JPH04506149A - 改良された細胞培養系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 改良された細胞培養系 技術分野 本発明は、真核細胞、特に動物細胞を培養維持し、そしてこれらの細胞からの分 泌産物を連続的に回収するための装置および方法に関する。

背景技術 培養で細胞を増殖し維持する技術は、ペプチド、ホルモン、成長因子、抗体およ び他の生物学的活性物質の生産に広く適用されてきた。広く種々の細胞が、有意 な生物医学的に目的とされる重要な生体分子の分泌物を利用するために培養増殖 に適応させられてきた。ウィルスワクチンは、従来の市販細胞培養物である一方 、インターフェロンおよびモノクローナル抗体のような他の生産物は、市販細胞 培養物に新たな興味が生じている。多くの組換え産物、例えばヒト組織型プラス ミノーゲン活性化物質、血液因子Ｖ［１１、およびヒトの治療物質あるいはイン ビボ診断物質として大いに潜在的な価値を有する生産物が、遺伝的に改変された 動物および植物細胞の増殖培養から生産される。

従うて、大量の細胞を高密度で増殖し、目的の生産物を効率的に回収し得る市販 細胞培養の方法および装置の開発が必要とされている。

従来から、細胞培養および細胞由来のタンパク質生産には、細胞増殖および細胞 増殖の最大化に焦点がおかれていた。しかし、培養細胞系によって生産される多 くの価値のあるタンパク質は、非増殖期の間により効率的にそして豊富に作られ る。例えば、体内では、タンパク質を作って分泌し、あるいは他の機能を行うの にエネルギーを費やし、はとんどの細胞は活発に成長したり増殖しない。そのよ うなインビボ環境を模擬して、本発明は、非増殖状態で高密度に維持して、細胞 が成長にエネルギーを費やさない様に、そして所望の細胞由来の産物の生産に多 くのエネルギーを費やすようにし得る。

また、増殖活性の減退は、さもな（ば成長系で生じ得る細胞分裂の結果としての 変異の危険性を低める。

本発明の発明者が開発した細胞培養維持系を記載した、米国特許第４．５３７． ８６０号は、本発明の一般的な背景技術を提供している。他の細胞潅流培養系は 、米国特許第４．６５１．４５８号およびＲａ１ｎｅｎ、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　（１９８８）　ｉ：２０−２４ ．およびＫｌｅｍｅｎｔら、Ｄｅｖｅｌｏ　Ｂｉｏｌ　５ｔａｎｄａｒｄ　（１ ９８７）　６６：２２１−２２６に記載されている。動物、さらに詳細には哺乳 類細胞の潅流培養および維持系も、米国特許第４．２０１．８４５号、およびＴ ｏｌｂｅｒｔら、Ｌａｒ　ｅ　５ｃａｌｅ　Ｍａｍｍａｌｆａｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｃ ｕ１ｔｕｒｅ、ｐｐ、９７−１２３、　Ａｃａｄｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９８７ ；　Ｖａｎ　Ｂｒｕｎｔ、　Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ　４：５０５−５１０． １９８６およびＴｏｌｂｅｒｔら、Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌｏ　。

Ａｅａｄｅ＋ｉｔｃ　Ｐｒｅｓｓに記載されているｏＮｉｌｓｓｏｎら、Ｎａｔ ｕｒｅ　（１９１１３＞　３０２：６２９−６３０に、モノクローナル抗体の生 産を維持しながらマウスハイブリドーマ細胞を捕捉するためのアガロースビーズ の使用が記載されている。

植物細胞で生体分子を生産するための大量細胞培養装置の使用が、５ｈｕｌｅｒ およびＨａｌｌｓｂｙ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　Ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　５ｃｉ ｅｎｃｅ、　ｐｐ、１９１−２０５．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９８ ５．およびＨａｌｌｓｂｙおよび５ｈｕｌｅｒ、　Ｂｉｏｔｅａ加回旦迂」回Ｂ ｉｏｅｎ　１ｎｅｅｒｉｎ　Ｓ　ｍ　ｏｓｉｕｍＮｏ、１７．　ｐｐ、７４１− ７４６、Ｊｏｈｎ　１Ｆｊｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ　１９８６に記載されている。

