KR101898093B1 - 생체관 모사조직이 포함된 분석용 칩 및 이의 제조방법 - Google Patents

생체관 모사조직이 포함된 분석용 칩 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생체관 모사조직이 포함된 분석용 칩을 제조하는 방법 및 생체관 모사조직이 포함된 분석용 칩에 관한 것이다. 본 발명의 생체관 모사조직이 포함된 분석용 칩은 상피세포막에 의해 형성된 생체관 및 생체관을 둘러싸고 있는 세포외기질을 분석용 칩 상에서 생체환경과 최대한 근접하게 구현하였다. 따라서, 본 발명의 생체관 모사조직이 포함된 분석용 칩은 암세포의 발암과정 또는 암전이 과정에 대한 연구 또는 신규 항암제의 스크리닝 또는 테스트를 실제 인 비보(in vivo)조건과 유사하게 수행할 수 있는 플랫폼을 제공할 수 있다.

Description

생체관 모사조직이 포함된 분석용 칩 및 이의 제조방법{Assay Chip for Simulating Biological Tubule and Manufacturing Method Thereof}
본 발명은 생체관 모사조직이 포함된 분석용 칩 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
생체 내에서 세포는 서로 결합하여 조직을 이루고 있으며 복잡한 구조의 생활성적 지지체인 세포외기질(extracellular matrix, ECM)에 둘러싸여 있다. 세포들은 결합된 조직 안에서 생리활성물질(physiological active substance)을 주고받으며 서로에게 영향을 주며 다양한 물질로 구성되어 있는 세포외 기질은 세포에 생화학적 신호를 전달하거나 세포를 구조적으로 지지하고 세포의 항상성을 유지하는 역할을 한다. 이러한 세포-세포 또는 세포-세포외기질의 상호작용은 세포의 분화 또는 특성을 결정하는 매우 복잡한 요소들로 구성되어 있기 때문에 실험실 상에서 이들을 이해하기 위해서는 생체와 유사한 미세 환경을 구축할 필요성이 있다. 이러한 필요에 따라, 인 비트로(in vitro) 상에서 생체와 유사한 미세 환경을 구축하기 위한 새로운 소재와 방법이 지속적으로 개발되고 있으며 이를 이용한 분석용 칩(assay chip)의 개발이 이루어지고 있다.
하지만 종래의 분석용 칩은 미세 스케일로 진화하여 많은 양의 분석을 짧은 시간에 수행할 수 있는 장점이 있지만, 생체와 유사한 미세 환경을 모사하는 기술에 있어서는 대부분의 분석용 칩이 기판 상에 인공적인 세포부착물질 또는 세포외기질성분을 코팅하여 세포를 배양하는 수준에 머물고 있다. 세포의 성질에 대한 인 비트로(in vitro)와 인 비보(in vivo)의 차이를 보여주는 대표적인 예로, 유관상피내암종(ductal carcinoma in situ, DCIS)이 있다.
유관상피내암(ductal carcinoma in situ, DCIS)은 비침윤성 암(non-invasive cancer)으로 환자에게서는 침윤이 일어나지 않지만, 인 비트로(in vitro) 세포배양에서는 침윤을 보인다. 이러한 결과는 인 비트로 세포 배양 조건과 인 비보 생리학적 환경(real in vivo physiology)이 근본적으로 다르기 때문이며 인 비트로와 인 비보 조건이 가지고 있는 암 세포 주위의 미세환경(micro environment) 차이가 발암 및 암전이 과정에서 매우 중요한 역할을 하기 때문인 것으로 판단된다. 따라서, DCIS와 같은 암세포의 발암 및 암전이 과정이나 실제 세포의 특성을 정확히 이해하고 연구하기 위해서는 실제 생체조직에 최대한 근접하게 모사한 생체 모사기술이 요구된다.
본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.
대한민국 등록특허 제10-1261710호 미국 공개특허 제20140011278호 국제공개특허 제WO 2013/086486호
본 발명자들은 발암 및 암전이 과정을 보다 정확하게 이해할 수 있는 플랫폼을 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 분석용 칩 상에 세포외기질로 둘러싸인 상피세포 유래 생체관 모사조직을 성공적으로 구현하였고, 이 분석용 칩이 인 비보(in vivo) 조건과 매우 유사한 조건하에서 발암 및 암전이 과정 연구와 항암 약물의 테스트가 가능한 플랫폼으로 이용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 생체관 (biological tubule) 모사조직이 포함된 분석용 칩을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 생체관 모사조직이 포함된 분석용 칩을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 생체관(biological tubule) 모사 조직이 포함된 분석용 칩(assay chip)의 제조 방법을 제공한다:
(a) 지지체(scaffold) 상에 세포(예: 상피세포(epithelial cell))를 접종하여 배양하는 단계;
(b) 상기 세포가 배양된 지지체를 관(tubule) 형상으로 형성하여 생체관 모사조직을 제조하는 단계;
(c) 분석용 칩의 중앙에 위치하는 생체관 모사조직 수용부, 상기 생체관 모사조직 수용부 양쪽 측면에 위치하는 채널, 및 상기 생체관 모사조직 수용부와 상기 채널 사이에 위치하는 다공성 벽(porous wall)을 포함하는 분석용 칩을 제조하는 단계;
(d) 상기 분석용 칩의 생체관 모사조직 수용부에 세포외기질 성분을 채우는 단계; 및
(e) 상기 단계 (b)에서 제조한 생체관 모사조직을 상기 분석용 칩의 생체관 모사조직 수용부에 매립(embedding)하는 단계.
