ES2755094T3 - Antagonistas de ST2L y métodos de uso - Google Patents

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John Wheeler
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Abstract

Un antagonista de anticuerpo aislado, o fragmento del mismo, que se une específicamente al Dominio I (SEQ ID NO: 9) de ST2L humano, que comprende una región variable de la cadena pesada (VH) y una región variable de la cadena ligera (VL), en donde: (a) la VH comprende la SEQ ID NO: 191; y (b) la VL comprende la SEQ ID NO: 209.

Description

DESCRIPCION
Antagonistas de ST2L y métodos de uso
Campo de la invención
La presente invención se refiere a antagonistas de ST2L, polinucleótidos que codifican los antagonistas o fragmentos de los mismos, y métodos de elaboración y uso de los anteriores.
Antecedentes de la invención
El ST2L (IL-1RL1 o IL-33Ra) es un miembro de la familia de receptores Toll/IL-1 expresado en la superficie celular de una amplia variedad de células inmunes, incluyendo las células T, células NK/NKT, basófilos, eosinófilos, mastocitos, y las recientemente descritas células linfoides innatas no B/no T tipo 2, nuocitos y células auxiliares naturales. La expresión de ST2L también es inducible en células dendríticas (DC), macrófagos y neutrófilos. El ST2L es capaz de regular por disminución la capacidad de respuesta de los receptores tipo Toll TLR2, TLR4 y TLR9, pero también induce la liberación de citoquinas tipo 2 mediante la activación por su ligando IL-33 y la asociación con la proteína accesoria IL-1RAcP. La IL-33 ha sido descrita como una 'alarmina', ya que su forma de longitud completa reside en los núcleos de las células epiteliales y endoteliales durante la homeostasis, pero puede escindirse y liberarse durante la necrosis.
La señalización de ST2L requiere la asociación de la proteína accesoria IL-1RAcP con el complejo ST2L/IL-33 preformado. La proteína accesoria IL-1RAcP se comparte con el complejo de señalización IL-1a/p. Se han propuesto modelos de interacciones ST2L, IL-33 e IL-1RAcP, así como interacciones entre IL-1R1 e IL-1RAcP (Lingel et al., Cell 17:1398-1410, 2009; Wang et al., Nat Immunol 11:905-11, 2010). Recientemente, se ha demostrado que ST2L/IL-33/IL-1RAcP forma un complejo de señalización con c-Kit en los mastocitos, el receptor del factor de células madre (SCF). IL-33 indujo la producción de citoquinas en mastocitos primarios de una manera dependiente de SCF (Drube etal., Blood 115:3899-906, 2010).
La activación de ST2L lleva a respuestas de citoquinas tipo 2 excesivas (especialmente IL-5 e IL-13), activación de mastocitos y eosinófilos, e hiperreactividad de las vías respiratorias, y también se ha informado que amplifica las respuestas de Th1 y Th17 a través de la inducción de IFNy a partir de células NKT e IL-1p e IL- 6 de mastocitos. La desregulación de la vía ST2L/IL-33 se ha implicado en una variedad de enfermedades inmunomediadas, incluyendo asma, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, dermatitis atópica, rinitis alérgica, poliposis nasal y esclerosis sistémica (revisado por Palmer y Gabay, Nat Rev Rheumatol 7:321-9, 2011 y Lloyd, Curr Opin Immunol 22:800-6, 2010; Shimizu et al., Hum Molec Gen 14:2919-27, 2005, Kamekura et al., Clin Exp Allergy 42:218-28, 2012; Manetti et al., Ann Rheum Dis 69:598-605, 2010). Por ejemplo, la administración de anticuerpos anti-ST2 a ratones con artritis inducida por colágeno (CIA) se describe en Palmer et al., Arthritis & Rheumatism 60(3):738-749.
Por tanto, hay una necesidad de antagonistas de ST2L que sean adecuados para su uso en el tratamiento de enfermedades y trastornos mediados por ST2L.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra la inhibición de la hiperreactividad de las vías aéreas por el mAb CNTO3914 de unión al dominio I de ST2L en un modelo de inflamación pulmonar inducida por IL-33 administrada intranasalmente en comparación con el control de isotipo CNTO5516. La resistencia máxima de las vías respiratorias se midió tras la administración de metacolina (MCH) a dosis aumentadas (mg/ml). **p<0,05 para CNTO3914/IL-33 frente a CNTO5516/IL-33; y ***p<0,001 para CNTO3914/IL-33 frente a p Bs con el grupo de tratamiento de IL-33.
La Figura 2 muestra la inhibición del reclutamiento celular de lavado broncoalveolar (BAL) por el mAb CNTO3914 de unión al dominio I de ST2L en un modelo de inflamación pulmonar inducida por IL-33 administrada intranasalmente en comparación con el control de isotipo CNTO5516. ***p<0,001.
La Figura 3 muestra la inhibición dependiente de la dosis de la liberación de la proteasa 1 de mastocitos de ratón (MMCP-1) por el mAb CNTO3914 de unión al dominio I de ST2L en fluido BAL libre de células en un modelo de inflamación pulmonar inducida por IL-33 administrada intranasalmente. **p<0,01, ***p<0,001, frente a CNTO5516 (control de isotipo) con tratamiento con IL-33.
La Figura 4 muestra la inhibición de la liberación GM-CSF (Figura 4A), IL-5 (Figura 4B) y TNFa (Figura 4C) inducida por IL-33 por el mAb CNTO3914 de unión al Dominio I de ST2L por mastocitos derivados de médula ósea de ratón in vitro. Las concentraciones de CNTO3914 usadas se muestran como pg/ml y las concentraciones de IL-33 como ng/ml entre paréntesis.
La Figura 5 muestra la inhibición de la liberación de prostaglandina D2 (PGD2) inducida por IL-33 por mastocitos derivados de la sangre del cordón umbilical humano por el mAb C2494 de unión al dominio I de ST2L (STLM62) a las concentraciones indicadas de IL-33 y C2494. MOX-PDG2 : metoxilsamina-PGD 2.
La Figura 6 muestra la inhibición de la liberación de GM-CSF (Fig. 6A), IL-8 (Figura 6B), IL-5 (Figura 6C), IL-13 (Figura 6D) e IL-10 (Figura 6E) por las concentraciones indicadas (pg/ml) de los mAb C2244 y C2494 de unión al Dominio I de ST2L en mastocitos derivados de la sangre del cordón umbilical humano (hCBMC) en presencia de 1 ng/ml de IL-33 en medio StemPro-34 100 ng/ml de SCF (factor de células madre).
La Figura 7 muestra efecto sobre la liberación de GM-CSF (Figura 7A), IL-8 (Figura 7B), IL-5 (Figura 7C), IL-13 (Figura 7D) e IL-10 (Figura 7E) por las concentraciones indicadas (pg/ml) de los mAb C2519 o C2521 de unión al Dominio III de ST2L en mastocitos derivados de sangre del cordón umbilical humano en presencia de 1 ng/ml de IL-33 en medio StemPro-34 100 ng/ml de SCF.
La Figura 8 muestra efecto sobre la liberación de A) GM-CSF; B) IL-8; C) IL-5; D) IL-13 y E) IL-10 por el mAb C2494 de unión al dominio I de ST2L y los mAb ST2M48 (M48), ST2M49 (M49) ST2M50 (M50) y ST2M51 (M51) de unión al dominio III de ST2L en mastocitos derivados de sangre de cordón humano (hCBMC) en presencia de3 ng/ml de IL-33 en RPMI/medio FCS al 10% 100 ng/ml de SCF.
La Figura 9 muestra el porcentaje medio (%) de inhibición de anticuerpos anti-ST2L de unión al Dominio I (D1) o Dominio III (D3) de ST2L sobre la liberación de GM-CSF, IL-5, IL-8, IL-10 e IL-13 por mastocitos derivados de la sangre del cordón umbilical humano tras la inducción de IL-33 y SCF como se indica usando o 50 pg/ml o 2 pg/ml de cada anticuerpo probado. Los valores negativos indican el % de activación.
La Figura 10 muestra regiones variables de cadena pesada (VH) y secuencias de CDR de cadena pesada de anticuerpos anti-ST2L derivados de bibliotecas de presentación en fagos y después de campañas de maduración de afinidad posteriores.
La Figura 11 muestra regiones variables de cadena ligera (VL) y secuencias de CDR de cadena ligera de anticuerpos anti-ST2L derivados de bibliotecas de presentación en fagos y después de campañas de maduración de afinidad posteriores.
La Figura 12 muestra las regiones VH y VL y secuencias de CDR de cadena pesada de las variantes STLM208 VH ST2H257 HCDR3 del anticuerpo anti-ST2L.
La Figura 13 muestra las secuencias A) VH y B) VL de anticuerpos anti-ST2L derivados de bibliotecas de presentación en fagos y después de campañas de maduración por afinidad posteriores.
La Figura 14 muestra la delineación de los sitios de unión a antígeno de VH y VL C2494 transferidos a marcos humanos (transferidos marcados como HFA, "adaptación de marco humano"). Las CDR de Kabat están subrayadas y los HV de Chothia se indican en líneas discontinuas por encima de las regiones de HFA transferidas indicadas. La numeración de los residuos de VH y VL se realiza según Chothia. Los residuos resaltados en gris en VH no se transfirieron en algunas variantes de HFA. C2494 VH: SEQ ID NO: 48; C2494 VH: SEQ ID NO: 52.
La Figura 15 muestra secuencias de CDR de anticuerpos adaptados al marco humano (HFA) derivados de C2494.
Figura 16 A) Niveles séricos de anticuerpo CNTO3914 anti-ST2L B) inhibición del reclutamiento de células de lavado broncoalveolar (BAL) C) inhibición de la secreción de IL-6 por células sanguíneas completas estimuladas con IL-33; D) inhibición de la secreción de MCP1 por células sanguíneas completas estimuladas con IL-33 por CNTO3914 24 horas después de la dosificación en un modelo de 6 horas de inflamación pulmonar inducida por IL-33 administrada intranasalmente. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; NQ = por debajo del límite de detección; @ = un punto de datos está por debajo del límite de detección.
Figura 17. Competencia entre varios anticuerpos anti-ST2L. A) el Fab de C2244 marcado 30 nM compitió con los anticuerpos indicados para la unión a ECD de ST2L recubierto sobre micropocillos. C2244 compitió con C2494 pero no con C2539. B) C2494 marcado 10 nM compitió con los anticuerpos indicados para la unión a ECD de ST2L recubierto sobre micropocillos. C2494 compitió con STLM208 y STLM213 pero no con C2539.
La Figura 18 muestra un mapa de intercambio H/D simplificado del ST2-ECD humano (SEQ ID NO: 119) complejado con Fab de C2244. Las regiones protegidas por el anticuerpo se mostraron en diferentes escalas de grises como se indica. Los segmentos que abarcaban los residuos 18-31 (encuadrados en línea discontinua) (correspondientes a los residuos 35-48 de ST2L de longitud completa de la SEQ ID NO: 1) estaban protegidos por el Fab. La región que abarca los residuos 71-100 (encuadrados en una línea continua) (correspondiente a los residuos 88-117 de la SEQ ID NO: 1) estaba muy glicosilada y no estaba cubierta por péptidos.
La Figura 19 muestra las constantes cinéticas y de afinidad para el anticuerpo de unión al dominio I de ST2L para las variantes ST2L como se indica en la figura.
La Figura 20 muestra inhibición de la secreción de A) GM-CSF; B) IL-5; C) IL-8; D) IL-13 de mastocitos pulmonares humanos primarios por un anticuerpo STLM208 anti-ST2L.
Sumario de la invención
La invención proporciona un antagonista de anticuerpo aislado, o fragmento del mismo, que se une específicamente al Dominio I (SEQ ID NO: 9) de ST2L humano, que comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde:
(a) la VH comprende la SEQ ID NO: 191; y
(b) la VL comprende la SEQ ID NO: 209. La invención proporciona un antagonista de anticuerpo humano o adaptado a humanos aislado o un fragmento del mismo que se une específicamente al Dominio I (SEQ ID NO: 9) de ST2L humano.
La presente divulgación también proporciona antagonistas de anticuerpos adaptados a humanos que se unen específicamente a ST2L humano que tiene ciertas secuencias de la región variable de cadena ligera y de cadena pesada, o ciertas secuencias determinantes de la complementariedad de la cadena pesada y la cadena ligera.
La presente divulgación también proporciona antagonistas de anticuerpos humanos o adaptados a humanos que se unen específicamente a ST2L humano en regiones de epítopo definidas y/o que tienen ciertas características como se describe en la presente.
La invención también proporciona un polinucleótido aislado que codifica las regiones variables de cadena pesada (VH) o las regiones variables de cadena ligera (VL) de la invención.
La invención también proporciona un vector que comprende un polinucleótido aislado de la invención. La invención también proporciona una célula huésped que comprende un vector de la invención.
La invención también proporciona un método para producir un anticuerpo de la invención, que comprende cultivar una célula huésped de la invención y recuperar el anticuerpo de la célula.
La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo aislado de la invención y un portador farmacéuticamente aceptado.
La presente divulgación también proporciona un método para tratar o prevenir una afección mediada por ST2L que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo aislado de la invención a un paciente con necesidad de ello durante un tiempo suficiente para tratar o prevenir la afección mediada por ST2L.
La presente divulgación también proporciona un método para inhibir la respuesta de mastocitos en un paciente que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo aislado de la invención a un paciente con necesidad de ello durante un tiempo suficiente para inhibir la respuesta de mastocitos.
La presente divulgación también proporciona un método para inhibir la interacción de IL-33 y ST2L en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un anticuerpo que se une específicamente al dominio I de ST2L en una cantidad suficiente para inhibir la interacción de IL-33 y ST2L.
Descripción detallada de la invención
Debe entenderse que la terminología usada en la presente tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente y no se pretende que sea limitativa. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la invención.
Aunque puede usarse cualquier método y material similares o equivalentes a los descritos en la presente en la puesta en práctica para probar la presente invención, en la presente se describen materiales y métodos ejemplares. Al describir y reivindicar la presente invención, se usará la siguiente terminología.
El término "antagonista" como se usa en la presente significa una molécula que inhibe parcial o completamente, por cualquier mecanismo, la actividad biológica de ST2L. Los antagonistas ejemplares son anticuerpos, proteínas de fusión, péptidos, peptidomiméticos, ácidos nucleicos, oligonucleótidos y moléculas pequeñas. Los antagonistas se pueden identificar usando los ensayos para la actividad biológica de ST2L que se describe a continuación. Los antagonistas de ST2L pueden inhibir la actividad biológica de ST2L medida en un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%.
El término "ST2L" o "huST2L" o "ST2L humano" se refiere a un polipéptido de ST2L humano que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en el N° de acceso de GenBank NP_057316. La SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de aminoácidos de ST2L humano de longitud completa. "Dominio extracelular de ST2L", " ECD de ST2L" o "ECD de huST2L" como se usa en la presente significa un polipéptido que tiene los aminoácidos 19-328 de la SEQ ID NO: 1. El ECD de huST2L tiene tres dominios de tipo C2 de tipo Ig que abarcan los residuos 19-122 (Dominio I, SEQ ID NO: 9), residuos 123-202 (Dominio II, SEQ ID NO: 10) y residuos 209-324 (Dominio III, SEQ ID NO: 11) de la SEQ ID NO: 1 "Dominio I" o "Dominio I de ST2L " o "Dominio I de huST2L" o "D1" se refiere al primer dominio tipo inmunoglobulina en ST2L humano que tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 9. "Dominio III" o "Dominio III de ST2L” se refiere al tercer dominio tipo inmunoglobulina en ST2L humano que tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 11.
El término "IL-33" como se usa en la presente incluye IL-33 de longitud completa (N° de Acceso de GenBank NP_254274 SEQ ID NO: 3), variantes y formas activas del mismo. Las variantes de IL-33 incluyen proteínas que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en N° de Acceso de GenBank NP_001186569 y N° de Acceso de GenBank NP_001186570). Las formas activas de IL-33 incluyen una "IL-33 madura" que tiene los residuos 112-270 de la SEQ ID NO: 3. Las formas activas adicionales incluyen fragmentos de IL-33 que tienen los residuos 11-270, 115-270, 95-270, 99-270, o 109-270 de la SEQ ID NO: 3 (LeFrancais et al., Proc Natl Acad Sci (USA) 109:1673-8, 2012), o cualquier forma o combinación de formas aisladas a partir de células que expresan endógenamente IL-33. La "forma activa de IL-33" es un fragmento o una variante de IL-33 de la SEQ ID NO: 3 que induce la actividad biológica de ST2L.
El término "anticuerpos" como se usa en la presente se entiende en un sentido amplio e incluye moléculas de inmunoglobulina que incluyen anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales incluyendo anticuerpos monoclonales murinos, humanos, adaptados a humanos, humanizados y quiméricos, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos formados a partir de por lo menos dos anticuerpos intactos o fragmentos de anticuerpos, anticuerpos diméricos, tetraméricos o multiméricos, y anticuerpos de cadena sencilla.
Las inmunoglobulinas pueden asignarse a cinco clases principales, concretamente, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de la cadena pesada. IgA e IgG se subclasifican además como los isotipos IgA-i, IgA2, IgG-i, IgG2, IgG3 e IgG4. Las cadenas ligeras de anticuerpos de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, concretamente kappa (k) y lambda (A), en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
El término "fragmentos de anticuerpos" se refiere a una parte de una molécula de inmunoglobulina que retiene el sitio de unión al antígeno de la cadena pesada y/o de la cadena ligera, como las regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR) 1, 2 y 3, las regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR) 1, 2 y 3, una región variable de la cadena pesada (VH) o una región variable de la cadena ligera (VL). Los fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, F(ab')2, Fd y Fv bien conocidos, así como anticuerpos de un dominio (dAb) que consisten en un dominio VH. Los dominios VH y VL pueden enlazarse entre sí a través de un conector sintético para formar varios tipos de diseños de anticuerpos de cadena sencilla en los que los dominios VH/VL se emparejan intramolecularmente, o intermolecularmente en aquellos casos en que los dominios VH y VL se expresan mediante constructos de anticuerpos de cadena sencilla separados, para formar un sitio de unión al antígeno monovalente, como Fv de cadena sencilla (scFv) o diacuerpo; descritos por ejemplo en la Publicación de Patente Internacional N° WO98/44001, Publicación de Patente Internacional N° WO88/01649; Publicación de Patente Internacional N° WO94/13804; Publicación de Patente Internacional N° WO92/01047.
Una región variable de anticuerpo consiste de una región "marco" interrumpida por tres "sitios de unión al antígeno". Los sitios de unión al antígeno se definen usando varios términos: (i) Regiones determinantes de la complementariedad (CDR), tres en la VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) y tres en la VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3), se basan en la variabilidad de secuencias (Wu y Kabat, J Exp Med 132:211-50, 1970; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). (ii) "Regiones hipervariables", "HVR" o "HV", tres en la VH (H1, H2, H3) y tres en la VL (L1, L2, L3), se refieren a las regiones de los dominios variables de un anticuerpo que son hipervariables en estructura como se define por Chothia y Lesk (Chothia y Lesk, Mol Biol 196:901-17, 1987). Otros términos incluyen "IMGT-CDR" (Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003) y "Uso de residuos determinantes de la especificidad" (SDRU) (Almagro, Mol Recognit 17:132-43, 2004). La base de datos de International ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www_imgt_org) proporciona una numeración y definición estandarizadas de sitios de unión al antígeno. La correspondencia entre las delineaciones CDR, HV e IMGt se describe en Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003.
Los "residuos de Chothia" como se usan en la presente son los residuos de anticuerpos VL y VH numerados de acuerdo con Al-Lazikani (Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273927-48, 1997).
"Marco" o "secuencias marco" son las secuencias restantes de una región variable distinta de las definidas como sitio de unión al antígeno. Como el sitio de unión al antígeno puede definirse mediante varios términos como se ha descrito anteriormente, la secuencia exacta de aminoácidos de un marco depende de cómo se haya definido el sitio de unión al antígeno.
"Anticuerpo humano" o "anticuerpo completamente humano" se refiere a anticuerpos que contienen secuencias de la región variable y la región constante derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir sustituciones, de tal manera que pueden no ser copias exactas de la inmunoglobulina humana expresada o las secuencias de genes de la línea germinal. Sin embargo, los anticuerpos en los que los sitios de unión al antígeno se derivan de una especie no humana no están incluidos en la definición de "anticuerpo humano".
Los anticuerpos "adaptados a humanos" o los anticuerpos "adaptados al marco humano (HFA)" se refieren a anticuerpos adaptados de acuerdo con los métodos descritos en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2009/0118127 y también se refieren a anticuerpos en los que las secuencias del sitio de unión al antígeno derivadas de especies no humanas se injertan en estructuras marco humanas.
Los "anticuerpos humanizados" se refieren a anticuerpos en los que los sitios de unión al antígeno se derivan de especies no humanas y las estructuras marco de la región variable se derivan de secuencias de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos humanizados pueden incluir sustituciones en las regiones marco para que el marco no sea una copia exacta de la inmunoglobulina humana expresada o de las secuencias de genes de la línea germinal.
El término "sustancialmente idéntico" como se usa en la presente significa que las dos secuencias de aminoácidos de la región variable del anticuerpo que se comparan son idénticas o tienen "diferencias insustanciales". Las diferencias insustanciales son sustituciones de 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10 u 11 aminoácidos en una secuencia de anticuerpo o de región variable de anticuerpo que no afectan negativamente a las propiedades del anticuerpo. Las secuencias de aminoácidos sustancialmente idénticas a las secuencias de la región variable divulgadas en la presente están dentro del alcance de la divulgación. En algunos casos, la identidad de secuencia puede ser de aproximadamente el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más. El porcentaje de identidad puede determinarse, por ejemplo, mediante la alineación por pares usando la configuración predeterminada del módulo AlignX del Vector NTI v.9.0.0 (Invitrogen, Carslbad, CA). Las secuencias de proteínas de la presente invención pueden usarse como una secuencia de consulta para realizar una búsqueda en bases de datos públicas o de patentes para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Los programas ejemplares usados para realizar tales búsquedas son los programas XBLAST o BLASTP (http_//www_ncbi_nlm/nih_gov), o la suite GenomeQuest™ (GenomeQuest, Westborough, MA) usando la configuración predeterminada.
