JP6844260B2 - 培養容器、及び培養容器の製造方法 - Google Patents
培養容器、及び培養容器の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6844260B2 JP6844260B2 JP2016565879A JP2016565879A JP6844260B2 JP 6844260 B2 JP6844260 B2 JP 6844260B2 JP 2016565879 A JP2016565879 A JP 2016565879A JP 2016565879 A JP2016565879 A JP 2016565879A JP 6844260 B2 JP6844260 B2 JP 6844260B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- culture
- culture vessel
- lymphocytes
- immobilized
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 66
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 claims description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 40
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 37
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 229920001684 low density polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000004702 low-density polyethylene Substances 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000007705 chemical test Methods 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 229940124589 immunosuppressive drug Drugs 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920005672 polyolefin resin Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/02—Form or structure of the vessel
- C12M23/14—Bags
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
- C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
- C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/20—Material Coatings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/26—Constructional details, e.g. recesses, hinges flexible
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は、細胞の培養技術に関し、特にリンパ球を活性化させるための培養容器、及びその製造方法に関する。
近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
このような状況において、ガス透過性フィルムから形成された培養容器に細胞と培養液を封入して、閉鎖系で自動的に細胞を大量培養することが行われている。
このような状況において、ガス透過性フィルムから形成された培養容器に細胞と培養液を封入して、閉鎖系で自動的に細胞を大量培養することが行われている。
特に、リンパ球を培養する場合には、細胞数を増やすための培養に先立って、まず抗ＣＤ３抗体を用いてリンパ球を活性化させるための培養を行う必要がある。このため、抗ＣＤ３抗体の入った培養容器にリンパ球と培養液を入れて、その活性化が行われる。
ところで、培養容器に溶液状の抗ＣＤ３抗体が少量しか入っていない場合には、リンパ球への刺激が不十分となり、活性化を十分に行うことができない。一方、培養容器に溶液状の抗ＣＤ３抗体が多量に入っている場合には、細胞の防御機構によって細胞膜に存在するＣＤ３抗原が脱落し、リンパ球の活性化は阻害される。
ところで、培養容器に溶液状の抗ＣＤ３抗体が少量しか入っていない場合には、リンパ球への刺激が不十分となり、活性化を十分に行うことができない。一方、培養容器に溶液状の抗ＣＤ３抗体が多量に入っている場合には、細胞の防御機構によって細胞膜に存在するＣＤ３抗原が脱落し、リンパ球の活性化は阻害される。
抗ＣＤ３抗体を主成分とする免疫抑制剤は、このようなリンパ球の性質に着目して創られたものであり、これを臓器・組織移植後に拒絶反応が生じた患者に投与すると、多量の抗ＣＤ３抗体が抗原に結合して集積し、その集積物は細胞内に取り込まれて細胞外に排出される。あるいは、集積物は酵素により切断されて、細胞表面から抗原が除去される。その結果、細胞内に刺激が伝達されなくなり、リンパ球の活性化は抑制される。
このように、溶液中に遊離する抗体を用いてリンパ球の活性化を適切に制御することは難しく、従来は、一般的に培養容器の底内面に抗ＣＤ３抗体を固相化し、このような培養容器を用いてリンパ球を適度に刺激することで、リンパ球を活性化することが広く行われていた。