단계 (a): 지지체 상에 세포(예: 상피세포)를 접종하여 배양하는 단계
먼저, 상피세포를 지지체(scaffold) 상에 접종하여 배양한다. 본 발명에서 상기 지지체는 세포가 부착되어 배양될 수 있고, 관(tubule) 형상을 형성할 수 있을 정도의 유연성을 가진다면 이의 재질이나 형태는 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 지지체는 다공성 지지체이다. 상기 다공성 지지체는 다수의 기공(pore)을 가지고 있으므로, 세포, 세포배양액 또는 생리활성물질의 통과가 가능하다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 다공성 지지체는 직조 메쉬 시트(woven mesh sheet)이다. 상기 직조 메쉬 시트는 생분해성 고분자 또는 난분해성 고분자로 이루어진 섬유를 느슨하게 상호 교차하여 연결한 직물구조일 수 있으며, 필요에 따라 기공 크기(pore size)를 조절하여 기체, 물, 영양물질, 또는 생리활성물질 뿐만 아니라, 세포의 이동도 가능하게 제조할 수 있다. 상기 직조 매쉬 시트를 구성하는 생분해성 고분자는 폴리카프로락톤, 폴리락트산, 폴리락트산-폴리카프로락톤 공중합체, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰루로오스, 초산셀룰로오스, 니트로셀룰로오스, 커들란, 폴리글루탐산, 폴리라이신, 폴리히드록시 알카노에이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리글리콜산, 또는 폴리에스테르이나 이에 한정되지 않는다. 상기 직조 메쉬 시트를 구성하는 난분해성 고분자는 테프론, 폴리올레핀, 폴리아마이드, 폴리아크릴레이트, 실리콘, 폴리메틸 메타아크릴레이트, 폴리스티렌, 에틸렌-비닐 아세테이트 코폴리머, 폴리에틸렌-말레 안하이드리드 코폴리머, 폴리아미드, 폴리(비닐 클로라이드), 폴리(비닐 플로라이드), 폴리비닐 이미다졸, 클로로술포네이트 폴리올레핀, 폴리에틸렌 테트라프탈레이트, 나일론, 저밀도 폴리에틸렌, 고밀도 폴리에틸렌, 아크릴, 폴리에테르케톤, 폴리이미드, 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 또는 폴리에틸렌옥시드를 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 지지체는 상피세포가 부착하여 성장이 용이하도록 세포외기질 성분으로 코팅될 수 있다.
본 발명에서 상기 세포외기질은 조직 내 또는 세포외의 공간을 채우고 있는 생체고분자의 복합체를 의미한다. 상기 세포외기질을 구성하는 성분은 각 조직을 구성하는 세포들이 필요에 의해서 만들어낸 산물 또는 이를 생산할 수 있는 기질세포(stromal cell)를 포함 할 수 있다. 상기 세포외기질의 구성 성분은 예를 들어, 구조 단백질(structural proteins)인 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 피브로넥틱(fibronectin), 또는 라미닌(laminin); 다당류(polysaccharides)인 헤파란황산(heparan sulfate), 히알루론산(hyaluronic acid) 또는 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycan); 또는 세포 부착 단백질(cell adhesive proteins)을 포함한다. 상기 세포외기질의 구성성분은 추가적으로 성장인자(growth factor), 조절인자(regulatory factor)를 포함할 수 있으며, 기질세포(stromal cell)로서 섬유아세포, 상피세포, 대식세포, 지방세포, 혈관주위세포, 또는 망상세포를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서 사용될 수 있는 세포외기질 성분은 상기 세포외기질의 구성 성분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 물질 또는 세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 세포는 상피세포(epithelial cell) 또는 내피세포(Endothelial cell)을 포함할 수 있다. 이 중 상피세포는 신체 표면이나 신체 내부의 빈 공간 또는 관의 내면을 덮고 있는 세포를 의미하며, 상피세포는 한 층 또는 여러 층으로 서로 밀착되어 상피조직을 이룰 수 있다.
본 발명에서 사용되는 상피세포는 생체관(biological tubule)을 구성하는 상피조직에서 유래한 것 일 수 있다. 상기 상피세포는 예를 들어, 유선관(mammary duct), 전립선(prostate gland), 담관(bile duct), 혈관(blood vessel), 기도(trachea), 췌관(pancreatic duct), 나팔관(fallopian tube), 세뇨관(renal tubule), 요관(ureter), 또는 요도(urethras) 에서 유래한 상피세포를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상피세포는 유선관(mammary duct), 세뇨관(renal tubule), 전립선(prostate gland), 또는 담관(bile duct) 유래 상피세포이며, 바람직하게는 유선관 유래 상피세포이다.
상기 상피세포를 지지체상에 접종하고 상피세포층(epithelial cell layer)이 형성될때까지 세포배양액에서 배양한다.
한편, 다양한 실시예에 따르면, 지지체 상에 접종하여 배양할 수 있는 세포는 특정 상피세포(예: Breast epithelial cell)에 한정하는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명에서 사용될 수 있는 세포는 도 11 내지 도 12의 데이터를 참조하면, 신장 상피세포(Renal epithelial cell) 또는 내피 세포(Endothelial cell) 등과 같이 다양한 세포를 포함할 수 있다.
