JP2015516817A - Ｓｔ２ｌ拮抗物質及び使用方法 - Google Patents

Ｓｔ２ｌ拮抗物質及び使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＳＴ２Ｌ拮抗物質、前記拮抗物質又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド、並びに上記のものを製造及び使用する方法に関する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年３月１３日出願の米国出願番号第１３／７９８，２０４号、２０１３年３月１３日出願の米国出願番号第１３／７９８，２２６号、２０１２年４月３０日出願の米国仮出願第６１／６４０，４０７号及び２０１２年４月３０日出願の米国仮出願第６１／６４０，２３８号の恩典を主張するものであり、前記公報の内容をすべて参照により本明細書に援用する。
（発明の分野）
本発明は、ＳＴ２Ｌ拮抗物質、当該拮抗物質又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド、並びに前記のものの製造方法及び使用方法に関する。
ＳＴ２Ｌ（ＩＬ−１ＲＬ１又はＩＬ−３３Ｒα）は、Ｔ細胞、ＮＫ／ＮＫＴ細胞、好塩基球、好酸球、マスト細胞、並びに新たに記述された非Ｂ／非Ｔ２型自然リンパ球細胞であるｎｕｏｃｙｔｅｓ及びナチュラルヘルパー細胞を包含する多種多様な免疫細胞の細胞表面に発現された、Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１受容体ファミリーメンバーである。ＳＴ２Ｌ発現はまた、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ及び好中球上でも生じ得る。ＳＴ２Ｌはまた、Ｔｏｌｌ様受容体であるＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＴＬＲ９の反応性を下方制御し得るだけでなく、そのリガンドＩＬ−３３による活性化及び付属タンパク質ＩＬ−１ＲＡｃＰとの会合によって２型サイトカインの放出をも生じさせ得る。ＩＬ−３３は、その全長型がホメオスタシス中には上皮細胞及び内皮細胞の核内にするが、壊死すると切断されて放出され得るので「アラーミン」と称されてきた。
ＳＴ２Ｌシグナル伝達は、付属タンパク質ＩＬ−１ＲＡｃＰを予め形成されたＳＴ２Ｌ／ＩＬ−３３複合体と会合させる必要がある。付属タンパク質ＩＬ−１ＲＡｃＰはＩＬ−１α／βシグナル伝達複合体と共有される。ＳＴ２Ｌ、ＩＬ−３３及びＩＬ−１ＲＡｃＰの相互作用モデル並びにＩＬ−１Ｒ１とＩＬ−１ＲＡｃＰの間の相互作用モデルが提案されている（Ｌｉｎｇｅｌら著、Ｃｅｌｌ、第１７巻、１３９８〜１４１０頁、２００９年、Ｗａｎｇら著、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、第１１巻、９０５〜１１頁、２０１０年）。近年、ＳＴ２Ｌ／ＩＬ−３３／ＩＬ−１ＲＡｃＰは、マスト細胞上のｃ−Ｋｉｔ、すなわち幹細胞因子（ＳＣＦ）の受容体とシグナル伝達複合体を形成することも分かった。ＩＬ−３３は、初代マスト細胞内ではＳＣＦに依存してサイトカイン産生を引き起こした（Ｄｒｕｂｅら著、Ｂｌｏｏｄ、第１１５巻、３８９９〜９０６頁、２０１０年）。
ＳＴ２Ｌの活性化は、過剰な２型サイトカイン反応（特にＩＬ−５及びＩＬ−１３）、マスト細胞及び好酸球の活性化並びに気道過敏症をもたらし、しかもＮＫＴ細胞からのＩＦＮγの誘導並びにマスト細胞からのＩＬ−１β及びＩＬ−６の誘導によってＴｈ１及びＴｈ１７応答を増幅することも報告されている。ＳＴ２Ｌ／ＩＬ−３３経路の調節不全は、喘息、関節リウマチ、炎症性大腸炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、鼻ポリープ及び全身性硬化症を包含する様々な免疫介在疾患に関与していた。（Ｐａｌｍｅｒ及びＧａｂａｙ著、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ、第７巻、３２１〜３２９頁、２０１１年及びＬｌｏｙｄ著、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ、第２２巻、８００〜８０６頁、２０１０年、並びにＳｈｉｍｉｚｕら著、Ｈｕｍ Ｍｏｌｅｃ Ｇｅｎ第１４巻、２９１９〜２７頁、２００５年、Ｋａｍｅｋｕｒａら著、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ、第４２巻、２１８〜２２８頁、２０１２年及びＭａｎｅｔｔｉら著、Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ、第６９巻、５９８〜６０５頁、２０１０年に概説されている）。
そのため、ＳＴ２Ｌ介在疾患及び障害の治療での使用に適したＳＴ２Ｌ拮抗物質が必要とされている。
本発明は、ヒトＳＴ２ＬドメインＩ（配列番号９）に特異的結合する、単離されたヒト若しくはヒト適合性抗体拮抗物質又はそのフラグメントを提供する。
本発明はまた、特定の軽鎖及び重鎖可変領域配列又は特定の重鎖及び軽鎖相補性決定配列を有する、ヒトＳＴ２Ｌに特異的結合する、ヒト適合性抗体拮抗物質も提供する。
本発明は更に、定義されたエピトープ領域でヒトＳＴ２Ｌに特異的結合する及び／又は本明細書に記載の特定の特性を有する、ヒト又はヒト適合性抗体拮抗物質も提供する。
本発明は更に、本発明の重鎖可変領域（ＶＨ）又は軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする単離ポリヌクレオチドも提供する。
本発明は更に、本発明の単離ポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。
本発明は更に、本発明のベクターを含む宿主細胞も提供する。
本発明は更に、本発明の宿主細胞を培養する工程と、当該細胞から抗体を回収する工程と、を含む、本発明の抗体の製造方法も提供する。
本発明は更に、本発明の単離された抗体と、製薬上許容された担体と、を含む、医薬組成物も提供する。
本発明は更に、本発明の単離された抗体の治療上の有効量を、それを必要とする患者に、ＳＴ２Ｌ介在状態を治療又は予防するうえで十分な時間にわたって投与する工程を含む、ＳＴ２Ｌ介在状態の治療又は予防方法も提供する。
本発明は更に、本発明の単離された抗体の治療上の有効量を、その必要のある患者に、マスト細胞応答を阻害するうえで十分な時間にわたって投与する工程を含む、患者のマスト細胞応答を阻害する方法も提供する。
本発明は更に、ＳＴ２ＬのドメインＩに特異的結合する抗体を、対象に、ＩＬ−３３とＳＴ２Ｌとの相互作用を阻害するうえで十分な量で投与する工程を含む、対象におけるＩＬ−３３とＳＴ２Ｌとの相互作用を阻害する方法も提供する。
アイソタイプ対照ＣＮＴＯ５５１６と比較したときの、ＩＬ−３３の鼻腔内投与によって誘発された肺炎症モデルにおけるＳＴ２ＬドメインＩ結合性ｍＡｂ ＣＮＴＯ３９１４による気道過敏症の阻害を示している。ピーク気道抵抗は、メタコリン（ＭＣＨ）を段階的な用量（ｍｇ／ｍｌ）で投与した直後に測定した。**ＣＮＴＯ３９１４／ＩＬ−３３対ＣＮＴＯ５５１６／ＩＬ−３３ではｐ＜０．０５、及び***ＩＬ−３３治療群によるＣＮＴＯ３９１４／ＩＬ−３３対ＰＢＳではｐ＜０．００１。 アイソタイプ対照ＣＮＴＯ５５１６と比較したときの、ＩＬ−３３の鼻腔内投与によって誘発された肺炎症モデルにおけるＳＴ２ＬドメインＩ結合性ｍＡｂ ＣＮＴＯ３９１４による気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）細胞動員阻害を示している。***Ｐ＜０．００１。 鼻腔内投与されたＩＬ−３３によって誘発された肺炎症モデルにおいて、無細胞ＢＡＬ液中のＳＴ２ＬドメインＩ結合性ｍＡｂ ＣＮＴＯ３９１４による、マウスマスト細胞プロテアーゼ１（ＭＭＣＰ−１）放出の用量依存的阻害を示している。ＩＬ−３３処理によるＣＮＴＯ５５１６（アイソタイプ対照）に対して、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１である。 ＳＴ２ＬドメインＩ結合性ｍＡｂ ＣＮＴＯ３９１４による、インビトロでのマウス骨髄由来マスト細胞によるＩＬ−３３誘発ＧＭ−ＣＳＦ（図４Ａ）、ＩＬ−５（図４Ｂ）及びＴＮＦα（図４Ｃ）放出の阻害を示している。使用したＣＮＴＯ３９１４濃度は括弧内の単位μｇ／ｍｌで、及びＩＬ−３３濃度はｎｇ／ｍｌで示す。 ＳＴ２ＬドメインＩ結合性ｍＡｂ Ｃ２４９４（ＳＴＬＭ６２）による、表示されたＩＬ−３３濃度及びＣ２４９４濃度におけるヒト臍帯血由来マスト細胞によるＩＬ−３３誘発プロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ2）放出の阻害を示している。ＭＯＸ−ＰＤＧ2：メトキシルサミン−ＰＧＤ2。 ヒト臍帯血由来マスト細胞（ｈＣＢＭＣ）中の表示された濃度（μｇ／ｍｌ）のＳＴ２ＬドメインＩ結合性ｍＡｂ Ｃ２２４４及びＣ２４９４による、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地＋１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ（幹細胞因子）中１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３３存在下で、ＧＭ−ＣＳＦ（図６Ａ）、ＩＬ−８（図６Ｂ）、ＩＬ−５（図６Ｃ）、ＩＬ−１３（図６Ｄ）及びＩＬ−１０（図６Ｅ）の放出阻害を示している。 ヒト臍帯血由来マスト細胞において表示された濃度（μｇ／ｍｌ）のＳＴ２ＬドメインＩＩＩ結合性ｍＡｂ Ｃ２５１９又はＣ２５２１が、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地＋１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ中１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３３の存在下で及ぼす、ＧＭ−ＣＳＦ（図７Ａ）、ＩＬ−８（図７Ｂ）、ＩＬ−５（図７Ｃ）、ＩＬ−１３（図７Ｄ）及びＩＬ−１０（図７Ｅ）の放出への影響を示している。 ヒト臍帯血由来マスト細胞（ｈＣＢＭＣ）においてＳＴ２ＬドメインＩ結合性ｍＡｂであるＣ２４９４並びにＳＴ２ＬドメインＩＩＩ結合性ｍＡｂであるＳＴ２Ｍ４８（Ｍ４８）、ＳＴ２Ｍ４９（Ｍ４９）、ＳＴ２Ｍ５０（Ｍ５０）及びＳＴ２Ｍ５１（Ｍ５１）が、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ培地＋１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ中３ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３３の存在下で及ぼす、ＧＭ−ＣＳＦ（図８Ａ）、ＩＬ−８（図８Ｂ）、ＩＬ−５（図８Ｃ）、ＩＬ−１３（図８Ｄ）及びＩＬ−１０（図８Ｅ）の放出への影響を示している。 図示するように試験抗体をそれぞれ５０μｇ／ｍｌ又は２μｇ／ｍＬ用いてＩＬ−３３及びＳＣＦ誘発によるヒト臍帯血由来マスト細胞によるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３放出に対する、ＳＴ２ＬのドメインＩ（Ｄ１）又はドメインＩＩＩ（Ｄ３）に結合する抗ＳＴ２Ｌ抗体の平均阻害率（%）を示している。負の値は活性化率（%）を示す。 ファージディスプレイライブラリ由来の及び後続の親和性成熟活動後の、抗ＳＴ２Ｌ抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖ＣＤＲ配列を示している。 ファージディスプレイライブラリ由来の及び後続の親和性成熟活動後の、抗ＳＴ２Ｌ抗体の、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖ＣＤＲ配列を示している。 抗ＳＴ２Ｌ抗体ＳＴＬＭ２０８ ＶＨ ＳＴ２Ｈ２５７ ＨＣＤＲ３変異体のＶＨ領域及びＶＬ領域並びに重鎖ＣＤＲ配列を示している。 ファージディスプレイライブラリ由来の及び後続の親和性成熟活動後の、抗ＳＴ２Ｌ抗体のＶＨ配列（図１３Ａ）及びＶＬ配列（図１３Ｂ）を示している。 ファージディスプレイライブラリ由来の及び後続の親和性成熟活動後の、抗ＳＴ２Ｌ抗体のＶＨ配列（図１３Ａ）及びＶＬ配列（図１３Ｂ）を示している。 ヒトフレームワークへ転移されたＣ２４９４ ＶＨ及びＶＬ抗原結合部位の略図を表している。（転移後は、ＨＦＡ、すなわち「ヒトフレームワークへの適合化（human framework adaptation）」と表示）。Ｋａｂａｔ ＣＤＲには下線を付し、また、Ｃｈｏｔｈｉａ ＨＶには、図示した転移後ＨＦＡ領域の上に破線を付している。ＶＨ残基及びＶＬ残基のナンバリングはＣｈｏｔｈｉａに準じた。ＶＨ中、グレーで強調した残基は一部ＨＦＡ変異体には転移されなかった。Ｃ２４９４のＶＨ：配列番号４８、Ｃ２４９４のＶＨ：配列番号５２。 Ｃ２４９４由来のヒトフレームワーク適合性（ＨＦＡ）抗体のＣＤＲ配列を示している。 