米国特許第４．５３７．８６０号に記載されている方法および装置は、特に適切 である。この系においては、種々の孔のあいたチューブの間を均一に埋める不活 性マトリックス物質の隙間に、細胞が浮遊されている。これらのチューブは新鮮 培地の導入および分泌された細胞産物および排泄物質を含有する馴化培地の除去 に用いられる。　（さらに、孔のあいたチューブの間、および細胞の近（に入れ られたものは、培養に酸素添加したガスを分散し、二酸化炭素を除去するための 半透過性の管状の膜である。）マトリックス物質を貫いている孔のあいたチコ、 −ブは、新鮮培地を放射状に分散するためのもので、その結果、栄養培地が不均 一に分散される。これは、なぜならば、培地は孔のあいたチューブから出るので チューブから遠（なるほど濃度が薄くなるからである。このことは、隣接する供 給用チューブを交差状にすることで部分的には改善されるが、新鮮な栄養物の細 胞への分散は、完全には均一ではない。さらに、孔のあるチューブ内あるいは細 胞／マトリックス混合物内に集る気泡は、非常に培地の流れに影響する。細胞培 養内でのガス分散の均一性は、さらに問題である。上記の米国特許第４．５３７ ．８６０号に記載の装置は、培地供給チューブ内に滞留する気泡を除去する方法 、および細胞チャンバー目身内に滞留する気泡を除去する方法は提供していない 。

米国特許第４．２ＯＬ、　８４５号、および、５ｈｕｌｅｒおよびＨａｌ　ｌ　 ｓｂｙの文献、およびＨａｌ　１ｓｂｙと５ｈｕｌｅｒとは、膜の間あるいは孔 のあいたプレートに入れられた細胞を有するフラットチャンバーを記載している 。これらの装置は、基本的に３つのチャンバーに分けられた装置であって、最初 のチャンバーは栄養培地を含み、それが中央の、あるいは細胞培養チャンバーを 通って３番目あるいは生産物回収チャンバーに流れ込む。米国特許第４．２０１ ．８４５号の装置では、孔のあいた中空のファイバーが、ガス交換および固定依 存性細胞の付着用に細胞チャンバー内に用いられている。このような系は、細胞 付着用の中空のファイバー上に可能な表面積量、および固定非依存性の細胞のた めの装置の非適切さによって非常に制限される。Ｈａｌｌｓｂｙおよび５ｈｕｌ ｅｒに記載されている装置、および５ｈｕｌｅｒとＨａｌｌｓｂｙとは同じ欠陥 を有し、さらにガス交換の方法を提供していない。

（以下余白） 余朋ｏｇ生丞 本発明は動物細胞、特に哺乳類細胞の培養のための、改善された装置および方法 を提供する。この改善された装置および方法は、活発に増殖せず、または正常に は増殖せずに生育に関しては「定常的」または正常に遅い条件を維持しているが 、所望の生物学的生成物を活発に分泌している細胞の培養に、特に有用である。

本発明方法および装置は、ガスの気泡の集積を防ぐことにより培地の均一で中断 の無い供給を保証する、このような細胞への培地の供給手段を提供する。本発明 装置はまた、培養物そのものに蓄積されたあらゆるガスを放出させるための手段 も提供する。この方法および装置は、足場固定非依存性のおよび依存性の両方の 細胞に適用できる。

一つの点からみて、本発明は、培地供給カートリッジおよび生成物除去カートリ ッジが隣接した細胞培養チャンバーを、内部に有する、ハウジングを含む装置に 向けられる。細胞培養チャンバーは、２つの垂直面を互いにだいたい反対側に有 し、その一方は培地供給カートリッジに面しており、他方は生成物除去カートリ ッジに面する。この垂直面は、培地供給カートリッジからの培地の配給のため、 および生成物除去カートリッジに生成物を除去するための適当な孔径を有する多 孔質表面であり、そしてその大きさは、培地供給カート１月。