단계 (b): 상기 상피세포가 배양된 지지체를 관(tubule) 형상으로 형성하여 생체관 모사조직을 제조하는 단계
상기 제조한 상피세포가 배양된 지지체를 관(tubule) 형상으로 형성하여 생체관 모사조직을 제조한다. 상기 지지체를 관 형상으로 형성하는 방법은 예를 들어 상기 유연성 있는 지지체를 구부려 관 형상으로 형성하는 방법이 있을 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 지지체의 관 형상의 형성을 용이하게 하기 위해, 상기 단계 (a)에서 지지체를 투명하고 잘 휘어지는 필름 위에 놓은 후에 세포외기질 코팅과 상피세포의 접종 및 배양을 행할 수 있다. 즉, 상기 필름은 투명한 재질로서, 신축성(flexible)을 가질 수 있다. 또한, 관 형상으로 형성한 지지체의 말단에 고정 덮개부(예: 뚜껑)을 씌워 캡핑(예: 형상을 고정)할 수 있다. 상기 관 형상으로 형성된 지지체는 분석용 칩의 생체관 모사조직 수용부에 매립하기 전까지 배양 접시에서 배양할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 지지체를 관(tubule) 형상으로 형성하기 전에 상기 배양된 상피세포상에 암세포를 위치시키는 단계를 더 포함한다. 상기 상피세포가 배양된 지지체에 암세포를 위치시키고 배양하여 암세포를 상피세포상에 안착시킨 후 지지체를 관 형상으로 형성할 수 있다.
본 발명에서 암세포는 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적 특성, 주위 조직에 침투하는 침윤적 특성, 또는 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적 특성을 갖는 세포를 의미한다.
본 발명에 사용할 수 있는 암세포는 유방암세포, 유관상피내암세포, 폐암세포, 위암세포, 간암세포, 담관암세포, 혈액암세포, 뼈암세포, 췌장암세포, 피부암세포, 두경부암세포, 피부 또는 안구 흑색종세포, 자궁육종세포, 난소암세포, 신장암세포, 직장암세포, 항문암세포, 대장암세포, 난관암세포, 자궁내막암세포, 자궁경부암세포, 소장암세포, 내분비암세포, 갑상선암세포, 부갑상선암세포, 신장암세포, 연조직종양세포, 요도암세포, 전립선암세포, 기관지암세포, 또는 골수암세포를 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 암세포는 유관상피내암 세포, 신장암 세포, 전립선암 세포, 또는 담관암 세포이며, 바람직하게는 유관상피내암 세포이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 암세포는 구배양(sphere culture)하여 암세포 응집체(sphere form)의 상태로 상기 지지체 상에 배양된 상피세포 상에 위치시킬 수 있으며 암 세포가 상피세포 상에 안착할 때까지 배양액에서 배양할 수 있다.
단계 (c): 분석용 칩의 중앙에 위치하는 생체관 모사조직 수용부, 상기 생체관 모사조직 수용부 양쪽 측면에 위치하는 채널, 및 상기 생체관 모사조직 수용부와 상기 채널 사이에 위치하는 다공성 벽(porous wall)을 포함하는 분석용 칩을 제조하는 단계
본 발명의 분석용 칩은 중앙의 생체관 모사조직 수용부, 상기 수용부 양측면에 위치하는 채널, 및 상기 수용부와 채널 사이에 위치하는 다공성 벽을 포함한다.
본 발명의 분석용 칩은 폴리머성 유기 실리콘(polymeric organosilicon) 화합물로 제조될 수 있다. 상기 폴리머성 유기 실리콘 화합물은 규소와 산소의 결합(...-Si-O-Si-O-...)을 주축으로 하는 중합체를 의미한다. 상기 폴리머성 유기 실리콘 화합물은 바람직하게는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS) 또는 올리고실록산(oligosiloxane)으로 이루어진 실리콘 수지이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 분석용 칩은 상기 다공성 벽에 의하여 생체관 모사조직 수용부 및 채널로 구획될 수 있다.
상기 생체관 모사조직 수용부는 분석용 칩의 중앙에 구획된 공간(compartment)으로서 세포외기질 성분이 채워지고, 상기 제조한 생체관 모사조직이 매립된다.
상기 채널은 상기 생체관 모사조직 수용부의 양쪽 측면에 구획된 공간으로서 세포배양용 배지 또는 분석을 위한 생리활성물질, 호르몬, 또는 약물이 주입될 수 있다. 상기 채널에는 배양용 배지 또는 분석을 위한 생리활성물질이 연속적으로 흐를 수 있도록 미세유체시스템(microfluidic system)이 적용될 수 있다. 예컨대, 상기 채널에 유입 포트(inlet port) 및 유출 포트(outlet port)가 설치되고, 상기 유입 및 유출 포트가 튜브를 통하여 펌프(pump) 또는 믹서(mixer)에 연결될 수 있다. 상기 펌프(pump) 및 믹서(mixer)를 통해 세포배양용 배지 및 분석하고자 하는 물질을 혼합하거나, 이들의 농도를 시간에 따라 변화시킬 수 있으며, 상기 채널을 흐르는 유체의 속도를 조절할 수 있다.
상기 채널에 유입될 수 있는 생리활성물질은 미량으로 생체의 기능에 큰 영향을 미치는 물질을 의미한다. 상기 생리활성물질은 예를 들어, 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 지질, 핵산, 생활성 분자, 고분자 화합물 및 저분자 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 물질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 다공성 벽은 기공(pore)을 포함하며, 벽면에 세포가 부착될 수 있다. 상기 다공성 벽의 벽면에 부착될 수 있는 세포는 예를 들어 혈관내피세포(endothelial cell), 케라틴 세포(keratinocyte), 지방세포(adipocyte) 또는 섬유아세포(fibroblast)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 다공성 벽에 세포가 부착됨으로써 기공을 통해 세포배양용 배지, 분석을 위한 생리활성물질, 세포신호전달물질, 약물은 통과가 가능하나 세포외기질 성분과 세포는 통과하지 않는다.
