孵化以允许在细胞糊剂中的细胞进一步粘附和/或粘合到彼此以形成多细胞主体)之后，细胞的粘合力足够强以允许得到的多细胞主体采用工具(例如，毛细吸管)可以获得。在另一些实施方式中，毛细吸管合适地是可操作以将多细胞主体自动地定位到三维结构的设备的打印头的一部分。

在一些实施方式中，多细胞主体的横截面形状和尺寸将基本上对应于用来制备多细胞主体的第一成型装置和可选的第二成型装置的截面形状和尺寸，熟练的技术工人能够选择具有合适截面形状、截面面积、直径和长度的合适的成型装置，其适于创建具有上文讨论的截面形状、截面面积、直径和长度的多细胞主体。

如本文所讨论的，大量的细胞类型可以用来创建本发明的多细胞主体。因此，一个或多个类型的细胞或细胞聚集体包括：例如，在本文中所列举的所有细胞类型可以被用作初始物料以创建细胞糊剂。例如，可选地采用诸如动物上皮细胞、成纤维细胞、角化细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞、或者其组合的细胞。如本文描述的，多细胞主体是同细胞的或者异细胞的。为了制备同细胞的多细胞主体，细胞糊剂合适地为同细胞的，即，其包括多个单一类型的活细胞。另一方面，为了制备异细胞的多细胞主体，细胞糊剂将适当地包括明显数量的一种以上的细胞类型的细胞(即，细胞糊剂将是异细胞的)。如本文描述的，当异细胞的细胞糊剂用来创建多细胞主体时，基于细胞的粘合强度上的差异，活细胞可以在熟化和粘合过程期间“整理”，且可以恢复它们的生理构造。

在一些实施方式中，如本文所指出的，除了多个活细胞之外，一个或多个ECM成分或者一种或多种ECM成分(例如，明胶、纤维蛋白原、胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、和/或蛋白多糖)的一种或多种衍生物可以适当地包括在细胞糊剂中以将这些物质并入多细胞主体。在另一些实施方式中，将ECM成分或者ECM成分的衍生物添加到细胞糊剂可以促进细胞在多细胞主体中的粘合力。例如，明胶和/或纤维蛋白原可选地被添加到细胞糊剂。更具体地，10％至30％的明胶的溶液和10mg/ml至80mg/ml纤维蛋白原的溶液可选地与多个活细胞混合以形成含有明胶和纤维蛋白原的细胞悬浮液。

多种方法适于方便进一步熟化过程。在一个实施方式中，细胞糊剂可以在约37℃下孵化一段时间(其可以是依赖于细胞类型)以产生粘附和/或粘合。可替选地或者另外地，细胞糊剂可以在含有因子和/或离子的细胞培养基的存在下被保持以产生粘附和/或粘合。

在支撑基材上布置多细胞主体以形成层

大量的方法适于在支撑基材上布置多细胞主体以制备所需的三维结构(例如，大致平面层)。例如，在一些实施方式中，多细胞主体被手工放置成彼此接触、通过来自移液管、喷嘴或枕头的基础被存放就位，或者被定位成接触例如生物制造器的自动化机器。

如本文描述的，在一些实施方式中，支撑基材能透过液体、气体和营养素且允许细胞培养基在布置和随后的融合期间与多细胞主体和/或层的所有表面接触。如本文的进一步描述，在一些实施方式中，支撑基材由诸如胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白和其他细胞外基质的天然生物材料制成。在一些实施方式中，支撑基材由例如羟基磷灰石、藻朊酸盐、琼脂糖、聚乙醇酸、聚乳酸和它们的共聚物的合成生物材料制成。在一些实施方式中，支撑基材是固态。在一些实施方式中，支撑基材是半固态的。在另一些实施方式中，支撑基材是固态和半固态的支撑元件的组合。在另一些实施方式中，支撑基材是平面的以方便平面层的制备。在一些实施方式中，支撑基材是在不能渗透的表面上方突起或者上升的，例如，细胞培养环境的一部分(例如，皮氏培养皿、细胞培养瓶、等)或者生物反应器。因此，在一些实施方式中，可渗透的、上升的支撑基材有助于防止细胞提前死亡、有助于增强细胞成长以及方便多细胞主体的融合以形成层。

如本文描述的，在多个实施方式中，多细胞主体具有多个形状和尺寸。在一些实施方式中，多细胞主体是细长的且为圆柱体的形状。例如，参见图1和图3。在一些实施方式中，细长的多细胞主体具有相同的长度和/或直径。在其他实施方式中，细长的多细胞主体具有不同的长度和/或直径。在一些实施方式中，多细胞主体基本上为球形。例如，参见图2和图4。在一些实施方式中，层包括大致相同尺寸的大致球形的多细胞主体。在其他实施方式中，层包括不同尺寸的大致球形的多细胞主体。

参考图6，在一些实施方式中，细长的多细胞主体1被布置在支撑基材3上，该细长的多细胞主体1水平相邻且接触一个或多个其他的细长的多细胞主体支撑，以形成大致平面层。

参考图7，在一些实施方式中，大致球形的多细胞主体2被布置在支撑基材3上，该大致球形的多细胞主体2水平地相邻且接触一个或多个其他的大致球形的多细胞主体。在另一些实施方式中，该过程被重复以构建大致球形的多细胞主体的图案(例如，网格)，以形成大致平面层。

