CN102850457A - 自身免疫性疾病抗自身抗体的抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学技术领域，涉及自身免疫性疾病抗自身抗体的抗体及其制备方法和应用。包括以自身抗体做为抗原的抗原制备、以自身抗体做为抗原免疫试验对象、获取抗自身抗体的抗体，制得抗总IgG的抗血清命名为NIgG抗血清。通过实验证实所制备的抗自身抗体的抗体可治疗1型糖尿病，可降低血糖，降低1型糖尿病的发病率和死亡率，保护胰岛细胞，有效防治胰岛炎症的发生。本发明为寻找治疗自身免疫性疾病的药物、治疗临床上由于自身免疫性疾病引起的一系列代谢紊乱引起的疾病提供了依据；为临床研究与实践提供了一种针对自身免疫性糖尿病的治疗策略。

Description

自身免疫性疾病抗自身抗体的抗体及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及自身免疫性疾病抗自身抗体的抗体，具体涉及自身免疫性疾病抗自身抗体的抗体及其制备方法和该抗体对1型糖尿病治疗的应用。

背景技术

现有技术公开了自身免疫性疾病(autoimmune diseases)是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，其以特定B淋巴细胞克隆的过度激活和产生大量自身抗体为特征(C.Hu，F.S.Wong，L.Wen，2009，Clinical andExperimental Immunology.157：181-190)。目前针对自身抗体来治疗自身免疫疾病的方法尚未见报道。

当前对自身免疫性疾病的治疗主要包括糖皮质激素、免疫抑制剂、细胞毒类药物如环保霉素A等，主要是非选择性地抑制全部或者一大类T、B淋巴细胞的功能和增殖，在一定程度上控制病情的发展。研究表明，如果长期或者大量使用这些药物，毒副作用大，对机体免疫功能造成严重的损伤。因此寻找新的更有效及更彻底的干预自身免疫性疾病的药物有着重要的理论意义和应用价值。

据报道，在机体发育过程中，由于遗传等因素，某些针对机体自身抗原的B淋巴细胞克隆规避了免疫耐受的杀灭作用。每一B细胞克隆只能产生一种特定的抗体。当针对自身抗原的特定B淋巴细胞克隆在成体时与相应的自身抗原相遇，即被激活，分化增殖，产生大量自身抗体，引起自身免疫反应，破坏带有相应自身抗体的组织细胞。产生自身抗体的B细胞不论是激活还是非激活状态，表面均带有自身抗体。因此，有研究者假设，通过制备抗自身抗体的抗体，将过量的这种抗自身抗体的抗体一次性注入患自身免疫疾病的个体体内，不但可中和体液中的自身抗体，还可以与产生自身抗体的B细胞表面的自身抗体结合，诱发抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)或补体依赖的细胞毒作用(CDC)，选择性地杀灭分泌自身抗体的B淋巴细胞的克隆，从而起到治疗自身免疫性疾病的目的。由于选择性地只杀灭产生自身抗体的B淋巴细胞，而且只注射一次，所以能避免非特异免疫治疗的副作用。

1型糖尿病是一种器官特异性的自身免疫性疾病，是以胰岛β细胞破坏导致胰岛素绝对缺乏所引起的一系列糖代谢紊乱为主要表现的临床综合症。其主要发病机制是自身免疫反应，机体在遗传因素和环境因素的影响下，体内的体液免疫反应和细胞免疫反应启动后使循环血液中出现了针对体内某些抗原组分的自身抗体，自身抗体还可以与胰岛素抗原结合，使其不能发挥正常的功能。约90％新发病的糖尿病病人循环血液中检测到有胰岛β细胞抗体的存在(Bingley PJ，Bonifacio E，Williams AJ，Genovese S，Bottazzo GF，Gale EA，1997，Diabetes.46(11)：1701-1710)。自身抗体主要是通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖性的细胞毒作用(CDC)，破坏胰腺细胞，使胰岛β细胞分泌胰岛素的绝对量显著下降。因此，自身抗体将在1型糖尿病的发生发展中具有重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种自身免疫性疾病抗自身抗体的抗体及其制备方法。

