CN109563555A - 培养的皮革及由其制作的产品 - Google Patents
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Abstract
包含多层的培养的皮革,每层包含细胞和细胞外胶原,其中通过核苷酸粘附分子将所述多层中的每层与相邻层连接,其中所述培养的皮革包含小于40%的水分含量。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年5月6日提交的美国临时申请第62/332,881号的权益,其内容通过引用在此并入本文中。
发明背景
从动物皮制成的皮革已经存在了数千年。最初利用的这些皮来自为生计而被猎杀的动物,并且皮革是一种容易获取的高度耐用的和功能性织物的来源。然而,今天,皮革是主要被用于时尚和奢侈品位的奢侈商品。当前皮革的采购在可持续性和道德方面都是令人反感的。在65-150kg的CO2/m2下,牛皮革的碳足迹比其他织物要显著得多。另外,皮革的生产需要养殖和屠杀动物,许多人在道德上是反感的。本文中公开了培养的皮革的产品和制造培养的皮革的产品的方法,其可以解决皮革的这些当前的缺点。
发明概述
在某些实施方案中,本文中公开了培养的“生物皮革”及由其制作的产品。通常,通过培养来源于合适的动物(诸如奶牛)的皮肤细胞,并对所述细胞进行产生可用的皮革产品的一个或多个处理步骤,而制成本公开的培养的皮革。本公开的方法和产品解决了当前与培养的皮革的生产相关的许多问题,主要产生被保持在一起的足够大的细胞片,其具有足够的强度以允许加工成皮革。这被完成而不存在破坏动物或传统皮革的大的碳足迹。
在某些实施方案中,本文中公开了包含多层的培养的皮革,每层包含细胞和细胞外胶原,其中通过核苷酸粘附分子将所述多层中的每层与相邻层连接,其中所述培养的皮革包含小于40%的水分含量。在某些实施方案中,所述细胞包含成纤维细胞。在某些实施方案中,所述细胞包含角化细胞。在某些实施方案中,所述细胞包含诱导的多能干细胞(iPS细胞或iPSC)。在某些实施方案中,所述细胞中的一些或全部来源于哺乳动物、禽类、鱼类、爬行动物或两栖动物中任意一种或多种。在某些实施方案中,所述细胞外胶原是交联的。在某些实施方案中,所述核苷酸粘附分子包含:膜锚定区,其包含至少12个碳原子的长烷基链;和多核苷酸,其具有膜远端和膜近端,其中将所述多核苷酸在所述膜近端处与所述膜锚定区缀合,其中所述多核苷酸为至少50个核苷酸,并且包含:接头区,其包含至少约20个核苷酸的连续延伸区;和膜远端粘附区,其包含至少10个核苷酸,并且位于接头区的远端,其中所述接头区不能与所述膜远端粘附区杂交。在某些实施方案中,所述核苷酸粘附分子包含DNA标签,其中所述DNA标签能够在鞣制过程后被扩增。在某些实施方案中,所述水分含量为10%至30%。在某些实施方案中,抗拉强度等于或超过25kgf/cm2。在某些实施方案中,所述培养的皮革的厚度小于100毫米。在某些实施方案中,本文中描述了包含所述培养的皮革的消费品。在某些实施方案中,所述消费品为皮夹。在某些实施方案中,所述消费品为手提袋。在某些实施方案中,所述消费品为手表带。在某些实施方案中,所述消费品为夹克。在某些实施方案中,所述消费品为鞋。在某些实施方案中,所述消费品为手机套。在某些实施方案中,所述消费品为公文包。在某些实施方案中,所述消费品为皮箱。在某些实施方案中,所述消费品为手套。在某些实施方案中,所述消费品为腰带。在某些实施方案中,所述消费品为长裤。
在某些实施方案中,本文中描述了制备培养的皮革的方法,其包括:培养多层,每层包含细胞,其中通过核苷酸粘附分子将所述多层中的每层与相邻层连接;以及将所述多层与至少一种鞣剂接触;其中所产生的培养的皮革包含小于40%的水分含量。在某些实施方案中,所述细胞包含成纤维细胞。在某些实施方案中,所述细胞包含角化细胞。在某些实施方案中,所述细胞包含诱导的多能干细胞(iPSC)。在某些实施方案中,所述细胞中的一些或全部来源于哺乳动物、禽类、鱼类、爬行动物或两栖动物中的任意一种或多种。在某些实施方案中,通过鞣剂将所述胶原交联。在某些实施方案中,所述鞣剂包含铬。在某些实施方案中,所述鞣剂包含植物鞣酸。在某些实施方案中,所述核苷酸粘附分子包含:膜锚定区,其包含至少12个碳原子的长烷基链;和多核苷酸,其具有膜远端和膜近端,其中将所述多核苷酸在所述膜近端处与所述膜锚定区缀合,其中所述多核苷酸为至少50个核苷酸,并且包含:接头区,其包含至少约20个核苷酸的连续延伸区;和膜远端粘附区,其包含至少10个核苷酸,并且位于所述接头区的远端,其中所述接头区不能与所述膜远端粘附区杂交。在某些实施方案中,所述核苷酸粘附分子包含DNA标签,其中所述DNA标签能够在鞣制过程后被扩增。在某些实施方案中,所产生的培养的皮革的水分含量为10%至30%。在某些实施方案中,所产生的培养的皮革的抗拉强度等于或超过25kgf/cm2。在某些实施方案中,所述方法还包括在制造消费品中使用所述培养的皮革。在某些实施方案中,所述消费品为皮夹。在某些实施方案中,所述消费品为手提袋。在某些实施方案中,所述消费品为手表带。在某些实施方案中,所述消费品为夹克。在某些实施方案中,所述消费品为鞋。在某些实施方案中,所述消费品为手机套。在某些实施方案中,所述消费品为公文包。在某些实施方案中,所述消费品为皮箱。在某些实施方案中,所述消费品为手套。在某些实施方案中,所述消费品为腰带。在某些实施方案中,所述消费品为长裤。
附图简述
图1显示了培养将被用于制造培养的皮革的细胞的方法的简化方案。在该方案中,两个细胞层通过具有不同粘附序列的两种不同的核苷酸粘附分子(灰色和黑色三角形)被保持在一起,所述不同的粘附序列通过互补碱基配对被保持在一起。通过接头区(黑线)将这些序列与膜锚定区(灰色框)连接。在某些实施方案中,以这种方式制造了多于2层。在某些实施方案中,所述层在细胞或组成上不同。
图2示出了任选地由培养的皮革制造的长裤的设计。
图3示出了任选地由培养的皮革制造的手提包的设计。
图4示出了任选地由培养的皮革制造的公文包的设计。
图5示出了任选地由培养的皮革制造的手提箱的设计。
图6示出了任选地由培养的皮革制造的女士高跟鞋的设计。
图7示出了任选地由培养的皮革制造的男士乐福鞋的设计。
图8示出了任选地由培养的皮革制造的腰带的设计。
图9示出了任选地由培养的皮革制造的皮夹的设计。
图10示出了任选地由培养的皮革制造的手套的设计。
图11示出了任选地由培养的皮革制造的手表带的设计。
图12示出了任选地由培养的皮革制造的太阳镜盒的设计。
图13示出了任选地由培养的皮革制造的方向盘套的设计。
图14示出了任选地由培养的皮革制造的飞机座椅的设计。
图15示出了任选地由培养的皮革制造的橄榄球的设计。
图16示出了任选地由培养的皮革制造的餐椅的设计。
图17示出了任选地由培养的皮革制造的日记簿的设计。
发明详述
某些定义
