WO2023218789A1 - 動物組織から幹細胞を回収する方法 - Google Patents

動物組織から幹細胞を回収する方法 Download PDF

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WO2023218789A1
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stem cells
cells
tissue
animal tissue
medium
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史朗 北野
典弥 松▲崎▼
フィオナ ルイス
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凸版印刷株式会社
国立大学法人大阪大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L13/00—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a method for recovering stem cells from animal tissue.
  • the present invention also relates to a method for producing cultured meat using stem cells recovered by the method.
  • Cultured meat is meat obtained by culturing cells, and is also called “artificial meat,” “lab meat,” and “clean meat.” Natural meat is composed of skeletal muscle cells, adipocytes, fibroblasts, cartilage cells, blood cells, and the like. Therefore, cells used in the production of cultured meat must have the ability to self-proliferate until reaching a sufficient amount and have the ability to differentiate into the above-mentioned cell types. As such cells, stem cells (somatic stem cells) existing in animal tissues are a promising candidate (Non-Patent Document 1).
  • stem cells collected by the above-mentioned stem cell collection method could not be used for producing cultured meat. Furthermore, there is no known method to collect stem cells from animal tissue without using materials that are not suitable for edible use.
  • an object of the present invention is to provide a method for collecting stem cells that can be used for cultured meat production from animal tissues. Another object of the present invention is to provide a method for producing cultured meat using stem cells recovered by the method.
  • the present invention relates to, for example, the following inventions.
  • [1] comprising the step of contacting at least the surface of the animal tissue with a cleaning solution, A method for recovering stem cells from animal tissue, wherein the washing solution is a solution containing peracetic acid, hydrogen peroxide, and acetic acid.
  • the cleaning liquid contains peracetic acid of 0.03 v/v% to 0.075 v/v%, hydrogen peroxide of 0.01 v/v% to 0.025 v/v%, and 0.09 v/v% to 0. .225 v/v% or less of acetic acid is contained, the method according to [1].
  • the method for recovering stem cells from animal tissue includes a step of bringing at least the surface of the animal tissue into contact with a specific cleaning solution (hereinafter also referred to as the "washing step”).
  • the cleaning liquid used here is a solution containing peracetic acid, hydrogen peroxide, and acetic acid.
  • stem cells refer to cells that have the ability to self-proliferate and have multipotency.
  • Stem cells may be any stem cells (somatic stem cells) that exist in animal tissues, and specifically include mesenchymal stem cells (e.g., adipose-derived stem cells, bone marrow-derived stem cells), hematopoietic stem cells, muscle stem cells, and neural stem cells. can be mentioned.
  • the stem cells are preferably mesenchymal stem cells, and more preferably adipose-derived stem cells.
  • stem cells can be recovered without causing contamination with bacteria, and the recovered stem cells can be It retains the ability to self-propagate and has pluripotency. Therefore, since stem cells can be collected without using materials that cannot be used for food (such as antibiotics), the collected stem cells can be used for producing cultured meat.
  • the cleaning step at least the surface of the animal tissue is brought into contact with a specific cleaning solution.
  • the specific washing liquid only needs to contact at least the surface of the animal tissue, that is, the entire surface of the animal tissue, and may also contact the inside of the animal tissue in addition to the entire surface of the animal tissue.
  • the cleaning step may be a step of bringing at least the surface of the animal tissue into contact with a specific cleaning solution to remove germs from the surface of the animal tissue.
  • "Remove germs" means to sterilize germs attached to the surface of collected animal tissues, to suppress the growth of germs attached to the surface of animal tissues, or to remove germs from the surface of animal tissues. It means to physically exclude.
  • stem cells By bringing at least the surface of the animal tissue into contact with a specific washing solution, stem cells can be recovered without causing contamination with bacteria.
  • the specific washing solution used in the washing step does not adversely affect the properties of the stem cells, so the recovered stem cells maintain their ability to self-proliferate and maintain their pluripotency. Since the specific washing liquid used in the washing step is applicable to edible uses, the stem cells recovered by the recovery method according to the present embodiment can be applied to cultured meat production.
  • the method of bringing the animal tissue into contact with the cleaning solution is not particularly limited as long as at least the surface of the animal tissue comes into contact with the cleaning solution. Examples include a method of coating.
  • the animal tissue is not particularly limited as long as it contains stem cells, but for example, it may be derived from a mammal such as a monkey, dog, cat, rabbit, chicken, pig, cow, horse, mouse, or rat. good.
  • the animal tissue is preferably derived from a cow, a pig, or a chicken, and more preferably from a cow.
  • the type of animal tissue is not particularly limited, and may be epithelial tissue, muscle tissue, connective tissue, nerve tissue, etc., including epidermal tissue, bone marrow tissue, cartilage tissue, adipose tissue, dental pulp tissue, skeletal muscle tissue, cardiac muscle tissue, hippocampus. It may be a tissue derived from a tissue or the like.
  • the cleaning liquid in the recovery method according to the present embodiment is a solution containing peracetic acid, hydrogen peroxide, and acetic acid.
  • the cleaning liquid according to this embodiment may contain an aqueous medium in addition to the above components.
  • the aqueous medium include, but are not limited to, water, physiological saline such as phosphate buffered saline (PBS), and the like.
  • PBS physiological saline
  • the cleaning liquid according to the present embodiment includes, for example, a commercially available concentrate (for example, Persan (registered trademark) (Envirotech, Inc., 15 v/v% peracetic acid, 5 v/v% hydrogen peroxide, and 45 v/v% acetic acid).
  • the cleaning liquid according to the present embodiment may further contain components that can be used for edible purposes, such as surfactants, pH adjusters, stabilizers, etc. that can be used for edible purposes. It may be
  • the concentration of peracetic acid in the cleaning liquid according to the present embodiment may be 0.012 v/v% or more and 0.15 v/v% or less, and 0.022 v/v% or more and 0.12 v/v% or less based on the total amount of the cleaning liquid. It may be less than or equal to v%, or more than or equal to 0.03 v/v% and less than or equal to 0.075 v/v%.
  • the concentration of hydrogen peroxide in the cleaning liquid according to the present embodiment may be 0.004 v/v% or more and 0.05 v/v% or less, and 0.0075 v/v% or more and 0.04 v/v% based on the total amount of the cleaning liquid. /v% or less, or 0.01 v/v% or more and 0.025 v/v% or less.
  • the time for contacting at least the surface of the animal tissue with the washing solution is not particularly limited, and may be, for example, 1 minute or more and 20 minutes or less, or 3 minutes or more and 15 minutes or less. , 5 minutes or more and 10 minutes or less.
  • the stem cell recovery method includes a step of dispersing animal tissue into a plurality of cell clumps (hereinafter also referred to as a "dispersion step”), culturing the plurality of dispersed cell clumps in an adherent manner, and culturing the dispersed cell clumps in a non-adherent manner. 1 selected from a process of removing cells (hereinafter also referred to as “removal process”) and a process of culturing a plurality of dispersed cell clumps in a stem cell medium (hereinafter also referred to as “cultivation process”). Alternatively, it may further include two or more steps.
  • the yield and yield of stem cells that can be recovered from animal tissue are improved, and the purity of the stem cells in the recovered cells is also increased. Since the yield, yield, and purity of the recovered stem cells increase, the efficiency of inducing differentiation into mature cells also increases.
  • a cell cluster means a cell cluster in which one cell or a plurality of cells (for example, about 2 to 10 cells) are adhered.
  • the method for dispersing animal tissue into a plurality of cell clumps is not particularly limited, and may be an enzymatic method or a physical method. Furthermore, these methods may be combined.