参考图8，在具体实施方式中，细长的多细胞主体6借助诸如毛细吸管5的工具被铺设在支撑基材3上，使得其水平地相邻且接触于一个或多个其他多细胞主体。在另一些实施方式中，细长的多细胞主体被铺设在支撑基材上，使得其平行于多个其他细长的多细胞主体。

参考图9，在一些实施方式中，后一组细长的多细胞主体8竖向相邻且接触于前一组支撑细长的多细胞主体9被布置支撑基材3上，以形成厚层。

在其他实施方式中，通过布置多个形状和尺寸的多细胞主体，形成不同形状和尺寸的层。在一些实施方式中，各个形状、尺寸、密度、细胞组成和/或添加剂组成的多细胞主体在层中组合，这例如有助于得到的层的外观、气味和质地。

参考图10，在一些实施方式中，细长的多细胞主体9被布置成支撑基材3上，该细长的多细胞主体9相邻且接触大致球形的多细胞主体10，以形成复合层。

在一些实施方式中，一旦层的组装完成，则将组织培养基浇注在结构的顶部上。在另一些实施方式中，组织培养基进入多细胞主体之间的空间以养育在多细胞主体中的细胞。在三维结构中的多细胞主体允许融合到彼此以制备用于形成工程的动物毛皮、生皮和皮革的大致平面层。“融合”("fuse"、"fused"、或"fusion")是指，直接地通过在细胞表面蛋白之间的相互作用，或者间接地通过具有ECM组分或者ECM组分的衍生物的细胞的相互作用，邻接的多细胞主体的细胞逐渐粘附和/或粘合到彼此。在一些实施方式中，融合层完全地融合，然后多细胞主体变成基本上连续。在一些实施方式中，融合层基本上融合或者部分地融合，以及多细胞主体的细胞变成粘附和/或粘合到必须允许完好地移动和操作层的程度。

在一些实施方式中，多细胞主体融合以在细胞培养环境(例如，皮氏培养皿、细胞培养瓶、生物反应器等)中层。在另一些实施方式中，多细胞主体融合以在具有适于方便在多细胞主体中包括的细胞类型的生长的条件的环境中形成层。在多个实施方式中，融合发生超过约15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、和60分钟，以及其中的更长的时间。在其他多个实施方式中，融合发生超过约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时、36小时、38小时、40小时、42小时、44小时、46小时、和48小时，以及其中的更长的时间。在另外的多个实施方式中，融合发生超过约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、12天、和14天，以及其中的更长的时间。在另一些实施方式中，融合发生超过约2小时至约24小时。多个因素影响所需的融合时间，通过非限制性示例，这些因素包括：细胞类型、细胞类型比例、培养条件和添加剂(例如，生长因子)的存在。

在一些实施方式中，一旦层的融合完成，则层和支撑基材分离。在其他实施方式中，当层的融合基本上完成或者部分地完成时，层和支撑基材分离，但是层的细胞被粘附和/或粘合到彼此到必须允许移动、操作和层叠层而无需将其撕裂开的程度。在另一些实施方式中，层和支撑基材借助用于熔化、溶解或降解支撑基材的标准流程来分离。在另一些实施方式中，例如，通过温度变化、光、或者其他对层没有负面影响的刺激，将支撑基材溶解。在具体实施方式中，支撑基材由柔性材料制成且从层剥离。

在一些实施方式中，分离的层被转移到用于进一步熟化的生物反应器。在一些实施方式中，分离的层熟化且在并入工程的动物毛皮、生皮或皮革产品之后进一步融合。

在其他实施方式中，层和支撑基材没有分离。在另一些实施方式中，支撑基材在组装的工程的动物毛皮、生皮或皮革产品的包装、冷冻、销售或者消费之前降解或生物降解。

将层布置在支撑基材上以形成动物毛皮、生皮或皮革

大量的方法适于将层布置在支撑基材上以制备工程的动物毛皮、生皮或皮革。例如，在一些实施方式中，层被手工放置成与彼此接触或者根据计算机脚本程序通过计算机辅助装置(诸如，生物制造器)被存放就位。在另一些实施方式中，大致平面层被层叠以形成工程的动物毛皮、生皮或皮革。

在多个实施方式中，约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个层或者其中的更多的层被层叠。在多个实施方式中，约55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、或500个层或者其中的更多的层被层叠。在一些实施方式中，约10个至约100个层被层叠。在一些实施方式中，约10个至约90个层被层叠。在一些实施方式中，约10个至约80个层被层叠。在一些实施方式中，约10个至约70个层被层叠。在一些实施方式中，约10个至约60个层被层叠。在一些实施方式中，约10个至约50个层被层叠。在一些实施方式中，约20个至约80个层被层叠。在一些实施方式中，约20个至约70个层被层叠。在一些实施方式中，约20个至约60个层被层叠。在一些实施方式中，约20个至约50个层被层叠。在一些实施方式中，约20个至约40个层被层叠。在一些实施方式中，约20个至约30个层被层叠。在一些实施方式中，约40个至约60个层被层叠。在另一些实施方式中，层叠被重复以得到接近传统的动物毛皮、生皮或皮革产品的厚度。在多个实施方式中，层叠的层包括约1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、或10mm或其中的更大数值的厚度的工程的动物毛皮、生皮或皮革产品。