図１６Ａは、抗ＳＴ２Ｌ抗体ＣＮＴＯ３９１４の血清中濃度を、図１６Ｂは、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）の細胞動員の阻害を、図１６Ｃは、ＩＬ−３３で刺激された全血細胞によるＩＬ−６分泌の阻害を、図１６Ｄは、ＩＬ−３３で刺激された全血細胞によるＭＣＰ１分泌の阻害をそれぞれ示している。ＩＬ−３３の鼻腔内投与によって誘発された肺炎症の６時間モデルにおける、ＣＮＴＯ３９１４を投与後２４時間。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、ＮＱ＝検出限界未満、＠＝１データ点が検出限界未満である。 様々な抗ＳＴ２Ｌ抗体同士の競合。図１７Ａ）３０ｎＭの標識Ｃ２２４４ Ｆａｂを、マイクロウェルにコーティングしたＳＴ２Ｌ−ＥＣＤとの結合において、表示した抗体と競合した。Ｃ２２４４は、Ｃ２４９４と競合したが、Ｃ２５３９とは競合しなかった。図１７Ｂ）１０ｎＭの標識Ｃ２４９４を、マイクロウェルにコーティングしたＳＴ２Ｌ−ＥＣＤとの結合において、表示した抗体と競合した。Ｃ２４９４は、ＳＴＬＭ２０８及びＳＴＬＭ２１３と競合したが、Ｃ２５３９とは競合しなかった。 Ｃ２２４４ Ｆａｂと複合体を形成したヒトＳＴ２−ＥＣＤ（配列番号１１９）の、単純化されたＨ／Ｄ交換マップを示している。図示するように、抗体で保護された領域を、異なるグレースケールで表示した。残基１８〜３１を含むセグメント（破線で囲まれた部分）（配列番号１の全長ＳＴ２Ｌの残基３５〜４８に相当）はＦａｂで保護された。残基７１〜１００を含む領域（実線で囲まれた部分）（配列番号１の残基８８〜１１７に相当）は、重度にグリコシル化されたが、ペプチドで覆われてはいなかった。 図示したＳＴ２Ｌ変異体に関するＳＴ２ＬドメインＩ結合抗体の速度定数及び親和性定数を表している。 抗ＳＴ２Ｌ抗体ＳＴＬＭ２０８による初代ヒト肺マスト細胞からのＧＭ−ＣＳＦ（図２０Ａ）、ＩＬ−５（図２０Ｂ）、ＩＬ−８（図２０Ｃ）及びＩＬ−１３（図２０Ｄ）分泌の阻害を表している。
特許及び特許出願を含むがこれらに限定されない、本明細書で引用する全ての刊行物は、参照により本明細書に、完全に説明されているかのごとく援用される。
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的でのみ使用され、限定を意図するものではないと理解すべきである。特に断らないかぎり、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の試験を実施するために使用できるが、例示となる材料及び方法を本明細書に記載する。本発明を説明及び特許請求するうえで以下の用語が用いられる。
本明細書で使用されるとき、「拮抗物質」という用語は、ＳＴ２Ｌの生物学的活性を任意の機序によって部分的に又は完全に阻害する分子を意味する。典型的な拮抗物質は、抗体、融合タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、核酸、オリゴヌクレオチド及び小分子である。拮抗物質は、以降に記載のＳＴ２Ｌ生物学的活性用のアッセイを用いて確認することができる。ＳＴ２Ｌ拮抗物質は、測定されるＳＴ２Ｌ生物学的活性を２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％阻害する可能性がある。
用語「ＳＴ２Ｌ」又は「ｈｕＳＴ２Ｌ」若しくは「ヒトＳＴ２Ｌ」とは、ＧｅｎＢａｎｋの登録番号ＮＰ＿０５７３１６で示されるアミノ酸配列を有するヒトＳＴ２Ｌポリペプチドを指す。配列番号１は、全長ヒトＳＴ２Ｌのアミノ酸配列を表す。本明細書で使用されるとき、「ＳＴ２Ｌ細胞外ドメイン」、「ＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ」又は「ｈｕＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ」は、配列番号１のアミノ酸１９〜３２８を有するポリペプチドを表す。ｈｕＳＴ２Ｌ−ＥＣＤは、配列番号１の残基１９〜１２２（ドメインＩ、配列番号９）、残基１２３〜２０２（ドメインＩＩ、配列番号１０）及び残基２０９〜３２４（ドメインＩＩＩ、配列番号１１）に及ぶ３種のＩｇ様Ｃ２型ドメインを有する。「ドメインＩ」又は「ＳＴ２ＬドメインＩ」又は「ｈｕＳＴ２ＬドメインＩ」又は「Ｄ１」とは、配列番号９で表される配列を有する、ヒトＳＴ２Ｌにおける第１の免疫グロブリン様ドメインを指す。「ドメインＩＩＩ」又は「ＳＴ２ＬドメインＩＩＩ」とは、配列番号１１で示される配列を有する、ヒトＳＴ２Ｌにおける第３の免疫グロブリン様ドメインを指す。
本明細書で使用されるとき、用語「ＩＬ−３３」は、全長ＩＬ−３３（ＧｅｎＢａｎｋの登録番号ＮＰ＿２５４２７４、配列番号３）、並びにその変異体及び活性体を包含する。ＩＬ−３３変異体としては、ＧｅｎＢａｎｋの登録番号ＮＰ＿００１１８６５６９及び同登録番号ＮＰ＿００１１８６５７０で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ＩＬ−３３活性体としては、配列番号３の残基１１２〜２７０を有する「成熟ＩＬ−３３」が挙げられる。別の活性体としては、配列番号３の残基１１〜２７０、１１５〜２７０、９５〜２７０、９９〜２７０又は１０９〜２７０を有するＩＬ−３３フラグメント（ＬｅＦｒａｎｃａｉｓら著、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）、第１０９巻、１６７３〜１６７８頁、２０１２年）、又はＩＬ−３３を内因性発現する細胞から単離された任意の形態若しくは形態の組み合わせが挙げられる。「ＩＬ−３３活性体」は、ＳＴ２Ｌ生物学的活性を誘発する配列番号３のＩＬ−３３のフラグメント又は変異体である。
本明細書で使用されるとき、「抗体」という用語は、広義で意図され、ポリクローナル抗体、マウス、ヒト、ヒト適合性、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、抗体フラグメント、少なくとも２つの無傷の抗体若しくは抗体フラグメント又は二量体の、四量体の若しくは多量体の抗体から形成される二重特異性抗体又は多重特異性抗体、並びに一本鎖抗体を含む、免疫グロブリン分子を含む。
免疫グロブリンは、重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じてＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの大きなクラスに分類することができる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3及びＩｇＧ4へと更に細分類される。あらゆる脊椎動物種の抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて２つの明確に異なるタイプ、すなわちカッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの１つに分類することができる。
用語「抗体フラグメント」とは、重鎖及び／又は軽鎖抗原結合部位、例えば、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、２及び３、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、２及び３、重鎖可変領域（ＶＨ）、又は軽鎖可変領域（ＶＬ）を保有する免疫グロブリン分子の一部を指す。抗体フラグメントとしては、周知のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及びＦｖフラグメント、並びに１つのＶＨドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）が挙げられる。ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、互いに合成リンカーを介して結合することで様々なタイプの一本鎖抗体設計を形成する可能性があり、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが別々の一本鎖抗体構築物で発現される場合は、ＶＨ／ＶＬドメインが分子内又は分子間で対を成して、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）又はダイアボディなどの一価の抗原結合部位を形成する。これらは、例えば国際特許出願公開第ＷＯ９８／４４００１号、同第ＷＯ８８／０１６４９号、同第ＷＯ９４／１３８０４号、同第ＷＯ９２／０１０４７号に記載されている。
抗体可変領域は、３つの「抗原結合部位」で遮られた「フレームワーク」領域からなる。抗原結合部位は、種々の用語を使用して定義される。（ｉ）３つがＶＨに（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）及び３つがＶＬに（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）ある、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づく（Ｗｕ及びＫａｂａｔ著、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第１３２巻、２１１〜２５０頁、１９７０年、Ｋａｂａｔら著、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９９１年）。（ｉｉ）３つがＶＨに（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及び３つがＶＬに（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）ある、「超可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」は、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ著、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１９６巻、１７〜９１７頁、１９８７年）によって記載されるように、構造において超可変である抗体可変ドメインの領域を指す。他の用語には、「ＩＭＧＴ−ＣＤＲ」（Ｌｅｆｒａｎｃら著、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２７巻、５５〜７７頁、２００３年）及び「特異性決定残基使用」（ＳＤＲＵ）（Ａｌｍａｇｒｏ著、Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．、第１７巻、１３２〜１４３頁、２００４年）が含まれる。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、抗原結合部位の標準化ナンバリング及び定義を規定する。各ＣＤＲ、ＨＶ及びＩＭＧＴの表記の間の対応についてはＬｅｆｒａｎｃら著、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２７巻、５５〜７７頁、２００３年に述べられている。
本明細書で使用されるとき、「Ｃｈｏｔｈｉａ残基」は、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２７３巻、９２７〜９４８頁、１９９７年）に従ってナンバリングされた抗体ＶＬ残基及びＶＨ残基である。
「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」は、抗原結合部位として定義されたものを除く、可変領域の残りの配列である。抗原結合部位は上記に述べたような様々な用語によって定義され得るため、フレームワークの正確なアミノ酸配列は抗原結合部位がどのように定義されるかによって決まる。
「ヒト抗体」又は「完全ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリン配列に由来する可変領域の配列と定常領域の配列とを含む抗体を指す。本発明のヒト抗体は置換を包含する可能性があるので、当該ヒト抗体は、発現した免疫グロブリン又は生殖細胞系列遺伝子配列の正確な複製物でない場合がある。ただし、抗原結合部位がヒト以外の種から得られる抗体は、「ヒト抗体」の定義には包含されない。
「ヒト適合性」抗体又は「ヒトフレームワーク適合性（ＨＦＡ）」抗体とは、米国特許出願公開第２００９／０１１８１２７号に記載の方法に従って適合化された抗体を指し、また更には、ヒト以外の種に由来する抗原結合部位配列がヒトフレームワーク上に移植された抗体も指す。
「ヒト化抗体」とは、抗原結合部位がヒト以外の種に由来しかつ可変領域フレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する、抗体を指す。ヒト化抗体はフレームワーク領域内に置換を含む可能性があることから、当該フレームワークは、発現したヒト免疫グロブリン又は生殖細胞系列遺伝子配列の完全な複製物でなくてもよい。