このように、溶液中に遊離する抗体を用いてリンパ球の活性化を適切に制御することは難しく、従来は、一般的に培養容器の底内面に抗ＣＤ３抗体を固相化し、このような培養容器を用いてリンパ球を適度に刺激することで、リンパ球を活性化することが広く行われていた。
また、リンパ球の活性化用培養バッグ（以下、単に活性化バッグと称する場合がある）を製造するにあっては、バッグ内に抗ＣＤ３抗体を含む抗体溶液を封入してバッグ内面に抗ＣＤ３抗体を固相化させた後、バッグ内を洗浄して遊離抗体を除去し、その後にリンパ球と培養液を封入して活性化培養が行われていた。このようにバッグ内を洗浄して遊離抗体を除去することにより、リンパ球の活性化をより効率的に行うことが可能となっていた。
そこで、本発明者らは、活性化バッグに抗体溶液が残存した場合の遊離抗体による活性化への悪影響を調べるため、様々な濃度の抗体溶液を用いて、リンパ球の活性化を行った。
その結果、驚くべきことに、抗体濃度が活性化バッグの製造に用いる程度の比較的高濃度の場合には、リンパ球の活性化が抑制されるものの、ある一定範囲の低濃度の場合には、反対にリンパ球の活性化が促進されることが見いだされた。
すなわち、活性化バッグに抗ＣＤ３抗体を固相化すると共に、低濃度の遊離抗体を封入することで、活性化バッグによるリンパ球の活性化を促進することができ、その結果、リンパ球の増殖効率をより一層向上できることが判明した。
その結果、驚くべきことに、抗体濃度が活性化バッグの製造に用いる程度の比較的高濃度の場合には、リンパ球の活性化が抑制されるものの、ある一定範囲の低濃度の場合には、反対にリンパ球の活性化が促進されることが見いだされた。
すなわち、活性化バッグに抗ＣＤ３抗体を固相化すると共に、低濃度の遊離抗体を封入することで、活性化バッグによるリンパ球の活性化を促進することができ、その結果、リンパ球の増殖効率をより一層向上できることが判明した。
ここで、特許文献１の実施例１には、リンパ球の活性化バッグを製造するために、バッグ内に抗ＣＤ３抗体を含む抗体溶液を封入してバッグ内面に抗ＣＤ３抗体を固相化させた後、抗体溶液を封入したまま活性化を行ったことが記載されている。また、同実施例２には、バッグ内面に抗ＣＤ３抗体を固相化させた後、バッグ内を洗浄して遊離抗体を除去し、その後にリンパ球と培養液を封入して活性化を行ったことが記載されている。そして、その結果、抗体溶液を封入したまま活性化を行った実施例１の方が、バッグ内を洗浄して遊離抗体を除去した実施例２よりもリンパ球の増殖効率が低かったことが示されている。
すなわち、実施例１ではバッグ内に多量の遊離抗体が残っていたためにリンパ球の活性化が抑制され、実施例２よりもリンパ球の増殖効率が低くなったと考えられる。
一方、特許文献１には、リンパ球の活性化効率をより向上させるために、抗ＣＤ３抗体を固相化した活性化バッグに一定範囲の低濃度の遊離抗体を封入することについては、記載も示唆もされていない。
一方、特許文献１には、リンパ球の活性化効率をより向上させるために、抗ＣＤ３抗体を固相化した活性化バッグに一定範囲の低濃度の遊離抗体を封入することについては、記載も示唆もされていない。
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、リンパ球を従来よりも高効率で活性化可能な培養容器、及びその製造方法の提供を目的とする。
上記目的を達成するため、本発明の培養容器は、リンパ球を活性化させるための軟包材からなる袋状の培養容器であって、対向する容器内面の片面に抗ＣＤ３抗体が１０〜３００ｎｇ／ｃｍ２の密度（以下、単位面積当たりの抗体固相化量を単に密度と称する場合がある）で固相化されており、且つ、培養時に、前記培養容器内の遊離した抗ＣＤ３抗体の濃度が５〜１００ｎｇ／ｍｌとなるように遊離した抗ＣＤ３抗体が封入されている構成としてある。
また、本発明の培養容器の製造方法は、リンパ球を活性化させるための軟包材からなる袋状の培養容器の製造方法であって、対向する容器内面の片面に抗ＣＤ３抗体を１０〜３００ｎｇ／ｃｍ２の密度で固相化し、培養時に、前記培養容器内の遊離した抗ＣＤ３抗体の濃度が５〜１００ｎｇ／ｍｌとなるように遊離した抗ＣＤ３抗体を封入する方法としてある。
本発明によれば、リンパ球を従来よりも高効率で活性化できる培養容器、及びその製造方法を提供することが可能となる。
以下、本発明の培養容器、及び培養容器の製造方法の実施形態について、図１〜４を用いて詳細に説明する。図１は、本実施形態に係る培養容器の概略を示す正面模式図、図２は、同平面模式図であり、図３は、この培養容器にリンパ球と培養液を封入して、活性化培養を行う様子を示す正面模式図である。また、図４は、この培養容器の応用例の概略を示す正面模式図である。
［培養容器］
図１，２に示すように、本発明の実施形態に係る培養容器１０は、上下に対向する容器壁を有している。そして、容器内面の一方が、抗体１２を固相化した固相化面１１（図１，２の容器内の底面）となっており、この固相化面１１が培養面として用いられる。また、培養容器１０内には、抗体１２が遊離する抗体溶液１３が封入されている。
なお、培養容器１０には、チューブ１４を接続可能なポートが備えられ、これによって培養容器１０内へのリンパ球と培養液の封入、及び培養したリンパ球と培養液の回収が行われる。図１，２の例では一つのチューブ１４が培養容器１０に接続されているが、２本以上接続されていても良い。
図１，２に示すように、本発明の実施形態に係る培養容器１０は、上下に対向する容器壁を有している。そして、容器内面の一方が、抗体１２を固相化した固相化面１１（図１，２の容器内の底面）となっており、この固相化面１１が培養面として用いられる。また、培養容器１０内には、抗体１２が遊離する抗体溶液１３が封入されている。
