EA023707B1 - Автономная система циркуляции, имитирующая систему перфузии крови позвоночных на тканевом уровне - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к автономной системе циркуляции, поддерживающей образование капилляров в участках роста капилляров и обеспечивающей образование микроорганоидов и/или участков микротканей для изучения действия одного или нескольких испытываемых соединений и определения эффективности, побочных эффектов, биологической безопасности, метаболитов, механизма действия или регенерации органов, а также способов развития таких микроорганоидов и/или микротканей в указанной автономной системе циркуляции.

Description

Настоящее изобретение относится к автономной системе циркуляции, которая поддерживает образование капилляров в участках роста капилляров и позволяет образовывать участки микроорганоидов и/или микротканей для отслеживания действия одного или нескольких испытываемых соединений и определения эффективности, побочных эффектов, биологической безопасности, метаболитов, механизма действия или регенерации органов, а также способов развития таковых микроорганоидов и/или микротканей в указанной автономной системе циркуляции.

Предпосылки изобретения

Громадные усилия прилагались для создания систем циркуляции для физиологического снабжения питательными веществами и отведения отходов от тканей, культивируемых ίη νίίτο. Данные разработки ставят своей целью выращивание ίη νίίτο таких органов, как печень, лимфатические узлы (С1С5С с1 а1., 2010, 1оитпа1 οί ВюЮсЬгюГду 148, 38-45) и легкие (Ний βί а1., 2010, 8аепсе, (328) 5986, рр. 1662-1668) или даже многоорганных систем (δοηηΚίβ еί а1., 2010, Ιοιιπκιί οί ВюЮсЬгюКду 148, 70-75) для тестирования веществ, исследования регенерации органов или в целях трансплантации. Изначально для таких целей использовались технические перфузионные системы, основанные на использовании мембран, полых волокон (СаШрагю апб Оег1асЬ. ВюгеасЮг8 Γογ Ымег Τί88ΐκ Епдшеетшд. 2. Τορκ8 ίη Т188ие Епдшеетшд, νοί. 3, 2007. 1-42 Еб8. N АзЬаттакЬг К. Ке18 & Е. СЫеШш) или сетей микроканалов (Ии еί а1., СЬар1ег 7: МюгоЯшбю δу8ίет8 ίοτ Епдшеетшд Vа8си1а^^ζеά Т188ие СотгисШ. 2008 (глава книги)).

В системе поддержки печени, разработанной Герлахом (Оег1асЬ) и коллегами, три пучка полых волокон переплетены друг с другом, образуя множество идентичных пространств для микрокультур для перфузии плазмы и снабжения кислородом. Перфузия плазмы человека обеспечивается двумя пучками микрофильтрационных половолоконных мембран, тогда как оксигенация производится через непроницаемую для жидкости мембрану, предназначенную для транспорта кислорода. Системы поддержки печени, основанные на этом принципе, показывали хорошие характеристики работы в течение нескольких недель, будучи подключенными к системе плазмотока пациентов.

Ии еί а1. обобщенно описали флюидные платформы для формирования микроваскуляризированных тканевых конструкций на основании гидрогелей и методик микропроизводства. Данный обзор подчеркивает техническую возможность создания сети кровеносных капилляров наподобие канальных структур в полимерных материалах для эффективной перфузии жидкости через тканевые культуры. Большая часть получаемых в итоге микросистем использовалась для высокоэффективной технической перфузии, не включая эндотелиальные клетки. Использование таких систем ограничивается культуральными средами или плазмой и не позволяет производить перфузию цельной крови из-за явления свертывания. Кроме того, эти системы не обеспечивают природного гистогематического барьера, который ίη νίνο состоит из замкнутого эндотелиального клеточного слоя. Это позволяет осуществлять активный перенос через клеточный слой, а также сигналов от ткани в капиллярную сеть. Были разработаны различные подходы для выстилания технических перфузионных систем (δο^ еί а1., 2005, Апа1.СЬет., 2005, 77, 3993-3999) или синтетических или биологических матриксов (2Ьапд еί а1., 2009, В^οтаίе^^а18, 30(19): 3213-3223; ^а11е8, 2010, 1οιιπη·ι1 οί ВюЮсЬгюГду 148, 56-63) эндотелиальными клетками. δοι^ с коллегами разработали микроциркуляторную поддержку для эндотелиальных клеток культуры при заданных касательных напряжениях. Замкнутые монослои эндотелиальных клеток могут развиваться в отдельных ячейках для клеточных культур, расположенных между техническими транспортными каналами.

С целью генерирования тканеинженерных сосудистых трансплантатов (ΤΟνΟ) 2Ьапд еί а1. разработал тканеинженерную конструкцию, имитирующую структуру кровеносных сосудов с помощью трубчатых клеточных каркасов на основе фиброина шелка, полученных электропрядением, с подходящими механическими свойствами. Они засевали клетками гладкой мускулатуры коронарной артерии человека (НСАδМС) и эндотелиальными клетками аорты человека (НАЕС) люминальную поверхность трубчатых клеточных каркасов и культивировали их в условиях физиологического пульсирующего потока, создаваемом с помощью двухконтурного биореактора, используя внешние трубопроводы и насосы.

\Уа11е8 еί а1. использовали полностью биологический матрикс для развития эндотелиализированной сосудистой системы ίη νίίτο, при этом полимерные трубки и управляемая система нагнетания соединялась с не содержащим клетки участком кишечника животного. В этой системе капилляры, полностью покрытые эндотелиальными клетками, ограничены участками биологического матрикса с соответственной функциональностью.

Однако ни одна из систем циркуляции из уровня техники не была пригодна для долговечных тканевых культур, основанных на цельной крови, как предусмотрено настоящим изобретением.

Настоящее изобретение относится к замкнутым и автономным системам циркуляции, имитирующим естественную систему перфузии крови позвоночных на тканевом уровне. Настоящая система использует миниатюризированное кровообращение в физиологических условиях для обеспечения циркуляции в микролитровых объемах для поддержания миллиграммов ткани. Она имитирует в микромасштабе, совместимом с чипом, соотношение, физиологически нормальное для человека, когда литры объема крови обеспечивают поддержку килограммам тканей. Автономная система циркуляции содержит по меньшей мере один участок роста капилляров, расположенный между микровходами и микровыходами

- 1 023707 системы.

Участок роста капилляров, служащий для образования кровеносных капилляров, поддерживающих обмен питательных веществ, интегрирован в циркуляцию совместно с миниатюризированным насосом и транспортными каналами.

Краткое описание изобретения

В первом аспекте настоящее изобретение относится к автономной системе (1) циркуляции, имитирующей естественную систему перфузии крови позвоночных на тканевом уровне, содержащей:

a) по меньшей мере один участок (2) роста капилляров, содержащий по меньшей мере два микровхода (3) и два микровыхода (4),

b) насосное устройство (5) направленного действия и

c) артериолярный транспортный канал (6), соединяющий насосное устройство (5) направленного действия по меньшей мере с двумя входами (3), и венулярный транспортный канал (7), соединяющий насосное устройство (5) направленного действия по меньшей мере с двумя выходами (4), при этом система циркуляции содержит отверстие (17) для прерывистой подачи питательной жидкости в систему циркуляции инжекционным устройством и не имеет подключения жидкости для непрерывной подачи жидкости из внешнего резервуара в систему циркуляции.

В своем втором аспекте настоящее изобретение относится к способу формирования системы (1) циркуляции по данному изобретению, включающему этапы, на которых:

a) эндотелиальные клетки прерывисто засевают в систему (1) циркуляции и

b) засеянные клетки инкубируют, по меньшей мере, до тех пор, пока в участке (2) роста капилляров не образуются капилляры (14), и/или в транспортных каналах образуется слой эндотелиальных клеток, и/или пока слой эндотелиальных клеток не покроет все внутренние поверхности насосного устройства (5), причем подачу питательной жидкости осуществляют прерывисто инжекционным устройством через отверстие (17), расположенное в системе циркуляции.