在一些实施方式中，岑具有通过多细胞主体的放置、图案、或者方向所限定的方向。在另一些实施方式中，各个层采用相对于支撑基材和/或一个或多个其他层的特定方向被层叠。在多个实施方式中，一个或多个层采用某一方向被层叠，该方向包括相对于下方的支撑基材和/或层的旋转，其中，旋转约5度、10度、15度、20度、25度、30度、35度、40度、45度、50度、55度、60度、65度、70度、75度、80度、85度、90度、95度、100度、105度、110度、115度、120度、125度、130度、135度、140度、145度、150度、155度、160度、165度、170度、175度、和180度或者其中更大的度数。在其他实施方式中，所有的层被定向成基本相同。

参考图11，在具体实施方式中，层具有通过用来形成层的细长的多细胞主体的平行放置所限定的方向。在另一具体实施方式中，层采用包括相对于下方的层旋转90度的方向被层叠以形成工程的动物毛皮、生皮或皮革。

在一些实施方式中，一旦层的层叠完成，则在三维结构中的层允许融合到彼此以制备工程的动物毛皮、生皮或皮革。在一些实施方式中，层融合以形成在细胞培养环境(例如，皮氏培养皿、细胞培养瓶、等)中的工程的动物毛皮、生皮或皮革。在多个实施方式中，融合进行超过约15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、和60分钟，以及其中的更长的时间。在其他多个实施方式中，融合进行超过约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时、36小时、38小时、40小时、42小时、44小时、46小时、和48小时，以及其中更长的时间。在另一些实施方式中，融合进行超过约2小时至约24小时。

在一些实施方式中，一旦层叠，则由于气体、液体和养分的不能扩散进入或者另外到达结构的内部，故多细胞主体和层的细胞而开始死亡。在另一些实施方式中，细胞的逐渐死亡类似于在实体器官的组织中发生的自然细胞死亡。在一些实施方式中，工程的动物毛皮、生皮或皮革结构的层融合到彼此，同时伴随细胞的逐渐死亡。在一些实施方式中，层的多细胞主体继续融合到彼此，同时伴随细胞的逐渐死亡。在另一些实施方式中，在层内和层间的融合在结构的大部分细胞的死亡之前完成或者基本上完成。在另一些实施方式中，在层内和层间的融合在结构的所有细胞的死亡之前完成或者基本上完成。

在一些实施方式中，一旦工程的动物毛皮、生皮或皮革的组装完成，则动物毛皮、生皮或皮革和支撑基材分离。在另一些实施方式中，动物毛皮、生皮或皮革和支撑基材借助用于熔化、溶解或降解支撑基材的标准流程被分离。在另一些实施方式中，例如，通过温度变化、光、或者其他对动物毛皮、生皮或皮革没有负面影响的刺激，将支撑基材溶解。在具体实施方式中，支撑基材由柔性材料制成且从动物毛皮、生皮或皮革剥离。在一些实施方式中，分离的动物毛皮、生皮或皮革被转移到用于进一步熟化的生物反应器。在其他实施方式中，动物毛皮、生皮或皮革和支撑基材没有分离。在另一些实施方式中，支撑基材在销售或消费之前降解或者生物降解。

在一些实施方式中，动物毛皮、生皮或皮革被照射。在一些实施方式中，动物毛皮、生皮或皮革被处理以防止在分销和销售之前的分解或降解。

工程的动物毛皮、生皮和皮革

在一些实施方式中，本文公开了工程的动物毛皮、生皮或皮革产品。在多个实施方式中，本文还公开了多个在支撑基材上相邻地布置以形成大致平面层的多细胞主体，用于形成工程的动物毛皮、生皮或皮革。

在一些实施方式中，通过本领域中任一已知的方法来进一步处理工程的动物毛皮、生皮或皮革产品。已知的处理方法的示例包括：通过保鲜、浸水、浸灰、脱毛、刮肉、片皮、脱灰、再浸灰、软化、脱脂、正面起绒、漂白、浸酸、脱酸、鞣制、打薄、复鞣、润滑、结壳、润湿、均湿、剃毛、再次铬处理、中和、染色、加脂、填充、剥离、填塞、白化、固定、定形、干燥、精整、碾磨、刮软、抛光、整饰、上油、刷涂、填补、浸渍、喷涂、辊涂、淋涂、打磨、电镀、压花、熨烫、上釉和滚揉处理。重要地，本文描述的方法不需要当使用天然动物生皮时必要的任一预处理步骤，其包括去毛(脱毛)、浸灰、刮肉、片皮、脱灰、再浸灰等。如本文所描述的形成的层状主体可以由任一合适长度制成，通过培养细胞所形成的胶原蛋白(和其他ECM分子)导致不包括例如毛囊、血管、肌肉(例如，立毛肌)等的结构的层状体。

