KR20160077198A - 항-ccl17 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CCL17에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체 또는 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 이들의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

Description

항-CCL17 항체{ANTI-CCL17 ANTIBODIES}
본 출원은 2013년 11월 6일자로 출원된 미국 가출원 제61/900,596호의 이득을 주장하며, 이의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명은 CCL17에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체 또는 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 이들의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
항상성 케모카인, CCL17(TARC, 케모카인(C-C 모티프) 리간드 17)은 강력한 림프구 화학유인물질(chemoattractant)이다. CCL17은 T 세포의 기능 및 주화성 그리고 면역 세포의 염증 부위로의 이주에서 중요한 것으로 여겨지는 GPCR인 CCR4에 대한 리간드이다. CCR4는 Th2 림프구, 자연 살해 세포 및 iNKT 세포 상에서 주로 발현된다.
CCL17은 궤양성 결장염(UC), 아토피성 피부염(AD), 특발성 폐섬유증(IPF) 및 천식과 같이 다양한 기관에 영향을 주는 인간 질병과 관련되어 왔다(문헌[Belperio et al.,J Immunol, 173: 4692-469, 2004]; 문헌[Christophi et al.,Inflamm Bowel Dis. doi: 10.1002/ibd.2295]; 문헌[Inoue et al.,Eur Respir J, 24: 49-56, 2004]; 문헌[Kakinuma et al.,J Allergy Clin Immunol, 107: 535-541, 2001]; 문헌[Saeki and Tamaki, J Dermatol Sci, 43: 75-84, 2006]; 문헌[Tamaki et al.,J Dermatol, 33: 300-302, 2006]). 마우스에서, CCL17은 섬유증 및 천식의 모델에 존재하는 만성 폐염증, 결장염 및 주혈흡충증과 같은 다양한 염증성 질환 및 감염에 관련되어 왔는데, 이는 추측컨대 CCR4+ 면역 세포의 동원을 통한 Th2 반응을 유도함에 의할 것이다. CCL17의 중화는 A. 푸미가투스(A.fumigatus) 및 오브알부민(OVA) 천식 모델 둘 모두에서의 질병, 및 T 세포의 유입(influx)을 차단함으로써 유도된 간 상해(hepatic injury)의 P. 아크네스(P.acnes) 마우스 모델에서의 간 손상의 영향을 개선한다(문헌[Carpenter and Hogamoam Infect Immun, 73:7198-7207, 2005]; 문헌[Heiseke et al.,Gastroenterology, 142:335-345]; 문헌[Hogamoam et al.,Med Mycol, 43 Suppl 1, S197-202, 2005]; 문헌[Ismailoglu et al., Therapeutic targeting of CCL17 via the systemic administration of a monoclonal antibody ameliorates experimental fungal asthma]; 문헌[Am J Respir Crit Care Med, 2011]; 문헌[Jakubzick et al.,Am J Pathol, 165:1211-122, 2004]; 문헌[Kawasaki et al.,J Immunol, 166:2055-2062, 2001]; 문헌[Yoneyama et al.,J Clin Invest, 102:1933-1941, 1998]에 제시된 논문).
CCL22(MDC)는 CCR4에 대한 제2 리간드이다. 각각의 케모카인과의 CCR4 상호작용은 별개의 결과를 생성하는데(문헌[Allen et al., Annu Rev Immunol 25:787-820, 2007]; 문헌[Imai et al., J Biol Chem 273:1764-1768, 1998]), 이는 아마도 CCR4에 대한 이들 2개의 리간드의 결합 친화성 차이에 기인될 것이다. CCL22는 더 높은 친화성으로 CCR4에 결합하고, CCL17보다 더 용이하게 수용체 내재화를 유도하고(문헌[Baatar et al., J Immunol 179:1996-2004, 2007]; 문헌[Imai et al., J Biol Chem 273:1764-1768, 1998]; 문헌[Mariani et al., Eur J Immunol 34:231-240, 2004]), CCL17보다 더 용이하게 세포 부착을 촉진시킨다(문헌[D'Ambrosio et al., J Immunol 169:2303-2312, 2002]). CCL22는 면역 세포에 한정된 생성으로 더 제한된 발현을 나타내는 반면, CCL17은 비-면역 세포를 포함한 많은 상이한 세포 유형에 의해 발현되고 분비된다(문헌[Alferink et al.,J Exp Med 197:585-599, 2003]; 문헌[Berin et al., Am J Respir Cell Mol Biol 24:382-389, 2001]; 문헌[Godiska et al., J Exp Med 185:1595-1604, 1997]; 문헌[Imai et al., J Biol Chem 271:21514-21521, 1996]; 문헌[Saeki and Tamaki, J Bermatol Sci 43:75-84, 2006]). 실험 패혈증의 뮤린 맹장 연결 및 천공(CLP) 모델에서, CCL22는 선천 면역을 촉진시킨 반면, CCL17은 방해하고, 일부 상황에서는 기관 손상에 기여하는 것으로 보였다(문헌[Matsukawa et al., Rev Immunogenet 2:339-358, 2000]). 폐 침습성 아스페르길루스증의 마우스 모델에서, CCL22는 선천 항진균 반응에서 보호 역할을 한 반면, CCL17은 억제인자의 역할을 하였다(문헌[Carpenter and Hogaboam, Infect Immun 73:7198-7207, 2005]). 이들 2개의 케모카인은 Treg 동원이 CCL22에 의해서는 유리해지지만 CCL17에 의해서는 그렇지 않다는 점에서 Treg 항상성에 대한 차등 효과로 인해 국부 염증을 확립하는 데 있어서 대조적인 역할을 할 수 있었다(문헌[Heiseke et al., Gastroenterology 142:335-345,2011]; 문헌[Montane et al., J Clin Invest, 121:3024-30, 2011]; 문헌[Weber et al., J Clin Invest 121:2898-2910, 2011]).
접촉 과민증(CHS)의 동물 모델에서, CCL17은 FITC 또는 DNFB에 의한 시험투여(challenge)에 대하여 접촉 과민증을 유도하는 염증 반응을 개시하는 데 있어서 주요 인자이고, 이러한 마우스에서의 CCL17 녹아웃(knockout)은 하나의 기능적 CCL17 대립유전자를 갖는 이형접합성 마우스와 대비하여 심장 동종이식편의 생존을 개선하였다(문헌[Alferink et al., J Exp Med 197:585-599, 2003]).
CCR4 길항제는 비선택적이고 CCL17 및 CCL22 기능 둘 모두를 억제할 수 있다. 따라서, 천식을 포함한 다양한 CCL17-매개 질병의 잠재적 치료를 위한 항-CCL17 항체에 대한 필요성이 있다.
본 발명의 일 실시 형태는 인간 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 본 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하며, 본 항체는 인간 CCL17에 대한 결합에 있어서 서열 번호 45의 VH 및 서열 번호 52의 VL을 포함하는 항체와 경쟁한다.
본 발명의 다른 실시 형태는 서열 번호 1의 서열을 갖는 인간 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 본 항체는 인간 CCL17에 적어도 CCL17 아미노산 잔기 21-23, 44-45 및 60-68 내에서 결합한다.
본 발명의 다른 실시 형태는 인간 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 본 항체는 약 1×10-10 M 이하의 친화성 상수(KD)로 인간 CCL17에 결합하며, 이때 KD는 4℃에서 48시간 동안 항체와 인간 CCL17의 공-인큐베이션(co-incubation) 후에 0.05% 트윈(Tween)-20을 함유하는 Tris-기반 식염수 완충액 중에서의 용액 평형 친화성(solution equilibrium affinity)을 사용하여 측정된다.
본 발명의 다른 실시 형태는 인간 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 본 항체는 소정의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 형태는 인간 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 본 항체는 소정의 VH 및 VL 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 형태는 인간 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 본 항체는 서열 번호 46의 VH와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 62의 VL과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 VH 또는 VL을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 항체의 생성 방법으로서, 본 방법은 항체가 생성되는 조건에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시 형태는 CCL17-매개 질병을 치료하는 방법으로서, 본 방법은 그를 필요로 하는 대상체에게 CCL17-매개 질병을 치료하기에 충분한 시간 동안 본 발명의 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시 형태는 천식 또는 기도 과민성(airway hyper-reactivity)을 치료하는 방법으로서, 본 방법은 대상체에게 천식을 치료하기에 충분한 시간 동안 본 발명의 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
도 1a는 CCRF-CEM 세포에서 1 nM 인간 CCL17에 의해 유도된 주화성의 항-CCL17 항체 B302에 의한 억제를 나타낸다. B302는 C17B302이다.
도 1b는 CCRF-CEM 세포에서 1 nM 인간 CCL17에 의해 유도된 주화성의 항-CCL17 항체 B311에 의한 억제를 나타낸다. B311은 C17B311이다.
도 1c는 CCRF-CEM 세포에서 1 nM 인간 CCL17에 의해 유도된 주화성에 대한 IgG2 동형 대조군의 영향을 나타낸다.
도 1d는 CCRF-CEM 세포에서 1 nM 인간 CCL17에 의해 유도된 주화성에 대한 IgG4 동형 대조군의 영향을 나타낸다.
도 2a는 HSC-F 세포에서 1 nM 사이노 CCL17에 의해 유도된 주화성의 항-CCL17 항체 B302에 의한 억제를 나타낸다. B302는 C17B302이다.
도 2b는 HSC-F 세포에서 1 nM 사이노 CCL17에 의해 유도된 주화성의 항-CCL17 항체 B311에 의한 억제를 나타낸다. B311은 C17B311이다.
도 2c는 HSC-F 세포에서 1 nM 사이노 CCL17에 의해 유도된 주화성에 대한 IgG2 동형 대조군의 영향을 나타낸다.
도 2d는 HSC-F 세포에서 1 nM 사이노 CCL17에 의해 유도된 주화성에 대한 IgG4 동형 대조군의 영향을 나타낸다.
도 3은 100 nM 이하의 KD로 인간 CCL17에 결합하는 항-CCL17 항체의 VH 서열을 나타낸다.
도 4는 100 nM 이하의 KD로 인간 CCL17에 결합하는 도 3에 나타낸 항-CCL17 항체의 공통 VH 및 HCDR 서열을 나타낸다.
도 5는 100 nM 이하의 KD로 인간 CCL17에 결합하는 항-CCL17 항체의 VL 서열을 나타낸다.
도 6a는 100 nM 이하의 KD로 인간 CCL17에 결합하는 도 5에 나타낸 항-CCL17 항체의 공통 VL 서열을 나타낸다.
도 6b는 100 nM 이하의 KD로 인간 CCL17에 결합하는 도 5에 나타낸 항-CCL17 항체의 공통 LCDR 서열을 나타낸다.
도 7은 항체 C17B236의 에피토프(epitope) 및 파라토프(paratope) 잔기를 나타낸다. VH 및 VL 파라토프 잔기는 박스로 표시되어 있고, CCL17 에피토프 잔기는 원으로 표시되어 있다. 잔기 넘버링은 서열 번호 45(VH), 서열 번호 52(VL), 서열 번호 1(CCL17)에 따른다.
본 명세서에 인용된, 특허 및 특허 출원을 포함하지만 이에 한정되지 않는 모든 간행물은 마치 완전히 기재되는 것처럼 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시 형태들을 설명하기 위한 것이며, 한정하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 시험 실시에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및 재료가 본 명세서에 기재되어 있다. 본 발명을 설명하고 청구함에 있어서, 하기 용어가 사용될 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "특이적인 결합" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "결합한다"는 다른 항원에 대한 친화성보다 더 큰 친화성으로, 항체가 사전결정된 항원에 결합하는 것을 지칭한다. 전형적으로, 본 항체는 약 1×10-7 M 이하, 예를 들어 약 1×10-8 M 이하, 약 1×10-9 M 이하, 약 1×10-10 M 이하, 약 1×10-11 M 이하, 약 1×10-12 M 이하, 약 1×10-13 M 이하 또는 약 1×10-14 M 이하의 해리 상수(KD)로 사전결정된 항원에 결합하며, 전형적으로 KD는 비특이적 항원 또는 에피토프(예를 들어, BSA, 카세인)에 대한 결합에 있어서의 그의 KD보다 적어도 10배 미만이다. 해리 상수는 표준 절차를 사용하여 측정될 수 있다. 그러나, 사전결정된 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 다른 관련 항원들과의, 예를 들어, 인간 또는 원숭이, 예를 들어 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)(사이노몰거스, 사이노) 또는 판 트로글로디테스(Pan troglodytes)(침팬지, 침프)와 같은 다른 종(상동체)으로부터의 동일한 사전결정된 항원과의 교차-반응성을 가질 수 있다.
"인간 CCL17에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체"는 서열 번호 1에 나타낸 서열을 갖는 인간 성숙 CCL17에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "중화시키는" 또는 "중화시킨다" 또는 "중화 항체" 또는 "항체 길항제"는 임의의 기전에 의해 CCL17 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 억제하는 항체 또는 항체 단편을 지칭한다. 중화 항체는 하기에 기재된 바와 같이 CCL17 생물학적 활성에 대한 검정을 사용하여 확인될 수 있다. CCL17 중화 항체는 측정된 CCL17 생물학적 활성을 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%로 억제할 수 있다.
본 명세서에 상호교환 가능하게 사용되는 바와 같이, "인간 CCL17" 또는 "huCCL17"은 신호 서열 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 인간 CCL17 단백질을 지칭한다. 신호 서열을 포함하는 전장(full length) CCL17의 서열은 진뱅크(기탁 번호 NP_002978)에서 이용가능하다.
본 명세서에 상호교환 가능하게 사용되는 바와 같이, "사이노 CCL17" 또는 "cCCL17"은 신호 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 마카카 파시쿨라리스(사이노) CCL17 단백질을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "항체"는 넓은 의미로 여겨지며, 뮤린, 인간, 인간화 및 키메라 항체를 포함하는 단일클론 항체, 항체 단편, 적어도 2개의 온전한 항체 또는 항체 단편으로부터 형성된 이중특이성 또는 다중특이성 항체, 이량체성, 사량체성, 또는 다량체성 항체, 단일쇄 항체를 포함하는 면역글로불린 분자, 및 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포함한다.
면역글로불린은 중쇄 불변 도메인 아미노산 서열에 따라, 5개의 주요 부류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 정해질 수 있다. IgA 및 IgG는 추가로 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 동형으로 하위-분류된다. 임의의 척추동물 종의 항체 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 명확하게 별개인 2개의 유형, 즉 카파(κ) 및 람다(λ) 중 하나로 정해질 수 있다.
용어 "항체 단편"은 중쇄 및/또는 경쇄 항원 결합 부위, 예컨대 중쇄 상보성 결정 영역(heavy chain complementarity determining region, HCDR) 1, 2, 및 3, 경쇄 상보성 결정 영역(light chain complementarity determining region, LCDR) 1, 2, 및 3, 중쇄 가변 영역(VH), 또는 경쇄 가변 영역(VL)을 보유하는 면역글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 항체 단편은 VL 또는 VH로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; 힌지(hinge) 영역에서 이황화물 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(문헌[Ward et al., Nature 341:544- 546, 1989])을 포함한다. VH 및 VL 도메인은 조작되고(engineered) 합성 링커를 통해 함께 연결되어 다양한 유형의 단일쇄 항체 설계를 형성할 수 있으며, 여기서 VH/VL 도메인은 VH 및 VL 도메인이 별개의 단일쇄 항체 작제물들에 의해 발현되는 경우에 분자내에서, 또는 분자간에 쌍을 형성하여 1가 항원 결합 부위, 예컨대 단일쇄 Fv(scFv) 또는 이중항체(diabody)를 형성하며, 이는, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 WO1998/44001호, 국제 특허 출원 공개 WO1988/01649호; 국제 특허 출원 공개 WO1994/13804호; 국제 특허 출원 공개 WO1992/01047호에 기재되어 있다. 이들 항체 단편은 잘 알려진 기법을 사용하여 얻어지며, 이들 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 특성화된다.