  • enzymes such as trypsin, collagenase, hyaluronidase, pronase, dispase, and Accutase (registered trademark) may be added, and a chelating agent such as EDTA may also be added to the enzyme used. It may also be added. Enzymes may be added alone or in combination of two or more.
  • concentration of the added enzyme is not particularly limited, but may be 0.001 to 1 mg/mL.
  • the reaction temperature may be appropriately set depending on the optimum temperature of each enzyme, and may be, for example, 30°C to 40°C, with 37°C being particularly preferred.
  • the reaction time may be, for example, 10 minutes to 1 hour, or 20 minutes to 30 minutes.
  • the physical method is not particularly limited, and may be dispersed into a plurality of cell clumps using, for example, an ultrasonic homogenizer, a stirring homogenizer, a high-pressure homogenizer, or the like. Further, by adjusting the homogenization time, number of times, etc., it is also possible to disperse the cells into a larger number of cell clumps.
  • the removal step the plurality of cell clumps obtained in the dispersion step are adhered and cultured, and non-adherent cells are removed.
  • the removal step may be a step of culturing the plurality of cell clumps obtained in the dispersion step in an adhesive manner, and removing non-adherent cells by washing the culture substrate with an aqueous medium or the like.
  • Stem cells adhere to the culture substrate and proliferate, so by culturing a plurality of cell clumps in an adherent manner and removing non-adherent cells, the purity of the stem cells in the dispersed cell clumps can be increased.
  • Adhesive culture refers to culture performed under conditions that allow cells to adhere to a culture substrate etc. through strong cell-substrate bonds.
  • the culture substrate is not particularly limited, but examples include flasks, test tubes, petri dishes, and the like.
  • non-adherent cells refer to cells that do not adhere to each other through cell-substrate bonds as described above and proliferate in a suspended state in a medium. Examples of non-adherent cells include blood cells.
  • the medium used for adhesive culture is not particularly limited, and examples include Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM), Iscove's Modified Dulbecco's medium (IMDM), and the like.
  • the medium may be a medium supplemented with serum or a serum-free medium.
  • the medium may be a mixed medium in which two types of medium are mixed.
  • the culture conditions for the cells may be any conditions that allow stem cells to proliferate, and the culture conditions in the removal step can be set to suitable culture conditions depending on the type of cells.
  • the culture temperature may be 20°C to 40°C, or 30°C to 37°C.
  • the pH of the medium may be 6 to 8, or 7.2 to 7.4.
  • the culture time may be 1 to 2 days, or 3 to 5 days.
  • subculture may be performed after a certain culture period has elapsed.
  • passaging refers to the operation of removing a medium from a cell culture system and transferring the cells to a new medium. When removing the medium from the culture system, an operation may be further performed to peel off cells adhering to the culture substrate from the cell substrate.
  • the number of times passaging may be performed is one or more times, two or more times, three or more times, or four or more times.
  • the plurality of cell clumps obtained in the dispersion step are cultured in a stem cell medium.
  • the dispersed cell clumps are cultured in a stem cell medium, so the yield of stem cells that can be recovered from the dispersed cell clumps can be improved.
  • stem cell medium means a medium in which stem cells can proliferate.
  • the method for producing cultured meat according to the present embodiment includes a step of collecting stem cells from animal tissue by implementing the above-mentioned collection method (hereinafter also referred to as a "recovery step"), and culturing the collected stem cells to induce differentiation,
  • the method includes a step of constructing an artificial tissue body.
  • “Artificial tissue” refers to a cell aggregate (clump-like cell population) that is artificially created by cell culture and in which cells are arranged three-dimensionally.
  • the artificial tissue body includes an extracellular matrix component described below, cells are arranged three-dimensionally via the extracellular matrix component.
  • the shape of the artificial tissue body is not particularly limited, and includes, for example, a sheet, a sphere, a substantially spherical shape, an ellipsoid, a substantially ellipsoid, a hemisphere, a substantially hemispherical shape, a semicircle, a substantially semicircular shape, and a rectangular parallelepiped. Examples include a shape, a substantially rectangular parallelepiped shape, and the like.
  • the cells of the artificial tissue include at least stem cells obtained by the above-mentioned collection method and cells differentiated from the stem cells.
  • stem cells differentiated from stem cells include mesenchymal cells such as fibroblasts, chondrocytes, and osteoblasts, cardiomyocytes, epithelial cells (e.g., human gingival epithelial cells), lymphatic endothelial cells, nerve cells, and dendritic cells.
  • mesenchymal cells such as fibroblasts, chondrocytes, and osteoblasts
  • cardiomyocytes e.g., epithelial cells (e.g., human gingival epithelial cells), lymphatic endothelial cells, nerve cells, and dendritic cells.
  • cells hepatocytes, adherent cells (e.g., immune cells), smooth muscle cells (e.g., aortic smooth muscle cells (Aorta-SMC)), pancreatic islet cells, keratinocytes (e.g
  • the artificial tissue may have a vascular network between cells.
  • Having a vascular network between cells means having a structure in which branched blood vessels extend between cells so as to surround the cells, similar to biological tissues.
  • the thickness of the artificial tissue means, when the artificial tissue is sheet-like or rectangular parallelepiped-like, the distance between both ends in the direction perpendicular to the main surface.
  • the thickness means the distance at the thinnest part of the main surface.
  • the artificial tissue when the artificial tissue is spherical or approximately spherical, it means its diameter. Furthermore, when the artificial tissue body is ellipsoidal or approximately ellipsoidal, it means its short axis. If the artificial tissue body is approximately spherical or ellipsoidal and has irregularities on its surface, the thickness is the shortest distance between two points where the above surface intersects a straight line passing through the center of gravity of the artificial tissue body. means the distance.
  • the recovered stem cells are cultured under the same culture conditions as the above removal step or the above culture step, and a certain culture is maintained. Passage may be performed after a period of time has elapsed. By passing the cells one or more times, non-stem cells that may remain in the stem cells collected during the collection process will die or decline, improving the purity of the stem cells, resulting in mature cells. It is expected that the differentiation ability will be significantly improved.
  • the number of times passaging may be performed is one or more times, two or more times, three or more times, or four or more times.
  • the differentiation-induced culture of stem cells can be performed by a conventional method.
  • the adipose-derived stem cells are treated with erucic acid, elaidic acid, oleic acid, palmitoleic acid, myristoleic acid, phytanic acid, and
  • the culture may be carried out in the presence of one or more fatty acids selected from the group consisting of , pristanic acid.
  • It may be cultured in the presence of the above fatty acids, or may be cultured in the presence of elaidic acid, oleic acid, palmitoleic acid, myristoleic acid, phytanic acid, and pristanic acid. Furthermore, the culture may be carried out in the presence of erucic acid, elaidic acid, oleic acid, palmitoleic acid, myristoleic acid, phytanic acid, and pristanic acid. By culturing in the presence of these fatty acids, differentiation of adipose-derived stem cells into mature adipocytes is further promoted.
  • the medium may be a solid medium or a liquid medium, but is preferably a liquid medium.
  • the culture medium include Eagle's MEM medium, DMEM, Modified Eagle medium (MEM), Minimum Essential medium, RPMI, and GlutaMax medium.
  • the liquid medium may be a gel-like medium such as fibrin gel, hydrogel, matrigel, collagen gel, or gelatin gel. Cells may be added to a gel-like liquid medium, or a liquid medium containing cells may be gelled.
  • the medium may be a medium supplemented with serum or a serum-free medium.
  • the medium may be a mixed medium in which two types of medium are mixed.