本发明的进一步目的是提供所述自身免疫性疾病抗自身抗体的抗体在制备治疗1型糖尿病的药物中的应用。

本发明的自身免疫性疾病抗自身抗体的抗体，其特征在于，通过下述方法制备，包括以自身抗体做为抗原的抗原制备、以自身抗体做为抗原免疫试验对象、获取抗自身抗体的抗体，

首先用亲和层析方法提取试验对象I血清总抗体IgG，以该总IgG为抗原与免疫佐剂混合，免疫试验对象II，制得抗总IgG的抗血清，命名为NIgG抗血清；

所述的总IgG包括试验对象I的正常健康的IgG和自身抗体IgG。

本发明中，所述的试验对象I和试验对象II同源。

本发明中，所述的所述的试验对象I为6周龄NOD小鼠，所述的试验对象II为正常Balb/c小鼠。

本发明中，还包括所述的抗自身抗体的单克隆和多克隆抗体及其制备方法。

本发明所述的抗自身抗体的抗体的制备方法的部分技术可用于制备抗自身抗体的抗体的基因和相关核酸物质，进一步的制备相关的多肽和蛋白质及其生产的衍生物；更进一步的对所制备抗自身抗体的单克隆和多克隆抗体进行结构和剂型改造制成产品。

本发明制备抗自身抗体的抗体的方法和原理是：每种抗体与其特定抗原结合的结合片断都是不同的，自身抗体结合片断上的特殊结合序列对于不产生自身抗体的动物或者人类个体来说是外来抗原，不产生自身抗体的动物或者人类个体在接触这些特殊结合序列抗原后可产生针对这些特殊结合序列的抗体，即抗自身抗体的抗体。

本发明的自身免疫性疾病抗自身抗体的抗体可用于制备治疗I型糖尿病的药物。所述的抗自身抗体的抗体药物治疗自身免疫疾病的给药途径是非消化道给药。

本发明中，提供了所述的抗自身抗体的抗体对自身免疫疾病的治疗试验方案，所用的剂量、途径、周期、及具体的实施方法。

本发明的自身免疫性疾病抗自身抗体的抗体还可用于检测分泌自身抗体的细胞及其检测方法。

本发明的自身免疫性疾病抗自身抗体的抗体还可用于检测组织和体液中的自身抗体。

本发明所制备的抗自身抗体的抗体用于治疗自身免疫疾病的原理是：每一B细胞克隆只能产生一种特定的抗体。产生自身抗体的B细胞不论是激活还是非激活状态，表面均带有自身抗体。过量抗自身抗体的抗体不但可中和体液中的自身抗体，还可以与产生自身抗体的B细胞表面的自身抗体结合，诱发抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用或补体依赖的细胞毒作用，选择性地杀灭分泌自身抗体的B淋巴细胞的克隆，从而起到治疗自身免疫性疾病的目的。

为了便于理解，下面以抗非肥胖型1型糖尿病小鼠(NOD)自身抗体的多克隆抗体制备和应用为例，进一步阐述本发明。

本发明采用NOD小鼠作为1型糖尿病的动物模型，NOD小鼠能够自然发生1型糖尿病，其发病是遗传学和免疫学相结合的自身免疫反应过程，具有很多类似人类自身免疫性糖尿病的特征。

本发明通过动物实验证实本发明制备的抗自身抗体的抗体治疗1型糖尿病(NOD)小鼠，可降低小鼠血糖，降低其发病率和死亡率，保护胰岛细胞不被破坏，能有效防治1型糖尿病的发生。其机制与该血清降低1型糖尿病小鼠血清中的自身抗体，并选择性的杀灭分泌自身抗体的B细胞有关。

本发明中，首先用亲和层析方法提取纯化6周龄NOD小鼠血清中的总抗体IgG，总IgG既包括正常健康的IgG，也包括自身抗体IgG；以此总IgG做为抗原与免疫佐剂混合，免疫与NOD小鼠同源的正常Balb/c小鼠，制备出抗总IgG的抗血清，本发明中将它命名为NIgG抗血清；

将所述的NIgG抗血清应用于发病前的6周龄的NOD小鼠，本发明的一个实施例中，采用一次性尾静脉注入方式，以注入PBS(磷酸盐缓冲液)的NOD小鼠为对照，观察至32周，结果显示，该抗血清能有效降低NOD小鼠血糖，降低其发病率和死亡率，并保护胰岛细胞不被破坏，有效的防治1型糖尿病的发生。

免疫组织化学染色证实，本发明制得的抗血清治疗NOD小鼠26周后，与PBS对照组相比，小鼠体内血清中的自身抗体含量明显降低，脾脏中分泌自身抗体的B细胞数量降低，表明所制得的抗血清能选择性的杀灭分泌自身抗体的B细胞。