ジから生成物除去カートリッジの流れを保証する適切な相対サイズである。

（細胞培養チャンバーはまた、マトリ・１クスと懸濁細胞とを引き入れるための 入口または穴、および細胞培養チャンバー全体への酸素の拡散および二酸化炭素 の除去のための、一般に管状をした多数の半透性膜も含む。これらの膜は、細胞 培養チャンバー内の細かく分割されるか、または多孔質のマトリックスおよび細 胞が、酸素の供給または二酸化炭素の除去能力から余りにも遠くなり細胞へ、あ るいは細胞からの拡散が妨害されるような容積を有さないように配置されている 。

細胞培養チャンバーはまた、その上部に、細胞培養チャンバー内に蓄積し得るあ らゆるガス気泡を放出させるために備えられた、ガス出口手段を含む。

生成物除去カートリッジは、分泌生成物を含む培地のための出口手段を有し、こ の出口手段は、随意に生成物の即時の冷却のための冷蔵庫に接続され得る。培地 供給カートリッジは、細胞培養チャンバーに隣接する多孔質表面に垂直なカート リッジの面に対して、好ましくは対角線上に位置した、入口および出口手段を有 する。入口手段は培地供給カートリッジの下部に配置され、出口手段は、培地が カートリッジの全体積に透過することが保証されるような様式でカートリッジの 上部近辺に配置されている。このことは、出口を入口の対角位置の反対面の上部 に有することにより、あるいはカートリッジ全体にわたって培地を循環するため の手段を提供することにより達成される。後者の場合、出口は入口と同じ垂直面 上の上部に位置し得る。

このようにして、装置に入っている培地は、あらゆる蓄積したガス気泡と共に、 出口手段から部分的に除去され得る。

操作の間、０−７５％の間、好ましくは１−２０％の間のパーセントの培地が流 入し、この量が出口手段から除去される。温度制御手段もまた、このカートリッ ジの入口手段の上流または出口手段の下流に用いられ得る。

好ましい実施態様においては、ハウジングは、ここに記載のように入口および出 口を有する培地供給カートリッジと生成物取り出しカートリッジとにより交互に 分離され、並行に配置された、多数の細胞培養チャンバーを備え得る。

これらの好ましい実施態様においては、培地供給カートリッジおよび生成物取り 出しカートリッジは、細胞培養チャンバーを隣接して備える、多孔質の２つの平 行した垂直面を有する。但し、平行配置の最後の培地供給カートリ、ジまたは生 成物取り出しカートリッジ、およびその反対側のカートリッジは、只一つの垂直 多孔面を有する。従って、一つの実施態様では、培地供給カートリッジは単一の 多孔質垂直面と反対側の不透過面とを有しており、細胞培養チャンバーの垂直面 として多孔質面を共有する。そしてこの細胞培養チャンバーの反対側の多孔質面 は、その一つが次の細胞培養チャンバーの垂直面を形成している２つの多孔質垂 直面を育する、生成物取り出しカートリッジと共通であり、これは続いてその反 対面で、反対側に不透過面を有する他の培地供給カートリッジの多孔質面に連結 している。あるいは、このカートす・２ジは反対側に、さらに他の細胞培養チャ ンバーに隣接する透過面を有し、これは次に再び、生成物取り出しカートリッジ に面しており、これはまた反対面に、さらに他の細胞培養チャンバー等の垂直面 を形成する不透過または多孔質面を有する。

多数のチャンバーとそれを仕切っているカートリッジのこのような平行した配列 において、培地供給カートリッジの入口および出口手段は、入口手段からの培地 の供給および出口手段から蓄積ガスと共に培地を除去することのために、穴を通 じてハウジングの多分枝管に連結され得る。同様に、生成物取り出しチャンバー の出口手段が、生成物の収集・取り出しのために穴を通じてハウジングの多分枝 管に連結され得る。

懸濁細胞、および細かく分割されるか、または多孔質のマトリックスの取入れの ために、細胞培養チャンバーの基底部の出入穴が、同様に多分枝管に接続され得 る。

（以下余白） 他の点では、本発明は、本発明の装置を使用した動物細胞、特に哺乳類細胞の培 養法を目指す。この方法では、新鮮な培地を、細胞培養チャンバーに、培地供給 カートリッジを通して供給する。細胞培養チャンバーは、目的の細胞懸濁液を、 細かく分割されているか、あるいは、細胞の増殖に適当な間隙を有する多孔のマ トリックスの懸濁液とともに供給されている。培地は下の出入口の入口を通して カートリッジに供給され、すべての蓄積したガス、および、所望ならば供給され た培地の一部は、上の出入口の出口から除去される。供給される培地の約０−７ ５％が、好ましくは１−２０％が、出口を通して除去される。残りの培地はカー トリッジの多孔面を通して細胞培養チャンバーに移動する。