なお、培養容器１０には、チューブ１４を接続可能なポートが備えられ、これによって培養容器１０内へのリンパ球と培養液の封入、及び培養したリンパ球と培養液の回収が行われる。図１，２の例では一つのチューブ１４が培養容器１０に接続されているが、２本以上接続されていても良い。
培養容器１０は、細胞培養に必要なガス透過性を有するフィルムを用いて、袋状（バック型）に形成されている。このような培養容器１０の材料として、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリオレフィン系樹脂を好適に用いることができる。
固相化面１１に固相化する抗体１２としては、抗ＣＤ３抗体が用いられる。リンパ球は、抗ＣＤ３抗体によって活性化され、増殖させることができる。
固相化面１１における抗体１２の固相化の密度は、１０〜３００ｎｇ／ｃｍ２とすることが好ましく、１０〜４０ｎｇ／ｃｍ２とすることがより好ましい。
抗体１２の固相化の密度を１０ｎｇ／ｃｍ２以上とすれば、リンパ球を効果的に活性化させることができる。また、固相化面１１における抗ＣＤ３抗体の最密充填密度は、３００ｎｇ／ｃｍ２であるため、抗体１２をこの密度範囲まで固相化することによって、リンパ球を好適に活性化させることが可能である。さらに、抗体１２の固相化の密度を１０〜４０ｎｇ／ｃｍ２とすれば、リンパ球の増殖効率を特に大きく向上させることが可能である。
固相化面１１における抗体１２の固相化の密度は、１０〜３００ｎｇ／ｃｍ２とすることが好ましく、１０〜４０ｎｇ／ｃｍ２とすることがより好ましい。
抗体１２の固相化の密度を１０ｎｇ／ｃｍ２以上とすれば、リンパ球を効果的に活性化させることができる。また、固相化面１１における抗ＣＤ３抗体の最密充填密度は、３００ｎｇ／ｃｍ２であるため、抗体１２をこの密度範囲まで固相化することによって、リンパ球を好適に活性化させることが可能である。さらに、抗体１２の固相化の密度を１０〜４０ｎｇ／ｃｍ２とすれば、リンパ球の増殖効率を特に大きく向上させることが可能である。
培養容器１０には、培養面として用いられる固相化面１１において、溶液状の抗体１２を、１ｃｍ２当たり０．２５〜４００ｎｇ且つ０．１〜８００μlの量で封入することが好ましい。培養容器１０に溶液状の抗体１２をこのような量で封入することで、リンパ球の活性化をより向上させることができ、その結果として増殖効率を一層向上させることができるためである。
このような観点から、溶液状の抗体１２を、培養面１ｃｍ２当たり０．５〜３００ｎｇ且つ０．１〜６００μlの量で封入することがより好ましく、１〜２００ｎｇ且つ０．１〜４００μlの量で封入することがさらに好ましく、１〜２００ｎｇ且つ０．１〜２００μlの量で封入することがより一層好ましい。
このような観点から、溶液状の抗体１２を、培養面１ｃｍ２当たり０．５〜３００ｎｇ且つ０．１〜６００μlの量で封入することがより好ましく、１〜２００ｎｇ且つ０．１〜４００μlの量で封入することがさらに好ましく、１〜２００ｎｇ且つ０．１〜２００μlの量で封入することがより一層好ましい。
また、培養容器１０における遊離した抗ＣＤ３抗体の濃度（以下、単に遊離抗体濃度と称する場合がある）を５〜１００ｎｇ／ｍｌとすることが好ましい。遊離抗体濃度をこのような範囲にすることで、リンパ球の活性化をより向上させることができ、その結果として増殖効率を一層向上させることができるためである。
ここで、軟包材からなる培養容器を用いた細胞培養は、優れた培養効率を得るために、一般に培養液の液厚を０．２〜２ｃｍとして行われることが多い。遊離抗体濃度が５ｎｇ／ｍｌの場合、液厚を０．２ｃｍとすると、１ｃｍ２当たりの抗体量は１ｎｇとなる。また、遊離抗体濃度が１００ｎｇ／ｍｌの場合、液厚を２ｃｍとすると、１ｃｍ２当たりの抗体量は２００ｎｇとなる。したがって、遊離抗体濃度を５〜１００ｎｇ／ｍｌとし、培養液の液厚を０．２〜２ｃｍとすると、培養容器１０には、溶液状の抗体１２が培養面１ｃｍ２当たり１〜２００ｎｇの量で封入されることになる。
また、細胞密度の調整等の理由で培養液の液厚が０．０５〜４ｃｍの範囲から選択される場合がある。この場合の遊離抗体濃度を５〜１００ｎｇ／ｍｌとし、培養を行うとすると、遊離抗体濃度が５ｎｇ／ｍｌの場合、液厚を０．０５ｃｍとすると、１ｃｍ２当たりの抗体量は０．２５ｎｇとなる。また、遊離抗体濃度が１００ｎｇ／ｍｌの場合、液厚を４ｃｍとすると、１ｃｍ２当たりの抗体量は４００ｎｇとなる。したがって、培養容器１０には、溶液状の抗体１２が培養面１ｃｍ２当たり０．２５〜４００ｎｇの量で封入されることになる。
さらに、溶液状の抗ＣＤ３抗体を培養容器に培養面積１ｃｍ２当たり０．１μlより少ない量で封入することは困難であるため、０．１μl以上の量で封入することが好ましい。また、軟包材からなる培養容器の取り扱いなどの観点から通常用いられる培養容器の容量は、培養面積１ｃｍ２当たり４０００μl以下である場合が多く、培養液量に対する抗体溶液量の割合は、優れた培養効率を得るために、好ましくは２割以下、より好ましくは１割以下、さらに好ましくは０．５割以下とすることが望ましい。このため、溶液状の抗ＣＤ３抗体を培養容器に培養面積１ｃｍ２当たり８００μl以下の量で封入することが好ましく、４００μl以下の量で封入することがより好ましく、２００以下の量で封入することがさらに好ましい。
このような培養容器１０にリンパ球と培養液をチューブ１４を介して注入して、リンパ球の活性化を行うことによって、抗体１２の固相化のみが行われている培養容器を用いる場合に比較して、リンパ球を抗ＣＤ３抗体に好適に接触させることができ、リンパ球の活性化効率をより向上させることができる。
