JP2016537024A - 抗ｃｃｌ１７抗体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ＣＣＬ１７に特異的に結合する抗体、該抗体又は断片をコードするポリヌクレオチド、並びに前述のものを作製及び使用する方法に関する。

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、２０１３年１１月６日出願の米国仮特許出願第６１／９００，５９６号の利益を主張するものであり、その全容が参照により本明細書に組み込まれる。
（発明の分野）
本発明は、ＣＣＬ１７に特異的に結合する抗体、該抗体又は断片をコードするポリヌクレオチド、並びに前述のものを作製及び使用する方法に関する。
恒常性ケモカインＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１７）は、強力なリンパ球走化性誘引物質である。ＣＣＬ１７は、Ｔ細胞及び走化性の機能、並びに免疫細胞の炎症部位への移動に重要であると考えられるＧＰＣＲであるＣＣＲ４のリガンドである。ＣＣＲ４は、Ｔｈ２リンパ球、ナチュラルキラー細胞、及びｉＮＫＴ細胞上で主に発現される。
ＣＣＬ１７は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、及び喘息などの様々な臓器に影響を及ぼすヒト疾患に関連する（Ｂｅｌｐｅｒｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７３：４６９２−４６９，２００４、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｌａｍｍ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ．ｄｏｉ：１０．１００２／ｉｂｄ．２２９５、Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ，２４：４９〜５６，２００４、Ｋａｋｉｎｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０７：５３５〜５４１，２００１、Ｓａｅｋｉ ａｎｄ Ｔａｍａｋｉ，Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｓｃｉ，４３：７５〜８４，２００６、Ｔａｍａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ，３３：３００〜３０２，２００６）。マウスにおいて、ＣＣＬ１７は、おそらくＣＣＲ４+免疫細胞の動員を通してＴｈ２応答を誘導することにより、線維症及び喘息のモデルにおいて示される慢性の肺の炎症、大腸炎、並びに住血吸虫症などの様々な炎症性状態及び感染に関連付けられてきた。ＣＣＬ１７の中和は、喘息のＡ．フミガーツス及びオボアルブミン（ＯＶＡ）モデルの両方における疾患の影響、並びにＴ細胞の流入を阻止することによって誘導された肝損傷のＰ．アクネスマウスモデルにおける肝障害を改善する（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ａｎｄ Ｈｏｇａｍｏａｍ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ，７３：７１９８〜７２０７，２００５、Ｈｅｉｓｅｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１４２：３３５〜３４５、Ｈｏｇａｍｏａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ Ｍｙｃｏｌ，４３ Ｓｕｐｐｌ １，Ｓ１９７〜２０２，２００５、Ｉｓｍａｉｌｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ＣＣＬ１７ ｖｉａ ｔｈｅ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｆｕｎｇａｌ ａｓｔｈｍａ．Ｐａｐｅｒ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ，２０１１、Ｊａｋｕｂｚｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，１６５：１２１１−１２２，２００４、Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６６：２０５５〜２０６２，２００１、Ｙｏｎｅｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１０２：１９３３〜１９４１，１９９８）。
ＣＣＬ２２（ＭＤＣ）は、ＣＣＲ４の第２のリガンドである。ＣＣＲ４の各ケモカインとの相互作用が異なる結果をもたらし（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２５：７８７〜８２０，２００７、Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３：１７６４〜１７６８，１９９８）、これはおそらく、ＣＣＲ４に対する２つのリガンドの結合親和性の相違が寄与する。ＣＣＬ２２は、高親和性でＣＣＲ４と結合し、ＣＣＬ１７よりも容易に受容体内在化を誘導し（Ｂａａｔａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７９：１９９６〜２００４，２００７、Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３：１７６４〜１７６８，１９９８、Ｍａｒｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３４：２３１〜２４０，２００４）、ＣＣＬ１７よりも容易に細胞接着を促進する（Ｄ’Ａｍｂｒｏｓｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９：２３０３〜２３１２，２００２）。ＣＣＬ２２は、生成が免疫細胞に限定される、より制限された発現を示すが、ＣＣＬ１７は、非免疫細胞を含む多くの異なる細胞型によって発現及び分泌される（Ａｌｆｅｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９７：５８５〜５９９，２００３、Ｂｅｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４：３８２〜３８９，２００１、Ｇｏｄｉｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８５：１５９５〜１６０４，１９９７、Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：２１５１４〜２１５２１，１９９６、Ｓａｅｋｉ ａｎｄ Ｔａｍａｋｉ，Ｊ Ｂｅｒｍａｔｏｌ Ｓｃｉ ４３：７５〜８４，２００６）。実験的敗血症のマウス盲腸結紮（ceacal ligation）及び穿刺（ＣＬＰ）モデルにおいて、ＣＣＬ２２は、先天性免疫を促進したが、ＣＣＬ１７は、臓器障害に干渉し、いくつかの場合では、それに寄与するように思われる（Ｍａｔｓｕｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ ２：３３９〜３５８，２０００）。肺侵襲性アスペルギルス症のマウスモデルにおいて、ＣＣＬ２２は、先天性抗真菌応答において保護的役割を果たしたが、ＣＣＬ１７は、抑制剤の役割を果たした（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ａｎｄ Ｈｏｇａｂｏａｍ，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７３：７１９８〜７２０７，２００５）。これら２つのケモカインは、Ｔｒｅｇ動員がＣＣＬ２２には好まれるが、ＣＣＬ１７には好まれないという点で、Ｔｒｅｇ恒常性に対する示唆的効果により、局所炎症の確立において対照的な役割を果たし得る（Ｈｅｉｓｅｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １４２：３３５〜３４５，２０１１、Ｍｏｎｔａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１２１：３０２４〜３０，２０１１、Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２１：２８９８〜２９１０，２０１１）。
接触過敏症の動物モデルにおいて、ＣＣＬ１７は、ＦＩＴＣ又はＤＮＦＢのいずれかでの負荷に対する炎症応答駆動接触過敏症（ＣＨＳ）の開始における主な要因であり、これらのマウスにおけるＣＣＬ１７ノックアウトは、１つの機能性ＣＣＬ１７対立遺伝子を有するヘテロ接合マウスと比較して、心移植の生存率を高めた（Ａｌｆｅｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９７：５８５〜５９９，２００３）。
ＣＣＲ４アンタゴニストは、非選択的であり、ＣＣＬ１７及びＣＣＬ２２の両方の機能を阻害し得る。したがって、喘息を含む様々なＣＣＬ１７媒介疾患の潜在的な治療のための抗ＣＣＬ１７抗体の必要性が存在する。
本発明の一実施形態は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ヒトＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体であり、該抗体は、配列番号４５のＶＨ及び配列番号５２のＶＬを含む抗体と、ヒトＣＣＬ１７への結合を競合する。
本発明の別の実施形態は、配列番号１の配列を有するヒトＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体であり、該抗体は、少なくともＣＣＬ１７のアミノ酸残基２１〜２３、４４〜４５、及び６０〜６８内でヒトＣＣＬ１７と結合する。
本発明の別の実施形態は、ヒトＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体であり、該抗体は、約１×１０-10Ｍ以下の親和性定数（ＫD）でヒトＣＣＬ１７に結合し、このとき、ＫDは、抗体及びヒトＣＣＬ１７を４℃で４８時間同時にインキュベートした後、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するトリス系生理食塩水緩衝液中の溶液平衡親和性を使用して測定される。
本発明の別の実施形態は、特定のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含むヒトＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体である。
本発明の別の実施形態は、特定のＶＨ及びＶＬ配列を含む、ヒトＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体である。
本発明の別の実施形態は、ヒトＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体であり、該抗体は、配列番号４６のＶＨと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６２のＶＬと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
本発明の別の実施形態は、本発明の抗体と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物である。
本発明の別の実施形態は、本発明のＶＨ及びＶＬをコードする単離されたポリヌクレオチドである。
本発明の別の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。
本発明の別の実施形態は、抗体が生成される条件下で本発明の抗体の宿主細胞を培養する工程を含む、本発明の抗体を生成する方法である。
本発明の別の実施形態は、ＣＣＬ１７媒介疾患を治療するのに十分な時間の間、本発明の抗体を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、ＣＣＬ１７媒介疾患を治療する方法である。
本発明の別の実施形態は、喘息を治療するのに十分な時間の間、本発明の抗体を対象に投与する工程を含む、喘息又は気道過敏性（airway hyper-reactivity）を治療する方法である。
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞において１ｎＭのヒトＣＣＬ１７によって誘導された走化性の、抗ＣＣＬ１７抗体Ｂ３０２による阻害を示す。Ｂ３０２は、Ｃ１７Ｂ３０２である。 ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞において１ｎＭのヒトＣＣＬ１７によって誘導された走化性の、抗ＣＣＬ１７抗体Ｂ３１１による阻害を示す。Ｂ３１１は、Ｃ１７Ｂ３１１である。 ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞において１ｎＭのヒトＣＣＬ１７によって誘導された走化性に対するＩｇＧ２アイソタイプ対照の作用を示す。 ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞において１ｎＭのヒトＣＣＬ１７によって誘導された走化性に対するＩｇＧ４アイソタイプ対照の作用を示す。 ＨＳＣ−Ｆ細胞において１ｎＭのｃｙｎｏ ＣＣＬ１７によって誘導された走化性の、抗ＣＣＬ１７抗体Ｂ３０２による阻害を示す。Ｂ３０２は、Ｃ１７Ｂ３０２である。 ＨＳＣ−Ｆ細胞において１ｎＭのｃｙｎｏ ＣＣＬ１７によって誘導された走化性の、抗ＣＣＬ１７抗体Ｂ３１１による阻害を示す。Ｂ３１１は、Ｃ１７Ｂ３１１である。 ＨＳＣ−Ｆ細胞において１ｎＭのｃｙｎｏ ＣＣＬ１７によって誘導された走化性に対するＩｇＧ２アイソタイプ対照の作用を示す。 ＨＳＣ−Ｆ細胞において１ｎＭのｃｙｎｏ ＣＣＬ１７によって誘導された走化性に対するＩｇＧ４アイソタイプ対照の作用を示す。 １００ｎＭ以下のＫDでヒトＣＣＬ１７に結合する抗ＣＣＬ１７抗体のＶＨ配列を示す。 １００ｎＭ以下のＫDでヒトＣＣＬ１７に結合する抗ＣＣＬ１７抗体のＶＨ配列を示す。 １００ｎＭ以下のＫDでヒトＣＣＬ１７に結合する、図３に示される抗ＣＣＬ１７抗体のコンセンサスＶＨ及びＨＣＤＲ配列を示す。 １００ｎＭ以下のＫDでヒトＣＣＬ１７に結合する抗ＣＣＬ１７抗体のＶＬ配列を示す。 １００ｎＭ以下のＫDでヒトＣＣＬ１７に結合する抗ＣＣＬ１７抗体のＶＬ配列を示す。 １００ｎＭ以下のＫDでヒトＣＣＬ１７に結合する、図５に示される抗ＣＣＬ１７抗体のコンセンサスＶＬ配列を示す。 １００ｎＭ以下のＫDでヒトＣＣＬ１７に結合する、図５に示される抗ＣＣＬ１７抗体のコンセンサスＬＣＤＲ配列を示す。 抗体Ｃ１７Ｂ２３６のエピトープ残基及びパラトープ残基を示す。ＶＨ及びＶＬのパラトープ残基は四角で囲まれ、ＣＣＬ１７エピトープ残基は丸で囲まれる。残基の番号付けは、配列番号４５（ＶＨ）、配列番号５２（ＶＬ）、配列番号１（ＣＣＬ１７）に準ずる。
本明細書に引用される特許及び特許出願を含む（ただしそれらに限定されない）全ての刊行物は、参照によりあたかもそれらの全体が記載されているものと同様に、本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的でのみ使用され、限定を意図するものではないと理解すべきである。特に断らないかぎり、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の試験を実施するために使用できるが、例示となる材料及び方法を本明細書に記載する。本発明を説明及び特許請求する上で以下の用語が用いられる。
本明細書で使用される「特異的結合」又は「特異的に結合する」又は「結合する」とは、抗体が既定の抗原に、他の抗原に対するより高い親和性で結合することを指す。典型的には、抗体は、約１×１０-7Ｍ以下、例えば、約１×１０-8Ｍ以下、約１×１０-9Ｍ以下、約１×１０-10Ｍ以下、約１×１０-11Ｍ以下、約１×１０-12Ｍ以下、約１×１０-13Ｍ以下、又は約１×１０-14Ｍ以下の解離定数（ＫD）で既定の抗原に結合し、非特異的抗原又はエピトープ（例えば、ＢＳＡカゼイン）との結合に関しては、典型的には、そのＫDより少なくとも１０倍低いＫDで結合する。解離定数は標準的手法を用いて測定することができる。しかし、既定の抗原と特異的に結合する抗体は、他の関連抗原、例えばヒト又はサル、例えばＭａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）又はＰａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー、ｃｈｉｍｐ）などの他の種からの同様の既定の抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有する可能性がある。
「ヒトＣＣＬ１７に特異的に結合するモノクローナル抗体」とは、配列番号１に示される配列を有するヒト成熟ＣＣＬ１７に特異的に結合する抗体を指す。
本明細書で使用される「中和」又は「中和する」又は「中和抗体」又は「抗体アンタゴニスト」とは、いずれかの機構によって、ＣＣＬ１７の生物活性を部分的又は完全に阻害する抗体又は抗体断片を指す。中和抗体は、下に記載するＣＣＬ１７の生物活性用のアッセイを用いて確認することができる。ＣＣＬ１７中和抗体は、測定されるＣＣＬ１７の生物活性を２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％阻害し得る。
本明細書で互換的に使用される「ヒトＣＣＬ１７」又は「ｈｕＣＣＬ１７」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するヒトＣＣＬ１７タンパク質を指す。シグナル配列を含む完全長ＣＣＬ１７の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ：受入番号ＮＰ＿００２９７８で入手可能である。