「実質的に同一の」という表現は、本明細書で使用されるとき、比較される２つの抗体可変領域のアミノ酸配列が同一であるか又は「ごく僅かな差異」があるということを意味する。ごく僅かな差異とは、抗体特性に悪影響を及ぼさない、抗体又は抗体可変領域の配列における１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は１１個のアミノ酸の置換である。本明細書に開示される可変領域の配列と実質上同一のアミノ酸配列は、本出願の範囲に属する。一部の実施形態では、配列の同一性は、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い可能性がある。同一性（％）は、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ｖ．９．０．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のＡｌｉｇｎＸモジュールの初期設定を使用するペアワイズアライメントによって決定することができる。本発明のタンパク質配列を問い合わせ配列として使用することで、例えば、近縁配列を確認するために公開データベース又は特許データベースでの検索を実行することができる。かかる検索を実行するために使用されるプログラム例は、初期設定を使用する、ＸＢＬＡＳＴ若しくはＢＬＡＳＴＰプログラム（ｈｔｔｐ＿／／ｗｗｗ＿ｎｃｂｉ＿ｎｌｍ／ｎｉｈ＿ｇｏｖ）、又はＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔ（商標）（ＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔ、Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）スイートである。
用語「エピトープ」とは、本明細書で使用されるとき、抗体が特異的結合する抗原の一部を意味する。エピトープは通常、アミノ酸又は多糖類側鎖のような部位の化学的に活性な（極性、非極性又は疎水性など）表面基からなり、特定の３次元構造特性及び特定の電荷特性を有しうる。エピトープは、立体配座空間単位を形成する連続した及び／又は連続していないアミノ酸から成り得る。連続していないエピトープについて、抗原の直鎖配列の異なる部分からのアミノ酸は、タンパク質分子の折り畳みを通じて、３次元空間において近接する。典型的なエピトープは、配列番号９で示されるｈｕＳＴ２ＬのドメインＩである。
本明細書で使用されるとき、「パラトープ」という用語は、抗原が特異的結合する抗体の一部分を意味する。パラトープは元来線状であっても又は不連続であってもよく、一つながりの線状のアミノ酸よりも、抗体の隣接していないアミノ酸同士の空間関係によって形成されてよい。「軽鎖パラトープ」及び「重鎖パラトープ」又は「軽鎖パラトープのアミノ酸残基」及び「重鎖パラトープのアミノ酸残基」はそれぞれ、抗原と接触する抗体の軽鎖残基及び重鎖残基を指す。
用語「特異的結合」又は「特異的結合する」とは、本明細書で使用されるとき、抗体が所定の抗原と、他の抗原又はタンパク質とよりも高い親和性で結合することを指す。典型的に、抗体は、所定の抗原と、解離定数（ＫD）１×１０-7Ｍ以下、例えば１×１０-8Ｍ以下、１ｘ１０-9Ｍ以下、１×１０-10Ｍ以下、１×１０-11Ｍ以下、又は１×１０-12Ｍ以下、典型的には、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン、又はその他任意の他の特定ポリペプチド）と結合するＫDよりも少なくとも１０倍低いＫDで結合する。解離定数は標準的手法を用いて測定することができる。しかし、所定の抗原と特異的結合する抗体は、他の関連抗原、例えばヒト又はサル、例えばカニクイザル（cynomolgus）などの他の種から得た同様の所定の抗原（ホモログ）と交差反応性を示す可能性もある。
本明細書で使用されるとき、「二重特異性」とは、２種の異なる抗原と結合する抗体、又は抗原内の２種の異なるエピトープと結合する抗体を指す。
本明細書で使用されるとき、「単一特異性」とは、１つの抗原又は１つのエピトープと結合する抗体を指す。
用語「〜と組み合わせて」は、本明細書で使用されるとき、記述の対象である薬剤が、混合物として一緒に、又はそれぞれ単独薬剤として同時に、又はそれぞれ単独薬剤として順次に任意の順序で、動物に投与され得ることを意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「炎症性状態」とは、部分的には、サイトカイン、ケモカイン、又は炎症細胞（例えば、好中球、単球、リンパ球、マクロファージ）の活性によって媒介される、有害な刺激（例えば、病原体、損傷した細胞、身体的傷害、若しくは刺激物質）に対する急性又は慢性の局部的反応又は全身性反応を指し、大抵の場合、疼痛、潮紅、膨張、及び組織機能の障害を特徴とする。
本明細書で使用されるとき、用語「ＳＴ２Ｌ介在炎症性状態」とは、ＳＴ２Ｌシグナル伝達経路の不適切な活性化に少なくとも部分的に由来する炎症性状態を指す。ＳＴ２Ｌ介在炎症性状態の例は、喘息及びアレルギーである。
本明細書で使用されるとき、「ＳＴ２Ｌ介在状態」という用語は、ＳＴ２Ｌが疾患若しくは状態の因果関係、発症、進行、持続又は経路を含む疾患及び病状に直接又は間接によらず影響を及ぼす、全ての疾患及び病状を包含する。
用語「ＳＴ２Ｌ生物学的活性」とは、本明細書で使用されるとき、ＳＴ２ＬのリガンドであるＩＬ−３３とＳＴ２Ｌとが結合した結果生ずる任意の活性を指す。典型的なＳＴ２Ｌ生物学的活性は、ＩＬ−３３に応じてＮＦ−κＢを活性化させる。ＮＦ−κＢの活性化は、ＩＬ−３３によってＳＴ２Ｌを誘発した直後にレポーター遺伝子法を用いて評価することができる（Ｆｕｒｓｏｖら著、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、第３０巻、１５３〜１６２頁、２０１１年）。他の典型的なＳＴ２Ｌ生物学的活性は、Ｔｈ２細胞の増殖、又はＩＬ−５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−８、ＩＬ−１０若しくはＩＬ−１３などの炎症性サイトカイン及びケモカインの分泌をもたらす。細胞若しくは組織からの又は循環におけるサイトカイン及びケモカインの放出は、ＥＬＩＳＡイムノアッセイなどの周知のイムノアッセイによって測定することができる。
用語「ベクター」は、生体系内で複製されることができる、又はこうした系の間で移動可能である、ポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは典型的に、生体系においてこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するように機能する複製起点、ポリアデニル化信号又は選択マーカーのような要素を含有する。このような生体系の例としては、細胞、ウイルス、動物及び植物、並びにベクターを複製することのできる生物学的構成成分を利用して再構成された生体系を挙げることができる。ベクターを構成するポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッド分子であってもよい。
「発現ベクター」という用語は、生体系又は再構成された生体系において、その発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの翻訳を指示するために使用することができるベクターを意味する。
用語「ポリヌクレオチド」は、糖−リン酸骨格又は他の等価な共有結合様式により共有結合しているヌクレオチド鎖からなる分子を意味する。二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡが、ポリヌクレオチドの典型的な例である。
「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は、ペプチド結合により連結されてポリペプチドを生成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を意味する。５０個のアミノ酸未満の小さなポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれる場合がある。
本明細書では、以下の通りの一般的なアミノ酸１文字表記及び３文字表記を用いる。
Figure 2015516817
物質の組成
本発明は、ＳＴ２Ｌに特異的結合してＳＴ２Ｌの生物学的活性を阻害する抗体、及びかかる抗体の使用を提供する。本発明者らは驚くことに、ヒトＳＴ２ＬのドメインＩ（配列番号９）に結合する抗体が、ＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ相互作用を阻止してＩＬ−３３誘発マスト細胞応答を含むＳＴ２Ｌの一連の生物学的活性を阻害するのに対し、ヒトＳＴ２ＬのドメインＩＩＩ（配列番号１１）に結合する抗体は、一連のＳＴ２Ｌ生物学的活性を阻害するがＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ相互作用を阻止しないことを見出した。しかし、ドメインＩＩＩに結合する抗体は、ＩＬ−３３誘発マスト細胞応答に対する阻害効果が低いか又は全くないか、或いはＩＬ−３３誘発マスト細胞応答を刺激することもあった。
本明細書に記載の一部の実施形態では、ＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ相互作用を阻止してＩＬ−３３誘発マスト細胞応答を含む一連のＳＴ２Ｌ生物学的活性を阻害する抗体は、ヒトＳＴ２ＬドメインＩ（ｒｃｐｒｑｇｋｐｓｙｔｖｄＷ、配列番号２１０）において及び場合により、ＳＴ２Ｌアミノ酸残基Ｔ９３及びＦ９４（残基のナンバリングは配列番号１に準拠する）においてもエピトープと結合する。
用語「マスト細胞応答」又は「マスト細胞活性」とは、ＩＬ−３３によって誘発される、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−８、ＩＬ−５、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０などのサイトカイン並びにプロスタグランジンＤ2などのアレルギー性介在物質のマスト細胞からの放出を指す。
本発明は、本明細書に記載のヒトＳＴ２ＬのドメインＩに結合する新規の抗原結合部位を提供する。抗原結合部位を保有する構造は、典型的には抗体ＶＨ又はＶＬである。
本明細書に記載の本発明の抗体は、ヒトＳＴ２ＬのドメインＩ（配列番号９）に特異的結合する、単離されたヒト若しくはヒト適合性抗体拮抗物質又はそのフラグメントであり得る。ヒトＳＴ２ＬのドメインＩ（配列番号９）に結合する典型的な抗体は、それぞれ配列番号２３、２７及び３１のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列及びＨＣＤＲ３配列並びにそれぞれ配列番号３５、３９及び４３のＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む抗体ＳＴＬＭ１５（Ｃ２２４４）、又はそれぞれ配列番号２４、２８及び３２のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列及びＨＣＤＲ３配列並びに配列番号３６、４０及び４４それぞれのＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む抗体Ｃ２４９４（ＳＴＬＭ６２）である（表３）。ヒトＳＴ２ＬのドメインＩに結合する別の典型的な抗体は、表１６及び図１３に示す抗体であって、例えば、抗体ＳＴＬＭ１０３、ＳＴＬＭ１０７、ＳＴＬＭ１０８、ＳＴＬＭ１２３、ＳＴＬＭ１２４、ＳＴＬＭ２０８、ＳＴＬＭ２０９、ＳＴＬＭ２１０、ＳＴＬＭ２１１、ＳＴＬＭ２１２及びＳＴＬＭ２１３である。ヒト抗体拮抗物質の例を図１２及び図１３に示す。ヒト適合性拮抗物質の例を表１４に示す。
本明細書に記載の一部の実施形態では、ヒトＳＴ２ＬのドメインＩ（配列番号９）に特異的結合する、単離されたヒト若しくはヒト適合性抗体拮抗物質又はそのフラグメントは、ＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ相互作用を阻止する。
抗体の、ＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ相互作用阻止能については、標準的なＥＬＩＳＡ法で試験することができる。例えば、プレートを、ヒトＳＴ２Ｌの細胞外ドメイン（ｈｕＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ）でコーティングして、抗体と共にインキュベートした後、プレートへのビオチン化されたＩＬ−３３の結合を測定する。「ＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ相互作用を阻止する」又は「ＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ相互作用を阻害する」抗体は、ＥＬＩＳＡ法においてｈｕＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ被覆プレートを用いて、プレートに結合したビオチン化ＩＬ−３３から生じる信号を、抗体濃度５０μｇ／ｍｌにおいて、抗体を含まない場合のＩＬ−３３の結合と比べると少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％軽減する抗体である。
