UA119973C2 - Антитіло до ссl17 - Google Patents

Антитіло до ссl17 Download PDF

Info

Publication number
UA119973C2
UA119973C2 UAA201606000A UAA201606000A UA119973C2 UA 119973 C2 UA119973 C2 UA 119973C2 UA A201606000 A UAA201606000 A UA A201606000A UA A201606000 A UAA201606000 A UA A201606000A UA 119973 C2 UA119973 C2 UA 119973C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
ssi
antibodies
human
shi
Prior art date
Application number
UAA201606000A
Other languages
English (en)
Inventor
Кен Боукай
Векчіо Альфред Дель
Векчио Альфред Дель
Джон Кіхоу
Джон Кихоу
Ейлін Лейсі
Эйлин Лейси
Лін Мюрей
Лин Мюрей
Мері Раян
Мери Раян
Сандра Сантулі-Марото
Сандра Сантули-Марото
Джон Вілер
Джон Вилер
Браян Вітакер
Браян Витакер
Алексей Тепляков
Original Assignee
Янссен Байотек, Інк.
Янссен Байотек, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Янссен Байотек, Інк., Янссен Байотек, Инк. filed Critical Янссен Байотек, Інк.
Publication of UA119973C2 publication Critical patent/UA119973C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Винахід стосується виділеного антитіла до CCL17. Винахід також стосується фармацевтичної композиції, виділеного полінуклеотиду, вектора, клітини хазяїна, способу отримання антитіла, способу лікування захворювання, опосередкованого CCL17, способу лікування бронхіальної астми або гіперреактивності дихальних шляхів та застосування даного антитіла в терапії.

Description

(57) Реферат:
Винахід стосується виділеного антитіла до ССІ 17. Винахід також стосується фармацевтичної композиції, виділеного полінуклеотиду, вектора, клітини хазяїна, способу отримання антитіла, способу лікування захворювання, опосередкованого ССІ1 17, способу лікування бронхіальної астми або гіперреактивності дихальних шляхів та застосування даного антитіла в терапії. во
З0О089: а 2500004... 1 ж 2000004 о - 4500004 о мо 01000005 і я о шини и и її
Мі й й п й й й «Е кА У Ки У г ік о и НИ НИ о а а КИ а с ок аю щу з п ом Фо й я АК АЮ
КИ
КК ех ко ся с я
Ця заявка заявляє пріоритет щодо попередньої заявки на патент США Мо 61/900,596, поданої 6 листопада 2013 р., повний зміст якої в повному обсязі включено в цей документ шляхом посилання.
Галузь техніки, до якої відноситься винахід
Цей винахід стосується антитіл, які специфічно зв'язують ССІ17, полінуклеотидів, які кодують антитіла або фрагменти, і способів отримання й використання вищезгаданого.
Рівень техніки
Гомеостатичний хемокін, ССІ17 (ТАКС, хемокін (С-С мотив) ліганд 17) є ефективним хемоатрактантом лімфоцитів. ССІ 17 є лігандом для ССК4, ОРСЕ, який вважають важливим у функціонуванні Т-клітин і хемотаксису й міграції імунних клітин до ділянок запалення. ССКА переважно експресується на лімфоцитах Тп2, природних клітинах-кілерах і клітинах іМКТ.
Встановлено зв'язок ССІ 17 із захворюваннями людини, які уражують різні органи, такими як виразковий коліт (С), атопічний дерматит (АЮ), ідіопатичний легеневий фіброз (ІРЕ) і бронхіальна астма (Веїрегіо еї аїЇ., У Іттипої, 173: 4692-469, 2004; СНгізіорні єї аї., Іпїатт
Воме! Орів. дої: 10.1002/ра.2295; Іпоце еї аї., Єиг ВНезріг у, 24: 49-56, 2004; КаКіпита еї аї.,
АПегду Сіїп Іттипої, 107: 535-541, 2001; Заєкі апа Татакі, У Оептаю! бсі, 43: 75-84, 2006;
Татакі єї аї., У Оептатю!, 33: 300-302, 2006). У мишей ССІ 17 зв'язаний із різними запальними станами і інфекціями, такими як хронічне запалення легенів, що є присутнім у моделях фіброзу й бронхіальної астми, коліт і шистосомоз, імовірно, шляхом індукції відповідей Тп2 через рекрутування імунних клітин ССК4». Нейтралізація ССІ 17 полегшує впливи захворювання як у моделях бронхіальної астми, викликаної А. Ритідайшве і овальбуміном (ОМА), так і ураження печінки в мишачій моделі індукованого Р. аспе5 ураження печінки шляхом блокування вхідного потоку Т-клітин (Сагрепіеєг апа Нодатоат Іптесі Іттип, 73:7198-7207, 2005; НеїівзекКе еї аї.,
Савігоеєпієгооду, 142:335-345; Нодатоат єї аі., Мей Мусої, 43 Биуррі 1, 5197-202, 2005;
Івтаїйоаім еї аї., Тнегарешііс їагдеййпу ої СС117 міа Ше зузієтіс адтіпівігайоп ої а топосіопаї апіїбоду атеїогасе5 ехрегітепіа! їшпда! азіпйта. Стаття представлена в Ат .) Везріг Стії Саге
Мей, 2011; ЧакКкибгіск еї а. Ат У Раїйої, 165:1211-122, 2004; КамжазакКі еї аї., У Іттипої, 166:2055-2062, 2001; Мопеуата 6вї а)., У Сіїп Іпмевзі, 102:1933-1941, 1998).
ССІ22 (МОСС) є другим лігандом для ССК4. Взаємодія ССМК4 із кожним хемокіном призводить до відмінних наслідків (АПеп еї аї., Аппи Вем Іттипої! 25:787-820, 2007; Ітаї еї аї., у
Віої! Спет 273:1764-1768, 1998), можливо зумовлених відмінностями в афінностях зв'язування двох лігандів для ССК4. СС122 зв'язує ССК4 із вищою афінністю й легше індукує інтерналізацію рецептора, ніж ССІ 17 (Вааїаг єї аї., У Іттипої! 179:1996-2004, 2007; Ітаї еї аї., у
Віої Спет 273:1764-1768, 1998; Магіапі еї аЇ., Еиг У Іттипої 34:231-240, 2004), і легше стимулює адгезію клітин, ніж ССІ 17 (С'Атьговіо еї аї., ) Іттипої! 169:2303-2312, 2002). 00122 демонструє більш обмежену експресію, причому його виробництво обмежене імунними клітинами, тоді як ССІ 17 експресується й секретується багатьма відмінними типами клітин, включаючи неїімунні клітини (АГегіпк еї аї., У Ехр Меа 197:585-599, 2003; Ветіп еїаІ., Ат У Незріг
Сеї! Мої Віої 24:382-389, 2001; СодівКа єї аї., / Ехр Мей 185:1595-1604, 1997; Ітаї еї аї., У Віо!
Спет 271:21514-21521, 1996; баєекі апа Татакі, У Вептаїйо! сі 43:75-84, 2006). У мишачій моделі експериментального сепсису з перев'язуванням і пункцією сліпої кишки (СІ Р), ССІ 22 стимулював вроджений імунітет, тоді як ССІ 17 здавалося виявляв шкідливий вплив і, за деяких обставин, сприяв пошкодженню органів (МаїзиКкама еї аї., Вем Іттиподепеї 2:339-358, 2000). У мишачій моделі інвазивного аспергільозу легенів ССІ 22 відігравав захисну роль у вродженій протигрибковій відповіді, тоді як ССІ 17 відігравав роль супресора (Сагрепієг апа Нодабоат,
ІпїТесі Іттип 73:7198-7207, 2005). Ці два хемокіни можуть відігравати протилежні ролі у виникненні локалізованого запалення через відмінні впливи на гомеостаз Тгед, оскільки рекрутуванню Тгед сприяє ССІ 22, але не ССІ117 (НеїізеКе еї аїІ., Савігоепівегоїоду 142:335- 345,2011; Мопіапе еї аї., ) Сіїп Іпмевзі, 121:3024-30, 2011; Мебрег сеї аї., У Сіїп Іпиезі 121:2898- 2910, 2011).
У тваринних моделях контактної гіперчутливості ССІ17 є основним фактором ініціації запальної відповіді, яка призводить до контактної гіперчутливості (СН) у відповідь на навантаження у вигляді РІТС або ОМЕВ, і нокаут ССІ 17 у цих мишей збільшував виживання серцевих алотрансплантатів порівняно з гетерозиготними мишами, що мали один функціональний алель ССІ 17 (Агкегіпк еї аІ., У Ехр Меа 197:585-599, 2003).
Антагоністи ССКА можуть бути неселективними і інгібувати функції як ССІ 17, так і ССІ 22.
Таким чином, існує необхідність у антитілах до ССІ 17 для потенційного лікування різноманітних захворювань, опосередкованих ССІ 17, включаючи бронхіальну астму.
Суть винаходу
Одним варіантом втілення винаходу є виділене антитіло, яке специфічно зв'язує людський
СС 17, яке містить варіабельну область важкого ланцюга (МН) і варіабельну область легкого ланцюга (М), де антитіло конкурує за зв'язування з людським ССІ 17 з антитілом, яке містить
МН із БЕО ІО МО:45 і МІ із БЕО ІЮ МО: 52.
Іншим варіантом втілення винаходу є виділене антитіло, яке специфічно зв'язує людський
СС 17, яке має послідовність із зХЕО ІО МО: 1, де антитіло зв'язує людський ССІ 17 принаймні в межах амінокислотних залишків ССІ 17 21-23, 44-45 і 60-68.
Іншим варіантом втілення винаходу є виділене антитіло, яке специфічно зв'язує людський
СС 17, де антитіло зв'язує людський ССІ 17 із константою афінності (Ко) приблизно 1 х 1070 М або менше, де Ко вимірюють із використанням рівноважної афінності в розчині в сольовому буфері на основі трис, що містить 0,05 95 твін-20, після спільної інкубації антитіла й людського
СС 17 протягом 48 годин за 4 "С.
Іншим варіантом втілення винаходу є виділене антитіло, яке специфічно зв'язує людський
СС 17, що містить певні послідовності НСОКІ, НСОМК2, НСОКЗ І СОМ, 1 СОК2і СОМ.
Іншим варіантом втілення винаходу є виділене антитіло, яке специфічно зв'язує людський
СС 17, що містить певні послідовності МН і МІ...
Іншим варіантом втілення винаходу є виділене антитіло, яке специфічно зв'язує людський
СС 17, де антитіло містить МН, що містить амінокислотну послідовність принаймні на 90 95, 91 95, 92 У, 93 Фо, 94 90, 95 о, 96 95, 97 У, 98 95 або 99 95 ідентичну МН із БЕО ІО МО: 46, і МІ, що містить амінокислотну послідовність принаймні на 90 95, 91 У, 92 У, 93 Ус, 94 Уо, 95 Фо, 96 9о, 97 У», 98 95 або 99 95 ідентичну Мі із БЕО ІЮ МО: 62.
Іншим варіантом втілення винаходу є фармацевтична композиція, що містить антитіло згідно з винаходом і фармацевтично прийнятний носій.
Іншим варіантом втілення винаходу є виділений полінуклеотид, що кодує МН або МІ. згідно з винаходом.
Іншим варіантом втілення винаходу є вектор, що містить полінуклеотид згідно з винаходом.
Іншим варіантом втілення винаходу є клітина-хазяїн, що містить вектор згідно з винаходом.
Іншим варіантом втілення винаходу є спосіб отримання антитіла згідно з винаходом, що включає культивування клітини-хазяїна згідно з винаходом в умовах, за яких продукується
Зо антитіло.
Іншим варіантом втілення винаходу є спосіб лікування захворювання, опосередкованого
ССІ17, що включає введення суб'єкту, який цього потребує, антитіла згідно з винаходом протягом періоду часу, достатнього для лікування захворювання, опосередкованого ССІ 17.
Іншим варіантом втілення винаходу є спосіб лікування бронхіальної астми або гіперреактивності дихальних шляхів, що включає введення суб'єкту антитіла згідно з винаходом протягом періоду часу, достатнього для лікування бронхіальної астми.
Короткий опис рисунків
На Фіг. 1А показано інгібування хемотаксису антитілом В302 до ССІ 17, індукованим 1 нм людського ССІ 17 у клітинах ССКЕ-СЕМ. В302 являє собою С178302.
На Фіг. 18 показано інгібування хемотаксису антитілом В311 до ССІ 17, індукованим 1 нм людського ССІ 17 у клітинах ССКЕ-СЕМ. В311 являє собою С17В311.
На Фіг. 1С показано вплив контролю ізотипу ІдД052 на хемотаксис, індукований 1 нм людського ССІ 17 у клітинах ССКЕ-СЕМ.
На Фіг. 10 показано вплив контролю ізотипу Ід054 на хемотаксис, індукований 1 нм людського ССІ 17 у клітинах ССКЕ-СЕМ.
На Фіг. 2А показано інгібування хемотаксису антитілом В302 до ССІ 17, індукованим 1 нм
СС 17 яванського макака в клітинах НОС-Е. В3З02 являє собою С178302.
На Фіг. 28 показано інгібування хемотаксису антитілом В311 до ССІ 17, індукованим 1 нм
СС 17 яванського макака в клітинах НОС-Е. В311 являє собою С178311.
На Фіг. 2С показано вплив контролю ізотипу І(д52 на хемотаксис, індукований 1 нМ СС 17 яванського макака в клітинах НЗСО-Е.
На Фіг. 20 показано вплив контролю ізотипу ІдД4 на хемотаксис, індукований 1 нМ СС 17 яванського макака в клітинах НЗСО-Е.
На Фіг. З показано послідовності МН антитіл до ССІ 17, що зв'язуються з людським ССІ 17 із
Ко 100 нМ або нижче.
На Фіг. 4 показано консенсусні послідовності МН і НСОК антитіл до ССІ 17, показаних на Фіг.
З, що зв'язуються з людським ССІ 17 із Ко 100 нМ або нижче.
На Фіг. 5 показано послідовності МІ. антитіл до ССІ 17, що зв'язуються з людським ССІ 17 із
Ко 100 нМ або нижче.
На Фіг. бА показано консенсусну послідовність Мі. антитіл до ССІ 17, показаних на Фіг. 5, що зв'язуються з людським СС 17 із Ко 100 нМ або нижче.
На Фіг. 6В показано консенсусні послідовності І СОК антитіл до ССІ 17, показаних на Фіг. 5, що зв'язуються з людським ССІ 17 із Ко 100 нМ або нижче.
На Фіг. 7 показано епітопний і паратопний залишки антитіла С178236. Паратопні залишки
МН ї М. обведені прямокутниками, а епітопні залишки ССІ17 обведені колами. Нумерація залишків відповідає ЗЕО ІО МО: 45 (МН), 5ЕО ІЮ МО: 52 (М), ЗЕО ІЮ МО: 1 (СС 17).
Детальний опис винаходу
Усі публікації, включаючи, серед іншого, патенти й патентні заявки, наведені в цьому описі, включені в цей документ шляхом посилання так, нібито їх було викладено повністю.
Необхідно розуміти, що термінологія в цьому документі вживається виключно для опису певних варіантів втілення й не має обмежувального характеру. Якщо не вказано інше, усі технічні й наукові терміни, використані в цьому документі, мають те саме значення, яке зазвичай розуміє звичайний фахівець у галузі, до якої належить цей винахід.
Незважаючи на те, що будь-які способи й матеріали, аналогічні або еквівалентні тим, які описані в цьому документі, можуть бути використані на практиці для тестування цього винаходу, у цьому документі описано типові матеріали й способи. В описі й формулі цього винаходу використовуватиметься наступна термінологія.
У контексті цього документа термін "специфічне зв'язування" або "специфічно зв'язується" або "зв'язується" стосується зв'язування антитіла з заздалегідь встановленим антигеном із більшою афінністю, ніж для інших антигенів. Зазвичай антитіло зв'язується з заздалегідь встановленим антигеном із константою дисоціації (Ко) приблизно 1 х 107 М або менше, наприклад, приблизно 1 х 108 М або менше, приблизно 1 х 109 М або менше, приблизно 1 х 10- 10 М або менше, приблизно 1 х 10-! М або менше, приблизно 1 х 10-72 М або менше, приблизно 1 х 1073 М або менше або приблизно 1 х 1077 М або менше, зазвичай із Ко, яка принаймні в десять разів менша, ніж його Ко для зв'язування з неспецифічним антигеном або епітопом (наприклад, В5А, казеїном). Константу дисоціації можна виміряти з використанням стандартних процедур. Однак антитіла, які специфічно зв'язуються з заздалегідь встановленим антигеном, можуть мати перехресну реактивність з іншими спорідненими антигенами, наприклад, із тим самим заздалегідь встановленим антигеном від інших видів (гомологами), таких як людина або мавпа, наприклад, Масаса їазсісціагі5 (яванський макак, супо) або Рап ігодіодуїе5 (шимпанзе, сПпітр). "Моноклональне антитіло, яке специфічно зв'язує людський ССІ 17" стосується антитіл, що специфічно зв'язують людський зрілий ССІ 17, який має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮО МО: 1.
У контексті цього документа, "нейтралізуюче" або "нейтралізує"! або "нейтралізуюче антитіло" або "антагоніст антитіла" стосується антитіла або фрагмента антитіла, які частково або повністю інгібує, у будь-який спосіб, біологічну активність ССІ 17. Нейтралізуючі антитіла можна ідентифікувати з використанням аналізів біологічної активності ССІ 17, як описано нижче.
Нейтралізуючі антитіла ССІ 17 можуть інгібувати виміряну біологічну активність ССІ 17 на 20 95,
ЗО о, 40 90, 50 90, 60 9, 70 У, 75 У, 80 9о, 85 9о, 90 90, 95 95, 96 9, 97 о, 98 о, 99 90 або 100 95.
Взаємозамінні в контексті цього документа терміни "людський ССІ17" або "пиСсІ 17" відносяться до людського білка ССІ 17, що має амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ
МО: 1. Послідовність повнорозмірного ССІ 17, включаючи сигнальну послідовність, доступна в
СепВапк; номер доступу МР 002978.
Взаємозамінні в контексті цього документа терміни "ССІ 17 яванського макака" або "ССС 17" відносяться до білка ССІ117 Масаса Тавсісціагіє (яванського макака), що має амінокислотну послідовність, наведену в ЗЕО ІЮ МО: 2.
У контексті цього документа термін "антитіла" використовуються в широкому значенні і включає молекули імуноглобуліну, включаючи моноклональні антитіла, включаючи мишацчці, людські, гуманізовані й химерні антитіла, фрагменти антитіл, біспецифічні або мультиспецифічні антитіла, утворені принаймні з двох інтактних антитіл або фрагментів антитіл, димерних, тетрамерних або мультимерних антитіл, одноланцюгових антитіл, і будь-яку іншу конфігурацію молекули імуноглобуліну, яка містить сайт розпізнавання антигена з потрібною специфічністю.
Імуноглобуліни можна віднести до п'яти основних класів, а саме ІдА, дО, ЧЕ, дос і ДМ, залежно від амінокислотної послідовності константного домену важких ланцюгів. ДА і до додатково поділяють на ізотипи ІдА:, ІдАг, даси, ІДС», ІдСз і ІдСз4. Легкі ланцюги антитіл будь- якого виду хребетних можна віднести до одного з двох чітко відмінних типів, а саме каппа (к) і 60 лямбда (ХА), на основі амінокислотних послідовностей їхніх константних доменів.
Термін "фрагменти антитіл" стосується частини молекули імуноглобуліну, яка зберігає антиген-зв'язуючий сайт важких ланцюгів і/або легких ланцюгів, наприклад, області, що визначають комплементарність, важких ланцюгів (НСОК) 1, 2 і 3, області, що визначають комплементарність, легких ланцюгів (ІСОК) 1, 2 і 3, варіабельну область важких ланцюгів (МН) або варіабельну область легких ланцюгів (МІ). Фрагменти антитіла включають фрагмент Раб, одновалентний фрагмент, що складається з Мі або МН; фрагмент К(абр)», двовалентний фрагмент, що містить два фрагменти Раб, зв'язаних дисульфідним містком у шарнірній ділянці; фрагмент Га, що складається з доменів УН і СНІ; фрагмент Ем, що складається з доменів Мі і
МН єдиного плеча антитіла; фрагмент ЯАБ (УмМага еї аї., Маїште 341:544-546, 1989), який складається з домену УН. Домени МН і Мі. можуть бути сконструйовані і зв'язані один з одним за допомогою синтетичного лінкера з утворенням різних типів конструкцій одноланцюгових антитіл, де домени МНЛ/І. паруються внутрішньомолекулярно або міжмолекулярно в тих випадках, коли домени МН і МІ. експресуються окремими конструкціями одноланцюгових антитіл з утворенням сайту зв'язування одновалентного антигена, наприклад, одноланцюговим Ем (ЗсЕм) або діатілом; описані, наприклад, у міжнародній патентній публікації Мо УМО1998/44001, міжнародній патентній публікації Мо У/О1988/01649; міжнародній патентній публікації Ме У/О1994/13804; міжнародній патентній публікації Мо УМО1992/01047. Ці фрагменти антитіл отримують із використанням добре відомих способів, і ці фрагменти характеризують у такий самий спосіб, що і інтактні антитіла.
Фраза "виділене антитіло" стосується антитіла, яке по суті не містить інших антитіл, що мають відмінні антигенні специфічності (наприклад, виділене антитіло, яке специфічно зв'язує людський ССІ 17 по суті не містить антитіл, які специфічно зв'язують антигени людини, крім людського ССІ 17). Виділене антитіло, яке специфічно зв'язує людський ССІ 17 може, однак, мати перехресну реактивність до інших антигенів, таких як ортологи людського ССІ 17, такі як
ССІ 17 Масаса Тазсісціагіз (яванського макака). Крім того, виділене антитіло може по суті не містити інший клітинний матеріал і/або хімічні речовини.
Варіабельна область антитіла складається з області "каркаса", що переривається трьома "антиген-зв'язуючими сайтами". Антиген-зв'язуючі сайти визначаються з використанням різних термінів: (ї) області, що визначають комплементарність (СОК), три у МН (НСОКІ1, НОСОК,
Зо НСОКЗ) і три у МІ (СОМ, І СОК2, І СО) на основі варіабельності послідовностей (Ууи апа
Кабаї, У Ехр Мей 132:211-50, 1970; Кабаї єї а!., хХедоепсез ої Ргоївїп5 ої Іттипоодісаї! Іпіегеві,
Б Ба. Рибіс Неантий Бегмісе, Маїййопа! Іпвійшев ої Неамнйй, ВеїШезаа, Ма., 1991); (ії) "гіперваріабельні області", "НМА" або "НУ", три у МН (НІ, Н2, НЗ) ї три у МІ (ІТ, 12, І 3), відносяться до областей варіабельних доменів антитіл, які мають гіперваріабельну структуру за визначенням СПпоїйпіа і ГезК (СпоїШіа апа ГевзКк Мої! Віої 196:901-17, 1987). Інші терміни включають "ІМОТ-СОВ" (І етапс еї а!І., Оем Сотрагаї Іттипої! 27:55-77, 2003) і "використання залишку, який визначає специфічність" (5ЗОКО) (АІтадго, Мо! Кесодпй, 17:132-43, 2004).
Міжнародна база даних ІпМипоСепеТісз (МСТ) (пНр/Ллмим/м ітді огу) пропонує стандартизовану нумерацію й визначення антиген-зв'язуючих сайтів. Відповідність між визначеннями СОК, НМ і ІМОТ описана в публікації І еїгапс еї аІ., Оем Сотрагаї Іттипої! 27:55- 77, 2003.
У контексті цього документа "залишки Споїйіа" є залишками Мі і МН антитіл, пронумерованими відповідно до АЇ-І агікапі (А1-І агікапі еї аї!., У Мої Віо! 273:927-48, 1997). "Каркас" або "каркасні послідовності" - це інші послідовності варіабельної області, крім тих послідовностей, які визначено як антиген-зв'язуючий сайт. Оскільки антиген-зв'язуючий сайт можна визначити за допомогою різних термінів, як описано вище, точна амінокислотна послідовність у каркасі залежить від того, як визначено антиген-зв'язуючий сайт.
Термін "гуманізоване антитіло" стосується антитіла, в якому антиген-зв'язуючий сайт отриманий із видів не людського походження, а каркаси варіабельної області отримано з послідовностей імуноглобуліну людини. Гуманізовані антитіла можуть включати заміщення в областях каркасів, так що каркас може не бути точною копією експресованого людського імуноглобуліну або генних послідовностей зародкової лінії.
Термін "людське антитіло" означає антитіло, яке має варіабельні області важкого й легкого ланцюгів, в яких каркас і антиген-зв'язуючий сайт отримано з послідовностей людського походження. Якщо антитіло містить константну область, цю константну область також отримують із послідовностей людського походження.
Людське антитіло містить варіабельні області важкого або легкого ланцюга, які "отримані з" послідовностей людського походження, якщо варіабельні області антитіла отримують із системи, в якій використовуються гени імуноглобулінів зародкової лінії людини або 60 перебудованих імуноглобулінів. Такі системи включають бібліотеки генів імуноглобулінів людини, наприклад, бібліотеки, продемонстровані на фагові й трансгенних тваринах не людського походження, наприклад, мишах із локусами імуноглобуліну людини, як описано в цьому документі. "Людське антитіло" може містити амінокислотні відмінності порівняно з послідовностями імуноглобуліну зародкової лінії або перебудованого імуноглобуліну внаслідок, наприклад, природних соматичних мутацій або навмисного введення заміщень. Зазвичай амінокислотна послідовність "людського антитіла" принаймні приблизно на 80 95, 85 95, 90 9, 95 95, 96 Фв, 97 9, 98 9», 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності, що кодується геном імуноглобуліну людської зародкової лінії або перебудованим геном імуноглобуліну. У деяких випадках "людське антитіло" може містити консенсусні каркасні послідовності, отримані з аналізу людської каркасної послідовності, наприклад, як описано в публікації Кпаррік еї аї.,.
Мої Віої 296:57-86, 2000), або синтетичну НСОКЗ, введену в бібліотеки генів імуноглобулінів людини, продемонстровані на фагові, наприклад, як описано в публікації Зі еї аї., / Мої Віо! 397:385-96, 2010 і міжнародній патентній публікації Мо УМО2009/08546).
Виділені гуманізовані антитіла можуть бути синтетичними. У той час як людські антитіла отримують із послідовностей людського імуноглобуліну, вони можуть бути отримані з використанням таких систем, як фаговий дисплей, що включає синтетичні СОР. і/або синтетичні каркаси, або можуть піддаватись іп міго мутагенезу, щоб покращити властивості антитіл, що призводить до отримання антитіл, які не існують у природі в репертуарі зародкової лінії антитіл людини іп мімо.
Людські антитіла можуть включати заміщення в каркасі, або в антиген-зв'язуючому сайті, тому вони можуть не бути точними копіями експресованого людського імуноглобуліну або генних послідовностей людської зародкової лінії. Однак антитіла, в яких антиген-зв'язуючі сайти отримано з видів не людського походження, не включено у визначення терміну "людське антитіло".
У контексті цього документа термін "рекомбінантне антитіло" включає всі антитіла, які отримані, експресовані, створені або виділені основаними на рекомбінації способами, такі як антитіла, виділені з організму тварини (наприклад миші), що є трансгенною або трансхромосомною для генів імуноглобуліну людини, або з гібридоми, отриманої від неї (додатково описано нижче), антитіла, виділені з клітини-хазяїна, трансформованої для експресії
Ко) антитіла, антитіла, виділені з рекомбінантної комбінаторної бібліотеки антитіл, і антитіла, отримані, експресовані, створені або виділені будь-якими іншими способами, які включають сплайсинг послідовностей генів імуноглобуліну людини з іншими послідовностями ДНК.
У контексті цього документа термін "моноклональне антитіло" стосується препарату молекул антитіл одномолекулярної композиції.
У контексті цього документа термін "по суті ідентичні" означає, що дві амінокислотні послідовності варіабельної області антитіла, які порівнюють, є однаковими або мають "несуттєві відмінності". Несуттєві відмінності - це заміщення 1, 2, 3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 амінокислот у послідовності варіабельної області антитіла, які не мають негативного впливу на властивості антитіла. Розкриті в цьому документі по суті ідентичні до послідовностей варіабельної області амінокислотні послідовності перебувають у рамках цього винаходу. У деяких варіантах втілення ідентичність послідовності може становити приблизно 90 95, 91 Об, 9296, 9395, 94 95, 9595, 9695, 97 95, 9895, 9995 або вище. Відсоток ідентичності можна визначити, наприклад, шляхом попарного вирівнювання з використанням налаштувань за замовчуванням модуля АїЇїдпХ Месіог МТ! м.9.0.0 (Іпмігодеп, м. Карлобад, штат Каліфорнія,
США). Послідовності білка згідно з цим винаходом можна використати як послідовність запиту для здійснення пошуку в публічно доступних або патентних базах даних, наприклад, для визначення споріднених послідовностей. Типовими програмами, які використовують для здійснення таких пошуків, є програми ХВГА5Т або ВІ АЗТР (пцр /Лумли посбі піт/піп дом) або комплект СепотеОцеві"Мм ((ЗепотеОцеві, м. Уестборо, штат Массачусетс, США) із використанням налаштувань за замовчуванням.
У контексті цього документа термін "епітоп" означає частину антигена, з якою специфічно зв'язується антитіло. Епітопи, як правило, складаються з хімічно активних (наприклад полярних, неполярних і гідрофобних) поверхневих скупчень функціональних груп, таких як амінокислоти або бічні ланцюги полісахаридів, і можуть мати специфічні тривимірні структурні характеристики, а також специфічні характеристики зарядів. Епітоп може складатися з суміжних іМабо несуміжних амінокислот, які утворюють конформаційну просторову одиницю. Для несуміжного епітопу амінокислоти з різних частин лінійної послідовності антигена опиняються в безпосередній близькості в З-вимірному просторі в результаті складання білкової молекули.
У контексті цього документа термін "біспецифічний" стосується антитіла або молекули, що бо зв'язує два різні антигени або два різні епітопи в межах антигена.
У контексті цього документа термін "моноспецифічний" стосується антитіла, яке зв'язує один антиген або один епітоп.
У контексті цього документа термін "у комбінації з" означає, що описані агенти можна ввести в організм тварини разом у вигляді суміші, одночасно у вигляді окремих агентів або послідовно у вигляді окремих агентів у будь-якому порядку.
Термін "вектор" означає неприродний полінуклеотид, здатний до дублювання в біологічній системі або який можна перемістити між такими системами. Полінуклеотиди вектора зазвичай містять кКДНК, що кодує білок, який становить інтерес, і додаткові елементи, такі як точки початку реплікації, сигнал поліаденілювання або маркери селекції, які функціонують для полегшення дублювання або підтримання цих полінуклеотидів у біологічній системі. Приклади таких біологічних систем можуть включати в себе клітину, вірус, тварину, рослину й відновлені біологічні системи, що використовують біологічні компоненти, здатні дублювати вектор.
Полінуклеотид, що містить вектор, може бути молекулою ДНК або РНК або їхнім гібридом.
Термін "експресійний вектор" означає вектор, який можна використати в біологічній системі або у відновленій біологічній системі для спрямування трансляції поліпептиду, кодованого полінуклеотидною послідовністю, присутньою в експресійному векторі.
Термін "полінуклеотид" означає молекулу, яка містить ланцюг нуклеотидів, ковалентно зв'язаних між собою цукор-фосфатним скелетом або іншим еквівалентним ковалентним хімічним зв'язком. Типовими прикладами полінуклеотидів є дво- й одноланцюгові ДНК і РНК. "Комплементарна ДНК" або "КДНК" стосується добре відомого синтетичного полінуклеотиду, який розділяє розташування елементів послідовності, що знаходяться в нативних зрілих видах
МРНК, із суміжними екзонами, з видаленими проміжними інтронами, присутніми в геномній ДНК.
Кодони, що кодують ініціаторний метіонін, можуть бути присутніми або відсутніми в КДНК. КкДНК можна синтезувати, наприклад, шляхом зворотної транскрипції або збирання синтетичного гена.
У контексті цього документа термін "синтетичний" або "неприродний" стосується молекули полінуклеотиду або поліпептиду, яка не зустрічається в природі.
Термін "поліпептид" або "білок" означає молекулу, яка містить принаймні два амінокислотні залишки, зв'язані пептидним зв'язком з утворенням поліпептиду. Малі поліпептиди, що містять менше ніж 50 амінокислот, можна називати "пептидами".
Зо Загальноприйняті одно- і трибуквені коди амінокислот, які використовуються в цьому документі, як показано в таблиці 1.
Таблиця 1 1111 Арінн////////Ї 77777777 А4Є111711111111111вССсСсСсСсСсСсСС 1111111 Аспартат///// | 77777777 АВр7171111111111110сСсСсСсСсС 11111 блутамн////// ЇЇ 77777777 бп77777/7ї1111111111111о11сСсСсССсСсС 111 волейциін/////// ЇЇ 77777776 1111 Пролн///////// | 77777777 РЮ/ 17711117 Р.ССС
Композиції речовини
У цьому винаході пропонуються моноклональні антитіла, які специфічно зв'язують людський
СС 17. Антитіла згідно з винаходом інгібують біологічну активність ССІ 17 у клітині, і можуть необов'язково перехресно реагувати з СС117 яванського макака. У цьому винаході пропонуються синтетичні полінуклеотиди, що кодують антитіла і їхні фрагменти, вектори й клітини-хазяїни, і способи утворення й використання антитіл згідно з винаходом.
Одним із варіантів втілення винаходу є виділене антитіло, яке специфічно зв'язує людський
СС 17.
Іншим варіантом втілення винаходу, описаного в цьому документі, є виділене антитіло, яке специфічно зв'язує людський ССІ 17, що містить варіабельну область важкого ланцюга (МН) і варіабельну область легкого ланцюга (МІ), де антитіло конкурує за зв'язування з людським
СС 17 з антитілом, яке містить МН із ЗЕО ІЮ МО:45 і МІ із БЕО ІЮ МО: 52.
Конкуренцію між специфічним зв'язуванням із людським ССіІ17 з антитілами згідно з винаходом, що містять певні амінокислотні послідовності МН і МІ, можна досліджувати іп міїго з використанням добре відомих способів. Наприклад, зв'язування М5О Зи!йийо-Тад'м МН5-естер- міченого антитіла з людським ССІ 17 за присутності неміченого антитіла можна проаналізувати за допомогою аналізів ЕГ ІЗА або Віасоге, або, для демонстрації конкуренції з антитілами згідно з винаходом, можна використати проточну цитометрію. Здатність досліджуваного антитіла інгібувати зв'язування антитіла, яке містить МН із ЗЕО ІЮ МО: 45 МІ із 5ЕБЕО ІЮО МО: 52, з людським ССІ 17 показує, що досліджуване антитіло може конкурувати з цими антитілами за зв'язування з людським ССІ 17.
Іншим варіантом втілення винаходу, описаного в цьому документі, є виділене антитіло, яке специфічно зв'язує людський ССІ 17, що має послідовність із ХЕО ІЮО МО: 1, де антитіло зв'язує людський ССІ 17 принаймні в межах амінокислотних залишків ССІ 17 21-23, 44-45 і 60-68. "Принаймні в межах амінокислотних залишків 21-23, 44-45 і 60-68 людського ССІ 17" означає, що антитіло до СС117 зв'язує принаймні один залишок, що розташований у межах амінокислотного проміжку з залишків 21-23 із БЕО ІО МО: 1, і принаймні один залишок, що розташований у межах амінокислотного проміжку залишків 44-45 із БЕО ІЮО МО: 1, і принаймні один залишок, що розташований у межах амінокислотного проміжку залишків 60-68 із БЕО ІЮ
МО: 1. Антитіло може зв'язувати більше ніж один залишок у межах залишків 21-23, 44-45 і 60- 68, і додаткові залишки поза межами залишків 21-23, 44-45160-68 із «ЕО ІО МО: 1.
У деяких варіантах втілення, описаних у цьому документі, антитіло зв'язує людський ССІ 17
Зо принаймні на залишках К22 і К23 із БЕО ІЮ МО: 1.