本明細書で互換的に使用される「Ｃｙｎｏ ＣＣＬ１７」又は「ｃＣＣＬ１７」とは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＣＬ１７タンパク質を指す。
本明細書で使用される「抗体」は、広義が意図され、マウス、ヒト、ヒト化、及びキメラ抗体を含むモノクローナル抗体、抗体断片、少なくとも２つの無傷の抗体若しくは抗体断片から形成される二重特異性抗体又は多重特異性抗体、二量体の、四量体の若しくは多量体の抗体、一本鎖抗体、及び必要とされる特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子のいずれの他の修飾された構成も含む、免疫グロブリン分子を含む。
免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて５つの主なクラス、即ち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭに分類することができる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、ＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、及びＩｇＧ4アイソタイプに更に下位分類される。あらゆる脊椎種の抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて２つの明確に異なるタイプ、即ちカッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの１つに分類することができる。
用語「抗体断片」とは、重鎖及び／又は軽鎖抗原結合部位、例えば、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、２、及び３、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、２、及び３、重鎖可変領域（ＶＨ）、又は軽鎖可変領域（ＶＬ）を保有する免疫グロブリン分子の一部を指す。抗体断片は、ＶＬ又はＶＨからなる一価の断片であるＦａｂ断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ）2断片、ＶＨ及びＣＨＩドメインからなるＦｄ断片、一本のアームの抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６，１９８９）を含む。ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、操作され、合成リンカーを介して一緒に連結して様々な種類の一本鎖抗体設計を形成することができ、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが別々の一本鎖抗体構築物で発現される場合は、ＶＨ／ＶＬドメインが分子内又は分子間で対合して、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）又はダイアボディなどの一価の抗原結合部位を形成する（これらは、例えば、国際特許公開第ＷＯ１９９８／４４００１号、国際特許公開第ＷＯ１９８８／０１６４９号、国際特許公開第ＷＯ１９９４／１３８０４号、国際特許公開第ＷＯ１９９２／０１０４７号に記載されている）。これらの抗体断片は周知の技術を用いて得られ、断片は無傷抗体と同一の方法で特徴付けされる。
句「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、ヒトＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体は、ヒトＣＣＬ１７以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ヒトＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体は、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）ＣＣＬ１７など、ヒトＣＣＬ１７のオルソログなどの他の抗原に対して交差反応性を有する可能性がある。更に、単離された抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まない場合もある。
抗体可変領域は、３つの「抗原結合部位」で遮られた「フレームワーク」領域からなる。抗原結合部位は、様々な用語を用いて定義される：（ｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）、これは、配列特異性に基づいてＶＨ内に３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）及びＶＬ内に３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）存在する（Ｗｕ ａｎｄ Ｋａｂａｔ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １３２：２１１〜５０，１９７０、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）、（ｉｉ）「超可変領域」、即ち「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」、ＶＨ内に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ内に３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）存在し、これは、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜１７，１９８７）により定義される構造において超可変性である抗体可変ドメインの領域を指す。他の用語は、「ＩＭＧＴ−ＣＤＲ」（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐａｒａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５〜７７，２００３）及び「特異性決定残基使用（ＳＤＲＵ）（Ａｌｍａｇｒｏ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ，１７：１３２〜４３，２００４）を含む。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、抗原結合部位の標準化された番号付け及び定義を提供する。ＣＤＲ、ＨＶ、及びＩＭＧＴの表記の間の対応については、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５〜７７，２００３に記載されている。
本明細書で使用される「Ｃｈｏｔｈｉａ残基」は、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３：９２７〜４８，１９９７）に準じて番号付けされた抗体ＶＬ残基及びＶＨ残基である。
「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」は、抗原結合部位として定義されたこれらの配列以外の可変領域の残りの配列である。抗原結合部位は上記のような様々な用語によって定義され得るため、フレームワークの正確なアミノ酸配列は抗原結合部位がどのように定義されるかによって決まる。
「ヒト化抗体」とは、抗原結合部位がヒト以外の種に由来しかつ可変領域フレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する、抗体を指す。ヒト化抗体はフレームワーク領域内に置換を含む可能性があることから、当該フレームワークは、発現したヒト免疫グロブリン又は生殖細胞系列遺伝子配列の完全な複製物でなくてもよい。
「ヒト抗体」とは、フレームワーク及び抗原結合部位領域の両方がヒト起源の配列に由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する抗体を指す。抗体が定常領域を含む場合、定常領域もヒト起源の配列に由来する。
ヒト抗体は、抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合のヒト起源の配列に「由来する」重鎖可変領域又は軽鎖可変領域を含む。そのような系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリ、例えばファージ上に提示されたライブラリ、及び本明細書に記載されるヒト免疫グロブリン遺伝子座を保有するマウスなど、トランスジェニックのヒト以外の動物を含む。「ヒト抗体」は、例えば天然に存在する体細胞突然変異又は意図した置換の導入により、ヒト生殖系列又は再編成された免疫グロブリン配列と比較したとき、アミノ酸の相違を含み得る。典型的には、「ヒト抗体」は、アミノ酸配列において、ヒト生殖系列又は再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。いくつかの場合では、「ヒト抗体」は、例えばＫｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６：５７〜８６，２０００）に記載されるヒトフレームワーク配列分析から得られたコンセンサスフレームワーク配列、又は例えばＳｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５〜９６，２０１０及び国際特許公開第ＷＯ２００９／０８５４６号）に記載されるファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに組み込まれた合成ＨＣＤＲ３を含み得る。
単離されたヒト化抗体は合成であり得る。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来するが、ファージ提示組み込み合成ＣＤＲ及び／若しくは合成フレームワークなどの系を用いて生成されるか、又は抗体特性を改善するためにインビトロ突然変異誘発を受けることができ、インビボのヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しない抗体をもたらす。
ヒト抗体は、フレームワーク又は抗原結合部位に置換を含む可能性があるので、該ヒト抗体は、発現したヒト免疫グロブリン又は生殖系列遺伝子配列の正確な複製物でない場合がある。ただし、抗原結合部位がヒト以外の種から得られる抗体は、「ヒト抗体」の定義には含まれない。
本明細書で使用される用語「組換え抗体」は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニック若しくは染色体導入動物（例えばマウス）又はそれから調製されたハイブリドーマ（下で更に説明される）から単離された抗体、抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリから単離された抗体、並びにヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライスすることを伴う任意の他の手段により調製、発現、作製、又は単離された抗体などの組換え手段により調製、発現、作製、又は単離される全ての抗体を含む。
本明細書で使用されるとき、「モノクローナル抗体」という用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を意味する。
「実質的に同一の」という表現は、本明細書で使用されるとき、比較される２つの抗体可変領域のアミノ酸配列が同一であるか又は「ごく僅かな相違」があるということを意味する。ごく僅かな相違とは、抗体の特性に悪影響を及ぼさない抗体可変領域配列における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸の置換である。本明細書に開示される可変領域の配列と実質的に同一のアミノ酸配列は、本発明の範囲に属する。一部の実施形態では、配列の同一性は、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれよりも高い可能性がある。同一性パーセントは、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ｖ．９．０．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のＡｌｉｇｎＸモジュールの初期設定を使用するペアワイズアライメントによって決定することができる。本発明のタンパク質配列を問い合わせ配列として使用することで、例えば、近縁配列を確認するために公開データベース又は特許データベースでの検索を実行することができる。そのような検索を実行するために使用されるプログラム例は、初期設定を使用する、ＸＢＬＡＳＴ若しくはＢＬＡＳＴＰプログラム（ｈｔｔｐ＿／／ｗｗｗ＿ｎｃｂｉ＿ｎｌｍ／ｎｉｈ＿ｇｏｖ）、又はＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔ（商標）（ＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔ、Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）スイートである。
本明細書で使用される用語「エピトープ」とは、抗体が特異的に結合する抗原の一部を意味する。エピトープは通常、アミノ酸又は多糖類側鎖のような部位の化学的に活性な（極性、非極性又、は疎水性など）表面基からなり、特定の３次元構造特性及び特定の電荷特性を有し得る。エピトープは、立体配座空間単位を形成する連続した及び／又は連続していないアミノ酸からなり得る。連続していないエピトープについて、抗原の直鎖配列の異なる部分からのアミノ酸は、タンパク質分子の折り畳みを通じて、３次元空間において近接する。
本明細書で使用される「二重特異性」とは、２つの異なる抗原と結合する、又は抗原内の２つの異なるエピトープに結合する抗体若しくは分子を指す。
本明細書で使用されるとき、「単一特異性」とは、１つの抗原又は１つのエピトープと結合する抗体を指す。
本明細書で使用される用語「〜と組み合わせて」は、記載される薬剤が、混合物として一緒に、又は単独薬剤として同時に、又は単独薬剤として順次に任意の順序で、動物に投与され得ることを意味する。
用語「ベクター」は、生物系内で複製することが可能である、又はそのような系間を移動することができる天然に存在しないポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは典型的には、生物系内でこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を容易にするように機能する複製起点、ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーなどの関心のタンパク質及び追加の要素をコードするｃＤＮＡを含有する。そのような生物系の例としては、細胞、ウイルス、動物、植物、及びベクターを複製することが可能である生物学的成分を利用して再構成された生物系を挙げることができる。ベクターを構成するポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッド分子であってもよい。
用語「発現ベクター」は、生体系又は再構成された生体系において、その発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの翻訳を指示するために使用することができるベクターを意味する。
用語「ポリヌクレオチド」は、糖−リン酸骨格又は他の同等の共有結合化学作用により共有結合を介して連結されたヌクレオチド鎖からなる分子を意味する。二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡが、ポリヌクレオチドの典型例である。
「相補的ＤＮＡ」又は「ｃＤＮＡ」は、隣接するエキソンと天然の成熟ｍＲＮＡ種に見られる配列要素の配置を共有する周知の合成ポリヌクレオチドを指し、ゲノムＤＮＡに存在する介在イントロンは除去される。開始剤メチオニンをコードするコドンは、ｃＤＮＡに存在してもしなくてもよい。ｃＤＮＡは、例えば逆転写又は合成遺伝子アセンブリによって合成され得る。
本明細書で使用される「合成」又は「非天然の」とは、自然界に存在しないポリヌクレオチド又はポリペプチド分子を指す。
用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、ペプチド結合により連結されてポリペプチドを生成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を意味する。５０個未満のアミノ酸からなる小さいポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれる場合もある。
本明細書では表１に示すような従来の１文字及び３文字のアミノ酸コードを用いる。
Figure 2016537024
物質の組成物
本発明は、ヒトＣＣＬ１７に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。本発明の抗体は、細胞におけるＣＣＬ１７の生物活性を阻害し、かつ任意に、ｃｙｎｏ ＣＣＬ１７と交差反応し得る。本発明は、抗体及びその断片をコードする合成ポリヌクレオチド、ベクター及び宿主細胞、並びに本発明の抗体を作製及び使用する方法を提供する。
本発明の一実施形態は、ヒトＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体である。
本明細書に記載される本発明の別の実施形態は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ヒトＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体であり、該抗体は、配列番号４５のＶＨ及び配列番号５２のＶＬを含む抗体と、ヒトＣＣＬ１７への結合を競合する。