図３は、このような活性化培養の様子を模式的に示したものであり、培養容器１０の底内面に抗体１２が固相化されると共に、抗体１２が培養液３０において低濃度で遊離している。そして、リンパ球２０が固相化された抗体１２と遊離している抗体１２とによって、活性化されるようになっている。
図３は、このような活性化培養の様子を模式的に示したものであり、培養容器１０の底内面に抗体１２が固相化されると共に、抗体１２が培養液３０において低濃度で遊離している。そして、リンパ球２０が固相化された抗体１２と遊離している抗体１２とによって、活性化されるようになっている。
また、本発明の実施形態に係る培養容器を、図４に示すように、固相化面１１に対向する容器内面（以下、対向面と称する場合がある）に抗ＣＤ３抗体を固相化面１１における密度よりも小さい密度で固相化した培養容器１０ａとして構成することも好ましい。
すなわち、対向面が、抗体１２が固相化されていない非固相化面である場合、例えば保管時や輸送時に溶液中の遊離抗体が非固相化面に吸着すると、培養容器における遊離抗体の濃度が低下するため、その濃度制御が困難になる。
すなわち、対向面が、抗体１２が固相化されていない非固相化面である場合、例えば保管時や輸送時に溶液中の遊離抗体が非固相化面に吸着すると、培養容器における遊離抗体の濃度が低下するため、その濃度制御が困難になる。
そこで、本実施形態の培養容器１０ａでは、対向面に抗ＣＤ３抗体を固相化することで、培養容器における遊離抗体の濃度が低下するのを抑制可能にしている。対向面に固相化する抗ＣＤ３抗体の濃度は特に限定されないが、固相化面１１の０．０１〜０．９倍程度の密度にすることが好ましい。
［培養容器の製造方法］
本実施形態の培養容器１０は、例えば以下のように製造することができる。
まず、プラスチック押出成形装置を用いて低密度ポリエチレンを押出成形し、フィルムを形成する。そして、インパルスシーラーを用いて、このフィルムからバッグ型の培養容器１０を製造する。また、チューブ１４を培養容器１０にポートを介して接続する。
本実施形態の培養容器１０は、例えば以下のように製造することができる。
まず、プラスチック押出成形装置を用いて低密度ポリエチレンを押出成形し、フィルムを形成する。そして、インパルスシーラーを用いて、このフィルムからバッグ型の培養容器１０を製造する。また、チューブ１４を培養容器１０にポートを介して接続する。
次に、培養容器１０を積載台に載置して、所定の量の気体を封入すると共に、抗体１２を溶解した緩衝液を続けて封入する。そして、培養容器１０を揺動することなどによって、培養容器１０内の底面上で緩衝液の液滴を移動させ、緩衝液に含まれる抗体１２を、培養容器１０内の底面上に付着させる。
このとき、固相化面１１に固相化する抗体１２として抗ＣＤ３抗体を用い、前述したように、固相化面１１における抗体１２の固相化の密度は、１０〜３００ｎｇ／ｃｍ２とすることが好ましく、１０〜４０ｎｇ／ｃｍ２とすることがより好ましい。
このとき、固相化面１１に固相化する抗体１２として抗ＣＤ３抗体を用い、前述したように、固相化面１１における抗体１２の固相化の密度は、１０〜３００ｎｇ／ｃｍ２とすることが好ましく、１０〜４０ｎｇ／ｃｍ２とすることがより好ましい。
また、固相化面１１に対向する容器内面にも抗ＣＤ３抗体を固相化することによって、図４に示す培養容器１０ａを製造することができる。
このとき、抗ＣＤ３抗体を固相化面１１の０．０１〜０．９倍程度の密度により固相化することが好ましい。
このとき、抗ＣＤ３抗体を固相化面１１の０．０１〜０．９倍程度の密度により固相化することが好ましい。
さらに、このようにして抗体１２が固相化された培養容器１０（又は培養容器１０ａ）内に、溶液状の抗ＣＤ３抗体を培養面（固相化面１１）１ｃｍ２当たり０．２５〜４００ｎｇ且つ０．１〜８００μlの量で封入する。また、前述したように、溶液状の抗ＣＤ３抗体を、培養面１ｃｍ２当たり０．５〜３００ｎｇ且つ０．１〜６００μlの量で封入することがより好ましく、１〜２００ｎｇ且つ０．１〜４００μlの量で封入することがさらに好ましく、１〜２００ｎｇ且つ０．１〜２００μlの量で封入することがより一層好ましい。
以上説明したように、本実施形態によれば、抗体１２が固相化された固相化面１１を備えると共に、溶液状の抗ＣＤ３抗体が上記最適な量で封入された培養容器を得ることができる。そして、このような培養容器によって、リンパ球を従来よりも高効率で活性化することができ、リンパ球の増殖効率をより一層向上させることが可能である。
様々な濃度の抗体溶液を封入した培養容器を製造してリンパ球の活性化を行い、それぞれの培養容器によるリンパ球の増殖効率を確認した。具体的には、以下のように行った。
＜実験１＞
［培養容器の作製］
ラボプラストミル（東洋精機製作所製）を用いて低密度ポリエチレンを押出成形して厚み１００μｍのフィルムを成形し、インパルスシーラーで１１ｃｍ×２０．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。
［培養容器の作製］
ラボプラストミル（東洋精機製作所製）を用いて低密度ポリエチレンを押出成形して厚み１００μｍのフィルムを成形し、インパルスシーラーで１１ｃｍ×２０．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。
［抗体の固相化］