У деяких варіантах втілення, описаних у цьому документі, антитіло зв'язує людський ССІ 17 принаймні на залишках 1 21, К22, К23, М44, 045, МбО, у64, 5671168 із БЕО ІЮО МО: 1.
Типовим антитілом, яке зв'язує людський ССІ 17 у межах амінокислотних залишків ССІ 17 21-23,44-45160-68 із БЕО ІО МО: 1 є С17В236, що має МН із БЕО ІО МО: 45 і Мі із ЗЕО ІЮ МО: 52. На основі аналізу кристалічної структури основними епітопними залишками, зв'язаними
С178236, є К22 і К23 СС 17 із БЕО ІО МО: 1, на основі кількості контактів між цими залишками і залишками УН антитіла.
Іншими типовими антитілами, які зв'язують людський ССІ17 у межах амінокислотних залишків 21-23, 44-45 1160-68 ССІ 17 є різновиди С178236 із дозрілою афінністю, причому всі антитіла утворюються в результаті кампанії дозрівання афінності одного й того ж батьківського антитіла. Послідовності МН і МІ. типових антитіл наведені на Фіг. З і Фіг. 5. Дозрівання афінності антитіл зазвичай включає заміщення амінокислот у СОК або в зоні Верньєра (каркасні області, що лежать у основі СОК). Дозрілі різновиди відбирають шляхом пеннінгу комбінаторних бібліотек, що можуть містити до 109 мутантів. Обмеження розміру бібліотеки обмежує кількість варіабельних положень до 6-7, якщо у кожному положенні дозволені всі 20 амінокислот. У кожній комбінаторній бібліотеці збережено більшість паратопних залишків, що забезпечує також збереження зв'язуючого епітопа. Декілька кристалографічних досліджень батьківських і дозрілих антитіл продемонстрували, що епітоп завжди зберігається протягом дозрівання афінності (наприклад, Егапв55оп еї аї., У. Мої. Віо!Ї. 2010; 398:214-231; Сивісніпа єї а!., Рі о5 Раїноа. 2010, б:'е1001182; Га Ропе вї аІ., МАБз 2014; 6:1059-1068).
Антитіла до ССІ 17, що зв'язують людський ССІ 17 у межах амінокислотних залишків 21-23, 44-45 1160-68 ССІ 17, зв'язують людський ССІ 17 із високою афінністю, зазвичай із Ко менше ніж приблизно 1 х 1079 М.
Антитіла, які зв'язують людський ССІ 17 у межах амінокислотних залишків 21-23, 44-45 і 60-68 ССІ17 можна отримати, наприклад, шляхом імунізації мишей химерним білком ССІ 17, що має послідовності людського ССІ17 у положеннях залишків 21-23, 44-45 і 60-68, або пеннінгом диким типом людського ССІ 17 бібліотек фагового дисплея й перехресним скринінгом отриманих найкращих хітів із різновидами ССІ 17, що мають заміщення в кожному або декількох положеннях залишків у межах залишків 21-23, 44-45 і 60-68 людського ССІ117 із 60 використанням способів, описаних у цьому документі.
У деяких варіантах втілення цього винаходу, описаних у цьому документі, антитіло, яке специфічно зв'язує людський ССІ 17, блокує взаємодію ССІ 17/СС4.
Антитіла можна тестувати на їхню здатність блокувати взаємодію ССІ17/ССР4 за допомогою стандартної проточної цитометрії. Наприклад, клітини, що експресують СОСКА, інкубують із флуоресцентно-міченим людським ССІ 17 і досліджуваними антитілами, після чого зв'язування флуоресцентно-міченого людського ССІ 17 із клітинами, що експресують СОСКА, оцінюють із використанням стандартних способів. Антитіла, які "блокують взаємодію
СС 17/СсСт4" або "інгібують взаємодію ССІ 17/24", можуть інгібувати зв'язування ССІ 17 із клітинами, що експресують ССК4, на 30 Уо, 40 95, 5095, 60 90, 70 90, 75 0, 80 о, 85 95, 90 9о, 9596, 96 95, 97 95, 9895, 9995 або 10095 порівняно зі зв'язуванням СС117 за відсутності антитіла.
Іншим варіантом втілення винаходу, описаного в цьому документі, є виділене антитіло, яке специфічно зв'язує людський ССІ17, де антитіло зв'язує людський ССІ17 із константою афінності (Ко) приблизно 1 х 107 М або менше, приблизно 1 х 108 М або менше, приблизно 1 х 109 М або менше, приблизно 1 х 1079 М або менше, приблизно 1 х 10-77 М або менше, приблизно 1 х 1072 М або менше, приблизно 1 х 1073 М або менше або приблизно 1 х 10-77 М або менше, коли Ко вимірюють із використанням рівноважної афінності в розчині в сольовому буфері на основі трис, що містить 0,05 95 твін-20, після спільної інкубації антитіла й людського
СС 17 протягом 48 годин за 4 "С.
У деяких варіантах втілення, описаних у цьому документі, антитіло зв'язує людський ССІ 17 із константою афінності (Ко) приблизно 1 х 1079 М або менше, коли Ко вимірюють із використанням рівноважної афінності в розчині в сольовому буфері на основі трис, що містить 0,05 95 твін-20, після спільної інкубації антитіла й людського ССІ 17 протягом 48 годин за 4 "С.
У деяких варіантах втілення, описаних у цьому документі, антитіло зв'язує людський ССІ 17 з Ко приблизно 5 х 10-72 М або менше.
В інших варіантах втілення, описаних у цьому документі, антитіло згідно з винаходом, що специфічно зв'язує людський ССІ 17, зв'язує ССІ 17 Масаса газсісціагіх (яванського макака) з константою афінності (Ко) приблизно 1 х 105 М або менше, приблизно 1 х 107 М або менше, приблизно 1 х 109 М або менше, приблизно 1 х 109 М або менше, приблизно 1 х 1079 М або
Ко) менше, приблизно 1 х 10-17 М або менше або приблизно 1 х 1072 М або менше, коли Ко вимірюють із використанням рівноважної афінності в розчині в сольовому буфері на основі трис, що містить 0,05 95 твін-20, після спільної інкубації антитіла й ССІ 17 яванського макака протягом 48 годин за 4 "С.
У деяких варіантах втілення, описаних у цьому документі, антитіло згідно з винаходом зв'язує ССІ 17 Масаса газсісціагіз (яванського макака) з Ко приблизно 1 х 108 М або менше, коли Ко вимірюють із використанням рівноважної афінності в розчині в сольовому буфері на основі трис, що містить 0,05 95 твін-20, після спільної інкубації антитіла й ССІ 17 яванського макака протягом 48 годин за 4 "С.
Афінність антитіла до людського ССІ 17, що має послідовність із «ЕО ІЮ МО: 1 або ССІ 17 яванського макака, що має послідовність із «ЕС ІЮ МО: 2 можна виміряти експериментально з використанням будь-якого відповідного способу. У таких способах можна застосовувати вимірювальні прилади Ргоїеоп, Віасоге або КіпЕхА, як-от РгоїеОп ХРЕЗ3б або Віасоге 3000, аналізи рівноважної афінності в розчині (ЗЕА), ЕГІЗА або аналізи конкурентного зв'язування, відомі фахівцям у цій галузі. Типовими способами є такі, що описані в прикладі 3. Виміряна афінність конкретної взаємодії антитіла/сСіІ 17 може змінюватися, якщо вимірюється за різних умов (наприклад, осмолярність, рН, буфер, концентрація детергентів). Таким чином, вимірювання афінності та інших параметрів зв'язування (наприклад, Ко, Кпряма, Кзворотня) переважно проводять за стандартних умов і зі стандартизованим буфером, такими як буфер, описаний у цьому документі. Фахівцям у цій галузі буде зрозуміло, що внутрішня помилка під час вимірювання афінності, наприклад, із використанням рівноважної афінності в розчині,
Віасоге 3000 або Ргоїеоп (вимірюється як стандартне відхилення, 50), може звичайно перебувати в межах 5-33 95 для вимірювання в типових межах виявлення. Таким чином, термін "приблизно" відображає типове стандартне відхилення в аналізі. Наприклад, типове 50 для Ко 1 х 109 М становить до х 0,33 х 1079 М.
Іншим варіантом втілення винаходу, описаного в цьому документі, є виділене антитіло, яке специфічно зв'язує людський ССІ 17, де антитіло інгібує біологічну активність ССІ 17.
У контексті цього документа "біологічна активність ССІ17" відноситься до будь-якої активності, що виникає в результаті зв'язування ССІ17 із його рецептором ССК4. Типова біологічна активність ССІ17 є результатом мобілізації внутрішньоклітинного кальцію або 60 хемотаксису клітин, наприклад, клітин ССКЕ-СЕМ (Т-лімфобластоїдної клітинної лінії від пацієнта з гострим лейкозом). Антитіла згідно з винаходом можна тестувати на їхню здатність інгібувати біологічну активність ССІ17 з використанням стандартних способів і способів, описаних у цьому документі. Наприклад, здатність антитіл згідно з винаходом інгібувати ССІ 17- залежну мобілізацію внутрішньоклітинного кальцію можна досліджувати шляхом вимірювання впливу антитіл на ССІ 17-індуковану мобілізацію кальцію з використанням флуоресцентних барвників, таких як РІшо-8 ММУ, Ріно-4 АМ або Рійо-3 АМ. Здатність антитіл згідно з винаходом інгібувати ССІ 17-індукований хемотаксис можна виміряти шляхом вимірювання міграції клітин
ССВАЕ-СЕМ через напівпроникний фільтр 5 мкм у двокамерній системі культивування і вимірювання життєздатності клітин, що мігрують через фільтр. Антитіла згідно з винаходом можуть інгібувати біологічну активність ССІ17 на приблизно 20 95, 30 Зо, 40 95, 50 о, 60 бо, 70 Фо, 75 ую, 80 95, 85 Зо, 90 9, 91 Фо, 92 о, 93 9, 94 9, 95 о, 96 Фо, 97 о, 98 95, 99 95 або 100 9.
Іншим варіантом втілення винаходу, описаного в цьому документі, є антитіло, яке специфічно зв'язує ССІ 17, де антитіло інгібує індуковану 10 нг/мл людського ССІ 17 мобілізацію кальцію в клітинах ССКЕ-СЕМ, як виміряно з використанням БіІшо-8 ММУМ, із значенням ІСво приблизно 1 х 10-77 М або менше, приблизно 1 х 109 М або менше або приблизно 1 х 109 М або менше.
Іншим варіантом втілення винаходу, описаного в цьому документі, є антитіло, яке специфічно зв'язує ССІ 17, де антитіло містить області, що визначають комплементарність, важких ланцюгів (НСОК) 1 (НСОКІ), 2 (НСОМ2) ії 3 (НСОКЗ), і області, що визначають комплементарність, легких ланцюгів (СОМ) 1 (СО), 2 (1 СОК2) і 3 (СОКЗ), де НСОКІ1, нНеОК2, НСОКЗ, І СОК1, І СО2 і СО містять амінокислотні послідовності із ФЗЕО ІЮ МО: 4, 5, 71, 72, 73 і 74, відповідно.
Антитіла, які містять послідовності НСОК і ГСОК із БЕО ІЮО МО: 4, 5, 71, 72, 73 і 74 зв'язують людський ССІ 17 із Ко 1 х 1079 або менше.
НОСОВІ: БУЛО (ЗЕО І МО: 4).
НСОВ2г: ПОРБОБОТАУВРБЕО (5ЕО ІО МО: 5).
Консенсусна послідовність НСОКЗ
УаРАВЮУМОХ:ЕОМ (5ЕО ІО МО: 71), де
Ко) Хі являє собою 5, А або Т.
Консенсусна послідовність | СОК1:
КЗБОБЗМІ ХХ» х зМХАМХ»І А (З5ЕО І МО: 72), де
Хі являє собою І, У, 5 або М;
Хг являє собою Е, Р, Н або І;
Хз являє собою Ю, У, МУ, Т або М;
Ха являє собою І, Е, 5, Т, М, М, КабоМм; і
Хо являє собою К, А, о, Т або 0.
Консенсусна послідовність | СОК2:
ХІАБЗТВЕ (ЗЕО ІО МО: 73), де
Хі являє собою М, Н, о, Е, Т або 0.
Консенсусна послідовність | СОКЗ:
ОХ х 2Хз х «РХ5Т (ЗЕО І МО: 74); де
Хі являє собою ЕК, У, Т або Н;
Хг являє собою "У, І, М або МУ;
Хз являє собою 5, А, І, І, Т, О або Н;
Ха являє собою М, Т, І, М, або;
БО Х5 являє собою 5, Е, А або.
У деяких варіантах втілення, описаних у цьому документі, НСОКІ1 містить послідовність із
ЗЕО ІЮ МО: 4, НСОКЗ містить послідовність із ФЕО ІЮ МО: 5, ії НСОКЗ містить послідовність із
ЗЕО ІО МО: 6, 42, 43 або 44 у антитілі згідно з винаходом, що специфічно зв'язує ССІ 17.
У деяких варіантах втілення, описаних у цьому документі, НСОК'І1 містить амінокислотну послідовність із БЕО ІЮО МО: 4, НСОКЗ2 містить амінокислотну послідовність із зЕО ІЮ МО: 5, і
НСОСОКЗ містить амінокислотну послідовність із ФЕО ІЮ МО: 6, 42 або 43.
У деяких варіантах втілення, описаних у цьому документі, ГСОКІ1 містить послідовність із
ЗЕО ІЮ МО: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 або 18; І СОР2 містить послідовність із ЗЕО ІЮ
МО: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 39, 40 або 41; і | СОРЗ містить послідовність із «ЕО ІЮ МО: 27,
28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 або 38 у антитілі згідно з винаходом, що специфічно зв'язує
СС 17.
У деяких варіантах втілення, описаних у цьому документі, ЇСОК1 містить амінокислотну послідовність із 5ЕО ІЮ МО: 8, 9, 10, 13, 14, 15, 17 або 18, ЇСОК2 містить амінокислотну послідовність із ХЕО ІЮ МО: 20, 21, 22, 24, 25 і 26, і Її СОКЗ містить амінокислотну послідовність із ЗЕО ІО МО: 28, 29, 30, 33, 34, 35, 37 або 38.
У деяких варіантах втілення, описаних у цьому документі, антитіло, яке специфічно зв'язує
СС 17, містить МН із ЗЕО ІО МО: 75 і МІ із БЕО ІЮ МО: 76.
Консенсусна послідовність МН (ЗЕО ІО МО: 75).
ЕМОЇ МОБОАЕМККРОЕБІ КІЗСКа Ба УЗЕТЗУМІСМУВОМРаКаТї ЕМ МОапПОРБОБОТАХУ5РОЕ
ОСОМТІЗАОК5ІЗТАМІ ОМУ55І КАБОТАМУУСАВМОаРАВЮУМ ОХ ЄВУ СОСТІ МТУ55 де
Хі являє собою 5, А або Т.
Консенсусна послідовність МІ (5ЕО ІЮ МО: 76):
РІММТО5РОБІ АМ5І ЕВАТІМСКОБВОБМІ Хі ЗХ» х
ЗМХАМХ5І АММООКРООРРКІ ПУИХвАЗТАЕЗОаМРОВЕЗОаЗИавОИ ТО ТІ ТІЗ5І ОАЛЕОМАММУСОСХ» хх 8Хе х 10 Х 1 ТЕООСТКМЕЇК; де
Хі являє собою І, У, 5 або М;
Хг являє собою Е, Р, Н або І;
Хз являє собою Ю, У, МУ, Т або М;
Ха являє собою І, Е, 5, Т, М, М, К або мМ;
Хо являє собою К, А, о, Т або 0;
Хе являє собою М, Н, о, Е, Т або 0;
Х7 являє собою ЕК, У, Т або Н;
Хв являє собою "У, І, М або МУ;
Хе» являє собою 5, А, І, І, Т, О або Н;
Хіо являє собою М, Т, І, М, або;
Хії являє собою 5, Е, А або І.
У деяких варіантах втілення, описаних у цьому документі, антитіло, яке специфічно зв'язує
Зо СС 17, містить МН із ЗЕО ІО МО: 45, 46, 47 або 48.
У деяких варіантах втілення, описаних у цьому документі, антитіло, яке специфічно зв'язує
ССІ 17, містить МІ із БЕО ІЮ МО: 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 або 66.
У деяких варіантах втілення, описаних у цьому документі, антитіло, яке специфічно зв'язує
СС 17, містить МН, що містить амінокислотну послідовність із «ЕО ІЮ МО: 45, 46 або 47.
У деяких варіантах втілення, описаних у цьому документі, антитіло, яке специфічно зв'язує
СС 17, містить МІ, що містить амінокислотну послідовність із ЗЕО ІЮО МО: 50, 51, 52, 55, 56, 57, 59, 60 або 62.
Іншим варіантом втілення винаходу, описаного в цьому документі, є виділене антитіло, яке специфічно зв'язує ССІ 17, де антитіло містить послідовності НСОКІ, НСОК2, НСОКЗ, І СОК1,
ІСОВ2і1 СОВЗ із
ЗЕОІЮ МО: 4, 5,6, 7, 19 і 27, відповідно;
ЗЕОЮ МО: 4, 5, 6, 8, 20 і 28, відповідно;
ЗЕОЮ МО: 4, 5, 6, 9, 21 і 29, відповідно;
ЗЕОІЮО МО: 4, 5,6, 10, 22 і 30, відповідно;
ЗЕОЮ МО: 4, 5, 6, 11, 23 і 31, відповідно;
ЗЕОЮ МО: 4, 5, 6, 12, 24 і 32, відповідно;
ЗЕОІЮ МО: 4, 5, 6, 13, 21 і 33, відповідно;
ЗЕОЮО МО: 4, 5, 6, 14, 20 і 34, відповідно;
ЗЕОЮ МО: 4, 5, 6, 15, 25 і 35, відповідно;
ЗЕОІЮО МО: 4, 5,6, 16, 21 і 36, відповідно;
ЗЕОІЮ МО: 4, 5,6, 17, 25 і 37, відповідно;
ЗЕОЮ МО: 4, 5, 6, 18, 26 і 38, відповідно;
ЗЕО ІЮ МО: 4, 5, 6, 8, 39 і 28, відповідно;
ЗЕОЮ МО: 4, 5, 6, 8, 24 і 28, відповідно;
ЗЕОЮ МО: 4, 5, 6, 8, 22 і 28, відповідно;
ЗЕОЮ МО: 4, 5, 6, 8, 40 і 28, відповідно;
ЗЕОЮ МО: 4, 5, 6, 8, 26 і 28, відповідно;
ЗЕОЮ МО: 4, 5, 6, 8, 41 і 28, відповідно; 60 ЗЕОІЮ МО: 4, 5, 42, 8, 24 і 28, відповідно;
5ЕО ІЮО МО: 4, 5, 43, 8, 24 і 28, відповідно; або 5ЕО ІЮ МО: 4, 5, 44, 8, 24 і 28, відповідно.
Іншим варіантом втілення винаходу, описаного в цьому документі, є виділене антитіло, яке специфічно зв'язує ССІ 17, де антитіло містить
МН із БЕО ІЮО МО: 45 і МІ із БЕО ІЮ МО: 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 або 66;
МН їі МІ. із БЕО ІО МО: 46 і 62, відповідно;
МН і МІ. із БЕО ІО МО: 47 і 62, відповідно; або
МН і МІ. із ЗБЕО ІО МО: 48 і 62, відповідно.
Іншим варіантом втілення винаходу, описаного в цьому документі, є виділене антитіло, яке специфічно зв'язує ССІ 17, де антитіло містить
МН із БЕО ІО МО: 45 і МІ із БЕО ІЮ МО: 50, 51, 52, 55, 56, 57, 59 або 60;
МН і МІ. із БЕО ІО МО: 46 і 62, відповідно; або
МН і МІ. із ЗЕО ІО МО: 47 і 62, відповідно.
Іншим варіантом втілення винаходу, описаного в цьому документі, є виділене антитіло, яке специфічно зв'язує ССІ 17, де антитіло містить МН із БЕО ІО МО: 45 і МІ із ЗЕО ІЮ МО: 50.
Іншим варіантом втілення винаходу, описаного в цьому документі, є виділене антитіло, яке специфічно зв'язує ССІ 17, де антитіло містить МН із БЕО ІО МО: 45 і МІ із ЗЕО ІЮ МО: 51.
Іншим варіантом втілення винаходу, описаного в цьому документі, є виділене антитіло, яке специфічно зв'язує ССІ 17, де антитіло містить МН із БЕО ІО МО: 45 і МІ із БЕО ІЮ МО: 52.
Іншим варіантом втілення винаходу, описаного в цьому документі, є виділене антитіло, яке специфічно зв'язує ССІ 17, де антитіло містить МН із БЕО ІО МО: 45 і МІ із ЗЕО ІЮ МО: 55.
Іншим варіантом втілення винаходу, описаного в цьому документі, є виділене антитіло, яке специфічно зв'язує ССІ 17, де антитіло містить МН із БЕО ІО МО: 45 і МІ із ЗЕО ІЮ МО: 56.
Іншим варіантом втілення винаходу, описаного в цьому документі, є виділене антитіло, яке специфічно зв'язує ССІ 17, де антитіло містить МН із БЕО ІО МО: 45 і МІ із БЕО ІЮ МО: 57.
Іншим варіантом втілення винаходу, описаного в цьому документі, є виділене антитіло, яке специфічно зв'язує ССІ 17, де антитіло містить МН із БЕО ІЮО МО: 45 і МІ із БЕО ІЮО МО: 59.
Іншим варіантом втілення винаходу, описаного в цьому документі, є виділене антитіло, яке
Зо специфічно зв'язує ССІ 17, де антитіло містить МН із БЕО ІО МО: 45 і МІ із ЗЕО ІЮ МО: 60.
Іншим варіантом втілення винаходу, описаного в цьому документі, є виділене антитіло, яке специфічно зв'язує ССІ 17, де антитіло містить МН із БЕО ІО МО: 46 і МІ із БЕО ІЮ МО: 62.
Іншим варіантом втілення винаходу, описаного в цьому документі, є виділене антитіло, яке специфічно зв'язує ССІ 17, де антитіло містить МН із БЕО ІО МО: 47 і МІ із БЕО ІЮ МО: 62.
Іншим варіантом втілення винаходу, описаного в цьому документі, є виділене антитіло, яке специфічно зв'язує ССІ 17, де антитіло містить МН, що містить амінокислотну послідовність принаймні на 90 95, 91 9», 92 9, 93 У, 94 9, 95 Фо, 96 95, 97 Фо, 98 90 або 99 95 ідентичну МН із
ЗЕБЕО ІЮ МО: 46, і МІ, що містить амінокислотну послідовність принаймні на 90 95, 91 9», 92 Об, 93 9, 94 95, 95 90, 96 9, 97 90, 98 95 або 99 95 ідентичну МІ. із БЕО ІЮ МО: 62.
Такими типовими антитілами є антитіла, наведені в таблиці 9.
Антитіла, в яких СОК важкого ланцюга, СОК легкого ланцюга, амінокислотні послідовності
МН або МІ. по суті не відрізняються від тих, що наведені в таблицях 3, 4, 6, 7 і 9, включено в рамки цього винаходу. Як правило, вони включають одне або більше консервативних амінокислотних заміщень амінокислотою, що має подібний заряд, гідрофобність або стереохімічні характеристики в антиген-зв'язуючому сайті або в каркасі без негативної зміни властивостей антитіла. Консервативні заміщення також можуть бути виконані для покращення властивостей антитіл, наприклад стабільності або афінності. У послідовності МН або Мі можна виконати 1,2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 амінокислотних заміщень. Наприклад, "консервативне амінокислотне заміщення" може включати заміщення нативного
БО амінокислотного залишку ненативним залишком таким чином, що вплив на полярність або заряд амінокислотного залишку в цьому положенні є незначним або відсутнім. Крім того, будь- який нативний залишок у поліпептиді також можна замінити аланіном, як описано вище, для аланін-скануючого мутагенезу (Мас еппап еї а! (1998) Асі РПузіої. зсапа. Зиррі. 643:55-67; зЗазакі єї ан! (1998) Айм. Віорвзув. 35:1-24). Фахівці в цій галузі можуть визначити бажані заміщення амінокислот на момент, коли такі заміщення є бажаними. Наприклад, амінокислотні заміщення можуть бути використані для ідентифікації важливих залишків у послідовності молекули або для підвищення або зниження афінності молекул, описаних у цьому документі.
Наступні вісім груп містять амінокислоти, які являють собою консервативні амінокислотні заміщення одна одної: 1) аланін (А), гліцин (С); 2) аспарагінова кислота (0), глутамінова кислота 60 (Е); 3) аспарагін (М), глутамін (С); 4) аргінін (К), лізин (К); 5) ізолейцин (І), лейцин (І), метіонін
(М), валін (М); 6) фенілаланін (Р), тирозин (У), триптофан (УМ); 7) серин (5), треонін (Т); і 8) цистеїн (С), метіонін (М) (див., наприклад, Стеідпіоп, Ргоїеїпз (1984)).
Амінокислотні заміщення можна провести, наприклад, за допомогою ПЛР -мутагенезу (патент США Мо 4,683,195). Бібліотеки різновидів можна отримувати з використанням добре відомих способів, наприклад із використанням випадкових (ММК) або невипадкових кодонів, наприклад ОМК кодонів, які кодують 11 амінокислот (Аа, Суз, Ар, Сім, Спу, Гуз, Авп, Ага, зег,
Туг, Тгр), і скринінгу бібліотек на різновиди з бажаними властивостями.
Хоча варіанти втілення, проілюстровані в цих прикладах, містять пари варіабельних областей, одну з важкого ланцюга й одну з легкого ланцюга, фахівець у цій галузі буде розуміти, що альтернативні варіанти втілення можуть містити єдину варіабельну область важкого або легкого ланцюга. Єдину варіабельну область можна використовувати для скринінгу на варіабельні домени, що здатні формувати дводоменний специфічний антиген-зв'язуючий фрагмент, здатний, наприклад, зв'язувати людський ССІ 17, що має послідовність із ФЕО ІЮО МО: 1. Скринінг можна здійснити за допомогою способів скринінгу фагового дисплея з використанням, наприклад, комбінаторного ієрархічного подвійного підходу, розкритого в міжнародній патентній публікації Мо М/01992/01047. При такому підході окремі колонії, що містять клон або Н-, або І -ланцюга, використовують для інфікування повної бібліотеки клонів, що кодують інший ланцюг (Її або Н), і отриманий дволанцюговий специфічний антиген- зв'язуючий домен вибирають відповідно до методик фагового дисплея, як описано. Таким чином, окремі поліпептидні ланцюги МН і МІ. є корисними для ідентифікації додаткових антитіл, що специфічно зв'язують людський ССІ17, що має послідовність із ЗЕБЕО ІЮО МО: 1 із використанням способів, розкритих у міжнародній патентній публікації Мо УУО1992/01047.
Антитіла згідно з винаходом, описаним у цьому документі, можна отримати з використанням різноманітних технологій для створення моноклональних антитіл. Наприклад, можна використовувати гібридомний спосіб Копіег апа Міївгеїп, Маїиге 256:495, 1975. У гібридомному способі мишу або іншу тварину-хазяїна, таку як хом'як, щур або мавпа, імунізують з використанням людського білка ССІ 17 і/або білка ССІ 17 яванського макака, або фрагментів цих білків, таких як позаклітинна ділянка людського ССІ 17, із наступним з'єднанням клітин селезінки імунізованих тварин із мієломними клітинами з використанням стандартних способів для отримання гібридомних клітин (СбСоодіпд, Мопосіопа! Апіірбодіев: Ргіпсірієє апа Ркгасіїсе, рр.59-103 (Асадетіс Ргез5, 1986)). Проводять скринінг колоній, що утворюються з одиночних імморталізованих гібридомних клітин, на продукування антитіл із бажаними властивостями, такими як специфічність зв'язування, перехресна реактивність (або їх відсутність) і афінність до антигена.
Для отримання антитіл до людського ССІ 17 можна використовувати різноманітних тварин- хазяїнів. Наприклад, можна використовувати мишей лінії ВаІр/с для генерації мишачих антитіл до людського ССІ 17. Антитіла, отримані в мишах Віабр/с і інших тваринах не людського походження можна гуманізувати з використанням різноманітних технологій для генерації більшої кількості послідовностей, подібних людським. Типові методики гуманізації, включаючи відбір каркасів людських акцепторів, відомі фахівцю в цій галузі й включають СОК-щеплення (патент США Мо 5,225,539), 5ОК-щеплення (патент США Мо 6,818,749), технологію зміни поверхні (Раїїп, Мої Іттипо!ї 28:489-499, 1991), зміну поверхні залишків, що визначають специфічність (публікація патенту США Мо 2010/0261620), людської адаптації (або адаптації людського каркаса) (публікація патенту США Ме 052009/0118127), супергуманізації (патент США
Мо 7,709,226) і керованої селекції (О5рогп еї аї., Меїйоавз 36:61-68, 2005; патент США Мо 5,565,332).
Гуманізовані антитіла можна додатково оптимізувати для покращення їхньої селективності або афінності до бажаного антигена шляхом включення змінених залишків підтримки каркаса для збереження афінності зв'язування (зворотні мутації) за допомогою методик, таких як ті, що розкриті й описані в міжнародній патентній публікації Мо УМ/01990/007861 і в міжнародній патентній публікації Мо М/О1992/22653.
Трансгенних мишей, що несуть людські локуси імуноглобулінів у своєму геномі можна використовувати для генерування людських антитіл проти білка-мішені, і це описано, наприклад, у міжнародній патентній публікації Мо М/01990/04036, патенті США Мо 6,150,584, міжнародній патентній публікації Мо УУО1999/45962, міжнародній патентній публікації Мо
МО2002/066630, міжнародній патентній публікації Мо УУМО2002/43478, І опег еї аї., Маїшге 368:856-9, 1994; Стееп еї а!., Майте Сепеї. 7:13-21, 1994; Стееп а даКороміїв Ехр Мей 188:483- 95, 1998; І опрега апа Низлаг Іпі Нем Іттипої! 13:65-93, 1995; Випддетапп еї аї., Єик У) Іттипої 21:1323-1326, 1991; Рівпм/йай еї аї., Маї Віотеснпо! 14:845-851, 1996; Мепае? сеї аї., Маї Сепеї (510) 15:146-156, 1997; Стееп, У Іттипо! Меїнодзв 231:11-23, 1999; Мапо еї аї., Сапсег Нев5 59:1236-
1243, 1999; Вгйддетапп апа Таибзід Сигг Оріп Віоїесппо! 8:455-458, 1997; міжнародній патентній публікації Мо УМО2002/043478). Ендогенні локуси імуноглобулінів у таких мишей можна зруйнувати або видалити, і можна вставити в геном миші принаймні один повний або частковий локус людського імуноглобуліну з використанням гомологічної або негомологічної рекомбінації з використанням трансхромосом або з використанням мінігенів. Для отримання людських антитіл, спрямованих проти вибраного антигена з використанням технології, описаної вище, можна залучати такі компанії, як Кедепегоп (ПИру/ млим/ гедепегоп сот), Наїбоиг Апііродіе5 (пНру/ мм Ппагбоигапіїродієб5 сот), Ореп Мопосіопаї Тесппоіоду, Іпс. (ОМ) (пЕр:// млим! отійпс пе), КуМар (пНр-// ммлу Кутар сот), Тгіаппі (пКр:// млум піаппі сот) і
Арієехів (пИр:// м/мли аріехібв сот).
Людські антитіла можна вибирати з бібліотеки фагового дисплея, де фаг піддали інжинірингу для експресії людських імуноглобулінів або їхніх ділянок, таких як Раб, одноланцюгові антитіла (5сЕм) або неспарені або спарені варіабельні області антитіл (Кпаррік еї аі., У Мої Віої 296:57-86, 2000; Ктерз еї аї., / Іттипої Мей 254:67-84, 2001; Машднап еї аї.,
Маїште Віоїесппоіоду 14:309-314, 1996; ЗПпевїв єї аЇ,, РІТАБ (ОБА) 95:6157-6162, 1998;
Ноодепроот апа М/іпіег, У Мої Віої! 227:381, 1991; Маїкз евї аї., У Мої Віої! 222:581, 1991). Антитіла згідно з винаходом можна виділити, наприклад, із бібліотеки фагового дисплея, що експресує варіабельні області важкого й легкого ланцюгів антитіла як гібридні білки з білком оболонки ріх бактеріофага, як описано в публікації Зпі еї аїЇ.,, У Мої! Віої 397:385-96, 2010 їі міжнародній патентній публікації Мо М/О2009/085462). Бібліотеки антитіл піддають скринінгу на зв'язування з позаклітинним доменом людського ССІ17 і додатково характеризують отримані позитивні клони, виділяють Раб із лізатів клонів і експресують як повнорозмірні Ідс. Такі способи з використанням способів фагового дисплея для виділення людських антитіл визнані в цій галузі.
Див., наприклад: патенти США МоМо 5,223,409; 5,403,484; і 5,571,698 авторів І адпег еї аї.; патенти США МоМо 5,427,908 і 5,580,717 авторів Юоуег еї аЇ; патенти США МоМо 5,969,108 і 6,172,197 авторів МсоСайепу еї а; і патенти США МоМо 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 і 6,593,081 авторів Сгінйнеь еї аї.
Підготовку імуногенних антигенів і отримання моноклонального антитіла можна виконати з використанням будь-якого відповідного способу, такого як отримання рекомбінантного білка.
Зо Імуногенні антигени можна вводити тварині у формі очищеного білка або сумішей білків, включаючи цілі клітини або екстракти клітин або тканин, або антиген можна отримати де помо у тілі тварини з нуклеїнових кислот, що кодують вказаний антиген або його ділянку.
Антитіла згідно з винаходом, описані в цьому документі, можуть бути людськими або гуманізованими.
Антитіла згідно з винаходом, описані в цьому документі, можуть бути синтетичними або рекомбінантними.
Антитіла згідно з винаходом, описані в цьому документі, можуть бути типу ІдА, дО, ІДЧЕ, дос або ІДМ. Антитіла згідно з винаходом, описані в цьому документі, можуть бути ізотипу ІДС,
Іа, Зав, Іа.
Імунні ефекторні властивості антитіл згідно з винаходом можна посилювати або пригнічувати через Ес-модифікації за допомогою методик, відомих фахівцям у цій галузі.
Наприклад, Ес-ефекторні функції, такі як зв'язування С1д, комплемент-залежна цитотоксичність (СОС), антитіло-залежна клітинно-опосередкована цитотоксичність (АЮ0СС), фагоцитоз, негативна регуляція рецепторів клітинної поверхні (наприклад, В-клітинного рецептора; ВСК) тощо, можна піддавати модуляції шляхом модифікації залишків у Ес, що відповідають за ці види активності. Фармакокінетичні властивості також можна посилити шляхом мутації залишків у домені Ес, що подовжують період напіврозпаду антитіл Типовими модифікаціями Ес є Ідс4
З228Р/Л 234А/Л 235А, Ідс2 М252у/525417/1256Е (БаІгАсдаца еї аї., У Віої Снет 281:23514-24, 2006; або Ідс2 М234А/5237А/Р2385, МУ234А/5237А/Н2680, Н2бвАЛ/ЗОЗ9ЗІ/АЗ305/Р331 або
М234А/5237А/Р2385/Н268АЛ/ЗОЗІ /А3305/Р3315 на Ідо2 (міжнародна патентна публікація Мо
ММО2011/066501), або ті, що описані у патенті США Мо 6,737,056 (нумерація відповідно до нумерації ЕО).
У деяких варіантах втілення, описаних у цьому документі, антитіло, яке специфічно зв'язує людський ССІ 17, містить заміщення в області Ес.
У деяких варіантах втілення, описаних у цьому документі, заміщення включає заміщення
М234А, 5237А, Р2385, Н2б68А, М3091, АЗ305 або РЗ3315 у ІдОс2, або заміщення 5228Р, І 234А або І 235А у Ідс4, де нумерація залишків відповідає індексу Е0О.