特定のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む本発明の抗体とのヒトＣＣＬ１７への特異的結合間の競合は、周知の方法を用いてインビトロでアッセイすることができる。例えば、非標識抗体の存在下での、ＭＳＤ Ｓｕｌｆｏタグ（商標）ＮＨＳ−エステル標識抗体の、ヒトＣＣＬ１７への結合は、ＥＬＩＳＡ法によって評価することができ、さもなければＢｉａｃｏｒｅ分析法若しくはフローサイトメトリーを用いて本発明の抗体との競合を示すことも可能である。試験抗体が配列番号４５のＶＨ及び配列番号５２のＶＬを含む抗体のヒトＣＣＬ１７への結合を阻害する能力は、試験抗体がヒトＣＣＬ１７への結合についてこれらの抗体と競合し得ることを示す。
本明細書に記載される本発明の別の実施形態は、配列番号１の配列を有するヒトＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体であり、該抗体は、少なくともＣＣＬ１７のアミノ酸残基２１〜２３、４４〜４５、及び６０〜６８内でヒトＣＣＬ１７に結合する。「少なくともＣＣＬ１７のアミノ酸残基２１〜２３、４４〜４５、及び６０〜６８内で」とは、抗ＣＣＬ１７抗体が配列番号１の残基２１〜２３のアミノ酸伸長内に位置する少なくとも１つの残基、並びに配列番号１の残基４４〜４５のアミノ酸伸長内に位置する少なくとも１つの残基、及び配列番号１の残基６０〜６８のアミノ酸伸長内に位置する少なくとも１つの残基に結合することを意味する。抗体は、配列番号１の残基２１〜２３、４４〜４５、及び６０〜６８内で２つ以上の残基、及び配列番号１の残基２１〜２３、４４〜４５、及び６０〜６８外の追加の残基に結合し得る。
本明細書に記載される一部の実施形態では、抗体は、配列番号１の少なくとも残基Ｒ２２及びＫ２３でヒトＣＣＬ１７に結合する。
本明細書に記載される一部の実施形態では、抗体は、配列番号１の少なくとも残基Ｌ２１、Ｒ２２、Ｋ２３、Ｖ４４、Ｑ４５、Ｎ６０、Ｙ６４、Ｓ６７、及びＬ６８でヒトＣＣＬ１７に結合する。
配列番号１のＣＣＬ１７のアミノ酸残基２１〜２３、４４〜４５、及び６０〜６８内でヒトＣＣＬ１７に結合する抗体の例は、配列番号４５のＶＨ及び配列番号５２のＶＬを有するＣ１７Ｂ２３６である。結晶構造分析から、Ｃ１７Ｂ２３６によって結合された主なエピトープ残基は、これらの残基と抗体ＶＨ残基との間の接触数に基づき、配列番号１のＣＣＬ１７のＲ２２及びＫ２３である。
ＣＣＬ１７のアミノ酸残基２１〜２３、４４〜４５、及び６０〜６８内でヒトＣＣＬ１７に結合する他の抗体の例は、Ｃ１７Ｂ２３６の親和性成熟変異体であり、その全抗体は、同一親抗体の親和性成熟キャンペーンに由来する。例示的な抗体のＶＨ及びＶＬ配列は、図３及び図５に示される。抗体の親和性成熟は、典型的には、ＣＤＲ又はバーニアゾーン（ＣＤＲを強調するフレームワーク領域）におけるアミノ酸置換を伴う。成熟変異体は、最大１０8の変異体を含有し得るコンビナトリアルライブラリをパニングすることにより選択される。ライブラリの大きさの上限は、２０個全てのアミノ酸が各位置で可能な場合、可変位置の数を６〜７に制限する。大半のパラトープ残基が、各コンビナトリアルライブラリにおいて保存され、これによって結合エピトープも保存されることを確実にする。親抗体及び成熟抗体のいくつかの結晶学研究は、エピトープが親和性成熟中に常に保存されることを示している（例えば、Ｆｒａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１０，３９８：２１４〜２３１、Ｇｕｓｔｃｈｉｎａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．２０１０，６：ｅ１００１１８２、Ｌａ Ｐｏｒｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ２０１４；６：１０５９〜１０６８）。
ＣＣＬ１７のアミノ酸残基２１〜２３、４４〜４５、及び６０〜６８内でヒトＣＣＬ１７に結合する抗ＣＣＬ１７抗体は、高親和性、典型的には約１×１０-10Ｍ未満のＫDでヒトＣＣＬ１７に結合する。
ＣＣＬ１７のアミノ酸残基２１〜２３、４４〜４５、及び６０〜６８内でヒトＣＣＬ１７に結合する抗体は、例えば、残基位置２１〜２３、４４〜４５、及び６０〜６８にヒトＣＣＬ１７配列を有するＣＣＬ１７キメラタンパク質でマウスを免疫化することにより、又は本明細書に記載される方法を用いて、野生型ヒトＣＣＬ１７でファージ提示ライブラリをパニングし、得られたヒットを、ヒトＣＣＬ１７の残基２１〜２３、４４〜４５、及び６０〜６８内の各残基位置若しくはいくつかの残基位置に置換を有するＣＣＬ１７変異体と交差スクリーニングすることにより作製され得る。
本明細書に記載される本発明の一部の実施形態では、ヒトＣＣＬ１７に特異的に結合する抗体は、ＣＣＬ１７／ＣＣＲ４相互作用を阻止する。
抗体の、ＣＣＬ１７／ＣＣＲ４相互作用阻止能力については、標準的なフローサイトメトリーにより試験することができる。例えば、ＣＣＲ４を発現する細胞を、蛍光標識されたヒトＣＣＬ１７及び試験抗体とインキュベートし、その後、標準的な方法を用いて蛍光標識されたヒトＣＣＬ１７のＣＣＲ４発現細胞上への結合を評価する。「ＣＣＬ１７／ＣＣＲ４相互作用を阻止する」又は「ＣＣＬ１７／ＣＣＲ４相互作用を阻害する」抗体は、抗体の不在下のＣＣＬ１７の結合と比較したとき、ＣＣＬ１７のＣＣＲ４発現細胞への結合を、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％阻害し得る。
本明細書に記載される本発明の別の実施形態は、ヒトＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体であり、該抗体は、約１×１０-7Ｍ以下、約１×１０-8Ｍ以下、約１×１０-9Ｍ以下、約１×１０-10Ｍ以下、約１×１０-11Ｍ以下、約１×１０-12Ｍ以下、約１×１０-13Ｍ以下、又は約１×１０-14Ｍ以下の親和性定数（ＫD）でヒトＣＣＬ１７に結合し、このとき、ＫDは、抗体及びヒトＣＣＬ１７を４℃で４８時間同時にインキュベートした後、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するトリス系生理食塩水緩衝液中の溶液平衡親和性を使用して測定される。
本明細書に記載される一部の実施形態では、抗体は、約１×１０-10Ｍ以下の親和性定数（ＫD）でヒトＣＣＬ１７に結合し、このとき、ＫDは、抗体及びヒトＣＣＬ１７を４℃で４８時間同時にインキュベートした後、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するトリス系生理食塩水緩衝液中の溶液平衡親和性を使用して測定される。
本明細書に記載される一部の実施形態では、抗体は、約５×１０-12Ｍ以下のＫDでヒトＣＣＬ１７に結合する。
本明細書に記載される別の実施形態では、ヒトＣＣＬ１７に特異的に結合する本発明の抗体は、約１×１０-6Ｍ以下、約１×１０-7Ｍ以下、約１×１０-8Ｍ以下、約１×１０-9Ｍ以下、約１×１０-10Ｍ以下、約１×１０-11Ｍ以下、又は約１×１０-12Ｍ以下の親和性定数（ＫD）でカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＣＬ１７に結合し、このとき、ＫDは、抗体及びｃｙｎｏ ＣＣＬ１７を４℃で４８時間同時にインキュベートした後、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するトリス系生理食塩水緩衝液中の溶液平衡親和性を使用して測定される。
本明細書に記載される一部の実施形態では、本発明の抗体は、約１×１０-8Ｍ以下のＫDでカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＣＬ１７に結合し、このとき、ＫDは、抗体及びｃｙｎｏ ＣＣＬ１７を４℃で４８時間同時にインキュベートした後、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するトリス系生理食塩水緩衝液中の溶液平衡親和性を使用して測定される。
配列番号１の配列を有するヒトＣＣＬ１７又は配列番号２の配列を有するｃｙｎｏ ＣＣＬ１７に対する抗体の親和性は、任意の好適な方法を用いて実験的に測定され得る。そのような方法は、当業者に既知のＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６若しくはＢｉａｃｏｒｅ ３０００などのＰｒｏｔｅｏｎ、Ｂｉａｃｏｒｅ、又はＫｉｎＥｘＡ機器、溶液平衡親和性（ＳＥＡ）、ＥＬＩＳＡ、又は競合結合アッセイを利用し得る。例示的な方法は、実施例３に記載されるものである。特定の抗体／ＣＣＬ１７相互作用の測定された親和性は、異なる条件（例えば、容量オスモル濃度、ｐＨ、緩衝液、洗剤濃度）下で測定される場合に異なり得る。したがって、親和性及び他の結合パラメータ（例えば、ＫD、Ｋon、Ｋoff）の測定は、好ましくは標準的な条件及び本明細書に記載される緩衝液などの標準化緩衝液を用いて行われる。例えば、溶液平衡親和性、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００、又はＰｒｏｔｅＯｎを用いた親和性測定での内部エラー（標準偏差（ＳＤ）として測定されるもの）は典型的には、典型的な検出限界内で測定した場合、５〜３３％の範囲内であり得ることを当業者は理解するであろう。したがって、用語「約」は、アッセイにおける典型的な標準偏差を表す。例えば、ＫDが１×１０-9Ｍの場合の典型的なＳＤは、最大±０．３３×１０-9Ｍである。
本明細書に記載される本発明の別の実施形態は、ヒトＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体であり、該抗体は、ＣＣＬ１７生物活性を阻害する。
本明細書で使用される「ＣＣＬ１７生物活性」は、ＣＣＬ１７がその受容体ＣＣＲ４に結合した結果として生じる、任意の活性を指す。例示的なＣＣＬ１７生物活性は、細胞内カルシウム動員又は細胞、例えばＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（急性白血病の患者からのＴリンパ芽球様細胞系）の走化性をもたらす。本発明の抗体は、標準的な方法及び本明細書に記載されるものを用いてＣＣＬ１７生物活性の阻害能力について試験され得る。例えば、本発明の抗体の、ＣＣＬ１７依存細胞内カルシウム動員の阻害能力は、Ｆｌｕｏ−８ ＮＷ、Ｆｌｕｏ−４ ＡＭ、又はＦｌｕｏ−３ ＡＭなどの蛍光染料を用いて、ＣＣＬ１７によって誘導されるカルシウム動員に対する抗体の作用を測定することによりアッセイされ得る。本発明の抗体の、ＣＣＬ１７によって誘導される走化性の阻害能力は、２チャンバ培養システムにおいて半透性の５μＭのフィルタを通るＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の移動を測定し、フィルタを通って移動した細胞の生存率を測定することにより測定され得る。本発明の抗体は、ＣＣＬ１７生物活性を、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％阻害し得る。
本明細書に記載される本発明の別の実施形態は、ＣＣＬ１７に特異的に結合する抗体であり、該抗体は、約１×１０-7Ｍ以下、約１×１０-8Ｍ以下、又は約１×１０-9Ｍ以下のＩＣ50値で、Ｆｌｕｏ−８ ＮＷを用いて測定される１０ｎｇ／ｍｌのヒトＣＣＬ１７によって誘導されるＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞中のカルシウム動員を阻害する。
本明細書に記載される本発明の別の実施形態は、ＣＣＬ１７に特異的に結合する抗体であり、該抗体は、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）の１（ＨＣＤＲ１）、２（ＨＣＤＲ２）、及び３（ＨＣＤＲ３）と、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）の１（ＬＣＤＲ１）、２（ＬＣＤＲ２）、及び３（ＬＣＤＲ３）とを含み、該ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４、５、７１、７２、７３、及び７４のアミノ酸配列を含む。
配列番号４、５、７１、７２、７３、及び７４のＨＣＤＲ及びＬＣＤＲ配列を含む抗体は、１×１０-10以下のＫDでヒトＣＣＬ１７に結合する。
ＨＣＤＲ１：ＳＹＷＩＧ（配列番号４）
ＨＣＤＲ２：ＩＩＤＰＳＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号５）
ＨＣＤＲ３コンセンサス配列
ＶＧＰＡＤＶＷＤＸ1ＦＤＹ（配列番号７１）
式中、
Ｘ1は、Ｓ、Ａ、又はＴである。
ＬＣＤＲ１コンセンサス配列：
ＫＳＳＱＳＶＬＸ1ＳＸ2Ｘ3ＮＸ4ＮＸ5ＬＡ（配列番号７２）
式中、
Ｘ1は、Ｌ、Ｙ、Ｓ、又はＮであり、
Ｘ2は、Ｆ、Ｐ、Ｈ、又はＩであり、
Ｘ3は、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｔ、又はＶであり、
Ｘ4は、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｎ、Ｋ、又はＶであり、かつ
Ｘ5は、Ｋ、Ａ、Ｑ、Ｔ、又はＤである。
ＬＣＤＲ２コンセンサス配列：
Ｘ1ＡＳＴＲＥ（配列番号７３）
式中、
Ｘ1は、Ｎ、Ｈ、Ｇ、Ｅ、Ｔ、又はＤである。
ＬＣＤＲ３コンセンサス配列
ＱＱＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＰＸ5Ｔ（配列番号７４）
式中、
Ｘ1は、Ｆ、Ｙ、Ｔ、又はＨであり、
Ｘ2は、Ｙ、Ｌ、Ｎ、又はＷであり、
Ｘ3は、Ｓ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｔ、Ｑ、又はＨであり、
Ｘ4は、Ｖ、Ｔ、Ｉ、Ｙ、Ｌ、又はＤであり、かつ
Ｘ5は、Ｓ、Ｆ、Ａ、又はＬである。
本明細書に記載される一部の実施形態では、ＣＣＬ１７に特異的に結合する本発明の抗体において、ＨＣＤＲ１は配列番号４の配列を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号５の配列を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号６、４２、４３、又は４４の配列を含む。
本明細書に記載される一部の実施形態では、ＨＣＤＲ１は配列番号４のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号５のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号６、４２、又は４３のアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載される一部の実施形態では、ＬＣＤＲ１は、ＣＣＬ１７に特異的に結合する本発明の抗体において、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８の配列を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、３９、４０、又は４１の配列を含み、ＬＣＤＲ３は、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、又は３８の配列を含む。
本明細書に記載される一部の実施形態では、ＬＣＤＲ１は配列番号８、９、１０、１３、１４、１５、１７、又は１８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号２０、２１、２２、２４、２５、及び２６のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３は配列番号２８、２９、３０、３３、３４、３５、３７、又は３８のアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載される一部の実施形態では、ＣＣＬ１７に特異的に結合する抗体は、配列番号７５のＶＨ及び配列番号７６のＶＬを含む。
ＶＨコンセンサス配列（配列番号７５）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＳＹＷＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＩＩＤＰＳＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＶＧＰＡＤＶＷＤＸ1ＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
式中、
Ｘ1は、Ｓ、Ａ、又はＴである。
ＶＬコンセンサス配列（配列番号７６）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＸ1ＳＸ2Ｘ3ＮＸ4ＮＸ5ＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＸ6ＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10ＰＸ11ＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ；式中、
Ｘ1は、Ｌ、Ｙ、Ｓ、又はＮであり、
Ｘ2は、Ｆ、Ｐ、Ｈ、又はＩであり、
Ｘ3は、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｔ、又はＶであり、
Ｘ4は、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｎ、Ｋ、又はＶであり、
Ｘ5は、Ｋ、Ａ、Ｑ、Ｔ、又はＤであり、
Ｘ6は、Ｎ、Ｈ、Ｇ、Ｅ、Ｔ、又はＤであり、
Ｘ7は、Ｆ、Ｙ、Ｔ、又はＨであり、
Ｘ8は、Ｙ、Ｌ、Ｎ、又はＷであり、
Ｘ9は、Ｓ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｔ、Ｑ、又はＨであり、
