ES2884255T3 - Anticuerpos anti-CCL17 - Google Patents

Anticuerpos anti-CCL17 Download PDF

Info

Publication number
ES2884255T3
ES2884255T3 ES14860331T ES14860331T ES2884255T3 ES 2884255 T3 ES2884255 T3 ES 2884255T3 ES 14860331 T ES14860331 T ES 14860331T ES 14860331 T ES14860331 T ES 14860331T ES 2884255 T3 ES2884255 T3 ES 2884255T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
ccl17
antibodies
seq
human
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES14860331T
Other languages
English (en)
Inventor
Ken Boakye
Vecchio Alfred Del
John Kehoe
Eilyn Lacy
Lynne Murray
Mary Ryan
Sandra Santulli-Marotto
John Wheeler
Brian Whitaker
Alexey Teplyakov
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Janssen Biotech Inc
Original Assignee
Janssen Biotech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Janssen Biotech Inc filed Critical Janssen Biotech Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2884255T3 publication Critical patent/ES2884255T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Anticuerpo anti-ligando 17 de quimiocina (motivo C-C) (CCL17) que comprende la región variable de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 46 y la región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 62.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-CCL17
Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen específicamente a CCL17, a polinucleótidos que codifican para los anticuerpos o fragmentos, y a métodos de obtención y uso de los anteriores.
Antecedentes de la invención
La quimiocina homeostática, CCL17 (TARC, ligando 17 de quimiocina (motivo C-C)) es un potente quimioatrayente de linfocitos. CCL17 es un ligando para CCR4, un GPCR (receptor acoplado a proteínas G) que se cree que es importante en la función de las células T y la quimiotaxia y la migración de células inmunitarias a sitios de inflamación. CCR4 se expresa de manera predominante en linfocitos Th2, linfocitos citolíticos naturales y células iNKT.
CCL17 se ha asociado con enfermedades humanas que afectan a diversos órganos, tales como colitis ulcerosa (UC), dermatitis atópica (AD), fibrosis pulmonar idiopática (IPF) y asma (Belperio et al., J Immunol, 173: 4692-469, 2004; Christophi et al., Inflamm Bowel Dis. doi: 10.1002/ibd.2295; Inoue et al., Eur Respir J, 24: 49-56, 2004; Kakinuma et al., J Allergy Clin Immunol, 107: 535-541, 2001; Saeki y Tamaki, J Dermatol Sci, 43: 75-84, 2006; Tamaki et al., J Dermatol, 33: 300-302, 2006). En ratones, CCL17 se ha asociado con diversas infecciones y estados inflamatorios, tales como inflamación pulmonar crónica presente en modelos de fibrosis y asma, colitis y esquistosomiasis, presumiblemente al inducir respuestas de Th2 a través del reclutamiento de células inmunitarias CCR4+. La neutralización de CCL17 mejora los efectos de la enfermedad en modelos de asma tanto de A. fumigatus como de ovoalbúmina (OVA), y el daño hepático en el modelo de ratón con P. acnes de lesión hepática inducida mediante el bloqueo del influjo de células T (Carpenter and Hogamoam Infect Immun, 73:7198-7207, 2005; Heiseke et al., Gastroenterology, 142:335-345; Hogamoam et al., Med Mycol, 43 Supl 1, S197-202, 2005; Ismailoglu et al., Therapeutic targeting of CCL17 via the systemic administration of a monoclonal antibody ameliorates experimental fungal asthma. Artículo presentado en Am J Respir Crit Care Med , 2011; Jakubzick et al., Am J Pathol, 165:1211-122, 2004; Kawasaki et al., J Immunol, 166:2055-2062, 2001; Yoneyama et al., J Clin Invest, 102:1933-1941, 1998).
CCL22 (MDC) es un segundo ligando para CCR4. La interacción de CCR4 con cada quimiocina produce distintos desenlaces (Allen et al., Annu Rev Immunol 25:787-820, 2007; Imai et al., J Biol Chem 273:1764-1768, 1998), a lo que contribuyen posiblemente las diferencias en las afinidades de unión de los dos ligandos para CCR4. CCL22 se une a CCR4 con mayor afinidad e induce la internalización del receptor más fácilmente que CCL17 (Baatar et al., J Immunol 179:1996-2004, 2007; Imai et al., J Biol Chem 273:1764-1768, 1998; Mariani et al., Eur J Immunol 34:231-240, 2004), y promueve la adhesión celular más fácilmente que CCL17 (D'Ambrosio et al., J Immunol 169:2303-2312, 2002). CCL22 muestra una expresión más restringida con producción limitada a las células inmunitarias, mientras que CCL17 se expresa y se secreta en muchos tipos de células diferentes incluyendo células no inmunitarias (Alferink et al., J Exp Med 197:585-599, 2003; Berin et al., Am J Respir Cell Mol Biol 24:382-389, 2001; Godiska et al., J Exp Med 185:1595-1604, 1997; Imai et al., J Biol Chem 271:21514-21521, 1996; Saeki y Tamaki, J Bermatol Sci 43:75-84, 2006). En el modelo murino de ligadura y punción cecal (CLP) de septicemia experimental, CCL22 promovió la inmunidad innata, mientras que CCL17 pareció interferir y en algunas circunstancias contribuir al daño orgánico (Matsukawa et al., Rev Immunogenet 2:339-358, 2000). En el modelo de ratón de aspergilosis invasiva pulmonar, CCL22 desempeñó un papel protector en la respuesta antifúngica innata, mientras que CCL17 desempeñó el papel de supresor (Carpenter y Hogaboam, Infect Immun 73:7198-7207, 2005). Estas dos quimiocinas pueden desempeñar papeles contrastantes en el establecimiento de la inflamación localizada debido a los efectos diferenciales sobre la homeostasis de Treg, ya que CCL22 favorece el reclutamiento de Treg a diferencia de CCL17 (Heiseke et al., Gastroenterology 142:335-345,2011; Montane et al., J Clin Invest, 121:3024-30, 2011; Weber et al., J Clin Invest 121:2898-2910, 2011).
En el modelo animal de hipersensibilidad de contacto, CCL17 es un factor importante en el inicio de la respuesta inflamatoria que conduce a hipersensibilidad de contacto (CHS) al exponerse o bien a FITC (isotiocianato de fluoresceína) o bien a DNFB (difluoronitrobenceno), y la inactivación de CCL17 en estos ratones potenció la supervivencia de aloinjertos cardiacos en comparación con ratones heterocigotos que tienen un alelo de CCL17 funcional (Alferink et al., J Exp Med 197:585-599, 2003).
Los antagonistas de CCR4 pueden ser no selectivos e inhibir las funciones tanto de CCL17 como de CCL22. Por tanto, existe la necesidad de anticuerpos anti-CCL17 para el tratamiento potencial de una variedad de enfermedades mediadas por CCL17, incluyendo el asma.
Santulli-Marotto et al. (Monoclon Antib Immunodiagn Immunother 32(3):162-71, 2013) analizan anticuerpos que se unen a y que inhiben la movilización de calcio mediada por CCL17. Ismailoglu et al. (Am J Respir Crit Care Med 183:A4504, 2011) analizan la selección como diana de CCL17 con anticuerpos en un modelo de ratón de asma fúngica establecida. La publicación de patente internacional n.° WO 2012/047584 analiza polipéptidos que pueden obtenerse a partir de la expresión de polinucleótidos que codifican para CCL17 de M. fascicularis.
Sumario de la invención
La invención proporciona un anticuerpo anti-ligando 17 de quimiocina (motivo C-C) (CCL17) que comprende la región variable de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 46 y la región variable de cadena ligera (VL) de Se Q ID NO: 62. La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptado.
La invención también proporciona uno o más polinucleótidos que codifican para la VH y la VL del anticuerpo de la invención.
La invención también proporciona uno o más vectores que comprenden el uno o más polinucleótidos de la invención. La invención proporciona además una célula huésped para producir un anticuerpo aislado que comprende el uno o más vectores de la invención.
La invención también proporciona un método de producción de un anticuerpo, que comprende cultivar la célula huésped de la invención en condiciones tales que se produce el anticuerpo.
La invención proporciona además el anticuerpo o la composición farmacéutica de la invención para su uso en terapia. Finalmente, la invención proporciona el anticuerpo o la composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, asma, colitis ulcerosa (UC), dermatitis atópica (AD) o fibrosis pulmonar idiopática (IPF), en particular asma o hiperreactividad de las vías respiratorias.
Sumario de la divulgación
En el presente documento se da a conocer un anticuerpo aislado que se une específicamente a CCL17 humana que comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en el que el anticuerpo compite por unirse a CCL17 humana con un anticuerpo que comprende la VH de SEQ ID NO:45 y la VL de SEQ ID NO: 52.
También se da a conocer en el presente documento un anticuerpo aislado que se une específicamente a CCL17 humana que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1, en el que el anticuerpo se une a CCL17 humana al menos dentro de los residuos de aminoácido 21-23, 44-45 y 60-68 de CCL17.
En una realización de la invención, el anticuerpo aislado de la invención bloquea la interacción CCL17/CCR4, por ejemplo en el que el anticuerpo se une a CCL17 humana con una constante de afinidad (Kd) de aproximadamente 1x10'10 M o menos, cuando la Kd se mide usando afinidad en equilibrio de disolución en tampón salino a base de Tris que contiene Tween-20 al 0,05% después de la coincubación del anticuerpo y CCL17 humana durante 48 horas a 4°C.
También se da a conocer en el presente documento un anticuerpo aislado que se une específicamente a CCL17 humana que comprende determinadas secuencias de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3.
También se da a conocer en el presente documento un anticuerpo aislado que se une específicamente a CCL17 humana que comprende determinadas secuencias de VH y VL.
Una realización de la invención es un anticuerpo aislado que se une específicamente a CCL17 humana que comprende la VH de SEQ ID NO: 46 y la VL de SEQ ID NO: 62.
Otra realización de la invención es una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la invención y un portador farmacéuticamente aceptado.
Otra realización de la invención es un polinucleótido aislado que codifica para la VH o la VL de la invención.
Otra realización de la invención es un vector que comprende el polinucleótido de la invención.
Otra realización de la invención es una célula huésped que comprende el vector de la invención.
Otra realización de la invención es un método de producción de un anticuerpo de la invención, que comprende cultivar la célula huésped de la invención en condiciones tales que se produce el anticuerpo.
Otra realización de la invención es un anticuerpo de la invención para su uso en terapia, por ejemplo para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad mediada por CCL17.
Otra realización de la invención es un anticuerpo de la invención para su uso en un método de tratamiento del asma 0 la hiperreactividad de las vías respiratorias.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1A muestra la inhibición de la quimiotaxia con el anticuerpo anti-CCL17 B302 inducida por CCL17 humana 1 nM en células CCRF-CEM. B302 es C17B302.
La figura 1B muestra la inhibición de la quimiotaxia con el anticuerpo anti-CCL17 B311 inducida por CCL17 humana 1 nM en células CCRF-CEM. B311 es C17B311.
La figura 1C muestra el efecto del control de isotipo IgG2 sobre la quimiotaxia inducida por CCL17 humana 1 nM en células CCRF-CEM.
La figura 1D muestra el efecto del control de isotipo IgG4 sobre la quimiotaxia inducida por CCL17 humana 1 nM en células CCRF-CEM.
La figura 2A muestra la inhibición de la quimiotaxia con el anticuerpo anti-CCL17 B302 inducida por CCL17 de macaco cangrejero 1 nM en células HSC-F. B302 es C17B302.
La figura 2B muestra la inhibición de la quimiotaxia con el anticuerpo anti-CCL17 B311 inducida por CCL17 de macaco cangrejero 1 nM en células HSC-F. B311 es C17B311.
La figura 2C muestra el efecto del control de isotipo IgG2 sobre la quimiotaxia inducida por CCL17 de macaco cangrejero 1 nM en células HSC-F.
La figura 2D muestra el efecto del control de isotipo IgG4 sobre la quimiotaxia inducida por CCL17 de macaco cangrejero 1 nM en células HSC-F.
La figura 3 muestra las secuencias de VH de los anticuerpos anti-CCL17 que se unen a CCL17 humana con una Kd de 100 nM o menor.
La figura 4 muestra las secuencias consenso de VH y HCDR de los anticuerpos anti-CCL17 mostradas en la figura 3 que se unen a CCL17 humana con una Kd de 100 nM o menor.
La figura 5 muestra las secuencias de VL de los anticuerpos anti-CCL17 que se unen a CCL17 humana con una Kd de 100 nM o menor.
La figura 6A muestra la secuencia consenso de VL de los anticuerpos anti-CCL17 mostradas en la figura 5 que se unen a CCL17 humana con una Kd de 100 nM o menor.
La figura 6B muestra las secuencias consenso de LCDR de los anticuerpos anti-CCL17 mostradas en la figura 5 que se unen a CCL17 humana con una Kd de 100 nM o menor.
La figura 7 muestra los residuos de epítopo y parátopo del anticuerpo C17B236. Los residuos de parátopo de VH y VL están rodeados con un cuadrado, y los residuos de epítopo de CCL17 están rodeados con un círculo. La numeración de residuos es según la SEQ ID NO: 45 (VH), la SEQ ID NO: 52 (VL), la SEQ ID NO: 1 (CCL17).
Descripción detallada de la divulgación
Ha de entenderse que la terminología usada en el presente documento es únicamente para el fin de describir casos particulares y no se pretende que sea limitativa. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido normalmente por un experto habitual en la técnica al que pertenece la invención.
Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la práctica de someter a prueba la presente invención, en el presente documento se describen materiales y métodos a modo de ejemplo. En la descripción y las reivindicaciones de la presente invención, se usará la terminología siguiente.
“Unión específica” o “se une específicamente” o “se une”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que se une a un antígeno predeterminado con mayor afinidad que para otros antígenos. Normalmente, el anticuerpo se une a un antígeno predeterminado con una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 1x10-7 M o menos, por ejemplo aproximadamente 1x10-8 M o menos, aproximadamente 1x10-9 M o menos, aproximadamente 1x10-10 M o menos, aproximadamente 1x10-11 M o menos, aproximadamente 1x10-12 M o menos, aproximadamente 1x10-13 M o menos o aproximadamente 1x10-14 M o menos, normalmente con una Kd que es al menos diez veces menor que su Kd para unirse a un antígeno o epítopo no específico (por ejemplo, BSA, caseína). La constante de disociación puede medirse usando procedimientos convencionales. Sin embargo, los anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno predeterminado pueden tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo con el mismo antígeno predeterminado de otras especies (homólogos), tal como ser humano o mono, por ejemplo Macaca fascicularis (macaco cangrejero) o Pan troglodytes (chimpancé).
“Anticuerpo monoclonal que se une específicamente CCL17 humana” se refiere a anticuerpos que se unen específicamente a CCL17 madura humana que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1.
“Que neutraliza” o “neutraliza” o “anticuerpo neutralizante” o “antagonista de anticuerpo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que inhibe parcial o completamente, mediante cualquier mecanismo, la actividad biológica de CCL17. Los anticuerpos neutralizantes pueden identificarse usando ensayos para determinar la actividad biológica de CCL17 tal como se describe a continuación. Un anticuerpo neutralizante frente a CCL17 puede inhibir la actividad biológica medida de CCL17 en el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 100%.