El término "epítopo" como se usa en la presente significa una parte de un antígeno al que se une específicamente un anticuerpo. Los epítopos consisten habitualmente de agrupaciones de fracciones superficiales químicamente activas (como polares, no polares o hidrófobas) como cadenas laterales de aminoácidos o polisacáridos y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Un epítopo puede estar compuesto de aminoácidos contiguos y/o no contiguos que forman una unidad espacial conformacional. Para un epítopo no contiguo, los aminoácidos de diferentes partes de la secuencia lineal del antígeno se aproximan estrechamente en un espacio tridimensional a través del pliegue de la molécula de proteína. Un epítopo ejemplar es el dominio I de huST2L mostrado en la SEQ ID NO: 9.
El término "paratopo" como se usa en la presente significa una parte de un anticuerpo al que se une específicamente un antígeno. Un paratopo puede ser de naturaleza lineal o puede ser discontinuo, formado por una relación espacial entre aminoácidos no contiguos de un anticuerpo en lugar de una serie lineal de aminoácidos. Un "paratopo de cadena ligera" y un "paratopo de cadena pesada" o "residuos de aminoácidos de paratopo de cadena ligera" y "residuos de aminoácidos de paratopo de cadena pesada" se refieren a residuos de cadena ligera y de cadena pesada de anticuerpos en contacto con un antígeno, respectivamente.
El término "unión específica" o "se une específicamente" como se usa en la presente se refiere a la unión de anticuerpos a un antígeno predeterminado con mayor afinidad que para otros antígenos o proteínas. Típicamente, el anticuerpo se une a un antígeno predeterminado con una constante de disociación (Kd) de 1x10-7 M o menos, por ejemplo 1x10-8 M o menos, 1x10-9 M o menos, 1x10-10 M o menos, 1x10-11 M o menos, o 1x10-12 M o menos, típicamente con una Kd que es por lo menos diez veces menor que su Kd para unirse a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína o cualquier otro polipéptido especificado). La constante de disociación puede medirse usando procedimientos estándar. Sin embargo, los anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno predeterminado pueden tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, con el mismo antígeno predeterminado de otra especie (homólogos), como humanos o monos, por ejemplo, Macaca fascicularis (cynomolgus).
"Biespecífico", como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo que se une a dos antígenos distintos o dos epítopos distintos dentro de un antígeno.
"Monoespecífico", como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo que se une a un antígeno o un epítopo.
El término "en combinación con" como se usa en la presente significa que los agentes descritos pueden administrarse juntos a un animal en una mezcla, concurrentemente como agentes individuales o secuencialmente como agentes individuales en cualquier orden.
"Afección inflamatoria", como se usa en la presente, se refiere a respuestas localizadas o sistémicas agudas o crónicas a estímulos dañinos como patógenos, células dañadas, lesiones físicas o irritantes, que están mediadas en parte por la actividad de citoquinas, quimiocinas o células inflamatorias (por ejemplo, neutrófilos, monocitos, linfocitos, macrófagos) y se caracteriza en la mayoría de los casos por dolor, enrojecimiento, hinchazón y deterioro de la función del tejido.
El término "afección inflamatoria mediada por ST2L" como se usa en la presente se refiere a una afección inflamatoria resultante de por lo menos parcialmente una activación inapropiada de la vía de señalización de ST2L. Las afecciones inflamatorias mediadas por ST2L ejemplares son asma y alergias.
El término "afección mediada por ST2L", como se usa en la presente, abarca todas las enfermedades y afecciones médicas en las que ST2L desempeña un papel, ya sea directa o indirectamente, en la enfermedad o afección médica, incluyendo la causa, el desarrollo, el progreso, la persistencia o la patología de la enfermedad. o afección.
El término "actividad biológica de ST2L" como se usa en la presente se refiere a cualquier actividad que se produce como resultado de la unión de IL-33 del ligando de ST2L a ST2L. Una actividad biológica de ST2L ejemplar da como resultado la activación de NF-kB en respuesta a IL-33. La activación de NF-kB puede analizarse usando un ensayo de gen informador tras la inducción de ST2L con IL-33 (Fursov et al., Hybridoma 30:153-62, 2011). Otras actividades biológicas de ST2L ejemplares dan como resultado la proliferación de células Th2, o la secreción de citoquinas y quimiocinas proinflamatorias, por ejemplo IL-5, GM-CSF, IL-8, IL-10 o IL-13. La liberación de citoquinas y quimiocinas de células, tejidos o en circulación puede medirse usando inmunoensayos bien conocidos, como un inmunoensayo ELISA.
El término "vector" significa un polinucleótido capaz de duplicarse dentro de un sistema biológico o que puede moverse entre dichos sistemas. Los polinucleótidos de vectores típicamente contienen elementos, como orígenes de replicación, señal de poliadenilación o marcadores de selección, que funcionan para facilitar la duplicación o mantenimiento de estos polinucleótidos en un sistema biológico. Los ejemplos de tales sistemas biológicos pueden incluir una célula, virus, animal, planta y sistemas biológicos reconstituidos que utilizan componentes biológicos capaces de duplicar un vector. El polinucleótido que comprende un vector puede ser moléculas de ADN o ARN o un híbrido de estas.
El término "vector de expresión" significa un vector que puede utilizarse en un sistema biológico o en un sistema biológico reconstituido para dirigir la traducción de un polipéptido codificado por una secuencia de polinucleótidos presente en el vector de expresión.
El término "polinucleótido" significa una molécula que comprende una cadena de nucleótidos enlazados covalentemente por una estructura principal de azúcar-fosfato u otra química covalente equivalente. Los ADN y ARN de cadena doble y de cadena sencilla son ejemplos típicos de polinucleótidos.
El término "polipéptido" o "proteína" significa una molécula que comprende por lo menos dos residuos de aminoácidos enlazados por un enlace peptídico para formar un polipéptido. Los polipéptidos pequeños de menos de 50 aminoácidos pueden ser referidos como "péptidos".
Los códigos de aminoácidos convencionales de una y tres letras se usan en la presente de la siguiente manera:
Aminoácido Código de tres letras Código de una letra
Alanina ala A
Arginina arg R
Asparagina asn N
Aspartato asp D
Cisteína cys C
Glutamato glu E
Glutamina gln Q
Glicina gly G
Histidina his H
Isoleucina ile I
Leucina leu L
Lisina lys K
Metionina met M
Fenilalanina phe F
Prolina pro P
Serina ser S
Treonina thr T
Triptofano trp W
Tirosina tyr Y
Valina val V
i
Composiciones del asunto
La presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen específicamente a ST2L e inhiben la actividad biológica de ST2L, y los usos de tales anticuerpos. Los inventores han hecho un sorprendente hallazgo de que los anticuerpos que se unen al Dominio I de ST2L humano (SEQ ID NO: 9) bloquean la interacción IL-33/ST2L e inhiben un espectro de actividades biológicas de ST2L que incluyen las respuestas de mastocitos inducidas por IL-33, mientras que los anticuerpos que se unen al dominio III de ST2L humano (SEQ ID NO: 11) no bloquean la interacción de IL-33/ST2L aunque son inhibidores en un espectro de las actividades biológicas de ST2L. Sin embargo, los anticuerpos que se unen al dominio III tienen un efecto inhibidor reducido o nulo, o en algunos casos estimulan las respuestas de mastocitos inducidas por IL-33.
En algunas realizaciones descritas en la presente, los anticuerpos que bloquean la interacción de IL-33/ST2L e inhiben un espectro de las actividades biológicas de ST2L incluyendo las respuestas de mastocitos inducidas por IL-33 se unen a un epítopo dentro del Dominio I de ST2L humano (RCPRQGKPSYTVDW; SEQ ID NO: 210), y opcionalmente los residuos de aminoácidos T93 y F94 de ST2L (numeración de residuos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1).
El término "respuesta de mastocitos" o "actividad de mastocitos" se refiere a la liberación de citoquinas inducida por IL-33 como GM-CSF, IL-8, IL-5, IL-13 e IL-10, y mediadores alérgicos como la prostaglandina D2 de los mastocitos.
En la presente se describen nuevos sitios de unión al antígeno que se unen al Dominio I de ST2L humano. La estructura para transportar un sitio de unión a antígeno es típicamente un anticuerpo VH o VL.
Los anticuerpos divulgados en la presente pueden ser antagonistas de anticuerpos humanos o adaptados a humanos aislados o un fragmento de los mismos que se unen específicamente al Dominio I (SEQ ID NO: 9) de ST2L humano. Un anticuerpo ejemplar que se une al dominio I de ST2L humano (SEQ ID NO: 9) es un anticuerpo STLM15 (C2244) que comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDr3 de las SEQ iD NO: 23, 27 y 31, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 35, 39 y 43, respectivamente, o un anticuerpo C2494 (STLM62) que comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y Hc Dr3 de las SEQ ID NO: 24, 28 y 32, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 36, 40 y 44, respectivamente (Tabla 3). Los anticuerpos ejemplares adicionales que se unen al Dominio I de ST2L humano son los anticuerpos mostrados en la Tabla 16 y la Figura 13, por ejemplo, los anticuerpos STLM103, STLM107, STLM108, STLM123, STLM124, STLM208, STLM209, STLM210, STLM211, STLM212 y STLM213. Los antagonistas de anticuerpos humanos ejemplares se muestran en la Figura 12 y la Figura 13. Los antagonistas adaptados a humanos ejemplares se muestran en la Tabla 14.
En algunas realizaciones descritas en la presente, el antagonista de anticuerpo aislado humano o adaptado a humanos o fragmento del mismo que se une específicamente al Dominio I (SEQ ID NO: 9) de ST2L humano bloquea la interacción de IL-33/ST2L.
Los anticuerpos pueden probarse para su capacidad para bloquear la interacción de IL-33/ST2L mediante ELISA estándar. Por ejemplo, las placas se recubren con el dominio extracelular de ST2L humano (ECD de huST2L) y se incuban con un anticuerpo, después de lo cual se mide la unión de IL-33 biotinilada sobre las placas. Los anticuerpos que "bloquean la interacción de IL-33/ST2L" o "inhiben la interacción de IL-33/ST2L" son anticuerpos que, en un ensayo ELISA que usa placas recubiertas con ECD de huST2L, reducen la señal derivada de la IL-33 biotinilada unida a la placa en por lo menos un 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% a 50 pg/ml de concentración de anticuerpo en comparación con la unión de IL-33 en ausencia del anticuerpo.
Los anticuerpos pueden probarse para su inhibición de las respuestas de mastocitos evaluando su actividad inhibidora, por ejemplo, sobre la liberación de GM-CSF, IL-5, IL-10 o IL-13 por mastocitos derivados de sangre del cordón umbilical humano o mastocitos del pulmón humano primarios usando métodos estándar y métodos ejemplificados a continuación. Los anticuerpos, como se describe en la presente, que "inhiben la respuesta de mastocitos" o "inhiben la actividad de los mastocitos" son anticuerpos que reducen la secreción de GM-CSF, IL-5, IL-13 o IL-10 inducida por 1-3 ng/ml de IL-33 en por lo menos un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% a una concentración de 10 pg/ml en comparación con los mastocitos no tratados por el anticuerpo. Típicamente, los mastocitos pueden derivarse de sangre del cordón umbilical humano o del parénquima pulmonar y de progenitores de CD34+ de las vías respiratorias pequeños por métodos bien conocidos y ejemplificados a continuación. Las condiciones de cultivo de mastocitos pueden afectar la medida del % de inhibición para un anticuerpo y, por lo tanto, las condiciones de cultivo y prueba pueden mantenerse estándar usando, por ejemplo, medios StemPro-34 durante el procedimiento de diferenciación de 6-10 semanas. A los 4 días antes del ensayo de liberación de citoquinas, los mastocitos se estimulan diariamente con 10 ng/ml de IL-4, 10 ng/ml de IL-6 y 100 ng/ml de SCF. Para el ensayo de liberación de citoquinas, los mastocitos se pueden resuspender en medio StemPro-34 nuevo o RPMI que contenga FCS al 10% sin antibióticos, con 100 ng/ml de SCF. Las densidades de colocación en placas adecuadas para los ensayos son de 65.000 a 75.000 células/0,16 ml/pocillo. Los anticuerpos ejemplares de la presente divulgación como se describen en la presente que inhiben las respuestas de mastocitos son los anticuerpos STLM15, STLM62 y STLM208. El anticuerpo CNTO3914 se une al Dominio I de ST2L de ratón sin reactividad cruzada con ST2L humano e inhibe las respuestas de mastocitos en células de ratón.
Los expertos en la técnica apreciarán que las respuestas de los mastocitos también incluyen la liberación de IL-1 e IL-32, y también quimiocinas como CCL1, CCL4, CCL5, CCL18 y CCL23, así como mediadores alérgicos como cisteinil leucotrienos, histamina, así como una variedad de proteasas de mastocitos que incluyen triptasa, quimasa, carboxipeptidasa y catepsina G. Los anticuerpos de la invención como se describe en la presente pueden probarse para su capacidad de inhibir estas respuestas de mastocitos adicionales usando métodos estándar. Se puede esperar que los anticuerpos de la invención que se unen al Dominio I de ST2L y que bloquean la interacción de IL-33/ST2L como se describe en la presente inhiban estas respuestas de mastocitos adicionales por lo menos en un 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más cuando se prueba a una concentración mínima de 10 pg/ml bajo estas condiciones.
Los anticuerpos de la invención tal como se describen en la presente se unen a ST2L humano con una constante de disociación (Kd) entre aproximadamente 5x10-12 M y aproximadamente 7x10-10 M, una constante de formación (Kon) para ST2 L humano entre aproximadamente 2 x 106 M 'V 1 y aproximadamente 1x108 M 'V 1, o una constante de ruptura ( K f para ST2L humano entre aproximadamente 1x10'6s -1 y aproximadamente 1x10'2s-1. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención como se describe en la presente se unen a ST2L humano con una Kd de menos de aproximadamente 7x10'10M, menos de aproximadamente 1x10'10M, menos de aproximadamente 5x10'11 M, menos de aproximadamente 1x10'11 M o menos de aproximadamente 5x1012 M.
Los anticuerpos de la invención como se describe en la presente pueden reaccionar de forma cruzada con ST2L de Macaca fascicularis (cyno) (SEQ ID NO: 2) y unirse a ST2L de cyno con una constante de disociación (Kd) entre aproximadamente 3x10-12 M y aproximadamente 2x10-9 M, una constante de formación (Kon) a ST2L de cyno entre aproximadamente 4x106 M 'V 1 y aproximadamente 1x108 M 'V 1’ o una constante de ruptura ( K f a ST2L de cyno entre aproximadamente 7x10-5s-1 y aproximadamente 1x10'V . Por ejemplo, los anticuerpos de la invención como se describe en la presente se unen a ST2L de cyno con una Kd de menos de aproximadamente 2x10-9 M, menos de aproximadamente 1x10-9 M, menos de aproximadamente 1x10-10 M, menos de aproximadamente 1x10'11 M o menos de aproximadamente 3x10-12 M.
La afinidad de un anticuerpo contra ST2L puede determinarse experimentalmente usando cualquier método adecuado. Tales métodos pueden utilizar la instrumentación ProteOn XPR36, Biacore 3000 o KinExA, ELISA o ensayos de unión competitiva conocidos por los expertos en la técnica. La afinidad medida de una interacción de anticuerpo/ST2L particular puede variar si se mide bajo diferentes condiciones (por ejemplo, osmolaridad, pH). Por tanto, las mediciones de afinidad y otros parámetros de unión (por ejemplo, Kd, Kon, K f se hacen preferiblemente con condiciones estandarizadas y un tampón estandarizado, tal como el tampón descrito en la presente. Los expertos en la técnica apreciarán que el error interno para las mediciones de afinidad, por ejemplo, usando Biacore 3000 o ProteOn (medido como desviación estándar, SD) puede estar típicamente dentro del 5-33% para mediciones dentro de los límites típicos de detección. Por lo tanto, el término "aproximadamente" refleja la desviación estándar típica en el ensayo. Por ejemplo, la SD típica para una Kd de 1x10-9 M es de hasta ± 0,33x10-9 M.
Los anticuerpos de unión a ST2L humano con una afinidad deseada y, opcionalmente, que reaccionan de forma cruzada con ST2L de cyno pueden seleccionarse de bibliotecas de variantes o fragmentos mediante barrido con ST2L humano y/o ST2L de cyno y, opcionalmente, mediante una maduración de afinidad de anticuerpos adicional. Los anticuerpos pueden identificarse en base a su inhibición de la actividad biológica de ST2L usando cualquier método adecuado. Tales métodos pueden utilizar ensayos de genes informadores o ensayos que miden la producción de citoquinas usando métodos bien conocidos y como se describe en la solicitud.
También se divulga en la presente un antagonista de anticuerpo aislado que se une específicamente a ST2L humano que comprende:
una región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR) 1 (HCDR1) de la SEQ ID NO: 160 (X1X2X3MX4); en donde
X1 es S, F, D, I, GoV;
X2 es Y o D;
X3 es A, D o S; y
X4 es S, F o I;
una HCDR 2 (HCDR2) de la SEQ ID NO: 161 (X5 IX6GX7GGX8TX9YADSVKG); en donde
X5 es A, S, T, Y o D;
X6 es S, R, E, K, G o A;
X7 es S, E o N;
X8 es S, R, E, G, T, D o A; y
X9 es Y, D, N, A o S; y
una HCDR 3 (HCDR3) de la SEQ ID NO: 162 (X10X11WSTEGSFFVLDY); en donde
X10 es D, A, R, N, Q, P, E, I, H, S, T o Y; y
X11 es P, A, H, Y, E, Q, L, S, N, T, V o I.
También se divulga en la presente un antagonista de anticuerpo aislado que se une específicamente a ST2L humano que comprende:
una región determinante de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR) 1 (LCDR1) de la SEQ ID NO: 163 (RASQSVDDX12LA); en donde
X12 es A o D;
una LCDR 2 (LCDR2) de la SEQ ID NO: 90 (DASNRAT); y
una LCDR 3 (LCDR3) de la SEQ ID NO: 164 (QQX13X14X15X16X17X18T); en donde
X13 es F o Y;
X14 es Y, IoN;
X15 es N, G, D o T;
X16 es W o A;
X17 es P o se elimina; y
X18 es L o I.
También se divulgan en la presente anticuerpos que comprenden las secuencias de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 160, 161, 162, 163, 90 y 164, respectivamente, pueden elaborarse mediante métodos de mutagénesis bien conocidos usando, por ejemplo, secuencias de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 78, 81, 84, 87, 90 y 92, respectivamente, como plantilla. Las CDR de cadena pesada y las CDR de cadena ligera de las SEQ ID NO: 160, 161, 162, 163, 90 y 164, respectivamente, pueden injertarse en estructuras marco humanas, como las estructuras marco descritas a continuación. Los anticuerpos pueden analizarse para su unión a ST2L y su capacidad para bloquear la interacción de IL-33/ST2L y otras características como la afinidad para ST2L humano y/o ST2L de cyno, y la inhibición de las respuestas de mastocitos usando los métodos descritos en la presente.
En un caso, un antagonista de anticuerpo aislado que se une específicamente a ST2L humano como se describe en la presente comprende:
la HCDR1 de las SEQ ID NO: 78 o 95-108;
la HCDR2 de las SEQ ID NO: 81, 109-118 o 120-129;
la HCDR3 de las SEQ ID NO: 84 o 165-185;
la LCDR1 de las SEQ ID NO: 87 o 130;
la LCDR2 de la SEQ ID NO: 90; y
la LCDR3 de las SEQ ID NO: 92 o 131-134.
En otro caso, un antagonista de anticuerpo aislado que se une específicamente a ST2L humano comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2, HCDR3, Lc Dr 1, LCDR2 y LCDR3 como se muestra en la Figura 10, la Figura 11 y Figura la 12 y como se describe en la presente.
En otro caso, un antagonista de anticuerpo aislado que se une específicamente a ST2L humano como se describe en la presente comprende:
la HCDR1 de las SEQ ID NO: 23 o 24;
la HCDR2 de las SEQ ID NO: 27 o 28;
la HCDR3 de las SEQ ID NO: 31 o 32;
la LCDR1 de las SEQ ID NO: 35 o 36;
la LCDR2 de las SEQ ID NO: 39 o 40; y
la LCDR3 de las SEQ ID NO: 43 o 44.
En otro caso, un antagonista de anticuerpo aislado que se une específicamente a ST2L humano como se describe en la presente comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2, Hc Dr3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3:
SEQ ID NO: 23, 27, 31, 35, 39 y 43, respectivamente;
SEQ ID NO: 24, 28, 32, 36, 40 y 44, respectivamente; (CDR de HFA);
SEQ ID NO: 24, 28, 146, 36, 40 y 147, respectivamente; o
SEQ ID NO: 24, 28, 146, 36, 40 y 44, respectivamente.
También se divulga en la presente un antagonista de anticuerpo aislado humano o adaptado a humanos o un fragmento del mismo que se une específicamente a ST2L humano como se describe en la presente, (SEQ ID NO: 1) que comprende una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende un marco VH derivado de secuencias marco de IGHV3-23 (SEQ ID NO: 158), IGHV1-24*01 (SEQ ID NO: 148) o IGHV1-f*01 (SEQ ID NO: 149) humanas, y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende un marco VL derivado de secuencias marco IGKV3-11 (L6) (SEQ ID NO: 159), IGKV3-15*01 (L2) (SEQ ID NO: 150), IGKV1-9*01 (L8) (SEQ ID NO: 151), IGKV1 -5*01 (L12) (SEQ ID NO: 152), IGKV1-12*01 (L5) (SEQ ID NO: 153), IGKV1-39*01 (012) (SEQ ID NO: 154), IGKV1-27*01 (A20) (SEQ ID NO: 155) o IGKV1-33*01 (018) (SEQ ID NO: 156) humanas.
En otro caso, el anticuerpo aislado que se une específicamente al Dominio I de ST2L humano como se describe en la presente comprende una VH que comprende un marco de VH derivado de secuencias marco VH 3-23 humanas (SEQ ID NO: 158); y una región variable de cadena ligera (VL) que comprende un marco de VL derivado de secuencias marco Vk L6 humanas (SEQ ID NO: 159). Las secuencias marco humanas son bien conocidas, y típicamente incluyen secuencias de la región variable de la línea germinal de inmunoglobulina humana unidas a las secuencias de unión (J). La secuencia de aminoácidos marco VH 3-23 humana que se muestra en la SEQ ID NO: 158 incluye la secuencia de VH 3-23 de la línea germinal humana unida a IGHJ4 y la secuencia de aminoácidos de marco de Vk L6 humana mostrada en la SEQ ID NO: 159 incluye la secuencia de la línea germinal Vk L6 humana unida a IGKJ1 como se describe en Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010; Publicación de Patente Internacional N° WO2009/085462; y Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2010/0021477. Los anticuerpos que tienen una secuencia de VH derivada de VH 3-23 humano y una secuencia de VL derivada de Vk L6 humano son los que se muestran en la Figura 12 y la Figura 13.