このバッグにエアー約２５０ｍｌを封入し、２０μｇの抗ＣＤ３抗体（タカラバイオ株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（抗体溶液，ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）２ｍｌを封入した。そして、バッグを揺動して、液滴を１０ｍ／分の速度で、２．５分間バッグ内面上で移動させた。次いで、抗体溶液を排出した後、リン酸緩衝液２ｍｌを封入して、１０ｍ／分の速度で２．５分間バッグ内面上で移動させ、排出することによって洗浄し、バッグ内面から遊離抗体を除去した。固相化された抗体量をＢＣＡ法にて測定した結果、３７ｎｇ／ｃｍ２の固相化量であった。
このバッグにエアー約２５０ｍｌを封入し、２０μｇの抗ＣＤ３抗体（タカラバイオ株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（抗体溶液，ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）２ｍｌを封入した。そして、バッグを揺動して、液滴を１０ｍ／分の速度で、２．５分間バッグ内面上で移動させた。次いで、抗体溶液を排出した後、リン酸緩衝液２ｍｌを封入して、１０ｍ／分の速度で２．５分間バッグ内面上で移動させ、排出することによって洗浄し、バッグ内面から遊離抗体を除去した。固相化された抗体量をＢＣＡ法にて測定した結果、３７ｎｇ／ｃｍ２の固相化量であった。
［活性化培養試験用バッグの作製］
抗体を固相化したバッグをインパルスシーラーで５ｃｍ×５ｃｍにリサイズし、活性化培養試験に用いるためのバッグを作製した。次に、培養時の遊離抗体の濃度が、それぞれ１０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌとなるように、抗ＣＤ３抗体を溶解したリン酸緩衝液（各々１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ）５０μｌを活性化試験用バッグに封入した。また、対照実験として、抗ＣＤ３抗体を溶解したリン酸緩衝液を封入しないバッグを準備した。
抗体を固相化したバッグをインパルスシーラーで５ｃｍ×５ｃｍにリサイズし、活性化培養試験に用いるためのバッグを作製した。次に、培養時の遊離抗体の濃度が、それぞれ１０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌとなるように、抗ＣＤ３抗体を溶解したリン酸緩衝液（各々１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ）５０μｌを活性化試験用バッグに封入した。また、対照実験として、抗ＣＤ３抗体を溶解したリン酸緩衝液を封入しないバッグを準備した。
［リンパ球の活性化工程］
リンパ球の一種であるヒト末梢血単核球（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＩＮＣ．製）８．２×１０５個を２％ウシ胎児血清（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）入りのＡＬｙＳ５０５Ｎ−７（株式会社細胞科学研究所）培地に懸濁して、細胞懸濁液を準備した。そして、細胞懸濁液５ｍｌをそれぞれ活性化培養試験用バッグに封入した。
リンパ球の一種であるヒト末梢血単核球（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＩＮＣ．製）８．２×１０５個を２％ウシ胎児血清（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）入りのＡＬｙＳ５０５Ｎ−７（株式会社細胞科学研究所）培地に懸濁して、細胞懸濁液を準備した。そして、細胞懸濁液５ｍｌをそれぞれ活性化培養試験用バッグに封入した。
これらのバッグを３７℃で１１６時間静置培養することで、リンパ球の活性化を行った（活性化培養工程）。そして、活性化培養の終了時にバッグにおける細胞数をカウントして、増殖倍率を算出した。その結果を図５に示す。
同図に示されるように、リンパ球の増殖倍率は、対照実験（固相化のみ）が４．３０倍であり、遊離抗体濃度１０ｎｇ／ｍｌが５．２４倍、同５０ｎｇ／ｍｌが５．２０倍、同１００ｎｇ／ｍｌが４．８８倍、同２００ｎｇ／ｍｌが３．７７倍、同５００ｎｇ／ｍｌが３．１８倍であった。
同図に示されるように、リンパ球の増殖倍率は、対照実験（固相化のみ）が４．３０倍であり、遊離抗体濃度１０ｎｇ／ｍｌが５．２４倍、同５０ｎｇ／ｍｌが５．２０倍、同１００ｎｇ／ｍｌが４．８８倍、同２００ｎｇ／ｍｌが３．７７倍、同５００ｎｇ／ｍｌが３．１８倍であった。
すなわち、遊離抗体濃度が１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの場合は、固相化された抗体のみにより活性化する場合よりも、増殖効率が向上していることが分かる。
これに対して、遊離抗体濃度が２００ｎｇ／ｍｌ以上の場合には、固相化された抗体のみにより活性化する場合よりも、増殖効率が低下していることが分かる。
このように、遊離抗体濃度が上記一定範囲の低濃度の場合には、リンパ球の増殖効率をより向上することができている。一方、遊離抗体濃度がより大きい場合には、リンパ球の活性化が阻害されて、増殖効率が低減したと考えられる。
これに対して、遊離抗体濃度が２００ｎｇ／ｍｌ以上の場合には、固相化された抗体のみにより活性化する場合よりも、増殖効率が低下していることが分かる。
このように、遊離抗体濃度が上記一定範囲の低濃度の場合には、リンパ球の増殖効率をより向上することができている。一方、遊離抗体濃度がより大きい場合には、リンパ球の活性化が阻害されて、増殖効率が低減したと考えられる。
＜実験２＞
培養容器における遊離抗体濃度が１０ｎｇ／ｍｌよりも小さい場合のリンパ球の増殖効率を確認するための実験を行った。培養容器の作製、及び抗体の固相化については、実験１と同様にして行った。