상기 다공성 벽은 분석용 칩과 마찬가지로 폴리머성 유기 실리콘 화합물로 제조될 수 있다. 상기 폴리머성 유기 실리콘 화합물은 바람직하게는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS) 또는 올리고실록산(oligosiloxane)으로 이루어진 실리콘 수지이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 다공성 벽은 상기 웨이퍼에 각인된 패턴을 조절하여 다공성 벽의 기공의 크기 및 개수를 조절하여 제조할 수 있다. 상기 다공성 벽은 생체관 모사조직 수용부 및 채널을 구획하여 물리적으로 분리 할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 다공성 벽에서 기공의 크기(pore size)는 바람직하게는 직경 0.4 mm 내지 1.0 mm 이다.
단계 (d): 상기 분석용 칩의 생체관 모사조직 수용부에 세포외기질 성분을 채우는 단계
상기 제조한 분석용 칩의 생체관 모사조직 수용부에 세포외기질 성분을 채운다. 상기 세포외기질 성분에 대한 내용은 상기 단계 (a)에서 설명된 내용과 동일하므로 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 중복하여 설명하지 않는다.
단계 (e): 상기 단계 (b)에서 제조한 생체관 모사조직을 상기 분석용 칩의 생체관 모사조직 수용부에 매립(embedding)하는 단계
상기 제조한 생체관 모사조직을 분석용 칩의 세포외기질 성분이 채워진 생체관 모사조직 수용부에 매립한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 상피세포가 배양된 지지체가 관 형상으로 형성된 생체관 모사조직 및 세포외기질 성분이 포함된 생체관 모사조직 수용부; (ⅱ) 상기 생체관 모사조직 수용부의 양쪽 측면에 형성된 채널; 및 (ⅲ) 상기 생체관 모사조직 수용부와 상기 채널 사이에 위치하여 이들을 구획하는 다공성 벽(porous wall)을 포함하는 생체관 모사조직이 포함된 분석용 칩을 제공한다.
이하에서 본 발명의 생체관 모사조직이 포함된 분석용 칩의 구성을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 분석용 칩은 중앙에 생체관 모사조직 수용부가 위치하고, 상기 수용부 양쪽 측면에 채널이 위치하며, 다공성 벽이 상기 생체관 모사조직 수용부와 상기 채널 사이에 위치하여 이들을 물리적으로 분리한다.
상기 생체관 모사조직 수용부에는 생체관 모사조직과 세포외기질 성분이 포함된다. 상기 생체관 모사조직은 세포외기질 성분이 채워진 수용부에 매립되는 방식으로 포함된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 생체관 모사조직의 상피세포는 유선관, 세뇨관, 전립선, 또는 담관 유래 상피세포이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 지지체는 세포외기질 성분으로 코팅되어 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 지지체는 기공을 갖는 다공성 지지체이다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 다공성 지지체는 직조 메쉬 시트이다.
본 발명의 분석용 칩에서 상기 생체관 모사조직 수용부에 포함되는 세포외기질 성분은 예를 들어, 구조 단백질(structural proteins)인 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 피브로넥틱(fibronectin), 또는 라미닌(laminin); 다당류(polysaccharides)인 헤파란황산(heparan sulfate), 히알루론산(hyaluronic acid) 또는 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycan); 또는 세포 부착 단백질(cell adhesive proteins)을 포함한다. 상기 세포외기질의 구성성분은 추가적으로 성장인자(growth factor), 조절인자(regulatory factor)를 포함할 수 있으며, 기질세포(stromal cell)로서 섬유아세포, 상피세포, 대식세포, 지방세포, 혈관주위세포, 또는 망상세포를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 생체관 모사조직의 관 내부에는 암세포가 위치한다. 상기 암세포는 예컨대 유방암세포, 유관상피내암세포, 폐암세포, 위암세포, 간암세포, 담관암세포, 혈액암세포, 뼈암세포, 췌장암세포, 피부암세포, 두경부암세포, 피부 또는 안구 흑색종세포, 자궁육종세포, 난소암세포, 신장암세포, 직장암세포, 항문암세포, 대장암세포, 난관암세포, 자궁내막암세포, 자궁경부암세포, 소장암세포, 내분비암세포, 갑상선암세포, 부갑상선암세포, 신장암세포, 연조직종양세포, 요도암세포, 전립선암세포, 기관지암세포, 또는 골수암세포를 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 암세포는 유관상피내암 세포, 신장암 세포, 전립선암 세포, 또는 담관암 세포이이다.
본 발명의 분석용 칩에서 상기 생체관 모사조직 수용부의 양쪽 측면에는 다공성 벽에 의해 구획된 세포배양용 배지가 흐를 수 있는 채널이 구비된다.