Ｘ10は、Ｖ、Ｔ、Ｉ、Ｙ、Ｌ、又はＤであり、かつ
Ｘ11は、Ｓ、Ｆ、Ａ、又はＬである。
本明細書に記載される一部の実施形態では、ＣＣＬ１７に特異的に結合する抗体は、配列番号４５、４６、４７、又は４８のＶＨを含む。
本明細書に記載される一部の実施形態では、ＣＣＬ１７に特異的に結合する抗体は、配列番号４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、又は６６のＶＬを含む。
本明細書に記載される一部の実施形態では、ＣＣＬ１７に特異的に結合する抗体は、配列場号４５、４６、又は４７のアミノ酸配列を含むＶＨを含む。
本明細書に記載される一部の実施形態では、ＣＣＬ１７に特異的に結合する抗体は、配列場号５０、５１、５２、５５、５６、５７、５９、６０、又は６２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
本明細書に記載される本発明の別の実施形態は、ＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体であり、該抗体は、
それぞれ、配列番号４、５、６、７、１９、及び２７、
それぞれ、配列番号４、５、６、８、２０、及び２８、
それぞれ、配列番号４、５、６、９、２１、及び２９、
それぞれ、配列番号４、５、６、１０、２２、及び３０、
それぞれ、配列番号４、５、６、１１、２３、及び３１、
それぞれ、配列番号４、５、６、１２、２４、及び３２、
それぞれ、配列番号４、５、６、１３、２１、及び３３、
それぞれ、配列番号４、５、６、１４、２０、及び３４、
それぞれ、配列番号４、５、６、１５、２５、及び３５、
それぞれ、配列番号４、５、６、１６、２１、及び３６、
それぞれ、配列番号４、５、６、１７、２５、及び３７、
それぞれ、配列番号４、５、６、１８、２６、及び３８、
それぞれ、配列番号４、５、６、８、３９、及び２８、
それぞれ、配列番号４、５、６、８、２４、及び２８、
それぞれ、配列番号４、５、６、８、２２、及び２８、
それぞれ、配列番号４、５、６、８、４０、及び２８、
それぞれ、配列番号４、５、６、８、２６、及び２８、
それぞれ、配列番号４、５、６、８、４１、及び２８、
それぞれ、配列番号４、５、４２、８、２４、及び２８、
それぞれ、配列番号４、５、４３、８、２４、及び２８、又は
それぞれ配列番号４、５、４４、８、２４、及び２８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む。
本明細書に記載される本発明の別の実施形態は、ＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体であり、該抗体は、
配列番号４５のＶＨ、及び配列番号４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、又は６６のＶＬ、
それぞれ、配列番号４６及び６２のＶＨ及びＶＬ、
それぞれ、配列番号４７及び６２のＶＨ及びＶＬ、又は
それぞれ、配列番号４８及び６２のＶＨ及びＶＬを含む。
本明細書に記載される本発明の別の実施形態は、ＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体であり、該抗体は、
配列番号４５のＶＨ、及び配列番号５０、５１、５２、５５、５６、５７、５９、又は６０のＶＬ、
それぞれ、配列番号４６及び６２のＶＨ及びＶＬ、又は
それぞれ、配列番号４７及び６２のＶＨ及びＶＬを含む。
本明細書に記載される本発明の別の実施形態は、ＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体であり、該抗体は、配列番号４５のＶＨ、及び配列番号５０のＶＬを含む。
本明細書に記載される本発明の別の実施形態は、ＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体であり、該抗体は、配列番号４５のＶＨ、及び配列番号５１のＶＬを含む。
本明細書に記載される本発明の別の実施形態は、ＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体であり、該抗体は、配列番号４５のＶＨ、及び配列番号５２のＶＬを含む。
本明細書に記載される本発明の別の実施形態は、ＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体であり、該抗体は、配列番号４５のＶＨ、及び配列番号５５のＶＬを含む。
本明細書に記載される本発明の別の実施形態は、ＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体であり、該抗体は、配列番号４５のＶＨ、及び配列番号５６のＶＬを含む。
本明細書に記載される本発明の別の実施形態は、ＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体であり、該抗体は、配列番号４５のＶＨ、及び配列番号５７のＶＬを含む。
本明細書に記載される本発明の別の実施形態は、ＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体であり、該抗体は、配列番号４５のＶＨ、及び配列番号５９のＶＬを含む。
本明細書に記載される本発明の別の実施形態は、ＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体であり、該抗体は、配列番号４５のＶＨ、及び配列番号６０のＶＬを含む。
本明細書に記載される本発明の別の実施形態は、ＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体であり、該抗体は、配列番号４６のＶＨ、及び配列番号６２のＶＬを含む。
本明細書に記載される本発明の別の実施形態は、ＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体であり、該抗体は、配列番号４７のＶＨ、及び配列番号６２のＶＬを含む。
本明細書に記載される本発明の別の実施形態は、ＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体であり、該抗体は、配列番号４６のＶＨと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６２のＶＬと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
そのような例示的な抗体は表９に示される抗体である。
重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ、ＶＨ、又はＶＬアミノ酸配列が表３、４、６、７、及び９に示されるものと実質的に異ならない抗体は、本発明の範囲内に包含される。典型的には、これは、抗体の特性に悪影響を及ぼすことなく、抗原結合部位若しくはフレームワークにおいて類似する電荷、疎水性、又は立体化学的特徴を有するアミノ酸との１つ又は２つ以上の保存的アミノ酸置換を伴う。保存的置換は、例えば安定性又は親和性といった抗体の特性を向上させるためにも行われ得る。１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５のアミノ酸置換がＶＨ又はＶＬ配列に対して行われ得る。例えば、「保存的アミノ酸置換」では、その位置のアミノ酸残基の極性又は電荷にほとんどあるいはまったく影響しないように天然アミノ酸残基を非天然残基と置換することができる。更に、ポリペプチドにおける任意の天然残基は、アラニン走査変異誘発について前述されるように、アラニンとも置換され得る（ＭａｃＬｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ａｃｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．６４３：５５〜６７、Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｓｙ’ｓ．３５：１〜２４）。当業者であれば、所望のアミノ酸置換を、そのような置換が望ましい時点で決定することができる。例えば、アミノ酸置換を用いることによってその分子の配列の重要な残基を特定したり、又は本明細書で述べる分子の親和性を増大若しくは減少させることができる。以下の８つのグループは、互いに保存的アミノ酸置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照）。
アミノ酸置換は、例えば、ＰＣＲ変異誘発（米国特許第４，６８３，１９５号）によって行うことができる。変異体のライブラリは、周知の方法を用いて、例えば、ランダムコドン（ＮＮＫ）又は非ランダムコドン、例えば１１個のアミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）をコードするＤＶＫコドンを用い、そして所望の特性を有する変異体のライブラリをスクリーニングすることで生成することができる。
実施例で説明する実施形態は、１個が重鎖に由来し、１個が軽鎖に由来する１対の可変領域を有しているが、当業者であれば代替的な実施形態は、１個の重鎖又は軽鎖の可変領域を有してもよいということを認識するであろう。１個の可変領域を用いることで、例えば配列番号１の配列を有するヒトＣＣＬ１７に結合することが可能な２ドメイン特異的抗原結合断片を形成することが可能な可変ドメインについてスクリーニングを行うことができる。スクリーニングは、例えば、国際特許公開第ＷＯ１９９２／０１０４７号に開示される階層的２重コンビナトリアルアプローチを用いたファージ提示スクリーニング法によって実現することが可能である。このアプローチでは、Ｈ鎖又はＬ鎖のいずれかのクローンを含む個別のコロニーを用いて、他方の鎖（Ｌ又はＨ）をコードするクローンの完全なライブラリに感染させ、得られた２鎖特異的抗原結合ドメインを記載されるようなファージ提示法に基づいて選択する。したがって、個別のＶＨ及びＶＬポリペプチド鎖は、国際特許公開第ＷＯ１９９２／０１０４７号に開示される方法を用いて、配列番号１の配列を有するヒトＣＣＬ１７に特異的に結合する追加の抗体を特定するのに有用である。
本明細書に記載される本発明の抗体は、モノクローナル抗体を生成するための様々な技術を用いて作製することができる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５，１９７５のハイブリドーマ法を使用することができる。ハイブリドーマ法において、ハムスター、ラット、又はサルなどのマウス又は他の宿主動物を、ヒトＣＣＬ１７の細胞外タンパク質などのヒトＣＣＬ１７及び／又はｃｙｎｏ ＣＣＬ１７タンパク質若しくはこれらのタンパク質の断片で免疫化し、続いて標準的な方法を用いて免役化した動物からの脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９〜１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。１個の不死化したハイブリドーマ細胞から発生したコロニーを、結合特異性、交差反応性又はその欠如、及び抗原の親和性などの所望の特性を有する抗体の生成についてスクリーニングする。
様々な宿主動物を使用して、ヒトＣＣＬ１７に対する抗体を生成することができる。例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用して、マウス抗ヒトＣＣＬ１７抗体を生成することができる。Ｂａｌｂ／ｃマウス及び他のヒト以外の動物において作製された抗体は、よりヒトのような配列を生成するために、様々な技術を用いてヒト化することができる。ヒト受容体フレームワークの選択を含む例示的なヒト化技術は、当該技術分野において既知であり、ＣＤＲ移植（米国特許第５，２２５，５３９号）、ＳＤＲ移植（米国特許第６，８１８，７４９号）、リサーフェーシング（Ｐａｌｉｎ，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８：４８９〜４９９，１９９１）、特異性決定残基リサーフェーシング（米国特許第２０１０／０２６１６２０号）、ヒト適応（又はヒトフレームワーク適応）（米国特許公開第ＵＳ２００９／０１１８１２７号）、超ヒト化（米国特許第７，７０９，２２６号）、及びガイド選択（（Ｏｓｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１〜６８，２００５、米国特許第５，５６５，３３２号）を含む。
ヒト化抗体は、国際特許公開第ＷＯ１９９０／００７８６１号及び国際特許公開第ＷＯ１９９２／２２６５３号に記載される開示物などの技術により、結合親和性を保存するために改変したフレームワーク支持残基を組み込むことによって所望の抗原に対するそれらの選択性又は親和性を向上させるように更に最適化され得る。
それらのゲノムにヒト免疫グロブリン遺伝子座を保有するトランスジェニックマウスを使用して、標的タンパク質に対してヒト抗体を生成することができ、例えば、国際特許公開第ＷＯ１９９０／０４０３６号、米国特許第６，１５０，５８４号、国際特許公開第ＷＯ１９９９／４５９６２号、国際特許公開第ＷＯ２００２／０６６６３０号、国際特許公開第ＷＯ２００２／４３４７８号、Ｌｏｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６〜９，１９９４、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：１３〜２１，１９９４、Ｇｒｅｅｎ ＆ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８８：４８３〜９５，１９９８、Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：６５〜９３，１９９５、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：１３２３〜１３２６，１９９１、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：８４５〜８５１，１９９６、Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １５：１４６〜１５６，１９９７、Ｇｒｅｅｎ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１１〜２３，１９９９、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９：１２３６〜１２４３，１９９９、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｔａｕｓｓｉｇ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ８：４５５〜４５８，１９９７、国際特許公開第ＷＯ２００２／０４３４７８号）に記載されている。そのようなマウスにおける内因性免疫グロブリン遺伝子座は、破壊又は欠失されてよく、相同又は非相同組換え、導入染色体、又はミニ遺伝子を使用して、少なくとも１つの完全な又は部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子座をマウスゲノム内に挿入することができる。Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ＿ｃｏｍ）、Ｈａｒｂｏｕｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ （ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｈａｒｂｏｕｒａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ＿ｃｏｍ）、Ｏｐｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（ＯＭＴ）（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｏｍｔｉｎｃ＿ｎｅｔ、ＫｙＭａｂ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｋｙｍａｂ＿ｃｏｍ）、Ｔｒｉａｎｎｉ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ．ｔｒｉａｎｎｉ＿ｃｏｍ）、及びＡｂｌｅｘｉｓ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ａｂｌｅｘｉｓ＿ｃｏｍ）などの企業は、上述の技術を用いた、選択された抗原を標的とするヒト抗体の提供に従事している可能性がある。
ヒト抗体は、ファージがヒト免疫グロブリン又はその一部（Ｆａｂ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、又は非対合若しくは対合抗体可変領域など）を発現するように操作されるファージ提示ライブラリから選択され得る（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６：５７〜８６，２０００、Ｋｒｅｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２５４：６７〜８４，２００１、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０９〜３１４，１９９６、Ｓｈｅｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＩＴＡＳ（ＵＳＡ）９５：６１５７〜６１６２，１９９８、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２７：３８１，１９９１、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２：５８１，１９９１）。本発明の抗体は、例えば、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５〜９６，２０１０及び国際特許公開第ＷＯ２００９／０８５４６２号）に記載されるバクテリオファージｐＩＸ被覆タンパク質との融合タンパク質として抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を発現するファージ提示ライブラリから単離され得る。抗体ライブラリをヒトＣＣＬ１７細胞外ドメインへの結合についてスクリーニングして、得られた陽性クローンの特徴付けを更に行い、Ｆａｂはクローンライセートから単離され、全長ＩｇＧとして発現する。ヒト抗体を単離するためのそのようなファージ提示法は、当技術分野にて確立されている。例えば、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、及び第５，５７１，６９８号；Ｄｏｗｅｒらの米国特許第５，４２７，９０８号、及び第５，５８０，７１７号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらの米国特許第５，９６９，１０８号及び第６，１７２，１９７号、並びにＧｒｉｆｆｉｔｈｓらの米国特許第５，８８５，７９３号、第６，５２１，４０４号、第６，５４４，７３１号、第６，５５５，３１３号、第６，５８２，９１５号及び第６，５９３，０８１号を参照。