培養容器における遊離抗体濃度が１０ｎｇ／ｍｌよりも小さい場合のリンパ球の増殖効率を確認するための実験を行った。培養容器の作製、及び抗体の固相化については、実験１と同様にして行った。
［活性化培養試験用バッグの作製］
抗体を固相化したバッグをインパルスシーラーで５ｃｍ×５ｃｍにリサイズし、活性化培養試験に用いるためのバッグを作製した。次に、培養時の遊離抗体の濃度が、それぞれ５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌとなるように、抗ＣＤ３抗体を溶解したリン酸緩衝液（各々０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ）５０μｌを活性化試験用バッグに封入した。また、対照実験として、抗ＣＤ３抗体を溶解したリン酸緩衝液を封入しないバッグを準備した。
抗体を固相化したバッグをインパルスシーラーで５ｃｍ×５ｃｍにリサイズし、活性化培養試験に用いるためのバッグを作製した。次に、培養時の遊離抗体の濃度が、それぞれ５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌとなるように、抗ＣＤ３抗体を溶解したリン酸緩衝液（各々０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ）５０μｌを活性化試験用バッグに封入した。また、対照実験として、抗ＣＤ３抗体を溶解したリン酸緩衝液を封入しないバッグを準備した。
［リンパ球の活性化工程］
リンパ球の一種であるヒト末梢血単核球（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＩＮＣ．製）８．６×１０５個を２％ウシ胎児血清（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）入りのＡＬｙＳ５０５Ｎ−７（株式会社細胞科学研究所）培地に懸濁して、細胞懸濁液を準備した。そして、細胞懸濁液５ｍｌをそれぞれ活性化培養試験用バッグに封入した。
そして、これらのバッグを３７℃で１２２時間静置培養することで、リンパ球の活性化を行った。
リンパ球の一種であるヒト末梢血単核球（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＩＮＣ．製）８．６×１０５個を２％ウシ胎児血清（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）入りのＡＬｙＳ５０５Ｎ−７（株式会社細胞科学研究所）培地に懸濁して、細胞懸濁液を準備した。そして、細胞懸濁液５ｍｌをそれぞれ活性化培養試験用バッグに封入した。
そして、これらのバッグを３７℃で１２２時間静置培養することで、リンパ球の活性化を行った。
次に、活性化したリンパ球を抗体が固相化されていないディッシュ（コーニング製）に移し替え、適宜希釈操作を行って、１９２時間培養した（増幅培養工程）。そして、増幅培養の終了時にバッグにおける細胞数をカウントして、増殖倍率を算出した。その結果を図６に示す。
同図に示されるように、リンパ球の増殖倍率は、対照実験（固相化のみ）が７３倍であり、遊離抗体濃度５ｎｇ／ｍｌが１２５倍、同１０ｎｇ／ｍｌが１０３倍であった。
すなわち、遊離抗体濃度が５ｎｇ／ｍｌ及び１０ｎｇ／ｍｌの場合は、いずれも固相化された抗体のみにより活性化する場合よりも、増殖効率が大きく向上していることが分かる。
同図に示されるように、リンパ球の増殖倍率は、対照実験（固相化のみ）が７３倍であり、遊離抗体濃度５ｎｇ／ｍｌが１２５倍、同１０ｎｇ／ｍｌが１０３倍であった。
すなわち、遊離抗体濃度が５ｎｇ／ｍｌ及び１０ｎｇ／ｍｌの場合は、いずれも固相化された抗体のみにより活性化する場合よりも、増殖効率が大きく向上していることが分かる。
以上の通り、実験１及び実験２の結果によって、培養容器における遊離抗体濃度が５〜１００ｎｇ／ｍｌの場合、固相化された抗体のみにより活性化する場合よりも、増殖効率が向上できることが確認された。
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、培養容器の大きさ、リンパ球の種類、及び培地を実施例とは異なるものにするなど適宜変更することが可能である。
例えば、培養容器の大きさ、リンパ球の種類、及び培地を実施例とは異なるものにするなど適宜変更することが可能である。
本発明は、リンパ球を大量培養する場合に好適に利用することが可能である。
この明細書に記載の文献及び本願のパリ優先の基礎となる日本出願明細書の内容を全てここに援用する。
１０，１０ａ 培養容器
１１ 固相化面
１２ 抗体
１３ 抗体溶液
１４ チューブ
２０ リンパ球
３０ 培養液
１１ 固相化面
１２ 抗体
１３ 抗体溶液
１４ チューブ
２０ リンパ球
３０ 培養液
Claims (5)
- リンパ球を活性化させるための軟包材からなる袋状の培養容器であって、対向する容器内面の片面に抗ＣＤ３抗体が１０〜３００ｎｇ／ｃｍ２の密度で固相化された培養面を有しており、且つ、培養時に、前記培養容器内の遊離した抗ＣＤ３抗体の濃度が５〜１００ｎｇ／ｍｌとなるように遊離した抗ＣＤ３抗体が封入されていることを特徴とする培養容器。
- 前記対向する容器内面の片面に前記抗ＣＤ３抗体が１０〜４０ｎｇ／ｃｍ２の密度で固相化されていることを特徴とする請求項１記載の培養容器。
- 前記培養面に対向する容器内面に抗ＣＤ３抗体が前記培養面における密度よりも小さい密度で固相化されていることを特徴とする請求項１又は２記載の培養容器。
- リンパ球を活性化させるための軟包材からなる袋状の培養容器の製造方法であって、
対向する容器内面の片面に抗ＣＤ３抗体を１０〜３００ｎｇ／ｃｍ２の密度で固相化し、