Los anticuerpos humanos o adaptados a humanos que comprenden regiones variables de la cadena pesada o ligera "derivadas de" un marco particular o secuencia de línea germinal se refieren a anticuerpos obtenidos de un sistema que usa genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana, como de ratones transgénicos o de bibliotecas de presentación de fagos como se trata más adelante. Un anticuerpo que se "deriva de" un marco o secuencia de línea germinal particular puede contener diferencias de aminoácidos en comparación con la secuencia de la que se deriva, debido, por ejemplo, a mutaciones somáticas de origen natural o sustituciones intencionadas.
En otro caso, el antagonista de anticuerpo humano o adaptado a humanos aislado o fragmento del mismo que se une específicamente al Dominio I (SEQ ID NO: 9) de ST2L humano como se describe en la presente compite por la unión a ST2L humano (SEQ ID NO: 1) con un anticuerpo aislado que comprende una región variable de cadena pesada (VH) de la SEQ ID NO: 47 y una región variable de cadena ligera (VL) de la SEQ ID NO: 51 (anticuerpo C2244).
En otro caso, un anticuerpo aislado divulgado en la presente se une a ST2L humano en los residuos de aminoácidos 35-48 de la SEQ ID No : 1 (RCPRQGKPSYTVdW; SEQ ID NO: 210). El anticuerpo como se describe en la presente puede unirse además a ST2L humano en los residuos de aminoácidos T93 y F94 de la SEQ ID NO: 1.
La competencia entre la unión específica a ST2L humano con anticuerpos de la invención como se describe en la presente que comprenden ciertas secuencias de aminoácidos de HCDR1, HCDR2 y HCDR3, y LCDR1, LCDR2 y LCDR3 o que comprenden ciertas secuencias de VH y VL puede ensayarse in vitro usando métodos bien conocidos. Por ejemplo, la unión del anticuerpo marcado con el éster NHS Sulfo-Tag™ de MSD a ST2L humano en presencia de un anticuerpo no marcado puede evaluarse mediante ELISA, o pueden usarse análisis de Biacore o citometría de flujo para demostrar la competencia con los anticuerpos de la presente. La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir la unión de C2244 a ST2L humano demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con estos anticuerpos para unirse a ST2L humano. Tales anticuerpos ejemplares son C2494, STLM208 y STLM213 mostrados en la Tabla 3 y la Figura 13.
Los anticuerpos que compiten con C2244 para unirse al Dominio I de ST2L como se describe en la presente bloquean la interacción de IL-33/ST2L e inhiben un espectro de las actividades biológicas de ST2L, incluyendo las respuestas de mastocitos inducidas por IL-33. También está presente un epítopo no neutralizante (es decir, no inhibidor) en el Dominio I de ST2L, como un segundo grupo de competencia de anticuerpos (representado por el anticuerpo C2240 que se une al Dominio I de ST2L, no compite con C2244 y no inhibe la señalización de ST2L).
Los anticuerpos como se describen en la presente de unión a dominios o epítopos de ST2L específicos pueden elaborarse inmunizando ratones que expresan loci de inmunoglobulina humana (Lonberg et al., Nature 368:856-9, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51, 1996; Mendez et al., Nature Genetics 15:146-56, 1997, Patentes de Estados Unidos N° 5.770.429, 7.041.870 y 5.939.598) o ratones Balb/c con los péptidos que codifican los epítopos, por ejemplo un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos del Dominio I de ST2L humano:
KFSKQSWGLENEALIVRCPRQGKPSYTVDWYYSQTNKSIPTQERNRVFASGQLLKFLPAAV
ADSGIYTCIVRSPTFNRTGYANVTIYKKQSDCNVPDYLMYSTV (SEQ ID NO: 9),
o un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos de RCPRQGKPSYTVDW (SEQ ID NO: 210), y que usa el método de hibridoma de Kohler et al., Nature 256:495-97, 1975. Los anticuerpos resultantes se prueban para su unión al epítopo usando métodos estándar. Por ejemplo, cuando se conocen las estructuras de ambos componentes individuales, se puede llevar a cabo el acoplamiento proteína-proteína in silico para identificar sitios compatibles de interacción. El intercambio de hidrógeno-deuterio (H/D) puede llevarse a cabo con el complejo de antígeno y anticuerpo para mapear regiones en el antígeno a las que se puede unir el anticuerpo. La mutagénesis segmentaria y puntual del antígeno puede usarse para localizar aminoácidos importantes para la unión de anticuerpos. Los mAbs identificados pueden modificarse adicionalmente incorporando residuos de soporte de marco alterados para preservar la afinidad de unión mediante técnicas como las divulgadas en Queen et al., Proc Natl Acad Sci (USA) 86:10029-32, 1989 y Hodgson et al., Bio/Technology 9:421, 1991.
Los anticuerpos de la invención como se describen en la presente pueden ser humanos o adaptados a humanos. Los anticuerpos de la invención como se describen en la presente pueden ser de tipo IgA, IgD, IgE, IgG o IgM.
También se divulgan anticuerpos cuyas secuencias de aminoácidos del sitio de unión al antígeno son sustancialmente idénticas a las mostradas en la Figura 10, Figura 11, Figura 12, Figura 13, Figura 15, Tabla 3, Tabla 9 y Tabla 12. Típicamente, esto implica una o más sustituciones de aminoácidos con un aminoácido que tiene una carga o características hidrofóbicas o estereoquímicas similares, y está hecho para mejorar las propiedades del anticuerpo, por ejemplo, estabilidad o afinidad. Por ejemplo, una sustitución conservadora puede implicar una sustitución de un residuo de aminoácido nativo con un residuo no nativo de tal manera que haya poco o ningún efecto sobre la polaridad o carga del residuo de aminoácido en esa posición. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido también puede sustituirse con alanina, como se ha descrito anteriormente para la mutagénesis de exploración de alanina (MacLennan et al., Acta Physiol Scand Suppl 643:55-67, 1998; Sasaki et al., Adv Biophys 35:1-24, 1998). Los expertos en la técnica pueden determinar las sustituciones de aminoácidos deseadas (ya sean conservadoras o no conservadoras) en el momento en el que se deseen tales sustituciones. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos pueden usarse para identificar residuos importantes para la función de los anticuerpos, como los residuos que afectan la afinidad, o los residuos que imparten propiedades indeseables como agregación. Ejemplos de sustituciones de aminoácidos se muestran en la Figura 12 y la Figura 13.
Las sustituciones en las regiones marco, al contrario que los sitios de unión al antígeno, también pueden realizarse siempre que no afecten adversamente a las propiedades del anticuerpo. Se pueden realizar sustituciones de marco, por ejemplo, en los residuos de la zona Vernier (Patente de Estados Unidos N° 6.649.055) para mejorar la afinidad o estabilidad del anticuerpo. Las sustituciones también pueden hacerse en esas posiciones marco en el anticuerpo que difieren en la secuencia cuando se comparan con las secuencias del gen de la línea germinal humana homóloga para reducir la posible inmunogenicidad. Estas modificaciones pueden hacerse, por ejemplo, a anticuerpos derivados de bibliotecas de anticuerpos de novo, como bibliotecas pIX.
Las sustituciones de aminoácidos conservadoras también abarcan residuos de aminoácidos de origen no natural que se incorporan típicamente por síntesis química de péptidos en lugar de por síntesis en sistemas biológicos. Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse, por ejemplo, mediante mutagénesis por PCR (Patente de Estados Unidos N° 4.683.195) Las bibliotecas de variantes pueden generarse usando métodos bien conocidos, por ejemplo, usando codones aleatorios (NNK) o no aleatorios, por ejemplo codones DVK, que codifican 11 aminoácidos (ACDEGKNRSYW), y seleccionando las bibliotecas o variantes con las propiedades deseadas.
Aunque las realizaciones ilustradas en los Ejemplos comprenden pares de regiones variables, pares de cadenas de anticuerpos de longitud completa, o pares de regiones CDR1, CDR2 y CDR3, una de una cadena pesada y otra de una cadena ligera, un experto en la técnica reconocerá que casos alternativos pueden comprender regiones variables de cadena pesada individuales o regiones variables de cadena ligera individuales, cadenas de anticuerpo de longitud completa individuales, o regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de una cadena de anticuerpo, ya sea pesada o ligera. La región variable individual, la cadena de anticuerpo de longitud completa o la región CDR1, CDR2 y CDR3 de una cadena pueden usarse para detectar dominios correspondientes en otra cadena, las dos cadenas siendo capaces de formar un anticuerpo que se une específicamente a ST2L. La selección puede realizarse mediante métodos de selección de presentación en fagos usando, por ejemplo, un enfoque combinatorio dual jerárquico divulgado en la Publicación de PCT N° WO1992/01047. En este enfoque, se usa una colonia individual que contiene un clon de cadena H o L para infectar una biblioteca completa de clones que codifican la otra cadena (L o H), y el dominio de unión al antígeno específico de dos cadenas resultante se selecciona de acuerdo con técnicas de presentación de fagos como se describe.
En la presente se divulgan dominios de VH y VL aislados de los anticuerpos divulgados en la presente y anticuerpos que comprenden ciertos dominios de VH y VL. Las regiones variables VH y VL para ciertos anticuerpos divulgados en la presente se muestran en la Figura 13 y la Tabla 12.
En la presente se divulga un antagonista de anticuerpo humano o adaptado a humanos aislado o un fragmento del mismo que se une específicamente al Dominio I (SEQ ID NO: 9) de ST2L humano que comprende la
VH por lo menos un 90% idéntica a la VH de la SEQ ID NO: 191.
También se divulga en la presente un antagonista de anticuerpo humano o adaptado a humanos aislado o un fragmento del mismo que se une específicamente al Dominio I (SEQ ID NO: 9) de ST2L humano que comprende la VL por lo menos un 94% idéntica a la VL de la SEQ ID NO: 209.
También se divulga en la presente un anticuerpo que comprende la VH de las SEQ ID NO: 143, 144, 145, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204 o 205.
También se divulga en la presente un anticuerpo que comprende la VL de las SEQ ID NO: 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 206, 207, 208 o 209.
También se divulga en la presente un anticuerpo que comprende
la VH de las SEQ ID NO: 186, 187, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204 o 205 y la VL de la SEQ ID NO:
206;
la VH de las SEQ ID NO: 195 o 196 y la VL de la SEQ ID NO: 207;
la VH de las SEQ ID NO: 188, 189 o 190 y la VL de la SEQ ID NO: 208; o
la VH de las SEQ ID NO: 187, 192, 193 o 194 y la VL de la SEQ ID NO: 209.
También se divulga en la presente un antagonista de anticuerpo humano o adaptado a humanos aislado o fragmento del mismo que se une específicamente al Dominio I (SEQ ID NO: 9) de ST2L humano que comprende:
la HCDR1 de la SEQ ID NO: 97;
la HCDR2 de la SEQ ID NO: 114;
la HCDR3 de la SEQ ID NO: 84;
la LCDR1 de la SEQ ID NO: 130;
la LCDR2 de la SEQ ID NO: 90;
la LCDR3 de la SEQ ID NO: 134.
La invención proporciona un anticuerpo que comprende la VH de la SEQ ID NO: 191 y la VL de la SEQ ID
NO: 209.
Los mAbs humanos que carecen de secuencias no humanas pueden prepararse y optimizarse a partir de bibliotecas de presentación en fagos mediante técnicas referenciadas en, por ejemplo, Knappik et al., J Mol Biol 296:57-86, 2000; y Krebs et al., J Immunol Meth 254:67-84 2001. En un método ejemplar, los anticuerpos de la invención se aíslan de bibliotecas que expresan regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpos como proteínas de fusión con proteína de recubrimiento pIX del bacteriófago. Las bibliotecas de anticuerpos se seleccionan para la unión a ECD de ST2L humano y los clones positivos obtenidos se caracterizan adicionalmente, los Fab se aíslan de los lisados de clones. y se expresan como IgG de longitud completa. Bibliotecas de anticuerpos ejemplares y métodos de detección se describen en Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010; Publicación de Patente Internacional N° WO2009/085462 y N° de Serie de Estados Unidos 12/546850; Patentes de Estados Unidos N° 5.223.409, 5.969.108 y 5.885.793)
Los mAbs resultantes pueden modificarse adicionalmente en sus regiones marco para cambiar ciertos residuos marco a los presentes en una línea germinal humana coincidente.
Las propiedades efectoras inmunitarias de los anticuerpos de la invención pueden potenciarse o silenciarse mediante modificaciones de Fc por técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las funciones efectoras de Fc como la unión a C1q, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis, la regulación por disminución de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B; BCR), etc. se proporcionará y/o controlará modificando los residuos en el Fc responsable de estas actividades. Las propiedades farmacocinéticas también podrían mejorarse mutando residuos en el dominio de Fc que extienden la vida media de los anticuerpos (Strohl Curr Opin Biotechnol 20:685-91, 2009). Las modificaciones ejemplares de Fc son IgG4 S228P/L234A/L235A, IgG2 M252Y/S254T/T256E (Dall'Acqua et al., J Biol Chem 281:23514-24, 2006; o IgG2 V234A/G237A/P238S, V234A/G237A/H268Q, H268A/V309L/A330S/P331 o V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S en IgG2 (Solicitud de Patente Internacional N° WO2011/066501) (numeración de acuerdo con la numeración de la EU).
Además, los anticuerpos de la invención como se describen en la presente pueden modificarse postraduccionalmente mediante procesos como glicosilación, isomerización, desglicosilación o modificación covalente no natural, como la adición de fracciones de polietilenglicol (pegilación) y lipidación. Tales modificaciones pueden tener lugar in vivo o in vitro. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención como se describen en la presente pueden conjugarse con polietilenglicol (PEGilarse) para mejorar sus perfiles farmacocinéticos. La conjugación puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Se ha demostrado que la conjugación de anticuerpos terapéuticos con PEG mejora la farmacodinámica sin interferir con la función (Knigh et al., Platelets 15:409-18, 2004;Leong et al., Cytokine 16:106-19, 2001; Yang et al., Protein Eng 16:761-70, 2003).
Los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención como se describe en la presente modificados para mejorar la estabilidad, selectividad, reactividad cruzada, afinidad, inmunogenicidad u otra propiedad biológica o biofísica deseable están dentro del alcance de la invención. La estabilidad de un anticuerpo está influenciada por una serie de factores, que incluyen (1) empaquetamiento del núcleo de dominios individuales que afecta a su estabilidad intrínseca, (2) interacciones de la interfaz proteína/proteína que tienen un impacto sobre el emparejamiento de HC y LC, (3) entierro de residuos polares y cargados, (4) red de unión en H para residuos polares y cargados; y (5) carga superficial y distribución de residuos polares entre otras fuerzas intra- e intermoleculares (Worn et al., J Mol Biol 305:989-1010, 2001) Los residuos desestabilizadores de la estructura potenciales pueden identificarse en base a la estructura cristalina del anticuerpo o mediante modelado molecular en ciertos casos, y el efecto de los residuos sobre la estabilidad del anticuerpo puede probarse generando y evaluando variantes que albergan mutaciones en los residuos identificados. Una de las maneras de aumentar la estabilidad de los anticuerpos es elevar el punto medio de transición térmica (Tm) medido por calorimetría diferencial de barrido (DSC). En general, la proteína Tm está correlacionada con su estabilidad e inversamente correlacionada con su susceptibilidad al despliegue y la desnaturalización en solución y los procesos de degradación que dependen de la tendencia de la proteína a desplegarse (Remmele et al., Biopharm 13:36-46, 2000). Una serie de estudios han encontrado correlación entre la clasificación de la estabilidad física de las formulaciones medida como estabilidad térmica por DSC y la estabilidad física medida por otros métodos (Gupta et al., AAPS PharmSci 5E8, 2003; Zhang et al., J Pharm Sci 93:3076-89, 2004; Maa et al., Int J Pharm 140:155-68, 1996; Bedu-Addo et al., Pharm Res 21:1353-61, 2004; Remmele et al., Pharm Res 15:200 -8, 1997). Los estudios de formulación sugieren que un Tm de Fab tiene implicaciones para la estabilidad física a largo plazo de un mAb correspondiente. Las diferencias en los aminoácidos en cualquier marco o dentro de las CDR podrían tener efectos significativos sobre la estabilidad térmica del dominio de Fab (Yasui et al., FEBS Lett 353:143-6, 1994)
Los anticuerpos de la invención que se unen específicamente al Dominio I de ST2L humano como se describe en la presente pueden diseñarse en anticuerpos biespecíficos que también están abarcados dentro del alcance de la invención. Las regiones VL y/o VH de los anticuerpos de la invención pueden diseñarse usando métodos publicados en anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla como estructuras como diseños TandAb® (Publicación de Patente Internacional N° WO1999/57150; Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2011/0206672) o en scFV biespecíficos como estructuras como las divulgadas en la Patente de Estados Unidos N° US5869620; Publicación de Patente Internacional N° WO1995/15388A, Publicación de Patente Internacional N° WO1997/14719 o Publicación de Patente Internacional N° WO2011/036460.
Las regiones VL y/o VH de los anticuerpos de la invención como se describe en la presente pueden diseñarse en anticuerpos de longitud completa biespecíficos, donde cada brazo de anticuerpo se une a un antígeno o epítopo distinto. Tales anticuerpos biespecíficos se elaboran típicamente modulando las interacciones de CH3 entre las dos cadenas pesadas de anticuerpos para formar anticuerpos biespecíficos usando tecnologías como las descritas en la Patente de Estados Unidos N° US7695936; Publicación de Patente Internacional N° WO04/111233; Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2010/0015133; Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2007/0287170; Publicación de Patente Internacional N° WO2008/119353; Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2009/0182127; Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2010/0286374; Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2011/0123532; Publicación de Patente Internacional N° WO2011/131746; Publicación de Patente Internacional N° WO2011/143545; o la Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2012/0149876. Las estructuras biespecíficas adicionales en las que pueden incorporarse las regiones VL y/o VH de los anticuerpos de la invención son, por ejemplo, inmunoglobulinas de dominio variable dual (Publicación de Patente Internacional N° WO2009/134776), o estructuras que incluyen varios dominios de dimerización para conectar los dos brazos de anticuerpos con diferente especificidad, como la cremallera de leucina o los dominios de dimerización de colágeno (Publicación de Patente Internacional N° WO2012/022811, Patente de Estados Unidos N° US5932448; Patente de Estados Unidos N° US6833441)
Otro aspecto de la invención es un polinucleótido aislado que codifica cualquiera de las regiones variables de la cadena pesada del anticuerpo o las regiones variables de la cadena ligera del anticuerpo o fragmentos de las mismas de la invención o su complemento. En la presente se divulgan ciertos polinucleótidos ejemplares, sin embargo, otros polinucleótidos que, dada la degeneración del código genético o las preferencias de codones en un sistema de expresión dado, codifican los antagonistas de anticuerpos de la invención también están dentro del alcance de la invención. Los polinucleótidos ejemplares de la divulgación son los mostrados en las SEQ ID NO: 211, 212, 213 y 214.
Otra realización de la invención es un vector que comprende el polinucleótido de la invención. Tales vectores pueden ser vectores plasmídicos, vectores virales, vectores para la expresión de baculovirus, vectores basados en transposones o cualquier otro vector adecuado para la introducción de los polinucleótidos de la invención en un organismo o antecedentes genéticos dados por cualquier medio.
Otra realización de la invención es una célula huésped que comprende el polinucleótido de la invención. Tales células huésped pueden ser células eucariotas, células bacterianas, células vegetales o células arqueales. Las células eucariotas ejemplares pueden ser de origen mamífero, de insecto, aviar u otro animal. Las células eucariotas de mamíferos incluyen líneas celulares inmortalizadas como hibridomas o líneas celulares de mieloma como SP2/0 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, CRL-1581), NS0 (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, Reino Unido, ECACC N° 85110503), líneas celulares murinas FO (ATCC CRL-1646) y Ag653 (ATCC c Rl-1580). Una línea celular de mieloma humana ejemplar es la U266 (ATTC c Rl-TIB-196). Otras líneas celulares útiles incluyen las derivadas de células de ovario de hámster chino (CHO) como CHO-K1SV (Lonza Biologics, Walkersville, MD), CHO-K1 (ATCC CRL-61) o DG44.
Otra realización de la invención es un método para producir un anticuerpo que se une específicamente al Dominio I de ST2L, que comprende cultivar una célula huésped de la invención y recuperar el anticuerpo producido por la célula huésped. Los métodos para elaborar anticuerpos y purificarlos son bien conocidos en la técnica.
Otra realización de la invención es un anticuerpo de la invención para su uso en un método para inhibir la interacción de ST2L con IL-33 en un sujeto que comprende administrar al sujeto un anticuerpo de la invención que se une específicamente al dominio I de ST2L en una cantidad suficiente para inhibir la interacción de ST2L e IL-33.
Métodos de tratamiento
Los antagonistas de ST2L divulgados en la presente, por ejemplo, los antagonistas de anticuerpos de ST2L que bloquean la interacción de IL-33/ST2L y se unen al Dominio I de ST2L, los anticuerpos que compiten por la unión a ST2L humano (SEQ ID NO: 1) con un anticuerpo aislado que comprende una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 47 y una región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 51, o los anticuerpos de unión a ST2L humano en los residuos de aminoácidos 35-48 de la SEQ ID NO: 1 (RCPRQGKPSYTVDW; SEQ ID NO: 210) pueden utilizarse para modular el sistema inmune. Los anticuerpos de la invención como se describe en la presente pueden ser más eficientes para antagonizar la actividad biológica de ST2L en comparación con los anticuerpos que se unen a otros dominios y/o regiones en ST2L ya que los anticuerpos de la invención son capaces de reducir de manera más eficiente las respuestas de mastocitos inducidas por IL-33. Cualquier anticuerpo de la invención puede usarse en los métodos de la invención. Los anticuerpos ejemplares de la divulgación que pueden usarse en los métodos divulgados en la presente son los anticuerpos STLM62, STLM15, STLM103, STLM107, STLM108, STLM123, STLM124, STLM206, STLM207, STLM208, STLM209, STLM210, STLM211, STLM212, STLM213. Sin desear estar limitados por ninguna teoría, se sugiere que los antagonistas de anticuerpos de unión al Dominio I y que bloquean la interacción de IL-33/ST2L pueden inhibir la formación del complejo IL-1RAcP/IL-33/ST2L/cKit o la señalización en sentido descendente en los mastocitos, mientras que los anticuerpos que se unen al Dominio III, aunque son capaces de inhibir el reclutamiento de IL-1RAcP al complejo de ST2L/IL-33, pueden ser incapaces de interrumpir la formación del complejo IL-1RAcP/IL-33/ST2L/cKit más grande encontrado específicamente en los mastocitos. El análisis de micromatrices realizado respalda la sugerencia, ya que se demostró que los anticuerpos de unión al dominio I anti-ST2L suprimían la mayoría de las vías de señalización de mastocitos inducidas por IL-33, y los anticuerpos de unión al dominio III anti-ST2L solo fueron capaces de inhibir un pequeño subconjunto de estas vías de señalización. Es factible que debido a que IL-33 se une a ST2L antes de la asociación de la proteína accesoria IL-1RAcP, el bloqueo de la unión de IL-33 a ST2L por los anticuerpos de unión al dominio I podría prevenir la asociación de cualquier otra proteína accesoria, incluyendo cKit o correceptores todavía sin identificar. Los anticuerpos de unión al dominio III, que no interfieren con la unión de IL-33 a ST2L, podrían teóricamente bloquear la asociación de IL-1RAcP pero no la asociación de otros correceptores, incluidos los correceptores aún no identificados. Se han propuesto múltiples modelos para ver como interactúa IL-1RAcp con los complejos IL-1/IL-1R o ST2L/IL-33 (Lingel et al., Structure 17: 1398-1410, 2009; y revisado por Thomas et al., Nat Struct & Molec Biol 19: 455-457, 2012). Estos modelos indican que IL-1RAcP podría unirse a un lado del complejo, pero qué lado no se ha demostrado de manera concluyente. Por lo tanto, es factible que el 'otro lado' o el 'lado libre' del complejo esté disponible para su asociación con un correceptor alternativo, que no estaría bloqueado por un anticuerpo del Dominio III, y son posibles efectos fuera del objetivo, como un reclutamiento aumentado de otro correceptor, dando como resultado una señalización aumentada.
En los métodos de la presente divulgación, puede usarse cualquier antagonista de anticuerpo que se une específicamente al Dominio I de ST2L humano, el antagonista de anticuerpo que bloquea la interacción de IL-33/ST2L y se une al Dominio I de ST2L humano, anticuerpos que compiten por la unión a ST2L humano (SEQ ID NO: 1) con un anticuerpo aislado que comprende una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 47 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 51, o anticuerpos de unión a ST2L humano en los residuos de aminoácidos 35-48 de la SEQ ID NO: 1 (RCPRQGKPSYTVDW; SeQ ID NO: 210). Las características adicionales de tales anticuerpos incluyen la capacidad del anticuerpo para bloquear la interacción de IL-33/ST2L e inhibir las respuestas de los mastocitos humanos.
Por lo tanto, los anticuerpos de la invención son adecuados para tratar un espectro de afecciones mediadas por ST2L, afecciones inflamatorias mediadas por ST2L y afecciones en las que se desea la inhibición de las respuestas de mastocitos.
Los métodos de la invención pueden usarse para tratar un paciente animal que pertenezca a cualquier clasificación. Ejemplos de tales animales incluyen mamíferos como humanos, roedores, perros, gatos y animales de granja. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención son útiles en la profilaxis y el tratamiento de afecciones mediadas por ST2L como enfermedades inflamatorias que incluyen asma, hiperreactividad de las vías respiratorias, sarcoidosis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis pulmonar idiopática (FPI), fibrosis quística, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), artritis reumatoide, esofagitis eosinofílica, esclerodermia, dermatitis atópica, rinitis alérgica, penfigoide ampolloso, urticaria crónica, nefropatía diabética, cistitis intersticial o enfermedad de injerto contra huésped (EICH). Los anticuerpos de la invención son útiles en la profilaxis y el tratamiento de enfermedades inmunes mediadas por lo menos en parto por mastocitos como asma, eccema, picazón, rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, así como enfermedades autoinmunes como artritis reumatoide, penfigoide ampolloso y la esclerosis múltiple.
Los anticuerpos de la invención también son útiles en la preparación de un medicamento para dicho tratamiento, en donde el medicamento se prepara para la administración en dosificaciones definidas en la presente.
Los mastocitos desempeñan un papel central en la inflamación alérgica y el asma a través de la liberación de una variedad de mediadores (revisado por Amin, Respir Med 106:9-14, 2012). ST2L se expresa altamente en los mastocitos y su activación lleva a la expresión de muchas citoquinas proinflamatorias y otros mediadores. Se propone la inhibición de la actividad de ST2L para interferir con el reclutamiento de células inflamatorias mediada por mastocitos y para modular la inflamación crónica.
Los mastocitos son respondedores rápidos a la estimulación, incluyendo los alérgenos, el aire frío, patógenos; el daño al epitelio por estos estímulos puede provocar la liberación de IL-33 (revisado por Zhao y Hu, Cell & Molec Immunol 7:260-2, 2012). Los mastocitos liberan leucotrienos, histamina, prostaglandinas y citoquinas para aumentar la permeabilidad vascular y la broncoconstricción, y reclutan otras células inmunes como neutrófilos, eosinófilos y linfocitos T al sitio (Henderson et al., JEM 184: 1483-94, 1996; White et al., JACI 86: 599-605, 1990). Además, mejoran las respuestas inmunes al inducir la regulación por incremento de la molécula de adhesión en las células endoteliales para aumentar el tráfico de células inmunes (Meng et al., J Cell Physiol 165:40-53, 1995) Los mastocitos desempeñan un papel importante en la remodelación de las vías respiratorias; en asmáticos, se encuentra un mayor número de mastocitos dentro de la capa celular del músculo liso de las vías respiratorias (ASM) y secretan mediadores para promover la proliferación de ASM (revisado por Okayama et al., Curr Opin Immunol 19:687-93, 2007).
La afección pulmonar inflamatoria es un ejemplo de afección inflamatoria. Las afecciones pulmonares inflamatorias ejemplares incluyen afecciones pulmonares inducidas por infección, incluyendo aquellas asociadas con infecciones virales, bacterianas, fúngicas, parasitarias o de priones; afecciones pulmonares inducidas por alérgenos; afecciones pulmonares inducidas por contaminantes como asbestosis, silicosis o beriliosis; afecciones pulmonares inducidas por aspiración gástrica, desregulación inmune, afecciones inflamatorias con predisposición genética como fibrosis quística, y afecciones pulmonares inducidas por traumas físicos como lesiones por respiradores. Estas afecciones inflamatorias también incluyen asma, enfisema, bronquitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), sarcoidosis, histiocitosis, linfangiomiomatosis, lesión pulmonar aguda, síndrome de dificultad respiratoria aguda, enfermedad pulmonar crónica, displasia broncopulmonar, neumonía adquirida en la comunidad, neumonía nosocomial, neumonía asociada a respiradores, sepsis, neumonía viral, infección por influenza, infección por parainfluenza, infección por rotavirus, infección por metapneumovirus humano, infección por virus respiratorio sincitial, y Aspergillus u otras infecciones por hongos. Las enfermedades inflamatorias asociadas a la infección ejemplares pueden incluir neumonía viral o bacteriana, que incluyen neumonía grave, fibrosis quística, bronquitis, exacerbaciones de las vías respiratorias y síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA). Tales afecciones asociadas a infecciones pueden implicar múltiples infecciones, como una infección viral primaria y una infección bacteriana secundaria. La señalización de ST2L desregulada puede desempeñar un papel en la patología de enfermedades pulmonares como el asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) (revisado en Alcorn et al., Annu Rev Physiol 72: 495-516, 2010). Los modelos animales usados comúnmente para el asma y la inflamación de las vías respiratorias incluyen el modelo de desafío de ovoalbúmina, los modelos de sensibilización con metacolina y la sensibilización con Aspergillus fumigatus (Hessel et al., Eur J Pharmacol 293:401-12, 1995). También puede usarse la inhibición de la producción de citoquinas y quimiocinas a partir de células epiteliales bronquiales humanas cultivadas, fibroblastos bronquiales o células de músculo liso de las vías respiratorias como modelos in vitro. La administración de antagonistas de la presente invención a cualquiera de estos modelos puede usarse para evaluar el uso de esos antagonistas para mejorar los síntomas y alterar el curso del asma, la inflamación de las vías respiratorias, la EPOC y similares.
El asma es una enfermedad inflamatoria del pulmón que se caracteriza por hiperreactividad de las vías respiratorias ("AHR"), broncoconstricción, sibilancias, inflamación eosinofílica o neutrofílica, hipersecreción de moco, fibrosis subepitelial y niveles elevados de IgE. Los pacientes con asma experimentan "exacerbaciones", un empeoramiento de los síntomas, más comúnmente debido a infecciones microbianas del tracto respiratorio (por ejemplo, rinovirus, virus de la gripe, influenza Haemophilus, etc.). Los ataques asmáticos pueden desencadenarse por factores ambientales (por ejemplo, ascaridos, insectos, animales (por ejemplo, gatos, perros, conejos, ratones, ratas, hámsteres, conejillos de indias y pájaros), hongos, contaminantes del aire (por ejemplo., humo de tabaco), gases irritantes, humos, vapores, aerosoles, productos químicos, polen, ejercicio, o aire frío. Además del asma, varias enfermedades inflamatorias crónicas que afectan el pulmón se caracterizan por infiltración de neutrófilos en las vías respiratorias, por ejemplo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), neumonía bacteriana y fibrosis quística (Linden et al., Eur Respir J 15:973-7, 2000; Rahman et al., Clin Immunol 115:268-76, 2005), y enfermedades como la EPOC, la rinitis alérgica y la fibrosis quística se caracterizan por la hiperreactividad de las vías respiratorias (Fahy y O'Byrne, Am J Respir Crit Care Med 163:822-3, 2001). Los modelos animales comúnmente usados para el asma y la inflamación de las vías respiratorias incluyen el modelo de desafío con metacolina después de la sensibilización y el desafío con ovoalbúmina (Hessel et al., Eur J Pharmacol 293:401-12, 1995). También pueden usarse como modelos in vitro la inhibición de la producción de citoquinas y quimiocinas de células epiteliales bronquiales humanas cultivadas, fibroblastos bronquiales o células de músculo liso de las vías respiratorias. La administración de antagonistas de anticuerpos de la presente invención a cualquiera de estos modelos puede usarse para evaluar el uso de esos antagonistas para mejorar los síntomas y alterar el curso del asma, la inflamación de las vías respiratorias, la EPOC y similares.
La señalización de IL-33 a través del receptor de ST2L en células TH2, basófilos, mastocitos y las células linfoides innatas de tipo 2 recientemente descritas da como resultado la secreción de IL-5 e IL-13 (citoquina tipo 2) (ILC revisadas por Spits et al., Nature Reviews Immunology 13:145-149, 2013). Los efectos beneficiosos de los agentes terapéuticos dirigidos a IL-5 o IL-13 en el asma confirman la relevancia de estas vías. La IL-5 activa los eosinófilos, y el tratamiento de un subgrupo de asmáticos graves con eosinofilia del esputo con un anticuerpo monoclonal que neutraliza la IL-5 dio como resultado menos exacerbaciones (Nair et al. N Engl J Med. 2009; 360(10): 985-93). Se informa que IL-13 contribuye a la síntesis de IgE, secreción de moco y fibrosis. El tratamiento de los asmáticos graves con un anticuerpo monoclonal anti-IL-13 dio como resultado una mejora en la función pulmonar, con un subgrupo que demostró una mejoría mayor (Corren et al., N. Engl. J. Med., 365:1088-1098, 2011) Otros mediadores de las vías inmunológicas diferenciales también están implicados en la patogénesis del asma, y el bloqueo de estos mediadores, además de ST2L, pueden ofrecer un beneficio terapéutico adicional. Las terapias dirigidas a múltiples citoquinas tipo 2, o vías en sentido ascendente de la producción de citoquinas tipo 2, podrían ser beneficiosas en la enfermedad grave.
Los dominios de VH y VL de los anticuerpos de ST2L de la invención pueden incorporarse en los anticuerpos y moléculas biespecíficos descritos en la presente, en los que el anticuerpo biespecífico se une específicamente al Dominio I de ST2L y un segundo antígeno como TSLP (linfoma de estroma tímico), IL- 25, IL-17RB o TSLPR.
IL-25 y TSLP, como IL-33, desencadenan la liberación de citoquinas tipo 2 a través de complejos de señalización distintos: IL-25 (IL-17E) es un miembro de la familia IL-17 y señala a través de IL-17RA/IL-17RB, y TSLP es miembro de la familia IL-7 y señala a través de los heterodímeros TSLPR/IL-7Ra (revisado por Koyasu et al., Immunol 132: 475-481, 2011) Los animales deficientes en IL-33, ST2L, IL-25, IL-17RB, TSLP o TSLPR demuestran inflamación de las vías respiratorias menos grave en por lo menos uno de los muchos tipos diferentes de modelos de ratón de asma; sin embargo, la falta de protección contra la inflamación de las vías respiratorias puede estar presente en la mayoría de estos modelos animales, aumentando la posibilidad de que la exposición del epitelio a varios alérgenos o patógenos pueda desencadenar la liberación de IL-33, IL-25 y TSLP concomitantemente. Hammad et al. informaron que la administración de extracto de ácaros del polvo doméstico a ratones dio como resultado la liberación de IL-25, TSLP e IL-33 (así como IL-5 e IL-13 en sentido descendente de IL-33) en las vías respiratorias (Hammad et al., Nat Med 15:210-216, 2009). Esto sugiere que el bloqueo de ST2L y TSLP y/o IL-25 puede tener efectos beneficiosos, particularmente en enfermedades de las vías respiratorias graves.
En otra realización de la invención, pueden usarse antagonistas de anticuerpos que se unen específicamente al Dominio I de ST2L humano para generar moléculas biespecíficas de unión a ST2L y TSLP, ST2L e IL-25, ST2L y TSLPR, ST2L e IL-17RA, o ST2L e IL- 17RB.
En otra realización de la invención, los antagonistas de anticuerpos que se unen específicamente al Dominio I de ST2L humano es un anticuerpo biespecífico, en donde el anticuerpo se une además a TSLP, IL-25, TSLPR, IL-17RA o IL-17RB.
Los anticuerpos de unión a TSLP, IL-25, TSLPR, IL-17RA e IL-17RB pueden generarse usando los métodos descritos en la presente, como inmunizando ratones que expresan loci de inmunoglobulina humana (Lonberg et al., Nature 368:856-9, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51, 1996; Mendez et al., Nature Genetics 15:146-56, 1997, Patentes de Estados Unidos N° 5.770.429, 7.041.870 y 5,939,598) o ratones Balb/c con las proteínas correspondientes o dominios extracelulares de las proteínas, o usando bibliotecas de presentación de fagos como se describe en la presente. Alternativamente, pueden usarse anticuerpos existentes contra TSLP, IL-25, TSLPR, IL-17RA e IL-17RB para generar las moléculas biespecíficas. Los anticuerpos de IL-25 ejemplares que pueden usarse son los descritos, por ejemplo, en la Publicación de Patente Internacional N° WO2011/123507.
La artritis, incluyendo la osteoartritis, artritis reumatoide, articulaciones artríticas como resultado de lesión, y similares, son afecciones inflamatorias comunes, que se beneficiarían del uso terapéutico de proteínas antiinflamatorias, como los antagonistas de la presente invención. La activación de la señalización de ST2l puede perpetuar la inflamación y un mayor daño tisular en la articulación inflamada. Se conocen varios modelos animales para la artritis reumatoide. Por ejemplo, en el modelo de artritis inducida por colágeno (CIA), los ratones desarrollan artritis inflamatoria crónica que se parece mucho a la artritis reumatoide humana. Los ratones deficientes en ST2L (ST2KO) desarrollaron enfermedad atenuada en este modelo, y la patología en este modelo dependía de la expresión de ST2L por los mastocitos (Xu et al., PNAS 105:10913-8, 2008) En este modelo, hubo infiltración reducida de células mononucleares y polimorfonucleares y de hiperplasia sinovial en las articulaciones de ratones ST2KO. El drenaje de LN de ratones ST2KO cultivados con colágeno (CII) mostró una producción significativamente disminuida de IL-17, IFNy y TNFa. Los ratones deficientes en ST2L transferidos adoptivamente con mastocitos derivados de médula ósea (BMMC) de tipo salvaje (WT), antes de que se indujera la CIA, desarrollaron una CIA más grave que aquellos injertados con BMMC de ST2KO. Por lo tanto, la señalización de ST2L por los mastocitos fue crítica para el desarrollo de la artritis en un modelo de ratón que se asemeja a la artritis reumatoide humana. La administración de los anticuerpos de ST2L de la presente invención, que inhiben las respuestas de los mastocitos, a los ratones del modelo CIA puede usarse para evaluar el uso de estos antagonistas para mejorar los síntomas y alterar el curso de la enfermedad.
Las afecciones inflamatorias gastrointestinales ejemplares son enfermedad inflamatoria intestinal (EII), colitis ulcerosa (CU) y enfermedad de Crohn (EC), colitis inducida por agresiones ambientales (por ejemplo, inflamación gastrointestinal (por ejemplo, colitis) provocada o asociada con (por ejemplo, como efecto secundario) un régimen terapéutico, como la administración de quimioterapia, radioterapia y similares), infecciones de colitis, colitis isquémica, colitis colágena o linfocítica, enterocolitis necrotizante, colitis en afecciones tales como enfermedad granulomatosa crónica o enfermedad celíaca, alergias alimenticias, gastritis, gastritis infecciosa o enterocolitis (por ejemplo, gastritis activa crónica infectada por Helicobacter pylori) y otras formas de inflamación gastrointestinal provocadas por un agente infeccioso. Existen varios modelos animales para afecciones inflamatorias gastrointestinales. Algunos de los modelos usados más ampliamente son el modelo de colitis inducida por ácido 2,4,6-trinitrobenesulfónico/etanol (TNBS) o el modelo de oxazalona, que inducen inflamación crónica y ulceración en el colon (Neurath et al., Intern Rev Immunol 19:51-62, 2000). Otro modelo usa sulfato sódico de dextrano (DSS), que induce una colitis aguda manifestada por diarrea sanguinolenta, pérdida de peso, acortamiento del colon y ulceración de la mucosa con infiltración de neutrófilos. Otro modelo implica la transferencia adoptiva de células T CD4 CD45RBhigh no tratadas a ratones RAG o SCID. En este modelo, las células T no tratadas de los donantes atacan el intestino receptor provocando inflamación intestinal crónica y síntomas similares a las enfermedades inflamatorias intestinales humanas (Read y Powrie, Curr Protoc Immunol Capítulo 15, unidad 15.13, 2001). Puede usarse la administración de antagonistas de la presente invención en cualquiera de estos modelos para evaluar la eficacia potencial de esos antagonistas para mejorar los síntomas y alterar el curso de las enfermedades asociadas con la inflamación en el intestino, como la enfermedad inflamatoria intestinal.
La fibrosis renal puede desarrollarse a partir de un ataque agudo como la isquemia/reperfusión del injerto (Freese et al., Nephrol Dial Transplant 16:2401-6, 2001) o una enfermedad crónica como la diabetes (Ritz et al., Nephrol Dial Transplant 11 Suplemento 9:38-44, 1996). La patogénesis se caracteriza típicamente por una respuesta inflamatoria inicial seguida de fibrogénesis sostenida del aparato de filtración glomerular y el intersticio tubular (Liu, Kidney Int 69:213-7, 2006). Se ha demostrado que la fibrosis tubulointersticial desempeña un papel crítico en la patogénesis de la lesión renal por insuficiencia renal terminal y la célula del túbulo proximal se ha revelado como un mediador central (Phillips y Steadman, Histol Histopathol 17:247-52, 2002;Phillips, Chang Gung Med J 30:2-6, 2007). La fibrogénesis en el compartimento tubulointersticial está mediada en parte por la activación de fibroblastos residentes, que secretan citoquinas proinflamatorias que estimulan el epitelio del túbulo proximal para secretar mediadores inflamatorios y fibrogénicos locales. Adicionalmente, las citoquinas quimiotácticas son secretadas por fibroblastos y células epiteliales y proporcionan un gradiente direccional que guía la infiltración de monocitos/macrófagos y células T en el tubulointersticio. El infiltrado inflamatorio produce citoquinas fibrogénicas e inflamatorias adicionales que activan aún más la liberación de fibroblastos y citoquinas epiteliales a la vez que estimulan el epitelio para experimentar una transición fenotípica en la que las células depositan componentes de la matriz extracelular en exceso (Simonson, Kidney Int 71:846-54, 2007).
Otras afecciones fibróticas ejemplares pueden incluir fibrosis hepática (incluyendo, pero no limitada a, cirrosis inducida por alcohol, cirrosis inducida por virus, hepatitis autoinmune inducida); fibrosis pulmonar (incluyendo, pero no limitada a, esclerodermia, fibrosis pulmonar idiopática); fibrosis renal (incluyendo, pero no limitada a, esclerodermia, nefritis diabética, nefritis glomerular, nefritis lúpica); fibrosis dérmica ((incluyendo, pero no limitada a, esclerodermia, cicatrices hipertróficas y queloides, quemaduras); mielofibrosis; neurofibromatosis; fibroma; fibrosis intestinal; y adherencias fibróticas resultantes de procedimientos quirúrgicos. La fibrosis puede ser fibrosis específica de un órgano o fibrosis sistémica. La fibrosis específica de un órgano puede estar asociada a fibrosis pulmonar, fibrosis hepática, fibrosis renal, fibrosis cardíaca, fibrosis vascular, fibrosis de la piel, fibrosis ocular 0 fibrosis de la médula ósea. La fibrosis pulmonar puede estar asociada a fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis pulmonar inducida por fármacos, asma, sarcoidosis o enfermedad pulmonar obstructiva crónica. La fibrosis hepática puede estar asociada a cirrosis, esquistomasomiasis o colangitis. La cirrosis se puede seleccionar de cirrosis alcohólica, cirrosis post-hepatitis C, cirrosis biliar primaria. La colangitis puede ser colangitis esclerosante. La fibrosis renal puede estar asociada a nefropatía diabética o lupus glomeruloesquelerosis. La fibrosis cardíaca puede estar asociada a infarto de miocardio. La fibrosis vascular puede estar asociada a restenosis arterial postangioplastia o aterosclerosis. La fibrosis de la piel puede estar asociada a cicatrices de quemaduras, cicatrices hipertróficas, queloides o dermatopatía fibrosante nefrogénica. La fibrosis ocular puede estar asociada a fibrosis retroorbitaria, cirugía post-cataratas o vitreoretinopatía proliferativa. La fibrosis de la médula ósea puede estar asociada a mielofibrosis idiopática o mielofibrosis inducida por fármacos. La fibrosis sistémica puede ser esclerosis sistémica o enfermedad de injerto contra huésped.
Otras afecciones inflamatorias y neuropatías, que pueden prevenirse o tratarse mediante los métodos de la invención son las provocadas por enfermedades autoinmunes. Estas afecciones y neuropatías incluyen esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico y trastornos neurodegenerativos y del sistema nervioso central (SNC) que incluyen la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, el trastorno bipolar y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedades hepáticas que incluyen cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, enfermedad del hígado graso no alcohólico/esteatohepatitis, fibrosis, virus de la hepatitis C (VHC) y virus de la hepatitis B (VHB), diabetes y resistencia a la insulina, trastornos cardiovasculares que incluyen aterosclerosis, hemorragia cerebral, apoplejía e infarto de miocardio, artritis, artritis reumatoide, artritis psoriásica y artritis reumatoide juvenil (ARJ), osteoporosis, osteoartritis, pancreatitis, fibrosis, encefalitis, psoriasis, arteritis de células gigantes, espondolitis anquilosante, hepatitis autoinmune, virus de inmunodeficiencia humana (VIH), afecciones inflamatorias de la piel, trasplante, cáncer, alergias, enfermedades endocrinas, reparación de heridas, otros trastornos autoinmunes, hiperreactividad de las vías respiratorias, e infecciones o trastornos celulares, virales o mediados por priones.
También se divulga en la presente un método para tratar o prevenir una afección mediada por ST2L que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de anticuerpo humano o adaptados a humanos aislado que se une específicamente al Dominio I (SEQ ID NO: 9) de ST2l humano, bloquea la interacción de IL-33/ST2L, compite por unirse a ST2L humano (SEQ ID NO: 1) con un anticuerpo aislado que comprende una región variable de la cadena pesada (VH) de la SEQ ID NO: 47 y una región variable de la cadena ligera (VL) de la SEQ ID NO: 51 y/o se une a ST2L humano en los residuos de aminoácidos 35-48 de la SEQ ID NO: 1 (Rc PrQg KPSYTVDW; SEQ ID NO: 210) a un paciente con necesidad de ello durante un tiempo suficiente para tratar o prevenir la afección mediada por ST2L.
También se divulga en la presente un método para inhibir la respuesta de mastocitos en un paciente que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de anticuerpo humano o adaptado a humanos aislado que se une específicamente al Dominio I (SEQ ID NO: 9) de ST2L humano, bloquea la interacción de IL-33/ST2L, compite por unirse a ST2L humano (SEQ ID NO: 1) con un anticuerpo aislado que comprende una región variable de la cadena pesada (VH) de la SEQ ID NO: 47 y una región variable de la cadena ligera (VL) de la SEQ ID NO: 51 y/o se une a St2l humano en los residuos de aminoácidos 35-48 de la SEQ ID NO: 1 (RCPRQGKPSYTVDW; SEQ ID NO: 210) a un paciente con necesidad de ello durante un tiempo suficiente para inhibir la respuesta de mastocitos.
También se divulga en la presente un método para inhibir la interacción de IL-33 y ST2L en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un antagonista de anticuerpo humano o adaptado a humanos aislado que se une específicamente al dominio I (SEQ ID NO: 9) de ST2L humano, bloquea la interacción de IL-33/ST2L, compite por unirse al ST2L humano (SEQ ID NO: 1) con un anticuerpo aislado que comprende una región variable de la cadena pesada (VH) de la SEQ ID NO: 47 y una región variable de la cadena ligera (VL) de la SEQ ID NO: 51 y/o se une a ST2L humano en los residuos de aminoácidos 35-48 de la EQ ID NO: 1 (RCPRQGKPSYTVDW; SEQ ID NO: 210) en una cantidad suficiente para inhibir la interacción de IL-33 y ST2L.
En otro caso, la afección mediada por ST2L es asma, hiperreactividad de las vías respiratorias, sarcoidosis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis pulmonar idiopática (FPI), fibrosis quística, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), esofagitis eosinofílica, esclerodermia, dermatitis atópica, rinitis alérgica, penfigoide ampolloso, urticaria crónica, nefropatía diabética, artritis reumatoide, cistitis intersticial o enfermedad de injerto contra huésped (EICH).
En otro caso, la afección mediada por ST2L está asociada con el reclutamiento de células inflamatorias en los pulmones, hiperplasia de células caliciformes, o aumento de la secreción de mucosa.
En otro caso, la afección mediada por ST2L está asociada con la respuesta de mastocitos.
En otro caso, la respuesta inhibidora de mastocitos comprende inhibir el nivel de GM-CSF, IL-5, IL-8, IL-10 o IL-13 liberado por los mastocitos derivados de la sangre del cordón umbilical humanos en por lo menos un 50% con 50 |jg/ml de anticuerpo.
En otro caso, el antagonista de anticuerpo administrado a un paciente con necesidad de ello es un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al Dominio I (SEQ iD NO: 9) de ST2L humano, bloquea la interacción de IL-33/ST2L, compite por unirse a ST2L humano (SEQ ID NO: 1) con un anticuerpo aislado que comprende una región variable de la cadena pesada (VH) de la SEQ ID NO: 47 y una región variable de la cadena ligera (VL) de la SEQ ID NO: 51 y/o se une a ST2L humano en los residuos de aminoácidos 35 -48 de la SEQ ID NO: 1 (RCPRQGKPSYTVDW; SEQ ID NO: 210), y además se une a TSLP, IL-25, TSLPR, IL-17RA o IL-17RB. Administración/Composiciones Farmacéuticas
La "cantidad terapéuticamente eficaz" de los anticuerpos anti-ST2L eficaces en el tratamiento de afecciones en las que es deseable la modulación de la actividad biológica de ST2L puede determinarse mediante técnicas de investigación estándar. Por ejemplo, la dosificación del anticuerpo anti-ST2L que será eficaz en el tratamiento de una afección inflamatoria como el asma o la artritis reumatoide puede determinarse administrando el anticuerpo anti-ST2L a modelos animales relevantes, como los modelos descritos en la presente.
Además, los ensayos in vitro pueden emplearse opcionalmente para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. La selección de una dosis eficaz particular puede determinarse (por ejemplo, mediante ensayos clínicos) por los expertos en la técnica en base a la consideración de varios factores. Tales factores incluyen la enfermedad a tratar o prevenir, los síntomas involucrados, la masa corporal del paciente, el estado inmunitario del paciente y otros factores conocidos por el experto en la técnica. La dosis precisa a ser empleada en la formulación también dependerá de la vía de administración y la gravedad de la enfermedad, y debe decidirse de acuerdo con el criterio del profesional y las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de curvas de respuesta a la dosis derivadas de sistemas de prueba in vitro o de modelos animales.
El modo de administración para el uso terapéutico del anticuerpo de la invención puede ser cualquier vía adecuada que administre el agente al huésped. Las composiciones farmacéuticas de estos anticuerpos son particularmente útiles para la administración parenteral, por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea o intranasal.
El anticuerpo de la invención puede prepararse como composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz del agente como ingrediente activo en un portador farmacéuticamente aceptable. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el compuesto activo. Tales vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos, como agua y aceites, incluyendo los de petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Por ejemplo, puede usarse un 0,4% de solución salina y un 0,3% de glicina. Estas soluciones son estériles y generalmente están libres de partículas. Pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas (por ejemplo, filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como se requiera para aproximarlas a las condiciones fisiológicas como agentes de ajuste y tamponamiento del pH, agentes estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes, etc. La concentración del anticuerpo de la invención en dicha formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente el 0,5%, habitualmente de por lo menos aproximadamente el 1% hasta el 15 o 20% en peso y se seleccionará principalmente en base a la dosis requerida, volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado.
Por tanto, una composición farmacéutica de la invención para inyección intramuscular podría prepararse para contener 1 ml de agua tamponada estéril, y entre aproximadamente 1 ng y aproximadamente 100 mg, por ejemplo, de aproximadamente 50 ng a aproximadamente 30 mg, o más preferiblemente de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg, de un anticuerpo anti-ST2L de la invención. De manera similar, una composición farmacéutica de la invención para infusión intravenosa podría estar compuesta para contener aproximadamente 250 ml de solución de Ringer estéril, y de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 30 mg y preferiblemente de 5 mg a aproximadamente 25 mg de un antagonista de la invención. Los métodos actuales para preparar composiciones administrables parenteralmente son bien conocidos y se describen con más detalle en, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Science", 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA.
Los anticuerpos de la invención pueden liofilizarse para almacenamiento y reconstituirse en un portador adecuado antes de su uso. Se ha demostrado que esta técnica es eficaz con inmunoglobulinas y preparaciones de proteínas convencionales y pueden emplearse técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la técnica.
La presente invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos específicos, no limitativos.
MATERIALES Y MÉTODOS (general)
Ensayo de inhibición de la unión receptor-ligando humano y de Cynomolgus (Macaca fascicularis, cyno) (ensayo RLB)
Se recubrió una placa de 96 pocilios con 50 |jl de 4 pg/ml de ECD de ST2L humano (aminoácidos 19-328 de la SEQ ID NO: 1) o 2 pg/ml de eCd de ST2L de cyno (aminoácidos 19-321 de la SEQ ID NO: 2) teniendo un marcador His6 C-terminal en tampón de bicarbonato a 4° C durante 16 h. Todos los pasos posteriores se realizaron a temperatura ambiente. La placa se bloqueó con 200 j l de tampón de bloqueo, y se lavó 3 veces con 300 j l de tampón de lavado que contenía PBS Tween al 0,05%. Se añadieron 30 j l de varias diluciones de mAbs anti-ST2L a los pocillos y se incubaron durante 1 hora. Para el ensayo de unión receptor-ligando humano, se añadieron 20 j l de IL-33 humana biotinilada (residuos 112-270 de la SEQ ID NO: 3) a una concentración final de 100 ng/ml y se incubaron durante 30 minutos. Para el ensayo de unión receptor-ligando de cyno, se añadieron 20 j l de IL-33 de cyno biotinilada (residuos 112-269 de la SEQ ID NO: 4) a una concentración final de 200 ng/ml y se incubaron durante 30 minutos. La placa se lavó 3 veces con 300 j l de tampón de lavado. Se añadieron 50 j l de 0,2 jg/ml de estreptavidina-HRP (Jackson Immunoresearch) y se incubaron durante 30 minutos. La placa se lavó 3 veces con 300 j l de tampón de lavado que contenía PBS Tween al 0,05%. Se añadieron 50 j l de sustrato TMB (EMD Biosciences) a cada pocillo. La reacción se detuvo mediante la adición de 100 j l de ácido sulfúrico 0.2N. Se midieron los OD450 usando el lector de placas Envision (Perkin Elmer).
Generación de constructos de ST2L quiméricos
Se diseñaron y generaron varios constructos presentado intercambios del dominio I, II y III de ST2L humano y de ratón usando técnicas estándar de biología molecular. Los constructos se enumeran en la Tabla 1. La numeración de aminoácidos corresponde a las proteínas ST2L (hST2L) humana (SEQ ID NO: 1; NP_057316) y ST2L de ratón (mST2L) (SEQ ID NO: 5; NP_001020773).
Tabla 1.
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Ensayo de determinación de unión a dominio.
La unión del anticuerpo al dominio I, II y III de ST2L se determinó usando el ensayo ELISA de captura estándar usando el formato de detección electroquimioluminiscente (tecnología de Meso-Scale Discovery (MSD) (MSD). Se recubrieron 10 pg/ml de cada anticuerpo sobre cada pocillo de una placa MSD HighBind (5 pl/pocillo) durante 2 horas a temperatura ambiente. La placa se bloqueó con 150 j l de tampón de bloqueo MSD al 5% durante 2 horas a temperatura ambiente, y se lavó 3 veces con tampón de lavado HEPES, seguido de la adición de 25 j l de ECD de huST2L o ECD de ST2L de ratón marcados con sulfo tag (amino ácidos 28-326 de la SEQ ID NO: 5) o quimeras de HHM-ST2L (SEQ ID NO: 6) o HMH-ST2L (SEQ ID NO: 8) o HH-ST2L (residuos 19-205 de la SEQ ID NO: 1) a la placa en concentraciones crecientes de 5 nM a 40 nM. La placa se cubrió con papel de aluminio y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. La placa se lavó 3 veces con tampón de lavado HEPES. Se añadió tampón de lectura MSD (150 jl) a cada pocillo, y luego se leyó la placa usando un MSD Sector Imager 6000.
Los anticuerpos unidos por ECD de ST2L humano, HHM-ST2L y HMH-ST2L, pero no por ECD de ST2L de ratón, reconocen el dominio I de ECD de ST2L humano. Los anticuerpos unidos por ECD de ST2L y HMH-ST2L humanos, pero no por HHM-ST2L y ECD de ST2L de ratón, reconocen el Dominio III de ECD de ST2L humano.
Los anticuerpos unidos por ECD de ST2L humano y de ratón pero no por HH-ST2L reconocen el dominio III de ECD de ST2L humano y de ratón.
Mediciones de afinidad de mAbs anti-ST2L.
Los mAbs anti-ST2L, ECD de huST2L y ECD de ST2L de cyno se expresaron usando métodos estándar. Se obtuvo Ab específico del fragmento de IgG Fcy anti-humano de cabra (N° de cat. 109-005-098) de los laboratorios Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA). Los chips sensores GLC (Bio-Rad N° de cat 176-5011), los chips sensores CM-5 (GE Healthcare N° de cat BR100014) y los reactivos para la preparación de la superficie de captura se obtuvieron de Biacore (GE healthcare, Piscataway, NJ) o de Bio-Rad Life Sciences (Bio-Rad, Hercules, CA).
Las interacciones de los anticuerpos anti-ST2L con ECD de ST2L humano marcado don His6 y ECD de ST2L de cyno marcado con His6 se estudiaron por ProteOn usando un ProteOn XPR36 a 25° C. Se preparó una superficie biosensora acoplando el anticuerpo específico de fragmento Fcy de IgG anti-humano de cabra (Ab) a la superficie de un chip sensor GLC usando las instrucciones del fabricante para la química de acoplamiento de amina. El tampón de acoplamiento era acetato de sodio 10 mM, pH 4,5. El Fcy de IgG anti-humano de cabra (aproximadamente 4500 unidades de respuesta) se inmovilizó en orientación horizontal. Los anticuerpos anti-ST2L se proporcionaron purificados o en sobrenadantes brutos. En cualquier caso, estos anticuerpos se diluyeron en PRB (PBS pH 7,4, suplementado con EDTA 3 mM y Tween 20 al 0,005%) a una concentración de aproximadamente 0,5 pg/ml. Los anticuerpos se capturaron (60-130 RU) en orientación vertical sobre el chip GLC modificado con anticuerpo Fcy antihumano. La captura de mAbs anti-ST2L fue seguida por la inyección de ECD de huST2L en solución (0,024 a 15 nM en diluciones de 5 veces) o ECD de ST2L de cyno en solución (0,020-5 nM en diluciones de 4 veces) en la orientación horizontal. La asociación se monitorizó durante 4 minutos en todos los experimentos (200 |jl inyectados a 50 pl/min). La disociación se monitorizó durante 30 minutos. La regeneración de la superficie sensora se obtuvo con tres pulsos de 15 segundos de glicina 10 mM, pH 1,5. Los datos se ajustaron usando el software ProteOn y usando un modelo de unión 1:1 con transferencia de masa.
Los experimentos de Biacore se realizaron usando un biosensor óptico Biacore 2000 o Biacore 3000 (Biacore AB). Todos los experimentos se realizaron en BRB (PBS pH 7.4, suplementado con EDTA 3 mM y Tween 20 al 0,005%) con o sin BSA al 0,1% a 25° C.
Se preparó una superficie biosensora Biacore acoplando el Ab específico del fragmento Fcy de IgG antihumano de cabra a la superficie de dextrano carboximetilado de un chip CM-5 usando las instrucciones del fabricante para la química de acoplamiento de aminas. El tampón de acoplamiento era acetato de sodio 10 mM, pH 4,5. Se inmovilizaron una media de 6000 unidades de respuesta (RU) de Ab en cada una de las cuatro celdas de flujo. Los mAbs anti-ST2L se capturaron (aproximadamente 33 RU) sobre la superficie del chip sensor modificado con anticuerpo Fcy anti-humano. La captura de mAbs anti-ST2L fue seguida por la inyección de ECD de huST2L en solución (0,2 a 15 nM en diluciones de 3 veces) o ECD de ST2L de cyno en solución (0,2 a 15 nM o 0,020-5 nM, en diluciones de 3 veces). La asociación se monitorizó durante 4 minutos u 8 minutos (se inyectaron 200 j l a 50 jl/min o 20 pl/min para C2521 y C2519). La disociación se monitorizó durante 10 minutos o hasta 2,5 horas. La regeneración de la superficie sensora se obtuvo con la inyección de NaOH 50 mM y/o la inyección de H3PO4100 mM.
Los datos se procesaron usando el software Scrubber, versión 1.1g (BioLogic Software). La sustracción de referencia doble de los datos se realizó sustrayendo las curvas generadas por inyección de tampón de las curvas sustraídas de referencia para inyecciones de analito para corregir la contribución del tampón a la señal y al ruido del instrumento (Myszka, Journal of Mol Recogn 12:279-84, 1999)
Después del procesamiento de datos, los datos generados para la determinación cinética y de afinidad se analizaron usando el software Scrubber o el software BIAevaluation, versión 4.0.1 (Biacore, AB). Los datos cinéticos se analizaron usando un modelo de unión simple 1:1 que incluía un término para transferencia de masa.
Medición de afinidad de mAb de ST2L anti-ratón (C1999/CNTO3914) a ECD de ST2L murino.
El mAb anti-ST2L (C1999/CNTO3914) y el dominio extracelular de ST2L murino (ECD de muST2L) se expresaron y purificaron usando métodos estándar. El Ab específico de fragmento Fcy de IgG anti-murino se obtuvo de los laboratorios Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA). Se obtuvieron chips sensores y reactivos para la preparación de la superficie de captura de Biacore (GE healthcare, Piscataway, NJ). El tampón de ejecución experimental Biacore (BRB) contenía PBS pH 7,4 con Tween 20 al 0,005% y 0,1 mg/ml de bSa y los datos se recogieron a 25° C.
La interacción del anticuerpo anti-ST2L con ECD de muST2L se estudió en un Biacore2000 a 25° C. Se preparó una superficie biosensora acoplando un anticuerpo específico anti-ratón-Fc a la superficie de un chip sensor CM4 usando las instrucciones del fabricante para la química de acoplamiento de aminas. El C1999/CNTO3914 y ECD de muST2L se diluyeron en BRB. El C1999 se capturó usando el anticuerpo Fcy anti-ratón (aproximadamente 85 RU). La captura fue seguida por inyección de ECD de muST2L (residuos 28-326 de la SEQ ID NO: 5) en solución (comenzando a 15 nM, 5 concentraciones, en una dilución en serie de 3 veces). La asociación se monitorizó durante 8 minutos. La disociación se monitorizó durante hasta 6000 segundos. Las regeneraciones se realizaron usando una dilución 1/100 de ácido fosfórico. Los datos se ajustaron usando un modelo de unión 1:1.
Ensayo de línea celular de basófilos humanos (ensayo de liberación de citoquinas de basófilos)
Se colocaron en placas células KU812 (línea celular de basófilos humanos; ATCC, CRL-2099) en placas estériles de cultivo de tejido de fondo en U de 96 pocillos a 25.000 o 50.000 células por pocillo en un total de 40 pl de medio de crecimiento RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado con FBS al 10% y penicilina/estreptomicina. Se añadieron mAbs de ST2L antihumanos y controles a varias concentraciones (50 pl/pocillo) y se incubaron a 37° C. Después de 1 hora de incubación, se añadió IL-33 "madura" recombinante (aminoácidos 111-270 de la SEQ ID NO: 3) a una concentración final de 10 ng/ml en 10 pl de medio de crecimiento RPMI. Las células se incubaron luego a 37° C durante 18-24 horas para permitir la inducción mediada por IL-33 de IL-5 e IL-6. Después de la incubación, se recogieron las células y se recogió el sobrenadante celular para la detección posterior de IL-5 e IL-6 inducidas por IL-33 usando ELISA (R&D systems) o análisis multiplex basado en perlas (Millipore).
Ensayo de liberación de citoquinas de mastocitos humanos y ensayo de liberación de PGD2
Los mastocitos se derivaron de células de sangre de cordón umbilical humano CD34+ (Lonza). Se descongelaron rápidamente viales congelados de >1,0 x 106 células de sangre de cordón umbilical CD34+ y se transfirieron a un tubo cónico de 50 ml. Se añadieron lentamente a las células gotas de medio Stem-Pro 34 suplementos calentados o a temperatura ambiente (25 ml en total; Invitrogen). Las células se centrifugaron a 1.000 rpm durante 15 minutos y se resuspendieron en medio (10 ml de StemPro-34, con los siguientes suplementos: 30 ng/ml de IL-3, 100 ng/ml de IL-6, y 100 ml de SCF/NG.
Las células se colocaron en placas en 2 pocillos de una placa de 6 pocillos y se cultivaron durante 1 semana. El día 4, las células se expandieron 1:3 en medio Stem Pro-34 suplementado. El día 7, las células no adherentes se eliminaron y se colocaron en placas a 0,5 x106/ml en medio StemPro-34 que contenían 10 ng/ml de IL-6 y 100 ng/ml de SCF. Las células se expandieron semanalmente para mantener la densidad celular a 0,5x106/ml hasta que los mastocitos maduraron a las 6-10 semanas (evaluado por expresión de FceR1, cKit y triptasa).
Los mastocitos maduros se cultivaron a 0,5 x 106/ml en StemPro-34 y se estimularon diariamente durante 4 días en IL-4 (10 ng/ml; Peprotech), IL-6 (10 ng/ml; R&D Systems) y SCF (100 ng/ml; Invitrogen). Antes del ensayo, se recogieron las células, se centrifugaron a 1000 RPM durante 10 minutos y se resuspendieron en medio StemPro-34 nuevo o RPMI que contenía FCS al 10% sin antibióticos, con 100 ng/ml de SCF recombinante humano. Las células se colocaron en placas a una densidad de 65.000 a 75.000 células/0,16 ml/pocillo en una placa de 96 pocillos tratada con cultivo de tejidos de fondo plano. Los mAbs anti-ST2L se agregaron a la placa para una concentración final de 50, 10, 2, 0,4, 0,08, 0,016, 0,0032 pg/ml durante 30 minutos antes de la adición de IL-33. La IL-33 "madura" humana recombinante (residuos 111-270 de la SEQ ID NO: 3) también se preparó a 10X (10 o 30 ng/ml) en medio 100 ng/ml de SCF. Se añadieron 20 pl del 10X IL-33 a los pocillos, para una concentración final de 1 (Figuras 6 y 7A-7E) o 3 ng/ml (Figura 8A-8E), y las placas se incubaron durante la noche a 37° C, 5% de CO2. El sobrenadante del cultivo se recogió 18-24 horas después de la estimulación. Las placas se centrifugaron a 1.000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se retiró y se colocó en una placa de 96 pocillos con fondo en U y se almacenó a -20° C antes del ensayo. Se usaron kits de citoquinas humanas de Millipore para analizar los niveles de citoquinas usando la tecnología Luminex™. Los niveles de PGD2 se midieron usando el kit Prostaglandin D2-MOX EIA de Cayman Chemical Company, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para mejorar la sensibilidad del ELISA, los PGD2 en los sobrenadantes del cultivo de mastocitos se convirtieron en MOX-PGD2 no degradables (metoxilsamina-PGD2) mediante tratamiento con clorhidrato de metoxilsamina (MOX-HCl).
Ensayo de inhibición de la unión de receptor-ligando de ratón (ensayo RLB de ratón)
Se recubrió una placa transparente de 96 pocillos (VWR) con 50 pl de 2 pg/ml de IgG antihumano de cabra, anticuerpo específico del fragmento Fcy (Jackson Immunoresearch) durante aproximadamente 16 horas a 4° C. Los pasos restantes se completaron a temperatura ambiente. Los pocillos se incubaron con tampón de bloqueo, se lavaron y se añadieron 50 pl de 2 pg/ml de ECD de ST2L de ratón fusionado al Fc humano durante 1 hora. La placa se lavó y se añadió 1 pg/ml de mIL-33 biotinilada con o sin anticuerpos anti-mST2L. La placa se lavó y la detección se realizó con estreptavidina-HRP (Jackson Immune Research) y se desarrolló una señal con sustrato TMB (RDI Division de Fitzgerald Industries) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Ensayos de genes informadores de ratón y humanos (ensayo RGA humano o de ratón)
Se colocaron en placas células HEK293 a 50.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos tratadas con cultivo de tejido de fondo transparente blanco (NUNC) en DMEM, FBS al 10% y se incubaron en incubadora humidificada a 37° C, 5% de CO2 durante 24 horas. Las células se cotransfectaron con vectores que codifican ADNc de ECD de ST2L humano o de ratón, vector de NF-KB-Luciferasa (Stratagene, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) usando Lipofectamine™ 2000 en medios Opti-MEM (Invitrogen) usando protocolos estándar. Después de 24 horas de incubación a 37° C, 5% de CO2, las células transfectadas se trataron con IL-33 de ratón (R&D Systems, residuos 109-266 de la SEQ ID NO: 5) o humana (residuos 112-270 de la SEQ ID NO: 3) con o sin anticuerpos anti-ST2L durante 16 horas a 37° C, 5% de CO2. La actividad de luciferasa se midió usando el reactivo Steady-Glo® (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ensayo de proliferación de células T de ratón
Se cultivaron células Th2 de ratón (D10.G4.1, ATCC) en medio de crecimiento completo: medio RPMI 1640 con L-glutamina 2 mM ajustada para contener 1,5 g/l de bicarbonato de sodio, 4,5 g/lL de glucosa, HEPES 10 mM y piruvato de sodio 1,0 mM, y suplementado con: 2-mercaptoetanol 0,05 mM, 10 pg/ml de IL-1â (R&D Systems), suero bovino fetal al 10%, factor T-STIM de rata al 10% con A (suplemento de cultivo de IL-2 de rata disponible de Becton Dickinson). Las células se lavaron dos veces con medio de ensayo (RPMI, FBS al 10%, sin IL-1, sin T-STIM), se resuspendieron a 1,25x105 células por ml y se colocaron en placas en 80 pl de medio en placas de 96 pocillos tratadas con cultivo de tejido de fondo transparente blanco (NUNC, Rochester, NY). Se añadieron varias cantidades de IL-33 de ratón (residuos 109-266 de la SEQ ID NO: 5) a las células para el volumen de ensayo final de 100 pl. Al probar la neutralización de anticuerpos, se añadieron a las células anticuerpos de control (añadidos en medio de hibridoma agotado) o sobrenadantes de hibridoma y se incubaron durante 1 hora seguido de la adición de 20 pg/ml de mIL-33. Las placas se cultivaron durante 24 horas en una incubadora humidificada a 37° C, 5% de CO2. La cuantificación de las células viables se logró con los reactivos CellTiter-Glo® (Promega, Madison, WI); protocolo realizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ensayo de mastocitos derivados de médula ósea de ratón
Los mastocitos de ratón se derivaron de médula ósea de ratones Balb/c (6 semanas). Las células se colocaron en placas a 300.000 células/pocillo en medio RPMI (libre de endotoxinas), FBS al 10%e, medio acondicionado con línea celular WEHI al 10%, 10 ng/ml de IL-3 (Peprotech), aminoácidos esenciales 0,1 mM, penicilina/estreptomicina al 1% (Invitrogen). Los mAbs anti-ST2L (100, 10, 1, 0,1 o 0,01 pg/ml) se incubaron con las células durante 1 hora antes de la adición de IL-33 "maduro" de ratón recombinante (residuos 109-266 de la SEQ ID NO: 215 (10 ng/ml; R&D Systems). Después de aproximadamente 24 h, se recogieron los sobrenadantes y se congelaron hasta el análisis usando el kit Millipore Mouse 22-plex para Luminex™, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ensayo de células endoteliales de cyno
Se colocaron en placas células endoteliales aórticas de cynomolgus cultivadas en medio de crecimiento de células endoteliales 2 EGM®-2 (Lonza) en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos a 10.000 o 20.000 células por pocillo. Se añadieron 50 pl de anticuerpos anti-ST2L a las células partiendo de 100 pg/ml con diluciones posteriores de 4 o 5 veces y se incubaron a 37° C durante 1 hora antes de la adición de IL-33 'maduro' de cyno recombinante (SEQ ID NO: 4). Se añadieron luego cincuenta microlitros de 20 ng/ml de IL-33 de cynomolgus a las células y se incubaron a 37° C durante 24 horas. Para evaluar las respuestas de citoquinas inducidas por IL-33, se recogieron los sobrenadantes y se evaluaron los niveles de citoquinas mediante un kit Non-Human Primate IL-8 para Luminex™ (Millipore) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ensayo de lavado peritoneal de ratón
Se lavaron los peritoneos de 6 ratones Balb/c con un total de 3 ml de PBS para recoger células peritoneales. Se encontró que la mayoría de estas células eran linfocitos y macrófagos, como se determinó por la expresión de B220 y F4/80 (análisis FACS). Aproximadamente el 1% eran mastocitos cKit+ (CD117+). Las células se centrifugaron y el sedimento se resuspendió a 1x106 células/ml en medio Alpha MEM FBS al 10% 100 U/ml de penicilina 100 pg/ml de estreptomicina (Invitrogen). Las células se colocaron en placas a 200 pl por pocillo en una placa de 96 pocillos y se dejaron reposar 2 h a 37° C. Se añadieron mabs anti-ST2L a las células durante 30 minutos antes de la adición de 10 ng/ml de IL-33 "maduro" de ratón (R&D Systems; residuos 109-266 de la SEQ ID NO: 215). Los sobrenadantes se recogieron 24 h después de la adición de iL-33, se almacenaron a -20° C hasta el análisis y se analizaron usando el kit Millipore Mouse 22-plex para Luminex™ de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 1. Generación de anticuerpos de ST2L anti-ratón de rata.
Se inmunizaron intraperitonealmente ratas con ST2-Fc de ratón (R&D Systems (Ser27-Ser342 de la SEQ ID NO: 5) y se evaluaron los títulos de IgG específicos. Una vez que se hubieron obtenido títulos suficientes, se aislaron los esplenocitos y se fusionaron con células FO. Los hibridomas resultantes se colocaron en placas en placas de 96 pocillos o metilcelulosa y se cultivaron durante 10 días. Se identificaron clones específicos del antígeno mediante ELISA de captura estándar para la unión a mST2-Fc y se sometieron a selección cruzada contra la proteína Fc sola. Se probaron adicionalmente hibridomas específicos de ST2 murino para la inhibición de la unión de IL-33 a ST2 en un ELISA y para la inhibición de la proliferación de células Th2 de ratón D10.G4.1 inducida por IL-33. Los hibridomas que mostraron neutralización tanto en la unión de receptor-ligando como en los ensayos de proliferación basados en células se seleccionaron clonalmente mediante dilución limitante. Las regiones V se secuenciaron y clonaron en el fondo de IgG1 de ratón. La especificidad del dominio de ECD de ST2L se abordó específicamente mediante un ensayo inmunosorbente estándar con detección electroquimioluminiscente usando varios constructos de intercambio de dominio de humano-ratón.
El anticuerpo secretado por el hibridoma C1999 se clonó en el fondo de IgG1 de ratón y se denominó CNTO3914. Las secuencias de las regiones variables y CDR de CNTO3914 se muestran en la Tabla 2. CNTO3914 no reacciona de forma cruzada con ST2L humano y se une al dominio I de ECD de ST2L de ratón.
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Ejemplo 2. Generación de anticuerpos anti-ST2L humanos de ratón.
Se realizaron dos inmunizaciones diferentes para la generación de mAb de ST2 antihumano de ratón. Se inmunizaron BALB/c intraperitonealmente con ST2-Fc soluble (R&D Systems, SEQ ID NO: 157) y se evaluaron para títulos de IgG específicos. Una vez que se hubieron obtenido títulos suficientes, se aislaron los esplenocitos y se fusionaron con células FO. Los hibridomas resultantes se colocaron en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante 10 días. Los clones específicos del antígeno se identificaron mediante ELISA de captura estándar para la unión a ECD de huST2L marcado con His6 C-terminal y reactividad cruzada para a ECD de ST2L de cyno marcado con His6. Los hibridomas específicos de ST2L humano que reaccionaron de forma cruzada con ST2L de cyno se analizaron adicionalmente para la inhibición de la unión de IL-33 a huST2L en un ensayo ELISA y para la inhibición de la activación de NF-kB en un ensayo del gen informador. Los clones que inhiben en el ensayo del gen informador o tanto en ELISA como en el ensayo del gen informador se seleccionaron para estudios adicionales.
Se seleccionaron anticuerpos de los hibridomas C2494, C2519A y C2521A para análisis adicionales. C2519A y C2521A se unen a ST2L humano en el Dominio III, y C2494 se une a ST2L humano en el Dominio I. El anticuerpo C2494 se clonó en el fondo de IgG2 humana, y el anticuerpo de longitud completa se denominó STLM62.
Se generaron mAbs de ST2L anti-humanos en Genovac Gmbh mediante tecnología de inmunización de ADN patentada usando constructos de ST2L de longitud completa y reforzando con las células transfectadas para expresar ECD de ST2L humano. Los hibridomas se seleccionaron para determinar su unión a ECD de ST2L humano mediante citometría de flujo. Se confirmó que los clones que mostraban unión en este ensayo se unían a ECD de hST2L y se caracterizaron adicionalmente para la unión a ECD de ST2L de cyno mediante ELISA de captura estándar. Los clones seleccionados se caracterizaron en ELISA de inhibición de unión a receptor-ligando y ensayo de gen informador. Los clones que inhibían en el ensayo del gen informador o tanto en ELISA como en el ensayo del gen informador se seleccionaron para estudios adicionales.
Se seleccionó el anticuerpo del hibridoma de Genovac C2244 para análisis adicionales y se clonó en un fondo de IgG2 humana. El anticuerpo de longitud completa se denominó STLM15. El STLM15 se une a ST2L humano en el dominio I.
Las secuencias de los dominios VH, VL y CDR de los anticuerpos antihumanos de ratón se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3
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Ejemplo 3. Generación de anticuerpos de ST2L completamente humanos.
Los Fab de unión a ST2L humano se seleccionaron de bibliotecas de presentación de fagos pIX de novo como se describe en Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010; Publicación de Patente Internacional N° WO2009/085462; Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2010/0021477). Brevemente, las bibliotecas se generaron diversificando andamiajes humanos donde los genes VH de la línea germinal IGHV1-69*01, IGHV3-23*01 e IGHV5-51*01 se recombinaron con el minigen IGHJ-4 humano a través del giro H3 y los genes VLkappa de la línea germinal humana 012 (IGKV1-39*01), L6 (IGKV3-11*01), A27 (IGKV3-20*01) y B3 (IGKV4-1*01) se recombinaron con el minigen IGKJ -1 para ensamblar dominios VH y VL completos. Las posiciones en las regiones variables de la cadena pesada y ligera alrededor de los giros de H1, H2, L1, L2 y L3 correspondientes a las posiciones que se identificaron que estaban frecuentemente en contacto con antígenos de proteínas y péptidos se eligieron para diversificación. La diversidad de secuencias en las posiciones seleccionadas se limitó a los residuos que se producen en cada posición en las familias de genes de la línea germinal IGHV o IGLV de los genes IGHV o IGLV respectivos. La diversidad en el giro H3 se generó utilizando giros sintéticos de tamaño corto a mediano de 7 a 14 aminoácidos. La distribución de aminoácidos en H3 fue diseñada para imitar la variación observada de los aminoácidos en anticuerpos humanos. El diseño de la biblioteca se detalla en Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010. Los andamiajes utilizados para generar bibliotecas se nombraron de acuerdo con su origen de genes de la línea germinal humana de VH y VL. Las tres bibliotecas de la cadena pesada se combinaron con las cuatro cadenas ligeras de la línea germinal o las bibliotecas de la cadena ligera de la línea germinal para generar 24 combinaciones de VH:VL únicas para la selección. Las 24 combinaciones de la biblioteca de VH:VL se utilizaron en experimentos de barrido de fagos contra ECD de huST2L-Fc.
Las bibliotecas se barrieron usando una fusión Fc del ECD de huST2L (residuos 19-328 de la SEQ ID NO: 1). Los barridos se realizaron en 2 formatos diferentes, antígeno (Ag) en solución y Ag mostrado. Para Ag en solución, se bloquearon las perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina en PBS con leche seca sin grasa al 3%. La fusión de Fc humano de ECD de huST2L de antígeno biotinilado (Bt) (Bt-huST2L-ECD-Fc) con una concentración 10 veces mayor de proteína Fc humana como competidor se mezcló con bibliotecas de fagos FabpIX. El fago Fab-plX unido al Bt-huST2L-ECD-Fc se capturó en las perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina (SA) bloqueadas. Las selecciones de fagos se realizaron para tres rondas donde las concentraciones de huST2L-ECD-Fc variaron de 100 nM, 10 nM, 10 nM de las rondas 1 a 3, respectivamente. Para la visualización de Ag, se recubrió el huST2L-ECD-Fc con perlas magnéticas recubiertas con Sa . Las bibliotecas de fagos Fab-pIX más un exceso de 10 veces de proteína Fc humana se añadieron simultáneamente a las perlas magnéticas de SA BthuST2L-ECD-Fc mostradas. Las concentraciones de Bt-Ag usadas fueron 100 nM, 10 nM, 10 nM para las rondas 1 a 3, respectivamente. La selección se realizó para ambos formatos de barrido mediante ELISA para la unión de Fab a la proteína ECD de huST2L-Fc. Se aislaron un total de 79 Fabs con unión a hST2L-Fc de estas selecciones. El Fab HuT2SU-39 se determinó mediante un ELISA de clasificación para tener la mejor actividad de unión en general.
Se realizó un ensayo de inhibición de la unión de IL-33 basado en ELISA en los 79 Fabs. Un total de 32 Fabs mostraron inhibición de la unión de IL-33 a ECD de huST2L-Fc. 46 Fabs fueron elegidos para maduración por afinidad de la campaña pIX de novo.
Ejemplo 4. Maduración por afinidad de anticuerpos de ST2L completamente humanos
Los anticuerpos seleccionados se maduraron por afinidad usando un proceso de maduración "en línea" descrito en Shi et al., J Mol Biol 397: 385-96, 2010 y la WO09085462A1. En esta tecnología, las regiones VH de los clones Fab obtenidos en la primera selección se combinan con bibliotecas del andamiaje de VL correspondiente. Todos los genes de VH de los 46 Fabs identificados en el Ejemplo 3 se clonaron en las bibliotecas de maduración de VL apropiadas como agrupaciones de acuerdo con su familia de genes de VL original. Las bibliotecas de andamiajes VL usadas y sus esquemas de diversificación se muestran en la Tabla 4. Los andamiajes de VL humanos son los siguientes: IGKV1-39*01 (012), IGKV3-11 (L6 ), IGKV3-20 (A27), IGKV4-1*01 (B3) y se describen, por ejemplo, en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2012/0108795. Para el barrido de maduración por afinidad, las bibliotecas de fagos se añadieron rimero a Bt-huST2-ECD-Fc. Después de la incubación, se añadió el complejo fago de la biblioteca de maduración/Bt-hST2L-ECD-Fc a las perlas magnéticas recubiertas con SA. Las concentraciones de Bt-huST2-Fc variaron respectivamente de R1 a R3 a 10 nM, 1 nM y 0,1 nM. El lavado final de la ronda 3 se realizó durante la noche a temperatura ambiente en presencia de huST2L-ECD-Fc sin marcar 10 nM para impulsar más la mejora de la afinidad.
Tabla 4.
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Se obtuvieron un total de 161 Fabs únicos de secuencia de los barridos de maduración. Los Fabs que mostraban la unión más alta a ECD de huST2L se convirtieron en IgG para caracterización adicional.
Los MAbs ST2M48, ST2M49, ST2M50 y ST2M51 se seleccionaron para una caracterización adicional, y sus secuencias de VH, VL y CDR se muestran en la Tabla 5. Los Mabs ST2 M4 8 , ST2M49, ST2M50 y ST2M51 se unen a ST2L humano en el Dominio III y reaccionan de forma cruzada con ST2L de ratón.
Tabla 5
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Ejemplo 5. Caracterización de anticuerpos anti-ST2L.
Los anticuerpos derivados de varias campañas como se ha descrito anteriormente se caracterizaron además por su capacidad para bloquear la interacción de IL-33/ST2L, por su inhibición de la señalización inducida por IL-33 medida por el ensayo del gen informador NF-kB, la capacidad de los anticuerpos para inhibir las respuestas de mastocitos, por su afinidad contra ST2L humano y de cyno, y reactividad cruzada con ST2L de ratón. El mapeo de epítopos se realizó usando constructos quiméricos de intercambio de dominio de ST2L humano/de ratón como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados de los experimentos se muestran en las Tablas 6, 7 y 8. En las Tablas 7 y 8, "+" indica que el anticuerpo bloquea la interacción de IL-33/ST2L, y "-" indica que no bloquea la interacción de IL-33/ST2L. Los experimentos con CNTO3914 se realizaron usando células de ratón y reactivos debido a la falta de reactividad cruzada con humanos. Se usaron células humanas y reactivos humanos en ensayos para todos los otros anticuerpos.
Los anticuerpos caracterizados se agruparon con los que bloquean la interacción de IL-33/ST2L (mAbs STLM15, STLM62 y CNTO3914) y los que no bloquean la interacción de IL-33/ST2L (mAbs C2519, C2521, ST2M48, ST2M49, ST2M50 y ST2M51). Los anticuerpos que bloquean la interacción de IL-33/ST2L se unen al dominio I de ST2L, mientras que los anticuerpos que no la bloquean se unen al dominio III de ST2L. Los anticuerpos probados inhibieron la señalización en sentido descendente de ST2L como se evaluó mediante el ensayo del gen informador NF-kB y la liberación de citoquinas inducida por IL-33 por la línea celular de basófilos humanos KU812, o en el caso de CNTO3914, evaluado por la proliferación de células Th2 de ratón. Los anticuerpos de unión al Dominio I de ST2L inhibieron las respuestas de los mastocitos humanos a mayor nivel como se evaluó mediante la secreción de citoquinas y quimiocinas en comparación con los anticuerpos anti-ST2L de unión al Dominio III de ST2L. CNTO3914, que se une al dominio I de ST2L y no reacciona de manera cruzada con humano también fue capaz de inhibir las respuestas de mastocitos inducidas por IL-33.
Tabla 6.
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Tabla 7.
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Tabla 8.
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Ejemplo 7. El anticuerpo CNTO3914 de unión al dominio I de ST2L inhibe la hiperreactividad de las vías respiratorias inducida por IL-33 intranasal (AHR), la inflamación de las vías respiratorias y las respuestas de mastocitos de ratón.
Se administraron cuatro dosis intranasales diarias consecutivas de 2 pg/ratón de IL-33 "madura" (R&D Systems) (residuos 109-266 de la SEQ ID NO: 215) a ratones BALB/c hembra. El anticuerpo CNTO3914 anti-ST2L de ratón se dosificó profilácticamente por vía subcutánea a 20 mg/kg (o 2 mg/kg o 0,2 mg/kg) 24 h antes de la primera administración intranasal de IL-33. Los ratones de control recibieron el control de isotipo CNTO5516 o PBS, 24 h antes de la primera administración intranasal de IL-33. La hiperreactividad de las vías respiratorias (AHR) a dosis crecientes de metacolina se midió usando maniobras forzadas con el sistema Flexivent (Scireq, Montreal, Quebec, Canadá). Para la medición de la hiperreactividad de las vías respiratorias (AHR), los ratones se anestesiaron con 100 mg/kg de pentobarbital y 13 mg/kg de fenitoína y se traqueostomizaron antes de conectarlos a FlexiVent. Los ratones se nebulizaron con solución salina para lecturas de referencia y luego con dos dosis (10 y 20 mg/ml) de metacolina. Para solución salina y cada dosis de metacolina, los valores de resistencia (R) se recogieron durante aproximadamente 2 minutos usando la perturbación "instantánea". La resistencia máxima se calculó usando solo aquellos valores con un COD (coeficiente de determinación) superior a 0,9.