어구 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체들이 사실상 없는 항체를 지칭한다(예를 들어, 인간 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 인간 CCL17 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 사실상 없다). 그러나, 인간 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원들, 예컨대 인간 CCL17의 오르토상동체(ortholog), 예컨대 마카카 파시쿨라리스(사이노몰거스) CCL17과의 교차-반응성을 가질 수 있다. 더욱이, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 사실상 없을 수 있다.
항체 가변 영역은 3개의 "항원 결합 부위"가 개재된 "프레임워크" 영역으로 이루어진다. 항원 결합 부위는 다양한 용어를 사용하여 정의된다: (i) 상보성 결정 영역(CDR) - VH 내에 3개(HCDR1, HCDR2, HCDR3) 및 VL 내에 3개(LCDR1, LCDR2, LCDR3) - 은 서열 가변성에 기초한다(문헌[Wu and Kabat, J Exp Med 132:211-50, 1970]; 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]). (ii) "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV" - VH 내에 3개(H1, H2, H3) 및 VL 내에 3개(L1, L2, L3) - 는 초티아(Chothia) 및 레스크(Lesk)에 의해 정의된 바와 같이 구조 면에서 초가변성인 항체 가변 도메인의 영역들을 지칭한다(문헌[(Chothia and Lesk Mol Biol 196:901-17, 1987]). 다른 용어는 "IMGT-CDR"(문헌[Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003]) 및 "특이성 결정 잔기 용법(Specificity Determining Residue Usage)"(SDRU)(문헌[Almagro Mol Recognit, 17:132-43, 2004])을 포함한다. 인터내셔널 이뮤노진틱스(International ImMunoGeneTics, IMGT) 데이터베이스(http://www_imgt_org)는 항원-결합 부위의 표준화된 넘버링과 정의를 제공한다. CDR, HV, 및 IMGT 도해 사이의 관련성은 문헌[Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003]에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "초티아 잔기"는 알-라지카니(Al-Lazikani)에 따라 넘버링된 항체 VL 및 VH 잔기이다(문헌[Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273:927-48, 1997]).
"프레임워크" 또는 "프레임워크 서열"은 항원 결합 부위인 것으로 정의된 서열 이외의 가변 영역의 나머지 서열이다. 항원 결합 부위가 전술된 바와 같은 다양한 용어에 의해 정의될 수 있기 때문에, 프레임워크의 정확한 아미노산 서열은 항원 결합 부위가 어떻게 정의되는지에 따라 달라진다.
"인간화 항체"는 항원 결합 부위가 인간 이외의 종으로부터 유래되고 가변 영역 프레임워크가 인간 면역글로불린 서열로부터 유래되는 항체를 지칭한다. 인간화 항체는 프레임워크 영역 내에 치환을 포함할 수 있으므로, 프레임워크는 발현된 인간 면역글로불린 또는 생식세포계열 유전자 서열의 정확한 카피가 아닐 수 있다.
"인간 항체"는 프레임워크 영역 및 항원 결합 부위 영역 둘 모두가 인간 기원의 서열로부터 유래되는, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 이 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, 불변 영역 또한 인간 기원의 서열로부터 유래된다.
인간 항체는, 항체의 가변 영역이 인간 생식세포계열 면역글로불린 또는 재배열된 면역글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터 얻어지는 경우, 인간 기원의 서열"로부터 유래되는" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 그러한 시스템은, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리, 예를 들어 파지 상에 디스플레이된 라이브러리, 및 인간 면역글로불린 유전자자리를 담지하는 유전자도입 인간 이외의 동물, 예컨대 마우스를 포함한다. "인간 항체"는 인간 생식세포계열 또는 재배열된 면역글로불린 서열과 비교할 때 아미노산 차이를 포함할 수 있는데, 이는 예를 들어 천연 발생 체세포 돌연변이 또는 치환의 의도적 도입에 기인한다. 전형적으로, "인간 항체"는 인간 생식세포계열 또는 재배열된 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과 아미노산 서열이 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 일부 경우에, "인간 항체"는, 예를 들어 문헌[Knappik et al., J Mol Biol 296:57-86, 2000]에 기재된 바와 같이, 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래되는 공통 프레임워크 서열을 함유하거나, 또는, 예를 들어 문헌[Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010] 및 국제 특허 출원 공개 WO2009/08546호에 기재된 바와 같이, 파지 상에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리 내로 도입된 합성 HCDR3을 함유할 수 있다.
단리된 인간화 항체는 합성 항체일 수 있다. 인간 면역글로불린 서열로부터 유래되는 인간 항체는, 합성 CDR 및/또는 합성 프레임워크를 도입시킨 파지 디스플레이와 같은 시스템을 사용하여 생성될 수 있거나, 또는 시험관내 돌연변이생성(in vitro mutagenesis)을 거쳐서 항체 특성을 개선하여, 그 결과 생체내에서(in vivo) 인간 항체 생식세포계열 레퍼토리 내에는 천연적으로 존재하지 않는 항체를 생성할 수 있다.
인간 항체는 프레임워크 내에 또는 항원 결합 부위 내에 치환을 포함할 수 있으므로, 이는 발현된 인간 면역글로불린 또는 생식세포계열 유전자 서열의 정확한 카피가 아닐 수 있다. 그러나, 항원 결합 부위가 인간 이외의 종으로부터 유래되는 항체는 "인간 항체"의 정의에 포함되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 항체를 포함하는데, 이러한 항체는, 예컨대 인간 면역글로불린 유전자를 위해 유전자도입 또는 염색체도입된(transchromosomal) 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체 또는 그로부터 제조된 하이브리도마(hybridoma)(하기에 추가로 기술됨), 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 단리된 항체, 재조합된 조합 항체 라이브러리(recombinant, combinatorial antibody library)로부터 단리된 항체, 및 다른 DNA 서열에 대해 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"는 단일 분자 조성의 항체 분자의 제조를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "사실상 동일한"은 비교하는 2개의 항체 가변 영역 아미노산 서열이 동일하거나 또는 "미미한(insubstantial) 차이"를 갖는 것을 의미한다. 미미한 차이는, 항체 특성에 불리한 영향을 주지 않는, 항체 가변 영역 서열 내의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 또는 15개의 아미노산의 치환이다. 본 명세서에 개시된 가변 영역 서열과 사실상 동일한 아미노산 서열은 본 발명의 범주 내에 있다. 일부 실시형태에서, 서열 동일성은 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상일 수 있다. 동일성(%)은, 예를 들어 벡터(Vector) NTI v.9.0.0의 얼라인엑스(AlignX) 모듈(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠(Invitrogen))의 디폴트 세팅(default setting)을 사용하여 페어와이즈 정렬(pairwise alignment)에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 단백질 서열을 질의 서열(query sequence)로 사용하여, 예를 들어 관련 서열을 확인하기 위해 공개 데이터베이스 또는 특허 데이터베이스에 대한 검색을 수행할 수 있다. 그러한 검색을 수행하기 위해 사용되는 예시적인 프로그램은, 디폴트 세팅을 사용하는 XBLAST 또는 BLASTP 프로그램(http_//www_ncbi_nlm/nih_gov), 또는 게놈퀘스트(GenomeQuest)™(미국 매사추세츠주 웨스트보로우 소재의 게놈퀘스트) 스위트(suite)이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "에피토프"는 항체가 특이적으로 결합하는 항원의 부분을 의미한다. 에피토프는 통상 아미노산 또는 다당류 측쇄와 같은 모이어티(moiety)의 화학적으로 활성(예컨대, 극성, 비극성 또는 소수성)인 표면 그룹화(grouping)로 이루어지며, 특이적인 3차원 구조 특징뿐만 아니라 특이적인 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 입체구조 공간 단위(conformational spatial unit)를 형성하는 연속 및/또는 불연속 아미노산으로 구성될 수 있다. 불연속 에피토프의 경우, 항원의 선형 서열의 상이한 부분으로부터의 아미노산이 단백질 분자의 접힘을 통해 3차원 공간에서 아주 근접하게 된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "이중특이성"은 2개의 별개의 항원 또는 항원 내의 2개의 별개의 에피토프에 결합하는 항체 또는 분자를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단일특이성"은 하나의 항원 또는 하나의 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "병용하여"는 기재된 작용제들이 혼합물 중에 함께, 단일 작용제로서 동시에, 또는 단일 작용제로서 임의의 순서로 순차적으로, 동물에게 투여될 수 있음을 의미한다.
용어 "벡터"는 생물 시스템 내에서 복제될 수 있거나 그러한 시스템들 사이에서 이동될 수 있는 비천연 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 전형적으로 벡터 폴리뉴클레오티드는 관심있는 단백질을 암호화하는 cDNA, 및 생물 시스템에서 이러한 폴리뉴클레오티드의 복제 또는 유지를 용이하게 하는 기능을 하는, 복제 기점, 폴리아데닐화 신호 또는 선택 마커와 같은 추가 요소들을 포함한다. 그러한 생물 시스템의 예에는 벡터를 복제할 수 있는 생물 구성요소들을 이용하는 세포 시스템, 바이러스 시스템, 동물 시스템, 식물 시스템 및 재구성된 생물 시스템이 포함될 수 있다. 벡터를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 분자 또는 이들의 혼성체일 수 있다.
용어 "발현 벡터"는 발현 벡터 내에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 번역을 유도하기 위하여 생물 시스템 또는 재구성된 생물 시스템에서 이용될 수 있는 벡터를 의미한다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 당-인산 골격 또는 기타 등가의 공유 결합적 화학적 특성에 의해 공유 결합된 뉴클레오티드의 쇄를 포함하는 분자를 의미한다. 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA 및 RNA가 폴리뉴클레오티드의 전형적인 예이다.
"상보적 DNA" 또는 "cDNA"는, 게놈 DNA에 존재하는 개재 인트론들이 제거된, 연속적인 엑손들을 갖는 천연 성숙 mRNA 종에서 발견되는 서열 요소들의 배열을 공유하는 잘 알려진 합성 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 개시자 메티오닌을 암호화하는 코돈은 cDNA에 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. cDNA는, 예를 들어 역전사 또는 합성 유전자 조립에 의해 합성될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "합성" 또는 "비천연"은 천연에 존재하지 않는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 분자를 지칭한다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 폴리펩티드를 형성하도록 펩티드 결합에 의해 연결된 적어도 2개의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. 50개 미만의 아미노산의 작은 폴리펩티드는 "펩티드"로 지칭될 수도 있다.
표 1에 나타낸 바와 같은 종래의 1-문자 및 3-문자 아미노산 코드가 본 명세서에 사용된다:
[표 1]
Figure pct00001
조성물
본 발명은 인간 CCL17에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 세포에서의 CCL17 생물학적 활성을 억제하고, 선택적으로 사이노 CCL17과 교차-반응할 수 있다. 본 발명은 항체 및 그의 단편을 암호화하는 합성 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 숙주 세포, 및 본 발명의 항체의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시 형태는 인간 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체이다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 다른 실시 형태는 인간 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 본 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하며, 본 항체는 인간 CCL17에 대한 결합에 있어서 서열 번호 45의 VH 및 서열 번호 52의 VL을 포함하는 항체와 경쟁한다.
소정의 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 항체와 인간 CCL17에 대한 특이적 결합 사이의 경쟁은 잘 알려진 방법을 사용하여 시험관내에서 검정될 수 있다. 예를 들어, 비표지 항체의 존재 하에서 MSD 설포-태그(Sulfo-Tag)™ NHS-에스테르―표지된 항체의 인간 CCL17에 대한 결합이 ELISA 또는 바이아코어(Biacore) 분석에 의해 평가될 수 있거나, 또는 본 발명의 항체와의 경쟁을 보여주기 위해 유세포측정법이 사용될 수 있다. 서열 번호 45의 VH 및 서열 번호 52의 VL을 포함하는 항체의 인간 CCL17에 대한 결합을 억제하는 시험 항체의 능력은 시험 항체가 인간 CCL17에 대한 결합에 있어서 이러한 항체와 경쟁할 수 있음을 보여준다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 다른 실시 형태는 서열 번호 1의 서열을 갖는 인간 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 본 항체는 인간 CCL17에 적어도 CCL17 아미노산 잔기 21-23, 44-45 및 60-68 내에서 결합한다. "적어도 인간 CCL17 아미노산 잔기 21-23, 44-45 및 60-68 내에서"는 항-CCL17 항체가 서열 번호 1의 잔기 21-23의 아미노산 스트레치(amino acid stretch) 내에 존재하는 적어도 하나의 잔기, 및 서열 번호 1의 잔기 44-45의 아미노산 스트레치 내에 존재하는 적어도 하나의 잔기, 및 서열 번호 1의 잔기 60-68의 아미노산 스트레치 내에 존재하는 적어도 하나의 잔기에 결합함을 의미한다. 항체는 잔기 21-23, 44-45 및 60-68 내의 하나 초과의 잔기, 및 서열 번호 1의 잔기 21-23, 44-45 및 60-68 외의 추가의 잔기에 결합할 수 있다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 항체는 인간 CCL17에 적어도 서열 번호 1의 잔기 R22 및 K23에서 결합한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 항체는 인간 CCL17에 적어도 서열 번호 1의 잔기 L21, R22, K23, V44, Q45, N60, Y64, S67 및 L68에서 결합한다.
인간 CCL17에 서열 번호 1의 CCL17 아미노산 잔기 21-23, 44-45 및 60-68 내에서 결합하는 예시적인 항체는 서열 번호 45의 VH 및 서열 번호 52의 VL을 갖는 C17B236이다. 결정 구조 분석에 기초하면, C17B236에 의해 결합된 주요 에피토프 잔기들은 서열 번호 1의 CCL17의 R22 및 K23이며, 이러한 분석은 이들 잔기와 항체 VH 잔기들 사이의 접촉의 수에 기초한다.
인간 CCL17에 CCL17 아미노산 잔기 21-23, 44-45 및 60-68 내에서 결합하는 다른 예시적인 항체는 C17B236의 친화성-성숙된 변이체(affinity-matured variant)이며, 이러한 모든 항체는 동일한 부모 항체의 친화성-성숙 캠페인(affinity-maturation campaign)으로부터 유도된다. 예시적인 항체의 VH 및 VL 서열이 도 3 및 도 5에 나타나 있다. 항체의 친화성 성숙은 전형적으로 CDR 내에서의 또는 베르니어 구역(Vernier zone)(CDR을 위치시키는 프레임워크 영역) 내에서의 아미노산 치환을 포함한다. 성숙된 변이체는 최대 108개의 돌연변이체를 포함할 수 있는 조합 라이브러리를 패닝(panning)함으로써 선택된다. 라이브러리의 크기에 대한 상한은, 20개의 모든 아미노산이 각각의 위치에 있는 것이 허용된다면, 가변 위치의 수를 6 내지 7로 제한한다. 파라토프 잔기의 대부분은 각각의 조합 라이브러리에서 보존되는데, 이는 결합 에피토프(binding epitope)가 또한 보존됨을 보장한다. 부모 항체 및 성숙된 항체의 몇몇 결정학적(crystallographic) 연구는 에피토프가 친화성 돌연변이 동안 항상 보존됨을 보여주었다(예를 들어, 문헌[Fransson et al., J. Mol. Biol. 2010, 398:214-231]; 문헌[Gustchina et al., PLoS Pathog. 2010, 6:e1001182]; 문헌[La Porte et al., MAbs 2014; 6:1059-1068]).
인간 CCL17에 CCL17 아미노산 잔기 21-23, 44-45 및 60-68 내에서 결합하는 항-CCL17 항체는 인간 CCL17과 높은 친화성으로, 전형적으로는 약 1×10-10 M 미만의 KD로 결합한다.