除非另有定义,本文中使用的所有技术术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。如本说明书和所附权利要求中所用的,单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数参照,除非上下文另有明确的指示。本文中的任何涉及“或者”旨在包括“和/或者”,除非另有陈述。
如本文中所用的“培养的皮革”,在本文中也被称为“生物皮革”,是指从源自动物的个体活的细胞制造的皮革,所述动物不会被杀死以获得细胞。在某些实施方案中,使用标准的组织/细胞培养方法和培养基来使培养的皮革的生长。
如本文中所用的“天然的皮革”是指传统上由动物皮肤或皮制造的皮革。
如本文中所用的“基质”是指用于细胞、细胞层、组织或培养的皮革的支持物,其与细胞层、组织或培养的皮革是非整体的,并且是暂时的,例如在制造期间或之后被去除。在一些实施方案中,基质可透过组织/细胞培养基。基质不同于预制的支架或其他支持材料,其被整合至细胞层、组织或皮革产品中。
培养的皮革
在某些实施方案中,本文中公开了包含多层的培养的皮革,每层包含细胞和细胞外胶原,其中通过核苷酸粘附分子将所述多层中的每层与相邻层连接,其中所述培养的皮革包含小于40%的水分含量。在某些实施方案中,本文中公开了包含多层的培养的皮革每层包含细胞,其中通过核苷酸粘附分子将所述多层中的每层与相邻层连接,其中所述培养的皮革包含小于40%的水分含量。在某些其他的实施方案中,本文中公开了培养的皮革,其包含细胞和细胞外胶原的层,其中所述培养的皮革包含小于40%的水分含量。
在某些实施方案中,培养的皮革是指在实验室或生产设施中由培养的细胞制成并且不是来源于死的动物的任何皮革。在某些实施方案中,细胞来源于动物,然后使用标准的组织培养技术被永生化或扩增。在某些实施方案中,细胞来源于获自未被杀死的动物的皮肤样品。在某些实施方案中,培养的皮革不包括纯的合成的皮革样或人造皮革产品。皮革的合成形式包括从乙烯树脂、聚氯乙烯、聚氨酯等制造的那些合成的形式。
在各种实施方案中,培养的皮革在许多方面不同于天然存在的组织和皮革。在某些实施方案中,培养的皮革缺少毛囊。在某些实施方案中,培养的皮革缺少毛发或毛皮。在某些实施方案中,培养的皮革缺少皮脂腺细胞。在某些实施方案中,培养的皮革缺少脉管系统。在某些实施方案中,培养的皮革还包含非天然存在的可扩增的DNA分子。在某些实施方案中,培养的皮革包含取自至少两个不同的供体的细胞。在某些实施方案中,培养的皮革是嵌合的,并且包含来自两种不同物种的细胞。在某些实施方案中,培养的皮革包含非真皮来源的成纤维细胞。
层和架构
在某些实施方案中,本文中描述了包含多层的培养的皮革。在某些实施方案中,多层包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多层。在某些实施方案中,多层包含至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多层,包括其中的增量。在某些实施方案中,多层中的任一层包含单一细胞类型。在某些实施方案中,多层中的任一层包含两种不同的细胞类型。在某些实施方案中,多层中的任一层包含3种不同的细胞类型。在某些实施方案中,多层中的任一层包含4种或更多种不同的细胞类型。在某些实施方案中,多层中的任一层基本上由单一细胞类型组成。在某些实施方案中,多层中的任一层基本上由两种不同的细胞类型组成。在某些实施方案中,多层中的任一层基本上由3种不同的细胞类型组成。在某些实施方案中,多层中的任一层基本上由4种或更多种不同的细胞类型组成。在某些实施方案中,层的厚度为单细胞。在某些实施方案中,层的厚度大于单细胞。在某些实施方案中,层的厚度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个细胞。在某些实施方案中,层的厚度为至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个细胞,包括其中的增量。
在某些实施方案中,培养的皮革为嵌合的,其包含不同细胞类型、不同物种或相同物种的不同品种的细胞。在某些实施方案中,培养的皮革的多层中的任一层为嵌合的,其包含不同细胞类型、不同物种或相同物种的不同品种的细胞的混合物。在某些实施方案中,至少一层与相邻层不同。在某些实施方案中,培养的皮革缺少被整合至培养的皮革中的预制的支架或其他的支持材料。在某些实施方案中,至少一层包含来自相邻层的不同动物物种的细胞。在某些实施方案中,至少一层包含来自相邻层的相同物种的不同品种的细胞。
在某些实施方案中,培养的皮革的厚度为至少0.1毫米。在某些实施方案中,培养的皮革的厚度为至少0.2毫米。在某些实施方案中,培养的皮革的厚度为至少0.5毫米。在某些实施方案中,培养的皮革的厚度为至少1毫米。在某些实施方案中,培养的皮革的厚度为至少2毫米。在某些实施方案中,培养的皮革的厚度为至少5毫米。在某些实施方案中,培养的皮革的厚度为至少10毫米。在某些实施方案中,培养的皮革的厚度小于100毫米。在某些实施方案中,培养的皮革的厚度小于10毫米。在某些实施方案中,培养的皮革的厚度小于5毫米。在某些实施方案中,培养的皮革的厚度小于2毫米。在某些实施方案中,培养的皮革包含至少1平方厘米的表面面积。在某些实施方案中培养的皮革包含至少10平方厘米的表面面积。在某些实施方案中,培养的皮革包含至少100平方厘米的表面面积。在某些实施方案中,培养的皮革包含至少1000平方厘米的表面面积。
细胞类型
在某些实施方案中,本文中描述的培养的皮革由任何合适的细胞类型制成。在某些实施方案中,皮肤细胞为真皮的细胞。在某些实施方案中,皮肤细胞为表皮的细胞。在一些实施方案中,皮肤细胞为基底膜的细胞。在某些实施方案中,本文中描述的培养的皮革由皮肤细胞制成。在某些实施方案中,皮肤细胞为角化细胞。在某些实施方案中,皮肤细胞为成纤维细胞。在某些实施方案中,皮肤细胞为色素细胞。在某些实施方案中,皮肤细胞为黑素细胞。在某些实施方案中,皮肤细胞为角化细胞。在某些实施方案中,本文中描述的培养的皮革包含多能干细胞。在某些实施方案中,本文中描述的培养的皮革包含已分化为皮肤样细胞的多能干细胞。在某些实施方案中,多能干细胞的分化产生异质细胞群。在某些实施方案中,多能干细胞的分化产生血管细胞。在某些实施方案中,多能干细胞的分化产生皮脂腺的细胞。在某些实施方案中,多能干细胞的分化产生毛囊的细胞。在某些实施方案中,多能干细胞的分化产生神经系统的细胞。在某些实施方案中,多能干细胞的分化产生脂肪细胞。在某些实施方案中,多能干细胞的分化产生成纤维细胞。在某些实施方案中,多能干细胞的分化产生本文中描述的一种或多种细胞类型的组合。
在某些实施方案中,培养的皮革包含来源于至少两个不同的供体动物的细胞。在某些实施方案中,培养的皮革不包含脂肪细胞或脂肪组织。在某些实施方案中,培养的皮革不包含肌肉细胞或组织。在某些实施方案中,培养的皮革不包含皮脂腺细胞。
