KR102038496B1 - 다공성막을 이용한 현적 세포 배양 기기, 이의 제조 방법, 이를 이용한 현적 세포 배양 방법, 및 현적 세포 배양 자동화 장치 - Google Patents

다공성막을 이용한 현적 세포 배양 기기, 이의 제조 방법, 이를 이용한 현적 세포 배양 방법, 및 현적 세포 배양 자동화 장치 Download PDF

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Abstract

배양액의 교환 및 외부 물질 주입이 가능한 현적 세포 배양 기기, 이의 제조 방법, 이를 이용한 세포 배양 방법, 및 현적 세포 배양 자동화 장치를 제공한다.

Description

다공성막을 이용한 현적 세포 배양 기기, 이의 제조 방법, 이를 이용한 현적 세포 배양 방법, 및 현적 세포 배양 자동화 장치{HANGING DROP CELL CULTURE DEVICE USING POROUS MEMBRANE, METHOD OF MANUFACTURING THE SAME, METHOD OF HANGING DROP CELL CULTURING, AND AUTOMATIC HANGING DROP CELL CULTURE DEVICE}
본 발명은, 현적 배양 기기, 이의 제조방법, 이를 이용한 현적 세포 배양 방법, 및 이를 이용한 현적 세포 배양 자동화 장치에 관한 것이다.
2차원적 세포 배양에서 3차원적 세포 배양으로의 발전은 제약 개발 분야, 기초 생물 분야 및 바이오 프린팅 분야 등의 발전에 엄청난 기여를 하였다. 현재 존재하는 3차원적 종양 스페로이드 형성 기술로서, 하이드로젤, 3차원적 지지체, 회전 배양 플라스크, 마이크로웰 스페로이드 배양 그리고 현적 배양 기기 등 다양한 방법들이 있다. 이러한 방법들은 다양한 분야에 활용될 일정한 크기의 동종 스페로이드를 형성하기에 이상적인 기술이다.
기존의 현적 배양 기술은 유리 또는 페트리 접시 위에 마이크로 리터 부피 (20-50 μl) 의 세포 배양 미디어를 올리면서 시행된다. 그 후, 유리 또는 패트리 접시를 뒤집는다. 이 물방울은 표면장력 때문에 떨어짐이 방지되며, 배양액 안에 매달려 있는 세포들은 중력으로 인해 정착되며, 배양액 내부에 정착되어 있는 세포들은 인접한 세포들과 상호작용하여 결합을 이루면서 3차원 스페로이드 또는 3차원 마이크로 조직을 형성한다. 이러한 기술에서의 가장 큰 어려움은 액적 (Droplet) 으로 부터의 배양액 교환과 액적 크기 조절이다.
본 발명의 구현예는, 배양액의 교체가 가능한 현적 세포 배양 기기, 이의 제조방법, 이를 이용한 현적 세포 배양 방법, 및 이를 이용한 현적 세포 배양 자동화 장치를 제공하고자 한다.
본 발명의 일 구현예는, 다공성막; 상기 다공성막에 위치하는 소수성부; 및 상기 소수성부로 둘러싸인 친수성부;를 포함하고, 상기 친수성부에서 세포 배양액의 액적이 현적되어 세포 배양이 이루어지고, 상기 다공성막을 통해 상기 친수성부에 형성된 액적 내 배양액의 교환 및 외부 물질 주입이 가능한 것인 현적 세포 배양 기기를 제공한다.
상기 다공성막은 친수성을 가지는 것일 수 있다.
상기 다공성막은 종이, 나이트로셀룰로오스, 실크, 면섬유, 중합체 다공성막, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
상기 다공성막은 기공 직경이 0.2 μm 이상 및 10 μm 이하인 것일 수 있다.
상기 다공성막은 두께가 0.04 mm 이상 및 0.5 mm 이하인 것일 수 있다.
상기 다공성막은 섬유상 입자가 무작위(random)로 배열된 것일 수 있다.
상기 친수성부는 직경이 0.5mm 이상 및 8mm 이하인 것일 수 있다.
상기 친수성부에 현적된 액적의 세로길이는 0.5 mm 이상 및 7 mm 이하인 것일 수 있다.
상기 친수성부에 현적된 액적은 20°이상 및 120°이하의 접촉각을 갖는 것일 수 있다.
상기 친수성부에 현적된 액적은 10 μl 이상 및 100 μl 이하의 부피를 갖는 것일 수 있다.
상기 친수성부에 현적된 액적에서 배양된 세포는 3차원적 스페로이드이고, 직경 50 μm 이상 및 2000 μm 이하인 것일 수 있다.
상기 소수성부는 소수성 중합체로 코팅된 것일 수 있다.
상기 소수성 중합체는 왁스, 테플론, 포토레지스트, 실란계 화합물, 폴리테트라 플루오로에틸렌 (Polytetrafluoroethylene), 왁스 (wax), 폴리디메틸실록산 (Poly dimethyl siloxane, PDMS), 실리콘(silicone), 금속 나노입자, 금속 산화물 나노입자, 실리카 나노입자, 중합체 나노 입자 또는 이들의 조합인 것일 수 있다.
상기 각각의 소수성부 간의 거리는 1 mm 이상 및 9 mm 이하인 것일 수 있다.
상기 다공성막에 위치하는 채널을 더 포함하고, 상기 채널은 2 이상의 친수성부를 연결하는 것이고, 상기 채널은 친수성부 사이의 상호작용이 가능하게 하는 것일 수 있다.
상기 채널의 너비는 0.1 mm 이상 및 2.5 mm 이하인 것일 수 있다.
상기 친수성부는 바이오 패시베이션(bio-passivation)코팅층을 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 바이오 패시베이션(bio-passivation)코팅층은 두께가 1 nm 이상 및 10 nm 이하인 것일 수 있다.
상기 친수성부에서 액적이 현적되는 면은 타면에 비해 친수성도가 감소된 표면인 것일 수 있다.
상기 세포 배양액에 포함된 세포는 포유류 세포의 단일 세포계 (primary cell line), 무한 증식 세포계 (continuous cell line), 줄기 세포, 종양 세포, 면역 세포, 박테리아 및 미생물 중에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
2 이상의 현적 세포 배양 단위체가 적층되고, 상기 현적 세포 배양 단위체는 다공성막; 상기 다공성막에 위치하는 소수성부; 및 상기 소수성부로 둘러싸인 친수성부;를 포함하고, 상기 다공성막을 통해 상기 친수성부에 형성된 액적 내 배양액의 교환 및 외부 물질 주입이 가능한 것이고, 가장 아래에 위치하는 현적 세포 배양 단위체의 친수성부에 세포 배양액의 액적이 현적되어 세포 배양이 이루어지는 것일 수 있다.
상기 1 이상의 현적 세포 배양 단위체는 상기 다공성막에 위치한 채널을 더 포함하고, 상기 채널은 2 이상의 친수성부를 연결하는 것이고, 상기 채널은 친수성부 사이의 상호작용이 가능하게 하는 것일 수 있다.
다공성막을 준비하는 단계; 상기 다공성막에 친수성부 및 소수성부를 형성하여 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계; 및 상기 현적 세포 배양 단위체를 2 이상 적층하는 단계;를 포함하는 현적 세포 배양 기기 제조방법을 제공한다.
상기 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계는 상기 친수성부를 연결하는 채널을 형성하는 것을 포함하는 것일 수 있다.
상기 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계는 친수성 다공성막에 소수성 물질을 인쇄하는 방식에 의해 수행되는 것일 수 있다.
상기 현적 세포 배양 단위체를 2 이상 적층하는 단계;는 현적 세포 배양 단위체의 상층과 하층의 친수성부가 중첩되도록 접는 방식에 의하여 현적 세포 배양 단위체를 적층하는 것일 수 있다.
상기 다공성막에 친수성부 및 소수성부를 형성하여 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계;이후에 상기 친수성부 표면처리 단계; 를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 친수성부 표면처리 단계;는 바이오 패시베이션(bio-passivation) 처리하는 단계; 또는 자외선 조사하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.
상기 친수성부 표면처리 단계;는 바이오 패시베이션(bio-passivation) 처리하는 단계; 및 자외선 조사하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.
현적 세포 배양 단위체로 구성된 현적 세포 배양 기기를 준비하는 단계; 배양하려는 세포를 포함하는 세포 배양액을 친수성부에 적하하여 세포 배양액의 액적을 형성하는 단계; 세포 배양액이 적하된 현적 배양 기기를 뒤집어서 세포 배양액의 액적을 현적시키는 단계; 세포 배양액의 액적이 현적된 상태로 세포를 배양하는 단계;를 포함하고, 상기 세포를 배양하는 단계;는 다공성막을 통하여 배양액을 교환하는 단계를 더 포함하는 것이고, 상기 현적 세포 배양 단위체는 다공성막; 상기 다공성막에 위치하는 소수성부; 및 상기 소수성부로 둘러싸인 친수성부;를 포함하고, 상기 다공성막을 통해 상기 친수성부에 형성된 액적 내 배양액의 교환 및 외부 물질 주입이 가능한 것이고, 가장 아래에 위치하는 현적 세포 배양 단위체의 친수성부에 세포 배양액의 액적이 현적되어 세포 배양이 이루어지는 것일 수 있다.
상기 세포 배양액이 적하된 현적 배양 기기를 뒤집어서 세포 배양액의 액적을 현적시키는 단계; 이후에 상기 다공성막을 통해 배양액을 추가하거나 제거하여 액적의 크기를 조절하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 세포를 배양하는 단계;는 다공성막을 통하여 외부 물질을 투입하는 단계;를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 현적 세포 배양 기기는 채널을 포함하는 것이고, 상기 채널은 2 이상의 친수성부를 연결하는 것이고, 상기 채널은 친수성부 사이의 상호작용이 가능하게 하는 것이고, 상기 세포 배양액의 액적을 형성하는 단계;는 1종 이상 세포 배양액을 채널로 연결된 각각의 친수성부에 적하하여 세포 배양액의 액적을 형성하는 것이고, 상기 세포를 배양하는 단계;는 세포 배양액의 액적이 현적된 상태로 채널을 통해 각각의 세포 스페로이드 간의 상호 작용이 이루어지며 세포를 배양하는 것일 수 있다.
복수의 현적 세포 배양 단위체를 포함하는 배양 시트; 상기 배양 시트를 이동시키는 구동모터; 상기 배양 시트 상부에 위치하며, 상기 현적 세포 배양 단위체의 친수성부에 세포 배양액을 적하하는 세포 배양액 투입장치; 를 포함하고, 상기 각각의 현적 세포 배양 단위체는, 다공성막; 상기 다공성막에 위치하는 소수성부; 및 상기 소수성부로 둘러싸인 친수성부;를 포함하고, 상기 친수성부에서 세포 배양액의 액적이 현적되어 세포 배양이 이루어지고, 상기 다공성막을 통해 상기 친수성부에 형성된 액적 내 배양액의 교환 및 외부 물질 주입이 가능한 것인, 현적 세포 배양 자동화 장치를 제공한다.