通常，本文描述的工程的皮革可以被鞣制(或者通过类似的工艺来处理)以将细胞外基质材料改性。如上文所讨论的，ECM的主成分之一是胶原蛋白(尤其是I型胶原蛋白)。鞣制可以使胶原蛋白改性。例如，一种铬(III)硫酸盐([Cr(H₂O)₆]₂(SO₄)₃)的鞣制试剂已经被视为最高效和有效的鞣制试剂。铬(III)硫酸盐溶解以提供六水合铬(III)阳离子，[Cr(H₂O)₆]³⁺，在较高的pH值下，其经历称为羟连作用的过程以提供聚铬(III)化合物，其在鞣制中是活性的，该化合物是胶原蛋白子单元的交联。一些配位体包括硫酸盐阴离子、胶原蛋白的羧基、来自氨基酸侧链的氨基，以及掩蔽剂。掩蔽剂为羧酸，例如，乙酸，其用来抑制聚铬(III)链的形成。掩蔽剂允许制革工人进一步增大pH值以增大胶原蛋白的反应性而不抑制铬(III)络合物的渗透。胶原蛋白的高含量的羟基脯氨酸允许通过螺旋结构内的氢键结合带来的明显交联。离子化的羧基(RCO^2-)通过氢氧化物的作用使胶原蛋白水解而形成。该转化可以发生在浸灰过程期间，在引入鞣制试剂(铬盐)之前。电离的羧基基团可以整合为氧-氢氧化物簇的铬(III)中心的配体。鞣制可以增大在胶原蛋白中的蛋白质链之间的间隔(例如，从到)，其与通过来自于羟连或氧连之类的聚铬物质的交联一致。铬可以被交联到胶原蛋白。铬形成稳定的桥键的能力解释了其视为最有效的鞣制化合物之一的原因。铬-鞣制的皮革会含有4％至5％的铬。该功效的特征在于：其增大了皮革的湿热稳定性，以及其在热水中的抗收缩性。其他鞣制试剂可以用来鞣制层状的主体且使胶原蛋白改性。

在一些实施方式中，工程的动物毛皮、生皮或皮革产品为基本上不含病原微生物。在另一些实施方式中，细胞制备、细胞培养、多细胞主体制备、层制备和工程的动物毛皮、生皮或皮革的制备的受控的和基本上无菌的方法得到基本上不含病原微生物的产品。在另一些实施方式中，该产品另外的优点是增大实用性和安全性。

在一些实施方式中，工程的动物毛皮、生皮或皮革产品被成型。在另一些实施方式中，动物毛皮、生皮或皮革通过以下方法来成型，例如：控制用来构建动物毛皮、生皮或皮革的多细胞主体和/或层的数量、尺寸和布置。在其他实施方式中，动物毛皮、生皮或皮革通过以下方法来成型，例如，切割、挤压、模制或者冲压。在一些实施方式中，动物毛皮、生皮或皮革产品的形状被选择以模拟传统的动物毛皮、生皮或皮革产品。

实施例

下列例证性示例是形成主体的方法的实施方法的代表，该主体可以被鞣制以形成工程的皮革。本文描述的实施例不意味着限制。

实施例1-支撑基材的制备

为了制备2％的琼脂糖溶液，2g的超纯低熔点(LMP)的琼脂糖溶解在100mL的超纯水/缓冲液(1:1，v/v)中。缓冲液可选地是PBS(Dulbecco磷酸盐缓冲盐水lx)或者HBSS(Hanks平衡盐溶液lx)。琼脂糖溶液被放置于具有温水(超过80℃)的烧杯中且放置在电热板上直到琼脂糖完全溶解。只要温度超过36℃，则琼脂糖溶液保持液态。低于36℃，则发生相变，粘度增大，且最终琼脂糖形成凝胶。

为了制备琼脂糖支撑基材、10mL的液态的2％的琼脂糖(温度>40℃)放置于10cm直径的皮氏培养皿中，然后均匀地铺展以形成一致的层。琼脂糖允许在4℃下的冷藏箱中形成凝胶。

实施例2-牛的角化细胞、成纤维细胞和上皮细胞的培养

新鲜的分离的牛的角化细胞、成纤维细胞和上皮细胞在低葡萄糖的DMEM中生长，该低葡萄糖的DMEM具有10％的小牛血清(HycloneLaboratories，UT)，10％的猪血清(Invitrogen)、左旋维生素C、硫酸铜、羟乙基哌嗪乙硫磺酸HEPES、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-甘氨酸、和青霉素G(所有的前述补充剂从Sigma，St.Louis，MO购买)。细胞株在涂覆有小于0.5％的明胶(猪皮明胶；Sigma)培养皿(Techno Plastic Products，St.Louis，MO)上培养且在37℃下保持在含有5％CO₂的潮湿空气中。角化细胞在用来形成多细胞主体之前被再次培养达到通道7。

实施例3–多细胞球体和圆柱体的制备

细胞培养物采用磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS，Invitrogen)洗涤两次，然后采用0.1％的胰岛素(Invitrogen)处理10分钟，然后在1500RPM下离心分离5分钟。细胞再次悬浮在4mL的细胞型特定介质中，然后在37℃下在具有5％CO₂的10Ml的组织培养瓶中孵化且在旋转振动器(New Brunswick Scientific，Edison，NJ)上持续1小时用于粘附复原，以及在3500RPM下离心分离。得到的小球被转移到300μm(Sutter Instrument，CA)或500μm(Drummond Scientific Company，Broomall，PA)直径的毛细微量吸液管中，且在37℃下采用5％的CO₂孵化15分钟。对于球形的多细胞主体，受挤压的圆柱体被切割成相等的碎片，其在旋转振动器上整夜地收集。根据微量吸液管的直径，该步骤提供了常规的限定尺寸和细胞数量的球体。对于圆柱形多细胞主体，圆柱体使用生物制造器被机械地挤出成为具体制备的非粘附的或琼脂糖模具。在模具中整夜熟化之后，细胞圆柱体具有足以存放的结合力。

多细胞主体被包装成盒(300μm至500μm的内径的微量吸液管)。盒被插入生物制造器且根据计算机脚本程序发送到支撑基材上，该计算机脚本程序可以将待制造的结构的形状编码。