本発明の方法による細胞の培養において、酸素は、細胞培養チャンバーに配置さ れた透過性膜を通して供給され、二酸化炭素はこの膜を通して除去される。細胞 から分泌された生成物を含む馴化培地は、細胞培養チャンバーおよび生成物取り 出しカートリッジに共有される多孔面を通して、および前記カートリッジの出口 を通して除去される。好ましい実施態様では、培地は約０〜１０℃の冷蔵温度で 貯蔵され、保持されて、そして培地供給用カートリッジに導入前に、室温から３ ７℃、好ましくは３７℃に暖められる。除去された液はカートリッジの出口から 出た後、０−１０°Ｃの冷蔵温度に冷やされる。馴化培地はまた、所望の生成物 を濃縮するために、透析あるいはその他の手段に供され得る。

阻盈１１υ１哩 図１は、１つの細胞培養チャンバーを有する、本発明の細胞培養装置の上端面図 である。

図２は、図１の細胞培養装置の線１−１′に沿った後面図である。

図３は、培地供給カートリッジの側端面図である。

図４は、生成物取り出しカートリッジの側端面図である。

図５は、複数の細胞培養チャンバーおよび、培地供給カートリッジおよび生成物 取り出しカートリッジを交互に有する本発明の装置の上端面図である。

図６は、生成物流出構造を有する生成物回収システム中の、本発明の装置を示す 。

図７は、培地循環構造を有する生成物回収システム中の、本発明の装置を示す。

（工・ム千命９２ 及朋μｊ０１１様 圧圭上玉ｍ棟 １つの実施態様においては、本装置は、１つの多孔面を有する１つの培地供給カ ートリッジと、同じく１つの多孔面を持つ１つの生成物取り出しカートリ・ノジ とに隣接する単一細胞培養チャンバーとして構成され得る。培地供給カートリッ ジの多孔面には０．１〜１０ミクロン、好ましくは０．５〜５ミクロンの大きさ の孔が存在する。生成物取り出しカートリッジは、１〜２００ミクロン、好まし くは１０〜１００ミクロンの大きさの孔を有する多孔面を持つ。いかなる場合も この孔の大きさは培地供給カートリッジの多孔面の孔より少なくともわずかに大 きい。単一細胞培養チャンバーを持つ、この実施態様の平面図が図１に示されて いる。

図１に示すように、本装置は、好ましくは方形のハウジング１０を含む。このハ ウジング１０には、培地供給カートリ・ノジ１８の垂直面１４と１６によって２ つの、水平に対向する面により分割された細胞培養チャンバー１２を含み、取り 外し可能なあるいは固定した、ハウジングｌＯの垂直壁にまで伸びている生成物 取り出しカートリッジ２０を含む。好ましくは細胞培養チャンバー１２の底面部 に近接して配された、少な（とも１つの穴（図示せず）が、細胞を保持する無毒 性マトリ・ツクス２６と混合された、高濃度の細胞のスラリーを導入するために 配される。細胞は一般に真核細胞であり、好ましくは動物の細胞であり、最も好 ましくは哺乳類の細胞である。細胞は懸濁状態で培養し得、あるいは、マトリッ クス物質を固定点として用いて固定依存で培養し得る。

マトリックス物質２６は、固定依存性細胞を分離、保持し、あるいは固定するた めに用い得る、任意の無毒性の微細分割のあるいは多孔性の物質であり得る。た とえば、Ｃｙｔｏｄｅｘ”　１．２あるいは３のような市販されているマイクロ キャリア、またはＰｈａｒ＋＋＋ａｃｉａ　Ｃｏｍｐａｎｙの販売するマイクロ キャリア、またはＫＣＢｉｏｌｏｇｉｃａｌあるいはＶｅｎｔｒｅｘ　Ｃｏｒｐ 、のコラーゲン（ゼラチン）系マイクロキャリア、またはＮａｔｕｒｅ　（１９ ８３）　３０２：６２９−６３０でＮｉ１ｓｓｏｎ、　Ｋ、らの説明しているよ うな多孔性マイクロキャリアなどが使用し得る。微細分割されたガラス、ステン レススティールあるいは高分子体などを含む、他の多くのタイプの物質も用い得 る。マトリックス物質そのものは、固体、多孔性、あるいは培地に対して透過性 があり得る。