상기 배양 시트는 컨베이어 벨트 구조이며, 상하부로 체인 형태의 이동을 하는 것일 수 있다. 상기 배양 시트가 컨베이어 벨트 구조의 상부로 이동시, 상기 세포 배양액 투입장치로부터, 세포 배양액이 상기 배양 단위체의 친수성부에 적하되어 액적을 형성하는 것일 수 있다.
상기 배양 시트가 컨베이어 벨트 구조의 하부로 이동시, 상기 배양 단위체의 친수성부에 형성된 액적이 중력에 의해 현적되는 것일 수 있다.
상기 현적된 액적이 다시 상부 컨베이어 벨트 구조로 이동될 때, 시약을 상기 액적으로 투입하는 것일 수 있다.
상기 시약이 투입된 액적이 다시 하부 컨베이어 벨트 구조로 이동될 때, 상기 액적 내부의 세포 분석이 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 기기는, 배양액의 교환이 가능하여, 장기간 세포 배양이 가능하다. 또한, 외부 물질 주입이 가능하여, 외부 물질의 영향에 의한 세포 변화 연구에도 적용 가능하다.
본 발명의 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 단위체를 다층으로 구성하여, 세포 간 상호작용 연구에 활용 가능하다.
도 1 에서 본 발명의 일 구현예인 현적 세포 배양 기기를 구조를 나타내었다
도 2 은 본 발명의 일 구현예로서, 친수성 재질의 다공성막에 소수성인 왁스 프린팅된 현적 세포 배양 기기를 이용한 세포 현적 배양 기술에 관한 실험 모식도이다.
도 3 은 본 발명의 일 구현예에 따른 종이 기반 현적 배양 기기 (PHDC, Paper Hanging Drop Chip)에 현적된 액적을 친수성부의 다양한 지름과 그에 따른 수용할 수 있는 액적 부피 간의 관계를 나타낸 결과이다.
도 4 은 특정 지름을 가진 친수부에 따른 액적 부피와 액적 세로길이의 관계이다.
도 5 은 친수성부의 액적 접촉각을 측정함으로써, 액적 최대 수용 부피 및 액적 안정성에 대한 실험결과이다.
도 6 은 채널이 형성된 PHDC(Networked PHDC, N-PHDC)에서의 다양한 너비의 채널에서의 시간에 따른 농도 구배 형성에 대한 결과 이다.
도 7는 다양한 종류의 디쉬에 조립된 본 발명의 일 구현예인 PHDC의 이미지를 나타낸 것이다.
도 8 은 본 발명의 일 구현예인 PHDC 및 N-PHDC를 이용한 세포 주입, 배양 및 분석 자동화 기기에 관한 모식도이다.
도 9 은 본 발명 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 기기 제조방법의 개략도이다.
도 10 은 본 발명의 일 구현예인 복수개의 친수성부가 채널에 의해 연결되어 있는 N-PHDC 를 이용하여 농도 구배 형성 및 약물 검사에 활용한 결과이다.
도 11 은 본 발명의 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 기기 제조과정의 모식도이다.
도 12 은 소수성 중합체 프린팅된 친수성 다공성막을 이용한 3차원 세포 현적 배양 장치의 친수성부 표면처리 단계의 개략도이다.
도 13 은 친수성부에 표면 처리 수행 후, 액적 유지시간 및 단백질 비특이적 결합 정도에 대한 실험 결과이다.
도 14 은 본 발명 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 방법의 개략도이다
도 15 은 본 발명의 일 구현예인 N-PHDC에서의 3차원 스페로이드의 농도 구배 내에서의 화학 주성 반응 실험 결과이다.
도 16 은 본 발명의 일 구현예인 PHDC를 이용하여 항암제(5FU)에 대한 일반 세포(CCD 1058sk)와 종양 세포(MDA-MB 231) 약물 검사 및 면역 반응 관련 실험 결과이다.
도 17 은 본 발명의 일 구현예에 따른 PHDC 에서의 종양 스페로이드 형성 이미지이다.
도 18 은 PHDC에서 배양된 스페로이드와 기존 현적 배양 방법인 패트리 디쉬(Petri-dish)에서 배양한 스페로이드와의 비교 결과이다.
도 19 은 PHDC에서의 다양한 세포들을 공동 배양했을 경우 스페로이드의 직경 변화에 관한 실험 결과이다
도 20 은 적층 방식에 의해 제조되고, 채널을 포함하는 현적 세포 배양 기기를 이용하여 유방암 세포 (MDA-MB 231)만 단일 배양한 경우와 유방암 세포 (MDA-MB 231) 및 섬유아세포 (MEF)를 채널이 형성된 친수성부에서 상호가능한 상태에서 배양한 경우 배양된 세포 결합 상태 비교를 위한 전자 주사 현미경 이미지이다.
본 명세서에서 사용되는 전문 용어는 단지 특정 실시 예를 언급하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것을 의도하지 않는다. 여기서 사용되는 단수 형태들은 문구들이 이와 명백히 반대의 의미를 나타내지 않는 한 복수 형태들도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함하는"의 의미는 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소 및/또는 성분을 구체화하며, 다른 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소 및/또는 성분의 존재나 부가를 제외시키는 것은 아니다. 다르게 정의하지는 않았지만, 여기에 사용되는 기술용어 및 과학용어를 포함하는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 가진다. 보통 사용되는 사전에 정의된 용어들은 관련기술문헌과 현재 개시된 내용에 부합하는 의미를 가지는 것으로 추가 해석되고, 정의되지 않는 한 이상적이거나 매우 공식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함” 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 명세서 전체에서, “~상에”라 함은 대상 부분의 위 또는 아래에 위치함을 의미하는 것이며, 반드시 중력 방향을 기준으로 상 측에 위치하는 것을 의미하는 것은 아니다.
본 명세서에서 액적의 세로길이(Height of drop)는 다공성막의 표면을 기준으로 액적의 수직방향 길이를 의미하는 것으로 사용되며, 다공성막의 친수성부 아래쪽에 현적된 액적의 수직방향의 길이를 의미하는 것으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 채널의 너비란, 유체가 이동하는 방향과 수직된 방향의 길이로 채널의 폭을 의미한다.
기존의 현적 배양 기술에서의 가장 큰 어려움은 액적 (Droplet)으로 부터의 배양액 교환과 액적 크기 조절이다. 그러나, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 소수성 패턴을 인쇄 방법에 의하여, 다공성 재질에 제한된 친수성 공간을 형성하고, 배양할 세포들을 포함한 마이크로 리터 정도의 세포 배양액이 다공성막의 강한 모세관힘 (Capillary force)에 의해 제한된 친수성 공간에 현적되어 3차원 스페로이드가 형성된다. 이러한 다공성막을 사용함으로써, 주기적 배양액 교환이 가능하며, 세포 노폐물 제거와 새로운 배양액 주입을 통해 배양 기간을 연장할 수 있다. 또한, 다공성막의 친수성부의 직경을 제어하거나, 다공성막을 통한 배양액의 일부 추가 또는 제거를 통해 액적의 크기 조절이 가능하다.
또한, 본 발명의 일 구현예에서는 각 액적 간의 상호 작용이 가능한 채널을 간편하게 왁스 프린팅 방식을 이용하여 제작할 수 있으며, 사용자의 필요에 따라 디자인을 용이하게 변경하여 제작할 수 있는 이점이 있다.
이하, 본 발명의 구현예를 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 예시로서 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술할 청구범위의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
현적 세포 배양 기기
본 발명의 일 구현 예에서는,
다공성막 및 상기 다공성막에 위치하는 소수성부 및 상기 소수성부로 둘러싸인 친수성부를 포함하고, 상기 친수성부에서 세포 배양액의 액적이 현적되어 세포 배양이 이루어지고, 상기 다공성막을 통해 상기 친수성부에 형성된 액적 내 배양액의 교환 및 외부 물질 주입이 가능한 것인 현적 세포 배양 기기를 제공한다.
상기 주입되는 외부 물질은 실험 시약, 형광 염색제, 항암제와 같은 질병 치료제, 하이드로젤과 같은 세포 외 기질 단백질, 세포 일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
도 1 에서 본 발명의 일 구현예인 현적 세포 배양 기기를 구조를 나타내었다. 본 발명의 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 기기는 다공성막(1), 다공성막에 위치하는 1이상의 소수성부(3), 및 소수성부로 둘러싸인 1이상의 친수성부(2)를 포함할 수 있다. 또한, 2이상의 친수성부를 연결하여 상호작용이 가능하게 하는 채널(4)을 더 포함하는 것일 수 있다.
앞서 언급한 바와 같이 기존의 현적 배양 기술에서는 액적으로부터 배양액 교환이 어려운 문제가 있다.
그러나, 본 발명의 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 기기의 경우 다공성막을 통해 주기적인 배양액의 교환이 가능할 뿐만 아니라, 이러한 배양액 교체를 통해 1일에서 30일까지도 세포 배양이 가능하므로, 세포 배양 기간을 연장 가능한 이점이 있다. 또한, 다공성막을 통해 외부 물질 주입이 가능하므로, 외부 물질의 영향에 의한 스페로이드 변화 연구에도 적용 가능하며, 다공성막을 통해 배양액의 일부 추가 및 제거가 가능하므로, 액적 크기 조절이 용이하다는 장점이 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 도 2은 친수성 재질의 다공성막에 소수성인 왁스 프린팅된 현적 세포 배양 기기를 이용한 세포 현적 배양 기술에 관한 실험 모식도이다. 왁스 프린팅을 이용하여 친수성 다공성막 위에 소수성부 패턴을 프린팅한다. 세포 배양액을 친수성부 위에 떨어뜨린 후, 세포 배양 액적을 현적(suspend)시키기 위해 기기를 뒤집는다. 다공성막의 모세관 힘과 배양액의 표면장력의 상호작용을 통해 친수성부에 액적이 현적된다.
다공성 재질 윗부분을 통해 주기적인 배양액 교체가 가능하므로, 보다 장기적인 기간 동안 액적 지지하면서 세포 배양이 가능하다.