实施例4-工程的动物毛皮、生皮和皮革的制备

如实施例3中所描述的，制备圆柱状多细胞主体。多细胞主体是异细胞的且由实施例2的牛的角化细胞、真皮成纤维细胞和上皮细胞组成。在多细胞主体中角化细胞与真皮成纤维细胞的比例约为19:1。多细胞主体具有300μm的截面直径以及2cm、3cm、4cm或5cm的长度。熟化的多细胞主体被包装成盒(300μm内径的微量吸液管)，其然后被插入生物制造器。

如实施例1中的描述，制备琼脂糖支撑基材。通过细筛孔基座使支撑基材出现在大的有盖培养皿的底部上，使得细胞培养基可以接触多细胞主体的所有表面和保存在支撑基材上的层。

根据计算机脚本程序的指令，生物制造器将多细胞主体送至支撑基材上。该脚本程序编码圆柱状多细胞主体的布局以形成大致方形单层，该方形单层具有约10cm的平均宽度和约10cm的平均长度。多细胞主体与首尾放置的各个长度的主体平行于彼此放置，以形成所编码的形状。

培养介质在层的顶部上浇注，且该结构允许在含有5％CO₂的潮湿的大气中在37℃下经过约12小时的过程上的部分地融合。在该时间期间，多细胞主体粘附和/或粘合到必须允许移动和操作层而无需将其撕裂开的程度。

部分地融合的层从支架上剥离且层叠。65层被层叠以形成工程的动物毛皮、生皮或皮革，其具有约2cm的总体宽度和高度以及约10cm的长度和宽度。各个层相对于下面的层旋转90度。一旦层叠，则细胞由于缺氧而开始染色，此时培养介质不变。当这些细胞首先剥离氧时，细胞死亡开始于叠层的内部，然后当周围的培养介质逐渐耗尽氧时，细胞死亡逐渐到达外细胞。细胞死亡的同时，部分地融合层将继续融合，同时它们还开始在竖向方向上融合。由于融合过程进行约6小时，同时细胞死亡进行约20小时，死后的结构完全被融合且发展成类似于传统动物毛皮、生皮或皮革的形状。动物毛皮、生皮或皮革通过传统的制备、鞣制和/或结壳方法被进一步处理。

图12示出了形成如本文所述的工程的皮革的方法的高层次的概述。图12示出了说明用于商品中的人造皮革的形成的8个“步骤”。如上文所讨论和说明的，首先，皮肤细胞从合适的来源培养。在图12(1)中，来源是来自动物毛皮样品(示出为奶牛)。细胞在体外培养且展开，如步骤12(2)中所示；如上文所讨论的，这些细胞可以用来形成多细胞主体。培养的皮肤细胞然后可以被保存以形成薄片或层，如步骤12(3)中所示。细胞可以被保存为多细胞主体(管、球等)且允许融合然后形成(或形成另外的)细胞外基质(ECM)，其通常包括胶原蛋白。当在如本领域中已知的单层中培养时，细胞通常释放包括胶原蛋白的ECM。在一些变型中，胶原蛋白合成和/或释放可以采用另外的试剂引发和/或通过洗涤以去除胶原蛋白释放的抑制剂。

薄片然后可以被分层堆积到一起，如图12(4)中总体所示。层可以单独地层叠到彼此的上方层叠到彼此的上方(例如，通过顺序添加的层)、或者同时地(例如，形成两层的层，然后结合该处理层，然后是四重的层，等，或者立刻将它们全部层叠到一起等等)。在一些变型中，层依次层叠。层在层叠之前可以被处理。

在适当的时间之后，层允许融合以形成单一的主体，其可以指如图12(5)中所示的层状主体。通过在一个(或多个)层叠的层内的皮肤细胞的活性继续形成和释放ECM，可以发生融合。如上文所讨论的，多细胞主体可以融合，设置在层之间的融合之后，在各个层内的ECM(例如，胶原蛋白)的图案可反映所用的制造方法。例如，通过熔合的层状主体的部分仍然可以反映反映形成过程的层状性质的层。

如图12(6)中所示，层状主体被鞣制。在图12中所示的示例中，多个层状主体可以一起鞣制，所形成的皮革可以后处理来抛光，包括如图12(7)中所示的染色和整修。最后，如图12(8)中所示，皮革可以用来形成另外会使用传统(“天然”)皮革的物体。

当特征或元件在本文中被称为在另一个特征或元件“上”，其可以直接位于另一个特征或元件上或者还可以存在介于中间的特征和/或元件。相反，当特征或元件在本文中被称为“直接在另一个特征或元件上”，则，不存在介于中间的特征或元件。还可以理解，当特征或元件被称为“连接”、“附接”或“联接”到另一特征或元件，其可以直接地连接、附接或者联接到另一特征或元件，或者可以存在介于中间的特征或元件。相反，当特征或元件被称为“直接地连接”、“直接地附接”或“直接地联接”到另一特征或元件时，则不存在介于中间的特征或元件。尽管描述和示出了关于一个实施方式，然而，所描述和示出的特征和元件可应用到其他实施方式。本领域的技术人员还可以理解，提到的设置在另一特征的“邻近”的结婚或特征可以具有重叠的部分或者位于相邻特征下方的部分。