免疫原性抗原の調製及びモノクローナル抗体の生成は、組換えタンパク質生成等の任意の好適な技術を用いて実施してよい。免疫原性抗原は、精製タンパク質、又は全細胞又は細胞若しくは組織抽出物を含むタンパク質混合物の形態で動物に投与されるか、あるいは抗原は、動物の身体内で、該抗原又はその一部をコードする核酸から新規に形成されてよい。
本明細書に記載される本発明の抗体は、ヒト又はヒト化されてもよい。
本明細書に記載される本発明の抗体は、合成又は組換え抗体であってよい。
本明細書に記載される本発明の抗体は、ＩｇＡ型、ＩｇＤ型、ＩｇＥ型、ＩｇＧ型、又はＩｇＭ型のものであってよい。本明細書に記載される本発明の抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプ、ＩｇＧ２アイソタイプ、ＩｇＧ３アイソタイプ、ＩｇＧ４アイソタイプのものであってよい。
本発明の抗体の免疫エフェクターの特性は、当業者には既知の技術により、Ｆｃ修飾によって強化又はサイレンシングすることが可能である。例えば、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貧食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ））の下方制御などのＦｃエフェクター機能は、これらの活性に関与するＦｃの残基を修飾することによって調節され得る。薬物動態特性は、抗体の半減期を延長するＦｃドメインの残基を変異させることによっても強化することができる。例示的なＦｃ修飾は、ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ２ Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：２３５１４〜２４，２００６、又はＩｇＧ２ Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｈ２６８Ｑ、Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１、若しくはＩｇＧ２上のＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ（国際特許公開第ＷＯ２０１１／０６６５０１号）、若しくは米国特許第６，７３７，０５６号に記載されるもの（ＥＵ番号付けに準ずる番号付け）である。
本明細書に記載される一部の実施形態では、ヒトＣＣＬ１７に特異的に結合する抗体は、Ｆｃ領域に置換を有する。
本明細書に記載される一部の実施形態では、置換は、ＩｇＧ２上のＶ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、若しくはＰ３３１Ｓ置換、又はＩｇＧ４上のＳ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、若しくはＬ２３５Ａ置換を含み、残基の番号付けは、ＥＵインデックスに準ずる。
更に、本明細書に記載される本発明の抗体は、グリコシル化、異性化、脱グリコシル化などのプロセスによって、又はポリエチレングリコール部分の付加（ペグ化）及び脂質化などの自然界では生じない共有結合修飾によって翻訳後修飾してもよい。こうした修飾はインビボあるいはインビトロで行われ得る。例えば、本発明の抗体はポリエチレングリコールと接合する（ペギレート）することによって薬物動態的なプロファイルを向上させることができる。結合は、当業者に既知の方法によって行うことができる。治療用抗体のＰＥＧとの接合によって、機能を妨害せずに薬力学的動態が強化されることが示されている（Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｔｅｌｅｓ １５：４０９〜４１８，２００４、Ｌｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １６：１０６〜１１９，２００１、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １６：７６１〜７７０，２００３）。
安定性、選択性、交差反応性、親和性、免疫原性、又は他の望ましい生物学的若しくは生物物理学的特性を向上するように修飾され得る、本発明の抗体又はその断片は発明の範囲内である。抗体の安定性は、（１）内在的な安定性に影響を及ぼす個々のドメインのコアパッキング、（２）ＨＣとＬＣとの対合により影響を受けるタンパク質／タンパク質の界面相互作用、（３）極性及び荷電残基の埋め込み、（４）極性及び荷電残基のためのＨ結合ネットワーク、並びに（５）他の分子内及び分子間力の間の表面電荷及び極性残基の分布、を含むいくつかの因子によって影響を受ける（Ｗｏｒｎ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３０５：９８９〜１０１０，２００１）。構造を不安定化させる可能性のある残基は、抗体の結晶構造に基づいて、あるいは場合によっては分子モデリングによって特定することが可能であり、また、抗体の安定性に対するこれらの残基の作用は、特定された残基に変異を含む変異体を生成及び評価することにより試験することができる。抗体の安定性を高める方法の１つは、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）で測定する場合、熱転移中点温度（Ｔm）を高くすることである。一般に、タンパク質のＴmは、その安定性と相関性を示すが、溶液中でのそのアンフォールディングし易さ及び変性し易さ、並びにそのタンパク質のアンフォールディングし易さに応じた分解プロセスとは負の相関性を示す（Ｒｅｍｍｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １５：２００〜２０８，１９９７）。いくつかの研究は、ＤＳＣで熱安定性として測定された配合物の物理的安定性のランク付けと他の方法で測定された物理的安定性との間に相関性があることを発見した（Ｂｅｄｕ−Ａｄｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２１：１３５３〜１３６１，２００４、Ｇｕｐｔａ ａｎｄ Ｋａｉｓｈｅｖａ，ＡＡＰＳ ＰｈａｒＳｃｉ，５Ｅ８，２００３、Ｍａａ ａｎｄ Ｈｓｕ，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ １４０：１５５〜１６８，１９９６、Ｒｅｍｍｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １５：２００〜２０８，１９９７、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９３：３０７６〜３０８９，２００４）。配合物の研究は、ＦａｂのＴｍが対応するｍＡｂの長期物理的安定性と密接な関係があることを示唆している。フレームワーク又はＣＤＲ内のいずれかにおけるアミノ酸の相違は、Ｆａｂドメインの熱安定性に有意な作用を有し得る（Ｙａｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３５３：１４３〜１４６，１９９４）。
本明細書に記載される本発明のＣＣＬ１７抗体は、二重特異性抗体へと操作することが可能であり、これらもまた本発明の範囲に包含される。本発明の抗体のＶＬ領域及び／又はＶＨ領域は、公開された方法を用いて、ＴａｎｄＡｂ（登録商標）などの構造として一本鎖二重特異性抗体（国際特許公開第ＷＯ１９９９／５７１５０号、米国特許公開第ＵＳ２０１１／０２０６６７２号）、又は米国特許第５，８６９，６２０号、国際特許公開第ＷＯ１９９５／１５３８８号、国際特許公開第ＷＯ１９９７／１４７１９号、若しくは国際特許公開第ＷＯ２０１１／０３６４６０号に開示されるものなどの構造として二重特異性ｓｃＦＶへと操作することが可能である。
本明細書に記載される本発明の抗体のＶＬ領域及び／又はＶＨ領域は、二重特異性全長抗体へと操作することも可能であり、各抗体のアームは特徴的な抗原又はエピトープに結合する。そのような二重特異性抗体は典型的には、米国特許第７，６９５，９３６号、国際特許公開第ＷＯ２００４／１１１２３３号、米国特許公開第ＵＳ２０１０／００１５１３３号、米国特許公開第ＵＳ２００７／０２８７１７０号、国際特許公開第ＷＯ２００８／１１９３５３号、米国特許公開第ＵＳ２００９／０１８２１２７号、米国特許公開第ＵＳ２０１０／０２８６３７４号、米国特許公開第ＵＳ２０１１／０１２３５３２号、国際特許公開第ＷＯ２０１１／１３１７４６号、国際特許公開第ＷＯ２０１１／１４３５４５号、又は米国特許公開第ＵＳ２０１２／０１４９８７６号に記載されるものなどの技術を用いて、２つの抗体の重鎖間のＣＨ３相互作用を調節して二重特異性抗体を形成することにより作製される。本発明の抗体のＶＬ領域及び／又はＶＨ領域が組み込まれる追加の二重特異性構造は、例えば、デュアル可変ドメイン免疫グロブリン（国際特許公開第ＷＯ２００９／１３４７７６号）、又は２つの抗体アームを異なる特異性と接続する、ロイシンジッパー又はコラーゲン二量体化ドメインのような様々な二量体化ドメインを含む構造（国際特許公開第ＷＯ２０１２／０２２８１１号、米国特許第５，９３２，４４８号、米国特許第６，８３３，４４１号）である。
本発明の別の実施形態は、本発明の抗体の重鎖可変領域又は抗体軽鎖可変領域のいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドである。特定の代表的なポリヌクレオチドを本明細書に開示するが、遺伝コードの縮重又は所与の発現系におけるコドンの好ましさを考慮すると、本発明の抗体をコードする他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。本発明の抗体のＶＨ若しくはＶＬ又はそれらの断片をコードするポリヌクレオチド配列は、意図される宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を可能にする、プロモーター及びエンハンサーなどの１つ又は２つ以上の制御因子に操作可能に連結され得る。ポリヌクレオチドはｃＤＮＡであってよい。
本発明の別の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。そのようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現ベクター、トランスポゾンに基づいたベクター、又は任意の手段によって所与の生物又は遺伝子的背景に本発明のポリヌクレオチドを導入するのに適した任意の他のベクターであってよい。例えば、任意に定常領域に連結される本発明の抗体の軽鎖及び重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、発現ベクターに挿入される。軽鎖及び重鎖は、同じ又は異なる発現ベクターにクローン化され得る。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクター内の制御配列に操作可能に連結される。そのような制御配列は、シグナル配列、プロモーター（例えば、天然に会合する又は異種プロモーター）、エンハンサー因子、及び転写終結配列を含み、抗体を発現するように選択された宿主細胞と適合性があるように選択される。ベクターが適切な宿主内に組み込まれると、宿主は、組み込まれたポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質の高レベル発現に適した条件下で維持される。
好適な発現ベクターは典型的には、エピソーム又は宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分のいずれかとして宿主生物において複製可能である。通常、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたこれらの細胞の検出を可能にするように、アンピシリン耐性、ヒグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性、又はネオマイシン耐性などの選択マーカーを含む。
好適なプロモーター及びエンハンサー因子は当該技術分野において既知である。細菌細胞における発現について、例示的なプロモーターとしては、ｌａｃｌ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ｌａｍｂｄａ Ｐ、及びｔｒｃが挙げられる。真核細胞における発現について、例示的なプロモーターとしては、軽鎖及び／又は重鎖免疫グロブリン遺伝子プロモーター及びエンハンサー因子、サイトメガロウイルス即時初期プロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスからの長鎖末端反復配列に存在するプロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター、及び様々な当該技術分野に既知の組織特異的プロモーターが挙げられる。酵母細胞における発現について、例示的なプロモーターとしては、ＡＤＨ１プロモーター、ＰＧＫ１プロモーター、ＥＮＯプロモーター、ＰＹＫ１プロモーター等の構成的プロモーター、又はＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＡＤＨ２プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＧＡＬ７プロモーター、ＭＥＴ２５プロモーター、ＭＥＴ３プロモーター、ＣＹＣ１プロモーター、ＨＩＳ３プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＡＤＣ１プロモーター、ＴＲＰ１プロモーター、ＵＲＡ３プロモーター、ＬＥＵ２プロモーター、ＥＮＯプロモーター、ＴＰ１プロモーター、及びＡＯＸ１などの制御可能プロモーター（例えばピキアにおいて使用するため）が挙げられる。適切なベクター及びプロモーターの選択は、十分に当業者のレベル内である。
数多くの好適なベクター及びプロモーターが当業者に既知であり、多くは、対象組換え構築物を生成するために市販されている。例として以下のベクターを提供する。細菌性：ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓ ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。真核：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＲ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。用語「宿主細胞」は、ベクターが導入される細胞を指す。用語「宿主細胞」は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代も指すように意図される。変異又は環境の影響のどちらかにより、特定の修飾が後の世代に起こる可能性があるため、そのような後代は親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。そのような宿主細胞は、真核細胞、原核細胞、植物細胞、又は古細菌（archeal）細胞であってよい。
原核宿主細胞の例は、大腸菌、バチルス・ズブチルスなどの桿菌、及びサルモネラ、セラチア、及び様々なシュードモナス種などの他の腸内細菌科である。酵母などの他の微生物も発現に有用である。好適な酵母宿主細胞の例は、サッカロミセス（例えば、Ｓ．セレビジアエ）及びピキアである。例示的な真核細胞は、哺乳動物、昆虫、鳥類、又は他の動物起源のものでよい。哺乳動物の真核細胞としては、ハイブリドーマ細胞株又は骨髄腫細胞株などの不死化細胞株、例えばＳＰ２／０（ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｍａｎａｓｓａ、ＶＡ、ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳ０（ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＵＫ、ＥＣＡＣＣ番号８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）マウス細胞株が挙げられる。ヒト骨髄腫細胞株の一例は、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）である。他の有用な細胞系としては、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ））、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−６１）、又はＤＧ４４などの、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来するものが挙げられる。