  • the content of each fatty acid in the medium is as follows: For example, it may be 0.1 ⁇ M to 200 ⁇ M, 2 ⁇ M to 100 ⁇ M, 10 ⁇ M to 60 ⁇ M, 30 ⁇ M to 50 ⁇ M, 30 ⁇ M to 150 ⁇ M, or 80 ⁇ M to 120 ⁇ M, 1 ⁇ M to 5, 10 ⁇ M to 20 ⁇ M.
  • it may be 30 ⁇ M or more, 40 ⁇ M or more, 50 ⁇ M or more, 60 ⁇ M or more, 70 ⁇ M or more, 80 ⁇ M or more, 90 ⁇ M or more, 200 ⁇ M or less, 150 ⁇ M or less, 120 ⁇ M or less, 100 ⁇ M or less, 80 ⁇ M or less, or 70 ⁇ M or less .
  • Each fatty acid is, for example, 2.0 ⁇ 10 ⁇ 11 mol to 4.0 ⁇ 10 ⁇ 8 mol, or 1.0 ⁇ 10 ⁇ 9 mol to 2.0 ⁇ for 1 ⁇ 10 6 adipose-derived stem cells. It may be 10 ⁇ 8 mol.
  • the weight of each fatty acid may be, for example, 6 ng to 15 ⁇ g, or 250 ng to 10 ⁇ g for 1 ⁇ 10 6 adipose-derived stem cells.
  • differentiation-induced culture there are no particular restrictions on differentiation-induced culture, and it can be performed under suitable conditions depending on the type of cells to be cultured.
  • the temperature for differentiation induction culture may be 20°C to 40°C, or 30°C to 37°C.
  • the pH of the medium may be 6 to 8, or 7.2 to 7.4.
  • the time for differentiation induction culture may be 24 hours or more and 336 hours or less, 72 hours or more and 336 hours or less, 96 hours or more and 384 hours or less, and 96 hours or more and 288 hours or less. There may be.
  • the culture vessel (support) used for culturing the cells of the artificial tissue is not particularly limited, and may be, for example, a well insert, a low adhesion plate, or a plate with a bottom shape such as a U-shape or a V-shape.
  • the cells may be cultured while being attached to the support, the cells may be cultured without being attached to the support, or the cells may be separated from the support during culture.
  • the bottom shape such as a U-shape or V-shape, which inhibits the adhesion of the cells to the support, may be used. It is preferable to use a plate with a low adsorption capacity or a low adsorption plate.
  • the differentiation induction of stem cells in the step of culturing the recovered stem cells to induce differentiation and constructing an artificial tissue can be achieved by culturing cells containing at least the stem cells recovered by the above-mentioned recovery method in the presence of fragmented extracellular matrix components. good.
  • culturing with the fragmented extracellular matrix component it is possible to obtain an artificial tissue in which cells are arranged three-dimensionally through the fragmented extracellular matrix component.
  • the artificial tissue is an artificial tissue in which the fragmented extracellular matrix component is arranged in the gaps between the cells.
  • the cells among the cells may be homogeneous cells or may be heterogeneous cells.
  • the fragmented extracellular matrix component can be obtained by fragmenting the extracellular matrix component.
  • extracellular matrix component refers to an aggregate of extracellular matrix molecules formed by a plurality of extracellular matrix molecules.
  • Extracellular matrix refers to substances that exist outside cells in living organisms. As the extracellular matrix, any substance can be used as long as it does not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates. Specific examples include, but are not limited to, collagen, elastin, proteoglycan, fibronectin, hyaluronic acid, laminin, vitronectin, tenascin, entactin, and fibrillin. These extracellular matrix components may be used alone or in combination.
  • the extracellular matrix component may include, for example, a collagen component.
  • the extracellular matrix component in this embodiment is preferably a substance that exists outside animal cells, that is, an animal extracellular matrix component.
  • collagen examples include fibrous collagen and non-fibrous collagen.
  • Fibrillar collagen refers to collagen that is the main component of collagen fibers, and specifically includes type I collagen, type II collagen, type III collagen, and the like.
  • non-fibrous collagen examples include type IV collagen.
  • proteoglycans include, but are not limited to, chondroitin sulfate proteoglycan, heparan sulfate proteoglycan, keratan sulfate proteoglycan, and dermatan sulfate proteoglycan.
  • the extracellular matrix component may contain at least one selected from the group consisting of collagen, laminin, and fibronectin, and preferably contains collagen.
  • the collagen is preferably fibrillar collagen, more preferably type I collagen.
  • fibrous collagen commercially available collagen may be used, and a specific example thereof includes type I collagen derived from pig skin manufactured by Nippon Ham Co., Ltd.
  • the method for fragmenting extracellular matrix components is not particularly limited.
  • the extracellular matrix component may be defibrated by applying physical force using an ultrasonic homogenizer, a stirring homogenizer, a high-pressure homogenizer, or the like.
  • the extracellular matrix component may be homogenized as it is, or may be homogenized with an aqueous medium such as physiological saline, or an organic solvent such as ethanol.
  • an aqueous medium such as physiological saline, or an organic solvent such as ethanol.
  • the fragmented extracellular matrix component may contain at least a portion of the defibrated extracellular matrix component. Furthermore, the fragmented extracellular matrix component may consist only of defibrated extracellular matrix components. That is, the fragmented extracellular matrix component may be a defibrated extracellular matrix component.
  • the defibrated extracellular matrix component preferably includes a defibrated collagen component (defibrated collagen component).
  • the defibrated collagen component preferably maintains a triple helical structure derived from collagen.
  • the defibrated collagen component may be a component that partially maintains the triple helical structure derived from collagen.
  • the fragmented extracellular matrix component may include, for example, a fragmented collagen component, and may consist of a fragmented collagen component.
  • At least a portion of the fragmented extracellular matrix component may be intermolecularly or intramolecularly crosslinked.
  • the extracellular matrix component may be cross-linked within or between molecules of the extracellular matrix molecules that constitute the extracellular matrix component.
  • the extracellular matrix component content in the artificial tissue may be 0.01 to 90% by mass, preferably 10 to 90% by mass, and preferably 10 to 80% by mass based on the artificial tissue (dry weight). %, preferably 10 to 70% by mass, preferably 10 to 60% by mass, preferably 1 to 50% by mass, and preferably 10 to 50% by mass. , more preferably 10 to 30% by mass, and even more preferably 20 to 30% by mass.
  • the artificial tissue body preferably has a survival rate of 70% or more, preferably 80% or more after trypsin treatment at a trypsin concentration of 0.25%, a temperature of 37°C, a pH of 7.4, and a reaction time of 15 minutes. More preferably, it is 90% or more, and even more preferably 90% or more.
  • a survival rate can be calculated, for example, from the mass of the artificial tissue before and after trypsin treatment.
  • the artificial tissue body may have a residual rate of 70% or more after collagenase treatment at a collagenase concentration of 0.25%, a temperature of 37°C, a pH of 7.4, and a reaction time of 15 minutes, and may have a survival rate of 80% or more. It is more preferable that it be at least 90%, and even more preferable that it be at least 90%.
  • Such an artificial tissue is stable and difficult to be degraded by enzymes during or after culturing.
  • One embodiment of the method for producing an artificial tissue may include mixing fibrinogen and thrombin simultaneously or separately. By mixing fibrinogen and thrombin, they react to form fibrin.
  • the content of fibrinogen may be, for example, 1 to 10 mg/mL, 2 to 8 mg/mL, or 5 to 6 mg/mL relative to the medium.
  • Adipose-derived stem cells were collected from bovine adipose tissue using the following procedure.