在某些实施方案中,多层包含一层或多层的角化细胞,其与一层或多层的成纤维细胞相邻。在某些实施方案中,多层种的任一层包含成纤维细胞和角化细胞的混合物。在某些实施方案中,所述混合物包含至少约95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%的角化细胞,包括其中的增量。在某些实施方案中,所述混合物包含至少约95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%的成纤维细胞,包括其中的增量。
在具体的实施方案中,多层包含一层或多层表皮样层。在其他实施方案中,表皮样层包含约80%、约85%、约90%、约95%或约98%的角化细胞和鳞状上皮细胞,包括其中的增量。在具体的实施方案中,多层包含一层或多层真皮样层。在其他实施方案中,真皮样层包含成纤维细胞、巨噬细胞和脂肪细胞的混合物。在具体的实施方案中,一层或多层包含由细胞分泌或在制造过程中引入的细胞外基质成分(诸如胶原、弹性蛋白、纤连蛋白和/或层粘连蛋白)。
在本文中描述的培养的皮革中使用的细胞来源于动物组织的活组织检查切片,而不伤害或杀死动物。在某些实施方案中,培养的皮革包含来源于哺乳动物(例如,奶牛)、禽类(例如,鸵鸟)、鱼类(例如,鲨鱼)、爬行动物(例如,蛇)、两栖动物或它们的组合的细胞。
胶原
在某些实施方案中,培养的皮革包含胶原。在某些实施方案中,培养的皮革包含由保持在培养物中的细胞分泌的胶原。在某些实施方案中,培养的皮革包含交联的胶原。在某些实施方案中,培养的皮革包含细胞外胶原。在某些实施方案中,培养的皮革包含交联的细胞外胶原。在某些实施方案中,培养的皮革包含约25重量%至约75重量%的胶原。在某些实施方案中,培养的皮革包含至少约25重量%的胶原。在某些实施方案中,培养的皮革包含至少约30重量%的胶原。在某些实施方案中,培养的皮革包含至少约35重量%的胶原。在某些实施方案中,培养的皮革包含至少约40重量%的胶原。在某些实施方案中,培养的皮革包含至少约45重量%的胶原。在某些实施方案中,培养的皮革包含至少约50重量%的胶原。在某些实施方案中,培养的皮革包含至少约55重量%的胶原。在某些实施方案中,培养的皮革包含至少约60重量%的胶原。在某些实施方案中,培养的皮革包含至少约65重量%的胶原。在某些实施方案中,培养的皮革包含至少约70重量%的胶原。在某些实施方案中,培养的皮革包含不多于约65重量%的胶原。在某些实施方案中,培养的皮革包含不多于约60重量%的胶原。在某些实施方案中,培养的皮革包含不多于约50重量%的胶原。在某些实施方案中,培养的皮革包含不多于约45重量%的胶原。在某些实施方案中,培养的皮革包含不多于约40重量%的胶原。在某些实施方案中,培养的皮革包含不多于约35重量%的胶原。在某些实施方案中,培养的皮革包含不多于约30重量%的胶原。在某些实施方案中,已经通过鞣剂将胶原交联。在某些实施方案中,所述鞣剂为植物鞣酸。在某些实施方案中,所述植物鞣酸来自栗树、橡树、欧马桑(redoul)、柯树(tanoak)、铁杉、白坚木、红树(mangrove)、金合欢树(金合欢属植物;参见邻苯二酚),和来自榄仁树属(Terminalia spp.)如诃子(Terminaliachebula)的诃子(myrobalans)。在某些实施方案中,鞣酸为化学鞣酸。在某些实施方案中,所述化学鞣酸为铬化合物。在某些实施方案中,鞣剂为铝化合物、矾、锆、钛、铁盐,或它们的组合。在具体的实施方案中,鞣剂为环境友好型的。通过实例,在一些实施方案中,鞣剂不包括对人类健康和环境有害的金属(诸如铬、铅或砷)。通过其他实例,在一些实施方案中,鞣剂不包括对人类健康和环境有害的有机化合物(诸如蒽或甲醛)。
在某些实施方案中,培养的皮革包含外源性胶原。在某些实施方案中,以1μg/ml的终浓度添加外源性胶原。在某些实施方案中,以5μg/ml的终浓度添加外源性胶原。在某些实施方案中,以10μg/ml的终浓度添加外源性胶原。在某些实施方案中,以20μg/ml的终浓度添加外源性胶原。在某些实施方案中,以30μg/ml的终浓度添加外源性胶原。在某些实施方案中,以40μg/ml的终浓度添加外源性胶原。在某些实施方案中,以50μg/ml的终浓度添加外源性胶原。在某些实施方案中,外源性胶原为牛的。在某些实施方案中,外源性胶原为猪的。在某些实施方案中,外源性胶原为禽类的。在某些实施方案中,外源性胶原为I型。在某些实施方案中,外源性胶原为I型。在某些实施方案中,外源性胶原为III型。在某些实施方案中,外源性胶原为IV型。在某些实施方案中,外源性胶原为V型。在某些实施方案中,外源性胶原为VI型。在某些实施方案中,外源性胶原为VII型。在某些实施方案中,外源性胶原为VIII型。在某些实施方案中,外源性胶原为IX型。在某些实施方案中,外源性胶原为X型。在某些实施方案中,外源性胶原为XI型。在某些实施方案中,外源性胶原为XII型。在某些实施方案中,外源性胶原为XIII型。在某些实施方案中,外源性胶原为XIV型。在某些实施方案中,外源性胶原为XV型。在某些实施方案中,外源性胶原为XVI型。在某些实施方案中,外源性胶原为XVII型。在某些实施方案中,外源性胶原为XVIII型。在某些实施方案中,外源性胶原为一种或多种类型的胶原的组合。
在某些实施方案中,培养的皮革包含外源性细胞外基质(ECM)蛋白,而非胶原。在某些实施方案中,外源性ECM蛋白为纤连蛋白。在某些实施方案中,外源性ECM蛋白为层粘连蛋白。在某些实施方案中,外源性ECM蛋白为弹性蛋白。在某些实施方案中,外源性ECM蛋白为一种或多种细胞外基质蛋白的组合。
胶原的内源性来源
在某些实施方案中,由培养的皮革的细胞内源性地产生胶原。在某些实施方案中,经由机械调节刺激内源性胶原的合成。在某些实施方案中,经由信号传导通路的激活刺激内源性胶原的合成。在某些实施方案中,使用重组DNA技术,经由增加的基因表达来增加内源性胶原的合成。
细胞的机械调节增加细胞中胶原的表达以及胶原的重构和成熟。在一些实施方案中,机械拉伸促进胶原的合成。在某些实施方案中,循环应变促进胶原的合成。在某些实施方案中,压缩促进胶原的合成。在某些实施方案中,机械力是外部的,并且产生自非细胞来源。在其他实施方案中,机械力是内部的,并且产生自细胞-细胞相互作用或细胞-环境相互作用。另外,细胞的电子刺激增加胶原的表达。在某些实施方案中,电子刺激是脉冲式的。在某些实施方案中,电子刺激仅针对细胞,而不针对细胞外基质。
将重组DNA技术用于增加胶原或胶原变体的细胞基因表达。在某些实施方案中,通过递送编码胶原的遗传物质来诱导培养的皮革的细胞表达胶原或胶原变体。在某些实施方案中,经由电穿孔或化学转染将遗传物质转染进入细胞中。在某些实施方案中,遗传物质为DNA。在某些实施方案中,遗传物质为RNA。在某些实施方案中,经由添加针对一种或多种细胞外基质蛋白的产生的信号传导通路的激活剂,来诱导细胞产生胶原。
胶原的外源性来源