本発明の別の実施形態は、本発明の宿主細胞を培養する工程と、宿主細胞によって生成された抗体を回収する工程とを含む、本発明の抗体の生成方法である。抗体を製造して精製する方法は当該技術分野において周知である。合成されたら（化学的又は組換えのいずれか）、全抗体、それらの二量体、個々の軽鎖及び重鎖、又はＶＨ又はＶＬなどの他の抗体断片は、硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製、ゲル電気泳動など（一般に、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，（１９８２）を参照）を含む、当該技術分野の標準的な手順により精製することができる。対象抗体は、実質的に純粋、例えば、細胞残屑、対象抗体等以外の巨大分子などの汚染物を含まない、例えば、少なくとも約８０％〜８５％純粋、少なくとも約８５％〜９０％純粋、少なくとも約９０％〜９５％純粋、又は少なくとも約９８％〜９９％以上純粋であり得る。
本発明の特定のＶＨ配列又はＶＬ配列をコードするポリヌクレオチドは、標準的な分子生物学法を用いてベクター内に組み込まれる。宿主細胞の形質転換、培養、抗体発現、及び精製は、周知の方法を用いて行われる。
治療方法
ヒトＣＣＬ１７に特異的に結合する抗体は、ＣＣＬ１７媒介状態のスペクトルを治療又は阻止するのに好適であり得る。
本明細書で使用される、用語「ＣＣＬ１７媒介状態」は、直接又は間接によらず、ＣＣＬ１７が疾患若しくは状態の因果関係、発症、進行、持続又は病理を含む、疾患及び病状において役割を果たす、全ての疾患及び病状を包含する。
本明細書で使用される、用語「ＣＣＬ１７媒介炎症性状態」とは、少なくとも部分的にＣＣＬ１７生物活性から結果として生じる、炎症性状態を指す。ＣＣＬ１７媒介炎症性状態の例は、喘息及びアレルギーである。
本発明の方法を用いて任意の分類に属する動物患者を治療することができる。このような動物の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる。例えば、本発明の抗体は、喘息及び呼吸性アレルギー性疾患（アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、過敏性肺疾患など）、アレルギー性疾患（全身性アナフィラキシー若しくは過敏性応答、薬物アレルギー、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）、虫刺されアレルギー、及び食物アレルギーなど）、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎、回腸炎、及び腸炎など）、膣炎、乾癬、及び炎症性皮膚疾患（皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹、及び掻痒など）、血管炎、脊椎関節症、強皮症、自己免疫疾患（関節炎（リウマチ性及び乾癬性を含む）、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、糸球体腎炎など）、移植片拒絶（同種移植片拒絶及び移植片対宿主病を含む）、及び望ましくない炎症性応答が阻害される他の疾患（アテローム性動脈硬化症、筋炎、Ｔ細胞媒介神経変性疾患、多発性硬化症、脳炎、髄膜炎、肝炎、腎炎、敗血症、サルコイドーシス、アレルギー性結膜炎、耳炎、キャッスルマン病、副鼻腔炎、ＬＰＳ誘導内毒素性ショック、ベーチェット症候群、及び痛風に有用である。
本明細書に記載される本発明の抗体、及びはまた、そのような処置のための薬剤の調製においても有用であり、薬剤は、本明細書に定められる投薬量で投与するために調製される。
本発明の方法及び使用は、ＣＣＬ１７の発現若しくは生物活性に関連する、又はＣＣＬ１７が生物学的役割を果たす任意の疾患若しくは状態を有する、又はそれを発症するリスクにある動物及び患者に使用することが意図され得る。
いかなる理論に拘束されるものではないが、本発明の抗体は、Ｔｈ２細胞の動員を直接阻害し、したがって複数のＴｈ２サイトカインを同時に阻害することにより、様々な炎症性疾患においてそれらの有効な作用を提供し得る。本発明の抗体は、ＣＣＬ１７のみを選択的に阻止することにより、抗ＣＣＲ４抗体と比較して改善された安全なプロファイルを提供することができる。抗体は、ＣＣＲ４を発現する血小板と相互作用しない。加えて、抗体は、ＣＣＲ４に対するＣＣＬ２２の有益な先天性免疫作用を阻止しない（Ｍａｔｓｕｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：５３８２〜８，２０００）。
本明細書で使用される、「炎症性状態」とは、部分的には、サイトカイン、ケモカイン、又は炎症性細胞（例えば、好中球、単球、リンパ球、マクロファージ、マスト細胞、樹状細胞、好中球）の活性によって媒介される、有害な刺激（例えば、病原体、損傷した細胞、身体的傷害、若しくは刺激物質）に対する急性又は慢性の局部的応答又は全身性応答を指し、大抵の場合、疼痛、潮紅、膨張、及び組織機能の障害を特徴とする。
ＣＣＬ１７媒介炎症状態の一例は炎症性肺疾患である。炎症性肺状態の例としては、感染によって誘導される肺状態（ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、又はプリオン感染に関連するものを含む）、アレルゲンによって誘導される肺状態、石綿症、珪粉症、又はベリリウム中毒症などの汚染物質によって誘導される肺状態、胃吸引誘導肺状態、免疫制御障害、遺伝的素因による炎症性状態（嚢胞性線維症など）、及び身体外傷によって誘導される肺状態（人工呼吸器傷害など）が挙げられる。これらの炎症性状態には更に、喘息、肺気腫、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、サルコイドーシス、ヒスチオサイトーシス、リンパ管筋腫症、急性肺傷害、急性呼吸窮迫症候群、慢性肺疾患、気管支肺異形成症、市中肺炎、院内肺炎、人工呼吸器関連肺炎、敗血症、ウイルス性肺炎、インフルエンザ感染、パラインフルエンザ感染、ロタウイルス感染、ヒト・メタニューモウイルス感染、呼吸器合胞体ウイルス感染、及びアスペルギルス感染又は他の真菌感染も含まれる。感染関連炎症性疾患の例としては、重症肺炎、肺嚢胞性線維症、気管支炎、気道の増悪、及び急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含むウイルス又は細菌性肺炎が挙げられる。そのような感染関連状態は、一次ウイルス感染及び二次細菌感染などの複数の感染を伴う場合がある。
喘息は、気道過剰応答（「ＡＨＲ」）、気管支収縮、喘鳴、好酸球性炎症又は好中球性炎症、粘液分泌過多、上皮下線維症、及び高いＩｇＥ値を特徴とする肺の炎症性疾患である。喘息の患者は、最も一般的には気道の微生物感染（例えばライノウイルス、インフルエンザウイルス、インフルエンザ菌など）による症状の悪化である「増悪」を経験する。喘息の発作は、環境因子（例えば、回虫、昆虫、動物（例えばネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット及び鳥）、真菌、空気汚染物質（例えば煙草の煙）、刺激性ガス、煙霧、蒸気、エアロゾル、化学物質、花粉、運動、又は冷気によって誘発される可能性がある。喘息は別として、肺に影響を及ぼすいくつかの慢性炎症性疾患は、気道への好中球湿潤、例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、細菌性肺炎、及び嚢胞性線維症を特徴とし（Ｌｉｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ １５：９７３〜７，２０００、Ｒａｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１５：２６８〜７６，２００５）、ＣＯＰＤ、アレルギー性鼻炎、及び嚢胞性線維症などの疾患は、気道の過剰応答を特徴とする（Ｆａｈｙ ａｎｄ Ｏ’Ｂｙｒｎｅ Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １６３：８２２〜３，２００１）。
アレルギー性喘息において、高レベルのアレルゲン特異的ＩｇＥの存在は、一般に吸い込まれた環境アレルゲンに対する異常Ｔｈ２細胞免疫応答の現れである。アレルゲンは、入来する外来抗原を絶えず確認する樹状細胞（ＤＣ）によってＴ細胞に提示される。ＤＣにより適切に活性化されるとき、病的気道に存在するアレルゲン特異的リンパ球は、白血球の血管外浸潤、杯細胞過形成、及び気管支過敏性を更に制御するＴｈ２サイトカインのインターロイキン（ＩＬ）−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１３を生成する。ＤＣにより生成されたＣＣＬ１７は、ＣＣＲ４の誘発を通して、Ｔｈ２細胞の選択的移動を誘導するが、Ｔｈ１細胞は誘導しない。喘息のマウスモデルでは、抗ＣＣＬ１７抗体による治療が気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）流体中のＣＤ４＋Ｔ細胞及び好酸球の数、Ｔｈ２サイトカインの生成、及びアレルゲン負荷後の気道の過剰応答を減少させ、ＣＣＬ１７の中和がヒトにおけるアレルギー性炎症を阻害するための実現可能な戦略であることを示唆する。
喘息及び気道の炎症に一般的に用いられる動物モデルとしては、オボアルブミン負荷モデル、メタコリン感作モデル、及びアスペルギルス・フミガーツスによる感作が挙げられる（Ｈｅｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２９３：４０１〜１２，１９９５）。培養したヒト気管支上皮細胞、気管支線維芽細胞、又は気道平滑筋細胞からのサイトカイン及びケモカインの生成の阻害をインビトロモデルとして用いることもできる。本発明の抗体をこれらのモデルのいずれかに投与することを用いて、喘息、気道の炎症、ＣＯＰＤなどの症状を改善して経過に変化を与えるそれらの有効性を評価することができる。
アトピー性皮膚炎は、ＣＣＬ１７媒介炎症性状態の一例である。
本発明の一態様は、ＣＣＬ１７媒介疾患を治療する方法であり、ＣＣＬ１７媒介疾患を治療するのに十分な時間の間、本発明の抗体を、それを必要とする対象に投与する工程を含む。
本明細書に記載される一部の実施形態では、ＣＣＬ１７媒介疾患は、炎症性疾患である。
本明細書に記載される一部の実施形態では、炎症性疾患は、喘息、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）、又は特発性肺線維症（ＩＰＦ）である。
本発明の一実施形態は、喘息を治療する方法であり、喘息を治療するのに十分な時間の間、本明細書に記載される本発明の抗体を対象に投与する工程を含む。
本発明の一実施形態は、潰瘍性大腸炎を治療する方法であり、潰瘍性大腸炎を治療するのに十分な時間の間、本明細書に記載される本発明の抗体を対象に投与する工程を含む。
本発明の一実施形態は、アトピー性皮膚炎を治療する方法であり、アトピー性皮膚炎を治療するのに十分な時間の間、本明細書に記載される本発明の抗体を対象に投与する工程を含む。
本発明の一実施形態は、特発性肺線維症を治療する方法であり、特発性肺線維症を治療するのに十分な時間の間、本明細書に記載される本発明の抗体を対象に投与する工程を含む。
投与／医薬組成物
本発明は、本発明の本発明のＣＣＬ１７に特異的に結合する抗体及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。治療使用としての本発明のＣＣＬ１７に特異的に結合する抗体は、医薬的に許容される担体内の活性成分として、有効量のドメイン、分子、又は抗体を含有する医薬組成物として調製することができる。用語「担体」は、活性化合物と共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのようなビヒクルは、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油等の、石油、動物、植物、又は合成物起源のものを含む、水及び油等の液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを用いることができる。これらの溶液は滅菌され、一般には粒子状物質を含まないものである。これらは、従来周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。この組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる医薬的に許容される補助物質、例えばｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤等を含むことができる。そのような医薬製剤中の本明細書に記載される本発明の分子又は抗体の濃度は幅広く変化してよく、即ち約０．５重量％未満、通常は約１重量％又は少なくとも約１重量％か、最大で１５又は２０重量％までであってよく、また、選択される特定の投与方法に従って、主として必要とされる用量、液体の体積、粘度等に基づいて選択される。好適なビヒクル及び製剤（他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１st Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ ２００６，Ｐａｒｔ ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｐ ６９１〜１０９２に記載され、特にｐｐ．９５８〜９８９を参照されたい。
本明細書に記載される本発明のＣＣＬ１７に特異的に結合する抗体の治療使用としての投与方法は、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は皮下、肺；経粘膜（経口、鼻腔内、膣内、直腸）；錠剤、カプセル、溶液、粉末、ゲル、粒子での製剤の使用、シリンジ、埋込装置、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプに含有される、又は当該技術分野において周知の、当業者が理解する他の手段など、薬剤を宿主に送達する任意の好適な経路であってよい。部位特異的投与は、例えば、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮送達によって達成され得る。
したがって、筋肉内注射用の本明細書に記載される本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水、及び約１ｎｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、又はより好ましくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇの本発明のＣＣＬ１７に特異的に結合する抗体を含むように調製することができる。
ＣＣＬ１７媒介状態を有する患者に与えられる用量は、症状を緩和する、又はＣＣＬ１７媒介状態を治療するのに十分であり（「治療有効量」）、時折０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８，９、又は１０ｍｇ／ｋｇであるが、更に高くてもよく、例えば、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ｍｇ／ｋｇである。例えば、５０、１００、２００、５００、又は１０００ｍｇの固定単位用量が与えられるか、又は用量は、例えば、４００、３００、２５０、２００、若しくは１０ｍｇ／ｍ2の患者の表面積に基づいてもよい。通常、１〜８の用量（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８）が投与されるが、１０、１２、２０以上の用量を与えることが可。能である本明細書に記載される本発明のＣＣＬ１７に特異的に結合する抗体の投与は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、５週間、６週間、７週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月以上後に繰り返すことができる。長期にわたる投与の場合、治療過程を繰り返すことも可能である。繰り返し投与は、同一用量であるか、又は異なる用量であってよい。
喘息などの炎症性疾患の治療に有効である本明細書に記載される本発明のＣＣＬ１７抗体の投薬量は、当該技術分野において周知の又は本明細書に記載される関連する動物モデルにＣＣＬ１７抗体を投与することによって決定することができる。
所望によりインビトロアッセイを用いて最適な用量範囲を特定することができる。特定の有効用量の選択は、当業者であれば幾つかの因子の考慮に基づいて（例えば臨床試験によって）決定することができる。こうした要因には、治療又は予防しようとする疾患、疾患症状、患者の体重、患者の免疫状態、及び当業者には既知の他の要因が含まれる。製剤に用いられる正確な用量は、投与経路、及び疾患の重篤度にも依存し、医師の判断及び各患者の状況に基づいて決定されなければならない。有効量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導出される用量反応曲線から推定することができる。本発明の抗体の有効性及び有効量について、本明細書に記載したモデルのいずれかを用いて試験することができる。
例えば、静脈内注射用の本明細書に記載される本発明のＣＣＬ１７に特異的に結合する抗体を含む医薬組成物は、８０ｋｇの患者に投与するために、約２００ｍｌの減菌リンガー液、及び約８ｍｇ〜約２４００ｍｇ、約４００ｍｇ〜約１６００ｍｇ、又は約４００ｍｇ〜約８００ｍｇの本明細書のＣＣＬ１７に特異的に結合する抗体を含むように作製され得る。非経口的に投与可能な組成物を調製する方法は周知のものであり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」（１５ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）に、より詳細に記載されている。