Крім того, антитіла згідно з винаходом, описані в цьому документі, можна модифікувати після трансляції за допомогою таких способів, як глікозилювання, ізомеризація, бо деглікозилювання або ковалентна модифікація, що не зустрічається в природі, наприклад,
доповнення функціональними групами поліетиленгліколю (пегілювання) і ліпідизація. Такі модифікації можуть відбуватись іп омімо або іп омйго. Наприклад, для покращення фармакокінетичних профілів антитіл такі антитіла згідно 3 винаходом можна кон'югувати з поліетиленгліколем (ПЕГілювати). Кон'югацію можна здійснити за допомогою способів, відомих фахівцям у цій галузі. Було продемонстровано, що кон'югація терапевтичних антитіл із ПЕГ покращує фармакодинаміку без перешкоджання функції (Кпідні еї а!., РіаїєЇез 15:409-418, 2004;
Ї еопа еї а!., СуїоКіпе 16:106-119, 2001; Мапа єї аї., Ргоївіп Епу 16:761-770, 2003).
Антитіла або їхні фрагменти згідно з винаходом, описані в цьому документі, можна модифікувати для покращення стабільності, селективності, перехресної реактивності, афінності, імуногенності або іншої бажаної біологічної або біофізичної властивості, перебувають у рамках цього винаходу. Стабільність антитіла залежить від ряду факторів, у тому числі (1) складу ядра окремих доменів, що впливає на їхню внутрішню стабільність, (2) взаємодій білка/білкового інтерфейсу, які впливають на спарювання НС і с, (3) запасу полярних і заряджених залишків, (4) мережі Н-зв'язування полярних і заряджених залишків; і (5) розподілу поверхневих зарядів і полярних залишків серед інших внутрішньо- й міжмолекулярних сил (Умогп апа РійсКкійип, У Мої
Віо! 305:989-1010, 2001). Залишки, які мають потенціал для дестабілізації структур, можна ідентифікувати на основі кристалічної структури антитіла або, у певних випадках, молекулярного моделювання, а вплив залишків на стабільність антитіла можна проаналізувати шляхом створення та оцінки різновидів, які несуть мутації в ідентифікованих залишках. Одним із шляхів підвищення стабільності антитіла є підвищення середньої точки температурного переходу (Тт), яку вимірюють за допомогою диференціальної скануючої калориметрії (ДСК).
Загалом Тт білка корелює з його стабільністю й зворотно корелює з його схильністю до розгортання й денатурації в розчині та процесів деградації, які залежать від схильності білка до розгортання (Кетіпеїе еї аІ., Рпапт ев 15:200-208, 1997). У ряді досліджень виявлено кореляцію між розподілом за фізичною стабільністю композицій, виміряною як термічну стабільність за допомогою ДСК, і фізичною стабільністю, виміряною за допомогою інших способів (Веди-Адао еї а!., Рнагт Рез 21:1353-1361, 2004; Сиріа апа Каїзнема, ААРБ5 РНагзсі,
БЕ8, 2003; Маа апа Нвзи, Іпї У Рпапт 140:155-168, 1996; Веттеїе сеї а!., Рнатт Нез 15:200-208, 1997; 7Напа евї а!., У Рнагт 5сі 93:3076-3089, 2004). Дослідження композицій показують, що Тт
Еаь демонструє зв'язок із довготривалою фізичною стабільністю відповідного тАб. Відмінності в амінокислотах у каркасі або в СОК можуть мати значні впливи на термічну стабільність домену
Раб (хХавзиї егаіІ., РЕВ5 І ей 353:143-146, 1994).
Антитіла ССІ 17 згідно з винаходом, описані в цьому документі, можна створити у формі біспецифічних антитіл, які також включено в рамки цього винаходу. Області МІ. і/або МН антитіл згідно з винаходом можна створити з використанням опублікованих способів у формі одноланцюгових біспецифічних антитіл, таких як структури конструкцій ТападьФф (міжнародна патентна публікація Мо УМО1999/57150; публікація патенту США Мо 052011/0206672) або у формі біспецифічних 5сЕМ5, таких як структури, розкриті в патенті США Мо 5,869,620; міжнародній патентній публікації Мо МУУО1995/15388, міжнародній патентній публікації Мо
УМО1997/14719 або міжнародній патентній публікації Мо М/О2011/036460.
Області МІ і/або МН антитіл згідно з винаходом, описаних у цьому документі, можна створити у формі біспецифічних повнорозмірних антитіл, де кожне плече антитіла зв'язує певний антиген або епітоп. Такі біспецифічні антитіла звичайно створюють шляхом модуляції взаємодій СНЗ між важкими ланцюгами двох антитіл з отриманням біспецифічних антитіл із використанням методик, таких як ті, що описані в патенті США. Мо 7,695,936; міжнародній патентній публікації Мо МУО2004/111233; публікації патенту США Мо 0О52010/0015133; публікації патенту США Мо И052007/0287170; міжнародній патентній публікації Ме У/О2008/119353; публікації патенту США Ме 0Ш52009/0182127; публікації патенту США Ме 052010/0286374; публікації патенту США Ме 052011/0123532; міжнародній патентній публікації Мо
УМО2011/131746; міжнародній патентній публікації Мо УУО2011/143545; або публікації патенту
США Мо Ш52012/0149876. Додатковими біспецифічними структурами, в які можна вбудувати області МІ і/або МН антитіл згідно з винаходом, є, наприклад, імуноглобуліни з подвійним варіабельним доменом (міжнародна патентна публікація Мо УМО2009/134776) або структури, які включають різноманітні димеризаційні домени для поєднання двох плечей антитіла з відмінною специфічністю, такі як "лейцинова застібка" або колагенові димеризаційні домени (міжнародна патентна публікація Мо УЛО2012/022811, патент США Мо 5,932,448; патент США Мо 6,833,441).
Іншим варіантом втілення винаходу є виділений полінуклеотид, що кодує будь-яку з варіабельних областей важких ланцюгів антитіла або варіабельних областей легких ланцюгів антитіла згідно з винаходом. Певні типові полінуклеотиди розкрито в цьому документі, однак бо інші полінуклеотиди, які, враховуючи виродженість генетичного коду або переваги кодонів у даній системі експресії, кодують антитіла згідно з винаходом, також перебувають в рамках цього винаходу. Полінуклеотидні послідовності, що кодують МН або Мі. або їхній фрагмент антитіла згідно з винаходом, можна функціонально пов'язати з одним або більше регуляторними елементами, такими як промотор і енхансер, що дозволяє експресію нуклеотидної послідовності в призначеній для цього клітині-хазяїні. Полінуклеотидом може бути кКДНК.
Іншим варіантом втілення винаходу є вектор, що містить полінуклеотид згідно з винаходом.
Такі вектори можуть бути плазмідними векторами, вірусними векторами, векторами для експресії бакуловірусів, векторами на основі транспозону або будь-якими іншими векторами, придатними для введення полінуклеотиду цього винаходу в певний організм або генетичне середовище за допомогою будь-яких засобів. Наприклад, полінуклеотиди, що кодують варіабельні області легкого й важкого ланцюга антитіла згідно з винаходом, необов'язково зв'язані з константними областями, вставляють у експресійні вектори. Легкі й важкі ланцюги можуть бути клоновані в однакові або різні експресійні вектори. Сегменти ДНК, що кодують ланцюги імуноглобулінів, функціонально пов'язані з регуляторними послідовностями в експресійному (-их) векторі (-ах), що забезпечують експресію поліпептидів імуноглобуліну. Такі регуляторні послідовності включають сигнальні послідовності, промотори (наприклад природні або гетерологічні промотори), елементи-енхансери й послідовності завершення транскрипції, і їх вибирають, щоб вони були сумісними з клітиною-хазяїном, вибраною для експресії антитіла.
Після введення вектора у відповідного хазяїна, цього хазяїна утримують в умовах, що підходять для високого рівня експресії білків, які кодуються введеними полінуклеотидами.
Відповідні експресійні вектори звичайно здатні до реплікації в організмах-хазяїнах як епісоми або як невід'ємна частина хромосомної ДНК хазяїна. Звичайно експресійні вектори містять селективні маркери, наприклад, резистентності до ампіциліну, резистентності до гігроміцину, резистентності до тетрацикліну, резистентності до канаміцину або резистентності до неоміцину, щоб дозволити виявлення клітин, трансформованих бажаними послідовностями
ДНК.
Відповідні промотори й енхансерні елементи відомі в цій галузі. Для експресії в бактеріальній клітині типові промотори включають Іасі, Іас/, Т3, Т7, орі, Іатбраа Р і їгс. Для експресії в еукаріотичній клітині типові промотори включають промотор і енхансерний елемент
Зо гена легкого і/або важкого ланцюгу імуноглобуліну; безпосередній ранній промотор цитомегаловірусів; промотор тимідинкінази вірусу простого герпесу; ранній і пізній промотори
ЗМ40; промотор, присутній у довгих кінцевих повторах ретровірусу; промотор металотіонеїну-І миші; і різноманітні відомі в цій галузі тканиноспецифічні промотори. Для експресії у дріжджовій клітині типовий промотор є конститутивним промотором, таким як промотор АОНІ, промотор
РОКІ, промотор ЕМО, промотор РУКІ тощо; або регульований промотор, такий як промотор
САЇ1 промотор САГ10, промотор АСН2, промотор РНО5, промотор СОРІ, промотор САЇ17, промотор МЕТ25, промотор МЕТЗ, промотор СУС1, промотор НІ5ЗЗ, промотор АСНІ, промотор
РОК, промотор САРОН, промотор АЮС1, промотор ТКРІ, промотор ОКАЗ, промотор І ЕШ2, промотор ЕМО, промотор ТРІ і АОХІ (наприклад, для використання в Ріспіа). Вибір відповідного вектора й промотора перебуває в межах рівня звичайного фахівця у цій галузі.
Фахівцю в цій галузі відома значна кількість відповідних векторів і промоторів; багато з них є комерційно доступними для отримання рекомбінантних конструкцій, що є предметом обговорення. Наступні вектори надані як приклад. Бактеріальні: рВе5, рпадезсгірі, Р5іХ174, рВінезсгірі ЗК, рВ5 К5, рМНва, рМНіба, рМНтіва, рМН4іба (Зігаїадепе, м. Ла-Хойя, штат
Каліфорнія, США); рТгс99А, рккК223-3, ркК233-3, рок540 і рКкІТ5 (Рпагтасіа, м. Уппсала,
Швеція). Еукаріотичні: рум пео, рем2саї, рос44, РХК1, рбоО (5ігаїадепе) ремМКЗ, рвРУ, рМо і ром. (Рпаптасіа).
Іншим варіантом втілення винаходу є клітина-хазяїн, що містить вектор згідно з винаходом.
Термін "клітина-хазяїн" стосується клітини, в яку ввели вектор. Зрозуміло, що термін "клітина- хазяїн" призначений для позначення не тільки конкретної клітини, що є предметом обговорення, але й потомства такої клітини. Оскільки в наступних поколіннях можуть відбутися деякі модифікації внаслідок або мутації, або впливів навколишнього середовища, таке потомство може не бути ідентичним батьківській клітині, але все ще буде включене в рамки терміна "клітина-хазяїн", що використовується в цьому документі. Такі клітини-хазяїни можуть бути еукаріотичними клітинами, прокаріотичними клітинами, рослинними клітинами або клітинами архей.
Прикладами прокаріотичних клітин-хазяїв є ЕзсПегіспіа соїї, бацили, такі як Васійи5 з!ЇбБЇ5, і інші ентеробактерії, такі як ЗаІтопеїПа, Зе!їтайа і різноманітні види Рзхендотопах. Для експресії також підходять інші мікроорганізми, такі як дріжджі. Прикладами відповідних дріжджових клітин- бо хазяїнів є Засспаготусез (наприклад, 5. сегемізіає) і Ріспіа. Типовими еукаріотичними клітинами є клітини ссавців, комах, птахів або інші клітини тваринного походження. Еукаріотичні клітини ссавців включають імморталізовані клітинні лінії, такі як гібридоми або лінії клітин мієломи, такі як мишачі клітинні лінії «Р2/0 (Американська колекція типових культур (АТСС), м. Манассас, штат Вірджинія, США СКІ-1581), М50О (Європейська колекція культур клітин (ЕСАСС), м.
Солеобері, графство Вілтшир, Великобританія, ЕСАСС Мо 85110503), РО (АТСС СКІ -1646) і
А9д653 (АТОС СВІ -1580). Типовою лінією клітин мієломи людини є 0266 (АТТС СЕ-ТІВ-196).
Інші придатні клітинні лінії включають отримані з яєчника китайського хом'ячка (СНО), такі як
СНО-КІ15М (І опа Віоіодіс5, м. Уолкерсвіль, штат Меріленд, США), СНО-КІ! (АТС СКІ -61) або раї.
Іншим варіантом втілення винаходу є спосіб отримання антитіла згідно з винаходом, що включає культивування клітини-хазяїна згідно з винаходом і відновлення антитіла, що продукується клітиною-хазяїном. Способи отримання антитіл і їхнього очищення добре відомі у цій галузі. Після синтезу (або хімічного, або рекомбінантного), цілі антитіла, їхні димери, окремі легкі й важкі ланцюги або інші фрагменти антитіла, такі як МН або Мі, можна очистити відповідно до стандартних процедур цієї галузі, включаючи преципітацію сульфатом амонію, афінну колонку, колонкову хроматографію, очищення високоефективною рідинною хроматографією (ВЕРХ), гель-електрофорез тощо (див. загалом Зсорев5, Ргоївіп Ригійсаєоп (5ргіпде/-Мегіад, М.М., (1982)). Антитіло, яке є предметом обговорення, може бути по суті чистим, наприклад, принаймні приблизно на від 80 95 до 85 95 чистим, принаймні приблизно на від 8595 до 9095 чистим, принаймні приблизно на від 9095 до 9595 чистим, принаймні приблизно на від 9895 до 9995 або більше чистим, наприклад, вільним від забруднюючих речовин таких як клітинний детрит, макромолекули, відмінні від антитіла, яке є предметом обговорення, тощо.
Полінуклеотиди, які кодують певні послідовності МН або МІ. згідно з винаходом, вбудовують у вектори з використанням стандартних способів молекулярної біології. Трансформацію клітини- хазяїна, культивування, експресію антитіла й очищення виконують із використанням добре відомих способів.
Способи обробки
Антитіла, які специфічно зв'язують людський ССІ 17, можуть бути придатними для лікування
Зо або попередження спектру станів, опосередкованих ССІ 17.
У контексті цього документа термін "стан, опосередкований ССі17" включає всі захворювання й медичні стани, в яких ССІ17 прямо або опосередковано відіграє роль у захворюванні або медичному стані, включаючи етіологію, патогенез, перебіг, тривалість клінічну патологію захворювання або стану.
У контексті цього документа термін "запальний стан, опосередкований ССІ 17" стосується запального стану, що принаймні частково виникає в результаті біологічної активності ССІ 17.
Типовими запальними станами, опосередкованими ССІ 17, є бронхіальна астма й алергії.
Способи згідно з винаходом можна використовувати для лікування хворих тварин, які належать до будь-якої класифікації. Приклади таких тварин включають ссавців, таких як люди, гризуни, собаки, коти й свійські тварини. Наприклад, антитіла згідно з винаходом є придатними для профілактики й лікування станів, опосередкованих ССІ 17, таких як бронхіальна астма й респіраторні алергічні захворювання, такі як алергічна астма, алергічний риніт, хронічне обструктивне захворювання легенів (ХОЗЛ), ідіопатичний легеневий фіброз (ІРЕ), захворювання гіперчутливості легенів тощо, алергічні захворювання, такі як системні анафілактичні реакції або реакції гіперчутливості, алергії на лікарські засоби, алергічний бронхолегеневий аспергільоз (АВРА), алергії на жалення комах і харчові алергії, запальні захворювання кишечнику, такі як хвороба Крона, виразковий коліт, ілеїт і ентерит, вагініт, псоріаз і запальні дерматози, такі як дерматит, екзема, атопічний дерматит, алергічний контактний дерматит, кропив'янка й свербіж, васкуліт, спондилоартропатії, склеродермія, аутоїмунні захворювання, такі як артрит (включаючи ревматоїдний і псоріатичний), розсіяний склероз, системний червоний вовчак, цукровий діабет | типу, гломерулонефрит тощо, відторгнення трансплантату (включаючи відторгнення алотрансплантату й реакцію "трансплантат проти хазяїна") і інші захворювання, під час яких необхідно інгібувати небажані запальні відповіді, такі як атеросклероз, міозит, опосередковані Т-клітинами нейродегенеративні захворювання, розсіяний склероз, енцефаліт, менінгіт, гепатит, нефрит, сепсис, саркоїдоз, алергічний кон'юнктивіт, отит, хвороба Кастлемана, синусит, ендотоксичний шок, індукований ліпополісахаридами (ГРБ5), синдром Бехчета й подагра.
Антитіла згідно з винаходом, описані в цьому документі, також придатні для отримання медичного препарату для такого лікування, причому медичний препарат готують для введення 60 в дозах, визначених у цьому документі.
Способи й використання цього можуть бути призначені для використання у тварин і пацієнтів які мають, або піддаються ризику розвитку будь-якого захворювання або стану, пов'язаного з експресією або біологічною активністю СС117, або в яких ССІ117 відіграє біологічну роль.
Без наміру бути зв'язаними будь-якою теорією, антитіла згідно з винаходом можуть забезпечити ефективний вплив на різні запальні захворюваннях шляхом прямого інгібування рекрутингу клітин ТП2, і таким чином одночасного інгібування численних цитокінів Тп2. Антитіла згідно з винаходом можуть забезпечити покращений профіль безпечності порівняно з антитілами до ССК4 шляхом селективного блокування тільки ССІ 17. Ці антитіла не будуть взаємодіяти з тромбоцитами, які експресують ССКА. Крім того, ці антитіла не будуть блокувати корисні ефекти вродженого імунітету ССІ 22 на СОСКА (Маїзикауча еї а!., І. Іттипо! 164:5382-8, 2000).
У контексті цього документа термін "запальний стан" стосується гострих або хронічних локалізованих або системних реакцій на шкідливі подразники, такі як патогени, ушкоджені клітини, фізична травма або подразники, які частково опосередковані активністю цитокінів, хемокінів або запальних клітин (наприклад, нейтрофіли, моноцити, лімфоцити, макрофаги, тучні клітини, дендритні клітини, нейтрофіли), і характеризується в більшості випадків болем, почервонінням, набряком і порушенням функції тканини.
Прикладом запального стану, опосередкованого ССІ 17, є запальний стан легенів. Типові запальні стани легенів включають: стани легенів, індуковані інфекцією, включаючи ті, що пов'язані з вірусними, бактеріальними, грибковими, паразитарними або пріонними інфекціями; стани легенів, індуковані алергенами; стани легенів, індуковані забруднювачами навколишнього середовища, такі як азбестоз, силікоз або бериліоз; стани легенів, індуковані аспірацією шлункового вмісту, порушення імунної регуляції, запальні стани з генетичною схильністю, такі як муковісцидоз, і стани легенів, індуковані фізичною травмою, такою як травма внаслідок штучної вентиляції легенів. Ці запальні стани також включають бронхіальну астму, емфізему, бронхіт, хронічне обструктивне захворювання легенів (ХОЗЛ), саркоїдоз, гістіоцитоз, лімфангіоматоз, гостре пошкодження легенів, гострий респіраторний дистрес-синдром, хронічні захворювання легенів, бронхолегеневу дисплазію, позалікарняну пневмонію, нозокоміальну пневмонію,
Зо вентиляторну пневмонію, сепсис, вірусну пневмонію, інфекцію грипу, інфекцію парагрипу, ротавірусну інфекцію, людську метапневмовірусну інфекцію, респіраторно-синцитіальну вірусну інфекцію і аспергільоз або інші грибкові інфекції. Типові запальні захворювання, пов'язані з інфекцією, можуть включати вірусну або бактеріальну пневмонію, включаючи тяжку пневмонію, муковісцидоз, бронхіт, загострення захворювань дихальних шляхів і гострий респіраторний дистрес-синдром (ГРДС). Такі стани, пов'язані з інфекцією, можуть включати в себе численні інфекції, такі як первинна вірусна інфекція та вторинна бактеріальна інфекція.
Бронхіальна астма -- це запальне захворювання легенів, яке характеризується гіперчутливістю дихальних шляхів (ГДШ), бронхоспазмом, свистячим диханням, еозинофільним або нейтрофільним запаленням, гіперсекрецією слизу, субепітеліальним фіброзом (і підвищенням рівнів ІДЕ. Пацієнти з бронхіальною астмою відчувають "загострення", посилення симптомів найчастіше внаслідок мікробних інфекцій дихальних шляхів (наприклад, викликаної риновірусом, вірусом грипу, Наеторпйи5 іпїчепла тощо). Напади бронхіальної астми можуть викликати фактори навколишнього середовища (наприклад, аскариди, комахи, тварини (наприклад, коти, собаки, кролики, миші, щури, хом'яки, морські свинки і птахи), гриби, забруднювачі повітря (наприклад, тютюновий дим), подразнюючі гази, дим, пари, аерозолі, хімічні речовини, пилок, фізичні навантаження або холодне повітря. Крім бронхіальної астми, декілька хронічних запальних захворювань, які вражають легені, характеризуються нейтрофільною інфільтрацією дихальних шляхів, наприклад, хронічне обструктивне захворювання легенів (ХОЗЛ), бактеріальна пневмонія і муковісцидоз (І іпаеп еї аї., Єиг Везрік у
БО 15:973-7, 2000; Вантап єї аї., Сіїп Іттипої 115:268-76, 2005), і захворювання, такі як ХОЗЛ, алергічний риніт і муковісцидоз характеризуються гіперчутливістю дихальних шляхів (Рапу апа
О'Вугпе Ат У Негзріг Стії Саге Мей 163:822-3, 2001).
При алергічній астмі присутність високих рівнів алерген-специфічного ІДЕ є віддзеркаленням імунної відповіді аберантних клітин ТП2 на поширені алергени навколишнього середовища, які вдихаються. Алергени презентують Т-клітинам дендритні клітини (ОС), які постійно відбирають зразки вхідних чужорідних антигенів. Після правильної активації за участі ОС алерген- специфічні лімфоцити, які присутні в уражених захворюванням дихальних шляхах, продукують
Тнаг-цитокіни інтерлейкіни (1-)-4, 1І -5 і 1-13, які додатково керують виходом лейкоцитів із судин у тканину, гіперплазією келихоподібних клітин і гіперреактивністю бронхів (ВНК). ССІ 17, що бо продукується ОС, індукує селективну міграцію клітин Тп2, але не клітин ТА1, шляхом ініціювання
ССК4. У мишачих моделях бронхіальної астми таке лікування за допомогою антитіл до ССІ 17 знижувало кількість Т-клітин СО4- і еозинофілів у рідині бронхоальвеолярного лаважу (БАЛ), продукування цитокінів ТП2 і гіперчутливість дихальних шляхів після стимуляції алергеном, що дозволяє припустити, що нейтралізація ССІ17 є можливою стратегією для інгібування алергічного запалення у людей.
Поширені моделі бронхіальної астми й запалення дихальних шляхів у тварин включають модель із стимуляцією овальбуміном, моделі метахолінової сенсибілізації і сенсибілізації з використанням Азрегоаїйи5 Титідатзв (Неззеї еї аї., Єиг ) Рпаптасої 293:401-12, 1995). Як моделі іп міго також можна використати інгібування продукування цитокінів і хемокінів з культивованих людських бронхіальних епітеліальних клітин, фібробластів або клітин гладких м'язів дихальних шляхів. Введення антитіл згідно з винаходом у будь-якій із цих моделей можна використовувати для оцінки їхньої ефективності для полегшення симптомів і зміни перебігу бронхіальної астми, запалення дихальних шляхів, ХОЗЛ тощо.
Прикладом запального стану, опосередкованого ССІ 17, є атопічний дерматит.
Одним аспектом цього винаходу є спосіб лікування захворювання, опосередкованого
ССІ17, що включає введення суб'єктові, який цього потребує, антитіла згідно з винаходом протягом часу, достатнього для лікування захворювання, опосередкованого ССІ 17.
У деяких варіантах втілення, описаних у цьому документі, захворювання, опосередковане,
СС 17 є запальним захворюванням.
У деяких варіантах втілення, описаних у цьому документі, запальним захворюванням є бронхіальна астма, виразковий коліт (ОС), атопічний дерматит (АОС) або ідіопатичний легеневий фіброз (ІРЕ).
Одним варіантом втілення винаходу є спосіб лікування бронхіальної астми, що включає введення суб'єктові антитіла згідно з винаходом, описаного у цьому документі, протягом часу, достатнього для лікування астми.
Одним варіантом втілення винаходу є спосіб лікування виразкового коліту, що включає введення суб'єктові антитіла згідно з винаходом, описаного в цьому документі, протягом часу, достатнього для лікування виразкового коліту.
Одним варіантом втілення винаходу є спосіб лікування атопічного дерматиту, що включає введення суб'єктові антитіла згідно з винаходом, описаного в цьому документі, протягом часу, достатнього для лікування атопічного дерматиту.
Одним варіантом втілення винаходу є спосіб лікування ідіопатичного легеневого фіброзу, що включає введення суб'єктові антитіла згідно з винаходом, описаного в цьому документі, протягом часу, достатнього для лікування ідіопатичного легеневого фіброзу.
Введення/фармацевтичні композиції
У цьому винаході запропоновано фармацевтичні композиції, які містять антитіла згідно з винаходом, що специфічно зв'язують ССІ 17 згідно з винаходом, і фармацевтично прийнятний носій. Для терапевтичного використання антитіла, яке специфічно зв'язують ССІ 17 згідно з винаходом, можна отримати у вигляді фармацевтичних композицій, що містять ефективну кількість домену, молекули або антитіла як активного інгредієнта у фармацевтично прийнятному носії. Термін "носій" означає розріджувач, ад'ювант, наповнювач або носій, з яким вводять активну сполуку. Такі носії можуть бути рідинами, такими як вода й олії, у тому числі олії з нафти, тваринного, рослинного або синтетичного походження, такі як арахісова олія, соєва олія, мінеральна олія, кунжутна олія тощо. Наприклад, можна використовувати 0,4 95 фізіологічний розчин і 0,3 95 гліцин. Ці розчини повинні бути стерильними й не містити жодних твердих частинок. Їх можна стерилізувати за допомогою загальноприйнятих, добре відомих способів стерилізації (наприклад, фільтрації). Композиції можуть містити фармацевтично прийнятні допоміжні речовини, необхідні для наближення до фізіологічних умов, такі як регулятори рН і буферні агенти, стабілізатори, загущувачі, ковзні агенти й барвники тощо.
Концентрація молекул або антитіл згідно з винаходом, описаним у цьому документі, у такій фармацевтичній композиції може змінюватися в широких межах, тобто від менше ніж приблизно 0,5 95, звичайно на рівні або принаймні приблизно 1 95, до 15 або 20 95 за масою, і буде вибрана в першу чергу виходячи з необхідної дози, об'ємів рідини, в'язкості тощо залежно від вибраного конкретного способу введення. Відповідні носії й композиції включно з іншими білками людини, наприклад сироватковим альбуміном людини, описані, наприклад, в публікації Ветіпаїоп: ТНе
Зсієпсе апа Ргасіїсе ої Рпаптасу, 215 Едйоп, Теоу, О.В. єйд., Ііріпсоїй УМШатв апа УМікіпв,
РПйЙааеє!рніа, РА 2006, Рап 5, Рнпнаптасешііса! Мапитасіигіпа рр 691-1092, див. особливо рр. 958- 989.
Спосіб введення для терапевтичного використання антитіл, які специфічно зв'язують ССІ 17 60 згідно з винаходом, описаним у цьому документі, може бути будь-яким відповідним шляхом, що доставляє агент до хазяїна, таким як парентеральне введення, наприклад, внутрішньошкірне, внутрішньом'язове, внутрішньоочеревинне, внутрішньовенне або підшкірне, легеневе; черезслизове (пероральне, інтраназальне, інтравагінальне, ректальне); з використанням композиції в таблетці, капсулі, розчині, порошку, гелі, частинці; і такої, що міститься в шприці, імплантованому пристрої, осмотичній помпі, картриджі, мікропомпі; або іншими способами, зрозумілими фахівцю в цій галузі, які добре відомі в цій галузі. Введення, специфічне для певного місцерозташування, може бути досягнуте, наприклад, шляхом внутрішньосуглобової, внутрішньобронхіальної, внутрішньочеревної, внутрішньокапсульної, внутрішньохрящової, у внутрішню порожнину, у черевну порожнину, у мозочок, інтрацеребровентрикулярної, у товстий кишечник, інтрацервікальної, у шлунок, внутрішньопечінкової, внутрішньосерцевої, внутрішньокісткової, внутрішньотазової, внутрішньоперикардіальної, внутрішньоочеревинної, внутрішньоплевральної, у передміхурову залозу, внутрішньолегеневої, інтраректальної, внутрішньониркової, інтраретинальної, інтраспінальної, внутрішньосиновіальної, внутрішньогрудної, внутрішньоматкової, внутрішньосудинної, внутрішньоміхурової, внутрішньовогнищевої, вагінальної, ректальної, букальної, сублінгвальної, інтраназальної або трансдермальної доставки.
Таким чином, фармацевтичну композицію згідно з винаходом, описаним у цьому документі, для внутрішньом'язової ін'єкції можна приготувати так, щоб вона містила 1 мл стерильної буферної води й приблизно від 1 нг до приблизно 100 мг/кг, наприклад від приблизно 50 нг до приблизно 30 мг/кг, або переважно від приблизно 5 мг до приблизно 25 мг/кг антитіл, які специфічно зв'язують СС 17, згідно з цим винаходом.
Доза, яку вводять пацієнтові з захворюванням, опосередкованим ССІ 17, є достатньою, щоб полегшити симптоми або лікувати стан, опосередкований ССІ 17 ("терапевтично ефективна кількість"), і може іноді становити 0,1-10 мг/кг маси тіла, наприклад 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 мг/кг, але може бути навіть вищою, наприклад 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 або 100 мг/кг.
Можна також вводити фіксовану одиничну дозу, наприклад 50, 100, 200, 500 або 1000 мг, або доза може бути заснована на площі поверхні тіла пацієнта, наприклад 400, 300, 250, 200 або 10 мг/мг. Зазвичай можна вводити 1-8 доз (наприклад 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 або 8), але можна вводити 10, 12, 20 або більше доз. Введення антитіл, які специфічно зв'язують ССІ 17, згідно з
Зо винаходом, описаним у цьому документі, можна повторювати через один день, два дні, три дні, чотири дні, п'ять днів, шість днів, один тиждень, два тижні, три тижні, один місяць, п'ять тижнів, шість тижнів, сім тижнів, два місяці, три місяці, чотири місяці, п'ять місяців, шість місяців або довше. Повторні курси лікування також можливі як довготривале введення. Повторне введення може бути в тій самій дозі або в іншій дозі.
Дозування антитіл до ССІ17 згідно з винаходом, описаним у цьому документі, яке продемонструє ефективне лікування запальних захворювань, таких як бронхіальна астма, можна визначити шляхом введення антитіл до ССІ 17 відповідним тваринним моделям, добре відомим у цій галузі й описаним у цьому документі.
Аналізи іп міго можна необов'язково використовувати як допоміжний засіб для визначення оптимальних діапазонів доз. Вибір конкретної ефективної дози можуть визначити (наприклад, шляхом клінічних досліджень) фахівці в цій галузі з урахуванням декількох факторів. До таких факторів належить захворювання, яке потрібно лікувати або попередити, пов'язані симптоми, маса тіла пацієнта, імунний статус пацієнта і інші фактори, відомі фахівцям у цій галузі. Точна доза для застосування в композиції буде також залежати від шляху введення й тяжкості захворювання, і її необхідно підбирати відповідно до оцінки лікаря, який проводить лікування, а також обставин для кожного пацієнта. Ефективні дози можна екстраполювати з кривих "доза- відповідь", отриманих із дослідних систем іп мійго або тваринних моделей випробування.
Антитіла згідно з винаходом можна тестувати на їхню ефективність і ефективну дозу з використанням будь-якої моделі, описаної в цьому документі.
Наприклад, для введення пацієнтові з масою 80 кг можна приготувати фармацевтичну композицію, яка містить антитіла, які специфічно зв'язують ССІ117, згідно з винаходом, описаним у цьому документі, для внутрішньовенної інфузії, яка містить приблизно 200 мл стерильного розчину Рінгера й від приблизно 8 мг до приблизно 2400 мг, від приблизно 400 мг до приблизно 1600 мг або від приблизно 400 мг до приблизно 800 мг антитіл, що специфічно зв'язують ССІ17 згідно з цим винаходом. Способи приготування композицій, які вводять парентерально, добре відомі й детальніше описані, наприклад, у "Кетіпдіоп'є Рпагтасеціїсаї
Зсієпсе", 15ІН єд., Маск Рибіїзпіпд Сотрапу, Еавюп, РА.
Антитіла, які специфічно зв'язують ССІ 17, згідно з винаходом, описаним у цьому документі, можна ліофілізувати для зберігання й відновлювати у відповідному носії перед використанням.
Доведено, що ця методика є ефективною при використанні звичайних білкових препаратів, і можна використовувати відомі у галузі методики ліофілізації й відновлення.
Антитіла, які специфічно зв'язують ССІ 17, згідно з винаходом, описаним у цьому документі, можна вводити в комбінації з другим терапевтичним агентом одночасно, послідовно або окремо.
Цей винахід далі буде описаний з посиланням на наступні специфічні необмежуючі приклади.
Приклад 1. Генерація антитіл, які нейтралізують ССІ 17
Раб, які зв'язують людський ССІ 17, вибрали з бібліотек фагового дисплея де помо ріхХ, як описано ЗпПі еї аї., у. Мої. Віої. 397:385-396, 2010; міжнародній патентній публікації Мо
УМО2009/085462; публікації патенту США Мо ИШ52010/0021477; публікації патенту США Мо
О52012/0108795. Коротко, бібліотеки створювали шляхом диверсифікації каркасів людського походження, де гени ІЗНМ1-69"01, ІСІНМ3-23701 і ІЗНМ5-51701 зародкової лінії Мн рекомбінували з людським мінігеном ІЗНО-4 через петлю НЗ, і гени 012 (1ОКМ1-39701), І 6 (пКМЗ3-11701), А27 (120КМ3-20"01) ії ВЗ (І6КМ4-1701) людської зародкової лінії МІ каппа рекомбінували з мінігеном ІОК.)-1 для складання повних доменів УН і МІ. Для диверсифікації вибрали положення варіабельних областей важких і легких ланцюгів навколо петель НІ, Н2, 11,
ІЇ2 ї 3, які відповідають положенням, визначеним як ті, що часто контактують із білюовими й пептидними антигенами. Відмінність послідовності в обраних положеннях обмежувалася залишками, які зустрічаються в кожному положенні в сімействах генів ІСНУ або ІСІ М зародкової лінії відповідних генів ІЗНМ або ІСГМ. Відмінність на петлі НЗ3 створювали з використанням короткої та середньої синтетичних петель довжиною 7-14 амінокислот. Розподіл амінокислот на
НЗ створили з метою імітації варіації амінокислот, яку спостерігали в людських антитілах.
Розробку бібліотеки докладно описано в оп еї аї., У Мої! Віої 397:385-96, 2010. Каркаси, які використовували для створення бібліотек, назвали відповідно до генів МН і Мі людської зародкової лінії їхнього походження. Для отримання 24 унікальних комбінацій МН:МІ для скринінгу три бібліотеки важких ланцюгів об'єднували з чотирма легкими ланцюгами зародкової лінії або бібліотеками легких ланцюгів зародкової лінії. Усі 24 комбінації бібліотек МН:МІ. використали для експериментів фагового пеннінгу проти людського ССІ 17.
Зо Пеннінг бібліотек проводили з використанням людського ССІ 17 із БЕО ІЮ МО: 1. Коротко кажучи, людський ССІі17 було біотинільовано з використанням стандартних способів, і виконували захоплення біотинільованого людського ССІ 17 (ВІ-пиССІ 17) на магнітних кульках, покритих стрептавідином (ЮупаІ, М280), і до кульок додавали фагові бібліотеки Рар-ріхХк.