虽然可以增加内源性胶原的表达,在其他实施方案中,将外源性胶原添加至培养的皮革的细胞。在某些实施方案中,商购获得胶原或胶原变体。在某些实施方案中,通过经典的蛋白合成方法(包括重组DNA技术或化学合成),来获得胶原或胶原变体。利用重组DNA技术,使用基于细胞的系统或无细胞的系统产生胶原或胶原变体。
在用于蛋白合成的基于细胞的系统的某些实施方案中,根据不同的因素(例如翻译后修饰、分子折叠和多结构域真核蛋白合成),来选择产生蛋白的细胞。在某些实施方案中,编码胶原或胶原变体的DNA是用于蛋白产生的模板,并且使用不同的方法(诸如电穿孔和病毒递送)被引入至宿主细胞。DNA稳定地整合至宿主细胞基因组。在一些情况下,不需要稳定整合。可以获得许多不同的宿主细胞,包括来源于细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞的那些宿主细胞。基于细胞的系统利用细菌宿主、真核宿主(诸如酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞)。
在用于蛋白质合成的无细胞系统的某些实施方案中,使用生物学机器(例如核糖体、氨酰-tRNA合成酶、翻译起始和延长因子、核酸酶等)产生多肽和蛋白质,而无需使用活细胞。在一些实施方案中,用于无细胞蛋白表达的生物学机器收获自细菌、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞。将包含生物学机器(例如,核糖体、氨酰-tRNA合成酶、翻译起始和延长因子、核酸酶等)、DNA模板、氨基酸和其他必须的补充剂的反应溶液一起孵育,以促进蛋白质的体外翻译。无细胞蛋白质合成使得能够直接获取和控制翻译环境,其在某些情况下,有利于优化蛋白质产生和掺入非天然氨基酸、氨基酸类似物、修饰的氨基酸等。
核苷酸粘附分子
在某些实施方案中,培养的皮革还包含核苷酸粘附分子。如图1中所示,在培养物中,使用锚定至每个连续层的细胞膜的核苷酸将预期的培养的皮革的相邻层保持在一起,。不同的相邻层具有不同的互补核苷酸粘附分子,以提供培养物中细胞层的快速和稳固组装。细胞组装依赖于通过连接(诸如间隙连接、紧密连接和细胞桥粒)的细胞至细胞的接触。在某些实施方案中,增加的细胞的接近通过增加细胞至细胞的连接的普遍性,而改善细胞至细胞的接触。
在某些实施方案中,每个相邻层包含核苷酸粘附分子。在某些实施方案中,所述核苷酸粘附分子包含膜锚定区和细胞外区。在某些实施方案中,细胞外区包含接头区和膜远端粘附区。核苷酸粘附分子在美国专利公开2014/0294782Al中有描述和例证,其通过引用整体并入。
在某些实施方案中,膜锚定区包含能够嵌入细胞膜中的一个或多个疏水性分子。在一些实施方案中,膜锚定区是疏水性的。在一些实施方案中,膜锚定区是亲脂性的。在一些实施方案中,整个膜锚定区是疏水性的。在一些实施方案中,整个膜锚定区是亲脂性的。在一些实施方案中,仅一部分是亲脂性的或疏水性的。在一些实施方案中,膜锚定区是两亲性的。在许多实施方案中,膜锚定区使得在能量上比被包含在溶液中,更利于将链插入膜中。在某些实施方案中,膜锚定区包含烷基链。在一些实施方案中,膜锚定区包含烷基链和烯基、烷基、芳基或芳烷基链。在某些实施方案中,烯基、烷基、芳基或芳烷基链包含12-22个碳原子。在一些实施方案中,烷基链包含约12-22个碳原子,并且烯基、烷基、芳基或芳烷基链包含约12-22个碳原子。在一些实施方案中,链具有相同数目的碳原子。在其他实施方案中,一条链比其他链少约1至约10个碳原子。在一些实施方案中,一条链比其他链少约1个碳原子、少约2个碳原子、少约3个碳原子、少约4个碳原子、少约5个碳原子、少约6个碳原子、少约7个碳原子、少约8个碳原子、少约9个碳原子,或少约10个碳原子。在各种实施方案中,膜锚定区包含多于1条烯基、芳基或芳烷基链,其中每条链包含12-22个碳原子。在某些实施方案中,膜锚定区包含至少12个碳的烷基链。在某些实施方案中,膜锚定区包含至少14个碳的烷基链。在某些实施方案中,膜锚定区包含至少16个碳的烷基链。在某些实施方案中,膜锚定区包含至少18个碳的烷基链。在某些实施方案中,烷基链是饱和的。在某些实施方案中,所述烷基链是不饱和的。
在某些实施方案中,细胞外区域包含多核苷酸。在某些实施方案中,细胞外区域包含单链DNA多核苷酸。在某些实施方案中,DNA多核苷酸包含接头区和膜远端粘附区。
在某些实施方案中,细胞外区域包含接头区。在某些实施方案中,接头区包含约20至约3000个核苷酸的连续延伸区。在许多实施方案中,接头区与多核苷酸的膜远端隔开约10个核苷酸或更多个核苷酸。在许多实施方案中,接头区与多核苷酸的膜远端隔开约10至约2000个核苷酸或更多个核苷酸。在一些实施方案中,接头区与膜远端隔开约5至约10个核苷酸、约10至约20个核苷酸、约20至约40个核苷酸、约40至约60个核苷酸、约60至约80个核苷酸、约80至约100个核苷酸、约100至约120个核苷酸、约120至约140个核苷酸、约140至约160个核苷酸、约160至约180个核苷酸、约180至约200个核苷酸、约200至约225个核苷酸、约225至约250个核苷酸、约250至约275个核苷酸、约275至约300个核苷酸、约300至约350个核苷酸、约350至约400个核苷酸、约450至约500个核苷酸、约500至约600个核苷酸、约600至约700个核苷酸、约700至约800个核苷酸、约800至约900个核苷酸、约1000至约1200个核苷酸、约1200至约1400个核苷酸、约1400至约1600个核苷酸、约1600至约1800个核苷酸、约1800至约2000个核苷酸。在许多实施方案中,接头区包含约5至约3000个相同的核苷酸的连续延伸区。在一些实施方案中,接头区包含约10至约2000个核苷酸的连续延伸区,其仅包含两种类型的碱基。在一些实施方案中,接头区不与位于多核苷酸中的接头区的远端的至少约10个核苷酸的任何连续延伸区杂交。在一些实施方案中,接头区不与位于多核苷酸中的接头区的远端的约10至约500个核苷酸的任何连续延伸区杂交。
在某些实施方案中,接头区包含约5至约3000个相同的核苷酸的连续延伸区。在一些实施方案中,连续延伸区包含约5至约10个核苷酸、约10至约20个核苷酸、约20至约40个核苷酸、约40至约60个核苷酸、约60至约80个核苷酸、约80至约100个核苷酸、约100至约120个核苷酸、约120至约140个核苷酸、约140至约160个核苷酸、约160至约180个核苷酸、约180至约200个核苷酸、约200至约225个核苷酸、约225至约250个核苷酸、约250至约275个核苷酸、约275至约300个核苷酸、约300至约350个核苷酸、约350至约400个核苷酸、约450至约500个核苷酸、约500至约600个核苷酸、约600至约700个核苷酸、约700至约800个核苷酸、约800至约900个核苷酸、约1000至约1200个核苷酸、约1200至约1400个核苷酸、约1400至约1600个核苷酸、约1600至约1800个核苷酸、约1800至约2000个核苷酸、约2000至约2250个核苷酸、约2250至约2500个核苷酸、约2500至约2750个核苷酸、约2750至约3000个核苷酸,或更多个核苷酸。在具体的实施方案中,连续延伸区包含胸腺嘧啶核苷酸。在其他的实施方案中,连续延伸区包含腺嘌呤核苷酸。在其他的实施方案中,连续延伸区包含胞嘧啶核苷酸。在其他的实施方案中,连续延伸区包含鸟嘌呤核苷酸。在其他的实施方案中,连续延伸区包含尿嘧啶核苷酸。