Un grupo separado de ratones se trató y analizó para la respuesta celular en los pulmones. Veinticuatro horas después de la última administración de isotipo de mIL-33 o PBS, los ratones se sacrificaron mediante sobredosis de Sleepaway® IP. Los pulmones de los ratones se lavaron con 0,7 ml de PBS frío con BSA al 0,1%. Los fluidos bronquioalveolares (BAL) resultantes se centrifugaron a 1200 rpm durante 10 minutos y los sobrenadantes libres de células se guardaron a -80° C hasta el análisis de citoquinas/quimiocinas. Las muestras de BAL se usaron para los recuentos totales usando un hemocitómetro. Para recuentos de BAL diferenciales, se contaron ~200 células de frotis de citospina después de teñir con wright giemsa al microscopio óptico.
Los sobrenadantes libres de células se recogieron y almacenaron a -80° C hasta su uso para análisis de proteínas Luminex. Se extrajeron los tejidos pulmonares y luego se perfundieron a través del ventrículo derecho usando 5 ml de PBS estéril frío hasta una perfusión adecuada. Los lóbulos pulmonares se colocaron luego en un tubo Fast Prep® que contenía 1 ml de PBS inhibidor de proteasa y se congelaron y almacenaron a -80° C para realizar perfiles de citoquinas/quimiocinas. El ensayo multiplex de citoquinas/quimiocinas se realizó siguiendo el protocolo del fabricante para Murine Millipore 22-plex. La proteasa 1 de mastocitos de ratón (mMCP-1) en el fluido BAL se analizó mediante ELISA (Moredun Scientific).
Hiperreactividad de las vías respiratorias
CNTO3914 inhibió significativamente la hiperreactividad de las vías respiratorias en el modelo de inflamación pulmonar inducida por IL-33 administrada por vía intranasal (Figura 1). CNTO3914 se dosificó por vía subcutánea 24 h antes de cuatro administraciones intranasales consecutivas diarias de 2 pg/ratón mIL-33. La resistencia de las vías respiratorias máxima como se determinó mediante Flexivent disminuyó significativamente con una dosis de CNTO3914 a 20 mg/kg. Cada barra representa la media ± SEM de tres (CNTO5516, un anticuerpo de control de isotipo) a seis ratones por grupo. Los resultados se han repetido en dos estudios separados. La significancia se determinó usando el ANOVA de dos vías con una prueba posterior de Bonferroni, CNTO3914/IL-33 **p<0,05 frente a CNTO5516/IL-33; y ***p<0,001, frente a PBS con el grupo de tratamiento con IL-33.
Inflamación de las vías respiratorias
CNTO3914 inhibió significativamente el reclutamiento de células de lavado broncoalveolar (BAL) en el modelo usado (Figura 2). CNTO3914 se dosificó por vía subcutánea 24 h antes de cuatro administraciones intranasales consecutivas diarias de 2 mg/ratón mIL-33. Los leucocitos de BAL aumentaron significativamente con la administración de IL-33 y fueron inhibidos significativamente por CNTO3914 a 20 mg/kg. Cada barra representa la media ± SEM de tres (CNTO5516, un anticuerpo de control de isotipo) a seis ratones por grupo. Los resultados se han repetido en dos estudios separados. La significancia se determinó usando el ANOVA de dos vías con una prueba posterior de Bonferroni, ***p<0,001.
Respuestas de mastocitos in vivo
Los mastocitos almacenan proteasas incluyendo triptasas y quimasas en sus gránulos, que se liberan rápidamente tras la activación de los mastocitos. La proteasa 1 de mastocitos de ratón (mMCP-1) es una p quimasa liberada por los mastocitos activados y se sabe que es importante para el control de las infecciones por gusanos parasitarias (Knight et al., J Exp Med 192:1849-56, 2000; Huntley et al.., Parasite Immunol 12:85-95, 1990). La medición de mMCP-1 puede usarse como un marcador de activación de mastocitos, y se ha demostrado que se induce en un modelo de inflamación de las vías respiratorias dependiente de mastocitos: ácaros del polvo doméstico (Yu y Chen, J Immunol 171:3808-15, 2003). MMCP-1 como se determina por ELISA (Moredun Scientific) aumentó significativamente en el fluido BAL de ratones administrados con IL-33, y fue inhibido por CNTO3914 de una manera dependiente de la dosis (Figura 3) La significancia se determinó usando el ANOVA unidireccional con una prueba posterior de Tukey, **p<0,01, ***p<0,001, frente al tratamiento con IL-33.
Ejemplo 8. Los anticuerpos de unión al dominio I anti-ST2L inhiben las respuestas de mastocitos in vitro Se evaluaron las respuestas de los mastocitos mediante la liberación de quimiocinas y citoquinas por mastocitos de ratón y humanos, así como por prostaglandina D2 en mastocitos humanos.
El anticuerpo CNTO3914 de unión al dominio I anti-ST2L inhibió la liberación de citoquinas inducida por IL-33 incluyendo GM-CSF (Figura 4A), IL-5 (Figura 4B) y TNFa (Figura 4C) por mastocitos derivados de médula ósea de ratón.
El mab C2494 (STLM62) de unión al dominio I anti-humano ST2L inhibió la liberación de PGD2 inducida por IL-33 por mastocitos derivados de sangre del cordón umbilical humano inducidos por 3 ng/ml de IL-33 a concentraciones de anticuerpo de 2, 10 y 50 pg/ml (Figura 5)
Los anticuerpos C2494 y C2244 de unión al dominio I anti-ST2L inhibieron la liberación de GM-CSF, IL-5, IL-8, IL-13 e IL-10 inducida por IL-33 por mastocitos derivados de sangre de cordón umbilical humano a concentraciones de anticuerpo 50 pg/ml, 10 pg/ml y 2 pg/ml (Figuras 6 y 8A-8E) El grado de inhibición dependía de la citoquina/quimiocina medida, el anticuerpo y la concentración de anticuerpo probada, y los medio usado. El porcentaje promedio de inhibición calculado (%) estaba entre el 50,6-100% en todos los ensayos realizados a una concentración de anticuerpos de 2 pg/ml, y entre el 62-100% a una concentración de anticuerpos de 50 pg/ml (Figura 9)
Los anticuerpos C2521, C2519, ST2M48, ST2M49, ST2M50 y ST2M51 anti-ST2L de unión al Dominio III mostraron una inhibición moderada o ninguna, o estimularon la liberación de citoquinas inducida por IL-33 por los mastocitos (Figuras 7A-7E y 8A-8E) a concentraciones de anticuerpos de 50 pg/ml y 10 pg/ml. El grado de inhibición dependía de la citoquina/quimiocina medida, el anticuerpo probado y el medio usado. El porcentaje de inhibición medio calculado (%) estaba entre -594,4-31,9% en todos los ensayos realizados a una concentración de anticuerpos de 2 pg/ml, y entre -481,5-36% a una concentración de anticuerpos de 50 pg/ml (Figura 9). En algunos ensayos, el anticuerpo ST2M50 inhibió la secreción de GM-CSF, IL-5, IL-10 e IL-13 a una concentración de anticuerpo de 10 pg/ml (Figuras 8A-8E)
El % de inhibición medio se calculó usando la fórmula siguiente: (1-(concentración de citoquina liberada en presencia del mAb)/(concentración de la misma citoquina liberada en respuesta a IL-33 en ausencia de mAb)) x 100. Las concentraciones de citoquinas están en pg/ml. En algunos casos, el % de inhibición es un valor negativo, lo que indica que la liberación de citoquinas en presencia de mAb fue realmente mayor que la liberada en ausencia de mAb. Pueden producirse ligeras variaciones en la potencia de los mAbs dependiendo de las concentraciones de IL-33 usadas para inducir la liberación de citoquinas en los mastocitos. De manera similar, puede haber ligeras variaciones en la actividad de los mAbs dependiendo del medio de ensayo usado (StemPro-34 frente a RPMI/ FCS al 10%). Todos los anticuerpos de unión al Dominio I de ST2L probados inhibieron todas las liberaciones de citoquinas y quimiocinas medidas en por lo menos un 50% como se mide mediante el % de inhibición medio a una concentración de 2 pg/ml, 10 pg/ml o 50 pg/ml.
Ejemplo 9. Los anticuerpos de unión al dominio I de ST2L inhiben la remodelación intranasal inducida por IL-33 de las vías respiratorias.
A ratones C57BL/6 se les dosificó por vía intranasal con 1 pg/ratón de IL-33 "madura" (o PBS) (residuos 109-266 de la SEQ ID NO: 215) en los días D1, D3, D5, D7 y D9 y se analizaron los pulmones en el día 10 o el día 20. Se dosificó el anticuerpo CNTO3914 de ST2L anti-ratón o el control de isotipo (CNTO5516) por vía subcutánea a 2 mg/kg 6 h antes de la primera administración intranasal de IL-33. Los ratones de control recibieron el control de isotipo CNTO5516 o PBS, 6 h antes de la primera administración intranasal de IL-33. Los pulmones inflados se fijaron en formalina tamponada al 10% para histología; Las tinciones usadas para el análisis incluyeron H&E, Tricromía de Masson y pAs .
El tratamiento con IL-33 indujo hipertrofia e hiperplasia epitelial bronquiolar de moderada a marcada con hiperplasia de células caliciformes e infiltrados peribronquiolares mezclados principalmente con eosinófilos. La hipertrofia epitelial bronquiolar y la hiperplasia no fueron evidentes en los animales que recibieron CNTO3914. Las tinciones del tricoma de Masson fueron para determinar la cantidad de colágeno presente; Esta tinción reveló hipertrofia de células caliciformes en animales tratados con IL-33. En los animales tratados con CNTO3914, los infiltrados en los alvéolos y las regiones peribonquiolares estaban ausentes.
Ejemplo 10. Generación de anticuerpos de ST2L completamente humanos.
Se seleccionaron Fabs de unión a ST2L humano adicionales de las bibliotecas de presentación de fagos pIX de novo esencialmente como se describe en el Ejemplo 3, excepto que las bibliotecas se barrieron usando el constructo quimérico HHM-ST2L (SEQ ID NO: 6 , Tabla 1) con el antígeno biotinilado capturado en perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina. La biblioteca de fagos se bloqueó en PBS-T con leche en polvo sin grasa al 3%. La proteína competidora, quimera MHM-ST2L (SEQ ID NO: 7, Tabla 1) se añadió a la solución de bloqueo para impulsar la selección de fagos hacia Fabs que se unirían específicamente a las secuencias de aminoácidos del dominio I de ST2L humano. Las selecciones de fagos se realizaron durante tres rondas, seguidas de selección por ELISA para la unión de Fab a la proteína hST2L-Fc.
Se asilaron diecinueve Fabs con unión a hST2L-Fc de estas selecciones y se seleccionaron adicionalmente para la unión a constructos de ST2L quiméricos (Tabla 1), así como a las proteínas de ST2L de ratón y ST2L humano para mapear el dominio de especificidad, y se caracterizaron por su capacidad para bloquear la interacción de IL-33/hST2L. Los Fabs ST2F1, ST2F4 y ST2F6 bloquearon la interacción de hIL-33/ST2L y se unieron el Dominio I de ST2L y avanzaron hacia la maduración por afinidad.
Tabla 9
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Ejemplo 11. Maduración por afinidad de Fabs de unión a ST2L humano
Se maduraron por afinidad ST2F1, ST2F4 y ST2F6 usando un proceso de maduración "en línea" descrito en Shi et al., J Mol Biol 397:385-396, 2010 y la Publicación de Patente Internacional N° WO2009/085462 y el Ejemplo 4. Se hicieron bibliotecas de maduración por afinidad para ST2F1, ST2F4 y ST2F6 diversificando las bibliotecas de cadena ligera correspondientes, B3, L6 y L6 , respectivamente, y combinando las bibliotecas con las regiones Fab de VH. El esquema de diversificación de los residuos de la cadena ligera para las bibliotecas de maduración por afinidad de L6 y B3 se muestra en la Tabla 10. La numeración de la posición es de acuerdo con Kabat. Para el barrido de maduración por afinidad, se capturó huST2-ECD-Fc biotinilado en perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina (SA) a concentraciones de 10 nM para la ronda 1, 1 nM para la ronda 2 y 0,1 nM para la ronda 3. Se realizó el lavado final de la ronda 3 durante la noche a temperatura ambiente en presencia de huST2L-ECD-Fc. sin marcar
Tabla 10.
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Las selecciones de la biblioteca de maduración de la cadena ligera de ST2F6 produjeron aglutinantes mejorados (ST2F14, ST2F17, ST2F31 y ST2F41) (Figura 10 y Figura 11). Estos fueron examinados como Fabs usando ProteOn y demostraron mejoras modestas de afinidad de 2nM a 400pM.
Para mejorar aún más la afinidad de ST2F14, ST2F17, ST2F31 y ST2F41, la cadena pesada común ST2H41 en ST2F14, ST2F17, ST2F31 y ST2F41 se aleatorizó en las posiciones de HCDR1 y de HCDR2 Kabat 31, 32, 33, 35, 50, 52, 53, 56 y 58 usando un esquema de diversificación mostrado en la Tabla 11. La biblioteca de cadenas pesadas resultante se emparejó con las cuatro cadenas ligeras mejoradas por afinidad ST2L32, ST2L35, ST2L49 y ST2L59, y esta biblioteca se barrió y seleccionó como se describe para las bibliotecas de maduración de cadenas ligeras. Los fabs con unión mejorada con respecto a ST2F14 se aislaron y se convirtieron en IgG para caracterización adicional. Los anticuerpos resultantes (STLM103, STLM107, STLM108, STLM123, STLM124, STLM206, STLM207, STLM208, STLM209, STLM210, STLM211, STLM212, STLM213, STLM214, STLM215, STLM216, STLM217, STLM218, STLM219, STLM220, STLM221, STLM222) (Figura 10 y Figura 11) tienen marcos derivados de VH3-23 o Vk-L6. Todos los anticuerpos se unen al Dominio I de ST2L y bloquean la interacción de IL-33/ST2L.
Tabla 11.
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Se diseñaron y expresaron variantes adicionales para STLM208 VH ST2L257 para reemplazar un motivo DP al comienzo de HCDR3. Las secuencias de las variantes se muestran en la Figura 12.
Ejemplo 11. Adaptación del marco humano (HFA) de C2494
El proceso de adaptación del marco se realizó como se describe esencialmente en la patente de Estados Unidos N° US2009/0118127 y Fransson et al., J Mol Biol 398:214-231, 2010. Brevemente, las secuencias de la cadena pesada y ligera se compararon con las secuencias de la línea germinal humana (solo los alelos "0 1 " a partir del 1 de octubre de 2007) usando la búsqueda BLAST frente a la base de datos IMGT (Kaas, et al., Nucl. Acids. Res.
32, D208-D210, 2004; Lefranc et al., Nucl. Acid Res., 33, D593-D597, 2005). De este conjunto de genes de la línea germinal humana, se eliminaron los genes redundantes (1 0 0 % idénticos a nivel de aminoácidos) y aquellos con residuos de cisteína no emparejados. Los genes de la línea germinal humana coincidentes más cercanos restantes tanto en el marco como en las regiones de CDR se eligieron como los marcos humanos aceptores. Se seleccionaron un total de 9 VL y 7 VH de los marcos de la línea germinal humana en base a la homología de secuencia global y las longitudes de c Dr , así como la similitud de CDR. Se seleccionó FR-4 en base a la similitud de secuencia de los genes de la línea germinal IGHJ/IGJK, JK2 para las cadenas VL y JH1 para las cadenas VH (Kaas, et al., Nucl. Acid Res. 32, D208-D210, 2004; Lefranc M.-P et al., Nucl. Acid Res., 33, D593-D597, 2005) con secuencia de C2494). Luego, los CDR de C2494 (subrayados en la Figura 14) Se transfirieron a los marcos aceptores humanos seleccionados para generar las variantes de HFA, excepto en la región correspondiente a la CDR-H1 de Vh. Para esta región, se transfirieron una combinación de CDR y HV, o una HCDR2 más corta (referida a Kabat-7, ver la Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2009/0118127) del anticuerpo no humano a las FR humanas porque los residuos de HCDR2 resaltados en gris en Figura 14 no se han encontrado en contacto en complejos antígeno-anticuerpo de estructuras conocidas (Almagro, J Mol Recognit. 17, 132, 2004).
En la Figura 14 se muestra la secuencia de proteínas madura de C2494 (VL: SEQ ID NO: 52; VH: SEQ ID NO: 48). En la figura, los residuos de CDR (Kabat) están subrayados, los giros de HV de Chothia indicados por debajo de las CDR, y los residuos transferidos a los marcos humanos seleccionados indicados bajo la HV (HFA). Los residuos de HCDR2 resaltados en gris no se transfirieron en todas las variantes.
Se construyó un modelo de homología 3D para el fragmento Fv de C2494 usando el módulo de modelado de anticuerpos de MOE (CCG, Montreal). El modelo se utilizó para la evaluación de las cargas de desarrollo, como la metionina expuesta y los residuos de triptófano, la N-glucosilación potencial y los motivos de desamidación. En LCDR3, hay un residuo Met (M94) potencialmente expuesto, basado en el modelo estructural Fv. Para eliminarlo, se generó y caracterizó una variante (STLL280, O12b) con una mutación M94L. Para la cadena pesada, el residuo R en el motivo CAR (residuos de Chothia 92-94, Figura 14) justo antes de que HCDR3 pueda afectar negativamente a un grupo de residuos cargados negativamente (residuos de Chothia D31, D32, D96 y D101a, Figura 14), que puede ser importante para la unión. Se generó y caracterizó una VH con sustitución de arginina por leucina en los residuos 94 de Chothia (CARACAL).
Los mAbs que combinan las cadenas pesadas y ligeras diseñadas, junto con los originales de C2494, se expresaron y analizaron para determinar la unión a ST2l humano. A partir de los mAbs de HFA generados, los mAbs con cadenas de VH que tienen IGHV1-24*01 (SEQ ID NO: 148) e IGHV1-f*01 (SEQ ID NO: 149), los marcos de cadena pesada (STLH195 y STLH194) expresaron bien los anticuerpos y se unieron a ST2L cuando se combinan con varias cadenas ligeras de HFA que tienenIGKV3-15*01 (L2) (SEQ ID NO: 150), IGKV1-9*01 (L8 ) (SEQ ID NO: 151), IGKV1-5*01 (L12) (SEQ ID NO: 152), IGKV1-12*01 (L5) (SEQ ID NO: 153), IGKV1-39*01 (012) (SEQ ID NO: 154), IGKV1-27*01 (A20) (SEQ ID NO: 155) o IGKV1-33*01 (018) (SEQ ID NO: 156) marcos (STLL280, STLL278, STLL277, STLL276, STLL275, STLL274, STLL273, STLL272)..
Las secuencias de VH y VL de HFA se muestran en la Tabla 12. Los residuos transferidos están subrayados, y las sustituciones adicionales descritas anteriormente se resaltan en gris. La Tabla 13 muestra las SEQ ID NO: así como pDR (plásmido) e CBIS ID únicos para cada VH y VL de HFA. La combinación de la cadena pesada y ligera para los mAbs generados seleccionados para caracterización adicional se muestra en la Tabla 14.
La Tabla 15 muestra los marcos humanos (regiones V y J combinadas) usados para transferir CDR de C2494.
Tabla 12. Cadenas VL adaptadas al marco (acopladas a la secuencia JK2). Las CDR están subrayados.
. >VL2494 (original) (SEQ ID NO: 52)
ETTVTQSPASLSVATGEKVTIRCmíTDIDDV1HWYQQKPGEPPKLLISEGNTLRP GVPSRFSSSGYGTDFVFTIENTLSEDVADYYCLQSDNMLTFGAGTKLELK
>VL2494-IGKV1 -33*01 018 (SEQ ID NO: 135) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCITNTDIDDV1HWYQQKPGKAPKLLIYEGNTLRP GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCLQSDNMLTFGQGTKLEIK
>VL2494-IGKV1-27*01 A20 (SEQ ID NO: 136)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCITNTDIDDV1HWYQQKPGKVPKLLIYEGNTLRP GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLQSDNMLTFGQGTKLEIK
>VL2494-IGKV1-39*01012 (SEQ ID NO: 137)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCITOTDIDDV1HWYQQKPGKAPKLLIYEGNTLRP GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQSDNMLTFGQGTKLEIK
>VL2494-IGKV1 -12*01 L5 (SEQ ID NO: 138)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCITNTDIDDV1HWYQQKPGKAPKLLIYEGNTLRP GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQSDNMLTFGQGTKLEIK
>VL2494-IGKV1 -5*01 L12 (SEQ ID NO: 139)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCITNTDIDDV1HWYQQKPGKAPKLLIYEGNTLRP GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCLQSDNMLTFGQGTKLEIK
>VL2494-IGKV1 -9*01 L8 (SEQ ID NO: 140)
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCITNTDIDDV1HWYQQKPGKAPKLLIYEGNTLRP GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQSDNMLTFGQGTKLEIK
>VL2494-IGKV3-15*01 L2 (SEQ ID NO: 141)
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCITNTDIDDV1HWYQQKPGQAPRLLIYEGNTLRP GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCLQSDNMLTFGQGTKLEIK
>VL2494-IGKV1 -39*01 O12b (SEQ ID NO: 142)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC ITNTDIDDV1H WYQQKPGKAPKLLIY EGNTLRP GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC LQSDNLLT FGQGTKLEIK
Cadenas de VH adaptadas al marco acopladas a JH1
>VH2494(original) (SEQ ID NO: 48)
EVQLQQSVAELVRPGASVKLSCTASAFNIKDDYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPAIGNTEYAPKFQD KATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCALGDFYAMDYWGQGTSVTVSS
>VH2494-IGHV1-f*01 (SEQ ID NO: 143)
EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSAFNIKDDYMHWVQQAPGKGLEWMGRIDPAIGNTEYAEKFQG RVTITADT STDTAYMEL SSLRSE DTAVYYCATGDFYAMDYWGQGTLVTVS S
>VH2494-IGHV1 -24*01 (SEQ ID NO: 144)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSAFNIKDDYMHWVRQAPGKGLEWMGRIDPAIGNTEYAPKFQD RVTMTEDTS TDTAYME LSSLRSE DTAVYYCA|GDFYAMDYWGQGTLVTVS S
Tabla 13.