  • Persan registered trademark
  • PBS phosphate buffered saline
  • Bovine adipose tissue was immersed in the above washing solution and washed for 5 minutes. Bovine adipose tissue was further washed three times with PBS for 5 minutes. Thereafter, visible blood vessels in the bovine adipose tissue were removed, and the bovine adipose tissue was minced using sterilized forceps and scissors to produce small tissue pieces approximately 3 mm in size. This bovine adipose tissue piece was transferred to a 6-well plate at 2 g per well. 3 mL of 0.1% trypsin was added to the wells, and the bovine adipose tissue pieces were incubated at 280 rpm and 37° C.
  • DMEM containing 10% fetal bovine serum (FBS) was added to the wells to stop the trypsin reaction, and the dispersed bovine adipose tissue pieces were further dispersed by pipetting.
  • the dispersed cells were precipitated by centrifugation at 1000 rpm for 10 minutes, and the precipitated cells were suspended in DMEM containing 10% FBS. This cell suspension was filtered through a cell strainer with a mesh size of 40 ⁇ m, then seeded in a 10 cm dish, and immersed in DMEM containing 10% FBS for 3 days.
  • a dispersion containing a collagen component (CMF) was defibrated by a conventional method from pig skin-derived collagen type I sponge fragments (manufactured by Nippon Ham Co., Ltd.).
  • a defibrated collagen component (CMF) was obtained as a dried product by freeze-drying the dispersion using a conventional method.
  • the fragmented collagen was dispersed in a serum-containing medium (DMEM) to a concentration of 10 mg/mL.
  • DMEM serum-containing medium
  • Test Example 3 Confirming the influence of the number of passages on the differentiation ability of recovered adipose-derived stem cells.
  • the adipose-derived stem cells collected by the method described in Test Example 1 were cultured in IMEM medium containing 10% bovine serum, and the adipose-derived stem cell samples were passaged once, twice, three times, and four times. Prepared. (Set as P2, P3, P4, and P5, respectively). After constructing an artificial tissue using each sample in the same manner as in Test Example 2, lipids and nuclei were stained in the same manner and fluorescence observation was performed.

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Abstract

本発明は、動物組織の少なくとも表面と洗浄液とを接触させる工程を含み、洗浄液が、過酢酸、過酸化水素、及び酢酸を含む溶液である、動物組織から幹細胞を回収する方法に関する。

Description

動物組織から幹細胞を回収する方法
　本発明は、動物組織から幹細胞を回収する方法に関する。本発明はまた、当該方法により回収した幹細胞を使用した培養肉の製造方法にも関する。
　培養肉とは、細胞を培養することによって得られた肉のことであり、「人工肉」、「ラボミート」、「クリーンミート」とも呼ばれている。天然肉は、骨格筋細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、及び血液細胞等から構成されている。そのため、培養肉の製造に用いられる細胞は、充分な量に達するまで自己増殖する能力を有し、かつ上述した細胞種に分化する能力を有する必要がある。このような細胞として、動物組織に存在する幹細胞（体性幹細胞）が有力な候補となっている（非特許文献１）。
　従来、動物組織から幹細胞を回収する際、雑菌の混入を防ぐために抗生物質が使用されていた。しかしながら、抗生物質を使用すると食用用途には適用できないため、上述の幹細胞の回収方法で回収した幹細胞は、培養肉製造用に使用することはできなかった。また、食用用途には適用できない材料を使用せず、動物組織から幹細胞を回収する方法はこれまで知られていない。
　そこで、本発明は、動物組織から培養肉製造に使用可能な幹細胞を回収する方法を提供することを目的とする。本発明はまた、当該方法により回収した幹細胞を使用した培養肉の製造方法を提供することを目的とする。
　すなわち、本発明は、例えば以下の発明に関する。
［１］
　動物組織の少なくとも表面と洗浄液とを接触させる工程を備え、
　前記洗浄液は、過酢酸、過酸化水素、及び酢酸を含む溶液である、動物組織から幹細胞を回収する方法。
［２］
　前記洗浄液は、０．０３ｖ／ｖ％以上０．０７５ｖ／ｖ％以下の過酢酸、０．０１ｖ／ｖ％以上０．０２５ｖ／ｖ％以下の過酸化水素、及び０．０９ｖ／ｖ％以上０．２２５ｖ／ｖ％以下の酢酸を含む、［１］に記載の方法。
［３］
　前記動物組織と前記洗浄液とを接触させる時間が、５分以上１０分以下である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
　前記動物組織が、脂肪組織を含む、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
　前記動物組織が、ウシ由来の脂肪組織を含む、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
　前記幹細胞が、脂肪由来幹細胞を含む、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
　前記動物組織を複数の細胞小塊に分散させる工程を更に備える、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
　前記複数の細胞小塊を接着培養し、非接着細胞を除去する工程、及び／又は前記複数の細胞小塊を幹細胞用培地で培養する工程を更に備える、［７］に記載の方法。
［９］
　少なくとも１回継代することを含む、［８］に記載の方法。
［１０］
　前記幹細胞が、培養肉製造用である、［１］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］