抗体のマスト細胞応答阻害については、ヒト臍帯血由来マスト細胞又は初代ヒト肺マスト細胞による、例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−５、ＩＬ−１０又はＩＬ−１３の放出に対する阻害活性を標準的な方法及び以下に例示する方法を用いて評価することによって試験することができる。「マスト細胞応答を阻害する」又は「マスト細胞の活性を阻害する」本明細書に記載の抗体は、１〜３ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３３で誘発されたＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３又はＩＬ−１０の分泌を、濃度１０μｇ／ｍｌにおいて、抗体で処理されていないマスト細胞と比べると少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％軽減する抗体である。典型的には、マスト細胞は、ヒト臍帯血又は肺柔組織、及び末梢気道ＣＤ３４+前駆細胞から周知の方法により及び以下に例示するように得てもよい。マスト細胞の培養条件は、抗体の阻害率（%）測定値に影響を及ぼす可能性があり、したがって、試験条件は、例えばＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地を用いて６〜１０週間の長い分化手順の間、標準に維持され得る。サイトカイン放出アッセイを行う前の４日間、マスト細胞を毎日１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４と１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６と１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦとで刺激する。サイトカイン放出アッセイでは、マスト細胞を、新たに調製したＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地、又は抗生物質を含まず１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦを含む１０％ ＦＣＳ含有ＲＰＭＩに再懸濁することも可能である。アッセイに好適なプレーティング密度は、ウェル１個当たり細胞６５，０００〜７５，０００個／０．１６ｍｌである。本明細書に記載の、マスト細胞応答を阻害する本発明の典型的な抗体は、抗体ＳＴＬＭ１５、ＳＴＬＭ６２及びＳＴＬＭ２０８である。抗体ＣＮＴＯ３９１４は、ヒトＳＴ２Ｌとの交差反応性を伴わずにマウスＳＴ２ＬのドメインＩに結合して、マウス細胞のマスト細胞応答を阻害する。
マスト細胞応答には、ＩＬ−１及びＩＬ−３２並びにＣＣＬ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１８及びＣＣＬ２３などのケモカインの放出だけでなく、システイニルロイコトリエン、ヒスタミンなどのアレルギー介在物質の放出、更にはトリプターゼ、キマーゼ、カルボキシペプチターゼ及びカテプシンＧを含む様々なマスト細胞プロテアーゼの放出も含むことが当業者には分かるであろう。本明細書に記載の本発明の抗体の、これらの更なるマスト細胞応答阻害能については、標準的な方法を用いて試験することができる。ＳＴ２ＬのドメインＩに結合し、しかもＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ相互作用を阻止する、本明細書に記載の本発明の抗体は、前記条件下において最少濃度１０μｇ／ｍｌで試験した場合、その更なるマスト細胞応答を少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上阻害すると見込まれる。
本明細書に記載の本発明の抗体は、解離定数（ＫD）約５×１０-12Ｍ〜約７×１０-10Ｍ、ヒトＳＴ２Ｌに対する会合速度定数（Ｋon）約２×１０6Ｍ-1ｓ-1〜約１×１０8Ｍ-1ｓ-1、又はヒトＳＴ２Ｌに対する解離速度定数（Ｋoff）約１×１０-6ｓ-1〜約１×１０-2ｓ-1でヒトＳＴ２Ｌに結合する。例えば、本明細書に記載の本発明の抗体は、ＫD約７×１０-10Ｍ未満、約１×１０-10Ｍ未満、約５×１０-11Ｍ未満、約１×１０-11Ｍ未満又は約５×１０-12Ｍ未満でヒトＳＴ２Ｌに結合する。
本明細書に記載の本発明の抗体は、カニクイザル（ｃｙｎｏ）ＳＴ２Ｌ（配列番号２）と交差反応して、解離定数（ＫD）約３×１０-12Ｍ〜約２×１０-9Ｍ、ｃｙｎｏ ＳＴ２Ｌに対する会合速度定数（Ｋon）約４×１０6Ｍ-1ｓ-1〜約１×１０8Ｍ-1ｓ-1、又はｃｙｎｏ ＳＴ２Ｌに対する解離速度定数（Ｋoff）約７×１０-5ｓ-1〜約１×１０-1ｓ-1でｃｙｎｏ ＳＴ２Ｌに結合する可能性がある。例えば、本明細書に記載の本発明の抗体は、ＫD約２×１０-9Ｍ未満、約１×１０-9Ｍ未満、約１×１０-10Ｍ未満、約１×１０-11Ｍ未満、又は約３×１０-12Ｍ未満でｃｙｎｏ ＳＴ２Ｌに結合する。
抗体のＳＴ２Ｌに対する親和性は、任意の好適な方法を使用して実験により測定することができる。かかる方法は、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００又はＫｉｎＥｘＡ装置、ＥＬＩＳＡ法又は当業者に既知の競合結合アッセイを利用することができる。特定の抗体／ＳＴ２Ｌ相互作用に関する親和性測定値は、様々な条件（例えば、容量オスモル濃度、ｐＨ）下で測定する場合、異なっていてよい。したがって、親和性及びその他の結合パラメータ（例えば、ＫD、Ｋon、Ｋoff）の測定は、好ましくは標準的な条件及び例えば本明細書に記載の緩衝液などの標準化緩衝液を用いて行われる。例えばＢｉａｃｏｒｅ ３０００又はＰｒｏｔｅＯｎを用いた親和性測定での内部エラー（標準偏差（ＳＤ）として測定されるもの）は典型的に、典型的な検出範囲内で測定した場合、５〜３３％の範囲内であり得ることが当業者には分かるであろう。したがって、用語「約」は、アッセイにおける典型的な標準偏差を表す。例えば、ＫDが１×１０-9Ｍの場合の典型的なＳＤは、±０．３３×１０-9Ｍ以下である。
所望の親和性でヒトＳＴ２Ｌに結合し、そして場合によりｃｙｎｏ ＳＴ２Ｌと交差反応を有する抗体は、変異体又はフラグメントのライブラリからヒト及び／又はｃｙｎｏ ＳＴ２Ｌを用いてパニングすることによって、そして場合により更なる抗体親和性成熟によって、選抜することができる。抗体は、任意の適当な方法を用い、そのＳＴ２Ｌの生物学的活性の阻害に基づいて確認することができる。かかる方法では、周知の方法を使用し、本願に記載されるように、レポーター遺伝子アッセイ又はサイトカイン産生を測定するアッセイを利用し得る。
本発明の一実施形態は、ヒトＳＴ２Ｌに特異的結合する、単離された抗体拮抗物質であって、
配列番号１６０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１（ＨＣＤＲ１）（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＭＸ4）であって、式中、
Ｘ1はＳ、Ｆ、Ｄ、Ｉ、Ｇ又はＶであり、
Ｘ2はＹ又はＤであり、
Ｘ3はＡ、Ｄ又はＳであり、そして
Ｘ4はＳ、Ｆ又はＩであるものと、
配列番号１６１のＨＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）（Ｘ5ＩＸ6ＧＸ7ＧＧＸ8ＴＸ9ＹＡＤＳＶＫＧ）であって、式中、
Ｘ5はＡ、Ｓ、Ｔ、Ｙ又はＤであり、
Ｘ6はＳ、Ｒ、Ｅ、Ｋ、Ｇ又はＡであり、
Ｘ7はＳ、Ｅ又はＮであり、
Ｘ8はＳ、Ｒ、Ｅ、Ｇ、Ｔ、Ｄ又はＡであり、そして
Ｘ9はＹ、Ｄ、Ｎ、Ａ又はＳであるものと、
配列番号１６２のＨＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）（Ｘ10Ｘ11ＷＳＴＥＧＳＦＦＶＬＤＹ）であって、式中、
Ｘ10はＤ、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｐ、Ｅ、Ｉ、Ｈ、Ｓ、Ｔ又はＹであり、そして
Ｘ11はＰ、Ａ、Ｈ、Ｙ、Ｅ、Ｑ、Ｌ、Ｓ、Ｎ、Ｔ、Ｖ又はＩであるものと、を含む、ヒトＳＴ２Ｌに特異的結合する、単離された抗体拮抗物質である。
本発明の別の実施形態は、ヒトＳＴ２Ｌに特異的結合する、単離された抗体拮抗物質であって、
配列番号１６３の重鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１（ＬＣＤＲ１）（ＲＡＳＱＳＶＤＤＸ12ＬＡ）であって、式中、
Ｘ12はＡ又はＤであるものと、
配列番号９０のＬＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）
（ＤＡＳＮＲＡＴ）と、
配列番号１６４のＬＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）（ＱＱＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18Ｔ）であって、式中、
Ｘ13はＦ又はＹであり、
Ｘ14はＹ、Ｉ又はＮであり、
Ｘ15はＮ、Ｇ、Ｄ又はＴであり、
Ｘ16はＷ又はＡであり、
Ｘ17はＰであるか又は欠失しており、そして
Ｘ18はＬ又はＩであるものと、を含む、ヒトＳＴ２Ｌに特異的結合する、単離された抗体拮抗物質である。
それぞれ配列番号１６０、１６１、１６２、１６３、９０及び１６４のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む本発明の抗体は、周知の変異誘発法により、テンプレートとして例えばそれぞれ配列番号７８、８１、８４、８７、９０及び９２のＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を用いて作製することができる。それぞれ配列番号１６０、１６１、１６２、１６３、９０及び１６４の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲは、以下に記載するフレームワークなどのヒトフレームワークに移植することができる。抗体は、ＳＴ２Ｌとの結合、及び抗体のＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ相互作用阻害能、並びにヒトＳＴ２Ｌ及び／又はｃｙｎｏ ＳＴ２Ｌに対する親和性、マスト細胞応答阻害などの他の特性について、本明細書に記載の方法を用いて評価することができる。
一実施形態では、本明細書に記載のヒトＳＴ２Ｌに特異的結合する、単離された抗体拮抗物質は、
配列番号７８又は９５〜１０８のＨＣＤＲ１、
配列番号８１、１０９〜１１８又は１２０〜１２９のＨＣＤＲ２、
配列番号８４又は１６５〜１８５のＨＣＤＲ３、
配列番号８７又は１３０のＬＣＤＲ１、
配列番号９０のＬＣＤＲ２、及び
配列番号９２又は１３１〜１３４のＬＣＤＲ３、を含む。
別の実施形態では、ヒトＳＴ２Ｌに特異的結合する、単離された抗体拮抗物質は、図１０、図１１及び図１２に示されかつ本明細書に記載されているようなＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む。
別の実施形態では、本明細書に記載の、ヒトＳＴ２Ｌに特異的結合する、単離された抗体拮抗物質は、
配列番号２３又は２４のＨＣＤＲ１、
配列番号２７又は２８のＨＣＤＲ２、
配列番号３１又は３２のＨＣＤＲ３、
配列番号３５又は３６のＬＣＤＲ１、
配列番号３９又は４０のＬＣＤＲ２、及び
配列番号４３又は４４のＬＣＤＲ３、を含む。
別の実施形態では、本明細書に記載の、ヒトＳＴ２Ｌに特異的結合する、単離された抗体拮抗物質は、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列が、
それぞれ配列番号２３、２７、３１、３５、３９及び４３からなる、
それぞれ配列番号２４、２８、３２、３６、４０及び４４（ＨＦＡ ＣＤＲ）からなる、
それぞれ配列番号２４、２８、１４６、３６、４０及び１４７からなる、又は
それぞれ配列番号２４、２８、１４６、３６、４０及び４４からなるものを含む。