本发明的目的通过下述方法和步骤实现：

1：获取6周龄NOD小鼠的血清及血清总IgG

总IgG采用亲和层析的方法提取；

2：被免疫的Balb/c小鼠中抗血清的制备和提取

将上述获取的小鼠血清总IgG蛋白作为抗原与佐剂等体积混合后非消化道给药免疫Balb/c小鼠；

免疫方案为两次基础免疫加一次加强免疫共三次；

获得NOD小鼠血清IgG免疫的Balb/c小鼠的血清，命名为NIgG抗血清；

3：用于NOD小鼠的

将所述的NIgG抗血清单次大剂量以非消化道给药用于6周龄NOD小鼠及同龄的对照Balb/c小鼠；

4：效果观察

观察血糖趋势，根据血糖变化记录每组小鼠每周糖尿病发病数量，死亡数量；

5：观察治疗后NOD小鼠的胰岛体积及炎症浸润面积的变化

小鼠胰岛组织石蜡切片制备；

胰岛组织的HE染色；

胰岛胰腺体积比及胰岛中炎症浸润面积的计算；

6：观察治疗后NOD小鼠血清中自身抗体的相对数量变化(免疫组织化学染色方法)

Balb/c正常小鼠胰腺组织石蜡切片制备；

治疗前6周龄和治疗26周后的NOD小鼠的血清作为一抗染色Balb/c小鼠胰岛组织的免疫组织化学染色；

7：观察脾脏中分泌自身抗体的B淋巴细胞的相对数量变化(免疫组织化学染色方法)

治疗前6周龄NOD小鼠和抗血清NIgG治疗26周后的NOD小鼠脾脏组织石蜡切片制备；1％的NIgG抗血清作为一抗染色Balb/c小鼠脾脏组织的免疫组织化学染色。

结果显示，

获得的抗血清能有效降低NOD小鼠血糖，降低其发病率和死亡率，并保护胰岛细胞不被破坏，有效的防治1型糖尿病的发生。免疫组织化学染色证实，制得的抗血清使小鼠体内血清中的自身抗体含量明显降低，脾脏中分泌自身抗体的B细胞数量降低。

本发明中，所采用的实验动物和材料，其中：

NOD小鼠购自中国科学院上海实验动物中心，经过血清中自身抗体检测实验证实6-8周NOD小鼠血清中有自身抗体的存在；Balb/c小鼠购自中国科学院上海实验动物中心；啮齿类动物普通饲料(复旦大学实验动物部)；NIgG antiserum是用NOD小鼠的IgG免疫Balb/c小鼠制备；抗体纯化试剂盒(Antibody purification kit)、免疫佐剂(Sigma ajuvant system)购自美国sigma公司；血糖测量仪及试纸(Optiumexceed)购自美国雅培公司；Rat-anti-mouse CD45R抗体(cambridge science park，UK)；nomal donkey serum、donkey-anti-rat conjugated with HRP、affinity-purified Fabfragment Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)、donkey-anti-mouse IgG(H+L)-HRP、donkey-anti-mouse antibody conjugated with CY³、donkey-anti-rat secondary antibodyconjugated with FITC均购自美国Jackson ImmunoResearch公司；Rabbit anti-mouseinsulin antibody、Goat anti-rabbit conjugated with HRP购自上海优宁维生物公司；DAB显色试剂盒购自上海长岛肾病理研究所。

本发明为寻找治疗自身免疫性疾病的药物、治疗临床上由于自身免疫性疾病引起的一系列代谢紊乱引起的疾病提供了依据；为临床研究与实践提供了一种针对自身免疫性糖尿病的治疗策略，该策略也可用于其它自身免疫性疾病的治疗；也为进一步分析抗自身抗体血清在治疗和调节1型糖尿病的作用机制奠定了基础。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1A抗血清NIgG治疗对NOD小鼠发病率的影响。