“CCL17 humana” o “huCCL17”, tal como se usa indistintamente en el presente documento, se refiere a la proteína CCL17 humana que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1. La secuencia de la CCL17 de longitud completa que incluye la secuencia señal está disponible en GenBank; número de registro NP_002978.
“CCL17 de macaco cangrejero” o “cCCL17”, tal como se usa indistintamente en el presente documento, se refiere a la proteína CCL17 de Macaca fascicularis (macaco cangrejero) que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2.
“Anticuerpos”, tal como se usa en el presente documento, se entiende en un sentido amplio e incluye moléculas de inmunoglobulina que incluyen anticuerpos monoclonales incluyendo anticuerpos murinos, humanos, humanizados y quiméricos, fragmentos de anticuerpo, anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos o fragmentos de anticuerpo, anticuerpos diméricos, tetraméricos o multiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida.
Las inmunoglobulinas pueden asignarse a cinco clases principales, concretamente IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de la cadena pesada. IgA e IgG se subclasifican adicionalmente en los isotipos IgA1, IgA2 , IgG1, IgG2 , IgG3 e IgG4. Las cadenas ligeras de anticuerpo de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, concretamente kappa (k ) y lambda (X), basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
La expresión “fragmentos de anticuerpo” se refiere a una parte de una molécula de inmunoglobulina que conserva el sitio de unión al antígeno de cadena pesada y/o cadena ligera, tales como las regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (HCDR) 1,2 y 3, las regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (LCDR) 1, 2 y 3, una región variable de cadena pesada (VH) o una región variable de cadena ligera (VL). Los fragmentos de anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en la VL o la VH; un fragmento F(ab)2 , un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro a la región bisagra; un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CHI; un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; un fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), que consiste en un dominio VH. Los dominios VH y VL pueden obtenerse mediante ingeniería genética y unirse entre sí a través de un ligador sintético para formar diversos tipos de diseños de anticuerpos de cadena sencilla donde los dominios VH/VL se emparejan de manera intramolecular o intermolecular en aquellos casos en los que los dominios VH y VL se expresan mediante constructos independientes de anticuerpo de cadenas sencilla, para formar un sitio de unión a antígeno monovalente, tal como Fv de cadena sencilla (scFv) o diacuerpo; descrito por ejemplo en la publicación de patente internacional n.° WO1998/44001, publicación de patente internacional n.° w O 1988/01649; publicación de patente internacional n.° WO1994/13804; publicación de patente internacional n.° WO1992/01047. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas bien conocidas y los fragmentos se caracterizan de la misma manera que los anticuerpos intactos.
La expresión “anticuerpo aislado” se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a CCL17 humana está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de CCL17 humana). Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a CCL17 humana puede tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como ortólogos de CCL17 humana, tal como CCL17 de Macaca fascicularis (macaco cangrejero). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o compuestos químicos.
Una región variable de anticuerpo consiste en una región de “entramado” interrumpida por tres “sitios de unión a antígeno”. Los sitios de unión a antígeno se definen usando diversos términos: (i) Las regiones determinantes de complementariedad (CDR), tres en la VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) y tres en la VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3) se basan en la variabilidad de secuencia (Wu y Kabat, J Exp Med 132:211-50, 1970; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Betesda, Md., 1991). (ii) Las “regiones hipervariables”, “HVR” o “HV”, tres en la VH (H1, H2, H3) y tres en la VL (L1, L2, L3) se refieren a las regiones de dominios variables de un anticuerpo variable que son de estructura hipervariable tal como definen Chothia y Lesk (Chothia y Lesk Mol Biol 196:901-17, 1987). Otros términos incluyen “ IMGT-CDR” (Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003) y “uso de residuos determinante de la especificidad” (SDRU) (Almagro Mol Recognit, 17:132-43, 2004). La base de datos de International ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www_imgt_org) proporciona una numeración y definición normalizada de sitios de unión a antígeno. La correspondencia entre las delineaciones de IMGT, HV y Cd R se describe en Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003.
Los “residuos de Chothia”, tal como se usa en el presente documento, son los residuos de VL y VH de anticuerpo numerados según Al-Lazikani (Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273:927-48, 1997).
“Región de entramado” o “secuencias de región de entramado” son las secuencias restantes de una región variable distintas de las secuencias definidas como sitio de unión a antígeno. Dado que el sitio de unión a antígeno puede definirse mediante diversos términos tal como se describió anteriormente, la secuencia de aminoácidos exacta de una región de entramado depende de cómo se definió el sitio de unión a antígeno.
“Anticuerpo humanizado” se refiere a un anticuerpo en el que el sitio de unión a antígeno se deriva de especies no humanas y las regiones de entramado de región variable se derivan de secuencias de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos humanizados pueden incluir sustituciones en las regiones de entramado de modo que la región de entramado puede no ser una copia exacta de la inmunoglobulina humana expresada o las secuencias génicas de línea germinal.
“Anticuerpo humano” se refiere a un anticuerpo que tiene regiones variables de cadena pesada y ligera en las que tanto la región de entramado como la de sitio de unión a antígeno se derivan de secuencias de origen humano. Si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva de secuencias de origen humano.
El anticuerpo humano comprende regiones variables de cadena pesada o ligera que se “derivan de” secuencias de origen humano si las regiones variables del anticuerpo se obtienen de un sistema que usa inmunoglobulina de línea germinal humana o genes de inmunoglobulina reordenados. Tales sistemas incluyen bibliotecas génicas de inmunoglobulina humana, por ejemplo bibliotecas presentadas en fagos, y animales transgénicos no humanos tales como ratones que portan loci de inmunoglobulina humana tal como se describe en el presente documento. El “anticuerpo humano” puede contener diferencias de aminoácido cuando se compara con las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana o reorganizadas debido, por ejemplo, a mutaciones somáticas que se producen de manera natural o a la introducción intencionada de sustituciones. Normalmente, el “anticuerpo humano” es idéntico al menos en aproximadamente el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 100% en la secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de línea germinal humano o reorganizado. En algunos casos, el “anticuerpo humano” puede contener secuencias consenso de región de entramado derivadas de análisis de secuencias de región de entramado humana, por ejemplo tal como se describe en Knappik et al., J Mol Biol 296:57-86, 2000), o HCDR3 sintético incorporado en bibliotecas génicas de inmunoglobulina humana presentadas en fagos, por ejemplo tal como se describe en Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010 y la publicación de patente internacional n.° WO2009/08546).
Los anticuerpos humanizados aislados pueden ser sintéticos. Los anticuerpos humanos, aunque se derivan de secuencias de inmunoglobulina humana, pueden generarse usando sistemas tales como la presentación en fagos que incorpora CDR sintéticas y/o regiones de entramado sintéticas, o pueden someterse a mutagénesis in vitro para mejorar las propiedades de los anticuerpos, dando como resultado anticuerpos que no existen de manera natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.
Los anticuerpos humanos pueden incluir sustituciones en la región de entramado o en el sitio de unión a antígeno, de modo que pueden no ser copias exactas de inmunoglobulina humana expresada o secuencias génicas de línea germinal. Sin embargo, los anticuerpos en los que los sitios de unión a antígeno se derivan de una especie no humana no se incluyen en la definición de “anticuerpo humano”.
El término “anticuerpo recombinante”, tal como se usa en el presente documento, incluye todos los anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de los mismos (descrito adicionalmente a continuación), anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos combinatoria y recombinante, y anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que implique corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN.
El término “anticuerpo monoclonal”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única.
El término “sustancialmente idéntico”, tal como se usa en el presente documento, significa que las dos secuencias de aminoácidos de región variable de anticuerpo que están comparándose son idénticas o tienen “diferencias insustanciales”. Las diferencias insustanciales son sustituciones de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos en una secuencia de región variable de anticuerpo que no afectan adversamente a las propiedades del anticuerpo. También se dan a conocer secuencias de aminoácidos sustancialmente idénticas a las secuencias de región variable dadas a conocer en el presente documento. La identidad de secuencia puede ser de aproximadamente el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o superior. El porcentaje de identidad puede determinarse por ejemplo mediante alineación por pares usando la configuración por defecto del módulo AlignX de Vector NTI v.9.0.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las secuencias de proteína de la presente invención puede usarse como secuencia de consulta para realizar una búsqueda en bases de datos públicas o de patente, por ejemplo, para identificar secuencias relacionadas. Los programas a modo de ejemplo usados para realizar tales búsquedas son los programas XBLAST o BLASTP (http_//www_ncbi_nlm/nih_gov), o the GenomeQuest™ (GenomeQuest, Westborough, MA) adecuados usando las configuraciones por defecto.
El término “epítopo”, tal como se usa en el presente documento, significa una parte de un antígeno al que se une específicamente un anticuerpo. Los epítopos consisten habitualmente en agrupaciones de superficie químicamente activas (tales como polares, no polares o hidrófobas) de restos tales como cadenas laterales de polisacáridos o aminoácidos y pueden presentar características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Un epítopo puede estar compuesto por aminoácidos contiguos y/o no contiguos que forman una unidad espacial conformacional. Para un epítopo no contiguo, los aminoácidos de diferentes partes de la secuencia lineal del antígeno se acercan en un espacio tridimensional a través del plegamiento de la molécula de proteína.
“Biespecífico”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo o molécula que se une a dos antígenos distintos o a dos epítopos distintos dentro de un antígeno.
“Monoespecífico”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que se une a un antígeno o a un epítopo.
El término “en combinación con”, tal como se usa en el presente documento, significa que los agentes descritos pueden administrarse a un animal juntos en una mezcla, simultáneamente como agentes individuales o secuencialmente como agentes individuales en cualquier orden.
El término “vector” significa un polinucleótido no natural que puede duplicarse dentro de un sistema biológico o que puede moverse entre tales sistemas. Los polinucleótidos de vector normalmente contienen un ADNc que codifica para una proteína de interés y elementos adicionales, tales como orígenes de replicación, señal de poliadenilación o marcadores de selección, que funcionan para facilitar la duplicación o el mantenimiento de estos polinucleótidos en un sistema biológico. Los ejemplos de tales sistemas biológicos pueden incluir una célula, un virus, un animal, una planta y sistemas biológicos reconstituidos que utilizan componentes biológicos que pueden duplicar un vector. El polinucleótido que comprende un vector puede ser moléculas de ADN o ARN o un híbrido de estas.
El término “vector de expresión” significa un vector que puede utilizarse en un sistema biológico o en un sistema biológico reconstituido para dirigir la traducción de un polipéptido codificado por una secuencia de polinucleótido presente en el vector de expresión.
El término “polinucleótido” significa una molécula que comprende una cadena de nucleótidos unidos covalentemente por una estructura principal de azúcar-fosfato u otra química covalente equivalente. Los ADN y ARN monocatenarios y bicatenarios son ejemplos típicos de polinucleótidos.
“ADN complementario” o “ADNc” se refiere a un polinucleótido sintético bien conocido que comparte la disposición de elementos de secuencia encontrados en especies de ARNm maduras nativas con exones contiguos, retirándose los intrones intermedios presentes en el ADN genómico. Los codones que codifican para la metionina iniciadora pueden estar presentes o no en el ADNc. El ADNc puede sintetizarse, por ejemplo, mediante transcripción inversa o ensamblaje de genes sintéticos.
“Sintético” o “no natural”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un polinucleótido o a una molécula de polipéptido no presente en la naturaleza.
El término “polipéptido” o “proteína” significa una molécula que comprende al menos dos residuos de aminoácido unidos mediante un enlace peptídico para formar un polipéptido. Los polipéptidos pequeños de menos de 50 aminoácidos pueden denominarse “péptidos”.
En el presente documento se usan códigos de aminoácidos convencionales de una y tres letras, tal como se muestra en la tabla 1.
Tabla 1.
Figure imgf000008_0001
Composiciones de materia
En el presente documento se dan a conocer anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a CCL17 humana. Los anticuerpos de la invención inhiben la actividad biológica de CCL17 en la célula, y opcionalmente pueden reaccionar de manera cruzada con CCL17 de macaco cangrejero. La presente invención proporciona polinucleótidos sintéticos que codifican para los anticuerpos de la invención y fragmentos de los mismos, vectores y células huésped, y métodos de obtención y uso de los anticuerpos de la invención.
En el presente documento se da a conocer un anticuerpo aislado que se une específicamente a CCL17 humana.
En el presente documento se da a conocer un anticuerpo aislado que se une específicamente a CCL17 humana que comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en el que el anticuerpo compite por unirse a CCL17 humana con un anticuerpo que comprende la VH de SEQ ID NO:45 y la VL de SEQ ID NO: 52. El anticuerpo de la presente invención puede competir por unirse a CCL17 humana con el anticuerpo que comprende la VH de SEQ ID NO: 45 y la VL de SEQ ID NO: 52.
Puede someterse a ensayo in vitro la competencia entre la unión específica a CCL17 humana con anticuerpos de la invención usando métodos bien conocidos. Por ejemplo, puede someterse a ensayo la unión del anticuerpo marcado con MSD Sulfo-Tag™-éster de NHS a CCL17 humana en presencia de un anticuerpo no marcado mediante ELISA, o puede usarse análisis Biacore o citometría de flujo para demostrar la competencia con los anticuerpos de la presente invención. La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir la unión del anticuerpo que comprende la VH de SEQ ID NO: 45 y la VL de SEQ ID NO: 52 a CCL17 humana demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con estos anticuerpos para unirse a CCL17 humana.
En el presente documento también se describe un anticuerpo aislado que se une específicamente a CCL17 humana que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1, en el que el anticuerpo se une a CCL17 humana al menos dentro de los residuos de aminoácido 21-23, 44-45 y 60-68 de CCL17. “Al menos dentro de los residuos de aminoácido 21-23, 44­ 45 y 60-68 de CCL17 humana” significa que el anticuerpo anti-CCL17 se une al menos a un residuo que reside dentro del tramo de aminoácidos de los residuos 21-23 de SEQ ID NO: 1, y al menos a un residuo que reside dentro del tramo de aminoácidos de los residuos 44-45 de SEQ ID NO: 1, y al menos a un residuo que reside dentro del tramo de aminoácidos de los residuos 60-68 de SEQ ID NO: 1. El anticuerpo puede unirse a más de un residuo dentro de los residuos 21-23, 44-45 y 60-68, y a residuos adicionales fuera de los residuos 21-23, 44-45 y 60-68 de SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención se une a CCL17 humana al menos en los residuos R22 y K23 de SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención se une a CCL17 humana al menos en los residuos L21, R22, K23, V44, Q45, N60, Y64, S67 y L68 de SEQ ID NO: 1.
Un anticuerpo a modo de ejemplo dado a conocer en el presente documento que se une a CCL17 humana dentro de los residuos de aminoácido 21-23, 44-45 y 60-68 de CCL17 de SEQ ID NO: 1 es C17B236 que tiene la VH de SEQ ID NO: 45 y la VL de SEQ ID NO: 52. Basándose en análisis de la estructura cristalina, los principales residuos de epítopo unidos a C17B236 son R22 y K23 de CCL17 de SEQ ID NO: 1, basándose en el número de contactos entre estos residuos y los residuos VH del anticuerpo.