인간 CCL17에 CCL17 아미노산 잔기 21-23, 44-45 및 60-68 내에서 결합하는 항체는, 예를 들어 마우스를 잔기 위치 21-23, 44-45 및 60-68에서 인간 CCL17 서열을 갖는 CCL17 키메라 단백질로 면역화함으로써, 또는 야생형 인간 CCL17을 갖는 파지 디스플레이 라이브러리를 패닝하고 생성된 히트(hit)를 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 인간 CCL17의 잔기 21-23, 44-45 및 60-68 내의 각각의 또는 몇몇 잔기 위치에서 치환을 갖는 CCL17 변이체와 교차-스크리닝함으로써 제조될 수 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 일부 실시 형태에서, 인간 CCL17에 특이적으로 결합하는 항체는 CCL17/CCR4 상호작용을 차단한다.
항체는 표준 유세포분석에 의해 CCL17/CCR4 상호작용을 차단하는 그의 능력에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, CCR4를 발현하는 세포를 형광 표지된 인간 CCL17 및 시험 항체와 함께 인큐베이션하고, 그 후에 CCR4-발현 세포 상에 대한 형광 표지된 인간 CCL17의 결합을 표준 방법을 사용하여 평가한다. "CCL17/CCR4 상호작용을 차단하는" 또는 "CCL17/CCR4 상호작용을 억제하는" 항체는 CCR4-발현 세포에 대한 CCL17의 결합을, 그러한 항체의 부재 하에서의 CCL17의 결합과 대비하여 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%로 억제할 수 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 다른 실시 형태는 인간 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 본 항체는 약 1×10-7 M 이하, 약 1×10-8 M 이하, 약 1×10-9 M 이하, 약 1×10-10 M 이하, 약 1×10-11 M 이하, 약 1×10-12 M 이하, 약 1×10-13 M 이하, 또는 약 1×10-14 M 이하의 친화성 상수(KD)로 인간 CCL17에 결합하며, 이때 KD는 4℃에서 48시간 동안 항체와 인간 CCL17의 공-인큐베이션 후에 0.05% 트윈-20을 함유하는 Tris-기반 식염수 완충액 중에서의 용액 평형 친화성을 사용하여 측정된다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 본 항체는 약 1×10-10 M 이하의 친화성 상수(KD)로 인간 CCL17에 결합하며, 이때 KD는 4℃에서 48시간 동안 항체와 인간 CCL17의 공-인큐베이션 후에 0.05% 트윈-20을 함유하는 Tris-기반 식염수 완충액 중에서의 용액 평형 친화성을 사용하여 측정된다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 본 항체는 약 5×10-12 M 이하의 KD로 인간 CCL17에 결합한다.
본 명세서에 기재된 다른 실시 형태에서, 인간 CCL17에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체는 약 1×10-6 M 이하, 약 1×10-7 M 이하, 약 1×10-8 M 이하, 약 1×10-9 M 이하, 약 1×10-10 M 이하, 약 1×10-11 M 이하, 또는 약 1×10-12 M 이하의 친화성 상수(KD)로 마카카 파시쿨라리스(사이노) CCL17에 결합하며, 이때 KD는 4℃에서 48시간 동안 항체와 사이노 CCL17의 공-인큐베이션 후에 0.05% 트윈-20을 함유하는 Tris-기반 식염수 완충액 중에서의 용액 평형 친화성을 사용하여 측정된다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 약 1×10-8 M 이하의 KD로 마카카 파시쿨라리스(사이노) CCL17에 결합하며, 이때 KD는 4℃에서 48시간 동안 항체와 사이노 CCL17의 공-인큐베이션 후에 0.05% 트윈-20을 함유하는 Tris-기반 식염수 완충액 중에서의 용액 평형 친화성을 사용하여 측정된다.
서열 번호 1의 서열을 갖는 인간 CCL17 또는 서열 번호 2의 서열을 갖는 사이노 CCL17에 대한 항체의 친화성은 임의의 적합한 방법을 사용하여 실험으로 측정될 수 있다. 그러한 방법은 프로테온(ProteOn), 바이아코어 또는 킨엑사(KinExA) 기기, 예컨대 프로테온 XPR36 또는 바이아코어 3000, 용액 평형 친화성(SEA), ELISA 또는 당업자에게 공지된 경쟁적 결합 검정을 이용할 수 있다. 예시적인 방법은 실시예 3에 기재된 것들이다. 특정 항체/CCL17 상호작용의 측정된 친화성은 상이한 조건(예를 들어, 오스몰 농도(osmolarity), pH, 완충액, 계면활성제 농도) 하에서 측정된다면 변동될 수 있다. 따라서, 친화성 및 다른 결합 파라미터(예를 들어, KD, Kon, Koff)의 측정은 바람직하게는 표준화된 조건 및 표준화된 완충액, 예컨대 본 명세서에 기재된 완충액을 사용하여 이루어진다. 당업자는, 예를 들어 용액 평형 친화성, 바이아코어 3000 또는 프로테온을 사용한 친화성 측정에 대한 내부 오차(표준 편차, SD로서 측정됨)가 전형적으로 전형적인 검출 한계 이내에서 측정치에 대해 5 내지 33% 이내에 있을 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "약"은 검정에서의 전형적인 표준 편차를 반영한다. 예를 들어, 1×10-9 M의 KD에 대한 전형적인 SD는 최대 ±0.33×10-9 M이다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 다른 실시 형태는 인간 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 본 항체는 CCL17 생물학적 활성을 억제한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "CCL17 생물학적 활성"은 CCL17의 수용체 CCR4에 대한 CCL17 결합의 결과로 발생하는 임의의 활성을 지칭한다. 예시적인 CCL17 생물학적 활성은 세포, 예를 들어 CCRF-CEM 세포(급성 백혈병을 갖는 환자로부터의 T 림프아구성 세포주)의 세포내 칼슘 동원 또는 주화성을 가져온다. 본 발명의 항체는 표준 방법 및 본 명세서에 기재된 것들을 사용하여 CCL17 생물학적 활성을 억제하는 그의 능력에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, CCL17-의존성 세포내 칼슘 동원을 억제하는 본 발명의 항체의 능력은 플루오(Fluo)-8 NW, 플루오-4 AM 또는 플루오-3 AM과 같은 형광 염료를 사용하여 CCL17-유도 칼슘 동원에 대한 항체의 영향을 측정함으로써 검정될 수 있다. CCL17-유도 주화성을 억제하는 본 발명의 항체의 능력은 2-챔버 배양 시스템 내의 반투과성 5 μM 필터를 통한 CCRF-CEM 세포의 이주를 측정하고, 필터를 통해 이주된 세포의 생존력을 측정함으로써 측정될 수 있다. 본 발명의 항체는 CCL17 생물학적 활성을 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%로 억제할 수 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 다른 실시 형태는 CCL17에 특이적으로 결합하는 항체로서, 본 항체는 플루오-8 NW를 사용하여 측정된 CCRF-CEM 세포에서의 10 ng/ml 인간 CCL17-유도 칼슘 동원을 약 1×10-7 M 이하, 약 1×10-8 M 이하, 또는 약 1×10-9 M 이하의 IC50 값으로 억제한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 다른 실시 형태는 CCL17에 특이적으로 결합하는 항체로서, 본 항체는 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1(HCDR1), 2(HCDR2) 및 3(HCDR3) 및 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1(LCDR1), 2(LCDR2) 및 3(LCDR3)을 포함하며, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 서열 번호 4, 5, 71, 72, 73 및 74의 아미노산 서열을 각각 포함한다.
서열 번호 4, 5, 71, 72, 73 및 74의 HCDR 및 LCDR 서열을 포함하는 항체는 1×10-10 이하의 KD로 인간 CCL17에 결합한다.
HCDR1: SYWIG(서열 번호 4)
HCDR2: IIDPSDSDTRYSPSFQG(서열 번호 5)
HCDR3 공통 서열
VGPADVWDX1FDY(서열 번호 71)
(상기 식에서,
X1은 S, A 또는 T임)
LCDR1 공통 서열:
KSSQSVLX1SX2X3NX4NX5LA(서열 번호 72)
(상기 식에서,
X1은 L, Y, S 또는 N이고;
X2는 F, P, H 또는 I이고;
X3은 D, Y, W, T 또는 V이고;
X4는 I, F, S, T, Y, N, K 또는 V이고;
X5는 K, A, Q, T 또는 D임)
LCDR2 공통 서열:
X1ASTRE(서열 번호 73)
(상기 식에서,
X1은 N, H, G, E, T 또는 D임)
LCDR3 공통 서열
QQX1X2X3X4PX5T(서열 번호 74)
(상기 식에서,
X1은 F, Y, T 또는 H이고;
X2는 Y, L, N 또는 W이고;
X3은 S, A, L, I, T, Q 또는 H이고;
X4는 V, T, I, Y, L 또는 D이고;
X5는 S, F, A 또는 L임)
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, CCL17에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체에서, HCDR1은 서열 번호 4의 서열을 포함하고, HCDR2는 서열 번호 5의 서열을 포함하고, HCDR3은 서열 번호 6, 42, 43 또는 44의 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, HCDR1은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열 번호 6, 42 또는 43의 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, CCL17에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체에서, LCDR1은 서열 번호 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18의 서열을 포함하고, LCDR2는 서열 번호 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 39, 40 또는 41의 서열을 포함하고, LCDR3은 서열 번호 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 또는 38의 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, LCDR1은 서열 번호 8, 9, 10, 13, 14, 15, 17 또는 18의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열 번호 20, 21, 22, 24, 25 및 26의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열 번호 28, 29, 30, 33, 34, 35, 37 또는 38의 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, CCL17에 특이적으로 결합하는 항체는 서열 번호 75의 VH 및 서열 번호 76의 VL을 포함한다.
VH 공통 서열(서열 번호 75)
Figure pct00002
(상기 식에서,
X1은 S, A 또는 T임)
VL 공통 서열(서열 번호 76):
Figure pct00003
(상기 식에서,
X1은 L, Y, S 또는 N이고;
X2는 F, P, H 또는 I이고;
X3은 D, Y, W, T 또는 V이고;
X4는 I, F, S, T, Y, N, K 또는 V이고;
X5는 K, A, Q, T 또는 D이고;
X6은 N, H, G, E, T 또는 D이고;
X7은 F, Y, T 또는 H이고;
X8은 Y, L, N 또는 W이고;
X9는 S, A, L, I, T, Q 또는 H이고;
X10은 V, T, I, Y, L 또는 D이고;
X11은 S, F, A 또는 L임)
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, CCL17에 특이적으로 결합하는 항체는 서열 번호 45, 46, 47 또는 48의 VH를 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, CCL17에 특이적으로 결합하는 항체는 서열 번호 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 또는 66의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, CCL17에 특이적으로 결합하는 항체는 서열 번호 45, 46 또는 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, CCL17에 특이적으로 결합하는 항체는 서열 번호 50, 51, 52, 55, 56, 57, 59, 60 또는 62의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 다른 실시 형태는 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 본 항체는
각각 서열 번호 4, 5, 6, 7, 19 및 27;
각각 서열 번호 4, 5, 6, 8, 20 및 28;
각각 서열 번호 4, 5, 6, 9, 21 및 29;
각각 서열 번호 4, 5, 6, 10, 22 및 30;
각각 서열 번호 4, 5, 6, 11, 23 및 31;
각각 서열 번호 4, 5, 6, 12, 24 및 32;
각각 서열 번호 4, 5, 6, 13, 21 및 33;
각각 서열 번호 4, 5, 6, 14, 20 및 34;
각각 서열 번호 4, 5, 6, 15, 25 및 35;
각각 서열 번호 4, 5, 6, 16, 21 및 36;
각각 서열 번호 4, 5, 6, 17, 25 및 37;
각각 서열 번호 4, 5, 6, 18, 26 및 38;
각각 서열 번호 4, 5, 6, 8, 39 및 28;
각각 서열 번호 4, 5, 6, 8, 24 및 28;
각각 서열 번호 4, 5, 6, 8, 22 및 28;
각각 서열 번호 4, 5, 6, 8, 40 및 28;
각각 서열 번호 4, 5, 6, 8, 26 및 28;
각각 서열 번호 4, 5, 6, 8, 41 및 28;
각각 서열 번호 4, 5, 42, 8, 24 및 28;
각각 서열 번호 4, 5, 43, 8, 24 및 28; 또는
각각 서열 번호 4, 5, 44, 8, 24 및 28의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 다른 실시 형태는 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 본 항체는
서열 번호 45의 VH 및 서열 번호 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 또는 66의 VL을 포함하거나;
각각 서열 번호 46 및 62의 VH 및 VL을 포함하거나;
각각 서열 번호 47 및 62의 VH 및 VL을 포함하거나;
각각 서열 번호 48 및 62의 VH 및 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 다른 실시 형태는 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 본 항체는
서열 번호 45의 VH 및 서열 번호 50, 51, 52, 55, 56, 57, 59 또는 60의 VL을 포함하거나;
각각 서열 번호 46 및 62의 VH 및 VL을 포함하거나;
각각 서열 번호 47 및 62의 VH 및 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 다른 실시 형태는 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 본 항체는 서열 번호 45의 VH 및 서열 번호 50의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 다른 실시 형태는 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 본 항체는 서열 번호 45의 VH 및 서열 번호 51의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 다른 실시 형태는 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 본 항체는 서열 번호 45의 VH 및 서열 번호 52의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 다른 실시 형태는 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 본 항체는 서열 번호 45의 VH 및 서열 번호 55의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 다른 실시 형태는 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 본 항체는 서열 번호 45의 VH 및 서열 번호 56의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 다른 실시 형태는 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 본 항체는 서열 번호 45의 VH 및 서열 번호 57의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 다른 실시 형태는 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 본 항체는 서열 번호 45의 VH 및 서열 번호 59의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 다른 실시 형태는 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 본 항체는 서열 번호 45의 VH 및 서열 번호 60의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 다른 실시 형태는 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 본 항체는 서열 번호 46의 VH 및 서열 번호 62의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 다른 실시 형태는 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 본 항체는 서열 번호 47의 VH 및 서열 번호 62의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 다른 실시 형태는 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 본 항체는 서열 번호 46의 VH와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 62의 VL과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
그러한 예시적인 항체는 표 9에 나타낸 항체이다.
중쇄 CDR, 경쇄 CDR, VH 또는 VL 아미노산 서열이 표 3, 표 4, 표 6, 표 7 및 표 9에 나타낸 서열과 미미하게 상이한 항체는 본 발명의 범주 내에 포함된다. 전형적으로, 이는 항체의 특성을 불리하게 변경시키지 않고서 항원-결합 부위 내에서의 또는 프레임워크 내에서의 유사한 전하, 소수성, 또는 입체화학 특성을 갖는 아미노산에 의한 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 보존적 치환은 또한 항체 특성, 예를 들어 안정성 또는 친화성을 개선하도록 이루어질 수 있다. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 아미노산 치환이 VH 또는 VL 서열에 대해 이루어질 수 있다. 예를 들어, "보존적 아미노산 치환"은 그 위치에서 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 대한 영향이 거의 없거나 영향이 없게 하는, 천연 아미노산 잔기의 비천연 잔기로의 치환을 수반할 수 있다. 더욱이, 폴리펩티드 내의 임의의 천연 잔기는 또한 알라닌으로 치환될 수 있는데, 이는 알라닌 스캐닝 돌연변이생성(alanine scanning mutagenesis)에 대해 이전에 기재된 바와 같다(문헌[MacLennan et al (1998) Act Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67]; 문헌[Sasaki et al (1998) Adv. Biopsy's. 35:1-24]). 원하는 아미노산 치환은 그러한 치환이 요구되는 때에 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환을 사용하여, 분자 서열의 중요한 잔기를 확인하거나, 본 명세서에 기재된 분자의 친화성을 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 하기의 8개의 그룹은 서로에 대해 보존적 아미노산 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌(A), 글리신(G); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 라이신(K); 5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(S), 트레오닌(T); 및 8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins (1984)] 참조).