Використовувані концентрації ВЕпиССІ 17 становили 100 нМ для циклів 1 і 2, 10 мМ для циклів
З і 4). За допомогою ЕГІ5ЗА проводили скринінг зв'язування Раб із білком людського ССІ 17. Для пеннінгу магнітні кульки, покриті БійпиСсСІ17, промили й заблокували з використанням фосфатно-сольового буфера з твіном ФСОБТ-М (ФСБ із додаванням 0,05 95 твін-20 і З 95 знежиреного сухого молока). Заблокований фаг із бібліотек додавали до кульок і обертали за кімнатної температури протягом 1 циклу. Кульки промивали, а потім інкубували в культурі лог- фази БЕ. соїї, (МС1061Е"), клітини й інфіковану Е соїї вирощували на планшетах з агаром Луріа-
Бертані (В) протягом ночі за температури 37 "С. Наступного ранку культури зіскрібали з планшетів у середовище 2хХУТ 2 мл (20 95 гліцерину) на планшет, до 50 мл 2хХУТ (вуглеводи) додавали 50 мкл бактеріальної суспензії, і вирощували за 37 "С зі струшуванням протягом 2 годин. Допоміжний фаг додавали до культур у середині лог-фази, і інкубували культури за 37 "С протягом 30 хвилин. До кожної культури додавали канаміцин і ІРТО до кінцевої концентрації 35 мкг/мл і 1 мМ відповідно, і вирощували протягом ночі зі струшуванням за температури 30 "с.
Ампліфікований фаг із бактеріального середовища осаджували з використанням ПЕГ/Масі і ресуспендували в 1 мл фосфатно-сольового буферу (ФСБ). Для наступного циклу пеннінгу використовували 200 мкл.
Після трьох циклів пеннінгу фагеміду ДНК виділяли з інфікованих клітин МС1061Е" і піддавали розщепленню з використанням рестриктаз, щоб видалити послідовність, яка кодує рІХ, і вирізали й очищали лінеаризовану плазмідну ДНК з агарозного гелю. Потім відбувалося самолігування цієї ДНК з лігазою ДНК Т4. Проводили електропорацію лігованої ДНК у клітини
МС1061Е" і висівали на планшети з агаром І В (вуглеводи/глюкоза). Колонії з цієї електропорації зібрали для скринінгу ЕГІЗА й оцінки експресії Бар. Раб містять Ніз-мітку всередині рамки зчитування на С-кінці важкого ланцюга. В ході вихідного скринінгу 24 Раб були частково очищені через С-кінцеву Ніб-мітку з використанням стандартних способів і додатково характеризували.
Раб характеризували за їхнім зв'язуванням із людським ССІ 17 (ЗЕБЕО ІО МО: 1), СС117 яванського макака (5ЕО ІЮ МО: 2) і ССІ22 яванського макака (ЗЕО ІЮО МО: 3) у аналізі ЕГІ5А. бо Коротко, 96-ямковий планшет Махізогр покривали 1 мкг/мл козячих антитіл до каппа-ланцюга людини (Зоційегп Віоїесп). До кожного планшета додавали напівочищений Бар. До кожного планшета з захопленим Бар додавали біотинільований пиСсСІ 17, сССІ 17 або сссіІ 22. Білки, зв'язані з захопленими Рар виявляли з використанням стрептавідину:НЕКР (пероксидази хрону).
П'ять Раб (Е21, Е24, ЕЗ34, Е43 і Е44), зв'язаних з ССІ 17 людини і яванського макака, але не з
ССІ22 яванського макака, вибирали для дозрівання афінності.
Приклад 2. Дозрівання афінності антитіл до ССІ 17
Для дозрівання афінності обирали п'ять аб на основі їхнього профілю вихідних характеристик. Гар піддавали дозріванню афінності шляхом диверсифікації легких ланцюгів з використанням технології лінійного дозрівання, описаної Пі еї аї. (ЗП еї аї., У Мої Віої 397:385-- 396, 2010), і зберігання незмінності важких ланцюгів. Важкий ланцюг у РГар являв собою МНЗ-23 або МН5Ь-51. Бібліотеки дозрівання афінності Е24 продукували покращенні речовини, які зв'язують ССІ 17.
Коротко, дозрівання афінності Е24 відбувалася з використанням бібліотеки легкого ланцюга
ВЗ. Схему диверсифікації бібліотеки ВЗ показано в таблиці 2. Положення зазначені відповідно до нумерації Кабат.
Таблиця 2 96111111 ммвшв0
Області МН Раб клонували у фагеміду бібліотеки С, що призводило до повної повторної диверсифікації С для кожного Бар. Області МН виділяли шляхом рестрикції розщеплення мініпрепаратів ДНК з використанням Мсої і АраЇ. Області МН виділяли на гелі й лігували в розщеплену подібним способом ДНК бібліотеки С. Лігатури очищали й трансформували в клітини МС10О61Е". Клітини вирощували в середовищі 2хуТ (вуглеводи) до досягнення росту лог-фази (оптична густина, ОГвоо нм - 0,6). Додавали допоміжний фаг і інкубували культури за
З37"С протягом 30 хвилин. До кожної культури додавали канаміцин і ІРТО до кінцевої концентрації 35 мкг/мл і 1 мМ відповідно, і вирощували протягом ночі зі струшуванням за температури 30 "С. Фаг з бактеріального середовища осаджували з використанням ПЕГ/Масі і ресуспендували у ФСБ.
Для пеннінгу дозрівання афінності виконували захоплення ВІ-ССІ 17 на 50 мкл магнітних кульок, покритих стрептавідином. Концентрації антигена становили 100 нМ для 1-го циклу, 10
Зо НМ для 2-го циклу й 10 нМ для 3-го циклу. Кульки промивали 6 разів з використанням ФСБ і один раз ФСБ, після чого інфікували Е. соїї, як описано вище. Виділення плазмід експресії Еаб і експресію Бар виконували як описано вище.
Раб з дозрілою афінністю піддавали скринінгу на зв'язування з пиСсСІ17 в аналізі ЕГІЗА (ЗЕО ІО МО: 1), сСС117 (ЗЕО ІО МО: 2) і сСС122 (ЗЕО ІЮ МО: 3), як описано вище для зв'язування з пиСсІ 17. Ідентифіковані клони секвенували, перетворювали на повні антитіла
ІЧО1, і підтверджували їхнє зв'язування з пиСсСі117, сССІ17 і сСС122 з використанням М50О-
ЗЕА.
Послідовності СОР. батьківських антитіл і антитіл з дозрілою афінністю показані в таблиці З і таблиці 4 для СОР. важкого ланцюга й легкого ланцюга відповідно.
Таблиця З тАБІЮ О| Послідов- | ЗО ще ЗЕО ще во ність послідовність ІО послідовність ІО
МО: МО: МО: (бетьівськи) |ЗУМО 4 | ПоРОвотАУєРОРОС 5 /УОРАСУЛОСКОУ 6 . . ЗзУУа 4 ПОРБЗОБОТАУ5РЗЕОС 5 МмаРАВУМОБЕВрУ (батьківський) осС1і7в234 |5МУЛО 4 ПОРБОЗОТВУ5ЗРБРОС| 5 )|МСРАРУМОЗ5ЕОУ | 6 осС1і7в235 | 5МУЛО 0 4 ПОРБОЗОТВУ5ЗРБРОС| 5 )|МСРАРУМОЗ5ЕОУ | 6 осС1і7в236 | 5МУЛО 4 ПОРБОЗОТВУ5ЗРБРОС| 5 )|МСРАРУМОЗЕОУ | 6 осС178в237 |5МУЛО о 4 ПОРБОЗОТНУ5ЗРБРОС| 5 )|МСРАРУМОЗЕОУ | 6 осСі7в238 | 5БМУЛО 0 4 ОПОРБОБОТВУ5ЗРБРОС| 5 )|МСРАРУМОЗЕОУ | 6 осС1і7в239 | 5МУЛО 0 4 ПОРБОЗОТВУ5ЗРБРОС| 5 )|МСРАРУМОЗЕОУ | 6 осС1і7в240 | 5МУЛО 4 ПОРБОЗОТВУ5ЗРБРОС| 5 )|МСРАРУМОЗ5ЕОУ | 6 осСі7в2г41 | 5БМУЛО 0 4 ОПОРБОБОТВУ5ЗРБРОС| 5 )|МСРАРУМОЗ5ЕОУ | 6 оС1і7в242 | 5МУЛО 0 4 ОПОРБОБОТВУ5ЗРБРОС| 5 )|МСРАРУМОЗ5ЕОУ | 6 осС1і7в243 |5МУЛО 0 4 ОПОРБОЗОТВУ5ЗРБРОС| 5 )|МСРАРУМОЗ5ЕОУ | 6 (сС1і7в244 |5МОе | 4 | ПОРБОБОТВУБ5РБРОВ| 5 )|МСРАРУМО5ЕОУ | 6
Таблиця 4 тео илинс ТЕ полю ГЕ полин ГУ.
ЗЕО ЗЕО ЗЕО тАбБ ІО . . . . . . послідовність ІО послідовність ІО послідовність ІО ооеяеннеь б ненюнь б тенкень
С17г24 кий) о сС178234 | К55ЗО5МИЗРОМІМКІА о 8 | МАЗТВЕ5 | 20 | ООРУБУРБТ | 28 о сС178в235 | К55О5МІУЗЕУМЕМАСА / 9 |НАЗТВЕ5 | 21 | ООРМАТРЕТ / 29
Приклад 3. Зв'язування антитіл до ССІ 17 з дозрілою афінністю ССІ 17 людини і яванського макака
Оцінювали зв'язування антитіл із людським ССІ17 і СС117 яванського макака з використанням рівноважної афінності в розчині (ЗЕА). Процедура для цих експериментів бла схожою з тією, що використовували Наєгпві еї аї (Наєпеї еї аї., Апа! Віоспет 339:182-184, 2005).
Для приготування комплексів антиген-антитіло виконували серійне розведення людського
ССІ17 або ССІ 17 яванського макака у сольовому буфері на основі трис, який містив 0,05 95 твін-20, ТВ5Т, (Тпепто зсіепійіс) у співвідношенні 1: б, починаючи з концентрації 2 000 000 пМ у 9б-ямкових глибоких поліпропіленових планшетах. До кожного розведення хемокіну додавали однакові об'єми моноклональних антитіл тАб до СС 17 у концентрації 40 пМ або 200 пМ, щоб отримати суміші, які містять серійне розведення хемокінів, починаючи з кінцевої концентрації 1 мкм, ї постійну концентрацію (20 пМ або 100 пМ) антитіла до ССІ 17. Суміші готувалися в двох повторах і інкубували за 4 "С протягом 48 годин для досягнення рівноваги. Вільне антитіло виявляли з використанням інструменту ЗЕСТОК Ітадег 6000 (Мезо зсаїе Оібсомегу). Отримані криві зв'язування апроксимували для досягнення рівноважної константи дисоціації (Ко) з використанням програмного забезпечення СгарпРай Ргізт (версія 5.01), використовуючи модель зв'язування 1:11 для виконання нелінійного регресійного аналізу даних способом найменших квадратів. У таблиці 5 показані афінності антитіл до ССІ 17 людини і яванського макака. Афінності варіювалися від приблизно 2 пМ до приблизно 700 пМ для людського ССІ 17 і від приблизно 200 пМ до приблизно 9500 пМ для ССІ 17 яванського макака. Отримані антитіла зв'язували людський ССІ17 з афінностями, які приблизно від 2 до приблизно 150 разів перевищували афінності зв'язування з ССІ 17 яванського макака.
Таблиця 5 тАЬ о ши Афінність(М) | пМ Кратність зв'язування з ССІ 17
С17Р24(батьківський)| 1000 | НЕ Її с178239,.7.7777777ю7ю77/7 17171792 Ї1171717171717171630 Ї1111111111117168СсС21С "Не визначено
Приклад 4. Оптимізація антитіл до ССІ 17
Антитіла до ССІ17 С178234 і С178240 містили потенційний М-зв'язаний сайт глікозилювання на початку ЇСОК2 (МА5). Залишок аспарагіну (М) у положенні залишку 50 (нумерація Кабат) С178234 був мутований до шести різних амінокислот (А,О, 5, 5, Ті |).
Потенційний мотив ізомеризації аспарагінової кислоти 05 ідентифікували в НСОКЗ у батьківському С17Е24 і в усіх його різновидах із дозрілою афінністю. Щоб протестувати вплив заміщень у цьому положенні залишок серину в положенні 100с (нумерація Кабат) був мутований на А, Т, або 5, або О в положенні 1000 був мутований на Е у важкому ланцюзі тАб С178234.
Отримані важкі ланцюги спарювали з легким ланцюгом тАб С178258.
Антитіла експресували як ІДС, і вимірювали їхню афінність до ССІ 17 людини і яванського макака. У таблиці б і таблиці 7 показано СОК-послідовності важкого і легкого ланцюга оптимізованих антитіл. У таблиці 8 показано афінність антитіл до ССІ 17 людини і яванського макака. Мутагенез М50 у легкому ланцюзі призвів до покращення зв'язування у 2-100 разів.
Таблиця 6
Послідовність ІО Послідовність ІО Послідовність ІО
МО: МО: МО:
С17в257 БУЛО 0 | 4 ПОРБОЗОТВУЗРОРОС | 5 |МОРАРУМОЗЕОУ 6
С17в258 5УМЛО 0 | 4 ОПОРБОЗОТВУЗРОРОС | 5 |МОРАРУМОЗЕОУ 6
Сі7в2бо 5УМЛО 00 | 4 ОПОРБОЗОТВУЗРОРОС | 5 |МОРАРУМОЗЕОУ 6
Сі7в26б2 БУЛО 00 | 4 ОПОРБОЗОТВУЗРОРОС | 5 |МОРАРУМОЗЕОУ 6
С17в263 (5УМЛО 000 | 4 ОПОРБОЗОТВУЗРОРОС | 5 |МОРАРУМОЗЕОУ 6
С17в264 (5УМЛО 0 | 4 ОПОРБОЗОТВУЗРОРОС | 5 |МОРАРУМОЗЕОУ 6
Таблиця 7
ЗЕО ЗЕО
МО: МО: І
С178в257 |К55О5УПЗРОМІМКІА | 8 |АА5ТНЕЗ | 39 ООРУЗУРБТ | 28
С17в258 |К55О5УПЗРОМІМКІА | 8 |РА5ТВЕ5 | 24 ООРУЗУРБТ | 28
Сі7в260 |К55О5УПЗРОМІМКІА | 8 |САБТНЕ5 | 22 ООРУЗУРБТ | 28
С17в262 |К55О5МИЗРОМІМКІА | 8 |5А5ТНЕ5 | 40 ООРУЗУРБТ | 28
Сі7в263 |К55О5УПЗРОМІМКІА | 8 |ТА5ТВЕЗ5 | 26 ООРУЗУРБТ | 28
С17в264 |К55О5УПЗРОМІМКІА | 8 ПАБТАЕ5 | 41 ООРУЗУРБТ | 28
С178в293 |К55О5УПЗРОМІМКІА | 8 |РАЗТВЕ5 | 24 ООРУЗУРБТ | 28
С17в294 |К55О5УПЗРОМІМКІА | 8 |РАЗТВЕ5 | 24 ООРУЗУРБТ | 28 (С17в295 |К55О5УПЗРОМІМКІА | 8 |РА5ТВЕ5 | 24 (ООРУЗУРБТ (| 28
Таблиця 8 тАЬ о Кратність зв'язування з ССІ 17 людини/яванського макака с17в82939,.4..ЙЮЙ | «0 Її 77717171717178981 11111111
Залишок триптофану в НСОКЗ у положенні 100а (нумерація Кара) у тАр С178236 ідентифікували як імовірний сайт небажаного окиснення після трансляції. Цей залишок був мутований на 17 інших амінокислот (всіх, за виключенням С і М) у Раб С17Е319, батьківського тАб для С178236. Для отримання цього набору провели мутагенез Кункеля з ММК або визначеними олігонуклеотидами кодона. Потім виконали скринінг цих аб з використанням ранжування ЕГІЗА щодо зв'язування з БІ-ССІ 17 людини й БІ-ССІ 17 яванського макака. П'ять різновидів (МУ -- К, У, Е, Т, І) продемонстрували деяке зв'язування в аналізі ЕГІ5ЗА зв'язування
Еаь (таблиця 5). Три найкращі різновиди перетворили на тАб (М178288, С178289, С178290) для експресії і М5О-5ЕА (таблиця 6). Більшість різновидів продемонстрували знижену афінність до ССІ 17 людини і яванського макака.
Послідовності МН і Мі. антитіл показано в таблиці 9.
Таблиця 9 (с17в8244....7777711171Ї1771111111117145111111171 11111111 в6осс7с7сИсИЙ2Й2 с178264.7777777717Ї7771171717171717171717145111111117111111111111111166в6ссСсСсСсСС
Приклад 6. Вибір константних областей
Вибрані антитіла клонували як /д52 або Ід054 з наступними заміщеннями: /дс4 5228Р//234А/І 235А або Ідое2 М234А/5237А/Р2385/Н268АЛ/ЗОЗІ /"АЗ3305/Р3315 з використанням стандартних способів. У таблиці 10 показано отримані антитіла.
Таблиця 10 . Варіабельні
Важкі й легкі ланцюги певних антитіл показані нижче:
Св302 НО (5ЕО ІО МО: 67)
ЕМО МОБСАЄЕМУККРОЕБІ КІЗСКОАБОаМЗЕТЗУМІСУМВОМРаТкКаТагЕМУМапрРБЗОБОТАМРБЕ
ОСОМТІЗАОКБІЗТАМІ ОМ/55І КАБОТАМУУСАВМаРАВЮВУМ ВАС УМ ПОСТІ МГУ55АВТКОаРБЗМУЕ
РГАРСЗАЗТЗЕЗТААЇ аСІ МКОМЕРЕРУТУБМУ МСА ТЗаМНТЕРАМІ О5503І151 55 МТ ЗЗМЕ атОТиТОММОнкРЗОМТКМОКТМЕАКССУЕСРРСОРАРРАААБЗЗУРІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕМТСУМУУ
РУ5БАЕОРЕМОЄМУУУрамМЕМНМАКТКРАЕЄОЄМЗТЕАУММІ ТМ НОБУУЛІ МСОКЕУКСКУЗМКаї Р
З9ІЕКТІЗКТКаОРАБЕРОММУТІ РРОВЕЕМТКМОМБІ ТС УКОЕМРЗБОІАМЕМ ЕБМСОРЕММУКТТРР
Мі рБравзЕРі КІ тМОКЗАУМООаММЕЗСЗУМНЕАЇ НМНУТОК5БІ 5І 5РОК
Св3021 С (5ЕО ІО МО: 68)
РІММТО5РОБІ АУ5І СЕВАТІМСКЗВОБМІ І ЗЕОМІМКІ АМ/МООКРИООРРК ІМОАЗТВЕБЗОаМРО вЕЗОаЗИаБзаИаИТОЕТІ ТІЗ5І ОАЕОМАУУУСООГУЗУРЗТРООСТКУБІКАТУМААРЗУРІЕРРБЗОЕОЇІ Ка
ТАБМУСІ І ММЕМРАЕАКМОМКМОМАЇ ОБОаМЗОЕЗУМТЕООЗКОБЗТУБІ 55ТІ ТІ ЗКАЮОМЕКНКУММАСЕ
УМТНОІ 5БРУТКЗЕМАСОСЕС
СВЗ301 НО (5ЕО ІЮ МО: 69)
ЕМО МОБСАЕУККРОЕБІ КІЗСКОАБОаМЗЕТЗУУМСУУВОМРОаКаТагєЕМУМаТапорРБЗОБОТАУРБЕ
ОСОМТІЗАОКБІЗТАМІ ОМ/55І КАБОТАМУУСАВМаРАВУМОТЕОУМСОСТІ МТУЗ5АЗТКаРБМУЕ
РГАРСЗАЗТЗЕЗТААЇ аСІ МКОМЕРЕРУТУБМУ МСА ТЗаМНТЕРАМІ О5503І151 55 МТ ЗЗМЕ
СтТОТиТОММОнНКкРОЬМТКМОКТМЕАКССУЕСРРСОРАРРАААБЗЗУРІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕМТСУММУ
РУ5БАЕОРЕМОЄМУУУраМЕМНМАКТКРАЕЄОЄМЗТЕАУММІ ТМ НОМ МЕОКЕУКОСКМУЗМКИаї Р
З9ІЕКТІЗКТКаОРАБЕРОММУТІ РРОВЕЕМТКМОМБІ ТС УКОЕМРЗБОІАМЕМ ЕБМСОРЕММУКТТРР
Коо) Мі рБравзЕРі КІ тМОКЗАУМООаММЕЗСЗУМНЕАЇ НМНУТОК5БІ 5І 5РОК
СВЗО011 С (5ЕО ІО МО: 70)
РІММТО5РОБІ АУМ5І ЕВАТІМСКЗВОБМІ І ЗЕОМІМКІ АМУМООКРООРРКО ІМОАЗТВЕЗОаМРО вЕЗОаЗИаБзаИаИТОЕТІ ТІЗ5І ОАЕОМАУУУСООГМ5УРЗТРИОСТКУБІКАТУМААРЗУРІЕРРРБОЕОЇІ Ка
ТАБМУСІ І ММЕМРАЕАКМОМКМОМАЇ ОБОаМЗОЕЗУМТЕООЗКОБЗТУБІ 55ТІ ТІ ЗКАЮОМЕКНКУММАСЕ МТнНОвІ 55РУТКЗЕМАИаЕС
Приклад 7. Характеристика антитіл до ССІ 17
Вибрані антитіла до ССІ 17 характеризували в аналізі потоку кальцію, аналізі репортерного гена рД-арестину й аналізі хемотаксису для оцінки їхньої здатності інгібувати види біологічної активності ССІ 17.
Аналіз потоку кальцію. Аналіз мобілізації кальцію використовували для перевірки здатності гібридоми тАбБ нейтралізувати сигналінг ССІ 17. Клітини ССЕРЕ-СЕМ (АТССФ СС -119 тм) культивували в середовищі КРМІ з сішамаАХ; 10 95 ЕВ5 (фетальна бичача сироватка); 10 мМ
ГЕПЕС, 1 мм пірувату натрію, 4500 мг/л глюкози й 1500 мг/мл бікарбонату натрію в інкубаторі за 37 "С із насиченням 595 СО». Виконували мічення клітин барвником з використанням набору реагентів для аналізу БІшо-8 МУМ Мо УмМахп Саїсішт Авзау КИ (Мо 36315) виробництва АВО
Віодпеві, Іпс. Досліджувані антитіла і 10 нг/мл людського ССІ 17 або 5 нг/мл ССІ 17 яванського макака попередньо інкубували з досліджуваними антитілами, і додавали суміш до клітин.
Сигнал флуоресценції виявляли за допомогою приладу ЕО55 6000 (Нататаїгзи, м. Бріджвотер, штат Нью-Джерсі, США) з використанням збудження на 490 нм і емісії на 525 нм.
Аналіз репортерного гена р-арестину. Аналіз ВД-арестину виконували для оцінки здатності антитіл до ССІ 17 нейтралізувати функцію ССІ 17. Аналіз проводили з використанням набору для аналізу РаїйНипіег еХргез55 рД-агтевііп аззау (Оізсомекх). Коротко, здатність антитіл до
ССІ17 інгібувати рекрутування р-арестину, індуковане ССІ 17, оцінювали в клітинах Нек293, коекспресуючих ССКА, злитий у рамці зчитування з невеликим фрагментом ферменту РгоГіпк тм і гібридним білком В-арестину і мутантною В-галактозидазою з делецією на М-кінцевому фрагменті (так званим акцептором ферменту або АФ). Антитіла до СС117 у різних концентраціях (від 0,15 НМ до 1 мкМ) об'єднували з 20 нМ ССІ 17, і перед додаванням до клітин комплексу антитіло-ССІ 17 інкубували суміш за 37 "С протягом 20-30 хвилин. Суміш додавали до клітин і інкубували за 37 "С (95595 О2/5905 СОг2) протягом 90 хвилин. Додавали 55 мкл реагенту для виявлення на ямку, і інкубували протягом 60 хвилин за кімнатної температури.
Зразки аналізували з використанням стандартного спектрофотометру для зчитування планшетів із візуалізацією флуоресценції, після чого розраховували значення ІСво.
Аналіз хемотаксису. Аналіз хемотаксису використовували для демонстрації того, що антитіла до ССІ 17 інгібують функцію ССІ 17. Міграцію клітин НЗС-Е (клітини НОС-Е отримували з джерел реагентів від нелюдиноподібних приматів, МІН) або клітин ССЕБ-СЕМ (АТССФО СС - 119 м) оцінювали з використанням 96-ямкової камери для аналізу хемотаксису з використанням полікарбонатного фільтру 5 мкм згідно з протоколом, описаним у Іптаї еї аї. 1997; Ітаї еї а. 1999.
Коротко, нижні камери наповнювали 320 мкл 0,195 КРМІ/ВБА і 1 нм ССІ17 людини або яванського макака без антитіл або з різними концентраціями антитіл (0,125, 025, 0,5,1 ї 10 мкг/мл), після чого їх обережно покривали полікарбонатною мембраною. Клітини промивали з використанням ФСБ і суспендували в 0,1 95 ЕРМІ/В5А в концентрації 0,5 х 1059 клітин/мл, після
Зо чого суспензію з клітинами додавали у верхні камери. Камери інкубували протягом 60 хвилин у зволоженому інкубаторі з 5 95 СО» за 37 "С, і міграцію клітин через мембрану в нижню камеру визначали за допомогою аналізу життєздатності клітин з використанням набору реагентів Те
Сеїї Тпег-Сіо І итіпезсепсе Сеї! Міаріїйу.
У таблиці 11 показано значення ІСво для аналізу потоку кальцію. Дані являють собою середнє значення з трьох незалежних експериментів. Кожне тАб повністю нейтралізувало потік кальцію, індукований ССІ 17 людини або яванського макака, за використання 10 нг/мл (1,25 нМ) людського ССІ 17, або 5 нг/мл (0,625 нМ) ССІ 17 яванського макака, і, як показано в таблиці 11, значення ІСво приблизно еквівалентні для кожного з антитіл до білка як людини, так і яванського макака.
Таблиця 11 с17в2я44С1СЇ111111111о311
У таблиці 12 показано значення ІСзо для аналізу В-арестину. Дані являють собою середнє значення з трьох незалежних експериментів. Усі тАр виявили здатність повністю інгібувати рекрутування р-арестину, індуковане ССІ 17 людини або яванського макака в концентрації 20
НМ їі дозозалежним чином інгібувати рекрутування В-арестину, індуковане ССІ 17 людини або яванського макака з еквівалентною ефективністю.
Таблиця 12 11111101 лЛюдськийССІМ7 | ///// ССіІл7яванськогомакакад//ЗО 11111111 Сю(днму | св | ІСювфмМм) | св'б
На Фіг. 1 їі Фіг. 2 продемонстроване інгібування хемотаксису відібраними антитілами в клітинах людини і яванського макака відповідно. Усі досліджувані антитіла інгібували хемотаксис клітин ССКЕ-СЕМ, індукований людським ССІ 17, на рівні інгібування приблизно 50 95 за концентрації антитіл 0,5 мкг/мл. С178302 і С178311 інгібували хемотаксис клітин НЗС-Е яванського макака, індукований ССІ 17 яванського макака на рівні інгібування приблизно 50 95 за концентрації антитіл 0,5 мкг/мл.
Приклад 8. Картування епітопів антитіла С178236 до ССІ 17
Зв'язуючий епітоп антитіла С178236 (МН: 5ЕО ІО МО: 45; МІ 5ЕО ІО МО: 52) визначали за допомогою рентгенівської кристалографії.
ССІ17 експресували в БЕ. соїї, виділяли з тілець включень і піддавали рефолдингу. Бар фрагмент тАб С178236 експресували в клітинах НЕК29ЗЕ. Комплекс ССІ17: С178236 отримували шляхом змішування в молярному співвідношенні 1,6: 1 з надлишком ССІ 17. Після цього комплекс очищали за допомогою гель-хроматографії. Комплекс кристалізували пародифузійним способом з розчину, який містив 20 95 ПЕГ 3350 їі 0,2 М тартрату К/Ма. Дані рентгенівської дифракції збирали до роздільної здатності 1,9 А. Структуру визначали шляхом молекулярної заміни і очищали до К-фактора 18,0 95.
Епітоп С178236 є конформаційним і перекриває З сегменти молекули ССІ 17, а саме дві петлі (залишки 21-23 і 44-45) і С-кінцеву спіраль (залишки 60-68). Найважливіші взаємодії включають основні залишки ССІ 17: Аго22 і Гуз23, і групу кислотних залишків у НСОК2, у тому числі Азр52, Азр55 і Азр57. На додаток до цих електростатичних взаємодій у центрі епітопу виникають контакти Ван-дер Ваальса між Тгр33 і Тгтр105 МН, їі Агд22 ССІ 17. Враховуючи кількість контактів, ключовим залишком епітопу є Агд22, який складається біля Тгтр33 МН і
Зо виконує численні контакти з НСОКЗ. Залишки паратопу та епітопу показані на Фіг. 7.
Паратоп (залишки антитіл, які беруть участь у зв'язуванні ССІ 17) включає в себе 18 залишків, що належать до 5 із 6 СОК (усі, за винятком СО).
Епітоп С178236 перебуває на протилежному боці мономера ССІ 17 відносно його поверхні димеризації. С17В236, таким чином, не блокує димеризацію ССІ 17. Нейтралізуюча дія С178236 виникає з конкурування з ССКА за епітопи, які перекриваються.
Ес НИНІ ПОН НИ НН агдіпудгессієуїкдаїріїкІкКомудізедс 1 РАТ | Ното зарієп5 ССІ117 вгдаіммімддгаісзарпоКи/Кпахку! ві ег5 тагаїпмагессікуїкааїрі"КкІкомудівеа 2 РАТ | Яванський макак СС 17 с5гдаіміміапКаіїсзарпаккуУккКаїКуїд 5іЄг5 друдаптеадзусстаумгуптрігУкпТум
З РАТ | яванський макак СС1І22 15азсрграхумнегакКеісадргуримкКтії пКІ5а
ЗЕО . . послідовність
НОСОК із С17Е24 ПОРБОБОТАУБРБОЕОС послідовність послідовність
Штучна СОМ із С17Е24 ово Ратол дсть ІЇСОМ1 із С178234 К5БОБМІ І ЗЕОМІМКІ А послідовність а РТ л дсть ІЇСОМ1 із С178235 К5БОБМІ У5ЕММЕМАЇ А послідовність
Штучна . (совтзсттвоє | КовОМ оРАМеМО ГА
Штучна . 11 РАТ . . ІЇСО1 із С178237 КОМІ Т5УММОММІ А послідовність 12. | рвт | Штучна І СОВІ із С178238 К55О5МИЗАЄМОМРІ А послідовність (совтсттвю 0 КОВОМ ЕТ послідовність
ІЇСОМ1 із С178240 К5БОБМІ У5НУМУМАЇ А послідовність
Штучна .
РАТ . . ІЇСОК1 із С178241 К5БОБМІ М5ЕТМММАЇ А послідовність
Штучна . 16 РАТ . . ІЇСО1 із С178242 К5БОБМІ ЕЗНОМІ МТ А послідовність
Штучна . 17 РАТ . . ІЇСО1 із С178243 К5БОБМІ М5ЕОМКМОЇ А послідовність
Штучна . 18 РАТ . . ІЇСОК1 із С178244 К5БОБМІ 5БІТМММОЇ А послідовність 19 |рвт| Штучна . Горнз із С17Е2а М/А5ТВЕ5 послідовність (батьківський) послідовність послідовність послідовність послідовність послідовність послідовність послідовність 27 РВТ Штучна | Ісок3 із С17Е24 ООХУУСТРІ Т послідовність (батьківський) 28 | Рвт | Штучна І СОВ3 із С178234 ООГУ5УРБТ послідовність послідовність
Штучна .
Штучна .
5ЕО . .
Штучна .
ІСОВ3ізс178238 | ООХОРІРЕТ
Штучна .
ІСОВ3ізс178239 | ООУПУРУТ
ПОСЛІДОВНІСТЬ
Штучна .
Ісов3зізсі7в241 | ООТМВІРІ Т
Штучна .