本明細書に記載される本発明のＣＣＬ１７に特異的に結合する抗体は、保存のために凍結乾燥され、使用前に適切な担体中で再構成することができる。これまでに、この手法は一般的なタンパク製剤に有効であることが示されており、当該技術分野で公知の凍結乾燥法及び溶解法を用いることができる。
本明細書に記載される本発明のＣＣＬ１７に特異的に結合する抗体は、第２の治療剤と組み合わせて、同時に、順次、又は別個に投与することができる。
次に、本発明を以下の具体的かつ非限定的な実施例を参照して説明する。
実施例１．ＣＣＬ１７中和抗体の生成
ヒトＣＣＬ１７結合Ｆａｂを、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９７：３８５〜３９６，２０１０、国際特許公開第ＷＯ２００９／０８５４６２号、米国特許公開第ＵＳ２０１０／００２１４７７号、米国特許公開第ＵＳ２０１２／０１０８７９５号に記載される新規ｐＩＸファージ提示ライブラリから選択した。簡潔に言えば、ライブラリは、ヒト足場を多様化することによって生成されたものであり、生殖系列ＶＨ遺伝子であるＩＧＨＶ１−６９*０１、ＩＧＨＶ３−２３*０１、及びＩＧＨＶ５−５１*０１を、Ｈ３ループを介してヒトＩＧＨＪ−４ミニ遺伝子で組換え、そしてヒト生殖系列ＶＬカッパ遺伝子であるＯ１２（ＩＧＫＶ１−３９*０１）、Ｌ６（ＩＧＫＶ３−１１*０１）、Ａ２７（ＩＧＫＶ３−２０*０１）及びＢ３（ＩＧＫＶ４−１*０１）をＩＧＫＪ−１ミニ遺伝子で組換えて、完全なＶＨ及びＶＬドメインが構築された。多様化に際し、重鎖及び軽鎖可変領域内の、タンパク質抗原及びペプチド抗原と高頻度に接していると確認された位置に相当するＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３ループ周辺の位置を選択した。選択した位置での配列多様性は、それぞれのＩＧＨＶ又はＩＧＬＶ遺伝子のＩＧＨＶ又はＩＧＬＶ生殖系列遺伝子ファミリーそれぞれの位置で見られる残基に制限した。長さがアミノ酸７〜１４個分の単鎖〜中鎖型の合成ループを用いることで、Ｈ３ループにおいて多様性が発生した。Ｈ３でのアミノ酸分布は、ヒト抗体において観察されるアミノ酸の変動を模倣するよう設計された。ライブラリ設計の詳細は、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９７、３８５〜９６、２０１０年に記載されている。ライブラリを生成するために利用した足場は、これらのヒトＶＨ及びＶＬ生殖系列遺伝子起源に準じて命名した。スクリーニングにあたって、３つの重鎖ライブラリを、４個の生殖系列軽鎖又は生殖系列軽鎖ライブラリと組み合わせることで２４個の固有ＶＨ：ＶＬの組み合わせを生成した。ヒトＣＣＬ１７に対するファージパニンク実験では、２４個全てのＶＨ：ＶＬライブラリの組み合わせを利用した。
配列番号１のヒトＣＣＬ１７を用いてライブラリをパニングした。簡潔に言えば、標準的な方法を用いてヒトＣＣＬ１７をビオチン化し、ビオチン化したヒトＣＣＬ１７（Ｂｔ−ｈｕＣＣＬ１７）をストレプトアビジンコーティングした磁気ビーズ上に捕捉し（Ｄｙｎａｌ，Ｍ２８０）、Ｆａｂ−ｐＩＸファージライブラリをビーズに付加した。１回目及び２回目には１００ｎＭ、３回目及び４回目）には１０ｍＭのＢｔ−ｈｕＣＣＬ１７濃度を用いた。ＦａｂのヒトＣＣＬ１７への結合のスクリーニングは、ＥＬＩＳＡによって行われた。パニングにあたって、ｂｔ−ｈｕＣＣＬ１７コーティングされた磁気ビーズを洗浄し、ＰＢＳＴ−Ｍ（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０及び３％の脱脂粉乳を含むＢＰＳ）で遮断した。ライブラリから遮断したファージをビーズに付加し、１回目は室温で回転させた。ビーズを洗浄し、その後、対数増殖期の大腸菌（ＭＣ１０６１Ｆ’）細胞の培養物中でインキュベートし、感染した大腸菌を３７℃で一晩ＬＢ寒天プレート上で成長させた。翌朝、培養物をプレートからプレート当たり２ｍＬの２ｘＹＴ（２０％グリセロール）にこすり取り、５０μＬの細菌懸濁液を５０ｍＬの２ｘＹＴ（Ｃａｒｂ）に添加し、最大２時間、振盪しながら３７℃で成長させた。ヘルパーファージを対数増殖期中期の培養物に添加し、培養物を３７℃で３０分間インキュベートした。カナマイシン及びＩＰＴＧを各培養物に添加して、それぞれ、３５μｇ／ｍＬ及び１ｍＭの最終濃度にし、振盪しながら３０℃で一晩成長させた。ＰＥＧ／ＮａＣｌを用いて細菌培地から増幅したファージを沈殿させ、１ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。次のパニング回に２００μＬを使用した。
３回パニングした後、ファージミドＤＮＡを感染したＭＣ１０６１Ｆ’細胞から単離し、制限酵素で消化させてｐＩＸをコードする配列を除去し、線状にしたプラスミドＤＮＡを切除し、アガロースゲルから精製した。次に、このＤＮＡをＴ４ ＤＮＡリガーゼで自己連結した。連結したＤＮＡをＭＣ１０６１Ｆ’細胞内に電気穿孔し、ＬＢ（Ｃａｒｂ／グルコース）寒天プレート上で平板培養した。この電気穿孔からのコロニーをＥＬＩＳＡスクリーニング及びＦａｂ発現の評価のために選んだ。Ｆａｂは、重鎖のＣ末端にインフレームＨｉｓタグを含む。標準的な方法を用いてＣ末端Ｈｉｓタグを介して初期のスクリーニングから２４個のＦａｂを部分的に精製し、更に特徴付けした。
ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＦａｂはヒトＣＣＬ１７（配列番号１）、ｃｙｎｏ ＣＣＬ１７（配列番号２）、及びｃｙｎｏ ＣＣＬ２２（配列番号３）へのそれらの結合について特徴付けされた。簡潔に言えば、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレートを１μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトカッパ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でコーティングした。半精製したＦａｂを各プレートに添加した。ビオチン化したｈｕＣＣＬ１７、ｃＣＣＬ１７、又はｃＣＣＬ２２を各Ｆａｂ捕捉したウェルに添加した。ストレプトアビジン：ＨＲＰを用いて捕捉したＦａｂに結合したタンパク質を検出した。ヒト及びｃｙｎｏ ＣＣＬ１７の両方に結合したが、ｃｙｎｏ ＣＣＬ２２に結合しなかった５つのＦａｂ（Ｆ２１、Ｆ２４、Ｆ３４、Ｆ４３、及びＦ４４）を親和性成熟用に選択した。
実施例２．抗ＣＣＬ１７抗体の親和性成熟
これらの初期特徴付けプロファイルに基づき５つのＦａｂを親和性成熟用に選択した。Ｓｈｉら（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５〜３９６，２０１０）に記載されるインライン成熟技術を用いて軽鎖を多様化し、重鎖を不変に保つことによりＦａｂを親和性成熟させた。Ｆａｂの重鎖はＶＨ３−２３又はＶＨ５−５１のいずれかであった。生成されたＦ２４親和性成熟ライブラリはＣＣＬ１７結合剤を改善した。
簡潔に言えば、Ｂ３軽鎖ライブラリを用いてＦ２４を親和性成熟させた。Ｂ３ライブラリの多様化スキームを表２に示す。位置はＫａｂａｔ番号付けで表示される。
Figure 2016537024
ＦａｂのＶＨ領域をＬＣライブラリファージミド内にクローン化し、各ＦａｂのＬＣの完全な再多様化を生じさせる。ＮｃｏＩ及びＡｐａＩを用いてＤＮＡミニプレップの制限消化によりＶＨ領域を単離した。ＶＨ領域はゲル単離され、類似する消化されたＬＣライブラリＤＮＡに連結された。連結を精製し、ＭＣ１０６１Ｆ’細胞内に形質転換した。対数増殖期成長（ＯＤ600nm≒０．６）が達成されるまで、細胞を２ｘＹＴ（Ｃａｒｂ）中で成長させた。ヘルパーファージを添加し、培養物を３７℃で３０分間インキュベートした。カナマイシン及びＩＰＴＧを各培養物に添加して、それぞれ、３５ｕｇ／ｍＬ及び１ｍＭの最終濃度にし、振盪しながら３０℃で一晩成長させた。ＰＥＧ／ＮａＣｌを用いて細菌培地からファージを沈殿させ、ＰＢＳに再懸濁した。
親和性成熟パニングにあたって、Ｂｔ−ＣＣＬ１７を５０μｌのＳＡコーティングした磁気ビーズ上に捕捉した。抗原の濃度は、１回目は１００ｎＭ、２回目は１０ｎＭ、そして３回目は１０ｎＭであった。ビーズを、ＰＢＳＴで６回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄し、続いて上述の大腸菌に感染させた。Ｆａｂ発現プラスミドの単離及びＦａｂの発現は上述のように行われた。
ｈｕＣＣＬ１７への結合について上述されるように、ｈｕＣＣＬ１７（配列番号１）、ｃＣＣＬ１７（配列番号２）及びｃＣＣＬ２２（配列版ｇ能３）への結合について、親和性成熟したＦａｂをＥＬＩＳＡアッセイにおいてスクリーニングした。特定したクローンを配列決定し、完全ＩｇＧ１抗体に変換し、ＭＳＤ−ＳＥＡを用いてｈｕＣＣＬ１７、ｃＣＣＬ１７、及びｃＣＣＬ２２へのそれらの結合を確認した。
親抗体及び親和性成熟した抗体のＣＤＲ配列を、重鎖及び軽鎖ＣＤＲについてそれぞれ表３及び表４に示す。
Figure 2016537024
Figure 2016537024
実施例３．親和性成熟した抗ＣＣＬ１７抗体のヒト及びｃｙｎｏ ＣＣＬ１７への結合
溶液平衡親和性（ＳＥＡ）を用いて抗体を、ヒトＣＣＬ１７及びｃｙｎｏ ＣＣＬ１７へのそれらの結合について評価した。これらの実験の手順は、Ｈａｅｎｅｌら（Ｈａｅｎｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３３９：１８２〜１８４，２００５）が用いたものに類似した。抗原−抗体複合体を調製するために、ヒトＣＣＬ１７又はｃｙｎｏ ＣＣＬ１７を、９６ディープウェルポリプロピレンプレートで２，０００，０００ｐＭの濃度から開始する、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、ＴＢＳＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有するトリス系生理食塩水緩衝液に１：６の割合で系列希釈した。４０ｐＭ又は２００ｐＭの等体積の抗ｈＣＣＬ１７ ｍＡｂを各ケモカイン希釈物に添加して、１μＭの最終濃度から開始するケモカインの系列希釈物と一定濃度（２０ｐＭ又は１００ｐＭ）の抗ＣＣＬ１７抗体とを含む混合物を得た。混合物を２組調製し、平衡に達するように４℃で４８時間インキュベートした。ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ６０００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）機器を用いて遊離抗体を検出した。得られた結合曲線を、データの非線形最小二乗法の回帰分析を行うために１：１結合モデルを使用するＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ｖ ５．０１）を用いて適合し、解離平衡定数（ＫD）を得た。表５は、ヒト及びｃｙｎｏ ＣＣＬ１７に対する抗体の親和性を示す。ヒトＣＣＬ１７の親和性は、約２ｐＭ〜約７００ｐＭの範囲であり、ｃｙｎｏ ＣＣＬ１７の親和性は、約２００ｐＭ〜約９５００ｐＭの範囲であった。生成された抗体は、ｃｙｎｏ ＣＣＬ１７への結合と比較して、ヒトＣＣＬ１７に約２−〜約１５０倍高い親和性で結合した。
Figure 2016537024
 *決定されず
実施例４．ＣＣＬ１７抗体の最適化
Ｃ１７Ｂ２３４及びＣ１７Ｂ２４０の抗ＣＣＬ１７抗体は、ＬＣＤＲ２の最初に潜在的なＮ連結グリコシル化部位（「ＮＡＳ」）を含んだ。Ｃ１７Ｂ２３４の残基位置５０（Ｋａｂａｔ番号付け）のアスパラギン残基（Ｎ）は、６つの異なるアミノ酸（Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、及びＩ）に変異した。
潜在的なアスパラギン酸異性化モチーフ「ＤＳ」は、親Ｃ１７Ｆ２４のＨＣＤＲ３、及びその全ての親和性成熟変異体において特定された。この位置での置換の作用を試験するために、ｍＡｂ Ｃ１７Ｂ２３４の重鎖において、位置１００ｃ（Ｋａｂａｔ番号付け）のセリン残基をＡ、Ｔ、若しくはＳに変異させるか、又は位置１００ｂのＤをＥに変異させた。得られた重鎖をｍＡｂ Ｃ１７Ｂ２５８の軽鎖と対合させた。
抗体はＩｇＧ１として発現され、それらのヒト及びｃｙｎｏ ＣＣＬ１７への親和性が測定された。表６及び表７は、最適化した抗体の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ配列を示す。表８は、ヒト及びｃｙｎｏ ＣＣＬ１７の抗体の親和性を示す。軽鎖におけるＮ５０の変異誘発は、２〜１００倍の改善された結合をもたらした。
Figure 2016537024
Figure 2016537024
Figure 2016537024
Ｃ１７Ｂ２３６のｍＡｂにおける位置１００ａ（Ｋａｂａｔ番号付け）でのＨＣＤＲ３のトリプトファン残基は、望ましくない翻訳後酸化の推定部位として特定された。この残基は、ｍＡｂがこれであるＣ１７Ｆ３１９のＣ１７Ｂ２３６のＦａｂ親において１７個の他のアミノ酸（Ｃ及びＭを除く全て）に変異した。Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発は、このパネルを生成するために「ＮＮＫ」又は定義されたコドンオリゴヌクレオチドを用いて行われた。これらのＦａｂは次に、ｂｕ−ヒト及びｂｔ−ｃｙｎｏ ＣＣＬ１７両方への結合についてランキングＥＬＩＳＡを用いてスクリーニングされた。５つの変異体（Ｗ→Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｔ、Ｉ）は、Ｆａｂ結合ＥＬＩＳＡにおいてある程度の結合を示した（表５）。発現及びＭＳＤ−ＳＥＡの最良の３つは、ｍＡｂ（Ｍ１７Ｂ２８８、Ｃ１７Ｂ２８９、Ｃ１７Ｂ２９０）に変換された（表６）。表示される大半の変異体は、ヒト及びｃｙｎｏ ＣＣＬ１７に対する親和性を減少させた。
抗体のＶＨ及びＶＬ配列を表９に示す。
Figure 2016537024
実施例６．定常領域の選択
選択抗体は、標準的な方法を用いて、以下の置換：ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ又はＩｇＧ２ Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１ＳによりＩｇＧ２又はＩｇＧ４としてクローン化された。表１０は、得られた抗体を示す。
Figure 2016537024
特定の抗体の重鎖及び軽鎖を下に示す。
ＣＢ３０２ ＨＣ（配列番号６７）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＳＹＷＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＩＩＤＰＳＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＶＧＰＡＤＶＷＤＡＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＴＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＡＡＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＣＢ３０２ ＬＣ（配列番号６８）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＬＳＦＤＮＩＮＫＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＤＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＦＹＳＶＰＳＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＣＢ３０１ ＨＣ（配列番号６９）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＳＹＷＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＩＩＤＰＳＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＶＧＰＡＤＶＷＤＴＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＴＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＡＡＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＣＢ３０１ ＬＣ（配列番号７０）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＬＳＦＤＮＩＮＫＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＤＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＦＹＳＶＰＳＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
実施例７．抗ＣＣＬ１７抗体の特徴付け
選択抗ＣＣＬ１７抗体は、それらのＣＣＬ１７生物活性の阻害能力を評価するために、カルシウム流入、β−アレスチンレポーターアッセイ、及び走化性アッセイにおいて特徴付けされた。