아미노산 치환은, 예를 들어, PCR 돌연변이생성에 의해 행해질 수 있다(미국 특허 제 4,683,195호). 변이체의 라이브러리를 잘 알려진 방법을 사용하여 생성할 수 있는데, 예를 들어, 무작위(NNK) 또는 비무작위 코돈, 예를 들어 DVK 코돈 - 이는 11개의 아미노산(Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg, Ser, Tyr, Trp)을 암호화함 - 을 사용하고, 원하는 특성을 갖는 변이체에 대한 라이브러리를 스크리닝하여 생성할 수 있다.
실시예에 예시된 실시 형태가 중쇄로부터의 하나의 가변 영역 및 경쇄로부터의 하나의 가변 영역으로 된 가변 영역들의 쌍을 포함할지라도, 숙련자는 대안적인 실시 형태가 단일의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있음을 인식할 것이다. 단일의 가변 영역을 사용하여, 예를 들어 서열 번호 1의 서열을 갖는 인간 CCL17에 결합할 수 있는 2-도메인 특이적 항원-결합 단편을 형성할 수 있는 가변 도메인에 대해 스크리닝할 수 있다. 스크리닝은, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 WO1992/01047호에 개시된 계통적 이중 조합 접근법(hierarchical dual combinatorial approach)을 사용하여, 파지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 달성할 수 있다. 이러한 접근법에서는, H 또는 L 쇄 클론 중 하나를 함유하는 개별적인 콜로니를 사용하여, 다른 쇄(L 또는 H)를 암호화하는 클론의 완전한 라이브러리를 감염시키고, 생성되는 2-쇄 특이적 항원-결합 도메인을 기재된 바와 같이 파지 디스플레이 기술에 따라 선택한다. 따라서, 개별 VH 및 VL 폴리펩티드 쇄는 국제 특허 출원 공개 WO1992/01047호에 개시된 방법을 사용하여 서열 번호 1의 서열을 갖는 인간 CCL17에 특이적으로 결합하는 추가 항체를 확인하는 데 유용하다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 항체는 단일클론 항체를 생성하기 위한 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Kohler and Milstein, Nature 256:495, 1975]의 하이브리도마 방법이 사용될 수 있다. 하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 다른 숙주 동물, 예컨대 햄스터, 래트 또는 원숭이를 인간 CCL17 및/또는 사이노 CCL17 단백질 또는 이들 단백질의 단편, 예컨대 인간 CCL17의 세포외 부분으로 면역화하고, 이어서 면역화된 동물로부터의 비장 세포를 표준 방법을 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다(문헌[Gooding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]). 단일 불멸화 하이브리도마 세포로부터 생성되는 콜로니를 결합 특이성, 교차-반응성 또는 그의 결여, 및 항원에 대한 친화성과 같은 원하는 특성을 갖는 항체의 생성에 대해 스크리닝한다.
인간 CCL17에 대한 항체를 생성하기 위해 다양한 숙주 동물이 사용될 수 있다. 예를 들어, Balb/c 마우스가 마우스 항-인간 CCL17 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. Blab/c 마우스 및 다른 인간 이외의 동물 내에서 제조된 항체는 다양한 기술을 사용하여 인간화되어 더 인간-유사한 서열을 생성할 수 있다. 인간 수용체 프레임워크의 선택을 포함한 예시적인 인간화 기법은 당업자에게 알려져 있고, CDR 그래프팅(grafting)(미국 특허 제5,225,539호), SDR 그래프팅(미국 특허 제6,818,749호), 재표면화(Resurfacing)(문헌[Palin, Mol Immunol 28:489-499, 1991]), 특이성 결정 잔기 재표면화(Specificity Determining Residues Resurfacing)(미국 특허 출원 공개 제2010/0261620호), 인간-적응화(또는 인간 프레임워크 적응화)(미국 특허 출원 공개 US2009/0118127호), 초인간화(Super humanization)(미국 특허 제7,709, 226호) 및 가이드된 선택(문헌[Osborn et al., Methods 36:61-68, 2005]; 미국 특허 제5,565,332호)을 포함한다.
인간화 항체는 국제 특허 출원 공개 WO1990/007861호에 그리고 국제 특허 출원 공개 WO1992/22653호에 기재된 바와 같이 개시된 것들과 같은 기법에 의해 결합 친화성을 보존하도록 변경된 프레임워크 지지 잔기를 도입함으로써(복귀 돌연변이) 원하는 항원에 대한 그의 선택성 또는 친화성을 개선하도록 추가로 최적화될 수 있다.
게놈 내에 인간 면역글로불린 유전자자리를 담지하는 유전자도입 마우스를 사용하여 표적 단백질에 대한 인간 항체를 생성할 수 있으며, 이러한 유전자 도입 마우스는, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 WO1990/04036호, 미국 특허 제6,150,584호, 국제 특허 출원 공개 WO1999/45962호, 국제 특허 출원 공개 WO2002/066630호, 국제 특허 출원 공개 WO2002/43478호, 문헌[Loner et al., Nature 368:856-9, 1994]; 문헌[Green et al., Nature Genet. 7:13-21, 1994]; 문헌[Green & Jakobovits Exp Med 188:483-95, 1998]; 문헌[Lonberg and Huszar Int Rev Immunol 13:65-93, 1995]; 문헌[Bruggemann et al., Eur J Immunol 21:1323-1326, 1991]; 문헌[Fishwild et al., Nat Biotechnol 14:845-851, 1996]; 문헌[Mendez et al., Nat Genet 15:146-156, 1997]; 문헌[Green, J Immunol Methods 231:11-23, 1999]; 문헌[Yang et al.,Cancer Res 59:1236-1243, 1999]; 문헌[
Figure pct00004
and Taussig Curr Opin Biotechnol 8:455-458, 1997]; 국제 특허 출원 공개 WO2002/043478호에 기재되어 있다. 그러한 마우스 내의 내인성 면역글로불린 유전자자리는 파괴 또는 결실될 수 있으며, 적어도 하나의 완전 또는 부분 인간 면역글로불린 유전자자리가 상동적 또는 비상동적 재조합을 사용하거나, 염색체도입을 사용하거나, 또는 미니유전자(minigene)를 사용하여 마우스 게놈 내로 삽입될 수 있다. 리제너론(Regeneron)(http://_www_regeneron_com), 하버 안티바디즈(Harbour Antibodies)(http://_www_harbourantibodies_com), 오픈 모노클로날 테크놀로지, 인크.(Open Monoclonal Technology, Inc.)(OMT)(http://_www_omtinc_net), KyMab(http://_www_kymab_com), 트리아니(Trianni)(http://_www.trianni_com) 및 아블렉시스(Ablexis)(http://_www_ablexis_com)와 같은 회사가 전술된 바와 같은 기술을 사용하여 선택 항원에 대하여 유도된 인간 항체를 제공하기 위해 참여할 수 있다.
인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택될 수 있으며, 여기서 파지는 인간 면역글로불린 또는 그의 부분들, 예컨대 Fab, 단일쇄 항체(scFv), 또는 쌍을 형성하지 않거나 쌍을 형성한 항체 가변 영역들을 발현시키도록 조작된다(문헌[Knappik et al., J Mol Biol 296:57-86, 2000]; 문헌[Krebs et al., J Immunol Meth 254:67-84, 2001]; 문헌[Vaughan et al., Nature Biotechnology 14:309-314, 1996]; 문헌[Sheets et al.,PITAS (USA) 95:6157-6162, 1998]; 문헌[Hoogenboom and Winter, J Mol Biol 227:381, 1991]; 문헌[Marks et al.,J Mol Biol 222:581, 1991]). 본 발명의 항체는, 예를 들어 문헌[Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010] 및 국제 특허 출원 공개 WO2009/085462호에 기재된 바와 같이 박테리오파지 pIX 외피 단백질과의 융합 단백질로서 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 항체 라이브러리는 인간 CCL17 세포외 도메인에 대한 결합에 대해 스크리닝되고, 얻어진 양성 클론은 추가로 특성화되고, 클론 용해물로부터 Fab가 단리되고, 전장 IgG로서 발현된다. 인간 항체를 단리하기 위한 그러한 파지 디스플레이 방법은 당업계에 확립되어 있다. 예를 들어, 라드너(Ladner) 등에게 허여된 미국 특허 제5,223,409호; 제5,403,484호; 및 제5,571,698호; 도워(Dower) 등에게 허여된 미국 특허 제5,427,908호 및 제5,580,717호; 맥카퍼티(McCafferty) 등에게 허여된 미국 특허 제5,969,108호 및 제6,172,197호; 및 그리피츠(Griffiths) 등에게 허여된 미국 특허 제5,885,793호; 제6,521,404호; 제6,544,731호; 제6,555,313호; 제6,582,915호 및 제6,593,081호를 참조한다.
면역원성 항원의 제조 및 단일클론 항체 생성은 임의의 적합한 기법, 예컨대 재조합 단백질 생성을 사용하여 수행될 수 있다. 면역원성 항원은 정제된 단백질, 또는 전 세포 또는 세포 또는 조직 추출물을 포함하는 단백질 혼합물의 형태로 동물에게 투여될 수 있거나, 또는 항원은 상기 항원 또는 그의 부분을 암호화하는 핵산으로부터 동물의 체내에서 드 노보(de novo)로 형성될 수 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 항체는 인간 항체 또는 인간화 항체일 수 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 항체는 합성 또는 재조합일 수 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 유형을 가질 수 있다. 본 명세서에 기재된 본 발명의 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 동형을 가질 수 있다.
당업자에게 공지된 기법에 의한 Fc 변형을 통해 본 발명의 항체의 면역 효과기 특성을 향상시키거나 침묵(silence)시킬 수 있다. 예를 들어, Fc 효과기 기능, 예컨대 C1q 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC), 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 식작용, 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등이, 이들 활성을 담당하는 Fc 내의 잔기를 변형시킴으로써 조절될 수 있다. 항체 반감기를 연장하는 Fc 도메인 내의 잔기를 돌연변이시킴으로써 약동학적 특성이 또한 향상될 수 있다. 예시적인 Fc 변형은 IgG4 S228P/L234A/L235A, IgG2 M252Y/S254T/T256E(문헌[Dall'Acqua et al., J Biol Chem 281:23514―24, 2006]); 또는 IgG2 V234A/G237A/P238S, V234A/G237A/H268Q, H268A/V309L/A330S/P331 또는 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S - IgG2 상에서임 -(국제 특허 출원 공개 WO2011/066501호), 또는 미국 특허 제6,737,056호에 기재된 것들이다(EU 넘버링에 따른 넘버링).
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 인간 CCL17에 특이적으로 결합하는 항체는 Fc 영역에서의 치환을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 치환은 IgG2 상에서의 V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S 또는 P331S 치환, 또는 IgG4 상에서의 S228P, L234A 또는 L235A 치환을 포함하며, 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따른다.
추가적으로, 본 명세서에 기재된 본 발명의 항체는 글리코실화, 이성질체화, 탈글리코실화(deglycosylation), 또는 천연 비발생 공유 변형(non-naturally occurring covalent modification), 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 첨가(페길화(pegylation)) 및 지질화와 같은 과정에 의해 번역-후 변형될 수 있다. 그러한 변형은 생체내에서 또는 시험관내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 폴리에틸렌 글리콜에 접합되어(PEG화되어), 그의 약동학적 프로파일을 개선할 수 있다. 접합은 당업자에게 알려져 있는 기법에 의해 수행될 수 있다. 치료 항체와 PEG의 접합은 기능을 방해하지 않으면서 약동학적 특성을 향상시키는 것으로 밝혀졌다(문헌[Knight et al., Plateles 15:409-418, 2004], 문헌[Leong et al., Cytokine 16:106-119, 2001], 문헌[Yang et al., Protein Eng 16:761-770, 2003]).
본 명세서에 기재된 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 안정성, 선택성, 교차-반응성, 친화성, 면역원성 또는 다른 바람직한 생물학적 또는 생물물리학적 특성을 개선하기 위하여 변형될 수 있고, 본 발명의 범주 내에 있다. 항체의 안정성은 (1) 그의 고유 안정성에 영향을 미치는 개별 도메인의 코어 패킹(core packing), (2) HC 및 LC 쌍 형성에 영향을 주는 단백질/단백질 계면 상호작용, (3) 극성 및 하전된 잔기의 매립(burial), (4) 극성 및 하전된 잔기에 대한 H-결합 네트워크, 및 (5) 다른 분자내 및 분자간 힘 중에서의 표면 전하 및 극성 잔기 분포를 비롯한 수많은 인자에 의해 영향을 받는다(문헌[Worn and Pluckthun, J Mol Biol 305:989-1010, 2001]). 잠재적인 구조 불안정화 잔기는 항체의 결정 구조에 기초하여 또는 소정 경우에 분자 모델링에 의하여 확인할 수 있으며, 확인된 잔기 내에 돌연변이를 갖는 변이체를 생성하고 평가함으로써, 항체 안정성에 대한 잔기의 영향을 시험할 수 있다. 항체 안정성을 증가시키는 방법 중 하나는 시차 주사 열량계법(DSC)에 의해 측정된 바와 같은 열 전이 중간점(Tm)을 상승시키는 것이다. 일반적으로, 단백질 Tm은 그의 안정성과 상관되며, 단백질이 풀리는 경향에 좌우되는 분해 과정 및 용액 중에서의 풀림(unfolding) 및 변성에 대한 그의 감수성과 역상관된다(문헌[Remmele et al., Pharm Res 15:200-208, 1997]). 다수의 연구는 DSC에 의해 열안정성으로서 측정된 제형의 물리적 안정성과 다른 방법에 의해 측정된 물리적 안정성의 랭킹 사이의 상관관계를 밝혀내었다(문헌[Bedu-Addo et al., Pharm Res 21:1353-1361, 2004]; 문헌[Gupta and Kaisheva, AAPS PharSci, 5E8, 2003]; 문헌[Maa and Hsu, Int J Pharm 140:155-168, 1996]; 문헌[Remmele et al., Pharm Res 15:200-208, 1997]; 문헌[Zhang et al., J Pharm Sci 93:3076-3089, 2004]). 제형 연구는 Fab Tm이 상응하는 mAb의 장기간 물리적 안정성에 영향을 준다는 것을 시사한다. 프레임워크 또는 CDR 내의 아미노산의 차이는 Fab 도메인의 열 안정성에 상당한 영향을 줄 수 있다(문헌[Yasui et al., FEBS Lett 353:143-146, 1994]).