다공성막을 통하여 배양액을 일부 추가하거나, 일부 제거하는 것이 가능하므로, 형성되는 액적의 크기 조절이 가능하다. 그러나, 이는 본 발명의 일 구현예에 불과하며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서는 상기 다공성막은 친수성을 가지는 것일 수 있으며, 구체적으로 종이, 나이트로셀룰로오스, 실크, 면섬유, 폴리스타일렌 (Polystyrene), 폴리테트라플루오로에틸렌 (Polytetrafluoroetylene), 중합체 다공성막, 마이크로 또는 나노 사이즈의 패턴이 있는 다공성막 중에서 선택된 어느 하나로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구현예에서는 상기 다공성막은 기공 직경이 0.2 μm 이상 및 10 μm 이하인 것일 수 있으며, 구체적으로, 0.5 μm 내지 9 μm, 0.7 μm 내지 8 μm, 1 μm 내지 7 μm, 3 μm 내지 5 μm, 0.7 μm 내지 3 μm, 4 μm 내지 10 μm, 또는 0.2 μm 내지 6 μm 일 수 있다. 기공 직경이 너무 큰 경우 세포 배양액을 친수성부에 적하할 때에 세포들이 다공막에 걸려 스페로이드 형성에 이용되는 세포 수가 감소할 문제가 있고, 기공 직경이 너무 작은 경우 다공성막을 통해 영양 배지 교환에 어려움을 갖는 문제가 발생할 수 있으며, 상기 기공 범위를 만족하는 경우 세포가 다공성막에 걸리는 문제를 방지할 수 있으며, 세포 배양을 위한 영양 배지 뿐만 아니라, 추후 분석 실험을 위한 시약 교환을 용이하게 할 수 있는 효과가 있다.
상기 다공성막은 두께가 0.04 mm 이상 및 0.5 mm 이하인 것일 수 있으며, 구체적으로 0.05 mm 이상 및 0.4 mm 이하, 0.07 mm 이상 및 0.3 mm 이하, 0.1 mm 이상 및 0.2 mm 일 수 있다. 다공성막의 두께가 얇은 경우 특정 부피 이상의 액적을 지지하는데 어려움이 있고, 두꺼운 경우 다공성막이 흡수할 수 있는 용액 부피가 너무 커, 추후 분석 실험이 어려운 문제가 있으며, 상기 다공성막의 두께 범위를 만족하는 경우 세포 배양에 필요한 액적 부피를 안정적으로 지지할 수 있고, 적은 시약 부피를 이용하여서도 추후 분석 실험이 가능한 효과가 있습니다.
상기 다공성막은 섬유형(fiber) 입자로 구성된 것일 수 있으며, 예를 들어 셀룰로오스 섬유일 수 있다. 구체적으로, 비단 섬유, 면 섬유 등이 사용될 수 있다.
상기 섬유형 입자가 일렬로 배열된 것일 수도 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 섬유형 입자가 무작위(random)로 배열된 형태일 수도 있다. 섬유상 입자의 배열이 무작위로 배열된 섬유형 입자의 경우, 시약이나 세포간의 신호 교신이 섬유 배열 방향에 영향을 받지 않고 균일한 모세관 힘과 확산으로 모든 방면으로 균일하게 전달될 수 있다는 효과가 있다.
종래 현적 배양 기술은 액적의 크기를 조절하기 어려운 문제점이 있었으나, 본 발명의 일 구현예에 따르면 친수성부의 형태 또는 직경을 제어함으로써, 형성되는 액적의 직경, 부피, 접촉각 등을 제어 가능하여 효과적으로 현적 배양이 가능하다.
상기 다공성막에 형성된 친수성부는 직경이 0.5mm 이상 및 8mm 이하인 것일 수 있다. 구체적으로, 2mm 이상 및 8mm 이하, 2 mm 이상 및 6 mm이하, 2 mm 이상 및 5 mm 이하, 3 mm 이상 및 5 mm 이하, 4 mm 이상 및 5 mm 이하, 2 mm 이상 및 4 mm 이하, 5mm 이상 및 6mm 이하 또는 0.5 mm 이상 및 6 mm 이하 일 수 있다. 친수성부의 직경이 너무 작은 경우 현적될 수 있는 액적의 부피가 너무 작아 세포 배양이 효과적으로 이루어지지 않을 수 있으며, 직경이 너무 큰 경우 적절한 액적 접촉각을 형성하기 위해 많은 양의 용액이 필요하고, 이로 인한 표면 면적이 넓어지면 액적 증발이 심해지는 문제가 있다. 따라서, 상기 직경범위를 만족하는 경우 적절한 부피의 액적이 안정적으로 현적되어 세포 배양에 충분한 영양분 제공할 수 있고, 배양 기간 동안 배양액이 마르는 문제를 방지함으로써, 효과적으로 세포 배양이 가능하다.
상기 친수성부에 형성된 액적은 10 μl 이상 및 100 μl 이하의 부피를 갖는 것일 수 있으며, 구체적으로 10 μl 이상 및 90 μl 이하, 10 μl 이상 및 80 μl 이하, 20 μl 이상 및 70 μl 이하, 20 μl 이상 및 50 μl 이하, 20 μl 이상 및 30 μl 이하, 30 μl 이상 및 40 μl 이하, 10 μl 이상 및 30 μl 이하 인 것일 수 있다. 현적 세포 배양 기기를 통해 세포를 배양하는 경우 친수성부에 형성된 액적의 부피는 세포 배양이 이루어지는 공간인 액적 내부 부피와 관련된다. 친수성부에 형성된 액적의 부피가 너무 큰 경우 액적의 질량 때문에 친수성부에 액적이 안정적으로 형성될 수 없고, 액적의 부피가 너무 작은 경우 세포 배양이 잘 이루어지지 않는 문제가 발생할 수 있으며, 상기 액적 부피 범위를 만족하는 경우 충분한 액적 내부 부피를 확보하고, 세포 배양에 충분한 영양분 제공 및 배양 기간동안 배양액이 마르는 문제를 방지함으로써 효율적으로 세포 배양이 이루어질 수 있을 뿐만 아니라, 다공성막을 통한 주기적 배양액 교환을 통해 오랜 기간 동안 안정적인 액적 지지가 가능하다,
친수성부의 직경은 그 친수성부에 형성되는 액적의 부피와 관련된다.
도 3 에서는 본 발명의 일 구현예인 종이 기반 현적 배양 기기 (PHDC, Paper Hanging Drop Chip)에 친수성부의 직경에 따른 수용할 수 있는 액적의 부피를 측정하였다. 친수성부의 직경이 2mm인 경우 액적의 부피가 40 μl되는 경우 더 이상 친수성부에 지지되지 못하고 분리되어 물방울로 떨어지게 되며, 10 μl에서 현적 배양에 가장 안정적인 액적을 형성한다. 친수성부의 직경이 3mm인 경우 액적의 부피가 60μl되는 경우 더 이상 친수성부에 지지되지 못하고 분리되어 물방울로 떨어지게 되며, 20 μl에서 현적 배양에 가장 안정적인 액적을 형성한다.
친수성부의 직경이 4mm인 경우 액적의 부피가 80 μl되는 경우 더 이상 친수성부에 지지되지 못하고 분리되어 물방울로 떨어지게 되며, 30 μl에서 현적 배양에 가장 안정적인 액적을 형성한다. 친수성부의 직경이 5mm인 경우 40 μl에서 현적 배양에 가장 안정적인 액적을 형성한다. 즉, 친수성부의 직경이 증가함에 따라 현적 가능한 액적의 부피도 증가하게 되며, 현적 배양에 가장 안정적인 액적 부피도 증가함을 알 수 있으며, 이처럼 특정 지름의 친수성부에서 현적 배양하기에 가장 안정적인 액적 부피가 있음을 확인하였다.
상기 친수성부에 형성된 액적의 세로길이는 0.5 mm 이상 및 7 mm 이하인 것일 수 있으며, 구체적으로, 0.5 mm 이상 및 4 mm 이하, 0.5 mm 이상 및 3.7 mm 이하, 0.5 mm 이상 및 3 mm 이하, 또는 1.3 mm 이상 및 3 mm 이하, 1.7 mm 이상 및 3 mm 이하, 1.7 mm 이상 및 2.5 mm 이하, 또는 0.5 mm 이상 및 4 mm 이하 일 수 있다.
도 4 는 친수성부의 지름에 따른 친수성부에 현적된 액적의 부피 및 액적의 세로길이의 관계를 나타낸다. 똑같은 액적 부피에서 친수성부의 지름이 클수록, 액적의 세로길이는 작은 것을 볼 수 있으며, 더 많은 액적 부피를 유지할 수 있음을 보여준다. 예를 들어, 30 μl의 액적 부피는, 2 mm 친수성부 지름에서 약 4 mm 의 액적 세로길이를 보였으며, 5 mm 친수성부 지름에서는 약 2 mm 의 액적 세로길이를 보였다.
친수성부에 현적된 액적의 지름이 너무 큰 경우 액적의 유지가 불안정할 수 있고, 친수성부에 지지되지 못하고 떨어지는 문제가 발생할 수 있고, 너무 작은 경우 형성되는 액적의 크기가 너무 작아 현적 배양에 충분한 공간을 확보할 수 없는 문제가 있다. 따라서, 상기 액적 지름 범위를 만족하는 경우 안정적인 액적을 형성할 수 있으며, 충분한 액적 내부 부피를 확보함으로써, 세포 배양에 충분한 영양분 제공하고, 배양 기간 동안 배양액이 마르는 문제를 방지함으로써 효율적으로 세포 배양이 이루어질 수 있을 뿐만 아니라, 친수성부에 오랜 기간 동안 안정적인 현적 세포 배양이 가능하다.
상기 친수성부에 현적된 액적은 20°이상 및 120°이하의 접촉각을 갖는 것일 수 있다. 친수성부에 현적된 액적의 접촉각은 친수성부의 직경 또는 현적되는 액적의 크기에 따라 달라질 수 있으며, 구체적으로 20°이상 및 120°이하, 40°이상 및 110°이하, 60°이상 및 110°이하, 80°이상 및 110°이하, 또는 70°이상 및 110°이하, 80°이상 및 120°인 것일 수 있다.
도 5A에서는 본 발명의 일 구현예에 따라 친수성부의 직경을 달리하여 친수성부에 현적된 액적의 접촉각을 측정함으로써, 액적의 최대 수용 부피 및 액적의 안정성을 보여주고 있다. 가장 큰 액적 접촉각을 보이는 조건을 통해, 다양한 친수성부에서 액적의 안정성을 보여주었으며, 또한 접촉각 경향을 보이는 조건을 통해, 다양한 친수성부 조건에서의 액적의 수용범위 또한 보여주었다.
본 명세서에서 접촉각은 도 5B와 같이 고체 표면과 액체 표면이 이루는 각도를 액체 안쪽에서 측정한 값(θ)을 의미한다.