在某些实施方案中,细胞外区域包含膜远端粘附区。在某些实施方案中,细胞外区域包含位于接头区远端的多核苷酸区,并且在膜远端之前包含膜远端粘附区。在某些实施方案中,膜远端粘附区与多核苷酸、荧光团或药物组分杂交。在某些实施方案中,膜远端粘附区与另外的膜锚定的多核苷酸中存在的多核苷酸杂交。在某些实施方案中,杂交位于两条膜锚定的多核苷酸的膜远端粘附区之间。在某些实施方案中,杂交为严格杂交。在某些实施方案中,膜远端粘附区的序列不与多核苷酸的任何其他区杂交。在某些实施方案中,膜远端粘附区包含约5至约3000个核苷酸。在具体的实施方案中,它包含约5至约10个核苷酸、约10至约20个核苷酸、约20至约40个核苷酸、约40至约60个核苷酸、约60至约80个核苷酸、约80至约100个核苷酸、约100至约120个核苷酸、约120至约140个核苷酸、约140至约160个核苷酸、约160至约180个核苷酸、约180至约200个核苷酸、约200至约225个核苷酸、约225至约250个核苷酸、约250至约275个核苷酸、约275至约300个核苷酸、约300至约350个核苷酸、约350至约400个核苷酸、约450至约500个核苷酸、约500至约600个核苷酸、约600至约700个核苷酸、约700至约800个核苷酸、约800至约900个核苷酸、约1000至约1200个核苷酸、约1200至约1400个核苷酸、约1400至约1600个核苷酸、约1600至约1800个核苷酸、约1800至约2000个核苷酸、约2000至约2250个核苷酸、约2250至约2500个核苷酸、约2500至约2750个核苷酸、约2750至约3000个核苷酸,或更多个核苷酸。在某些实施方案中,膜远端粘附区包含(CAGT)和/或(ACTG)n,其中n为等于或大于1的整数。在一些实施方案中,n为1。在其他的实施方案中,n为1至20。在某些实施方案中,n为1至10,或者更优选地为1至5。
在某些实施方案中,培养的皮革还包含第一和第二核苷酸粘附分子。在某些实施方案中,除了膜远端粘附区不同之外,第二核苷酸粘附分子与第一核苷酸粘附分子相同,并且包含与第一核苷酸粘附分子的膜远端粘附区互补的多核苷酸序列。
在某些实施方案中,述核苷酸粘附分子包含可通过聚合酶链式反应扩增的DNA标签。在某些实施方案中,DNA标签含有10个或更多个核苷酸的非天然存在的连续序列。在某些实施方案中,DNA标签含有20个或更多个核苷酸的非天然存在的连续序列。在某些实施方案中,DNA标签含有30个或更多个核苷酸的非天然存在的连续序列。在某些实施方案中,包含DNA标签的多核苷酸含有引物结合位点。在具体的实施方案中,将DNA标签用于验证消费品是由通过本文中描述的方法学制造的培养的皮革制作的。
通过实例,本文中描述了鉴定被用于制造培养的皮革产品的方法学的方法,所述方法包括:从产品的培养的皮革的样品提取核酸;使用特异性针对已知DNA标签的引物对核酸进行扩增程序,所述DNA标签包含特定的非天然存在的核酸序列,所述特定的非天然存在的核酸序列在制造过程中被引入至所述培养的皮革;检测所述DNA标签的扩增的存在;以及基于所述扩增的DNA标签的存在或不存在,鉴定所述被用于制造所述培养的皮革产品的方法学。在一些实施方案中,样品获自特别提供以允许验证制造的方法学的产品的一部分。在一些实施方案中,其中扩增程序为聚合酶链式反应(PCR)。在一些实施方案中,特定的非天然存在的核酸序列的长度为至少10、20或30个核酸。在其他的实施方案中,特定的非天然存在的核酸序列含有引物结合位点。
通过其他实例,本文中描述了鉴定皮革产品为培养的皮革产品的方法,所述方法包括:从所述产品的皮革的样品提取核酸;使用特异性针对已知DNA标签的引物对所述核酸进行扩增程序,所述DNA标签包含特定的非天然存在的核酸序列,所述特定的非天然存在的核酸序列在制造过程中被引入至培养的皮革;检测所述DNA标签的扩增的存在;以及基于扩增的DNA标签的存在或不存在,鉴定皮革产品为培养的皮革产品。在一些实施方案中,样品获自特别提供以允许验证皮革产品为培养的皮革产品的产品的一部分。在一些实施方案中,扩增程序为聚合酶链式反应(PCR)。在一些实施方案中,特定的非天然存在的核酸序列的长度为至少10、20或30个核酸。在其他的实施方案中,特定的非天然存在的核酸序列含有引物结合位点。
结构支持
细胞外基质蛋白用于提供组织中的结构完整性。将包含细胞和任何另外的蛋白质的细胞溶液接种至支架中。在一些实施方案中,当工程化组织时,将支架用于提供结构支持或帮助细胞对齐。
在一些实施方案中,由生物可降解的聚合物(例如,聚乳酸、聚乙醇酸、聚二乳酸共乙醇酸等)制造支架。在一些实施方案中,用另外的部分将支架功能化,以使得其具有生物活性(例如、肽类、脂类、核酸或药物化合物)。在一些实施方案中,支架来源于脱细胞组织。在一些实施方案中,脱细胞组织为哺乳动物的。在一些实施方案中,脱细胞组织来自植物。材料的选择影响支架和工程化组织的刚度。另外,支架的结构有助于支架的刚度。例如,支架中孔的大小的变化会改变支架的刚度。
培养的皮革的物理特性
本公开的培养的皮革旨在模拟天然皮革的外观和感觉。在某些实施方案中,培养的皮革具有与天然皮革类似的水分含量。在某些实施方案中,培养的皮革的水分含量的小于40%。在某些实施方案中,培养的皮革的水分含量小于30%。在某些实施方案中,培养的皮革的水分含量小于20%。在某些实施方案中,培养的皮革的水分含量大于5%。在某些实施方案中,培养的皮革的水分含量大于10%。在某些实施方案中,培养的皮革的水分含量大于15%。在某些实施方案中,培养的皮革的水分含量大于20%。在某些实施方案中,培养的皮革的水分含量为5%至40%。在某些实施方案中,培养的皮革的水分含量为10%至35%。在某些实施方案中,培养的皮革的水分含量为10%至30%。
本公开的培养的皮革旨在模拟来源于死的动物皮肤的皮革的外观和感觉。在某些实施方案中,培养的皮革具有从死的动物皮肤制备的皮革的抗拉强度。在某些实施方案中,培养的皮革具有至少50kgf/cm2的抗拉强度。在某些实施方案中,培养的皮革具有至少75kgf/cm2的抗拉强度。在某些实施方案中,培养的皮革具有至少100kgf/cm2的抗拉强度。在某些实施方案中,培养的皮革具有至少125kgf/cm2的抗拉强度。在某些实施方案中,培养的皮革具有至少150kgf/cm2的抗拉强度。在某些实施方案中,培养的皮革具有至少175kgf/cm2的抗拉强度。在某些实施方案中,培养的皮革具有至少200kgf/cm2的抗拉强度。在某些实施方案中,根据美国测试与材料协会(American Society for Testing and Materials,ASTM))标准进行抗拉强度测试。