Подробное описание изобретения

Прежде чем настоящее изобретение будет подробно описано ниже, необходимо понять, что настоящее изобретение не ограничивается частными методами, протоколами и реагентами, описанными в настоящем документе, поскольку они могут отличаться. Также необходимо понимать, что используемая в настоящем документе терминология предназначена исключительно для описания частных вариантов осуществления и не может рассматриваться как ограничивающая объем настоящего изобретения, который ограничивается исключительно прилагаемой формулой изобретения. Если только не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, обладают теми же значениями, как они в общем случае понимаются специалистом в области техники. Предпочтительно, чтобы используемые здесь термины определялись в соответствии со следующими документами А ти1ййпдиа1 д1о88агу о£ Ью!есйпо1одюа1 1егт8: (ГОРАС Кесоттепбайоп8), ЬеиеиЬегдег, Н.СЛУ. Ыаде1, В. апб К1Ь1, Н. еб8. (1995), Некейса СЫтюа Ас!а, СН-4010 Ва8е1, 8\\й/ег1апб) и как описано в документе Рйагтасеийса1 8иЬ81аисе8: 8уЫйе8е8, Ра!еи!8, Аррйсайои8 Ьу Ахе1 К1еетаии апб Ыгдеп Епде1, ТЫете МеЫса1 РиЬЙ8Ыпд, 1999; Не Мегск 1пбех: Ап Епсус1ореб1а о£ Сйетюак, Огид8, апб Вю1одюа18, ебйеб Ьу 8и8ап Вибауап е! а1., СКС Рге88, 1996, и 1йе Ипйеб 81а1е8 Рйагтасоре1а-25/Ыайопа1 Рогти1агу-20, риЬЙ8Йеб Ьу Не Ипйеб 81а1е8 Рйагтсоре1а1 Сопуепйоп, 1пс., КоскуШе Мб., 2001.

В настоящем описании и последующей формуле изобретения, если только иное не требуется контекстом, слово содержать и его формы, например содержит и содержащий, следует понимать как подразумевающее включение упомянутого признака, системы или этапа или группы признаков, систем или этапов, но не исключение какого-либо иного признака, системы или этапа или группы систем или этапов. Ниже различные аспекты настоящего изобретения определяются более подробно. Каждый определенный таким образом аспект может объединяться с любым другим аспектом или аспектами, если только явным образом не указано иное. В частности, любой признак, полагаемый предпочтительным или полезным, может объединяться с любым другим признаком или признаками, указанными как предпочтительные или полезные.

В тексте данного описания цитируется несколько документов. Каждый из цитируемых здесь документов (включая все патенты, заявки на патенты, научные публикации, технические требования изготовителя, инструкции и т.д.), встречающийся 8ирга или 1п£та, включены в настоящий документ во всей полноте посредством ссылки. Ничто в настоящем документе не может рассматриваться как признание того, что настоящее изобретение не вправе иметь приоритет в силу более раннего изобретения.

Далее приведены некоторые определения терминов, часто используемых в настоящем описании. Данные термины, в каждом случае их использования в оставшейся части описания, будут иметь соответственным образом определенное значение и предпочтительные значения.

Клетки означают клеточные линии или эмбриональные клетки позвоночных и беспозвоночных.

Органоиды означают искусственные, образуемые бе иоуо, функциональные агрегатов клеток различных типов клеток ш уйго, которые демонстрируют хотя бы одну функцию органа или ткани, предпочтительно демонстрируют большинство или, по существу, все функции органа или ткани.

Ткани означают биопсийный материал или эксплантаты, взятые у пациентов или животных, либо

- 2 023707 из тканей, культивированных ίη νίΐΓο.

Дифференциация означает развитие особых функций тканей культивированных клеток.

Поддержание описывает способность сохранять все функции данной ткани постоянными в данном процессе культивирования клеток, предпочтительно без существенных признаков гибели клеток и/или апоптоза.

Среда (множественное число среды) означает жидкость, поддерживающую рост питательными и иными веществами для культивирования клеток. Примеры подходящих сред включают в себя ΌΜΕΜ, Нат'5 Р12 и ΚΡΜΤ.

Матрикс означает вещества или смеси веществ, которые поддерживают жизнеспособность, улучшают пролиферацию, дифференциацию и функционирование клеток и/или органоидов либо образование органов. Материал матрикса предпочтительно предоставляется в форме, которая позволяет образовать пространство участка роста капилляров (2). Матриксы, используемые в контексте настоящего изобретения, могут принимать различные формы, предусматривающие, например, гидрогели, пены, ткани или нетканые ткани. Материал матрикса может содержать вещества, которые встречаются в матриксе в природе, например, белки внеклеточного матрикса, предпочтительно коллагены, ламинины, эластин, витронектин, фибронектин, малые клеточно-матриксные белки, малые интегринсвязывающие гликопротеины, факторы роста или протеогликаны, или могут содержать искусственные матриксные вещества, например, неразлагающиеся полимеры, как полиамидные волокна, метилцеллюлоза, агароза или альгинатный гель, или разлагающиеся полимеры, например, полилактид.

Внутренняя поверхность означает те поверхности системы (1) циркуляции, которые непосредственно контактируют с циркулирующей средой, плазмой и/или кровью, например с цельной кровью.

Для преодоления проблем, связанных с известными из уровня техники системами культивирования клеток, настоящее изобретение предлагает систему (1) циркуляции, которая является автономной и содержит:

a) по меньшей мере один участок (2) роста капилляров, содержащий по меньшей мере два микровхода (3) и два микровыхода (4),

b) насосное устройство (5) направленного действия и

c) артериолярный транспортный канал (6), соединяющий насосное устройство (5) направленного действия по меньшей мере с двумя входами (3), и венулярный транспортный канал (7), соединяющий насосное устройство (5) направленного действия по меньшей мере с двумя выходами (4).

Автономная относится к тому факту, что жидкость в системе циркулирует внутри системы, т.е. между насосным устройством (5) направленного действия и участком (2) или участками роста капилляров, и предпочтительно отсутствует подключение жидкости для непрерывной подачи жидкости, например, среды, крови, от внешнего резервуара для жидкости в систему (1) циркуляции.

Внешний в данном контексте означает, что резервуар для жидкости не является составной частью системы циркуляции, например, подключенной к системе циркуляции посредством трубок.

Если в ходе инкубации потребуется восполнение веществ, например питательных веществ и/или жидкостей, предпочтительным является, чтобы такие питательные вещества или жидкости подавались прерывисто через отверстие (17) подачи, которое предпочтительно располагается в артериолярном или венулярном транспортном канале или соединено с участком роста капилляров. В первом случае вещества, например питательные вещества и/или жидкости, непосредственно подаются внутрь капилляров. Такой способ подачи потенциально ведет к повреждению эндотелиальных клеток, выстилающих отверстие (17) подачи на внутренней поверхности системы (1) циркуляции. Во втором случае подача увеличивает давление жидкости на экстракапиллярное пространство вокруг капилляров, образованных в участке роста капилляров. Жидкости и питательные вещества рассеиваются при циркуляции по капиллярам благодаря повышенному парциальному давлению в экстракапиллярном пространстве. Во избежание увеличения давления в системе со временем и с повторением подач веществ, которые требуют восполнения, предпочтительно, чтобы система циркуляции дополнительно оснащалась резервуаром для компенсации давления. Если отверстие (17) подачи организовано так, что позволяет подачу внутрь капилляров, предпочтительно, чтобы резервуар для компенсации давления был соединен с экстракапиллярным пространством.

И наоборот, если отверстие (17) подачи организовано так, что позволяет подачу в экстракапиллярное пространство, предпочтительно, чтобы резервуар для компенсации давления был соединен с внутренней частью капилляров. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления резервуар для компенсации давления содержит отверстие, предпочтительно в виде отверстия малого диаметра или обратного клапана, для стравливания газа из резервуара для компенсации давления. Данное отверстие предпочтительно обладает такой конфигурацией, что газ стравливается в окружающую среду только тогда, когда достигается заданное пороговое давление. Подходящими средствами являются, например, подпружиненные обратные клапаны или кремниевые заглушки с пазом. Таким образом возможно предотвратить образование избыточного давления в системе циркуляции, что может вызвать повреждение образовавшихся капилляров. С учетом того, что система содержит малый общий объем жидкости, предпочтительно, чтобы каждый раз в систему подавались крайне малые объемы, например, менее 10% об- 3 023707 щего объема. Предпочтительный способ загрузки жидкостей и/или клеток в контур циркуляции заключается во введении инжектора, предпочтительно инжекционной иглы, в отверстие подачи и в подаче жидкостей и/или клеток в контур циркуляции с помощью инжектора, при этом скорость регулируется по скорости движения эндотелиальных клеток. В частности, это предпочтительно, если был образован замкнутый монослой эндотелиальных клеток. Предпочтительно, чтобы отверстие подачи было самоуплотняющимся, т.е. чтобы оно перекрывало ход жидкости и становилось также воздухонепроницаемым после извлечения инжекционного устройства, например шприца. Примеры таких самоуплотняющихся отверстий подачи хорошо известны из уровня техники и содержат обратные клапаны и силиконовые заглушки.