　［１］～［１０］のいずれかに記載の方法を実施し、動物組織から幹細胞を回収する工程、及び回収した幹細胞を分化誘導培養し、人工組織を構築する工程を備える、培養肉の製造方法。
　本発明によれば、動物組織から培養肉製造に使用可能な幹細胞を回収する方法を提供できる。本発明によればまた、当該方法により回収した幹細胞を使用した培養肉の製造方法を提供できる。
試験例１においてウシ由来の脂肪組織から回収した脂肪由来幹細胞の培養２日後及び７日後の写真である。 試験例２において脂肪由来幹細胞を成熟脂肪細胞へ分化誘導して得た人工組織体のナイルレッドによる脂質染色及びヘキストによる核染色の結果を示す写真である。 試験例３において脂肪由来幹細胞の継代回数による分化能への影響を調べた結果を示すグラフである。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
〔動物組織から幹細胞を回収する方法〕
　本実施形態に係る動物組織から幹細胞を回収する方法（以下、単に「回収方法」ともいう。）は、動物組織の少なくとも表面と特定の洗浄液とを接触させる工程（以下、「洗浄工程」ともいう。）を備える。ここで、使用する洗浄液は、過酢酸、過酸化水素、及び酢酸を含む溶液である。
　本明細書において「幹細胞」とは、自己増殖する能力を有し、かつ分化多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する細胞を意味する。幹細胞としては、動物組織に存在する幹細胞（体性幹細胞）であればよく、具体的には例えば、間葉系幹細胞（例えば、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞）、造血幹細胞、筋幹細胞、神経幹細胞が挙げられる。幹細胞は、間葉系幹細胞が好ましく、脂肪由来幹細胞がより好ましい。
　本実施形態に係る回収方法は、動物組織の表面に特定の洗浄液を接触させる処理を行うものであるため、雑菌のコンタミネーションを生じることなく幹細胞を回収することができ、また回収した幹細胞は、自己増殖する能力、及び分化多能性を保持している。したがって、食用用途に適用できない材料（抗生物質等）を使用することなく幹細胞を回収することができるため、回収した幹細胞は培養肉製造に使用可能である。
　洗浄工程では、動物組織の少なくとも表面と特定の洗浄液とを接触させる。洗浄工程において、特定の洗浄液は、動物組織の少なくとも表面、すなわち動物組織の表面全体と接触すればよく、動物組織の表面全体に加えて動物組織内部とも接触してもよい。洗浄工程は、動物組織の少なくとも表面と特定の洗浄液とを接触させ、動物組織表面の雑菌を除去する工程であってもよい。「雑菌を除去する」とは、採取した動物組織の表面に付着している雑菌を殺菌する、若しくは動物組織の表面に付着している雑菌の増殖を抑制する、又は動物組織の表面から雑菌を物理的に排除することを意味する。動物組織の少なくとも表面と特定の洗浄液とを接触させることにより、雑菌のコンタミネーションを生じることなく幹細胞を回収することができるようになる。加えて、洗浄工程で使用する特定の洗浄液は、幹細胞の性質に悪影響を与えることがないため、回収した幹細胞は自己増殖する能力、及び分化多能性を維持している。そして、洗浄工程で使用する特定の洗浄液は、食用用途への適用が可能なものであるため、本実施形態に係る回収方法で回収した幹細胞は、培養肉製造用途へ適用可能である。
　動物組織と洗浄液とを接触させる方法は、動物組織の少なくとも表面が当該洗浄液と接触する方法であれば特に制限はなく、例えば、動物組織を洗浄液に浸漬する方法、動物組織表面に洗浄液を散布又は塗布する方法等が挙げられる。
　動物組織は、幹細胞を含む動物組織であれば特に限定されないが、例えば、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ニワトリ、ブタ、ウシ、ウマ、マウス、ラット等の哺乳類動物に由来するものであってもよい。動物組織は、ウシ、ブタ、又はニワトリ由来であることが好ましく、ウシ由来であることがより好ましい。動物組織の種類も特に限定されず、上皮組織、筋組織、結合組織、神経組織等であってよく、表皮組織、骨髄組織、軟骨組織、脂肪組織、歯髄組織、骨格筋組織、心筋組織、海馬組織等由来の組織であってよい。動物組織の種類は、筋組織、結合組織であることが好ましく、骨格筋組織、又は脂肪組織であることがより好ましく、脂肪組織であることがさらに好ましい。また、動物組織はウシ由来の脂肪組織であることが好ましい。
　本実施形態に係る回収方法における洗浄液は、過酢酸、過酸化水素、及び酢酸を含む溶液である。本実施形態に係る洗浄液は、上記各成分に加えて、水性媒体を含むものであってよい。水性媒体としては、特に制限されないが、例えば、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の生理食塩水等が挙げられる。本実施形態に係る洗浄液は、例えば、市販されている濃縮液（例えば、パーサン（登録商標）（エンビロテック社、１５ｖ／ｖ％過酢酸、５ｖ／ｖ％過酸化水素、及び４５ｖ／ｖ％酢酸を含む。））を水性媒体で希釈して調製することもできる。本実施形態に係る洗浄液には、食用用途への適用が可能な成分が更に含まれていてもよく、例えば、食用用途への適用が可能な界面活性剤、ｐＨ調整剤、安定剤等が含まれていてもよい。
　本実施形態に係る洗浄液中の過酢酸の濃度は、洗浄液全量に対して０．０１２ｖ／ｖ％以上０．１５ｖ／ｖ％以下であってもよく、０．０２２ｖ／ｖ％以上０．１２ｖ／ｖ％以下であってもよく、０．０３ｖ／ｖ％以上０．０７５ｖ／ｖ％以下であってもよい。
　本実施形態に係る洗浄液中の過酸化水素の濃度は、洗浄液全量に対して０．００４ｖ／ｖ％以上０．０５ｖ／ｖ％以下であってもよく、０．００７５ｖ／ｖ％以上０．０４ｖ／ｖ％以下であってもよく、０．０１ｖ／ｖ％以上０．０２５ｖ／ｖ％以下であってもよい。
　本実施形態に係る洗浄液中の酢酸の濃度は、洗浄液全量に対して０．０３６ｖ／ｖ％以上０．４５ｖ／ｖ％以下であってもよく、０．０６７５ｖ／ｖ％以上０．３６ｖ／ｖ％以下であってもよく、０．０９ｖ／ｖ％以上０．２２５ｖ／ｖ％以下であってもよい。
　洗浄工程において、上記動物組織の少なくとも表面と、上記洗浄液とを接触させる時間としては、特に制限されず、例えば、１分以上２０分以下であってよく、３分以上１５分以下であってよく、５分以上１０分以下であってもよい。
　本実施形態に係る幹細胞の回収方法は、動物組織を複数の細胞小塊に分散させる工程（以下、「分散工程」ともいう。）、分散させた複数の細胞小塊を接着培養し、非接着細胞を除去する工程（以下、「除去工程」ともいう。）、及び分散させた複数の細胞小塊を幹細胞用培地で培養する工程（以下、「培養工程」ともいう。）から選択される１又は２以上の工程を更に備えていてもよい。これらの工程を備えることにより、動物組織から回収できる幹細胞の収率、収量が向上し、さらに、回収した細胞中の幹細胞の純度が増加する。そして、回収した幹細胞の収率、収量、及び純度が増加するため、成熟細胞への分化誘導効率も高くなる。
　分散工程では、動物組織を複数の細胞小塊に分散させる。細胞小塊は、１個の細胞、又は複数の細胞（例えば、２個～１０個程度）が接着した細胞塊を意味する。動物組織を複数の細胞小塊に分散させる方法としては、特に制限されないが、酵素的手法であっても、物理的手法であってもよい。また、これらの手法を組み合わせてもよい。
　酵素的手法としては、例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、プロナーゼ、ディスパーゼ、アキュターゼ（登録商標）等の酵素を添加することであってよく、また、使用する酵素に併せてＥＤＴＡ等のキレート剤を併せて添加してもよい。酵素は単独で添加してもよいし、２種類以上を組み合わせて添加してもよい。添加する酵素の濃度は、特に限定されないが、０．００１～１ｍｇ／ｍＬであってよい。また、反応温度は各酵素の至適温度により適宜設定すればよいが、例えば、３０℃～４０℃であってよく、特に３７℃が好ましい。反応時間は、例えば、１０分間～１時間であってもよく、２０分間～３０分間であってもよい。
　物理的手法としては、特に制限されず、例えば、超音波式ホモジナイザー、撹拌式ホモジナイザー、及び高圧式ホモジナイザー等によって複数の細胞小塊に分散してもよい。また、ホモジナイズする時間、回数等調節することでより多くの細胞小塊に分散させることも可能となる。
　除去工程では、分散工程で得られた複数の細胞小塊を接着培養し、非接着細胞を除去する。除去工程は、分散工程で得られた複数の細胞小塊を接着培養し、培養基材を水性媒体等で洗浄することで、非接着細胞を除去する工程であってもよい。幹細胞は培養基材に接着して増殖するため、複数の細胞小塊を接着培養し、非接着細胞を除去することにより、分散させた細胞小塊中の幹細胞の純度を増加させることができる。
