JP6581650B2 - 温度感応性グリコールキトサン誘導体を利用したスフェロイド形成用培養容器及びそれを利用したスフェロイドの形成方法 - Google Patents
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Description
下記化学式1のグリコールキトサン誘導体が、培養空間の表面にコーティングされたスフェロイド形成用培養用器を提供する。
<化学式1>
(前記化学式1において、
R1はC1〜C18のアルキル基であり、
x、y、zは10乃至10000の整数であって、これらのモル%は0.05≦x≦0.8、0.05≦y≦0.15及び0.05≦z≦0.9である。)
本発明では、特定温度で可逆的なゾル−ゲル転移を行う温度感応特性を有するグリコールキトサン誘導体を利用した細胞培養を介して、3次元細胞組織であるスフェロイドを形成する方法を提示する。
(前記化学式1において、
R1はC1〜C18のアルキル基であり、
x、y、zは10乃至10000の整数であって、これらのモル%は0.05≦x≦0.8、0.05≦y≦0.15及び0.05≦z≦0.9である。)
下記反応式1に示したように、反応器に、アセチル化されたグリコールキトサン10g(重量平均分子量400kDa、アセチル化度9.34±2.50%(1H NMR測定したとき)、Sigma−Aldrich、Inc.、USA)を、蒸留水100mlに溶解した後、グリコールキトサンとヘキサン酸無水物とのモル比が0.4になるようにヘキサン酸無水物を添加し、常温で48時間攪拌した。
前記で製造した−NHアルキルアシルグリコールキトサンの合成の成否の如何を確認するために、1H−NMR分析を行い、得られた結果を図1に示した。
前記で製造した−NHアルキルアシルグリコールキトサンの合成の成否の如何を確認するためにFT−IR分析を行って、得られた結果を図2に示した。試片はKBrペレットとして製造し、750〜4000cm−1の範囲で測定した。グリコールキトサンとN−ヘキサノイル・グリコールキトサンの、それぞれのスペクトルにおいて、カルボニル結合(C=O)の伸縮振動を示す波長(1665cm−1)と、C−Hの伸縮振動を示す波長(2880〜2890cm−1)とをいずれも確認しており、グリコールキトサンのスペクトルでは、1級アミン結合の曲げ振動を示す吸収波長が1596cm−1で示された。N−ヘキサノイル・グリコールキトサンのスペクトルでは1596cm−1でのピークが消えており、1555cm−1でアミド結合(N−H)の曲げ振動を示す吸収波長を確認した。
前記で製造した−NHアルキルアシルグリコールキトサンをPBSに4wt%濃度で希釈した後、ゾル−ゲル挙動を確認した。
グリコールキトサン0.2g(重量平均分子量400kDa、アセチル化度9.34±2.50%(1H NMR測定したとき、Sigma−Aldrich、Inc.、USA)を、25mlの蒸留水に溶解した後、25mlのメタノールを添加して希釈した。得られた溶液に、予め計算された含量の無水酢酸(Sigma−Aldrich、Inc.、USA)をマグネティックスターラーで攪拌しながら添加した。
図4に示したように、直径35mmのペトリ皿に4wt%でDMEM培地に溶かされたグリコールキトサンとN−ヘキサノイル・グリコールキトサンをそれぞれ250μlずつ追加し、底面全体に、均一に広がるように、針のない注射器の先を利用して塗布した。コーティングされたペトリ皿を37℃、5%CO2インキュベータにover−night(O/N)で保管した。一日後、培養したラット胎子の心筋細胞を、トリプシン酵素で処理して単一細胞として浮遊させた。血清が含有された培地でトリプシンを不活性化させた後、遠心分離して細胞を集めた。集められた細胞を新たな培地に移動させ、細胞を計数した。計数した細胞は、採集培地ボリュームを3mlに合わせて、コーティングされた35mmペトリ皿に追加した。37℃、5%CO2インキュベータにて一日ほど培養した。一日後、細胞が凝集されたかについて顕微鏡により確認した。
直径35mmのペトリ皿に4wt%でDMEM培地に溶かされたマトリゲル(BD−matrigel)、N−アセチル・グリコールキトサンとN−ヘキサノイル・グリコールキトサンをそれぞれ250μlずつ追加し、底面全体に、均一に広がるように、針のない注射器の先を利用して塗布した。コーティングされたペトリ皿に、臍帯血幹細胞由来の血管前駆細胞を6×104個/100μlを敷き、37℃、5%CO2インキュベータにて24時間培養した。一日後、細胞が凝集されたかについて顕微鏡により確認した。その結果を図5に示した。