如上所述，本文所用的术语是出于仅描述具体实施方式的目的且不旨在限制本发明。例如，如本文所用的，单数形式“一个”意在还包括复数形式，除非上下文另外明确指出。还应该理解，当在说明书中使用术语“包括”时，其指明存在所述特征、步骤、操作、元件和/或部件，但是不排除存在或者添加一个或多个其他的特征、步骤、操作、元件、部件和/或其组合。如本文所用的，术语“和/或”包括一个或多个相关的列举项目的任何和所有组合，且可以简写为“/”。

空间相对术语，例如，“下面”、“下方”、“低于”、“越过”、“上方”等在本文中可以用于方便说明以描述在附图中所示的一个元件或特征的关系与另一个元件或特征的关系。可以理解，空间相对术语旨在包括除了在附图中示出的方向之外的用户或操作的装置的不同方向。例如，如果附图中的装置被倒置，则如“下面”或者“下方”的其他元件或特征所描述的元件然后将被定向成在其他元件或特征的“上方”。因此，示例性术语“下面”可包括上方和下面的两个方向。该装置可以另外定向(被旋转90度或者以其他的方向)以及因此解释本文所用的空间相对描述语。类似地，术语“向上”、“向下”、“竖向”、“横向”等在本文仅用于说明的目的，除非另外具体指明。

尽管术语“第一”和“第二”在本文中可以用来描述多个特征/元件，然而，这些特征/元件应该不受限于这些术语，除非上下文另外指出。这些术语可以用来区分一个特征/元件与另一个特征/元件。因此，下文讨论的第一特征/元件可以被称为第二特征/元件，类似地，下文讨论的第二特征/元件可以被称为第一特征/元件而不脱离本发明的教导。

除非另外明确指出，否则如本文中在说明书和权利要求书中所用的所有数字可以解读为以“约”或者“近似”为修饰语，即使该修饰语没有清楚地出现。当描述大小和/或位置时，可以使用措辞“约”或者“近似”，以指出所述值和/或位置在值和/或位置的合理期望范围内。例如，数值可具有以下值：设定值(或值的范围)的+/-0.1％、设定值(或值的范围)的+/-1％、设定值(或值的范围)的+/-2％、设定值(或值的范围)的+/-5％、设定值(或值的范围)的+/-10％等。本文提到的任何数值范围旨在包括所有的归入其中的子范围。

尽管上文描述了各个例证性实施方式，然而，对各个实施方式可以做出任意数量的变化而不脱离如权利要求书所描述的本发明的范围。例如，在替选实施方式中通常可以改变执行各种所述方法步骤的次序，而在其他替选实施方式中，一个或多个方法步骤完全可以被忽略。各个装置和系统的实施方式的可选特征可以被包括在一些实施方式中而在其他实施方式中可以不被包括。因此，前述说明主要出于示例的目的而提供且不应该理解为限制如在权利要求书中所列举的本发明的范围。

通过举例而非限制，本文所包括的实施例和附图示出可以实施主题的具体实施方式。如所提到的，其他实施方式可以被利用且从其推断，使得可以做出结构和逻辑上的替换和变化而不脱离该公开的范围。如果事实上公开了不只一个发明或发明构思，则发明主题的这些实施方式出于方便可以单独地或者共同地在本文称为术语“发明”且无意将该申请的范围主动限制到任何单一的发明或发明构思。因此，尽管本文已经举例说明和描述了具体实施方式，然而，任何打算用以实现相同目的的布置可以代替所示出的具体实施方式。该公开旨在覆盖各个实施方式的任何和所有的更改或变化。在阅读上述说明时，上述实施方式和本文没有具体描述的其他实施方式的组合对于本领域的技术人员而言将是明显的。

Claims (61)

1.一种工程的皮革，包括：

具有体积的主体；

其中，所述主体包括多个层，其中各个层包括通过培养的细胞所释放的胶原蛋白；

其中所述主体完全没有毛发、毛囊和血管，且其中所述主体被鞣制以使所述胶原蛋白改性。

2.如权利要求1所述的工程的皮革，其中所述层至少部分地融合。

3.如权利要求1所述的工程的皮革，其中各个层包括胶原蛋白在所述层内的均匀分布。

4.如权利要求1所述的工程的皮革，其中所述培养的细胞包括上皮细胞、成纤维细胞、角化细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞、或者其组合。

5.如权利要求2所述的工程的皮革，其中所述上皮细胞包括鳞状细胞、立方细胞、柱状细胞、基底细胞、或者其组合。

6.如权利要求2所述的工程的皮革，其中所述成纤维细胞是真皮成纤维细胞。

7.如权利要求2所述的工程的皮革，其中所述角化细胞是上皮角化细胞、基底角化细胞、增生基底角化细胞、分化型上基底角化细胞、或者其组合。如权利要求1所述的工程的皮革，还包括细胞外基质或者结缔组织。

8.如权利要求1所述的工程的皮革，还包括选自角蛋白、弹性蛋白、明胶、蛋白多糖、硫酸皮肤素蛋白多糖、糖胺聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、皮连蛋白、脂质、脂肪酸、糖、和其组合中的一种或多种成分。

9.如权利要求1所述的工程的皮革，其中所述培养的细胞源自于选自羚羊、熊、海狸、北美野牛、公猪、骆驼、驯鹿、猫、牛、鹿、狗、大象、麋鹿、狐狸、长颈鹿、山羊、野兔、马、野生山羊、袋鼠、狮子、美洲驼、山猫、貂、驼鹿、公牛、野猪、家猪、家兔、海豹、绵羊、松鼠、老虎、鲸、狼、牦牛和斑马、和其组合中的哺乳动物。