本発明の別の実施形態は、ヒトＩＧＨＶ３−２３（配列番号１５８）フレームワーク配列、ＩＧＨＶ１−２４*０１（配列番号１４８）フレームワーク配列又はＩＧＨＶ１−ｆ*０１（配列番号１４９）フレームワーク配列由来のＶＨフレームワークを含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、ヒトＩＧＫＶ３−１１（Ｌ６）（配列番号１５９）フレームワーク配列、ＩＧＫＶ３−１５*０１（Ｌ２）（配列番号１５０）フレームワーク配列、ＩＧＫＶ１−９*０１（Ｌ８）（配列番号１５１）フレームワーク配列、ＩＧＫＶ１−５*０１（Ｌ１２）（配列番号１５２）フレームワーク配列、ＩＧＫＶ１−１２*０１（Ｌ５）（配列番号１５３）フレームワーク配列、ＩＧＫＶ１−３９*０１（Ｏ１２）（配列番号１５４）フレームワーク配列、ＩＧＫＶ１−２７*０１（Ａ２０）（配列番号１５５）フレームワーク配列又はＩＧＫＶ１−３３*０１（Ｏ１８）（配列番号１５６）フレームワーク配列由来のＶＬフレームワークを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む、本明細書に記載のヒトＳＴ２Ｌ（配列番号１）に特異的結合する、単離されたヒト若しくはヒト適合性抗体拮抗物質又はそのフラグメントである。
別の実施形態では、本明細書に記載のヒトＳＴ２ＬのドメインＩに特異的結合する、単離された抗体は、ヒトＶＨ ３−２３フレームワーク配列（配列番号１５８）由来のＶＨフレームワークを含むＶＨと、ヒトＶκ Ｌ６フレームワーク配列（配列番号１５９）由来のＶＬフレームワークを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む。ヒトフレームワーク配列は周知であり、そして典型的には連結（Ｊ）配列に連結されたヒト免疫グロブリン生殖細胞系列の可変領域配列を包含する。Ｓｈｉら著、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、第３９７巻、３８５〜３９６頁、２０１０年、国際特許出願公開第ＷＯ２００９／０８５４６２号及び米国特許出願公開第２０１０／００２１４７７号に記載されているように、配列番号１５８で表されるヒトＶＨ３−２３フレームワークアミノ酸配列には、ＩＧＨＪ４に連結されたヒト生殖細胞系列ＶＨ３−２３配列が包含され、また、配列番号１５９で表されるヒトＶｋＬ６フレームワークアミノ酸配列には、ＩＧＫＪ１に連結されたヒトＶκ Ｌ６生殖細胞系列配列が包含される。ヒトＶＨ３−２３由来のＶＨ配列とヒトＶκ Ｌ６由来のＶＬ配列とを有する典型的な抗体は、図１２及び図１３に示すものである。
特定のフレームワーク又は生殖細胞系列配列「に由来する」重鎖可変領域又は軽鎖可変領域を含むヒト又はヒト適合性抗体とは、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子を用いた系から、例えば以下に述べるようなトランスジェニックマウス又はファージディスプレイライブラリから得られる抗体を指す。特定のフレームワーク又は生殖細胞系列配列「に由来する」抗体は、その起源となる配列と比べると、例えば自然発生の体細胞変異又は意図的な置換が原因のアミノ酸の相違を含む可能性がある。
別の実施形態では、本明細書に記載のヒトＳＴ２ＬのドメインＩ（配列番号９）に特異的結合する、単離されたヒト若しくはヒト適合性抗体拮抗物質又はそのフラグメントは、配列番号４７の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号５１の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離された抗体（抗体Ｃ２２４４）と、ヒトＳＴ２Ｌ（配列番号１）との結合に関して競合する。
別の実施形態では、本明細書に記載の本発明の単離された抗体は、ヒトＳＴ２Ｌに、配列番号１のアミノ酸残基３５〜４８（ＲＣＰＲＱＧＫＰＳＹＴＶＤＷ、配列番号２１０）で結合する。本明細書の抗体は更に、配列番号１のアミノ酸残基Ｔ９３及びＦ９４においてもヒトＳＴ２Ｌと結合する。
本明細書に記載のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含むか又は特定のＶＨ配列及びＶＬ配列を含む本発明の抗体のヒトＳＴ２ＬとヒトＳＴ２Ｌと特異的結合間の競合は、周知の方法を用いてインビトロで評価することができる。例えば、非標識抗体の存在下での、ＭＳＤ Ｓｕｌｆｏタグ（商標）ＮＨＳ−エステル標識抗体とヒトＳＴ２Ｌとの結合はＥＬＩＳＡ法によって評価することができ、さもなければＢｉａｃｏｒｅ分析法若しくはフローサイトメトリーを用いて本発明の抗体との競合を実証することも可能である。試験抗体のＣ２２４４とヒトＳＴ２Ｌとの結合阻害能は、当該試験抗体が、ヒトＳＴ２Ｌ結合について抗体と競合し得ることを示す。かかる典型的な抗体は、表３及び図１３に示すＣ２４９４、ＳＴＬＭ２０８及びＳＴＬＭ２１３である。
本明細書に記載のＳＴ２ＬのドメインＩ結合についてＣ２２４４と競合する抗体は、ＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ相互作用を阻止して、ＩＬ−３３誘発マスト細胞応答を包含する一連のＳＴ２Ｌ生物学的活性を阻害する。非中和の（すなわち、非阻害の）エピトープもまた、ＳＴ２ＬドメインＩに第二の抗体競合群（ＳＴ２ＬのドメインＩに結合するが、Ｃ２２４４と競合せず、しかもＳＴ２Ｌシグナル伝達を阻害しない抗体Ｃ２２４０で代表される）として存在する。
特異的なＳＴ２Ｌドメイン又はエピトープに結合する本明細書に記載の本発明の抗体は、ヒト免疫グロブリン座を発現するマウス（Ｌｏｎｂｅｒｇら著、Ｎａｔｕｒｅ、第３６８巻、８５６〜８５９頁、１９９４年、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら著、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１４巻、８４５〜８５１頁、１９９６年、Ｍｅｎｄｅｚら著、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１５巻、１４６〜１５６頁、１９９７年、米国特許第５，７７０，４２９号、同第７，０４１，８７０号及び同第５，９３９，５９８号）、或いはＢａｌｂ／ｃマウスを、エピトープをコードするペプチド、例えばヒトＳＴ２ＬのドメインＩのアミノ酸配列ＫＦＳＫＱＳＷＧＬＥＮＥＡＬＩＶＲＣＰＲＱＧＫＰＳＹＴＶＤＷＹＹＳＱＴＮＫＳＩＰＴＱＥＲＮＲＶＦＡＳＧＱＬＬＫＦＬＰＡＡＶＡＤＳＧＩＹＴＣＩＶＲＳＰＴＦＮＲＴＧＹＡＮＶＴＩＹＫＫＱＳＤＣＮＶＰＤＹＬＭＹＳＴＶ（配列番号９）を有するペプチド又はアミノ酸配列ＲＣＰＲＱＧＫＰＳＹＴＶＤＷ（配列番号２１０）を有するペプチドによって免疫化し、そしてＫｏｈｌｅｒら著、Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻、４９５〜４９７頁、１９７５年に記載のハイブリドーマ法を用いることによって作製することができる。こうして得られた抗体の、エピトープとの結合については、標準的な方法を用いて試験する。例えば、両方の個別の構成成分の構造が知られている場合、インシリコでタンパク質−タンパク質ドッキングを行って、適合する相互作用部位を特定することができる。抗原抗体複合体において水素−重水素（Ｈ／Ｄ）交換を行うことによって抗体が結合しうる抗原の領域をマッピングすることができる。抗原のセグメント及び点突然変異誘発を用いることにより、抗体の結合に重要なアミノ酸の位置を特定することができる。特定されたｍＡｂは更に、Ｑｕｅｅｎら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、第８６巻、１００２９〜３２頁、１９８９年及びＨｏｄｇｓｏｎら著、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：４２１、１９９１で開示されている技術等の技術によって、変化したフレームワーク支持残基を組み込むことによって結合親和性を保存するように修飾することができる。
本明細書に記載の本発明の抗体は、ヒト型であっても又はヒト適合性であってもよい。本明細書に記載の本発明の抗体は、ＩｇＡ型、ＩｇＤ型、ＩｇＥ型、ＩｇＧ型又はＩｇＭ型であってもよい。
抗原結合部位アミノ酸配列が図１０、図１１、図１２、図１３、図１５、表３、表９及び表１２に示されたものと実質上同一である抗体は、本発明の範疇に含まれる。典型的に、これは、類似した電荷又は疎水性若しくは立体化学的性質を有するアミノ酸との、１つ以上のアミノ酸置換を伴い、抗体特性、例えば、安定性又は親和性を改善するようにされる。例えば、保存的置換は、その位置のアミノ酸残基の極性又は電荷にほとんどあるいは全く影響しないように、天然アミノ酸残基の非天然残基との置換を伴ってもよい。更に、アラニン・スキャニング変異導入法についてこれまでに述べられているように（ＭａｃＬｅｎｎａｎら、Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．第６４３巻、５５〜６７頁、１９９８年；Ｓａｓａｋｉら、Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．第３５巻、１〜２４頁、１９９８年）、ポリペプチド内の任意の天然残基をアラニンで置換することもできる。当業者であれば、所望のアミノ酸置換（保存的又は非保存的であるかによらず）を、かかる置換が望まれるときには決定することができる。例えば、アミノ酸置換を使用して、親和性に影響を及ぼす残基、又は凝集等の望ましくない特性を付与する残基のように、抗体の機能に重要な残基を特定することができる。例示のアミノ酸置換を、図１２及び図１３に示す。
抗原結合部位とは対照的に、フレームワーク領域における置換は、それらが抗体の特性に悪影響を及ぼさないのであれば、行なってもよい。フレームワークの置換は、例えばバーニアゾーン残基で行う（米国特許第６，６４９，０５５号）ことで抗体の親和性又は安定性を改善することができる。置換はまた、潜在的な免疫原性を低減するために、相同のヒト生殖細胞系列遺伝子配列と比較したときに配列が異なる抗体中のフレームワーク位置でも行うことができる。これらの改変は、例えば、ｐＩＸライブラリ等の、ｄｅ ｎｏｖｏ抗体ライブラリに由来する抗体に対して行うことができる。
保存的アミノ酸置換はまた、生体系における合成によってよりはむしろ、化学的ペプチド合成によって典型的に組み込まれる、非天然起源アミノ酸残基も包含する。アミノ酸置換は、例えばＰＣＲによる変異導入（米国特許第４，６８３，１９５号）によって行うことができる。変異体のライブラリは、周知の方法を用いて、例えば、ランダムコドン（ＮＮＫ）又は非ランダムコドン、例えば１１個のアミノ酸（ＡＣＤＥＧＫＮＲＳＹＷ）をコードするＤＶＫコドンを用い、そして所望の特性を有するライブラリ又は変異体をスクリーニングすることで作製することができる。
実施例に例証される実施形態は、１つは重鎖から及び１つは軽鎖からの、可変領域の対、全長抗体鎖の対、又はＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域の対を含むが、代替的な実施形態が、単一の重鎖可変領域若しくは単一の軽鎖可変領域、単一の全長抗体鎖、又は重鎖若しくは軽鎖のいずれかの１つの抗体鎖からのＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域を含んでもよいことが当業者には分かるであろう。単一の可変領域、全長抗体鎖、又は１つの鎖のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域を使用して、別の鎖中の対応するドメインをスクリーニングすることができ、これらの２つの鎖は、ＳＴ２Ｌに特異的結合する抗体を形成することができる。スクリーニングは、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９２／０１０４７号で開示されている階層的二重組み合わせアプローチを使用する、ファージディスプレイスクリーニング法によって達成することができる。このアプローチでは、Ｈ鎖又はＬ鎖のいずれかのクローンを含む個別のコロニーを用いて、他方の鎖（Ｌ又はＨ）をコードするクローンの完全なライブラリに感染させ、得られた２鎖特異的抗原結合ドメインを上記に述べたようなファージディスプレイ法に基づいて選択する。
本発明は、本明細書に記載の本発明の抗体の単離されたＶＨ及びＶＬドメイン、そして特定のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体を提供する。本明細書に記載の本発明の特定の抗体におけるＶＨ及びＶＬ可変領域を図１３及び表１２に示す。
本発明の一実施形態は、配列番号１９１のＶＨと少なくとも９０％同一のＶＨを含むヒトＳＴ２ＬのドメインＩ（配列番号９）に特異的結合する、単離されたヒト若しくはヒト適合性抗体拮抗物質又はそのフラグメントである。
本発明の別の実施形態は、配列番号２０９のＶＬと少なくとも９４％同一のＶＬを含むヒトＳＴ２ＬのドメインＩ（配列番号９）に特異的結合する、単離されたヒト若しくはヒト適合性抗体拮抗物質又はそのフラグメントである。
本明細書に記載の一部の実施形態では、本発明は、配列番号１４３、１４４、１４５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４又は２０５のＶＨを含む抗体を提供する。
本明細書に記載の一部の実施形態では、本発明は、配列番号１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、２０６、２０７、２０８又は２０９のＶＬを含む抗体を提供する。