Otros anticuerpos a modo de ejemplos dados a conocer en el presente documento que se unen a CCL17 humana dentro de los residuos de aminoácido 21-23, 44-45 y 60-68 de CCL17 son variantes de C17B236, que se derivan a partir de una campaña de maduración por afinidad del mismo anticuerpo parental. Las secuencias de VH y VL de los anticuerpos a modo de ejemplo se muestran en la figura 3 y la figura 5. El anticuerpo de la presente invención puede unirse a CCL17 humana dentro de los residuos de aminoácido 21-23, 44-45 y 60-68 de CCL17.
La maturación por afinidad de los anticuerpos normalmente implica sustituciones de aminoácido en las CDR o en la zona Vernier (regiones de entramado que subyacen a las CDR). Las variantes maduras se seleccionan mediante el cribado de las bibliotecas combinatorias, que pueden contener hasta 108 mutantes. El límite en el tamaño de la biblioteca limita el número de posiciones variables a 6-7 si se permiten los 20 aminoácidos en cada posición. La mayoría de los residuos de parátopo se conservan en cada biblioteca combinatoria, lo que garantiza que también se conserve el epítopo de unión. Varios estudios cristalográficos de los anticuerpos parentales y maduros han mostrado que el epítopo siempre se conserva durante la maduración por afinidad (por ejemplo Fransson et al., J. Mol. Biol. 2010, 398:214-231; Gustchina et al., PLoS Pathog. 2010, 6:e1001182; La Porte et al., MAbs 2014; 6:1059-1068).
Anticuerpos anti-CCL17 que se unen a CCL17 humana dentro de los residuos de aminoácido 21-23, 44-45 y 60-68 de CCL17 se unen a CCL17 humana con alta afinidad, normalmente con la Kd menor de aproximadamente 1x10'10 M.
Los anticuerpos que se unen a CCL17 humana dentro de los residuos de aminoácido 21-23, 44-45 y 60-68 de CCL17 pueden obtenerse por ejemplo inmunizando ratones con la proteína quimérica de CCL17 que tiene secuencias de CCL17 humana en las posiciones de residuo 21-23, 44-45 y 60-68, o mediante el cribado de bibliotecas de presentación en fagos con CCL17 humana de tipo natural, y el examen cruzado de las coincidencias resultantes con variantes de CCL17 que tienen sustituciones en cada una o en varias posiciones de residuo dentro de los residuos 21-23, 44-45 y 60-68 de CCL17 humana usando métodos descritos en el presente documento.
En algunas realizaciones de la invención, el anticuerpo que se une específicamente a CCL17 humana de la invención bloquea la interacción CCL17/CCR4.
Los anticuerpos pueden someterse a prueba para determinar su capacidad para bloquear la interacción CCL17/CCR4 mediante citometría de flujo convencional. Por ejemplo, se incuban células que expresan CCR4 con CCL17 humana marcada de manera fluorescente y el anticuerpo de prueba, después de lo cual se evalúa la unión de la CCL17 humana marcada de manera fluorescente a las células que expresan c CR4 usando métodos convencionales. Los anticuerpos que “bloquean la interacción CCL17/CCR4” o “inhiben la interacción CCL17/CCR4” pueden inhibir la unión de CCL17 a células que expresan CCR4 en el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 100% cuando se compara con la unión de CCL17 en ausencia del anticuerpo.
En otra realización de la invención, el anticuerpo aislado de la invención se une a CCL17 humana con una constante de afinidad (Kd) de aproximadamente 1x10'7 M o menos, de aproximadamente 1x10'8 M o menos, aproximadamente 1x10'9 M o menos, aproximadamente 1x10'10 M o menos, aproximadamente 1x10'11 M o menos, aproximadamente 1x10'12 M o menos, aproximadamente 1x10'13 M o menos, o aproximadamente 1x10'14 M o menos, cuando la Kd se mide usando afinidad en equilibrio de disolución en tampón salino a base de Tris que contiene Tween-20 al 0,05% después de la coincubación del anticuerpo y CCL17 humana durante 48 horas a 4°C.
En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención se une a CCL17 humana con una constante de afinidad (Kd) de aproximadamente 1x10-10 M o menos, cuando la Kd se mide usando afinidad en equilibrio de disolución en tampón salino a base de Tris que contiene Tween-20 al 0,05% después de la coincubación del anticuerpo y CCL17 humana durante 48 horas a 4°C.
En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención se une a CCL17 humana con la Kd de aproximadamente 5x10-12 M o menos.
En otra realización, el anticuerpo de la invención que se une específicamente a CCL17 humana se une a CCL17 de Macaca fascicularis (macaco cangrejero) con una constante de afinidad (Kd) de aproximadamente 1x10-6 M o menos, aproximadamente 1x10-7 M o menos, aproximadamente 1x10-8 M o menos, aproximadamente 1x10-9 M o menos, aproximadamente 1x10-10 M o menos, aproximadamente 1x10-11 M o menos o aproximadamente 1x10-12 M o menos, cuando la Kd se mide usando afinidad en equilibrio de disolución en tampón salino a base de T ris que contiene Tween-20 al 0,05% después de la coincubación del anticuerpo y CCL17 de macaco cangrejero durante 48 horas a 4°C.
En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención se une a CCL17 de Macaca fascicularis (macaco cangrejero) con la Kd de aproximadamente 1x10-8 M o menos, cuando la Kd se mide usando afinidad en equilibrio de disolución en tampón salino a base de Tris que contiene Tween-20 al 0,05% después de la coincubación del anticuerpo y CCL17 de macaco cangrejero durante 48 horas a 4°C.
La afinidad de un anticuerpo por la CCL17 humana que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 o por la CCL17 de macaco cangrejero que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2 puede medirse experimentalmente usando cualquier método adecuado. Tales métodos pueden utilizar instrumentación Proteon, Biacore o KinExA, tal como ProteOn XPR36 o Biacore 3000, afinidad en equilibrio de disolución (SEA), ELISA o ensayos de unión competitiva conocidos por los expertos en la técnica. Los métodos a modo de ejemplo son los descritos en el ejemplo 3. La afinidad medida de la interacción de un anticuerpo particular/CCL17 puede variar si se mide en diferentes condiciones (por ejemplo, osmolaridad, pH, tampón, concentración de detergente). Por tanto, las mediciones de afinidad y otros parámetros de unión (por ejemplo, Kd, Kon, Koff) se realizan preferiblemente con condiciones normalizadas y un tampón normalizado, tal como el tampón descrito en el presente documento. Los expertos en la técnica apreciarán que el error interno para las mediciones de afinidad, por ejemplo usando afinidad en equilibrio de disolución, Biacore 3000 o ProteOn (medido como desviación estándar, DE) puede estar normalmente dentro del 5-33% para mediciones dentro de los límites típicos de detección. Por tanto, el término “aproximadamente” refleja la desviación estándar típica en el ensayo. Por ejemplo, la DE típica para una Kd de 1x10'9 M es de hasta 0,33x10'9 M.
En otra realización, el anticuerpo aislado de la invención inhibe la actividad biológica de CCL17.
“Actividad biológica de CCL17”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier actividad que se produce como resultado de la unión de CCL17 a su receptor CCR4. Una actividad biológica a modo de ejemplo de CCL17 da como resultado la movilización de calcio intracelular o la quimiotaxia de células, por ejemplo células CCRF-CEM (línea celular linfoblastoide T de paciente con leucemia aguda). Los anticuerpos de la invención pueden someterse a prueba para determinar su capacidad para inhibir la actividad biológica de CCL17 usando métodos convencionales y los descritos en el presente documento. Por ejemplo, la capacidad de los anticuerpos de la invención para inhibir la movilización de calcio intracelular dependiente de CCL17 puede someterse a ensayo midiendo el efecto de los anticuerpos sobre la movilización del calcio inducida por CCL17 usando colorantes fluorescentes tales como Fluo-8 NW, Fluo-4 AM o Fluo-3 AM. La capacidad de los anticuerpos de la invención para inhibir la quimiotaxia inducida por CCL17 puede medirse midiendo la migración de células CCRF-CEM a través de un filtro semipermeable 5 pM en un sistema de cultivo de dos cámaras, y midiendo la viabilidad de las células migradas a través del filtro. Los anticuerpos de la invención pueden inhibir la actividad biológica de CCL17 en aproximadamente el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 100%.
En otra realización, el anticuerpo de la invención inhibe la movilización de calcio inducida por CCL17 humana 10 ng/ml en células CCRF-CEM medida usando Fluo-8 NW con un valor de CI50 de aproximadamente 1x10'7 M o menos, aproximadamente 1x10'8 M o menos, o aproximadamente 1x10'9 M o menos.
En el presente documento se da a conocer un anticuerpo que se une específicamente a CCL17, en el que el anticuerpo comprende regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (HCDR) 1 (HCDR1), 2 (HCDR2) y 3 (HCDR3) y regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (LCDR) 1 (LCDR1), 2 (LCDR2) y 3 (LCDR3), en el que la HCDR1, la HCDR2, la HCDR3, la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3 comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 5, 71, 72, 73 y 74, respectivamente.
Los anticuerpos que comprenden las secuencias de HCDR y LCDR de SEQ ID NO: 4, 5, 71, 72, 73 y 74 se unen a CCL17 humana con una Kd de 1x10-10 o menos.
HCDR1: SYWIG (SEQ ID NO: 4)
HCDR2: IIDPSDSDTRYSPSFQG (SEQ ID NO: 5)
secuencia consenso de HCDR3:
VGPADVWDX1FDY (SEQ ID NO: 71),
en la que
X1 es S, A o T
secuencia consenso de LCDR1:
KSSQSVLX1SX2X3NX4NX5LA (SEQ ID NO: 72),
en la que
X1 es L, Y, S o N;
X2 es F, P, H o I;
X3 es D, Y, W, T o V;
X4 es I, F, S, T, Y, N, K o V; y
X5 es K, A, Q, T o D.
secuencia consenso de LCDR2:
X1ASTRE (SEQ ID NO: 73),
en la que
X1 es N, H, G, E, T o D.
secuencia consenso de LCDR3:
QQX1X2X3X4PX5T (SEQ ID NO: 74);
en la que
X1 es F, Y, T o H;
X2 es Y, L, N o W;
X3 es S, A, L, I, T, Q o H;
X4 es V, T, I, Y, L o D; y
X5 es S, F, A o L.
La HCDR1 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 4, la HCDR2 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5 y la HCDR3 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 6, 42, 43 o 44 en anticuerpos dados a conocer en el presente documento.
En el presente documento se dan a conocer anticuerpos en los que la HCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 4, la HCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y la HCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 42 o 43.
En el presente documento se dan a conocer anticuerpos en los que la LCDR1 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18; la LCDR2 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 39, 40 o 41; y la LCDR3 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37 o 38.
En el presente documento se dan a conocer anticuerpos en los que la LCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 9, 10, 13, 14, 15, 17 o 18, la Lc Dr 2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, 21,22, 24, 25 y 26 y la LCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, 29, 30, 33, 34, 35, 37 o 38.
También se da a conocer en el presente documento, un anticuerpo que se une específicamente a CCL17 que comprende la VH de SEQ ID NO: 75 y la VL de SEQ ID NO: 76.
Secuencia consenso de VH (SEQ ID NO: 75)
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIDPSDSDTRYS
PSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARVGPADVWDXiFDYWGQGTLVTVSS
en la que
X1 es S, A o T.
Secuencia consenso de VL (SEQ ID NO: 76):
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLX1SX2X3NX4NX5LAWYQQKPGQPPKLLIYX6A
STRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQX7X8X9X10PX11TFGQGTKVEIK ;
en la que
X1 es L, Y, S o N;
X2 es F, P, H o I;
X3 es D, Y, W, T o V;
X4 es I, F, S, T, Y, N, K o V;
X5 es K, A, Q, T o D;
X6 es N, H, G, E, T o D;
X7 es F, Y, T o H;
X8 es Y, L, N o W;
X9 es S, A, L, I, T, Q o H;
X10 es V, T, I, Y, L o D; y
X11 es S, F, A o L.
También se da a conocer en el presente documento un anticuerpo que se une específicamente a CCL17 que comprende la VH de SEQ ID NO: 45, 46, 47 o 48.
También se da a conocer en el presente documento un anticuerpo que se une específicamente a CCL17 que comprende la VL de SEQ ID NO: 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65 o 66.
También se da a conocer en el presente documento un anticuerpo que se une específicamente a CCL17 que comprende la VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, 46 o 47.
También se da a conocer en el presente documento un anticuerpo que se une específicamente a CCL17 que comprende la VL que comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 50, 51,52, 55, 56, 57, 59, 60 o 62.
Adicionalmente se da a conocer en el presente documento un anticuerpo aislado que se une específicamente a CCL17, en el que el anticuerpo comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, Lc Dr2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 19 y 27, respectivamente;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, 20 y 28, respectivamente;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 9, 21 y 29, respectivamente;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 10, 22 y 30, respectivamente;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 11, 23 y 31, respectivamente;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 12, 24 y 32, respectivamente;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 13, 21 y 33, respectivamente;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 14, 20 y 34, respectivamente;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 15, 25 y 35, respectivamente;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 16, 21 y 36, respectivamente;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 17, 25 y 37, respectivamente;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 18, 26 y 38, respectivamente;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, 39 y 28, respectivamente;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, 24 y 28, respectivamente;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, 22 y 28, respectivamente;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, 40 y 28, respectivamente;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, 26 y 28, respectivamente;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, 41 y 28, respectivamente;
SEQ ID NO: 4, 5, 42, 8, 24 y 28, respectivamente;
SEQ ID NO: 4, 5, 43, 8, 24 y 28, respectivamente; o
SEQ ID NO: 4, 5, 44, 8, 24 y 28, respectivamente.
También se da a conocer en el presente documento un anticuerpo aislado que se une específicamente a CCL17, en el que el anticuerpo comprende
la VH de SEQ ID NO: 45 y la VL de SEQ ID NO: 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 o 66;
la VH y la VL de SEQ ID NO: 46 y 62, respectivamente;
la VH y la VL de SEQ ID NO: 47 y 62, respectivamente; o
la VH y la VL de SEQ ID NO: 48 y 62, respectivamente.
También se da a conocer en el presente documento un anticuerpo aislado que se une específicamente a CCL17, en el que el anticuerpo comprende
la VH de SEQ ID NO: 45 y la VL de SEQ ID NO: 50, 51, 52, 55, 56, 57, 59 o 60;
la VH y la VL de SEQ ID NO: 46 y 62, respectivamente; o
la VH y la VL de SEQ ID NO: 47 y 62, respectivamente.
También se da a conocer en el presente documento un anticuerpo aislado que se une específicamente a CCL17, en el que el anticuerpo comprende la VH de SEQ ID NO: 45 y la VL de SEQ ID NO: 50.