合成的皮革相比天然皮革
合成的皮革在一些方面不同于天然皮革。首先,天然皮革的细胞组成不同于天然皮革的细胞组成。来源于多能干细胞的细胞的遗传谱不同于它们的类似的成体细胞的遗传谱征。遗传谱的差异产生了基因表达谱的差异,其最终导致蛋白合成、蛋白结构和蛋白功能的差异。
另外,天然皮肤中的细胞类型的比例不同于工程化的皮肤组织中的细胞类型的比例。结果,分化的细胞不自发形成天然皮肤中发现的亚结构(诸如皮脂腺、脉管系统或毛囊)。工程化组织的形成依赖于许多因素,包括细胞的对齐、细胞的相互作用、细胞表达和分泌的细胞外基质,以及细胞外基质蛋白的成熟。这些因素影响了工程化的组织以及培养的皮革的性能。
制作培养的皮革的方法
本文中公开了制作培养的皮革的方法。将已从供体动物采集的皮肤细胞(诸如成纤维细胞、角化细胞、黑色素细胞或它们的组合)用于产生培养的皮革。在某些实施方案中,采样不杀死动物。在某些实施方案中,采样不引起动物疼痛。在某些实施方案中,细胞为分化成成纤维细胞、角化细胞和/或黑色素细胞的多能干细胞。在某些实施方案中,细胞为分化成成纤维细胞、角化细胞或黑色素细胞的诱导的多能干细胞。在某些实施方案中,通过化学、基因或病毒处理产生诱导的多能干细胞。
通过递增法制造过程制造培养的皮革。一片完成的培养的皮革将包含由几层细胞释放的胶原。层被连续放下。第一层被放在包含组织培养兼容的玻璃、塑料或网的基质上。在某些实施方案中,用诸如胶原或赖氨酸的物质包被基质,从而促进第一层的粘附。在某些实施方案中,基质为在加入第一层后可生物降解的,和/或可溶解的。在加入至基质之前或之后,用核苷酸粘附分子将第一层功能化。连续层被放下,先将层放下,再用促进粘附的核苷酸粘附分子将每层功能化。在某些实施方案中,通过核苷酸粘附分子的互补碱基配对促进粘附。在某些实施方案中,在添加连续层之前,允许细胞完全贴附。在某些实施方案中,在添加连续层之前,允许细胞贴附至少10、20、30、40、50、60、90、120、180或240分钟,包括其中的增量。
许多涂覆每层的细胞的方法都是合适的。在某些实施方案中,通过施加液体、含细胞的悬浮液来涂覆每层的细胞。在某些实施方案中,通过生物打印来涂覆每层的细胞。在其他的实施方案中,生物打印技术包括喷墨打印或喷涂液态或半液态的含细胞的溶液。在其他实施方案中,生物打印技术包括施加或挤出半固态或固态的含细胞的组分。在某些实施方案中,通过将细胞在基质的表面上图案化,而涂覆每层的细胞。在其他实施方案中,图案化包括在基质的表面上排列核酸的图案,并在杂交条件下将图案化的核酸与细胞的第一悬浮液接触,其中第一悬浮液的细胞包括细胞表面连接的与图案化的核酸互补的核酸,并且其中细胞表面连接的核酸与图案化的核酸杂交,从而在基质的表面上将细胞图案化。在基质的表面上将细胞图案化的方法在美国专利公开2016/0010054A1中有描述和例证,其通过引用整体并入。
在将细胞层与基质连接后,使用标准组织培养技术和培养基培养它们。在约5%和24至40摄氏度的温度下培养细胞。优选为30至38摄氏度。在富液体培养基(诸如RPMI、DMEM或专门的细胞培养基)中培养细胞。在某些实施方案中,在能够支持细胞生长和附着的无血清培养基中培养细胞。在某些实施方案中,在去除细胞以进行处理之前将细胞培养至少24、48、72、96或120小时,包括其中的增量。在某些实施方案中,在从基质去除细胞以进行进一步的处理之前,将细胞培养至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天。
以允许维持层的完整性的任一方式从基质去除细胞。在某些实施方案中,通过酶消化去除细胞。在某些实施方案中,通过物理手段(诸如刮或振动)去除细胞。在去除细胞层后,通过另外的处理步骤处理细胞,以产生皮革样织物。通常,皮革处理步骤是本领域熟知的。在某些实施方案中另外的处理步骤包括干燥、保存、浸湿、浸灰、削肉、片皮、复灰、脱石灰、软化、脱脂、去粒面、漂白、酸洗、脱酸、鞣制、染色,或它们的任意组合。在某些实施方案中,对皮革进行一个或多个结壳步骤,诸如挤水、片皮、削匀、再次铬鞣(rechroming)、中和、复鞣、染色、乳化加脂(fatliquoring)、填充、剥制(stuffing)、剥离、增白、固定(fixating)、定型(setting)、干燥、整修、干滚(milling)、拉软、磨皮,或它们的任意组合。在某些实施方案中,对培养的皮革进行一个或多个完成步骤,包括加油、刷净、补白(padding)、浸渍、磨皮、喷涂、辊涂、淋涂、抛光、镀层、压花、熨烫、上釉、翻滚(tumbling),或它们的任意组合。
由培养的皮革制造的物品
本公开的培养的皮革预期的目的是制造消费品。在某些实施方案中,消费品为使用天然皮革制作的任何产品。
在一些实施方案中,消费品包括时尚物品和/或服装物品。在各种其他的实施方案中,消费品包括,通过非限制性实例的方式,长裤(参见,例如图2)、短裤、手提包(参见,例如图3)、书包、公文包(参见,例如图4)、背包、膝上型电脑包、皮箱(参见,例如图5)、皮箱标签、手提袋(totes)、手机套、膝上型电脑箱、膝上型电脑遮盖物、平板电脑箱、鞋(例如,高跟鞋(参见,例如图6)、凉鞋、拖鞋、乐福鞋(参见,例如图7)、系带鞋、靴子、婴儿袜、鞋带等)、夹克(例如,雨衣、摩托车夹克等)、裙子、衬衫(例如,T恤、背心、运动衫等)、内衣、汗衫、皮套裤(chaps)、腰带(参见,例如图8)、皮夹(参见,例如图9)、包括摩托车手套的手套(参见,例如图10)、帽子、珠宝(例如,手链、手镯、耳饰、项链、手表带(参见,例如图11)等)、防弹衣、头盔、装饰品(例如流苏等)、太阳镜和太阳镜盒(参见,例如图12)。
在一些实施方案中,消费品包括宠物饰品。在各种其他的实施方案中,消费品包括,通过非限制性实例的方式,动物(狗)颈圈、动物(狗)绳套、动物(狗)衣服等。
在一些实施方案中,消费品包括汽车零部件和设备。在各种其他的实施方案中,消费品包括,通过非限制性实例的方式,方向盘套(参见,例如图13)、汽车仪表、汽车扶手、汽车船长椅、汽车座椅和长椅、汽车内饰件、飞机座椅(参见,例如图14)、飞机内饰件、船的座椅、摩托车座椅等。
在一些实施方案中,消费品包括运动和体育器材。在各种其他的实施方案中,消费品包括,通过非限制性实例的方式,橄榄球(footballs)(参见,例如图15)、棒球、垒球、英式足球、排球、板球、橄榄球(rugby balls)、手球、防滑钉(cleats)、攀岩鞋、骑行鞋、自行车座椅、棒球手套、高尔夫球手套、拳击手套、滑雪/滑雪板手套、瑜伽垫、普拉提器材、拳击用吊袋、健身长椅、马用运动装备、马具和装备、鞍马、平衡木、帐篷、圆锥形帐篷、棚屋(wigwams)、圆顶帐篷(房屋)、橡皮船、训鹰脚带(falconry jesses)、弓箭手护腕、牛鞭(bullwhips)、马蹄靴(horse hoof boots)、拳击速度袋、剑柄、刀柄、剑鞘、箭袋、刀鞘、枪套、枪套筒(gun sleeves)等。