ІСОВ3ізСс178242 | ООУУАУРОТ
ПОСЛІДОВНІСТЬ
ПОСЛІДОВНІСТЬ
39 | РАТІ 7 | ІсовВ2ізс178257 ААЗТВЕБ |РАТЇ -/К/////// | ісов2ізс178262 ЗАЗТВЕБ 41 1РАТІ 77777777 | ісов2ізс178264 ІА5ТВЕ5 42 |РВТІ 00000000 ЇЇ НСОВЗ із С178293 УмаРАЮУМДАБрУ 43 |РВТІ 00000000 ЇЇ НСОВЗ із С178294 УмаРАЮУМОТЕВУ 44 |РВТЇ 00000000 | НСОВЗ із С178295 МаРАВСМУУЕЗЕОСУ
МН із С17Е24,
С178234, С17В235,
С17в236, С17В237, ЕМО! МОЗОАЕМККРОЕВІ КІЗСК
С178в238, С17В239, С5аУ5ЕТ5УМІСМУВОМРОКИІ. ав РВТ | Ното зарієпе С178240, С17В241, ЕМ МИапоРЗО5ОТАУЗРЗГОСОМ р С178242, С178243, ТІБАОКОІЗТАМІ ОМ/55І КАБОТА
С178244, С17В257, МУУСАВМаРАЮУМОЗЕВСУМОО
С178258, С17В260, СТІ УТУ55 сС17в262, С17В266, сС178264
ЕМО МО5БОАЕМККРОЕБГКІЗСК
С5СОУ5ЕТЗУУМОМУВОМРОаКаИї. ! . ЕММСИПОРЗОЗОТАУ5ЗРОРОСОМ 46 РАТ | Ното зарієп5 МН із С17М293 ТІБАОКЗІЄТАХІ ОМ/551 КА5ОТА
МУУСАВМОРАЮУМОАЕОУМОО стімТУ55
ЕМО МО5БСАЕМККРОЕБІГКІЗСК
С5СОУ5ЕТЗУУМОМУВОМРОаКаИї. ! . ЕММСИПОРЗОЗОТАУ5ЗРОРОСОМ 47 РАТ | Ното зарієп5 МН із С178294 ТІБАОК5І5ТАХІ ОМ/55І КАБОТА
МУУСАВМОРАЮУМОТЕОУМСО стімТУ55
ЕМО МО5БОАЕМККРОЕБГКІЗСК
С5СОУ5ЕТЗУУМОМУВОМРОаКаИї. ! . ЕММСИПОРЗОЗОТАУ5ЗРОРОСОМ 48 РАТ | Ното зарієп5 МН із С178295 ТІЗАОК5І5ТАХІ ОМ/55І КАБОТА
МУУСАВМОаРАЮММЕЗЕО УМО стімТУ55
ПІММТО5РОЗБІ АМ5І СЕВАТІМСК 5505МІ УЗ5ММКМУІ АМ/МООКР 49 РВТт | Ното зарієпе М. із С17Е24 СОРРКІ ШУМ АЗТВЕЗОМРОВЕ5 р (батьківський) С5О5ОТОЕТІ ТІЗ5І ОАДЕОМАМУУ
СООУУ5ТРІ ТЕФОСТКМЕЇК
АЕсЯ ЕІ НН УННИ НИ НЯ НС НН
РІММТО5РОБІ АМ5І СЕВАТІМС
КЗБЗОЗМІ І 5ЕОМІМКІ АМ/МООКР 5о0 РАТ | Ното зарієп5 МІ. їз С178В234 СОРРКІ ПУМАЗТВЕЗБОУРОВЕ5 а5Оа5ОатТОЕТІ ТІ ОДЕОУДУУ
МУСООГУЗБУРЗТЕСОСТКУЄІК
РІММТО5РОБІ АМ5І СЕВАТІМС
КЗБ5ОЗМІ УЗЕУМЕМАЇ АМ/МООК 51 РАТ | Ното зарієп5 МІ. їз С178В235 РООРРКІ ГІУНАЗТНЕЗОУРОВНЕ 5БабабатовЕТтІТІЗ55 ОДЕОМ ДУ
МУ СООГМАТРЕТЕСОСТКУЕїІК
РІММТО5РОБІ АМ5І СЕВАТІМС
КЗБЗОЗМІ І 5РМУМЗМОГАММООК 52 РАТ | Ното зарієп5 МІ. їз С178236 РООРРКІ ІМ АЗТВЕЗОУРОВНЕ 5БабабатовЕТтІТІЗ55 ОДЕОМ ДУ
МУ СООУМІ ІРЗТЕСОСТКМЕІК
РІММТО5РОБІ АМ5І СЕВАТІМС
К5Б5ОЗМІ ТЗТУММЗММУІ АМ/МООК 53 РАТ | Ното зарієп5 МІ. їз С178237 РООРРКІ ІМ АЗТВЕЗОУРОВЕ 5БабабатовЕТтІТІЗ55 ОДЕОМ ДУ
МУ СООХІ 5РРОТЕСОСТКУЄІК
РІММТО5РОБІ АМ5І СЕВАТІМС
КЗБ5ОЗМІ ІЗАЕМОМРІ АМ/МООК 54 РАТ | Ното зарієп5 МІ. їз С17В238 РООРРКІ ІМОАЗТНЕЗОМУРОВНЕ 5БабабатовЕТтІТІЗ55 ОДЕОМ ДУ
МУ СООХОРІРЕТЕСОСТКМУЕІК
РІММТО5РОБІ АМ5І СЕВАТІМС
КЗБЗОЗМІ 55ЕТМТ МТ АММООК
РАТ | Ното зарієп5 МІ. їз С178В239 РООРРКІ ГІУНАЗТНЕЗОУРОВНЕ 5БабабатовЕТтІТІЗ55 ОДЕОМ ДУ
У СООХІМРОТЕСОСТКМЕІК
РІММТО5РОБІ АМ5І СЕВАТІМС
К55ОЗМІ УЗНУМУМАГАМ/МООК 56 РАТ | Ното зарієп5 МІ. їз С178240 РООРРКІ ГІУМАЗТНЕЗОУРОВНЕ 5БабабатовЕТтІТІЗ55 ОДЕОМ ДУ
МУ СООУУТІ РАТЕСОСТКУЄІК
РІММТО5РОБІ АМ5І СЕВАТІМС
КЗБ5ОЗМІ МЗЕТМММ АГА МООК 57 РАТ | Ното зарієп5 МІ. їз С178241 РООРРКІ ІМЕАЗТВЕЗОМУРОВЕ 5БабабатовЕТІТІЗ55І ОДЕОУДУ
МУ СООТМ5ІРІ ТЕСОСТКУЕІК
РІММТО5РОБІ АМ5І СЕВАТІМС
КЗБЗОЗМІ ЕЗНОМІ МТ А МООК
58 РАТ | Ното зарієп5 МІ. їз С178242 РООРРКІ ГІУНАЗТНЕЗОУРОВНЕ 5БабабатовЕТтІТІЗ55 ОДЕОМ ДУ
УУСООУУАМРОТЕСОСТКУЄІК
РІММТО5РОБІ АМ5І СЕВАТІМС
К5Б5ОЗМІ МОЕОМКМО АМ/МООК 59 РАТ | Ното зарієп5 МІ. їз С178243 РООРРКІ ІМЕАЗТНЕЗОМУРОВЕ 5БабабатовЕТтІТІЗ55 ОДЕОМ ДУ
МУ СООНМОТРІ ТЕСОСТКУЕїК
РІММТО5РОБІ АМ5І СЕВАТІМСК
ЗБОБМІ 551 МММОЇ А МООКРИ
РАТ | Ното зарієп5 МІ. із С178244 ОРРК НУТАЗТАЕЗаУРОВЕБО5 аБОаТОгТІ ТЗІ ОАДЕОМАМУУСО
ОУМНОРЕТЕСОСТКМЕЇК тя вс НИ УНН НИНІ НИК НН
РІММТО5РОБІ АМ5І СЕНАТІМС
КОЗБОБМІ І 5ЕОМІМКІ АМ/МООКР 61 РАТ | Ното зарієп5 МІ із С178257 СОРРКІ ГІМААЗТВЕЗБОУРОНЕ5 а5Оа5ОатТОЕТІ ТІ ОДЕОУДУУ
УСООгУБУРЗТЕСОСТКУЕїК
РІММТО5РОБІ АМ5І СЕНАТІМС
КОЗБОБМІ І 5ЕОМІМКІ АМ/МООКР 62 РАТ | Ното зарієп5 МІ із С178258 СОРРКІ ГІМОАОТВЕЗБОУРОНЕ5 а5Оа5ОатТОЕТІ ТІ ОДЕОУДУУ
УСООгУБУРЗТЕСОСТКУЕЄЇІК
РІММТО5РОБІ АМ5І СЕНАТІМС
КОЗБОБМІ І 5ЕОМІМКІ АМ/МООКР 63 РАТ | Ното зарієп5 МІ. із С178260 СОРРКІ ГМО АЗТВЕБОУРОНЕ5 а5Оа5ОатТОЕТІ ТІ ОДЕОУДУУ
УСООгУБУРЗТЕСОСТКУЕїЇК
РІММТО5РОБІ АМ5І СЕНАТІМС
КОЗБОБМІ І 5ЕОМІМКІ АМ/МООКР 64 РАТ | Ното зарієп5 МІ із С178262 СОРРКІ ППУЗАЗБТВЕЗБОУРОВЕ5 а5Оа5ОатТОЕТІ ТІ ОДЕОУДУУ
УСООгУБУРЗТЕСОСТКУЕїК
РІММТО5РОБІ АМ5І СЕНАТІМС
КОЗБОБМІ І 5ЕОМІМКІ АМ/МООКР 65 РАТ | Ното зарієп5 МІ із С178263 СОРРКІ ПУТАЗТВЕЗОУРОВЕ5 а5Оа5ОатТОЕТІ ТІ ОДЕОУДУУ
УСООгУБУРЗТЕСОСТКУЕїЇК
РІММТО5РОБІ АМ5І СЕНАТІМС
КОЗБОБМІ І 5ЕОМІМКІ АМ/МООКР , . СОРРКІ ГМІАЗТВЕЗаУРОНЕЗОа
РАТ | Ното зарієп5 МІ. із С178264 9СО5СТОЕТІ ТІ ОДЕОУАДУХУ
СООГУБУРЗТЕСОСТКУЕЄІК
ЕМОЇ МОБОАЕМККРОИЕБІ КІОСК а5БаМ5ЕТЗУМІСУМУВОМРОаКаї.
ЕМ МСОИПОРБОБОТАУ5БРОБОСОМ
ТІБАОКБІЗТАМІ СМ/5БІ КАБОТА
МУМУСАВМаРАЮММСАБєОММУСО
СТІ МТМ55АБТКОРОУМЕРІ АРС5
В5Т5Е5ТААЇ аСІ МКОМЕРЕРМТ
УМБММБИаАІ Т5аМНТЕРАМІ О55С2
МБ 55БУМТУТ55МЕатотУтсмМ
МОНКРУьМТКМОКТУЕНКССМЕСР 67 РАТ | Ното зарієп5 Свзо2 НО РСОРАРРААДАБ5ОМУРІ ЕРРКРКОТІ.
МІЗАТРЕМТСУМУМОМ5БАЕОРЕМО
ЕМУУМраМЕМНМАКТКРАЕЕОЕ
МОТЕВМУБМІ ТМ НОВУ МаКЕМ
КСКУ5БМКаї РОБІЕКТІЗКТКИасоР
ВЕРОМУТІ РРОВЕЕМТКМОМ5І Т
СГ УКОЕУРБОІАМЕМЖМ ЕБМИОРЕМ
МУКТТРРМІОБОСОЗБЕРІ МКМ оКЗВУМООаММЕЗСОУМНЕАЇ НМ
НУТОКОБІ 5І 5РОК
АЕсЯ ЕІ НН УННИ НИ НЯ НС НН
РІММТО5РОБІ АМ5І СЕВАТІМСК
ЗБОБМІ І 5ЕОМІМКІ АМУМООКРИ
ОРРК НМОАЗТВЕБОаМРОВЕ5И
БабБатОвТІТтІ55І ОАЕОМАМУМС
ОООГУБУРБТРаОС,ТКМУЄІКАТМУА
РАТ | Ното зарієп5 Св3021 С АРБМЕІЕРРБОЕОЇ КБИаТАБММСІ.
ЕММЕМРАЕАКМОМУКМОМАГ ОСИ
МЗБОЕЗМТЕООБКОБТУБІ 55 Т
І -«КАОМЕКНКУМУАСЕМТНОСІ 55
РУТКЗ5ЕМАСЕС
ЕМО МОБСОАЕМККРОИЕБІ КІБСК аБаУБЕТЗУУМІСУМУУВОМРОаКаї.
ЕММИИапОРБЗОБОТАУЗРОРОСОМ
ТІБАЮОК5БІЗТАМІ ОМ/55І КАБОТА
МУУСАВМаРАВУМОТЕОУМИО
СТІ МТМ55АВБТКОаРБОМЕРІ АРС5
В5О5Т5Е5ТААІ СІ МКОУЕРЕРМТ
УМБУУМ5ИаАІ Т5СМНТЕРАМІ О5504
МБ 55БУМТУТ55МЕатотУтсмМ
МОНКРОЬМТКМОКТУМЕВКССМЕСР
РАТ | Ното зарієп5 Свзо1 Но РСОРАРРААДАБ5ОМУГРГІ ЕРРКРКОТІ.
МІБАТРЕМТСУУМОУМ5АЕОРЕМО
ЕМУУМООСМЕМНМАКТКРАЕЕО
МОТЕАУМБМІ ТМ НОВУ МЕКЕМ
КСКУ5МКаїЇ РОБІЕКТІБКТКООР
ВЕРОМУТІ РРОВЕЕМТКМОМ5І Т
СІ УКОЕМРБОІАМЕМ ЕБМСООРЕМ
МУКТТРРМІ ОБОС5ЗЕРІ КІСТУ оКБВУМОССММЕЗСО5УММНЕА НМ
НУТОКОБІ 5І 5РОК
РІММТО5РОБІ АМ5І СЕВАТІМСК
ЗБОБМІ І 5ЕОМІМКІ АМУМООКРИ
ОРРК НМОАЗТВЕБОаМРОВЕ5И
БабБатОвТІТтІ55І ОАЕОМАМУМС
ОООГУБУРБТРаОС,ТКМУЄІКАТМУА 70 РАТ | Ното зарієп5 СВ3011С АРБМЕІЕРРБОЕОЇ КБИаТАБММСІ.
ЕММЕМРАЕАКМОМУКМОМАГ ОСИ
МЗБОЕЗМТЕООБКОБТУБІ 55 Т
І -«КАОМЕКНКУМУАСЕМТНОСІ 55
РУТКЗ5ЕМАСЕС
ПЕБЕДЕК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
Я Софт йо ухих. ти «іа. Чедщеа ВуББесв: Ве,
Сея биту Шу шЖаанмутш: ЩИД
ЕМ дату Ул іки. їі ес, АХ
Мудрим кн, кхапоиа. ЗЕИНЕ мелу. ВА УЙ
Ммаохжну. дуте
Визи, Мату с Уч дич кі селу пзлдовімі-маковто, зВАЛЙХа ен НН
Іпріуйисоу. дАшХЕЖУ яка г; у вже сппетіяк. ХО хазпакнх, хх «Ж бджетуня де БшХхЇ важ ОЖІБИАТКНИХИ кіййх пора сиупми пив
Мал х птжреушкутми пики асо Ед ну «1айи ха Ве «150» БІДИ, НН сад заічз-1-пай ками МБ хау т сао пліт у тні Ох
КАТЕ аесавкІй. ВБшсМя а.х «МІ Ше Х шля я сим т
СЯ пий
Можу т ку «иїїх ЗО забішла еапе 4 «дних ї що жи ст юю Му с «хх йони пі у кю их 03: жи ЇМ То зіва вт щі ТК АБИ УЖУ Зі дж щіЗ Сув був Без бЗїб тУуК Бра Був ьН с З лох.
Кз Я хи. про іш Віа її Боб їнна ВБхщробов ше Бувствх хи бут піп оте Цех пла йо й і «М шХ З прик ли: Зішу Коі сдуу Ал Ух дО умо ил чає Уго мрої туя Мовою сл д-е Суд о пеих БК даю Аза їлю бі пев уд тче Зав бій піУ вка діа 35 з а ти; гу дн Жоїву Ук до Ха тм Мк ЩО уУлкю сл дл ік зак пі
Іза о суув бек ЖвроБко аа) Ав оСУув дк ММ Бу вай Аа УаА ев о туУх
З в БИ
Ти ла ще їжену піс ЗХ пає ек -х
У злам «Ві
ТИ, Ел
Я Еш «іш КК или «озимих овен ит мух Мзсзза Хавсзенівкиув «аг З жом ох зує що джем АХ Мою козух ля ха АЮ ШУ: Ями ук им би ух ВД ме Віа дк щу ТИХ Бай узі піу дк са Су сбуш за Му бух Бр 3 ІЗ її ке ї З У Ух тий Мім діла тю по ге вк тло Тим ту У бучу стчеу са ла Фе му іЗзКУ са ваш КжОо Бржи ХО Му їм дув оСуВи МЕрОХКЕ и АЖ хх
КУ 5 І: их Ед пуху ях Хо доєзч. хх з те ле сут. хАуЗ ном 3 (13 й дже сів Взв осСуа ах Аєх дер вів їла МаК жає Уа бу Мазі ВІЙ бло хв тах «г чц а що 35 тм жі их дою Вас и Мам щу хх Жлятщо тою по тео То Услум тик вів хів Пух Шах Ар Бо хви бар обу Б Са був зуд БІВ Хм цу
ЗО ще Б чут її ць сурми З Ум 613 дм пи ук шви см ІМТ МД їз лллф жах пу па
МУ ги «Вій» З «ді Е5 «Відео БК ел Ха тре Жуки ит я тех Мзкаса їаносісвівКАв яти 3 «а5И 5 туф ХУ Чо тя Ух шт гдєує УТ. й у ЗА чик ум у вх бю
Сіу рхоастує ЩЕ Але вв Мет ій дВю шЖек о Заї СУ Су АКБ АЮ ТУ
Н У 18 15 «хі шк и хє джу июмМ о Нею їм Ду їй хдуї їм піші Чим сим ух М
Чаі Втщ о пУє Аж Ме Бе ісц Бха Мах чай іме Ні Бе бує тую ТВУх
КУ п ха ше Мі Слім (чо фену уч ФА Утіч Лу тгд що ті Му ую дм Дт пек АБ опех Чую БО АК БК біу хв» мазі їФО Па о ТМХ пе лХЯ АВ ех дк нос Б ки тет алі) жі тен Кл лову: ит сер Ах Зк тку: ларі Тс о ме тів тм пУувБошАаб хаФ лу Аіа одЕм Бл дКо лю хо тт Уал о мбув Мет іа ма
Зо 55 Б ча а ння ви о гпУВ Пе псу ЗА па «М пря к кад ом КУ икж мч зшити и ХА мі спе мері тує м, хм жу ПОСЛА Кгу оо «МАТ
СУ ЄСТУ 15 ту «ЖИй МСПАТ їз ПТК ла
«воп» 4 дію У гу т сх шик ОКХ ХВО ху х 5 кам ої
ВО АН
ОС 7 кт жуде «ши ВК пружно ин дея ОшХуУхнаА ПОСЛА мОВНИУХЬ «де ск а слав БОНЯ з опіка
До яч «ох В є г я г ; - не пе з шля ЖК
Ії2 її дво Бо Пех би оЗосї вро дежр о Бух беж Бо ше КН Св : х зв те 1 У ї5 хЙ пло шу «тек д чи МИ КУ ик Кк шим де
УТ чх пи
Люджуюаюи С ою бе тм и ЩО ех мам ВШ УчНа ПОЛА ДОВМиЕЕ «да»
ТЕХ Ах студ ро ТИ кхИМАю МИБКУ і лий кун 5 «ПИ» о ху ик дес із му МКУ бе м бум ТУ Хо ун
Мак Фі БКо віз бр оах тв дже беих пе Зврогух ву 5 7
Х К- їй «шій я ях чи АХ слух киш «хх ЖЕ кри Вімуечв пила вні чшран шум МУЛ АД ВНИКИО «Ийпх я тах г втру «аю ОСМОЮКЕ меж ФСК КИ сн
ЗНО тота брахє зику ху ше І лову би Жухе Шут Вам, ДУ тд йод хи та іжв о Євж цпоех зій жежЖ Уі їли хХух важ жк дим дала був Вал Офух хе їх Кі за КУ: 8 стр д чем У удо ху вам кл «тру у сих са" ЖКХ 2 00 інте. еф еру
У В М с о Но хх в з хи ий НЯ ма МАТИ «МНІ» З тліщо Ще Жозе фітя; фан дц тах Толя Шуєр ІДУ дру холу Ту йду Тло ті цПущ паж жеє шщхЗ пе ЗІ ЗИ мем ше о КЗ» Бр оба Я АШУ свои
Н Ку КУ х5 зіж як г «й» В кн ях
А Не «Й1Жх БЕ на фе мех мими педхі ть
МФО ЖЖ ХММІЛІ БАН М МАХ
ТИ ТКх
ЖодшАМИ
Какдее и титУу 1 Секс
ЛК МАТКА ВО СОУ Ме ИЙ «ШИ ШК ЗВО СВУ ярі З жк сих смиах Тур Му лящ бом Миколу 3УБіМ че ду йно ди хі гм
Би ще б сів Бех мах» їдь ук мех Біжа Тут Аве пе Ал Мая Би 1 в 15 я ід
КЛІ В
«іх В шт дол
КА 1: «ші ВЕЖ «ВІ Ух неежчаєй посилена ууть
САКЕ хм
Кк лад ду Кт А ши» ОЩИБаХх Ма ОІВ пий й
Ж МКХ их тек жид ляє З суху ХЕЙЮГ жиї Тим: длухуює СТУ те де Фе дм Ол т. мук о миткК ше о сап де Мах хаві ше сеш КО ЩхЮ а ОшеК Клод Би. х и тк Зх ж -. Кк ля шт вів «дж 11 й -
ОКУ ле Я мова Уже ххх хх беж хе тглу чигеї еУє В пе. хх ЖИВ ФЧИПАЛОУВН І ше нут
Бе ох течМмх гл свцюю «сш ВКЛ ха МАСИ як - «ем ха тато бу. Мкужо ХУ. Фу Хто птреує Хдужх СТУ ше. луг Що пе би так їжвобех ев М щделоУай їмна БЖ Беж ТУ Ав) вв Бех ба Ттук Це ч щ я 5
КУ КІ Ах хе
Б
УМ лій ях «Мій «я т «їй ЕЖЖЕ
АЖ Же Му Ня ТИМАЙХ ДАВНІХ «ШИХ» «да» ЗМОВІ са СТЕ хв ХЕ
Тл слух суку (іх ик 47 У вух СТУ зи З м МІУ бла с дичні СБошкт їлив Бех ВШ ів шшК Уві Мероїів Жах Ав Пе ави бЗМА дЕТ ОМ Па ї З 1 Ех
Ав. «Кі 3 сам ОО ж ТИ КІ нти путі се трт кут их
АБИ М ТУМАН БОС
«ДИ» хе БОКУ ла пути ап У г Фо б У шує ХЛ їакщо аву. Ще сеужу В. се У - шу тре ох ог іже Шех ех ЗИ деж 3 їні Зах пах ЖДЕ ТтпК одна ЖпХ Вва Є їм ї У 13 їБ щі ка стать 8
ХДАК ха «ам» ії «іль пщрВ «132 Штучна посцпілавнхште «Й я«ийам БОР М їз СМІВЖЯЗ «ах 14 сомиєх Мине ТУ я кмжя. а и чужих їм їз пх сх Мить іх ще
Мує Зак шах бій ет Уві бом ТуК Бех Ніз Уді зва оСтук дп важ Ту ї в 15 іч ка 27 че жк ж мл 17
ЯКО КІ
«віча БК «им ОМпкУучЧчаЙ ІДМЛЮМІНУВНІ СУК лі
Ах шу сю ІМУННИХ О «ий АНА з СІТЕМА «0 ХУ ал Ми Щрихує Й умах МАХ тем рої щухаи сичуї Ле сх. мії щу ДТ жид
ПУув беж Ве шер о маз їж; вв! бЗеє же ТрБровва ай Бай АМа їде 4 к їх че
Ка й М хо
Ме кий «вій ТЕ штук Ух кари ОМ кекл - «М ВАТ «Ей» шееЗМа посіли ВиХоте «Ше жуть вочждії є ух «Ва МЛН З пра
КОХ ХУ тис фею са М шує 3 Ким заз Ха жі йо по бима джу ЛИ тт ійев БЕЖ Вт ММ дж Фа їнма БНе она КІ дже аЗвоиМа ат ОТАК дк ї 5 їй 15
Хлох
КА.
ВИ ЯНУхУ ес «дів оку. «т хЕі М ХУ ря опртв чом 0 ЖКХ «ал преучий бно
ЕТО ОУЖуим БРОШИАКОМУТУ уд. «ПВЛ» ча соя г ДДТ «жи ЖАКА М з СІТВІИХ «мах Ж гою рук рю ди ля тахур башт буєе М ду ду блем шт Щоецу Туз му ат Ше пад о бзу УВУ Хом) Аа ех БВе ЗЗр дви МУК ЕТ ВОЮ бею 3 с 13 15 дл лі ей» ТВ «її люту си
ЕМ ВК
«ЕКО 0 Плееможеомо екв мим вх
ЗИ шІхучна числівсввЕште «да «Ж ИН Й За СУД «сб ув
Тут бух пзж Зіз Бек Уві ба Бех дет іє Тахо дви Мі бий дву їж ї У ке); 1 дій «жк 15 «АЛ
Ко Киев леж КУА вОКася УЖ УМ ПОМ ДК НИУИУ
ТК лих що м молю жука з ем тре М «дм иа їх БТ «ніх Її тЕв діа жЖек ТВХ ВКЯ бій ше шли Ж Тук. «ких М кла лм й «йїих КАХ «пі» жу чма похламлаВНісхе й пл х кое гу пять сух чи «Ше» ЮК Ва СТВ «ай ЗВ «НІ» йй до пкомо бу кс ЖУК ва Аза пек блх ВЗ ід дає 1 ї
Же хх
В КОН кут БУ «жук» -
Ех їх: «паїв ОБАТ ка цеучеціа смтю лі пив мрі им сах ОА МИ КАК
У шал «ЛИХ учи з. ОВ «ша ЯЮКИ їз тр
КАХ п «ФАЦУМ А уре дл фею сом ут М суд ні ів ЕК Тих дуФоЗІй жк їх х сту кл екю хх ее - ше 7 стр, туди «Май У пл прим сличеті поніс
Іде щу Поп ЛОВНАТИ
Кен мадам
Є х тажци їм ша хлиСЖУ ІМ СМУЮ Ком «дих т «ВО Ожея пиря Б и ихм о тач доичч КУ. шу сюу Ввід дає ТАЄ ОАжУ М пиХ ї « жук. зх «ше й я т «ах 7
«іш КВ
С. Змови: жилки тк а, моих. ший штучна ПопШЛІДдДОоЗнУтт г «Й лу Же З ут «шах БИ ЮВІ їз МІВ заци кл «Ом 3 тує що ую сив Уж 22; де пем овійа дах ТОК ОАЕ САМ ОХ я їх ї У «асп ша «Мі чне речи люк Ме СІ ФЕН МО и я «ока 0 ЩУЄМЖЧНЯ ТОСсПІДОВНУ КУЄ сет
ХА
КМЛИС х Ж сн Же таку айдак ОПАй Уа біта шВ «апр За туя ях. дах о Си ух су ЯМ ких ав; оАів ех їх вхо За ее
У 5 7 т «их МЕ
Зв ДИН лю У
ОМ тих МУСУ «ШІй пруцва досліджені штЕ уж и свй МОЙ КО КК ТНИЯ, «а» ха иУтх -5 ху у кити СИЛ г у піч від век ТВ. АжУ КОХ ПВХ і 5 ха мВ «13 т ну дите.
УСТАВ ГЕ
«Вій» Шуумий НЛОНЗДОВи МеВ паз хадшт
СТЕ то т І гуд
А їх МУМНІУМХУ УКВ. Хей КВУ за ех КЕ прах г и на Уа ху їх іа ес ТК АЖУ САД ОВУ ї х діння І тя Ко кт ту «Ех ХХ щен пи хат ЕВ ие зма каукинм її ери ми іч, твій щшеучна попід амасее стугут, «ВИК я жиди К дж ФМ «ШИ ОА За ЛУ Оа
Ж ННЯ Тл канОуух КУ
ТУЗ У и Чим му ух тку Су тла, хуя со ма жх КУХ ак ЧК шкй іш ух їх 1 «хім ЛВ «Вих 5 лет, КА су МтМ ХУ
ЄЛу в» во не в «а ши ТС ЛОвВН Ех во лях шк ОМ УХ с і 73 «ЖИ ККЗ їв СРУВІЛя «ам як
За блль КівзотТух ех Ух Бо ех ТЕ
Ь с «ВО й
Я ейї1ї1х З «Ай» БЕЖ шк пек тівмх уж Ук хутвех К ин
ЖИМ птУММНа пОЦЦДОВщЕи.
ТУ ших «иа» І їз ІІ ех, - там ох 53 ха ІМееУ сбезує Ку Пкуже битих КУ ро ій бів на ек Ввід о жих бо Жпе стих 1 « ето з сю щу акне х «ік 5 «Ід ОВК акне Пелех ся мив, «ха ЩЕ чна ПОСІВНА
КекостьЯ
Хижі
АЙДа ЯМА в СУТЕИЗ Є «амп» 3 т й журі ех сухе бр Ул ше луУктх бууу Чбуух піп бій ую стує ем обі Бра ех жНЕ у ц пок яеи п
РА дк, «ями З кал ВЕ «й шежчиа пласнідоввЕсть «ей «ших БИМАЗ їз ліва лт ож «пово ТУ лій ома тк па; бек Бо Вує ек во 3 ке «ВО З как З «2125 РЕЖ «ЕВ промчда попит сех у хюжх лЛСУхх ТЕМА с с'ищцу
ШИ ОЇАКЮКЯ Ва бів «ух У па Мур Умию біз Же їх ау Її срср
Зм із жк ПЕ Клеї Бюл БМме УВП
Х з «кім 3 «Дії В «туту. пуцелих аМих КУ
ЛУ ся, УК ххх прис коки дю
А дИШутчна ТИПА ВНІСИУЬ сур, тя. «ШИ КЕ а СШУВЛЯЯ «м ЗА дутм єї Умажю боях З тк їУКе; бом ли папопівотук їв тео Хую БЕОо ЗежЖ тик «й ОО «цім «Вій БАЛ «ді щеЕучна ресмпінавнікове си Йщх стул А ЧО «ий БИМКЯ їз СУТО ч ЗІБ 2 «ах ха с Фуєк бу тб пмруух ї сен З ощочокуях
Зі од Тух тую ЖИж ем о Бко дів жу з т. зал «Е «вп х Ух
ЗЕїїх З «ВИ БЖ «ШІЯх шШткамо порлідавнісхь
ТЕХ окт КІ хо тв «хв ОБІНА за СУЗУБЕЯХ ка Ох ги ре ттпбхух оту со ко жЬ ЯК. те. ех пек сів опій не джек о жаак Хі БК Бе де з Кк яру ск «Ме СВ «жі В
АЙ ВЕЖ сх Полхіжкта. су й мери я кл
ОК путч ЗЛУ Н ЛОВ АТАК, «ЖИ ий БК їз ПВА
Яке ЯК ки. ик ни НИ пт шия пет ил хх са се беж бує іа май Бос пам жнх ї В «КА 37
«ем З ра прот пихи БЕ сао і о нн АВ Я «вій МуучниЗ поста цОаВНІшт» «Ля кийМт пт орхтту тло ех ех «Ей ЗОН їз ШУНИЩХ «вс щ- з «ай 0 тт жі дура струнку Кр МУ гени. той піку сх сій на ту шує ОКНЕ БКОо Бей од і ху «ик о ІВ «зії» З етери, У «Ві Уух БЖ де у Аа КАКЯ іти. оиК ва оку, ххіши шужучна писліІдавиить ох «ие лу сигиУх пло адек сю КІ ха СІТІ ЗА «Оп» ЗЕ
Як фл о Ук р сту Те Журі Спр
З ій жк ТЖжя нів бар оБжа жа ОтТвЕ 1 Ку «ле З «иКЕх «Вій ВЖЕ п Ум ху тки ву Їх,
ЧІМ пл чВа ІЕМ ВМ «ІДЕ нки тгаажцію що ил ущцт «ЕМ ТИ Зих ККУ «ай» 3
Мія Від Зет СИж Ах М ех ї НУ мож хи жа о «ам еру сне тю ОКУ
ІТК жи Жено учи пед хи ШЕУ И ПпИслЛІПОВиДАТОХ дер
АЙ
Ок іжецутУ ти иа в, «Ва БЕХ З сь БХ «ап В ху З М
Фе. т ддсухю сяє ж пев я
Бек КІ ех ХЕ ЕФ Ма Ех х М ока Не
ЖАВ О СЮХ
«ВІК 7 «ух пт
КАЖЕ КТОЕ
«вій» Штучна поднідОови Кот
ЛУК
МУКИ
«авЗх СІЩН їз СРІБНЕ «шу З птах В пах бра фс сті хе ті Аква Жак Ту вгУ (М Бе ї х шиті дл «іх Я реж НЯ ха Кк «Мах ПКЕЕ ел хх, кВ, ик т ІОН, иа» щшІечМма послід анНьииь «Тату т си зму сх рда «виз НСВИЗ зе СКУЧИЗА
КЕ как хо зе
Уві км Бко іа аю мах тео Бе Зі Ба Ар ог ї ч НЕ е м не «ам 43 ках г
СИНЯ ТЕ
«Від БЕ «Вії» щреучна попивдиВМмасте стру жим. ето ЖИ Зою ст «ПЕ ОНССКО із шШУутВив «пи м ай
УА ІУеих ж Ми их Чиж дуже Хр Ми щих ее ск їх са із Ба ак гою де ну Би Бар ЧЕ ц 1п 1 З ДІ ик ту Ах
ТЕМ ах па не. мах Ма шуй ОКУ ха шерЗна пооладовсьсте «Тут: «ЕЙ
КО ПИ по мі ЕЛ; «ай БОЮНА За ПУТ
ОА, п «а тя ч Мр духу ХЛ Ха ЖИ сю ко, шу Же ших ие сбаї пі» бу Віа дже ай блювота Зве Бош АБО БУК
З А хі «их У
КА КВ хи «УЮ У «Ме ОБВтТ
КО пт унівтиот пит здутті Я «ЖИВ щтУЧчЧНЯ ПО ЦрЬДюЮНВА МТК сах
«вййж ММ їі СІтВаЖ, СТИ, СУТО, СЕБЕ, ее ня кое и ША
ПЕЛиУї, СЕТИ Я,. бІїВие, СИНЯ, ЩпЕТВХЯ,
Ух. тю Укра ре туху яку Ук сітцниЯш, СЕУБлИЗаА. ши ВІАаАч. СЬУВИя?, СА ТВИМЯ, пости будо мччеруді стати й
ПУтваВОо, СРІБишя, СТВО. СУТ ен Ми вк па їх г як «окт до т Ухлуче Ух погли як доки Хиуж піч КИ М гя
Зі Маї пуп бе Чаї Шім обеж ім Аза с зві Му Му Бут СЕУ ЦИ ії 5 КУ їх слутию он ен чи и КО Ко ех пл хе я срок ах р щи ех век Бе, Був Тіз жа СУБ Був 0іу пеж бу тТУК БЕХ Бе твУ хек о тух зМаичю фовух жарт пух лий де гри: миє ЛУК Ї31лю Хор Я Чи рух тан тжю Але Зі був Майк ди о люп Мес ВЕФО ок їв щшеЖ Бест ию мех
Ха за 5 п кі и ух. ї пу пре «тку шк ву ду ми ух ух Му зх; сім із хі Бе ско де дє БК ВВЕ ТНЕУ дк ок щеЖ ВКОо бвЕ ве ше пе хх туш ЗЕ ЗО пл сил «мл має их сиди МОУ ве тд су тк ук М Мі що м пащдожьу щі Уві ТНЕ Жісє дек Аїа Ав Був дих 115 Бех ТВ Зій ух пк у чц тк їй ТІ я -ї зу Фирр шию тжм Дю ке ОД ло сі "уже б Ід ем біз тв Шик Бех пе оуУш ВМ ошаК о АЖе ТВ дів МО тую тую Суд ще пе зе пе йх хї с. КО ли их їх пех Уд Чу даже Куєт ШМее позує Лу Спб ГЕРХ ліво вхо Маз Щіу ко діз хво оМаі Стр дей Чех Бе ба бук ТЕ щує я л пе БК їмо Мк МАМ
УМ РІМ 1 Тни т хгяі би дк ру дух спаму ЖД їм Уа ОУмИ Зі ЗВУ БУЄ їх НУ
«вах б пт 151 хі Зх «Й Мт пл Мих мухи умі сееуухо Кун,
ЖІ А МТ мг ЦД НОВ МАЕ шо ЕИх шує хг поз піз мтвХ хИх3»в Б за СУМИ «асо Я пе винен чн ЖЕ Ух шу Киї Я я є лій сблуку їси фр ух ФУ
М: Майї плід па АХ ЗИ Щек сі Від За Мі їжБ пу Бо (Бу ЗІ
У к 15 15. че Фо ЖК щу. Ви дм бочку Сх Клим тля См уж сбджик ЗИ. Єлидах моху ат бе бук о хів Беж Су муй сш БЕЖ Ду СбжЕ пе тва тех о шее ХУ хо ЇХ о пух т пк ин я длит у с оветї ЩА» дощ Ж дж оц км Вир тке їі у ткрв оУуі Вжоф Зі Меб каз пу Був лу Мейо тк Веб ж жо 35 клі жі да й и НЯ ге Єх. м Уа не ША прах - ж миих сух пу хз їі пав БО нх ЗБЮрозЗек вам лк лжя Тух пс Вус шеЖ Жря ща Кк -
Бе ве У пхй и гуд лих пря СД шо дя ск жк се и НВ св ща ПІ МщХ тк тів пех ат дар БУ дек її БУ бВЖ Віа скух
Ух т ТУ ЩО - ост жк хи ку сну бек Жожда тя ее Зо зує щі Мф Сало ду кує хх. БАХ цей ча тую Бек жк ви Бу бій Беж Бею тп Аа ек Тек тую Су
КЗ ща 5
Моя скит КУ ТУТ АХ Муз АХА о хе Щек жду яри п мн
Аза Ажч сві іУу КжхОо Аза Аво омві ТСкробаю АтТа Єйе Аро Сех бю Зіх
Ми МУ 1
У пік ме тину дух см ІК чає ух
Зіа ші тмЕ Без Зі Жде ах шшК ших
НК Зв
МА їхО «шашка стуз о пух сю хх мух срок ках ОЖКХ кл лек тих тичні хек у, «иа СУКИ ЛАДА ДЕ ХИХІх «ВВ» еяйак УМ хз Спам «НО Ах пір дві и томі а шій би су АЗор ли; хі лав дещо ее п БУ е пін мхві ЗІ сен чаї сів пех З М Зиа шум хах му омУш ЖЕО ШУМ КО 4 « «пл їх
А й зх и спепх осла Бу їі ще СУ пе ЗУ вав ще Кок ЕХ Ба ТИХ Ще БУЄ мех Оошжа Му лом омши ЗМОЖЕ о ЗУ ОДУ сш УЖ ЖК жМХ КіКн АКНЕ ОККО ТЕХ - дк зи их -5 м зи жу гугл сп хе дяк п ше 3Уєух ЗТ би пи т 231 ск сім
Бш Хе щі в УщА Ас а ЕК Биб ЗіМ Буш бхмЖ пецошій тю» меж 35 о з сяНе КН пет ох ту, лих йо Кт с тХвує жи ТЕН зі ПИ Мих Іду ЗУ іш її сів др схо Бек зви о бЕК вжЕЮ ВХ ХК тує Бек о КтЄ беж БОБ
З 50 лк р ке рю тем ом ди фдуко ск тій ща тер Мід тує
За пі щуп чаї Тх сів Зв дія Аве ев пеож ї1і6 дек ТКС Ада бух п За щ ши ши ЕЕЯ нак Б тим "ббауї Єуриво бут бум Ти й швах дода щи хі же о У пед обтв тем ошеК Зх пецпогхш Віа Еш Аще жмх Вій мес тус Тук Су во за з
Мід дит лют щі цка дій лі А спр шия ки Ба дет бе бе (ТЕХ
Зі: ЗхУ аз шішж БКо віз зви оМаЗ СРО Аж Жах пе зве тТУхотКв СУ тий так пи
ККУ ХЕ У т парт брусу їй Мч ХМ єм ик па ом жну Зима МОСК ОВ ПВХ обех хо їхО ек хх «іх Як де т «хім БА
Б тк «й» ВВЕ ве Мет, лучення худ ее лм 0 ММА ЦО ІА ІАЕ «ШО шт ня ИО дах СМС, «хеиде ОУН о жа СУутваВаХ гиптсн йВ хжуут З
УА: ж т Ток ий МИ уза птах Хе ху У тс Тяхж фрчх 3 х М ша Уж жил си мЕуМ п ше ОсАуЄ ра під мах мувВолуй Бго Зіу Ук ї х хе ук х п ми НКУ кім т схо Хо мук о боже (г що ЇМ: Фрхмує Жауєє душ мо бо пес.