También se da a conocer en el presente documento un anticuerpo aislado que se une específicamente a CCL17, en el que el anticuerpo comprende la VH de SEQ ID NO: 45 y la VL de SEQ ID NO: 51.
También se da a conocer en el presente documento un anticuerpo aislado que se une específicamente a CCL17, en el que el anticuerpo comprende la VH de SEQ ID NO: 45 y la VL de SEQ ID NO: 52.
También se da a conocer en el presente documento un anticuerpo aislado que se une específicamente a CCL17, en el que el anticuerpo comprende la VH de SEQ ID NO: 45 y la VL de SEQ ID NO: 55.
También se da a conocer en el presente documento un anticuerpo aislado que se une específicamente a CCL17, en el que el anticuerpo comprende la VH de SEQ ID NO: 45 y la VL de SEQ ID NO: 56.
También se da a conocer en el presente documento un anticuerpo aislado que se une específicamente a CCL17, en el que el anticuerpo comprende la VH de SEQ ID NO: 45 y la VL de SEQ ID NO: 57.
También se da a conocer en el presente documento un anticuerpo aislado que se une específicamente a CCL17, en el que el anticuerpo comprende la VH de SEQ ID NO: 45 y la VL de SEQ ID NO: 59.
También se da a conocer en el presente documento un anticuerpo aislado que se une específicamente a CCL17, en el que el anticuerpo comprende la VH de SEQ ID NO: 45 y la VL de SEQ ID NO: 60.
El anticuerpo aislado que se une específicamente a CCL17 de la invención comprende la VH de SEQ ID NO: 46 y la VL de SEQ ID NO: 62.
También se da a conocer en el presente documento un anticuerpo aislado que se une específicamente a CCL17, en el que el anticuerpo comprende la VH de SEQ ID NO: 47 y la VL de SEQ ID NO: 62.
También se da a conocer en el presente documento un anticuerpo aislado que se une específicamente a CCL17, en el que el anticuerpo comprende la VH que comprende la secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% a la VH de SEQ ID NO: 46 y la VL que comprende la secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% a la VL de SEQ ID NO: 62.
Tales anticuerpos son los anticuerpos mostrados en la tabla 9.
También se dan a conocer en el presente documento anticuerpos cuyas secuencias de aminoácidos de CDR de cadena pesada, CDR de cadena ligera, VH o VL difieren insustancialmente de las mostradas en las tablas 3, 4, 6, 7 y 9. Normalmente, esto implica una o más sustituciones de aminoácido conservativas con un aminoácido que tiene características estereoquímicas, hidrófobas o de carga similares en el sitio de unión a antígeno o en la región de entramado sin alterar adversamente las propiedades del anticuerpo. También pueden realizarse sustituciones conservativas para mejorar las propiedades del anticuerpo, por ejemplo la estabilidad o la afinidad. Pueden realizarse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 sustituciones de aminoácido en la secuencia de VH o VL. Por ejemplo, una “sustitución de aminoácido conservativa” puede implicar una sustitución de un residuo de aminoácido nativo por un residuo no nativo, de manera que haya poco o ningún efecto sobre la polaridad o la carga del residuo de aminoácido en esa posición. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido también puede sustituirse con alanina, tal como se ha descrito anteriormente para la mutagénesis por barrido con alanina (MacLennan et al (1998) Act Physiol. Scand. Supl. 643:55-67; Sasaki et al (1998) Adv. Biopsy's. 35:1-24). Los expertos en la técnica pueden determinar sustituciones de aminoácidos deseadas en el momento en que se deseen tales sustituciones. Por ejemplo, pueden usarse sustituciones de aminoácido para identificar residuos importantes de la secuencia de la molécula, o para aumentar o disminuir la afinidad de las moléculas descritas en el presente documento. Los ocho grupos siguientes contienen aminoácidos que son sustituciones de aminoácido conservativas entre sí: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (y ), Triptófano (W); 7) Serina (s ), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)).
Las sustituciones de aminoácido pueden realizarse por ejemplo mediante mutagénesis por PCR (patente estadounidense n.° 4.683.195). Pueden generarse bibliotecas de variantes usando métodos bien conocidos, por ejemplo usando codones aleatorios (NNK) o no aleatorios, por ejemplo codones DVK, que codifican para 11 aminoácidos (Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg, Ser, Tyr, Trp) y examinando las bibliotecas para buscar variantes con las propiedades deseadas.
Aunque los anticuerpos ilustrados en los ejemplos comprenden pares de regiones variables, una de la cadena pesada y una de la cadena ligera, un experto en la técnica reconocerá que los anticuerpos alternativos pueden comprender regiones variables de cadena pesada o ligera individuales. La región variable individual puede usarse para examinar dominios variables que pueden formar un fragmento de unión a antígeno específico de dos dominios que puede unirse, por ejemplo, a CCL17 humana que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1. El examen puede llevarse a cabo mediante métodos de examen de presentación en fagos usando, por ejemplo, el enfoque combinatorio dual jerárquico dado a conocer en la publicación de patente internacional n.° WO1992/01047. En este enfoque, se usa una colonia individual que contiene un clon de cadena o bien H o bien L para infectar una biblioteca completa de clones que codifican para la otra cadena (L o H), y se selecciona el dominio de unión antígeno específico de dos cadenas resultante según técnicas de presentación en fagos tal como se describe. Por tanto, las cadenas polipeptídicas de VH y VL individuales son útiles para identificar anticuerpos adicionales que se unen específicamente a CCL17 humana que tienen la secuencia de SEQ ID NO: 1 usando los métodos dados a conocer en la publicación de patente internacional n.° WO1992/01047.
Los anticuerpos de la invención pueden obtenerse usando una variedad de tecnologías para generar anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, puede usarse el método de hibridoma de Kohler y Milstein, Nature 256:495, 1975. En el método de hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal huésped, tal como un hámster, rata o ratón, con proteína CCL17 humana y/o CCL17 de macaco cangrejero o fragmentos de estas proteínas, tales como una parte extracelular de CCL17 humana, seguido por fusión de células de bazo de los animales inmunizados con células de mieloma usando métodos convencionales para formar células de hibridoma (Gooding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986)). Las colonias que surgen de las células de hibridoma inmortalizadas individuales se examinan para determinar la producción de anticuerpos con las propiedades deseadas, tales como la especificidad de unión, la reactividad cruzada o falta de la misma, y la afinidad por el antígeno.
Pueden usarse diversos animales huésped para producir anticuerpos contra CCL17 humana. Por ejemplo, pueden usarse ratones Balb/c para generar anticuerpos de ratón anti-CCL17 humana. Los anticuerpos obtenidos en ratones Blab/c y otros animales no humanos puede humanizarse usando diversas tecnologías para generar secuencias más similares a las humanas. Los expertos en la técnica conocen técnicas de humanización a modo de ejemplo que incluyen la selección de regiones de entramado aceptoras humanas e incluyen injertos de CDR (patente estadounidense n.° 5.225.539), injertos de SDR (patente estadounidense n.° 6.818.749), modificación de la superficie (Palin, Mol Immunol 28:489-499, 1991), modificación de la superficie de residuos determinantes de la especificidad (publicación de patente estadounidense n.° 2010/0261620), adaptación humana (o adaptación de la región de entramado humana) (publicación de patente estadounidense n.° US2009/0118127), superhumanización (patente estadounidense n.° 7.709.226) y selección guiada (Osborn et al., Methods 36:61-68, 2005; patente estadounidense n.° 5.565.332).
Los anticuerpos humanizados pueden optimizarse adicionalmente para mejorar su selectividad o afinidad por un antígeno deseado mediante la incorporación de residuos de soporte alterados de la región de entramado para preservar la afinidad de unión (retromutaciones) mediante técnicas tales como las dadas a conocer según se describe en la publicación de patente internacional n.° WO1990/007861 y en la publicación de patente internacional n.° WO1992/22653.
Pueden usarse ratones transgénicos que portan loci de inmunoglobulina humana en su genoma para generar anticuerpos humanos contra una proteína diana, y se describen por ejemplo en la publicación de patente internacional n.° WO1990/04036, patente estadounidense n.° 6.150.584, publicación de patente internacional n.° WO1999/45962, publicación de patente internacional n.° WO2002/066630, publicación de patente internacional n.° WO2002/43478, Loner et al., Nature 368:856-9, 1994; Green et al., Nature Genet. 7:13-21, 1994; Green & Jakobovits Exp Med 188:483-95, 1998; Lonberg y Huszar Int Rev Immunol 13:65-93, 1995; Bruggemann et al., Eur J Immunol 21:1323-1326, 1991; Fishwild et al., Nat Biotechnol 14:845-851, 1996; Mendez et al., Nat Genet 15:146-156, 1997; Green, J Immunol Methods 231:11-23, 1999; Yang et al., Cancer Res 59:1236-1243, 1999; Brüggemann y Taussig, Curr Opin Biotechnol 8:455-458, 1997; publicación de patente internacional n.° WO2002/043478). Los loci de inmunoglobulina endógena en tales ratones pueden romperse o delecionarse, y al menos puede insertarse un locus completo o parcial de inmunoglobulina humana en el genoma de ratón usando recombinación homóloga o no homóloga, usando transcromosomas, o usando minigenes. Puede contratarse a empresas tales como Regeneron (http://_www_regeneron_com), Harbour Antibodies (http://_www_harbourantibodies_com), Open Monoclonal Technology, Inc. (OMT) (http://_www_omtinc_net), KyMab (http://_www_kymab_com), Trianni (http://_www.trianni_com) y Ablexis (http://_www_ablexis_com) para que proporcionen anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando tecnología tal como se describió anteriormente.
Los anticuerpos humanos pueden seleccionarse de una biblioteca de presentación en fagos, donde el fago se modifica por ingeniería genética para expresar inmunoglobulinas humanas o partes de las mismas tales como Fab, anticuerpos de cadena sencilla (scFv) o regiones variables de anticuerpo emparejadas o no emparejadas (Knappik et al., J Mol Biol 296:57-86, 2000; Krebs et al., J Immunol Met 254:67-84, 2001; Vaughan et al., Nature Biotechnology 14:309-314, 1996; Sheets et al., PITAS (EE.UU.) 95:6157-6162, 1998; Hoogenboom y Winter, J Mol Biol 227:381, 1991; Marks et al., J Mol Biol 222:581, 1991). Los anticuerpos de la invención pueden aislarse por ejemplo de una biblioteca de presentación en fagos que expresan regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpo como proteínas de fusión con la proteína pIX de cubierta de bacteriófagos, tal como se describe en Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010 y en la publicación de patente internacional n.° WO2009/085462). Las bibliotecas de anticuerpos se examinan para determinar la unión al dominio extracelular de la CCL17 humana y se caracterizan adicionalmente los clones positivos obtenidos, se aíslan los Fab de los lisados de clones y se expresan como IgG de longitud completa. Tales métodos de presentación en fagos para aislar anticuerpos humanos están establecidos en la técnica. Véanse por ejemplo: las patentes estadounidenses n.os 5.223.409; 5.403.484; y 5.571,698 concedidas a Ladner et al.; las patentes estadounidenses n.os 5.427.908 y 5. 580.717 concedidas a Dower et al.; las patentes estadounidenses n.os 5.969.108 y 6.172.197 concedidas a McCafferty et al.; y las patentes estadounidenses n.os 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 y 6.593.081 concedidas a Griffiths et al.
La preparación de antígenos inmunogénicos y la producción de anticuerpos monoclonales pueden realizarse usando cualquier técnica adecuada, tal como producción de proteínas recombinantes. Los antígenos inmunogénicos pueden administrarse a un animal en forma de proteína purificada, o mezclas de proteínas que incluyen células completas o extractos de células o tejidos, o el antígeno puede formarse de novo en el cuerpo del animal a partir de ácidos nucleicos que codifican para dicho antígeno o una parte del mismo.
Los anticuerpos de la invención pueden ser humanos o humanizados.
Los anticuerpos de la invención pueden ser sintéticos o recombinantes.
Los anticuerpos de la invención pueden ser de tipo IgA, IgD, IgE, IgG o IgM. Los anticuerpos de la invención pueden ser de isotipo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4.
Las propiedades inmunoefectoras de los anticuerpos de la invención pueden potenciarse o silenciarse a través de modificaciones de Fc mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las funcionas efectoras de Fc tales como unión a C1q, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis, regulación por disminución de receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B; BCR), etc. pueden modularse modificando residuos en el Fc responsables de estas actividades. Las propiedades farmacocinéticas también pueden potenciarse mutando residuos en el dominio Fc que prolongan la semivida del anticuerpo. Modificaciones de Fc a modo de ejemplo son IgG4 S228P/L234A/L235A, IgG2 M252Y/S254T/T256E (Dall'Acqua et al., J Biol Chem 281:23514-24, 2006; o IgG2 V234A/G237A/P238S, V234A/G237A/H268Q, H268A/V309L/A330S/P331 o V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S en IgG2 (publicación de patente internacional n.° WO2011/066501), o las descritas en la patente estadounidense n.° 6.737.056 (numeración según la numeración EU).
En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente a CCL17 humana de la invención comprende una sustitución en una región Fc.
En algunas realizaciones, la sustitución comprende la sustitución V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S o P331S en IgG2, o la sustitución S228P, L234A o L235A en IgG4, en la que la numeración de residuos es según el índice EU.
Adicionalmente, los anticuerpos de la invención pueden modificarse de manera postraduccional mediante procedimientos tales como glicosilación, isomerización, desglicosilación o modificación covalente que se produce de manera no natural, tal como la adición de restos de polietilenglicol (pegilación) y lipidación. Tales modificaciones puede producirse in vivo o in vitro. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden conjugarse con polietilenglicol (PEGilado) para mejorar sus perfiles farmacocinéticos. La conjugación puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Se ha demostrado que la conjugación de anticuerpos terapéuticos con PEG potencia la farmacodinamia a la vez que no interfiere con la función (Knight et al., Plateles 15:409-418, 2004; Leong et al., Cytokine 16:106-119, 2001; Yang et al., Protein Eng 16:761-770, 2003).