Control：NOD小鼠PBS对照组；NIgG-treated：NOD小鼠抗血清NIgG治疗组。

图1B抗血清NIgG治疗对NOD小鼠空腹血糖的影响。

*P＜0.05，**P＜0.01for NIgG-treated vs.Control。

图1C抗血清NIgG治疗对NOD小鼠死亡率的影响。

26w Ctrl：NOD小鼠PBS 26周对照组；26w Treated：NOD小鼠抗血清治疗26周组。

图2A抗血清NIgG治疗对NOD小鼠胰岛炎症浸润的影响，图为HE染色。

0d Ctrl：6周龄NOD小鼠治疗前组；26w Ctrl：NOD小鼠PBS 26周对照组；26w Treated：NOD小鼠抗血清治疗26周组。

图2B抗血清NIgG治疗对NOD小鼠胰岛炎评分的影响。

0分：无淋巴细胞的浸润；1分：胰岛周边淋巴细胞浸润面积＜25％；

2分：胰岛被淋巴细胞浸润面积在25％-50％之间；3分：胰岛被淋巴细胞浸润面积＞50％。

图2C各组小鼠的胰岛胰腺体积比值的统计计算。

图3抗血清NIgG治疗对NOD小鼠血清中的自身抗体数量的影响。

正常Balb/c小鼠胰腺组织的免疫组织化学染色，以治疗前后NOD小鼠血清作为一抗检测血清中自身抗体的数量。Negative Control：阴性对照；0d Ctrl： 6周龄NOD小鼠组；26w Ctrl：NOD小鼠PBS 26周对照组；26w Treated：NOD小鼠抗血清治疗26周组。

图4A抗血清NIgG治疗后对NOD小鼠脾脏中分泌自身抗体的B细胞数量的影响。

治疗前后NOD小鼠脾脏组织的免疫组织化学染色，以NIgG抗血清作为一抗检测脾脏中分泌自身抗体的B细胞。

图4B抗血清NIgG治疗后对NOD小鼠脾脏中B细胞的数量的影响。

治疗前后NOD小鼠脾脏组织的免疫组织化学染色，以抗CD45R单克隆抗体作为一抗检测脾脏中的B细胞。

具体实施方式

实施例1

1，提取6周龄NOD小鼠的血清及血清总IgG

按常规方法获得NOD小鼠的血清约1ml，于eppendorf管中4℃放置1h，3000rpm离心15min获得血清约400ul/每只；

血清中总IgG的提取：将蛋白A(一种分离自G型链球菌的细胞壁蛋白)共价偶联至琼脂糖支持物上，通过与血清中IgG的Fc片段结合以提取NOD小鼠血清中的IgG。

亲和层析提取血清IgG：

(1)取1ml的亲和层析柱子于架子上固定，用缓冲液A约10ml平衡柱子，即10个柱床体积，流速为1ml/min，

(2)将NOD小鼠血清用缓冲液A稀释到原体积的2倍，将血清加入柱中，使血清慢慢渗入胶中，关闭柱子下口约2h，使血清中IgG与胶中的Protein A充分结合，

(3)打开柱子下口，用缓冲液A约10ml冲洗柱床，流速为1ml/min，

(4)换用缓冲液B洗脱，流速约1ml/min，收集洗脱峰，

(5)用纯水清洗柱床约10个柱床体积，再用20％乙醇清洗柱床约10个柱床体积，流速约2ml/min，柱子置于4℃环境保存，

(6)将收集到的峰值IgG蛋白的进行定量和鉴定，BCA法测定蛋白质浓度。

2，制备和提取被免疫的Balb/c小鼠中抗血清

将提步骤1制得的NOD小鼠血清中总的IgG蛋白作为抗原与佐剂等体积混合后免疫Balb/c小鼠。其包括步骤：

预热免疫佐剂adjuvant到40-50℃，将无菌生理盐水1ml用注射器注入佐剂瓶中，剧烈震荡佐剂瓶2-3分钟以形成乳浊液，倒转瓶震荡1min，使瓶内容物充分利用，免疫前使佐剂预热到37℃，并做短暂震荡，使佐剂溶液与抗原溶液以体积比1∶1比例混合；

免疫方案为两次基础免疫加一次加强免疫共三次。

(1)初次免疫：提取到的IgG以200ug/100ul/每只的量腹腔注射雄性Balb/c mice，共注射10只。

(2)二次免疫：同初次。

(3)加强免疫：提取到的IgG以100ug/100ul/每只的量腹腔注射雄性Balb/c mice，共注射10只。

提取被NOD小鼠血清IgG免疫的Balb/c小鼠的血清，命名为NIgG抗血清。

3，NOD小鼠的治疗试验

将NIgG抗血清单次大剂量0.2ml以尾静脉注射方式给于6周龄NOD小鼠及同龄的Balb/c小鼠，对照组采用PBS 0.2ml以同样方式注入6周龄NOD小鼠及同龄的Balb/c小鼠体内，随后连续观察各项指标至小鼠32周龄，32周时将所有小鼠常规处理。