본 명세서에 기재된 본 발명의 CCL17 항체는 이중특이성 항체 내로 조작될 수 있는데, 이러한 이중특이성 항체 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다. 본 발명의 항체의 VL 및/또는 VH 영역은 공개된 방법을 사용하여, TandAb® 설계와 같은 구조로서 단일쇄 이중특이성 항체 내로(국제 특허 출원 공개 WO1999/57150호; 미국 특허 출원 공개 US2011/0206672호), 또는 미국 특허 제5,869,620호; 국제 특허 출원 공개 WO1995/15388호, 국제 특허 출원 공개 WO1997/14719호 또는 국제 특허 출원 공개 WO2011/036460호에 개시된 것들과 같은 구조로서 이중특이성 scFV 내로 조작될 수 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 항체의 VL 및/또는 VH 영역은 이중특이성 전장 항체 내로 조작될 수 있으며, 여기서 각각의 항체 아암은 별개의 항원 또는 에피토프에 결합한다. 그러한 이중특이성 항체는 전형적으로 하기에 기재된 것들과 같은 기술을 사용하여 2개의 항체 중쇄들 사이의 CH3 상호작용을 조절하여 이중특이성 항체를 형성함으로써 제조된다: 미국 특허 제7,695,936호; 국제 특허 출원 공개 WO2004/111233호; 미국 특허 출원 공개 US2010/0015133호; 미국 특허 출원 공개 US2007/0287170호; 국제 특허 출원 공개 WO2008/119353호; 미국 특허 출원 공개 US2009/0182127호; 미국 특허 출원 공개 US2010/0286374호; 미국 특허 출원 공개 US2011/0123532호; 국제 특허 출원 공개 WO2011/131746호; 국제 특허 출원 공개 WO2011/143545호; 또는 미국 특허 출원 공개 US2012/0149876호. 본 발명의 항체의 VL 및/또는 VH 영역이 도입될 수 있는 추가의 이중특이성 구조는, 예를 들어 이중 가변 도메인 면역글로불린(Dual Variable Domain Immunoglobulin)(국제 특허 출원 공개 WO2009/134776호)이거나; 또는 상이한 특이성을 갖는 2개의 항체 아암을 연결하기 위하여 다양한 이량화 도메인, 예컨대 류신 지퍼 또는 콜라겐 이량화 도메인을 포함하는 구조(국제 특허 출원 공개 WO2012/022811호, 미국 특허 제5,932,448호; 미국 특허 제6,833,441호)이다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 항체 중쇄 가변 영역들 또는 항체 경쇄 가변 영역들 중 임의의 것을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 소정의 예시적인 폴리뉴클레오티드가 본 명세서에 개시되어 있지만, 주어진 발현 시스템 내에서 유전자 코드의 축퇴 또는 코돈 선호도를 고려하여, 본 발명의 항체를 암호화하는 다른 폴리뉴클레오티드 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 본 발명의 항체의 VH 또는 VL 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 의도된 숙주 세포 내에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는 하나 이상의 조절 요소, 예컨대 프로모터 및 인핸서에 작동가능하게 연결될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 cDNA일 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다. 그러한 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 배큘로바이러스 발현용 벡터, 트랜스포존 기반 벡터, 또는 임의의 수단에 의해 주어진 유기체 또는 유전적 백그라운드 내로 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 도입시키기에 적합한 임의의 다른 벡터일 수 있다. 예를 들어, 불변 영역에 선택적으로 연결된, 본 발명의 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 발현 벡터 내로 삽입된다. 경쇄 및 중쇄는 동일하거나 상이한 발현 벡터 내에서 클로닝될 수 있다. 면역글로불린 쇄를 암호화하는 DNA 세그먼트는 면역글로불린 폴리펩티드의 발현을 보장하는 발현 벡터 (들) 내의 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 그러한 제어 서열은 신호 서열, 프로모터(예를 들어, 천연 관련 프로모터 또는 이종 프로모터), 인핸서 요소, 및 전사 종결 서열을 포함하며, 항체를 발현하도록 선택된 숙주 세포에 적합하도록 선택된다. 일단 벡터가 적절한 숙주 내로 도입되었으면, 숙주는 도입된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 단백질의 고수준 발현에 적합한 조건 하에서 유지된다.
적합한 발현 벡터는 전형적으로 숙주 유기체 내에서 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 필수 부분으로서 복제가능하다. 일반적으로, 발현 벡터는 선택 마커, 예컨대 암피실린-내성, 하이그로마이신-내성, 테트라사이클린 내성, 카나마이신 내성 또는 네오마이신 내성을 함유하여 원하는 DNA 서열로 형질전환된 세포의 검출을 가능하게 한다.
적합한 프로모터 및 인핸서 요소는 당업계에 알려져 있다. 세균 세포 내에서의 발현을 위하여, 예시적인 프로모터는 lacl, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 P 및 trc를 포함한다. 진핵 세포 내에서의 발현을 위하여, 예시적인 프로모터는 경쇄 및/또는 중쇄 면역글로불린 유전자 프로모터 및 인핸서 요소; 거대세포바이러스 전초기 프로모터; 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 프로모터; 초기 및 후기 SV40 프로모터; 레트로바이러스로부터의 긴 말단 반복 내에 존재하는 프로모터; 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터; 및 당업계에 알려진 다양한 조직 특이적 프로모터를 포함한다. 효모 세포 내에서의 발현을 위하여, 예시적인 프로모터는 구성적 프로모터, 예컨대 ADH1 프로모터, PGK1 프로모터, ENO 프로모터, PYK1 프로모터 등; 또는 조절가능 프로모터, 예컨대 GAL1 프로모터, GAL10 프로모터, ADH2 프로모터, PH05 프로모터, CUP1 프로모터, GAL7 프로모터, MET25 프로모터, MET3 프로모터, CYC1 프로모터, HIS3 프로모터, ADH1 프로모터, PGK 프로모터, GAPDH 프로모터, ADC1 프로모터, TRP1 프로모터, URA3 프로모터, LEU2 프로모터, ENO 프로모터, TP1 프로모터, 및 AOX1(예를 들어, 피키아(Pichia)에서의 사용을 위함)이다. 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 본 기술분야의 통상의 기술의 수준 내에 충분히 있다.
다수의 적합한 벡터 및 프로모터는 당업자에게 알려져 있으며, 많은 것들이 대상 재조합 작제물의 생성을 위하여 구매가능하다. 하기의 벡터가 예로서 제공된다. 세균 벡터: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a(스트라타진(Stratagene), 미국 캘리포니아주 라졸라 소재); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, 및 pRIT5(파르마시아(Pharmacia), 스웨덴 웁살라 소재). 진핵 벡터: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG(스트라타진) pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL (파르마시아).
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포이다. 용어 "숙주 세포"는 벡터가 내부에 도입된 세포를 지칭한다. 용어 숙주 세포는 특정 대상 세포뿐만 아니라 그러한 세포의 자손도 지칭하고자 함이 이해된다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 소정의 변형이 일어날 수 있기 때문에, 그러한 자손은 부모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범주 내에 포함된다. 그러한 숙주 세포는 진핵 세포, 원핵 세포, 식물 세포 또는 고세균(archeal) 세포일 수 있다.
에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 간균강, 예컨대 바실루스 숩틸리스(Bacillus subtilis), 및 다른 장내세균과(Enterobacteriaceae), 예컨대 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종이 원핵 숙주 세포의 예이다. 다른 미생물, 예컨대 효모가 또한 발현에 유용하다. 사카로마이세스(Saccharomyces)(예를 들어, S. 세레비시아이(S. cerevisiae)) 및 피키아가 적합한 효모 숙주 세포의 예이다. 예시적인 진핵 세포는 포유류, 곤충, 조류 또는 다른 동물 기원의 것일 수 있다. 포유류 진핵 세포는 불멸화 세포주, 예컨대 하이브리도마 또는 골수종 세포주, 예컨대 SP2/0(ATCC(American Type Culture Collection), 미국 버지니아주 머내서스 소재, CRL-1581), NS0(ECACC(European Collection of Cell Cultures), 영국 윌트셔주 솔즈베리 소재, ECACC 번호 85110503), FO(ATCC CRL-1646) 및 Ag653(ATCC CRL-1580) 뮤린 세포주를 포함한다. 예시적인 인간 골수종 세포주는 U266(ATTC CRL-TIB-196)이다. 다른 유용한 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예컨대 CHO-K1SV(론자 바이올로직스(Lonza Biologics), 미국 매사추세츠주 워커스빌 소재), CHO-K1(ATCC CRL-61) 또는 DG44로부터 유래된 것을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 항체의 생성 방법으로서, 본 방법은 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 숙주 세포에 의해 생성된 항체를 회수하는 단계를 포함한다. 항체의 제조 방법 및 그의 정제 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일단 (화학적으로 또는 재조합으로) 합성되었으면, 전 항체, 그의 이량체, 개별 경쇄 및 중쇄, 또는 다른 항체 단편, 예컨대 VH 또는 VL이 본 기술분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있는데, 이러한 표준 절차에는 황산암모늄 침전, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 정제, 겔 전기영동 등이 포함된다(전반적으로 문헌[Scopes, Protein Purification (Springer- Verlag, N.Y., (1982)]을 참조한다). 대상 항체는 사실상 순수할 수 있으며, 예를 들어 적어도 약 80% 내지 85% 순도, 적어도 약 85% 내지 90% 순도, 적어도 약 90% 내지 95% 순도, 또는 적어도 약 98% 내지 99%, 또는 그 이상의 순도일 수 있으며, 예를 들어 세포 잔해, 대상 항체 이외의 거대분자 등과 같은 오염물이 없을 수 있다.
본 발명의 소정의 VH 또는 VL 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 표준 분자 생물학 방법을 사용하여 벡터 내로 도입된다. 숙주 세포 형질전환, 배양, 항체 발현 및 정제가 잘 알려진 방법을 사용하여 행해진다.
치료 방법
인간 CCL17에 특이적으로 결합하는 항체는 광범위한 CCL17-매개 질환을 치료 또는 예방하는 데 적합할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CCL17-매개 질환"은 질병 또는 의학적 질환 - 질병 또는 질환의 원인, 발생, 진행, 지속 또는 병상을 포함함 - 에서 CCL17이 직접적으로든 또는 간접적으로든 역할을 하는 모든 질병 및 의학적 질환을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CCL17-매개 염증성 질환"은 CCL17 생물학적 활성으로부터 적어도 부분적으로 기인되는 염증성 질환을 지칭한다. 예시적인 CCL17-매개 염증성 질환은 천식 및 알레르기이다.
본 발명의 방법은 임의의 분류에 속하는 동물 환자를 치료하기 위해 사용할 수 있다. 그러한 동물의 예에는 포유동물, 예컨대 인간, 설치류, 개, 고양이 및 가축이 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 다음과 같은 CCL17-매개 질환의 예방 및 치료에 유용하다: 천식 및 알레르기성 호흡 질병, 예컨대 알레르기성 천식, 알레르기성 비염, 만성 폐색성 폐 질병(COPD), 특발성 폐섬유증(IPF), 과민증 폐 질병 등, 알레르기성 질병, 예컨대 전신성 아나필락시스 또는 과민증 반응, 약물 알레르기, 알레르기성 기관지 폐 아스페르길루스증(ABPA), 곤충 자상 알레르기 및 식품 알레르기, 염증성 장 질병, 예컨대 크론병(Crohn's disease), 궤양성 결장염, 회장염 및 장염, 질염, 건선 및 염증성 피부증, 예컨대 피부염, 습진, 아토피성 피부염, 알레르기성 접촉 피부염, 두드러기 및 소양증, 혈관염, 척추관절병증, 피부경화증, 자가면역 질병, 예컨대 관절염(류마티스성 및 건선성을 포함함), 다발성 경화증, 전신 홍반성 루프스, I형 당뇨병, 사구체신염 등, 이식 거부반응(동종이식편 거부반응 및 이식편-대-숙주 질병을 포함함), 및 원치 않는 염증 반응이 억제되어야 하는 다른 질병, 예컨대 죽상동맥경화증, 근염, T-세포 매개 신경변성 질병, 다발성 경화증, 뇌염, 수막염, 간염, 신장염, 패혈증, 유육종증, 알레르기성 결막염, 이염(otitis), 캐슬맨병(Castleman's disease), 동염(sinusitis), LPS-유도성 내독소 쇼크, 베체트 증후군(Behcet's syndrome) 및 통풍.
본 명세서에 기재된 본 발명의 항체는 또한 그러한 치료를 위한 약제의 제조에 유용하며, 여기서 약제는 본 명세서에 규정된 투여량으로의 투여를 위해 제조된다.
본 발명의 방법 및 용도는 CCL17 발현 또는 생물학적 활성과 관련되거나 CCL17이 생물학적 역할을 하는 임의의 질병 또는 질환을 갖거나 그것이 발생될 위험이 있는 동물 및 환자에서 사용하도록 의도될 수 있다.
어떠한 이론에 의해서도 구애되고자 함이 없이, 본 발명의 항체는 Th2 세포 동원의 직접 억제 및 이에 따른 다수의 Th2 사이토카인의 동시 억제에 의해 다양한 염증성 질병에서 그의 효능적 효과를 제공할 수 있다. 본 발명의 항체는 CCL17만을 선택적으로 차단함으로써 항-CCR4 항체와 대비하여 개선된 안전성 프로파일을 제공할 수 있다. 본 항체는 CCR4를 발현하는 혈소판과 상호작용하지 않을 것이다. 게다가, 본 항체는 CCR4에 대한 CCL22의 유익한 선천성 면역 효과를 차단하지 않을 것이다(문헌[Matsukawa et al., I. Immunol 164:5382-8, 2000]).
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "염증성 질환"은 사이토카인, 케모카인, 또는 염증성 세포(예를 들어, 중성구, 단핵구, 림프구, 대식세포, 비만 세포, 수지상 세포, 호중구)의 활성에 의하여 부분적으로 매개되고 대부분의 경우에 통증, 발적, 종창, 및 조직 기능의 손상을 특징으로 하는, 유해한 자극, 예컨대 병원체, 손상된 세포, 신체적 상해 또는 자극물에 대한 급성 또는 만성의 국부 또는 전신 반응을 지칭한다.
염증성 폐 질환은 CCL17-매개 염증성 질환의 일례이다. 예시적인 염증성 폐 질환은 바이러스, 세균, 진균, 기생충 또는 프리온(prion) 감염과 관련된 것을 비롯한 감염-유도성 폐 질환; 알레르겐-유도성 폐 질환; 석면증(asbestosis), 규폐증(silicosis), 또는 벨릴륨증(berylliosis)과 같은 오염물질-유도성 폐 질환; 위 흡인-유도성 폐 질환; 면역 조절이상; 낭성 섬유증과 같은 유전적 소인이 있는 염증성 질환; 및 호흡기 손상(ventilator injury)과 같은 신체적 외상-유도성 폐 질환을 포함한다. 이들 염증성 질환은 또한 천식, 폐기종, 기관지염, 만성 폐색성 폐 질환(COPD), 유육종증, 조직구증, 림프관근종증, 급성 폐 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 만성 폐 질병, 기관지폐 형성이상, 지역사회-획득 폐렴, 병원내 폐렴, 호흡기-관련 폐렴, 패혈증, 바이러스성 폐렴, 인플루엔자 감염, 파라인플루엔자 감염, 로타바이러스 감염, 인간 메타뉴모바이러스(metapneumovirus) 감염, 호흡기 세포융합 바이러스 감염 및 아스페르길루스(Aspergillus) 또는 다른 진균성 감염을 포함한다. 예시적인 감염-관련 염증성 질병은 중증 폐렴, 낭성 섬유증, 기관지염, 기도 결절(airway exacerbation) 및 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS)을 비롯한 바이러스성 또는 세균성 폐렴을 포함할 수 있다. 그러한 감염-관련 질환은 일차 바이러스성 감염 및 이차 세균성 감염과 같은 다수의 감염을 포함할 수 있다.
천식은 기도 과민성("AHR"), 기관지수축, 천명, 호산구 또는 호중구 염증, 점액 과다분비, 상피하 섬유증, 및 상승된 IgE 수준을 특징으로 하는 폐의 염증성 질병이다. 천식 환자는, 가장 일반적으로는 기도의 미생물 감염(예를 들어, 리노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 헤모필루스 인플루엔자 등)에 기인하는, 증상의 악화인, "증악(exacerbation)"을 경험한다. 천식 발작은 환경적 인자(예를 들어, 회충, 곤충, 동물(예를 들어, 고양이, 개, 토끼, 마우스, 래트, 햄스터, 기니 피그 및 새), 진균, 공기 오염물질(예를 들어, 담배 연기), 자극성 가스, 퓸(fume), 증기, 에어로졸, 화학물질, 화분, 운동, 또는 찬 공기)에 의해 촉발될 수 있다. 천식 이외에, 폐에 영향을 주는 몇몇 만성 염증성 질병, 예를 들어 만성 폐색성 폐 질병(COPD), 세균성 폐렴 및 낭포성 섬유증은 기도에 대한 호중구 침윤을 특징으로 하고(문헌[Lind, en et al., Eur Respir J 15:973-7, 2000]; 문헌[Rahman et al., Clin Immunol 115:268-76, 2005]), COPD, 알레르기성 비염, 및 낭포성 섬유증과 같은 질병은 기도 과민성을 특징으로 한다(문헌[Fahy and O'Byrne Am J Respir Crit Care Med 163:822-3, 2001]).