Los anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos pueden modificarse para mejorar la estabilidad, selectividad, reactividad cruzada, afinidad, inmunogenicidad u otra propiedad biológica o biofísica deseable. La estabilidad de un anticuerpo se ve influida por varios factores incluyendo (1) empaquetamiento central de dominios individuales que afecta a su estabilidad intrínseca, (2) interacciones de superficie de contacto de proteína/proteína que tienen efecto sobre el emparejamiento de HC y LC, (3) ocultamiento de residuos polares y cargados, (4) red de enlaces de H para residuos polares y cargados; y (5) distribución de residuos polares y carga de superficie entre otras fuerzas intra e intermoleculares (Worn y Pluckthun, J Mol Biol 305:989-1010, 2001). Pueden identificarse posibles residuos de desestabilización de la estructura basándose en la estructura cristalina del anticuerpo o mediante modelado molecular en determinados casos, y puede someterse a prueba el efecto de los residuos sobre la estabilidad de los anticuerpos generando y evaluando variantes que albergan mutaciones en los residuos identificados. Uno de los modos de aumentar la estabilidad de los anticuerpos es elevar el punto de medio de transición térmica (Tm) medido mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC). En general, el Tm de la proteína está correlacionado con su estabilidad y está correlacionado inversamente con su susceptibilidad al despliegue y la desnaturalización en disolución y los procesos de degradación que dependen de la tendencia de la proteína a desplegarse (Remmele et al., Pharm Res 15:200-208, 1997). Varios estudios han encontrado correlación entre la clasificación de la estabilidad física de las formulaciones medida como estabilidad térmica mediante DSC y la estabilidad física medida mediante otros métodos (Bedu-Addo et al., Pharm Res 21:1353-1361, 2004; Gupta y Kaisheva, AAPS PharSci, 5E8, 2003; Maa y Hsu, Int J Pharm 140:155-168, 1996; Remmele et al., Pharm Res 15:200-208, 1997; Zhang et al., J Pharm Sci 93:3076-3089, 2004). Los estudios de formulación sugieren que el Tm de un Fab tiene implicación para la estabilidad física a largo plazo de un AcM correspondiente. Las diferencias de aminoácidos o bien en la región de entramado o bien dentro de las CDR podrían tener efectos significativos sobre la estabilidad térmica del dominio Fab (Yasui et al., FEBS Lett 353:143-146, 1994).
Los anticuerpos de la invención pueden modificarse mediante ingeniería genética para dar anticuerpos biespecíficos. Las regiones VH y VL de los anticuerpos de la invención pueden modificarse mediante ingeniería genética usando métodos publicados para dar anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla como estructurales tales como los diseños TandAb® (publicación de patente internacional n.° WO1999/57150; publicación de patente estadounidense n.° US2011/0206672) o para dar scFV biespecíficos como estructuras tales como las dadas a conocer en la patente estadounidense n.° 5.869.620; publicación de patente internacional n.° WO1995/15388, publicación de patente internacional n.° WO1997/14719 o publicación de patente internacional n.° WO2011/036460.
Las regiones VH y VL de los anticuerpos de la invención pueden modificarse mediante ingeniería genética para dar anticuerpos biespecíficos de longitud completa, en los que cada brazo de anticuerpo se une a un antígeno o epítopo distinto. Tales anticuerpos biespecíficos normalmente se obtienen mediante la modulación de las interacciones de CH3 entre las dos cadenas pesadas de anticuerpos para formar anticuerpos biespecíficos usando tecnologías tales como las descritas en la patente estadounidense n.° 7.695.936; publicación de patente internacional n.° WO2004/111233; publicación de patente estadounidense n.° US2010/0015133; publicación de patente estadounidense n.° US2007/0287170; publicación de patente internacional n.° WO2008/119353; publicación de patente estadounidense n.° US2009/0182127; publicación de patente estadounidense n.° US2010/0286374; publicación de patente estadounidense n.° US2011/0123532; publicación de patente internacional n.° WO2011/131746; publicación de patente internacional n.° WO2011/143545; o publicación de patente estadounidense n.° US2012/0149876. Estructuras biespecíficas adicionales en las que pueden incorporarse las regiones VH y VL de los anticuerpos de la invención son por ejemplo inmunoglobulinas de dominio variable dual (publicación de patente internacional n.° WO2009/134776), o estructuras que incluyen diversos dominios de dimerización para conectar los dos brazos de anticuerpo con diferente especificidad, tales como dominios de dimerización de colágeno o cremallera de leucina (publicación de patente internacional n.° WO2012/022811, patente estadounidense n.° 5.932.448; patente estadounidense n.° 6.833.441).
Otra realización de la invención es un polinucleótido aislado que codifica para las regiones variables de cadena pesada de anticuerpo y las regiones variables de cadena ligera de anticuerpo del anticuerpo de la invención. En el presente documento se dan a conocer determinados polinucleótidos a modo de ejemplo, sin embargo, otros polinucleótidos que, dada la degeneración del código genético o las preferencias de codón en un sistema de expresión dado, que codifican para los anticuerpos de la invención son realizaciones adicionales de la invención. Las secuencias de polinucleótido que codifican para una VH o una VL del anticuerpo de la invención o un fragmento del mismo pueden unirse operativamente a uno o más elementos reguladores, tales como un promotor y potenciador, que permiten la expresión de la secuencia de nucleótidos en la célula huésped deseada. El polinucleótido puede ser un ADNc.
Otra realización de la invención es un vector que comprende el polinucleótido de la invención. Tales vectores puede ser vectores plasmídicos, vectores virales, vectores para la expresión de baculovirus, vectores basados en transposones o cualquier otro vector adecuado para la introducción del polinucleótido de la invención en un organismo o contexto genético dado mediante cualquier medio. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican para las regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos de la invención, unidos opcionalmente a las regiones constantes, se insertan en vectores de expresión. Las cadenas ligeras y pesadas pueden clonarse en vectores de expresión iguales o diferentes. Los segmentos de ADN que codifican para cadenas de inmunoglobulina se unen operativamente a secuencias de control en el/los vector(es) de expresión que garantizan la expresión de los polipéptidos de inmunoglobulina. Tales secuencias de control incluyen secuencias señal, promotores (por ejemplo promotores asociados de manera natural o heterólogos), elementos potenciadores y secuencias de terminación de la transcripción, y se eligen para que sean compatibles con la célula huésped elegida para expresar el anticuerpo. Una vez que el vector se ha incorporado en el huésped apropiado, el huésped se mantiene en condiciones adecuadas para la expresión de alto nivel de las proteínas codificadas por los polinucleótidos incorporados.
Los vectores de expresión adecuados normalmente pueden replicarse en los organismos huésped o bien como episomas o bien como una parte integral del ADN cromosómico del huésped. Normalmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección tales como resistencia a ampicilina, resistencia a higromicina, resistencia a tetraciclina, resistencia a kanamicina o resistencia a neomicina para permitir la detección de las células transformadas con las secuencias de ADN deseadas.
Se conocen en la técnica elementos promotores y potenciadores adecuados. Para la expresión en una célula bacteriana, los promotores a modo de ejemplo incluyen lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P y trc. Para la expresión en una célula eucariota, los promotores a modo de ejemplo incluyen elementos promotores y potenciadores de genes de inmunoglobulina de cadena ligera y/o pesada; el promotor temprano inmediato de citomegalovirus; el promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple; los promotores tempranos y tardíos de SV40; el promotor presente en las repeticiones terminales largas de un retrovirus; el promotor de metalotioneína-I de ratón; y diversos promotores específicos de tejido conocidos en la técnica. Para la expresión en una célula de levadura, un promotor a modo de ejemplo es un promotor constitutivo tal como un promotor de ADH1, un promotor de PGK1, un promotor de ENO, un promotor de PYK1 y similares; o un promotor regulable tal como un promotor de GAL1, un promotor de GAL10, un promotor de ADH2, un promotor de PH05, un promotor de CUP1, un promotor de GAL7, un promotor de MET25, un promotor de MET3, un promotor de CYC1, un promotor de HIS3, un promotor de ADH1, un promotor de PGK, un promotor de GAPDH, un promotor de ADC1, un promotor de TRP1, un promotor de URA3, un promotor de LEU2, un promotor de ENO, un promotor de TP1, y AOX1 (por ejemplo, para su uso en Pichia). La selección del vector y el promotor apropiados están completamente dentro del nivel del experto habitual en la técnica.
Los expertos en la técnica conocen un gran número de vectores y promotores adecuados; muchos están disponibles comercialmente para generar constructos recombinantes en cuestión. Los siguientes vectores se facilitan a modo de ejemplo. Bacterianos: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, Calif., EE.UU.); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 y pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Eucariotas: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL (Pharmacia).
Otra realización de la invención es una célula huésped que comprende el vector de la invención. El término “célula huésped” se refiere a una célula en la que se ha introducido un vector. Se entiende que el término célula huésped pretende referirse, no solo a la célula en cuestión particular, sino a la progenie de tal célula. Dado que pueden producirse determinadas modificaciones en generaciones sucesivas debido o bien a mutación o bien a influencias ambientales, tal progenie puede no ser idéntica a la célula parental, pero todavía se incluye dentro del término “célula huésped” tal como se usa en el presente documento. Tales células huésped pueden ser células eucariotas, células procariotas, células vegetales o células de arqueas.
Escherichia coli, bacilos tales como Bacillus subtilis, y otras enterobacteriáceas, tales como Salmonella, Serratia y diversas especies de Pseudomonas son ejemplos de células huésped procariotas. Otros microbios, tales como levaduras, también son útiles para la expresión. Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae) y Pichia son ejemplos de células huésped de levadura adecuadas. Células eucariotas a modo de ejemplo pueden ser de origen mamífero, insecto, ave u otro animal. Las células eucariotas de mamífero incluyen líneas celulares inmortalizadas tales como hibridomas o líneas celulares de mieloma como SP2/0 (Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Manassas, VA, CRL-1581), NS0 (Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), Salisbury, Wiltshire, Ru , ECACC n.° 85110503), líneas celulares murinas FO (At Cc CRL-1646) y Ag653 (ATCC CRL-1580). Una línea celular de mieloma humano a modo de ejemplo es U266 (ATTC CRL-TIB-196). Otras líneas celulares útiles incluyen las derivadas de células de ovario de hámster chino (c Ho ) tales como CHO-K1SV (Lonza Biologics, Walquersville, MD), CHO-K1 (ATCC CRL-61) o DG44.
Otra realización de la invención es un método de producción de un anticuerpo de la invención que comprende cultivar la célula huésped de la invención y recuperar el anticuerpo producido por la célula huésped. En la técnica se conocen bien métodos de obtención de anticuerpos y su purificación. Una vez sintetizados (de manera o bien química o bien recombinante), los anticuerpos completos, sus dímeros, cadenas individuales ligera y pesada, u otros fragmentos de anticuerpo tales como VH o VL, pueden purificarse según procedimientos convencionales de la técnica, incluyendo precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, purificación por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), electroforesis en gel, y similares (véase en general Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)). Un anticuerpo en cuestión puede ser sustancialmente puro, por ejemplo, puro en al menos aproximadamente del 80% al 85%, puro en al menos aproximadamente del 85% al 90%, puro en al menos aproximadamente del 90% al 95%, o puro en al menos aproximadamente del 98% al 99%, o más, por ejemplo, libre de contaminantes tales como residuos celulares, macromoléculas distintas de un anticuerpo en cuestión, etc.
Los polinucleótidos que codifican para determinadas secuencias de VH o VL de la invención se incorporan en vectores usando métodos convencionales de biología molecular. La transformación de células huésped, el cultivo, la expresión de anticuerpos y la purificación se realizan usando métodos bien conocidos.
Usos terapéuticos
Los anticuerpos de la invención pueden usarse en el tratamiento o la prevención de un espectro de estados mediados por CCL17.
El término “estado mediado por CCL17”, tal como se usa en el presente documento, abarca todas las enfermedades y estados médicos en los que CCL17 desempeña un papel, ya sea directa o indirectamente, en la enfermedad o el estado médico, incluyendo la causa, el desarrollo, la evolución, la persistencia o la patología de la enfermedad o el estado.
El término “estado inflamatorio mediado por CCL17”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un estado inflamatorio que resulta, al menos parcialmente, de la actividad biológica de CCL17. Estados inflamatorios mediados por CCL17 a modo de ejemplo son el asma y las alergias.
Los anticuerpos de la invención pueden usarse en el tratamiento de un paciente animal que pertenece a cualquier clasificación. Los ejemplos de tales animales incluyen mamíferos tales como seres humanos, roedores, perros, gatos y animales de granja. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden usarse en la profilaxis y el tratamiento de estados mediados por CCL17, tales como asma y enfermedades alérgicas respiratorias tales como asma alérgica, rinitis alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis pulmonar idiopática (IPF), enfermedades pulmonares por hipersensibilidad y similares, enfermedades alérgicas tales como anafilaxia sistémica o respuestas de hipersensibilidad, alergias a fármacos, aspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPA), alergias a picaduras de insectos y alergias a alimentos, enfermedades inflamatorias del intestino tales como enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, ileítis y enteritis, vaginitis, psoriasis y dermatosis inflamatorias como dermatitis, eccema, dermatitis atópica, dermatitis alérgica de contacto, urticaria y prurito, vasculitis, espondiloartropatías, esclerodermia, enfermedades autoinmunitarias, tales como artritis (incluyendo reumatoide y psoriásica), esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, diabetes tipo I, glomerulonefritis y similares, rechazo de injerto (incluyendo rechazo de aloinjerto y enfermedad de injerto contra huésped) y otras enfermedades en las que han de inhibirse las respuestas inflamatorias no deseadas, tales como aterosclerosis, miositis, enfermedades neurodegenerativas mediadas por células T, esclerosis múltiple, encefalitis, meningitis, hepatitis, nefritis, septicemia, sarcoidosis, conjuntivitis alérgica, otitis, enfermedad de Castleman, sinusitis, choque endotóxico inducido por LPS, síndrome de Behcet y gota.
Otro aspecto de la invención son los anticuerpos de la invención para su uso en terapia.
Los anticuerpos de la presente invención pueden estar destinados para su uso en animales y pacientes que tienen o están en riesgo de desarrollar cualquier enfermedad o estado asociado con la expresión o actividad biológica de CCL17 o en que CCL17 desempeña un papel biológico.
Sin desear vincularse a ninguna teoría, los anticuerpos de la invención pueden proporcionar su efecto eficaz en diversas enfermedades inflamatorias mediante la inhibición directa del reclutamiento de células Th2 y, por tanto, la inhibición simultánea de múltiples citocinas de Th2. Los anticuerpos de la invención pueden proporcionar un perfil de seguridad mejorado en comparación con los anticuerpos anti-CCR4 al bloquear selectivamente solo CCL17. Los anticuerpos no interactuarán con las plaquetas, que expresan CCR4. Además, los anticuerpos no bloquearán los efectos inmunes innatos beneficiosos de CCL22 sobre CCR4 (Matsukawa et al., I. Immunol 164: 5382-8, 2000).
“Estado inflamatorio”, tal como se usa en este documento, se refiere a respuestas sistémicas o localizadas agudas o crónicas a estímulos dañinos, tales como patógenos, células dañadas, lesiones físicas o agentes irritantes, que están mediadas en parte por la actividad de citocinas, quimiocinas o células inflamatorias (por ejemplo, neutrófilos, monocitos, linfocitos, macrófagos, mastocitos, células dendríticas, neutrófilos) y se caracteriza en la mayoría de los casos por dolor, enrojecimiento, hinchazón y deterioro de la función tisular.
El estado pulmonar inflamatorio es un ejemplo de un estado inflamatorio mediado por CCL17. Los estados pulmonares inflamatorios a modo de ejemplo incluyen estados pulmonares inducidos por infección, incluyendo los asociados con infecciones víricas, bacterianas, fúngicas, parasitarias o priónicas; estados pulmonares inducidos por alérgenos; estados pulmonares inducidos por contaminantes tales como asbestosis, silicosis o beriliosis; estados pulmonares inducidos por aspiración gástrica, desregulación inmunitaria, estados inflamatorios con predisposición genética tal como la fibrosis quística, y estados pulmonares inducidos por traumatismos físicos, tales como lesión por respirador. Estos estados inflamatorios también incluyen asma, enfisema, bronquitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), sarcoidosis, histiocitosis, linfangiomiomatosis, lesión pulmonar aguda, síndrome de dificultad respiratoria aguda, enfermedad pulmonar crónica, displasia broncopulmonar, neumonía adquirida en la comunidad, neumonía nosocomial, neumonía asociada a respirador, septicemia, neumonía vírica, infección por influenza, infección por parainfluenza, infección por rotavirus, infección por metapneumovirus humano, infección por virus sincitial respiratorio y Aspergillus u otras infecciones fúngicas. Las enfermedades inflamatorias asociadas a infecciones a modo de ejemplo pueden incluir neumonía vírica o bacteriana, incluyendo neumonía grave, fibrosis quística, bronquitis, empeoramientos de las vías respiratorias y síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS). Tales estados asociados a infecciones pueden implicar múltiples infecciones, tales como una infección vírica primaria y una infección bacteriana secundaria.
El asma es una enfermedad inflamatoria del pulmón que se caracteriza por hiperreactividad de las vías respiratorias (“AHR”), broncoconstricción, sibilancias, inflamación eosinofílica o neutrofílica, hipersecreción de moco, fibrosis subepitelial y niveles elevados de IgE. Los pacientes con asma experimentan “crisis”, un empeoramiento de los síntomas, lo más frecuentemente debido a infecciones microbianas del aparato respiratorio (por ejemplo, rinovirus, virus influenza, Haemophilusinfluenza, etc.). Los ataques de asma pueden desencadenarse por factores ambientales (por ejemplo, ascáridos, insectos, animales (por ejemplo, gatos, perros, conejos, ratones, ratas, hámsteres, cobayas y aves), hongos, contaminantes del aire (por ejemplo, humo de tabaco), gases irritantes, humos, vapores, aerosoles, productos químicos, polen, ejercicio o aire frío. Además del asma, varias enfermedades inflamatorias crónicas que afectan al pulmón se caracterizan por la infiltración de neutrófilos en las vías respiratorias, por ejemplo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), neumonía bacteriana y fibrosis quística (Linden et al., Eur Respir J 15: 973-7, 2000; Rahman et al., Clin Immunol 115: 268-76, 2005), y enfermedades como EPOC, rinitis alérgica y fibrosis quística se caracterizan por una hiperreactividad de las vías respiratorias (Fahy y O'Byrne Am J Respir Crit Care Med 163: 822-3, 2001).
En el asma alérgica, la presencia de altos niveles de IgE específica de alérgeno es un reflejo de una respuesta inmunitaria aberrante de las células Th2 a alérgenos ambientales inhalados comúnmente. Los alérgenos se presentan a las células T mediante células dendríticas (DC) que muestrean continuamente los antígenos extraños entrantes. Tras la activación adecuada mediante las CD, los linfocitos específicos de alérgeno que están presentes en las vías respiratorias enfermas producen las citocinas de Th2, las interleucina (IL)-4, IL-5 e IL-13, que además controlan la extravasación de leucocitos, la hiperplasia de células caliciformes y la hiperreactividad bronquial (BHR). CCL17 producida por DC induce la migración selectiva de células Th2 pero no de células Th1 a través de la activación de CCR4. En modelos murinos de asma, el tratamiento con anticuerpos anti-CCL17 redujo el número de células T CD4+ y eosinófilos en el líquido de lavado broncoalveolar (BAL), la producción de citocinas de Th2 y la hiperreactividad de las vías respiratorias después de la exposición a alérgenos, lo que sugiere que la neutralización de CCL17 es una estrategia factible para inhibir la inflamación alérgica en seres humanos.
Los modelos animales usados frecuentemente para el asma y la inflamación de las vías respiratorias incluyen el modelo de exposición a ovoalbúmina, los modelos de sensibilización con metacolina y la sensibilización con Aspergillus fumigatus (Hessel et al., Eur J Pharmacol 293: 401-12, 1995). La inhibición de la producción de citocinas y quimiocinas a partir de células epiteliales bronquiales, fibroblastos bronquiales o células de músculo liso de las vías respiratorias de seres humanos en cultivo también puede usarse como modelos in vitro. La administración de anticuerpos de la invención a cualquiera de estos modelos puede usarse para evaluar su eficacia para mejorar los síntomas y alterar el curso del asma, la inflamación de las vías respiratorias, EPOC y similares.
Dermatitis atópica es un ejemplo de un estado inflamatorio mediado por CCL17.
Un aspecto de la invención son anticuerpos de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad mediada por CCL17.
En algunas realizaciones, la enfermedad mediada por CCL17 es una enfermedad inflamatoria.
En algunas realizaciones, la enfermedad inflamatoria es asma, colitis ulcerosa (UC), dermatitis atópica (AD) o fibrosis pulmonar idiopática (IPF).
Una realización de la invención son anticuerpos de la invención para su uso en el tratamiento del asma.
Una realización de la invención son anticuerpos de la invención para su uso en el tratamiento de la colitis ulcerosa.
Una realización de la invención son anticuerpos de la invención para su uso en el tratamiento de la dermatitis atópica.
Una realización de la invención son anticuerpos de la invención para su uso en el tratamiento de la fibrosis pulmonar idiopática.
Administración/Composiciones farmacéuticas
La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos que se unen específicamente a CCL17 de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Para el uso terapéutico, los anticuerpos que se unen específicamente a CCL17 de la invención pueden prepararse como composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz del dominio, la molécula o el anticuerpo como principio activo en un portador farmacéuticamente aceptable. El término “portador” se refiere un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el principio activo. Tales vehículos pueden ser líquidos, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tal como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Por ejemplo, puede usarse solución salina al 0,4% y glicina al 0,3%. Estas disoluciones son estériles y generalmente están libres de materia particulada. Pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas (por ejemplo, filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes tamponantes y de ajuste del pH, agentes estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes, etc. La concentración de los anticuerpos de la invención en tal formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, desde menos de aproximadamente el 0,5%, habitualmente al o al menos aproximadamente al 1%, hasta como mucho el 15 o el 20% en peso y se seleccionará basándose principalmente en la dosis requerida, los volúmenes de líquido, las viscosidades, etc., según el modo particular de administración seleccionado. Se describen formulaciones y vehículos adecuados, que incluyen otras proteínas humanas, por ejemplo, albúmina sérica humana, por ejemplo en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams y Wilkins, Filadelfia, PA 2006, Parte 5, Pharmaceutical Manufacturing, págs. 691-1092, véanse especialmente las págs. 958-989.
El modo de administración para el uso terapéutico de los anticuerpos que se unen específicamente a CCL17 de la invención puede ser cualquier vía adecuada que administre el agente al huésped, tal como administración parenteral, por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea, pulmonar; transmucosa (oral, intranasal, intravaginal, rectal); usando una formulación en un comprimido, cápsula, disolución, polvo, gel, partícula; y contenido en una jeringa, un dispositivo implantado, bomba osmótica, cartucho, microbomba; u otros medios apreciados por el experto en la técnica, también conocidos en la técnica. La administración en un sitio específico puede lograrse, por ejemplo mediante administración intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intracerebelosa, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intracardiaca, intraósea, intrapélvica, intrapericárdica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniana, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravascular, intravesical, intralesional, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmica.
Por tanto, puede prepararse una composición farmacéutica de la invención para inyección intramuscular que contenga 1 ml de agua tamponada estéril, y entre aproximadamente 1 ng y aproximadamente 100 mg/kg, por ejemplo de aproximadamente 50 ng a aproximadamente 30 mg/kg o de manera más preferible, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg/kg, de los anticuerpos que se unen específicamente a CCL17 de la invención.
La dosis administrada a un paciente que tiene un estado mediado por CCL17 es suficiente para aliviar los síntomas o tratar el estado mediado por CCL17 (“cantidad terapéuticamente eficaz”) y en ocasiones es de 0,1 a 10 mg/kg de peso corporal, por ejemplo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mg/kg, pero puede ser incluso mayor, por ejemplo 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg. También puede administrarse una dosis unitaria fija, por ejemplo, 50, 100, 200, 500 o 1000 mg, o la dosis puede basarse en el área superficial del paciente, por ejemplo, 400, 300, 250, 200 o 10 mg/m2. Habitualmente se administran entre 1 y 8 dosis, (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8), pero pueden administrarse 10, 12, 20 o más dosis. La administración de los anticuerpos que se unen específicamente a CCL17 de la invención puede repetirse después de un día, dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, cinco semanas, seis semanas, siete semanas, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o más. También son posibles tandas repetidas de tratamiento, al igual que la administración crónica. La administración repetida puede ser a la misma dosis o a una dosis diferente.
La dosificación de los anticuerpos frente a CCL17 de la invención que será eficaz en el tratamiento de enfermedades inflamatorias tales como el asma puede determinarse administrando los anticuerpos frente a CCL17 a modelos animales relevantes bien conocidos en la técnica y tal como se describe en el presente documento.
Pueden emplearse opcionalmente ensayos in vitro para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. Los expertos en la técnica pueden determinar la selección de una dosis eficaz particular (por ejemplo, a través de ensayos clínicos) basándose en la consideración de varios factores. Tales factores incluyen la enfermedad que va a tratarse o prevenirse, los síntomas implicados, la masa corporal del paciente, el estado inmunitario del paciente y otros factores conocidos por el experto en la técnica. La dosis precisa que ha de emplearse en la formulación también dependerá de la vía de administración, y de la gravedad de la enfermedad, y debe decidirse según el criterio del médico y de las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces pueden extrapolarse de curvas de respuesta a la dosis derivadas de sistemas de prueba de modelos animales o in vitro. Los anticuerpos de la invención pueden someterse a prueba para determinar su eficacia y dosificación eficaz usando cualquiera de los modelos descritos en el presente documento.
Por ejemplo, puede prepararse una composición farmacéutica que comprende los anticuerpos que se unen específicamente a CCL17 de la invención para infusión intravenosa para que contenga aproximadamente 200 ml de solución de Ringer estéril, y de aproximadamente 8 mg a aproximadamente 2400 mg, de aproximadamente 400 mg a aproximadamente 1600 mg, o de aproximadamente 400 mg a aproximadamente 800 mg de los anticuerpos que se unen específicamente a CCL17 de la invención para la administración a un paciente de 80 kg. Se conocen bien los métodos para preparar composiciones que pueden administrarse por vía parenteral y se describen en más detalle en, por ejemplo, “Remington's Pharmaceutical Science”, 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA.
Los anticuerpos que se unen específicamente a CCL17 de la invención pueden liofilizarse para su almacenamiento y reconstituirse en un portador adecuado antes de su uso. Se ha demostrado que esta técnica es eficaz con preparaciones de proteínas convencionales y pueden emplearse técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la técnica.
Los anticuerpos que se unen específicamente a CCL17 de la invención pueden administrarse en combinación con un segundo agente terapéutico de manera simultánea, secuencial o por separado.
Ejemplo 1. Generación de anticuerpo neutralizantes frente a CCL17
Se seleccionaron Fab de unión a CCL17 humana a partir de bibliotecas de presentación en fagos de pIX de novo descritas en Shi et al., J. Mol. Biol. 397: 385-396, 20l0; publicación de patente internacional n.° WO2009/085462; publicación de patente estadounidense n.° US2010/0021477; publicación de patente estadounidense n.° US2012/0108795. Brevemente, las bibliotecas se generaron mediante la diversificación de estructuras de soporte humanas donde los genes de VH de línea germinal IGHV1-69*01, IGHV3-23*01 e IGHV5-51*01 se recombinaron con el minigén IGHJ-4 humano a través del bucle H3 y los genes kappa de VL de línea germinal humana 012 (IGKV1-39*01), L6 (IGKV3-11*01), A27 (IGKV3-20*01) y B3 (IGKV4-1*01) se recombinaron con el minigén IGKJ-1 para ensamblar dominios VH y VL completos. Para la diversificación se eligieron las posiciones en las regiones variables de cadena pesada y ligera alrededor de los bucles H1, H2, L1, L2 y L3 correspondientes a las posiciones que se ha identificado que están frecuentemente en contacto con antígenos de proteínas y péptidos. La diversidad de secuencia en posiciones seleccionadas se limitó a los residuos que se producían en cada posición en las familias de genes de línea germinal IGHV o IGLV de los genes respectivos IGHV o IGLV. La diversidad en el bucle H3 se generó utilizando bucles sintéticos de tamaño corto a medio de longitudes de 7-14 aminoácidos. La distribución de aminoácidos en H3 se diseñó para imitar la variación observada de aminoácidos en anticuerpos humanos. El diseño de la biblioteca se detalla en Shi et al., J Mol Biol 397: 385-96, 2010. Las estructuras de soporte utilizadas para generar bibliotecas se nombraron según el origen de los genes de línea germinal de VH y VL humanos. Las tres bibliotecas de cadenas pesadas se combinaron con las cuatro cadenas ligeras de línea germinal o bibliotecas de cadenas ligeras de línea germinal para generar 24 combinaciones únicas de VH:VL para el examen. Las 24 combinaciones de bibliotecas de VH:VL se utilizaron en experimentos de cribado en fagos contra la CCL17 humana.
Se cribaron las bibliotecas usando CCL17 humana de SEQ ID NO: 1. Brevemente, se biotiniló CCL17 humana usando métodos convencionales y se capturó la CCL17 humana biotinilada (Bt-huCCL17) en perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina (Dynal, M280), y se añadieron a las perlas bibliotecas de presentación en fagos de Fab-pIX. Las concentraciones de Bt-huCCL17 usadas fueron de 100 nM para las rondas 1 y 2 y de 10 mM para las rondas 3 y 4. Se realizó un examen mediante ELISA para determinar la unión de Fab a la proteína CCL17 humana. Para el cribado, las perlas magnéticas recubiertas con bt-huCCL17 se lavaron y se bloquearon con PBST-M (BPS con Tween-20 al 0,05% y leche en polvo desnatada al 3%). Se añadieron fagos bloqueados procedentes de las bibliotecas a las perlas y se hicieron rotar a temperatura ambiente para la ronda 1. Se lavaron las perlas y luego se incubaron en un cultivo de células de E. coli en fase logarítmica (MC1061F') y las células de E. coli infectadas se hicieron crecer en placas de agar LB durante la noche a 37°C. A la mañana siguiente, se rasparon los cultivos de las placas en 2 ml de 2xYT (glicerol al 20%) por placa, se añadieron 50 pl de suspensión bacteriana a 50 ml de 2xYT (Carb) y se hicieron crecer a 37°C con agitación durante hasta 2 horas. Se añadió fago auxiliar a los cultivos en fase logarítmica media y los cultivos se incubaron a 37°C durante 30 minutos. Se añadieron kanamicina e IPTG a cada cultivo hasta concentraciones finales de 35 pg/ml y 1 mM, respectivamente, y se hicieron crecer durante la noche a 30°C con agitación. El fago amplificado del medio bacteriano se precipitó usando PEG/NaCl y se resuspendió en 1 ml de PBS. Se usaron 200 pl para la siguiente ronda de cribado.