친수성부에 현적된 액적의 접촉각이 너무 큰 경우 친수성부에 액적이 안정적으로 형성되지 못하고, 장기간 세포 배양이 어려울 수 있으며, 접촉각이 너무 작은 경우 형성된 액적 내부의 부피가 너무 작아 현적 세포 배양에 충분한 공간을 확보하지 못하여 세포 배양이 효과적으로 수행될 수 없는 문제가 있으며, 상기 액적의 접촉각 범위를 만족하는 경우 세포 배양에 충분한 부피의 액적을 안정적으로 형성 가능하며, 충분한 액적 내부 부피를 확보함으로써, 세포 배양에 충분한 영양분을 제공하고, 배양 기간 동안 배양액이 마르는 문제를 방지함으로써 효율적으로 세포 배양이 이루어질 수 있을 뿐만 아니라, 친수성부에 오랜 기간 동안 안정적으로 현적 세포 배양이 가능하다.
상기 친수성부에 현적된 액적에서 배양된 세포는 3차원적 스페로이드이고, 직경 50 μm 이상 및 2000 μm 이하인 것일 수 있다. 구체적으로 50 μm 이상 및 1800 μm 이하, 50 μm 이상 및 1500 μm 이하, 80 μm 이상 및 1000 μm 이하, 50 μm 이상 및 500 μm 이하, 또는 50 μm 이상 및 1000 μm 이하인 것일 수 있다. 상기 스페로이드의 직경이 너무 큰 경우, 스페로이드 중간에 위치하는 세포들이 영양분, 산소, 또는 이산화탄소에 대한 접근이 어려워 심각한 괴사 상태가 발생하는 문제가 있고, 너무 작은 경우, 3차원 스페로이드 형성의 목적인, 생체 내(in vivo) 모방에 차이를 보일 수 있다는 문제가 있으며, 상기 범위를 만족하는 경우, 다양한 질병 사례를 생체내(in vivo)와 가장 비슷하게 모방할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 일 구현예에서는 다공성막에 형성된 친수성부의 형태는 원형으로 형성된 것이지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 원형, 사각형, 타원형 등 다양한 모양으로 형성될 수 있다. 또한, 친수성부는 기공을 포함하는 것일 수 있다.
하나의 친수성부에는 1종의 세포만을 배양할 수도 있으며, 2종 이상의 세포를 공동 배양하는 것도 가능하다.
상기 다공성막에 형성된 소수성부는 다공성막에 소수성 중합체가 코팅된 것일 수 있으며, 구체적으로 소수성 중합체는 왁스, 테플론, 포토레지스트, 실란계 화합물, 또는 폴리테트라 플루오로에틸렌 (Polytetrafluoroethylene), 왁스 (wax), 피디엠에스 (Poly dimethyl siloxane), 실리콘(silicone), 금속 나노입자, 금속 산화물 나노입자, 실리카 나노입자, 중합체 나노 입자, 또는 이들이 조합된 것일 수 있으며, 금속 나노 입자는 구체적으로 금, 은, 구리, 백금 등일 수 있다. 그러나, 이는 본 발명의 일 구현예이며, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 소수성부 형성 방법에 적합한 해당 기술분야에서 통상적으로 사용될 수 있는 소수성 중합체가 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는 소수성 중합체로서 왁스를 인쇄 방식을 통하여 다공성막에 소수성 패턴을 프린팅하는 방법을 개시하고 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다.
상기 각각의 소수성부 간의 거리는 1 mm 이상 및 9 mm 이하인 것일 수 있으며, 구체적으로 1 mm 이상 및 8 mm 이하, 2 mm 이상 및 7 mm 이하, 3 mm 이상 및 6 mm 이하, 4 mm 이상 및 6 mm 이하, 4 mm 이상 및 9 mm 이하, 또는 1 mm 이상 및 9 mm 이하인 것일 수 있다. 소수성부 간의 거리가 너무 좁은 경우, 친수성 패턴에 위치한 액적이 합쳐져 액적이 무너질 가능성이 높은 문제가 있고, 너무 넓은 경우, 현적 배양 기기 하나당 형성할 수 있는 액적 수가 제한적이어서, 대량 신속 처리 (highthroughput) 분석에 한계를 가질 문제가 있으며, 상기 소수성부 간의 거리를 만족하는 경우, 충분한 액적 내부 간의 거리를 확보함으로써, 액적 간의 중첩될 위험을 방지하여, 안정적인 현적 세포 배양이 가능할 뿐만 아니라, 많은 수의 액적을 동시에 형성할 수 있음으로, 대량 신속 처리 (highthroughput) 분석 또한 활용 가능하다.
본 발명의 일 구현예에서는 다공성막에 위치하는 채널을 더 포함할 수 있으며, 상기 채널은 친수성을 가지는 것일 수 있으며, 2 이상의 친수성부를 연결하여 상기 채널로 연결된 친수성부 및 친수성부에 형성된 액적 사이의 상호작용이 가능하도록 하는 것일 수 있다. 이러한 채널을 포함하는 현적 세포 배양 기기를 이용하여 세포를 배양함으로써, 서로 다른 액적 내부의 배양 세포의 상호작용 연구가 가능하다. 또한, 채널로 연결된 각각의 친수성부에 종류가 다른 세포를 배양하는 경우 이종 세포 간의 상호작용 연구에도 활용 가능하다는 장점이 있다.
상기 채널의 너비는 0.1 mm 이상 및 2.5 mm 이하인 것일 수 있으며, 구체적으로, 0.1 mm 이상 및 1.5 mm 이하, 0.1 mm 이상 및 1 mm 이하, 0.3 mm 이상 및 2.0 mm 이하, 0.1 mm 이상 및 0.7 mm 이하, 또는 0.1 mm 이상에서 2.0 mm 이하인 것일 수 있다. 채널의 너비가 너무 넓으면, 모세관 힘이 커져서 친수성부 액적의 형태를 유지하기 어려울 수 있고, 너무 좁으면 모세관 힘이 작아져서 유체간 이동에 어려운 문제가 있으며, 상기 범위를 만족하는 경우에는 적당한 모세관 힘으로 인해 친수성부 액적 모양 유지도 가능하며, 채널을 통한 유체간 이동도 원활하게 이루어질 수 있다.
도 6 은 본 발명의 일 구현예에 따른 채널이 형성된 PHDC(Networked PHDC, N-PHDC)에서의 다양한 너비의 채널에서의 시간에 따른 농도 구배 형성에 대한 결과 이다. 본 발명에서는 3개의 친수성부가 채널로 연결되어 상호작용 가능한 현적 세포 배양 기기 (N-PHDC)를 제작하였으며, 채널 너비를 0.5mm와 1mm로 다양하게 하여 시간의 흐름에 따른 농도 구배가 형성됨을 확인하였다. 이 실험을 통해, 모세간힘 및 확산 작용에 의해, 중간 원천부로부터 다양한 채널 너비에 따른 다양한 농도 구배 형성이 가능함을 보여주었다. 이 실험에서는, 0.5 Mole/ml 형광 소디움 염 (fluorescein sodium salt)을 포함한 용액을 중심에 위치한 친수성부 (원천부)에 주입하고 상대적인 형광 세기를 측정함으로써 형광 소디움 염의 농도를 구할 수 있으며, 이를 통해 다양한 너비의 채널을 통해 다른 확산 계수를 가짐을 볼 수 있었다.
상기 채널의 길이는 0.5 mm 이상 및 15 mm 이하인 것일 수 있으며, 채널의 길이를 조절함으로써, 친수성부 및 친수성부에 형성된 액적 간의 상호 작용을 조절할 수 있다.
도 5, 및 도 10을 살펴보면, 상기 채널의 너비 및 길이를 조절함으로써, 다양한 시약의 농도 구배를 형성할 수 있으며, 이를 이용한 다양한 실험, 예를 들어 화학주성, 세포 이동, 조직 개조, 약물 검사 등에 활용 가능하다.
도 10 은 본 발명의 일 구현예인 복수개의 친수성부가 채널에 의해 연결되어 있는 N-PHDC 를 이용하여 농도 구배 형성 및 약물 검사에 활용한 결과이다. 이를 활용하여 도 10C, E에서 보듯이, 다양한 채널 너비를 이용하여, 3차원 스페로이드의 5FU(5-FLUOROURACIL)항암제 효과를 다양한 농도에서 PHDC와 N-PHDC를 이용하여 확인하였다. 주변 친수성부에 3차원 스페로이드 형성을 위해 48 시간동안 배양한 후, 중심에 있는 친수성부(원천부)에 1000 mMol 농도의 5FU 를 주입하였다. 또한 100, 500, 1000 Mole 의 5FU 을 24 시간동안 처리하여 종양 세포의 생존력 (viability)를 확인함으로써, 3차원 종양 스페로이드의 항암 효과를 확인하였다. 중심에 있는 친수성부(원천부)으로부터의 다양한 농도의 항암제에 의해, 다양한 세포 죽음 정도를 확인하였으며, 5FU 항암제에 대한 2 mm 너비의 채널에서 가장 낮은 세포 생존력을 보였으며, 0.5 mm에서는 가장 높은 생존력을 보였다. 이를 통해, 본 발명의 일 구현예에 따른 채널이 형성된 종이 기반의 현적 배양 기기 (N-PHD,Networked Paper Hanging Drop) 가 시약의 다양한 농도 구배를 형성할 수 있으며, 이를 다양한 주제에 활용할 수 있음을 확인하였다.
이와 같이, 본 발명의 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 기기를 이용하는 경우 액적이 현적된 상태에서 스페로이드 내의 현상을 명시야 또는 형광 이미지를 통해 분석이 가능하다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 친수성부는 바이오 패시베이션(bio-passivation)코팅층 을 더 포함하는 것일 수 있다. 친수성부의 다공성 막과 세포 배양에서 사용되는 단백질이나 세포외 기질의 비특이성 결합을 방지할 수 있다. 상기 바이오 패시베이션(bio-passivation)코팅층 은 친수성부의 기공을 폐쇄시키지 않고, 친수성부 표면 및 기공 내부 표면을 포함하는 면적에 코팅층을 형성되는 것일 수 있다. 따라서, 상기 바이오 패시베이션(bio-passivation)코팅층이 존재하더라도 친수성부의 기공은 여전히 개방된 것일 수 있으며, 친수성부 다공성막 상부를 통해 배양액 교환, 외부물질의 주입이나 제거가 가능하다. 상기 바이오 패시베이션(bio-passivation)코팅층은 소혈청 알부민 (Bovine Serum Albumin, BSA), 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드(Poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide), PEO-PPO-PEO), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 또는 아가로즈 (Agarose) 로 구성된 것일 수 있다.