本明細書に記載の一部の実施形態では、本発明は、抗体であって、
配列番号１８６、１８７、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４若しくは２０５のＶＨ及び配列番号２０６のＶＬ、
配列番号１９５若しくは１９６のＶＨ及び配列番号２０７のＶＬ、
配列番号１８８、１８９若しくは１９０のＶＨ及び配列番号２０８のＶＬ、又は
配列番号１８７、１９１、１９２、１９３若しくは１９４のＶＨ及び配列番号２０９のＶＬ、を含む、抗体を提供する。
本発明の別の実施形態は、ヒトＳＴ２ＬのドメインＩ（配列番号９）に特異的結合する、単離されたヒト若しくはヒト適合性抗体拮抗物質又はそのフラグメントであって、
配列番号９７のＨＣＤＲ１、
配列番号１１４のＨＣＤＲ２、
配列番号８４のＨＣＤＲ３、
配列番号１３０のＬＣＤＲ１、
配列番号９０のＬＣＤＲ２、
配列番号１３４のＬＣＤＲ３、又は
配列番号１９１のＶＨ及び配列番号２０９のＶＬ、を含む、抗体拮抗物質又はそのフラグメント。
ヒト以外の配列を全く含まないヒトｍＡｂは、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら著、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌｍ、第２９６巻、５７〜８６頁、２０００年、及びＫｒｅｂｓら著、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ、第２５４巻、６７〜８４頁、２００１年に参照された技法により、ファージディスプレイライブラリから調製及び最適化することができる。典型的な方法では、本発明の抗体は、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を、バクテリオファージｐＩＸコートタンパク質との融合タンパク質として発現させるライブラリから単離される。抗体ライブラリをヒトＳＴ２Ｌ−ＥＣＤの結合についてスクリーニングして、得られた陽性クローンの特性評価を更に行い、Ｆａｂはクローンライセートから単離して、全長ＩｇＧとして発現する。典型的な抗体ライブラリ及びスクリーニング方法については、Ｓｈｉら著、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、第３９７巻、３８５〜９６頁、２０１０年、国際特許出願公開第ＷＯ２００９／０８５４６２号、及び米国特許出願番号１２／５４６８５０号、並びに米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，９６９，１０８号及び同第５，８８５，７９３号）に記載されている。
結果として得られたｍＡｂは、それらのフレームワーク領域において、特定のフレームワーク残基をマッチングするヒト生殖細胞系列に存在する残基へと変更するように更に改変することができる。
本発明の抗体の免疫エフェクター特性は、当業者には周知の技術により、Ｆｃ改変によって強化又はサイレンシングすることも可能である。例えば、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貧食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ））のダウンレギュレーション等のＦｃエフェクター機能は、これら活性に関与するＦｃの残基を改変することによって提供及び／又は制御することができる。また、薬物動態特性は、抗体の半減期を延長するＦｃドメインの残基を変異させることによって強化することができる（Ｓｔｒｏｈｌ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、第２０巻、６８５〜９１頁、２００９年）。典型的なＦｃ改変は、ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ２ Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら著、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、第２８１巻、２３５１４〜２３５２４頁、２００６年、又はＩｇＧ２ Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｈ２６８Ｑ、Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１又はＩｇＧ２上のＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ（国際特許出願公開第ＷＯ２０１１／０６６５０１号）である（ＥＵのナンバリングに準拠したナンバリング）。
更に、本明細書に記載の本発明の抗体は、グリコシル化、異性化、又は脱グリコシル化等の反応によって、或いはポリエチレングリコール部分の付加（ペグ化）及び脂質化等の自然界では生じない共有結合修飾等の反応によって翻訳後修飾してもよい。このような修飾は、インビボ又はインビトロで行われてもよい。例えば、本明細書に記載の本発明の抗体は、ポリエチレングリコールと結合（ペグ化）させることによって薬物動態的なプロファイルを改善することができる。結合は、当業者に既知の方法によって行うことができる。治療用抗体とＰＥＧとの結合は、機能に干渉することなく薬力学を強化することが示されている（Ｋｎｉｇｈｔら著、Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ、第１５巻、４０９〜１８頁、２００４年、Ｌｅｏｎｇら著、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、第１６巻、１０６〜１９頁、２００１年、Ｙａｎｇら著、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ、第１６巻、７６１〜７０頁、２００３年）。
安定性、選択性、交差反応性、親和性、免疫原性、又は他の望ましい生物学的特性若しくは生物物理学的特性を改善するように改変される、本明細書に記載の本発明の抗体又はそのフラグメントは、本発明の範囲に属する。抗体の安定性は、分子内力及び分子間力の中でも特に（１）固有の安定性に影響を及ぼす個々のドメインのコアパッキング、（２）ＨＣとＬＣとのペアリングに影響するタンパク質／タンパク質の界面相互作用、（３）極性及び荷電残基の埋め込み、（４）極性及び荷電残基の水素（Ｈ）結合ネットワーク、及び（５）表面電荷及び極性残基の分布、などの多くの因子によって影響される（Ｗｏｒｎら著、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、第３０５巻、９８９〜１０１０頁、２００１年）。構造を不安定化させる可能性のある残基は、抗体の結晶構造に基づいて、あるいは場合によっては分子モデリングによって特定することが可能であり、また、抗体の安定性に対するこれらの残基の影響は、特定された残基に変異を含む変異体を生成及び評価することにより試験することができる。抗体の安定性を高める方法の１つは、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）で測定する場合、熱転移中点温度（Ｔｍ）を高くすることである。一般に、タンパク質のＴｍは、その安定性と相関性を示すが、溶液中でのそのアンフォールディングし易さ及び変性し易さ、並びにそのタンパク質のアンフォールディングし易さに応じた分解プロセスとは負の相関性を示す（Ｒｅｍｍｅｌｅら、Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，１３：３６〜４６，２０００）。幾つかの研究からは、ＤＳＣにより熱安定性として測定される製剤の物理的安定性の順位と他の方法によって測定される物理的安定性との間に相関性が見つかった（Ｇｕｐｔａら著、ＡＡＰＳ ＰｈａｒｍＳｃｉ．５Ｅ８、２００３年、Ｚｈａｎｇら著、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、第９３巻、３０７６〜３０８９頁、２００４年、Ｍａａら著、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．、第１４０巻、１５５〜１６８頁、１９９６年、Ｂｅｄｕ−Ａｄｄｏら著、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、第２１巻、１３５３〜１３６１頁、２００４年、Ｒｅｍｍｅｌｅら著、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．、第１５巻、２００〜２０８頁、１９９７年）。製剤研究は、ＦａｂのＴｍが対応するｍＡｂの長期の物理的安定性と密接な関係があることを示唆している。フレームワーク又はＣＤＲ内のアミノ酸の差異は、Ｆａｂドメインの熱安定性に有意な影響を及ぼし得る（Ｙａｓｕｉら著、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、第３５３巻、１４３〜１４６頁、１９９４年）。
本明細書に記載の、ヒトＳＴ２ＬのドメインＩに特異的結合する本発明の抗体は、本発明の範疇にも含まれる二重特異性抗体へと改変することができる。本発明の抗体のＶＬ領域及び／又はＶＨ領域は、公表された方法を用いてＴａｎｄＡｂ（登録商標）様式（国際公開第ＷＯ１９９９／５７１５０号、米国特許出願公開第２０１１／０２０６６７２号）などの構造体として一本鎖二重特異性抗体へと改変してもよく、又は米国特許第５８６９６２０号、国際特許出願公開第ＷＯ１９９５／１５３８８Ａ号、同第ＷＯ１９９７／１４７１９号又は同第ＷＯ２０１１／０３６４６０号に記載されているような構造体として二重特異性ｓｃＦＶへと変更してもよい。
本明細書に記載の本発明の抗体のＶＬ領域及び／又はＶＨ領域は、二重特異性全長抗体へと改変することも可能であり、当該抗体の結合手はそれぞれ特徴的な抗原又はエピトープに結合する。かかる二重特異性抗体は典型的に、米国特許第７６９５９３６号、国際特許出願公開第ＷＯ０４／１１１２３３号、米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、同第２００７／０２８７１７０号、国際特許出願公開第ＷＯ２００８／１１９３５３号、米国特許出願公開第２００９／０１８２１２７号、米国特許出願公開第２０１０／０２８６３７４号、同第２０１１／０１２３５３２号、国際特許出願公開第ＷＯ２０１１／１３１７４６号、同第ＷＯ２０１１／１４３５４５号、又は米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号に記載されているような技法を用いて、二重特異性抗体を形成するように２つの抗体の重鎖間のＣＨ３相互作用を調節することにより作製される。本発明の抗体のＶＬ領域及び／又はＶＨ領域を組み込むことができる更なる二重特異性構造体は、例えば、二重可変ドメイン免疫グロブリン（国際特許出願公開第ＷＯ２００９／１３４７７６号）、又は異なる特異性を有する２つの抗体の結合手をつなげるように様々な二量体化ドメイン、例えばロイシン・ジッパードメイン又はコラーゲン二量化ドメイン（国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／０２２８１１号、米国特許第５９３２４４８号、同第６８３３４４１号）を包含する構造体である。
本発明の別の態様は、本発明の抗体重鎖可変領域若しくは抗体軽鎖可変領域又はそれらのフラグメント或いはそれらの相補体のいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドである。ある種のポリヌクレオチドの例が本明細書に開示されるが、所定の発現系における遺伝コードの縮重又はコドンの選択性を考慮すると、本発明の抗体拮抗物質をコードする他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。本発明の典型的なポリヌクレオチドは、配列番号２１１、２１２、２１３及び２１４で示されるものである。
本発明の別の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。こうしたベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現ベクター、トランスポゾンに基づいたベクター、又は任意の手段によって特定の生物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明のポリヌクレオチドを導入するのに適した他の任意のベクターであってよい。
