WO2021167042A1 - 細胞凝集速度が制御可能な細胞培養器 - Google Patents

細胞凝集速度が制御可能な細胞培養器 Download PDF

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WO2021167042A1
WO2021167042A1 PCT/JP2021/006244 JP2021006244W WO2021167042A1 WO 2021167042 A1 WO2021167042 A1 WO 2021167042A1 JP 2021006244 W JP2021006244 W JP 2021006244W WO 2021167042 A1 WO2021167042 A1 WO 2021167042A1
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cell
carbon atoms
linear
group
hydrogen atom
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PCT/JP2021/006244
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康平 鈴木
菜月 深澤
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日産化学株式会社
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    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
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    • C08F220/34—Esters containing nitrogen, e.g. N,N-dimethylaminoethyl (meth)acrylate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/50—Soluble polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG]
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers

Definitions

  • the present invention uses a polymer having a specific structure as a base material for cell culture, a substrate for producing cell aggregates in which the cell aggregation rate can be controlled and a method for producing the same, a method for producing cell aggregates, and a method for producing cell aggregates.
  • the present invention relates to a method for improving the cell culture rate, a method for controlling the agglomeration formation rate during the production of cell agglomerates, and a cell culture container base material for promoting cell agglomeration formation.
  • a cell aggregate (also called a spheroid or a cell mass) is a cell aggregate that is three-dimensionally cultured and cells are self-aggregated and aggregated, and a living body-like structure is constructed. It has been reported that it can be maintained for a long period of time and its physiological function is improved. Therefore, there are increasing expectations for the use of cell aggregates in drug discovery research, cell therapy, and regenerative therapy.
  • Patent Document 1 discloses a method for producing a cell incubator using a polymer derived from poly (2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate) having a cationic functional group and an anionic functional group.
  • the present invention includes the following.
  • U a1 and U a2 independently represent a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and R a1 is a linear or branched alkyl having a hydrogen atom or 1 to 5 carbon atoms.
  • R a2 represents a linear or branched alkylene group having 1 to 5 carbon atoms] and a repeating unit derived from a monomer represented by the following formula (II):
  • R b represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms], which comprises a spot made of a copolymer containing a repeating unit derived from a monomer represented by].
  • a copolymer in which the substrate having the ability to suppress cell adhesion contains a repeating unit containing a group represented by the following formula (a) and a repeating unit containing a group represented by the following formula (b).
  • U a11 , U a12 , U b11 , U b12 and U b13 independently represent a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms
  • An ⁇ is a halide ion or an inorganic acid.
  • the substrate for producing a cell agglutinin according to any one of the above [1] to [4], which comprises at least a part of the surface of the coating film containing.
  • R a2 represents a linear or branched alkylene group having 1 to 5 carbon atoms] and a repeating unit derived from a monomer represented by the following formula (II):
  • Rb represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms]
  • a copolymer containing a repeating unit derived from a monomer represented by is applied in a plurality of spots, and then dried.
  • a method for producing a substrate for producing a cell aggregate which comprises a step of producing a substrate for producing a cell aggregate, wherein the completion time of agglutination formation after cell seeding is within 20 hours.
  • R a2 represents a linear or branched alkylene group having 1 to 5 carbon atoms] and a repeating unit derived from a monomer represented by the following formula (II):
  • R b represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms], which comprises a spot made of a copolymer containing a repeating unit derived from a monomer represented by].
  • a method for producing a cell aggregate which comprises a step of seeding cells in a cell and a step of culturing the cells within 20 hours after seeding to form an aggregate.
  • R a2 represents a linear or branched alkylene group having 1 to 5 carbon atoms] and a repeating unit derived from a monomer represented by the following formula (II):
  • Rb represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms]
  • a copolymer containing a repeating unit derived from a monomer represented by is used as a base material for cell culture.
  • a method for improving the cell culture rate during the production of aggregates which is carried out by reducing the molar ratio of the repeating unit derived from the formula (I) to the entire copolymer.
  • R a2 represents a linear or branched alkylene group having 1 to 5 carbon atoms] and a repeating unit derived from a monomer represented by the following formula (II):
  • Rb represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms]
  • a copolymer containing a repeating unit derived from a monomer represented by is used as a base material for cell culture.
  • a method for controlling the cell culture rate during the production of aggregates which is carried out by changing the monomer ratios of the formulas (I) and (II) in the copolymer.
  • R a2 represents a linear or branched alkylene group having 1 to 5 carbon atoms] and a repeating unit derived from a monomer represented by the following formula (II):
  • R b represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms], and contains a copolymer containing a repeating unit derived from a monomer represented by], and a cell for promoting cell culture formation.
  • a substrate for producing cell aggregates specifically, cell aggregate formation after cell seeding is completed, which can significantly shorten the production time of cell aggregates as compared with the conventional method (for example, by using a cell culture dish).
  • Substrate for producing cell aggregates and a method for producing the same a method for producing cell aggregates, a method for improving the cell aggregate production rate, a method for controlling the aggregate formation rate during cell aggregate production,
  • a cell culture container base material for promoting cell agglomeration formation can be provided.
  • Example 4 It is a micrograph which observed the state of cell adhesion and agglutination of Example 4. It is a graph which compared the cell adhesion area and the cell culture time of Example 4. It is a table comparing the cell adhesion area and the cell culture time of Example 4 (numerical data in FIG. 2). The cell adhesion area of Example 4 and the DM molar ratio to 2- (dimethylamino) ethyl methacrylate (denoted as DM in the figure) and methacrylic acid (denoted as MA in the figure) in the copolymer are calculated. It is a contrasting graph.
  • the substrate for producing cell aggregates of the present application is on a substrate having the ability to suppress cell adhesion, and the following formula (I): [During the ceremony, U a1 and U a2 independently represent a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and R a1 is a linear or branched alkyl having a hydrogen atom or 1 to 5 carbon atoms.
  • R a2 represents a linear or branched alkylene group having 1 to 5 carbon atoms] and a repeating unit derived from a monomer represented by the following formula (II):
  • R b represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms], which comprises a spot made of a copolymer containing a repeating unit derived from a monomer represented by]. It is a substrate for producing cell aggregates, wherein the completion time of aggregate formation after cell seeding is within 20 hours. This will be described in order below.
  • the copolymer according to the present invention is The following formula (I): [During the ceremony, U a1 and U a2 independently represent a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and R a1 is a linear or branched alkyl group having a hydrogen atom or 1 to 5 carbon atoms.
  • R a2 represents a linear or branched alkylene group having 1 to 5 carbon atoms
  • R b is a copolymer obtained by polymerizing an anionic monomer represented by [representing a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms].
  • the "linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms" as used herein includes, for example, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, and the like. Isobutyl group, s-butyl group, t-butyl group, n-pentyl group, 1-methylbutyl group, 2-methylbutyl group, 3-methylbutyl group, 1,1-dimethylpropyl group, 1,2-dimethylpropyl group, 2 , 2-Dimethylpropyl group or 1-ethylpropyl group.
  • R a1 and R b are independently selected from a hydrogen atom and a methyl group, respectively.
  • U a1 and U a2 are preferably independently selected from a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group and an n-butyl group, but are preferably a methyl group or an ethyl group.
  • a methyl group is most preferred.
  • the "linear or branched alkylene group having 1 to 5 carbon atoms" as used herein includes, for example, a methylene group, an ethylene group, a propylene group, a trimethylene group, a tetramethylene group, or 1-methyl.
  • R a2 is preferably selected from an ethylene group and a propylene group.
  • examples of the cationic monomer represented by the above formula (I) include 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, N, N-dimethylaminomethyl methacrylate and the like, and 2-N, N-dimethylaminoethyl Methyl is preferred.
  • examples of the anionic monomer represented by the above formula (II) include acrylic acid and methacrylic acid, and methacrylic acid is preferable.
  • the molar ratio of the monomer-derived unit represented by the formula (I) / the monomer-derived unit represented by the formula (II) in the polymer is 99/1 to 51/49. It is preferably 98/2 to 60/40. It is preferably 95/5 to 70/30, preferably 93/7 to 70/3.
  • the above-mentioned copolymer is a copolymer obtained by further polymerizing a monomer represented by the formula (I) / formula (II) with a monomer having two or more carbon-carbon unsaturated bonds. May be good.
  • the monomer having two or more carbon-carbon unsaturated bonds is specifically a monomer having two or more carbon-carbon double bonds, for example, a polyfunctional acrylate compound, a polyfunctional acrylamide compound, and a polyfunctionality. Examples thereof include polyester and isoprene compounds.
  • Preferred specific examples include monomers represented by the following formulas (III) to (V).
  • R c and R d independently represent a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms
  • R e is a linear or branched alkylene having 1 to 5 carbon atoms. It represents a group, and n represents a number from 1 to 50.
  • the monomer represented by the formula (III) is preferable.
  • the molar ratio of the monomers represented by the formulas (III) to (V) to the entire copolymer is preferably 0 to 5.0%. More preferably, it is 0 to 3.0%. This is because if the molar ratio of the formulas (III) to (V) is 5.0% or more, there is a risk of gelation during production due to high molecular weight due to excessive cross-linking, which makes production difficult.
  • R c and R d are independently selected from a hydrogen atom and a methyl group, respectively.
  • Re is preferably selected from a methylene group, an ethylene group and a propylene group, most preferably an ethylene group.
  • n is a number from 1 to 50, n is preferably a number from 1 to 30, and n is preferably a number from 1 to 10.
  • the copolymer according to the present invention may be copolymerized with an ethylenically unsaturated monomer, a polysaccharide or a derivative thereof as an optional additional monomer component.
  • ethylenically unsaturated monomers are one or two selected from the group consisting of (meth) acrylic acid and its esters; vinyl acetate; vinylpyrrolidone; ethylene; vinyl alcohol; and their hydrophilic functional derivatives.
  • Ethylene unsaturated monomers of more than one species can be mentioned.
  • polysaccharides or derivatives thereof include cellulosic polymers such as hydroxyalkyl cellulose (for example, hydroxyethyl cellulose or hydroxypropyl cellulose), starch, dextran, and curdlan.
  • the hydrophilic functional derivative refers to an ethylenically unsaturated monomer having a hydrophilic functional group or structure.
  • hydrophilic functional groups or structures include betaine structures; amide structures; alkylene glycol residues; amino groups; and sulfinyl groups.
  • Betaine structure means a monovalent or divalent group of a compound having an amphoteric center of a quaternary ammonium type cation structure and an acidic anion structure, for example, a phosphorylcholine group: Can be mentioned.
  • a phosphorylcholine group for example, a phosphorylcholine group:
  • examples of the ethylenically unsaturated monomer having such a structure include 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) and the like.
  • the amide structure is expressed by the following formula: [Here, R 16 , R 17 and R 18 are independent of each other and are concretely such as a hydrogen atom or an organic group (for example, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms which may be substituted). Is a methyl group, an isopropyl group, a hydroxymethyl group, a hydroxyethyl group, etc.)] Means the group represented by. Examples of ethylenically unsaturated monomers having such a structure include (meth) acrylamide, N-isopropylacrylamide, N- (hydroxymethyl) (meth) acrylamide and the like. Further, a monomer or polymer having such a structure is disclosed in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2010-169604.
  • the alkylene glycol residue remains after the hydroxyl groups of one or both terminals of the alkylene glycol (HO-Alk-OH; where Alk is an alkylene group having 1 to 10 carbon atoms) undergoes a condensation reaction with another compound. It means an alkyleneoxy group (-Alk-O-) and also includes a poly (alkyleneoxy) group in which an alkyleneoxy unit is repeated.
  • alkyleneoxy group -Alk-O-
  • Examples of the ethylenically unsaturated monomer having such a structure include 2-hydroxyethyl (meth) acrylate and methoxypolyethylene glycol (meth) acrylate.
  • a monomer or polymer having such a structure is disclosed in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-533489.
  • the amino group is of the formula: -NH 2 , -NHR 19 or -NR 20 R 21 [where R 19 , R 20 and R 21 are independent of each other and have an organic group (eg, 1 to 5 carbon atoms). It is a linear or branched alkyl group, etc.)] means a group represented by.
  • Amino groups in the present invention include quaternized or chlorinated amino groups. Examples of the ethylenically unsaturated monomer having such a structure include dimethylaminoethyl (meth) acrylate, 2- (t-butylamino) ethyl (meth) acrylate, and methacryloylcholine chloride.
  • the sulfinyl group has the following formula: [Here, R 22 is an organic group (for example, an organic group having 1 to 10 carbon atoms, preferably an alkyl group having 1 or more hydroxy groups and having 1 to 10 carbon atoms, etc.)]. Means the group represented by. Examples of the polymer having such a structure include copolymers disclosed in JP-A-2014-48278.