4，效果观察

NIgG抗血清注射后，每周监测空腹血糖，血糖监测前一天晚上所有小鼠禁食12h，当天采用尾部采血方式测定空腹血糖值，观察血糖趋势，根据血糖变化记录每组小鼠每周发病数量，死亡数量，观测至32周龄，32周时常规处理小鼠。

5，观察治疗后NOD小鼠的胰岛的变化

胰岛组织做石蜡切片，隔50μm取一张，共25张，做HE染色，用ImageMeasurement统计软件测量每张切片中的胰岛总面积及胰腺总面积，计算两者比值，乘以间隔距离，即胰岛胰腺的相对体积比。胰岛的炎症浸润面积与胰岛面积的比值计算同上。

6，观察治疗后NOD小鼠血清中自身抗体的相对数量变化(免疫组织化学方法)

(1)Balb/c小鼠正常的胰腺组织切片热修复后PBST洗3次各5min；

(2)将切片浸入3％H₂O₂中浸泡15min，以去除内源性过氧化物酶，PBST洗3次各5min；

(3)滴加正常驴血清(5％)封闭液，室温40min，甩去多余液体；

(4)滴加一抗50ul：1％的NOD小鼠(32周龄)血清及对照血清，室温2h；

(5)滴加亲和纯化的驴抗小鼠IgG(H+L)Fab片段，室温2h，PBST洗3次各5min；

(6)1％NIgG抗血清封闭，室温2h；PBST洗3次各5min；

(7)滴加二抗50ul：HRP-donkey anti-mouse IgG(H+L)，37℃30min；

(8)PBST洗3次各5min；

(9)DAB显色5-10min，在显微镜下掌握染色程度，PBST或自来水冲洗10min；

(10)苏木精复染2min，盐酸酒精分化，自来水冲洗10-15min；

(11)脱水、透明、封片、镜检。Leica倒置相差显微镜下对典型视野放大后进行显微摄影；

(12)各组胰岛的灰度值用Image Measurement统计软件进行统计计算；

7，免疫组织化学染色测定脾脏中分泌自身抗体的B细胞的相对数量

(检测NIgG抗血清治疗26周后NOD小鼠脾脏中分泌自身抗体的B细胞)

(1)治疗后NOD小鼠脾脏组织切片热修复后PBST洗3次各5min；

(2)将切片浸入3％H₂O₂中浸泡15min，以去除内源性过氧化物酶，PBST洗3次各5min；

(3)滴加正常驴血清(5％)封闭液，室温40min，甩去多余液体；

(4)滴加一抗50ul：1％的NIgG抗血清，室温2h；

(5)滴加亲和纯化的驴抗小鼠IgG(H+L)Fab片段(1∶100)，室温2h，PBST洗3次各5min；

(6)滴加二抗50ul：HRP-donkey anti-mouse IgG(H+L)，37℃30min；

(7)PBST洗3次各5min；

(8)DAB显色5-10min，在显微镜下掌握染色程度，PBST或自来水冲洗10min；

(9)苏木精复染2min，盐酸酒精分化，自来水冲洗10-15min；

(10)脱水、透明、封片、镜检。Leica倒置相差显微镜下对典型视野放大后进行显微摄影；

(11)每张切片随机取10个不同的视野，计数分泌自身抗体的B细胞数与视野下的总细胞数，计算平均比值

统计学分析：数据以均数±标准误

表示，组间差异用单因素方差分析统计。结果显示：

(1)抗血清NIgG治疗可明显降低1型糖尿病小鼠的血糖，降低其发病率和死亡率。

本发明用NOD小鼠提取的血清总IgG来免疫balb/c小鼠后，再从Balb/c小鼠中提取的血清(即为抗血清NIgG)注射NOD小鼠(n＝19)，对照组仅用PBS注射NOD小鼠(n＝18)，观察治疗后26周内小鼠糖尿病发病情况。结果显示抗血清治疗组小鼠共19只，其中糖尿病发病8只，死亡4只，其发病率为42.1％，死亡率为21.1％；对照组小鼠共18只，其中发病16只，死亡11只，其发病率为88.9％，死亡率为61.1％。NIgG抗血清治疗后的小鼠发病率与PBS对照组相比明显降低46.8％(P＜0.001)，死亡率降低40％(P＜0.001)，如图1A和1C所示；同时，NIgG抗血清治疗组血糖在14周以后明显低于PBS对照组，且血糖波动幅度相对平稳，对照组最高血糖平均值达到388.3mg/dl，比同周龄治疗组的血糖值191.3mg/dl高2.23倍(P＜0.01)，表明抗血清NIgG治疗可以明显降低NOD小鼠的血糖，如图1B所示。