在一些实施方案中,消费品包括,通过非限制性实例的方式,皮革重音工具(leather-accented tools)、木工工具带(carpentry tool belts)、木工钉袋(carpentrynail bags)等。
在一些实施方案中,消费品包括家具(例如,装软垫的床、床头板、椅子(参见,例如图16)、靠垫、枕头、帷幔(draperies)等)。在一些实施方案中,消费品包括地板。在一些实施方案中,消费品包括家用器皿(例如,饮料杯垫(drink coasters)、服务员托盘(valettrays)、相框、长颈瓶(flasks)、葫芦、装软垫的填充玩具动物、地毯等)。在一些实施方案中,消费品包括,通过非限制性实例的方式,书、书封面、书籍装帧(book bindings)、日记簿(参见,例如图17)、期刊封面和皮革绘图板。
在一些实施方案中,消费品包括乐器(例如,鼓、班卓琴、吉他背带等)。
在一些实施方案中,消费品包括羊皮纸和/或牛皮纸。
实施例
以下说明性实施例是本文中描述的主题的代表性实施方案,并且非意指以任何方式进行限制。
实施例1-由牛源性的多能干细胞制作合成的皮革的方法
本文中描述的实施例为示例性的,且不旨在以任何方式限制权利要求。本实施例描述了制作培养的皮革的方法。由分化的牛的诱导的多能干(iPS)细胞、核苷酸粘附分子和外源胶原工程化组织。工程化的组织经进一步加工以开发成培养的皮革。
开发牛的诱导的多能干细胞
为了开发牛的iPS细胞,首先从牛科动物获取血液样品。经由聚蔗糖密度离心从血浆分离细胞。为了诱导血液细胞去分化为iPS细胞,使用本领域技术人员通常使用的方法诱导血液细胞表达Oct4、Sox2、cMyc和Klf4。被成功诱导的细胞分裂并形成集落;这些细胞为iPS细胞。在用基底膜蛋白包被的组织培养板上,通过挑选和扩增集落将iPS细胞进一步制备为贴附培养物。测试iPS细胞以确认它们增殖和分化成全部3种胚层的能力。表征了牛的iPS细胞的iPS细胞生物标志物(诸如SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60、Oct4和Nanog)的基因表达和蛋白表达。
将iPS细胞分化为角化细胞样细胞
随后,将iPS细胞分化为角化细胞样细胞。用3mg/mL的I型胶原和基底膜混合物(诸如Matrigel或Geltrex hESC合格的还原型生长因子基底膜基质),或类似等同的基底膜混合物,包被组织培养板。通过在DMEM/F12中首先制备1:100稀释的Geltrex,然后添加I型胶原以达到3mg/mL的最终胶原浓度,在达尔伯克改良的伊戈尔培养基/营养混合物F-12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12,DMEM/F12)中制备用于包被的混合物。将包被的板在37℃下孵育1h。
为了制备细胞的第一层,使用一种或多种分离剂(包括乙二胺四乙酸(EDTA)、分散酶或Accutase)分离iPS细胞的汇合板。首先,从iPS细胞的平皿吸出培养基,并用1mL的100nM EDTA替代。用EDTA将细胞在37℃下孵育3-7mn,或者直至细胞为圆形但仍未分离。吸出EDTA并将细胞重悬于iPS细胞培养基中,并以1:5的比例在用基底膜混合物预包被的组织培养皿上重新铺板。在N2B27培养基中培养iPS细胞,所述N2B27培养基由以下组成:DMEM/F12、Neurobasal培养基、0.1mM的非必需氨基酸、1mM的谷氨酰胺、55μΜ的2-巯基乙醇、N2补充物、B27补充物、50μg/mL的抗坏血酸、0.05%的牛血清白蛋白、50U/mL青霉素-链霉素、100ng/mL的基础FGF和10μΜ的Y27632。将细胞在37℃组织培养箱中孵育过夜。
第二天,如果iPS细胞形成集落,则可以开始分化方案。通过培养基组分控制iPS细胞分化为角化细胞样细胞的过程。通过角化细胞无血清培养基(DKSFM)限定用于分化的基础培养基,所述角化细胞无血清培养基(DKSFM)由Gibco出售,且被补充有50U/mL青霉素-链霉素。在分化的第1天,用含有1μΜ视黄酸和25ng/mL的BMP4的DKSFM更换培养基。将细胞孵育48小时。在第3天,用含有1μΜ视黄酸和25ng/mL的BMP4的新鲜DKSFM更换培养基。在第5天,用无视黄酸或BMP4的新鲜DKSFM更换培养基。将细胞在DKSFM中孵育10天,每隔一天更换培养基。在第14天,用含有50U/mL青霉素-链霉素的表皮角化细胞培养基更换培养基。在第24天,从长出的iPS细胞集落迁移开的细胞展现出角化细胞样表型,且开始表达p63(将外胚层定型为为角化细胞命运所需的主调节因子)和Krt14。
通过快速贴附在包被胶原的板上获得富集的角化细胞样细胞。利用于0.25%乙酸中的7μg/ml的IV型胶原和30μg/ml的I型胶原包被组织培养板。将板在室温下孵育1小时。然后吸出胶原,并将板用无菌的PBS冲洗1x,并用蒸馏的H2O冲洗1x。通过将细胞用Accutase孵育5mn,用另外的角化细胞培养基移出细胞,并将细胞重悬于角化细胞培养基中,来对分化的细胞传代。将细胞在包被胶原的板上铺板15-30分钟。吸出任何漂浮的细胞,并在37℃下扩增剩下的细胞,每隔一天更换培养基。当板达到汇合时,将细胞以1:4的比例传代至新的包被胶原的板上。在2或3代后,培养物由90%的展现出角化细胞样表型的Krt14阳性细胞组成。
工程化的皮肤样组织
用包含分化的角化细胞样细胞、胶原混合物和核苷酸粘附分子的混合物制备工程化的皮肤组织。用Accutase从板分离角化细胞样细胞(通过用Accutase孵育5mn,用另外的角化细胞培养基移出细胞,并将细胞重悬于角化细胞培养基中)。然后对细胞总数计数。用细胞(每毫升角化细胞培养基1千万个细胞)、I型胶原(10μg/ml),和第一核苷酸粘附分子制备第一溶液。在角化细胞培养基中制备第一核苷酸粘附分子。用细胞(每毫升角化细胞培养基1千万个细胞)、I型胶原(10μg/ml)和第二核苷酸粘附分子制备第二溶液。第二核苷酸粘附分子的序列与第一核苷酸粘附分子的序列互补,从而允许细胞的第一层和第二层之间的互补配对。
将第一溶液施加至基底膜包被的基质上,并孵育15分钟以允许胶原形成凝胶。随后,在第一层上施加第二溶液。连续地和可选地施加这些溶液。所述施加是手动的,但在一些实施方案中,使用3D打印技术来施加层。一旦层达到至少5mm的厚度,即分离并加工组织以形成皮革产品。加工培养的皮革