  • the difference is 0 to 10 mol%.
  • the difference between the monomer charging ratio and the measured value of the produced copolymer is small by the production method described later, and is 0 to 10 mol%. More preferably, it is 0 to 8 mol%.
  • the number average molecular weight (Mn) of the copolymer is 20,000 to 1,000,000, more preferably 50,000 to 800,000.
  • the ratio (Mw / Mn) of the weight average molecular weight (Mw) of the copolymer to the number average molecular weight (Mn) is 1.01 to 10.00, and 1.2 to 8.0. It is preferably 1.4 to 6.0, preferably 1.5 to 5.0, and preferably 1.6 to 4.5.
  • the weight average molecular weight (Mw) and the number average molecular weight (Mn) can be determined by, for example, Gel Filtration Chromatography described in Examples.
  • the cell agglutinin refers to a structure formed as a result of cell agglutination, and the shape is not limited such as a spherical shape or a ring shape.
  • the size of the cell aggregates can be adjusted according to the regulation of the adhesion area (cell aggregates of any size can be produced). There is a merit in.
  • the substrate for producing cell agglutinations of the present invention can be produced by using the copolymer as a base material for a cell culture container by a method described later, applying it to the surface of the substrate and drying it.
  • the "surface” refers to a surface in contact with the contents such as cells or cell culture medium.
  • the shape of the substrate surface may be flat or uneven, but a flat shape is preferable.
  • Examples of the material of the substrate include glass, metal, metal-containing compound or semimetal-containing compound, activated carbon or resin.
  • the metal is a typical metal: (aluminum group element: Al, Ga, In; iron group element: Fe, Co, Ni; chromium group element: Cr, Mo, W, U; manganese group element: Mn, Re; noble metal: Cu , Ag, Au, etc.
  • Examples of metal-containing compounds or semi-metal-containing compounds are ceramics, semiconductors such as silicon, and metals, which are sintered bodies whose basic component is a metal oxide and which is hardened by heat treatment at a high temperature.
  • Inorganic compounds such as oxides or semi-metal oxides (silicon oxide, alumina, etc.), metal carbides or semi-metal carbides, metal nitrides or semi-metal nitrides (silicon nitride, etc.), metal borides or semi-metal borides.
  • inorganic solid materials such as molded bodies of the above, aluminum, nickel titanium, and stainless steel (SUS304, SUS316, SUS316L, etc.).
  • the resin may be a natural resin or a derivative thereof, or a synthetic resin, and the natural resin or a derivative thereof may be synthetic such as cellulose, cellulose triacetate (CTA), nitrocellulose (NC), and cellulose on which dextran sulfate is immobilized.
  • Resins include polyacrylonitrile (PAN), polyimide (PI), polyester polymer alloy (PEPA), polystyrene (PS), polysulfone (PSF), polyethylene terephthalate (PET), polymethylmethacrylate (PMMA), polyvinyl alcohol (PVA).
  • PU Polyethylene
  • EVAL Ethylene Vinyl Alcohol
  • PE Polyethylene
  • Polyester Polypropylene
  • PVDF Vinylidene Fluoride
  • PES Polyethersulfone
  • PC Polycarbonate
  • COP Cycloolefin Polymer
  • PVC Polyvinyl chloride
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • UHPE ultrahigh molecular weight polyethylene
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • ABS acrylonitrile-butadiene-styrene resin
  • Teflon registered trademark
  • the copolymer when the copolymer is coated so as to be present on at least a part of the surface of the substrate, it does not require treatment at a high temperature, so that a resin having low heat resistance or the like is used. Is also applicable.
  • the material of the substrate may be one type or a combination of two or more types, but in the substrate for producing cell aggregates of the present application, for example, in order to mass-produce cell culture aggregates, the substrate is a belt conveyor. It is preferable that the substrate has flexibility so that it can be wound (rolled) as described above. Examples of the substrate material used in the roll method include synthetic resins and natural polymers.
  • the substrate of the present application may be a substrate used in a so-called cell incubator.
  • Petri dishes commonly used for cell culture tissue culture dishes, petri dishes such as multi-dish, flasks such as cell culture flasks and spinner flasks, plastic bags, Teflon® bags, and bags such as culture bags.
  • the copolymer of the present application can be produced by a method known per se (for example, described in JP-A-2014-162685, PCT / JP2019 / 032785).
  • the cell culture container base material of the present invention can be produced by mixing the copolymer with an aqueous solution containing an aqueous solution by a method known per se.
  • the base material of the present invention is useful for promoting the formation of cell aggregates.
  • the promotion of cell agglutination formation means that the completion time of cell agglutination formation after cell seeding is within 20 hours, as will be described later.
  • aqueous solution examples include a salt-containing aqueous solution such as water, physiological saline or a phosphate buffer solution, or a mixed solvent in which water or a salt-containing aqueous solution and alcohol are combined.
  • Alcohols include alcohols having 2 to 6 carbon atoms, such as ethanol, propanol, isopropanol, 1-butanol, 2-butanol, isobutanol, t-butanol, 1-pentanol, 2-pentanol, 3-pentanol.
  • the base material in addition to the above-mentioned copolymer and solvent, other substances can be added as needed within a range that does not impair the performance of the obtained base film.
  • other substances include pH adjusters, cross-linking agents, preservatives, surfactants, primers that enhance adhesion to containers or substrates, fungicides, sugars and the like.
  • spot The spot made of the above-mentioned copolymer, preferably a plurality of spots (coating film), provided in the substrate for producing cell aggregates of the present invention is not particularly limited with respect to the ratio of the total area of the spots to the surface area of the substrate, but is, for example, 30. % Or more, and the diameter of each spot is, for example, 50 to 5000 ⁇ m, and the distance between the spots is, for example, 30 to 1000 ⁇ m.
  • the shape of the spot is not particularly limited. For example, it has a substantially circular or quadrangular shape, but it is preferably a substantially circular spot.
  • the ratio of the total area of the spots to the surface area of the substrate, the diameter of each spot and the distance between the spots can be appropriately selected from a predetermined range according to the type of cells and the substrate to be used, the desired size of the cell aggregate, and the like.
  • the ratio of the total area of the spots to the surface area of the substrate is preferably 30% or more, 40% or more, 50% or more, and preferably 99% or less, and the diameter of each spot is 50 to 50 to. It is preferably 5000 ⁇ m and preferably 300 to 3000 ⁇ m, and the distance between the spots is preferably 30 to 1000 ⁇ m and preferably 100 to 500 ⁇ m.
  • the present invention is uniform by arranging independent micro-sized regions (spots) to which cells can adhere on a substrate having the ability to suppress cell adhesion in such a high density, preferably regularly. Multiple spheroids of a size can be formed on one substrate (container) at one time.
  • the spot made of the above-mentioned copolymer can be formed by applying the above-mentioned copolymer, preferably the above-mentioned cell culture container base material.
  • a method of applying the base material for example, an inkjet method, a screen printing method, a slit coating method, a roll-to-roll method or the like can be used, but a printing technique such as an inkjet method or screen printing is preferably used.
  • a substrate that protects the non-formed portion of the spot is immersed in the above-mentioned base material, and the base agent is added to the substrate (container) that protects the non-formed portion of the spot in some cases, and a predetermined coating method is used.
  • a method such as allowing the cells to stand for a certain period of time is used, but in the case of a substrate, in the case of a cell culture vessel as one embodiment, a base material may be added to a container in which the non-formed spots are protected, and the cells are allowed to stand for a predetermined time. Will be done.
  • the addition can be performed, for example, by adding 0.5 to 1 times the total volume of the container as a base material using a syringe or the like.
  • the standing is carried out by appropriately selecting the time and temperature according to the material of the container or substrate and the type of the base material for cell culture. For example, 1 minute to 24 hours, preferably 5 minutes to 3 hours, 10 to It is carried out at 80 ° C. This makes it possible to manufacture a substrate for producing cell aggregates.
  • the spots on the surface of the substrate obtained by such a method are washed as they are without undergoing a drying step, or with water or a medium of a sample to be subjected to cell culture (for example, water, buffer solution, medium, etc.). Later, it can be used as a substrate for producing cell aggregates.
  • water or a medium of a sample to be subjected to cell culture for example, water, buffer solution, medium, etc.
  • sample medium eg, water, buffer, medium, etc., particularly preferably medium (eg, DMEM medium (Dalveco's modified Eagle's medium)) as it is without undergoing a drying step or to be subjected to water or cell culture. After washing, it can be used as a substrate for producing cell aggregates.
  • the substrate for producing cell aggregates may be subjected to a drying step.
  • the drying step is carried out in the air or in vacuum, preferably in the temperature range of ⁇ 200 ° C. to 200 ° C. By removing the solvent in the base material by the drying step, it completely adheres to the substrate.
  • the spots can also be formed by drying at room temperature (10 ° C. to 35 ° C., preferably 20 ° C. to 30 ° C., for example 25 ° C.), but for more rapid spot formation, for example, 40 ° C. to 50 ° C. It may be dried at ° C. If the drying temperature is less than ⁇ 200 ° C., an uncommon refrigerant must be used, resulting in lack of versatility, and it takes a long time to dry due to solvent sublimation, resulting in inefficiency. If the drying temperature is more than 200 ° C., thermal decomposition of the copolymer occurs. A more preferable drying temperature is 10 ° C. to 180 ° C., and a more preferable drying temperature is 20 ° C. to 150 ° C.
  • the substrate for producing cell aggregates of the present application is produced through the above simple steps. Further, in order to eliminate impurities, unreacted monomers and the like remaining in the spot (coating film), a step of washing with at least one solvent selected from an aqueous solution containing water and an electrolyte may be carried out. For cleaning, running water cleaning, ultrasonic cleaning, or the like is desirable.
  • the aqueous solution containing the water and the electrolyte may be, for example, heated in the range of 40 ° C. to 95 ° C.
  • the aqueous solution containing the electrolyte PBS, physiological saline (containing only sodium chloride), dalbecolinic acid buffered saline, Tris buffered saline, HEPES buffered saline and Veronal buffered saline are preferable, and PBS is preferable. Especially preferable.
  • the coating film does not elute and remains firmly fixed to the substrate even when washed with water, PBS, alcohol, or the like.
  • the film thickness of the spot (coating film) of the present application has a maximum film thickness and a minimum film thickness in the range of 1 to 1000 nm, preferably in the range of 5 to 500 nm.
  • the substrate for producing cell aggregates of the present application is produced using a substrate having an ability to suppress cell adhesion.
  • the substrate Prior to the formation of the spot (coating film), the substrate may be subjected to a cell adhesion suppressing treatment.
  • a substrate having a cell adhesion inhibitory ability can be produced, for example, through a step of applying a known coating film forming composition having a cell adhesion inhibitory ability.
  • the coating film forming composition having an ability to suppress cell adhesion includes a repeating unit containing an organic group represented by the following formula (a) and a repeating unit containing an organic group represented by the following formula (b).
  • the coating film may be included in at least a part of the surface of the substrate, but is applied over the entire surface on which the cell aggregates are produced (that is, the surface where the spots of the present application are present) or over the entire surface of the substrate. Is preferable.
  • the linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms is the same as that described above.
  • the coating film forming composition for example, the coating film forming composition described in WO2014 / 196650 can be used.
  • the coating method for forming the coating film is not particularly limited, and a usual spin coating, dip coating, solvent casting or other coating method is used.
  • the drying step of the coating film is performed in the air or vacuum in a temperature range of ⁇ 200 ° C. to 180 ° C.
  • the solvent in the coating film forming composition is removed, and the copolymer formulas (a) and (b) form an ionic bond and are completely fixed to the substrate.
  • the coating film can also be formed by drying at room temperature (10 ° C. to 35 ° C., for example 25 ° C.), but in order to form the coating film more quickly, it is dried at, for example, 40 ° C. to 50 ° C. You may. Further, a drying step at an extremely low temperature to a low temperature (around ⁇ 200 ° C. to ⁇ 30 ° C.) by the freeze-drying method may be used. Freeze-drying is called vacuum freeze-drying, which is a method in which what is normally desired to be dried is cooled with a refrigerant and the solvent is removed by sublimation in a vacuum state.
  • Common refrigerants used in freeze-drying include a mixed medium of dry ice and methanol (-78 ° C), liquid nitrogen (-196 ° C), and the like. If the drying temperature is ⁇ 200 ° C. or lower, an uncommon refrigerant must be used, resulting in lack of versatility, and drying takes a long time due to solvent sublimation, resulting in poor efficiency. When the drying temperature is 200 ° C. or higher, the ionic bonding reaction on the surface of the coating film proceeds too much, the surface loses hydrophilicity, and the ability to suppress the adhesion of biological substances is not exhibited. A more preferable drying temperature is 10 ° C. to 180 ° C., and a more preferable drying temperature is 25 ° C. to 150 ° C.