　「接着培養」とは、細胞と培養基材等との間の強固な細胞－基質間結合によって接着するような条件で行われる培養を意味する。培養基材としては、特に制限はないが、フラスコ、試験管、シャーレ等が挙げられる。また、「非接着細胞」とは、上述したような細胞－基質間結合による接着が生じず、培地中で浮遊した状態で増殖する細胞を意味する。非接着細胞としては、例えば、血液細胞等が挙げられる。
　接着培養に用いる培地としては、特に制限はなく、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ培地（ＩＭＤＭ）等が挙げられる。培地は、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。培地は、二種類の培地を混合した混合培地であってもよい。
　細胞の培養条件は、幹細胞が増殖する条件であればよく、除去工程における培養条件は、細胞の種類に応じて、好適な培養条件を設定することができる。例えば、培養温度は２０℃～４０℃であってもよく、３０℃～３７℃であってもよい。培地のｐＨは、６～８であってもよく、７．２～７．４であってもよい。培養時間は、１日～２日であってもよく、３日～５日であってもよい。また、一定の培養期間の経過後に、継代を行ってもよい。なお、「継代」とは、細胞の培養系から培地を除去し、細胞を新しい培地に移す操作を指す。培養系からの培地の除去の際、培養基材に接着している細胞を細胞基材から剥がす操作を更に行ってもよい。１回以上の継代を行うことで、分散工程で得られた細胞小塊中にわずかに残存している可能性がある幹細胞以外の細胞が死滅・減退し、幹細胞の純度が向上することにより、成熟細胞への分化能が有意に向上することが期待される。継代を行う回数は１回以上、２回以上、３回以上、又は４回以上であってよい。
　培養工程では、分散工程で得られた複数の細胞小塊を幹細胞用培地で培養する。培養工程は、分散させた細胞小塊を幹細胞用培地で培養するため、分散させた細胞小塊から回収できる幹細胞の収量を向上させることができる。「幹細胞用培地」とは、幹細胞が増殖可能な培地を意味する。
　幹細胞用培地としては、幹細胞が増殖できる培地であれば特に制限はないが、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ培地（ＩＭＤＭ）等であってよい。培地は、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。培地は、二種類の培地を混合した混合培地であってもよい。また、幹細胞用培地は、幹細胞以外の細胞が増殖不可能な培地であることが好ましい。細胞の培養条件は、幹細胞が増殖する条件であればよく、上述の除去工程と同様の条件であってよい。また、除去工程と同様に継代を行ってもよい。除去工程及び培養工程の両方を実施する場合、両工程は同時に行われてもよく、同時に行われなくてもよい。
〔培養肉の製造方法〕
　本実施形態に係る培養肉の製造方法は、上述した回収方法を実施して動物組織から幹細胞を回収する工程（以下、「回収工程」ともいう。）、及び回収した幹細胞を分化誘導培養し、人工組織体を構築する工程を備える。
　「人工組織体」とは、細胞培養によって人工的に作られ、細胞が三次元的に配置されている細胞の集合体（塊状の細胞集団）を意味する。人工組織体が後述する細胞外マトリックス成分を含む場合には、細胞外マトリックス成分を介して細胞が三次元的に配置される。人工組織体の形状は、特に制限はなく、例えば、シート状、球体状、略球体状、楕円体状、略楕円体状、半球状、略半球状、半円状、略半円状、直方体状、略直方体状等が挙げられる。
　人工組織体の細胞は、少なくとも上述の回収方法によって得られた幹細胞及び当該幹細胞から分化した細胞を含む。幹細胞から分化した細胞としては、例えば、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞等の間葉系細胞、心筋細胞、上皮細胞（例えば、ヒト歯肉上皮細胞）、リンパ管内皮細胞、神経細胞、樹状細胞、肝細胞、接着性細胞（例えば、免疫細胞）、平滑筋細胞（例えば、大動脈平滑筋細胞（Ａｏｒｔａ－ＳＭＣ））、膵島細胞、角化細胞（例えば、ヒト表皮角化細胞）等が挙げられる。
　人工組織体は、細胞間に血管網を有するものであってよい。「細胞間に血管網を有する」とは、生体組織と同様に、分岐した血管が細胞を取り囲むように細胞と細胞の間に延びた構造を有することを意味する。
　上記人工組織体の厚さは０．５ｍｍ以上であることが好ましく、１ｍｍ以上であることがより好ましく、２ｍｍ以上であることが更により好ましい。このような人工組織体は、培養肉として好適なものとなる。人工組織体の厚さの上限は、特に制限されないが、例えば、４０ｍｍ以下であってもよいし、３０ｍｍ以下であってもよいし、２０ｍｍ以下であってもよいし、１０ｍｍ以下であってもよいし、５ｍｍ以下であってもよい。
　ここで、「人工組織体の厚さ」とは、人工組織体がシート状、又は直方体状である場合、主面に垂直な方向における両端の距離を意味する。上記主面に凹凸がある場合、厚さは上記主面の最も薄い部分における距離を意味する。
　また、人工組織体が球体状又は略球体状である場合、その直径を意味する。さらにまた、人工組織体が楕円体状又は略楕円体状である場合、その短径を意味する。人工組織体が略球体状又は略楕円体状であって表面に凹凸がある場合、厚さは、人工組織体の重心を通る直線と上記表面とが交差する２点間の距離であって最短の距離を意味する。
　上記回収工程の後、かつ回収した幹細胞を分化誘導培養し、人工組織体を構築する工程の前に、回収した幹細胞を上記除去工程又は上記培養工程と同様の培養条件で培養し、一定の培養期間の経過後に継代を行ってもよい。１回以上の継代を行うことで、回収工程で回収した幹細胞中にわずかに残存している可能性がある幹細胞以外の細胞が死滅・減退し、幹細胞の純度が向上することにより、成熟細胞への分化能が有意に向上することが期待される。継代を行う回数は１回以上、２回以上、３回以上、又は４回以上であってよい。
　幹細胞の分化誘導培養は、常法により行うことができ、回収した幹細胞が脂肪由来幹細胞である場合、脂肪由来幹細胞をエルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸、及び、プリスタン酸からなる群から選択される１種以上の脂肪酸の存在下で培養してもよい。また、エルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸、及び、プリスタン酸からなる群から選択される２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上の脂肪酸の存在下で培養してもよく、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸、及び、プリスタン酸の存在下で培養してもよい。また、エルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸、及び、プリスタン酸の存在下で培養してもよい。これらの脂肪酸の存在下で培養することで、脂肪由来幹細胞の成熟脂肪細胞への分化がより促進される。
　培地は特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培地を選択できる。培地は、固体培地であっても、液体培地であってもよいが、液体培地であることが好ましい。培地としては、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ　ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＰＭＩ、及びＧｌｕｔａＭａｘ培地等が挙げられる。また、液体培地は、フィブリンゲル、ハイドロゲル、マトリゲル、コラーゲンゲル及びゼラチンゲルのようにゲル状のものを用いてもよい。ゲル状の液体培地に細胞を添加してもよく、細胞を含む液体培地をゲル化させて用いてもよい。培地は、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。培地は、二種類の培地を混合した混合培地であってもよい。
　人工組織体の細胞が、上述の回収方法で回収した脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞であり、当該細胞を上記脂肪酸が含まれる培地中で分化誘導培養する場合、培地における各脂肪酸の含有量は、例えば、０．１μＭ以上２００μＭ以下、２μＭ以上１００μＭ以下、１０μＭ以上６０μＭ以下、３０μＭ以上５０μＭ以下、３０μＭ以上１５０μＭ以下、又は８０μＭ以上１２０μＭ以下であってもよく、１μＭ以上、５以上、１０μＭ以上、２０μＭ以上、３０μＭ以上、４０μＭ以上、５０μＭ以上、６０μＭ以上、７０μＭ以上、８０μＭ以上、９０μＭ以上であってもよく、２００μＭ以下、１５０μＭ以下、１２０μＭ以下、１００μＭ以下、８０μＭ以下又は７０μＭ以下であってもよい。