经由将培养的组织的蛋白质转变成稳定物质的方法,将工程化的组织加工成培养的皮革。该过程被称为鞣制,并且涉及交联蛋白质,并且通过施加铬来实现。使用分散酶(在37℃下孵育10mn)从基质分离培养的组织,并转移至铬鞣酸溶液中,并在室温下孵育15分钟。然后在45℃、pH 3.5-4.0下将培养的皮革浸入氧化镁中过夜。因为铬鞣制过程是酸性的,用碳酸氢钠和甲酸钠或乙酸钠中和培养的皮革。然后,用合成的鞣剂(诸如syntans、树脂和天然鞣酸)将培养的皮革复鞣。将培养的皮革染色至所需的颜色深浅,并脂肪液化(fatliquored)以便培养的皮革吸收天然的和合成的油。然后使用包括真空干燥、悬挂干燥和拉伸干燥的各种方法方法来干燥培养的皮革。
虽然在本文中已经显示和描述了本发明的优选实施方案,仅通过实例的方式提供此类实施方案对本领域技术人员而言是显而易见的。本领域技术人员可以想到许多变形、改变和替换,而不脱离本发明。应当理解可以将本文中描述的本发明的实施方案的各种替代用于实施本发明。
Claims (38)
1.包含多层的培养的皮革,每层包含细胞和细胞外胶原,其中通过核苷酸粘附分子将所述多层中的每层与相邻层连接,其中所述培养的皮革包含小于40%的水分含量。
2.如权利要求1所述的培养的皮革,其中所述细胞包含成纤维细胞。
3.如权利要求1所述的培养的皮革,其中所述细胞包含角化细胞。
4.如权利要求1所述的培养的皮革,其中所述细胞包含诱导的多能干细胞(iPSC)。
5.如权利要求1所述的培养的皮革,其中所述细胞包含多能干细胞源性的皮肤样细胞。
6.如权利要求1至5中任一项所述的培养的皮革,其中任一所述细胞来源于哺乳动物、禽类、鱼类或爬行动物中的任意一种或多种。
7.如权利要求1至6中任一项所述的培养的皮革,其中所述细胞外胶原是交联的。
8.如权利要求1至7中任一项所述的培养的皮革,其中所述核苷酸粘附分子包含:
a)膜锚定区,其包含至少12个碳原子的长烷基链;和
b)多核苷酸,其具有膜远端和膜近端,其中将所述多核苷酸在所述膜近端处与所述膜锚定区缀合,其中所述多核苷酸为至少50个核苷酸,并且包含:
i)接头区,其包含至少约20个核苷酸的连续延伸区;和
ii)膜远端粘附区,其包含至少10个核苷酸,并且位于所述接头区的远端,其中所述接头区不能与所述膜远端粘附区杂交。
9.如权利要求8所述的培养的皮革,其中所述核苷酸粘附分子包含DNA标签,其中所述DNA标签能够在鞣制过程后被扩增。
10.如权利要求1至9中任一项所述的培养的皮革,其中所述水分含量为10%至30%。
11.如权利要求1至10中任一项所述的培养的皮革,其中抗拉强度等于或超过25kgf/cm2。
12.如权利要求1至11中任一项所述的培养的皮革,其中所述培养的皮革的厚度小于100毫米。
13.消费品,其包含权利要求1至12中任一项所述的培养的皮革。
14.如权利要求13所述的消费品,其中所述消费品包括皮夹、手提袋、手表带、夹克、鞋、手机套、公文包、皮箱、手套、腰带或长裤。
15.制备培养的皮革的方法,其包括:
a)培养多层,每层包含细胞,其中通过核苷酸粘附分子将所述多层中的每层与相邻层连接;以及
b)将所述多层与至少一种鞣剂接触;
其中所产生的培养的皮革包含小于40%的水分含量。
16.如权利要求15所述的方法,其中所述细胞包含成纤维细胞。
17.如权利要求15所述的方法,其中所述细胞包含角化细胞。
18.如权利要求15所述的方法,其中所述细胞包含诱导的多能干细胞(iPSC)。
19.如权利要求15至18中任一项所述的方法,其中任一所述细胞来源于哺乳动物、禽类、鱼类或爬行动物中的任意一种或多种。
20.如权利要求15至19中任一项所述的方法,其中通过鞣剂将胶原交联。
21.如权利要求20所述的方法,其中所述鞣剂包含铬。
22.如权利要求20所述的方法,其中所述鞣剂包含植物鞣酸。
23.如权利要求15至22中任一项所述的方法,其中所述核苷酸粘附分子包含:
a)膜锚定区,其包含至少12个碳原子的长烷基链;和
b)多核苷酸,其具有膜远端和膜近端,其中将所述多核苷酸在所述膜近端处与所述膜锚定区缀合,其中所述多核苷酸为至少50个核苷酸,并且包含:
i)接头区,其包含至少约20个核苷酸的连续延伸区;和
ii)膜远端粘附区,其包含至少10个核苷酸,并且位于所述接头区的远端,其中所述接头区不能与所述膜远端粘附区杂交。
24.如权利要求15至23中任一项所述的方法,其中所述核苷酸粘附分子包含DNA标签,其中所述DNA标签能够在鞣制过程后被扩增。
25.如权利要求15至24中任一项所述的方法,其中所产生的培养的皮革的水分含量为10%至30%。
26.如权利要求15至25中任一项所述的方法,其中所产生的培养的皮革的抗拉强度等于或超过25kgf/cm2。
27.如权利要求15至26中任一项所述的方法,还包括在制造消费品中使用所述培养的皮革。
28.如权利要求27所述的方法,其中所述消费品包括皮夹、手提袋、手表带、夹克、鞋、手机套、公文包、皮箱、手套、腰带或长裤。
29.鉴定被用于制造培养的皮革产品的方法学的方法,所述方法包括:
a.从所述产品的培养的皮革的样品提取核酸;
b.使用特异性针对已知DNA标签的引物对所述核酸进行扩增程序,所述DNA标签包含特定的非天然存在的核酸序列,所述特定的非天然存在的核酸序列在制造过程中被引入至所述培养的皮革;
c.检测所述DNA标签的扩增的存在;以及
d.基于所述扩增的DNA标签的存在或不存在,鉴定所述被用于制造所述培养的皮革产品的方法学。
30.如权利要求29所述的方法,其中所述样品获自特别提供以允许验证所述制造的方法学的产品的一部分。
31.如权利要求29或30中任一项所述的方法,其中所述扩增程序为聚合酶链式反应(PCR)。
32.如权利要求29至31中任一项所述的方法,其中所述特定的非天然存在的核酸序列的长度为至少10、20或30个核酸。
33.如权利要求29至32中任一项所述的方法,其中所述特定的非天然存在的核酸序列含有引物结合位点。
34.鉴定皮革产品为培养的皮革产品的方法,所述方法包括:
a.从所述产品的皮革的样品提取核酸;
b.使用特异性针对已知DNA标签的引物对所述核酸进行扩增程序,所述DNA标签包含特定的非天然存在的核酸序列,所述特定的非天然存在的核酸序列在制造过程中被引入至培养的皮革;
c.检测所述DNA标签的扩增的存在;以及
d.基于所述扩增的DNA标签的存在或不存在,鉴定所述皮革产品为培养的皮革产品。
35.如权利要求34所述的方法,其中所述样品获自特别提供以允许验证所述皮革产品为培养的皮革产品的产品的一部分。
36.如权利要求34或35中任一项所述的方法,其中所述扩增程序为聚合酶链式反应(PCR)。
37.如权利要求34至36中任一项所述的方法,其中所述特定的非天然存在的核酸序列的长度为至少10、20或30个核酸。
38.如权利要求34至37中任一项所述的方法,其中所述特定的非天然存在的核酸序列含有引物结合位点。
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