  • One or more solvents selected from aqueous solutions containing water and electrolytes to eliminate impurities, unreacted monomers, etc. remaining on the coating film after drying, and to adjust the ion balance of the copolymer in the film. It is desirable to wash with running water or ultrasonic cleaning.
  • the aqueous solution containing the water and the electrolyte may be, for example, heated in the range of 40 ° C. to 95 ° C.
  • the aqueous solution containing the electrolyte PBS, physiological saline (containing only sodium chloride), dalbecolinic acid buffered saline, Tris buffered saline, HEPES buffered saline and Veronal buffered saline are preferable, and PBS is preferable. Especially preferable.
  • the coating film does not elute and remains firmly fixed to the substrate even when washed with water, PBS, alcohol, or the like. Even if the formed coating film adheres to the biological substance, it can be easily removed by washing with water or the like, and the surface of the substrate on which the coating film is formed has an ability to suppress the adhesion of the biological substance.
  • the film thickness of the coating film is preferably 5 to 1000 nm, more preferably 5 to 500 nm.
  • a substrate having a cell adhesion suppressing ability a commercially available cell culture dish having undergone cell low adhesion treatment, a cell incubator having a cell adhesion suppressing ability, or the like may be used, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-61609.
  • the cell culture vessel described in the above can be used, but is not limited thereto.
  • an ethylenically unsaturated monomer or a copolymer of a polysaccharide or a derivative thereof may be used.
  • ethylenically unsaturated monomers are one or two selected from the group consisting of (meth) acrylic acid and its esters; vinyl acetate; vinylpyrrolidone; ethylene; vinyl alcohol; and their hydrophilic functional derivatives.
  • Ethylene unsaturated monomers of more than one species can be mentioned.
  • polysaccharides or derivatives thereof include cellulosic polymers such as hydroxyalkyl cellulose (for example, hydroxyethyl cellulose or hydroxypropyl cellulose), starch, dextran, and curdlan.
  • the hydrophilic functional derivative refers to an ethylenically unsaturated monomer having a hydrophilic functional group or structure.
  • hydrophilic functional groups or structures include betaine structures; amide structures; alkylene glycol residues; amino groups; and sulfinyl groups.
  • Betaine structure means a monovalent or divalent group of a compound having an amphoteric center of a quaternary ammonium type cation structure and an acidic anion structure, for example, a phosphorylcholine group: Can be mentioned.
  • a phosphorylcholine group for example, a phosphorylcholine group:
  • examples of the ethylenically unsaturated monomer having such a structure include 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) and the like.
  • the amide structure is expressed by the following formula: [Here, R 16 , R 17 and R 18 are independent hydrogen atoms or organic groups (eg, methyl group, hydroxymethyl group, hydroxyethyl group, etc.)] Means the group represented by. Examples of ethylenically unsaturated monomers having such a structure include (meth) acrylamide, N- (hydroxymethyl) (meth) acrylamide and the like. Further, a monomer or polymer having such a structure is disclosed in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2010-169604.
  • the alkylene glycol residue remains after the hydroxyl groups of one or both terminals of the alkylene glycol (HO-Alk-OH; where Alk is an alkylene group having 1 to 10 carbon atoms) undergoes a condensation reaction with another compound. It means an alkyleneoxy group (-Alk-O-) and also includes a poly (alkyleneoxy) group in which an alkyleneoxy unit is repeated.
  • alkyleneoxy group -Alk-O-
  • Examples of the ethylenically unsaturated monomer having such a structure include 2-hydroxyethyl (meth) acrylate and methoxypolyethylene glycol (meth) acrylate.
  • a monomer or polymer having such a structure is disclosed in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-533489.
  • the amino group is of the formula: -NH 2 , -NHR 19 or -NR 20 R 21 [where R 19 , R 20 and R 21 are independent of each other and have an organic group (eg, 1 to 5 carbon atoms). It is a linear or branched alkyl group, etc.)] means a group represented by.
  • Amino groups in the present invention include quaternized or chlorinated amino groups. Examples of the ethylenically unsaturated monomer having such a structure include dimethylaminoethyl (meth) acrylate, 2- (t-butylamino) ethyl (meth) acrylate, and methacryloylcholine chloride.
  • the sulfinyl group has the following formula: [Here, R 22 is an organic group (for example, an organic group having 1 to 10 carbon atoms, preferably an alkyl group having 1 or more hydroxy groups and having 1 to 10 carbon atoms, etc.)]. Means the group represented by. Examples of the polymer having such a structure include copolymers disclosed in JP-A-2014-48278.
  • the cell in the present invention is the most basic unit constituting an animal or a plant, and has a cytoplasm and various organelles inside the cell membrane as its elements.
  • the nucleus containing DNA may or may not be contained inside the cell.
  • the animal-derived cells in the present invention include germ cells such as sperm and eggs, somatic cells constituting the living body, stem cells (pluripotent stem cells, etc.), precursor cells, cancer cells isolated from the living body, and isolated from the living body.
  • Cells that have acquired immortalization ability and are stably maintained in vitro (cell lines), cells that have been artificially modified from the living body, and cells that have been separated from the living body and have artificially exchanged nuclei. Etc. are included.
  • somatic cells constituting the living body are not limited to the following, but are not limited to, fibroblasts, bone marrow cells, B lymphocytes, T lymphocytes, neutrophils, erythrocytes, platelets, macrophages, monospheres, and bones.
  • Cells bone marrow cells, pericutaneous cells, dendritic cells, keratinocytes, fat cells, mesenchymal cells, epithelial cells, epidermal cells, endothelial cells, vascular endothelial cells, hepatic parenchymal cells, cartilage cells, oval cells, nervous system cells, Glia cells, neurons, oligodendrocytes, microglia, stellate glue cells, heart cells, esophageal cells, muscle cells (eg, smooth muscle cells or skeletal muscle cells), pancreatic beta cells, melanin cells, hematopoietic progenitor cells (eg) CD34-positive cells derived from umbilical cord blood), mononuclear cells and the like are included.
  • dendritic cells keratinocytes
  • fat cells mesenchymal cells
  • epithelial cells epidermal cells
  • endothelial cells vascular endothelial cells
  • hepatic parenchymal cells cartilage
  • the somatic cells include, for example, skin, kidney, spleen, adrenal gland, liver, lung, ovary, pancreas, uterus, stomach, colon, small intestine, large intestine, bladder, prostate, testis, thoracic gland, muscle, connective tissue, bone, cartilage, blood vessel. Includes cells taken from any tissue such as tissue, blood (including umbilical cord blood), bone marrow, heart, eye, brain or nerve tissue. Further, the somatic cell includes a cell whose differentiation is induced from a stem cell or a progenitor cell.
  • Stem cells are cells that have the ability to replicate themselves and differentiate into other multi-lineage cells, examples of, but not limited to, embryonic stem cells (ES cells). , Embryonic tumor cells, embryonic germ stem cells, artificial pluripotent stem cells (iPS cells), nerve stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, hepatic stem cells, pancreatic stem cells, muscle stem cells, germ stem cells, intestinal stem cells, cancer stem cells, Hair follicle stem cells and the like are included. Examples of pluripotent stem cells include ES cells, embryonic reproductive stem cells, and iPS cells among the stem cells. Progenitor cells are cells in the process of differentiating from the stem cells into specific somatic cells or germ cells.
  • Cancer cells are cells that are derived from somatic cells and have acquired infinite proliferative potential.
  • a cell line is a cell that has acquired infinite proliferative capacity by artificial manipulation in vitro. Among these, adherent cells that survive and proliferate by adhering to the scaffold are preferable, and fibroblasts or stem cells are more preferable.
  • the substrate for producing cell aggregates of the present application is characterized in that the completion time of cell aggregate formation after cell seeding is within 20 hours.
  • the production of cell aggregates, which normally takes several days, can be performed in a short time.
  • the completion time is within 20 hours, but may be within 15 hours, within 10 hours, within 9 hours, within 8 hours, within 7 hours, within 6 hours, or within 5 hours.
  • R a2 represents a linear or branched alkylene group having 1 to 5 carbon atoms
  • Rb represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms
  • a cell aggregate can be produced by forming the base material for cell culture on a spot on the cell culture substrate of the present application as described above and culturing the cells by a method known per se.
  • a repeating unit derived from a monomer represented by the above formula (I) and a repeating unit represented by the above formula (II) are represented on a substrate having the ability to suppress cell adhesion.
  • the step of seeding cells on the substrate for producing cell aggregates of the present invention which comprises a spot consisting of a copolymer containing a repeating unit derived from the monomer to be produced, and the cells are cultured within 20 hours after seeding to produce the aggregates. It is a method for producing a cell aggregate, which comprises a step of forming.
  • R a2 represents a linear or branched alkylene group having 1 to 5 carbon atoms] and a repeating unit derived from a monomer represented by the following formula (II):
  • R b represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms] which uses a copolymer containing a repeating unit derived from a monomer represented by the above as a base material for cell culture.
  • a method for improving the cell culture rate during the production of agglomerates which is carried out by reducing the molar ratio to the entire copolymer of the formula (I), or a method for improving the cell culture rate during the production of agglomerates. This is a method for controlling the cell culture rate during the production of cell aggregates.
  • the meanings and preferred embodiments of the symbols described in the formulas (I) and (II) are as described above.
  • the cell culture rate can be improved by reducing the molar ratio to the total of the repeating units derived from the above in the range of 99 mol% to 51 mol%. The reason for this is that if the amount of the monomer-derived cation moiety represented by the above formula (I) of the copolymer of the present application increases, the cell adhesion ability increases, but conversely, if the adhesion force is too strong, the cells of the present application co-exist. The cells adhered to the polymer and did not peel off, and cell aggregates could not be formed.
  • the cation / anion ratio for controlling the time for proper cell agglutination production may have an appropriate range depending on the type of cells used for cell agglutination production.
  • the method of the present application can improve the cell aggregate production rate, that is, the cell aggregate production time can be shortened, or the optimum cell aggregate production time can be set according to the cell type (that is, the cell aggregate production time). Can be controlled).
  • GFC Gel Filtration Chromatography
  • PEGDMA polyethylene glycol dimethacrylate
  • the reaction product was reprecipitated with hexane, which is a poor solvent, and the precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure.
  • the obtained powder was dissolved in pure water and the solution was transferred to a dialysis tube. Dialysis was performed for 72 hours to purify the reaction product.
  • the solution containing the reaction product was filtered through a glass fiber 1.0 ⁇ m filter (manufactured by AS ONE, model number: SYGF0605MNXX104), and the obtained filtrate was freeze-dried to obtain a copolymer.
  • the weight average molecular weight of this copolymer according to GFC was 770,000, and the degree of polydispersity was 4.1 (Synthetic Example Polymer 1).
  • the polymer was obtained as a reaction product by heating and stirring while maintaining the above environment for 24 hours.
  • the reaction product was reprecipitated with hexane, which is a poor solvent, and the precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure.
  • the obtained powder was dissolved in pure water and the solution was transferred to a dialysis tube. Dialysis was performed for 72 hours to purify the reaction product.
  • the solution containing the reaction product was filtered through a glass fiber 1.0 ⁇ m filter (manufactured by AS ONE, model number: SYGF0605MNXX104), and the obtained filtrate was freeze-dried to obtain a copolymer.
  • the weight average molecular weight of this copolymer according to GFC was 663,000, and the degree of polydispersity was 3.6 (Synthetic Example Polymer 2).
  • the obtained powder was dissolved in pure water and the solution was transferred to a dialysis tube. Dialysis was performed for 72 hours to purify the reaction product.
  • the solution containing the reaction product was filtered through a glass fiber 1.0 ⁇ m filter (manufactured by AS ONE, model number: SYGF0605MNXX104), and the obtained filtrate was freeze-dried to obtain a copolymer.
  • the weight average molecular weight of this copolymer according to GFC was 856,000, and the polydispersity was 4.4 (Synthetic Example Polymer 3).
  • polyethylene glycol dimethacrylate (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) were added to the above ethanol solution while keeping the temperature below 20 ° C.
  • the polymer was obtained as a reaction product by heating and stirring while maintaining the above environment for 24 hours.
  • the reaction product was reprecipitated with hexane, which is a poor solvent, and the precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure.
  • the obtained powder was dissolved in pure water and the solution was transferred to a dialysis tube. Dialysis was performed for 72 hours to purify the reaction product.