В предпочтительных вариантах осуществления отверстие (17) подачи и/или резервуар для компенсации давления отделены от контура циркуляции или экстракапиллярного пространства мембраной для удержания клеток, т.е. средний размер пор мембраны меньше среднего размера клеток, растущих в системе (1) циркуляции настоящего изобретения, или каналов, не пропускающих клетки, размеры которых подобраны так, чтобы не пропускать клетки, растущие в системе (1) циркуляции настоящего изобретения во избежание засорения или просачивания клеток.

Возможно подавать газ совместно с жидкостями или во время начального заполнения системы, или во время дальнейших подач. Во избежание блокирования контура циркуляции пузырьками захваченного газа предпочтительно, чтобы в системе (1) была предусмотрена одна или несколько ловушек для пузырьков газа. Такие ловушки могут иметь форму полостей или зубцов на направленной вверх стороне артериолярного или венулярного транспортного канала.

Кроме того, предпочтительно, чтобы газовая среда, например О₂/СО₂, поставлялась в участок (2) роста капилляров пассивным способом, например диффузией в участок (2) роста капилляров через проницаемый для газа биосовместимый матрикс (8) и/или через артериолярные транспортные каналы (6).

Одним из преимуществ системы (1) циркуляции является то, что возможно осуществлять поддержку двух или больше различных тканей и/или органоидов (15) внутри одной автономной системы, для тканей и/или органоидов которых выполняется перфузия одной и той же циркулирующей жидкости и которые, таким образом, находятся в том же жидкостном соединении, что и в природной среде. Число участков (2) роста капилляров в общем случае определяется числом отдельных тканей и/или органоидов (15), которым необходимо обеспечить поддержку. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления система (1) циркуляции по настоящему изобретению система (1) циркуляции содержит по меньшей мере два участка (2) роста капилляров; предпочтительно она содержит 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 участков (2) роста капилляров.

Обмен газов, например О2/СО2, предпочтительно осуществляется за счет обеспечения газопроницаемых альвеолярных и венулярных транспортных каналов (7), т.е. альвеолярные и венулярные транспортные каналы содержат или состоят из газопроницаемого материала. В зависимости от общего объема жидкости в системе и общей совокупной площади поверхности транспортного канала (5, 6) перфузия О₂/СО₂ через внутреннюю поверхность транспортных каналов может быть недостаточной для поддержания клеток и/или органоидов (15) в системе (1) циркуляции. В этих случаях предпочтительно, чтобы материал одного из участков (2) роста капилляров был хотя бы частично газопроницаемым и, таким образом, мог функционировать как микролегкое, снабжающее О₂ всю систему (1) циркуляции. Соответственно, предпочтительно, чтобы одна или больше стенок участка роста капилляров содержала или состояла из газопроницаемого материала. Подходящие газопроницаемые материалы известны из уровня техники. Предпочтительно, чтобы материал, используемый для образования одной или больше стенок участка роста капилляров, представлял собой полидиметилсилоксан (ΡΌΜ8).

Участок (2) роста капилляров представляет собой пространство, предусмотренное для сборки капилляров (14) из эндотелиальных клеток и опционально из клеток гладкой мускулатуры, которыми засеяна система. Участок роста капилляров предпочтительно заполнен матриксом (8), который служит для обеспечения клеточного каркаса для роста капилляров (14), которые образуются естественным образом после засевания системы эндотелиальными клетками и начала циркуляции жидкости через участок (2) роста капилляров. Таким образом, предпочтительно, чтобы биосовместимый матрикс (8) содержал микроканалы, структуры и/или сети, которые позволяют и поддерживают образование капилляров (14) эндотелиальными клетками. Предпочтительно эти структуры сами не характеризуются формой указанных капилляров, но просто предоставляют точки крепления и/или направляющие для образуемых капилляров. Предпочтительно, чтобы участок (2) роста капилляров содержал или состоял из полутвердого биосовместимого матрикса (8). После засевания системы эндотелиальными клетками начинают образовываться капилляры (14), как правило, сначала на микровходах (3), а затем продолжают расти по направлению тока жидкости, пока, в конце концов, не соединятся с одним из микровыходов (4). Альтернативно, предусматриваются биосовместимые полые волокна (9), сами по себе или внедренные в биосовместимый матрикс (8), как указано выше. Предпочтительно они одной стороной соединяются с микровходом, а другой стороной - с микровыходом (4), таким образом направляя рост эндотелиальных клеток. Для поддержания эластичности образующихся в итоге капилляров (14) предпочтительно, чтобы материал биосовместимого полого волокна (9) был биоразлагающимся, поскольку это позволяет удалить его с течением

- 4 023707 времени после образования капилляра. Предпочтительно биосовместимый матрикс (8) содержит или состоит из матригеля, фибринового геля, агарозного геля, альгинатного геля, синтетического геля, сшиваемых полимеров, а биосовместимое полое волокно (9) предпочтительно состоит из материала, выбранного из группы, состоящей из полимера полимолочной кислоты (РЬА), полилактида-ко-гликолида (РЬОЛ), поликапролактона (РСЬ) и поли(фумарового-ко-себацинового ангидрида), поливинилового спирта, сополимера этилена акриловой кислоты, полиакриловой кислоты, полигликолида, полилактида, производных целлюлозы, карбометокси/этил/гидроксипропила, гиалуроновой кислоты, связанного фолатом циклодекстрина/декстрана, пространственного полимера саркозина/аминокислоты, каррагенана, пектина/хитозана, хитозана, декстрана, коллагена или их смеси. Предпочтительно сшиваемые полимеры являются производными РЕО по формуле РЬО-(ПСК-СО)и, где РЕО - это поли(этиленгликоль), ЭСВ - это контрольная область разложения, СО - сшиваемая группа, а η больше или равно 3. В частности, предпочтительными материалами для биосовместимого полого волокна (9) являются РЬЛ и РЬОЛ. Выбор материалов матрикса и/или полого волокна, а также артериорального или венулярного транспортного канала гарантирует, что внутренняя поверхность системы циркуляции настоящего изобретения быстро и полностью покроется эндотелиальными клетками.

Анализ транспорта кислорода привел к появлению концепции, что участок ткани, наиболее отдаленный от входного конца капилляра образует мертвую зону (Шадйейа с1 а1., 1996, Сагйюуазси1аг Кезеагсй 32, 632-643). Поскольку в теле также присутствуют зоны малого парциального давления О₂, например в опухолевой ткани, целью настоящего изобретения является развить так называемую область (16) неоваскуляризации в участке (2) роста капилляров, т.е. участок, где во время начального образования капилляров (14) в системе (1) циркуляции настоящего изобретения не образуются капилляры (14). Это достигается за счет организации в участке (2) роста капилляров подучастка (16), лишенной микровходов (3) и микровыходов (4). Если этот подучасток (16) достаточно далеко удален от соответствующих микровходов (3) и микровыходов (4), образование капилляров (14) в этом подучастке ухудшается. Подучасток достаточно удален, если в нем не образовались капилляры, предпочтительно он удален по меньшей мере на 100 мкм и до 500 мкм, предпочтительно этот подучасток удален от микровходов (3) и/или микровыходов на расстояние от 100 до 300 мкм. Затем возможно поместить любую выбранную ткань или органоид в эту область, например опухолевую ткань, чтобы исследовать стимулы образования капилляров (14) или процессов регенерации. Как подробнее описано ниже, предпочтительно, чтобы одна часть материала, ограничивающего участок (2) роста капилляров, могла убираться, чтобы предоставить доступ к участку (2) роста капилляров. Предполагается, что через это отверстие будет осуществляться ввод клеток и/или органоидов в участок (2) роста капилляров. Впоследствии отверстие закрывается и является непроницаемым для жидкости. Материал крышки предпочтительно выбирается из пропускающих свет материалов, например стекла или пластика, что позволяет выполнять микроскопический осмотр участка (2) роста капилляров посредством микроскопии. Предпочтительно материал не является газопроницаемым. Однако в варианте осуществления, где у одного или нескольких участков роста капилляров есть функция микролегкого, такие участки роста капилляров закрываются газопроницаемой крышкой. Предпочтительно участок (2) роста капилляров отлит или обточен в виде сплошного блока данного материала, предпочтительно кубовидной формы. В этом исполнении предпочтительно, чтобы отверстие находилось с верхней стороны блока и занимало всю площадь поверхности участка (2) ростка капилляров.