상기 채널에는 세포배양용 배지 이외에 분석을 위한 생리활성물질, 호르몬, 또는 약물이 흐를 수 있다. 상기 분석을 위한 생리활성물질, 호르몬 또는 약물은 배지에 포함된 형태로 채널을 흐를 수 있다. 상기 채널에는 상기 배지 또는 분석을 위한 물질이 연속적으로 흐를 수 있도록 유체시스템(fluidic system)이 적용될 수 있다. 예컨대, 상기 채널에 유입 포트(inlet port) 및 유출 포트(outlet port)가 설치되고, 상기 유입 및 유출 포트가 튜브를 통하여 펌프(pump) 또는 믹서(mixer)에 연결될 수 있다. 상기 펌프(pump)와 믹서(mixer)를 통해 세포배양용 배지 및 분석하고자 하는 물질을 혼합하거나, 이들의 농도를 시간에 따라 변화시킬 수 있으며, 상기 채널을 흐르는 유체의 속도를 조절할 수 있다.
본 발명의 분석용 칩에서 상기 다공성 벽은 상기 생체관 모사조직 수용부와 상기 채널 사이에 위치하여 이들을 분리하여 구획한다. 상기 다공성 벽은 기공(pore)을 포함하며, 벽면에 세포가 부착될 수 있다. 상기 다공성 벽의 벽면에 부착될 수 있는 세포는 예를 들어 혈관내피세포(endothelial cell), 케라틴 세포(keratinocyte), 지방세포(adipocyte) 또는 섬유아세포(fibroblast)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 다공성 벽에 세포가 부착됨으로써 기공을 통해 세포배양용 배지 또는 분석을 위한 생리활성물질, 세포신호전달물질, 약물은 통과가 가능하나 세포외기질 성분과 세포는 통과하지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 다공성 벽의 기공의 크기는 직경 0.4 mm 내지 1.0 mm 이다.
본 발명의 분석용 칩 또는 상기 분석용 칩 내부의 다공성 벽은 폴리머성 유기 실리콘(silicon) 화합물로 제조될 수 있다. 상기 폴리머성 유기 실리콘 화합물은 규소와 산소의 결합(...-Si-O-Si-O-...)을 주축으로 하는 중합체를 의미한다. 상기 폴리머성 유기 실리콘 화합물은 바람직하게는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS) 또는 올리고실록산(oligosiloxane)으로 이루어진 실리콘 수지이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다양한 실시예에 따르면, 상기 분석용 칩은, 하부 영역 중 적어도 일부 영역에 상기 다공성 벽이 삽입되는 쐐기 구조의 오목 홈이 형성될 수 있다.
본 발명의 다양한 실시예에 따르면, 상기 분석용 칩은, 외부로부터 상기 생체관 모사조직의 압력을 조절하기 위한 압력조절 포트를 포함하도록 형성될 수 있다.
본 발명의 다양한 실시예에 따른 방법은 생체관(biological tubule) 모사 조직의 제조 방법으로서, 지지체(scaffold)를 세포외기질 성분으로 코팅하는 단계; 상기 지지체 상에 세포(cell)를 접종하여 배양하는 단계; 상기 배양된 세포 상에 암세포를 안착시키는 단계; 및 상기 세포 및 암세포가 포함된 지지체를 관(tubule) 형상으로 형성하여 생체관 모사조직을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시예에 따른 생체관 모사 조직의 제조 방법에서, 상기 지지체를 코팅하는 단계 이전에, 투명한 재질로서 신축성을 가지는 필름 상에 상기 지지체를 위치시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시예에 따른 생체관 모사 조직의 제조 방법에서, 상기 관 형상으로 형성된 지지체의 말단에 상기 관 형상을 고정하도록 고정덮개부를 캡핑하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명의 분석용 칩은 종래에는 관찰하기 어려웠던 실시간 세포 변화를 모니터링할 수 있다.
(ⅱ) 본 발명의 분석용 칩은 미세환경 변화에 따른 생체관에서 발생되는 세포의 변화를 현미경을 통하여 칩상에서 실시간 영상(live image)으로 관찰할 수 있으며, 3차원 재구성 영상(3D Z-stack image)을 통해 생물물리 및 생화학적 변화를 분석할 수 있다.
(ⅲ) 본 발명의 분석용 칩은 세포외기질 및 기질 세포 등 다양한 조직이 존재하는 생체관을 모사한 상황에서 분석 물질이 암세포 및 주변세포에 미치는 영향을 분석할 수 있는 플랫폼으로 이용가능하다.
본 발명은 생체관 모사조직이 포함된 분석용 칩 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 생체관 모사조직이 포함된 분석용 칩은 상피세포에 의해 형성된 생체관 및 생체관을 둘러싸고 있는 세포외기질을 분석용 칩 상에서 생체환경과 최대한 근접하게 구현하였다. 따라서, 본 발명의 생체관 모사조직이 포함된 분석용 칩은 암세포의 발암 과정 또는 암전이 과정에 대한 연구, 신규 항암제의 스크리닝 또는 테스트를 실제 인 비보(in vivo) 조건과 매우 유사한 조건하에서 수행할 수 있는 플랫폼을 제공할 수 있다.
도 1는 분석용 칩을 주조하기 위해 3D 프린터로 제작되는 주형의 평면도를 보여준다.
도 2는 생체관 모사조직이 포함된 분석용 칩의 주형과 제조된 칩을 보여준다. 패널 ①은 주형의 모식도와 제작된 주형을 보여준다. 패널 ②는 생체관 모사조직을 매립하기 위한 분석용 칩의 모식도와 실제 PDMS로 주조하여 제작된 칩을 보여준다.
도 3은 생체관 모사조직이 포함된 분석용 칩의 공간을 구획하는 다공성 벽의 평면도를 보여준다.
도 4는 다공성 벽을 제조하기 위해 웨이퍼에 구현한 기공의 패턴을 보여주며 패턴에 의해 주조된 다공성 벽을 보여준다.