알레르기성 천식에서, 고수준의 알레르겐-특이적 IgE의 존재는 일반적으로 흡입되는 환경 알레르겐에 대한 비정상적인 Th2 세포 면역 반응의 반영이다. 알레르겐은 유입되는 외래 항원을 연속적으로 샘플링하는 수지상 세포(DC)에 의해 T 세포에 제시된다. DC에 의한 적절한 활성화 시에, 이환된 기도에 존재하는 알레르겐-특이적 림프구는 Th2 사이토카인 인터류킨(IL)-4, IL-5 및 IL-13을 생성하는데, 이들 Th2 사이토카인 인터류킨은 더욱이 백혈구 혈관외유출, 배상 세포 과형성 및 세기관지 과민성(BHR)을 제어한다. DC에 의해 생성된 CCL17은 CCR4의 촉발을 통해 Th1 세포는 아니고 Th2 세포의 선택적 이주를 유도한다. 천식의 뮤린 모델에서, 항-CCL17 항체에 의한 그러한 치료는 알레르겐 시험투여 후에 기관지폐포 세척액(BAL) 내의 CD4+ T 세포 및 호산구의 수, Th2 사이토카인의 생성 및 기도 과민성을 감소시켰는데, 이는 CCL17 중화가 인간에서 알레르기성 염증을 억제하는 데 실행가능한 전략임을 시사한다.
천식 및 기도 염증에 대하여 일반적으로 사용되는 동물 모델은 오브알부민 시험투여 모델, 메타콜린 감작화 모델 및 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)에 의한 감작화 모델을 포함한다(문헌[Hessel et al., Eur J Pharmacol 293:401-12, 1995]). 또한, 배양된 인간 기관지 상피 세포, 기관지 섬유아세포 또는 기도 평활근 세포로부터의 사이토카인 및 케모카인 생성의 억제가 시험관내 모델로 사용될 수 있다. 이들 모델 중 임의의 것에 대한 본 발명의 항체의 투여는 천식, 기도 염증, COPD 등의 경과를 변경시키고, 증상을 개선하기 위한 그의 효능을 평가하는 데 사용될 수 있다.
아토피성 피부염은 CCL17-매개 염증성 질환의 일례이다.
본 발명의 일 태양은 CCL17-매개 질병을 치료하는 방법으로서, 본 방법은 그를 필요로 하는 대상체에게 CCL17-매개 질병을 치료하기에 충분한 시간 동안 본 발명의 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, CCL17-매개 질병은 염증성 질병이다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 염증성 질병은 천식, 궤양성 결장염(UC), 아토피성 피부염(AD) 또는 특발성 폐섬유증(IPF)이다.
본 발명의 일 실시 형태는 천식을 치료하는 방법으로서, 본 방법은 대상체에게 천식을 치료하기에 충분한 시간 동안 본 명세서에 기재된 본 발명의 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시 형태는 궤양성 결장염을 치료하는 방법으로서, 본 방법은 대상체에게 궤양성 결장염을 치료하기에 충분한 시간 동안 본 명세서에 기재된 본 발명의 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시 형태는 아토피성 피부염을 치료하는 방법으로서, 본 방법은 대상체에게 아토피성 피부염을 치료하기에 충분한 시간 동안 본 명세서에 기재된 본 발명의 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시 형태는 특발성 폐섬유증을 치료하는 방법으로서, 본 방법은 대상체에게 특발성 폐섬유증을 치료하기에 충분한 시간 동안 본 명세서에 기재된 본 발명의 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
투여/약제학적 조성물
본 발명은 본 발명의 CCL17에 특이적으로 결합하는 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 치료적 용도를 위하여, 본 발명의 CCL17에 특이적으로 결합하는 항체는 약제학적으로 허용되는 담체 중에 활성 성분으로서 도메인, 분자 또는 항체의 유효량을 함유하는 약제학적 조성물로서 제조될 수 있다. 용어 "담체"는 활성 화합물과 함께 투여되는 희석제, 애쥬번트(adjuvant), 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 그러한 비히클은 석유, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 포함하는, 물 및 오일과 같은 액체일 수 있다. 예를 들어, 0.4% 식염수 및 0.3% 글리신이 사용될 수 있다. 이들 용액은 멸균성이고 일반적으로 미립자상 물질이 없다. 이들은 종래의 잘 알려져 있는 멸균 기법(예를 들어, 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 본 조성물은 생리학적 조건에 근접시키기 위하여 필요한 약제학적으로 허용되는 보조 물질, 예컨대 pH 조정제 및 완충제, 안정제, 증점제, 윤활제 및 착색제 등을 함유할 수 있다. 그러한 약제학적 제형에서 본 명세서에 기재된 본 발명의 분자 또는 항체의 농도는 광범위하게, 즉 약 0.5 중량% 미만부터, 통상 약 1 중량% 또는 적어도 약 1 중량% 내지 많게는 15 또는 20 중량%까지 변동될 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식에 따라, 필요 용량, 유체 부피, 점도 등에 기초하여 주로 선택될 것이다. 다른 인간 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민을 포함하는 적합한 비히클 및 제형이, 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092, 특히 pp. 958-989 참조]에 기재되어 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 CCL17에 특이적으로 결합하는 항체의 치료적 용도를 위한 투여 방식은 이러한 작용제를 숙주에게 전달하는 임의의 적합한 경로일 수 있으며, 예컨대 비경구 투여, 예를 들어 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내 또는 피하, 폐, 경점막(구강, 비강내, 질내, 직장) 투여로서, 이러한 투여에서는 정제, 캡슐, 용액, 분말, 겔, 입자 형태이고, 주사기, 이식 디바이스, 삼투압 펌프, 카트리지, 마이크로펌프 내에 담긴 제형; 또는 당업자에 의해 인식되는 다른 수단을 사용하는데, 이는 당업계에 잘 알려진 바와 같다. 부위 특이적 투여는, 예를 들어, 관절내, 기관지내, 복강내, 관절낭내, 연골내, 강내, 체강내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장주위내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활막내, 흉부내, 자궁내, 혈관내, 방광내, 병변내, 질, 직장, 협측, 설하, 비강내, 또는 경피 전달에 의해 달성될 수 있다.
따라서, 근육내 주사를 위한 본 명세서에 기재된 본 발명의 약제학적 조성물은 1 ml의 멸균 완충수, 및 약 1 ng 내지 약 100 mg/㎏, 예를 들어 약 50 ng 내지 약 30 mg/㎏ 또는 더 바람직하게는 약 5 mg 내지 약 25 mg/㎏의 본 발명의 CCL17에 특이적으로 결합하는 항체를 함유하도록 제조될 수 있다.
CCL17-매개 질환을 갖는 환자에게 제공되는 용량은 증상을 경감시키거나 CCL17-매개 질환을 치료하기에 충분하며("치료적 유효량"), 때때로 0.1 내지 10 mg/㎏ 체중, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mg/㎏일 수 있지만, 더욱 더 클 수 있으며, 예를 들어 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg/㎏일 수 있다. 고정 단위 용량, 예를 들어 50, 100, 200, 500 또는 1000 mg이 또한 제공될 수 있거나, 또는 이러한 용량은 환자의 표면적을 기준으로, 예를 들어 400, 300, 250, 200, 또는 10 mg/m2일 수 있다. 통상 1 내지 8회(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8회)의 용량이 투여되지만, 10, 12, 20회 또는 그 이상의 용량이 제공될 수 있다. 본 명세서에 기재된 본 발명의 CCL17에 특이적으로 결합하는 항체의 투여는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 5주, 6주, 7주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 그 이상 후에 반복될 수 있다. 만성 투여인 바와 같이, 반복된 치료 과정이 또한 가능하다. 반복 투여는 동일한 용량으로 또는 상이한 용량으로 행해질 수 있다.
천식과 같은 염증성 질병의 치료에 유효하게 될 본 명세서에 기재된 본 발명의 CCL17 항체의 투여량은 당업계에 잘 알려진 관련 동물 모델에게 그리고 본 명세서에 기재된 바와 같이 CCL17 항체를 투여함으로써 결정될 수 있다.
최적 투여량 범위를 확인하는 것을 돕기 위하여 시험관내 검정이 선택적으로 사용될 수 있다. 특정 유효 용량의 선택은 몇몇 인자의 고려에 기초하여, 당업자에 의해 (예를 들어, 임상 시험을 통해) 결정될 수 있다. 그러한 인자는 치료 또는 예방하고자 하는 질환, 관련된 증상, 환자의 체중, 환자의 면역 상태 및 당업자가 알고 있는 다른 인자를 포함한다. 제형에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 질환의 중증도에 좌우될 것이며, 전문의의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 도출된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다. 본 발명의 항체는 본 명세서에 기재된 모델들 중 임의의 것을 사용하여 그의 효능 및 유효 투여량에 대해 시험될 수 있다.
예를 들어, 정맥내 주입을 위한 본 명세서에 기재된 본 발명의 CCL17에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 80 ㎏의 환자에 대한 투여의 경우 약 200 ml의 멸균 링거액, 및 약 8 mg 내지 약 2400 mg, 약 400 mg 내지 약 1600 mg, 또는 약 400 mg 내지 약 800 mg의 본 발명의 CCL17에 특이적으로 결합하는 항체를 함유하도록 구성될 수 있다. 비경구로 투여가능한 조성물을 제조하기 위한 방법은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌["Remington's Pharmaceutical Science", 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA]에 더욱 상세히 기재되어 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 CCL17에 특이적으로 결합하는 항체는 저장을 위해 동결건조되고, 사용 전에 적합한 담체 중에 재구성될 수 있다. 이러한 기법은 종래의 단백질 제제에 유효한 것으로 밝혀져 있으며, 당업계에 공지된 동결건조 및 재구성 기법이 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 CCL17에 특이적으로 결합하는 항체는 제2 치료제와 동시에, 순차적으로 또는 별개로 병용하여 투여될 수 있다.
이제 본 발명을 하기의 구체적인 비제한적 실시예를 참고로 하여 설명할 것이다.
실시예 1. CCL17 중화 항체의 생성
문헌[Shi et al., J. Mol. Biol. 397:385-396, 2010]; 국제 특허 출원 공개 WO2009/085462호; 미국 특허 출원 공개 US2010/0021477호; 미국 특허 출원 공개 US2012/0108795호에 기재된 드 노보 pIX 파지 디스플레이 라이브러리들로부터 인간 CCL17 결합 Fab를 선택하였다. 간략하게 말하면, 이들 라이브러리는 인간 스캐폴드를 다양화함으로써 생성하였는데, 여기서는 생식세포계열 VH 유전자 IGHV1-69*01, IGHV3-23*01, 및 IGHV5-51*01을 H3 루프를 통해 인간 IGHJ-4 미니유전자와 재조합하고, 인간 생식세포계열 VL 카파 유전자 O12(IGKV1-39*01), L6(IGKV3-11*01), A27(IGKV3-20*01), 및 B3(IGKV4-1*01)을 IGKJ-1 미니유전자와 재조합하여 완전한 VH 및 VL 도메인을 조립하였다. 단백질 항원 및 펩티드 항원과 빈번하게 접촉되는 것으로 확인되는 위치에 상응하는 H1, H2, L1, L2 및 L3 루프 주위의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내의 위치를 다양화를 위하여 선택하였다. 선택된 위치에서의 서열 다양성은 각각의 IGHV 또는 IGLV 유전자의 IGHV 또는 IGLV 생식세포계열 유전자 패밀리 내의 각각의 위치에서 일어나는 잔기로 제한하였다. 7 내지 14개의 아미노산 길이의 짧은 내지 중간 크기의 합성 루프를 이용함으로써 H3 루프에서의 다양성을 생성하였다. H3에서의 아미노산 분포는 인간 항체에서의 아미노산의 관찰된 변동을 모방하도록 설계하였다. 라이브러리 설계는 문헌[Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010]에 상세히 기재되어 있다. 라이브러리를 생성하기 위해 이용된 스캐폴드는 그의 인간 VH 및 VL 생식세포계열 유전자 기원에 따라 명명하였다. 3개의 중쇄 라이브러리를 4개의 생식세포계열 경쇄 또는 생식세포계열 경쇄 라이브러리와 조합하여, 스크리닝을 위한 24개의 특유의 VH:VL 조합을 생성하였다. 모든 24개의 VH:VL 라이브러리 조합을 인간 CCL17에 대한 파지 패닝 실험에 이용하였다.
라이브러리들을 서열 번호 1의 인간 CCL17을 사용하여 패닝하였다. 간략하게 말하면, 표준 방법을 사용하여 인간 CCL17을 비오티닐화하고, 비오티닐화된 인간 CCL17(Bt-huCCL17)을 스트렙타비딘-코팅된 자성 비드(다이날(Dynal), M280) 상에 포획하고, Fab-pIX 파지 라이브러리를 비드에 첨가하였다. 사용된 Bt-huCCL17 농도는, 라운드 1 및 2에 대해서는 100 nM, 그리고 라운드 3 및 4에 대해서는 10 mM이었다. 인간 CCL17 단백질에 대한 Fab 결합에 대하여 ELISA에 의해 스크리닝을 행하였다. 패닝을 위하여, bt-huCCL17 코팅된 자성 비드를 PBST-M(0.05% 트윈-20 및 3% 탈지분유를 갖는 BPS)으로 세척하고 블로킹하였다. 라이브러리로부터의 블로킹된 파지를 비드에 첨가하고 라운드 1 동안에 실온에서 회전하였다. 비드를 세척하고, 이어서 대수기(log phase) E. 콜라이, (MC1061F') 세포의 배양물 중에서 인큐베이션하고, 감염된 E. 콜라이를 37℃에서 하룻밤 LB 한천 플레이트 상에서 성장시켰다. 다음날 아침, 플레이트당 2 mL 2xYT(20% 글리세롤) 중에서 플레이트들로부터 배양물을 긁어내고, 50 μL의 세균 현탁액을 50 mL 2xYT(Carb)에 첨가하고, 최대 2시간 동안 진탕하면서 37℃에서 성장시켰다. 헬퍼 파지를 중간-대수기 배양물에 첨가하고, 배양물을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 카나마이신 및 IPTG를 각각의 배양물에 각각 35 ㎍/mL 및 1 mM의 최종 농도로 첨가하고, 진탕하면서 30℃에서 하룻밤 성장시켰다. 세균 배지로부터의 증폭된 파지를 PEG/NaCl을 사용하여 침전시키고, 1 mL PBS 중에 재현탁시켰다. 패닝의 다음 라운드를 위해 200 μL를 사용하였다.
패닝의 3회의 라운드 후에, 감염된 MC1061F' 세포로부터 파지미드(phagemid) DNA를 단리하고, 제한 효소로 효소분해하여 pIX를 암호화하는 서열을 제거하고, 선형화된 플라스미드 DNA를 절제하고 아가로스 겔로부터 정제하였다. 이어서, 이 DNA를 T4 DNA 리가제로 자가-연결하였다. 연결된 DNA를 전기천공으로 MC1061F' 세포 내로 도입하고 LB(Carb/글루코스) 한천 플레이트 상에서 플레이팅하였다. 이러한 전기천공으로부터의 콜로니를 ELISA 스크린 및 Fab 발현의 평가를 위하여 취출하였다. Fab는 중쇄의 C-말단에서 프레임 내(in-frame) His 태그를 포함한다. 초기 스크린으로부터, 24개의 Fab를 표준 방법을 사용하여 C-말단 His 태그를 통해 부분적으로 정제하고 추가로 특성화하였다.
Fab를 ELISA 검정에서 인간 CCL17(서열 번호 1), 사이노 CCL17(서열 번호 2) 및 사이노 CCL22(서열 번호 3)에 대한 그의 결합에 대해 특성화하였다. 간략하게 말하면, 맥시소프(Maxisorp) 96웰 플레이트를 1 ㎍/ml 염소 항-인간 카파(서던 바이오테크(Southern Biotech))로 코팅하였다. 반정제된 Fab를 각각의 플레이트에 첨가하였다. 비오티닐화된 huCCL17, cCCL17 또는 cCCL22를 각각의 Fab-포획된 웰에 첨가하였다. 포획된 Fab에 결합된 단백질을 스트렙타비딘:HRP를 사용하여 검출하였다. 인간 CCL17 및 사이노 CCL17 둘 모두에는 결합되지만 사이노 CCL22에는 결합되지 않은 5개의 Fab(F21, F24, F34, F43 및 F44)를 친화성 성숙을 위해 선택하였다.
실시예 2. 항-CCL17 항체의 친화성 성숙
5개의 Fab를 그들의 초기 특성화 프로파일에 기초하여 친화성 성숙을 위해 선택하였다. 시(Shi) 등(문헌[Shi et al., J Mol Biol 397:385-396, 2010])에 기재된 인라인 성숙(in-line maturation) 기술을 사용하여 경쇄를 다양화하고 중쇄는 변함없이 유지함으로써 Fab를 친화성-성숙시켰다. Fab 내의 중쇄는 VH3-23 또는 VH5-51이었다. 생성된 F24 친화성 성숙 라이브러리는 CCL17 바인더(binder)를 개선하였다.
간략하게 말하면, B3 경쇄 라이브러리를 사용하여 F24를 친화성-성숙시켰다. B3 라이브러리 다양화 계획이 표 2에 나타나 있다. 위치는 카밧 넘버링(Kabat numbering)으로서 표시되어 있다.
[표 2]
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Fab의 VH 영역을 LC 라이브러리 파지미드 내로 클로닝하여, 각각의 Fab에 대해 LC의 완전한 재다양화를 가져왔다. NcoI 및 ApaI를 사용하여 DNA 미니프렙(miniprep)의 제한 효소분해에 의해 VH 영역을 단리하였다. VH 영역을 겔 단리하고, 유사하게 효소분해된 LC 라이브러리 DNA 내로 연결시켰다. 연결반응물(ligation)을 정제하고 MC1061F' 세포 내로 형질전환시켰다. 대수기 성장(OD600nm
Figure pct00006
0.6)이 달성될 때까지 세포를 2xYT(Carb) 중에서 성장시켰다. 헬퍼 파지를 첨가하고, 배양물을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 카나마이신 및 IPTG를 각각의 배양물에 각각 35 ug/mL 및 1 mM의 최종 농도로 첨가하고, 진탕하면서 30℃에서 하룻밤 성장시켰다. 세균 배지로부터의 파지를 PEG/NaCl을 사용하여 침전시키고, PBS 중에 재현탁시켰다.
친화성 성숙 패닝을 위하여, Bt-CCL17을 50 μl의 SA-코팅된 자성 비드 상에 포획하였다. 항원 농도는 라운드 1에 대해서는 100 nM, 라운드 2에 대해서는 10 nM, 그리고 라운드 3에 대해서는 10 nM이었다. 비드에 PBST로 6회의 세척을 그리고 PBS로 1회의 세척을 거친 후, 전술된 바와 같이 E. 콜라이 감염을 행하였다. Fab 발현 플라스미드의 단리 및 Fab의 발현을 기재된 바와 같이 행하였다.
친화성-성숙된 Fab를 huCCL17에 대한 결합에 대해 전술된 바와 같이 huCCL17(서열 번호 1), cCCL17(서열 번호 2) 및 cCCL22(서열 번호 3)에 대한 결합에 대해 ELISA 검정에서 스크리닝하였다. 확인된 클론을 서열분석하고, 완전 IgG1 항체로 전환시키고, MSD-SEA를 사용하여 huCCL17, cCCL17 및 cCCL22에 대한 그의 결합을 확인하였다.
부모 항체 및 친화성-성숙된 항체의 CDR 서열이 중쇄 및 경쇄 CDR에 대해 각각 표 3 및 표 4에 나타나 있다.
[표 3]
Figure pct00007
[표 4]
Figure pct00008
실시예 3. 인간 CCL17 및 사이노 CCL17에 대한 친화성- 성숙된 항- CCL17 항체의 결합
용액 평형 친화성(SEA)을 사용하여 인간 CCL17 및 사이노 CCL17에 대한 결합에 대하여 항체를 평가하였다. 이들 실험에 대한 절차는 헤넬(Haenel) 등(문헌[Haenel et al., Anal Biochem 339:182-184, 2005])에 의해 사용된 것과 유사하였다. 항원-항체 복합체를 제조하기 위하여, 인간 CCL17 또는 사이노 CCL17을 96-딥웰 폴리프로필렌 플레이트에서 2,000,000 pM의 농도로 출발하여, 0.05% 트윈-20, TBST(서모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 함유하는 Tris-기반 식염수 완충액 중에서 1:6 비로 연속 희석하였다. 40 pM 또는 200 pM의 동일한 부피의 항-hCCL17 mAb를 각각의 케모카인 희석물에 첨가하여, 일정 농도(20 pM 또는 100 pM)의 항-CCL17 항체 및 1 μM의 최종 농도에서 출발한 연속 희석의 케모카인들을 함유하는 혼합물들을 얻었다. 혼합물을 2회 반복하여 제조하고 4℃에서 48시간 동안 인큐베이션하여 평형에 도달하였다. 섹터 이미저(SECTOR Imager) 6000(메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery)) 기기를 사용하여 유리 항체를 검출하였다. 생성된 결합 곡선을 적합화(fit)하여, 데이터의 비선형 최소 제곱 회귀 분석을 수행하기 위하여 1:1 결합 모델을 사용하는 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어(v 5.01)를 사용하여 해리 평형 상수(KD)를 얻었다. 표 5는 인간 CCL17 및 사이노 CCL17에 대한 항체의 친화성을 나타낸다. 친화성은 인간 CCL17의 경우에는 약 2 pM 내지 약 700 pM, 그리고 사이노 CCL17의 경우에는 약 200 pM 내지 약 9500 pM의 범위였다. 생성된 항체는 사이노 CCL17과 대비할 때 약 2 내지 약 150배 더 높은 친화성으로 인간 CCL17에 결합하였다.
[표 5]
Figure pct00009
실시예 4. CCL17 항체의 최적화
C17B234 및 C17B240 항-CCL17 항체는 LCDR2의 개시 지점에 잠재적인 N-연결 글리코실화 부위("NAS")를 포함하였다. C17B234의 잔기 위치 50(카밧 넘버링)에서의 아스파라긴 잔기(N)를 6개의 상이한 아미노산(A, D, G, S, T 및 I)으로 돌연변이시켰다.
잠재적인 아스파르트산 이성질화 모티프, "DS"를 부모 C17F24 및 모든 그의 친화성-성숙된 변이체에서의 HCDR3에서 확인하였다. 이 위치에서의 치환의 효과를 시험하기 위하여, mAb C17B234의 중쇄에서, 위치 100c(카밧 넘버링)에서의 세린 잔기를 A, T 또는 S로 돌연변이시키거나, 또는 위치 100b에서의 D를 E로 돌연변이시켰다. 생성된 중쇄는 mAb C17B258의 경쇄와 쌍을 형성하였다.
항체를 IgG1로서 발현시키고, 인간 CCL17 및 사이노 CCL17에 대한 그의 친화성을 측정하였다. 표 6 및 표 7은 최적화된 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 나타낸다. 표 8은 인간 CCL17 및 사이노 CCL17에 대한 항체의 친화성을 나타낸다. 경쇄에서의 N50의 돌연변이생성은 2 내지 100배의 개선된 결합을 가져왔다.
[표 6]
Figure pct00010
[표 7]
Figure pct00011
[표 8]
Figure pct00012
C17B236의 mAb에서 위치 100a(카밧 넘버링)에서의 HCDR3 내의 트립토판 잔기는 원치 않는 번역 후 산화에 대한 추정 부위로서 확인되었다. 이 잔기를 C17B236의 Fab 부모 - C17F319, 이 mAb가 이것임 - 내의 17개의 다른 아미노산(C 및 M을 제외한 모두)으로 돌연변이시켰다. "NNK" 또는 규정된 코돈 올리고뉴클레오티드를 사용하여 쿤켈(Kunkel)의 돌연변이생성을 수행하여 이 패널을 생성하였다. 이어서, bt-인간 CCL17 및 bt-사이노 CCL17 둘 모두에 대한 결합에 대하여 랭킹 ELISA를 사용하여 이들 Fab를 스크리닝하였다. 5개의 변이체(W → R, Y, F, T, I)는 Fab 결합 ELISA에서 약간의 결합을 보여주었다(표 5). 가장 우수한 3개를 발현 및 MSD-SEA를 위하여 mAb(M17B288, C17B289, C17B290)로 전환시켰다(표 6). 대부분의 변이체는 인간 CCL17 및 사이노 CCL17에 대해 감소된 친화성을 나타내었다.
항체의 VH 및 VL 서열이 표 9에 나타나 있다.
[표 9]
Figure pct00013
실시예 6. 불변 영역의 선택
선택 항체를 표준 방법을 사용하여 다음의 치환으로 IgG2 또는 IgG4로서 클로닝하였다: IgG4 S228P/L234A/L235A 또는 IgG2 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S. 표 10은 생성된 항체를 나타낸다.
[표 10]
Figure pct00014
소정 항체의 중쇄 및 경쇄가 하기에 나타나 있다:
CB302 HC(서열 번호 67)
Figure pct00015
CB302 LC(서열 번호 68)
Figure pct00016
CB301 HC(서열 번호 69)
Figure pct00017
CB301 LC(서열 번호 70)
Figure pct00018
실시예 7. 항- CCL17 항체의 특성화
선택 항-CCL17 항체를 칼슘 플럭스 검정, β-아레스틴 리포터 검정에서, 그리고 주화성 검정에서 특성화하여 CCL17 생물학적 활성을 억제하는 그의 능력을 평가하였다.
칼슘 플럭스 검정. 칼슘 동원 검정을 사용하여, CCL17 신호전달을 중화시키는 하이브리도마 mAb의 능력에 대해 시험하였다. CCRF-CEM 세포(ATCC® CCL-119™)를 5% CO2 포화를 갖는 37℃ 인큐베이터에서 글루타맥스(GlutaMAX); 10% FBS; 10 mM Hepes, 1 mM 소듐 피루베이트, 4500 mg/L 글루코스, 및 1500 mg/ml 중탄산나트륨을 갖는 RPMI 중에서 배양하였다. 에이비디 바이오퀘스트, 인크.(ABD Bioquest, Inc.)로부터의 플루오-8 NW 무세척 칼슘 검정 키트(No Wash Calcium Assay Kit)(#36315)를 사용하여 세포를 염료로 표지하였다. 시험 항체 및 10 ng/mL 인간 CCL17 또는 5 ng/mL 사이노 CCL17을 시험 항체와 사전-인큐베이션하고, 혼합물을 세포에 첨가하였다. 490 nm 여기 및 525 nm 방출을 사용하는 FDSS 6000(하마마츠(Hamamatsu), 미국 뉴저지주 브리지워터 소재)을 사용하여 형광 신호를 검출하였다.
β-아레스틴 리포터 검정. β-아레스틴 검정을 사용하여, 항-CCL17 항체가 CCL17 기능을 중화시키는 능력을 평가하였다. 패스헌터 익스프레스(PathHunter eXpress) β-아레스틴 검정(디스커브알엑스(DiscoveRx))을 사용하여 검정을 수행하였다. 간략하게 말하면, 항-CCL17 항체가 CCL17-유도 β-아레스틴 동원을 억제하는 능력을, β-gal(효소 수용체 또는 EA로 지칭됨)의 N-말단 결실 돌연변이체와 β-아레스틴의 융합 단백질 및 작은 효소 단편 프로링크(ProLink)™와 프레임 내에서 융합된 CCR4를 공발현하는 Hek293 세포에서 평가하였다. 다양한 농도(0.15 nM 내지 1 μM)의 항-CCL17 항체를 20 nM CCL17과 배합하고, 항체-CCL17 복합체를 세포에 첨가하기 전에 이 혼합물을 37℃에서 20 내지 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 혼합물을 세포에 적용하고 37℃(95% O2/5% CO2)에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 웰당 55 μl의 검출 시약을 첨가하고 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 표준 발광 플레이트 리더에서 판독하고, IC50 값을 계산하였다.
주화성 검정: 주화성 검정을 사용하여 항-CCL17 항체가 CCL17 기능을 억제함을 보여주었다. HSC-F 세포(HSC-F 세포는 NIH 인간 이외의 영장류 시약 공급원(Nonhuman Primate Reagent Resource)을 통해 입수하였음) 또는 CCRF-CEM 세포(ATCC® CCL-119™)의 이주를 문헌[Imai et al. 1997]; 문헌[Imai et al. 1999]에 기재된 프로토콜에 따라 5 μm 폴리카르보네이트 필터를 사용하는 96웰 주화성 챔버를 사용하여 평가하였다. 간략하게 말하면, 하부 챔버를 항체 없이 또는 상이한 농도의 항체(0.125, 0.25, 0.5, 1 및 10 ㎍/ml)와 함께 320 μl RPMI/BSA 0.1% 및 1 nM의 인간 CCL17 또는 사이노 CCL17로 충전하고, 이어서 폴리카르보네이트 막으로 조심스럽게 덮어씌웠다. 세포를 PBS로 세척하고 0.5×106개 세포/ml로 RPMI/BSA 0.1% 중에 현탁하고, 세포 현탁액을 상부 챔버에 첨가하였다. 챔버를 37℃에서 5% CO2-가습된 인큐베이터 내에서 60분 동안 인큐베이션하고, 막을 가로질러 하부 챔버 내로 이주하는 세포의 수를 셀 타이터-글로 발광 세포 생존력(Cell Titer-Glo Luminescence Cell Viability)을 사용하여 측정하였다.
표 11은 칼슘 플럭스 검정에 대한 IC50 값을 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균이다. 각각의 mAb는 10 ng/ml(1.25 nM) 인간 CCL17 또는 5 ng/ml(0.625 nM) 사이노 CCL17을 사용하여 인간 CCL17 또는 사이노 CCL17에 의해 유도된 칼슘 플럭스를 완전히 중화시켰으며, 표 11에 나타낸 바와 같이, IC50 값은 인간 단백질 및 사이노 단백질 둘 모두에 대한 각각의 항체들에 대해 대략 동등하였다.
[표 11]
Figure pct00019
표 12는 β-아레스틴 검정에 대한 IC50 값을 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균이다. 모든 mAb는 20 nM에서 인간 CCL17 또는 사이노 CCL17-유도 β-아레스틴 동원을 완전히 억제하고, 동등한 효력으로 인간 CCL17 또는 사이노 CCL17에 의해 유도된 β-아레스틴 동원을 용량-의존적으로 억제할 수 있었다.
[표 12]
Figure pct00020
도 1 및 도 2는 각각 인간 및 사이노 세포에서의 선택 항체에 의한 주화성의 억제를 나타낸다. 시험된 모든 항체는 0.5 ㎍/ml의 항체 농도로 약 50%의 억제 수준으로 인간 CCL17-유도 CCRF-CEM 세포 주화성 둘 모두를 억제하였다. C17B302 및 C17B311은 0.5 ㎍/ml의 항체 농도로 약 50%의 억제 수준으로 사이노 CCL17에 의해 유도된 사이노 HSC-F 세포 주화성을 억제하였다.
실시예 8. 항-CCL17 항체 C17B236의 에피토프 매핑
항체 C17B236(VH: 서열 번호 45; VL: 서열 번호 52)의 결합 에피토프를 X선 결정학에 의해 결정하였다.
인간 CCL17을 봉입체(inclusion body)로부터 단리된 E. 콜라이에서 발현하고 다시 접혀지게 하였다. mAb C17B236의 Fab 단편을 HEK293F 세포에서 발현하였다. CCL17을 과량으로 하여 1.6:1의 몰비로 혼합함으로써 CCL17:C17B236 복합체를 제조하였다. 이어서, 복합체를 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. 복합체를 20% PEG 3350 및 0.2 M K/Na 타르트산염을 함유하는 용액으로부터 증기-확산 방법에 의해 결정화하였다. X선 회절 데이터를 1.9 Å 분해능으로 수집하였다. 구조를 분자 치환으로 결정하고, 18.0%의 R-팩터로 리파이닝(refining)하였다.
C17B236 에피토프는 입체구조형이고 CCL17 분자의 3개의 세그먼트, 즉 2개의 루프(잔기 21-23 및 44-45) 및 C-말단 나선(잔기 60-68)에 걸쳐 이어져 있다. 핵심 상호작용은 CCL17의 염기성 잔기 Arg22 및 Lys23과, Asp52, Asp55 및 Asp57을 포함한 HCDR2 내의 산성 잔기들의 클러스터를 포함한다. 이들 정전기 상호작용에 더하여, 에피토프의 중심에서의 반데르발스 접촉이 VH의 Trp33 및 Trp105와 CCL17의 Arg22 사이에 일어난다. 접촉의 수를 고려해볼 때, 에피토프의 핵심 잔기는 Arg22이며, 이는 VH의 Trp33에 스태킹하고(stack), HCDR3에 대한 다수의 접촉을 형성한다. 파라토프 및 에피토프 잔기가 도 7에 나타나 있다.
파라토프(CCL17에 결합하는 데 관여하는 항체 잔기)는 6개의 CDR 중 5개(LCDR2를 제외한 모두)에 속하는 18개의 잔기를 포함한다.
C17B236 에피토프는 CCL17 단량체에 대해 그의 이량화 표면으로부터 반대측에 있다. 따라서, C17B236은 CCL17의 이량화를 차단하지 않는다. C17B236의 중화 효과는 오버래핑(overlapping) 에피토프에 대한 CCR4와의 경쟁으로부터 기인된다.
서열:
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
SEQUENCE LISTING <110> Janssen Biotech, Inc. Boakye, Ken Del Vecchio, Alfred Kehoe, John Lacy, Eilyn Murray, Lynne Ryan, Mary Santulli-Marotto, Sandra Teplyakov, Alexey Wheeler, John Whitaker, Brian <120> Anti-CCL17 antibodies <130> JBI5040WOPCT <140> To be assigned <141> 2014-11-06 <150> 61/900,596 <151> 2013-11-06 <160> 76 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 71 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Arg Gly Thr Asn Val Gly Arg Glu Cys Cys Leu Glu Tyr Phe Lys 1 5 10 15 Gly Ala Ile Pro Leu Arg Lys Leu Lys Thr Trp Tyr Gln Thr Ser Glu 20 25 30 Asp Cys Ser Arg Asp Ala Ile Val Phe Val Thr Val Gln Gly Arg Ala 35 40 45 Ile Cys Ser Asp Pro Asn Asn Lys Arg Val Lys Asn Ala Val Lys Tyr 50 55 60 Leu Gln Ser Leu Glu Arg Ser 65 70 <210> 2 <211> 72 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 2 Met Ala Arg Gly Thr Asn Val Gly Arg Glu Cys Cys Leu Lys Tyr Phe 1 5 10 15 Lys Gly Ala Ile Pro Leu Arg Lys Leu Lys Thr Trp Tyr Gln Thr Ser 20 25 30 Glu Asp Cys Ser Arg Asp Ala Ile Val Phe Val Thr Val Gln Asn Lys 35 40 45 Ala Ile Cys Ser Asp Pro Asn Asp Lys Lys Val Lys Lys Ala Leu Lys 50 55 60 Tyr Leu Gln Ser Leu Glu Arg Ser 65 70 <210> 3 <211> 69 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 3 Gly Pro Tyr Gly Ala Asn Met Glu Asp Ser Val Cys Cys Arg Asp Tyr 1 5 10 15 Val Arg Tyr Arg Met Pro Leu Arg Val Val Lys His Phe Tyr Trp Thr 20 25 30 Ser Asp Ser Cys Pro Arg Pro Gly Val Val Leu Leu Thr Ser Arg Asp 35 40 45 Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Arg Val Pro Trp Val Lys Met Ile Leu 50 55 60 Asn Lys Leu Ser Gln 65 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HCDR1 of C17F24 <400> 4 Ser Tyr Trp Ile Gly 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HCDR2 of C17F24 <400> 5 Ile Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HCDR3 of C17F24 <400> 6 Val Gly Pro Ala Asp Val Trp Asp Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR1 of C17F24 <400> 7 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR1 of C17B234 <400> 8 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Leu Ser Phe Asp Asn Ile Asn Lys Leu 1 5 10 15 Ala <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR1 fo C17B235 <400> 9 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Phe Tyr Asn Phe Asn Ala Leu 1 5 10 15 Ala <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR1 of C17B236 <400> 10 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Leu Ser Pro Trp Asn Ser Asn Gln Leu 1 5 10 15 Ala <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR1 of C17B237 <400> 11 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Thr Ser Tyr Asn Asn Ser Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR1 of C17B238 <400> 12 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Ile Ser Ala Phe Asn Gln Asn Pro Leu 1 5 10 15 Ala <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR1 of C17B239 <400> 13 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Ser Ser Phe Thr Asn Thr Asn Thr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR1 of C17B240 <400> 14 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser His Val Asn Tyr Asn Ala Leu 1 5 10 15 Ala <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR1 of C17B241 <400> 15 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Ser Phe Thr Asn Asn Asn Ala Leu 1 5 10 15 Ala <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR1 of C17B242 <400> 16 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Phe Ser His Asp Asn Leu Asn Thr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR1 of C17B243 <400> 17 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Ser Phe Asp Asn Lys Asn Asp Leu 1 5 10 15 Ala <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR1 of C17B244 <400> 18 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Ser Ser Ile Thr Asn Val Asn Asp Leu 1 5 10 15 Ala <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR2 fo C17F24 <400> 19 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR2 of C17B234 <400> 20 Asn Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR2 fo C17B235 <400> 21 His Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR2 of C17B236 <400> 22 Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR2 of C17B237 <400> 23 Leu Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR2 of C17B238 <400> 24 Asp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR2 of C17B241 <400> 25 Glu Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR2 of C17B244 <400> 26 Thr Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR3 of C17F24 <400> 27 Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR3 of C17B234 <400> 28 Gln Gln Phe Tyr Ser Val Pro Ser Thr 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR3 of C17B235 <400> 29 Gln Gln Phe Tyr Ala Thr Pro Phe Thr 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR3 of C17B236 <400> 30 Gln Gln Tyr Tyr Leu Ile Pro Ser Thr 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR3 of C17B237 <400> 31 Gln Gln Tyr Leu Ser Pro Pro Ser Thr 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR3 of C17B238 <400> 32 Gln Gln Tyr Gln Phe Ile Pro Phe Thr 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR3 of C17B239 <400> 33 Gln Gln Tyr Leu Ile Tyr Pro Ser Thr 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR3 fo C17B240 <400> 34 Gln Gln Tyr Tyr Thr Leu Pro Ala Thr 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial 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Ser Val Pro Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 67 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CB302 HC <400> 67 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Pro Ala Asp Val Trp Asp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Thr Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys 210 215 220 Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ser Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Ala Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 68 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CB302 LC <400> 68 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Leu Ser 20 25 30 Phe Asp Asn Ile Asn Lys Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Phe Tyr Ser Val Pro Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 69 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CB301 HC <400> 69 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Pro Ala Asp Val Trp Asp Thr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Thr Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys 210 215 220 Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ser Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Ala Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 70 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CB301 LC <400> 70 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Leu Ser 20 25 30 Phe Asp Asn Ile Asn Lys Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Phe Tyr Ser Val Pro Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 71 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HCDR3 consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa may be Ser, Ala or Thr <400> 71 Val Gly Pro Ala Asp Val Trp Asp Xaa Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 72 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR1 consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa may be Leu, Tyr, Ser or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa may be Phe, Pro, His or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa may be Asp, Tyr, Trp, Thr or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa may be Ile, Phe, Ser, Thr, Tyr, Asn, Lys or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa may be Lys, Ala, Qln, Thr or Asp <400> 72 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Xaa Ser Xaa Xaa Asn Xaa Asn Xaa Leu 1 5 10 15 Ala <210> 73 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR2 consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa may be Asn, His, Gly, Glu, Thr or Asp <400> 73 Xaa Ala Ser Thr Arg Glu 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LCDR3 consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa may be Phe, Tyr, Thr or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa may be Tyr, Leu, Asn or Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa may be Ser, Ala, Leu, Ile, Thr, Qln or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa may be Val, Thr, Ile, Tyr, Leu or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa may be Ser, Phe, Ala or Leu <400> 74 Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr 1 5 <210> 75 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> VH consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (107)..(107) <223> Xaa may be Ser, Ala or Thr <400> 75 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Pro Ala Asp Val Trp Asp Xaa Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 76 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> VL consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa may be Leu, Tyr, Ser or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa may be Phe,Pro, His or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa may be Asp, Tyr, Trp, Thr or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Xaa may be Ile, Phe, Ser, Thr, Tyr, Asn, Lys or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa may be Lys, Ala, Qln, Thr or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(56) <223> Xaa may be Asn, His, Gly, Glu, Thr or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(97) <223> Xaa may be Phe, Tyr, Thr or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (98)..(98) <223> Xaa may be Tyr, Leu, Asn or Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(99) <223> Xaa may be Ser, Ala, Leu, Ile, Thr, Qln or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (100)..(100) <223> Xaa may be Val, Thr, Ile, Tyr, Leu or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (102)..(102) <223> Xaa may be Ser, Phe, Ala or Leu <400> 76 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Xaa Ser 20 25 30 Xaa Xaa Asn Xaa Asn Xaa Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys

Claims (37)

  1. 인간 CCL17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하며, 상기 항체는 인간 CCL17에 대한 결합에 있어서 서열 번호 45의 VH 및 서열 번호 52의 VL을 포함하는 항체와 경쟁하는, 항체.
  2. 제1항에 있어서, 인간 CCL17에 적어도 서열 번호 1의 CCL17 아미노산 잔기 21-23, 44-45 및 60-68 내에서 결합하는, 항체.
  3. 제2항에 있어서, 인간 CCL17에 적어도 서열 번호 1의 잔기 R22 및 K23에서 결합하는, 항체.
  4. 제1항에 있어서, CCL17/CCR4 상호작용을 차단하는, 항체.
  5. 제4항에 있어서, 약 1×10-10 M 이하의 친화성 상수(KD)로 인간 CCL17에 결합하며, 이때 KD는 4℃에서 48시간 동안 상기 항체와 인간 CCL17의 공-인큐베이션(co-incubation) 후에 0.05% 트윈(Tween)-20을 함유하는 Tris-기반 식염수 완충액 중에서의 용액 평형 친화성(solution equilibrium affinity)을 사용하여 측정되는, 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5×10-12 M 이하의 KD로 인간 CCL17에 결합하는, 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1×10-8 M 이하의 KD로 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)(사이노(cyno)) CCL17에 결합하며, 이때 KD는 4℃에서 48시간 동안 상기 항체와 사이노 CCL17의 공-인큐베이션 후에 0.05% 트윈-20을 함유하는 Tris-기반 식염수 완충액 중에서의 용액 평형 친화성을 사용하여 측정되는, 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 플루오(Fluo)-8 NW를 사용하여 측정된 CCRF-CEM 세포에서의 10 ng/ml 인간 CCL17-유도 칼슘 동원을 약 1×10-9 M 이하의 IC50 값으로 억제하는, 항체.
  9. 제5항에 있어서, 서열 번호 4, 5, 42, 8, 24 및 28의 아미노산 서열을 각각 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1(HCDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(HCDR2), 중쇄 상보성 결정 영역 3(HCDR3), 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1(LCDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(LCDR2) 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(LCDR3)을 포함하거나, 또는 각각 서열 번호 46 및 62의 VH 및 VL을 포함하는, 항체.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1(HCDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(HCDR2), 중쇄 상보성 결정 영역 3(HCDR3), 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1(LCDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(LCDR2) 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(LCDR3)을 포함하며, 상기 HCDR1, 상기 HCDR2, 상기 HCDR3, 상기 LCDR1, 상기 LCDR2 및 상기 LCDR3은 서열 번호 4, 5, 71, 72, 73 및 74의 아미노산 서열을 각각 포함하는, 항체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 HCDR1은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR3은 서열 번호 6, 42 또는 43의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 LCDR1은 서열 번호 8, 9, 10, 13, 14, 15, 17 또는 18의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열 번호 20, 21, 22, 24, 25 및 26의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열 번호 28, 29, 30, 33, 34, 35, 37 또는 38의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  13. 제12항에 있어서,
    a) 각각 서열 번호 4, 5, 6, 8, 20 및 28;
    b) 각각 서열 번호 4, 5, 6, 9, 21 및 29;
    c) 각각 서열 번호 4, 5, 6, 10, 22 및 30;
    d) 각각 서열 번호 4, 5, 6, 13, 21 및 33;
    e) 각각 서열 번호 4, 5, 6, 14, 20 및 34;
    f) 각각 서열 번호 4, 5, 6, 15, 25 및 35;
    g) 각각 서열 번호 4, 5, 6, 17, 25 및 37;
    h) 각각 서열 번호 4, 5, 6, 18, 26 및 38;
    i) 각각 서열 번호 4, 5, 42, 8, 24 및 28; 또는
    j) 각각 서열 번호 4, 5, 43, 8, 24 및 28의 상기 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는, 항체.
  14. 제10항에 있어서, 서열 번호 75의 VH 및 서열 번호 76의 VL을 포함하는, 항체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 VH는 서열 번호 45, 46 또는 47의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 VL은 서열 번호 50, 51, 52, 55, 56, 57, 59, 60 또는 62의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  17. 제16항에 있어서,
    a) 서열 번호 45의 VH 및 서열 번호 50, 51, 52, 55, 56, 57, 59 또는 60의 VL을 포함하거나;
    b) 각각 서열 번호 46 및 62의 VH 및 VL을 포함하거나;
    c) 각각 서열 번호 47 및 62의 VH 및 VL을 포함하는, 항체.
  18. 제5항에 있어서, 서열 번호 46의 VH와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 62의 VL과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 항체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 항체 또는 인간화 항체인, 항체.
  20. 제19항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 동형(isotype)을 갖는, 항체.
  21. 제20항에 있어서, Fc 영역 내에서의 치환을 포함하는, 항체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 치환은 IgG2 상에서의 V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S 또는 P331S 치환, 또는 IgG4 상에서의 S228P, L234A 또는 L235A 치환을 포함하며, 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따르는, 항체.
  23. 제22항에 있어서, 상기 치환은 IgG2 상에서의 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 치환, 또는 IgG4 상에서의 S228P/L234A/L235A 치환을 포함하며, 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따르는, 항체.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  25. 제9항 내지 제24항 중 어느 한 항의 항체의 상기 VH 또는 상기 VL을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  26. 제25항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  27. 제26항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  28. 제9항 내지 제24항 중 어느 한 항의 항체를 생성하는 방법으로서,
    상기 항체가 생성되는 조건 하에서 제27항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 생성 방법.
  29. CCL17-매개 질병을 치료하는 방법으로서,
    그를 필요로 하는 대상체에게 상기 CCL17-매개 질병을 치료하기에 충분한 시간 동안 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 CCL17-매개 질병은 염증성 질병인, 치료 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 염증성 질병은 천식, 궤양성 결장염(UC), 아토피성 피부염(AD) 또는 특발성 폐섬유증(IPF)인, 치료 방법.
  32. 천식 또는 기도 과민성(airway hyper-reactivity)을 치료하는 방법으로서,
    대상체에게 천식을 치료하기에 충분한 시간 동안 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
  33. 요법(therapy)을 위한 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 항체의 용도.
  34. 요법에서 사용하기 위한 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 항체.
  35. CCL17-매개 질병을 갖는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 항체.
  36. 제35항에 있어서, 상기 CCL17-매개 질병은 염증성 질병, 천식, 궤양성 결장염(UC), 아토피성 피부염(AD) 또는 특발성 폐섬유증(IPF)인, 상기 사용을 위한, 항체.
  37. 제36항에 있어서, 상기 CCL17-매개 질병은 천식인, 상기 사용을 위한, 항체.
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