(2)抗血清NIgG治疗保护1型糖尿病小鼠的胰岛。

与PBS对照组相比，抗血清NIgG治疗后胰岛的炎症浸润明显减轻，胰岛炎评分也明显好于对照组(如图2A和2B所示)，胰岛胰腺体积比明显增加(P＝0.0142，图2C)，抗血清治疗后与治疗前比较无统计学差异(P＝0.6675)。

(3)抗血清NIgG治疗降低1型糖尿病小鼠血清中的自身抗体。

血清中自身抗体的检测结果显示，抗血清NIgG治疗后与对照组相比，血清中的自身抗体明显降低(53.65±3.41vs 69.50±5.33，P＝0.0028)，抗血清治疗后与治疗前比较无统计学差异(P＝0.3359)，如图3所示。

(4)抗血清NIgG选择性的杀灭1型糖尿病小鼠分泌自身抗体的B细胞，而对总B细胞无影响。

抗血清NIgG治疗后与对照组相比，脾脏中分泌自身抗体的B淋巴细胞明显减少(8.59±1.5％vs 18.99±4.5％，P＝0.0101)，治疗后与治疗前相比，分泌自身抗体的B淋巴细胞也降低(8.59±1.5％vs 12.74±1.39％，P＝0.0302)，如图4A所示，脾脏中总B细胞占总的脾脏细胞的百分比各组之间没有统计学差异，如图4B所示。

Claims (13)

1.自身免疫性疾病抗自身抗体的抗体，其特征在于，通过下述方法制备：包括以自身抗体做为抗原的抗原制备、以自身抗体做为抗原免疫试验对象、获取抗自身抗体的抗体，

首先用亲和层析方法提取试验对象I血清总抗体IgG，以该总IgG为抗原与免疫佐剂混合，免疫试验对象II，制得抗总IgG的抗血清，命名为NIgG抗血清；

所述的总IgG包括试验对象I的正常健康的IgG和自身抗体IgG。

2.按权利要求1所述的自身免疫性疾病抗自身抗体的抗体，其特征在于，所述的试验对象I和试验对象II同源。

3.按权利要求1或2所述的自身免疫性疾病抗自身抗体的抗体，其特征在于，所述的所述的试验对象I为6周龄NOD小鼠，所述的试验对象II为正常Balb/c小鼠。

4.按权利要求1所述的自身免疫性疾病抗自身抗体的抗体，其特征在于，所述的抗自身抗体的抗体还包括抗自身抗体的单克隆和多克隆抗体

5.制备权利要求1的自身免疫性疾病抗自身抗体的抗体的方法，其特征在于，其包括步骤：

1)获取试验对象I的血清及血清总IgG

总IgG采用亲和层析的方法提取；

2)制备和提取被免疫的试验对象II的抗血清

将上述获取的总IgG蛋白作为抗原与佐剂等体积混合后非消化道给药免疫试验对象II；

免疫方案为两次基础免疫加一次加强免疫共三次；

获得免疫的试验对象II的血清，命名为NIgG抗血清。

6.权利要求1的自身免疫性疾病抗自身抗体的抗体在制备治疗自身免疫性疾病药物中的用途。

7.权利要求1的自身免疫性疾病抗自身抗体的抗体在制备治疗I型糖尿病药物中的用途。

8.按权利要求6或7所述的用途，其特征在于，所述的治疗给药途径是非消化道给药。

9.权利要求1的自身免疫性疾病抗自身抗体的抗体在检测分泌自身抗体的细胞及其检测方法中的用途。

10.权利要求1的自身免疫性疾病抗自身抗体的抗体在检测组织和体液中的自身抗体中的用途。

11.权利要求5的方法在制备抗自身抗体的单克隆和多克隆抗体中的用途。

12.权利要求5的方法在制备抗自身抗体的抗体的基因和相关核酸物质中的用途。

13.权利要求5的方法在制备抗自身抗体的抗体的基因和相关核酸物质相关的多肽和蛋白质中的用途。

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