상기 바이오 패시베이션(bio-passivation)코팅층은 두께가 1 nm 이상 10 nm 이하일 수 있다. 코팅 두께가 너무 두꺼운 경우 친수성부에 재질 특성을 변화시킬 문제가 있고, 너무 얇은 경우 단백질이나 세포외 기질의 비특이성 결합을 방지 효과가 미미할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 친수성부에서 액적의 현적되는 면은 타면에 비해 친수성도가 감소된 표면일 수 있다. 이는, 친수성부를 자외선 조사하는 단계를 수행함으로써 이루어질 수 있다. 친수성을 조절함으로써, 액적이 다공성막에 짧은시간 안에 흡수되는 것을 방지하여, 다공성막에 오랜시간동안 액적이 유지될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 현적 세포 배양 기기에서 배양되는 세포는 포유류 세포의 단일 세포계 (primary cell line), 무한 증식 세포계 (continuous cell line), 또는 줄기 세포, 종양 세포, 면역 세포, 박테리아 또는 미생물일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 소수성부 패턴의 설계에 따라 하나의 현적 배양 기기에서 1 내지 384 개의 스페로이드 형성이 가능하며, 현적 배양을 통한 세포 스페로이드 형성 이후, 선택적 단일 스페로이드를 수득할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 기기를 35, 60, 90, 100 mm 페트리 디쉬, 그리고 6, 12, 24, 48, 96, 384 웰플레이트 등 다양한 종류의 디쉬에 조립하여 사용할 수 있다.
도 7는 다양한 종류의 디쉬에 조립된 PHDC의 이미지를 나타낸 것이다. 각각 PHDC 가 PC 홀더에 조립된 이미지, 384 와 96 well 이 PC 홀더에 조립된 이미지, 60 mm 페트리 접시에 조립된 3x3 PHDC와 그 위에 형성된 액적 이미지이며, 이를 통해, 다양한 디자인의 PHDC를 용이하게 제작 및 조립하여 사용할 수 있음을 보여주고 있다.
2 이상의 현적 세포 배양 단위체가 적층된 현적 세포 배양 기기
본 발명의 다른 일 구현예에서는 2 이상의 현적 세포 배양 단위체가 적층되고, 상기 현적 세포 배양 단위는 다공성막 상기 다공성막에 위치하는 소수성부 및 상기 소수성부로 둘러싸인 친수성부를 포함하고, 가장 아래에 위치하는 현적 세포 배양 단위의 친수성부에 세포 배양액의 액적이 현적되어 세포 배양이 이루어지고, 상기 다공성막을 통해 상기 친수성부에 형성된 액적 내 배양액의 교환 및 외부 물질 주입이 가능한 현적 세포 배양 기기를 제공한다. 상기 현적 세포 배양 단위체를 2이상 적층하는 경우, 세포의 공간적 배치를 통제할 수 있어, 기존 기기에서 실현하기 어려웠던 생체 모사를 하는데 용이하다.
각각의 현적 세포 배양 단위체는 1 이상의 친수성부, 및 1 이상의 소수성부를 포함하는 것일 수 있다.
상기 적층된 2 이상의 현적 세포 배양 단위체 중에서, 1 이상의 현적 세포 배양 단위체는 상기 다공성막에 위치한 채널을 더 포함하고, 상기 채널은 2 이상의 친수성부를 연결하는 것이고, 상기 채널은 채널로 연결된 친수성부 사이의 상호작용이 가능하게 하는 것일 수 있다.
이러한 세포 배양 단위체의 적층 구조와 채널이 형성된 세포 배양 단위체를 효과적으로 설계하여 적층함으로써, 다양한 구조를 갖는 현적 세포 배양 기기를 구성할 수 있으며, 다양한 세포 배양 조건을 설계하여, 다양하고 효과적인 세포 배양 연구 또는 세포 간 상호작용 연구에 활용 가능하다.
현적 세포 배양 기기의 제조 방법
본 발명의 다른 일 구현예에서는
다공성막을 준비하는 단계, 상기 다공성막에 친수성부 및 소수성부를 형성하여 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계, 및 상기 현적 세포 배양 단위체를 2 이상 적층하는 단계를 포함하는 현적 세포 배양 기기 제조방법을 제공한다. 현적 세포 배양 단위체를 2 개 이상 적층하는 경우, 세포의 공간적 배치를 조절할 수 있어, 기존 현적 배양 기기에서 다양한 종류의 세포들을 공간적 배치를 통해 공간 배양하는 것이 시현하기 어려웠지만, 이와 같은 본 발명의 일 구현예에 의하는 경우 용이하게 생체 모사가 가능하다.
도 9 은 본 발명 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 기기 제조방법의 개략도이다.
상기 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계는 상기 친수성부를 연결하는 채널이 형성되는 것을 포함할 수 있다.
상기 현적 세포 배양 단위체를 2 개 이상 적층하는 단계;는 현적 세포 배양 단위체의 상층과 하층의 친수성부가 중첩되도록 접는 방식에 의하여 현적 세포 배양 단위체를 적층하는 것일 수 있다. 기존 현적 배양 기기에서 다양한 종류의 세포들을 공간적 배치를 통해 공간 배양하는 것을 시현하기 어려웠지만, 본 발명의 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 기기를 이용하는 경우 세포의 공간적 배치를 조절할 수 있어, 세포 간의 상호 작용을 모사할 수 있고, 생체 모사를 더욱 정확하게 할 수 있다.
상기 채널을 통해 친수성부 및 친수성부에 형성된 액적 간의 상호 작용이 가능하며, 이를 통해 서로 다른 액적 내부의 배양 세포의 상호작용 연구가 가능할 뿐만 아니라 이종 세포 간의 상호작용 연구에도 활용 가능하다. 또한, 상기 현적 세포 배양 단위체의 적층 및 채널을 포함하는 현적 세포 배양 단위체를 적절하게 설계하여 조립함으로써, 다양한 형태의 현적 세포 배양 기기를 제조할 수 있으며, 다양하고 효과적인 세포 상호작용 연구에 활용 가능하다.
구체적으로, 도 10a와 같이 적층 구조를 통해 채널이 외부에 노출되지 않고 내부에 형성된 현적 세포 배양 기기를 제조 가능하다. 내부의 네트워크 형성을 할 수 있어, 단일 입구를 통해 많은 부분으로 용액을 전달할 수 있으며, 이는 제한적인 용액 조작 단계에서 유용하게 활용될 수 있다.
상기 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계는 다공성막에 소수성부 패턴을 프린팅하는 방식에 의해 이루어질 수 있으며, 본 발명의 일 구현예에서는 친수성을 갖는 다공성막인 종이에 왁스를 프린팅하는 방식을 이용하여 현적 세포 배양 기기를 제작하였으며, 이러한 인쇄 방식에 의하는 경우 현적 세포 배양 기기를 간편하게 제작이 가능하다. 또한, 사용자의 필요에 따라 현적 세포 배양 기기의 디자인을 용이하게 변경하여 제작할 수 있는 이점이 있다. 다만, 이는 본 발명의 일 구현예에 해당하며, 소수성부 패턴을 형성하는 방식이 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계는 친수성 다공성막에 소수성부의 패턴을 소수성 중합체를 이용하여 인쇄하는 단계, 상기 소수성 중합체가 인쇄된 다공성막을 열처리하는 단계, 및 소수성부 및 친수성부가 형성된 현적 세포 배양 단위체를 수득하는 단계를 통해 이루어질 수 있다. 상기 열처리 하는 단계;이후에 상기 다공성막을 컷팅하는 단계를 더 포함할 수 있다.
도 11에서는 본 발명의 일 구현예로서 현적 세포 배양 기기의 제조 과정에 대한 모식도이다. 2mm 내지 8mm의 특정 지름을 가진 원형 친수성 패턴을 상용화된 소프트웨어 (corel draw x5) 를 이용하여 디자인한다. 친수성 패턴 같은 경우는 실험에 사용한 well plate (96 well, 384 well, 3x3 또는 5x5) 에 따라 결정된다. 이 디자인은 Xerox solid wax printer (colorQube 8570)를 이용하여 소수성 중합체인 솔리드(Solid) 왁스가 다공성막에 소수성부 패턴에 따라 프린팅되고, 솔리드(Solid) 왁스가 프린팅된 다공성막을 왁스를 녹이기 위해 가열하여 왁스 변형을 통해 소수성부를 형성한다. 도 11의 현적 세포 배양 기기 제작 방법의 순서도는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니다.
상기 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계 이후에 상기 친수성부 표면처리 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 친수성부 표면처리 단계는 현적 세포 배양 단위체의 친수성부에 바이오 패시베이션(bio-passivation) 처리하는 것일 수 있다. 이 과정을 통해 친수성부에 바이오 물질의 비특이적인 흡착 등을 방지할 수 있다.
구체적으로 상기 바이오 패시베이션(bio-passivation) 처리하는 단계는 소혈청 알부민 (Bovine Serum Albumin, BSA), 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드(Poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide), PEO-PPO-PEO), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 아가로즈 (Agarose) 등을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, BSA용액을 표면에 도포함으로써, 다공성막 표면에 소혈청 알부민(BSA)이 흡착되어, 친수성부에 바이오 패시베이션(bio-passivation)코팅층을 형성하게 된다. 따라서 친수성부에 다른 단백질이나, 세포 등의 무작위적 결합 (Non-specific binding)을 방지할 수 있다.
상기 친수성부 표면처리 단계는 현적 세포 배양 단위체의 친수성부를 자외선 조사하는 것일 수 있다. 이 과정을 통해 친수성부의 친수성도가 조절될 수 있다.
대기 분위기 하에서 다공성막에 자외선을 조사하는 경우, 다공성막에 존재하는 일부의 C-OH 기가 C-O-기로 바뀔 수 있고, 일부의 C = O가 O-C-O기로 바뀔 수 있다. 이에 따라, 다공성막의 친수성도가 조절될 수 있다.
자외선 조사를 통해, 친수성부 표면의 친수성도를 감소시킴으로써, 친수성부에 위치한 액적이 짧은 시간에 다공성막에 흡수되지 않도록 하여, 오랜기간동안 액적이 다공성막에 유지될 수 있다.
상기 친수성부 표면처리 단계에서 바이오 패시베이션(bio-passivation) 처리하는 단계와 자외선 조사하는 단계는 어느 하나만 수행될 수도 있고, 두 가지 단계가 모두 수행될 수도 있다.
바이오 패시베이션(bio-passivation) 처리하는 단계에 의해 친수성부의 친수성도가 증가될 수 있으며, 자외선 조사를 통해 친수성도를 감소시킴으로써, 친수성부의 친수성도를 적절하게 조절 가능하다. 따라서, 바이오 패시베이션 처리와 자외선 조사 단계를 모두 수행한 경우에는 다공성막 친수성부의 액적 유지 시간이 현저히 증가될 수 있다,
또한, 자외선 조사 처리에 의하여 친수성이 감소될 수 있으므로, 바이오 패시베이션 처리와 자외선 조사 단계를 모두 수행한 경우에는 바이오 물질의 비특이적인 흡착 감소 효과도 현저히 향상될 수 있다.