도 5는 다공성 벽이 분석용 칩에 장착된 모습의 모식도와 실제 장착된 모습을 보여준다.
도 6은 유선관 모사조직의 제조과정을 보여준다.
도 7은 세포외기질 성분이 채워져 있는 생체관 모사조직 수용부에 유선관 모사조직이 매립된 모식도와 실제 매립된 결과를 보여준다.
도 8은 유선관모사조직이 포함된 분석용 칩에 적용된 유체시스템의 모식도와 실제 적용된 결과를 보여준다.
도 9은 유선관 모사조직이 분석용 칩에 매립된 모습과 유선상피세포와 DCIS 세포가 지지체위에 잘 안착된 보습을 보여준다.
도 10는 생체관 모사조직이 포함된 분석용 칩에서 배양된 유선관 모사조직의 세포생존률 그래프를 보여준다.
도 11 내지 도 12는 다른 장기들을 이용한 생체관 모사조직의 예시도이다.
도 13은 본 발명의 다양한 실시예에 따른 분석용 칩의 주형과 제조된 칩, 그리고 다공성 벽을 나타내는 예시도이다.
도 14는 본 발명의 다양한 실시예에 따라 압력조절 포트가 형성된 분석용 칩을 나타내는 예시도이다.
도 15는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 분석용 칩의 압력조절 포트를 이용하여 생체관 모사조직의 압력을 조절하는 동작을 나타내는 예시도이다.
실시예
실시예 1: 분석용 칩(assay chip) 제조를 위한 주형(mold)의 제작
3D 프린터를 이용하여 생체관 모사조직이 포함된 분석용 칩의 제작을 위한 주형(mold)을 제작하였다. 주형 외벽은 가로 x 세로는 15 mm x 15 mm - 50 mm x 50 mm의 범위 내에서 제작할 수 있고, 주형 내벽은 가로 x 세로는 10 mm x 10 mm - 30 mm x 30 mm의 범위 내에서 제작할 수 있다. 도 1에는 주형의 세부적인 크기와 모양을 보여주는 평면도를 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이 주형의 외벽은 가로 22.4mm이며, 세로 26mm이고, 주형의 내벽은 가로 10.4mm이며 세로 16mm이고, 주형의 두께는 30mm으로 하여 제작하였다.
칩 내부 공간의 구획화를 위한 2개의 다공성 벽(porous wall)을 삽입할 수 있는 오목면(홈)을 형성할 수 있도록 주형의 내부 면에 4개의 볼록면을 추가하였다. 이 볼록면들은 가로 x 세로가 각각 0.1 mm x 2.0 mm - 1.5 mm x 5.0 mm의 범위 내에서 제작할 수 있으며 내부면의 모서리로부터 중앙으로 2 - 5 mm 범위 내에 위치하도록 제작할 수 있다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 볼록면은 가로 0.7 mm이며 세로 2.5 mm으로서 내부 면 모서리로부터 중앙으로 양쪽 측면으로 3.5 mm 떨어진 곳에 위치하도록 제작하였다. 다양한 실시예에 따르면, 볼록면은 가로 0.7 mm 내지 2.0mm 범위로 제작될 수 있다.
상기 도 1에서 도시된 규격을 바탕으로 3D 프린터를 사용하여 주형을 제작하였다(도 2의 패널 ① 참조). 3D 프린터를 사용하여 주형을 제작할 때 주형의 높이는 10 - 50 mm의 범위 내에서 제작할 수 있다.
실시예 2: 분석용 칩의 제작
상기 실시예 1에서 제작한 주형에 PDMS 용액을 주조하여 분석용 칩을 제작하였다(도 2의 패널 ② 참조). 이어서, 상기 제작한 상기 분석용 칩의 내부에 삽입되어 생체관 모사조직 수용부를 구획하고, 상기 수용부의 양쪽 측면을 채널(channel)로 구획하기 위한 다공성 벽을 PDMS를 사용하여 제작하였다(도 3 참조). 다공성 벽은 가로 x 세로를 10 x 5 - 25 x 15 mm의 범위 내에서 제작할 수 있다. 벽에 통로를 형성하기 위해 기공(pore)를 형성하였다. 상기 기공은 0.4 - 1.0 mm 범위의 면으로 이루어진 육각형 구조의 기공이었으며, 10 x 3 - 16 x 5개의 배열로 정렬할 수 있다. 도 3은 PDMS 다공성 벽의 규격 및 세부구조를 보여주는 평면도이다.
다공성 벽은 평면도를 기반으로 제작된 웨이퍼(wafer)에 PDMS를 주조하여 제작하였다. 도 4는 PDMS 다공성 벽의 제조를 위해 웨이퍼에 구현한 패턴과 실제 PDMS를 주조하여 제조한 다공성 벽을 보여준다. 상기 제작한 다공성 벽을 상기 제작한 분석용 칩 내부의 오목 홈 또는 오목면에 끼워 넣어 생체관 모사조직 수용부 및 양쪽 측면의 채널로 구획된 분석용 칩을 완성하였다(도 5 참조).
한편, 다양한 실시예에 따르면, 분석용 칩은 하부 영역 중 적어도 일부 영역에 상기 다공성 벽이 삽입되는 쐐기 구조의 오목 홈이 형성될 수 있다. 이와 같은 분석용 칩을 제조하기 위해, 도 13과 같이 주형에는 소정 높이(예: 0.5mm)로 돌출된 돌출부(1300)가 포함될 수 있다.
몇몇 실시예에 따르면, 분석용 칩은 외부로부터 상기 생체관 모사조직의 압력을 조절하기 위한 압력조절 포트를 포함하도록 형성될 수 있다. 도 14 및 도 15를 예로서 참조하면, 분석용 칩은 생체관 모사조직 수용부의 적어도 일부 영역(예: 끝 단)에 압력조절 포트가 형성될 수 있고, 외부의 압력 조절 튜브(1500)를 통해 생체관 모사조직 내부 압력이 조절될 수 있다.
상기와 같은 실시예에 의해, 생체관 모사조직의 압력 조절이 이루어지게 되면, 관내 압력에 따라 관내 상피 세포 혹은 관내 위치하는 암세포의 생장이 억제되거나 촉진되는 양상을 관찰할 수 있다. 암세포의 생장에 영향이 있음에 따라 주변부로 분비되는 세포 간 신호전달 물질이나 성장 인자 등의 발현 양상이 변화될 수 있다. 관내 압력을 상기 압력조절 포트를 통해 변화시킴으로써, 관내 위치하는 암세포가 상피세포 층을 뚫고 세포 외기질이 존재하는 층으로 침윤하게 되는 양상을 관찰할 수 있다는 효과가 있다.
실시예 3: 유선관(mammary duct) 모사조직의 제작
유선관 모사조직은 유선상피세포, 직조 메쉬 시트, OHP 필름 및 세포외기질 성분을 이용하여 제작하였다(도 6 참조). 유선상피세포는 BPE(bovine pituitary extract), hEGF(human epidermal growth factor), 인슐린, 하이드로코르티손(hydrocortisone), 겐타마이신(gentamycin)이 함유된 MEBM(mammary epithelial basal medium) 배지에서 배양하였다. 유관상피내암세포는 상기 유선상피세포를 배양한 배지와 동일한 MEBM 배지, 또는 DMEM/F12(Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12) 배양액에 EGF, 인슐린, 겐타마이신이 포함된 배양액을 사용하여 배양하였다. 유방암세포의 경우 DMEM에 10％ FBS(fetal bovine serum)와 1％의 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)이 포함된 배양액을 기본 배양액으로 사용하였다. 세포외 기질에 존재하는 섬유아세포나 다른 기질 세포는 DMEM에 10％ FBS(fetal bovine serum)와 1％의 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 배양액을 기본 배양액으로 사용하였으며, 각 세포에 따라 세포의 특성에 맞는 배양액을 사용하였다. OHP 필름에 15 mm x 10 mm 크기의 직조 메쉬 시트를 양면테이프로 부착하고 4 - 8 ㎎/㎖ 농도의 메트리겔(Matrigel) 또는 엔젤브레스-홀름-스웜 쥐 육종(Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma) 유래 세포외기질 겔(ECM gel) 용액을 도포하였다. ECM 겔이 도포된 직조 메쉬 시트는 24 - 72 시간 동안 인큐베이션하여 겔화(gelation)하고 100 - 200 ㎕의 배양액에 혼탁된 0.5 - 4.0 x 107 세포/㎖의 유선상피세포를 도포하여 접종하였다. 상기 접종된 유선상피세포는 상기와 같은 조건에서 48시간 동안 배양하여 밀착연접(tight junction)에 의한 상피세포층(epithelial cell layer)을 형성하도록 유도하였다. 추가적으로, 유관상피내암(DCIS) 세포 응집체를 유선상피세포 상에 올려 배양하였다.
상기 DCIS 세포가 함께 배양된 직조 메쉬 시트를 관 형상으로 형성하고 말단 부분에 폴리스티렌(poly styrene) 또는 고무 재질의 뚜껑을 씌워 유선관 모사조직을 완성하였다. 상기 완성된 유선관 모사조직은 분석용 칩의 세포외기질 성분이 채워져 있는 생체관 모사조직 수용부에 매립하기 전까지 MEBM 배지에서 배양하였다.
실시예 4: 유선관 모사조직의 분석용 칩 내부로의 매립
생체관 모사조직 수용부에 세포외기질인 I형 콜라겐을 채우고, 상기 제조한 유선관 모사조직을 매립하여, 실제 유선관 조직과 최대한 유사한 환경을 가진 분석용 칩을 제작하였다(도 7 참조). 먼저, I형 콜라겐 용액을 다음과 같이 제조하였다. 8.0 - 10.0 ㎎/㎖ I형 콜라겐을 1M HEPES 버퍼, 10x DMEM, 0.44M 탄산수소나트륨(NaHCO3) 버퍼 및 멸균된 3차 증류수와 혼합하고 pH를 중성(pH 7)으로 적정한 후 멸균된 3차 증류수를 첨가하여 2㎎/㎖ 농도의 I형 콜라겐 용액을 제조하였다. 상기 제조된 I형 콜라겐 용액으로 생체관 모사조직 수용부를 채우고 상기 제작한 유선관 모사조직을 매립(embedding)한 후에 37℃에서 인큐베이션하여 I형 콜라겐을 겔화하였다.
실시예 5: 분석용 칩에 유체시스템의 적용
분석용 칩의 양쪽 측면에 구획된 채널에 유입 포트(inlet port) 및 유출 포트(outlet port)를 설치하였다(도 8 참조). 각 포트는 스테인레스 재질로 제작하였으며 미세관을 매개체로 튜브에 연결하였다. 포트에 연결된 튜브는 다시 시린지 펌프(syringe pump) 또는 연동펌프(peristaltic pump)와 연결되어 배양액이 채널에 일정한 체적유량으로 공급될 수 있도록 하였다. 유입 포트를 통하여 주입된 배양액은 15 - 120 ㎕/시간의 체적유량으로 채널을 흘러 생체관 모사조직 수용부의 세포외기질과 유선관 모사조직의 세포에 영양분, 세포신호전달물질 또는 신약후보물질이 전달될 수 있도록 하였다. 채널 및 생체관 모사조직 수용부를 통과한 배양액은 미세채널의 유출 포트를 통하여 배출되었다.
실시예 6: 분석용 칩 상에서의 유선관 모사조직의 배양
배양된 분석용 칩의 유선관 모사조직을 공초점 현미경(confocal microscope)으로 관찰하여 유선상피세포가 유선관 모사조직을 잘 형성하고 있으며 DCIS 세포 응집체가 유선관 모사조직 상에 잘 안착하였는지 확인하였다. 실험결과 유선상피세포가 직조 메쉬 시트 상에서 성공적으로 상피세포층을 형성한 것을 확인하였으며 DCIS 세포 응집체 또한, 유선상피세포 상에 성공적으로 안착된 것을 확인하였다(도 9 참조). 상기와 같이 성공적으로 안착한 유선상피세포와 DCIS 세포의 생존력을 측정하기 위하여 미세채널을 통하여 세포배양액을 공급하며 5일간 배양하고 세포생존력(cell viability)을 측정하였다. 측정결과, 세포 배양을 수행한 5일 동안 세포의 생존력이 70％ 이상으로 유지되었다(도 10 참조).
본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.

Claims (22)

  1. 생체관(biological tubule)모사조직이 포함된 분석용 칩(assay chip)의 제조 방법에 있어서,
    (a) 지지체(scaffold) 상에 세포(cell)를 접종하여 세포층이 형성될 때까지 세포 배양액에서 배양하는 단계;
    (b) 상기 세포가 배양된 지지체를 관(tubule) 형상으로 형성하여 생체관 모사조직을 제조하는 단계;
    (c) 분석용 칩의 중앙에 위치하는 생체관 모사조직 수용부, 상기 생체관 모사조직 수용부 양쪽 측면에 위치하는 채널, 및 상기 생체관 모사조직 수용부와 상기 채널 사이에 위치하는 다공성 벽(porous wall)을 포함하는 분석용 칩을 제조하는 단계;
    (d) 상기 분석용 칩의 생체관 모사조직 수용부에 세포외기질 성분을 채우는 단계; 및
    (e) 상기 단계 (b)에서 제조한 생체관 모사조직을 상기 분석용 칩의 생체관 모사조직 수용부에 매립(embedding)하는 단계를 포함하고,
    상기 단계 (b)는, 지지체를 관(tubule) 형상으로 형성하기 전에 상기 배양된 세포 상에 암세포를 위치시키는 단계를 포함하고,
    상기 단계 (c)에서 채널은, 세포 배양용 배지, 분석을 위한 생리활성 물질, 호르몬 또는 약물 중에서 적어도 하나 이상 주입될 수 있는,
    생체관 모사 조직이 포함된 분석용 칩의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 상기 지지체상에 세포를 접종하기 전에 상기 지지체를 세포외기질(extracellular matrix) 성분으로 코팅하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서의 세포는 유선관, 세뇨관, 전립선, 또는 담관 유래 상피세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 지지체는 기공을 갖는 다공성 지지체인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 다공성 지지체는 직조 메쉬(woven mesh) 시트인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 암세포는 유관상피내암 세포, 유방암 세포, 신장암 세포, 전립선암 세포, 또는 담관암 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 다공성 벽에서 기공의 크기(pore size)는 직경 0.4 mm 내지 1.0 mm인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구항 제1항 내지 제5항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항의 제조 방법에 의해 제조된, 생체관 모사조직이 포함된 분석용 칩.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제 1항에 있어서,
    상기 분석용 칩은,
    하부 영역 중 적어도 일부 영역에 상기 다공성 벽이 삽입되는 쐐기 구조의 오목 홈이 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1항에 있어서,
    상기 분석용 칩은,
    외부로부터 상기 생체관 모사조직의 압력을 조절하기 위한 압력조절 포트를 포함하도록 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 생체관(biological tubule)모사조직의 제조 방법으로서,
    지지체(scaffold)를 세포외기질 성분으로 코팅하는 단계;
    상기 지지체 상에 세포(cell)를 접종하여 세포층이 형성될 때까지 세포 배양액에서 배양하는 단계;
    상기 배양된 세포 상에 암세포를 안착시키는 단계; 및
    상기 세포 및 암세포가 포함된 지지체를 관(tubule) 형상으로 형성하여 생체관 모사조직을 제조하는 단계;
    를 포함하는, 생체관 모사 조직의 제조 방법.
  21. 제 18항에 있어서,
    상기 지지체를 코팅하는 단계 이전에,
    투명한 재질로서 신축성을 가지는 필름 상에 상기 지지체를 위치시키는 단계;
    를 더 포함하는, 생체관 모사 조직의 제조 방법.
  22. 제 19항에 있어서,
    상기 관 형상으로 형성된 지지체의 말단에 상기 관 형상을 고정하도록 고정덮개부를 캡핑하는 단계;
    를 더 포함하는, 생체관 모사 조직의 제조 방법.


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WO2023063660A1 (ko) 2021-10-15 2023-04-20 주식회사 에드믹바이오 채널 내 유체의 유동 제어가 용이한 생체 조직 모사용 마이크로유체 디바이스

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