  • the solution containing the reaction product was filtered through a glass fiber 1.0 ⁇ m filter (manufactured by AS ONE, model number: SYGF0605MNXX104), and the obtained filtrate was freeze-dried to obtain a copolymer.
  • the weight average molecular weight of this copolymer according to GFC was 508,000, and the degree of polydispersity was 2.9 (Synthetic Example Polymer 4).
  • polyethylene glycol dimethacrylate (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) were added to the above ethanol solution while keeping the temperature below 20 ° C.
  • the polymer was obtained as a reaction product by heating and stirring while maintaining the above environment for 24 hours.
  • the reaction product was reprecipitated with hexane, which is a poor solvent, and the precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure.
  • the obtained powder was dissolved in pure water and the solution was transferred to a dialysis tube. Dialysis was performed for 72 hours to purify the reaction product.
  • the solution containing the reaction product was filtered through a glass fiber 1.0 ⁇ m filter (manufactured by AS ONE, model number: SYGF0605MNXX104), and the obtained filtrate was freeze-dried to obtain a copolymer.
  • the weight average molecular weight of this polymer according to GFC was 578,000, and the polydispersity was 3.6 (Synthetic Example Polymer 5).
  • Example 1> Composition analysis of polymer by 1H-NMR measurement
  • D 2 O heavy water
  • the weight average molecular weight Mw was 500,000 or more.
  • the range of molecular weight distribution (PDI) was 2.9 or more, which was a relatively wide distribution. This is because the copolymer contains a polyfunctional cross-linking agent, which makes it possible to produce a polymer having reduced elution and excellent coatability.
  • Example 2 Production of an aqueous polymer solution for producing a base material for cell culture 0.01 g of each of Synthesis Example Polymers 1 to 5 and 100 g of sterilized water were added and dissolved to prepare base materials 1 to 5 for cell culture.
  • Example 3 Preparation of cell agglutinating plate> (3-1. Preparation of cell low adhesion plate)
  • a coating solution was prepared from the copolymer-containing varnish according to the production method described in Example 30 of WO2014 / 196650.
  • the prepared coating solution was added to the wells of a 24-well cell culture plate (manufactured by BD Biosciences, # 351147) to a concentration of 2 mL (solid content 0.5% by mass) / well, and allowed to stand at room temperature for 1 hour. , Excess coating solution was removed. Then, after adding 3 mL of sterilized water per well, it was removed and washed. Similarly, the cells were washed twice more and dried at room temperature for 30 minutes to obtain a cell low-adhesion plate.
  • Example 4 Confirmation test of cell agglutination rate> (4-1.
  • Preparation of cells mouse fetal fibroblasts (C3H10T1 / T2 cells: manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) were used.
  • 10% of FBS manufactured by Sigma-Aldrich
  • 1% of Glutamine / Penicillin / Streptomycin manufactured by Gibco
  • BME medium manufactured by Gibco
  • the cells were statically cultured for 2 days or more in a petri dish (medium 10 mL) having a diameter of 10 cm while maintaining a 5% carbon dioxide concentration in a 37 ° C./CO 2 incubator. Subsequently, the cells were washed with 3 mL of PBS solution (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 3 mL of trypsin-EDTA solution (manufactured by PromoCell) was added, and the cells were allowed to stand at room temperature for 3 minutes to detach the cells. The cells were collected by adding 7 mL of the above medium.
  • PBS solution manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • trypsin-EDTA solution manufactured by PromoCell
  • the cells were uniformly adhered only to the portion where the base material was spotted regardless of the DM / MA ratio.
  • rate of cell aggregation differed with the passage of time depending on the DM / MA ratio.
  • the cell adhesion area at each time was quantified. As shown in FIGS. 2 and 3, the cell adhesion area is almost constant after 2 hours regardless of the DM / MA ratio, but at 7 hours and 9 hours, the cell adhesion area increases as the DM ratio increases. became. At 15 hours later, agglutination was completely completed in all compositions, and the spheroid diameter became almost constant regardless of the composition. From the above, by changing the DM / MA ratio under the conditions of constant concentration of the base material and constant coating amount according to the present invention, agglutination is performed while keeping the initial adhesion area of cells and the size of cell aggregates finally formed constant. It is possible to control the speed.
  • a substrate for producing cell aggregates which can significantly reduce the production time of cell aggregates, specifically, a substrate for producing cell aggregates in which the completion time of cell aggregate formation after cell seeding is within 20 hours. (For example, petri dishes or dishes for cell culture, plates) and the like can be provided.

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Abstract

細胞凝集塊を簡便かつ迅速に、量産性高く製造するための、細胞凝集塊製造用基板や細胞凝集塊の製造方法を提供すること。　細胞の付着抑制能を有する基板上に、下記式（Ｉ）及び（ＩＩ）：［式中、Ｕａ１、Ｕａ２、Ｒa１、Ｒa２及びＲｂは、明細書及び特許請求の範囲に記載のとおりである］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含む共重合体からなるスポットを備える細胞凝集塊製造用基板であって、細胞播種後の凝集塊形成完了時間が２０時間以内である、細胞凝集塊製造用基板。

Description

細胞凝集速度が制御可能な細胞培養器
　本発明は、特定の構造を有するポリマーを細胞培養の下地剤として使用する、細胞凝集速度が制御可能な細胞凝集塊製造用基板及びその製造方法、細胞凝集塊の製造方法、細胞凝集塊製造時の細胞培養速度を向上する方法、細胞凝集塊製造時の凝集塊形成速度を制御する方法、並びに細胞凝集塊形成促進用の細胞培養容器下地剤に関する。
　細胞凝集塊（スフェロイド又は細胞塊などともいう）は、三次元的に培養され、細胞同士が自己集合・凝集化した細胞集合体であり、生体様構造が構築されることから、細胞の機能を長期間維持でき、生理的機能が向上することが報告されている。そのため、細胞凝集塊の、創薬研究における、又は細胞治療や再生治療における利用についての期待が高まっている。
　それに伴い、細胞凝集塊を簡便かつ迅速に、均一かつ大量に作製できる組織工学技術の開発が再生医療の実用化や創薬試験の効率化のための重要課題とされているが、細胞凝集塊製造のための細胞培養には、培養時間が長期間（例えば数日）要する場合があり、量産性に優れないという課題があった。
　特許文献１には、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を有する、ポリ（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート）由来のポリマーを用いた細胞培養器の製造方法が開示されている。
特開２０１４－１６２８６５号公報
　上記細胞凝集塊を簡便かつ迅速に、量産性高く製造するための、細胞凝集塊製造用基板及びその製造方法、並びに細胞凝集塊の製造方法等を提供することである。
　本発明は以下を包含する。
［１］　細胞の付着抑制能を有する基板上に、下記式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
［式中、
　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位、及び、下記式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
［式中、
　Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含む共重合体からなるスポットを備える細胞凝集塊製造用基板であって、細胞播種後の凝集塊形成完了時間が２０時間以内である、細胞凝集塊製造用基板。
［２］　上記式（Ｉ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位の、上記式（Ｉ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位及び上記式（ＩＩ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位の合計に対するモル比率が、９９モル％～５１モル％である、上記［１］に記載の細胞凝集塊製造用基板。
［３］　上記共重合体が、さらに下記式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
［式中、
　Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒeは、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表し、ｎは１～５０の数を表す］で表されるモノマーから誘導される構造単位を含む、上記［１］又は［２］に記載の細胞凝集塊製造用基板。
［４］　上記細胞が幹細胞又は線維芽細胞である、上記［１］～［３］何れかに記載の細胞凝集塊製造用基板。
［５］　上記細胞の付着抑制能を有する基板が、下記式（ａ）で表される基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される基を含む繰り返し単位とを含む共重合体（Ｐ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
［式中、
　Ｕａ１１、Ｕａ１２、Ｕｂ１１、Ｕｂ１２及びＵｂ１３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ａｎ－は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す］
を含むコーティング膜をその表面の少なくとも一部に含む、上記［１］～［４］何れかに記載の細胞凝集塊製造用基板。
［６］　細胞の付着抑制能を有する基板上に、下記式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
［式中、
　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位、及び、下記式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
［式中、
　Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含む共重合体を複数のスポット状に塗布し、次いで乾燥する工程を含む、細胞凝集塊製造用基板の製造方法であって、細胞播種後の凝集塊形成完了時間が２０時間以内である、細胞凝集塊製造用基板の製造方法。
［７］　上記塗布工程をインクジェット方式で行う、上記［６］に記載の細胞凝集塊製造用基板の製造方法。
［８］　細胞の付着抑制能を有する基板上に、下記式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