　各脂肪酸は、例えば、脂肪由来幹細胞１×１０６ｃｅｌｌｓに対して、２．０×１０－１１ｍｏｌ～４．０×１０－８ｍｏｌ、又は１．０×１０－９ｍｏｌ～２．０×１０－８ｍｏｌであってよい。各脂肪酸の重量は、例えば、脂肪由来幹細胞１×１０６ｃｅｌｌｓに対して、６ｎｇ～１５μｇ、又は２５０ｎｇ～１０μｇであってよい。
　分化誘導培養は、特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な条件で行うことができる。例えば、分化誘導培養の温度は２０℃～４０℃であってもよく、３０℃～３７℃であってもよい。培地のｐＨは、６～８であってもよく、７．２～７．４であってもよい。分化誘導培養の時間は、２４時間以上３３６時間以下であってもよく、７２時間以上３３６時間以下であってもよく、９６時間以上３８４時間以下であってもよく、９６時間以上２８８時間以下であってもよい。
　人工組織体の細胞の培養に用いられる培養器（支持体）は、特に制限されず、例えば、ウェルインサート、低接着プレート、Ｕ字やＶ字等の底面形状を有するプレートであってよい。上記細胞を支持体と接着させたまま培養してもよく、上記細胞を支持体と接着させずに培養してもよく、培養の途中で支持体から引き離して培養してもよい。上記細胞を支持体と接着させずに培養する場合や、培養の途中で支持体から引き離して培養する場合には、細胞の支持体への接着を阻害するＵ字やＶ字等の底面形状を有するプレートや、低吸着プレートを用いることが好ましい。
　回収した幹細胞を分化誘導培養し、人工組織体を構築する工程における幹細胞の分化誘導は、上述の回収方法で回収した幹細胞を少なくとも含む細胞を断片化細胞外マトリックス成分の存在下で培養してもよい。断片化細胞外マトリックス成分とともに培養することで、断片化細胞外マトリックス成分を介して細胞が三次元的に配置された人工組織体を得ることができる。断片化細胞外マトリックス成分が上記細胞同士の隙間に配置されている人工組織体であることが好ましい。細胞同士における細胞は、同種細胞であってもよく、異種細胞であってもよい。
　断片化細胞外マトリックス成分は、細胞外マトリックス成分を断片化して得ることができる。本明細書において「細胞外マトリックス成分」とは、複数の細胞外マトリックス分子によって形成されている細胞外マトリックス分子の集合体である。細胞外マトリックスとは、生物において細胞の外に存在する物質を意味する。細胞外マトリックスとしては、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の物質を用いることができる。具体例としては、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、ラミニン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン及びフィブリリン等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックス成分は、これらの１種単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。細胞外マトリックス成分は、例えば、コラーゲン成分を含んでいてよく、コラーゲン成分であってもよい。本実施形態における細胞外マトリックス成分は、動物細胞の外に存在する物質、すなわち動物の細胞外マトリックス成分であることが好ましい。
　コラーゲンとしては、例えば、線維性コラーゲン及び非線維性コラーゲンが挙げられる。線維性コラーゲンとは、コラーゲン線維の主成分となるコラーゲンを意味し、具体的には、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン等が挙げられる。非線維性コラーゲンとしては、例えば、ＩＶ型コラーゲンが挙げられる。
　プロテオグリカンとして、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカンが挙げられるが、これらに限定されない。
　細胞外マトリックス成分は、コラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてよく、コラーゲンを含むことが好ましい。コラーゲンは好ましくは繊維性コラーゲンであり、より好ましくはＩ型コラーゲンである。線維性コラーゲンは、市販されているコラーゲンを用いてもよく、その具体例としては、日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲンが挙げられる。
　「断片化」とは、細胞外マトリックス分子の集合体をより小さなサイズにすることを意味する。断片化は、細胞外マトリックス分子内の結合を切断する条件で行われてもよいし、細胞外マトリックス分子内の結合を切断しない条件で行われてもよい。物理的な力の印加によって断片化された細胞外マトリックスは、酵素処理とは異なり、通常、分子構造は断片化する前とは変化しない（分子構造は維持されている）。断片化細胞外マトリックス成分は、上述の細胞外マトリックス成分を物理的な力の印加により解繊した成分である、解繊された細胞外マトリックス成分（解繊細胞外マトリックス成分）を含んでいてよい。解繊は、断片化の一態様であり、例えば、細胞外マトリックス分子内の結合を切断しない条件で行われるものである。
　細胞外マトリックス成分を断片化する方法としては、特に制限されない。細胞外マトリックス成分を解繊する方法としては、例えば、超音波式ホモジナイザー、撹拌式ホモジナイザー、及び高圧式ホモジナイザー等の物理的な力の印加によって細胞外マトリックス成分を解繊してもよい。撹拌式ホモジナイザーを用いる場合、細胞外マトリックス成分をそのままホモジナイズしてもよいし、生理食塩水等の水性媒体や、エタノール等の有機溶媒でホモジナイズしてもよい。また、ホモジナイズする時間、回数等を調整することでミリメートルサイズ、ナノメートルサイズの解繊細胞外マトリックス成分を得ることも可能である。解繊細胞外マトリックス成分は、凍結融解を繰り返すことで解繊することにより得ることもできる。
　断片化細胞外マトリックス成分は、解繊された細胞外マトリックス成分を少なくとも一部に含んでいてよい。また、断片化細胞外マトリックス成分は、解繊された細胞外マトリックス成分のみからなっていてもよい。すなわち、断片化細胞外マトリックス成分は、解繊された細胞外マトリックス成分であってよい。解繊された細胞外マトリックス成分は、解繊されたコラーゲン成分（解繊コラーゲン成分）を含むことが好ましい。解繊コラーゲン成分は、コラーゲンに由来する三重らせん構造を維持していることが好ましい。解繊コラーゲン成分は、コラーゲンに由来する三重らせん構造を部分的に維持している成分であってよい。
　断片化細胞外マトリックス成分は、例えば、断片化コラーゲン成分を含んでいてよく、断片化コラーゲン成分からなっていてよい。
　断片化細胞外マトリックス成分の少なくとも一部は分子間又は分子内で架橋されていてよい。細胞外マトリックス成分は、細胞外マトリックス成分を構成する細胞外マトリックス分子の分子内又は分子間で架橋されていてよい。
　人工組織体における細胞外マトリックス成分含有率は、上記人工組織体（乾燥重量）を基準として０．０１～９０質量％であってよく、１０～９０質量％であることが好ましく、１０～８０質量％であることが好ましく、１０～７０質量％であることが好ましく、１０～６０質量％であることが好ましく、１～５０質量％であることが好ましく、１０～５０質量％であることが好ましく、１０～３０質量％であることがより好ましく、２０～３０質量％であることがより好ましい。
　人工組織体は、トリプシンの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でトリプシン処理を行った後の残存率が７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることが更により好ましい。このような人工組織体は、培養中又は培養後において酵素による分解が起きにくく、安定である。上記残存率は、例えば、トリプシン処理の前後における人工組織体の質量から算出できる。
　上記人工組織体は、コラゲナーゼの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でコラゲナーゼ処理を行った後の残存率が７０％以上であってもよく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることが更により好ましい。このような人工組織体は、培養中又は培養後における酵素による分解が起きにくく、安定である。