Же дам їшво Хе дет бу бу су Шеюх ШБІУу ру Зах Бе Тнх беж ку -к сут, хд щи дк Ку ух Спр ска учи з. жучсу ту я дія Уа Тл г ях жи: пута бах то їЗе їж тТЕВосаі Бра бій МеБ т ПУ Був ЩЙлЛе Бех ос КЕ Чех тт і т доме ши: Фе. -ї оду тую сич Ух деук. юки сих Дім т» пІУу Ха ліва дев о бКО пех двр Вск Звр Так дод Тех беж схо шак ше
ККУ ж щу о ва АК піт сі бі лах бе ті пи хі дит тм Шху Ті ех Мб діла ее щи о піх За ща та хі песо Міз дар бух тю хл пе ВЕ ака стек
ЩЕ "хх мя ча
СЯ ТЕ ІБ зо
Тов пожье ТКиже біжи Миті 1. КІ Х Фіихух щоку, Ст Ух ХДУ ная І бик, ши ОсСАДОХУКЮ Оле век ма муз вай оЗшх АЮ КЛК дам ме Ух Ту Ум
ВО ЗО Ж
Мо он Ух мік гр М дн ЗИ ря КІ бю У ен о НЯ із хи мах іжЖ го вій Баш У ТЕО п Нех Бе ваш гу тю пУш м 10 МЕ ую Уфа пом тоні ЗЛ Ма ку у про
ПМ ОпаУ жВЕ бєд ма) так Уа Бех у 115 їй «Кох Я «ве з пк» ВВЕ. мож шт ХУ «Мій» Щитана послідовність коваль мере нут то с злу «ик МЕ ОЗ ПАХ
СК жи С «300
ЕС Кі св) Мат так осів Нцех вхо ЗВО ет іш дів Ж вежу з ЗУ ї 5 М 15 спін Ак вів ТІ їі Аа См о ПувБ о бЗевК пех біл щеж У) їжі ТУЖ дих сту хе З ж хо Б «Жах й Ха т ДУ жи о пе ШІ їз ях я їз пкт, ки ноя
Век Аж дЕВ МУ дви ТУК Її йлів тТЕв ТУ ЗРй БІВ Бу БУ пу пІй 35 С 5
Туже Жак жо ті Ти тих ли ру м т м Кк. Хо микмих ШКф я кт пхо вхо ую їжи; цем Хі тТук ТЕМ Аза Шах о жЗХ Вхе Зі БаЄ ШЕУ Уа
ЗИ во) З;
Ум ох бошиж ЖУжу обу ли хи (хх Жука ДУМ хх пух Є Чи тажхр ах ко зви Ка же мех Су дех зи шшжЖ пі суне АвроБипе ти ХМ УК то ТЕ 30
Б дух бок Є сопе М рщо их зугзуя ЕХ д тера бу сп Єрки пе а
Хі: Бсу век їди п Аза бі Апвроса Аза маї ТУХ ТІ буд БІД ОМА 3 жа В піку суд ее сбУри Зуцу тихі тую їбуую тя» ТІ сф пря тлу Іі ит
Хук рук ШЕ УМ ККе Мецотде ша ФУ пхй о Озфу ЯлЄ мух УА СХ Хот «иа її 4
ЕН Ах хх
Буд т туя па пе СО ли Ки «мих у пи жцМк птідкукх ЖУК
Зх првзку сеї пууц кт «ил Штучва пеосплідавнатуь. гу хи
Дн уго4су сб ух «тпм МЕ їв ОПіУдлІя «ан У хико т хід сла бере ЇУТїЕ бо луку Мах Факти 11 ли ди ої :ОВУрхх зив їі гаї Мей тнж Сів З вшО АБИ БАХ Па Віз МЖь ЗеЖ ії ПТУ ї 5 Та їх амрію що А Чиж Уч п жим тую суху ому Па хуя дО тим Фк піз да іа тв Гі» ВЗ СУ Зуз ЗБЕ ак ШУМ бек чаї Пе) ем бах ву 2 ЗО тую» пі Що лег джу Тл То Ффоплену мих ПЕТ і їде уєсу ли С
Епос: бно Зв її дже цу їж Ві ЖЕв о тут М іп був бхо бі ЗУ уз 42 35 поту жлио то ток сл жи думі их іх стихи фатер врІх први схуху луд
ВийоБжеа Буш Лем о їшо Ті ТУК вний овіа ох та АюУ під дес Зімж дух
Ку ко С «кт Вел ур бро бом схе рр ут «беу. (їх сту дешут Ша кр бу пн
Жто АЖОо АХ Спо пе Зішж ес шум ех у ТК ААУ ве ТВх та БУ я -к У; а
Біо ТУ рас ща та хідує тд» щи Й вза плям с ЖІ зЗкщо Михиє сумик меш тугу Ох хіа Башж шшак іже сій Віа бли дв Уві ків УВІ Ту тую СУ БІВ би м За 35
ОН м НН гіди Та: «хм ууУ УТАЬ ЛА КТ
Бнао тут веж Уа ка Бех ТМ Бере ошхю хв осі СМ Му Мах сах КД ек чу я їїп їі 11
ЕВ
«шов чі плуга че «ік хи «ст, це
УЕФА ВТ Ку «АБИ» Штучна или дозах
Ох чаш «ах Я їв ПРТУВЕНУ ка ихУ 3
ВАНЯ 51 похо тзшщ хі Миво бую лк Бу тя Шозує Ті д хг ше ти їі зшо їз Уві Ме ТМ Бів Бек га Ан Безу Бе діа аж шк і су ї « 15 15 «їх ще Ал м оз бтзжкх томисі Фе ут «схему ЛЕх там б с
Зі; ха Ам ТЕ Хіє Зв оСух му ШЕК пШеЕ Пій бек УВУ лем ТУ шех
КІ я -5ї хи ч З т пу довує ШК 2 ОБ тощо САС ухуичи тю У ху жі ЖІН ТУЮ вУКЕ
БВиФОТух дшт КЗ дви Кіа Ба ліва стЕв ТК пій Оси ду Бета ща У СІВ 4 дк м
Б що 45 тка би Вл Там ру СИХ паж іл В'їщ ши Пре уч Фах У хх чи ко со бух ебЗ Пеб хіФ Жук Мік одіа пех ОТ Аа вІіМ Бах шу УВХ пл пк п
З Оу о тк Хоту ей урн бах у паж рю суку хи Ма ут» ХМ прє тах ух
Бго ввробзка Жве ер шум пех Пфу Ве обу тТвс дво Бпе тв ей ТУг шк -ї -к де тб 15 З
ТЗ ою СУ Там Се конк че їх ШИХ ра ми че йчила КУКИ Кк х їз. ек бек ем біз Аіа Зм ар У«і див Уві бук БУК Сув ІА ОСІВ я й
ЗО що о пр юки хр п ІЗ ок кум КУ кофти и ТАфра то лю Кури тих
Бра отут діа тн реа ме тку Клео шіж ка піу ЗБЕ бух УВА ЩО Хе їх хх МАЄ
ПУ
«Еш БЕ нт я
ДАХ УК суті дп ля ВК еться зплжхкхгігі меті тома их, «ВМ штежчна ПОСЛАЛА тТЕ стумаух ве ве мо ду пливи кам МЬь зво яа лак ТУ
АНІ шоу тЗ б озлх З Шен ло, кл Шия лих сг. лиш М вм То їх С тів ія дав огтіз Ві ет Сак 01» шає Бо Ар опех їм. АІіа уві пЕх бла біх х ге чи зх
КМ Б БЖ ди с руту пото ре жим дих Меачу сб «мо мі у рми ейту та бро гу
Зі о дкш дз ах са вай СуБ їж цех Бех Зій За Уа їн фо Бпх
За 35 35 їн пух шир ки ші 31 Мої СйОроу Уміти Мужик т ДУ колу и й: Тр жо тТув о джиа пех зви БІЙ Бей о Азе же ЖЕ Під Ла Муш Бо пу ОІД
БЕ р Б мем ем Тл том фе же фтлу Ж сах чи хе Бу Моє ри ік
Жка ВКО Був рем без їуз ТУуК ОлУ Віа же Тих дит Сіз Бех бу ах 50 35 5 роя дод ти ра свя МК шедт Ли пирує У ку ж Жрещух фени ММ Ст онстя фр
ВКЕО дв де ріне веж іх щет жіж Бех Зі ЧАС двр о вка та оцей ТКУ йх т Б ще ях а ТЗ до меш пу. пух тут МА їх го оз й и 751 тури лю жує Фк МУ не Мао
Хе саке Беж Хо суп віз ЗБ Зав УКХ діа Уві Же бух ук ша шХВ 35 35 55 оч мохом 7 Ки битих ЄЗмєе Ук: Уреия Є хи Ши а Мою хг щук гла тех ТеЕ мем ї3е бе Бек ЖМОЕ КАш їх плоско Ти о Беа Уві Зо БУє
ЩО їй: 118 їлУш. пух «Й» я «х11» 113 а Кияк пах КЖХ бо Мурат. хе ту ех кри ЗГЕЖКСЯМО ПОДА ДКЗ ХХХ пор
АХ зд шо ту УК УТ е«ЖИй» У їз ПІТНОУ; «й ОА айшим б'є мая же ку 3 ма: жу дм Яцик тир Кі їх бує Жах (чх
Вяроїле ад о жмек Зх ів Зеє Сто Аве пЕХ Бі овів УВО Важ їди су
З З А хх
ФУ 35 йому М Мих мі м тий шию сут У Му й Ул Зі Фе ві дАта АЗИ Бах ХІЄ Бий був Уж жах тех під опе МАХ Хом: Тех ех 5 ЩО пу Жжия дай же дши лчсу Тим: дл ле томів бля Тло фут лу У тух Ва дайошек Ана бух ей йма Тв ЖЕ ІЙ ОС бу Був оМуУ КВ бує ет где Фа с тіж тех їжи Віа Зак Та дк пі йо бі ді ус БУ їли ММ МИ ХО ІЖХ ОО І Ах УМ ХК мМ ХУ ЗКУ ж
Зо БУ 5:
Бо Авт дБ БМ дек Зі ЖЕ уж ВЕ Оу ТИХ двровва так ле ТНЕ пк зв "ЕВ Я
ТО Ше б ті Моз: Махє Танф (ти від 331 щем ут Зх З чик сту бо Кг; А
Хівз бат Зає їде лід Від а Бар тах ів Уві ХЕ ух був ія шАЗ
Б жя Зо 5 че Е т и петих лиш рухи нія ГУ Межа жи ЗЛ ха лих в з туш тТУух іа Зех Вуз ВЕС Шех их КБа р м ХУ БВж іш ЗУБІ Ма жує їх ре тв
Мо 175 КМ її їК ка У жд, ше Ух оту я ж «хм хі
ДЛ, Ме ЯКьї яаюхМ ОКХ «Ех 0 хе пит УЛ а УЖ МІ ТРУСИ ДАОМУКИ ТУ УЮ. «ги «ВЛ ром шко ду зу уй чай ме у СТИ їА «ННУх 5 дозу. Сб Хі Її ше мує у шим и У бує киш ножні аЗзв офіє баі ше жВи Біл ще ЕКО дкройпчх Мох овіа ах шк Їж СТУ 1 5 Бе Я
М і; хх А гул ще АК до ик хи шу гйхо Жхщо Єюею юр ії лу УлУХ Жалчї КЗ их єеву. зва вжи Аза увх хів БА ОСУЖ хе ех ех спадомах УЗА Хе ХА их й ї5 ЗИ дл пу шлю жи дозу феуииу тої Бо гу ту су тому ох віхи
Міа же аж Сів Аза БЖ їні Вій ТЕроОтуУЄ ВУЗ ОБУ Був Бк пф КА -Е хе КЕ 55 о дл що х. пу Ям фруже свахує Або шт ує пуху хі стук. Жид гко вхо мб оїні ва ха БУЄ Аве о АКа о Чцех ХЕ дк ім Бек шу ва чи чх в я роз шо
ІВ ТУ Ка Жигкує слу али се Сума Ск Оу ко же вол ехнНку ар ко взр ому пе ше су пох сЗЬу Бек хе ТБХ др БОие Тех ев отТну ще чк чик р
Ух р ТЕ СН тів вну Вуу Хан шій дід пір варю маії дій маї ху усу бив їв и блтв хМмтд МК Мам ії дав маю перо ММ май ах А СУЖХ ІК ХАТІ ча Як
Михит шт: Мк ти кі Мік ом о 6Мчух с хх мех Змі побу шУТУу о жук Щі Кіз Хі вхо Бйе ик ваз О1У ЛИ у ЖЖ бук ові СІМ жа ий 15 НІ
МОВ Їж 13
Муй ст, ня «Ах ВО судо «ех
ХЕ ХХХ гл тет вив Кт ен «кА ЖХУучни ПОслЛАПОеВНІИХ хх
МО
ТУ ЩЕ. форту УЗ хм шк АВ ОПА Би У еп 35
КН чо р сюди юю ух ду ух Мт. пута То 1 ти СЖфимих стилла ТЯ». авИа ха УВА МЕМОСУВХ СИЛ су КІс АЕН фо) фра ми леж ач шу 4 х «В 5-х ї й Ах КОТУ
ТЕ) щас щі Маг УТ Зам їЗма Тих вує Шиємо їі зу. лИщ Ох, бобах пи піз вха йівз твк їХе ЗБа Су Му де Бек сім Бех Хв3 Без Явк цех я Зк «й
У ЯЗ У жін МН пи ену Ще кру тд голих тику Я МУБИ фи пз ям У
Же Ту вва ХНУ БО ТМ їжи; Вів оХКО тує ми З же БрОо пі ЗІ за о 35 ух, их доме с -1 Умухиє ті З шо у селі ж чх Ши бУрля уж ко ЖЕО їж їз ев бів бук ніш о дів Бех ТЕ ди хи шек піУ Уві
За ЗУ Ко
Тк» що й ЩщВ Фо т «буму (ла Жим КУТА в ох туз Пи тм бю ко ба Ах ББи беж біу бобу у шек шХУу ТЗ АВЮ рве стає їм ТвЕ сх сит ди вка Тк г п сив Ихивує Мх- че ож Зо 3133 щем же ул МАЛО хм тлу ня стра аа
Ті бу Ве їм: щхв вів бі бас аз Аза ай КеХ Тух був іа ща
Тук іїдшна Хі сБрє вхо ех обих Бра бі ща оди рих пу МАО Бе
Мо ЕВ ій їду
НН с яшх Во
ХЕ: 313 ель да яд хи ЖХ ох Птеххзкхоій Фреїк ХХ,
ЖАХ МОЮ у ЧІМ ХА А якою я Ум КАТЮ. хх чо нал т, я Бе ТА. «ший х б КВ СЕЯБиа ей ЗИ со «іх БЕ же Тіз яд бух ну пі см усу Кох де та: віх и уже там ЩИ
Ав пів мві Ме таке Бі бе риб ар дек реб вів хі беж хм ку
Х У 15 їх
СК ла нн я ж у пеки : єму. Меуж СУХ Же: Хе стоки Уч рух
Зі: Ашу Зв тм Хі дай бу бже Ше беж Ба лю май їжа МуХ ЗшХ ве ях Зо піз ув Ах яки я КВ т. х би склу їі лу 1 кн нн о нів узі Би тус Аз дід зва Віа ТЕ ТУЮ МАВ СЛ Буш ЕХО ШУ ХА ї5 Б 35 де покажу г г МИХ лежрииври в жде Ул хх ще Го А ННЯ о уко ко Був їмо їз гі тжжЖ Бядмй вЗта о жЕЄ ТВХ Ажея Офа пе паж Ма вх ха 5
Кт: ваних ВИпе беж жіш Бек Пі беж бу Таж Ар Біне ЗКт дви ЕЕ
У Км ТИХ ЩО лю Ж пух я (аж що йгхя шде чу у Уха бик жує укту ЯТї Ух їі Жешк беж ем бій Віа сб дкв о уві йів УВІ Тук ТУую Сув Ми ЗТ ек п су,
Мо ХЕ роя стуки три СИ г Лу ак тражих жк пити з Тпрує Ко тлу м 1. жує ТУуЄ ЖКХ Ї-шо бро ів сває Же щук сх слу ЖЖ Ху Мах шов хх їй а ях
МОЙ Ки МАМ «й У
ХА 113
ТУ п ж Х КІ
ОК Лех Женеви ую ния. те ді В мих.
ІА ТУ МИХ уТАМА МЛ МЯНВІВ А АХ «дО
Тк ОХ, лоз хутрі ших М Кз СЕУ «аби ух яхт Тл тях Молає шю бирух ме туга бух км й и бе ех ху
ДЕ ШАв ві Ме ТА Зам шшЕК БКОо двродек беи діа УА пех БеМм оЗІУ є к її як
Х Б ІЗ) Ко
МЕ до ше сви їх пе ох КО Я ТУ шуй лу дк ше сли 1 Ах дівотнх хі дай Буш пуб ек шекх бБійлоЇУЄ Малої ві ОеХ а их КК
ЗУкрих Хр. Дх Мк Веди МІ тем 1 Тука ме піт УВУ Тих ек пл пуб гне пу еп оди Аз діЗз бПзи дра Стр тує іп «ло Бу схо БІ со зх й «їх
З зо ее пет Уго ям Ух трі СКЛ и пи ті зпдчеє ПИфує ет рю тку КУ ки. Ми тчнчз Па Муш мм мо. Мі сКжЖЖх їУБа іа ослею сБйх джере т м Ал
Я КС о
СбЛУХ ря тка би Зк Бце беж ую пек спі Бех лім БАлж Ав ба те БМед ВУ
Ук 7а у й х Фе. т У 5 - . ї коту Ж Мдує ал плуг лу гул
МБ ов шву ів ій Аза о ЕВ Заї Віз ді Луж тує щСхй Пів Зі 5 З 5 ий йо ЖУК озага Тим. мех Жебужи пУрлу кат узі Мих, не ко ви ние
Твж о дЕТ ШЕ Ха БО цей о жЖиж Ен шу ав сі ЖЖ ду Май Ша щАє лк ча. ЖІ
Пюхя я КАХ хол у «ех ХВ
КТ х, зч.х ви лох ти БКЕ свій» Штучна пвоспідовниість «ВА во НН ур МЕ ка СІТБХЗЕ «Оп» З гра дв чне лій дек о Буо двух Щех бе Віз Мі кб дм Ме
Яви їхав мяз МебОТяк бів ех Бхо вврожек фе ваз Мві смат Хоамо ху й З що х5 ри я- тору Тіт й У тло дю слон хі Шах зі їдшмх МЖна лі зі Акщч віз жи її дв См був бле беу ба шЖех Уаї Би бце ЗЕ тк зи кт СЕ п дм кХ ди нів дщау дже пли Ва тВЄ їсмхі Діаз стр отбех ціа ів був Во пі Бій
ТО А ЖАХИ ІМЩА БЛОКУ мМ А МВС СУМУ махмро Уа х ІА У
Зк о р
Зко БжО ми їлці Мей жів тут чів дів ше т ж З Щек ку ме, то РО СБ ланці я ха ЖЕ ЩЕ АВ ОВК У ОВК М щ п 2
ЗО 55 З
СУ че док сіхуо. Ф3єгу жи ду її хе ом сік МЕ щих Ма й ба
Бо Азо Ат же Бек Соду Безу Зі Бек У ТЕ двЮ о Бае тах ії тпХ ту ШУ че; щи чо У ТУ. о гг і «ож бі КУТ тро ті щої ТК А хг теку ж її ФО р їі су век сома ліа Адв Сім АББ о АМа май тую ЖрЕ Суш са о оде
За З ло сх жу да ран ІМнох Ту й се М лм дл бл т бук ожжх Віа хі Жто ша сузи Мне бі» ів ощіж ТВ Був Уді 51 3
Е жи Ух мк ЩІ їх
У
«ам ад ча
Ж НКЯ
«Й БЕЖ мк т ЗМежх и дані ве и из «ше ШеУучна послідевнутх «ТИЖ «ий мі ізо влаЗ «Вк З
М та сг шик тм ТУ бу лих доку руту Ту ЩІ сало шохи тах, Ух квв ява саї Бе ТЕХ Сів беж Бо дев Жас їз ДІВ МВ) Бак бєвЬ пу ї З 15 Ее ік вко Вів м лі дже сСувопа пет де щі пу УВА Меа бБяиа же я як х ел КЗ 30 тте ви ба Му ав Ав їн Від тую ут Зійосоль був БК Зі піл 45 з ку ех Хіуєи де то 1 - Ж бик ЖУБ; Мр ху До Про: Же КУТ, лим
Ехо Куб пев о Бий о )со Хі тує із дів Бех бу ло ле шЕм слу вх
БЖ ее зи
ТУжсх щожуу ит че б СУуфже Мк Ше Ка бух (Іі УХКрюю Му ее сах ру ЛРЛрьяя ро аю дих Еме пе ЗіУ де у дек зу 3УЗЖ ЗвровДдЕ так ев КВ
У їй 15 що тих пики ниє ут КЕ З Ум моду у що та суму глкаус фтжиму. МК й
Хі бВет жає са пар ів Бій БЕоЮ Ух Аза зЗаї бмх бух був п см
Зх КА 15 пів то сф пе му Бущі Ки да хи а се ВУ пув ді ща тія пав ЖАХ КМ жЖтМуУ їММА ОМ УХЦВ см ХЛ Ж ТАБУ сум ХА КК о 115 Ме жи
«ВАШ ВИ «ії 13 «Еш БЕЖ
ТУ, Міжхичх с ее чех хх у ЖуУчНа ПОСОЛ. дк
НК лих т. З зи «йиайм М: їв КІТНаЗА «НІ во шух І жи дек Урі лу хх о в нн а КН Но вкрв ожіє Уві мес стнЕ іа Бе вто дЕВ ШК їі БІВ Мах щех бе о сіу
ХЕ У а їх жилах 5 ше би в- ех аку ток сих шт Уа сум. меч х и щу пи вка Зьа ста сфе ж пУБ Пущ шеє фак са бек Уь Хе» ек шех
Ко Ко о или Ух щих п посух жу таж 35 ту Пре ПИЛ у Ре бі жучок Я пе хну Бай о Ма) дв Ар ої; Віа же теє ХЕ ій Був БО саж щівй в й з
Бл «ум ЗУ дея, рт, орто - тлу НЯ м о УМ. й ява вне ситу тає З СО ГА то Бех сбев їх емо її бук Жвх Вів пеу ве й ПО Ве БЖ Мах
У зу Ей и ах з то АБИ йо БЗе дет Зі Жек ші бе бЬу це Аве уче Хв Бе ве п Чо у КУ
Пе бек Ше Мед Сів АЛкв о сів ве чай Валя УЖЕ ТМ уЖХ пу ПпіМ ОВ жо о ЗБ су Мих (іє мі» Зк» Зах Мін Дизго їЇЗілу гм Й пера сїлек ві ща т
Бут Жук Кіш Бер Бхо Бе о тпж бе ім Пів пу Тк бух бві ба 1
КИ ї55 1
Мих ха хакі БЕЗ
АЙ| дО ІММК
АК щежчна пс ідОвНАа ЄВ «2ЩО2 кт ЖАт: ям зт «Ах М у ків ОУ й ї ИН «айпйх ВІ дже тр тах сг січ ує (їх Ж Фе и Ше ВІ Я хи зва іє Уві Ме ТИ біз ек БО АкБробеї Бе) віза і ШК Беб обгу х І. Та Ко 3 З то Во гУТхУ щу: ХА МІ жало дату сехшо Жлео Є бує т пу ли тату фі б
Зіз ов Аза ву Хі Бай Су уз щей ех сад оак УА Мер фев цех лугу сг; чкх «М тий. й їх доку. ся Ст шк ку секту СД тчичих тужить туз у хо ее я о
Бра овае дя КТіє вБи Був їй діа Тсо ТУхХ ДОЛІ Був шум щу СІ с Б зе жи Ху ть гр жу Мету щі А рих дм см тт їЗТІіх ож З гї про Бжо мУБ Хе ін» Хі бук АІЗВ Аза ех ббх Вхч бій Вшж бі Маї ща «в «й
ІУєху пу що жа бр жі Ми їЗух пуф Ки п Фе ІУМню низ Ух МК вро вно ЗХ Бак о жех ау ех бі де смУ ТЕ вав ОБ Мах Ха сах 5 ло п ще тех сармати Мт Я турі щу их АЖ ЩІ Худо бич лету ях МЕ В, ха цЗеж Зеєт їм; об вав сі 5Ер ув) Аха зай ТУХ ут був ою З 5 За ЧУ тн и нь ри СМшту слу ср. їх пе лю рр оку ти сут
Біне тух дв узі ЕКО ОБЖ жНЖу Бе пі ія сту ТНК Був МАХ щу лів
М не зц кує ямі БЕ зу т хи: НН «ВІ НКУ кК пед пи й енд ВМ, лом Ме жзна поплУуцоеанАим «ай ухилу мо ік ну «ЕшЖд МЕ ОМВО Су МИХ Ух ие вих ап ОКУ досе уч ця оМуме сф ст шт Мк - перу дл. хжі дик Там 3 дви Те Уі Ме Хе ска шк БЕ двох ем Аа а ших БМ су іі й їй 15 х КУ ки ЕУ пл ла Мід мя т мл се ТАС Фою бе ТУ сиди ЛФ Тим: Том блю
З дж Аїз ву її бай сук Суб ше бер За Беж З їн б) пише
ТУ ьо У т п ше З
А дир отлиЕ Жим дод лечу що у фу стлащо ше Фі и
Хе А Ав Ул аБл о Мужх Її Аза тТжвокжІ бсідобла ХУ шу спЕУ МА
Ж ух х зжохжею Жаже логію Сб ах Чеки: домух ДОБ Кюем. УУ хм, - У Шеоует ФЛ и Ху,
Ка Бо сш їні ми хів тут АВ ОАЇє Цех Ох хо хім дя щу ла їх пк і хи За КЗ їзусу йду пої Ци бує рю слу хх Ж. Ми УЖ гля Ж Чу там; Кр хо ваду АХщ БВ бе ОБу ВаєЄ у Шеє Бе сук ВвроБка пс їдм ТпУ ек й «к 5 шї Й а 55
- же хе бах Пе ів хв юю а У зі склу Чеууже бує іл Ше їла Бек шк Бе ох віз Ста зАБЮ Уві за бах тух Жук бук алю ше вх за За річ сяк о ати в хиїу бар гм о Фу» (ро тм пра їми пат мі ТІ: пи Тух Би хв) Бура ек тах вне ої Сій ЗіМм аж був і Ба Те
ІП зец ап
ТЯ БЖ КК
ПУ же ШК ка ще ГУж «ВМ ОТО
Корея се
МАК ЖшІТА пт поем пИмМУці пев «У МУ чЧНА ТИМУЛЛ ДО ВМ» сту ех суху Ст, лож ІБ их У а СІВ та цух Як «Вайк ЕХ даму Кіа гаї оон нн НЯ У ша зму ща ху ю тн З» дво гія баї ше о тву Зій дал бо Ав беу зви діа шаї щеЖ ім ОДУ х ся п ту
М КУ дм ях хо соти З що М ж дпху мхя рше идююх се ТУфлю хдуєт уж От : мах сшх ім дич дів отнЕ тів би Лу цу Беж шеж ОЇй БВ Мах їжи; БЖ) Ву йо Жх 3 вче о длвробЗЕТ ТУє ща ЦУув Бещ Зіа ВВ ТУЮ СЕ ОБІЙ Буш тлу ЧУЖУ АВ ву З ЕЕ їжу їх ох тощо Ж ббхує У Знж о шику му яса ТУТ ах смхух пили А
Кхос БЕЗ ую їм) їжн3 Кі тує Зі Ака Бах БЕ Уха бід Зее слу За че че ко їни» ви ж битим ПУфаж др стиму ле кл ЩдУМіІх се Ссж ом сум їх; вер ох вда бшк У ше СЕУ Беї Зі Так ОАЕ Ба ТИХ її це
ЕКО Тх це -ї Яиек о им тих хм той ше ха ЗЧс дям тТрхоеучи Му суки п Кр
ЖіФожеж цех їлиа БМ вів УЗ Аще а Віа МБ3і Теж бук суми си СІ 5 25 За їй тиж Щужує ХАІ печу бує бАрує ЗУ би Ку; ЕУраУ ою дя жд литу; р
Бпеотбмж Ба Ма Бо цех ХВ впеоЗішж щіЗз шхж Таж БУ Мао г
ННЯ їп5 мл ся «шлю 5 сад. є х «4 МАУ ст щи тиїйМ КЕ хиіЗ» щшучна пеосаіловВиите кпк я «Й М в СІ ТБИБИ «Ой За
Мт дів Уві Мей Так бід: Вех рео Мр охея їшео Від Мі беж Сем ку і 5 ї8 ТУ щих дк Віз тих ЇМ оааи Суз Був Ве ЗУ біб ошак ува ес би ЗЕ щ 5 35
ТЕ сх. схо щи ги хх тФохик вимі мм хау. (З бобер; о тжгмо ки М я
КзЗе дБЕ хни і Ав ме їні вав оСКо ую ЗЗР Є цу БКо бім бій и АТХ щи 5 Що ке пре ен т х дет Чу дру ДІ их фе ди Та бою лі вл ж ях Був БМ Бем їі бук шбЕК Вів бах Сп ак шхЗ) Вих о сіу За
За хі 5 ко вдб вВіІш жа цех пі дек їм щаж сук ТЕЖ мявО Клея Фа Тйх то тк Во те шию. Се. Лоихку чо ши АН Сак, не ЧК зужкю хм гл ПУ ку тіж Ще Беж отима ЗІ Аза Чі во Уві Віа дю тук Тух Св ЗІЗ ОЗ 5 З КУ х Ми Що 2 пла свуж же бік ТУ м іх нує їли А щі ух
Ве їхк Жех Заї ко бах таж БвйвоЗіу Пів бЗфу Чиж дуб Уей са І тий ча 315 ми КО, АЛЕ
НУ
«Вій» 55 ех 115 киш ВЕ «ЕОМ о мпреучиа мпопмілеютаМміс ех хи» Мь оЮв о шутвевА я тк иктю, КУ «ло КУ кет жу Ж Мови стоки сх би Ми м жук сю ТК с мм т їз дер їж» Улі Ме тв бот ЖЕ БКО вЗЮ беж ей хв Заї пеж емо су ї п зх Ук х М лі З пол Кома ти йо рок. Кт ую. слух тю щої сп ем бін дих АЕЗ жу лі пав См: БУ Бех Бсу Мі Бех Узі Мейо офи ще -й яки пу ре, ду ж хх Лос ст ЖІ г КИ а «му ж Хоми її ж МИ хх Аг ку САя їх х їТє Ашо Аж ХіФ Бза Бук гм Діє ТКротух БІД ОЛІЯ Мув ВЕВ СЕМ М ї5 до їх пе Шу Ти Там там: Тл сб; м сах є Ду Уі4У дуує сти в птеа БКе Буз Пец о гбем Її тТух тних Віа Бек Так о лку піз пех п1у му ща ях йоажя жене ІЇУКр) осуум о с3З ху Між (чт є УТ ех спи ах жі я є тік ну
Бко Авт Аж Кіа пеу піу дак чі йек Слу Ту АвробБбе тах їм: ТИХ пц з чи ай що т го 55 ен Я іт 2135 дов ли Са до ІА сумо пучимо бмао гу М хх їж пає їх; Зі ВІВ о сій БвроУадз Аза аї уух бух бух осів с де е; ак о ЗО З5 інве КУХ бхзж Ух бтоз Шех бах Бі Зім о зМа су тах оїжшжв ові піп гів
М 15 мо
Ж зу
Су «Ма» ве «211: 313 х1 зок «ак ККЗ
Не МИ МЖВИА ИМЯ УМХ спа «их «йди МІ АВОКИЕ ТНИХ
ОА пу хвросів щі Меаї ТтТавх Обл пе Біо Авропех йо Зі Маі позх Бем ху й 5 хо ТУ тів ла сія у жи птой о Мих племен сте ху сг усу хх тю піц вка вІасгпж Ті АБИ Пух Буш дж чеп оса ОпеХ Чві їм їм Щек ти 25 ти ща МУ 10 ся пх й теж Ли Тих се пет Мк КТ ро од Скую УЕ ких
Ба вер ле 1 Ах Буд Зима Віа сттрм о тжю пів бій пу КхО ую са. чи Я 5 я АВ Се тік сучежю сМжиже Мету Мах 1 дж Ми СМТ Зо их мих дружба ші тую лид ка ЖИ ПУБ о Ммец Бе оїбіє бук їїя Вів Бак це дм ФО; Щек су св
У я жуки иа б ТЗ серии ух ух Уфа току жо бін, СМуУм. т Аж вхо вар дже Бма пек сту Вес ЗІУ БЕК ОЛУу Тв Аз рве тТВх їі ТМ ща ТВ т що і Ка Зоо жде ху к-т. а ж. ще путь Мо ХІІ их, с Ме уч ти
Хіз беєх ек ше бів ів бій БвфБоМайї діє паї тех тую був Ме щу г аг с
Зх по п ім б гру Зб сти -к їмо Ук 31 ах схї МН тек томі 4Вц бух т піеотТухК веж ді Бо Бах Ту Бра бі Зі озуЖ так оїжв о Уа бій Те єп цх на їпо 5 ІТ уки, їм «ме шї «ідо Вау ел у, «ЩІ х жЖКХ «МІЖ Шурузания теле «Ук
ОБО
«ший СВД ТИ «і ОЇ
ЛА КІ в нн т Нр НН ОН чими МУК Зв Кіа дІ ях кожи Мети ЛИ. 1 сім ма ля Б Мапа бай ес ші ово сп Му Буш жу пхЖ пі ї гЯ п хх 3 ХЕ а ХЛ пежх сем їж їде пех Су бух ж ЩЕБКОЦПХУу ХХ беж БМме кп ше оТуХ ха 25 Зо сухе оч Кл уж Мун жу не мч о ж ому ЇХ фучух ще
ТжЕ Ті Сі бе Уві да ха Шев рез бій бує сук мем Би тер омМех кх хи пе о У ку пл тра кл піт іх Ми спожи шен ху пре спи бує орех пкт У
Ем 116 Хі оавв око Зеж вве шек дроту вх тує Меб Бе Бех о Бпа
БИ ШО ІВ
1 ки (У хмж то ех ті ру ВУ й. тм Ди т зує Має що м. пів бітум ад ТК ті йеж ЗІ й ув о БЕХ Ті Бетотвх ДАВ ОтуХ
КЕ -д че Б
Б ТЕ Ії п «ін КК ке сх між Же. Ват ди бо ху шує дю ї ях си и и ЕКЖ їж; біос шеж ше їж; Був БІВ Веє АЕЮ ТВЕ дів Беж Жук ту СУБ 35 по Зх міш ко ді зі шує Айба дви сбві Чо де «їа внз во жук Фкюр о піх
А ЖК М ЗК хх ЛАХВО ЕК МВ СКУ ВЮ она ТІНІ МБ КУТ ДЮ ху
Ммю 1Тюу ТО ем жі РІ х кт озум фу Ж ка жі «лю. ЗИЩ ет хиа А їх уже сю ху МЕ ем ож Тек обаі Ше беж Віа Зекостви жа опа БЖО пає
Де; ЕВ
Зо вича Ма Тема хз Мк, гозеки Жири флерсу сл дух су боже (ЛК Ма тм Кі а жан Бе Пе) хів Бо Сук Бек дку цех ЖУК дек с ех жКжоВія
Ук щи я ї35 135 Мо ще - ШУїкх їм стих ху км дому у бе МУ Уєтх 3 хе Ху му хх
Ма ден щі Сув бии УЗХ Муй дам тую Ббе Бро Обі хе Уа о Жжне Усі хх Ма Ух іо ие се, бе А ту в «буки щи КА кл ут -. Ума Дис ДУ Не ож Ту дже шеК блу віж ще Тож шеКХ сжу УЖ НЕ ОЖИХ Ре БЕа КОВ з ЕВ атм тупу 155 КУ ВУ ма там п Фр буру їз тому ймеко бою им бр пи ста ха має дух тв бе пат бек Сех Зі ей тую дек це) пох дек баз ах ТК УвА
Бл ща тугу хв ху їЗО се бури бо тує су; Ох ми М три ие ле Сей хм ил ЖОХ зх
ТВ оцдех псех ха оОБає ду ТЕХ СО сце бує Так СУ Ав) чаї Бвев ЯМ
За злу угу що ХХІ. гожаху СЖеилея юку. му Ібтух лук МУ Ак ин и нн го бом фе
Шуш Виєб Пес оба Чт щук УВА Аве Буд ХМ МЖК ОМ Аже бже па СВ
КУ Її У иа КІ
З 3 дек м лу уд тую долу жур Де щі хі «і си ж тії
Узі іч шук Бо Бк Сув ро Ала Бкш бко віз діз Бід дек шек У тю тут сх зам дк ДИ ежея хм