Después de tres rondas de cribado, se aisló el ADN de fagémido de las células MC1061F' infectadas y se digirió con enzimas de restricción para retirar la secuencia que codifica para pIX, y el ADN de plásmido linealizado se escindió y se purificó a partir de geles de agarosa. Entonces se autoligó este ADN con ADN ligasa de T4. El ADN ligado se sometió a electroporación en células MC1061F' y se sembraron en placas de agar LB (Carb/glucosa). Las colonias de esta electroporación se escogieron para el examen con ELISA y la evaluación de la expresión de Fab. Los Fab contienen una etiqueta de His en marco en el extremo C-terminal de la cadena pesada. A partir del examen inicial, se purificaron parcialmente 24 Fab a través de la etiqueta de His del extremo C-terminal usando métodos convencionales y se caracterizaron adicionalmente.
Los Fab se caracterizaron por su unión a CCL17 humana (SEQ ID NO: 1), a CCL17 de macaco cangrejero (SEQ ID NO: 2) y a CCL22 de macaco cangrejero (SEQ ID NO: 3) en un ensayo ELISA. Brevemente, se recubrieron placas Maxisorp de 96 pocillos con 1 pg/ml de anticuerpo de cabra anti-kappa humana (Southern Biotech). Se añadió Fab semipurificado a cada placa. Se añadió huCCL17, cCCL17 o cCCL22 biotinilado a cada pocillo con captura de Fab. Las proteínas unidas a los Fab capturados se detectaron usando estreptavidina:HRP. Se seleccionaron cinco Fab (F21, F24, F34, F43 y F44) que se unían a CCL17 tanto humana como de macaco cangrejero pero no a CCL22 de macaco cangrejero para la maduración por afinidad.
Ejemplo 2. Maduración por afinidad de anticuerpos anti-CCL17
Se seleccionaron cinco Fab para la maduración por afinidad basándose en su perfil de caracterización inicial. Los Fab se hicieron madurar por afinidad mediante la diversificación de las cadenas ligeras usando la tecnología de maduración en línea descrita en Shi et al. (Shi et al., J Mol Biol 397:385-396, 2010) y manteniendo invariable la cadena pesada. La cadena pesada en los Fab fue o bien VH3-23 o bien VH5-51. Las bibliotecas de maduración por afinidad de F24 produjeron aglutinantes de CCL17 mejorados.
Brevemente, se maduró por afinidad F24 usando la biblioteca de cadenas ligeras B3. En la tabla 2 se muestra el esquema de diversificación de la biblioteca B3. Las posiciones se indican como numeración de Kabat.
Tabla 2.
Figure imgf000023_0002
Se clonaron las regiones VH de los Fab en el fagémido de la biblioteca de LC dando como resultado una nueva diversificación completa de la LC para cada Fab. Se aislaron las regiones VH mediante digestión por restricción de minipreparaciones de ADN usando NcoI y ApaI. Las regiones VH se aislaron en gel y se ligaron en ADN de biblioteca de LC digerido de manera similar. Se purificaron los ligamientos y se transformaron en células MC1061F'. Se hicieron crecer las células en 2xYT (Carb) hasta que se logró el crecimiento en fase logarítmica (DÜ600nm « 0,6). Se añadió fago auxiliar y se incubaron los cultivos a 37°C durante 30 minutos. Se añadieron kanamicina e IPTG a cada cultivo hasta concentraciones finales de 35 ug/ml y 1 mM, respectivamente, y se hicieron crecer durante la noche a 30°C con agitación. El fago del medio bacteriano se precipitó usando PEG/NaCl y se resuspendió en PBS.
Para el cribado de maduración por afinidad se capturó Bt-CCL17 en 50 pl de perlas magnéticas recubiertas con SA. Las concentraciones de antígeno fueron de 100 nM para la ronda 1, de 10 nM para la ronda 2 y de 10 nM para la ronda 3. Las perlas se sometieron a 6 lavados con p Bs T y a un lavado con PBS, seguido por infección de E. coli tal como se describió anteriormente. El aislamiento de plásmidos de expresión de Fab y la expresión de Fab se realizaron tal como se describe.
Los Fab madurados por afinidad se examinaron en un ensayo ELISA para determinar la unión a huCCL17 (SEQ ID NO: 1), a cCCL17 (SEQ ID NO: 2) y a cCCL22 (SEQ ID NO: 3) tal como se describió anteriormente para la unión a huCCL17. Los clones identificados se secuenciaron, se convirtieron en anticuerpos IgG1 completos y se confirmó su unión a huCCL17, cCCL17 y cCCL22 usando MSD-SEA.
En la tabla 3 y en la tabla 4 se muestran las secuencias de CDR de los anticuerpos parentales y madurados por afinidad para las CDR de cadena pesada y de cadena ligera, respectivamente.
Tabla 3.
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
Tabla 4.
Figure imgf000024_0002
Ejemplo 3. Unión de anticuerpos anti-CCL17 madurados por afinidad a CCL17 humana y de macaco cangrejero
Se evaluaron los anticuerpos para determinar su unión a CCL17 humana y CCL17 de macaco cangrejero usando afinidad en equilibrio de disolución (SEA). El procedimiento para estos experimentos fue similar al usado por Haenel et al (Haenel et al., Anal Biochem 339:182-184, 2005). Para preparar los complejos antígeno-anticuerpo, se diluyeron en serie CCL17 humana o CCL17 de macaco cangrejero en tampón salino a base de Tris que contiene Tween-20 al 0,05%, TBST, (Thermo Scientific) a una razón de 1:6 comenzando a una concentración de 2.000.000 pM en placas de polipropileno de 96 pocillos profundos. Se añadieron volúmenes iguales de los AcM anti-hCCL17 a 40 pM o 200 pM a cada dilución de quimiocina para obtener mezclas que contenían la dilución en serie de quimiocinas comenzando a una concentración final de 1 pM y una concentración constante (20 pM o 100 pM) de anticuerpo anti-CCL17. Se prepararon las mezclas por duplicado y se incubaron a 4°C durante 48 horas hasta alcanzar el equilibrio. Se detectó el anticuerpo libre usando un instrumento SECTOR Imager 6000 (Meso Scale Discovery). Se ajustaron las curvas de unión resultantes para obtener la constante de equilibrio de disociación (Kd) usando el software GraphPad Prism (v 5.01) usando un modelo de unión 1:1 para realizar análisis de regresión no lineal de mínimos cuadrados de los datos. La tabla 5 muestra las afinidades de los anticuerpos a CCL17 humana y de macaco cangrejero. Las afinidades oscilaron desde aproximadamente 2 pM hasta aproximadamente 700 pM para CCL17 humana y desde aproximadamente 200 pM hasta aproximadamente 9500 pM para CCL17 de macaco cangrejero. Los anticuerpos generados se unieron a CCL17 humana con afinidades de aproximadamente 2 a aproximadamente 150 veces mayores cuando se compararon con la unión a CCL17 de macaco cangrejero.
Tabla 5.
Figure imgf000024_0003
Figure imgf000025_0001
Ejemplo 4. Optimización de anticuerpos anti-CCL17
Los anticuerpos anti-CCL17, C17B234 y C17B240, contenían un posible sitio de glicosilación unido a N al comienzo de la LCDR2 (“NAS”). El residuo de asparagina (N) en la posición de residuo 50 (numeración de Kabat) de C17B234 se mutó a seis aminoácidos diferentes (A, D, G, S, T e I).
Se identificó un posible motivo de isomerización de ácido aspártico “DS” en la HCDR3 en el C17F24 parental y todos sus variantes madurados por afinidad. Para someter a prueba el efecto de las sustituciones en esta posición, se mutó el residuo de serina en la posición 100c (numeración de Kabat) a A, T o S o se mutó la D en la posición 100b a E en la cadena pesada del AcM C17B234. Las cadenas pesadas resultantes se emparejaron con la cadena ligera del AcM C17B258.
Los anticuerpos se expresaron como IgG1 y se midió su afinidad por la CCL17 humana y de macaco cangrejero. La tabla 6 y la tabla 7 muestran las secuencias de CDR de cadena pesada y ligera de los anticuerpos optimizados. La tabla 8 muestra la afinidad de los anticuerpos por la CCL17 humana y de macaco cangrejero. La mutagénesis de N50 en la cadena ligera dio como resultado una unión mejorada de 2 a 100 veces.
Tabla 6.
Figure imgf000025_0002
Tabla 7.
Figure imgf000025_0003
Figure imgf000026_0001
Tabla 8.
Figure imgf000026_0002
Se identificó un residuo de triptófano en HCDR3 en la posición 100a (numeración de Kabat) en el AcM de C17B236 como un supuesto sitio para la oxidación postraduccional no deseada. Este residuo se mutó a otros 17 aminoácidos (todos excepto C y M) en el Fab parental de C17B236, C17F319, que es este AcM. Se realizó mutagénesis de Kunkel con “NNK” u oligonucleótidos de codones definidos para producir este panel. Estos Fab se examinaron entonces usando un ELISA de clasificación para la unión a CCL17 tanto bt-humana como bt-macaco cangrejero. Cinco variantes (W ^ R, Y, F, T, I) mostraron algo de unión en un ELISA de unión a Fab (tabla 5). Los tres mejores se convirtieron en AcM (M17B288, C17B289, C17B290) para expresión y MSD-SEA (tabla 6). La mayoría de las variantes mostraron afinidad reducida por la CCL17 humana y de macaco cangrejero.
En la tabla 9 se muestran las secuencias de VH y VL de los anticuerpos.
Tabla 9.
Figure imgf000026_0003
Figure imgf000027_0002
Ejemplo 5. Selección de regiones constantes
Se clonaron anticuerpos seleccionados como IgG2 o IgG4 con las sustituciones siguientes: S228P/L234A/L235A de IgG4 o V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S de IgG2 usando métodos convencionales. La tabla 10 muestra los anticuerpos resultantes.
Tabla 10.
Figure imgf000027_0001
A continuación se muestran las cadenas pesadas y ligeras de determinados anticuerpos:
HC de CB302 (SEQ ID NO: 67)
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIDPSDSDTRYS
PSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARVGPADVWDAFDYWGQGTLVTVSSA
STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL
YSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFP
PKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSV
LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT
CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK
LC de CB302 (SEQ ID NO: 68)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLLSFDNINKLAWYQQKPGQPPKLLIYDASTRE
SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQFYSVPSTFGQGTKVEIKRTVAAPSVF
IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS
TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
HC de CB301 (SEQ ID NO: 69)
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIDPSDSDTRYS
PSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARVGPADVWDTFDYWGQGTLVTVSSA
STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL
YSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFP
PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSV
LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT
CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK
LC de CB301 (SEQ ID NO: 70)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLLSFDNINKLAWYQQKPGQPPKLLIYDASTRE
SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQFYSVPSTFGQGTKVEIKRTVAAPSVF
IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS
TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Ejemplo 6. Caracterización de anticuerpos anti-CCL17
Se caracterizaron anticuerpos anti-CCL17 seleccionados en ensayos de flujo de calcio - indicador p-arrestina y en ensayos de quimiotaxia para evaluar su capacidad para inhibir las actividades biológicas de CCL17.
Ensayo de flujo de calcio. Se usó el ensayo de movilización de calcio para someter a prueba la capacidad de los AcM de hibridoma para neutralizar la señalización de CCL17. Se cultivaron células CCRF-CEM (ATCC® CCL-119™) en RPMI con GlutaMAX; FBS al 10%; Hepes 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, glucosa 4500 mg/l y bicarbonato de sodio 1500 mg/ml en un incubador a 37°C con saturación del 5% de CO2. Se marcaron las células con colorante usando el kit de ensayo de calcio sin lavado Fluo-8 NW (n.° 36315) de ABD Bioquest, Inc. Se preincubaron los anticuerpos de prueba y CCL17 humana 10 ng/ml o CCL17 de macaco cangrejero 5 ng/ml con los anticuerpos de prueba y se añadió la mezcla a las células. Se detectó la señal fluorescente usando FDSS 6000 (Hamamatsu, Bridgewater, NJ) para usar excitación de 490 nm y emisión de 525 nm.
Ensayo de indicador p-arrestina. Se usó el ensayo de p-arrestina para evaluar la capacidad de los anticuerpos anti-CCL17 para neutralizar la función de CCL17. El ensayo se realizó usando en ensayo de p-arrestina PathHunter eXpress (DiscoveRx). Brevemente, se evaluó la capacidad de los anticuerpos anti-CCL17 para inhibir el reclutamiento de p-arrestina inducido por CCL17 en células Hek293 que coexpresan CCR4 fusionado en marco con el pequeño fragmento enzimático ProLink™ y una proteína de fusión de p-arrestina y el mutante de deleción en el extremo N-terminal de p-gal (denominado aceptor enzimático o EA). Se combinaron anticuerpos anti-CCL17 a diversas concentraciones (0,15 nM - 1 pM) con CCL17 20 nM y la mezcla se incubó a 37°C durante 20-30 minutos antes de añadir el complejo anticuerpo-CCL17 a las células. Entonces se aplicó la mezcla a las células y se incubó a 37°C (95% de 02/5% de CO2) durante 90 minutos. Se añadieron 55 pl de reactivo de detección por pocillo y se incubó durante 60 min a temperatura ambiente. Las muestras se leyeron en un lector de placas de luminiscencia convencional y se calcularon los valores de CI50.
Ensayo de quimiotaxia: el ensayo de quimiotaxia se usó para demostrar que los anticuerpos anti-CCL17 inhiben la función de CCL17. Se evaluó la migración de las células HSC-F (las células HSC-F se obtuvieron a través de Nonhuman Primate Reagent Resource del NIH) o células CCRF-Ce M (ATCC® CCL-119™) usando una cámara de quimiotaxia de 96 pocillos usando un filtro de policarbonato de 5 pm según el protocolo descrito en Imai et al. 1997; Imai et al. 1999. Brevemente, las cámaras inferiores se llenaron con 320 pl de RPMI/BSA al 0,1% y 1 nM de la CCL17 humana o de macaco cangrejero sin o con diferentes concentraciones de los anticuerpos (0,125, 0,25, 0,51 y 10 pg/ml) y entonces se recubrieron cuidadosamente con la membrana de policarbonato. Se lavaron las células con PBS y se suspendieron en RPMI/BSA al 0,1% a 0,5x106 células/ml, y la suspensión celular se añadió a las cámaras superiores. Las cámaras se incubaron durante 60 min en un incubador humidificado con el 5% de CO2 a 37°C, y se determinaron las células que migraron a través de la membrana hacia la cámara inferior usando el ensayo de viabilidad celular luminiscente Cell Titer-Glo.
La tabla 11 muestra los valores de CI50 para el ensayo de flujo de calcio. Los datos son un promedio de tres experimentos independientes. Cada AcM neutralizó completamente el flujo de calcio inducido por CCL17 humana o de macaco cangrejero usando o bien CCL17 humana 10 ng/ml (1,25 nM) o bien CCL17 de macaco cangrejero 5 ng/ml (0,625 nM) y tal como se muestra en la tabla 11, los valores de CI50 fueron aproximadamente equivalentes para cada uno de los anticuerpos contra la proteína tanto humana como de macaco cangrejero.