Образование капилляров (14) эндотелиальными клетками стимулируется, если область, которая должна быть васкуляризована, не снабжается кислородом. Кроме того, максимальная длина капилляров (14) не должна превышать 4 мм, потому что на этом расстоянии окружающие ткани с естественной плотностью полностью потребляют питательные вещества, особенно кислород, поставляемые такими капиллярами (14).

Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления расстояние между микровходами (3) и микровыходами (4), которые должны соединяться с вновь образованными капиллярами (14), не должно превышать это максимальное расстояние, чтобы стимулировать рост капилляров (14). Соответственно, предпочтительно, чтобы расстояние между микровходом (3) и ближайшим микровыходом (4) находилось в диапазоне от 0,2 до 4 мм, более предпочтительно от 0,3 до 2 мм, еще предпочтительнее от 0,4 до 1 мм, предпочтительно около 0,5 мм. Ширина участка (2) роста капилляров находится в пределах от 0,5 до 1,5 мм, предпочтительно 1,0 мм, и/или высота участка (2) роста капилляров находится в пределах от 0,3 до 0,7 мм, предпочтительно 0,5 мм. Объем участка (2) роста капилляров находится в пределах 0,03-4,2 мкл, предпочтительно 0,5-1,0 мкл. Общий объем участка (2) роста капилляров, артериолярных транспортных каналов (6), венулярного транспортного канала (7) и насосного устройства (5) направленного действия находится в пределах 1,0-100 мкл, предпочтительно 5,0-15 мкл. Для стимулирования роста линейных соединений капилляров предпочтительно, чтобы каждый из микровходов (3) и микровыходов (4) располагался на противоположных концах участка (2) роста капилляров. Предпочтительно, чтобы участок роста капилляров был преимущественно прямоугольным параллелепипедом, предпочтительно кубической формы. Предпочтительно, чтобы микровход и микровыход располагались на противоположных гранях прямоугольного параллелепипеда. Тогда длина прямоугольного параллелепипеда определя- 5 023707 ется расстоянием между микровходами и микровыходами. В частности, предпочтительно, чтобы каждый микровход (3) был непосредственно расположен на одной линии с соответствующим микровыходом (4).

Желательно, чтобы кислород подавался в участок роста капилляров по капиллярам, соответственно, предпочтительно, чтобы материал, образующий стены участка роста капилляров обладал низкой газопроницаемостью или был газонепроницаем. Однако если один или несколько участков роста капилляров обладают функцией микролегкого, эти участки роста проектируются так, как описано выше. Предпочтительно, чтобы материал стенки выбирался из группы, состоящей из стекла и пластиков.

Как указано выше, капилляры (14) образуются самостоятельно в участке (2) роста капилляров после того, как он будет засеян эндотелиальными клетками. Важным направляющим сигналом для эндотелиальных клеток является поток жидкости через систему. Для стимулирования роста капилляров (14) правильного размера предпочтительно, чтобы диаметр микровходов (3) и/или микровыходов (4) находился в пределах 5-50 мкм, еще предпочтительнее в пределах 15-30 мкм. Образуемые капилляры (14) обладают диаметром в пределах 1-10 мкм, предпочтительно от 5 до 6 мкм. Как будет подробнее указано ниже, число микровходов и микровыходов в участке роста капилляров соответствует площади поверхности артериолярных и венулярных транспортных каналов. Для обеспечения достаточного снабжения тканей кислородом соответствующее количество микровходов и микровыходов предпочтительно распределено по поверхности соответствующей стороны камеры роста капилляров. По той же причине расстояние между двумя образованными капиллярами не должно быть менее 30 мкм. Соответственно, предпочтительно, чтобы расстояние между микровходами (3) находилось в пределах 30-500 мкм, предпочтительно в пределах 80-200 мкм, и/или расстояние между микровыходами (4) находилось в пределах 30-500 мкм, предпочтительно в пределах 80-200 мкм. В предпочтительном варианте осуществления микровходы (3) и/или микровходы (4) организованы в один, два, три или четыре ряда.

Предполагается, что ткани и/или органоиды (15) помещаются в участок (участки) роста капилляров (2), которые выполняют их естественную функцию. Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления участок (2) роста капилляров дополнительно содержит сборник (10) экстракапиллярной жидкости и/или отходов. Дренаж экстракапиллярной жидкости осуществляется за счет разности интракапиллярных давлений. Это обеспечивает дренирование жидкостей из тканей и/или органоидов (15), например, поджелудочной железы, почки, кишечника, которые выделяют жидкость экстракапиллярно. Предпочтительно, чтобы сборник (10) отходов был отделен от биосовместимого матрикса (8) и/или биосовместимого полого волокна (9) способом, который предотвращает утечку клеток крови и/или клеток ткани или органоида из участка (2) роста капилляра. Предпочтительно, чтобы сборник (10) экстракапиллярной жидкости и/или отходов был отделен от оставшегося участка (2) роста капилляров мембраной (11) для удержания клеток, т.е. средний размер пор мембраны меньше среднего размера клеток, растущих в системе (1) циркуляции настоящего изобретения, или каналов, не пропускающих клетки, размеры которых подобраны так, чтобы не пропускать клетки, растущие в системе (1) циркуляции настоящего изобретения.

Для отслеживания состояния системы предпочтительно, чтобы в системе (1) циркуляции по настоящему изобретению были предусмотрены один или несколько датчиков (12), предпочтительно в альвеолярном и/или венулярном транспортном канале (7), в сборнике (10) экстракапиллярной жидкости и/или отходов и/или в насосном устройстве направленного действия. Датчики (12), которые могут использоваться, содержат, помимо прочего, датчики рН, датчики рО₂, датчики захвата анализируемого вещества, кондуктометрические датчики, датчики плазмонного резонанса, датчики температуры, датчики СО₂, датчики N0, датчики хемотаксиса, датчики цитокинов, датчики ионов, датчики давления, потенциометрические датчики, амперометрические датчики, проточные датчики, датчики наполнения, датчики сопротивления, кондуктометрические датчики, датчики электромагнитного поля, датчики на поверхностных акустических волнах и датчики метаболизма. Датчики (12), используемые в этой системе, могут быть датчиками, отслеживающими участок (2) роста капилляров и/или среду, вытекающую из участка роста капилляров (2), или могут быть датчиками (12), расположенными в канале отходов и/или резервуаре (10) отходов.