ФУ томі іще ема рих во люту зл ду ЧЗує їжа у хи ум домах ее птне іа ММда Же БО жи БлО Був о зщр аж їжа Щит Хі В дж ї-: дк зд ее хай ХО я їх глин 1 паси: киш т хат сх те ач ня чо У их пік ву
Ел: бій Мі жа Су ал сві Уві двома аеЖ Ах сі ве БК лад
ЗО 55 У с сі Мох под Між зи ДІ с тк ха у Ху тії стю дю тло, чаї шов КМе пз отр отук УВІ АВ ОС У Ма Зі маж Бав дкв АХ Буш -ц ей худа щі мн КУ причи те: Ж Мох газ її сл Шу» фе Щоуу стфяю рих долю лу и -
БЖ Був Без дк бій бЗ3Я м Ббе» дев бзх ж ле бЗроу ах Уа бах їх ха З
Зтвут х. :оймжує 2 думи Ма о сл дашки п о сх жу сто БУК р. як мах шеМ ло Уві їй нашо даротжЕш би й Зам мук ша сум БУВ
Ох їх Ж ЗЕй зи озиму є жує ЇХ в биху; ЩЦябсу. Фужує Шум тих 4 Тл тк ти
Суш був ад шЕХ дДВД о Бу ЗУ Мем вка пЕХ о щех Дід а ХУ ТБ ХХ
КУ З 335 мих ях На оищо ла т фужту щит Крах дух ж См Стеучия Іф ро жк
ЗвЕж Був о тпс пу оску сад оБруеМ вуу ся ВО лота жук сих себо вух за их це аа зх ЗО ту бю шк кла КЗ Жим а бурий, ше Ж ях тих пан соки ро ме йти шк Меч Зій ЗІ Мат тво їжа зва ЗІЗ Уа де пжшо Хнх буд Мей 3-5 зай Коза тт дек сл лкю ДУМох хе ТУ бок й жу Мі м їх 1 Хе пух. -У мах ву КУ це Тек БКо де зви їїін Дія Уі підотхр хи шк ДЕВ
ЗЕМ т СЯ
Ка Зх, ЗИ тлу жур Укту ЛЮЖЯ сх ші гуиу: тиху при Сі жтрих зе ие тісту ща си спіУу ОР БжхО С АБО Вей Ух Був ж Тк ово ККОо Вас З АВ ек зн З Уа КО хек ошау мет БУ Бе іш ЖХух Бех Був сем тв За овяв о Мув леж Ату ге дя як 455 їй АВ ов ШУ Ух як ще хв дику и в; Ву Худ кий До Ка. Ех тих
Тв шал піп су ба зах жає дер осСув БЗУ щі Ме Мав ось ВІВ бо
Бонн дл 3
БУ ко АХ кі ех буки. Муррує (Ля Бобхші Мем, т Фе ож Міри пу, МИ ки Ти зи дже ММ ух хви бам у ша іш йех пуща Ма жу шу БУ зе їде ах й ЖЕ са 0 Е сажа зах
ЖУКИ хх «й ВЖК
Є Лу, с НН Кг, «йіЗвк шу цка допліцевність
МЕ
АХА. «ВИЗ ОСЕЙ БО «М яв ду Ж хр -ео й Ух бум смути, Вахут суху ее що жж шини Ти ях азвв оїтїе сві Каб отв пій Зах Ко АЮ пек їм: Рід А Бак їли) КУ ї Х 15 15 п дич іх суюує т моху суму тд бик их зи ХТО Фішер Тогвуу ик о деч віз ср їі дам СВ Був бах пек ба жа Аа ФУзи бима ОХ ям ла Б чу. д дже хх стоотджю т до. пе мем М о жскжше буюти рях ТУ
БМе див Аше Оз вд Буш ей вія тТЕротеК Ов Мій бу та сїУ ціа 4х й
К йо ах
Зе Із Хм та соки Кз бмуює Ку йо дуує М о НА
Бро Био Му Хаме їли) Ха ХХ ЗароАіа же тек вка бали За м УВА шк -к ще щи п БЖ тт вві вд БМе шек у Бех у фрезу ЗУ БЖ Аше РІЗ ТБи фузи твЕ
ВЕ ГЕ ГУ КО дю по щу доба тля пт дав А тлу тре ужею їм мот пі Бех Шех фзи Ма зів Бі даю Уєі діа в) тук ТУЮ був см пів
З з ЗЕ те тео ер ІА ТИ прє ЛИ ря и и. те не у Я Тк. кра тт
Ба рує Бак Уві Бко Зах Та пе пам сл лу ТК їжЕв очах п оКІє ий ІН т
Ам АК МАУ їх й ре хг їх і тек пі Мат пщцеа іа ОК; тих Же у; ЗкК дос
Був ха тв о Уаі вла віз: схо Баш о уах За хі іш жо б ес Бр як як у
МЕ Не 155 туїах ТУТ ях т то жен ж тн Фо Ід чиї ме Ух ух поши СМ сіщ бат хаа жВ щих ду ХМ а ле са бла слух а мем АБО АБ
ХО 13 в
ІХКудх стіни у дже МИХ лк о тло лив меру. битих срок Уж до Ал їх
БиеЩотут жує дж ж) вав Мущ УВУ Щі бо ПУБ оОУВЛ БЕК Дай АХа їх ліка аб ие. Ец лу КУ М ж дм тиж Ти р дк ливо ач (ЛА: ЖКчх шт Іврит су хх оку, ша ОошЕЖ ау ли же са СА ОС МТМ Є слі шт аа сяк му ощЮ 185 МТ іч
Ж Пйує им бум бдма оує дує СМ фі Тими таму Ххшо шж Укр пам их ж-жжх БеХ Ома ІМС Є СТИК їх» Жу сти Зах М лю ще М їв ІЩЕ ха
Жах тож шо їм пУуї тех щів сту 13; ла ке ців ім тім т ся під БУ Зі ху УВІ ТУХ Вів пу зм УВІ ТК НІВ б Злу ше ех зле БТ см
Вих М А стик ях ЩО Яку Ж озуші ущн ФУНІх щі» фа сли Уфа йти
Щек МЕ Ус СКМ МЕ ЩЕ МТ БИ ОХ МОЗу ек ож ік ух й сукні хо лад Беж кт гу -в «АХ б кА кт
А ТАК
КОЗУ си тем УЖУ
ОЗ пий пихи УВУ
КАХ Жука пОсллУдеВнаАтУх
Ен хаАдК сут Бон «си СЕН дя. Е «ЗО Аз іє уд ФУухуУ. том: г ж пуху Ах тпУТаУ Я дих тд їеи, лях ФМ пам см хи Май АВ Лек БЖ мав о мАЗ ЗУВЮ Пд му ХХ Ж КМ
Н х їх Ї5
Фо тм Мох СХ о у етика сти ЇХ ум о Ум АХ Се Фу МКМ п дуже Му пехо іа Був о їМе Щек слжи МУ бі аж Уж БУХ Пех Біда ду дат тує ха ха З
Зее хі іх стуу; Чай дає ПІімйоМат шШуту у фев спі у їжа бі ру МАЕ
МК ода сб шІх УА МЕсч ОМ жит МУ МеВ о сАУу Ба ЗІ С БКЕСВЄ тк Ту сх
ЇВ ря: 5 ч зе де сруу ее соту пики свт ан доких Су Моє жен сок ша пу пла ї3ж дво БКро Ост зво о ЗеЄє Ащо ТЕ ойка Жук беЄ щу жк Ва сирах жу тю Хм лихе ср бух їх ща Услжух. Жим Тв кк слух У Зросли хів шу іа в вп о гУз йех дів вва о Буа За Ті бежех тТБжх Мі тех я ек ще 55 та 5 че
Я - сера смію Між ух де дя ше ше с шко мкл п век цем сб отже пе еж Бо Буш Та шах АкЕ ТМи діа Меб о тук тую сжа ща ЗО ЗЕ 1 ч хм дл юх иух т пух ди тпамує ух Мі Ме. г те трі 5 хи зів ха ах жує вет Аз о ввИ ом Тр аю Гах Бвоа оазротех тую їм хо М На ті і цим: там Мід Кік З ми бузу ов ек и пуд ру сухо де шАїх У САЛО м ща КпХ ОО Ува шешХ їм см пу по Беж оАУ КЕ пИЖ 15 І яЯооодев 4. ум х їжи дими Ж туї уую Мр ик сла; Ст обме Мік тай нір Бк оїи дів Бо су шеК дже пе Су век сл ЕК ТМх 5іЗ сх сх хат 130 ї35 їжа хі г. лах їм хм ЗаЛо їз деку Че З Іру ТТ ми. и му ЗА іа ев сіУу Су ої УВО Мун ав ТК Бе Бо сій КО МаМ тв У й ца 5 ТЕЦ
Мах МИ їхе Ак т. Фо ки Кі їжу Тих шує ФА и т Фріс тлу Укеуму. Жуч Ах
Зек чхо два шт слу вій Мей чщкЕ лає се аї нів мк жов жиз АХ аск пет «ех їх А Мт ї З пл же бур її тир сеуу Худ бл лм душ їМ5 3 дищою пах хлю
Уві за сі ШО ше «У Би охух сМаЖ еле Бех БИиХ ВО АМКУ
Ех сх іп хво ї85 Зо соки А їх при ЗУ Є аж ев меми Мф ТИ ші 4хщОЮ кох ХК
Ух пЕЖ СУ ЛЕТ жів ши ВХ Ой ти тує тпкЕ Сув ввд охві вдо КІВ
А Бу В
Фохже жи Фбшвж Мат Поу Тло лу хг Жди чує Я ря Ле руна ШЕ
Ху бо йеих Зал ау Му МаЇ Вр обу Типу до бл Аж Бу Сжа був рок пат роя ло тк ие зл ях ск тен ДК, гзажкю бу Холл тає 51 х1 хом ех бах ХК
Узі БІ бу Ка Бо Суз схо АВа жа бо Вів ві Вів бе ше У зв 252 238 паї
Епце це БМе БТ бжи жи рБКОа Пув дар о жвж іїішжо о Мек сфе деж ВЕБ КЕ шах хв 55 пгжену КОЖ а І ств тки хи кві ХА 25 їхав шими лов гурт ец їхух о кт-Ї із чаї ств був са тв Уві двроуаУ ах Аза са зАвроБКОо 03
КУ джк ай
ККАЛ. юш КН лях пов кет. ТЕ п есу тру гул при ах Іл пн БО пк: кт КО товка т. жк ія ге 8БиИ бхЮ Тухє май Ашр сПОу Уві пла хі ів Аа дів пив ща судок лк
КУ Ви ХВО з оо жлжух СЖичих ужеею Ура тт м Жірчює ло сис ру іа дух та сх биу
Є Муш Вт Аж ПА Сип ій Бе Аж Ше вх КМме лтя УВА Уай Бех чо шЗ5 м їх. м Мін ЖИВ Фк І 231 дом Зржєжя т й ша Мт жк их мит. «ки ті їв» тих афіш НІіЗз Пій Авр оте Сем дЕВ СЛУ Був ЗБ ту ув аж й зи туп
М 335 БЖ за гг ллж ХХщ суха іш тА Кк тим 55 Фежае шлею ЖІ ок я Км,
Суд Був узи Щек дп Муз СЛУ були рез Бек шШак оте сі був ТЕ Ге клю по пи, в Ех Зх
Фа Тк Лю Хом ІЛ КА МУ ши ри їх. би Мр Р ку ЕК ую их жиму ек БУВ МОХ Му БУ Шов БКОо Мкч бій ж Зі бай Жух ХВ би же пе Зх, зай зу КАХ ке що мн нн чи ех хі ее мя Мхрх фтууєх ще пса Шех ЗК обід баможеає ТЕ о Буз Бла оба Мал же їни жа був ї5И З тд ше ик хх Укх зу: по бю шк ху щі жо сля Мучичух Мі оф ща
Уві ув Шу Бім тую ККо дах Ашо ї3ез Віа ХВ) уз тк Бій пеж дай мах ТЕТ, щу
То ШО зим мрію умі ох и: де пух иа Кот Су вк гри Ух. мг те пошу с
Зі Віз БкОо Зі Аа вва бух Був ТВ ОТЬВК Бгто Бхо Зоб їз АЮ ОЛИеХ ак «щи р зх зн За 355 ЗО
Все г луУ сбрую ХЕ і КУ т брувух дру блю Хо піч ха шко Тих лехж. доли дв сік дах Бе вве їде ТУЮ БЕ БУ Бей тп УЗ ВЕ Бу бе ЛЯ ач ха зх прут ри ру тую тур хх мк зла сацУ сту би ССМихую ли ек КІ кута тіж ге щі піп піт БО Мах бе пек був Зет аз Мах ув осв іще у ; дк суп
КЗ СУ Ук ців дв Вів о жУЖ ТВ ли їуБ Щек їжею; Бех Мей о деЄ хо шим Буд
Ка а 3455 «вій 7
ХИТ прю
М зм «кій СХ
КЛ ля мірмамамєх Ум МуУх є М люди ее в а ак «В»
ПЕВ стаз Од тих жи кх ва мжжмх ех УТ «Я М ше в УЛ Ж зв Фу ТУ ою а ИН М ЧА СА дообМри,
Аж Хі Ма Мет тик сСув Бах КО ЗароБех Без Ада уві веж бен У ї У та їх
МУ с я тільних ст лих дак СА си КА я Храм. дл т. 3. и шия спів вка віа тає іє дЕЗ Сжв буд Зає ща ші ех Ул Бема ем ше їй ЗВ зо зх я : У т. ії Фран сучту ТУ пе тлу дет іх м їце до АБО ів ва Був цеб дів Бе тех дій й бу Бла ЗКУ Іа
Ух о 45 же Фумиху Ме Жох соти уст жим о ла теме кю риє Фу ШУуїхи хто
Мчч пи ЗУ хм житі МА МжХ дом Міа дже ли де ра ше ЧУ У, и Ух 5 пекння с см їх таж (хе дм У». су кін дж мату СОКУє т трбжех тто йше дз Бпе беж сіж Жах ШУ Бех Піу ЧИЖ ше ніш ХБу Зм сих вх ти та Що чл слони Кк и ж що У ву хи 54 Ук буд сома. УТ і тів о шщеЄ КК ім; Бій оБіа ЗЛ дЕю Уа Від ові тує тує СПУВ СІВ ІЙ я Зо З мухи уж пику хг лужку Му Мо сяде ли Ук сі жи Жид Б (и У моде свує щек бал вЕОа ЗеЄ Бе шва сСаж ід ОПпту а хуя чай св Хе
ЩЕ ах Мо муз дЕш тиж узи аа ів БКо бех Уві Бглпе Хі БМе БЕЗ б Щек ва
Мк ки Мих піз бій їй бут шШає пі Ту вій йдем щі ча СУ Бер їм За Зак пах зем Буш жає щу Упх іш пу Хж Уйх СЖЗВ Бий ом бла Зак з: 45 ха що ї58 ї55 тп: бклж 1Зету мих Ал ти МІ лу хау Жлма тв В щі Щі т
Ко Бужх Бе Ба ми Аіа їв осла бід хр дув УВА АБо Зах Від ех я щи тах да
ХУ УЮ УБУ їх йшйкут Жив Ля що уж ую МУРУ: дк дл лтуюу. с му ШОячо пкя Ше о Те щих п шеЖж пЕУ Зводу Мід 3 ех За Бу см че Аж ех зу БдУх
МАХ НВ БТ химе СИЇВеє схем їду Та Миуих кує ЗИ о стоки сб Мол Млимит бут, т п Ту аж ЧК о тлух фу іїряма я щас іі Ху ви СМ ув хз ВвроОтух
Не кас А
Укл у Ж Зх бли АЖ учи щу туш у: ХА ву ІХ1 ау слу жах их са БуБ БОЮ Б о Заф Ух Вів був мо Заї ХВ нів бли сіж се цех їЗ5 жо ТКУ
Ян їМмч Маі чЧлуєЄє хо Ер БяОЗ Би ді бл а У
ШЕ ОКЯЛОІ Мт. АХУК АОЄТ ХХ КТРйО ВІ МАМ МЕ и КОЮ, зи хв ск пі пів и «їй» т ся чу «Ку ах кинь жи. пе ММ ЖКХ «их лозу МІ М хор итох, кА АКТАМ ЗМ КОВІ КІ ХЕ и СИЛУ ккд нок мізмууемуиум суит пимкт кче, ЩИТ «23 Хпапечекина прслідсваність НСПУ ли
ХІІ М. «я ІчЗисимуикця гУМмуд их «иа КМУЯМІМНЬ СОНАКЬ ктретух, ках етух
Ів т. 13 ІН
ЗИ Хна зоже убили амУмах щеж, Вів дика ЧК «ав т
Му їх Зк й дошжу ЗК сит «о Ха» зва де ме чаї піу рко Аза Ав Уві тк йвЮ Хав пе АБО гТух : х УМ х З МО му тхх р ле с сх м «ММ ко КК
ЕОМ ЕХ кулі тдяч ит призи М хи зали жд ШТУЧНЕ послід нОст реУжка хх «т. Міг Вричих КА зу ях ТД хшкаАх ДКОНнеВнНсупний пп лЛА.ДОВнаОтЬ Би
Село ь хІАЖИНЮМ ок не тих каві ОЗКЛИИА ДНК Х
Де зах «й «вай (83, 5 м х Я уми ст хуєтти усе еу ли Тк рми сту, хо щих «Мах Хва може схнляхи слобою їйц. тух. йиЖх або вва «их «ТЕТУ хо пи. УМІТИ «ШИ ОСОЕЛИВА ГУБКА кл іх іп
ХА . КВ КУН
АСК Ел виг ШЕ спи: зи УХху дтутх їх У ще шНех чаеКУХ Хай може пвляти сефею БМе, у. НІВ В.О ТЕ «ЖЕД» ек. тиці пуд чим ЕММУ иа сСЧЗАКВ пе ШЕ (115 хх тк. .(Ї3 «Лу соди хе певно сени я чужа. Зк свати дм «МИМО Хай млже зевеашлим соло АЮ. ЗХ. Ж» Зх аплОо ХВаХ сухо
ДО
«Ме ЛОВЛЯ ОСЗДАКА
ЛК жк ї355
ЖАХИ СЕК. 13 она зт зу сс. опт, х Сток РУ ща н. 5 пит « ох ми ХА, «ШИЯ Хащ може яви щле сеєо Бе, Біде. Щек, ТМ. бух, вим. МУш Ол ві
ТУ
«хи «ТЕКСТ гатихдтм ва ТУЯ «ййи ОХАТСЕЛИВА СУНАКА скит ке Мч «Ми БІБ. 1 я, хг вату дик. питц т дити жи жи Ти. хУНе Тут тт мо стажу МУ. тк Ха може шхвлати словОю Ба. вка. СІ, їВу зба АЖ «є бак же дум. Мр: їЗшку. ЛУКИ Жомхя Му др пов ОКОд щих Хо даху сою Сто
Був ож беж САБО Вих За Ха жає пек дих лава Биа Хай АшЕя жав осБеу
Н в. 15 15 ід я ще лих 73 рен г еихів жк
Кене де «й» ВК «ША прручма поса цеВМ ие пеки
ЖІКХАУАИХ що дич Аитя в гу і ук у т К тот «ИЙ ХОМ А ПУХУ ТОН ПАТЕ. шик сх хи «ЖИ ШИСЕЛИВА СІДАКА соло 14 а
КУ Інд
УЮ до. гук ко суслухуєтся уми ДУ реж ше УТ сх жо Бе «Ей Хва миоже чвлаши спчосю ва, виш. пму. Зімй, Зпх дамо де «М» 7 ще ях «Усе ММ ше ЇУї-
Хав Віва веж БИК вже СТ ї 5 се ИН «МАЕ Та
Коен Їх ех З шо) лю СМцлі пед ЖК Кт Уу ших Шичюлктовий ІМбюЄтТІВІ Муха А «їх Штучна пОсНпіданиУттх «ДАЙ» ки ух ЖенУсісруксх и пі Мох міки ТИ ння ЩинуансутсвА посадова нить КН и «ЙО «Пи СКМ ИИВА СУКА, «или 15.04 «чай» Хва може налити собою КМме. мк, КМЕ ро мів ли ше мл «й Ки МОБ МВЕ ОЗНАКА. ша ах На «шим йа..15,
ЗК С - ух ми тих уху Ми. т праху ЕК де «МД Ха змуске вже симадю уж, їлма. СВ: Ех Бут іх
КИМ Ке «й СКОБА КВА СПІНЕКА «УК гі гору яти жу УЗ. «их хай шоже швлятн сиою Беж Діф, їі. Хі, ТВх. ЩіЙ я НІВ
Ех
ЗИ согОоЖпМЕА Се АК, «М х ОПОЕДКВА СЗНАКА. ся. Ук -Е «ИВи ЯЖР. ОІВ сети ща тлума ст урдетми о пихкох що чих се чере тжпр чКих щу «вий» Хва може явила сина бі, СБУ а, ЧУЄ. їЖНА ВЕ БА ий» дари ОМ ЕДИЕа ОЗНАКА «хе АВР,.ЛВ мл ще сек пе ери тич ик пл іх -их т їх «ЕпЗх Хай може зхидити собою беу. Же, Вів або Бещ шоу с, виз їж ма ск зичу що ж дсдоу жхує; ту Ся
Зіп із хаз жваво охва Хаа Ехо Хай ЗЕ 1 з
У -х. «хіх Тх
Ех КИ
Ач док «ел УУКУТХ «Їй І «ай» пвУЧчМА рОеслІНОВНІКИ
КЛИН
АЖ о А НН т
ДАЛИ Ж Кон уУ єм МТМ ОДТНаТЬ А ТВ ОВ
Уа сажки ий 0 ХЕУММИХЕ СУПИ АКЕ но СР гачиху «си СІРКО СІ, «ЖИ3» Хаз може налити сен смак, Аа я ших
ООН ти
Б В; я й пет ух мо усу лис дви км хх Зпа ук ли ж б джу ТЗ ху с моз ай сх ів МЕ хо Мек ому Бра сій Уж Ку бук вка бПіУ см 1 З 10 15
Жим бохжет хе Ж ху ру бух бук бл шк ЖУТ ую сум уже Жито б иву. Чеуже жає ба же хів о сеж Пух См ос БЖ Міу Тут Беж ЕнеосЖнх бЗею ух хо хх 35 ткроців ім тТтв о Уаї ко бів Ме Бто ЗУ Був Зі Мед бі Бер Ме:
Ко: «У 35 кге тла УТ шоку Мирна Жийче ше єр Фе тав щоеуся лвмию бури ТУурех биху: Шермх ше о гхи ха Би КЖО ве А Нпех Бр охах м ТУ Кжех вро СПЕ Бум
Ух що о поз ля хМЖІ сх 1 «Жухжи с т Шууєю бах ШУМ СИ Зоо тех пів зі їв Уві ТЕ Ті6 З діа ав о мув пех 118 ек сних Від тТух ув чех ре їЧч
ЕІ т т ВИ тив: Б3адрстут Ши Чегоїж пев Віа шеє Аве Ти дід Меб о рує бу св їх бащрстжю ЖЖ чих об Му Іа жає АВ СКйих дха Ме Ту ТМ СУ п а
З ем лИМ тичих Кк тм ЛЕ. пЧоуєью СЛуумл Доу Щ3М піезху При сут Ах.
Зів хв Мал хіж бо Віз Зно св) рю ву КХаз пе вва жує кю су
ШО пах їх»
ДМ ЖУфлж лбауж Жорвхмю Я ее 75 Фу о хе су пу жмвж мем УВІ типо ві Бик пе уз ла
МАУ ЯК
«ше ТВ с «5 хх ІЗ та МТА я ххх ХХ се р нн хи КМУ СЛ ПОКЛІН УСХ ІМ «лу кдд ша Ту З Пежергзавли рик: три ум од хі КУ, папа Конссекоуслна пзолудовньше УМ еТУлугі я
КАК лик м сист У МЛИ А
Еш СПАДИ ВА СОКАХ сут гай тт шли ЗР. ня ше кежи сгулжурмтий сжтесема С. тлу: Фу. суди В чі Хла мож жфеляли изд Ейр, ух: ЕК ВО впй
«ВО» ха СМООВИИНВ ВАХ яаших 3). ,3) «ЗЯ3» Жав можа залати сопою БДдФ. бе, Вів збе 13 «ИЙе «й МК ИМІМНА ВКА ееайхх 3. , 34) «ИшІ» Хав може явлажи собсоу АБО, ТК, ЖЖ, ТК до ХВ каш «си ЗМО БОМНВ СОНАКА «ит 3. ХВІ «пла» Жаа може хвлити собою Бі. Ве, ек, ТОК, ЖМЖ. вв. Був ета та
БО
«дИум МД ВА СНАХ «Важ І Р,.5 58 «ВІЗ Хва шоже диляхи сллбою Був, ій, щих, ТЗ ОО Ав; «Мих «ЖИ САКЕ ЛИВА ПОЗНАХА хдлшв БУР. СІВ «ВИй» Хай може квдяти сосбсо ввд, Ук. САУ, Зі. ТБи айе їБа «Ай «Ж ФЕОБИЖНВ ОБНАКВ «чим УТ. «23» Хаз муже звати себою шк, ЖУК. ВК ЗВО ОдщІЄ «ДК» «ек СК НМИВА ОЗНАКА «ийже ЯіпяР.. 8 са Хва може вав лдовою тТУухм. Зм. АЖ айО БВ сах «ай СУ МВА СЯКАКА «ЙЖлт ЇЗ5уУ.. а шкі» Ха може двлачи соеБщОжш ШЕ. дів, ем, Те. Тв, (в або Бій ких «дв ОССХНМПИВА КІНА КА «ЩИЖУ СМ, ТННИ «МИХ: КХазв може двпати собом омаз, ТНх, дів, УК. Ма о ЗОе АщЮ «ПВ «щі МВ лиЗА ОЗНАКА «ЕЙ ІАЕ, Я «КЗ» ЖХав возже виз соєю шШек, БМе, Ака веб їн «Од Та
Авто КАЄ бзі Мт о чук са бшх БКо Бдо Бек їв Аза оаї беж іа Бі 1 а 12 ІВ о Аж ів Бе її Авий сжБ бмя Пех Ве зів йеє ал бе) Хо Бех що й Зо хва хаа Ашт Хай дяй Ха се Аха Бк ух ОІВ пів Буш бот ау Ша вхо вВко му цез іо її Жуж Хаа діа дес ТБу Ак діа За Щі ча ка 55 чо
Бко свви ве шле ЕК Осу бої бі ще у Тег оАБО БВ о шБЕ рев пе
ШУ 75 ка
Хі беу пох Бем сів діа сли Аз Уві йза Уаї УК ТУЮ Суд Зла ж
За За каз хзз хза да ЖЖ Жаз ЗУ Бе обі» АЮ У ТВЖ лу За бій ТЕ ї122 103 115 мух

Claims (24)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Виділене антитіло, яке специфічно зв'язує людський ССІ17, яке містить області, що визначають комплементарність, важких ланцюгів (НСОК), 1 (НСОКТ), 2 (НСОКЗ) і З (НСОКЗ), і області, що визначають комплементарність, легких ланцюгів (СОР), 1 1 СОК1), 2 І. СО) Її З (СОКЗ), причому НСОКІ, НСОК2, НСОКЗ, 1 СОК1, 1 СОК2 і 1 СОКЗ містять амінокислотні послідовності зЕО ІЮО МО: 4, 5, 42, 8, 24 і 28, відповідно.
2. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга (МН) і варіабельну область легкого ланцюга (М), де МН та МІ. містять 5ЕО ІЮО МО: 46 і 62, відповідно.
3. Антитіло за п. 1 або 2, яке відрізняється тим, що антитіло є людським або гуманізованим.
4. Антитіло за п. 3, яке відрізняється тим, що антитіло має ізотип Ідс1, Ідс2, доз або Ідсаі.
5. Антитіло за п. 4, яке відрізняється тим, що антитіло містить одне або більше заміщень в області Ес.
6. Антитіло за п. 5, яке відрізняється тим, що заміщення включає заміщення М234А, 5237А, Р2385, Н2б68А, М309І, АЗ3305 або РЗ3315 у Ід02 або заміщення 5228Р, І 234А або І 235А у Ідса4, де нумерація залишків відповідає індексу ЕО.
7. Антитіло за п. 5, яке відрізняється тим, що заміщення включає заміщення М234А/5237А/Р2385/Н268АЛ/ЗОЗІ /"А3305/Р3315 у ІД02 або заміщення 5228Р//234А/Л 235А у ІЧО4, де нумерація залишків відповідає індексу ЕО.
8. Антитіло за будь-яким із пп. 1-7, яке відрізняється тим, що антитіло блокує взаємодію ССІ 17/ССВ84.
9. Антитіло за будь-яким із пп. 1-8, яке відрізняється тим, що антитіло зв'язує людський ССІ 17 з константою афінності (Ко) приблизно 1х1!070 М або менше, коли Ко вимірюється із використанням рівноважної афінності у розчині у сольовому буфері на основі трис, який містить 0,05 95 твін-20 після спільної інкубації антитіла і людського ССІ 17 протягом 48 годин при 4 "С.
10. Антитіло за п. 9, яке відрізняється тим, що антитіло зв'язує людський ССІ17 із КО приблизно 5х1072 М або менше.
11. Антитіло за будь-яким із пп. 1-10, яке відрізняється тим, що антитіло зв'язує Масаса їазсісшагіє (супо) ССІ17 з Ко приблизно 1х1!08 М або менше, коли Ко вимірюється із використанням рівноважної афінності у розчині у сольовому буфері на основі трис, який містить 0,05 95 твін-20 після спільної інкубації антитіла і супо ССІ 17 протягом 48 годин при 4 "С.
12. Антитіло за будь-яким із пп. 1-11, яке відрізняється тим, що антитіло інгібує індуковану 10 нг/мл людського ССІ 17 мобілізацію кальцію у клітинах ССКЕ-СЕМ, як виміряно з використанням ЕРіІно-8 ММУ із значенням ІСзо приблизно 1х107 М або менше.
13. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло за будь-яким із пп. 1-12 і фармацевтично прийнятний носій.
14. Виділений полінуклеотид, який кодує МН або Мі. антитіла за будь-яким із пп. 1-12.
15. Вектор, який містить полінуклеотид за п. 14.
16. Клітина-хазяїн, яка містить вектор за п. 15.
17. Спосіб отримання антитіла, який включає культивування клітини-хазяїна за п. 16 в таких умовах, за яких отримують антитіло.
18. Спосіб лікування захворювання, опосередкованого ССі17, який включає введення суб'єктові, який цього потребує, антитіла за пп. 1-12 протягом часу, достатнього для лікування захворювання, опосередкованого ССІ 17.
19. Спосіб за п. 18, який відрізняється тим, що захворювання, опосередковане ССІ117, є запальним захворюванням.
20. Спосіб за п. 19, який відрізняється тим, що запальним захворюванням є бронхіальна астма, виразковий коліт (ОС), атонічний дерматит (АБ) або ідіопатичний легеневий фіброз (ІРЕ).
21. Спосіб лікування бронхіальної астми або гіперреактивності дихальних шляхів, який включає введення суб'єктові антитіла за пп. 1-12 протягом періоду часу, достатнього для лікування бронхіальної астми.
22. Застосування антитіла за пп. 1-12 для терапії.
23. Антитіло за пп. 1-12 для застосування в терапії.
24. Антитіло за пп. 1-12 для застосування в лікуванні суб'єкта, який має захворювання, опосередковане ССІ 17.
а Хе ;
Фіз. 1А. з й со й оно - Как те Ж Кия з: Ж ОО БЕ МИМО: х й о ВО ЗИ ВО Е тм Ужих кл о. я во Як ; ; УК і К ЯН Е Ж Ким. ; Як о А Я КМ т в МАК за ! я их а ЛИШ її ; й ДОА, й Ух КК. Бей кара Е КЕ Х -3 УК й зак Е Е й ; МКУ ї оп паском Зв Я ОКУ Я. пек я ходою МИХ Мк ПК г кн щу Кз МК Я зав : У Я Он Я ОЙ Е Х ОКОМ ОМ ЕК МО: Й Ж Я мк. ШЕ КО НО ооо КО у В ходре Ки Й КК КК ПОМ Кв зх Ко. си 0 ОО БУ ен З ХМ содою У Й ТЕЗ дн БУ др Ве БУ Ї ВОК: Де охо ШК КК ПОН ро но й МИ Я ЕЕ БЕ БО ВО ОКХ ВЕ Кк З КУМ В ВО ОО КК В ТК дооо ОО ВХ У ржик В Е ФО ек у ОО кни В ке Кк. У ВО ОК ВЕ ЗК ТУ НОМ УЕЛКМИ ПМ ШЕ ОК Я о Б оо ВЕ ОК ВХ ПО С ШК ХК КОКО КК Я Би ТОК: ССО: ШИ КК В ния СКУ ПЕ оо Я ОК СВК й НУ М УС, ТИВИ ви В З ВОК на ВН МКК. Кн ВК А ; ин я я Ся ММК н жд
Фіг. АВ. жк С Б акме Кк. Я у : СКК й . у се ОК ИКих їй ОК Ак ОО ВОК ч - Е Ин: х к З Е Я Кг ; ОМ оо х: т дме а . й Е ОКИКИих. : ; . ше рей І; нин. щік : я зар зве з Я ; Е Поки. З Я З - 100000. і т ше З ш-е ; Е з Її Бони З МЕ во фИВМКИ кажу Же Е МО і ей Же СЕ КеКОЯ де Е рик ї: ТКУ ММ ЕД» ее З Е ди МНН МКК: ИМИМИМ ех Е; покемнние МОЯ ах и ЕК аи. океан Ввовв вік. чк М ЗИМИ. МИ МИМО МЛМ МЕКККМХ МОЖ і ес оо ВЕ о В со ШУ ШЕ ОХ ШЕ а Зі і в КО ШЕ УМО ее шо КН МК мк Зо Я Бе ДУМИ ДУ М УК БИКея Ки НО БУ Б М ККх. БО ВО Ж ВУ КК. ДЯ тр лут Де СЕК КН БО ЕН НО НІ Ор У Би Лю КК аККиК МУЖИК ро ОО І: І Бо. 0 ЗОМ У Боно вн ОО 0 КОСОЮ Ко с ОД ОД МИ ЗИ: о А Ох їі. 16 ко вза ; сере В БО МО 004 БО : ОКХ ? ; х ОКУ я я | ; ьс з . В ЗО яере : з ; - | п Шк як Яке : й п. о зов сю рук ОБО Її зжей що я коси ОХ Б БО о : ся Е. ЕХ ОК КО ВСЯ БОМЕХ о МОХ Ох ХК вом ДОБУ ЩО о ш оо ЩЕ КО дО ом Кх і реч Бог Б ОХ Кк ще с ; і век Е У МОХ ЗУ КО . о в | З Я Мов ДОЯ СКК з ее со Кон ї в КЕ Я У А: ОКХ ХК хо К КОХ КАиХХ во рити ак МОХ. Я Ве с хижих К па КК Со я ТО Я ОЕМ ро ох ; Е МКК ХК ВОМУ оку Й МОУ МК е ; Е ОХ хе ЩЕ я що й І; ; Е и: ОКХ В ВО ОО 1.