10.如权利要求1所述的工程的皮革，其中所述培养细胞源自于选自龟、蛇、鳄鱼和短吻鳄、或其组合的爬行动物。

11.如权利要求1所述的工程的皮革，其中所述培养细胞源自于选自鸡、鸭、鸸鹋、鹅、松鸡、鸵鸟、野鸡、鸽子、鹌鹑和火鸡、或其组合的鸟类。

12.如权利要求1所述的工程的皮革，其中所述培养细胞源自于选自凤尾鱼、鲈鱼、鲶鱼、鲤鱼、鳕鱼、鳗鱼、比目鱼、河豚、石斑鱼、黑线鳕、大比目鱼、鲱鱼、鲭鱼、鲯鳅、蝠鲼、枪鱼、新西兰红鱼、河鲈鱼、梭子鱼、绿青鳕、三文鱼、沙丁鱼、鲨鱼、鲷鱼、鳎目鱼、黄貂鱼、剑鱼、罗非鱼、鳟鱼、金枪鱼、和白斑鱼、或其组合的鱼类。

13.如权利要求1所述的工程的皮革，其中所述主体不包括结构支架。

14.如权利要求1所述的工程的皮革，其中所述层的至少一个层包括动物成纤维细胞与动物角化细胞的比例为约20:1至约3:1。

15.如权利要求1所述的工程的皮革，其中所述层基本上不含未分化的角化细胞、成纤维细胞或者上皮细胞。

16.如权利要求1所述的工程的皮革，其中所述皮革被图案化。

17.如权利要求16所述的工程的皮革，其中所述图案是选自羚羊、熊、海狸、北美野牛、公猪、骆驼、驯鹿、猫、牛、鹿、狗、大象、麋鹿、狐狸、长颈鹿、山羊、野兔、马、野生山羊、袋鼠、狮子、美洲驼、山猫、貂、驼鹿、公牛、野猪、家猪、家兔、海豹、绵羊、松鼠、老虎、鲸、狼、牦牛、斑马、龟、蛇、鳄鱼、短吻鳄、恐龙、青蛙、蟾蜍、火蜥蜴、蝾螈、鸡、鸭、鸸鹋、鹅、松鸡、鸵鸟、野鸡、鸽子、鹌鹑、火鸡、凤尾鱼、鲈鱼、鲶鱼、鲤鱼、鳕鱼、鳗鱼、比目鱼、河豚、石斑鱼、黑线鳕、大比目鱼、鲱鱼、鲭鱼、鲯鳅、蝠鲼、枪鱼、新西兰红鱼、河鲈鱼、梭子鱼、绿青鳕、三文鱼、沙丁鱼、鲨鱼、鲷鱼、鳎目鱼、黄貂鱼、剑鱼、罗非鱼、鳟鱼、金枪鱼、白斑鱼、和其组合的动物的毛皮图案。

18.如权利要求16所述的工程的皮革，其中所述图案是选自龙、独角兽、狮鹫、塞壬、凤凰、天蛾、独眼龙、眼蝶、美杜莎、飞马、地狱犬、百头巨怪、蛇发女怪、卡律布迪斯、恩浦萨、奇美拉、牛头人、天鲸、九头蛇、半人马、仙女、美人鱼、尼斯湖水怪、北美野人、雷鸟、雪人、山羊吸血怪和其组合的虚幻动物的毛皮图案。

19.如权利要求1所述的工程的皮革，其中各个所述层特征在于，厚度允许扩散以充分地支持所述培养的细胞在培养基中的维持和生长。

20.如权利要求1所述的工程的皮革，其中各个所述层的厚度是约50μm至约200μm。

21.如权利要求1所述的工程的皮革，其中各个所述层的厚度是约50μm至约150μm。

22.如权利要求1所述的工程的皮革，其中所述多个层包括约2个至约50个层。

23.如权利要求1所述的工程的皮革，其中所述多个层包括约2个至约40个层。

24.如权利要求1所述的工程的皮革，其中所述多个层包括约2个至约30个层。

25.如权利要求1所述的工程的皮革，还包括一种或多种着色剂或者颜料。

26.一种制备工程的皮革的方法，所述方法包括：

在体外培养一个类型或多个类型的产生胶原蛋白的细胞；

形成细胞外基质的多个薄片，所述细胞外基质包括由所述一个类型或多个类型的产生胶原蛋白的细胞所产生的胶原蛋白；

将所述多个薄片分层以形成具有体积的主体；和

通过鞣制，处理所述主体。

27.如权利要求26所述的方法，还包括制备多个细长的或者球形的多细胞主体，所述多细胞主体包括所述一个或多个类型的产生胶原蛋白的细胞，其中所述细胞被粘附到彼此。

28.如权利要求26所述的方法，其中形成所述多个薄片包括，形成多个包括相邻地布置多个细长的多细胞主体的平面层，其中所述细长的多细胞主体被融合以形成平面层。

29.如权利要求28所述的方法，其中布置包括将多细胞主体放置在支撑基材上，该支撑基材允许所述多细胞主体融合以形成大致平面层。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述支撑基材能透过液体和养分以允许细胞培养基接触所述层的所有表面。