［式中、
　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位、及び、下記式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
［式中、
　Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含む共重合体からなるスポットを備える細胞凝集塊製造用基板に細胞を播種する工程と、細胞を播種後２０時間以内で培養し凝集塊を形成する工程を含む、細胞凝集塊の製造方法。
［９］　細胞の付着抑制能を有する基板上に、下記式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
［式中、
　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位、及び、下記式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
［式中、
　Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含む共重合体を細胞培養の下地剤として使用する、細胞凝集塊製造時の細胞培養速度を向上する方法であって、式（Ｉ）から誘導される繰り返し単位の共重合体全体に対するモル比率を低下させることにより行う、方法。
［１０］　細胞の付着抑制能を有する基板上に、下記式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
［式中、
　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位、及び、下記式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
［式中、
　Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含む共重合体を細胞培養の下地剤として使用する、細胞凝集塊製造時の細胞培養速度を制御する方法であって、共重合体における式（Ｉ）と式（ＩＩ）のモノマー比率を変化させることにより行う、方法。
［１１］　下記式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
［式中、
　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位、及び、下記式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
［式中、
　Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含む共重合体を含む、細胞凝集塊形成促進用の細胞培養容器下地剤。
［１２］　上記式（Ｉ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位の、上記式（Ｉ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位及び上記式（ＩＩ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位の合計に対するモル比率が、９９モル％～５１モル％である、上記［１１］に記載の下地剤。
［１３］　上記共重合体が、さらに下記式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
［式中、
　Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒeは、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表し、ｎは１～５０の数を表す］で表されるモノマーから誘導される構造単位を含む、上記［１１］又は［１２］に記載の下地剤。
［１４］　細胞凝集塊形成促進が、細胞播種後の凝集塊形成完了時間が２０時間以内であることを特徴とする、上記［１１］～［１３］何れかに記載の下地剤。
　発明者らが鋭意検討した結果、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を有する共重合体の、具体的にはカチオン性官能基のモル比率を所定の範囲内に制御することにより（特に、該所定の範囲において低減させることにより）、該共重合体を細胞凝集塊製造のための下地剤として使用した場合、細胞凝集塊の製造速度が著しく向上すること、又、カチオン性官能基及びアニオン性官能基のモル比を適切に変化させることで、細胞凝集塊製造の速度を制御可能であることを見出し、本発明を完成させた。
　本発明により、従来法（例えば、細胞培養皿による）に比較し、細胞凝集塊の製造時間が大幅に短縮できる細胞凝集塊製造用基板、具体的には、細胞播種後の細胞凝集塊形成完了時間が２０時間以内である細胞凝集塊製造用基板及びその製造方法、細胞凝集塊の製造方法、細胞凝集塊製造速度を向上する方法、細胞凝集塊製造時の凝集塊形成速度を制御する方法、並びに細胞凝集塊形成促進用の細胞培養容器下地剤が提供できる。
実施例４の細胞接着及び凝集化の様子を観察した顕微鏡写真である。 実施例４の細胞接着面積と細胞培養時間を対比したグラフである。 実施例４の細胞接着面積と細胞培養時間を対比した表である（図２の数字データである）。 実施例４の細胞接着面積と共重合体中のメタクリル酸２－（ジメチルアミノ）エチル（図中、ＤＭと表記される）及びメタクリル酸（図中、ＭＡと表記される）に対するＤＭモル比率を対比したグラフである。
＜細胞凝集塊製造用基板及びその製造方法＞
　本願の細胞凝集塊製造用基板は、細胞の付着抑制能を有する基板上に、下記式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
［式中、
　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位、及び、下記式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
［式中、
　Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含む共重合体からなるスポットを備える細胞凝集塊製造用基板であって、細胞播種後の凝集塊形成完了時間が２０時間以内である、細胞凝集塊製造用基板である。以下順に説明する。
（共重合体）
　本発明に係る共重合体は、
　下記式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　［式中、
　Ｕａ１、Ｕａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるカチオン性モノマーと、下記式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
［式中、
　Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるアニオン性モノマーを重合することで得られる共重合体である。
　本明細書において、他に定義のない限り、「炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基」としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓ－ブチル基、t－ブチル基、ｎ－ペンチル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、３－メチルブチル基、１，１－ジメチルプロピル基、１，２－ジメチルプロピル基、２，２－ジメチルプロピル基又は１－エチルプロピル基が挙げられる。
　Ｒa１及びＲｂは、それぞれ独立して、水素原子及びメチル基から選ばれることが好ましい。
　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基及びｎ－ブチル基から選ばれることが好ましいが、メチル基又はエチル基であることが好ましく、メチル基が最も好ましい。
　本明細書において、他に定義のない限り、「炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基」としては、例えばメチレン基、エチレン基、プロピレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、１－メチルプロピレン基、２－メチルプロピレン基、ジメチルエチレン基、エチルエチレン基、ペンタメチレン基、１－メチル－テトラメチレン基、２－メチル－テトラメチレン基、１，１－ジメチル－トリメチレン基、１，２－ジメチル－トリメチレン基、２，２－ジメチル－トリメチレン基、１－エチル－トリメチレン基等が挙げられる。これらの中で、Ｒa２としてはエチレン基及びプロピレン基から選ばれることが好ましい。 
　したがって、上記式（Ｉ）で表されるカチオン性モノマーとしては、２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチルメタクリレートなどが挙げられ、２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレートが好ましい。上記式（ＩＩ）で表されるアニオン性モノマーとしては、アクリル酸、メタクリル酸などが挙げられ、メタクリル酸が好ましい。
　前記ポリマー中の式（Ｉ）で表されるモノマー由来の単位／式（ＩＩ）で表されるモノマー由来の単位のモル比が、９９／１～５１／４９である。好ましくは９８／２～６０／４０である。好ましくは９５／５～７０／３０であり、好ましくは９３／７～７０／３である。
　式（ＩＩ）のモル比が５０以上であると、共重合体のアニオン性が過剰となり、細胞の接着力が低下するためである。
＜２つ以上の炭素―炭素不飽和結合を有するモノマー＞
　上記共重合体は、式（Ｉ）／式（ＩＩ）で表されるモノマーと共に、さらに２つ以上の炭素－炭素不飽和結合を有するモノマーとを重合することで得られる共重合体であってもよい。２つ以上の炭素－炭素不飽和結合を有するモノマーとは、具体的には、２つ以上の炭素－炭素二重結合を有するモノマーであり、例えば多官能アクリレート化合物、多官能アクリルアミド化合物、多官能ポリエステル、又はイソプレン化合物などが挙げられる。
　好ましい具体例としては下記式（ＩＩＩ）～（Ｖ）で表されるモノマーが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　式中、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒeは、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表し、ｎは１～５０の数を表す。これらの中で、式（ＩＩＩ）で表されるモノマーであることが好ましい。
　前記共重合体全体に対する式（ＩＩＩ）～（Ｖ）で表されるモノマーのモル比は、０～５．０％であることが好ましい。さらに好ましくは０～３．０％である。
　式（ＩＩＩ）～（Ｖ）のモル比が５．０％以上であると、過度な架橋による高分子量化により、製造中にゲル化して製造を困難にする恐れがあるためである。
　Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、水素原子及びメチル基から選ばれることが好ましい。
　Ｒｅはメチレン基、エチレン基及びプロピレン基から選ばれることが好ましく、エチレン基が最も好ましい。
　ｎは１～５０の数であるが、ｎは１～３０の数であることが好ましく、ｎは１～１０の数であることが好ましい。
　本発明に係る共重合体は、さらに任意の追加モノマー成分として、エチレン性不飽和モノマー、又は多糖類若しくはその誘導体が共重合していてもよい。エチレン性不飽和モノマーの例としては、（メタ）アクリル酸及びそのエステル；酢酸ビニル；ビニルピロリドン；エチレン；ビニルアルコール；並びにそれらの親水性の官能性誘導体からなる群より選択される１種又は２種以上のエチレン性不飽和モノマーを挙げることができる。多糖類又はその誘導体の例としては、ヒドロキシアルキルセルロース（例えば、ヒドロキシエチルセルロース又はヒドロキシプロピルセルロース）等のセルロース系高分子、デンプン、デキストラン、カードランを挙げることができる。
　親水性の官能性誘導体とは、親水性の官能基又は構造を有するエチレン性不飽和モノマーを指す。親水性の官能性基又は構造の例としては、ベタイン構造；アミド構造；アルキレングリコール残基；アミノ基；並びにスルフィニル基等が挙げられる。
　ベタイン構造は、第４級アンモニウム型の陽イオン構造と、酸性の陰イオン構造との両性中心を持つ化合物の一価又は二価の基を意味し、例えば、ホスホリルコリン基：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
を挙げることができる。そのような構造を有するエチレン性不飽和モノマーの例としては、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）等を挙げることができる。
　アミド構造は、下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
［ここで、Ｒ１６、Ｒ１７及びＲ１８は、互いに独立して、水素原子又は有機基（例えば、置換されていてもよい炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基等、具体的には、メチル基、イソプロピル基、ヒドロキシメチル基又はヒドロキシエチル基等）である］
で表される基を意味する。そのような構造を有するエチレン性不飽和モノマーの例としては、（メタ）アクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－（ヒドロキシメチル）（メタ）アクリルアミド等を挙げることができる。さらに、そのような構造を有するモノマー又はポリマーは、例えば、特開２０１０－１６９６０４号公報等に開示されている。
　アルキレングリコール残基は、アルキレングリコール（ＨＯ－Ａｌｋ－ＯＨ；ここでＡｌｋは、炭素原子数１乃至１０のアルキレン基である）の片側端末又は両端末の水酸基が他の化合物と縮合反応した後に残るアルキレンオキシ基（－Ａｌｋ－Ｏ－）を意味し、アルキレンオキシ単位が繰り返されるポリ（アルキレンオキシ）基も包含する。そのような構造を有するエチレン性不飽和モノマーの例としては、２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等を挙げることができる。さらに、そのような構造を有するモノマー又はポリマーは、例えば、特開２００８－５３３４８９号公報等に開示されている。
　アミノ基は、式：－ＮＨ２、－ＮＨＲ１９又は－ＮＲ２０Ｒ２１［ここで、Ｒ１９、Ｒ２０及びＲ２１は、互いに独立して、有機基（例えば、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基等）である］で表される基を意味する。本発明におけるアミノ基には、４級化又は塩化されたアミノ基を包含する。そのような構造を有するエチレン性不飽和モノマーの例としては、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、２－（ｔ－ブチルアミノ）エチル（メタ）アクリレート、メタクリロイルコリンクロリド等を挙げることができる。
　スルフィニル基は、下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
［ここで、Ｒ２２は、有機基（例えば、炭素原子数１乃至１０の有機基、好ましくは、１個以上のヒドロキシ基を有する炭素原子数１乃至１０のアルキル基等）である］
で表される基を意味する。そのような構造を有するポリマーとして、特開２０１４－４８２７８号公報等に開示された共重合体を挙げることができる。
　前記共重合体全体に対する式（ＩＩ）で表されるモノマーの占めるモル％の値と、前記調製工程時のモノマー仕込み量全体に対する式（ＩＩ）で表される単量体の占めるモル％の値の差が、０～１０モル％である。本願の共重合体は後述する製造方法により、モノマー仕込み比と、製造された共重合体の実測値との差が少なく、０～１０モル％である。さらに好ましくは０～８モル％である。
　前記共重合体の数平均分子量（Ｍｎ）は、２０，０００～１，０００，０００であり、５０，０００～８００，０００であることがさらに好ましい。
　前記共重合体の重量平均分子量（Ｍｗ）と前記数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）が、１．０１～１０．００であり、１．２～８．０であることが好ましく、１．４～６．０であることが好ましく、１．５～５．０であることが好ましく、１．６～４．５であることが好ましい。
　前記重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）は、例えば実施例に記載のGel Filtration Chromatographyにより求めることができる。
　本発明に係る共重合体を利用することで、細胞を接着させた後に剥離させて細胞凝集塊を形成させることが可能である。なお細胞凝集塊とは、細胞が凝集した結果形成する構造体を示し、球状やリング状などのように形状が限定されない。従来の細胞低接着プレート上での非接着培養により作製される細胞凝集塊と比較し、接着面積の規定による細胞凝集塊のサイズ調整（任意の大きさの細胞凝集塊が製造できる）などの点でメリットがある。
（基板）
　前記共重合体を後述の方法にて、細胞培養容器下地剤とし、それを基板の表面に塗布し乾燥することにより、本発明の細胞凝集塊製造用基板が製造できる。ここで「表面」とは、細胞又は細胞培養液などの内容物と接する面を指す。
　基板表面の形状は、平面であっても凹凸があってもよいが、平面形状であることが好ましい。