이와 같이, 본원의 일 구현예에서는 바이오 패시베이션(bio-passivation) 처리하는 단계와 자외선 조사 처리 단계 수행에 의해 친수성도를 조절하면서, 효과적으로 바이오 물질의 비특이적인 흡착을 방지 가능한 최적의 조건을 제공할 수 있다. 도 12에는 본 발명의 일 구현예에 따른 친수성부 표면처리 단계의 개략도를 살펴보면, 현적 세포 배양 단위체를 에탄올을 이용하여 멸균 처리하는 단계, 친수성부에 BSA용액을 이용하여 바이오 패시베이션(bio-passivation) 처리하는 단계, PBS를 이용하여 세척하는 단계, 및 자외선 조사하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
현적 세포 배양 방법
본 발명의 일 구현예에서는,
본 발명의 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 기기를 준비하는 단계, 배양하려는 세포를 포함하는 세포 배양액을 친수성부에 적하하여 세포 배양액의 액적을 형성하는 단계, 세포 배양액이 적하된 현적 배양 기기를 뒤집어서 세포 배양액의 액적을 현적시키는 단계, 세포 배양액의 액적이 현적된 상태로 세포를 배양하는 단계를 포함하고,
상기 세포를 배양하는 단계는 다공성막을 통하여 배양액을 교환하는 단계를 더 포함하는 것인 현적 배양 방법을 제공한다.
도 14에서 본 발명 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 방법의 개략도를 나타내었다.
본 발명의 다른 일 구현예에서는 상기 세포를 배양하는 단계 이후에 다공성막을 통하여 외부 물질을 투입하는 단계를 더 포함할 수 있다.
다공성막 상부를 통하여 세포 배양액의 교환이 가능하므로, 기존 현적 배양 기술의 문제점을 극복하고, 주기적인 배양액 교체를 통해 오랜 기간 동안 세포 배양이 가능하다는 장점이 있으며, 다공성막 상부를 통하여 외부 물질 주입이 용이하므로, 외부 물질에 대한 스페로이드 변화를 연구하는 데에도 적용 가능하다.
본 발명의 일 구현예에서는 상기 세포 배양액이 적하된 현적 배양 기기를 뒤집어서 세포 배양액의 액적을 현적시키는 단계; 이후에 상기 다공성막을 통해 배양액을 추가하거나 제거하여 액적의 크기를 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다.
도 15 은 본 발명의 일 구현예인 N-PHDC에서의 3차원 스페로이드의 농도 구배 내에서의 화학 주성 반응 실험 결과이다. 본 발명의 일 구현예인 N-PHDC를 활용하여 3차원 스페로이드의 FBS에 관한 화학 주성을 24 시간동안 확인하였으며, 이를 통해 본 발명이 외부 화학 물질의 영향에 의한 스페로이드 변화에 관한 실험에 활용될 수 있음을 확인하였다. 도 15 A 같은 경우, 0.5 mm 너비의 채널에서의 24 시간 후 화학 시약의 농도 구배 시뮬레이션 결과를 보여주며, 농도가 높은 곳을 붉은색, 낮은 곳으로 갈수록 짙은 청색을 띄는 것으로 표시하였으며, 시약을 주입한 왼쪽 영역은 가장 붉은 색으로 농도가 가장 높으며, 중간 영역은 청색, 오른쪽 영역으로 갈수록 짙은 청색으로 시약의 농도 구배 시뮬레이션 결과를 확인할 수 있다. 도 15 B는 0.5 mm, 1.0 mm 와 2.0 mm 너비의 채널에서의 화학 시약의 실험 농도와 시뮬레이션 결과를 비교하였다. 도 15 C,D,E 는 0 % FBS와 10 % FBS 사이에서의 농도 구배에 따른 세포의 주화성을 확인하였으며, 높은 농도의 FBS로 세포의 강한 화학 주성을 보였다.
도 16 은 본 발명의 일 구현예인 PHDC를 이용하여 항암제(5FU)에 대한 일반 세포(CCD 1058sk)와 종양 세포(MDA-MB 231) 약물 검사 및 면역 반응 관련 실험 결과이다. 다공성막에 서로 다른 친수성부 간의 채널을 형성하는 기술을 활용함으로써, 외부 물질 및 세포 주입이 용이하여, 외부 물질에 대한 스페로이드 변화뿐만 아니라, 항암제 처리 후, 제 2세포인 면역세포를 주입함으로써, 외부 물질에 의한 세포 간의 상호작용 변화 연구에 대해서도 적용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 다른 일 구현예에서는,
본 발명의 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 방법으로서, 상기 현적 세포 배양 기기는 채널을 포함하는 것이고, 상기 세포 배양액의 액적을 형성하는 단계는 1종 이상 세포 배양액을 채널로 연결된 각각의 친수성부에 적하하여 세포 배양액의 액적을 형성하는 것이고, 상기 세포를 배양하는 단계는 세포 배양액의 액적이 현적된 상태로 채널을 통해 각각의 세포 스페로이드 간의 상호 작용이 이루어지며 세포를 배양하는 현적 세포 배양 방법을 제공한다.
이 경우 같은 종류 세포간의 상호작용 뿐만 아니라, 서로 다른 종류 세포간의 상호작용에 대한 연구가 가능한 이점이 있다.
현적 세포 배양 자동화 장치
본 발명의 또 다른 일 구현예로서,
복수의 현적 세포 배양 단위체를 포함하는 배양 시트, 상기 배양 시트를 이동시키는 구동모터, 상기 배양 시트 상부에 위치하며, 상기 현적 세포 배양 단위체의 친수성부에 세포 배양액을 적하하는 세포 배양액 투입장치를 포함하고,
상기 각각의 현적 세포 배양 단위체는 다공성막, 상기 다공성막에 위치하는 소수성부, 및 상기 소수성부로 둘러싸인 친수성부를 포함하고,
상기 친수성부에서 세포 배양액의 액적이 현적되어 세포 배양이 이루어지고,
상기 다공성막을 통해 상기 친수성부에 형성된 액적 내 배양액의 교환 및 외부 물질 주입이 가능한 것인 현적 세포 배양 자동화 장치를 제공한다.
상기 배양 시트는 컨베이어 벨트 구조이며, 상하부로 체인 형태의 이동을 하는 것 일 수 있다.
상기 배양 시트가 컨베이어 벨트 구조의 상부로 이동시에 상기 세포 배양액 투입장치로부터, 세포 배양액이 상기 배양 단위체의 친수성부에 적하되어 액적을 형성하는 것일 수 있다.
상기 배양 시트가 컨베이어 벨트 구조의 하부로 이동시에 상기 배양 단위체의 친수성부에 형성된 액적이 중력에 의해 현적되고 세포 배양이 이루어지는 것일 수 있다.
상기 현적된 액적이 다시 상부 컨베이어 벨트 구조로 이동될 때, 시약을 상기 액적으로 투입하는 것일 수 있다.
상기 시약이 투입된 액적이 다시 하부 컨베이어 벨트 구조로 이동될 때, 상기 액적 내부의 세포 분석이 이루어지는 것일 수 있다.
도 8 은 본 발명의 일 구현예인 PHDC 및 N-PHDC를 이용한 세포 주입, 배양 및 분석 자동화 기기에 관한 모식도이다. 도 8와 같이, PHDC와 N-PHDC는 회전(Rotating) 시스템을 이용하여, 세포 주입, 스페로이드 배양 및 스페로이드 현상을 이미징, 분석을 자동화할 수 있다. 구체적으로, 친수성 다공성 막을 이용한 현적기기에 소형 컨베이어 벨트(rotating pully)를 결합한 것이다. 이 시스템은 액적의 이동 및 형성을 자동화한 것으로써, 상층부에서 하층부로, 하층부에서 다시 상층부로 회전 이동하는 구성을 가지며, 상층부에서 세포 배양액을 친수성부에 적하하여 액적 형성을 하고, 회전하여 하층부로 이동하며 하층부에서 액적이 적하되고, 스페로이드 형성이 이루어진다. 배양 조건인 37 ℃, 5% 이산화탄소 조건에서 배양이 가능할 뿐만 아니라, 영양 배지와 시약 주입 및 흡광도 측정과 같은 추후 분석도 자동적으로 수행될 수 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예를 기재한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 내지 3
크로마토그래픽 필터 종이 (chromatographic filter paper) 위에 소수성 중합체로서 왁스를 이용하여 프린팅하고, 왁스를 120 ℃에서 2 분 동안 가열하여, 소수성부을 형성함으로써, 친수성부가 패터닝된 실시예 1의 현적 세포 배양 기기를 제조하였다.
상기 실시예 1의 친수성부의 친수성 조절을 위하여 18.52 mW/cm2 세기의 자외선을 3분간 쬐어주는 자외선 조사 처리를 수행하여 실시예 2의 현적 세포 배양 기기를 제조하였다.
상기 실시예 1의 현적 세포 배양 기기를 살균하기 위해 100 % 에탄올에 30 분간 넣은 후, 친수성 부에 비특이적 단백질 결합을 막기 위해 친수성부를 1% 소혈청 알부민 (Bovine serum albumin, BSA) 내에 도포하여, 한시간 처리 후, 인산염완충식염수(Phosphate-buffered saline, PBS) 버퍼로 3회 세척하고, 건조 시킨 후, 친수성부의 친수성도 조절을 위하여 18.52 mW/cm2 세기의 자외선를 3분간 쬐어주는 자외선 조사 처리를 수행하여 실시예 3의 현적 세포 배양 기기를 제조하였다.
이후 각각의 실시예의 현적 세포 배양 기기에 세포 배양액 액적을 형성하여, 3D 프린팅된 홀더에 고정시켰다.
도 12의 현적 세포 배양을 위한 다공성막 처리 방법의 순서도를 나타내고 있으며 이는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니다.
도 13 은 친수성부에 BSA와 자외선 조사 처리 전 후의 액적 유지시간 및 단백질 비특이적 결합에 대한 실험 결과이다.
친수성부의 표면 처리가 수행되지 않은 실시예 1의 경우 액적 유지 시간은 1분 미만이지만, 자외선 조사 처리를 거친 경우(실시예2)에는 액적 유지 시간이 10분 미만으로 자외선 조사 처리 전보다 증가하였으며, BSA처리와 자외선 조사 처리를 모두 행한 경우 (실시예 3)의 경우 액적 유지 시간이 10분을 초과하는 것으로 현저히 향상됨을 확인하였다.