Транспортные каналы имитируют меньшие артерии и вены кровеносной системы и служат соединением между насосным устройством (5) направленного действия и участком (2) роста капилляров. Следовательно, предпочтительно, чтобы транспортные каналы подходили для покрытия клетками гладкой мускулатуры и эндотелиальными клетками. Транспортные каналы желаемого диаметра и формы могут быть выполнены микромеханической обработкой соответствующей структуры в биосовместимом матриксе (8) или могут представлять собой биосовместимые полые волокна (9). Однако также возможно использовать бесклеточные биологические артериолы и/или венулы. Площадь поверхности транспортных каналов (6, 7) достаточна для обеспечения нужного количества О2 для большинства систем, если только в системе нет слишком большого количества участков (2) роста капилляров. Следовательно, предпочтительно, чтобы указанный биосовместимый матрикс (8) или биосовместимое полое волокно (9) было, по меньшей мере, частично газопроницаемым, предпочтительно содержало или состояло из ΡΌΜ8. ΡΌΜ8 представляет собой органический полимер на основе кремния, оптически прозрачный, вязкоэластичный, с возможность непосредственного нанесения рисунка способом литографии с поверхност- 6 023707 ным зарядом.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения диаметр артериолярного транспортного канала (6) и/или венулярного транспортного канала (7) в месте его соединения с насосным устройством (5) направленного действия находится в пределах от 300 мкм до 2,0 мм, предпочтительно 500 мкм. Желательно, чтобы скорость течения жидкости в системах (1) циркуляции не менялась существенно по системе во время циркуляции жидкости. Предпочтительно расход потока в системе находится в диапазоне от 0,02 до 0,1 см/с, предпочтительнее в пределах от 0,03 до 0,07 см/с, наиболее предпочтительно около 0,05 см/с. Однако микровходы (3) и микровыходы (4), как правило, имеют меньший диаметр и, таким образом, меньшую площадь поверхности, чем артериолярные микровходы (3) и венулярные микровыходы (4) соответственно, что приводит к увеличению расхода потока, когда жидкость попадает в микровходы (3). Соответственно, предпочтительно, чтобы артериолярный транспортный канал (6) ветвился по меньшей мере один раз, чтобы соединиться по меньшей мере с двумя входами, а венулярный транспортный канал (7) ветвился по меньшей мере один раз, чтобы соединяться по меньшей мере с двумя выходами (4), соответственно. Во избежание значительных отклонений в потоке жидкости предпочтительно, чтобы объединенная площадь поперечного сечения артериолярных каналов после точки (13) ветвления была по существу идентична площади поперечного сечения артериолярного канала перед точкой (13) ветвления, и/или объединенная площадь поперечного сечения венулярных транспортных каналов (7) после точки (13) ветвления была в общем идентична площади поперечного сечения венулярного канала перед точкой (13) ветвления. Как правило, артериолярный канал (6) или венулярный канал (7), соединенный с насосным устройством (5) направленного действия, ветвится на два или три артериолярных или венулярных канала (6, 7) меньшего диаметра. Количество точек (13) ветвления и/или число ветвлений, необходимых для уменьшения диаметра артериолярного или венулярного канала до диаметра соответствующего микровхода (3) и микровыхода (4), определяется относительной площадью поперечного сечения артериолярного канала (6) и венулярного канала (7) и диаметра и площади поперечного сечения, соответственно, микровходов (3) и микровыходов (4), с которыми они соединяются. Если, к примеру, диаметр артериолярного канала (6) составляет 1 мм, а диаметр микровхода (3) составляет 50 мкм, то 400 микровходов (3) обладают той же площадью поверхности, что и артериолярный канал (6) у насосного устройства (5) направленного действия. Соответственно, необходимо предусмотреть столько двунаправленных, трехнаправленных, четырехнаправленных и более направленных точек (13) ветвления, сколько требуется, чтобы соединить каждый конкретный микровход с разветвлением артериолярного канала (6). В предпочтительном варианте осуществления точка (13) ветвления выполнена в виде двунаправленной точки (13) ветвления, соответственно, количество микровходов (3) определяется формулой 2^П, где η число точек (13) ветвления в каждом протоке. В случаях, когда система (1) циркуляции состоит из двух или более участков (2) роста капилляров, проток разветвляется, чтобы соединиться с каждым из участков (2) роста капилляров отдельно. Не требуется, чтобы обе ветви имели одинаковые площади поперечного сечения, пока объединенная площадь поперечного сечения после точки (13) ветвления идентична или по существу идентична площади поперечного сечения до точки (13) ветвления. Например, в случаях, когда в одном из участков (2) роста капилляров было образовано микролегкое, направление в данный органоид (15) аналогичного количества жидкости, что и в участок (2) роста капилляров другого органоида (15) может не требоваться. Таким образом, в точке (13) ветвления артериолярная ветвь, соединяющаяся с легким-органоидом, будет иметь меньшую площадь поверхности, чем артериолярная ветвь, соединяющаяся с другим участком (2) роста капилляров. Совокупная площадь поперечных сечений всех входов (3) практически идентична площади поперечного сечения указанного артериолярного канала и/или артериолярных каналов, и совокупная площадь всех выходов (4) практически идентична площади поперечного сечения указанного венулярного канала и/или венулярных каналов, предпочтительно является площадью поперечного сечения артериолярного канала (6) и венулярного канала (7). Предпочтительно, чтобы насосное устройство (5) направленного действия являлось биологическим насосом, гидравлическим насосом, пьезоэлектрическим насосом, перистальтическим насосом, пневматическим насосом, электромагнитным насосом или магнитным насосом. Биологический насос образуется, например, кардиомиоцитами, которыми засеваются преимущественно эластические полимеры формы, поддерживающей пульсирующий поток при сокращении кардиомиоцитов (Тапака с1 а1., 2006, ЬаЬ ί,’ΐιίρ. 6, 362-386). Подергивание кардиомиоцитов обеспечивает сокращение, необходимое для работы насоса. Направленность потока, т.е. из венулярных каналов в артериолярные каналы, насосного устройства (5) может задаваться режимом действия насоса (5), который приводит к вытеснению жидкости только с одной стороны насосного устройства (5), или, в случаях, когда насосное устройство (5) просто пульсирует, дополнительными элементами, которые стимулируют направленный поток в артериолярных каналах. Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления насосное устройство (5) направленного действия содержит одно или несколько элементов потока, предпочтительно выбираемых из группы, состоящей из струеобразного элемента и элемента в виде обратного клапана. Элементы потока могут предусматриваться в протоке на выходе из венулярного транспортного канала (7) перед насосным устройством (5) направленного действия и/или в протоке в артериолярном канале после насосного устройства (5) направленного действия. В случае использования струеобразных элементов предпочтительно, чтобы они были предусмотрены на

- 7 023707 обоих концах насосного устройства (5) направленного действия. Предпочтительно механизм насосного устройства основывается на пульсациях предпочтительного эластичного матрикса/мембраны из ΡΌΜ8, приводимых в действие насосной камерой для генерации непрерывного перистальтического течения среды.

Предпочтительно, чтобы внутренняя поверхность указанных транспортных каналов и/или насосного устройства (5) направленного действия была покрыта веществами, выбранными из группы, состоящей из пептидов или белков, стимулирующих клеточную адгезию на биосовместимые полимеры или на их смесь. Адгезивные молекулы, пригодные для поддержания клеток, выбираются из группы, состоящей из интегринов, альбуминов, фибринов, адгезинов и/или коллагенов или их смеси. Данное покрытие стимулирует полное покрытие внутренней поверхности системы (1) циркуляции эндотелиальными клетками и/или клетками гладкой мускулатуры.

В предпочтительном варианте осуществления системы (1) циркуляции по настоящему изобретению система дополнительно содержит капилляры (14) и/или органоиды (15), образованные в участке (2) роста капилляров.

Предпочтительно участок (2) роста капилляров, насосное устройство направленного действия, артериолярный транспортный канал (каналы) (6) и венулярный транспортный канал (7) изготавливаются цельной деталью. Цельная деталь может состоять из различных материалов, склеенных друг с другом. Например, насосное устройство (5) направленного действия, артериолярный транспортный канал (каналы) (6) и венулярный транспортный канал (7) выполнены, например, микромеханической обработкой или литьем, в виде блока газопроницаемого материала, например, ΡΌΜ8. Часть, содержащая участок роста капилляров и микровходы и микровыходы, выполнена из газонепроницаемого материала, который приклеен к другой части таким образом, что каждый микровход и микровыход соответственно выровнен по артериолярному транспортному каналу (6) и венулярному транспортному каналу (7), соответственно. Также предпочтительно, чтобы матрикс (8) и/или полые волокна, которые предусмотрены в участке роста капилляров, были выполнены из другого материала, чем материал участка роста капилляров, предпочтительно, чтобы эта часть изготавливалась отдельно и вводилась в участок роста капилляров. Предпочтительно, чтобы участок роста капилляров затем был закрыт газонепроницаемой крышкой, если только этот участок не выполняет функцию микролегкого.

Предпочтительно, чтобы размеры системы (1) циркуляции по настоящему изобретению поддерживали непрерывную циркуляцию 4-8 мкл цельной крови по системе, внутренние поверхности которой полностью выстланы эндотелиальными клетками, предпочтительно в виде монослоя.

Предпочтительно настоящая система циркуляции сконфигурирована так, чтобы снабжать питательными веществами по меньшей мере два разных микроорганоида, каждый в масштабе микролитров в течение нескольких месяцев культивирования. Использование крови, предпочтительно цельной крови, гарантирует мощную буферную систему, обеспечивает все необходимые белки плазмы для тканей, поддерживает транспорт кислорода через эритроциты и обеспечивает иммунологические меры против загрязняющих микроорганизмов через белые клетки крови.

Настоящее изобретение предоставляет способ формирования системы (1) циркуляции, включающий этапы:

a) засевание циркуляционной системы (1) эндотелиальными клетками и

b) инкубирование, по меньшей мере, до тех пор, пока в участке (2) роста капилляров не образуются капилляры (14), и/или пока в транспортных канала не образуется слой эндотелиальных клеток, и/или до тех пор, пока слой эндотелиальных клеток не покроет все внутренние поверхности насосного устройства (5).

Эндотелиальные клетки способны образовывать капилляры (14) при условии помещения их в среду, обеспечивающую клеточный каркас для роста, питательные вещества и кислород и, опционально, ангиогенные факторы, например, ТОТ и/или васкулярный эндотелиальный кадгерин (УЕС). Соответственно, система засевается эндотелиальными клетками, предпочтительно через отверстие для доступа, которые затем инкубируются до тех пор, пока не образуются капилляры (14), что, обычно, занимает от 2 до 10 дней, предпочтительно от 2 до 6 дней, в зависимости от количества засеянных эндотелиальных клеток, расстояния между микровходами (3) и микровыходами (4), которые должны быть соединены, и при этом вся внутренняя поверхность системы (1) циркуляции по настоящему изобретению должна быть покрыта эндотелиальными клетками. Как правило, система с общим объемом жидкости в пределах от 1 до 100 мкл, преимущественно от 5 до 50 мкл, засевается клетками в количестве от 500 до 5000 клеток. Естественно, артериолы и венулы состоят не только из эндотелиальных клеток, но также из клеток гладкой мускулатуры и биосовместимых матриксов. Клетки гладкой мускулатуры обеспечивают артериолам и венулам гибкость и делают их непроницаемыми для жидкостей. Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления данный способ дополнительно включает засевание клетками гладкой мускулатуры ранее, одновременно или после засевания эндотелиальными клетками. Предпочтительно соотношение между засеваемыми эндотелиальными клетками и клетками гладкой мускулатуры должно составлять от 5 к 1 и от 0,5 к 1, предпочтительно 2 к 1.

Предпочтительно способ по настоящему изобретению далее включает этап подачи цельной крови в

- 8 023707 контур микроциркуляции после того, как монослой эндотелиальных клеток покроет все поверхности. Во время инкубационного периода эндотелиальные клетки наиболее вероятно образуют неповрежденные капилляры (14), если они находятся под действием постоянных механических сил, следовательно, предпочтительно, чтобы этап Ь) осуществляли под действием касательного усилия. Касательные усилия создаются циркулированием среды по системе (1) циркуляции по настоящему изобретению. Предпочтительно поток на микровходе (3) и микровыходах (4) находится в пределах 5-20 дин/см². Чтобы позволить прилипание клеток к внутренней поверхности системы (1) циркуляции и/или миграцию в камеру (2) роста капилляров, система (1) циркуляции наполняется жидкостью.

Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления засеваемые клетки входят в состав среды, плазмы или крови, предпочтительно цельной крови. В частности, предпочтительная среда засевания, которая также использовалась на этапе инкубации, ведущему к образованию капилляров (14), состоит, например, из эндотелиальной клеточной базальной среды-2 (ЕВМ-2), дополненной гидрокортизоном, фетальной сывороткой крупного рогатого скота (РС8), свиным УЕОР (фактор роста сосудистого эндотелия), базовым фактором роста фибробластов человека (ЬЬРСР), фактором роста эпидермиса человека (ЬЕСР), инсулиноподобным фактором роста (КЗ 1ОР), аскорбиновой кислотой, пенициллином, стрептомицином, если средой засевания является плазма или кровь, предпочтительно, чтобы она дополнялась одним или несколькими из перечисленных выше веществ. Для определения, образовались ли на этапе Ь) капилляры (14), используются микродатчики (12) и/или визуальный осмотр. Подходящие микродатчики (12) измеряют трансэндотелиальное электрическое сопротивление (ТЕЕК). Предпочтительно, чтобы система (1) циркуляции засевалась одним или несколькими типами клеток, не относящимися к эндотелию, предпочтительно в участке (2) роста капилляров, для развития тканей и/или органоидов (15) в участках (2) роста капилляров. Данные клетки могут также засеиваться перед этапом а) или одновременно с ним, после этапа а) или после этапа Ь). Типы тканей, из которых извлекаются клетки, предпочтительно выбираются из группы, состоящей из печени, кожи, легкого, почки, кишечника, нейронов, сердечной мышцы и/или опухолей.

Настоящее изобретение предусматривает систему (1) циркуляции, которую можно изготовить описанным способом, например систему циркуляции с развившимися капиллярами и/или органоидами.

Настоящее изобретение предусматривает использование системы (1) циркуляции для отслеживания действия одного или нескольких испытываемых соединений и/или для определения эффективности, побочных эффектов, биологической безопасности, метаболитов, механизма действия или регенерации органов. Предпочтительно, чтобы подобное тестирование выполнялось подачей одного или нескольких испытываемых соединений через отверстие подачи.

Пункт 1 относится к системе (1) циркуляции, которая является автономной и содержит:

a) по меньшей мере один участок (2) роста капилляров, содержащий по меньшей мере два микровхода (3) и два микровыхода (4),

b) насосное устройство (5) направленного действия и

c) артериолярный транспортный канал (6), соединяющий насосное устройство (5) направленного действия по меньшей мере с двумя входами (3), и венулярный транспортный канал (7), соединяющий насосное устройство (5) направленного действия по меньшей мере с двумя выходами ( 4).

Пункт 2 относится к системе (1) циркуляции по п.1, отличающейся тем, что система (1) циркуляции содержит по меньшей мере два участка (2) роста капилляров.

Пункт 3 относится к системе (1) циркуляции по п.1 или 2, где один участок (2) роста капилляров является, по меньшей мере, частично газопроницаемым.

Пункт 4 относится к системе (1) циркуляции по любому из пп.1-3, где участок (2) роста капилляров содержит или состоит из полутвердого биосовместимого матрикса (8) и/или полутвердых биосовместимых полых волокон (9).

Пункт 5 относится к системе (1) циркуляции по п.4, где биосовместимое полое волокно (9) является биологически разлагающимся.

Пункт 6 относится к системе (1) циркуляции по п.4 или 5, где биосовместимый матрикс (8) содержит или состоит из материала, выбранного из группы, состоящей из матригеля, фибринового геля, агарозного геля, альгинатного геля, синтетического геля, сшиваемых полимеров, а биосовместимое полое волокно (9) состоит из материала, выбранного из группы, состоящей из полимера полимолочной кислоты, полилактида-ко-гликолида или их смеси.

Пункт 7 относится к системе (1) циркуляции по любому из пп.4-6, где биосовместимый матрикс (8) содержит микроканалы, структуры и/или сети, которые обеспечивают образование капилляров (14) эндотелиальными клетками.

Пункт 8 относится к системе (1) циркуляции по любому из пп.1-7, где часть участка (2) роста капилляров лишена микровходов (3) и микровыходов (4).

Пункт 9 относится к системе (1) циркуляции по любому из пп.1-8, где расстояние между микровходами (3) и микровыходами (4) составляет от 0,2 до 4 мм, предпочтительно 0,5 мм.

Пункт 10 относится к системе (1) циркуляции по любому из пп.1-9, где ширина участка (2) роста капилляров находится в пределах от 0,5 до 1,5 мм, предпочтительно 1,0 мм, и/или высота участка (2) ро- 9 023707 ста капилляров находится в пределах 0,3-0,7 мм, предпочтительно 0,5 мм.

Пункт 11 относится к системе (1) циркуляции по любому из пп.1-10, где объем участка (2) роста капилляров находится в пределах 0,03-4,2 мкл.

Пункт 12 относится к системе (1) циркуляции по любому из пп.1-11, где микровходы (3) и микровыходы (4) расположены на противоположных концах участка (2) роста капилляров.

Пункт 13 относится к системе (1) циркуляции по любому из пп.1-12, где диаметр микровходов (3) и/или микровыходов (4) составляет 10-50 мкм.

Пункт 14 относится к системе (1) циркуляции по любому из пп.1-13, где участок (2) роста капилляров также содержит сборник (10) экстракапиллярной жидкости и/или отходов.

Пункт 15 относится к системе (1) циркуляции по любому из пп.1-14, где сборник (10) экстракапиллярной жидкости и/или отходов отделен от биосовместимого матрикса (8) и/или биосовместимого полого волокна (9) мембраной для удержания клеток или каналами (11), не принимающими клетки.

Пункт 16 относится к системе (1) циркуляции по п.14 или 15, где в сборнике (10) экстракапиллярной жидкости и/или отходов предусмотрен хотя бы один датчик (12).

Пункт 17 относится к системе (1) циркуляции по п.16, где хотя бы один датчик (12) выбран из группы, содержащий датчик рН, датчик рО₂, датчик захвата анализируемого компонента, кондуктометрический датчик, датчик плазмонного резонанса, датчик температуры, датчик СО₂, датчик N0, датчик хемотаксиса, датчик цитокина, датчик ионов, датчик давления, потенциометрический датчик, амперометрический датчик, проточный датчик, датчик наполнения, датчик сопротивления, кондуктометрический датчик, датчик электромагнитного поля, датчик на поверхностных акустических волнах и датчик метаболизма.

Пункт 18 относится к системе (1) циркуляции по любому из пп.1-17, где транспортный канал изготовлен микромеханической обработкой в биосовместимый матрикс (8) или биосовместимое полое волокно (9), где указанный биосовместимый матрикс (8) или биосовместимое полое волокно (9) является хотя бы частично газопроницаемым, предпочтительно содержит или состоит из ΡΌΜδ.