カルシウム流入アッセイ。カルシウム動員アッセイを用いて、ハイブリドーマｍＡｂがＣＣＬ１７シグナル伝達を中和する能力を試験した。ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１１９（商標））を、ＧｌｕｔａＭＡＸ、１０％のＦＢＳ、１０ｍＭのヘペス、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、４５００ｍｇ／Ｌのグルコース、及び１５００ｍｇ／ｍｌの重炭酸ナトリウムを含むＲＰＭＩ中で、５％のＣＯ2飽和の３７℃のインキュベータ中で培養した。ＡＢＤ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ，Ｉｎｃ．のＦｌｕｏ−８ ＮＷ洗浄不要カルシウムキット（＃３６３１５）を用いて、細胞を染料で標識した。試験抗体及び１０ｎｇ／ｍＬのヒトＣＣＬ１７又は５ｎｇ／ｍＬのｃｙｎｏ ＣＣＬ１７を試験抗体と事前にインキュベートし、混合物を細胞に添加した。蛍光シグナルは、４９０ｎｍの励起及び５２５ｎｍの放射を用いて、ＦＤＳＳ６０００（Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）を用いて検出された。
β−アレスチンレポーターアッセイ．β−アレスチンアッセイを用いて、抗ＣＣＬ１７抗体がＣＣＬ１７機能を中和する能力を評価した。アッセイは、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ ｅＸｐｒｅｓｓ β−アレスチンアッセイ（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ）を用いて行われた。簡潔に言えば、抗ＣＣＬ１７抗体がＣＣＬ１７によって誘導されるβ−アレスチング動員を阻害する能力は、小さい酵素断片ＰｒｏＬｉｎｋ（商標）及びβ−アレスチンの融合タンパク質及びβ−ｇａｌのＮ末端欠失突然変異体（酵素アクセプター又はＥＡと呼ばれる）と共にフレーム内に融合されたＣＣＲ４を同時発現するＨｅｋ２９３細胞において評価された。様々な濃度（０．１５ｎＭ〜１μＭ）の抗ＣＣＬ１７抗体を２０ｎＭのＣＣＬ１７と混合し、抗体−ＣＣＬ１７複合体を細胞に添加する前に混合物を３７℃で２０〜３０分間インキュベートした。次に混合物を細胞に適用し、３７℃（９５％ Ｏ2／５％ ＣＯ2）で９０分間インキュベートした。ウェル当たり５５μｌの検出試薬を添加し、室温で６０分間インキュベートした。サンプルを標準的な発光プレート読取装置で読取り、ＩＣ50値を計算した。
走化性アッセイ：抗ＣＣＬ１７抗体がＣＣＬ１７機能を阻害することを示すために走化性アッセイを用いた。ＨＳＣ−Ｆ細胞（ＨＳＣ−Ｆ細胞はＮＩＨ Ｎｏｎｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅから得た）又はＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１１９（商標））の移動は、Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ．１９９７、Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ．１９９９に記載されるプロトコルに従い、５μｍのポリカーボネートフィルタを用いた９６ウェル走化性チャンバを用いで評価された。簡潔に言えば、下部チャンバを、抗体なしで、又は異なる濃度（０．１２５、０．２５、０．５ １、及び１０μｇ／ｍｌ）の抗体と共に３２０μｌのＲＰＭＩ／ＢＳＡ ０．１％及び１ｎＭのヒト若しくはｃｙｎｏ ＣＣＬ１７で充填し、次にポリカーボネート膜を注意深く重ね合わせた。ＰＢＳで細胞を洗浄し、０．５×１０6細胞／ｍｌでＲＰＭＩ／ＢＳＡ ０．１％に懸濁し、細胞懸濁液を上部チャンバに添加した。３７℃の５％のＣＯ2加湿インキュベータ中で６０分間チャンバをインキュベートし、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙを用いて、膜を横切って下部チャンバに移動した細胞を決定した。
表１１は、カルシウム流入アッセイについてのＩＣ５０値を示す。データは、３つの独立した実験の平均である。各ｍＡｂは、１０ｎｇ／ｍｌ（１．２５ｎＭ）のヒトＣＣＬ１７又は５ｎｇ／ｍｌ（０．６２５ｎＭ）のｃｙｎｏ ＣＣＬ１７のいずれかを用いたヒト又はｃｙｎｏ ＣＣＬ１７によって誘導されたカルシウム流入を完全に中和し、表１１に示されるように、ヒト及びｃｙｎｏタンパク質両方に対する抗体のそれぞれのＩＣ50値はほぼ同等であった。
Figure 2016537024
表１２は、β−アレスチンアッセイのＩＣ50値を示す。データは、３つの独立した実験の平均である。ｍＡｂの全ては、２０ｎＭでヒト又はｃｙｎｏ ＣＣＬ１７によって誘導されたβ−アレスチン動員を完全に阻害し、同等の効力でヒト又はｃｙｎｏ ＣＣＬ１７によって誘導されたβ−アレスチン動員を用量依存的に阻害することができた。
Figure 2016537024
図１及び図２は、それぞれ、ヒト及びｃｙｎｏ細胞における選択抗体による走化性の阻害を示す。試験した全ての抗体は、０．５μｇ／ｍｌの抗体濃度で、ヒトＣＣＬ１７によって誘導されたＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞両方の走化性を約５０％の阻害レベルで阻害した。Ｃ１７Ｂ３０２及びＣ１７Ｂ３１１は、０．５μｇ／ｍｌの抗体濃度で、ｃｙｎｏ ＣＣＬ１７によって誘導されたｃｙｎｏ ＨＳＣ−Ｆ細胞の走化性を約５０％の阻害レベルで阻害した。
実施例８．抗ＣＣＬ１７抗体Ｃ１７Ｂ２３６のエピトープマッピング
抗体Ｃ１７Ｂ２３６（ＶＨ：配列番号４５、ＶＬ：配列番号５２）結合エピトープは、Ｘ線結晶解析によって決定された。
ヒトＣＣＬ１７を大腸菌において発現させ、封入体から単離し、リフォールディングした。ｍＡｂ Ｃ１７Ｂ２３６のＦａｂ断片をＨＥＫ２９３Ｆ細胞において発現させた。ＣＣＬ１７：Ｃ１７Ｂ２３６複合体は、過剰のＣＣＬ１７で１．６：１のモル比で混合することにより調製された。次に、複合体をサイズ排除クロマトグラフィーで精製した。２０％のＰＥＧ３３５０及び０．２ＭのＫ／Ｎａ酒石酸を含む溶液から蒸気拡散法により複合体を結晶化した。Ｘ線回折データは、１．９Åの解像度に収集された。構造は、分子置換により決定され、１８．０％のＲ因子に修正された。
Ｃ１７Ｂ２３６エピトープは立体構造であり、ＣＣＬ１７分子の３セグメント、つまり、２つのループ（残基２１〜２３及び４４〜４５）及びＣ末端らせん構造（残基６０〜６８）に及ぶ。主要な相互作用は、ＣＣＬ１７の塩基性残基Ａｒｇ２２及びＬｙｓ２３、並びにＡｓｐ５２、Ａｓｐ５５、及びＡｓｐ５７を含むＨＣＤＲ２における酸性残基のクラスターを伴う。これらの静電相互作用に加えて、エピトープの中心のファン−デル−ワールス接触は、ＶＨのＴｒｐ３３及びＴｒｐ１０５とＣＣＬ１７のＡｒｇ２２との間で生じる。接触の数を考慮すると、エピトープの主要な残基は、ＶＨのＴｒｐ３３に対して積み重なり、ＨＣＤＲ３に多く接触するＡｒｇ２２である。パラトープ残基及びエピトープ残基を図７に示す。
パラトープ（ＣＣＬ１７の結合に関与する抗体残基）は、６つのＣＤＲのうちの５つに属する（ＬＣＤＲ２を除く全て）１８個の残基を含む。
Ｃ１７Ｂ２３６エピトープは、その二量体化表面とＣＣＬ１７単量体の反対側にある。よって、Ｃ１７Ｂ２３６は、ＣＣＬ１７の二量体化を阻止しない。Ｃ１７Ｂ２３６の中和作用は、ＣＣＲ４と重複するエピトープを競合することに起因する。
Figure 2016537024
Figure 2016537024
Figure 2016537024
Figure 2016537024

Claims (37)

  1. 重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ヒトＣＣＬ１７に特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体は、配列番号４５のＶＨ及び配列番号５２のＶＬを含む抗体と、ヒトＣＣＬ１７への結合を競合する、抗体。
  2. 前記抗体が、配列番号１の少なくともＣＣＬ１７のアミノ酸残基２１〜２３、４４〜４５、及び６０〜６８内でヒトＣＣＬ１７と結合する、請求項１に記載の抗体。
  3. 前記抗体が、配列番号１の少なくとも残基Ｒ２２及びＫ２３においてヒトＣＣＬ１７に結合する、請求項２に記載の抗体。
  4. 前記抗体が、ＣＣＬ１７／ＣＣＲ４相互作用を阻止する、請求項１に記載の抗体。
  5. 前記抗体が、約１×１０-10Ｍ以下の親和性定数（ＫD）でヒトＣＣＬ１７に結合し、このとき、前記ＫDが、前記抗体及びヒトＣＣＬ１７を４℃で４８時間同時にインキュベートした後、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するトリス系生理食塩水緩衝液中の溶液平衡親和性を使用して測定される、請求項４に記載の抗体。
  6. 前記抗体が、約５×１０-12Ｍ以下のＫDでヒトＣＣＬ１７に結合する、請求項１〜５に記載の抗体。
  7. 前記抗体が、約１×１０-8Ｍ以下のＫDでカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＣＬ１７に結合し、このとき、前記ＫDが、前記抗体及びｃｙｎｏ ＣＣＬ１７を４℃で４８時間同時にインキュベートした後、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するトリス系生理食塩水緩衝液中の溶液平衡親和性を使用して測定される、請求項１〜６に記載の抗体。
  8. 前記抗体が、約１×１０-9Ｍ以下のＩＣ50値で、Ｆｌｕｏ−８ ＮＷを使用して測定される、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＣＣＬ１７によって誘導されるＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞中のカルシウム動員を阻害する、請求項１〜７に記載の抗体。
  9. 重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）の１（ＨＣＤＲ１）、２（ＨＣＤＲ２）、及び３（ＨＣＤＲ３）と、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）の１（ＬＣＤＲ１）、２（ＬＣＤＲ２）、及び３（ＬＣＤＲ３）と、を含み、前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、前記ＨＣＤＲ３、前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２、及び前記ＬＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号４、５、４２、８、２４、及び２８のアミノ酸配列、又はそれぞれ、配列番号４６及び６２のＶＨ及びＶＬを含む、請求項５に記載の抗体。
  10. 重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）の１（ＨＣＤＲ１）、２（ＨＣＤＲ２）、及び３（ＨＣＤＲ３）と、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）の１（ＬＣＤＲ１）、２（ＬＣＤＲ２）、及び３（ＬＣＤＲ３）と、を含み、前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、前記ＨＣＤＲ３、前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２、及び前記ＬＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号４、５、７１、７２、７３、及び７４のアミノ酸配列を含む、請求項１〜８に記載の抗体。
  11. 前記ＨＣＤＲ１が、配列番号４のアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が、配列番号５のアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ３が、配列番号６、４２、又は４３のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の抗体。
  12. 前記ＬＣＤＲ１が、配列番号８、９、１０、１３、１４、１５、１７、又は１８のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ２が、配列番号２０、２１、２２、２４、２５、及び２６のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ３が、配列番号２８、２９、３０、３３、３４、３５、３７、又は３８のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の抗体。
  13. ａ）それぞれ、配列番号４、５、６、８、２０、及び２８、
    ｂ）それぞれ、配列番号４、５、６、９、２１、及び２９、
    ｃ）それぞれ、配列番号４、５、６、１０、２２、及び３０、
    ｄ）それぞれ、配列番号４、５、６、１３、２１、及び３３、
    ｅ）それぞれ、配列番号４、５、６、１４、２０、及び３４、
    ｆ）それぞれ、配列番号４、５、６、１５、２５、及び３５、
    ｇ）それぞれ、配列番号４、５、６、１７、２５、及び３７、
    ｈ）それぞれ、配列番号４、５、６、１８、２６、及び３８、
    ｉ）それぞれ、配列番号４、５、４２、８、２４、及び２８、又は
    ｊ）それぞれ、配列番号４、５、４３、８、２４、及び２８の前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の配列を含む、請求項１２に記載の抗体。
  14. 前記抗体が、配列番号７５のＶＨ、及び配列番号７６のＶＬを含む、請求項１０に記載の抗体。
  15. 前記ＶＨが、配列番号４５、４６、又は４７のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の抗体。
  16. 前記ＶＬが、配列番号５０、５１、５２、５５、５６、５７、５９、６０、又は６２のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の抗体。
  17. 前記抗体が、
    ａ）配列番号４５のＶＨ、及び配列番号５０、５１、５２、５５、５６、５７、５９、若しくは６０のＶＬ、
    ｂ）それぞれ、配列番号４６及び６２のＶＨ及びＶＬ、又は
    ｃ）それぞれ、配列番号４７及び６２のＶＨ及びＶＬを含む、請求項１６に記載の抗体。
  18. 前記抗体が、配列番号４６のＶＨと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６２のＶＬと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む、請求項５に記載の抗体。
  19. 前記抗体が、ヒト又はヒト化されている、請求項１〜１８に記載の抗体。
  20. 前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のアイソタイプのものである、請求項１９に記載の抗体。
  21. 前記抗体が、Ｆｃ領域内に置換を含む、請求項２０に記載の抗体。
  22. 前記置換が、ＩｇＧ２上のＶ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、若しくはＰ３３１Ｓ置換、又はＩｇＧ４上のＳ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、若しくはＬ２３５Ａ置換を含み、残基の番号付けがＥＵインデックスに準ずる、請求項２１に記載の抗体。
  23. 前記置換が、ＩｇＧ２上のＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ置換、又はＩｇＧ４上のＳ２２８Ｐ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換を含み、残基の番号付けがＥＵインデックスに準ずる、請求項２２に記載の抗体。
  24. 請求項１〜２３に記載の抗体と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
  25. 請求項９〜２４のいずれかに記載の抗体の前記ＶＨ又は前記ＶＬをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
  26. 請求項２５に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  27. 請求項２６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  28. 請求項９〜２４に記載の抗体を生成する方法であって、
    前記抗体が生成される条件下で、請求項２７に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、方法。
  29. ＣＣＬ１７媒介疾患を治療する方法であって、
    それを必要とする対象に、前記ＣＣＬ１７媒介疾患を治療するのに十分な時間の間、請求項１〜２４に記載の抗体を投与する工程を含む、方法。
  30. 前記ＣＣＬ１７媒介疾患が、炎症性疾患である、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記炎症性疾患が、喘息、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）、又は特発性肺線維症（ＩＰＦ）である、請求項３０に記載の方法。
  32. 喘息又は気道過敏性を治療する方法であって、
    喘息を治療するのに十分な時間の間、請求項１〜２４に記載の抗体を対象に投与する工程を含む、方法。
  33. 療法のための請求項１〜２４に記載の抗体の使用。
  34. 療法において使用するための、請求項１〜２４に記載の抗体。
  35. ＣＣＬ１７媒介疾患を有する対象の治療において使用するための、請求項１〜２４に記載の抗体。
  36. 前記ＣＣＬ１７媒介疾患が、炎症性疾患、喘息、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）、又は特発性肺線維症（ＩＰＦ）である、請求項３５に記載の使用のための抗体。
  37. 前記ＣＣＬ１７媒介疾患が、喘息である、請求項３６に記載の使用のための抗体。
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