培養時に、前記培養容器内の遊離した抗ＣＤ３抗体の濃度が５〜１００ｎｇ／ｍｌとなるように遊離した抗ＣＤ３抗体を封入する
ことを特徴とする培養容器の製造方法。 - 前記対向する容器内面の片面に前記抗ＣＤ３抗体が１０〜４０ｎｇ／ｃｍ２の密度で固相化されることを特徴とする請求項４記載の培養容器の製造方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2014261643 | 2014-12-25 | ||
| JP2014261643 | 2014-12-25 | ||
| PCT/JP2015/005805 WO2016103570A1 (ja) | 2014-12-25 | 2015-11-20 | 培養容器、及び培養容器の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2016103570A1 JPWO2016103570A1 (ja) | 2017-10-05 |
| JP6844260B2 true JP6844260B2 (ja) | 2021-03-17 |
Family
ID=56149644
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2016565879A Active JP6844260B2 (ja) | 2014-12-25 | 2015-11-20 | 培養容器、及び培養容器の製造方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10745659B2 (ja) |
| EP (1) | EP3239289B1 (ja) |
| JP (1) | JP6844260B2 (ja) |
| KR (1) | KR101985914B1 (ja) |
| CN (1) | CN107002018B (ja) |
| WO (1) | WO2016103570A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2703227T3 (es) * | 2013-12-18 | 2019-03-07 | Toyo Seikan Group Holdings Ltd | Recipiente de cultivo y método para el cultivo de linfocitos |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6352694B1 (en) * | 1994-06-03 | 2002-03-05 | Genetics Institute, Inc. | Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells |
| JPH07508711A (ja) | 1992-04-07 | 1995-09-28 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン | Ｃｄ２８経路免疫調節 |
| AU7107794A (en) | 1993-06-10 | 1995-01-03 | Regents Of The University Of Michigan, The | Cd28 pathway immunosuppression |
| JP2007175028A (ja) * | 2005-12-28 | 2007-07-12 | Koojin Bio Kk | 閉鎖系細胞培養容器、閉鎖系細胞培養用キット、及び閉鎖系細胞培養容器の製造方法 |
| JP2010099022A (ja) * | 2008-10-24 | 2010-05-06 | Takara Bio Inc | リンパ球の製造方法 |
| JP6043934B2 (ja) | 2008-10-31 | 2016-12-14 | 国立大学法人名古屋大学 | 抗原特異的細胞傷害性ｔ細胞の調製キット |
| JP5786444B2 (ja) * | 2011-05-17 | 2015-09-30 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 細胞培養方法、及び細胞培養システム |
| CN102433303B (zh) * | 2011-12-29 | 2013-02-20 | 辽宁迈迪生物科技有限公司 | 用于t淋巴细胞的体外培养方法 |
-
2015
- 2015-11-20 JP JP2016565879A patent/JP6844260B2/ja active Active
- 2015-11-20 EP EP15872148.0A patent/EP3239289B1/en active Active
- 2015-11-20 WO PCT/JP2015/005805 patent/WO2016103570A1/ja active Application Filing
- 2015-11-20 KR KR1020177015913A patent/KR101985914B1/ko active IP Right Grant
- 2015-11-20 CN CN201580067308.0A patent/CN107002018B/zh active Active
-
2017
- 2017-06-20 US US15/627,500 patent/US10745659B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3239289B1 (en) | 2023-04-12 |
| CN107002018B (zh) | 2019-12-03 |