Пункт 19 относится к системе (1) циркуляции по любому из пп.1-18, где диаметр артериолярного транспортного канала (6) и/или венулярного транспортного канала (7) в месте их соединения с насосным устройством (5) направленного действия находится в пределах от 300 мкм до 2,0 мм, предпочтительно 500 мкм.

Пункт 20 относится к системе (1) циркуляции по любому из пп.1-19, где артериолярный транспортный канал (6) ветвится по меньшей мере один раз, чтобы соединиться по меньшей мере с двумя входами (3), а венулярный транспортный канал (7) ветвится по меньшей мере один раз, чтобы соединяться по меньшей мере с двумя выходами (4), соответственно.

Пункт 21 относится к системе (1) циркуляции по п.20, где совокупная площадь поперечного сечения артериолярных каналов после точки (13) ветвления, по существу, идентична площади поперечного сечения артериолярного канала перед точкой (13) ветвления, и/или совокупная площадь поперечного сечения венулярных транспортных каналов (7) после точки (13) ветвления, по существу, идентична площади поперечного сечения венулярного канала перед точкой (13) ветвления.

Пункт 22 относится к системе (1) циркуляции по любому из пп.20 и 21, где совокупная площадь поперечных сечений всех входов (3) практически идентична площади поперечного сечения указанного артериолярного канала и/или артериолярных каналов, и совокупная площадь всех выходов (4) практически идентична площади поперечного сечения указанного венулярного канала и/или венулярных каналов, предпочтительно площади поперечного сечения артериолярного и венулярного каналов идентичны.

Пункт 23 относится к системе (1) циркуляции по любому из пп.1-22, где насосное устройство (5) направленного действия является биологическим насосом, гидравлическим насосом, пьезоэлектрическим насосом, перистальтическим насосом, пневматическим насосом, электромагнитным насосом или магнитным насосом.

Пункт 24 относится к системе (1) циркуляции по любому из пп.1-23, где устройство (5) направленного действия состоит из одного или нескольких элементов потока, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из струеобразного элемента и элемента в виде обратного клапана.

Пункт 25 относится к системе (1) циркуляции по любому из пп.1-24, где, по меньшей мере, внутренняя поверхность указанных транспортных каналов и/или насосного устройства (5) направленного действия покрыта веществом, выбранным из группы, состоящей из пептидов или белков, стимулирующих клеточную адгезию на биосовместимые полимеры, или их смеси.

Пункт 26 относится к системе (1) циркуляции по п. 25, где пептиды или белки, стимулирующие клеточную адгезию, выбраны из группы, состоящей из интегринов, альбуминов, фибринов, адгезинов, коллагенов.

Пункт 27 относится к системе (1) циркуляции по любому из пп.1-26, дополнительно содержащей капилляры (14) и/или органоиды (15), образованные в участке (2) роста капилляров.

Пункт 28 относится к способу развития системы (1) циркуляции в соответствии с любым из пп.1-27, при этом способ включает этапы:

а) засевание системы (1) циркуляции эндотелиальными клетками и

- 10 023707

Ь) инкубирование, по меньшей мере, до тех пор, пока в участке (2) роста капилляров не образуются капилляры (14), и/или в транспортных каналах образуется слой эндотелиальных клеток, и/или пока слой эндотелиальных клеток не покроет все внутренние поверхности насосного устройства (5).

Пункт 29 относится к способу формирования системы (1) циркуляции по п.28, где засеиваемые клетки входят в состав среды и плазмы.

Пункт 30 относится к способу формирования системы (1) циркуляции по п.28 или 29, где способ дополнительно включает этап засевания клетками гладкой мускулатуры перед этапом а), одновременно с ним или после него.

Пункт 31 относится к способу формирования системы (1) циркуляции любому из пп.28-30, где способ дополнительно включает этап подачи цельной крови в указанную систему циркуляции.

Пункт 32 относится к способу развития системы (1) циркуляции по любому из пп.28-31, где этап Ь) осуществляют под действием касательного усилия.

Пункт 33 относится к способу развития системы (1) циркуляции по любому из пп.29-32, где участок (2) роста капилляров засевают клетками одного или нескольких клеточных типов, предпочтительно после этапа Ь).

Пункт 34 относится к способу развития системы (1) циркуляции по п.33, где клетки выбирают из группы, состоящей из клеток печени, клеток кожи, клеток легкого, клеток почки, клеток кишечника, нейронных клеток, кардиомиоцитов и/или опухолевых клеток.

Пункт 35 относится к системе (1) циркуляции, которую можно изготовить способом по любому из пп.28-34.

Пункт 36 относится к способу использования системы циркуляции (1) по пп.27-35 для отслеживания действия одного или нескольких испытываемых соединений и/или для определения эффективности, биологической безопасности, побочных эффектов, метаболитов, механизма действия или регенерации органов.

Перечень ссылочных позиций (1) автономная система циркуляции (2) участок роста капилляров (3) микровход (4) микровыход (5) насосное устройство направленного действия (6) артериолярный транспортный канал (7) венулярный транспортный канал (8) биосовместимый матрикс (9) биосовместимое полое волокно (10) сборник экстракапиллярной жидкости и/или отходов (11) мембрана для удержания клеток или канал, не пропускающий клетки (12) датчики (13) точка ветвления (14) капилляры (15) ткани и/или органоиды (16) область неоваскуляризации (17) отверстие подачи

Краткое описание фигур

Фиг. 1: вид сверху вниз предпочтительного варианта осуществления автономной системы (1) циркуляции, содержащей два участка (2) роста капилляров, насосное устройство (5) направленного действия и артериолярный транспортный канал (6) и венулярный транспортный канал (7). В предпочтительном варианте осуществления насосное устройство (5) и два участка (2) роста капилляров расположены параллельно. Транспортные каналы (6, 7) служат соединением между насосным устройством (5) направленного действия и участком (2) роста капилляров. В предпочтительном варианте осуществления отверстие (17) подачи для поддержки буфера расположено в непосредственной близости от микронасоса. Как правило, артериолярный канал (6) или венулярный канал (7), соединенный с насосным устройством (5) направленного действия, ветвится на два или три артериолярных или венулярных канала меньшего диаметра в точках (13) ветвления. Участки (2) роста капилляров предпочтительно заполняют разными тканями и/или органоидами (15), которые перфузируются одной и той же циркулирующей жидкостью и позволяют, например, проводить испытание действия одного вещества одновременно на несколько тканей.

Фиг. 2: вид сверху вниз предпочтительного варианта осуществления участка (2) роста капилляров автономной системы (1) циркуляции. Участки (2) роста капилляров представляют собой пространства, предусмотренные для скопления капилляров (14), например, эндотелиальными клетками между микровходами (3) и микровыходами (4). Для обеспечения надлежащей окружающей среды для роста капилляров (14) предпочтительно, чтобы участок (2) роста капилляров содержал или состоял из полутвердого биосовместимого матрикса (8). Альтернативно, предусмотрены биосовместимые полые волокна (9), ко- 11 023707 торые с одной стороны соединены с микровходом (3), а с другой стороны - с микровыходом (4). Наиболее удаленный от входного конца капилляра (14) участок ткани образует область (16) неоваскуляризации в участке (2) роста капилляров, т.е. участок, где во время основного формирования капилляров (14) в контуре циркуляции капилляры (14) не образуются. Предпочтительно, чтобы участок (2) роста капилляров также содержал сборник (10) экстракапиллярной жидкости и/или отходов, который будет отделен от оставшейся части участка (2) роста капилляров мембраной для удержания клеток (11). Для отслеживания состояния системы в сборнике (10) экстракапиллярной жидкости и/или отходов предусмотрен один или несколько датчиков (12).

Фиг. 3: вид сверху вниз предпочтительного варианта осуществления автономной системы циркуляции, используемой в примере эксперимента и оснащенной перистальтическим насосом (5), тремя клапанами для вытеснения жидкости, вставки (15) и двух сборников (10), поддерживающих наполнение и промывку системы.

Фиг. 4: окрашивание кальцеином АМ живых клеток отдельного участка каналов автономной системы микроциркуляции, полностью покрытого эндотелиальными клетками человека после семи дней культивирования с перфузией.

Фиг. 5: окрашивание флуоресцентной плазменной мембраны СеНМакк© чипа автономной системы циркуляции, полностью покрытой эндотелиальными клетками человека после семи дней перфузии.