96−ウェルプレートにコラーゲンをコーティングした。ラット胎子から分離した心筋細胞を2×104個/100μl敷いた。翌日、1wt%に希釈した、グリコールキトサン、N−ヘキサノイル・グリコールキトサンを培地として敷いた。細胞を敷いた翌日を1日と計算し、1、3、5、7日間隔で新しい培地に切り替えながら、日別にMTT分析を行って日にちによる細胞の増殖率を確認した。
グリコールキトサンとN−ヘキサノイル・グリコールキトサンが心筋細胞の3次元スフェロイド形成にいかなる影響を及ぼすのかを確認するために、ペトリ皿、グリコールキトサンコーティング皿、そしてN−ヘキサノイル・グリコールキトサンコーティング皿に、それぞれ、心筋細胞の濃度を多様にして培養した。
心筋細胞と同様の類似した結果が出るのかを確認するために、他の細胞を利用して同じ実験を行った。使用した細胞は軟骨細胞であって、多様な細胞数をN−ヘキサノイル・グリコールキトサンコーティング皿に分注して2日後に観察した。その結果を図10に示した。図10に示したように、心筋細胞とは異なり、対照群のペトリ皿でも軟骨細胞スフェロイドがよく形成されており、N−ヘキサノイル・グリコールキトサンでは、より少数の細胞でもスフェロイドをよく形成することを観察した。
従来の、スフェロイドを製作する方法のうち、懸滴培養法は、重力を利用する方法であって、これは細胞が混合された培地を一滴ずつペトリ皿の蓋に落として覆い被せるのである。一定の大きさのスフェロイドを製造することができる長所があるが、多数のスフェロイドを製造するほど、時間が長くかかり、扱いが容易でないという短所がある。1000個のスフェロイドを製造する際に要する時間を、N−ヘキサノイル・グリコールキトサンコーティング皿と比べて、図11に示した。
Claims (11)
- 下記化学式1のN−ヘキサノイル・グリコールキトサン誘導体が、培養空間の表面にコーティングされたスフェロイド形成用培養容器。
<化学式1>
(前記化学式1において、
R1はC5のアルキル基であり、
x、y、zは10乃至10000の整数であって、これらのモル%は0.05≦x≦0.8、0.05≦y≦0.15及び0.05≦z≦0.9である。) - 前記化学式1のN−ヘキサノイル・グリコールキトサン誘導体は、置換度が20〜95%であることを特徴とする請求項1に記載のスフェロイド形成用培養容器。
- 前記N−ヘキサノイル・グリコールキトサン誘導体は、重量平均分子量が200〜5,000,000であることを特徴とする請求項1に記載のスフェロイド形成用培養容器。
- 前記N−ヘキサノイル・グリコールキトサン誘導体は、相転移臨界温度以上の温度では、化学架橋を形成せずに形成される、ヒドロゲルを形成することを特徴とする請求項1に記載のスフェロイド形成用培養容器。
- 前記相転移臨界温度は37℃以下であることを特徴とする請求項4に記載のスフェロイド形成用培養容器。
- 細胞培養の際、下記化学式1のN−ヘキサノイル・グリコールキトサン誘導体が、培養空間の表面にコーティングされた培養容器を使用するスフェロイドの形成方法。
<化学式1>
(前記化学式1において、
R1はC5のアルキル基であり、
x、y、zは10乃至10000の整数であって、これらのモル%は0.05≦x≦0.8、0.05≦y≦0.15及び0.05≦z≦0.9である。) - 前記化学式1のN−ヘキサノイル・グリコールキトサン誘導体は、置換度が20〜95%であることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 前記N−ヘキサノイル・グリコールキトサン誘導体は、重量平均分子量が200〜5,000,000であることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 前記N−ヘキサノイル・グリコールキトサン誘導体は、相転移臨界温度以上の温度では、化学架橋を形成せずに形成される、ヒドロゲルを形成することを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 前記相転移臨界温度は37℃以下であることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 前記N−ヘキサノイル・グリコールキトサン誘導体の相転移温度未満に温度を下げて、形成されたスフェロイドを分離することを特徴とする請求項6に記載の方法。
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