　人工組織体の製造方法の一実施形態は、フィブリノゲン及びトロンビンを同時に又は別々に混合することを含んでいてよい。フィブリノゲン及びトロンビンを混合することによって、これらが反応してフィブリンが形成される。フィブリノゲンの含有量は、例えば、培地に対して、１～１０ｍｇ／ｍＬであってよく、２～８ｍｇ／ｍＬであってよく、５～６ｍｇ／ｍＬであってもよい。
　以下に本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［試験例１：ウシ由来の脂肪組織からの脂肪由来幹細胞の回収及び脂肪由来幹細胞の培養］
　ウシ由来の脂肪組織から脂肪由来幹細胞を以下の手順で回収した。パーサン（登録商標）（エンビロテック社製、１５ｖ／ｖ％過酢酸、５ｖ／ｖ％過酸化水素、及び４５ｖ／ｖ％酢酸を含む。）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて０．２ｖ／ｖ％に希釈し、０．０３ｖ／ｖ％過酢酸、０．０１ｖ／ｖ％過酸化水素、０．０９ｖ／ｖ％酢酸を含む洗浄液を調製した。ウシ由来の脂肪組織を、上記洗浄液中に浸漬し、５分間洗浄した。さらに３回、ウシ由来の脂肪組織をＰＢＳで５分間洗浄した。その後、ウシ由来の脂肪組織の目に見える血管を取り除き、滅菌したピンセットとハサミでウシ由来の脂肪組織を細かく刻んで約３ｍｍサイズの小さな組織片を作製した。このウシ由来の脂肪組織片を、１ウェルあたり２ｇとなるように６ウェルプレートに移した。ウェルに３ｍＬの０．１％トリプシンを添加し、ウシ由来の脂肪組織片を２８０ｒｐｍ、３７℃で３０分間インキュベートし、ウシ脂肪組織片を細胞小塊に分散させた。その後、ウェルに１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む５ｍＬのＤＭＥＭを添加してトリプシンの反応を停止させ、分散したウシ脂肪組織片をピペッティングによってさらに分散させた。分散させた細胞を１０分間、１０００ｒｐｍで遠心して沈殿させ、沈殿した細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに懸濁した。この細胞懸濁液をメッシュサイズが４０μｍのセルストレーナーで濾過したのち、１０ｃｍディッシュに播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに３日間浸した。３日後に脂肪由来幹細胞が付着した１０ｃｍディッシュを５ｍＬのＰＢＳで５回洗浄して脂肪由来幹細胞を得た。回収した脂肪由来幹細胞は、ＤＭＥＭでコンフルエントの７０％に達するまで、２～３日ごとに培地交換を行った。培養２日後及び７日後の写真を順に図１（Ａ）～（Ｂ）に示す。
　過酢酸、過酸化水素、及び酢酸を含む溶液（洗浄液）でウシ由来の脂肪組織を洗浄することによって、ウシ由来の脂肪組織から、コンタミネーションなく増殖可能な脂肪由来幹細胞を回収できた（図１（Ａ）～（Ｂ））。
［試験例２：人工組織体の構築］
　ブタ皮膚由来コラーゲンＩ型スポンジ断片（日本ハム株式会社製）から、常法により解繊されたコラーゲン成分（ＣＭＦ）を含む分散液を得た。分散液を常法によって凍結乾燥させることにより、乾燥体として、解繊コラーゲン成分（ＣＭＦ）を得た。使用の際には、血清を含む培地（ＤＭＥＭ）にて濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように断片化コラーゲンを分散させて使用した。上記解繊コラーゲン成分１．２重量％（最終濃度）、６ｍｇ／ｍＬ（最終濃度）フィブリノゲン、３Ｕ／ｍＬ（最終濃度）トロンビン、５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの試験例１で回収した脂肪由来幹細胞を含むＦＢＳ非含有ＤＭＥＭ　２μＬを、９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社製）上に播種し１５分インキュベートした後、ＤＭＥＭ　２００μＬを加えて４８時間培養した。その後、エルカ酸、エライジン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、フィタン酸及びプリスタン酸各１００μＭ含有するＤＭＥＭ　２００μＬで培地交換を行い、２日ごとに培地を交換して培養し、脂肪由来幹細胞の成熟脂肪細胞への分化を誘導して人工組織体を得た。分化３日目（播種から５日目）、分化７日目（播種から９日目）及び分化１４日目（播種から１６日目）の人工組織体を、ナイルレッドにより脂質染色し、ヘキスト染色により核を染色し、共焦点定量イメージサイトメーターＣＱ（ＹＯＫＯＧＡＷＡ）を用いて蛍光観察した写真を順に図２（Ａ）～（Ｃ）に示す。
　分化１４日目には、人工組織体に大きな脂肪滴を有する細胞が確認され（図２（Ｃ））、試験例１における手法で回収した脂肪由来幹細胞は、成熟脂肪細胞へ分化したことがわかった。したがって、試験例１の手法にて動物組織から脂肪由来幹細胞をコンタミネーションなく回収でき、この幹細胞が増殖可能なだけでなく、成熟脂肪細胞への分化能も維持していることが示された。また、当該方法により回収した幹細胞を使用して培養肉の製造も可能であることが示された。
［試験例３：回収した脂肪由来幹細胞の継代回数による分化能への影響確認］
　試験例１に記載した方法により回収した脂肪由来幹細胞を、１０％のウシ血清を含むＩＭＥＭ培地下で培養し、１回、２回、３回、４回継代を行った脂肪由来幹細胞サンプルを用意した。（それぞれ、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５とする）。それぞれのサンプルを用いて、試験例２と同様の方法により人工組織体を構築した後、同様にして脂質及び核の染色をし、蛍光観察を行った。画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ、ＮＩＨ）を用いて、脂質染色（ナイルレッド）及び核染色（ヘキスト）の総蛍光強度を定量化し、核染色（ヘキスト）蛍光強度に対する、脂質染色（ナイルレッド）蛍光強度を算出した。その結果を図３に示す。図３の縦軸は、各サンプルにおいて算出された核染色（ヘキスト）蛍光強度に対する、脂質染色（ナイルレッド）蛍光強度比を、非分化条件で培養した組織における蛍光強度比によって標準化したものである。
　継代回数を増やすことにより、上記蛍光強度比がＰ４以降で最大化した。通常、がん化（不死化）していない細胞は継代を重ねると徐々に形質が変化し、その後の機能に良い影響を及ぼすことは期待されないが、試験例３の結果によれば驚くべきことに継代回数を増やすことにより脂肪由来幹細胞の分化能が向上することがわかった。この理由は明確には不明だが、脂肪由来幹細胞の回収工程後に細胞集団内にわずかに残留した他の細胞種が、脂肪細胞への分化に不測の悪影響を与えており、継代を重ねることによりそれらの細胞種が死滅したことによって幹細胞の純度が向上し、分化効率が向上した可能性がある。

Claims (11)

  1. 　動物組織の少なくとも表面と洗浄液とを接触させる工程を備え、
    　前記洗浄液は、過酢酸、過酸化水素、及び酢酸を含む溶液である、動物組織から幹細胞を回収する方法。
  2. 　前記洗浄液は、０．０３ｖ／ｖ％以上０．０７５ｖ／ｖ％以下の過酢酸、０．０１ｖ／ｖ％以上０．０２５ｖ／ｖ％以下の過酸化水素、及び０．０９ｖ／ｖ％以上０．２２５ｖ／ｖ％以下の酢酸を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記動物組織と前記洗浄液とを接触させる時間が、５分以上１０分以下である、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記動物組織が、脂肪組織を含む、請求項１に記載の方法。
  5. 　前記動物組織が、ウシ由来の脂肪組織を含む、請求項１に記載の方法。
  6. 　前記幹細胞が、脂肪由来幹細胞を含む、請求項１に記載の方法。
  7. 　前記動物組織を複数の細胞小塊に分散させる工程を更に備える、請求項１に記載の方法。
  8. 　前記複数の細胞小塊を接着培養し、非接着細胞を除去する工程、及び／又は前記複数の細胞小塊を幹細胞用培地で培養する工程を更に備える、請求項７に記載の方法。
  9. 　少なくとも１回継代することを含む、請求項８に記載の方法。
  10. 　前記幹細胞が、培養肉製造用である、請求項１に記載の方法。
  11. 　請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法を実施し、動物組織から幹細胞を回収する工程、及び回収した幹細胞を分化誘導培養し、人工組織体を構築する工程を備える、培養肉の製造方法。
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