또한, 배지를 통한 영양 공급 및 세포 간 신호 교신을 방해할 수 있는 재질에서의 단백질 비특이성 결합을 방지하기 위해, 형광 스트렙타비딘 (streptavidin)을 이용하여 단백질 비특이성 결합 정도를 확인한 결과, 친수성부 표면 처리가 이루어지지 않은 실시예1의 경우 친수성부 다공성막과 단백질의 비특이성 결합 정도가 매우 높은 것으로 확인되나, 자외선 조사 처리를 거친 경우(실시예2)에는 단백질 비특이성 결합 정도가 일부 감소하였으며, BSA처리와 자외선 조사 처리를 모두 행한 경우 (실시예 3)의 경우는 단백질 비특이성 결합 정도가 실시예 2의 경우보다도 절반 이하로 현저히 감소하였음을 확인하였다.
실시예 4
두께 200 μm GE whatman Chrome 1 filter paper를 이용하여 PHDC 를 제작하였으며, 4 mm 지름 위, 30 μl 액적 안에서 2,000 개의 종양 세포들을 배양하여, 다양한 배양 날짜로 종양 스페로이드를 형성하였다.
도 17 은 PHDC를 이용하여, 다양한 배양 날짜에 따른 종양세포 스페로이드 형성을 이미징한 예이다.
도 17A 는 현미경을 이용하여 스페로이드를 이미징하는 모식도이며, 1.25 배율의 유방암 세포의 스페로이드 명시 야상과 형광 이미지를 보여주고 있으며, 이처럼 PHDC 액적 안에서 세포들이 3차원적 스페로이드 형성을 할 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예 5
유방 상피 세포(MCF 10A)와 유방암 세포 (MDA MB 231) 를 PHDC 기기 위에서 5일간 현적 배양하여 도 17B에 나타내었다. MCF 10A 배양의 경우 DMEM F12 배양액을 이용하였으며, MDA-MB 231 세포의 경우 10 % FBS and 1 % collagen 가 포함된 DMEM 배양액을 이용하여, 1일에 액적의 5 μl 배양액을 제거하고, 10 μl 새로운 배양액을 주입하면서 5일 간 스페로이드 형성하였다.
다공성막을 이용한 PHDC 같은 경우, 액적 부피의 약 0.5% 내지 50 % 배양액을 정기적으로 교환할 수 있음을 보여주고 있으며, 그 결과로, 세포 노폐물 제거와 새로운 배양액 주입을 통한 장기간 세포 배양을 할 수 있음을 확인 할 수 있다.
실시예 6
도 18 은 PHDC에서 배양된 스페로이드와 기존 현적 배양 방법인 패트리 디쉬(Petri-dish)에서 배양한 스페로이드와의 비교 결과이다.
기존 현적 배양 기술 중 하나인 패트리 디쉬(Petri-dish)에서 배양했을 때의 스페로이드와 PHDC에서 배양된 스페로이드를 비교해보았을 때, 도 18A, B에 보이는 것과 같이 형태학적으로나 생존 능력 관해서 비슷한 경향을 보였다. 도 18C는 Calcein-am 염색을 통해 PHDC에서 배양된 스페로이드의 생존 능력과 종양 세포 전이와 관련 있는 마커인 F-actin 염색을 통해 PHDC에서 배양된 스페로이드의 전이 능력을 확인하였다. 도 18D 같은 경우, 종양 세포의 성장인자로 알려진 TGF-β1 분비 정도를 PHDC에서 세포 수와 배양 날짜에 따라 비교한 결과, 배양 날짜가 지남에 따라 많은 세포수로 형성된 스페로이드가 적은 세포수로 형성된 스페로이드 보다 배양 날짜가 지남에 따라 더 많은 양의 TGF-β1을 분비하는 것을 확인할 수 있다.
실시예 7
도 19 은 PHDC에서의 하나의 친수성부에서 다양한 세포들을 공동으로 배양하여 스페로이드를 형성한 경우 스페로이드의 직경 변화에 관한 실험 결과이다
도 19에서는, 종양 세포와 일반 세포를 하나의 친수성부에서 공동 배양함으로써, 스페로이드 직경 변화를 확인하였으며, 이를 통해, 하나의 친수성부에서 1종의 세포를 단일 배양한 경우(단일 배양) 뿐만 아니라, 하나의 친수성부에서 2종 이상의 세포를 공동 배양하여 스페로이드를 형성하는 것(공동 배양)이 가능함을 확인하였다.
종양 세포(MCF-7)과 일반 세포인 섬유 아세포(CCD 1058)를 단일 배양과 공동 배양했을 경우에 배양 시간에 따른 스페로이드 직경을 2 일 간격으로 10 일 동안 비교하여, 세포 종류에 따른, 그리고 세포 배양 방법에 따라 스페로이드 직경 변화의 경향성을 확인하였다.
본 실험에서, 종양 세포(MCF-7) 단일 배양일 경우, 시간이 지남에 따라 스페로이드 직경이 커지는 경향이 있었고, 섬유 아세포(CCD 1058) 단일 배양일 경우, 시간이 지남에 따라 세포들이 응집하여 스페로이드 직경이 작아지는 경향이 있었다. 종양 세포(MCF-7) 와 섬유아세포(CCD 1058)를 섞어 공동 배양(Coculture)했을 경우의 스페로이드 직경 변화는 섬유아세포 단일 배양 경우의 직경 변화와 좀 더 유사하다는 것을 확인하였습니다.
실시예 8
본 발명의 일 구현예에 따른 2개의 현적 세포 배양 단위체의 상층과 하층의 친수성부가 중첩되도록 접는 적층 방식에 의해 제조되는 채널을 포함하는 현적 세포 배양 기기를 이용하였다. 유방암 세포 (MDA-MB 231)를 다른 세포와의 상호 작용 없이 단일 배양한 경우와 채널로 연결되어 상호작용이 가능한 하나의 친수성부에는 유방암 세포(MDA-MB 231)를 다른 친수성부에는 섬유아세포 (MEF)를 배양한 후, 배양된 세포 결합 상태 비교를 위한 전자 주사 현미경 이미지를 도 20에 나타내었다.
첫번째 층의 현적 세포 배양 단위체(B)는 세포 현적 배양을 위한 친수성부 및 소수성부 패턴이 형성되어 있으며, 두번째 층의 현적 세포 배양 단위체(A)는 친수성부를 연결하는 채널(x, y, z)이 더 형성되어 있다. 2 개의 현적 세포 배양 단위체 (A, B)는 친수성부가 중첩되도록 접혀져 적층된 형태로 구성되었으며, 친수성부 (2, 5, 8)에는 유방암 세포(MDA-MB 231)를 친수성부 (1, 4, 7)에는 섬유아세포 (MEF)를 각각 배양하여, 종류가 다른 이종의 스페로이드 간의 상호작용을 유도할 수 있는 네트워크를 형성하였다. 2일간 상호 작용된 유방암 세포(MDA-MB 231)와 섬유아세포 (MEF)의 전자 주사 현미경 이미지를 보면, 섬유아세포 (MEF)와의 상호작용을 통한 유방암 스페로이드(MDA-MB 231)(도 20 Ⅲd)가 단일 배양된 유방암 스페로이드(MDA-MB 231)(도 20 Ⅲc)보다 좀 더 강한 세포간의 결합을 가짐을 확인할 수 있었다.
본 발명은 상기 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
1 다공성막 2 친수성부 3 소수성부 4 채널

Claims (39)

  1. 다공성막;
    상기 다공성막에 위치하는 소수성부; 및
    상기 소수성부로 둘러싸인 친수성부;를 포함하고,
    상기 친수성부에서 세포 배양액의 액적이 현적되어 세포 배양이 이루어지고,
    상기 다공성막을 통해 상기 친수성부에 형성된 액적 내 배양액의 교환 및 외부 물질 주입이 가능한 것인,
    현적 세포 배양 기기.
  2. 제 1항에서,
    상기 다공성막은 친수성을 가지는 것인,
    현적 세포 배양 기기.
  3. 제 1항에서,
    상기 다공성막은 종이, 나이트로셀룰로오스, 실크, 면섬유, 중합체 다공성막, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인,
    현적 세포 배양 기기.
  4. 제 1항에서,
    상기 다공성막은 기공 직경이 0.2 μm 이상 및 10 μm 이하인 것인,
    현적 세포 배양 기기.
  5. 제 1항에서,
    상기 다공성막은 두께가 0.04 mm 이상 및 0.5 mm 이하인 것인,
    현적 세포 배양 기기.
  6. 제 1항에서,
    상기 다공성막은 섬유상 입자가 무작위(random)로 배열된 것인,
    현적 세포 배양 기기.
  7. 제 1항에서,
    상기 친수성부는 직경이 0.5mm 이상 및 8mm 이하인 것인,
    현적 세포 배양 기기.
  8. 제 1항에서,
    상기 친수성부에 현적된 액적의 세로길이는 0.5 mm 이상 및 7 mm 이하인 것인,
    현적 세포 배양 기기.
  9. 제 1항에서,
    상기 친수성부에 현적된 액적은 20°이상 및 120°이하의 접촉각을 갖는 것인,
    현적 세포 배양 기기.
  10. 제 1항에서,
    상기 친수성부에 현적된 액적은 10 μl 이상 및 100 μl 이하의 부피를 갖는 것인,
    현적 세포 배양 기기.
  11. 제 1항에서,
    상기 친수성부에 현적된 액적에서 배양된 세포는 3차원적 스페로이드이고, 직경 50 μm 이상 및 2000 μm 이하인 것인,
    현적 세포 배양 기기.
  12. 제 1항에서,
    상기 소수성부는 소수성 중합체로 코팅된 것인,
    현적 세포 배양 기기.
  13. 제 12항에서,
    상기 소수성 중합체는 왁스, 테플론, 포토레지스트, 실란계 화합물, 폴리테트라 플루오로에틸렌 (Polytetrafluoroethylene), 왁스 (wax), 폴리디메틸실록산 (Poly dimethyl siloxane, PDMS), 실리콘(silicone), 금속 나노입자, 금속 산화물 나노입자, 실리카 나노입자, 중합체 나노 입자 또는 이들의 조합인 것인,
    현적 세포 배양 기기.
  14. 제 1항에서,
    상기 각각의 소수성부 간의 거리는 1 mm 이상 및 9 mm 이하인 것인,
    현적 세포 배양 기기.
  15. 제 1항에서,
    상기 다공성막에 위치하는 채널을 더 포함하고,
    상기 채널은 2 이상의 친수성부를 연결하는 것이고,
    상기 채널은 친수성부 사이의 상호작용이 가능하게 하는 것인,
    현적 세포 배양 기기.

  16. 제 15항에서,
    상기 채널의 너비는 0.1 mm 이상 및 2.5 mm 이하인 것인,
    현적 세포 배양 기기.