Figure imgf000037_0002
Tabla 14.
Figure imgf000037_0001
Tabla 15.
Figure imgf000038_0001
Ejemplo 12. Diseño de alanina y mutantes de la línea germinal humana para exploración de paratopo
Se llevó a cabo mutagénesis dirigida al sitio para evaluar las contribuciones de unión de los residuos de CDR individuales, así como algunos residuos que tienen un efecto potencial sobre otras características de los anticuerpos. En base al modelo molecular de C2494 Fv anterior, se predijo que un subconjunto de residuos de CDR expuestos al solvente estaba implicado en la unión del antígeno. Estos fueron mutados a alanina y/o el residuo 'tipo humano' correspondiente, que es el residuo correspondiente en el gen de la línea germinal más cercano. La sustitución de D101aA (residuos de Chothia), (D104A en la SEQ ID NO: 48) en VH de C2494 disminuyó koff aproximadamente 4 veces, de 1,43x10-4 a 3,2x10-5.
A medida que la sustitución de D101aA disminuyó koff del Fab de C2494 en la unión a ST2L se esperaba que la misma mutación también pudiera mejorar la constante de ruptura en las variantes de HFA de C2494. Por tanto, D101aA (numeración de Chothia) se incorporó en la VH de STLH194 (> VH2494-IGHV1-f*01, SEQ ID NO: 143) para generar un VH STLH201 (SEQ ID nO: 145). STLH201 se emparejó con 7 cadenas ligeras STLL280, STLL277, STLL276, STLL275, STLL274, STLL273 y STLL272 (Tabla 13 y Tabla 14) para generar los mAbs STLM226, STLM227, STLM228, STLM229, STLM230, STLM231 y STLM232 que se caracterizaron adicionalmente. Los mAbs STLM226, STLM227, STLM228, STLM229, STLM230, STLM231 y STLM232, por lo tanto, tienen secuencias de LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1 y HCDR2 idénticas en comparación con el anticuerpo C2494 original y una HCDR3 diferente (SEQ ID NO: 146, Gd FYAM). Además, el anticuerpo STLM266 VL STLM280 tenía una LCDR3 única: LQSDNLLT (SEQ ID NO: 147)
STLH201 (SEQ ID NO: 145):
EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSAFNIKDDYMHWVQQAPGKGLEWMGRIDPAIGNTEYAEKFQG RVTITADT STDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATGDFYAMAYWGQGTLVTVSS
Incorporación a HCDR3 de sustitución D101aA (numeración de Chothia):
SEQ ID NO: 146: GDFYAMAY
el anticuerpo STLM266 VL STLM280 tenía una LCDR3 única: LQSDNLLT (SEQ ID NO: 147)
Ejemplo 13. Caracterización de anticuerpos anti-ST2L.
Los anticuerpos obtenidos a partir de la presentación de fagos, el hibridoma y las campañas de adaptación del marcos humanos se caracterizaron en varios ensayos que incluían la unión a ECD de huST2L, ECD de ST2L de cyno, mediciones de afinidad, unión a quimeras humanas/de ratón para determinar la unión al dominio, el ensayo de inhibición de receptor-ligando, ensayos de gen informador y ensayos de respuesta de mastocitos.
Las afinidades de los anticuerpos derivados de las campañas de presentación en fagos a ST2L humano y de cyno, así como su especificidad de unión a ST2L humano se muestran en la Tabla 16. Todos los anticuerpos en la Tabla 16 se unieron al Dominio I de ST2L humano.
Tabla 16.
Figure imgf000039_0001
Las afinidades de los anticuerpos anti-ST2L de la campaña de HFA con respecto al original (STLM62, C2494) se muestran en la Tabla 17. Las afinidades se analizaron mediante ProteOn. Los experimentos se realizaron a 25° C usando el tampón de PBS-TE de ProteOn (PBS, P20 al 0,005% y EDTA 3 mM) como tampón en ejecución. Para realizar los experimentos, se preparó un chip sensor GLC mediante inmovilización covalente de Fc anti­ humano de cabra (-5800 RU) se capturaron 122-146 unidades de respuesta (RU) de Mab. La captura de Mab fue seguida de la inyección de ECD de ST2L de 0,024-15 nM (diluciones de 5 veces) durante 4 min (200 |jl a 50 pl/min). La disociación se monitorizó durante 30 minutos para todas las reacciones. La regeneración se realizó usando dos pulsos de 15 segundos de glicina 10 mM pH 1,5. Los datos se ajustaron a 1:1 con un modelo de deriva de referencia.
Las tasas de asociación para las muestras son rápidas, se usó el modelo langmuir con transferencia de masa para el ajuste de la curva y la estimación de la afinidad. Todas las muestras tuvieron tasas de ruptura más rápidas que el clon original y el Mab de control. La diferencia en la tasa de ruptura fue el principal contribuyente a la afinidad más baja de las variantes de HFA en comparación con el anticuerpo original.
Tabla 17.
Figure imgf000040_0002
Tabla 18.
Figure imgf000040_0001
continuación
Figure imgf000041_0001
Los anticuerpos seleccionados se analizaron para determinar las respuestas de los mastocitos que miden la inhibición de la liberación de IL-5, IL-13 e IL- 8 inducida por 3 ng/ml de IL-33 de mastocitos derivados de la sangre del cordón umbilical humano como se describe usando 100 pg/ml, 10 pg/ml, 1 pg/ml, 0 , 1 pg/ml o 0 , 01 pg/ml de anticuerpo en RPMI FCS al 10%. En estas condiciones de ensayo, todos los anticuerpos probados inhibieron la liberación de citoquinas IL-5, IL-13 e IL- 8 inducidas por IL-33 en aproximadamente un 40%-100% a una concentración de anticuerpo de 100 pg/ml en comparación con una muestra de control inducida con IL-33.
Ejemplo 14. El anticuerpo anti-ST2L inhibe las vías de señalización en sentido descendente en basófilos humanos
Se probaron los anticuerpos anti-ST2L para su capacidad para inhibir la señalización de p38 MAPK en basófilos humanos.
Se recogió sangre completa en tubos heparinizados y se llevó a temperatura ambiente (RT) antes del inicio del ensayo. Se alicuotó 1 ml de sangre en tubos cónicos de 50 ml y se añadió o anticuerpo anti-ST2L (STLB252) o control de isotipo (CNTO 8937) diluido en PBS para una concentración final de 2, 20 o 200 pg/ml. Los tubos se dieron vueltas suavemente para mezclar y se colocaron en una incubadora a 37° C x 30 minutos, dando vueltas suavemente después de 15 minutos. Luego, la sangre se tiñó con anticuerpos marcados con fluorocromo contra antígenos de la superficie celular (CD123-FITC, CRTH2-PCP-CY5.5 y CD45-APC-C7) y los tubos se incubaron a 37° C durante 15 minutos. Se añadió 1 ml de medio de cultivo calentado (RPMI-1640/FBs al 10 %/pen-strep al 1 %) a cada tubo antes de añadir IL-33 diluido en medio de cultivo calentado para una concentración final de 10 ng/ml. Las muestras se incubaron a 37° C x 10 minutos antes de la adición de 20 ml de tampón BD Phosflow Lyse/Fix precalentado a cada tubo, para lisar simultáneamente los glóbulos rojos y fijar las muestras. Los tubos se mezclaron bien invirtiendo 10 veces y se incubaron a 37° C x 10 minutos. Las muestras se lavaron con 20 ml de RT PBS estéril, se resuspendieron en 2 ml de 1x RT BD Perm/Wash Buffer, y se incubaron a RT x 30 minutos. Las muestras se lavaron una vez con 2 ml de tampón BD Perm/Wash y luego se resuspendieron en 400 pl de tampón BD Perm/Wash. Se añadió anticuerpo marcado con PE contra p38-MAPK intracelular (vCell Signaling, N° de Cat.
6908S) y las muestras se incubaron 30 minutos a temperatura ambiente, protegidas de la luz. Las muestras se lavaron una vez con 5 ml de tampón Perm/Wash antes de resuspenderse en 100 pl de tampón FACS y se transfirieron a una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Las muestras se analizaron usando un citómetro de flujo BD LSRII que utiliza un sistema de alto rendimiento (HTS) que recopila tantos eventos como sea posible para cada muestra. Los datos se analizaron usando el software FloJo. Los basófilos se identificaron como CD45+CRTH2+CD123+ y se evaluó el porcentaje de basófilos positivos para p38 MAPK para cada condición. La preincubación de sangre completa con mAB anti-ST2L (STLB252) dio como resultado una inhibición dependiente de la dosis de la fosforilación de p38-MAPK inducida por IL-33, mientras que no se observó ningún efecto con el control de isotipo (CNTO 8937). El anticuerpo de ST2L anti-humano bloqueó específicamente la activación de basófilos por IL-33 humana recombinante en el contexto de la sangre completa. Los resultados sugieren que los anticuerpos anti-ST2L inhiben la señalización por IL-33 endógena in vivo.
Tabla 19.
Figure imgf000042_0001
Ejemplo 15. Acoplamiento al objetivo in vivo por anticuerpo anti-ST2L
Modelo in vivo de 6 horas de mIL-33 intranasal de reclutamiento de células BAL
Se administró una dosis individual de 1,2 pg/ratón de mIL-33 (R&D systems #3626-ML/CF) o PBS a ratones Balb/c macho (6 - 8 semanas de edad, Taconic). Anticuerpo CNTO 3914 de sT2L anti-ratón de rata o a 2, 0,2, 0,06 o 0,02 mg/kg, 24 horas antes de la primera administración intranasal de mIL-33. El mAb de control de isotipo (ITC) CNTO 5516 se dosificó por vía subcutánea a 2 mg/kg. Seis horas después de la administración de mIL-33 (o PBS), se sacrificaron los ratones y se recogió sangre para el análisis del suero. Los lavados broncoalveolares (BAL) se realizaron inyectando dos volúmenes de 0,7 ml de PBS/ BSA al 0,1% en los pulmones y recuperando el efluente. Los BAL se centrifugaron (1200 rpm, 10 minutos) y el sedimento celular se resuspendió en 200 pl de PBS para recuentos de células totales y diferenciales usando un hemocitómetro (en preparaciones de citoespina teñidas con Giemsa de Wright).
Medición de CNTO 3914 en suero de ratón
Se bloquearon placas MSD SA-STD con 50 pl por pocillo de tampón de ensayo durante 5 minutos. Se volcaron las placas para eliminar el tampón de ensayo y se golpearon sobre toallas de papel. Se añadieron 50 pl por pocillo de 1,4 pg/ml de quimera ST2L/IL1R4/Fc de ratón recombinante biotinilada de (R&D System) en tampón de ensayo y se incubaron durante la noche en el refrigerador. Se añadieron 150 pl de tampón de ensayo a cada pocillo de las placas prerecubiertas sin eliminar el reactivo de recubrimiento y se incubaron durante 30 minutos. Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado en el lavador de placas. Las placas se golpearon ligeramente sobre toallas de papel para eliminar el tampón de lavado residual. Se añadieron 50 pl por pocillo de muestra de CNTO 3914 a cada pocillo de la placa. La placa se incubó durante una hora con agitación en vórtice suave a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado en el lavador de placas. Se añadieron a cada pocilio de la placa 50 j l por pocillo de titulación de IgG1b anti-ratón de ratón marcado con rutenio (BD Biosciences). La placa se incubó durante una hora con agitación en vórtice suave a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado en el lavador de placas. Se añadieron l5o j l de tampón de lectura a cada pocillo de la placa. Las placas se leyeron inmediatamente en el lector MSD sector imager 6000 para los niveles de luminiscencia.
Ensayo de sangre completa
La sangre se diluyó 1:4 en medio DMEM penicilina al 1% solución de estreptomicina /-10 ng/ml de IL-33 de ratón en tubos de filtro Sarstedt. Los tubos se incubaron a 37° C durante la noche, luego se midieron los niveles de citoquinas y quimiocinas en los sobrenadantes utilizando el kit Millipore Milliplex Mouse Cytokine/Chemokine de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Resultados
El anticuerpo anti-ST2L fue detectable en el suero de ratones 24 horas después de la dosificación con 0,2 o 2 mg/kg de CNTO 3914 (Figura 16A)
La administración intranasal de IL-33 indujo el reclutamiento celular a las vías respiratorias a las 6 h (Figura 16B) La administración de mAb anti-ST2L redujo el reclutamiento de células BAL; 0.2 mg/kg fue la dosis mínima necesaria para ver una inhibición significativa del reclutamiento de células BAL (Figura 16B) La significancia estadística se calculó usando ANOVA unidireccional.
La sangre completa estimulada con IL-33 de ratón mostró niveles aumentados de citoquinas y quimiocinas, incluyendo IL- 6 (Figura 16C) y MCP-1 (Figura 16D), después de 24h. En ratones a los que se les administró 20 mg/kg o 2 mg/kg de mAb anti-ST2L CNTO 3914, los niveles de IL- 6 y MCP-1 se redujeron en comparación con CNT05516 (control isotípico de IgG1 anti-ratón), lo que implica el acoplamiento con el objetivo. La dosis mínima que se correlacionó con la inhibición en el análisis de sangre completa, 2 mg/kg, también inhibió el reclutamiento de células BAL (Figura 16B)
Colectivamente, estos datos confirman que el mAb anti-ST2L alcanza el sitio de acción y se logró el efecto farmacológico previsto (implica acoplamiento con el objetivo).
Ejemplo 16. Epítopos de anticuerpos anti-ST2L
Se realizaron estudios de mapeo de epítopos y de competencia para seleccionar los anticuerpos anti-ST2L.
Ensayos de unión competitiva
Se realizaron ensayos de unión competitiva para evaluar diferentes grupos de epítopos de unión para mAbs anti-ST2L. Se recubrieron 5 j l (10 jg/ml) de proteína de ECD de ST2L en una placa MSD HighBind (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) por pocillo durante 2 horas a temperatura ambiente. Se añadieron ciento cincuenta microlitros de tampón MSD Blocker A al 5% (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) a cada pocillo y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con tampón h Ep ES 0,1 M, pH 7,4, seguido de la adición de la mezcla del colorante fluorescente MSD (sulfo tag, éster n Hs ) marcado con anticuerpo anti-ST2L individual con diferentes competidores. El anticuerpo marcado, 10 o 30 nM, se incubó con concentraciones crecientes de anticuerpos competidores, de 1 nM a 2 o 5 jM, y luego se añadió a los pocillos designados en un volumen de mezcla de 25 jl. Después de 2 horas de incubación con agitación suave a temperatura ambiente, las placas se lavaron 3 veces con tampón HEPES 0,1 M (pH 7,4). Se diluyó MSD Read Buffer T con agua destilada (4 veces) y se dispensó a un volumen de 150 jl/pocillo y se analizó con un SECTOR Imager 6000.
Los siguientes anticuerpos se usaron en ensayos de competición: anticuerpos STLM208, STLM213, C2244 (STLM15) y C2494 (STLM62) neutralizantes de unión al Dominio I de ST2L, anticuerpo C2539 de unión al Dominio III de ST2L y un anticuerpo C2240 anti-ST2L no neutralizante que se une al Dominio I de ST2L. La Figura 17A y la 17B muestran los experimentos de competencia. En base al experimento, los conglomerados de epítopos identificados fueron: BinA: mAbs C2244, C2494, STLM208 o STLM213; BinB: mAb C2240, BinC: C2539. Los anticuerpos que bloquean la interacción de IL33/ST2L e inhiben las respuestas de los mastocitos se encontraron en el mismo conglomerado de epítopos y competían entre sí. El resumen de los datos de la competencia se muestra en la Tabla 20.
Tabla 20.
Figure imgf000044_0001
Mapeo de epítopos: análisis de intercambio H/D
Para el intercambio H/D, el procedimiento usado para analizar la perturbación de anticuerpos es similar al descrito anteriormente (Hamuro, Y., et al., Journal of Biomolecular Techniques, 14:171-182, 2003; Horn, J.R., et al.., Biochemistry, 45:8488-8498, 2006) con alguna modificación. Se incubo ECD de ST2 recombinante (expresado a partir de HEK293E con el marcador His C-terminal) (residuos 18-328 de la SEQ ID NO: 157) en una solución de agua deuterada durante tiempos predeterminados, dando como resultado la incorporación de deuterio en átomos de hidrógeno intercambiables. El ECD de ST2 deuterado se capturó en una columna que contenía moléculas Fab de C2244 anti-ST2L inmovilizadas y luego se lavó con tampón acuoso. La proteína de ECD de ST2 intercambiada se eluyó de la columna y se determinó la localización de fragmentos que contenían deuterio mediante digestión con proteasa y análisis de espectrometría de masas.
La Figura 18 muestra un mapa de intercambio de H/D simplificado del ECD de ST2humano (ST2 soluble) complejado con Fab de C2244. Los residuos 18-31 de ECD de ST2 de la SEQ ID NO: 119 (residuos de aminoácidos RCPrQg KPSYTVDW;; SEQ ID NO: 210) estaban protegidos por el Fab (correspondiente a los residuos 35-48 de ST2L de longitud completa de la SEQ ID NO: 1. Los datos indican que C2244 se une al epítopo RCPRQGKPSYTVDW; SEQ ID NO: 210), y que es probable que los anticuerpos que compiten con C2244 (C2494, STLM208 o STLM213) se unan al mismo epítopo o se superpongan.
Mapeo de epítopos por mutagénesis
Se generaron varios mutantes de ST2L que tienen sustituciones a los residuos de ratón correspondientes en el Dominio I de ST2L. Los anticuerpos probados no reaccionan de forma cruzada con ST2L de ratón, por lo tanto, se espera que las variantes de ST2L con unión anulada y/o reducida sean indicativos de residuos de epítopos en los sitios de sustitución en ST2L. Las variantes se hicieron en el constructo HH-ST2L que tenía los residuos 19-205 de ST2L de longitud completa de la SEQ ID NO: 1 usando métodos estándar. Los anticuerpos se probaron para la unión a las variantes de ST2L por ELISA o Proteon.
Resonancia de plasmones de superficie
Los estudios de unión se realizaron usando el sistema ProteOn XPR36 Protein Interaction Array (Bio-Rad) (Bravman T, et al. Anal Biochem 358:281-288, 2006). La mezcla de Fc antihumano/anti-ratón (Jackson ImmunoResearch, N° de Cat., 109-005-098/115-005-071) se inmovilizó en el chip sensor GLC mediante química de acoplamiento de aminas. El mAb anti-ST2L individual se capturó luego mediante una solución de anticuerpo que fluía (1 |jg/ml) preparada en PBS que contenía 0,5% de Nonidet P-40 y 0,5% de Na-desoxicolato). La señal en las superficies alcanzó ~250 unidades de resonancia (RU, 1 RU = 1 pg de proteína/mm2) en las superficies recubiertas con anti-Fc, confirmando que estos anticuerpos capturan específicamente mAbs anti-ST2L. Después de una rotación de 90° del sistema de fluido, se inyectó un tipo salvaje de ST2L-D1D2 o proteínas variantes (0,5 mg/ml en PBS que contenía 0,5% de Nonidet P-40 y 0,5% de Na-desoxicolato) en los canales de flujo paralelos. Todos estos ensayos se realizaron a 25° C. Las señales dependientes de ST2L-D1D2 en las superficies se obtuvieron mediante referenciación haciendo, sustrayendo la respuesta observada en las superficies inmovilizando los anticuerpos solos, y la señal observada inyectando el vehículo solo (lo que permite la corrección de las respuestas independientes de la unión). Los sensorgramas resultantes se ajustaron mediante el modelo de interacción 1:1 más simple (software de análisis ProteOn), para obtener las correspondientes constantes de tasa de asociación y disociación (ka y kd) La Figura 19 muestra las variantes de ST2L que se hicieron y la afinidad de los anticuerpos anti-ST2L ST2B206 y ST2B252 por las variantes. La variante 93NL94 (sustitución 93TF94-> 93NL94) redujo la afinidad de unión de STLM208 y STLB252 en aproximadamente 5 veces de aproximadamente 10,8x10' 12 M a aproximadamente

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un antagonista de anticuerpo aislado, o fragmento del mismo, que se une específicamente al Dominio I (SEQ ID NO: 9) de ST2L humano, que comprende una región variable de la cadena pesada (VH) y una región variable de la cadena ligera (VL), en donde:
(a) la VH comprende la SEQ ID NO: 191; y
(b) la VL comprende la SEQ ID NO: 209.
2. El antagonista de anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en donde el antagonista de anticuerpo es de tipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, opcionalmente tiene una sustitución en una región Fc, y opcionalmente en donde la sustitución comprende una sustitución M252Y/S254T/T256E, V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, o S228P/L234A/L235A, en donde la numeración de los residuos es de acuerdo con la numeración de la EU.
3. Un polinucleótido aislado que codifica el antagonista de anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1­ 2.
4. Un vector que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 3.
5. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 4.
6. Un método para producir un antagonista de anticuerpo, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 5 y recuperar el antagonista de anticuerpo de la célula huésped.
7. Una composición farmacéutica que comprende el antagonista de anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y un portador farmacéuticamente aceptado.
8. El antagonista de anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o la composición farmacéutica de la reivindicación 7 para su uso en terapia.
9. El antagonista de anticuerpo aislado o la composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la terapia es el tratamiento o prevención de una enfermedad pulmonar, opcionalmente en donde el tratamiento o prevención comprende:
a) inhibir la respuesta de mastocitos en un paciente, opcionalmente en donde la inhibición de la respuesta de mastocitos comprende inhibir el nivel de GM-CSF, IL-5, IL-8, IL-10 o IL-13 liberado por mastocitos derivados de sangre del cordón umbilical humano en por lo menos un 50% con 50 pg/ml de anticuerpo; y/o b) inhibir de la interacción de IL-33 y ST2L en un sujeto.
10. El antagonista de anticuerpo aislado o composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la enfermedad pulmonar es asma, hiperreactividad de las vías respiratorias, sarcoidosis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis pulmonar idiopática (FPI), fibrosis quística, esclerodermia, rinitis alérgica., o está asociada con el reclutamiento de células inflamatorias en el pulmón, hiperplasia de células caliciformes, o secreción de mucosa aumentada o respuesta de mastocitos.
11. El antagonista de anticuerpo aislado o composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la enfermedad pulmonar es asma.
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