! п. НЯ ММ ВО мя БОГ Я 3 Б ,;,Е. Ер шо Я БО Я по жи Я КЕ 5 Ме що тмеК со Й МСМОИХ я ЗК ее ша Я в еко и ЖЕ ВОК КО ше ОО СІ і о В | Я ОО ЩЕ ще с | о Ії Ох ШЕ ОХ суки, Й ВО : ж й. щу У ОКУ Ме В КИМ і. З ВОК БО ОО Я : СУ: Й А бо що» сети. Й хек оо пледи Я . що Б ОК У ї сон ВО ОО ПАХМИнМК че с й МОМ ще хх "у зо си равввння МУК ОО ь Е х ак 5 Пов вва КОСИМ ке с є мох : Кх и Фф 7 в о й К Я у. «М и «
з. ЛВ х жан. : | | кон кн ДОМ з ж по ї, ся що м зх КЗ я ОВ -й дека х. Коня жо х у у ОН ! «іх х С: ні Я ї КМ Я Кох гЯх. З я БЯ Я м. ; і Мен ооо К у; в - ; БОБ Ж М Е; г о. ! В жаов вето ІЗ : У ! ШОН ЕКО ия п и о. Б ХУВОНХ ВО ГИ о Я о | ОБУ Е Я о х ОКХ СІ ТО БО г. '' о | о Е БОЯ ОК КО Бо В БАК я с о не ч о : ВО я ОК сок: Я о. ом ткх, Й во ея ом лику Я еко Ж о . вваих Її Не ПЕ У я хе см Усе. БУХ | і. о | МИ Е я щ : Б о | З ЕЕ ПО БУ і
М о. | ЩО У МО У !
; я. | і по що ВО т. Ж Код, сх В С Ж НК Я нта о ЕЕ ВЕК Бе М Я . я ОК кахох Я що МА Х як ПО з ях ко й ее со М Ох ОК КУ ТхВЕ о се х до ря МК ох ЖЕ хх ЗХ ме КК й г Я що БУ о о й Я Я МК КО ОО Ех о я! | що хз ОКОКОмЯ Ми ко сек с В ох їх КУ м К о | о Б ПОВ ДО МОЖЕ ЮХ нання МОМ МКК ВОМ СХ о КОХ МО ха що Еко Коня Я Дн як Тих о о Я Ох КО а чи» то гом, Ук х С кн Я БО З с з Хо о В я ВО ОО ФІ як х і ки Бк леї: я их, схе. Й ОКХ КИ о
З. Зх Сх о Си КУ м. й Я КИ В Я БО о. й Я «: ї лКАХ. ЖЕ те КУ на й Є ХМ о й. з Вей З я ше мА ща з ех «о хе. « й у Ах ; є ха мк хе КУ як ВК с о з | Км с де ще Ай З К- ; ) дк чо : ; я ві. еВ, Зо АПОСО Я ЕЕ ОО. х 200005 с. ж ок о о- ще жо 10000 нн те МОЗ і й й й ж й и кв п и и и НН НА КУ КИ МК й «і ща Ко, о и М М рек ши ши и А ЩА ше и а я. Ка че пі ву я що ще - с Бу кв меш ще" а п о У Ко ми М Я АЖ ще Ко а Ко щі воша и В Я и ше М МИ же щи Ше ШЕ НИ шк ШЕ МИ ШК ке ее ше» ее Я Ше НИ З и АН А а а ко се у Ка ня о ше ш в;
Фі. В. ВУ 40004 В зобов з З00004 ш дк яке й 80000 ЖЕ с. жо 00003 У я шо о б ее се и ОК КИ ж а КОС соб а «Ко Мо ши ИН сок ШИ МИ са ми и М ШК КЕ а Я ої шк ши и ШЕ Ше:
и. и Ше чЯ мк що Й с І ше ік ді Сг АН м вів. 26, де й е 30000. й Й ж м не - т ме т Її шо шини й же зе ! я 5 Б МУ
- . и й її її и: Ж вени. й й ЕЕ ВО ОХ Ов ЕМО МИ ПАСКИ Са а А ВИ НК Я а КУ КУ КУ КУ Є МОЖУ: о ши кА С Не М ек: й и ки ши ши Шк ши ше ше ше и сш и А и ШО НИ ЗА м и Ме ЗШ Я м ОН ХАТА, ех и но о ие ен м сс ж.
КВ. с с х 200005 о ': о во ж ше ші ї- «поовя їй її її х. ди: Не ТО КОЗИ ше У ОА БУ ен нн ення и нн «м ОН ЕЕ КІ пк и ши, Ши ШИ ОО а НАША и ие ше ше я СИ СИ ке а ШК и Ле МЕ ой ше и с 7 З Я ее и Ку ШИ и ше Шк КК ДК с й щи нюх о, КИ КО АКА АТНМ щи а но ши ке ще ее Не со
Фі.
З дк 4 З ке му т гук ох вх ; 5 БІО У ОА КМ ОВА піти В 5 КО я и Є ще ОКТИКВ ОО ї пеки Ким ект сітввз5 У тя ЕУОІОЮВОАЕУЮКРОВВЬКІНСКОВИТВКХ пізня УМ УСС У В Вова М Ж дочия сек нео ккех мВ я ОУуМІлК КЕ сів УМХ 55 ВУШОК ОЕМ ВКМ ОЕ МІЛВІЗЕ УК 55 УЮ х ТВО Мо ЖЖ ОН ЕАВУКУВОКВ КІС КОИУВВХ Ви мВ А ВИ САКУ КК ОК КК М пон М сх й з.
ОТ Кортик й 5 ШОУ ОЛЕСКИВИКОКІВОКИоиХ сттавзаив он а ЕШОСБУЧОСАЕУККВОВОВБКІВОКИО ТЕБЕ ОЕМ ох ж полози рУ милу сутвові ши чя ВУСІ ОА КУККЕСВЕК ВОК сти ца ик УМОВУ Е: ЗУ М ТАМ Ся хх чи -УЖ. х а Мох шари т так дл успиА КОКО МАТЕЯ В я БУ Й МК ВКМ МК КТ КВ ЕМ КІХ і; мА ВВЕ М ЖЕ зак тннрЕВрКІ ККУ В Х ї4 В 45 УСБУ СИВУ ЦЕВЬьКІССКОВОКОЕЕ ітд и АВ УВУ КЕ ЗЕ де щачх дО ее вон а ств; ва ЕТО САБУККЕСВВСКІВСКИВИККХ візвзаза Ук ак ВУДКУ АВУККЕКО : по ма с ІД ож жк маш ШИК а асики СІТІ УВО УС АВУКАВОВ КІНО КИ и шале УМ Уж. . " Еш кто ши Що Щ Жожок жо ж можок ок ж жому ж жожкВжх я Ся 31 ДІ зх ; Жх Що суто кчКУд т ЗУ ту вила У АХ Зенон о Е НОМ х АТ У МЕТУ УХКИХ дання пр КК м пек ж ах ен в в ИН НА пт М 5 ВОК ММ КК З ее и вв аж раю Зк УК пане МК ТИХ к я меш Мох соти ня МКОЗе а Іво хн 45 Он нен НН Ме ЕК ОК ВАМ ж о стру ШЕ осв ким пив пІзцо ув ах ЗХКІСНУМОМесЕоКиМОоІМЕННЕМКаЕ маІЇвЕВ УК ОХ он Й пощеушмия тег У яз ЗІМІСМККОКРЕЬКИМОХ СХ ІВХ тітці: У а ХЕ СКК УК КЕ РЕЯТ сем АОС ХУ КВК КУ От ЗЛУ потккки и МУК Маша Х сх сет. хх ОМА ЦИХ ХАТКИ КИ Ве ХХ планом т дае тентом вт Е г ще м а лемури КК х СІЮ ми 5 ІМК Ме КУМ БЕОБЕВЕВЕНЕ Сет с ще Тижня с с ех у уУюІТВІЗХЬ им ; ізо У я КІСКИ МО ОАЄ и М ЕОЖУ КОКОС ЕИМ жна я ли АК У СЖОх ижх у ие ТР х й ав ПЕОМ ЕК СІіТВиВ УМ 8 хх ух В Й ВО і ин Я шли ча.
МИ ще де КЕ шій су зони СЕ ас . сем кн о й день ке й Що І -УжшкМкХкхКоиМУжЖЖКАОХХ дек р стар юку ЕК ча і. З ях Продевження щі со жа З тех Етюьи їя х кож печити о В п ш е МТ УК ИДТх УТ СІСТИ ОЛЯ з чаш мттовлшито татко ав У ЗМ Ве у а В НУ пот и Оп МК т у туди ВК т ви КВУ ех пак ММ Я пижма АН злочи тЕтуєх то СУКА В В ТА КЛ Ко КК В ТИ КТ пат Ми 4 ЕБЕКОНИО ТІК КИ КУ є ув тк им дж им ку и МКК в ми УКЛ хх МАЛО ШЕхІ Ах о МЕ ЛЕ Ще КОНЯ ПАЛКЕ х ІВ МУК КАВА пт смуг чи а пості плату тах г мих ща аж ОХ БИ ЕЕО ІВАН ТАЙ пе АЙАИ НЯ. МАО плоским ам МК, мису им и Ми т КІ зи пли з ах дише АТАК о пАЇВшЯи ММ ВО ДЕШЕВА ОКА я Ка з ій ке оУЖЕщок и ЕЕ КК супи пути т о В Кр и и Кім ЕТ ши М лу и ВН ОО ех сш в дум до ТІК путі МАУ КК МАО ЕЖЕОЖЛЮ УТ КО шЕЕСНК УТІК АК КА тів ку ав кс утро тут щит им т прю А М В ХМК АД ЕМ МЕККА АК ИЙ ж ДАМА сеча змо п р ж в и Ти им м В шаксмиа Ми 5 МИТ ВО АХКЕКИМНЕАНА УМ УОЗ КИАКЕ аж ЖЖ Ж иЖ ою ЖК ЖК ИК Ж Ж ЖК жя Я те здо хм тиху Ус УхТиВ Ту Кт КЕ ВИК од МАЙК МАМО ОСУУХ ЯКЕ ЮА ТУ СУА МИ ММ ан М А М АД дл лях ПДХМТА КАХ АКА школу а ж зрадив у им ми ди пи хо жкУ т Ноя а по ТОМАСА КУКИ плоттю хх КИ ЛІРИКА ТЛ ТИ ТИ УТ М ЖЖ зп м а и а КО ее ПАТО УК Я ТАБУХСАКУК УМОВУ постер жа мих ств ок ух де У ШЕУ ЯМ МЕ ТАМЕТІАЛУЕВУКОрно и тя ку ЛЕН я плід у ЕМО ТВ Кит Кекс КН КК ХХХ МКМ ММ ЛЕМ МАМ КАТИ аж труть люк и мехих км ж Ми ик М му о БА ТАЖЕ СЕУ М ЧЕ ке а НК Я Я ее КК п НН хОЖІу БУ НЯ пожити ВЕ ЮК ЖЕК ХА ОК З ЖІ жд ЕТ ВН еВ ИН Худ А х5 ми о тудуєти й жімі й Ком уд ух Ки тя пд луки МК Ки ВХ Я УК У пьіІвриа чи ВВ ВН Ов В а ВЕ тел теру ви КЕ сам ім ШТУК Іо СТВ За УК пе ДУ ДМК ВІВ ХМК АХ ХИАЕ се ту п мож блем ж сі и хг т ик ий Метт жк хтів ож моде Ого КИ тт жкау Кн ХЕ ис А ШВСМ УТМЦМІМХ МОЖ жом юс мо ЖЖ ж жо Ж Ж ЖЖ ж КОЖ х
Біт. Ж. МЕ етики им ет ЗИ СА ж ТК УК комі нжнИомсниа пі десь С ЕВК Ж ОМО ОТА пут ут ТМ вит Ка КК Р ТД ВІК ди ех пиди и Ку шШУЦПІ МОСКІТНІ и докт тк МК Гм Ук ти ЕТ тку КЕ Кт в мк ек ДЕ пере Ве еВ и ВОНО С В па В ЗВ В ОН ЗВ ЕК В З ЗУ т діти їй Ам ли хх птхуєт см о де жі НЕВИиВЕО ПАМ Б, М Ос хх, НІЛЗІ смчзй милі си мм ЗСУ ЛИ ХЕ ЕХ пожвиттт фебим т хуя й ПІ ІМК 3 ВКМ 5) ПИТНІЙ тиж еле умеа в т ПИТУМИ опеБлллантш ие. т МУ МрМІДМУЄМА ШИ бе ст та Ж ОІМРшОБгиУБЕНВКОО ІБ ТО; Бу ВИКН еМУнУХУТХМА ПЕНАЛ МЕН МИХ» пшшАУЖАОТУМ. КІ га 113 ЩІ ТЕЛ УКИОКОХ о БОМ: ТІ, пе ї сегмоєківум о схстіщемі КЛ ока ТИ х. ТІМОТІ ШУМОВИХ Ще; жу СКМ Ак
1 за їй с СУМ дк жди мм не Кажу и пази см МО ВЖК ев КК КВН ЗО М ин м сту микесн й Пе З й У я-е Хр сиот ВІ М и В КІ Сави У ЗІ ПІУКТОКРОСОКУЮ ОК ІМК лк Тс мих ее п, мух ОК млЄЖ кжемкт ох тиви МЕТИ м п ПІСОК ОАМО ВОВК МОВИ шим ка г ші М ж им КАСКИ х МИ Ще т, сек акт дич тов им ЕК ех тів ж хх ПІЧМТСОВОО ПАМ МОВАМИ ЗМУ о ве с с ШК м Ах шин кнАТІНСКН Я ше тю мето ми ус риатІнковоуУї, пня У МІМІКУ мьоигМ ТМ УМА ж ММ ЗЕ п ще ще -е тугу т. шу ЕК тм а Ут, : то ще Емо ква меш, шШіваяаЮ Мой БЕУМІШНКОЧОАУВОККАВКІВ КОТ яХ то кожи ІМТ АКВА ТІМСКАОКІ, спілвлаз у ла ПуІУМІСсаВОМеАУВцЕНАгІМС УЗА ЕМ дек по у пк ум и и у - т Ве а АЙ січ о ви ВЕУМТОВВОВВУВКОЕКАТАНСК ВИМ, хх УК Ем х КУТУ я В й Ха совет кю Юа тки, ПЕВ У Б ПІТ СЕРОМЬАУВБОКАТІМСКВОО ПІ Мь ВЕ ж | ев о у з МИЛЕ АНеТИКАТІКИ КЕ ШІ ми й ПЕЧУМІШОМОКАМВБИККАКАНСКУВОЕ с У МОЖ ККУ ККУ МО м ММ У Я не КИ Що Жжжжж ЖЕК кю я ж до по ї тя ц Я я дк
-. хом им У ек утм и УК ПОВИ У Зо БеОБІБІ МКМ КК КахТВ мон а ув кукі жі дк кну вк ср Уроку. су шк ТЕМІ усно ЕЕ ВК пе УМ ЗХ ЖК ВЕ ХНВМХУЙ ХОСЕ ЕКОЬХ ТАК СЕЛ УкоОЯ о ща піни йа У 55 ООЖННОМаСАНу ОКО ЕКЬиКО в КВ у шт с шк тупу т ту ВХ 7 сх З ЕЕ ТМ ТК ТІ УМХ ЮК пІвиа м БВ ПОЕТ ТМТЬАИХ США ЕВВИМІ ЛАСК КИ кон ов ях тиж Ж МК К попи тон ди ній т ще еру ее тт ов . пе ТуНомтМкАну спри вІнваКЕ ПЕТ М 5 УМОВУ КИЕВ МА Ї: Бай Ух т же соколи лька люють Й ПЕ ноасьсованки Ніну од туя ЕМО Ху кими я М КАН СІМ УМ ої МЕТА КЕ КоОА ШВА Я пітТтщиА МІ З СЗКОК ВНУ А я ТКА ЖЕ я ЛИ лм Я ЖАТЬ кю ко й й дат й ечеакчекя пи тиск и щі ПОЕТИ МО тк пів м ах МЕКОМКЕМИ и АСК КАШІ пово ноя ХЕ дп о В галу Поу м оон мусив УА пісних а м о ДЕК МИМІНКК У шик ЕХ Мой Ух Й ЩІ АЖ ЖЖ ЖЖЖЖАЖЖТВВМ ї ою МК МОЗКУ и. ТАТ СКМ АНУ ОО ВВА пітЕоза м БЕ кеВ МІМКІ Кук ХОАБТХ че УЖ доля, хх по я НИ й ех УМ я тя че Тут т умру хо ех КУ Ін пато я. о ВЯКОМІШКОАМУ КРОТИ ВАМ ОТ АМА 7 тт САДКУ Анна ; М о : т т х. жо гжоОожем Км ою вок си ож ж ке аж сив вує фі. 5 я прОодОовженни а тр ії а часту тья хи Ех пучку це руку и С куки дих піл ьо ЕОвиновЕВО ІМТ САКУХ стік р ж Деу тих пумскиун уу вче в тя КАЖУ В піз Б ЖЕО МІК ЕВООИНОКЕТКІ А ВИА сту суду Жар щих поро п да ПЕВНЕ о о ЕК ВН МАО Я Я тт туп лев ще дет тутує и ен ту ВИК т Ку В ПАЇВ МЕ 5 о о о ФІОЕ ЗВ МЕ КЕ КІВ ож тує ккд ву пу о и мур жи р КУ Ж У ях ке М МО ВИ У Я шк тка ювя жк ДЕ лсутую п сиву пи Кур т РК УАДУ шАЗКЕЯ БО ІК шОовИшаТОЕ ть помер уж вк но Акти гуюмЕту у ж фот ПК пава шЕ Б5я ОН и НИ и и КН о зх очи Му я полічити КАТЕ МЕ БО БЕСУВИВЕВЛМНОТН ТІМ пе жу яко смути и Ех КК Іва ОКУ Осика Ми КМ ШОКУ з кажу и ролу продихи т ДАВ и Ер поря КВ піти ЗК БЕ вишки МОУ д шк ня й й око мом ж ою ЖК ЖМоК ж КО ЖОК ЖЖ доОж ов Ж КОКСК В щ 115 сп зак я жк жа кв пам и пе пив ие що оз МЕ З БО УМХ перси за ця джкажеи ик Ко и о МН піни м УХЕЦОВСЕКЕКООУКУВК нин о Я куми ук мА Ох ЗЕ по У УЖЕ ЕК К а руту аж шо хатки ю ку думи Кіз УВО ХК МК ТЕО ОЦ ТКУКІК пе тут Б сто Щд стуки у вир кт піч Б о Сак а но В Я тертю ж т о ар я ШЕТБЕЕ МОЗ ДСО МИТО сивая ме аа УЖ ОНКО КВТ КОСИТИ В. віч шк зам м и пит атаки УВО Ух КН ВЕТЕОСТКТВІК рез тер у ОО ОН НО піІлва і ки УЖ ЦО т ке Тахти содою ву до шити Мі ще ТЕПЛОВЕ ТЕСТ ЕКУВІК Ж око х шо сж Ж Во жк ож ат, ША. сит ескімо: уми их тічки ху загін. КОМИ КТ ха лу шЖь»ь аЖНОСВОШУСВИ ОЗОН ІТтТЬ ШИ БІ ОМ БІ тУУЛУМІ ат дет МАМ и рити Умов ХО У ВИХ ПІчМІДВКМЕ КУСОК КЕ закЖамк: МАМІ КВиЕКИВІХ У Отак р и ро В МИ ми тити мо М МУ ему ОО и ВЕ КК У ЗИМИ еру иа жо ХМ КОСИ Ус фл Мамо т «йо уж М ко ЯВЛЯВ ТОНИ п; їу МОЗМ ОМ Х: шБляє СО Ху Б. Бош Ку як смктрххстх схеми ож У НЯ ЕТИКИ ШОВК ОЮ., Ж М» КОМУ ХІ щк тати пливи п о те З хм Що Ж сплждж СЦЕНИ: Я; Ж и Ж ОО Ж М, МО ВИМ ХУ: з РУ, о ень . В ГА я ТК жнкя Бач Ха мишей М. М,» це Ковш їе Ж жид ти о штКиНк М й хо посруютю ТЕ шо МОЖУ КЛЕМ ТЖК Ха ож Мі тую СМ ОД ІЕ че що ники С КЕ г» же, її Ж МН ЛШ ге Ж х СТАНУ З секики ик мою х ол Же ДЕ УЗ Я. ме Мом Мі Ха пвияж СМ У. Я Лу ї. Б, ЩЕ Кі Ба «еФУтсдіми тт у з т хе з ШИНИ Же М ЛЯ ІМЩИМ ЖИ Аж о йуУ хх АОМИВ УООХ нн НН ЗХ хі: ЖАВ МО Ж: Ху МОВ ІМ ваг. БВ. ТЕМІ ухмеенисУсва ТНМОЛЕДОИВМЕСжвІ КУБОЦНУМХ КІМ аМкамМка и ЇШКО ІВ ОМ ЕХ, я Ха мрлне ше ою Ха ОХ ОВО Хе йвинш сома б. бе Боба ї; Ха валик: сойзш бе Ж, Ж. Ж ВЕ У; Ха мали «ПОЕМОЮ ОЇ, Ж) Бу Лу Ж М, В щЩОО М; 4
Ж. шнидж си жу й. ще СБ ОВТ БІ БОСПВЖ хпмоеншеюва КиМОеМН ії шоу» МІАНТЕК ІОБ ЩО ОХ М, пе Ж маддю ОО Му М. У Ж, Ж ЗО ПО МАУ кожмевоисна сені денані сте СК какзникак БМ ЛОБ: 73; Хі пани ОМ Ж, Же б ОЗ Мо Ха ШВІІ НОЮ Ж дл» МОБ ЖЕ Ха Вам шою Же Ж. б Ла Жу МОЗ М; Ха аляш шин М, її. ХУ» Же Б ощОом пу Її Же маляжш сої Б, Ж. й оцИк Ту о
Бі. 7, шк и в С рнинненя нен | шум й рмтннннтнятнн
Я. ОМА 85 вва Н-А Я КВ ІОВ оо---х ВОЗ Женя ЩО бен ВК г» Я Тости М Пожжкяиежк ОН поки Що фттттттттттттнтнння х дит тяж, То ДА, рова ве пи Н ххх Н Я ит я о ТІЇ ї р х Й т : я Н ОВК он КЕ ох ої МОВ, ОБР нн ВИ СУ Я ОХ ШО 0 : НН КИ т. Її я ЩН е сь хх Н т 1111111. Ух : Б их о. ОМ НЕ ЗЩН ОВ . пн КЕ дин Обох в Кочан ект
UAA201606000A 2013-11-06 2014-11-06 Антитіло до ссl17 UA119973C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361900596P 2013-11-06 2013-11-06
PCT/US2014/064302 WO2015069865A1 (en) 2013-11-06 2014-11-06 Anti-ccl17 antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA119973C2 true UA119973C2 (uk) 2019-09-10

Family

ID=53007215

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201606000A UA119973C2 (uk) 2013-11-06 2014-11-06 Антитіло до ссl17

Country Status (32)

Country Link
US (4) US9944697B2 (uk)
EP (2) EP3466445A1 (uk)
JP (1) JP6556742B2 (uk)
KR (1) KR102331054B1 (uk)
CN (1) CN105722531B (uk)
AU (1) AU2014346770B2 (uk)
BR (1) BR112016010071A2 (uk)
CA (1) CA2929166C (uk)
CL (1) CL2016001081A1 (uk)
CR (1) CR20160187A (uk)
CY (1) CY1124445T1 (uk)
DK (1) DK3065774T3 (uk)
DO (1) DOP2016000105A (uk)
EA (1) EA034655B1 (uk)
ES (1) ES2884255T3 (uk)
HR (1) HRP20211234T1 (uk)
HU (1) HUE058272T2 (uk)
IL (1) IL245488B (uk)
LT (1) LT3065774T (uk)
MA (1) MA39090B2 (uk)
MX (1) MX2016005982A (uk)
MY (1) MY192757A (uk)
NZ (2) NZ758354A (uk)
PE (1) PE20160856A1 (uk)
PH (1) PH12016500826A1 (uk)
PL (1) PL3065774T3 (uk)
PT (1) PT3065774T (uk)
RS (1) RS62373B1 (uk)
SG (1) SG11201603231XA (uk)
SI (1) SI3065774T1 (uk)
UA (1) UA119973C2 (uk)
WO (1) WO2015069865A1 (uk)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015069865A1 (en) * 2013-11-06 2015-05-14 Janssen Biotech, Inc. Anti-ccl17 antibodies
US11104727B2 (en) * 2015-10-14 2021-08-31 Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd. Anti-canine TARC antibody used for treatment and diagnosis of canine atopic dermatitis
WO2017079369A2 (en) * 2015-11-03 2017-05-11 Glaxosmithkline Llc Novel antibodies
HUE064791T2 (hu) 2015-11-25 2024-04-28 Visterra Inc APRIL ellenes antitest molekulák és alkalmazásaik
CN108250290B (zh) * 2018-02-23 2024-03-12 上海捌加壹医药科技有限公司 Ccr4的n端重组蛋白及其用途
WO2024127277A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Method of treating pain with an anti-ccl17 antibody

Family Cites Families (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7709A (en) 1850-10-08 Chas S Gaylord Improved spring-grapple
US226A (en) 1837-06-03 Samuel goss
US4683985A (en) 1985-01-04 1987-08-04 Dresser Industries, Inc. Lubrication system for a vertical gear unit
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5869620A (en) 1986-09-02 1999-02-09 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
ATE87659T1 (de) 1986-09-02 1993-04-15 Enzon Lab Inc Bindungsmolekuele mit einzelpolypeptidkette.
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
ES2313867T3 (es) 1991-12-02 2009-03-16 Medical Research Council Produccion de anticuerpos anti-auto de repertorios de segmentos de anticuerpo expresados en la superficie de fagos.
CA2150262C (en) 1992-12-04 2008-07-08 Kaspar-Philipp Holliger Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
EP0731842A1 (en) 1993-12-03 1996-09-18 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
AUPO591797A0 (en) 1997-03-27 1997-04-24 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation High avidity polyvalent and polyspecific reagents
US5989830A (en) 1995-10-16 1999-11-23 Unilever Patent Holdings Bv Bifunctional or bivalent antibody fragment analogue
AU2246597A (en) 1996-02-12 1997-08-28 Schering Corporation Mammalian dendritic cell chemokine reagents
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
US6818749B1 (en) 1998-10-31 2004-11-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Variants of humanized anti carcinoma monoclonal antibody cc49
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
AU2001273549A1 (en) 2000-07-18 2002-01-30 Geoff D. Koch Remote control for a drilling machine
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
EP1916303B1 (en) 2000-11-30 2013-02-27 Medarex, Inc. Nucleic acids encoding rearranged human immunoglobulin sequences from transgenic transchromosomal mice
CA2491864C (en) 2001-07-12 2012-09-11 Jefferson Foote Super humanized antibodies
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
WO2004111233A1 (ja) 2003-06-11 2004-12-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体の製造方法
EP1870459B1 (en) 2005-03-31 2016-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
JP5474531B2 (ja) 2006-03-24 2014-04-16 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 操作されたヘテロ二量体タンパク質ドメイン
US20090182127A1 (en) 2006-06-22 2009-07-16 Novo Nordisk A/S Production of Bispecific Antibodies
CA2681974C (en) 2007-03-29 2019-12-31 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
JP4341704B2 (ja) 2007-07-12 2009-10-07 トヨタ自動車株式会社 ハイブリッド車両およびハイブリッド車両の制御方法
GB0718167D0 (en) * 2007-09-18 2007-10-31 Cancer Rec Tech Ltd Cancer marker and therapeutic target
US8748356B2 (en) 2007-10-19 2014-06-10 Janssen Biotech, Inc. Methods for use in human-adapting monoclonal antibodies
CN101970730A (zh) 2007-12-19 2011-02-09 森托科尔奥索生物科技公司 通过融合到pⅨ或pⅦ来设计和生成人从头pⅨ噬菌体展示文库,载体、抗体及方法
HUE028536T2 (en) 2008-01-07 2016-12-28 Amgen Inc Method for producing antibody to FC heterodimer molecules using electrostatic control effects
SI2274008T1 (sl) 2008-03-27 2014-08-29 Zymogenetics, Inc. Sestavki in metode za zaviranje PDGFRBETA in VEGF-A
EP2282769A4 (en) 2008-04-29 2012-04-25 Abbott Lab DUAL VARIABLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND ITS USES
US20100261620A1 (en) 2008-10-14 2010-10-14 Juan Carlos Almagro Methods of Humanizing and Affinity-Maturing Antibodies
US9067986B2 (en) 2009-04-27 2015-06-30 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
GB201005063D0 (en) 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products
WO2011056997A1 (en) 2009-11-04 2011-05-12 Fabrus Llc Methods for affinity maturation-based antibody optimization
EA201890907A1 (ru) 2009-11-30 2020-04-30 Янссен Байотек, Инк. МУТИРОВАННЫЕ Fc АНТИТЕЛА С УСТРАНЕННЫМИ ЭФФЕКТОРНЫМИ ФУНКЦИЯМИ
US20110206672A1 (en) 2010-02-25 2011-08-25 Melvyn Little Antigen-Binding Molecule And Uses Thereof
JP6040148B2 (ja) 2010-04-20 2016-12-07 ゲンマブ エー／エス ヘテロ二量体抗体Ｆｃ含有タンパク質およびその産生方法
JP6022444B2 (ja) 2010-05-14 2016-11-09 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション ヘテロ二量体タンパク質ならびにそれを生産および精製するための方法
EP2420253A1 (en) 2010-08-20 2012-02-22 Leadartis, S.L. Engineering multifunctional and multivalent molecules with collagen XV trimerization domain
KR101603001B1 (ko) * 2010-08-25 2016-03-11 에프. 호프만-라 로슈 아게 Il-18r1에 대한 항체 및 그의 용도
US8394378B2 (en) 2010-09-27 2013-03-12 Janssen Biotech, Inc. Antibodies binding human collagen II
JP2013545440A (ja) * 2010-09-27 2013-12-26 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド マカカ・ファシキュラリス（Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＣＬ１７
DK2635607T3 (da) 2010-11-05 2019-11-18 Zymeworks Inc Stabilt heterodimert antistofdesign med mutationer i fc-domænet
RU2620071C2 (ru) * 2010-11-17 2017-05-22 Чугаи Сеияку Кабушики Каиша Мультиспецифическая связывающая антиген молекула, которая обладает альтернативной функцией к функции фактора свертывания крови viii
US8790651B2 (en) * 2011-07-21 2014-07-29 Zoetis Llc Interleukin-31 monoclonal antibody
US20130171659A1 (en) * 2011-12-28 2013-07-04 Abbott Japan Co., Ltd. Methods of prognosis and diagnosis of rheumatoid arthritis
WO2015069865A1 (en) * 2013-11-06 2015-05-14 Janssen Biotech, Inc. Anti-ccl17 antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
CA2929166A1 (en) 2015-05-14
US20180171007A1 (en) 2018-06-21
PT3065774T (pt) 2021-08-31
EA201690942A1 (ru) 2016-09-30
SG11201603231XA (en) 2016-05-30
US11414484B2 (en) 2022-08-16
PE20160856A1 (es) 2016-09-03
CL2016001081A1 (es) 2016-10-21
EP3466445A1 (en) 2019-04-10
US9944697B2 (en) 2018-04-17
EP3065774B1 (en) 2021-05-26
US20210017267A1 (en) 2021-01-21
US20220348647A1 (en) 2022-11-03
RS62373B1 (sr) 2021-10-29
MY192757A (en) 2022-09-07
MX2016005982A (es) 2016-08-11
LT3065774T (lt) 2021-09-10
EA034655B1 (ru) 2020-03-03
JP2016537024A (ja) 2016-12-01
IL245488B (en) 2020-03-31
CN105722531B (zh) 2020-03-06
EP3065774A1 (en) 2016-09-14
NZ719506A (en) 2022-09-30
CY1124445T1 (el) 2022-07-22
EP3065774A4 (en) 2017-06-21
MA39090B2 (fr) 2021-10-29
JP6556742B2 (ja) 2019-08-07
DOP2016000105A (es) 2016-10-31
ES2884255T3 (es) 2021-12-10
CR20160187A (es) 2016-08-04
BR112016010071A2 (pt) 2017-12-05
PH12016500826B1 (en) 2016-06-13
NZ758354A (en) 2022-09-30
AU2014346770B2 (en) 2020-05-21
CA2929166C (en) 2023-08-22
KR102331054B1 (ko) 2021-11-24
WO2015069865A1 (en) 2015-05-14
DK3065774T3 (da) 2021-08-23
HRP20211234T1 (hr) 2021-11-26
IL245488A0 (en) 2016-06-30
PH12016500826A1 (en) 2016-06-13
CN105722531A (zh) 2016-06-29
US20150125458A1 (en) 2015-05-07
SI3065774T1 (sl) 2021-11-30
HUE058272T2 (hu) 2022-07-28
US10829549B2 (en) 2020-11-10
PL3065774T3 (pl) 2021-12-13
KR20160077198A (ko) 2016-07-01
MA39090A1 (fr) 2018-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200308232A1 (en) Coronaviruses epitope-based vaccines
UA124734C2 (uk) Антитіло проти с5 і його застосування
UA119973C2 (uk) Антитіло до ссl17
CN104822705B (zh) M971嵌合抗原受体
AU2009296937B2 (en) Anti-CD147 antibodies, methods, and uses
UA126281C2 (uk) Антитіла проти сигнал-регуляторного білка альфа та способи їх застосування
CN102741283B (zh) 具有高阻断活性的抗-C5a结合部分
UA125382C2 (uk) Антитіла проти людського vista та їх застосування
CN104178491B (zh) 治疗性人抗-il-1r1单克隆抗体
UA127450C2 (uk) Рекомбінантний поліпептид, що зв'язується з cd123
UA127985C2 (uk) Сконструйований поліпептид, який зв'язує трансфериновий рецептор
UA128472C2 (uk) B7-h4 антитіла і методи їх використання
UA126441C2 (uk) Химерні антигенні рецептори, націлені на bcma, та способи їх застосування
UA103912C2 (uk) Антитіла проти ангіопоетину-2 людини
UA118950C2 (uk) Поліпептид, який зв'язує специфічний мембранний антиген простати та комплекс т-клітинного рецептора
JP6006404B2 (ja) 抗ＢＬｙＳ抗体
CN106413749B (zh) 新颖全谱抗登革抗体
UA125757C2 (uk) Антитіло до par2 і його застосування
UA125501C2 (uk) Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, яке здатне специфічно зв'язуватися з альфа-синуклеїном людини, його застосування та спосіб лікування синуклеопатії
TW201010725A (en) Anti-IL-12/IL-23 antibodies
KR20100014476A (ko) Ｃ형 간염 바이러스(ｈｃｖ)에 대한 인간 항체 및 이것의 용도
UA119226C2 (uk) Антитіло, яке специфічно зв'язується з axl, та його застосування як продукту для адресної доставки при лікуванні раку
UA118954C2 (uk) АНТИ-FcRn АНТИТІЛО
US20220251226A1 (en) Anti-bcma single domain antibodies and application thereof
HUE026089T2 (hu) NGF elleni antitestek és eljárás alkalmazásukra