ハウジング１０は孔２７を含み得、この孔は、ハウジング上面に隣接する側面あ るいは細胞培養チャンバーの上面の開口部に近接して配されている。そしてこれ は、これがなければ内部に閉じ込められてしまうガスの除去のためにある。

細胞培養チャンバー１２はまた、細胞充填マトリックス２６の内に酸素化ガスを 、外に二酸化炭素を拡散させる、一般に管状で選択的透過性を有する多数の膜４ ４と交差している。この膜は、細胞の大多数が拡散表面からの有効距離に入るよ うな間隔で配置されている。このような配置により、培養チャンバー内のすべて の容積が透過膜の拡散表面から３１１Ｉ１１１　好ましくは１ｍｍ内に位置する 。この管状膜は、１つかそれ以上の細胞培養チャンバーの面に設置されたガス入 口手段４６およびガス出口手段４８、およびハウジング１０内の対向する孔５０ に取り付けられている。管状膜は、図１に示すように、細胞培養チャンバーの長 さにそって水平に並べ得るか、あるいは、培養チャンバー内に設けた別の枠組み に取り付は得るか、あるいは、培養チャンバーが充分に狭いならば、培地カート リ・ツジあるいは生成物カートリッジ、あるいはその双方の周囲に培養チャンバ ーに接するように巻き付は得る。ランダムに対をなす配置も含め、細胞培養内の すべての位置が拡散表面に近接するという必要を満たす、様々な配置が用い得る 。

側面のカートリッジには２種あり、一方は細胞チャンバ−１２に新鮮な栄養培地 を供給するカートリッジ１８であり、もう一方は培地内の生成物を取り出すカー トリッジ２０である。培地供給カートリッジ１８は、一般にハウジング内に側面 １４と共に垂直に配されており、この１４は、一般に０．１から１０ミクロンの 間の大きさの孔を有する膜、焼固した板、スクリーン、あるいは織物より成る細 胞チャンバー１２に面しているが、この表面の孔はいかなる場合も、細胞培養チ ャンバーと以下に述べる生成物取り出しカートリ・２ジとが共有している反対側 の壁にある孔の大きさより小さい。培地供給カートリッジ１８は、少なくとも１ つの入口手段３２および少なくとも１つの出口手段３４とを含有する。入口手段 ３２は新鮮な栄養培地を導入するためにカートリッジの底部近辺に位置し、／％ ウジング１０の底辺に近接する壁に設けられた孔３６に近接している。出口手段 ３４は、カートリッジ上面付近に設けられ、ハウジング上面に近接する壁に配さ れた孔３８に隣接しており、内部に閉じ込められた気泡、および導入栄養培地の 流れの０および７５％の間、好ましくは１％と２０％との間、を放出するための ものである。

残りの培地の流れはカートリッジ１８から流出し、多孔面１４を通って、細胞お よびマトリックスを含む細胞チャンバー１２に流れ込む。培地が、一般に水平に 、マトリ・ノクスの間隙および周辺を潅流するにつれ、所望の細胞生成物が培地 中に分泌される。

細胞培養チャンバー１２から流出した生成物馴化培地は、培養チャンバー１２と カートリッジ１６が共有する面を通って、図示したように一般に培地供給カート リッジに垂直に対向して設けられた生成物取り出しカートリッジ２０に流入する 。カートリッジ１６の側面は、膜フイルタ−、焼固板、スクリーン、織物などの 、１〜２００ミクロン、好ましくは１０〜１００ミクロンの孔を有する多孔性の 平坦な物質で構成されており、この孔はいかなる場合も培地供給カートリッジの 表面の孔より大きい。

生成物取り出しカートリッジは、ハウジングの壁に配された孔４０に近接した、 少なくとも１つの出口手段４２を有しており、この出口手段は馴化培地を含む生 成物を除去するために提供されている。

図２〜４は、本発明による装置とその一部を交互に示している。図２は、線１− １°にそつでの本装置の側面図を示してい　。

る。細胞培養チャンバーには、２４に存する細胞とマトリックスとを導入する入 口孔と閉じ込められた気体２７を排出する出口孔が含まれている。反対側の壁に 、点線で示すように、培養チャンバー４６と４８中に配された気体拡散膜のため の入口手段と出口手段が設けられている。左側に図示された培地供給カートリッ ジは細胞培養チャンバーと面１４を共有し、そして培地３２のための入口手段お よび、閉じ込められた気体、および所望の場合には培地の一部のための出口手段 をカートリッジ３４上面の（この実施例においては）対角線上に有している。

右側には、生成物取り出しカートリッジ２０が細胞培養チャンバーと面１６を共 有し、馴化培地のための出口手段４２を含有している。図２に示す垂直面上の出 口手段の位置は、決定的なものではない。

図３と図４は、それぞれ培地供給カートリッジと生成物取り出しカートリッジの 側面図であり、図において、多孔面１４と１６が、培地供給カートリッジのため の入口手段３２と出口手段３４、および生成物除去カートリッジのための出口手 段４２と共に示されている。

（以下余白） 本装置の別の好適な実施態様においては、ハウジング１゜は、図５の平面図に示 すような多数の細胞培養チャンバーを含む。ハウジングの水平言回の寸法は、図 １に示した実施態様に相対して１つの軸５２に沿って増加する。培地がチャンバ ーを通じて拡散するとき培地中の栄養物がなくならないようにするために、そし て分泌された生体分子の回収された生物学的活性を最大限にするために、細胞培 養チャンバー１２は多数の交互に配置された培地供給カートリッジ１８′　と生 成物取り出しカートリッジ２０′　とにより分けられる。これらの分割カートリ ッジ１８′および２０’　は、図１に示す培地供給カートリッジ１８および生成 物取り出しカートリッジ２０、およびハウジングの対向する壁におけるこれらカ ートリッジとは、平行および垂直の壁が共に多孔であるという点で異なり、これ により培地は各培地供給カートリッジ１８′からこの両側部の細胞培養チャンバ ー１２へ垂直面１４′を通って流出する。馴化培地は生成物取り出しカートリッ ジ２０′の壁１６′を通って流れる。従って、内部のカートリッジは２つの平行 な多孔側面をもち、端部のカートリッジ１８および２０は図１に示すように単一 の多孔側面をもつ。これにより多細胞チャンバー１２を培地が平行に流れ、また 培地供給カートリッジ１８および１８゛、細胞培養物、および生成物取り出しカ ートリッジ２０および２０′の間の効果的な幾何学的関係を著しく変更すること なく細胞培養チャンバー１２の容積および容量が共に増加する。

他の点においては、細胞培養チャンバー、培地供給カートリッジエ８および１８ °、および生成物取り呂しカートリッジ２０および２０″は、図１に示す単一細 胞培養チャンバーの実施態様にて述べたように構成される。多細胞培養チャンバ ーは、選択的にチャンバーの先端部近くにガス出口ポートと、細胞とマトリック スを導入する手段と、内部に配置された通常は管状のガス拡散膜とを含む。生成 物取り出しカートリッジは、生成物を含有する馴化培地の出口手段を含む。培地 供給カートリッジは、カートリッジのほぼ底部に配置された培地の入口手段と、 エントラップされたガスの出口手段と、必要に応じて、チャンバーの先端部の近 くにこれに対角方向に対向する潅流されない培地とをもつ。

各細胞培養チャンバーに新鮮な培地および生成物を取り出す手段を供給するため には特定の形状のみが許容される。ハウジング内に２つの細胞培養チャンバーが ある場合は、その間に２重壁の培地供給カートリッジまたは生成物取り出しカー トリッジが１つ、および１重壁生成物取り出しカートリッジまたは培地供給カー トリッジが両側に計２つである。このように、ｎ個の細胞培養チャンバーには１ 重多孔壁をもつ２つのカートリッジと２重多孔壁をもっｎ−１個のカートリッジ とが存在する。培地供給カートリッジおよび生成品取り出しカートリッジは細胞 培養チャンバー列に沿って交互に配置される。ｎの偶数番目には同じタイプの１ 重壁カートリッジモしてｎの奇数番目には反対のタイプのカートリッジとなる。