Tabla 11.
Figure imgf000029_0002
La tabla 12 muestra los valores de CI50 para el ensayo de p-arrestina. Los datos son un promedio de tres experimentos independientes. Todos los AcM pudieron inhibir completamente el reclutamiento de p-arrestina inducido por CCL17 humana o de macaco cangrejero a 20 nM e inhibir de manera dependiente de la dosis el reclutamiento de p-arrestina inducido por CCL17 humana o de macaco cangrejero con potencia equivalente.
Tabla 12.
Figure imgf000029_0001
La figura 1 y la figura 2 muestran la inhibición de la quimiotaxia con anticuerpos seleccionados en células humanas y de macaco cangrejero, respectivamente. Todos los anticuerpos sometidos a prueba inhibieron tanto la quimiotaxia de células CCRF-CEM inducida por CCL17 humana a un nivel de inhibición de aproximadamente el 50% a una concentración de anticuerpos de 0,5 pg/ml. C17B302 y C17B311 inhibieron la quimiotaxia de células HSC-F de macaco cangrejero inducida por CCL17 de macaco cangrejero a un nivel de inhibición de aproximadamente el 50% a una concentración de anticuerpos de 0,5 pg/ml.
Ejemplo 7. Mapeo de epítopos del anticuerpo anti-CCL17, C17B236
Se determinó el epítopo de unión del anticuerpo C17B236 (VH: SEQ ID NO: 45; VL: SEQ ID NO: 52) mediante cristalografía de rayos X.
Se expresó CCL17 humana en E. coli, se aisló a partir de cuerpos de inclusión y se volvió a plegar. Se expresó el fragmento Fab del AcM C17B236 en células HEK293F. Se preparó el complejo CCL17:C17B236 mezclando una razón molar de 1,6:1 con un exceso de CCL17. Entonces se purificó el complejo mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Se cristalizó el complejo mediante el método de difusión de vapor en disolución que contenía PEG 3350 al 20% y tartrato de K/Na 0,2 M. Se recogieron los datos de la difracción de rayos X a una resolución de 1,9 A. La

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Anticuerpo anti-ligando 17 de quimiocina (motivo C-C) (CCL17) que comprende la región variable de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 46 y la región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 62.
2. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que la cadena pesada comprende la SEQ ID NO: 67 y la cadena ligera comprende la SEQ ID NO: 68.
3. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es del isotipo IgG2, y en el que el anticuerpo comprende una sustitución V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S o P331s en IgG2, en el que la numeración de residuos es según el índice EU.
4. Anticuerpo según la reivindicación 3, en el que el anticuerpo comprende una sustitución V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S y P331S, en el que la numeración de residuos es según el índice EU.
5. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es del isotipo IgG4, y en el que el anticuerpo comprende una sustitución S228P, L234A o L235A en IgG4, en el que la numeración de residuos es según el índice EU.
6. Anticuerpo según la reivindicación 5, en el que el anticuerpo comprende una sustitución S228P, L234A y L235A, en el que la numeración de residuos es según el índice EU.
7. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y un portador farmacéuticamente aceptado.
8. Uno o más polinucleótidos aislados que codifican para la VH y la VL del anticuerpo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
9. Uno o más vectores que comprenden el uno o más polinucleótidos según la reivindicación 8.
10. Célula huésped para producir un anticuerpo aislado que comprende el uno o más vectores según la reivindicación 9.
11. Método de producción de un anticuerpo, que comprende cultivar la célula huésped según la reivindicación 10 en condiciones tales que se produce el anticuerpo.
12. Anticuerpo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o composición farmacéutica definida en la reivindicación 7 para su uso en terapia.
13. Anticuerpo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o composición farmacéutica definida en la reivindicación 7 para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, asma, colitis ulcerosa (UC), dermatitis atópica (AD) o fibrosis pulmonar idiopática (IPF), en particular asma o hiperreactividad de las vías respiratorias.
ES14860331T 2013-11-06 2014-11-06 Anticuerpos anti-CCL17 Active ES2884255T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361900596P 2013-11-06 2013-11-06
PCT/US2014/064302 WO2015069865A1 (en) 2013-11-06 2014-11-06 Anti-ccl17 antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2884255T3 true ES2884255T3 (es) 2021-12-10

Family

ID=53007215

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14860331T Active ES2884255T3 (es) 2013-11-06 2014-11-06 Anticuerpos anti-CCL17

Country Status (32)

Country Link
US (4) US9944697B2 (es)
EP (2) EP3466445A1 (es)
JP (1) JP6556742B2 (es)
KR (1) KR102331054B1 (es)
CN (1) CN105722531B (es)
AU (1) AU2014346770B2 (es)
BR (1) BR112016010071A2 (es)
CA (1) CA2929166C (es)
CL (1) CL2016001081A1 (es)
CR (1) CR20160187A (es)
CY (1) CY1124445T1 (es)
DK (1) DK3065774T3 (es)
DO (1) DOP2016000105A (es)
EA (1) EA034655B1 (es)
ES (1) ES2884255T3 (es)
HR (1) HRP20211234T1 (es)
HU (1) HUE058272T2 (es)
IL (1) IL245488B (es)
LT (1) LT3065774T (es)
MA (1) MA39090B2 (es)
MX (1) MX2016005982A (es)
MY (1) MY192757A (es)
NZ (2) NZ719506A (es)
PE (1) PE20160856A1 (es)
PH (1) PH12016500826A1 (es)
PL (1) PL3065774T3 (es)
PT (1) PT3065774T (es)
RS (1) RS62373B1 (es)
SG (1) SG11201603231XA (es)
SI (1) SI3065774T1 (es)
UA (1) UA119973C2 (es)
WO (1) WO2015069865A1 (es)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA034655B1 (ru) * 2013-11-06 2020-03-03 Янссен Байотек, Инк. Антитела к ccl17
JP6976566B2 (ja) * 2015-10-14 2021-12-08 日本全薬工業株式会社 イヌアトピー性皮膚炎の治療及び診断のために用いる抗イヌｔａｒｃ抗体
WO2017079369A2 (en) * 2015-11-03 2017-05-11 Glaxosmithkline Llc Novel antibodies
CN118027201A (zh) * 2015-11-25 2024-05-14 威特拉公司 April的抗体分子及其应用
CN108250290B (zh) * 2018-02-23 2024-03-12 上海捌加壹医药科技有限公司 Ccr4的n端重组蛋白及其用途

Family Cites Families (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US226A (en) 1837-06-03 Samuel goss
US7709A (en) 1850-10-08 Chas S Gaylord Improved spring-grapple
US4683985A (en) 1985-01-04 1987-08-04 Dresser Industries, Inc. Lubrication system for a vertical gear unit
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5869620A (en) 1986-09-02 1999-02-09 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
WO1988001649A1 (en) 1986-09-02 1988-03-10 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
PT1696031E (pt) 1991-12-02 2010-06-25 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
US5837242A (en) 1992-12-04 1998-11-17 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
CA2177367A1 (en) 1993-12-03 1995-06-08 Andrew David Griffiths Recombinant binding proteins and peptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
AUPO591797A0 (en) 1997-03-27 1997-04-24 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation High avidity polyvalent and polyspecific reagents
CN1173878A (zh) 1995-10-16 1998-02-18 尤尼利弗公司 双功能或双价抗体片段类似物
AU2246597A (en) 1996-02-12 1997-08-28 Schering Corporation Mammalian dendritic cell chemokine reagents
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
US6818749B1 (en) 1998-10-31 2004-11-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Variants of humanized anti carcinoma monoclonal antibody cc49
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
AU2002222951A1 (en) 2000-07-18 2002-01-30 Geoff D. Koch Apparatus and method for maintaining control of a drilling machine
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
KR100857943B1 (ko) 2000-11-30 2008-09-09 메다렉스, 인코포레이티드 인간 항체의 제조를 위한 형질전환 트랜스염색체 설치류
EP2298809A3 (en) 2001-07-12 2012-02-15 FOOTE, Jefferson Super humanized antibodies
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
US8597911B2 (en) 2003-06-11 2013-12-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for producing antibodies
ES2592271T3 (es) 2005-03-31 2016-11-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Métodos de producción de polipéptidos mediante la regulación de la asociación de los polipéptidos
AR060070A1 (es) 2006-03-24 2008-05-21 Merck Patent Gmbh Dominios proteicos heterodimericos obtenidos por ingenieria
WO2007147901A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
WO2008119353A1 (en) 2007-03-29 2008-10-09 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
JP4341704B2 (ja) 2007-07-12 2009-10-07 トヨタ自動車株式会社 ハイブリッド車両およびハイブリッド車両の制御方法
GB0718167D0 (en) * 2007-09-18 2007-10-31 Cancer Rec Tech Ltd Cancer marker and therapeutic target
US8748356B2 (en) 2007-10-19 2014-06-10 Janssen Biotech, Inc. Methods for use in human-adapting monoclonal antibodies
WO2009085462A1 (en) 2007-12-19 2009-07-09 Centocor, Inc. Design and generation of human de novo pix phage display libraries via fusion to pix or pvii, vectors, antibodies and methods
EP2235064B1 (en) 2008-01-07 2015-11-25 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
EP2604280A3 (en) 2008-03-27 2013-10-16 ZymoGenetics, Inc. Compositions and methods for inhibiting PDGFRBETA and VEGF-A
CA2722466A1 (en) 2008-04-29 2009-11-05 Tariq Ghayur Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20100261620A1 (en) 2008-10-14 2010-10-14 Juan Carlos Almagro Methods of Humanizing and Affinity-Maturing Antibodies
EP2424567B1 (en) 2009-04-27 2018-11-21 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
GB201005063D0 (en) 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products
US20120316071A1 (en) * 2009-11-04 2012-12-13 Vaughn Smider Methods for affinity maturation-based antibody optimization
KR101791430B1 (ko) 2009-11-30 2017-10-30 얀센 바이오테크 인코포레이티드 이펙터 기능이 제거된 항체 Ｆｃ 돌연변이체
US20110206672A1 (en) 2010-02-25 2011-08-25 Melvyn Little Antigen-Binding Molecule And Uses Thereof
KR101930964B1 (ko) 2010-04-20 2018-12-19 젠맵 에이/에스 이종이량체 항체 ｆｃ-함유 단백질 및 그의 생산 방법
WO2011143545A1 (en) 2010-05-14 2011-11-17 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
EP2420253A1 (en) 2010-08-20 2012-02-22 Leadartis, S.L. Engineering multifunctional and multivalent molecules with collagen XV trimerization domain
CA2805054A1 (en) * 2010-08-25 2012-03-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against il-18r1 and uses thereof
EP2625523A4 (en) * 2010-09-27 2014-03-12 Janssen Biotech Inc Cynomolgus monkey CCL17
US8394378B2 (en) 2010-09-27 2013-03-12 Janssen Biotech, Inc. Antibodies binding human collagen II
BR112013011811A2 (pt) 2010-11-05 2023-02-23 Zymeworks Inc Modelo de anticorpo heterodimérico estável com mutações no domínio fc
PT2644698T (pt) * 2010-11-17 2018-01-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molécula multiespecífica de ligação ao antigénio com uma função alternativa à função do fator viii de coagulação do sangue
US8790651B2 (en) * 2011-07-21 2014-07-29 Zoetis Llc Interleukin-31 monoclonal antibody
US20130171659A1 (en) * 2011-12-28 2013-07-04 Abbott Japan Co., Ltd. Methods of prognosis and diagnosis of rheumatoid arthritis
EA034655B1 (ru) * 2013-11-06 2020-03-03 Янссен Байотек, Инк. Антитела к ccl17

Also Published As

Publication number Publication date
MY192757A (en) 2022-09-07
DK3065774T3 (da) 2021-08-23
NZ758354A (en) 2022-09-30
SI3065774T1 (sl) 2021-11-30
JP6556742B2 (ja) 2019-08-07
PH12016500826B1 (en) 2016-06-13
PT3065774T (pt) 2021-08-31
PH12016500826A1 (en) 2016-06-13
PL3065774T3 (pl) 2021-12-13
IL245488A0 (en) 2016-06-30
RS62373B1 (sr) 2021-10-29
WO2015069865A1 (en) 2015-05-14
EP3065774A1 (en) 2016-09-14
PE20160856A1 (es) 2016-09-03
CR20160187A (es) 2016-08-04
AU2014346770B2 (en) 2020-05-21
DOP2016000105A (es) 2016-10-31
CN105722531B (zh) 2020-03-06
CL2016001081A1 (es) 2016-10-21
CA2929166C (en) 2023-08-22
BR112016010071A2 (pt) 2017-12-05
EA201690942A1 (ru) 2016-09-30
IL245488B (en) 2020-03-31
NZ719506A (en) 2022-09-30
MA39090A1 (fr) 2018-03-30
US20180171007A1 (en) 2018-06-21
US20210017267A1 (en) 2021-01-21
KR20160077198A (ko) 2016-07-01
EP3466445A1 (en) 2019-04-10
CY1124445T1 (el) 2022-07-22
EP3065774A4 (en) 2017-06-21
LT3065774T (lt) 2021-09-10
HRP20211234T1 (hr) 2021-11-26
US11414484B2 (en) 2022-08-16
SG11201603231XA (en) 2016-05-30
JP2016537024A (ja) 2016-12-01
UA119973C2 (uk) 2019-09-10
US10829549B2 (en) 2020-11-10
MX2016005982A (es) 2016-08-11
EA034655B1 (ru) 2020-03-03
HUE058272T2 (hu) 2022-07-28
MA39090B2 (fr) 2021-10-29
US20220348647A1 (en) 2022-11-03
CN105722531A (zh) 2016-06-29
EP3065774B1 (en) 2021-05-26
US9944697B2 (en) 2018-04-17
KR102331054B1 (ko) 2021-11-24
US20150125458A1 (en) 2015-05-07
CA2929166A1 (en) 2015-05-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11414484B2 (en) Anti-CCL17 antibodies
ES2755094T3 (es) Antagonistas de ST2L y métodos de uso
ES2821753T3 (es) Procedimientos de producción de Fab y de anticuerpos biespecíficos
ES2728115T3 (es) Antagonistas de IL-17A
ES2444012T3 (es) Composiciones y metodos relacionados con anticuerpos de receptores de glucagón
PT2403528E (pt) Anticorpos contra um ligando indutor da proliferação (april)
ES2690786T3 (es) Anticuerpos que se unen a la proteína 1 de reconocimiento de peptidoglicano
BR112019022702A2 (pt) gama de anticorpos anti-interferon e utilizações dos mesmos.
WO2015057906A1 (en) Cd200 receptor 1 agonists
AU2014346770A1 (en) Anti-CCL17 antibodies
TW202003584A (zh) 單特異性及多特異性抗ｔｍｅｆｆ２抗體及其用途
ES2529734T3 (es) Anticuerpo PcrV humanizado con actividad anti-pseudomonas
ES2665851T3 (es) Nuevo anticuerpo anti-CTGF humano
KR20180042300A (ko) Mrka 폴리펩티드, 항체 및 이의 용도