Пример

Автономная система (1) циркуляции сформировалась за период 14 дней, полностью покрыв все каналы и поверхности прототипного чипа биореактора, как показано на фиг. 3, живыми эндотелиальными клетками человека в стерильной среде. Для создания циркуляции жидкости в пространстве (15) тканевой культуры использовался перистальтический микронасос (5). Сборники (10) для экстракапиллярной жидкости и отходов использовались совместно с клапанами А, В и С для управления уровнями жидкости и обмена в системе. Чип был отлит с использованием эталона и ΡΌΜδ. Слой ΡΌΜδ затем был помещен на стеклянную пластинку и установлен в держатель. Металлические вставки для инокулятов (15) клеток и ткани и сбора излишков жидкости и отходов (10) были закреплены на чипе биореактора с помощью карбонатной пластины на верху пластины ΡΌΜδ. Полностью собранный чип автономной системы циркуляции показан на фиг. 4.

Клетки микрососудистого эндотелия кожи человека (ПОМЕС), полученные от Рготосе11, использовались между пассажами 4-7. Перед использованием их выращивали во флаконах Т-75 в среде для роста эндотелиальных клеток МУ-2 (Рготосе11, 5% ΡСδ, 1% пенициллин-стрептомиицин) при 37°С и 5% СО₂ (увлажненный инкубатор) и пассировании при конфлюэнтности 80%. Для данного эксперимента клетки собирали мытьем один раз с ΡΒδ и добавлением 2 мл 0,25% раствора трипсина/ΕΌΤΑ. Отделение клеток происходило в течение 5 минут инкубации при температуре 37°С. После нейтрализации раствора трипсина 10%-ный ΡСδ в ОМЕМ клетки отделяли в центрифуге в течение 5 минут с 300/д и подсчитывали с помощью гемоцитометра. Чип стерильной автономной системы циркуляции промывали 80%-ным этанолом в течение 10 мин. Затем с помощью шприца в каналы вводили ΡΒδ и инкубировали в течение еще 10 минут. После замены ΡΒδ промыванием каналов с помощью среды НОМЕС чип инкубировали на протяжении ночи при температуре 4°С.

Для засевания НОМЕС в микроканалы осадок клеток перерастворяли в среде НОМЕС до окончательной концентрации 2/10⁷ клеток/мл. Взвесь отмытых клеток перемещали на пустую вставку (фиг. 3, 15). Для создания разности в гидростатическом давлении между пространством вставки и сборниками (фиг. 3, 10) среду из сборников удаляли. Затем перистальтический насос открывали, чтобы позволить клеткам заполнить каналы. Кроме того, открывали клапан А, чтобы обеспечить равномерное заполнение всего чипа.

Чтобы позволить крепление и распространение эндотелиальных клеток по поверхностям каналов, чип автономной системы циркуляции инкубировали при 37°С и с 5% СО₂ в течение 2 ч. После этого на вставки добавляли 50 мкл НОМЕС среды, и клетки перерастворяли, заполняя каналы так же, как описано выше. Затем сборники заполняли средой, герметично закрывали, и устройство переворачивали, чтобы позволить клеткам закрепиться также на потолке каналов. Через 5 ч статической инкубации чип подключили к пневматическому насосному устройству, и клапаны В и С закрывали, чтобы создать циркуляционный поток. Чип инкубировали в течение 14 дней на частоте накачки 0,16 Гц и давлении 0,3 бар. Среда вставки и пространство сборника заменяли ежедневно.

Воздействие касательных напряжений на форму эндотелиальных клеток и полностью замкнутое покрытие всех поверхностей канала эндотелиальными клетками было определено посредством флуоресцентной микроскопии (фиг. 4 и 5).

Claims (18)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Автономная система (1) циркуляции, имитирующая естественную систему перфузии крови позвоночных на тканевом уровне, содержащая:

   а) по меньшей мере один участок (2) роста капилляров, содержащий по меньшей мере два микро- 12 023707 входа (3) и два микровыхода (4),

   b) насосное устройство (5) направленного действия и

   c) артериолярный транспортный канал (6), соединяющий насосное устройство (5) направленного действия по меньшей мере с двумя входами (3), и венулярный транспортный канал (7), соединяющий насосное устройство (5) направленного действия по меньшей мере с двумя выходами (4), при этом система циркуляции содержит отверстие (17) для прерывистой подачи питательной жидкости в систему циркуляции инжекционным устройством и не имеет подключения жидкости для непрерывной подачи жидкости из внешнего резервуара в систему циркуляции.
2. 2. Система (1) циркуляции по п.1, где система (1) циркуляции содержит по меньшей мере два участка (2) роста капилляров.
3. 3. Система (1) циркуляции по любому из пп.1 или 2, где один участок (2) роста капилляров является, по меньшей мере, частично газопроницаемым.
4. 4. Система (1) циркуляции по любому из пп.1-3, где участок (2) роста капилляров содержит или состоит из полутвердого биосовместимого матрикса (8) и/или полутвердых биосовместимых полых волокон (9).
5. 5. Система (1) циркуляции по п.4, где биосовместимый матрикс (8) содержит микроканалы, структуры и/или сети, которые обеспечивают образование капилляров (14) эндотелиальными клетками.
6. 6. Система (1) циркуляции по любому из пп.1-5, где часть участка (2) роста капилляров лишена микровходов (3) и микровыходов (4).
7. 7. Система (1) циркуляции по любому из пп.1-6, где участок (2) роста капилляров дополнительно содержит сборник (10) экстракапиллярной жидкости и/или отходов.
8. 8. Система (1) циркуляции по п.7, где сборник (10) экстракапиллярной жидкости и/или отходов отделен от биосовместимого матрикса (8) и/или биосовместимого полого волокна (9) мембраной для удержания клеток или каналами (11), не пропускающими клетки.
9. 9. Система (1) циркуляции по п.8, где в сборнике (10) экстракапиллярной жидкости и/или отходов предусмотрен по меньшей мере один датчик (12).
10. 10. Система циркуляции (1) по любому из пп.1-9, где в участке (2) роста капилляров предусмотрен подучасток (16), лишенный микровходов (3) и микровыходов (4).
11. 11. Система (1) циркуляции по п.10, где подучасток (16) удален на расстояние по меньшей мере от 100 до 500 мкм от соответствующих микровходов (3) и микровыходов (4), так что образование капилляров (14) в этом подучастке ухудшено.
12. 12. Система (1) циркуляции по п.10 или 11, где подучасток (16) удален предпочтительно на расстояние 100-300 мкм от микровходов (3) и/или микровыходов (4).
13. 13. Система (1) циркуляции по любому из пп.1-12, где артериолярный транспортный канал (6) выполнен разветвленным по меньшей мере один раз для соединения по меньшей мере с двумя входами (3) и венулярный транспортный канал (7) выполнен разветвленным по меньшей мере один раз для соединения по меньшей мере с двумя выходами (4), соответственно.
14. 14. Система (1) циркуляции по п.13, где совокупная площадь поперечного сечения артериолярных каналов после точки (13) ветвления, по существу, идентична площади поперечного сечения артериолярного канала перед точкой (13) ветвления, и/или совокупная площадь поперечного сечения венулярных транспортных каналов (7) после точки (13) ветвления, по существу, идентична площади поперечного сечения венулярного канала перед точкой (13) ветвления.
15. 15. Система (1) циркуляции по п.13 или 14, где совокупная площадь поперечных сечений всех входов (3), по существу, идентична площади поперечного сечения указанного артериолярного канала и/или артериолярных каналов и совокупная площадь всех выходов (4), по существу, идентична площади поперечного сечения указанного венулярного канала и/или венулярных каналов, предпочтительно площади поперечного сечения артериолярного и венулярного каналов идентичны.
16. 16. Способ формирования системы (1) циркуляции по любому из пп.1-15, в котором:

    a) эндотелиальные клетки прерывисто засевают в систему (1) циркуляции и

    b) засеянные клетки инкубируют, по меньшей мере, до тех пор, пока в участке (2) роста капилляров не образуются капилляры (14), и/или в транспортных каналах образуется слой эндотелиальных клеток, и/или пока слой эндотелиальных клеток не покроет все внутренние поверхности насосного устройства (5), причем подачу питательной жидкости осуществляют прерывисто инжекционным устройством через отверстие (17), расположенное в системе циркуляции.
17. 17. Способ формирования системы (1) циркуляции по п.16, где способ дополнительно включает этап подачи цельной крови в указанную систему циркуляции.
18. 18. Способ формирования системы (1) циркуляции по любому из пп.16 или 17, при этом этап Ь) осуществляют под действием касательного усилия, созданного циркулированием среды по системе (1) циркуляции.