複数の細胞培養チャンバーを使用するときは、対応するチャンバーまたはカート リッジに様々な入口および出口手段を接続して多岐システムとすると便利である 。このようなシステムの代表的なものがまた図５に示される。従１て、図に示す ように、培地は、ハウジングの外部にあり入口手段３２と流体連通している共通 のマニフォールド９０を通って培地供給カートリッジ１８および１８′に供給さ れる。同様に、培地供給カートリッジの出口手段３４はマニフオールド９２と流 体連通している。生成物取り出しカートリッジ２０および２０′の出口手段４２ はハウジング外部のマニフォールド９４と流体連通している。同様に、ガス入口 手段４６は好ましくは外部マニフォールド９６により供給され、ガス出口手段４ ８はマニフオールド９８へ収集される。

図１または５に示す装置は、流出または再循環モードで作動し、長期間の間高密 度で細胞の培養を提供し、そして、分泌された細胞生成物を連続回収するため、 全体システムに組み込まれ得る。図６は流出モードの形状を示す。培地は一連の 殺菌ポンプ５８、好ましくはぜん動ポンプによりシステムを通じて吸入される。

ポンプ圧は圧力差がシステム内に維持されるように制御される。通常は細胞培養 チャンバー内の液体圧はチャンバーに配置された拡散膜のガス圧に対して一定の レベルで維持され、これにより管状膜の壁を通してガス泡を形成してまたは形成 せずにガスの拡散が最適化され、また二酸化炭素が拡散して戻ることが可能とな る。

培地を所望の温度に暖めるために、栄養培地は４°〜１０″Ｃに維持された貯蔵 部６０から柔軟な管６１および熱交換器６２を通して吸入される。暖められた培 地は次に、温度変化により培地から放出されたガスを駆逐するためのガス除去容 器６４を通過して、本発明の装置６６、図５の例えば培地供給マニフォールド９ ０へ到る。例えば図５の生成物回収マニフォールド９４からの調整された培地が 装置を通って出て来る。生成物馴化培地は柔軟な管６１を介して冷蔵環境へ、次 に生成物冷却器６８、そして最後に生成物貯蔵部７ｏへ戻される。

培地の少量のフラクションは培地供給カートリッジ１８（および１８′）から例 えば排出マニフオールド９２へ除去される。あるいは、この余分の新しい培地は 、生成物の流れ７２と合流させてガス除去容器７４に再び導入させ得る。または 後述のように廃棄７６され得る。

図６に示すシステムの再循環形状を図７に示す。生成物の流れを分岐して、一方 は供給カートリッジの入口手段に戻し、残りの部分を取り入れることができる。

生成物の流れを分岐して、部分７８が装置６６の入口側に戻り、残りの部分７９ が生成物容器７０へと取り出される。必要に応じて、濾過システム８０（適当な サイズ領域の前フィルターおよびフィルターカートリッジよりなる）を使用して 、装置の詰まりを防ぐため粒子すべてを生成物の流れから除去する。圧力感知お よび制御装置８８が必要に応じて使用され得る。必要に応じて、ホローファイバ ー透析カートリッジ８４または再循環回路においてより大きなタンパクを濃縮し 、そして水、および生成物を含有しない低分子量の成分を除去する他の手段もま た含まれ得る。

反応器の供給側に戻される培地のフラクション７８は０〜１００％、好ましくは ５０〜８０％である。ｐＨ監視および調整手段８２が、自動または手動サンプリ ングシステム８６と共にこの再循環回路に含まれる。このような情報は、流入す る栄養培地を細胞により代謝された成分と置き換えるのを調整するおよび／また は補給するために使用され得る。

以上の記述は例示的なものであり限定的なものではない。

添付のクレームにより限定されたような本発明の範囲内での他の変形も当業者に は明かであろう。

ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３ １Ｊ蟻物−ｐ−トリ・・ｌジ゛へφ見１黄帖６凸６０ＦＩＧ、４ 国際調査報告

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．分泌された細胞生成物を連続して回収するための手段を備え、増殖が実質的 に阻止された状態の動物細胞をインビトロにおいて維持するための装置であって 、該装置は、ハウジング、 該ハウジング内に設けられ、流体培養物培地を通過させるための間隙を有した、 微細に分割されたまたは多孔のマトリックス中に細胞を保持するための少なくと も１つの細胞培養チャンバー、 該細胞およびマトリックス材料を導入するための、該チャンバーの底部に近接し て配置されている少なくとも１つの入口手段、を含み、 該チャンバーは、該ハウジングの１つまたはそれ以上の壁に配置されている対応 する穴に通じている外気入口手段および出口手段を有し、該入口および出口手段 は、該チャンバーの内部を実質的に貫通して配置されているほぼ管状の拡散膜へ とガスが通じるようになっており、該細胞の大半は、該ほぼ管状の膜の拡散表面 から有効な距離内に配置されており、該チャンバーは、該ハウジングの垂直方向 の壁に沿って延長する、培地供給カートリッジと生成物取り出しカートリッジの 垂直面によって、２つの垂直でほぼ対向して平行な側部に区画されており、 該培地供給カートリッジは、新鮮な培地を供給するためのものであり、該生成物 取り出しカートリッジは、分泌された細胞生成物を取り出すためのものであり、 該培地供給カートリッジは、該カートリッジの内部に流体が通じるようになって いる培地入口手段および培地出口手段を有し、培地が該培地供給カートリッジの 実質的にすべての部分に供給されるように、該入口手段は、該カートリッジの底 部に近接して配置されており、該出口手段は、該カートリッジの頂部に近接して 配置されている、装置。
2. ２．前記培地入口手段および培地出口手段が、前記培地供給カートリッジ内に対 角線状に対向する位置に配置されている、請求項１に記載の装置。
3. ３．ｎ個の細胞培養チャンバーおよび（ｎ＋１）個のカートリッジを交互に配列 して含み、各２つの該ｎ個のチャンバ一の間に配置されている（ｎ−１）個のカ ートリッジが、２つの平行な多孔面を有し、該列のいずれかの端部に配置されて いる２つのカートリッジが、チャンバーに対向している１つの多孔面を有し、１ 列おきのカートリッジが、前記培地供給カートリッジであり、そして、残りのカ ートリッジが前記生成物取り出しカートリッジである、請求項１に記載の装置。
4. ４．捕捉されたガスを除去するための細胞培養チャンバーの頂部に近接して配置 されている少なくとも１つの出口手段をさらに含む、請求項１に記載の装置。
5. ５．ｎが２である、請求項３に記載の装置。
6. ６．ｎが＞２である、請求項３に記載の装置。
7. ７．増殖を実質的に阻止し低減する状態で、インビトロにおいて動物細胞を維持 し、分泌された細胞生成物を連続して回収するための方法であって、 該細胞および多孔マトリックスの懸濁液を、新鮮な培地を供給するための培地供 給カートリッジの多孔垂直面および分泌生成物を取り出すための生成物取り出し カートリッジの多孔垂直面によって、２つの平行な長手方向の側部に区画されて いるハウジング内の少なくとも１つの細胞培養チャンバーに導入する工程； 該培地供給カートリッジは、該カートリッジの内部に流体が通じるようになって いる培地入口手段および培地出口手段を有し、該入口手段は、該カートリッジの 底部に近接して配置されており、該出口手段は、該カートリッジの頂部に近接し て配置されている； 該入口手段を通じて生成物供給カートリッジの内部に新鮮な培地を供給し、該出 口手段からガスおよび必要に応じて新鮮な培地の一部を除去する工程；および該 カートリッジの頂部に近接して配置されている出口手段を通じて、該生成物取り 出しカートリッジの内部から生成物を取り出す工程； を含む方法。
8. ８．前記培地入口手段および培地出口手段が、前記培地供給カートリッジ内で対 角線状に対向して配置されている、請求項７に記載の方法。
9. ９．前記チャンバーの頂部に近接して配置されている穴を通じて、該チャンバー から捕捉されたガスを定期的に排出することをさらに含む、請求項７に記載の方 法。