KR20160077209A - 배양 용기, 림프구의 배양 방법, 배양 용기의 제조 방법 및 고체상화 장치 - Google Patents

배양 용기, 림프구의 배양 방법, 배양 용기의 제조 방법 및 고체상화 장치 Download PDF

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Abstract

림프구를 배양하기 위한 배양 용기이며, 가스 투과성 필름으로 구성되며, 마주하는 용기 내면의 한쪽 면에만 항체가 고체상화되어 고체상화 면과 비 고체상화 면이 갖추어지고, 고체상화 면에서 항 CD3항체가 10~300ng/cm2의 농도로 고체상화되어 있는 것을 특징으로 하는 배양 용기. 이 배양 용기에 림프구 및 배양액을 봉입하고 배양 용기에서의 고체상화 면이 바닥면이 되도록 배양 용기를 배치하여 림프구를 활성화시키고 이어서 배양 용기를 반전하여 배양 용기에서의 비 고체상화 면이 바닥면이 되도록 배양 용기를 배치하여 림프구를 증폭시킨다. 또한 이러한 단백질이 고체상화된 배양 용기는 배양 용기에 단백질이 용해되어 있는 물방울을 주입하고 물방울을 배양 용기의 내면 상의 일부 또는 전부에 이동시켜서 제조할 수 있다.

Description

배양 용기, 림프구의 배양 방법, 배양 용기의 제조 방법 및 고체상화 장치{CULTURE CONTAINER, METHOD FOR CULTURING LYMPHOCYTES, CULTURE-CONTAINER PRODUCTION METHOD, AND SOLID-PHASING APPARATUS}
본 발명은 세포 배양 기술에 관하여, 특히 림프구를 배양하기 위한 배양 용기 및 림프구의 배양 방법, 단백질을 고체상화(固相化)한 배양 용기의 제조 방법 및 고체상화 장치에 관한 것이다.
최근 의약품 생산이나 유전자 치료, 재생 의료, 면역 요법 등의 분야에서 세포나 조직, 미생물 등을 인공적인 환경에서 효율적으로 대량으로 배양하는 것이 요구되고 있다.
이와 같은 상황에서 가스 투과성 필름으로 구성된 배양백에 세포와 배양액을 봉입하여, 세포를 폐쇄계에서 대량 배양 하는 것이 행해지고 있다.
그러나 림프구를 증식시키기 위해서는 처음에 림프구를 활성화할 필요가 있다. 그래서, 항 CD3항체가 고체상화된 기재(基材)상에서 림프구를 활성화하고, 활성화된 림프구를 배양백에 봉입하여 증식이 이루어지고 있었다.
이때 일반적으로 도 8과 같이, 림프구 활성화를 위해서 항 CD3항체가 바닥면에 고체상화된 플라스크가 사용되고, 림프구가 활성화된 후에 배양백에 옮겨서, 림프구 배양이 진행되고 있었다. 그 이유는 림프구는 증식을 위해서 항 CD3항체에 의한 자극을 필요로 하는 한편, 항 CD3항체에 의한 자극을 계속 받으면 증식하기 어려워진다는 성질을 가지고 있기 때문이다. 이 때문에, 림프구가 활성화된 후에는 항 CD3항체가 고체상화되지 않은 용기에서 배양할 필요가 있었다.
림프구를 활성화시키기 위한 배양 용기로서는, 예를 들면 특허 문헌 1에 기재된 폐쇄계 세포 배양 용기 등을 들 수 있다. 이 폐쇄계 세포 배양 용기는 용기 내의 전체면에 항 CD3항체가 고체상화되어 있으며(단락 0048,0057), 림프구를 효율적으로 활성화시킬 수도 있다.
또한, 림프구 활성화는, 상기와 같이, 일반적으로 항 CD3항체를 사용하여 이루어진다. 즉, 항 CD3항체가 고체상화된 용기 내에서 림프구의 활성화가 이뤄지고, 그 후 항 CD3항체가 고체상화되지 않은 배양백에 활성화된 림프구를 봉입하여, 림프구의 증식이 이루어지고 있었다.
이를 위해, 림프구 활성화에 앞서서, 림프구의 활성화를 위해 사용하는 용기 내에 항 CD3항체를 고체상화(코팅) 할 필요가 있었다.
기존의 고체상화 방법으로서는 일반적으로 플라스크 내의 저면을 항 CD3항체를 포함한 용액에 담그어 정치한 뒤 그 용액을 제거함으로써, 항 CD3항체의 고체상화가 이루어지고 있었다.
구체적으로는 예를 들면 특허 문헌 2에는 항 CD3항체를 플라스크 내의 저면에 고르게 담그고, 하룻밤 냉장고에서 보관 후, 항 CD3항체를 빼내어 항체 고체상화 플라스크를 조제하는 것이 기재되어 있다(단락 0035~0036, 도 1).
또한 특허 문헌 1에는 항 CD3항체를 용해한 용해액을 용기의 수용부에 봉입하여, 소정 시간 정치함으로써 항 CD3항체를 용기의 필름 표면에 고체상화하는 것이 기재되어 있다(단락 0015, 도 1).
[특허 문헌 1]
일본특허 공개공보 2007-175028호 공보
[특허 문헌 2]
일본특허 제4399710호 공보
그러나 특허 문헌 1에 기재된 폐쇄계 세포 배양 용기만을 사용하여 림프구의 배양을 하는 경우, 림프구가 활성화한 후에도 항 CD3항체에 의한 자극을 계속 받기 때문에, 림프구가 과잉 자극을 받아 증식이 억제된다. 그래서 림프구를 대량으로 효율적으로 배양하려면 이 폐쇄계 세포 배양 용기를 활성화 전용 용기로서 사용하여 세포의 증식은 별도의 배양 용기에서 하는 것이 바람직하다.
따라서 이 기존 기술에서는 림프구를 대량으로 효율적으로 배양하는 경우에는 활성화된 세포를 옮기는 번잡성이나 오염의 리스크가 생긴다는 문제가 있었다.
그래서 본 발명자들은 예의 연구하여, 림프구를 배양하기 위한 배양 용기이며, 가스 투과성 필름으로 구성되어, 마주하는 용기 내면의 한쪽 면에만 항 CD3항체를 고체상화하고 고체상화 면과 비 고체상화 면을 갖춘 것을 개발하였다. 그리고 고체상화 면이 바닥면이 되도록 배양 용기를 배치하고, 림프구의 활성화를 한 후 비 고체상화 면이 바닥면이 되도록 배양 용기를 배치하고, 림프구의 증식을 실시함으로써 단일의 용기 내에서, 림프구 활성화와 증식을 효율적으로 실시 가능하게 하는 데 성공하였다.
즉, 본 발명은 단일의 배양 용기에 의해서, 림프구 활성화와 증식을 효율적으로 실시하는 것이 가능한 배양 용기 및 림프구 배양 방법의 제공을 목적으로 한다.
또한 특허 문헌 1, 2에 기재된 기존 고체상화 방법으로는 항체를 충분히 고체상화하는 데 긴 정지 시간이 걸린다는 문제가 있었다.
또한 종래의 방법에서는 대부분의 항체가 용기 내에 흡착되지 않고 용액 안에 잔존하기 때문에 고체상화 양에 비해서 다량의 항체를 사용해야 한다는 문제가 있었다. 예를 들면, 후술 하는 바와 같이, 종래의 방법으로 항체를 봉입한 용기를 1시간 정지한 경우 용기 내에 흡착하는 항체는 10%정도이고, 나머지 약 90%가 용기에 고체상화되지 않고 폐기되어 버리는 문제가 있었다.
여기서 항체 등의 단백질은 열에 약하고, 고온으로 흡착시키면 그 기능이 상실되기 때문에 용기에 고체상화하기 어려운 재료이다. 한편 소량의 단백질을 사용하여 단시간에 필요량의 고체상화를 실현하는 것이 바람직하다. 또한 항체는 일반적으로 고가이므로 쓸데없이 폐기되는 양을 줄이는 것이 바람직하다.
그래서 본 발명자들은 예의 연구하여 용기 내에 단백질 용액의 물방울을 기체와 함께 봉입하고, 이 물방울을 용기 내면상에서 이동시킴으로써 물방울의 기액(기체와 액체) 계면에 집중하는 단백질 분자가 효율적으로 용기에 흡착하는 것을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 단백질을 용기 안쪽에 고체상화하는 데 있어, 단백질 용액의 물방울을 기체와 함께 용기 내에 봉입하고 그 물방울을 용기 내면상에서 이동시킴으로써 단백질을 효율적으로 용기에 고체상화하는 배양 용기의 제조 방법 및 이를 실시하기위한 고체상화 장치의 제공을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해서 본 발명의 배양 용기는 림프구를 배양하기 위한 배양 용기 이며 가스 투과성 필름으로 구성되어, 마주하는 용기 내면의 한쪽 면에만 항체가 고체상화되어 고체상화 면과 비 고체상화 면이 갖추어지고 상기 고체상화 면에서 항 CD3항체가 10~300ng/cm2의 농도로 고체상화된 구성으로 되어 있다.
또한 본 발명의 림프구의 배양 방법은 상기 배양 용기를 사용한 림프구의 배양 방법이며, 상기 배양 용기에 림프구 및 배양액을 봉입하고, 상기 배양 용기에서의 상기 고체상화 면이 바닥면이 되게 상기 배양 용기를 배치하고, 림프구를 활성화시키는 활성화 공정과, 상기 배양 용기를 반전하여, 상기 배양 용기에서의 상기 비 고체상화 면이 바닥면이 되도록 상기 배양 용기를 배치하고, 림프구를 증폭시키는 증식 공정을 가진 방법으로 되어있다.
또한 본 발명의 배양 용기의 제조 방법은 단백질이 고체상화된 배양 용기의 제조 방법이며, 상기 배양 용기에 상기 단백질이 용해하고 있는 물방울을 주입하고 상기 물방울을 상기 배양 용기의 내면 상의 일부 또는 전부에 이동시키는 방법으로 되어있다.
또한 본 발명의 고체상화 장치는 단백질을 배양 용기의 내면에 고체상화하는 고체상화 장치이며, 단백질이 용해하고 있는 물방울 및 배양 용기를 재치하는 적재대와, 적재대를 움직여서 배양 용기 내의 물방울을 배양 용기의 내면상에서 이동시키는 구동 수단을 갖춘 구성으로 되어 있다.