31.如权利要求28所述的方法，其中形成包括将多细胞主体自动沉积进入所述层，而没有结构支架。

32.如权利要求28所述的方法，其中所述多细胞主体相邻于彼此水平地和/或竖向地布置。

33.如权利要求28所述的方法，其中所述融合进行超过约2小时至约24小时。

34.如权利要求28所述的方法，其中产生胶原蛋白的细胞的细长的多细胞主体具有相同的长度。

35.如权利要求28所述的方法，其中所述细长的多细胞主体具有的长度在从1mm至约10m的范围内。

36.如权利要求28所述的方法，其中所述细长的多细胞主体具有的长度在从1cm至约1m的范围内。

37.如权利要求28所述的方法，其中所述细长的多细胞主体具有的长度在从1cm至约50cm的范围内。

38.如权利要求26所述的方法，还包括：使用一个或多个另外的处理步骤，处理所述主体。

39.如权利要求29所述的方法，其中所述另外的处理步骤选自保鲜、浸水、软化、浸酸、脱酸、打薄、复鞣、润滑、结壳、润湿、均湿、剃毛、再次铬处理、中和、染色、加脂、填充、剥离、填塞、白化、固定、定形、精整、碾磨、刮软、抛光、整饰、上油、刷涂、填补、浸渍、喷涂、辊涂、淋涂、抛光、电镀、压花、熨烫、上釉和滚揉。

40.如权利要求26所述的方法，其中所述产生胶原蛋白的细胞包括皮肤细胞。

41.如权利要求26所述的方法，其中所述产生胶原蛋白的细胞包括上皮细胞、成纤维细胞、角化细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞、或者其组合中的一种或多种。

42.如权利要求33所述的方法，其中所述上皮细胞包括鳞状细胞、立方细胞、柱状细胞、基底细胞、或者其组合。

43.如权利要求33所述的方法，其中所述成纤维细胞是真皮成纤维细胞。

44.如权利要求33所述的方法，其中所述角化细胞是上皮角化细胞、基底角化细胞、增生基底角化细胞、分化型上基底角化细胞、或者其组合。

45.如权利要求26所述的方法，其中形成所述多个薄片包括：形成所述一个或多个类型的产生胶原蛋白的细胞和包括胶原蛋白和选自角蛋白、弹性蛋白、明胶、蛋白多糖、硫酸皮肤素蛋白多糖、糖胺聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、皮连蛋白、脂质、脂肪酸、糖、和其组合中的细胞外基质材料的多个薄片。

46.如权利要求26所述的方法，其中形成所述多个薄片包括：以约20:1至约2:1比例的动物成纤维细胞与动物角化细胞，形成所述一个或多个类型的产生胶原蛋白的细胞的多个薄片。

47.如权利要求26所述的方法，其中所述产生胶原蛋白的细胞基本上不含未分化的角化细胞、成纤维细胞或者上皮细胞。

48.如权利要求26所述的方法，其中所述产生胶原蛋白的细胞源自于选自羚羊、熊、海狸、北美野牛、公猪、骆驼、驯鹿、猫、牛、鹿、狗、大象、麋鹿、狐狸、长颈鹿、山羊、野兔、马、野生山羊、袋鼠、狮子、美洲驼、山猫、貂、驼鹿、公牛、野猪、家猪、家兔、海豹、绵羊、松鼠、老虎、鲸、狼、牦牛和斑马、和其组合中的哺乳动物。

49.如权利要求26所述的方法，其中所述产生胶原蛋白的细胞源自于选自龟、蛇、鳄鱼和短吻鳄、或其组合的爬行动物。

50.如权利要求26所述的方法，其中所述产生胶原蛋白的细胞源自于选自鸡、鸭、鸸鹋、鹅、松鸡、鸵鸟、野鸡、鸽子、鹌鹑和火鸡、或其组合的鸟类。

51.如权利要求26所述的方法，其中所述产生胶原蛋白的细胞源自于选自凤尾鱼、鲈鱼、鲶鱼、鲤鱼、鳕鱼、鳗鱼、比目鱼、河豚、石斑鱼、黑线鳕、大比目鱼、鲱鱼、鲭鱼、鲯鳅、蝠鲼、枪鱼、新西兰红鱼、河鲈鱼、梭子鱼、绿青鳕、三文鱼、沙丁鱼、鲨鱼、鲷鱼、鳎目鱼、黄貂鱼、剑鱼、罗非鱼、鳟鱼、金枪鱼、和白斑鱼、或其组合的鱼类。

52.如权利要求26所述的方法，还包括将所述产生胶原蛋白的细胞对齐以形成图案。

53.如权利要求26所述的方法，其中形成包括多细胞主体的自动沉积以形成所述薄片。

54.如权利要求26所述的方法，其中所述多个薄片的各个所述层的特征在于，厚度允许扩散以充分地支持所述产生胶原蛋白的细胞的在培养基中的维持和生长。

55.如权利要求26所述的方法，其中各个所述薄片的厚度为约50μm至约200μm。

56.如权利要求26所述的方法，其中各个所述层的厚度为约50μm至约150μm。

57.如权利要求26所述的方法，其中各个所述层的厚度为约50μm至约100μm。

58.如权利要求26所述的方法，其中所述多个层包括约2个至约50个层。

59.如权利要求26所述的方法，其中所述多个层包括约2个至约40个层。

60.如权利要求26所述的方法，其中所述多个层包括约2个至约30个层。

61.如权利要求26所述的方法，还包括利用一种或多种着色剂或者颜料，将所述主体染色。