| US10745659B2 (en) | 2020-08-18 |
| KR20170082612A (ko) | 2017-07-14 |
| KR101985914B1 (ko) | 2019-06-04 |
| CN107002018A (zh) | 2017-08-01 |
| WO2016103570A1 (ja) | 2016-06-30 |
| US20170283758A1 (en) | 2017-10-05 |
| EP3239289A4 (en) | 2018-09-05 |
| EP3239289A1 (en) | 2017-11-01 |
| JPWO2016103570A1 (ja) | 2017-10-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6661544B2 (ja) | 遺伝子改変したｔ細胞の自動生成法 | |
| JP5098471B2 (ja) | 細胞培養用トレイ状容器並びに同容器への収容物の充填方法 | |
| JP2017516745A (ja) | グラフェンのｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用 | |
| US8460930B2 (en) | Method for controlling proliferation of cord blood hematopoietic stem cells and use thereof | |
| JP2007175028A (ja) | 閉鎖系細胞培養容器、閉鎖系細胞培養用キット、及び閉鎖系細胞培養容器の製造方法 | |
| US20220127554A1 (en) | Culture container, method for culturing lymphocytes, culture-container production method, and solid-phasing apparatus | |
| Wang et al. | Cellular shellization: Surface engineering gives cells an exterior | |
| JP2005058103A (ja) | 閉鎖系細胞培養用容器及び該容器を用いた細胞の増殖培養方法、ならびに該培養方法を用いた免疫治療剤、細胞増殖培養用キット | |
| JP6844260B2 (ja) | 培養容器、及び培養容器の製造方法 | |
| Ha et al. | Rapid single-step growth of mof exoskeleton on mammalian cells for enhanced cytoprotection | |
| Santos et al. | Enhanced human T cell expansion with inverse opal hydrogels | |
| Yuan et al. | Ex vivo amplification of human hematopoietic stem and progenitor cells in an alginate three‐dimensional culture system | |
| JP6241257B2 (ja) | 培養容器、及びリンパ球の培養方法 | |
| WO2017028715A1 (zh) | 一种组织细胞培养装置 | |
| EP1953218B1 (fr) | Récipient destiné à la culture de cellules, notamment des lymphocytes T | |
| KR20230015896A (ko) | 3차원 바이오프로세서 | |
| Xing et al. | Permeability and metabolism of Ba-alginate encapsulated hepatocytes with gelatin and poly (vinyl alcohol) | |
| JP2015122960A (ja) | 培養容器の製造方法、及び固相化装置 | |
| JP2000106871A (ja) | 動物細胞の固定化方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170607 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20181019 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20191112 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20200110 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200310 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200804 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200831 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210126 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210208 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6844260 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |