JP2022500026A

JP2022500026A - 自己免疫有害事象および免疫チェックポイント遮断療法の遺伝的マウスモデル

Info

Publication number: JP2022500026A
Application number: JP2021513201A
Authority: JP
Inventors: スペンサーウェイ，; ジェイムズアリソン，
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 2018-09-11
Filing date: 2019-09-11
Publication date: 2022-01-04
Anticipated expiration: 2039-09-11
Also published as: WO2020055962A1; CN112654245B; EP3849305B1; CA3121855A1; EP3849305A1; EP3849305A4; JP7338894B2; US20220053740A1; CN112654245A

Abstract

心筋炎およびインスリン依存性糖尿病を含め、自己免疫に罹患し得る、Ｃｔｌａ４に関してはヘテロ接合性ノックアウトでありかつＰｄｃｄ１に関してはホモ接合性ノックアウトであるマウス（Ｃｔｌａ４＋／−Ｐｄｃｄ１−／−マウス）が、本明細書で提供される。このようなマウスを使用して、免疫関連有害事象を軽減する治療剤をスクリーニングする方法がまた、提供される。ヒト患者においてチェックポイント遮断によって誘導される自己免疫を再現する動物モデルが、本明細書で提供される。１つの実施形態において、マウスであって、そのゲノムが（ｉ）Ｃｔｌａ４遺伝子のヘテロ接合性機能喪失および（ｉｉ）Ｐｄｃｄ１遺伝子のホモ接合性機能喪失を含むマウスが提供される。１つの局面において、上記マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ遺伝子バックグラウンドを有する。いくつかの局面において、上記マウスは、雌性マウスである。

Description

本出願は、２０１８年９月１１日出願の米国仮特許出願第６２／７２９，９６５号（その全体は、本明細書に参考として援用される）の利益を主張する。

背景
１．分野
本発明は、一般に、免疫学の分野に関する。より詳細には、免疫チェックポイント遮断療法の結果として生じる自己免疫疾患病因論の動物モデル、および上記動物モデルを使用して、上記疾患病因論を軽減する因子をスクリーニングする方法に関する。

２．関連分野の説明
Ｔ細胞活性化は、自己を非自己から区別しかつ自己免疫を防止する能力を維持しながら、外来抗原に対して迅速かつ高感度な応答を生じることを可能にする、精巧に調節された生物学的プロセスである。この注目すべきプロセスの根底にある重要な概念は、多数の別個のシグナルが、ナイーブＴ細胞を十分に活性化する、または初回刺激するために要求されることである。これらのきっかけは、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）による同種抗原認識（シグナル１）およびＣＤ２８陽性共刺激（シグナル２）が挙げられる。ＣＤ２８陽性共刺激は、専門の抗原提示細胞によって提供されることから、これは、強いＴ細胞活性化のために細胞外部の要求を強いる。その次の重要な工程は、陰性共刺激（ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）であり、これは、シグナル１および２の阻害を通じてＴ細胞活性化を弱めるフィードバック調節機構である。ＣＴＬＡ４およびＰＤ−１は、別個の分子機構を通じてＴ細胞活性化を減弱する主要な陰性共刺激分子である。ＣＴＬＡ４は、ＣＤ２８陽性共刺激の競合的阻害を通じてＴ細胞活性化を減弱するが、ＰＤ−１は主に、ホスファターゼＳＨＰ２を介して、近くのＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）シグナル伝達を阻害するように作用する（Ｃｈｅｍｎｉｔｚら，２００４；Ｋｒｕｍｍｅｌ＆Ａｌｌｉｓｏｎ，１９９６；Ｐａｒｒｙら，２００５；Ｗａｌｕｎａｓら，１９９６）。近年の証拠は、ＰＤ−１がまた、ＣＤ２８陽性共刺激の阻害をもたらす（Ｈｕｉら，２０１７）こと、および関連して、ＣＤ２８シグナル伝達がＰＤ−１遮断に対する効果的な応答のために必要とされる（Ｋａｍｐｈｏｒｓｔら，２０１７）ことを示唆する。これは、ＣＤ２８を減弱することが、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ４媒介性Ｔ細胞調節の共有される機構であり得ることを示唆する。

Ｔ細胞活性化は概して、ＴＣＲおよび共刺激シグナルが活性化を誘発するために最小のレベルを満たさなければならない閾値モデルによって左右されると考えられる。ＰＤ−１およびＣＴＬＡ４陰性共刺激が、収束性の機能的調節をもたらすか否か、または代わりに、それらが、活性化閾値を定義するために別個の調節圧（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｐｒｅｓｓｕｒｅ）を発揮するか否かは、未知である。関連して、Ｔ細胞減弱化へのＣＴＬＡ４およびＰＤ−１の特異的機構の相対的な機能的寄与は不明確なままである。これらの別個の機構が、分子レベル、細胞レベル、および／または組織レベルで収束することは、起こり得る。例えば、分子レベルでは、ＣＴＬＡ４およびＰＤ−１は、ＣＤ２８の阻害を介して細胞内在的な様式でＴ細胞シグナル伝達を共調節し得る。細胞レベルでは、ＣＴＬＡ４およびＰＤ−１は、活性化に関して別個の動力学でＴ細胞を減弱し、そしてこのような時間的に分離した調節がまとまるか否かおよびどのようにしてまとまるかは、不明確である。従って、重大で解決のつかない基本的な問題は、ＣＴＬＡ４およびＰＤ−１陰性共刺激の別個の調節機構が、機能的に相互作用するか否かである。

抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−１療法は、多数の腫瘍タイプ、進行性黒色腫および腎細胞癌において有効である。しかし、免疫チェックポイント遮断療法は、重度の免疫関連有害事象、ならびに希な例では正真正銘の自己免疫（例えば、心筋炎およびＩ型糖尿病を誘導し得る。現在、チェックポイント遮断療法と関連する有害事象を忠実に再現する動物モデルは存在しない。チェックポイント遮断抗体（すなわち、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ−１）でのマウスの処置は、重大な病理をもたらさず、ヒト患者において認められる免疫関連有害事象の範囲、重篤度、およびタイプを忠実に再現しない。特に、これらのモデルは、チェックポイント遮断と関連する希な自己免疫疾患を再現しない。よって、チェックポイント遮断療法と関連する有害事象を再現する動物モデルは、必要とされる。

要旨
ヒト患者においてチェックポイント遮断によって誘導される自己免疫を再現する動物モデルが、本明細書で提供される。１つの実施形態において、マウスであって、そのゲノムが（ｉ）Ｃｔｌａ４遺伝子のヘテロ接合性機能喪失および（ｉｉ）Ｐｄｃｄ１遺伝子のホモ接合性機能喪失を含むマウスが提供される。１つの局面において、上記マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ遺伝子バックグラウンドを有する。いくつかの局面において、上記マウスは、雌性マウスである。いくつかの局面において、上記マウスは、雄性マウスである。

いくつかの局面において、上記Ｃｔｌａ４遺伝子のヘテロ接合性機能喪失型アレルは、上記Ｃｔｌａ４遺伝子もエキソン３へのネオマイシン耐性カセットのヘテロ接合性挿入としてさらに定義される。いくつかの局面において、上記Ｐｄｃｄ１遺伝子のホモ接合性機能喪失型アレルは、上記Ｐｄｃｄ１遺伝子のエキソン２およびエキソン３のホモ接合性欠失としてさらに定義される。１つの局面において、上記マウスは、Ｃｔｌａ４^{ｔｍ１Ａｌｌ}Ｐｄｃｄ１^{ｔｍ１．１Ｓｈｒ} マウスである。

いくつかの局面において、上記マウスは、自己免疫に罹患している。ある種の局面において、上記自己免疫は、心臓の自己免疫または膵臓の自己免疫である。１つの局面において、上記心臓の自己免疫は、心筋炎である。ある種の局面において、上記心筋炎は、劇症型心筋炎である。１つの局面において、上記膵臓の自己免疫は、インスリン依存性糖尿病またはリンパ球性膵炎である。いくつかの局面において、上記膵臓の自己免疫は、膵臓外分泌破壊または膵島破壊を生じる。いくつかの局面において、上記自己免疫は、リンパ球性心筋炎、動脈内膜炎、膵臓外分泌破壊、肺血管炎、脂肪組織萎縮（白色および褐色の両方）、肝臓の炎症、女性生殖器の萎縮、消化管の炎症、滑膜炎、または腎臓、唾液腺、涙腺もしくは胃のリンパ球浸潤である。

１つの実施形態において、本発明の実施形態のうちのいずれかのマウスから単離された細胞が提供される。いくつかの局面において、上記細胞は、免疫細胞である。いくつかの局面において、上記細胞は、Ｔ細胞である。

１つの実施形態において、本発明の実施形態のマウスにおいて少なくとも１種の候補因子をスクリーニングするための方法であって、上記方法は、１種またはこれより多くの候補因子を上記マウスに投与する工程を包含する方法が、提供される。いくつかの局面において、上記方法は、上記少なくとも１種の候補因子を、（ｉ）ホモ接合性野生型Ｃｔｌａ４遺伝子および（ｉｉ）Ｐｄｃｄ１遺伝子のホモ接合性機能喪失を含むマウス；（ｉ）ホモ接合性野生型Ｃｔｌａ４遺伝子および（ｉｉ）ホモ接合性野生型Ｐｄｃｄ１遺伝子を含むマウス；（ｉ）ホモ接合性野生型Ｃｔｌａ４遺伝子および（ｉｉ）Ｐｄｃｄ１遺伝子のヘテロ接合性機能喪失型アレルを含むマウス；（ｉ）Ｃｔｌａ４遺伝子のヘテロ接合性機能喪失型アレルおよび（ｉｉ）ホモ接合性野生型Ｐｄｃｄ１遺伝子を含むマウス；ならびに／または（ｉ）Ｃｔｌａ４遺伝子のヘテロ接合性機能喪失型アレルおよび（ｉｉ）Ｐｄｃｄ１遺伝子のヘテロ接合性機能喪失を含むマウス；ならびに／または（ｉ）Ｃｔｌａ４遺伝子のヘテロ接合性機能喪失型アレルおよび（ｉｉ）Ｐｄｃｄ１遺伝子のホモ接合性機能喪失型アレルを含むマウスにおいてスクリーニングする工程をさらに包含する。

いくつかの局面において、上記少なくとも１種の候補治療剤は、免疫関連有害事象または免疫関連状態を軽減するその能力に関してスクリーニングされる。いくつかの局面において、免疫関連有害事象または免疫関連状態の軽減は、免疫関連有害事象または免疫関連状態の発生を防止するとしてさらに定義される。いくつかの局面において、免疫関連有害事象または免疫関連状態の軽減は、上記免疫関連有害事象または免疫関連状態の重篤度を減少させるとしてさらに定義される。いくつかの局面において、免疫関連有害事象または免疫関連状態の軽減は、Ｃｔｌａ４ハプロ不全から生じる死亡率を軽減するとしてさらに定義される。いくつかの局面において、免疫関連有害事象または免疫関連状態の軽減は、全身性の免疫関連有害事象または免疫関連状態を軽減するとしてさらに定義される。いくつかの局面において、自己免疫の軽減は、器官特異的または組織特異的な自己免疫を軽減するとしてさらに定義される。いくつかの局面において、免疫関連有害事象または免疫関連状態の軽減は、上記免疫関連有害事象または免疫関連状態の重篤度を減少させるとしてさらに定義される。いくつかの局面において、免疫関連有害事象または免疫関連状態の軽減は、上記免疫関連有害事象または免疫関連状態が、マウスの集団において現れる頻度を減少させるとしてさらに定義される。いくつかの局面において、免疫関連有害事象または免疫関連状態の軽減は、上記免疫関連有害事象または免疫関連状態の発生を、またはその始まる時を遅らせるとしてさらに定義される。いくつかの局面において、候補治療剤のスクリーニングは、上記候補治療剤の有効性を試験するとして定義される。

いくつかの局面において、上記免疫関連有害事象または免疫関連状態は、例えば、急性炎症または慢性炎症のような炎症である。いくつかの局面において、上記免疫関連有害事象または免疫関連状態は、自己免疫または自己免疫状態である。いくつかの局面において、上記免疫関連有害事象または免疫関連状態は、ヒトにおいてチェックポイント遮断療法によって誘導される免疫関連有害事象または自己免疫を模倣する、免疫関連有害事象または免疫関連状態を含む。ある種の局面において、上記免疫関連有害事象または免疫関連状態は、心臓の自己免疫または膵臓の自己免疫である。１つの局面において、上記心臓の自己免疫は、例えば、劇症型心筋炎のような心筋炎である。１つの局面において、上記膵臓の自己免疫は、インスリン依存性糖尿病である。

いくつかの局面において、上記候補因子は、ＣＴＬＡ４−免疫グロブリン融合タンパク質（例えば、アバタセプトまたはそのマウスバージョン）、ステロイド、免疫細胞の特異的集団を除去する因子（例えば、ＣＤ４Ｔ細胞を除去する抗ＣＤ４抗体またはＢ細胞を除去する抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（例えば、リツキシマブ））、サイトカイン調節因子（例えば、トシリズマブ（ｔｏｃｌｉｚｕｍａｂ）またはそのマウスバージョン）、または免疫抑制剤である。いくつかの局面において、上記候補因子は、抗がん治療（例えば、化学療法、放射線療法、外科手術、キナーゼインヒビター、免疫療法、抗ＴＩＭ３、抗ＯＸ４０、腫瘍溶解性ウイルス、二重特異的抗体）であり、上記方法は、免疫関連有害事象を模倣する自己免疫に罹患しているマウスにおいて起こるさらなる有害事象に関してスクリーニングされる。上記スクリーニングは、免疫チェックポイント遮断と組み合わせた場合に、自己免疫または免疫関連有害事象の発生に関して不利なリスクプロフィールを有する治療剤を同定し得る。いくつかの局面において、上記候補因子は、病原体（例えば、片利共生性または感染性）、ストレス、傷害、および／または食事である。いくつかの局面において、上記候補因子は、腫瘍細胞（例えば、同系腫瘍細胞（例えば、Ｂ１６黒色腫、ＭＣ３８結腸癌、Ｌｅｗｉｓ肺癌）である。上記腫瘍細胞は、上記マウスに移植され得、上記免疫関連有害事象に対する得られる腫瘍の効果が特徴づけられ得る。試験される腫瘍特性としては、総腫瘍負荷、治療から生じる腫瘍溶解、腫瘍関連抗原の放出（例えば、腫瘍免疫としての照射した腫瘍細胞の注射）、または上記腫瘍の特異的特性（例えば、特異的遺伝子の特異的変異または活性）が挙げられ得る。

本明細書で使用される場合、「本質的にない」とは、特定の構成要素に関して、上記特定の構成要素が組成物へと目的を持って製剤化されていないおよび／または夾雑物としてまたは微量でのみ存在することを意味するために、本明細書で使用される。組成物の何らかの意図しない夾雑から生じる上記特定される構成要素の総量は、従って、０．０５％を十分に下回り、好ましくは０．０１％を下回る。上記特定の構成要素の量が、標準的な分析方法で検出できない組成物は、最も好ましい。

ここで本明細書において使用される場合、「１つの、ある（ａ）」または「１つの、ある（ａｎ）」は、１またはこれより大きい、を意味し得る。ここで請求項において使用される場合、文言「含む、包含する」とともに使用される場合、文言「１つの、ある（ａ）」または「１つの、ある（ａｎ）」は、１または１より大きい、を意味し得る。

請求項において用語「または」の使用は、選択肢のみに明示的に言及するのでなければ、またはその選択肢が相互に排他的であるのでなければ「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、選択肢および「および／または」のみに言及する定義を支持する。本明細書で使用される場合、「別の、もう１つの」とは、少なくとも第２のまたはこれより多い、を意味し得る。

本出願全体を通じて、用語「約」とは、１つの値が、デバイスに関して本質的な誤差の変動、上記値を決定するために使用される方法、または研究被験体の中で存在するバリエーションを含むことを示すために使用される。

本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、詳細な説明および具体例は、本発明の趣旨および範囲内の種々の変更および改変がこの詳細な説明から当業者に明らかになることから、本発明の好ましい実施形態を示すと同時に、例証によって与えられるに過ぎないことは、理解されるべきである。

本特許または本出願のファイルは、少なくとも１枚のカラー仕上げの図面を含む。この特許または特許出願公報のカラーズ面付きの写しは、請求および必要な料金の支払いをすれば、当局によって提供される。

図１Ａ〜Ｃ。Ｃｔｌａ４とＰｄｃｄ１との間の遺伝的相互作用は、致死的なハプロ不全表現型を明らかにする。（図１Ａ）Ｃｔｌａ４およびＰｄｃｄ１ノックアウトアレルを有するトランスジェニックＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスのカプラン・マイアー生存曲線（ｎ＝１３８全マウス（ｎ＝５Ｃｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^＋／＋、ｎ＝６Ｃｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^＋／−、ｎ＝３２Ｃｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−、ｎ＝１０Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^＋／＋、ｎ＝５０Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^＋／−、ｎ＝１４Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−、ｎ＝１４Ｃｔｌａ４^−／− Ｐｄｃｄ１^＋／＋、およびｎ＝７Ｃｔｌａ４^−／− Ｐｄｃｄ１^＋／−マウス））。マウスは、Ｐｄｃｄ１およびＣｔｌａ４機能喪失型アレルがｔｒａｎｓにあるＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^＋／−マウスのインタークロスに由来した。個々のマウスを、育種に使用される場合またはデータ分析時に生きている場合に打ち切った。死亡事象を、マウスの死亡が見出された場合、または安楽死を要すると動物スタッフが特定した場合と定義した。（図１Ｂ）雄性Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−および雌性Ｃｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−マウスの交配育種に由来するＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−（ｎ＝１０２）および同腹仔Ｃｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−（ｎ＝１０６）マウスのカプラン・マイアー生存曲線。（図１Ｃ）マウス性別（ｎ＝２４および２９、雄性および雌性Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−；ｎ＝３８および２２、雄性および雌性Ｃｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−）によって層別化したＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−および同腹仔Ｃｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−マウスのカプラン・マイアー生存曲線。０．０５未満のＭａｎｔｅｌ−Ｃｏｘログランクｐ値とのペアワイズ比較を、示す。

図２Ａ〜Ｄ。ＰＤ−１の非存在下でのＣｔｌａ４の単一アレル喪失は、５０％浸透度に伴う死亡率をもたらす。（図２Ａ）症候性Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−および同腹仔コントロールＣｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−マウスの全体重。（図２Ｂ）年齢の関数としてプロットしたＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−および同腹仔コントロールＣｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−マウスの全体重。安楽死を要すると特定されるＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスを、特定する。いかなる症状をも示さずに死亡していることが見出されたＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスの体重は、記録できなかったので、ここには含めなかった。（図２Ｃ）表現型が影響を受けない、年齢が４〜１０ヶ月齢のＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−、同腹仔コントロールＣｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−マウス、および症候性Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスの血清化学検査を、行った。有意に上昇したレベルのＡＬＴ、ＡＳＴ、およびＬＤＨは、症候性Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスにおいて観察された。（図２Ｄ）インビトロで刺激したＴ細胞における全ＣＴＬＡ４タンパク質レベルの代表的プロットを、フローサイトメトリーによって評価した。Ｃｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−マウスに由来するＴ細胞におけるＣＴＬＡ４発現レベルを破線としてプロットし、Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／− Ｔ細胞のものを実線としてプロットした、定量的データを図１０Ｄに示す。同上。

図３Ａ〜Ｅ。Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスは、多数の組織において自己免疫を発生させる。（図３Ａ）Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−およびＣｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−マウスのＨ＆Ｅ染色したＦＦＰＥ膵臓組織切片の画像。（図３Ｂ）Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−およびＣｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−マウスのＨ＆Ｅ染色したＦＦＰＥ心臓組織切片の画像。（図３Ｃ，上パネル）心臓および膵臓組織におけるリンパ球浸潤スコアの定量。（図３Ｃ，下パネル）膵臓および心臓組織切片における全Ｔ細胞の定量。（図３Ｄ）グラフは、心臓組織における全ＣＤ３およびリンパ球浸潤スコアの定量を示す。（図３Ｅ）パネルは、Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスの心臓組織の代表的組織画像を示す。低倍率のＨ＆Ｅ染色（左上）およびＣＤ３免疫組織化学（右上）画像を、示す。矢印は、免疫浸潤の例示的領域を示す。下の列：ＣＤ３（Ｔ細胞マーカー）、ＣＤ４（Ｔ細胞マーカー）、ＣＤ８（Ｔ細胞マーカー）、およびＦ４／８０（マクロファージマーカー）の免疫組織化学染色の高倍率での組織画像。これは、Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスの心臓組織へのこれらの細胞サブタイプの各々の浸潤の例である。同上。同上。

図４。Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスにおける免疫応答の分子的特徴付け。Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−およびＣｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−マウスのリンパ節、心臓および膵臓組織におけるＴＣＲ配列決定によって評価されるＴ細胞クローン性。

図５Ａ〜Ｆ。プロテオミクス分析は、Ｃｔｌａ４の１コピー喪失に起因する非常に微妙な分子変化を明らかにする。（図５Ａ）Ｃｔｌａ４^−／−、Ｃｔｌａ４^＋／−、およびＣｔｌａ４^＋／＋マウスのリンパ節のＲＰＰＡ分析の主成分分析プロット。（図５Ｂ）有意に調節されるタンパク質の発現を、二元の教師なしの階層的クラスター分析）によって体系化したヒートマップとして示した。（図５Ｃ〜Ｅ）野生型対ヘテロ接合性マウス（図５Ｃ）、野生型対Ｃｔｌａ４ノックアウト（図５Ｄ）、およびヘテロ接合性対Ｃｔｌａ４ノックアウトマウス（図５Ｅ）を比較するタンパク質発現のボルケーノプロット。（図５Ｆ）細胞周期と関連する特異的タンパク質の発現値を、マウスあたりを基本にしてプロットした。野生型マウスとヘテロ接合性マウスとの間でテューキーの多重比較ｐ＜０．０５を有するタンパク質を示す。同上。同上。同上。同上。同上。

図６Ａ〜Ｅ。転写分析は、機能的ＰＤ−１の文脈においてＣｔｌａ４の単一コピー喪失に起因する変化はほとんどまたは全くないことを明らかにする。（図６Ａ）Ｃｔｌａ４^−／−および同腹仔コントロールマウス（全てホモ接合性野生型Ｐｄｃｄ１）のリンパ節のＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ遺伝子発現分析の主成分分析プロット。（図６Ｂ）有意に調節されるタンパク質の発現を、二元の教師なしの階層的クラスター分析によって体系化したヒートマップとして示した。（図６Ｃ〜Ｅ）野生型対ヘテロ接合性マウス（図６Ｃ）、野生型対Ｃｔｌａ４ノックアウト（図６Ｄ）、およびヘテロ接合性対Ｃｔｌａ４ノックアウトマウス（図６Ｅ）を比較するタンパク質発現のボルケーノプロット。同上。同上。同上。同上。

図７。Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスは、ほぼ純粋なＣ５７ＢＬ６／Ｊ系統バックグラウンドに接しており、分離ＳＮＰｓは、病理と関連しない。病原性（影響あり）および非病原性（影響なし）Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスの系統バックグラウンドを評価する１００−ＳＮＰパネル。全ての試験したマウスは、９７〜１００％Ｃ５７ＢＬ６／Ｊアレルを有した。同上。同上。同上。同上。

図８。分離ＳＮＰｓは、Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスの病理と関連しない。全てのマウスにわたる非ホモ接合性Ｂ６アレルの頻度を、試験した各ＳＮＰに関して示す。非ホモ接合性Ｂ６遺伝子座を、Ｂ６／１２９に関してヘテロ接合性または１２９アレルに関してホモ接合性のいずれかとして定義する。

図９Ａ〜Ｂ。Ｃｔｌａ４およびＰｄｃｄ１の複合機能喪失型アレルを有するトランスジェニックマウスの生成および特徴付け。（図９Ａ）Ｃｔｌａ４およびＰｄｃｄ１機能喪失型変異アレルの全ての潜在的組み合わせを生成する育種スキームの模式図。（図９Ｂ）クラスＩ（死亡する前に臨床症状を示したマウス）およびクラスＩＩ（症状を示す前に死亡したマウス）のＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスの死亡年齢。

図１０Ａ〜Ｄ。Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスの広い組織学的特徴付けは、多数の組織の自己免疫を明らかにする。（図１０Ａ）組織における免疫浸潤のスコアを、Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−および同腹仔コントロールマウスの組織学分析に基づいて示した。（図１０Ｂ）組織学によって分析した肝臓組織の面積あたりの肝壊死および／または炎症の病変の数。（図１０Ｃ）Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−および同腹仔コントロールマウスにおける肺脂肪組織萎縮のスコア。（図１０Ｄ）インビトロで刺激したＴ細胞における全ＣＴＬＡ−４タンパク質レベルの定量をフローサイトメトリーによって評価した。Ｃｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−マウスに由来するＴ細胞におけるＣＴＬＡ−４発現レベルを点線としてプロットし、Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／− Ｔ細胞のものを実線としてプロットする。同上。

図１１Ａ〜Ｂ。Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスにおける心臓および膵臓組織の病理。（図１１Ａ）グラフは、膵臓組織からのさらなる組織定量を示す。（図１１Ｂ）グラフは、血清抗体濃度の定量を示す。同上。

図１２Ａ〜Ｄ。Ｃｔｌａ４の単一アレル喪失は、減少したＣＴＬＡ−４タンパク質をもたらす。（図１２Ａ〜Ｄ）Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−、同腹仔Ｃｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−、およびＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスに由来するＣＤ８Ｔ細胞（ＡおよびＢ）およびＣＤ４Ｔ細胞（ＣおよびＤ）における全ＣＴＬＡ−４のフローサイトメトリー分析。

詳細な説明
Ｔ細胞活性化は、陰性共刺激を含む広い範囲の機構を介して厳密に調節されるが、個々の分子メディエーターが機能的に相互作用する程度は、不明確なままである。ＣＴＬＡ４およびＰＤ−１は、別個の分子機構および細胞機構を利用するＴ細胞活性化の重要な負の調節因子である。ＣＴＬＡ４およびＰＤ−１は、ともにＴ細胞の陰性共刺激分子であり、その機能は、Ｔ細胞活性を減弱することである。これらの分子は、別個の分子機構を利用して、これらの機能を実行する。これらの分子機構は、大部分は別個の細胞シグナル伝達経路によって媒介される（Ｗｅｉら，２０１８）。ＣＴＬＡ４の主な機能は、Ｂ７リガンドの結合（Ｂ７−１／ＣＤ８０、Ｂ７−２／ＣＤ８６）に関して競合することであり、これは、ＣＤ２８陽性共刺激および下流のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達における低減をもたらす。ＰＤ−１の主な機能は、そのリガンドＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２への結合の際に、近くのＴ細胞レセプターシグナル伝達を阻害することである；しかし、ＣＤ２８シグナル伝達の阻害はまた、ＰＤ−１の顕著な機能として報告されている（Ｈｕｉら，２０１７）。抗体媒介性遮断は、リガンド結合を防止することによって、これらの機能を阻害する。シグナル伝達能力のこの喪失および結論としての下流の生物学的事象は、Ｃｔｌａ４およびＰｄｃｄ１の機能喪失型アレルの組み合わせを経る遺伝的手段によってモデル化され得る。

本発明者らは、ＣＴＬＡ４およびＰＤ−１によって課される調節機構が、機能的に非依存性であるかまたは依存性であるかを理解しようとし、マウスにおいてＣｔｌａ４とＰｄｃｄ１（ＰＤ−１をコードする）との間の遺伝的相互作用の証拠を見出した。Ｐｄｃｄ１の完全な遺伝的非存在の文脈におけるＣｔｌａ４の単一アレル喪失は、マウスのうちのおよそ半数において死亡をもたらした。死亡率は、膵臓および心臓を含む多数の組織における自己免疫によって引き起こされた（例えば、図３Ｅを参照のこと）。対照的に、同腹仔Ｃｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−またはＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^＋／−では、死亡または重篤な表現型は観察されなかった。これらのデータは、Ｃｔｌａ４がＰｄｃｄ１ヌルバックグラウンドの文脈において条件付きのハプロ不全を示すことを明らかにする。合わせると、これらの所見は、ＣＴＬＡ４およびＰＤ−１が機能的に相互作用し、陰性共刺激分子が用量依存性かつ相加的様式で、Ｔ細胞活性化を減弱する閾値モデルを支持することを示す。

この動物モデルは、疾患病因論の研究および免疫関連有害事象の生成を調節する因子の同定を可能にする。この動物モデルは、心臓および膵臓（ならびに他の器官）において自己免疫を発生させ、これは、致命的な心筋炎（心臓の炎症）およびＩ型糖尿病（膵臓の自己免疫破壊）がヒト患者において抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−１併用療法と関連する希であるが非常に重度のな合併症の２つのタイプであることから、重要である。このモデルはまた、チェックポイント遮断と関連する自己免疫有害事象の他のタイプ（例えば、消化管）をモデル化することができるようである。記載されるトランスジェニックマウスモデルは、抗ＣＴＬＡ４と抗ＰＤ−１免疫チェックポイント遮断（すなわち、Ｔ細胞共刺激レセプターＣＴＬＡ４およびＰＤ−１を標的化するモノクローナル抗体の処置）との併用のモデルとして使用され得る。ＰＤ−１の遺伝的喪失およびＣＴＬＡ４の単一コピー喪失は、陰性共刺激活性が低減され、モデル化される類似のシナリオにおいてこの治療をモデル化する。従って、ＣＴＬＡ４およびＰＤ−１を調節するこの遺伝的モデルは、チェックポイント遮断療法に起因する免疫関連有害事象の現象を再現する。これは、チェックポイント遮断療法と関連する有害事象を忠実に再現する動物モデルは現在存在しないことから、特に注目に値する。抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−１チェックポイント遮断併用療法は、黒色腫および腎細胞癌の処置に関して（２５０超の進行中の臨床試験とともに）現在承認されている。

さらに、このマウス系統バックグラウンドは、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊであり、これは、腫瘍免疫学研究のためにこのバックグラウンドの広範囲にわたる使用が原因で、および同様に、このバックグラウンドが通常、自己免疫を誘導することが非常に困難であることから、注目に値する。これは、この表現型が高い生物学的障壁を満足させることを示唆する。また、外因性抗原を導入しなかった（例えば、トランスジェニックウイルス）ので、この自己免疫を駆動するように認識されている抗原は、チェックポイント遮断療法を受ける患者の状況においてあてはまると推測されるように、自己抗原である。さらに、自己免疫および免疫関連疾患病因論の多数のタイプがこの動物モデルにおいて起こることから、これは、これらの疾患の間の関係性の調査を可能にする。

従って、このマウスモデルは、これら有害事象がどのように誘導されるかを理解するために、ならびにこのような有害事象および自己免疫を軽減することを目的とする治療の有効性を試験するために使用され得る。このような調査は、治療有効性を保持しかつ有害事象、特に、希で非常に重篤な自己免疫の誘導を低減する次世代の免疫療法をデザインするためにおそらく必要である。

Ｉ．本発明の局面
Ｔ細胞陰性共刺激遺伝子Ｃｔｌａ４とＰｄｃｄ１（ＰＤ−１をコードする）との間の遺伝的相互作用は、本明細書で同定される。この遺伝的相互作用は、Ｐｄｃｄ１の完全な非存在下の文脈においてＣｔｌａ４の条件付きハプロ不全として現れ、これは、致命的な全身性の自己免疫をもたらす。根本的な観点から、この観察は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）シグナル混乱の多数の原因が、異常なＴ細胞活性化を生じる可能性が増し得るＴ細胞活性化の閾値モデルを支持する。これは、ＣＴＬＡ４およびＰＤ−１調節シグナルが機能的に統合され、一緒に重大な緩和システムを提供して、Ｔ細胞活性化を抑制することを示す。分子レベルでは、Ｐｄｃｄ１およびＣｔｌａ４の併用遺伝子投与量の減少は、細胞に内在する様式で、Ｔ細胞活性化を減弱する全体的な能力を制限し得る

Ｔ細胞活性化の基本的機構への重要な洞察に加えて、これらの所見は、がん免疫チェックポイント遮断の状況において注目に値する臨床的関与を有する。抗ＣＴＬＡ４と抗ＰＤ−１との併用療法は、進行性黒色腫および腎細胞癌を含む多数の腫瘍タイプにおいて有効である。抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−１免疫チェックポイント遮断は、別個の細胞機構を利用することが公知である（Ｄａｓら，２０１５；Ｗｅｉら，２０１７）。本発明の所見の文脈の中で解釈すると、これらの別個の細胞機構は、おそらく機能的に相互作用し、これは、部分的には、単剤療法に対する併用療法の増強された有効性を説明し得る（Ｃｕｒｒａｎら，２０１０；Ｐｏｓｔｏｗら，２０１５；Ｗｏｌｃｈｏｋら，２０１３）。本発明の所見にさらにより関連して、免疫チェックポイント遮断療法は、重度の免疫関連有害事象および希な場合には、正真正銘の自己免疫（例えば、心筋炎およびＩ型糖尿病）を誘導し得る。Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスは、前臨床的動物モデルを提供し、これを用いて、ＣＴＬＡ４およびＰＤ−１シグナル伝達の喪失によって誘導される自己免疫を研究する。これは、このモデルにおいて観察される自己免疫が、ヒト患者において抗ＣＴＬＡ４と抗ＰＤ−１との併用チェックポイント遮断療法の後に生じ得る心筋炎およびＩ型糖尿病を厳密に反映することを考慮すれば、特に注目に値する。さらなる機械論的理解は、免疫チェックポイント遮断療法の有効性および有害事象を媒介する免疫学的応答の局面を区別しかつ特異的に調節する可能性を提供する。

興味深いことに、Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスにおいて発生する自己免疫は、特定の解剖学的部位において繰り返し現れる。特定の組織部位が、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ４シグナル伝達の喪失によって誘導される自己免疫に対してより高感度である理由は、重大で解決のつかない問題のままである。これらの部位に由来する組織特異的抗原は、陰性共刺激の非存在下での自己免疫認識に特に罹りやすくすることが考えられる。あるいは、組織感受性は、以前に観察されている組織特異的Ｔ_ｒｅｇ集団間の機能的差異に起因することが考えられる（Ｌｅｇｏｕｘら，２０１５）。

とりわけ、ＣＴＬＡ４のヘテロ接合性生殖系列機能喪失型アレルは、非常に変化しやすい臨床像を伴う免疫調節異常をもたらす（Ｋｕｅｈｎら，２０１４；Ｓｃｈｕｂｅｒｔら，２０１４）。これは、ヒトにおけるＣＴＬＡ４の単一コピー喪失が病原性であり、さらに、他の遺伝的および／または環境的因子との遺伝的相互作用を強く示唆する。ヒトまたはマウスにおけるＣＴＬＡ４の単一コピー喪失（ＰＤ−１の非存在下で）は、Ｔ細胞活性化閾値を、トニックＴＣＲシグナル伝達が到達し得るレベルへと低下させ、従って、確率論的プロセスは、ＣＴＬＡ４欠損ヒトおよびマウスにおける臨床像の相違を説明し得ることも考えられる。未解決の問題は、他のＴ細胞共刺激分子またはそれらの機能に関与する分子が、Ｐｄｃｄ１およびＣｔｌａ４と遺伝的に相互作用する程度である。例えば、ＬＲＢＡ（ＣＴＬＡ４トラフィッキングの重要な調節因子）の機能喪失型アレルを有する患者は、機能喪失型ＣＴＬＡ４を有する患者と類似の自己免疫表現型を示す（Ｂｅｓｎａｒｄら，２０１８；Ｈｏｕら，２０１７）。

ＣＴＬＡ４とＰＤ−１との間の遺伝的相互作用の重要な所見に加えて、本発明の所見はまた、Ｃｔｌａ４およびＰｄｃｄ１の同時の遺伝的欠損が、胚致死性であることを示唆する。これは、αβ Ｔ細胞が、生後まで出現しないことを考慮すれば、驚くべきことである（ＨａｖｒａｎａｎｄＡｌｌｉｓｏｎ，１９８８）。これが起こる機構は不明確なままであるが、２つの大きな可能性が存在する。それら可能性はともに、極めて興味をそそるものである。第１の可能性は、ＣＴＬＡ４およびＰＤ−１がγδ Ｔ細胞の活性化を拘束することである。これは、胚発生の間にＥ１４程度の早さで出現する。第２の可能性は、ＣＴＬＡ４およびＰＤ−１が、発生の間に未だ同定されていない非免疫学的機能を有し得ることである。

結論として、本発明の所見は、Ｃｔｌａ４とＰｄｃｄ１との間の遺伝的相互作用を明らかにする。これは、ＣＴＬＡ４およびＰＤ−１の調節機構の間の機能的相互作用に関する決定的な証拠を提供する。さらに、これは、抗ＣＴＬＡ４と抗ＰＤ−１との併用免疫チェックポイント遮断療法によって誘導される免疫関連有害事象をモデル化する強い動物を提供する。

ＩＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含められる。以下の実施例の中で開示される技術が、本発明の実施において十分に機能することが本発明者らによって発見された技術を表し、従って、その実施のために好ましい態様を構成すると考えられ得ることは、当業者によって認識されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、多くの変更が、開示される具体的実施形態の中で行われ得、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、同様のまたは類似の結果をなお得ることができることを認識するべきである。

材料および方法
マウス。Ｃｔｌａ４^{ｔｍ１Ａｌｌ}マウス（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，１９９７）を、ＴｈｅＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（０２１１５７）から購入したＰｄｃｄ１ノックアウトマウス（Ｐｄｃｄ１^{ｔｍ１．１Ｓｈｒ}）（Ｋｅｉｒら，２００７）に交配した。Ｐｄｃｄ１ノックアウトマウスを、この交配の前にＣ５７ＢＬ／６Ｊに一度戻し交配した。得られたＦ１Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^＋／−マウスを、インタークロスして、その２つの遺伝子の野生型および変異アレルの全ての可能な組み合わせを生成した。この第１の育種スキームは、Ｃｔｌａ４^＋／−（これは、Ｐｄｃｄ１に関して野生型である）およびＰｄｃｄ１^−／−マウス（これは、Ｃｔｌａ４に関して野生型である）の交配から得られるＦ１マウスを具体的に利用した。この育種スキームは、Ｆ１マウスにおけるＣｔｌａ４およびＰｄｃｄ１の変異アレルがｔｒａｎｓにあり、従って、組換え頻度が計算され得ることを担保する（図９Ａ）。Ｃｔｌａ４とＰｄｃｄ１との間の遺伝的距離を、この交配における組換え数および全事象を評価することによって計算した。その観察された組換え頻度１７．０３ｃＭは、ＭｏｕｓｅＰｈｅｎｏｍｅＤａｔａｂａｓｅ（ＭＰＤ，ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿００３２１２）によって報告されるＣｔｌａ４とＰｄｃｄ１との間の１６．８９センチモルガン遺伝的距離と密接に並んだ（Ｂｏｇｕｅら，２０１８）。これの予測された遺伝的距離は、この育種スキームにおいて観察された組換え頻度と一致した。

上記第１の育種スキームからの所見を検証するために、第２の関連する育種スキームを利用した。重要なことには、この育種アプローチは、異なる遺伝子型を利用し、その変異アレルは、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓのいずれかにあり得るので、そのアプローチは、Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−（実験用）およびＣｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−（コントロール同腹仔）を１：１比で生成する。これは、最初の育種アプローチにおけるより多くのＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスの生成を可能にする。具体的には、雄性Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−および雌性Ｃｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−を育種した。雌性Ｃｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−を使用して、Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−において観察される自己免疫が、致死的な母子間寛容または生存できる同腹仔を生じる能力に影響を与え得る可能性を排除する。

生存曲線の生成のために、事象を、死亡（すなわち、マウスが死亡していると見出された）または安楽死を要すると動物スタッフによってマウスが同定される（例えば、不活発、瀕死状態、呼吸困難に起因する）のいずれかとして定義した。安楽死を要すると特定されたマウスに関しては、死亡日を、そのマウスが動物スタッフによって知らされた日として定義した。死亡率と関連する動物表現型を同定し、動物スタッフが報告した。育種のために利用したマウスを、この目的のためにそれらを利用した時点で生存分析から打ち切った。

全てのマウスを、ＴｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｘａｓＭＤＡｎｄｅｒｓｏｎＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒＳｏｕｔｈＣａｍｐｕｓＶｉｖａｒｉｕｍ、ＡＡＡＬＡＣ認定の特定病原体のない動物施設において飼育した。全ての実験を、ＴｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｘａｓＭＤＡｎｄｅｒｓｏｎＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒ動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）ガイドラインに従って行った。

遺伝子型決定。ゲノムＤＮＡを、Ｄｉｒｅｃｔ−ｔｏ−ＰＣＲ消化ミックスを使用して単離し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの遺伝子型決定を、Ｃｔｌａ４およびＰｄｃｄ１ノックアウトマウスに関して行った。プライマーを表１に提供する。Ｃｔｌａ４^{ｔｍ１Ａｌｌ}マウスを、以前に記載されるように遺伝子型決定した（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，１９９７）。Ｃｔｌａ４野生型および変異アレルに関して予測されるバンドサイズは、それぞれ、約７５および約１５０ｂｐである。Ｐｄｃｄ１ノックアウトマウスを、以前に記載されるように遺伝子型決定した（Ｋｅｉｒら，２００７）。Ｐｄｃｄ１野生型および変異アレルに関して予測されるバンドサイズは、それぞれ、４１８および３５０ｂｐである。

ＳＮＰタイピング。粗製ゲノムＤＮＡ溶解物を、１００マーカーパネルを使用するＳＮＰタイピングのために、ＴｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｘａｓＭＤＡｎｄｅｒｓｏｎＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＧｅｎｅｔｉｃｓＳｅｒｖｉｃｅｓコア施設に提出した。遺伝的改変体が自己免疫と関連するか否かを決定する目的で、「影響なし」マウスを、いかなる症状をも現さなかったかまたは６ヶ月齢以内に死亡しなかったマウスとして定義し、「影響あり」マウスを、症状を現し、疾患のために死亡したクラスＩマウスとして定義した。

病理分析。動物剖検を、ＴｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｘａｓＭＤＡｎｄｅｒｓｏｎＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒ獣医学組織研究室またはＡｌｌｉｓｏｎ研究室において職員が行った。ＣｏｂａｓＩｎｔｅｇｒａ４００Ｐｌｕｓ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒｉｓｃｈ−Ｒｏｔｋｒｅｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用する自動化血清化学分析を、安楽死時に集めた血液サンプルに対して行った。ホルマリン固定組織を、パラフィンブロックへと慣用的に処理し、５ミクロンの切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。さらなる切片を、ＣＤ３に対して指向される抗体（ａｂ１６６６９，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、続いて、色素生成検出のための二次試薬（ＢｏｎｄＰｏｌｙｍｅｒＲｅｆｉｎｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ，ＤＳ９８００，Ｌｅｉｃａ，ＢｕｆｆａｌｏＧｒｏｖｅ，ＩＬ）を使用して、目的の特定の組織の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色のために使用した。染色した切片を、ＬｅｉｃａＤＦＣ４９５カメラおよびＬｅｉｃａＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＳｕｉｔｅｖ４．１２ソフトウェア付きのＬｅｉｃａＤＭ２５００顕微鏡を使用して、獣医病理学者が調べた。組織変化を、０＝病変なしから４＝重篤な病変までの半定量的スケールを使用してスコア付けした。

フローサイトメトリー。プラスチックシリンジの後ろを使用して、７０μｍフィルターを通して、プールした鼠径リンパ節、腋窩リンパ節、および上腕リンパ節をすり潰すことによって、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリンストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０の中に、リンパ節に由来する単一細胞懸濁物を調製した。９６ウェル平底プレートに、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３εおよび２μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８を前夜に４℃において一晩、２００μｌ／ウェルでコーティングした。次いで、細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎキットで製造業者のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃ３４５５７）に従って染色した。各サンプルについて３連で、１０％ＦＢＳ、ピルビン酸ナトリウム、０．１％ｂ−ＭＥ、およびＰ／Ｓを補充した２００μｌのＲＰＭＩ−１６４０中、１ウェルあたり１０^６細胞／ｍＬをプレートし、３７℃で４６時間インキュベートした。次いで、細胞をＵ底９６ウェルプレートに移し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、２％の各ウシ、マウス、ラット、ハムスター、およびウサギ血清ＰＢＳと、２５ｍｇ／ｍＬ２．４Ｇ２抗体とともに、４℃で１０分間インキュベートし、その後、５０ｍＬ容積において、抗体カクテルで４℃において３０分間、表面染色した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次いで、ＦｏｘＰ３固定および透過化キットを使用して、製造業者のプロトコール（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して固定および透過化した。細胞を、その後、室温において３０分間、細胞内抗体カクテルで染色した。次いで、細胞を、Ｆｏｘｐ３透過化緩衝液で２回、次いで、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＬＳＲＩＩ（ＢＤ）で分析した。

表面染色（ｒｅｓｔｉｍ）のために、以下の抗体を使用した：ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ^ＴＭＦｉｘａｂｌｅＢｌｕｅＤｅａｄＣｅｌｌＳｔａｉｎＬ２３１０５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）；ＢＶ７８６ハムスター抗マウスＣＤ３ｅ（クローン１４５−２Ｃ１１，５６４３７９（ＢＤ））；ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ６０５抗マウスＴＣＲ β鎖抗体（クローン）Ｈ５７−５９７，１０９２４１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ））；ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ６５０抗マウスＣＤ１９抗体（クローン６Ｄ５，１１５５４１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ））；ＦＩＴＣ抗マウスＣＤ４抗体（クローンＲＭ４．５，１１−００４２−８２（ｅｂｉｏ））；ＰＥ抗マウスＣＤ１５２抗体（クローンＵＣ１０−４Ｂ９，１０６３０６（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ））；ＰＥアルメニアンハムスターＩｇＧアイソタイプコントロール抗体（クローンＨＴＫ８８８，４００９０８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）；ＡＰＣ抗マウスＣＤ８ａ抗体（クローン５３−６．７，１７−００８１−８２（ｅｂｉｏ））；およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００抗マウスＣＤ４５．２抗体（クローン１０４，５６−０４５４−８２（ｅｂｉｏ））。ＩＣ染色（ｒｅｓｔｉｍ）に関しては、以下の抗体を使用した：ＢＶ７８６ハムスター抗マウスＣＤ３ｅ（クローン１４５−２Ｃ１１，５６４３７９（ＢＤ））；ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ６０５抗マウスＴＣＲ β鎖抗体（クローンＨ５７−５９７，１０９２４１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ））；ＦＩＴＣ抗マウスＣＤ４抗体（クローンＲＭ４．５，１１−００４２−８２（ｅｂｉｏ））；ＰＥ抗マウスＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）抗体（クローンＵＣ１０−４Ｂ９，１０６３０６（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ））；ＰＥアルメニアンハムスターＩｇＧアイソタイプＣＴＬＡ−４コントロール抗体（クローンＨＴＫ８８８，４００９０８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ））；およびＡＰＣ抗マウスＣＤ８ａ抗体（クローン５３−６．７，１７−００８１−８２（ｅｂｉｏ））。

Ｌｕｍｉｎｅｘサイトカインおよびケモカイン評価。Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−およびコントロール同腹仔マウス（上記の育種スキーム両方からのＣｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−マウスおよびＣＴＬＡ４およびＰＤ−１の両方の能力があるマウス（例えば、Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^＋／−マウス）の両方が挙げられる）から血清を集めた。簡潔には、血液を末端心臓穿刺によって集め、室温において凝固させ、８，０００ｇにおいて１０分間遠心分離し、上清の血清を集め、液体窒素中で急速凍結し、その後、−８０℃で貯蔵した。抗体、サイトカインおよびケモカインの血清レベルを、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ＆Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ３６−ｐｌｅｘＭｏｕｓｅＰｒｏｃａｒｔＰｌｅｘｌｕｍｉｎｅｘａｓｓａｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、製造業者のプロトコールに従って評価した。全てのサンプルを、各それぞれの分析のために単一のバッチにおいて並行して分析した。血清サンプルを、血清抗体レベルの分析のために１：１０，０００希釈した。

逆相プロテオミックアレイ分析。１６日齢Ｃｔｌａ４ノックアウトおよび同腹仔コントロールマウスのリンパ節を、その後の分析のために急速凍結した。組織サンプルを、プロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ，０５０５６４８９００１）およびホスファターゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ，０４９０６８３７００１）を新鮮に添加した状態の１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍＭＥＧＴＡ、１００ｍＭＮａＦ、１０ｍＭピロリン酸Ｎａ、１ｍＭＮａ_３ＶＯ_４、１０％グリセロールの中で溶解し、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓホモジナイザー（ＢｅｒｔｉｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用してホモジナイズした。サンプルを、アレイプリントおよび分析の前に、サンプル緩衝液（１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、６２．５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＢＭＥ，ｐＨ６．８）中で希釈した。シグナルを、Ａｒｒａｙ−ＰｒｏＡｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を使用して定量し、ＭＤＡｎｄｅｒｓｏｎＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒｆｏｒｔｈｅＲＰＰＡＣｏｒｅＦａｃｉｌｉｔｙにおいて開発された「Ｓｕｐｅｒｃｕｒｖｅｆｉｔｔｉｎｇ」アプローチを使用して正規化した。正規化した線形値を、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）において、不等分散を想定する両側Ｔ検定を使用して分析し、Ｐｒｉｓｍ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してプロットした。

ＮａｎｏｓｔｒｉｎｇｍＲＮＡ分析。Ｃｔｌａ４ノックアウトおよび同腹仔コントロールマウスのリンパ節を解剖した。ＲＮＡを、（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してリンパ節から抽出した。１００ｎｇＲＮＡを、ｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォーム（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）上のＭｏｕｓｅＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＣｏｄｅセットパネルを使用して分析した。上記パネル内のハウスキーピング遺伝子を使用して、サンプルベースあたりで値を正規化した。Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ遺伝子発現のヒートマップおよびＲＰＰＡプロテオミクスデータを、Ｐｅａｒｓｏｎ距離マトリクスおよびウォードの最小分散法を利用してＲにおいて生成した。差次的に発現された遺伝子のみ（遺伝子型間での一元配置ＡＮＯＶＡ比較で５％という偽発見率によって定義）をプロットした。

統計学。別段注記されなければ、Ｐｒｉｓｍ７．０または８．０（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）で統計分析を行った。ＲＰＰＡデータの正規化した線形値を、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）において、不等分散を想定する両側Ｔ検定を使用して分析し、プロットした。

実施例１ − Ｐｄｃｄ１の遺伝的非存在下でのＣｔｌａ４の致死的ハプロ不全
Ｃｔｌａ４とＰｄｃｄ１との間の遺伝的相互作用が存在するか否かを試験するために、Ｃｔｌａ４およびＰｄｃｄ１（ＰＤ−１をコードする）ノックアウトトランスジェニックマウスを交配した。マウスＣｔｌａ４およびＰｄｃｄ１は、ＭｏｕｓｅＰｈｅｎｏｍｅＤａｔａｂａｓｅからの予測に基づいて、１６．８９ｃＭの遺伝的距離で遺伝的に連鎖する（Ｂｏｇｕｅら，２０１８）。ヘテロ接合性インタークロス育種スキーム（材料および方法を参照のこと）を使用した。これは、単交雑に由来する変異アレルの全ての考えられる並べ替えの生成および１７．０３ｃＭにおいてＣｔｌａ４とＰｄｃｄ１との間で観察された組換え頻度の予測を可能にした。驚くべきことに、Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−のうちのおよそ５０％が、３ヶ月齢以内に自然に死亡した（図１Ａ）。対照的に、関連するコントロール同腹仔（例えば、Ｃｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−およびＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^＋／−）は、明白な表現型を示さず、これらの群において死亡は観察されなかった。Ｃｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−マウスにおいて明白な表現型がないことと、以前の観察とは一致する（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら，１９９９）。さらに、Ｃｔｌａ４^−／− Ｐｄｃｄ１^＋／＋マウスの全ての死亡は、ＣＴＬＡ４欠損マウス系統の最初の特徴付けと一致する（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，１９９７；Ｔｉｖｏｌら，１９９５；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら，１９９５）。興味深いことではあるが、Ｐｄｃｄ１の単一アレル喪失は、ＣＴＬＡ４の喪失によって誘導される致死的リンパ球増殖を加速した（図１Ａ）。これは、Ｐｄｃｄ１遺伝子量が、ＣＴＬＡ４欠損マウスの表現型およびｔリンパ球増殖性疾患を改変することを示唆する。これらの観察は、Ｃｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^＋／−またはＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^＋／−マウスにおいていかなるＰＤ−１ハプロ不全もないことと対照をなす。

特に目的のものは、Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスの驚くべき自然な死亡であった。なぜならこれは、遺伝的相互作用の強力な証拠を提供するからである。この観察をさらに確認するために、Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−およびＣｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−同腹仔マウスを、異なる育種スキームを使用して生成した（材料および方法を参照のこと）。この第２のアプローチは、およそ５０％のＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスが自然に死亡するが、同腹仔Ｃｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−マウスでは死亡は観察されないという顕著に類似する所見を引き起こした（図１Ｂ）。マウスは、種々の観察される臨床症状を伴って、２〜６ヶ月齢の間に自然に死亡したかまたは瀕死状態になった（表２。材料および方法を参照のこと）。これらの特異的表現型の始まりは、これらの症状の事前の提示があるマウスおよびその提示がないマウスは、死亡するまでの時間が類似であることを考慮すれば、観察される致命的自己免疫に関して本質的に必要ではない（図９Ｂ）。興味深いことではあるが、雄性および雌性のＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスは、顕著に異なる頻度で死亡した（図１Ｃ）。これは、Ｃｔｌａ４の観察された条件付きハプロ不全が性別依存性であり、雌性マウスが、雄性マウスより高頻度で死亡することを示す。この性別の不均衡は、抗ＣＴＬＡ−４ＩＣＩを受けている雌性患者におけるｉｒＡＥの全体的なリスクの増大と一致する（Ｖａｌｐｉｏｎｅら，２０１８）。死ぬべき運命の前には、死亡したマウスのうちのおよそ２／３において１ヶ月齢程度で始まる、明白な非特異的臨床徴候がある（例えば、体重増加の低減、運動失調、呼吸困難）。この表現型の重篤度を反映して、臨床徴候を示すＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスの全体重は、臨床徴候を示さないＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスのものより有意に低かった（図２Ｂ）。

合わせると、これらの観察は、Ｐｄｃｄ１およびＣｔｌａ４が、強力な遺伝的相互作用を示すことを示す。具体的には、劇的なＣｔｌａ４条件付きハプロ不全が存在し、これは、Ｐｄｃｄ１の遺伝的欠失の文脈においてのみ現れ、自然な死亡をもたらす（図１Ａ〜Ｂ）。

表２．Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスの死亡率と関連する表現型。死亡が見いだされたかまたは安楽死を要すると特定されたＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスと関連する表現型の絶対数および相対的な頻度

Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスのうちの５０％のみが死亡することを考慮すれば、さらなる遺伝的または環境的因子がＣｔｌａ４条件付きハプロ不全の浸透度を調節するようである。微妙な遺伝的差異がこの二分法の根底にあり得るか否かを調査した。全ての試験したマウスは、１００−マーカー一ヌクレオチド多型タイピングパネルに基づいて９７〜１００％Ｃ５７ＢＬ６／Ｊであり、表現型出現に伴ういかなる分離するアレル間の関連性も観察されなかった（図７および図８）。

次いで、自然に死亡せず、生存プラトーの年齢（およそ６ヶ月）に達したＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスが、生物学的に関連するが、死亡を引き起こすには十分でない微妙な自己免疫を有するか否かを決定した。対照的に、影響ありのＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスの全体重は、表現型的には通常のＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−またはＣｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−マウスのいずれかと比較して、有意に低減した（図２Ａ）。対照的に、表現型的には通常のＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−およびコントロール同腹仔Ｃｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−マウスの全体重は、有意に異ならなかった（図２Ｂ）。生物学的にどうかをさらに調べるために、基本的な血清化学検査を、加齢した（［４＋］ヶ月）影響なしのＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−およびＣｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−マウスに由来するサンプルに対して行った。興味深いことに、遺伝子型の間で有意差は認められなかった（図２Ｂ）。これは、影響なしのマウス（死亡をもたらす表現型の低下が存在しないとして定義される）が、少なくとも全身性の組織損傷（例えば、ＬＤＨ）のマーカーまたは目視検査によって検出可能な、有意に増大した自己免疫を発生させないことを示唆する。しかしとりわけ、表現型的に影響があるＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスの血清化学検査の分析は、ＡＬＴ、ＡＳＴ、およびＬＤＨの有意に上昇した血清レベル、ならびに減少したグルコースレベルとともに、組織損傷の証拠を明らかにした（図２Ｃ）。その所見は、Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスにおける組織破壊を、および末梢血において検出可能であることを示唆する。

これらのデータは、環境的因子がＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスにおける浸透度および致命的表現型の発生を調節するモデルを裏付ける。根本的な観点から、この観察は、ＴＣＲシグナル混乱の多数の原因が、Ｔ細胞活性化を調節するために統合されるＴ細胞活性化の閾値モデルを裏付ける。Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスの場合では、活性化の閾値は、さらなる微妙な入力（これは、通常は緩和される）が異常なＴ細胞活性化および自己免疫を誘導するために十分であるように、有意に低下される。このモデルの予測は、Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスに由来するＴ細胞が、Ｃｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−マウスに由来するＴ細胞と比較して、減少したレベルのＣＴＬＡ−４を有することである。Ｃｔｌａ４の単一コピー喪失が、利用可能なＣＴＬＡ−４タンパク質の減少をもたらすことを確認するために、本発明者らは、Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−および同腹仔コントロールＣｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−マウスに由来する活性化Ｔ細胞における全ＣＴＬＡ−４タンパク質発現を評価した。とりわけ、インビトロ刺激したＴ細胞のフローサイトメトリー分析は、Ｃｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−マウスに由来するＴ細胞と比較して、Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスに由来するＴ細胞におけるＣＴＬＡ−４タンパク質がより低いレベルであることを示唆する（図２Ｄ）。

Ｃｔｌａ４^＋／−マウスが、生物レベルまたは細胞レベルのいずれでも、いかなるハプロ不全をも示さないという以前の所見の文脈において解釈すると、これらの所見は、ＰＤ−１陰性共刺激が、Ｃｔｌａ４の単一アレル喪失を機能的に緩和するために十分であることを示す。この考えと一致して、ほとんどの差異が、Ｃｔｌａ４^＋／＋およびＣｔｌａ４^＋／−マウスに由来するリンパ節の転写分析およびプロテオミクス分析において観察されなかった（その分析において、劇的な変化がＣｔｌａ４^−／−マウスにおいて観察された）（図５および６）。

興味深いことに、これらの結果は、細胞表現型または頻度における差異が検出されなかったＣｔｌａ４^＋／＋およびＣｔｌａ４^＋／−マウス（Ｐｄｃｄ１において混乱なし）の類似組織のマスサイトメトリープロファイリングからの所見と対照をなす。これは、少なくとも均質な近親交配マウス系統において、さらなる調節性分子機構が、Ｃｔｌａ４の単一コピー喪失によって引き起こされるシグナル伝達の混乱を緩和し得ることを示唆する。しかし、さらなる混乱（例えば、ＰＤ−１の遺伝的喪失）の文脈において、単一アレルＣｔｌａ４に起因するＴ細胞調節の機能的欠損は、緩和能力の喪失に起因して現れ得る。

実施例２ − Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスは、多数の組織の自己免疫を発生させる
次に、Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスの死亡原因を理解し、特異的組織が影響を受けるか否かを調査しようとした。さらに、特定の細胞タイプが、疾患病因論を媒介するか否かを理解しようとした。これらの問題に対処するために、Ｃｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−およびＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスの４２の組織を、組織学的に分析した（材料および方法を参照のこと）。炎症を、心臓、膵臓、肺、肝臓、および消化管を含む多数の組織において観察した。特異的病理観察としては、リンパ球性心筋炎、動脈内膜炎、肺血管炎、およびリンパ球性膵炎が挙げられる。最も劇的な組織学的所見のうち、顕著な免疫浸潤が、Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスの心臓および膵臓組織において観察された（図３Ａ〜Ｄ；図１０および図１１Ａ）。本質的により軽微であるが、顕著でもあるさらなる病理観察としては、唾液腺、涙腺、ハーダー腺、および腎臓のリンパ球浸潤が挙げられる。他の軽微な観察としては、肝臓変性／壊死、リンパ球性胃炎、および滑膜炎が挙げられるが、これらの所見が遺伝子型と関連する程度は、十分に決定されないままである。興味深いことに、より多くの顕著な組織学的所見が、リンパ器官（例えば、脾臓またはリンパ節）よりむしろ末梢の非リンパ組織において観察された。これは、末梢の免疫学的寛容がＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスにおいて特異的に突破されることを示唆する。

心筋浸潤の性質をより良好に問い合わせるために、より大きなマウスコホートの詳細なＨ＆Ｅ組織学的分析、ならびにＴ細胞に関して類似の組織サンプルの免疫組織化学的染色（汎Ｔ細胞マーカーとしてＣＤ３を利用）を行った。心筋炎は、Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスにおいて顕著なＴ細胞浸潤からなった。組織学的分析はまた、マクロファージのような他の免疫集団の浸潤を示唆した。これらのデータは、Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスにおいて認められる心筋炎が、ＩＣＩ関連心筋炎を有する患者と組織学的に類似であることを示唆する。ある範囲の組織学的分析の結果を、以下の表３〜４にまとめる。

表３：心臓病変および膵臓病変の組織評価のまとめ

表４：Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−および同腹仔Ｃｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−コントロールマウスの組織学的分析。広い範囲の組織にわたる半定量的組織スコア。年齢、性別、観察される症状、および遺伝子型を含むマウス特徴を表示する。偶発的またはマウス系統関連であると考えられる病変は、表中で報告しない。遺伝子型、年齢、性別による病変の分布を、スコアの閾値とともに報告する。全ての解剖学的構造が、試験した切片において評価のために利用可能であるわけではない。

肺および皮下（皮膚）を含む広い範囲の解剖学的部位と関連する脂肪組織の重篤な萎縮がまた、観察された（図１０）。この表現型が、膵臓外分泌機能の喪失に対して二次的であるのか、または脂肪組織の自己免疫認識に起因する直接的な効果であるのかは、不明確なままである。さらに、女性生殖器の萎縮もまた、観察された。

これらの所見は、マウスのＣ５７ＢＬ６／Ｊ近親交配系統が、自己免疫の発生に非常に抵抗性であることを考慮すれば、さらに注目に値する。例えば、ここでの所見と一致して、ＰＤ−１欠損のマウスは、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊバックグラウンドと比較して、Ｂａｌｂ／ｃバックグラウンドに対してより重篤な自己免疫を発生させる（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら，１９９９；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら，２００１）。加齢したマウスにおいてＰＤ−１の遺伝的喪失に起因して発生する自己免疫が、自己抗体によって主に媒介されることに注目することはまた、重要である。しかし、抗体レベルは、Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスにおいて上昇しなかった（図１１Ｂ）。これは、末梢組織におけるリンパ球浸潤がＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスにおいて観察されたこととは対照をなす。

注目すべきは、これらの所見が、自己免疫および抗ＣＴＬＡ４と抗ＰＤ−１との併用免疫チェックポイント遮断療法（例えば、イピリムマブとニボルマブ）と関連した他の免疫関連有害事象（ｉｒＡＥｓ）に著しく似ている点があることである（Ｓｚｎｏｌら，２０１７）。特に、膵臓および心臓組織において観察される重篤な自己免疫が、Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスにおいて観察され、これは、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１の治療的遮断と関連する希であるが、非常に重度の有害事象である劇症型心筋炎およびインスリン依存性糖尿病に類似するようである（Ｂａｒｒｏｓｏ− Ｓｏｕｓａら，２０１８；Ｊｏｈｎｓｏｎら，２０１６；Ｍｏｓｌｅｈｉら，２０１８）。Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスが、この生物学を厳密に再現するという考えを支持して、治療に関連する心筋炎および糖尿病は、直接的にＴ細胞が媒介するようである。

次に、Ｃｔｌａ４の条件付きハプロ不全によって誘導される全身性自己免疫の根底にあるＴ細胞の抗原特異性の、特に、特定の組織抗原が繰り返して認識されているか否かの洞察を獲得しようとした。この可能性を探求するために、Ｃｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−およびＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスのリンパ節、心臓、および膵臓組織に対してＴＣＲ配列決定を行った（材料および方法を参照のこと）。興味深いことに、Ｔ細胞クローン性における有意な変化は、Ｃｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−とＣｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスとの間で観察されなかった（図４）。Ｔ細胞クローン性は、以前に特徴づけられた野生型またはＣｔｌａ４^＋／−マウスと比較して、両方の系統において増大された。これは、ＰＤ−１の喪失が、Ｔ細胞増殖およびクロノタイプの拡大を誘導するために十分であるが、これらのクローンの病原性活性が、さらなる機構によって制限されることを示唆する。これは、Ｐｄｃｄ１^−／−マウスにおいて自己免疫表現型が存在しないかまたは長期潜伏することと一致する。しかし、この文脈において、Ｃｔｌａ４の単一コピー喪失は、拡大されたＴ細胞クローンによる病原性活性の出現を可能にする、さらなる調節上の拘束を除去するために十分であると思われる。

ＰＤ−１の非存在下でのＣｔｌａ４の条件付きハプロ不全に起因する自己免疫が、単に末梢性の寛容における欠陥、または中枢性の寛容における欠陥にも起因して生じるのかを評価するために、Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−および同腹仔Ｃｔｌａ４^＋／＋Ｐｄｃｄ１^−／−マウスにおける胸腺発生を特徴づけた。Ｃｔｌａ４の単一アレル喪失は、ＣＴＬＡ−４が胸腺発生の間に重要な役割を果たさないという以前の報告（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，１９９７；Ｗｅｉら，２０１９）と一致して、胸腺細胞組成に影響を与えなかった。リンパ節由来Ｔ細胞におけるこれらの観察と一致して、Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスに由来する胸腺由来Ｔｒｅｇ（新たに生成し、再循環する）は、減少したＣＴＬＡ−４タンパク質を発現した。合わせると、これらのデータは、Ｃｔｌａ４ハプロ不全が、中枢性の寛容における欠陥よりむしろ末梢性の寛容における欠損をもたらすことを示す。

最後に、Ｃｔｌａ４とＰｄｃｄ１との間の遺伝的相互作用の分子的な基礎を調査した。Ｃｔｌａ４の単一コピー喪失は、他の点で野生型条件の文脈において、Ｔ細胞活性化シグナル伝達経路内での強い緩和に起因して、Ｔ細胞の活性または表現型を調節しない、シグナル伝達および転写出力における微妙な変化をもたらすと仮説を立てた。しかし、ＰＤ−１の、またはおそらく他の陰性共刺激分子のさらなる非存在下では、Ｃｔｌａ４ハプロ不全に起因する部妙な分子欠陥は、明白に現れ得る。この可能性を探索するために、本発明者らは、逆相プロテオミクス分析（ＲＰＰＡ）を利用して、野生型、ヘテロ接合性、およびホモ接合性Ｃｔｌａ４ノックアウトマウスに由来するリンパ節組織において２３８のタンパク質標的の発現を厳密に調べた。このＲＰＰＡパネルは、シグナル伝達分子およびリン酸化エピトープの一団を含んでいたので、真正のシグナル伝達経路における変化を検出するのに十分適している。

予測されるように、増殖経路と関連するタンパク質は、Ｃｔｌａ４ノックアウトマウスのリンパ増殖性表現型と一致して、同腹仔コントロールと比較して、Ｃｔｌａ４^−／−マウスにおいて高度にアップレギュレートされた。これは、ＣＤＫ１、ｐ−Ｒｂ、ｐ−Ｓ６、ｐ−ＣＨＫ１、およびｐ−ＳＴＡＴ３における有意な増大を含み、ｐ２１のダウンレギュレーションが付随した（図５Ｆ）。最もとりわけ、主成分分析（ＰＣＡ）および教師なしの階層的クラスター分析は、Ｃｔｌａ４^＋／−およびＣｔｌａ４^＋／＋マウスのプロテオミクスプロフィールが別個であることを示唆する。これらの群間の差異は、Ｃｔｌａ４^＋／−マウスにおける多数のタンパク質（例えば、ｐ２１、ＤＵＳＰ４、およびＢ７−Ｈ３）のダウンレギュレーションによって主に駆動される。同様に、遺伝子発現分析は、ｄＣｔｌａ４^＋／−とＣｔｌａ４^＋／＋マウスとの間の差異を（より小さい程度であるが）、およびＣｔｌａ４^−／−マウスにおける劇的な転写変化を検出した。プロテオミクスおよび転写のプロフィールにおいて観察された差異は、全リンパ節組織が分析されることを考慮すれば、細胞に内在するシグナル伝達における変化および相対的な細胞組成における変化を反映し得るが、これらの所見は、それにもかかわらず、Ｃｔｌａ４の単一コピー喪失が微妙な分子ハプロ不全表現型をもたらすことを示す。しかし、プロテオミクスレベルでのこれらの微妙な変化（図５）は、転写レベルでのこのような差異の非存在（図６）と一致して、免疫学的応答を調節するには不十分であると思われる。合わせると、これらのデータは、ＰＤ−１陰性共刺激が、マウスにおいてＣｔｌａ４の単一アレル喪失を機能的に緩和するには不十分であることを示す。この機能的緩和は、Ｃｔｌａ４^＋／− Ｐｄｃｄ１^−／−マウスにおいて失われており、従って、これは、自然な自己免疫の発生および始まりを可能にする。

本明細書で開示および特許請求される方法の全ては、本開示に照らして過度の実験なしに作製および実行され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関して記載されているが、本明細書で記載される方法および方法の工程または工程の順番において、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなくバリエーションが適用され得ることは、当業者に明らかである。より具体的には、化学的にかつ生理学的に関連するある種の因子が、本明細書で記載される因子の代わりに使用され得るが、同じまたは類似の結果が達成されることは、明らかである。当業者に明らかであるこのような類似の置換および改変は全て、添付の請求項によって定義されるとおりの発明の趣旨、範囲および概念の範囲内にあるとみなされる。

参考文献
以下の参考文献は、それらが、例示的手順または本明細書で示されるものを補足する他の詳細を提供する程度まで、本明細書に参考として具体的に援用される。

Claims

マウスであって、前記マウスのゲノムが、（ｉ）Ｃｔｌａ４遺伝子のヘテロ接合性機能喪失型アレルおよび（ｉｉ）Ｐｄｃｄ１遺伝子のホモ接合性機能喪失型アレルを含む、マウス。
前記マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ遺伝子バックグラウンドを有する、請求項１に記載のマウス。
前記Ｃｔｌａ４遺伝子のヘテロ接合性機能喪失型アレルは、前記Ｃｔｌａ４遺伝子のエキソン３へのネオマイシン耐性カセットのヘテロ接合性挿入としてさらに規定される、請求項１に記載のマウス。
前記Ｐｄｃｄ１遺伝子のホモ接合性機能喪失型アレルは、前記Ｐｄｃｄ１遺伝子のエキソン２および３のホモ接合性欠失としてさらに規定される、請求項１に記載のマウス。
前記マウスは、Ｃｔｌａ４^{ｔｍ１Ａｌｌ}Ｐｄｃｄ１^{ｔｍ１．１Ｓｈｒ}マウスである、請求項１に記載のマウス。
前記マウスは、自己免疫に罹患している、請求項１に記載のマウス。
前記自己免疫は、心臓の自己免疫または膵臓の自己免疫である、請求項６に記載のマウス。
前記心臓の自己免疫は、心筋炎である、請求項７に記載のマウス。
前記心筋炎は、劇症型心筋炎である、請求項８に記載のマウス。
前記膵臓の自己免疫は、インスリン依存性糖尿病である、請求項７に記載のマウス。
前記膵臓の自己免疫は、膵臓外分泌破壊または膵島破壊を含む、請求項７に記載のマウス。
前記自己免疫は、リンパ球性心筋炎、動脈内膜炎、膵臓外分泌破壊、肺血管炎、脂肪組織萎縮、肝臓の炎症、女性生殖器の萎縮、消化管の炎症、滑膜炎、または腎臓、唾液腺、涙腺もしくは胃のリンパ球浸潤である、請求項６に記載のマウス。
前記マウスは雌性マウスである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のマウス。
前記マウスは雄性マウスである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のマウス。
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のマウスから単離された細胞。
前記細胞は免疫細胞である、請求項１５に記載の細胞。
前記細胞はＴ細胞である、請求項１５に記載の細胞。
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のマウスにおいて少なくとも１種の候補因子をスクリーニングするための方法であって、前記方法は、１種またはこれより多くの候補因子を前記マウスに投与する工程を包含する方法。
前記少なくとも１種の候補因子を、（ｉ）ホモ接合性野生型Ｃｔｌａ４遺伝子および（ｉｉ）Ｐｄｃｄ１遺伝子のホモ接合性機能喪失型アレルを含むマウスにおいてスクリーニングする工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
前記少なくとも１種の候補因子を、（ｉ）ホモ接合性野生型Ｃｔｌａ４遺伝子および（ｉｉ）ホモ接合性野生型Ｐｄｃｄ１遺伝子を含むマウスにおいてスクリーニングする工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
前記少なくとも１種の候補因子を、（ｉ）ホモ接合性野生型Ｃｔｌａ４遺伝子および（ｉｉ）Ｐｄｃｄ１遺伝子のヘテロ接合性機能喪失型アレルを含むマウスにおいてスクリーニングする工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
前記少なくとも１種の候補因子を、（ｉ）Ｃｔｌａ４遺伝子のヘテロ接合性機能喪失型アレルおよび（ｉｉ）ホモ接合性野生型Ｐｄｃｄ１遺伝子を含むマウスにおいてスクリーニングする工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
前記少なくとも１種の候補因子を、（ｉ）Ｃｔｌａ４遺伝子のヘテロ接合性機能喪失型アレルおよび（ｉｉ）Ｐｄｃｄ１遺伝子のヘテロ接合性機能喪失を含むマウスにおいてスクリーニングする工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
前記少なくとも１種の候補因子は、免疫関連有害事象または免疫関連状態の発生を加速するその能力に関してスクリーニングされる、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の方法。
前記少なくとも１種の候補因子は、免疫関連有害事象または免疫関連状態の重篤度を増悪させるその能力に関してスクリーニングされる、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の方法。
前記少なくとも１種の候補因子は、前記マウスの集団において免疫関連有害事象または免疫関連状態の浸透度を増大させるその能力に関してスクリーニングされる、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の方法。
前記少なくとも１種の候補因子は、免疫関連有害事象または免疫関連状態を軽減するその能力に関してスクリーニングされる、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の方法。
免疫関連有害事象または免疫関連状態を軽減することは、前記免疫関連有害事象または免疫関連状態の発生を防止することとしてさらに規定される、請求項２７に記載の方法。
免疫関連有害事象または免疫関連状態を軽減することは、前記免疫関連有害事象または免疫関連状態の重篤度を減少させることとしてさらに規定される、請求項２７に記載の方法。
前記少なくとも１種の候補因子は、有効性に関してスクリーニングされる、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の方法。
前記候補因子は、抗がん療法である、請求項１８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
前記候補因子は、病原体、ストレス、傷害、および／または食事である、請求項１８〜３０のいずれか１項に記載に記載の方法。
前記候補因子は、同系腫瘍細胞である、請求項１８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
前記候補因子は、ＣＴＬＡ−４免疫グロブリン融合タンパク質、ステロイド、免疫細胞の特異的集団を除去する因子、サイトカイン調節因子、または免疫抑制剤である、請求項１８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫関連有害事象は、自己免疫である、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫関連状態は、自己免疫状態である、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫関連有害事象は急性である、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫関連有害事象は慢性である、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫関連状態は慢性である、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫関連状態は急性である、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫関連有害事象または免疫関連状態は、炎症である、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の方法。
前記炎症は、急性または慢性である、請求項４１に記載の方法。
前記免疫関連有害事象または免疫関連状態は、ヒトにおいてチェックポイント遮断療法によって誘導される自己免疫を表すかまたはヒトにおいて免疫関連有害事象を表す自己免疫である、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫関連有害事象または免疫関連状態は、心臓の自己免疫または膵臓の自己免疫である、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の方法。
前記心臓の自己免疫は、心筋炎である、請求項４４に記載の方法。
前記心筋炎は、劇症型心筋炎である、請求項４５に記載の方法。
前記膵臓の自己免疫は、インスリン依存性糖尿病である、請求項４４に記載の方法。
前記膵臓の自己免疫は、膵臓外分泌破壊または膵島破壊を含む、請求項４４に記載の方法。
前記免疫関連有害事象または免疫関連状態は、リンパ球性心筋炎、動脈内膜炎、膵臓外分泌破壊、肺血管炎、脂肪組織萎縮、肝臓の炎症、女性生殖器の萎縮、消化管の炎症、滑膜炎、または腎臓、唾液腺、涙腺もしくは胃のリンパ球浸潤である、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の方法。