　基板の材質は、例えば、ガラス、金属、金属含有化合物若しくは半金属含有化合物、活性炭又は樹脂を挙げることができる。金属は、典型金属：（アルミニウム族元素：Al、Ga、In；鉄族元素：Fe、Co、Ni；クロム族元素：Cr、Mo、W、U；マンガン族元素：Mn、Re；貴金属：Cu、Ag、Au等が挙げられる。金属含有化合物若しくは半金属含有化合物は、例えば基本成分が金属酸化物で、高温での熱処理によって焼き固めた焼結体であるセラミックス、シリコンのような半導体、金属酸化物若しくは半金属酸化物（シリコン酸化物、アルミナ等）、金属炭化物若しくは半金属炭化物、金属窒化物若しくは半金属窒化物（シリコン窒化物等）、金属ホウ化物若しくは半金属ホウ化物等の無機化合物の成形体等の無機固体材料、アルミニウム、ニッケルチタン、ステンレス（ＳＵＳ３０４、ＳＵＳ３１６、ＳＵＳ３１６Ｌ等）が挙げられる。
　樹脂としては、天然樹脂若しくはその誘導体、又は合成樹脂いずれでもよく、天然樹脂若しくはその誘導体としては、セルロース、三酢酸セルロース（ＣＴＡ）、ニトロセルロース（ＮＣ）、デキストラン硫酸を固定化したセルロース等、合成樹脂としてはポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリエステル系ポリマーアロイ（ＰＥＰＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリスルホン（ＰＳＦ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン（ＰＵ）、エチレンビニルアルコール（ＥＶＡＬ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリエステル、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、超高分子量ポリエチレン（ＵＨＰＥ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン樹脂（ＡＢＳ）又はテフロン（登録商標）が好ましく用いられる。
　本発明の細胞凝集塊製造用基板の製造では、共重合体を、基板の表面の少なくとも一部に存在するようにコーティングする際に、高温での処理を要しないため、耐熱性が低い樹脂等も適用可能である。
　基板の材質は１種類であっても２種類以上の組み合わせであってもよいが、本願の細胞凝集塊製造用基板は、例えば、細胞培養凝集塊を大量製造するために、該基板がベルトコンベアーのように巻き取り（ロール方式）できるような柔軟性を有する基板であることが好ましい。上記ロール方式に用いられる基板の材質としては、合成樹脂、天然高分子が挙げられる。
　又、本願の基板は、いわゆる細胞培養器で使用される基板であってもよい。細胞の培養に一般的に用いられるペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュなどのシャーレ又はディッシュ、細胞培養フラスコ、スピナーフラスコなどのフラスコ、プラスチックバッグ、テフロン（登録商標）バッグ、培養バッグなどのバッグ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレートなどのプレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、ローラーボトルなどのボトル等が挙げられる。
　本願の共重合体は、自体公知の方法（例えば特開２０１４－１６２８６５号公報、ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／０３２７８５に記載）で製造できる。
（下地剤）
　前記共重合体に、自体公知の方法にて含水溶液を混合させることで、本発明の細胞培養容器下地剤が製造できる。本発明の下地剤は、細胞凝集塊形成促進用として有用である。細胞凝集塊形成促進とは、後述するように、細胞播種後の細胞凝集塊形成完了時間が２０時間以内であることを意味する。
　含水溶液とは、水、生理食塩水又はリン酸緩衝溶液などの塩含有水溶液、あるいは水又は塩含有水溶液とアルコールとを組み合わせた混合溶媒が挙げられる。アルコールとしては、炭素原子数２乃至６のアルコール、例えば、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、イソブタノール、ｔ－ブタノール、１－ペンタノール、２－ペンタノール、３－ペンタノール、１－ヘプタノール、２－ヘプタノール、２，２－ジメチル－１－プロパノール（＝ネオペンチルアルコール）、２－メチル－１－プロパノール、２－メチル－１－ブタノール、２－メチル－２－ブタノール（＝ｔ－アミルアルコール）、３－メチル－１－ブタノール、３－メチル－３－ペンタノール、シクロペンタノール、１－ヘキサノール、２－ヘキサノール、３－ヘキサノール、２，３－ジメチル－２－ブタノール、３，３－ジメチル－１－ブタノール、３，３－ジメチル－２－ブタノール、２－エチル－１－ブタノール、２－メチル－１－ペンタノール、２－メチル－２－ペンタノール、２－メチル－３－ペンタノール、３－メチル－１－ペンタノール、３－メチル－２－ペンタノール、３－メチル－３－ペンタノール、４－メチル－１－ペンタノール、４－メチル－２－ペンタノール、４－メチル－３－ペンタノール及びシクロヘキサノールが挙げられ、単独で又はそれらの組み合わせの混合溶媒を用いてもよい。
　さらに下地剤は、上記共重合体と溶媒の他に、必要に応じて得られる下地膜の性能を損ねない範囲で他の物質を添加することもできる。他の物質としては、ｐＨ調整剤、架橋剤、防腐剤、界面活性剤、容器又は基板との密着性を高めるプライマー、防カビ剤及び糖類等が挙げられる。
（スポット）
　本発明の細胞凝集塊製造用基板が備える、上記共重合体からなるスポット、好ましくは複数のスポット（塗布膜）は、基板の表面積に対するスポットの総面積の割合に関して特に制限は無いが、例えば３０％以上であり、かつ各スポットの直径が例えば５０～５０００μｍであり、スポット間の間隔が例えば３０～１０００μｍである。スポットの形状は、特に限定されない。例えば略円状、四角形形状であるが、略円状のスポットであることが好ましい。
　基板の表面積に対するスポットの総面積の割合、各スポットの直径やスポット間の間隔は、用いる細胞や基板の種類、細胞凝集塊の所望のサイズ等に応じて、所定の範囲から適宜選択することができるが、基板の表面積に対するスポットの総面積の割合は、３０％以上、４０％以上、５０％以上であることが好ましく、かつ９９％以下であることが好ましく、各スポットの直径は、５０～５０００μｍであり、３００～３０００μｍであることが好ましく、スポット間の間隔は、３０～１０００μｍであり、１００～５００μｍであることが好ましい。
　本発明は、細胞の付着抑制能を有する基板上に、細胞が接着し得る独立したマイクロサイズの領域（スポット）を、このように高密度で、好ましくは規則的に配することにより、均一なサイズのスフェロイドを一つの基板（容器）で一度に複数形成できる。
　上記共重合体からなるスポットは、共重合体、好ましくは上記細胞培養容器下地剤を塗布することにより形成することができる。下地剤の塗布の方式としては、例えばインクジェット法、スクリーン印刷法、スリットコート法、ロール・トゥー・ロール法等を用いることが出来るが、好ましくはインクジェット法又はスクリーン印刷等の印刷技術で行われる。
　別の塗布方法としては、例えば場合によりスポットの非形成箇所を保護した基板を上記下地剤に浸漬する、下地剤を場合によりスポットの非形成箇所を保護した基板（容器）に添加し、所定の時間静置する等の方法が用いられるが、基板、一態様として細胞培養容器の場合は、下地剤を場合によりスポットの非形成箇所を保護した容器に添加し、所定の時間静置する方法によって行われる。添加は、例えば、容器の全容積の０．５乃至１倍量の下地剤を、シリンジ等を用いて添加することによって行うことができる。静置は、容器又は基板の材質や細胞培養の下地剤の種類に応じて、時間や温度を適宜選択して実施されるが、例えば、１分から２４時間、好ましくは５分から３時間、１０乃至８０℃で実施される。これにより、細胞凝集塊製造用基板を製造することができる。
　また、かかる方法により得られる基板の表面のスポットは、乾燥工程を経ずにそのまま、あるいは水又は細胞培養に付される試料の媒質（例えば、水、緩衝液、培地等）を用いての洗浄後に、細胞凝集塊製造用基板として使用することができる。
　すなわち、上記基板の表面のスポットの形成後、４８時間以内、好ましくは２４時間以内、さらに好ましくは１２時間以内、さらに好ましくは６時間以内、さらに好ましくは３時間以内、さらに好ましくは１時間以内に乾燥工程を経ずにそのまま、あるいは水又は細胞培養に付される試料の媒質（例えば、水、緩衝液、培地等、特に好ましくは培地（例えば、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地））を用いての洗浄後に、細胞凝集塊製造用基板として使用することができる。
　細胞凝集塊製造用基板は、乾燥工程に付してもよい。乾燥工程は、大気下又は真空下にて、好ましくは、温度－２００℃乃至２００℃の範囲内で行なう。乾燥工程により、上記下地剤中の溶媒を取り除くことで、基体へ完全に固着する。
　スポットは、例えば室温（１０℃乃至３５℃、好ましくは２０℃乃至３０℃、例えば２５℃）での乾燥でも形成することができるが、より迅速にスポットを形成させるために、例えば４０℃乃至５０℃にて乾燥させてもよい。乾燥温度が－２００℃未満であると、一般的ではない冷媒を使用しなければならず汎用性に欠けることと、溶媒昇華のために乾燥に長時間を要し効率が悪い。乾燥温度が２００℃超であると、共重合体の熱分解が生じる。より好ましい乾燥温度は１０℃乃至１８０℃、より好ましい乾燥温度は２０℃乃至１５０℃である。
　本願の細胞凝集塊製造用基板は、以上の簡便な工程を経て製造される。
　また、スポット（塗布膜）に残存する不純物、未反応モノマー等を無くすために、水及び電解質を含む水溶液から選ばれる少なくとも１種の溶媒で洗浄する工程を実施してもよい。洗浄は、流水洗浄又は超音波洗浄等が望ましい。上記水及び電解質を含む水溶液は例えば４０℃乃至９５℃の範囲で加温されたものでもよい。電解質を含む水溶液は、ＰＢＳ、生理食塩水（塩化ナトリウムのみを含むもの）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水及びベロナール緩衝生理食塩水が好ましく、ＰＢＳが特に好ましい。固着後は水、ＰＢＳ及びアルコール等で洗浄してもコーティング膜は溶出せずに基体に強固に固着したままである。
　本願のスポット（塗布膜）の膜厚は、最大膜厚と最小膜厚が１～１０００ｎｍの範囲であり、好ましくは５～５００ｎｍの範囲である。
　本願の細胞凝集塊製造用基板は、細胞の付着抑制能を有する基板を用いて製造される。上記スポット（塗布膜）の形成前に、基板が細胞の付着抑制処理を施されたものであってよい。細胞の付着抑制能を有する基板は、例えば公知の細胞の付着抑制能を持つコーティング膜形成用組成物を塗布する工程を経て製造出来る。細胞の付着抑制能を有するコーティング膜形成組成物としては、下記式（ａ）で表される有機基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される有機基を含む繰り返し単位とを含む共重合体（Ｐ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
　［式中、
　Ｕａ１１、Ｕａ１２、Ｕｂ１１、Ｕｂ１２及びＵｂ１３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ａｎ－は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す］
と、溶媒とを含むコーティング膜形成用組成物を容器又は基板の表面に塗布し乾燥する工程を含むことが好ましい。上記コーティング膜は、基板表面の少なくとも一部に含めばよいが、細胞凝集塊を製造する表面（すなわち本願のスポットが存在する表面）全体に渡って、あるいは基板表面全体に渡って塗布されていることが好ましい。
　炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基は、上述のものと同一である。
　上記コーティング膜形成用組成物は例えば、ＷＯ２０１４／１９６６５０に記載されているコーティング膜形成用組成物が使用できる。
　上記コーティング膜形成用組成物の塗布方法としては、特に制限は無く、通常のスピンコート、ディップコート、溶媒キャスト法等の塗布法が用いられる。
　上記コーティング膜の乾燥工程は、大気下又は真空下にて、温度－２００℃乃至１８０℃の範囲内で行なう。乾燥工程により、上記コーティング膜形成用組成物中の溶媒を取り除くと共に、上記共重合体の式（ａ）及び式（ｂ）同士がイオン結合を形成して基体へ完全に固着する。
　上記コーティング膜は、例えば室温（１０℃乃至３５℃、例えば２５℃）での乾燥でも形成することができるが、より迅速にコーティング膜を形成させるために、例えば４０℃乃至５０℃にて乾燥させてもよい。またフリーズドライ法による極低温～低温（－２００℃乃至－３０℃前後）での乾燥工程を用いてもよい。フリーズドライは真空凍結乾燥と呼ばれ、通常乾燥させたいものを冷媒で冷却し、真空状態にて溶媒を昇華により除く方法である。フリーズドライで用いられる一般的な冷媒は、ドライアイスとメタノールを混合媒体（－７８℃）、液体窒素（－１９６℃）等が挙げられる。
　乾燥温度が－２００℃以下であると、一般的ではない冷媒を使用しなければならず汎用性に欠けることと、溶媒昇華のために乾燥に長時間を要し効率が悪い。乾燥温度が２００℃以上であると、コーティング膜表面のイオン結合反応が進みすぎて該表面が親水性を失い、生体物質付着抑制能が発揮されない。より好ましい乾燥温度は１０℃乃至１８０℃、より好ましい乾燥温度は２５℃乃至１５０℃である。
　乾燥後、該コーティング膜上に残存する不純物、未反応モノマー等を無くすため、さらには膜中の共重合体のイオンバランスを調節するために、水及び電解質を含む水溶液から選ばれる１以上の溶媒で流水洗浄又は超音波洗浄等で洗浄することが望ましい。上記水及び電解質を含む水溶液は例えば４０℃乃至９５℃の範囲で加温されたものでもよい。電解質を含む水溶液は、ＰＢＳ、生理食塩水（塩化ナトリウムのみを含むもの）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水及びベロナール緩衝生理食塩水が好ましく、ＰＢＳが特に好ましい。固着後は水、ＰＢＳ及びアルコール等で洗浄してもコーティング膜は溶出せずに基体に強固に固着したままである。形成されたコーティング膜は生体物質が付着してもその後水洗等にて容易に除去することができ、上記コーティング膜が形成された基体表面は、生体物質の付着抑制能を有する。
　上記コーティング膜の膜厚は、好ましくは５～１０００ｎｍであり、さらに好ましくは５～５００ｎｍである。
　細胞の付着抑制能を有するとは、例えばＷＯ２０１６／０９３２９３の実施例に記載した方法で行う蛍光顕微鏡によるコーティング膜無し、又は細胞低吸着処理無しと比較した場合の相対吸光度（ＷＳＴ　Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ）（％）（（実施例の吸光度（ＷＳＴ　Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ））／（比較例の吸光度（ＷＳＴ　Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ）））が５０％以下、好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下であることを意味する。
　また、細胞の付着抑制能を有する基板として、市販の細胞低接着処理済みの細胞培養皿、細胞の付着抑制能を有する細胞培養器等を使用してもよい、例えば特開２００８－６１６０９号公報に記載されている細胞培養容器が使用できるが、これに限定されるものではない。
　本発明に係る細胞の付着抑制能を有するコーティング膜として、エチレン性不飽和モノマー、又は多糖類若しくはその誘導体が共重合したものを用いてもよい。エチレン性不飽和モノマーの例としては、（メタ）アクリル酸及びそのエステル；酢酸ビニル；ビニルピロリドン；エチレン；ビニルアルコール；並びにそれらの親水性の官能性誘導体からなる群より選択される１種又は２種以上のエチレン性不飽和モノマーを挙げることができる。多糖類又はその誘導体の例としては、ヒドロキシアルキルセルロース（例えば、ヒドロキシエチルセルロース又はヒドロキシプロピルセルロース）等のセルロース系高分子、デンプン、デキストラン、カードランを挙げることができる。
　親水性の官能性誘導体とは、親水性の官能基又は構造を有するエチレン性不飽和モノマーを指す。親水性の官能性基又は構造の例としては、ベタイン構造；アミド構造；アルキレングリコール残基；アミノ基；並びにスルフィニル基等が挙げられる。
　ベタイン構造は、第４級アンモニウム型の陽イオン構造と、酸性の陰イオン構造との両性中心を持つ化合物の一価又は二価の基を意味し、例えば、ホスホリルコリン基：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
を挙げることができる。そのような構造を有するエチレン性不飽和モノマーの例としては、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）等を挙げることができる。
　アミド構造は、下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
［ここで、Ｒ１６、Ｒ１７及びＲ１８は、互いに独立して、水素原子又は有機基（例えば、メチル基、ヒドロキシメチル基又はヒドロキシエチル基等）である］
で表される基を意味する。そのような構造を有するエチレン性不飽和モノマーの例としては、（メタ）アクリルアミド、Ｎ－（ヒドロキシメチル）（メタ）アクリルアミド等を挙げることができる。さらに、そのような構造を有するモノマー又はポリマーは、例えば、特開２０１０－１６９６０４号公報等に開示されている。
　アルキレングリコール残基は、アルキレングリコール（ＨＯ－Ａｌｋ－ＯＨ；ここでＡｌｋは、炭素原子数１乃至１０のアルキレン基である）の片側端末又は両端末の水酸基が他の化合物と縮合反応した後に残るアルキレンオキシ基（－Ａｌｋ－Ｏ－）を意味し、アルキレンオキシ単位が繰り返されるポリ（アルキレンオキシ）基も包含する。そのような構造を有するエチレン性不飽和モノマーの例としては、２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等を挙げることができる。さらに、そのような構造を有するモノマー又はポリマーは、例えば、特開２００８－５３３４８９号公報等に開示されている。
　アミノ基は、式：－ＮＨ２、－ＮＨＲ１９又は－ＮＲ２０Ｒ２１［ここで、Ｒ１９、Ｒ２０及びＲ２１は、互いに独立して、有機基（例えば、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基等）である］で表される基を意味する。本発明におけるアミノ基には、４級化又は塩化されたアミノ基を包含する。そのような構造を有するエチレン性不飽和モノマーの例としては、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、２－（ｔ－ブチルアミノ）エチル（メタ）アクリレート、メタクリロイルコリンクロリド等を挙げることができる。
　スルフィニル基は、下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
［ここで、Ｒ２２は、有機基（例えば、炭素原子数１乃至１０の有機基、好ましくは、１個以上のヒドロキシ基を有する炭素原子数１乃至１０のアルキル基等）である］
で表される基を意味する。そのような構造を有するポリマーとして、特開２０１４－４８２７８号公報等に開示された共重合体を挙げることができる。
（細胞）
　本発明における細胞とは、動物又は植物を構成する最も基本的な単位であり、その要素として細胞膜の内部に細胞質と各種の細胞小器官をもつものである。この際、ＤＮＡを内包する核は、細胞内部に含まれても含まれなくてもよい。例えば、本発明における動物由来の細胞には、精子や卵子などの生殖細胞、生体を構成する体細胞、幹細胞（多能性幹細胞等）、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が含まれる。生体を構成する体細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、線維芽細胞、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（たとえば、平滑筋細胞又は骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血前駆細胞（例えば、臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞）、及び単核細胞等が含まれる。当該体細胞は、例えば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液（臍帯血を含む）、骨髄、心臓、眼、脳又は神経組織などの任意の組織から採取される細胞が含まれる。さらに当該体細胞は、幹細胞又は前駆細胞から分化誘導された細胞が含まれる。
　幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞などが含まれる。多能性幹細胞としては、前記幹細胞のうち、ＥＳ細胞、胚性生殖幹細胞、ｉＰＳ細胞が挙げられる。前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。癌細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞である。これらの中でも、足場に接着することで生存及び増殖する、接着細胞が好ましく、線維芽細胞又は幹細胞がより好ましい。
（細胞播種後の細胞凝集塊形成時間）
　本願の細胞凝集塊製造用基板は、細胞播種後の細胞凝集塊形成完了時間が２０時間以内であることを特徴とする。通常であれば、数日を要する細胞凝集塊製造を、短時間で行うことができる。上記完了時間は２０時間以内であるが、１５時間以内、１０時間以内、９時間以内、８時間以内、７時間以内、６時間以内、５時間以内であってよい。
＜細胞凝集塊の製造方法＞
　本願の細胞凝集塊の製造方法は、細胞の付着抑制能を有する基板上に、下記式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
［式中、
　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位、及び、下記式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
［式中、
　Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含む共重合体を細胞培養の下地剤として使用する細胞凝集塊の製造方法であって、細胞播種後の凝集塊形成完了時間が２０時間以内である、細胞凝集塊の製造方法、である。式（Ｉ）、式（ＩＩ）に記載の記号の意味及び好ましい態様は上述の通りである。
　上記細胞培養の下地剤を、本願の細胞凝集塊製造用基板上に上述のようにスポット上に形成し、自体公知の方法で上記細胞を培養することにより、細胞凝集塊が製造できる。
　具体的に、本願の細胞凝集塊の製造方法は、細胞の付着抑制能を有する基板上に、上記式（Ｉ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位、及び上記式（ＩＩ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含む共重合体からなるスポットを備える、本発明の細胞凝集塊製造用基板に細胞を播種する工程と、細胞を播種後２０時間以内で培養し凝集塊を形成する工程を含む、細胞凝集塊の製造方法である。
＜細胞凝集塊製造速度を向上する方法、細胞凝集塊製造速度を制御する方法＞
　本願の細胞凝集塊製造速度を向上する方法は、細胞の付着抑制能を有する基板上に、下記式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
［式中、
　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位、及び、下記式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
［式中、
　Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含む共重合体を細胞培養の下地剤として使用する、細胞凝集塊製造時の細胞培養速度を向上する方法であって、式（Ｉ）の共重合体全体に対するモル比率を低下させることにより行う、細胞凝集塊製造時の細胞培養速度を向上する方法、又は細胞凝集塊製造時の細胞培養速度を制御する方法、である。式（Ｉ）、式（ＩＩ）に記載の記号の意味及び好ましい態様は上述の通りである。
　具体的には、上記式（Ｉ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位の、上記式（Ｉ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位及び上記式（ＩＩ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位の合計に対するモル比率を、９９モル％～５１モル％の範囲でより少なくすることにより細胞培養速度が向上できる。この理由は、本願の共重合体の上記式（Ｉ）で表されるモノマー由来のカチオン部分が増えると、細胞接着能が高くなるが、逆に接着力が強すぎると、細胞が本願の共重合体に接着したままで剥離せず、細胞凝集塊を形成することができず、逆に上記式（ＩＩ）由来のアニオン成分が多すぎると細胞が接着せず、本願の細胞凝集塊製造のための接着培養が達成できないためと考えられる。適切な細胞凝集塊製造のための時間を制御するためのカチオン／アニオン比率は、細胞凝集塊製造に使用する細胞の種類により、適切な範囲を有することが考えられる。本願の方法により細胞凝集塊製造速度を向上、すなわち細胞凝集塊の製造時間を短くすることが出来、あるいは細胞種により、最適な細胞凝集塊の製造時間を設定（すなわち、細胞凝集塊の製造時間を制御）することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜分子量の測定方法＞
　下記合成例に示す重量平均分子量はGel Filtration Chromatography（以下、ＧＦＣと略称する）による結果である。
（測定条件）
・装置：ＨＬＣ－８３２０ＧＰＣ（東ソー（株）製）
・ＧＦＣカラム：TSKgel G６０００+３０００PWXL-CP
・流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
・溶離液：塩含有の水／有機混合溶媒
・カラム温度：４０℃
・検出器：ＲＩ
・注入濃度：ポリマー固形分０．０５質量％
・注入量：１００μＬ
・検量線：三次近似曲線
・標準試料：ポリエチレンオキサイド（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）×１０種
＜合成例１＞熱重合による細胞培養の下地剤として使用する共重合体の製造（１）
　メタクリル酸２－（ジメチルアミノ）エチル（以下、「ＤＭ」と略称することもある）（東京化成工業（株）製）１０．００ｇにエタノール３１．４６ｇを加え十分に溶解した。次いでジメチル　１，１′-アゾビス（１－シクロヘキサンカルボキシレート）（製品名；ＶＥ－０７３、富士フイルム和光純薬（株）製）０．０１ｇ、メタクリル酸（以下、「ＭＡ」と略称することもある）（東京化成工業（株）製）０．４８ｇ、ポリエチレングリコールジメタクリレート（以下、「ＰＥＧＤＭＡ」と略称することもある）（ｎ＝約４）（東京化成工業（株）製）０．２１ｇを、２０℃以下に保ちながら、上記エタノール溶液に加えた。十分に攪拌して均一となった上記全てのものが入った混合液を冷却管付きの３つ口フラスコに加えて窒素フローし、撹拌しながらリフラックス温度まで昇温した。２４時間上記環境を維持した状態で加熱撹拌することで重合体が反応生成物として得られた。反応生成物を貧溶媒であるヘキサンで再沈殿させ、析出物を濾過により回収し減圧乾燥させた。得られた紛体を純水に溶解させ、溶液を透析チューブに移した。透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
　反応生成物を含む溶液をグラスファイバー製の１．０μｍフィルター（アズワン社製、型番：ＳＹＧＦ０６０５ＭＮＸＸ１０４）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、共重合体が得られた。ＧＦＣによるこの共重合体の重量平均分子量は７７０，０００、多分散度は４．１であった（合成例ポリマー１）。
＜合成例２＞熱重合による細胞培養の下地剤として使用する共重合体の製造（２）
　メタクリル酸２－（ジメチルアミノ）エチル（東京化成工業（株）製）１０．００ｇにエタノール４３．９０ｇを加え十分に溶解した。次いでジメチル　１，１′-アゾビス（１－シクロヘキサンカルボキシレート）（製品名；ＶＥ－０７３、富士フイルム和光純薬（株）製）０．０１ｇ、メタクリル酸（東京化成工業（株）製）０．９７ｇ、ポリエチレングリコールジメタクリレート（ｎ＝約４）（東京化成工業（株）製）０．２２ｇを、２０℃以下に保ちながら、上記エタノール溶液に加えた。十分に攪拌して均一となった上記全てのものが入った混合液を冷却管付きの３つ口フラスコに加えて窒素フローし、撹拌しながらリフラックス温度まで昇温した。２４時間上記環境を維持した状態で加熱撹拌することで重合体が反応生成物として得られた。反応生成物を貧溶媒であるヘキサンで再沈殿させ、析出物を濾過により回収し減圧乾燥させた。得られた紛体を純水に溶解させ、溶液を透析チューブに移した。透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
　反応生成物を含む溶液をグラスファイバー製の１．０μｍフィルター（アズワン社製、型番：ＳＹＧＦ０６０５ＭＮＸＸ１０４）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、共重合体が得られた。ＧＦＣによるこの、共重合体の重量平均分子量は６６３，０００、多分散度は３．６であった（合成例ポリマー２）。
＜合成例３＞熱重合による細胞培養の下地剤として使用する共重合体の製造（３）
　メタクリル酸２－（ジメチルアミノ）エチル（東京化成工業（株）製）１０．００ｇにエタノール４５．５１ｇを加え十分に溶解した。次いでジメチル　１，１′-アゾビス（１－シクロヘキサンカルボキシレート）（製品名；ＶＥ－０７３、富士フイルム和光純薬（株）製）０．０１ｇ、メタクリル酸（東京化成工業（株）製）１．３７ｇ、ポリエチレングリコールジメタクリレート（ｎ＝約４）（東京化成工業（株）製）０．２３ｇを、２０℃以下に保ちながら、上記エタノール溶液に加えた。十分に攪拌して均一となった上記全てのものが入った混合液を冷却管付きの３つ口フラスコに加えて窒素フローし、撹拌しながらリフラックス温度まで昇温した。２４時間上記環境を維持した状態で加熱撹拌することで重合体が反応生成物として得られた。反応生成物を貧溶媒であるヘキサンで再沈殿させ、析出物を濾過により回収し減圧乾燥させた。得られた紛体を純水に溶解させ、溶液を透析チューブに移した。透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
　反応生成物を含む溶液をグラスファイバー製の１．０μｍフィルター（アズワン社製、型番：ＳＹＧＦ０６０５ＭＮＸＸ１０４）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、共重合体が得られた。ＧＦＣによるこの共重合体の重量平均分子量は８５６，０００、多分散度は４．４であった（合成例ポリマー３）。
＜合成例４＞熱重合による細胞培養の下地剤として使用する共重合体の製造（４）
　メタクリル酸２－（ジメチルアミノ）エチル（東京化成工業（株）製）１０．００ｇにエタノール６７．０７ｇを加え十分に溶解した。次いでジメチル　１，１′-アゾビス（１－シクロヘキサンカルボキシレート）（製品名；ＶＥ－０７３、富士フイルム和光純薬（株）製）０．０１ｇ、メタクリル酸（東京化成工業（株）製）１．８３ｇ、ポリエチレングリコールジメタクリレート（ｎ＝約４）（東京化成工業（株）製）０．２４ｇを、２０℃以下に保ちながら、上記エタノール溶液に加えた。十分に攪拌して均一となった上記全てのものが入った混合液を冷却管付きの３つ口フラスコに加えて窒素フローし、撹拌しながらリフラックス温度まで昇温した。２４時間上記環境を維持した状態で加熱撹拌することで重合体が反応生成物として得られた。反応生成物を貧溶媒であるヘキサンで再沈殿させ、析出物を濾過により回収し減圧乾燥させた。得られた紛体を純水に溶解させ、溶液を透析チューブに移した。透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
　反応生成物を含む溶液をグラスファイバー製の１．０μｍフィルター（アズワン社製、型番：ＳＹＧＦ０６０５ＭＮＸＸ１０４）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、共重合体が得られた。ＧＦＣによるこの共重合体の重量平均分子量は５０８，０００、多分散度は２．９であった（合成例ポリマー４）。
＜合成例５＞熱重合による細胞培養の下地剤として使用する共重合体の製造（５）
　メタクリル酸２－（ジメチルアミノ）エチル（東京化成工業（株）製）１０．００ｇにエタノール７０．００ｇを加え十分に溶解した。次いでジメチル　１，１′-アゾビス（１－シクロヘキサンカルボキシレート）（製品名；ＶＥ－０７３、富士フイルム和光純薬（株）製）０．０１ｇ、メタクリル酸（東京化成工業（株）製）２．３５ｇ、ポリエチレングリコールジメタクリレート（ｎ＝約４）（東京化成工業（株）製）０．２５ｇを、２０℃以下に保ちながら、上記エタノール溶液に加えた。十分に攪拌して均一となった上記全てのものが入った混合液を冷却管付きの３つ口フラスコに加えて窒素フローし、撹拌しながらリフラックス温度まで昇温した。２４時間上記環境を維持した状態で加熱撹拌することで重合体が反応生成物として得られた。反応生成物を貧溶媒であるヘキサンで再沈殿させ、析出物を濾過により回収し減圧乾燥させた。得られた紛体を純水に溶解させ、溶液を透析チューブに移した。透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
　反応生成物を含む溶液をグラスファイバー製の１．０μｍフィルター（アズワン社製、型番：ＳＹＧＦ０６０５ＭＮＸＸ１０４）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、共重合体が得られた。ＧＦＣによるこのポリマーの重量平均分子量は５７８，０００、多分散度は３．６であった（合成例ポリマー５）。
＜実施例１＞（ポリマーの１Ｈ－ＮＭＲ測定による組成解析）
　合成例ポリマー１～５の核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）を、核磁気共鳴装置（ＢＲＵＫＥＲ社製、型番：ＡＳＣＥｎｄ５００）を用いて、重水（Ｄ２Ｏ）を標準物質として測定した。下記には、合成例ポリマー１～合成例ポリマー５に共通する代表的なピークを示す。
1H-NMR (in D2O) δ 0.8-1.2 (br, -CH2-C(CH3)-), 1.6-2.0 (br, -CH2-C(CH3)-), 2.2-2.4 (br, -N(CH3)2), 2.5-2.7 (br, -CH2-N(CH3)2), 4.0-4.2 (br, -O-CH2-).
　ここで、主鎖のメチル基-CH2-C(CH3)-（δ 0.8-1.2）のプロトン数（ＤＭのホモポリマーの場合はモノマー１分子につき３個）Ａと、側鎖の-O-CH2-基（δ 4.0-4.2）のメチルプロトン数（ＤＭのホモポリマーの場合はモノマー１分子につき２個）Ｂとから、側鎖が有するアミノ基の官能基数と、側鎖のカルボキシル基の官能基数との比を算出した。
　その結果、熱重合で合成した合成例１から６について、合成例１の場合は９２／８、合成例２の場合は８１／１９、合成例３の場合は７６／２４、合成例４の場合は７２／２８、合成例５の場合は７０／３０となった。詳細な結果を表１に示す。
　合成例１～５で合成したポリマーについて、重量平均分子量Ｍｗはいずれも５００，０００以上の高分子量体となった。また分子量分布（ＰＤＩ）の範囲は、２．９以上と比較的広い分布となった。これは多官能の架橋剤を共重合体に含有したためであり、これにより溶出を低減し、かつ塗布性に優れたポリマーを製造できた
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000049
＜実施例２＞ 細胞培養の下地剤製造用のポリマー水溶液の製造
　合成例ポリマー１～５をそれぞれ０．０１ｇ、滅菌水を１００ｇ加えて溶解させ、細胞培養の下地剤１～５を製造した。
＜実施例３：細胞凝集塊形成プレートの作製＞
（３－１．細胞低接着プレートの調製）
　ＷＯ２０１４／１９６６５０の実施例３０に記載の製造方法に従って、共重合体含有ワニスからコーティング溶液を調製した。調製したコーティング溶液を、２４穴細胞培養プレート（ＢＤバイオサイエンス社製、＃３５１１４７）のウェルに２ｍＬ（固形分０．５質量％）／ウェルとなるよう添加し、室温にて１時間静置後、過剰のコーティング溶液を除去した。その後、滅菌水を１ウェルあたり３ｍＬ添加後、除去して洗浄を行った。同様にさらに２回洗浄を行い、室温で３０分乾燥させて細胞低接着プレートを得た。
（細胞培養の下地剤の製造、細胞培養の下地膜として使用するポリマーコーティングプレートの調製）
（３－２）インクジェットによる細胞凝集塊形成用シャーレの作製
　インクジェット装置（（株）マイクロジェット製、型番：LaboJet-600）、及びインクジェットヘッド（型番：500-S-C）を用いて、上記で調製した細胞低接着シャーレに、細胞培養の下地剤１～５を５０nLずつスポット状に塗布した。室温で３０分間乾燥させて膜を形成させて細胞凝集塊形成用シャーレを得た。
＜実施例４：細胞凝集塊の形成速度の確認試験＞
（４－１．細胞の調製）
　細胞は、マウス胎児線維芽細胞（C3H10T1／T2細胞：ＤＳファーマバイオメディカル（株）製）を用いた。細胞の培養には、基礎培地となるＢＭＥ培地（Gibco社製）に対しＦＢＳ（Sigma-Aldrich社製）を１０％、Glutamine／Penicillin／Streptomycin（Gibco社製）を１％となるように添加した培地を用いた。細胞は、３７℃／ＣＯ２インキュベーター内にて５％二酸化炭素濃度を保った状態で、直径１０cmのシャーレ（培地１０mL）を用いて２日間以上静置培養した。引き続き、本細胞をＰＢＳ溶液（富士フイルム和光純薬（株）製）３mLで洗浄した後、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（PromoCell社製）３mLを添加して室温で３分間静置し細胞を剥離した。上記培地を７mL添加して細胞を回収した。本懸濁液を遠心分離（（株）トミー精工製、型番LC-230、２００×g／３分、室温）後、上清を除き、上記の培地を添加して細胞懸濁液を調製した。
（４－２．細胞凝集塊形成試験）
　上記実施例３にて調製したプレートに対して、細胞懸濁液を５．０×１０５cells／cm2となるように各１ｍL加えた。その後、５％二酸化炭素濃度を保った状態で、３７℃／ＣＯ２インキュベーター内にて２時間静置した。静置後、非接着細胞と培地を除去し、ＰＢＳで洗浄することで接着細胞のみをウェル上へ残した。洗浄後、新しい培地を１ｍL／well添加し、倒立型リサーチ顕微鏡ＩＸ８３（オリンパス（株）製）を用いて培養しながらタイムラプスにて細胞接着及び凝集化の様子を観察した。図１に示すように、２時間後の時点ではＤＭ／ＭＡの比率に拠らず下地剤をスポットした部分のみに細胞が均一に接着していた。また時間経過とともにＤＭ／ＭＡの比率により細胞が凝集化する速度が異なった。
　画像解析ソフトＩｍａｇｅJを用いて、各時間の細胞接着面積を定量した。図２、図３に示すように２時間後の時点ではＤＭ／ＭＡ比によらずほぼ一定であるが、７時間後、９時間後の時点ではＤＭの比率が高くなるにつれて細胞接着面積が大きくなった。また１５時間後の時点ではすべての組成において完全に凝集化が終了し、組成に拠らずほぼ一定の大きさのスフェロイド径となった。以上から本発明により下地剤の濃度一定、塗布量一定の条件でＤＭ／ＭＡ比率を変えることにより、細胞の初期接着面積及び最終的に形成する細胞凝集塊のサイズを一定に保ちつつ、凝集化速度を制御することが可能である。
　このように、共重合体のカチオン性官能基のモル比率を所定の範囲内に制御することにより、該共重合体を細胞凝集塊製造のための下地剤として使用した場合、細胞凝集塊の製造速度が著しく向上すること、又、カチオン性官能基及びアニオン性官能基のモル比を適切に変化させることで、細胞凝集塊製造の速度を制御可能であることが明らかとなった。したがって本発明により、細胞凝集塊の製造時間が大幅に短縮できる細胞凝集塊製造用基板、具体的には、細胞播種後の細胞凝集塊形成完了時間が２０時間以内である細胞凝集塊製造用基板（例えば、細胞培養用のシャーレ又はディッシュ、プレート）等が提供できる。

Claims (14)

  1. 　細胞の付着抑制能を有する基板上に、下記式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    ［式中、
    　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位、及び、下記式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    ［式中、
    　Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含む共重合体からなるスポットを備える細胞凝集塊製造用基板であって、細胞播種後の凝集塊形成完了時間が２０時間以内である、細胞凝集塊製造用基板。
  2. 　上記式（Ｉ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位の、上記式（Ｉ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位及び上記式（ＩＩ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位の合計に対するモル比率が、９９モル％～５１モル％である、請求項１に記載の細胞凝集塊製造用基板。
  3. 　上記共重合体が、さらに下記式（ＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    ［式中、
    　Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒeは、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表し、ｎは１～５０の数を表す］で表されるモノマーから誘導される構造単位を含む、請求項１又は２に記載の細胞凝集塊製造用基板。
  4. 　上記細胞が幹細胞又は線維芽細胞である、請求項１～３何れか１項に記載の細胞凝集塊製造用基板。
  5. 　上記細胞の付着抑制能を有する基板が、下記式（ａ）で表される基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される基を含む繰り返し単位とを含む共重合体（Ｐ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    ［式中、
    　Ｕａ１１、Ｕａ１２、Ｕｂ１１、Ｕｂ１２及びＵｂ１３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ａｎ－は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す］
    を含むコーティング膜をその表面の少なくとも一部に含む、請求項１～４何れか１項に記載の細胞凝集塊製造用基板。
  6. 　細胞の付着抑制能を有する基板上に、下記式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    ［式中、
    　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位、及び、下記式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
    ［式中、
    　Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含む共重合体を複数のスポット状に塗布し、次いで乾燥する工程を含む、細胞凝集塊製造用基板の製造方法であって、細胞播種後の凝集塊形成完了時間が２０時間以内である、細胞凝集塊製造用基板の製造方法。
  7. 　上記塗布工程をインクジェット方式で行う、請求項６に記載の細胞凝集塊製造用基板の製造方法。
  8. 　細胞の付着抑制能を有する基板上に、下記式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
    ［式中、
    　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位、及び、下記式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
    ［式中、
    　Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含む共重合体からなるスポットを備える細胞凝集塊製造用基板に細胞を播種する工程と、細胞を播種後２０時間以内で培養し凝集塊を形成する工程を含む、細胞凝集塊の製造方法。
  9. 　細胞の付着抑制能を有する基板上に、下記式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
    ［式中、
    　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位、及び、下記式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
    ［式中、
    　Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含む共重合体を細胞培養の下地剤として使用する、細胞凝集塊製造時の細胞培養速度を向上する方法であって、式（Ｉ）から誘導される繰り返し単位の共重合体全体に対するモル比率を低下させることにより行う、方法。
  10. 　細胞の付着抑制能を有する基板上に、下記式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
    ［式中、
    　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位、及び、下記式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
    ［式中、
    　Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含む共重合体を細胞培養の下地剤として使用する、細胞凝集塊製造時の細胞培養速度を制御する方法であって、共重合体における式（Ｉ）と式（ＩＩ）のモノマー比率を変化させることにより行う、方法。
  11. 　下記式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
    ［式中、
    　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位、及び、下記式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
    ［式中、
    　Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含む共重合体を含む、細胞凝集塊形成促進用の細胞培養容器下地剤。
  12. 　上記式（Ｉ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位の、上記式（Ｉ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位及び上記式（ＩＩ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位の合計に対するモル比率が、９９モル％～５１モル％である、請求項１１に記載の下地剤。
  13. 　上記共重合体が、さらに下記式（ＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
    ［式中、
    　Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒeは、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表し、ｎは１～５０の数を表す］で表されるモノマーから誘導される構造単位を含む、請求項１１又は１２に記載の下地剤。
  14. 　細胞凝集塊形成促進が、細胞播種後の凝集塊形成完了時間が２０時間以内であることを特徴とする、請求項１１～１３何れか１項に記載の下地剤。
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