  17. 제1항에서,
    상기 친수성부는 바이오 패시베이션(bio-passivation)코팅층을 더 포함하는 것인,
    현적 세포 배양 기기.
  18. 제 17항에서,
    상기 바이오 패시베이션(bio-passivation)코팅층은 두께가 1 nm 이상 및 10 nm 이하인 것인,
    현적 세포 배양 기기.
  19. 제1항에서,
    상기 친수성부에서 액적이 현적되는 면은 타면에 비해 친수성도가 감소된 표면인 것인,
    현적 세포 배양 기기.
  20. 제 1항에서,
    상기 세포 배양액에 포함된 세포는 포유류 세포의 단일 세포계 (primary cell line), 무한 증식 세포계 (continuous cell line), 줄기 세포, 종양 세포, 면역 세포, 박테리아 및 미생물 중에서 선택된 어느 하나인 것인,
    현적 세포 배양 기기.
  21. 2 이상의 현적 세포 배양 단위체가 적층되고,
    상기 현적 세포 배양 단위체는
    다공성막;
    상기 다공성막에 위치하는 소수성부; 및
    상기 소수성부로 둘러싸인 친수성부;를 포함하고,
    상기 다공성막을 통해 상기 친수성부에 형성된 액적 내 배양액의 교환 및 외부 물질 주입이 가능한 것이고,
    가장 아래에 위치하는 현적 세포 배양 단위체의 친수성부에 세포 배양액의 액적이 현적되어 세포 배양이 이루어지는 것인,
    현적 세포 배양 기기.
  22. 제 21항에서,
    상기 2 이상의 현적 세포 배양 단위체 중 적어도 1이상의 현적 세포 배양 단위체는
    상기 다공성막에 위치한 채널을 더 포함하고,
    상기 채널은 2 이상의 친수성부를 연결하는 것이고,
    상기 채널은 친수성부 사이의 상호작용이 가능하게 하는 것인,
    현적 세포 배양 기기.
  23. 다공성막을 준비하는 단계;
    상기 다공성막에 친수성부 및 소수성부를 형성하여 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계; 및
    상기 현적 세포 배양 단위체를 2 이상 적층하는 단계;를 포함하고,
    상기 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계는 상기 다공성막에 복수개의 친수성부, 및 소수성부를 형성하고, 상기 2 이상의 친수성부를 서로 연결하는 채널을 형성하는 것을 포함하는 것이고,
    상기 현적 세포 배양 단위체를 2 이상 적층하는 단계는 현적 세포 배양 단위체의 상층과 하층의 친수성부 중에서 일부 또는 전부가 중첩되도록 적층하는 것인,
    현적 세포 배양 기기 제조방법.
  24. 삭제
  25. 제 23항에서,
    상기 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계는
    친수성 다공성막에 소수성 물질을 인쇄하는 방식에 의해 수행되는 것인,
    현적 세포 배양 기기 제조방법.
  26. 제 23항에서,
    상기 현적 세포 배양 단위체를 2 이상 적층하는 단계;는
    현적 세포 배양 단위체의 상층과 하층의 친수성부가 중첩되도록 접는 방식에 의하여 현적 세포 배양 단위체를 적층하는 것인,
    현적 세포 배양 기기 제조방법.
  27. 제 23항에서,
    상기 다공성막에 친수성부 및 소수성부를 형성하여 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계;이후에
    상기 친수성부 표면처리 단계;를 더 포함하는
    현적 세포 배양 기기 제조방법.
  28. 제 27항에서,
    상기 친수성부 표면처리 단계;는
    바이오 패시베이션(bio-passivation) 처리하는 단계; 또는 자외선 조사하는 단계;를 포함하는 것인,
    현적 세포 배양 기기 제조방법.
  29. 다공성막을 준비하는 단계;
    상기 다공성막에 친수성부 및 소수성부를 형성하여 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계; 및
    상기 현적 세포 배양 단위체를 2 이상 적층하는 단계;를 포함하고,
    상기 다공성막에 친수성부 및 소수성부를 형성하여 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계;이후에 상기 친수성부 표면처리 단계;를 더 포함하고,
    상기 친수성부 표면처리 단계;는
    친수성부의 기공을 폐쇄시키지 않고, 친수성부 표면 및 기공 내부 표면을 포함하는 면적에 코팅층을 형성하여 단백질이나 세포외 기질의 비특이성 결합을 방지하는 바이오 패시베이션(bio-passivation) 처리하는 단계; 및
    상기 친수성부에서 액적이 현적되는 면의 타면에 자외선을 조사하여 친수성도를 감소시키는 자외선 조사하는 단계;를 포함하는 것인,
    현적 세포 배양 기기 제조방법.
  30. 현적 세포 배양 단위체로 구성된 현적 세포 배양 기기를 준비하는 단계;
    배양하려는 세포를 포함하는 세포 배양액을 친수성부에 적하하여 세포 배양액의 액적을 형성하는 단계;
    세포 배양액이 적하된 현적 배양 기기를 뒤집어서 세포 배양액의 액적을 현적시키는 단계;
    세포 배양액의 액적이 현적된 상태로 세포를 배양하는 단계;를 포함하고,
    상기 세포를 배양하는 단계;는
    다공성막을 통하여 배양액을 교환하는 단계를 더 포함하는 것이고,
    상기 현적 세포 배양 단위체는
    다공성막;
    상기 다공성막에 위치하는 소수성부; 및
    상기 소수성부로 둘러싸인 친수성부;를 포함하고,
    상기 다공성막을 통해 상기 친수성부에 형성된 액적 내 배양액의 교환 및 외부 물질 주입이 가능한 것이고,
    가장 아래에 위치하는 현적 세포 배양 단위체의 친수성부에 세포 배양액의 액적이 현적되어 세포 배양이 이루어지는 것인,
    현적 배양 방법.
  31. 제 30항에서,
    상기 세포 배양액이 적하된 현적 배양 기기를 뒤집어서 세포 배양액의 액적을 현적시키는 단계; 이후에
    상기 다공성막을 통해 배양액을 추가하거나 제거하여 액적의 크기를 조절하는 단계를 더 포함하는 것인,
    현적 배양 방법.
  32. 제 30항에서,
    상기 세포를 배양하는 단계;는
    상기 다공성막을 통하여 외부 물질을 투입하는 단계;를 더 포함하는 것인,
    현적 배양 방법.
  33. 제 30항에서,
    상기 현적 세포 배양 기기는 채널을 포함하는 것이고,
    상기 채널은 2 이상의 친수성부를 연결하는 것이고,
    상기 채널은 친수성부 사이의 상호작용이 가능하게 하는 것이고,
    상기 세포 배양액의 액적을 형성하는 단계;는
    1종 이상 세포 배양액을 채널로 연결된 각각의 친수성부에 적하하여 세포 배양액의 액적을 형성하는 것이고,
    상기 세포를 배양하는 단계;는
    세포 배양액의 액적이 현적된 상태로 채널을 통해 각각의 세포 스페로이드 간의 상호 작용이 이루어지며 세포를 배양하는 것인,
    현적 배양 방법.
  34. 복수의 현적 세포 배양 단위체를 포함하는 배양 시트;
    상기 배양 시트를 이동시키는 구동모터;
    상기 배양 시트 상부에 위치하며, 상기 현적 세포 배양 단위체의 친수성부에 세포 배양액을 적하하는 세포 배양액 투입장치; 를 포함하고,
    상기 각각의 현적 세포 배양 단위체는,
    다공성막;
    상기 다공성막에 위치하는 소수성부; 및
    상기 소수성부로 둘러싸인 친수성부;를 포함하고,
    상기 친수성부에서 세포 배양액의 액적이 현적되어 세포 배양이 이루어지고,
    상기 다공성막을 통해 상기 친수성부에 형성된 액적 내 배양액의 교환 및 외부 물질 주입이 가능한 것인,
    현적 세포 배양 자동화 장치.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 배양 시트는 컨베이어 벨트 구조이며,
    상하부로 체인 형태의 이동을 하는 것인,
    현적 세포 배양 자동화 장치.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 배양 시트가 컨베이어 벨트 구조의 상부로 이동시,
    상기 세포 배양액 투입장치로부터, 세포 배양액이 상기 배양 단위체의 친수성부에 적하되어 액적을 형성하는 것인,
    현적 세포 배양 자동화 장치.
  37. 제35항에 있어서,
    상기 배양 시트가 컨베이어 벨트 구조의 하부로 이동시,
    상기 배양 단위체의 친수성부에 형성된 액적이 중력에 의해 현적되는 것인,
    현적 세포 배양 자동화 장치.
  38. 제36항에 있어서,
    상기 현적된 액적이 다시 상부 컨베이어 벨트 구조로 이동될 때, 시약을 상기 액적으로 투입하는것인,
    현적 세포 배양 자동화 장치.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 시약이 투입된 액적이 다시 하부 컨베이어 벨트 구조로 이동될 때, 상기 액적 내부의 세포 분석이 이루어지는 것인,
    현적 세포 배양 자동화 장치.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111748459B (zh) * 2019-11-19 2023-09-15 杭州希蚁网络科技有限公司 微生物培养用培养床和微生物活性检测方法
CN111705037A (zh) * 2020-06-24 2020-09-25 西交利物浦大学 一种成纤维细胞与癌细胞的3d共培养模型及其制备方法和应用
KR102576914B1 (ko) * 2021-09-15 2023-09-08 성균관대학교산학협력단 스페로이드 현적 배양 및 분리장치

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010063375A (ja) * 2008-09-08 2010-03-25 Tokyo Univ Of Science スフェロイド複合体およびその製造方法、ならびに多層型スフェロイド複合体
KR101555239B1 (ko) * 2014-10-21 2015-09-25 연세대학교 산학협력단 세포 스페로이드 형성 방법 및 세포 스페로이드 형성 장치

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003010302A1 (fr) * 2001-07-26 2003-02-06 Kazunori Kataoka Construction cellulaire cultivee contenant des spheroides de cellules animales cultivees et utilisation correspondante
KR101412155B1 (ko) * 2011-09-27 2014-06-27 동국대학교 산학협력단 3차원 세포 배양 용구 및 이를 이용한 세포의 3차원 배양 방법
KR101647793B1 (ko) * 2014-09-02 2016-08-12 충남대학교산학협력단 온도 감응성 글리콜 키토산 유도체를 이용한 스페로이드 형성용 배양 용기 및 이를 이용한 스페로이드 형성 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010063375A (ja) * 2008-09-08 2010-03-25 Tokyo Univ Of Science スフェロイド複合体およびその製造方法、ならびに多層型スフェロイド複合体
KR101555239B1 (ko) * 2014-10-21 2015-09-25 연세대학교 산학협력단 세포 스페로이드 형성 방법 및 세포 스페로이드 형성 장치

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