본 발명에 따르면 단일의 배양 용기만으로 전용 배양 장치 등을 사용하지 않고 림프구의 활성화와 증식을 효율적으로 실시할 수 있다. 따라서 항체에 의한 림프구에 대한 과잉 자극을 방지하기 위한 이동의 번잡성 및 오염의 리스크를 배제할 수 있다. 또한 본 발명에 따르면 단백질을 효율적으로 용기에 고체상화하는 배양 용기의 제조 방법 및 이를 실시하기 위한 고체상화 장치를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시형태에 관한 배양 용기를 나타내는 도이다.
도 2는 본 발명의 실시형태에 관한 배양 용기를, 용기 내면을 맞붙인 상태로 보관한 경우의 항체의 이동 결과의 그래프를 나타내는 도이다.
도 3A는 본 발명의 실시형태에 관한 배양 용기의 보관 형태를 나타내는 도이다.
도 3B는 본 발명의 실시형태에 관한 배양 용기의 보관 형태를 나타내는 도이다.
도 4는 본 발명의 제1 실시형태에 관한 림프구 배양 방법을 나타내는 도이다.
도 5는 본 발명의 제2 실시형태에 관한 림프구 배양 방법을 나타내는 도이다.
도 6은 본 발명의 실시형태에 관한 배양 용기 및 림프구의 배양방법의 실시예 및 비교예를 나타내는 모식도이다.
도 7은 본 발명의 실시형태에 관한 배양 용기 및 림프구의 배양방법의 실시예 및 비교예의 실험 결과의 그래프를 나타내는 도이다.
도 8은 기존의 림프구의 배양 방법을 나타내는 도이다.
도 9는 본 발명의 실시형태에 관한 배양 용기의 제조 방법에서의 고체상화의 원리를 설명하기 위한 도이다.
도 10은 본 발명의 실시형태에 관한 배양 용기의 제조 방법으로 얻을 수 있는 항체 고체상화 배양백을 나타내는 도이다.
도 11은 본 발명의 실시형태에 관한 고체상화 장치를 나타내는 도(평면도)이다.
도 12는 본 발명의 실시형태에 관한 고체상화 장치를 나타내는 도(정면도)이다.
도 13은 본 발명의 실시형태에 관한 고체상화 장치에 의한 고체상화의 모습을 나타내는 도이다.
도 14는 본 발명의 실시형태에 관한 고체상화 장치에서의 유지 수단을 나타내는 도(정면도 및 측면도)이다.
도 15는 본 발명의 실시형태에 관한 고체상화 장치에서의 유지 수단의 사용 형태를 나타내는 도이다.
도 16은 본 발명의 실시형태에 관한 배양 용기(항체 고체상화 배양 백)의 제조 방법의 실시예 및 비교예를 나타내는 모식도이다.
도 17은 본 발명의 실시형태에 관한 배양 용기(항체 고체상화 배양 백)의 제조 방법의 실시예 및 비교예의 실험 결과의 그래프를 나타내는 도이다.
도 18은 본 발명의 실시형태에 관한 배양 용기(항체 고체상화 프라스크)의 제조 방법의 실시예 및 비교예를 나타내는 모식도이다.
도 19는 본 발명의 실시형태에 관한 배양 용기(항체 고체상화 프라스크)의 제조 방법의 실시예 및 비교예의 실험 결과 그래프를 나타내는 도이다.
도 20은 본 발명의 실시형태에 관한 배양 용기(피브로 넥틴 고체상화 배양 백)의 제조 방법의 실시예 및 비교예를 나타내는 모식도이다.
도 21은 본 발명의 실시형태에 관한 배양 용기(피브로 넥틴 고체상화 배양 백)의 제조 방법의 실시예 및 비교예의 실험 결과 그래프를 나타내는 도이다.
이하, 본 발명의 배양 용기 및 림프구 배양 방법의 실시형태에 대해서 자세히 설명한다. 먼저 본 발명의 배양 용기의 제1 실시형태에 대해서, 도 1을 참조하여 설명한다. 이 도에는 배양 용기를 적재대(도시하지 않았음)에 재치(載置)하고 위쪽에서 본 개략도 및 측면에서 본 개략도가 도시되어 있다.
[배양 용기]
도 1과 같이 본 발명의 실시형태에 관한 배양 용기 (10)는 아래위로 마주하는 용기 벽을 가지고 있다. 그리고 용기 내면의 한쪽이 항체 (20)를 고체상화한 고체상화 면 (11)(도 1의 용기 내의 바닥)이다. 또한 용기 내면의 다른 한쪽이 항체 (20)를 고체상화되지 않은 고체상화 면 (12)(도 1의 용기 내의 윗면)으로 되어있다. 또한 배양 용기 (10)에는 튜브 (13)가 갖추어지고, 이에 의해서 배양 용기 (10)내에의 림프구와 배양액의 봉입 및 배양한 림프구와 배양액의 회수를 한다. 이 도의 예에서는 튜브 (13)는 배양 용기 (10)에 1개 갖추어져 있으나 2개 이상 갖추고 있어도 된다.
배양 용기 (10)는 세포 배양에 필요한 가스 투과성을 가진 필름을 사용하여 주머니 모양(백형)으로 형성되어 있다. 이러한 배양 용기 (10)의 재료로서, 폴리 에틸렌이나 폴리 프로필렌 등의 폴리올레핀계 수지를 알맞게 사용할 수 있다.
고체상화 면 (11)에 고체상화하는 항체 (20)로서는 항 CD3항체를 사용하는 것이 바람직하다. 림프구는 항 CD3항체에 의해서 활성화되고 증식시킬 수 있다.
고체상화 면 (11)에서의 항체 (20)의 고체상화의 농도는 10~300ng/cm2으로 하는 것이 바람직하고, 10~40ng/cm2로 하는 것이 보다 바람직하다.
항체 (20)의 고체상화의 농도를 10ng/cm2이상으로 하면 림프구를 효과적으로 활성화시킬 수 있고, 그 후에 림프구를 효율적으로 증식시킬 수 있게 되기 때문이다. 또한 항체 (20)의 고체상화의 농도를 40ng/cm2보다 크게 해도 림프구의 증식 효율에 큰 차이가 없으며 항체를 지나치게 사용함으로써 용기의 비용이 증가하기 때문이다.
고체상화 면 (11)에서의 항 CD3항체의 최조밀 충전(closest packing) 농도는 300ng/cm2이며, 이 농도 범위까지 있으면, 림프구를 충분히 활성화시키고 그 다음에 림프구를 효율적으로 증식시킬 수 있다. 한편 항 CD3항체의 고체상화 농도가 300ng/cm2을 넘으면 배양 용기 (10)내의 배양액 중에 항 CD3항체가 부유하여, 림프구에 과잉 자극을 주는 경우가 있어서 바람직하지 않다.
본 실시형태의 배양 용기 (10)는 예를 들면 다음과 같이 제조할 수 있다.
먼저 플라스틱 압출 성형 장치를 사용하여 저밀도 폴리 에틸렌을 압출 성형하여, 필름을 형성한다. 그리고, 임펄스 실러를 사용하여 이 필름에서 백 모양의 배양 용기 (10)를 제조한다. 배양 용기 (10)는 도 1에 나타낸 바와 같이 튜브 (13)를 장착하여 제조된다.
다음에 배양 용기 (10)를 적재대에 재치하여, 소정의 양의 기체를 봉입하는 동시에 항체 (20)를 용해한 완충액을 계속 봉입한다. 그리고 배양 용기 (10)를 요동시킴으로써 배양 용기 (10)내의 바닥면 위에서 완충액의 물방울을 이동시키고 완충액에 포함되는 항체 (20)를 배양 용기 (10)내의 바닥면 위에 부착시킨다. 이로써 배양 용기 (10)내의 바닥면에만 항체 (20)를 부착시켜서, 고체상화 면 (11)을 형성한다. 이 때, 배양 용기 (10)내의 윗면은 항체 (20)가 부착되어 있지 않은 고체상화 면 (12)으로서 형성된다.
다음에 본 실시형태의 배양 용기 (10)의 보관 형태에 대해서 설명한다.
본 실시형태의 배양 용기 (10)는 고체상화 면 (11)과 비 고체상화 면 (12)이 접촉하지 않은 형태로 유지하여 보관되는 것이 바람직하다.
즉 배양 용기 (10)를 고체상화 면 (11)과 비 고체상화 면 (12)이 접촉한 형태로 1.6kg의 하중 하에서 2시간 37℃로 유지할 경우 도 2에 나타낸 바와 같이 약 2할의 항체 (20)가 고체상화 면 (11)에서 비 고체상화 면 (12)으로 옮겨진다. 이와 같이 비 고체상화 면 (12)으로 이동한 항체 (20)는 림프구 활성화 후 증식을 할 때, 림프구에 과잉 자극을 주어 증식률을 떨어뜨리는 요인이 될 수 있다. 그러므로 고체상화 면 (11)에서 비 고체상화 면 (12)으로의 대한 항체 (20)의 이동은 되도록 억제하는 것이 바람직하다.
그래서 본 실시형태의 배양 용기 (10)를 보관하려면 배양 용기 (10)에 소정량의 기체를 봉입하여, 고체상화 면 (11)과 비 고체상화 면 (12)이 접촉하지 않는 형태를 유지시키는 것이 바람직하다.
구체적으로는 봉입하는 기체의 양은 배양 용기 (10)내의 바닥 면적 1cm2당 0.01~4ml로 하는 것이 바람직하다. 봉입하는 기체의 양을 이와 같은 범위로 하면 고체상화 면 (11)과 비 고체상화 면 (12)이 접촉하는 것을 방지할 수 있다.
봉입하는 기체로는 특히 한정되지 않지만, 불활성 가스로 하는 것이 바람직하고 공기나 질소 가스 등을 사용할 수 있다. 이러한 기체를, 예를 들면 기체 공급 장치로 튜브 (13)를 통해서 배양 용기 (10)에 주입할 수 있다.
본 실시형태의 배양 용기 (10)의 구체적인 보관 형태로서는, 도 3A와 같이, 강성이 있는 외장 용기 (60)에 의해서 배양 용기 (10)의 형상을 유지시키는 것이 바람직하다. 이러한 외장 용기 (60)를 사용해서 배양 용기 (10)를 보관할 경우 소량의 기체를 배양 용기 (10)에 봉입하는 것만으로 배양 용기 (10)를 항체 (20)의 이동이 없도록 보관할 수 있다.
또한 도 3B와 같이 배양 용기 (10)를 기체로 팽만한 상태로 하여 포장 용기 (70)로 보관하는 것도 바람직하다. 이렇게 하면 여러 개의 배양 용기 (10)를 간단하게 포장하여 항체 (20)의 이동이 없도록 보관할 수 있다.
이상 설명한 바와 같이, 본 실시형태의 배양 용기 (10)는 가스 투과성 필름으로 구성되며, 마주하는 용기 내면의 한쪽 면에만 항체 (20)가 고체상화되어 고체상화 면 (11)과 비 고체상화 면 (12)을 갖춘 것으로 되어있다. 또한 배양 용기 (10)에 봉입된 림프구는 용기 내의 저부에 모인다.
그래서, 림프구의 활성화에 있어서는 배양 용기 (10)를 고체상화 면 (11)이 바닥면이 되게 사용하고, 림프구의 증식에 있어서는 배양 용기 (10)를 비 고체상화 면 (12)이 바닥면이 되도록 사용함으로써 항체 (20)에 의한 림프구의 과잉 자극을 방지할 수 있고, 단일 용기 내에서, 림프구의 활성화와 증식을 효율적으로 실시할 수 있다. 그 결과, 번잡한 이동이나, 오염의 리스크를 배제할 수 있게 되어있다. 또한 활성화에서 증식 공정의 이행은 용기를 반전한다는 단순한 조작이므로 전용의 장치 등을 사용하지 않고 간편하게 할 수 있다.
또한 본 실시형태의 배양 용기 (10)에 소정양의 기체를 봉입하여, 고체상화 면 (11)과 비 고체상화 면 (12)이 접촉하지 않는 형태를 유지시키는 것으로, 림프구에 대한 과잉 자극 방지 효과를 감소시키지 않고 배양 용기 (10)를 보관할 수 있게 된다.
또한 기존의 림프구 활성화에 사용되는 플라스크는 바닥면에만 항 CD3항체가 고체상화되어 있으며, 이로써 림프구를 활성화시킬 수도 있게 되어있다. 그러나 플라스크는 단일 용기로 림프구의 활성화 이후의 증식 공정에 사용할 수는 없다. 그 이유는 플라스크에서는 면적당 세포 수를 적절한 밀도로 유지할 수 없게 된다는 문제가 있기 때문이다. 즉, 림프구는 활성화 후에 증식하기 때문에 배양 면적을 확대할 필요가 있다. 본 실시형태라면 예를 들어 배양 용기의 일부를 클립 또는 롤러로 구분하여, 세포 증식에 맞추어 클립 또는 롤러를 이동 또는 제거하는 것 등에 의해서 재배 면적을 확대할 수는 있지만, 플라스크에서는 할 수 없으므로 플라스크는 림프구의 활성화에는 사용할 수 있으나 증식에는 적당하지 않다.
[림프구 배양 방법(제1 실시형태)]
다음에 본 발명의 림프구 배양 방법의 제1 실시형태에 대해서, 도 4를 참조하여 설명한다. 본 실시형태의 림프구 배양 방법은 이 도와 같이 (1)활성화 공정 및 (2)생산 공정을 가지고 있다.
(1)활성화 공정
본 실시형태의 림프구 배양 방법에서의 활성화 공정은 배양 용기 (10)에 림프구 (30)및 배양액 (40)을 봉입하고, 고체상화 면 (11)이 바닥면이 되도록 배양 용기 (10)를 배치하고, 림프구 (30)를 활성화시키는 공정이다.
상기와 같이 고체상화 면 (11)에는 항체 (20)가 고체상화되어 있고 이 항체 (20)로서는 항 CD3항체가 알맞게 사용된다.
림프구 (30)의 종류는 특히 한정되지 않으며, NK세포, B세포, T세포 및 단핵구 등을 배양 대상으로 할 수 있다.
배양액 (40)은 림프구 (30)의 배양에 일반적으로 사용되는 것을 사용할 수 있으며, 예를 들면 인터류킨-2가 첨가된 배양액 등을 알맞게 사용할 수 있다.
이 활성화 공정에서 배양 용기 (10)내의 림프구 (30)는 고체상화 면 (11)상에 고체상화된 항 CD3항체에 의해서 수용체 분자의 CD3이 자극되어 활성화된다.
(2)증식 공정
본 실시형태의 림프구의 배양 방법에서의 증식 공정은 배양 용기 (10)를 반전하고, 비 고체상화 면 (12)이 바닥면이 되도록 배양 용기 (10)를 배치하여, 림프구 (30)를 증폭시키는 공정이다.
이렇게 배양 용기 (10)를 비 고체상화 면 (12)이 바닥면이 되도록 배치함으로써, 림프구 (30)를 배양 용기 (10)내에서의 비 고체상화 면 (12)측에서 배양할 수 있다.
이에 의해서, 림프구 (30)를 고체상화 면 (11)에 고체상화된 항 CD3항체로부터의 자극을 받지 않고 증식시킬 수 있다. 그래서, 림프구 (30)가 항 CD3항체로부터 과잉 자극을 받은 경우에 생기는 증식 효율의 저하를 방지할 수도 있다.
[림프구의 배양 방법(제2 실시형태)]
다음에 본 발명의 림프구의 배양 방법의 제2 실시형태에 대해서, 도 5를 참조하여 설명한다. 본 실시형태의 림프구 배양 방법은 이 도와 같이 (1)활성화 공정 (2)제1 증식 공정 (3)용적 확대 공정 및 (4)제2 증식 공정을 가지고 있다.
즉, 본 실시형태의 림프구 배양 방법은 증식 공정의 도중에 용적 확대 공정을 가지고 있으며 이로 인해서, 림프구의 증식 효율을 제1 실시형태에 비교하여 더욱 향상시키는 것이 가능하다. 그래서 본 실시형태에서는 생산 공정을 상기(2)~(4)의 3개 공정으로 세분화해서 설명한다. 기타의 점에 대해서는 제1 실시형태와 같은 것으로 할 수 있다.
(1)활성화 공정
본 실시형태의 림프구 배양 방법에서의 활성화 공정에서는 먼저 배양 용기 (10)를 칸막이 부재 (50)를 사용하여 칸막이함으로써 배양부 (10-1)와 확장 가능부 (10-2)로 구분한다.
배양부 (10-1)는 림프구 (30)및 배양액 (40)을 봉입하여, 림프구 (30)의 활성화를 실시하는 방이다.
확장 가능부 (10-2)는 림프구 (30) 및 배양액 (40)이 봉입되지 않은 방이며, 림프구 (30)의 증식에 따라 배양부 (10-1)를 확장하기 위한 공간으로 이용된다.
배양부 (10-1)와 확장부 (10-2)사이를, 림프구 (30)및 배양액 (40)은 통과할 수 없다.
여기서 일반적으로 세포에는 배양 초기에 일정 이상의 세포 밀도가 없으면 증식하기 어렵다는 성질이 있다. 그래서 배양부 (10-1)의 용적을 배양 초기에는 작게 그 후에 커지도록 조정하는 것이 바람직하다.
또한 도 5에서는 칸막이 부재 (50)로 클립을 사용해서 배양 용기 (10)를 나누고, 나중에 이 클립을 빼고 배양 용기 (10)내의 전체를 배양부 (10-1)로 하는 공정이 제시되고 있지만, 배양 용기 (10)의 칸막이 방법은 이에 한정되지 않는다. 예를 들면 칸막이 부재 (50)로 롤러를 사용하여 배양부 (10-1)를 연속적으로 변경 가능하게 해도 되고, 배양부 (10-1)를 임의의 크기로 여러번 변경할 수도 있다.
다음에 배양 용기 (10)에서의 배양부 (10-1)에 림프구 (30)와 배양액 (40)을 봉입하고, 배양부 (10-1)에서의 고체상화 면 (11)이 바닥면이 되도록 배양 용기 (10)를 배치하여, 림프구 (30)를 활성화시킨다.
이 활성화 공정에서 배양부 (10-1)내의 림프구 (30)는 고체상화 면 (11) 위에 고체상화된 항 CD3항체에 의해서 활성화된다.
(2)제1 증식 공정
다음에 배양 용기 (10)를 반전하여 비 고체상화 면 (12)이 바닥면이 되도록 배양 용기 (10)를 배치하고, 림프구 (30)를 증폭시킨다.
즉 배양 용기 (10)를 비 고체상화 면 (12)이 바닥면이 되도록 배치함으로써, 림프구 (30)를 배양부 (10-1)에서의 비 고체상화 면 (12)측에서 배양할 수 있게 되고, 림프구 (30)를 고체상화 면 (11)에 고체상화된 항 CD3항체로부터의 자극을 받지 않고 증식시킬 수 있다. 그래서 림프구를 단일 용기 내에서 효율적으로 증식시킬 수도 있다.
(3)용적 확대 공정
용적 확대 공정은 칸막이 부재 (50)를 이동 또는 제거함으로써 배양부 (10-1)의 용적을 확장하는 공정이다.
이로써 배양부 (10-1)의 용적을 증식한 림프구 (30)의 세포 수에 따라 조정할 수 있다. 따라서, 림프구 (30)의 증식 효율을 더욱 향상시킬 수 있다.
(4)제2 증식 공정
제2 증식 공정은 배양 용기 (10)에서의 배양부 (10-1)를 확장한 상태에서, 림프구 (30)의 배양을 계속 실시하는 공정이다. 이때 배양 용기 (10)는 비 고체상화 면 (12)이 바닥면이 되도록 배치된 그대로의 상태이다.
따라서, 림프구 (30)를 고체상화 면 (11)에 고체상화된 항 CD3항체의 자극을 받지 않고 증식할 수 있고, 또한 배양부 (10-1)내에서의 림프구 (30)의 밀도가 너무 높음으로써, 림프구 (30)의 증식 효율이 떨어지는 것을 방지할 수 있게 된다.
또한 칸막이 부재 (50)로서 여러개의 클립이나 롤러를 사용하여 (3)과 (4)를 여러 차례 반복하여, 배양부 (10-1)의 용적의 확대를 단계적으로 실시하는 것도 가능하다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 실시형태에 관한 림프구 배양 방법에 따르면, 본 발명의 실시형태에 관한 배양 용기 (10)를 사용하여 고체상화 면 (11)이 바닥면이 되도록 배치하여 림프구 (30)의 활성화를 한 뒤, 비 고체상화 면 (12)이 바닥면이 되도록 배치하여 림프구 (30)의 증식을 할 수 있다.
그래서, 림프구 (30)가 항체 (20)에 의해서 과잉 자극을 받는 것을 방지할 수 있고 단일 용기 내에서, 림프구 (30)의 활성화와 증식을 효율적으로 실시하는 것이 가능하다.
또한 배양 용기 (10)에서의 배양부 (10-1)의 용적을 증식한 림프구 (30)의 세포 수에 따라 조정하고 림프구 (30)의 증식 효율을 더욱 향상시킬 수도 있다.
다음에 본 발명의 배양 용기의 제조 방법 및 고체상화 장치의 일 실시형태에 대해서 자세히 설명한다.
[배양 용기의 제조 방법]
본 실시형태의 배양 용기의 제조 방법은 단백질이 고체상화된 배양 용기의 제조 방법이며, 배양 용기에 단백질이 용해되어 있는 물방울(drop)을 주입하고 물방울을 배양 용기의 내면 위의 일부 또는 전부에 옮기는 것을 특징으로 한다.
처음에 본 실시형태의 배양 용기의 제조 방법에서의 배양 용기의 내면에 단백질을 효율적으로 고체상화시킬 수 있는 원리에 대해서, 도 9를 참조하고 설명한다.
단백질이 용해되어 있는 용액을 정치시키면 단백질은 그 용액의 기액 계면에 흡착한다는 성질을 가지고 있다(BUNSEKI KAGAKU Vol.59, No.6. pp.437-445(2010)). 그래서 본 실시형태의 배양 용기의 제조 방법에서는 단백질이 용해되어 있는 물방울을 기재(基材)상에서 이동시키고, 기액(기체와 액체) 계면에 집중하는 단백질 분자를 적극적으로 기재에 접촉시키고 있다.
이와 같이 물방울을 용기 내에서 굴려서 용기 내에서 기액 계면을 이동시킴으로써 기·액·재(材)의 경계선상에서 단백질이 기재에 흡착한다. 단백질이 기재에 흡착하면 새로 생긴 기액 계면에 물방울 중의 단백질이 흡착된다. 그리고 물방울이 용기 내면상에서 이동하면 단백질 농도가 높은 기액 계면과 용기 내면과의 접촉에 의해서 단백질이 고 확률로 용기 내면에 흡착한다.
이에 따라서, 본 실시형태의 배양 용기의 제조 방법에 따르면 단백질을 용기 내면에 효율적으로 고체상화할 수도 있다.
또한 예를 들면 용기의 바닥면에만 단백질을 고체상화시킬 경우에는 용기 윗면에의 단백질의 흡착에 의한 단백질 손실을 방지하는 것도 가능하다.
본 실시형태에서 배양 용기는 세포 배양에서 사용되는 용기 전반을 의미하며 세포의 활성화 및/또는 세포의 증식에 사용되는 용기를 포함한다.
본 실시형태의 배양 용기의 형태는 특히 한정되지 않고, 연포재로 이루어진 주머니 모양의 배양 백이나 유리나 폴리스티렌 제의 플라스크 등을 알맞게 사용할 수 있다.
예를 들면, 용기 내면에 대향하는 용기 벽을 가진 배양 백을 알맞게 사용할 수 있고, 이 배양 백의 내면의 한쪽 또는 양쪽면에서의 일부 또는 전부에 단백질을 고체상화시켜서 본 실시형태에서의 배양 용기를 제조할 수 있다.
구체적으로는 도 10과 같이 배양 백 (100)에서의 마주하는 내면의 한쪽을, 단백질 (200)을 고체상화한 고체상화 면 (110)(도 10의 용기 내 바닥면)으로 하고, 배양 백 내면의 또 다른 쪽을, 단백질 (200)을 비고체상화하지 않은 고체상화 면 (120)(도 10의 용기 내 윗면)으로 할 수 있다.
또한 배양 백 (100)에는 튜브 (130)를 갖추어 이 튜브 (130)를 통해서 배양 백 (100)안에 단백질이 용해하고 있는 물방울과 기체를 도입하거나 또는 제거할 수 있다. 이 도의 예에서는 튜브 (130)는 배양 백 (100)에 2개 갖추고 있지만 1개 또는 3개 이상 갖추고 있어도 된다.
또한 배양 백 (100)은 세포 배양에 필요한 가스 투과성을 가진 필름을 사용하여 형성하는 것이 바람직하다. 이러한 배양 백 (100)의 재료로서, 폴리 에틸렌이나 폴리 프로필렌 등 폴리올레핀계 수지를 알맞게 사용할 수가 있다.
본 실시형태에서 배양 백 (100)에 고체상화하는 단백질 (200)로는 특히 한정되지 않고 예를 들면 항 CD3항체 등의 항체나 피브로 넥틴, 콜라겐, 라미닌 등의 세포 접착성 단백을 사용할 수 있다. 항 CD3항체는 림프구를 활성화시키기 위해 알맞게 사용된다. 또한 세포 접착성 단백은 배양기 자재 위에 접착성 세포를 효율적으로 접착시키기 위해 알맞게 사용된다.
단백질 (200)로서 항 CD3항체를 고체상화할 경우, 항 CD3항체의 고체상화의 농도는 10~300ng/cm2로 하는 것이 바람직하다. 항 CD3항체의 고체상화의 농도를 10ng/cm2이상으로 하면 림프구를 효과적으로 활성화시킬 수 있고, 그 후에 림프구를 효율적으로 증식시킬 수 있게 되기 때문이다. 한편 항 CD3항체의 고체상화 농도가 300ng/cm2을 넘으면 배양 백 (100)내의 배양액 중에 항 CD3항체가 부유하고, 림프구에 과잉 자극을 주는 경우가 있어 좋지 않다.
본 실시형태에서의 단백질을 용해되어 물방울로서는 특히 한정되지 않지만, 인산 완충액을 알맞게 사용할 수 있다.
또한 본 실시형태의 단백질이 용해하고 있는 물방울의 크기(액적량)을 1cc~20cc로 하는 것이 바람직하다. 배양 백 (100)의 내면을 물방울이 이동할 때에 물방울과 내면과의 사이에 마찰력이 작용하므로, 물방울의 크기가 너무 작으면 적절하게 이동할 수 없기 때문이다. 또한, 물방울이 너무 크면, 물방울 중의 단백질 농도가 저하하고 또한 물방울의 부피당 기액 계면의 면적이 감소하기 때문에 흡착 효율이 저하한다. 이런 관점에서 물방울의 크기를 1cc~10cc로 하는 것이 보다 바람직하고 1cc~5cc로 하는 것이 더욱 바람직하며 2cc전후로 하는 것이 더욱 바람직하다.
본 실시형태에서 배양 백 (100)에 봉입하는 기체로는 특히 한정되지 않지만, 불활성 가스로 하는 것이 바람직하고 공기나 질소 가스 등을 사용할 수 있다. 이러한 기체를, 예를 들면 기체 공급 장치로 튜브 (130)를 통해서 배양 백 (100)에 주입할 수 있다.
또한 배양 백 (100)에 봉입하는 기체의 양은 배양 백 (100)내 바닥 면적 1cm2당 0.1~4ml로 하는 것이 보다 바람직하고 1~3ml로 하는 것이 더욱 바람직하다. 봉입하는 기체의 양을 이와 같은 범위로 하면 배양 백 (100)의 내면에서의 대향하는 용기 벽이 접촉하는 것을 방지할 수 있어서 배양 백 (100)내에서 단백질 (200)이 용해하고 있는 물방울을 효율적으로 이동시킬 수 있다.
배양 백 (100)은 예를 들면 다음과 같이 제조할 수 있다.
먼저 플라스틱 압출 성형 장치를 사용하여 저밀도 폴리 에틸렌을 압출 성형하여, 필름을 형성한다. 그리고, 임펄스 실러를 사용하여 이 필름에서 배양 백 (100)을 제조한다. 배양 백 (100)은 도 10에 나타낸 바와 같이 튜브 (130)를 장착하여 제조된다.
다음에 배양 백 (100)을 적재대에 재치하고, 소정량의 기체를 봉입함과 동시에, 단백질 (200)을 용해한 완충액을 계속 봉입한다. 그리고 배양 백 (100)을 요동하는 것 등에 의해서 배양 백 (100)내의 바닥면 위에서 완충액의 물방울을 이동시킨다. 이로써 완충액에 포함되는 단백질 (200)을 배양 백 (100)내의 바닥면 위에 부착시켜서, 단백질 (200)이 고체상화된 배양 백 (100)을 얻을 수 있다.
[고체상화 장치]
다음에 본 실시형태의 배양 용기의 제조 방법에 있어서 알맞게 사용할 수 있는 본 실시형태의 고체상화 장치 및 이 고체상화 장치에서 사용되는 유지 부재에 대해서, 도 11~도 15를 참조하여 설명한다. 도 11은 고체상화 장치의 평면도를 나타내고, 도 12는 이 정면도를 나타내고 있다. 도 13은 고체상화 장치에 의한 고체상화의 양상을 나타내고 있다. 도 14는 유지 수단의 정면도 및 측면도를 도시하고, 도 15는 유지 수단의 사용 형태를 나타내고 있다.
도 11에서 하측이 고체상화 장치 (300)의 정면 쪽을, 위쪽이 고체상화 장치 (300)의 배면 측을, 왼쪽이 고체상화 장치 (300)의 왼쪽을, 오른쪽이 고체상화 장치 (300)의 오른쪽을 각각 나타내고 있다. 또한 이 도에서 좌우 방향(후술 하는 적재대의 길이 방향)을 X축 방향, 상하 방향(이 적재대의 짧은 방향)을 Y축 방향으로 하고 있다.
고체상화 장치 (300)는 X축 방향 이동용 지지대 (310)와 Y축 방향 이동용 지지대 (360)를 갖추고 있다. 배양 백 (100)은 단백질이 용해되어 있는 물방울 및, 소정양의 기체를 봉입하여, Y축 방향 이동용 지지대 (360)에 재치된다. 이들 X축 방향 이동용 지지대 (310)와 Y축 방향 이동용 지지대 (360)와는 일체적으로 운동한다. 이하, X축 방향 이동용 지지대 (310)와 Y축 방향 이동용 지지대 (360)를 총칭하여 적재대라고 칭하는 경우가 있다.
X축 방향 이동용 지지대 (310)는 기대 (基台)(400)에 고정되어 입설(세워 설치)하는 두개의 지지 기둥 (320)으로 길이 방향의 중앙에서 정면 측 및 후면 측의 양쪽에서 지지되어 있다.
또한 X축 방향 이동용 지지대 (310)는 X축 방향 이동용 기어 박스 (340)를 통해서 X축 방향 이동용 서보 모터 (330)(길이 방향 이동용 구동 수단)에 접속되어 있다.
이 X축 방향 이동용 서보 모터 (330)를 구동함으로써 X축 방향 이동용 지지대 (310)는 Y축 방향을 중심축으로 하여 좌회전 및 우회전으로 번갈아 회전 운동을 할 수 있다. 이로써 X축 방향 이동용 지지대 (310)는 좌우에 이른바 시소 운동을 할 수 있다.
따라서 적재대에 재치된 배양 백 (100)내의 단백질이 용해되어 있는 물방울은 배양 백 (100)내를 왼쪽 끝에서 오른쪽 끝까지 좌우로 왕복 운동할 수 있다.
이때 X축 방향 이동용 지지대 (310)의 회전 운동의 각도는 수평 방향에 대해서, 예를 들면, -10°~ +10°의 범위로 할 수 있다. 또한 도 11, 12에서 왼쪽이 높아질 경우를 마이너스(-), 오른쪽이 높아질 경우를 플러스(+)로 한다.
또한 X축 방향 이동용 지지대 (310)의 회전 운동의 속도는 배양백 (100)내의 단백질이 용해되어 있는 물방울이 예를 들면 5m/분~15m/분의 속도로 배양 백 (100)내를 이동하는 속도로 할 수 있다.
Y축 원점 리밋 검출 센서 (350)는 Y축의 원점 및 리밋을 검출하기 위해서 사용된다.
Y축 방향 이동용 지지대 (360)는 X축 방향 이동용 지지대 (310)의 좌우 끝 부에 입설하는 두개의 지지부에 의해서 짧은 방향 중앙에서 왼쪽 및 오른쪽의 양쪽에서 지지되어 있다.
또한 Y축 방향 이동용 지지대 (360)는 Y축 방향 이동용 기어 박스 (380)를 통해서 Y축 방향 이동용 서보 모터 (370)(짧은 방향 이동용 구동 수단)에 접속되어 있다.
이 Y축 방향 이동용 서보 모터 (370)를 구동함으로써 Y축 방향 이동용 지지대 (360)는 X축 방향 이동용 지지대 (310)와 함께 X축 방향을 중심축으로서 좌회전 및 우회전으로 번갈아 회전 운동을 할 수 있다. 이로써 적재대는 좌우로(도 11에서는 상하로)이른바 시소 운동을 할 수 있다.
그러므로 적재대에 재치된 배양 백 (100)내의 단백질이 용해되어 있는 물방울은 배양 백 (100)내를 하단에서 상단까지 이동할 수 있다.
이때 Y축 방향 이동용 지지대 (360)의 회전 운동의 각도는 수평 방향에 대해서, 예를 들면, -50°~ +50°의 범위로 할 수 있다. 또한 도 11에서 정면 측이 높아질 경우를 마이너스(-), 배면 측이 높아질 경우를 플러스(+)로 한다.
또한 Y축 방향으로의 물방울의 이동은 물방울의 크기 이하의 거리씩 하는 것이 바람직하다. 이렇게 물방울을 Y축 방향으로 이동시키고 또한 X축 방향으로 배양 백 (100)내를 왼쪽 끝에서 오른쪽 끝까지 이동시킴으로써 물방울을 배양 백 (100)내의 바닥면 전체로 이동할 수 있고, 물방울에 포함되는 단백질을 배양 백 (100)에 효율적으로 흡착시킬 수 있다.
X축 원점 리밋 검출 센서 (390)는 X축의 원점 및 리밋을 검출하기 위해서 사용된다.
다음에 본 실시형태의 고체상화 장치 (300)를 사용한 배양 백 (100)의 제조 방법에 대해서 설명한다.
먼저 배양 백 (100)을 적재대에 재치하고, 소정량의 공기를 봉입하여 계속해서 단백질이 용해되어 있는 물방울을 주입한다. 이어서 Y축 방향 이동용 서보 모터 (370)를 구동하여, 도 13과 같이 적재대를 X축 방향을 중심축으로 정면 쪽으로 회전 이동시켜서, 물방울을 배양 백 (100)내의 정면 측단부로 이동시킨다.
다음에 X축 방향 이동용 서보 모터 (330)를 구동시켜서, 적재대를 Y축 방향을 중심축으로 하여 좌우로 회전 운동시켜서 물방울을 배양 백 (100)내에서 왼쪽 끝 및 오른쪽 끝 사이에서 좌우로 이동시킨다.
다음에 Y축 방향 이동용 서보 모터 (370)를 구동시켜서, 적재대를 배면 측으로 약간 회전 이동시켜서, 물방울을 배면 측으로 향해서 조금 이동시키고 이어서 다시 X축 방향 이동용 서보 모터 (330)를 구동시키고, 적재대를 좌우로 회전 운동시켜서 물방울을 배양 백 (100)내에서 왼쪽 끝 및 오른쪽 끝 사이에서 좌우로 이동시킨다. 이상의 동작을 물방울이 배양 백 (100)내의 배면 측단부로 이동하여 왼쪽 끝 및 오른쪽 끝 사이에서 좌우로 이동할 때까지 반복한다.
이와 같이 고체상화 장치 (300)을 사용하여 배양 백 (100) 내에 단백질을 흡착시킴으로써 단백질의 고체상화의 효율을 더욱 높일 수 있게 된다.
또한 본 실시형태의 고체상화 장치 (300)는 배양 백 (100)뿐만 아니라 프라스크나 기타 용기에 단백질을 고체상화하는 경우에도 알맞게 사용할 수 있다.
다음에 본 실시형태의 고체상화 장치에서 사용되는 유지 부재에 대해서 설명한다.
유지 부재는 배양 용기의 바닥면이 반원통 형상을 형성하도록 배양 용기를 유지하기 위한 부재이며, 적재대에 고정되거나 적재대와 일체로 형성된다.
도 14와 같이 유지 부재 (500)는 본체부 (510), 윗뚜껑부 (520)및 누름부 (530)를 갖추고 있다.
본체부 (510)는 배양 백 (100)을 만곡시켜서 유지하기 위한 반원통 형상의 오목부 (510-1)를 갖추고 있다. 이 오목부 (510-1)를 덮고 윗뚜껑부 (520)가 본체부 (510)에 장착된다. 본체부 (510)에 대한 윗뚜껑부 (520)의 장착 방법은 특히 한정되지 않고, 예를 들면 나사 고정을 할 수 있다.
윗뚜껑부 (520)에는 배양 백 (100)을 외면에서 누르기 위한 누름부 (530)가 장착되어 있다. 이 누름부 (530)를 아래쪽으로 이동시킴으로써 본체부 (510)의 오목부 (510-1)에 배치된 배양 백 (100)을 누르고, 배양 백 (100)의 바닥면을 반원통형 모양으로 안정시킬 수 있다.
윗뚜껑부 (520)에 대한 누름부 (530)의 장착은, 누름부 (530)를 아래쪽으로 이동시켜서, 배양 백 (100)을 누를 수 있으면 특히 국한되지 않지만, 예를 들면 윗뚜껑부 (520)와 누름부 (530)를 나사 맞춤으로 실시할 수 있다.
또한 누름부 (530)의 형상은 도 14와 같은 막대 모양에 한정되지 않고, 다른 형상으로 해도 된다. 예를 들면 누름부 (530)의 아래쪽 첨단부를 나누거나 또는 아래쪽을 곡면으로 하는 반구형으로 함으로써 배양 백 (100)의 바닥면을 한층 안정적으로 반원통형 모양으로 유지하는 것도 바람직하다.
또한 도 14에서는 윗뚜껑부 (520)에 3개의 누름부 (530)를 장착한 상태를 도시하고 있지만 누름부 (530)의 장착 개수는 특히 국한되지 않고 1,2개, 또는 4개 이상이라도 된다.
도 15는 유치 부재 (500)의 사용 형태를 도시하고 있으며, 유지 부재 (500)에 배양 백 (100)을 유지시키는 모습을 나타내고 있다.
먼저, 유지 부재 (500)의 본체부 (510)의 오목부 (510-1)에 배양 백 (100)을 배치한다. 이 때, 배양 백 (100)의 바닥면이 오목부 (510-1)를 따라, 곡면을 이루도록 배치시킨다.
다음에 본체부 (510)에 윗뚜껑부 (520)를 장착하여 누름부 (530)를 아래쪽으로 이동시킨다. 이에 의해서 배양 백 (100)의 바닥면을 반원형 모양으로 유지할 수 있다.
유지 부재 (500)는 오목부 (510-1)의 반원통형 형상의 중심축의 방향이 적재대의 길이 방향과 같은 방향이 되도록 고체상화 장치 (300)의 적재대에 고정하여 사용된다. 또한 유지 부재 (500)를 이러한 위치 관계에서 적재대와 일체적으로 형성해도 된다.
이러한 유지 부재 (500)에 배양 백 (100)의 바닥면을 반원통형 모양으로 유지하여 유지시키고 배양 백 (100)내에서의 물방울을 Y축 방향으로 이동시키면 물방울은 항상 유지 부재 (500)에서의 오목부 (510-1)의 최하부에 위치하므로 물방울의 Y축 방향의 이동을 정밀하게 제어할 수 있다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 배양 용기의 제조 방법에 따르면 단백질을 배양 용기 내면에 효율적으로 고체상화할 수 있고, 고체상화에 요하는 시간을 단축할 수 있는 동시에 배양 용기에 대한 흡착률을 높일 수 있고, 소량의 단백질로 필요량의 고체상화를 할 수 있게 된다. 그래서, 고체상화되지 않고 폐기되는 단백질량을 저감할 수 있게 된다. 또한 본 실시형태의 고체상화 장치를 사용함으로써 단백질의 고체상화의 효율을 보다 한층 높일 수 있다. 또한 유지 부재를 사용함으로써 물방울의 이동을 보다 정밀하게 제어할 수 있고 단백질의 고체상화의 효율을 더욱 높일 수 있게 된다.
[실시예]
이하, 본 발명의 실시형태에 관한 배양 용기 및 림프구 배양 방법의 실시예 및 비교예에 대해서, 도 6과 도 7을 참조하여 설명한다. 도 6은 실시예와 비교예를 나타내는 모식도로 도 7은 실시예와 비교예의 실험 결과의 그래프를 나타내는 도이다. 또한 도 6은 실시예와 비교예의 차이를 나타내기 위한 것이며, 배양부의 용적의 확장은 생략하고 있다.
[실험 1:배양 용기의 제조]
(실시예 1)
플라스틱 압출 성형 장치로서 라보플라스토밀(주식회사 도요정기 제작소제)를 사용하여, 저밀도 폴리 에틸렌을 압출 성형하고 두께 100μm의 필름을 성형하였다. 이어 임펄스 실러를 사용하여 이 필름에서 11cm x 22.5cm(약 225cm2)의 백을 제작하고 이 백을 γ 선 멸균하여 실험에 제공하였다.
다음에, 이 백에 공기를 약 600ml봉입하는 동시에 50μg의 항 CD3항체(밀테니바이오텍 주식회사제)를 용해된 인산 완충액(라이프 테크놀로지 재팬 주식회사제)10ml를 계속해서 봉입하였다. 이때 인산 완충액의 물방울이 백 내면의 한쪽(고체상화 면)에만 접촉하도록 하여 실시하였다.
그리고, 수작업에 의해서 백을 1분간 26℃의 조건에서 요동하여, 인산 완충액의 물방울을 10m/분의 속도로 백 내의 바닥면 위를 이동시켜서 백 안에 고체상화 면을 형성하여 배양 용기를 제조하였다.
또한 이 배양 용기를 2개 제조하여 한쪽을 고체상화 농도 측정에 사용하고 다른 쪽을 림프구의 배양 시험에 제공하였다. 이것은 기타의 실시예 및 비교예에 대해서도 마찬가지이다.
고체상화 농도의 측정은 다음과 같이 하였다.
먼저 배양 용기 내의 액을 제거하고 고체상화 면에 1% 도데실 황산 나트륨(시그마-알드리치 재팬 합동회사제)을 포함한 인산 완충액(상동)500μl를 접촉시키고, 30분간 정치시킨 뒤 프레젠트 믹서(다이테크 주식회사제)로 강한 진동을 가하고, 흡착한 항체를 박리하였다. 박리 액중의 항체량을 Micro BCATM Protein Assay Kit(써모 피숴 싸이언티픽 주식회사제)를 사용하여 측정하고 고체상화 면적으로 나누는 방식으로 흡착 농도를 산출하였다.
실시예 1의 배양 용기는 그 안쪽의 한쪽 면에만 항 CD3항체가 고체상화되어 있다.
실시예 1의 배양 용기에 대한 고체상화 농도의 측정 결과 고체상화 면에서의 항 CD3항체의 농도는 40ng/cm2이었다.
(실시예 2)
실시예 1과 마찬가지로 11cm x 22.5cm(약 225cm2)의 백을 제작하였다.
다음에, 이 백에 공기를 약 600ml봉입하는 동시에 5μg의 항 CD3항체(밀테니바이오텍 주식회사제)를 용해된 인산 완충액(라이프 테크놀로지 재팬 주식회사제) 10ml를 계속 봉입하였다. 그 밖에 대해서는 실시예 1과 같은 처리를 하여, 실시예 2의 배양 용기를 제조하였다.
실시예 2의 배양 용기는 그 안쪽의 한쪽 면에만 항 CD3항체가 고체상화되어 있다.
실시예 2의 배양 용기에 대한 고체상화 농도의 측정 결과 고체상화 면에서의 항 CD3항체의 농도는 11ng/cm2이었다.
(비교예 1)
실시예 1과 마찬가지로 11cm x 22.5cm(약 225cm2)의 백을 제작하였다.
다음에, 이 백에 50μg의 항 CD3항체(밀테니바이오텍 주식 회사제)를 용해된 인산 완충액(라이프 테크놀로지 재팬 주식회사제) 10ml를 봉입하여, 인산 완충액의 물방울을 백 안의 상하 양면에 접촉시켜서 26℃에서 60분간 정치하였다. 그리고 인산 완충액 40ml로 3회 백 내의 세척을 하고 비교예 1의 배양 용기를 제조하였다.
비교예 1의 배양 용기는 그 안쪽의 양면에 항 CD3항체가 고체상화되어 있다.
비교예 1의 배양 용기에 대한 고체상화 농도의 측정 결과, 용기 내면의 항 CD3항체의 농도는 25ng/cm2이었다.
(비교예 2)
실시예 1과 마찬가지로 11cm x 22.5cm(약 225cm2)의 백을 제작하였다.
다음에, 이 백에 공기를 약 600ml 봉입하는 동시에 5μg의 항 CD3항체(밀테니바이오텍 주식회사제)를 용해된 인산 완충액(라이프 테크놀로지 재팬 주식회사제) 10ml를 계속 봉입하였다. 이때 인산 완충액의 물방울이 백 내면의 한쪽(고체상화 면)에만 접촉하도록 하여 실시하였다.
그리고, 수작업에 의해서 백을 1분간 26℃의 조건에서 진동하고, 인산 완충액의 물방울을 10m/분의 속도로 백 내의 바닥면 위를 이동시켜서 백 안에 고체상화 면을 형성하였다. 또한 인산 완충액 10ml로 3회 백 내 세척을 하여 비교예 2의 배양 용기를 제조하였다.
비교예 2의 배양 용기는 그 안쪽의 한쪽 면에만 항 CD3항체가 고체상화되어 있다.
비교예 2의 배양 용기에 대한 고체상화 농도의 측정 결과 고체상화 면에서의 항 CD3항체의 농도는 8ng/cm2이었다.
[실험 2: 림프구의 배양]
(활성화 공정)
실험 1의 실시예 1, 2및 비교예 1, 2에서 얻어진 배양 용기를 클립을 사용하여 각각 배양부가 5cm x 11cm가 되도록 분할하였다.
이어서 사람의 말초 혈액 단핵구(Cell Applications사제) 5.8 x 104개를 10% 소태아 혈청(라이프 테크놀로지 재팬 주식 회사제) 함유의 ALyS505N-7배지(주식회사 세포 과학 연구소제)에 현탁하여 4ml를 배양 용기에 봉입하였다. 그리고 그대로 37℃에서 75시간 정치하여, 림프구 활성화 공정을 실시하였다.
이 때 실시예 1, 2및 비교예 2는 배양 용기의 고체상화 면을 아래로 하여 실시하였다. 또한 비교예 1의 배양 용기는, 상기와 같이, 그 안쪽의 상하 양면에 같은 양의 항 CD3항체가 고체상화되어 있고, 상하의 구별, 즉, 고체상화 면, 비 고체상화 면의 구별은 없다.
(증식 공정)
활성화 공정을 완료한 배양 용기에 상기 배지를 4ml 추가하고, 배양 용기를 상하 반전하여 그대로 37℃에서 26시간 정치하고, 림프구의 증식을 실시하였다(제2 실시형태에서의 제1 증식 공정).
다음에 클립을 빼고 배양 용기의 배양부의 용적을 확대하여(제2 실시형태에서의 용적 확대 공정), 상기 배지를 20ml 추가하고 그대로 37℃에서 62시간 정치하여, 림프구의 증식을 계속하였다(제2 실시형태에서의 제2 증식 공정).
배양 개시부터 상기 각 조작의 시점(75시간 이후 75+26(=101)시간 후 75+26+62(=163)시간 후) 및 클립을 빼고 18시간 이후(75+26+18(=119)에 각 배양 용기에서의 림프구의 수를 계수하였다. 그 결과를 도 7에 도시한다.
도 7과 같이 배양 용기 내의 한쪽 면에만 각각 40ng/cm2, 11ng/cm2의 항 CD3항체를 고체상화한 실시예 1, 2에서는 생산 공정에서 림프구를 현저하게 증식할 수도 있다. 이때 고체상화 농도가 40ng/cm2의 경우(실시예 1)와 11ng/cm2의 경우(실시예 2)와의 사이에서 증식 효율에 큰 차이는 없었다.
한편 배양 용기 내의 양면에 항 CD3항체를 고체상화된 비교예 1에서는 실시예 1, 2와 비교하여 증식 공정에서의 림프구의 증식 효율이 크게 낮아지고 있음을 알 수 있다.
또한 고체상화하는 항 CD3항체의 농도를 실시예 2보다 약간 줄인 비교예 2에서는 생산 공정에서 림프구를 거의 증식하지 못하고 있다. 이 사실로부터, 배양 용기의 고체상화 면에 고체상화하는 항 CD3항체의 농도는 약 10ng/cm2이상으로 하는 것이 바람직하다.
다음에 본 발명의 실시형태에 관한 배양 용기의 제조 방법의 실시예 및 비교예에 대해서, 도 16~도 21을 참조하여 설명한다. 도 16, 18, 20은 실시예와 비교예를 나타내는 모식도로 도 17, 19, 21은 실시예와 비교예의 실험 결과 그래프를 나타내는 도이다.
[실험 3:항체 고체상화 배양 백 제조]
(실시예 3)
플라스틱 압출 성형 장치로서 라보 플라스토 밀(주식회사 도요 정기 제작소제)을 사용하여, 저밀도 폴리 에틸렌을 압출 성형하고 두께 100μm의 필름을 성형하였다. 이어 임펄스 실러를 사용하여 이 필름에서 11cm x 22.5cm(약 225cm2)의 백을 제작하였다. 이 백을 γ 선 멸균하여 실험에 제공하였다.
다음에 이 백을 적재대에 놓고, 공기 약 600ml봉입하는 동시에 50μg의 항 CD3항체(밀테니바이오텍 주식회사제)를 용해한 인산 완충액(라이프 테크놀로지 재팬 주식회사제) 10ml를 물방울의 상태로 계속 봉입하였다. 이 때, 이 인산 완충액의 물방울이 백 속 바닥에만 접촉하도록 하여 실시하였다.
그리고, 수작업에 의해서 백을 1분간 26℃의 조건에서 요동하여, 인산 완충액의 물방울을 10m/분의 속도로 백 내의 바닥면 위에서 이동시키고, 백 안의 저면에 항체를 흡착시켜서 항체 고체상화 배양 백을 제조하였다.
고체상화 농도의 측정은 다음과 같이 하였다.
먼저 배양 용기 내의 물방울을 제거하고, 고체상화 면에 1% 도데실 황산 나트륨(시그마-올드리치 재팬 합동회사제)을 포함한 인산 완충액(상동) 500μl를 접촉시키고 30분간 정치시킨 뒤 프레젠트 믹서(다이테크 주식회사제)로 강한 진동을 가하고, 흡착한 항체를 박리하였다. 박리 액 중의 항체량을 Micro BCATM Protein Assay Kit(써모 피숴 싸이언티픽 주식회사제)를 사용하여 측정하여 고체상화 면적으로 나누는 방식으로 단위 면적당 단백질 흡착량(이하, 흡착 농도라 한다)을 산출하였다.
실시예 3의 배양 용기는 그 안쪽의 한쪽 면(바닥면)에만 항 CD3항체가 고체상화되어 있다. 실시예 3의 배양 용기에 대한 고체상화 농도의 측정 결과 항 CD3항체의 흡착 농도는 41.5ng/cm2이었다.
(실시예 4)
실시예 3과 마찬가지로 11cm x 22.5cm(약 225cm2)의 백을 제작하였다.
다음에, 이 백에 공기를 약 600ml봉입하는 동시에 50μg의 항 CD3항체(밀테니바이오텍 주식회사제)를 용해된 인산 완충액(라이프 테크놀로지 재팬 주식회사제) 10ml를 물방울 상태로 계속 봉입하였다.
그리고, 수작업에 의해서 백을 2.5분간 26℃의 조건에서 요동하고, 인산 완충액의 물방울을 10m/분의 속도로 백 내의 바닥면 위를 이동시켜서 백 안의 저면에 항체를 흡착시켰다. 이어서 백을 상하로 반전시키고 다시 수작업으로 백을 2.5분간 요동하여 상기 물방울을 10m/분의 속도로 백 내의 바닥면(상하 반전 전의 윗면) 위를 이동시켰다. 이로써 백 내벽의 양면에 항체를 흡착시켜서 항체 고체상화 배양 백을 제조하였다.
실시예 4의 배양 용기는 그 안쪽의 양면에 항 CD3항체가 고체상화되어 있다. 실시예 4의 배양 용기에 대한 고체상화 농도의 측정 결과 항 CD3항체의 흡착 농도는 31.2ng/cm2이었다.
(비교예 3)
실시예 3와 마찬가지로 11cm x 22.5cm(약 225cm2)의 백을 제작하였다.
다음에, 이 백에 공기를 봉입하지 않고 50μg의 항 CD3항체(밀테니바이오텍 주식회사제)를 용해된 인산 완충액(라이프 테크놀로지 재팬 주식회사제) 10ml를 봉입하고 이 인산 완충액을 백 안의 상하 양면에 접촉시켜서 26℃에서 60분간 정치하였다. 그리고 인산 완충액 40ml로 3회 백 내 세척을 하고 항체 고체상화 배양 백을 제조하였다.
비교예 3의 배양 용기는 그 안쪽의 양면에 항 CD3항체가 고체상화되어 있다. 비교예 3의 배양 용기에 대한 고체상화 농도의 측정 결과 항 CD3항체의 흡착 농도는 26.1ng/cm2이었다.
(비교예 4)
실시예 3과 마찬가지로 11cm x 22.5cm(약 225cm2)의 백을 제작하였다.
다음에, 이 백에 공기를 봉입하지 않고 50μg의 항 CD3항체(밀테니바이오텍 주식 회사제)를 용해된 인산 완충액(라이프 테크놀로지 재팬 주식회사제) 10ml를 물방울 상태로 봉입하였다. 그리고, 수작업으로 백을 5분간 26℃의 조건에서 요동하여, 인산 완충액의 물방울을 10m/분의 속도로 백 내를 이동시켜서 백의 내면에 항체를 흡착시켰다. 또한 인산 완충액 10ml로 3회 백 내 세척을 하고 항체 고체상화 배양 백을 제조하였다.
비교예 4의 배양 용기는 그 안쪽의 양면에 항 CD3항체가 고체상화되어 있다. 비교예 4의 배양 용기에 대한 고체상화 농도의 측정 결과 항 CD3항체의 흡착 농도는 23.8ng/cm2이었다.
도 17과 같이 실시예 3, 실시예 4 비교예 3및 비교예 4의 배양 용기 바닥면에 대한 면적당 항체의 흡착 효율(흡착 농도 x 225cm2/50000ng x 100)은 각각 19%, 14%, 12%, 11%였다.
즉, 실시예 3의 방법에 따르면 고체상화 시간이 1분간임에도 불구하고, 고체상화 시간 60분간의 비교예 3의 결과에 비해서 60%정도 흡착 효율이 커져 있다.
한편 배양 용기에 기체를 봉입하지 않고 물방울을 옮겨서 고체상화를 비교예 4에서는 비교예 3의 결과에 비해서 흡착 효율이 작았다.
또한 실시예 4의 흡착 효율이 실시예 3의 흡착 효율보다 작은 것은 실시예 4의 흡착 면적이 실시예 3의 흡착 면적에 비해서 2배가 되어 있기 때문으로 생각된다.
또한 실시예 4와 비교예 4의 결과를 비교하면 배양 용기에 기체를 넣은 후에 물방울을 옮겨서 고체상화를 실시함으로써 흡수 효율을 30%정도 향상되었음을 알 수 있다.
이와 같이 본 실시형태의 배양 용기의 제조 방법에 따르면 기존보다 짧은 시간에서 더 많은 항체를 배양 용기에 고체상화할 수도 있다. 또한, 종래보다 소량의 항체를 사용하여 더 많은 항체를 배양 용기에 고체상화할 수도 있게 되어 있다.
[실험 4:항체 고체상화 플라스크의 제조]
(실시예 5)
부유 배양용 플라스크 (800)(스미토모 베이크라이트, 폴리스티렌 제품, 바닥 면적 225cm2)에 50μg의 항 CD3항체(밀테니바이오텍 주식회사제)를 용해된 인산 완충액(라이프 테크놀로지 재팬 주식회사제) 10ml를 물방울 상태로 봉입하였다. 수작업으로 플라스크를 5분간 26℃의 조건에서 요동하고, 인산 완충액의 물방울을 10m/분의 속도로 백 내의 바닥면 위를 이동시켜서, 플라스크 안의 저면에 항체를 흡착시키고 항체 고체상화 플라스크를 만들었다. 실시예 5의 항체 고체상화 플라스크의 항 CD3항체의 농도는 27.9ng/cm2이었다.
(비교예 5)
부유 배양용 플라스크 (800)(스미토모 베이크라이트, 폴리스티렌 제품, 바닥 면적 225cm2)에 50μg의 항 CD3항체(밀테니바이오텍 주식회사제)를 용해된 인산 완충액(라이프 테크놀로지 재팬 주식회사제) 10ml를 넣고 바닥면 전체에 항체 용액을 고루 미치게 하여 26℃에서 60분간 정치하였다. 이로써 플라스크의 바닥면에 항체를 흡착시켜서 항체 고체상화 플라스크를 만들었다. 비교예 5의 항체 고체상화 플라스크의 항 CD3항체의 농도는 27.6ng/cm2이었다.
(비교예 6)
부유 배양용 플라스크 (800)(스미토모 베이크라이트, 폴리스티렌 제품, 바닥 면적 225cm2)에 50μg의 항 CD3항체(밀테니바이오텍 주식회사제)를 용해된 인산 완충액(라이프 테크놀로지 재팬 주식회사제) 10ml를 넣고 바닥면 전체에 항체 용액을 고루 미치게 하여 26℃에서 5분간 정치하였다. 이로써 플라스크의 바닥면에 항체를 흡착시켜서 항체 고체상화 플라스크를 만들었다. 비교예 6의 항체 고체상화 플라스크의 항 CD3항체의 농도는 21.8ng/cm2이었다.
도 19와 같이 실시예 5, 비교예 5, 및 비교예 6의 플라스크의 면적당 항체의 흡수 효율은 각각 13%, 12%, 10%였다.
즉 비교예 5에 나타낸 바와 같이, 기존의 정치에 의한 항체의 고체상화 방법으로는 고체상화 시간 60분 동안 흡착 효율이 12%인 것에 비해서, 실시예 5에 제시된 바와 같이 본 실시형태의 배양 용기의 제조 방법으로는 고체상화 시간 5분 만에 흡착 효율을 13%로 할 수 있게 되어있다.
따라서 본 실시형태의 배양 용기의 제조 방법에 따르면 플라스크에 단백질을 고체상화하는 경우라도 기존 방법보다 짧은 시간에 동등량의 단백질을 고체상화하는 것이 밝혀졌다.
[실험 5:피브로 넥틴 고체상화 배양백의 제조]
(실시예 6)
실시예 3과 마찬가지로 11cm x 22.5cm(약 225cm2)의 백을 제작하였다.
다음에, 이 백에 공기를 약 600ml봉입하는 동시에 50μg의 사람의 혈장 유래의 피브로 넥틴(시그마-올드리치 재팬 합동회사제)를 용해된 인산 완충액(라이프 테크놀로지 재팬 주식회사제)10ml를 물방울 상태로 계속 봉입하였다.
그리고, 수작업으로 백을 1분간 26℃의 조건에서 요동하고, 인산 완충액의 물방울을 10m/분의 속도로 백 내의 바닥면 위를 이동시키고, 백 안의 저면에 항체를 흡착시켜서 피브로 넥틴 고체상화 배양 백을 제조하였다.
실시예 6의 배양 용기는 그 안쪽의 한쪽 면(바닥면)에만 피브로 넥틴이 고체상화되어 있다. 실시예 6의 배양 용기에 대한 고체상화 농도의 측정 결과 피브로 넥틴 흡착 농도는 53.6ng/cm2이었다.
(비교예 7)
실시예 3과 마찬가지로 11cm x 22.5cm(약 225cm2)의 백을 제작하였다.
다음에, 이 백에 공기를 봉입하지 않고 50μg의 사람의 혈장 유래의 피브로 넥틴(시그마-올드리치 재팬 합동회사제)를 용해된 인산 완충액(라이프 테크놀로지 재팬 주식회사제) 10ml를 봉입하여 인산 완충액의 물방울을 백 안의 상하 양면에 접촉시켜서 26℃에서 60분간 정치하였다. 그리고 인산 완충액 40ml로 3회 백 내의 세척을 하고 피브로 넥틴 고체상화 배양 백을 제조하였다.
비교예 7의 배양 용기는 그 안쪽의 양면에 피브로 넥틴이 고체상화되어 있다. 비교예 7의 배양 용기에 대한 고체상화 농도의 측정 결과 피브로 넥틴 흡착 농도는 30.7ng/cm2이었다.
도 21과 같이 실시예 6 및 비교예 7의 배양 용기의 면적당 항체 흡착 효율은 각각 24%, 14%였다.
즉 단백질로서 피브로 넥틴을 사용한 경우 본 실시형태의 배양 용기의 제조 방법에 따르면 기존 방법보다 70%이상의 흡착 효율로 피브로 넥틴을 배양 용기에 고체상화하도록 되어있다.
따라서 본 실시형태의 배양 용기의 제조 방법에 따르면 항체 이외의 단백질로도 단시간에 효율적으로 배양 용기에 고체상화할 수 있는 것이 밝혀졌다.
[실험 6:고체상화 장치를 사용한 항체 고체상화 배양백의 제조]
(실시예 7)
실시예 3과 마찬가지로 8cm x 20cm(약 160cm2)의 백을 제작하였다.
다음에 이 백을 고체상화 장치에서의 유지 부재에 놓고, 누름부를 사용하여 바닥면이 반원형 모양이 되도록 고정하였다. 이어서 공기를 약 280ml 봉입하는 동시에 10μg의 항 CD3항체(밀테니바이오텍 주식회사제)를 용해한 인산 완충액(라이프 테크놀로지 재팬 주식회사제) 2ml를 물방울 상태로 계속 봉입하였다.
그리고 도 13과 같이 고체상화 장치에서의 적재대를 Y축 방향으로 -50°기울이고(X축 방향을 중심 축으로 회전 이동), 물방울을 배양 백 내의 끝에 모으고, 이어 적재대를 X축 방향으로 -10°~10°의 범위로 회전시키고(Y축 방향을 중심 축으로 회전 이동), 물방울을 X축 방향으로 이동시켜서 배양 백 내의 왼쪽 끝에서 오른쪽 끝까지 좌우로 왕복 이동시켰다.
다음에 적재대를 Y축 방향으로 10°회전시켜서 물방울을 배면 측으로 조금 이동시키고, 이어서 적재대를 다시 X축 방향으로 -10°~10°의 범위로 회전시켜서 물방울을 X축 방향으로 이동시키고, 배양 백 내 왼쪽 끝에서 오른쪽 끝까지 좌우로 왕복 이동시켰다.
이상의 동작을 Y축 방향의 회전각(X축 회전각)이 50°가 될 때까지 반복하여 배양 백의 바닥면 전체에 물방울을 이동시켰다. 이 것을 1사이클로 하여 4사이클을 실시하고(고체상화 시간 3.5분, 온도 26℃), 고체상화 양을 측정하였다.
실시예 7의 배양 용기는 그 안쪽의 한쪽 면(바닥면)에만 항 CD3항체가 고체상화되어 있다. 실시예 7의 배양 용기에 대한 고체상화 농도의 측정 결과 항 CD3항체의 흡착 농도는 30.1ng/cm2이었다.
따라서 실시예 7의 배양 용기의 면적당 항체 흡착 효율(흡착 농도x 160cm2/10000ng x 100)은 48%였다. 이는 비교예 3의 배양 용기의 이 흡착 효율 12%에 비해서 4 배이다.
이와 같이 본 실시형태의 고체상화 장치를 사용하여 배양 용기를 제조함으로써 단시간에 종래에는 실현할 수 없는 수준 높은 흡착 효율을 나타내는 배양 용기를 얻을 수 있음이 명백해졌다.
본 발명은 이상의 실시형태나 실시예에 한정되는 것은 아니고 본 발명의 범위 내에서 다양한 변경 실시가 가능하다는 것을 말할 필요도 없다.
예를 들면 배양 용기의 크기, 림프구의 종류, 배지 및 단백질의 종류 등을 실시예와는 다른 것으로 하는 등 적절히 변경할 수 있다.
본 발명은 단일의 배양 용기를 사용함으로써 활성화된 세포의 이동의 번잡성이나 콘타미 네이션의 리스크를 배제하면서, 림프구를 대량 배양하는 경우에 알맞게 이용할 수 있다. 또한 본 발명은 단백질이 내면에 고체상화된 배양 용기를 단시간에 효율적으로 제조하기 위해서, 알맞게 이용할 수 있다.
10 배양 용기
11 고체상화 면
12 비고체상화 면
13 튜브
20 항체
30 림프구
40 배양액
50 칸막이 부재
60 외장 용기
70 포장 용기
100 배양백
110 고체상화 면
120 비고체상화 면
130 튜브
200 단백질
300 고체상화 장치
310 X축 방향 이동용 지지대
320 지지 기둥
330 X축 방향 이동용 서보 모터
340 X축 방향 이동용 기어 박스
350 Y축 원점 리밋 검출 센서
360 Y축 방향 이동용 지지대
370 Y축 방향 이동용 서보 모터
380 Y축 방향 이동용 기어 박스
390 X축 원점 리밋 검출 센서
400 기대
500 유지 부재
510 본체부
510-1 오목부
520 윗뚜껑부
530 누름부

Claims (17)

  1. 림프구를 배양하기 위한 배양 용기이며, 가스 투과성 필름으로 구성되며, 대향하는 용기 내면의 한쪽 면에만 항체가 고체상화되어 고체상화 면과 비 고체상화 면이 갖추어지고, 상기 고체상화 면에서 항 CD3항체가 10~300ng/cm2의 농도로 고체상화되어 있는 것을 특징으로 하는 배양 용기.
  2. 제1항에 있어서, 상기 고체상화 면과 상기 비고체상화 면이 접촉하지 않는 형태로 유지되고 있는 것을 특징으로 하는 배양 용기.
  3. 제2항에 있어서, 용기 내 저면적 1cm2당 0.01~4ml의 기체가 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 배양 용기.
  4. 제1~3항 중 어느 한 항에 기재된 배양 용기를 사용한 림프구의 배양 방법이며,
    상기 배양 용기에 림프구 및 배양액을 봉입하고, 상기 배양 용기에서의 상기 고체상화 면이 바닥면이 되도록 상기 배양 용기를 배치하고, 림프구를 활성화시키는 활성화 공정과,
    상기 배양 용기를 반전하여, 상기 배양 용기에서의 상기 비 고체상화 면이 바닥면이 되도록 상기 배양 용기를 배치하고, 림프구를 증폭시키는 증식 공정을 가진
    것을 특징으로 하는 림프구 배양 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 활성화 공정에서 상기 배양 용기를 칸막이 부재로 칸막이함으로써 상기 배양 용기 내에 배양부를 형성하고, 이 배양부에 림프구 및 배양액을 봉입하고,
    상기 증식 공정으로서,
    상기 배양 용기를 반전하여, 상기 배양 용기에서의 상기 비 고체상화 면이 바닥면이 되도록 상기 배양 용기를 배치하고, 림프구를 증폭시키는 제1의 증식 공정과,
    상기 칸막이 부재를 이동 또는 제거하여 상기 배양부의 용적을 확장하는 용적 확장 공정과,
    상기 배양부의 용적을 확장한 후에, 림프구를 증폭시키는 제2의 증식 공정을 가진
    것을 특징으로 하는 림프구 배양 방법.
  6. 단백질이 고체상화된 배양 용기의 제조 방법이며,
    상기 배양 용기에 상기 단백질이 용해되어 있는 물방울을 주입하고,
    상기 물방울을 상기 배양 용기의 내면 상의 일부 또는 전부에 이동시키는
    것을 특징으로 하는 배양 용기의 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서, 연포재로 형성된 상기 배양 용기에 기체를 봉입하는 공정과,
    기체가 봉입된 상기 배양 용기에 상기 단백질이 용해되어 있는 물방울을 주입하는 공정과,
    상기 물방울을 상기 배양 용기의 내면 상의 일부 또는 전부에 이동시키는 공정을 가진
    것을 특징으로 하는 배양 용기의 제조 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 물방울을 이동시키는 영역이 상기 배양 용기의 내면에서의 대향하는 용기 벽의 한쪽뿐인 것을 특징으로 하는 배양 용기의 제조 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기체를 상기 배양 용기 내의 바닥 면적 1cm2당 0.1~4ml의 범위에서 상기 배양 용기에 봉입하는 것을 특징으로 하는 배양 용기의 제조 방법.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 항체 또는 세포 접착성 단백질임을 특징으로 하는 배양 용기의 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 항체가 항 CD3항체임을 특징으로 하는 배양 용기의 제조 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 세포 접착성 단백질이 피브로 넥틴, 콜라겐, 라미닌으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 배양 용기의 제조 방법.
  13. 단백질을 배양 용기의 내면에 고체상화하는 고체상화 장치이며,
    상기 단백질이 용해되어 있는 물방울, 및 배양 용기를 재치하는 적재대와,
    상기 적재대를 움직여서, 상기 배양 용기 내의 상기 물방울을 상기 배양 용기의 내면상에서 이동시키는 구동 수단을 갖춘 것을 특징으로 하는 고체상화 장치.
  14. 제13항에 있어서, 상기 구동 수단으로서
    상기 적재대를 짧은 방향을 중심축으로 하여 회전 운동시키고, 상기 물방울을 상기 배양 용기의 내면 위에서 길이 방향으로 이동시키는 길이 방향 이동용 구동 수단과,
    상기 적재대를 길이 방향을 중심축으로 하여 회전 운동시키고, 상기 물방울을 상기 배양 용기의 내면상에서 짧은 방향으로 이동시키는 짧은 방향 이동용 구동 수단을 갖춘
    것을 특징으로 하는 고체상화 장치.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 배양 용기의 바닥면이 반원통 형상을 형성하도록 상기 배양 용기를 유지하기 위한, 반원통 형상의 오목부를 가진 유지 부재를 갖추고, 상기 유지 부재가 상기 적재대에 고정되거나, 또는 상기 적재대와 일체로 형성된 것을 특징으로 하는 고체상화 장치.
  16. 제15항에 있어서, 상기 유지 부재의 반원통 형상의 중심축의 방향이 상기 적재대의 길이 방향과 같은 방향이 되도록 상기 유지 부재가 상기 적재대에 고정되거나, 또는 상기 유지 부재가 상기 적재대와 일체로 형성된 것을 특징으로 하는 고체상화 장치.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 유지 부재가 상기 배양 용기의 바닥면이 반원통 형상을 형성하도록 상기 배양 용기를 누르기 위한 누름부를 갖춘 것을 특징으로 하는 고체상화 장치.
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