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。このような宿主細胞は、真核細胞、細菌細胞、植物細胞又は古細菌細胞であってもよい。真核細胞の例としては、哺乳動物、昆虫、鳥類又は他の動物由来のものが挙げられる。哺乳動物の真核細胞としては、ハイブリドーマ細胞株又は骨髄腫細胞株などの不死化細胞株、例えばＳＰ２／０（ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｍａｎａｓｓａ、ＶＡ、ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳ０（ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＵＫ、ＥＣＡＣＣ番号８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）マウス細胞株が挙げられる。ヒト骨髄腫細胞株の一例は、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）である。他の有用な細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＣＲＬ−６１）、又はＤＧ４４などの、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来するものが挙げられる。
本発明の別の実施形態は、本発明の宿主細胞を培養する工程と、宿主細胞によって産生された抗体を回収する工程と、を含む、ＳＴ２ＬのドメインＩに特異的結合する抗体の製造方法である。抗体を製造して精製する方法は、当該技術分野で周知である。
本発明の別の実施形態である、ＳＴ２ＬのドメインＩに特異的結合する抗体を、対象に、ＩＬ−３３及びＳＴ２Ｌの相互作用を阻害するうえで十分な量で投与する工程を含む、対象におけるＳＴ２ＬとＩＬ−３３との相互作用を阻害する方法。
治療方法
本明細書に記載の本発明のＳＴ２Ｌ拮抗物質、例えば、ＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ相互作用を阻止しかつＳＴ２ＬのドメインＩに結合するＳＴ２Ｌ抗体拮抗物質、ヒトＳＴ２Ｌ（配列番号１）への結合を、配列番号４７の重鎖可変領域と配列番号５１の軽鎖可変領域とを含む単離された抗体と競合する抗体、又はヒトＳＴ２Ｌに配列番号１のアミノ酸残基３５〜４８（ＲＣＰＲＱＧＫＰＳＹＴＶＤＷ、配列番号２１０）で結合する抗体は、免疫系を調節するのに用いてもよい。本明細書に記載の本発明の抗体は、本発明の抗体がＩＬ−３３誘発マスト細胞応答をより効率良く軽減できるので、ＳＴ２Ｌの他のドメイン及び／又は領域に結合する抗体と比べるとＳＴ２Ｌ生物学的活性を拮抗する際により有効であり得る。本発明のどの抗体も、本発明の方法に使用可能である。本発明の方法に使用可能な典型的な抗体は、抗体ＳＴＬＭ６２、ＳＴＬＭ１５、ＳＴＬＭ１０３、ＳＴＬＭ１０７、ＳＴＬＭ１０８、ＳＴＬＭ１２３、ＳＴＬＭ１２４、ＳＴＬＭ２０６、ＳＴＬＭ２０７、ＳＴＬＭ２０８、ＳＴＬＭ２０９、ＳＴＬＭ２１０、ＳＴＬＭ２１１、ＳＴＬＭ２１２、ＳＴＬＭ２１３である。理論に束縛されるものではないが、ドメインＩに結合しかつＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ相互作用を阻止する抗体拮抗物質は、ＩＬ−１ＲＡｃＰ／ＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ／ｃＫｉｔ複合体の形成又はマスト細胞上での下流のシグナル伝達を阻害する可能性があるのに対し、ドメインＩＩＩに結合する抗体は、ＩＬ−１ＲＡｃＰのＳＴ２Ｌ／ＩＬ−３３複合体への動員を阻害できるが、マスト細胞上に特異的に見られる更に大きなＩＬ−１ＲＡｃＰ／ＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ／ｃＫｉｔ複合体の形成を妨害できない可能性があると考えられる。実施されたマイクロアレイ解析によれば、抗ＳＴ２ＬドメインＩ結合抗体はＩＬ−３３によるマスト細胞シグナル伝達経路の大部分を抑制するが、抗ＳＴ２ＬドメインＩＩＩ結合抗体はシグナル伝達経路のほんの一部のみを阻害できたことから、この示唆を裏付けている。ＩＬ−３３は付属タンパク質ＩＬ−１ＲＡｃＰとの会合前にＳＴ２Ｌと結合するので、ドメインＩ結合抗体によりＩＬ−３３とＳＴ２Ｌとの結合を阻止することで、ｃＫｉｔ又は未だ確認されていない補助受容体を包含する他の付属タンパク質の会合を防ぐことは実現可能である。ドメインＩＩＩ結合抗体は、ＳＴ２Ｌに結合するＩＬ−３３と干渉せず、ＩＬ−１ＲＡｃＰ会合を理論上阻止し得るが、未だ確認されていない補助受容体などの他の補助受容体の会合を阻止しないことが可能である。ＩＬ−１ＲＡｃＰがＩＬ−１／ＩＬ−１Ｒ又はＳＴ２Ｌ／ＩＬ−３３複合体とどのように相互作用するかについて複数のモデルが提案されている（Ｌｉｎｇｅｌら著、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第１７巻、１３９８〜１４１０頁、２００９年、また、Ｔｈｏｍａｓら著、Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ ＆ Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｌ、第１９巻、４５５〜４５７頁、２０１２年に概説されている）。これらのモデルは、ＩＬ−１ＲＡｃＰが複合体の片面に結合することを示しているが、その面は確証的に示されていない。したがって、複合体の「他の面」又は「自由面」は代替の補助受容体との会合に利用でき、ドメインＩＩＩ抗体で阻止されず、しかも別の補助受容体の動員が増加し、結果としてシグナル伝達が向上するというようなオフターゲット効果が生じる可能性がある。
本発明の方法では、ヒトＳＴ２ＬのドメインＩに特異的結合する抗体拮抗物質、ＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ相互作用を阻止しかつヒトＳＴ２ＬのドメインＩに結合する抗体拮抗物質、ヒトＳＴ２Ｌ（配列番号１）の結合に関して配列番号４７の重鎖可変領域及び配列番号５１の軽鎖可変領域とを含む単離された抗体と競合する抗体、又は配列番号１のアミノ酸残基３５〜４８（ＲＣＰＲＱＧＫＰＳＹＴＶＤＷ、配列番号２１０）においてヒトＳＴ２Ｌに結合する抗体を使用することができる。かかる抗体の更なる特徴としては、抗体のＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ相互作用阻止能及びヒトマスト細胞応答阻害能が挙げられる。
したがって、本発明の抗体は、一連のＳＴ２Ｌ介在状態、ＳＴ２Ｌ介在炎症性状態及びマスト細胞応答を阻害することが望まれる状態を治療するのに適している。
本発明の方法を用いて任意の分類に属する動物患者を治療することができる。かかる動物の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜等の哺乳動物が挙げられる。例えば、本発明の抗体は、ＳＴ２Ｌ介在状態、例えば喘息、気道過敏症、サルコイドーシス、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、肺嚢胞性線維症、炎症性大腸炎（ＩＢＤ）、関節リウマチ、好酸球性食道炎、強皮症、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、水泡性類天疱瘡、慢性じん麻疹、糖尿病性腎症、間質性膀胱炎又は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を包含する炎症性疾患の予防及び治療に有用である。本発明の抗体は、少なくとも部分的にマスト細胞によってもたらされる免疫疾患、例えば喘息、湿疹、掻痒、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、並びに関節リウマチ、水泡性類天疱瘡及び多発性硬化症などの自己免疫疾患の予防及び治療に有用である。
本発明の抗体はまた、かかる治療のための薬剤の調製においても有用であり、薬剤は、本明細書に定められる投薬量で投与するために調製される。
マスト細胞は、その様々な介在物質の放出によってアレルギー性炎症及び喘息において中心的な役割を果たす（Ａｍｉｎ著、Ｒｅｓｐｉｒ Ｍｅｄ、第１０６巻、９〜１４頁、２０１２年に概説されている）。ＳＴ２Ｌはマスト細胞上に高発現し、そしてその活性化は、多くの炎症性サイトカイン及び他の介在物質の発現につながる。ＳＴ２Ｌ活性の阻害は、マスト細胞介在炎症細胞動員を妨げて慢性炎症を調整すると考えられている。
マスト細胞は、アレルゲン、冷気、病原体などの刺激に対して迅速に反応するものであり、これら刺激による上皮組織の損傷はＩＬ−３３の放出をもたらす可能性がある（Ｚｈａｏ及びＨｕ著、Ｃｅｌｌ ＆ Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ、第７巻、２６０〜２頁、２０１２年に概説されている）。マスト細胞は、ロイコトリエン、ヒスタミン、プロスタグランジン及びサイトカインを放出することで血管透過性及び気管支収縮を向上させて、その部位に好中球、好酸球及びＴリンパ球などの他の免疫細胞を動員する（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら著、ＪＥＭ、第１８４巻、１４８３〜９４頁、１９９６年、Ｗｈｉｔｅら著、ＪＡＣＩ、第８６巻、５９９〜６０５頁、１９９０年）。さらに、マスト細胞は、内皮細胞上で接着分子の上方調節を誘発することによって免疫反応を増強させて、免疫細胞の移動を向上させる（Ｍｅｎｇら著、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、第１６５巻、４０〜５３頁、１９９５年）。マスト細胞は気道のリモデリングにおいて重要な役割を果たす。すなわち、喘息患者の場合、マスト細胞数の増加は気道平滑筋（ＡＳＭ）細胞層内で認められ、介在物質を分泌することでＡＳＭの増殖を促進する（Ｏｋａｙａｍａら著、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ、第１９巻、６８７〜９３頁、２００７年に概説されている）。
炎症状態の別の一例は炎症性肺疾患である。炎症性肺疾患の例としては、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫又はプリオンによる感染にともなうものなどの感染により誘発される肺疾患、アレルゲンにより誘発される肺疾患、石綿症、珪肺症、又はベリリウム肺症などの汚染物質により誘発される肺疾患、胃吸引により誘発される肺疾患、多発性内分泌障害腸症候群、肺嚢胞性線維症などの遺伝的素因をともなう炎症性状態、及び人工呼吸器による傷害などの物理的外傷により誘発される肺疾患が挙げられる。これらの炎症性状態には更に、喘息、肺気腫、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、サルコイドーシス、ヒスチオサイトーシス、リンパ管筋腫症、急性肺傷害、急性呼吸窮迫症候群、慢性肺疾患、気管支肺異形成症、市中肺炎、院内肺炎、人工呼吸器関連肺炎、敗血症、ウイルス性肺炎、インフルエンザ感染、パラインフルエンザ感染、ロタウイルス感染、ヒト・メタニューモウイルス感染、ＲＳウイルス感染、及びアスペルギルス感染又は他の真菌感染も含まれる。感染にともなう炎症性疾患の例としては、重症肺炎、肺嚢胞性線維症、気管支炎、気道の増悪、及び急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含むウイルス又は細菌性肺炎が挙げられる。こうした感染にともなう状態は、一次ウイルス感染及び二次細菌感染のように複数の感染をともなう場合がある。ＳＴ２Ｌシグナル伝達の調節不全は、喘息及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）等の肺疾患の病理に関与する可能性がある（Ａｌｃｏｒｎら著、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、第７２巻、４９５〜５１６頁、２０１０年に概説されている）。喘息及び気道の炎症に対する一般的に用いられる動物モデルとしては、オボアルブミン負荷モデル、メタコリン感作モデル及びアスペルギルス・フミガーツスによる感作が挙げられる（Ｈｅｓｓｅｌら著、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、第２９３巻、４０１〜４１２頁、１９９５年）。培養したヒト気管支上皮細胞、気管支線維芽細胞又は気道平滑筋細胞からのサイトカイン及びケモカインの産生の阻害をインビトロモデルとして用いることもできる。本発明の拮抗物質をこれらのモデルのいずれかに投与することを用いて、喘息、気道の炎症、ＣＯＰＤなどの症状を改善して経過に変化を与えるためのこれらの拮抗物質の使用を評価することができる。
喘息は、気道過敏症（「ＡＨＲ」）、気管支収縮作用、喘鳴、好酸球性炎症又は好中球性炎症、粘液分泌過多、上皮下線維症、及び高いＩｇＥ値を特徴とする肺の炎症性疾患である。喘息の患者は、最も一般的には気道の微生物感染（例えばライノウイルス、インフルエンザウイルス、インフルエンザ菌など）により症状の悪化である「増悪」を経験する。喘息の発作は、環境因子（例えば、回虫、昆虫、動物（例えばネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット及び鳥）、真菌、空気汚染物質（例えば煙草の煙）、刺激性ガス、煙霧、蒸気、エアゾール、化学物質、花粉、運動、又は冷気によって誘発される可能性がある。喘息とは別に、肺を侵すいくつかの慢性炎症性疾患は、例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、細菌性肺炎及び肺嚢胞性線維症などの、気道への好中球浸潤を特徴とするものであり（Ｌｉｎｄｅｎら著、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．、第１５巻、９７３〜９７７頁、２０００年、Ｒａｈｍａｎら著、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１１５巻、２６８〜２７６頁、２００５年）、また、ＣＯＰＤ、アレルギー性鼻炎及び肺嚢胞性線維症などの疾患は、気道過敏症を特徴とする（Ｆａｈｙ及びＯ’Ｂｙｒｎｅ著、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．、第１６３巻、８２２〜８２３頁、２００１年）。喘息及び気道の炎症に対する一般的に用いられる動物モデルとしては、オボアルブミン感作後及びオボアルブミン負荷後のメタコリン負荷モデル（Ｈｅｓｓｅｌら著、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、第２９３巻、４０１〜４１２頁、１９９５年）が挙げられる。培養したヒト気管支上皮細胞、気管支線維芽細胞又は気道平滑筋細胞からのサイトカイン及びケモカインの産生の阻害をインビトロモデルとして用いることもできる。本発明の抗体拮抗物質をこれらのモデルのいずれかに投与することを用いて、喘息、気道の炎症、ＣＯＰＤなどの症状を改善して経過に変化を与えるための当該拮抗物質の使用を評価することができる。
ＴＨ２細胞、好塩基球、マスト細胞及び新たに報告された自然リンパ球２型細胞上でのＳＴ２Ｌ受容体からのＩＬ−３３シグナル伝達により、ＩＬ−５及びＩＬ−１３（２型サイトカイン）の分泌が生じる（ＩＬＣはＳｐｉｔｓら著、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１３巻、１４５〜１４９、２０１３年に概説されている）。ＩＬ−５又はＩＬ−１３を喘息において標的とする治療薬の効能は、その経路の関連性を裏付けている。ＩＬ−５は好酸球を活性化するが、喀痰中の好酸球の増加を伴う重症喘息患者のサブグループを、ＩＬ−５を中和モノクローナル抗体によって治療すると、悪化が減ずる（Ｎａｉｒら著、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．、２００９年、第３６０巻（第１０号）、９８５〜９９３頁）。ＩＬ−１３は、ＩｇＥ合成、粘液の分泌、及び線維症に寄与すると報告されている。抗ＩＬ−１３モノクローナル抗体による重症喘息患者の治療は肺機能を改善し、かなりの改善を示したサブグループもあった（Ｃｏｒｒｅｎら著、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第３６５巻、１０８８〜１０９８頁、２０１１年）。各免疫学的経路の他の介在物質も、喘息の発症に関与しており、ＳＴ２Ｌの他に、これら介在物質を阻止することで、更なる治療的有効性が示される可能性もある。多数の２型サイトカイン、又は２型サイトカイン産生の上流の経路を標的とする治療法が重症疾患に有効な可能性もある。
本発明のＳＴ２Ｌ抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインは、二重特異性抗体及び本明細書に記載の分子に組み込んでもよく、この場合、二重特異性抗体がＳＴ２ＬのドメインＩおよびＴＳＬＰ（胸腺間質リンパ球造成）、ＩＬ−２５、ＩＬ−１７ＲＢ又はＴＳＬＰＲなどの第二の抗原に特異的結合する。
ＩＬ−２５及びＴＳＬＰ、例えばＩＬ−３３は、個々のシグナル伝達複合体によって２型サイトカインの放出を誘発する。すなわち、ＩＬ−２５（ＩＬ−１７Ｅ）は、ＩＬ−１７ファミリーの一員であって、ＩＬ−１７ＲＡ／ＩＬ−１７ＲＢを介してシグナル伝達を行い、また、ＴＳＬＰは、ＩＬ−７ファミリーの一員であって、ＴＳＬＰＲ／ＩＬ−７Ｒαヘテロ二量体を介してシグナル伝達を行う（Ｋｏｙａｓｕら著、Ｉｍｍｕｎｏｌ、第１３２巻、４７５〜４８１頁、２０１１年に概説されている）。ＩＬ−３３、ＳＴ２Ｌ、ＩＬ−２５、ＩＬ−１７ＲＢ、ＴＳＬＰ又はＴＳＬＰＲが欠損している動物は、多種多様な喘息マウスモデルのうち少なくとも一種ではそれほど重度の気道の炎症を示さないが、これら動物モデルの大部分では気道の炎症への保護不足が認められる場合もあり、様々なアレルゲン又は病原体に上皮が晒され、それに付随してＩＬ−３３、ＩＬ−２５及びＴＳＬＰの放出が誘発される可能性がある。Ｈａｍｍａｄらは、ハウスダストであるダニを投与すると、気道にＩＬ−２５、ＴＳＬＰ及びＩＬ−３３（並びにＩＬ−３３の下流ではＩＬ−５及びＩＬ−１３）の放出が生じることを報告している（Ｈａｍｍａｄら著ｍＮａｔ Ｍｅｄ、第１５巻、２１０〜２１６頁、２００９年）。このことは、ＳＴ２Ｌ及びＴＳＬＰ並びに／又はＩＬ−２５の阻止が、とりわけ重度の気道疾患に有益な効果をもたらす可能性があることを示唆している。
本発明の別の実施形態では、ＳＴ２ＬのドメインＩに特異的結合する抗体拮抗物質は、ＳＴ２ＬとＴＳＬＰ、ＳＴ２ＬとＩＬ−２５、ＳＴ２ＬとＴＳＬＰＲ、ＳＴ２ＬとＩＬ−１７ＲＡ、又はＳＴ２ＬとＩＬ−１７ＲＢに結合する二重特異性分子を産生するのに用いることができる。
本発明の他の実施形態では、ＳＴ２ＬのドメインＩに特異的結合する抗体拮抗物質は、更にＳＬＰ、ＩＬ−２５、ＴＳＬＰＲ、ＩＬ−１７ＲＡ又はＩＬ−１７ＲＢに結合する二重特異性抗体である。
ＴＳＬＰ、ＩＬ−２５、ＴＳＬＰＲ、ＩＬ−１７ＲＡ及びＩＬ−１７ＲＢ結合抗体は、本明細書に記載の方法を用いて、例えばヒト免疫グロブリン座位を発現するマウス（Ｌｏｎｂｅｒｇら著、Ｎａｔｕｒｅ、第３６８巻、８５６〜８５９頁、１９９４年、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら著、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第１４巻、８４５〜８５１頁、１９９６年、Ｍｅｎｄｅｚら著、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１５巻、１４６〜１５６頁、１９９７年、並びに米国特許第５，７７０，４２９号、同第７，０４１，８７０号及び同第５，９３９，５９８号）又はＢａｌｂ／ｃマウスを対応するタンパク質若しくはタンパク質の細胞外ドメインによって免疫化することで、或いは本明細書に記載のファージディスプレイライブラリを用いて作製することができる。あるいは、ＴＳＬＰ、ＩＬ−２５、ＴＳＬＰＲ、ＩＬ−１７ＲＡ、及びＩＬ−１７ＲＢに対する抗体を用いて二重特異性分子を産生することも可能である。使用可能な典型的なＩＬ−２５抗体は、例えば国際特許出願公開第ＷＯ２０１１／１２３５０７号に記載されているものである。
変形性関節症、関節リウマチ、傷害の結果として関節炎にかかった関節等を含む関節炎が、一般的な炎症性状態であり、それらは本発明の拮抗物質等の抗炎症性タンパク質の治療的使用から利益を受けるであろう。ＳＴ２Ｌシグナル伝達の活性化によって、炎症を起こした関節の炎症及び更なる組織傷害が持続しうる。関節リウマチのための複数の動物モデルが既知である。例えばコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）モデルでは、ヒト関節リウマチとよく似た慢性炎症性関節炎をマウスに発症させる。このモデルのＳＴ２Ｌ欠損（ＳＴ２ＫＯ）マウスは、弱い疾患に罹ったが、このモデルの病態は、マスト細胞によるＳＴ２Ｌ発現に依存していた（Ｘｕら著、ＰＮＡＳ、第１０５巻、１０９１３〜１０９１８頁、２００８年）。このモデルでは、単核細胞及び多形核細胞の浸潤が軽減され、また、ＳＴ２ＫＯマウスの関節における滑膜の過形成が軽減された。コラーゲン（ＣＩＩ）で培養したＳＴ２ＫＯマウスの所属ＬＮは、ＩＬ−１７、ＩＦＮγ、及びＴＮＦαの産生がかなり低下することが分かった。骨髄油体マスト細胞（ＢＭＭＣ）が養子移入されたＳＴ２Ｌ欠損マウスは、ＣＩＡを誘発する前に、ＳＴ２ＫＯのＢＭＭＣを生着したマウスよりも重度のＣＩＡを発症した。そのため、マスト細胞によるＳＴ２Ｌシグナル伝達は、ヒト関節リウマチに似たマウスモデルでは関節炎の発症に重要な役割を果たした。ＣＩＡモデルマウスへの本発明のＳＴ２Ｌ抗体の投与は、マスト細胞応答を阻害するものであって、症状を改善して病気の経過を変化させるための拮抗物質の使用を評価するのに使用することができる。
典型的な消化管炎症性状態は、炎症性大腸炎（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、及びクローン病（ＣＤ）、外界からの刺激によって誘発される大腸炎（例えば、化学療法、放射線療法等の投与等の治療レジメンによって引き起こされるかあるいはこれにともなう（例えば、副作用として）消化管炎症（例えば、大腸炎）、感染性大腸炎、虚血性大腸炎、コラーゲン大腸炎又はリンパ球性大腸炎、壊死性腸炎、そして慢性肉芽腫症若しくはセリアック病などの状態の大腸炎、食品アレルギー、胃炎、感染性胃炎若しくは感染性腸炎（例えばヘリコバクター・ピロリの感染による慢性活動性胃炎）、並びに感染性病原体によって引き起こされる消化管炎症の他の形態である。消化管炎症性状態のための複数の動物モデルが存在する。最も広く用いられているモデルは、結腸に慢性炎症及び潰瘍を誘発する２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸／エタノール（ＴＮＢＳ）誘発大腸炎モデル又はオキサゾロンモデルである（Ｎｅｕｒａｔｈら著、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、第１９巻、５１〜６２頁、２０００年）。別のモデルでは、血性下痢、体重減少、結腸の短縮、及び好中球浸潤をともなう粘膜の潰瘍形成が現われる急性大腸炎を誘発する、硫酸デキストランナトリウム（ＤＳＳ）を使用する。別のモデルは、ナイーブなＣＤ４５ＲＢhigh ＣＤ４ Ｔ細胞をＲＡＧ又はSCIDマウスに養子移入する。このモデルでは、ドナーのナイーブＴ細胞がレシピエントの腸を攻撃することにより、ヒトの炎症性大腸炎に似た慢性腸炎及びその症状を引き起こす（Ｒｅａｄ及びＰｏｗｒｉｅ著、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｈａｐｔｅｒ、第１５巻、ユニット１５．１３、２００１年）。これらのモデルのいずれかにおいて本発明の拮抗物質の投与を用いることによって、炎症性大腸炎等の腸内の炎症に伴う症状を改善して疾患の経過を変化させるこれらの拮抗物質の潜在的な有効性を評価することができる。
腎線維症は、移植片の虚血／再灌流などの急性傷害（Ｆｒｅｅｓｅら著、Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、第１６巻、２４０１〜２４０６頁、２００１年）又は糖尿病などの慢性状態（Ｒｉｔｚら著、Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、第１１巻、追補９、３８〜４４頁、１９９６年）によって発生する可能性がある。これらの発症は典型的に、初期炎症反応に続いて、糸球体ろ過装置及び尿細管間質の持続性線維成長を特徴とする（Ｌｉｕ著、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ、第６９巻、２１３〜２１７頁、２００６年）。尿細管間質線維症は、末期の腎不全に至る腎損傷の発症において重要な役割を果たしていることが示されており、近位尿細管細胞が中心的媒介物であることが明らかにされている（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ及びＳｔｅａｄｍａｎ著、Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．、第１７巻、２４７〜２５２頁、２００２年、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ著、Ｃｈａｎｇ Ｇｕｎｇ、Ｍｅｄ．Ｊ．、第３０巻、２〜６頁、２００７年）。尿細管間質区画における線維化は、部分的に、常在線維芽細胞の活性化により媒介され、この常在線維芽細胞は、炎症促進性のサイトカインを分泌し、これが近位尿細管上皮を刺激して、局所炎症性及び線維形成性媒介物質を分泌する。更に、走化性サイトカインが線維芽細胞及び上皮細胞によって分泌され、単球／マクロファージ及びＴ細胞を尿細管間質へと浸潤させるよう導く方向の勾配をもたらす。炎症性湿潤により、更なる線維形成性及び炎症性のサイトカインが産生され、それらは更に線維芽細胞及び上皮サイトカインの放出を活性化し、同時に上皮も刺激して表現型移行を起こし、これにより細胞が過剰の細胞外マトリックス成分を蓄積させる（Ｓｉｍｏｎｓｏｎ著、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．、第７１巻、８４６〜８５４頁、２００７年）。
維症状態の他の例としては、肝線維症（アルコール性肝硬変、ウイルス性肝硬変、自己免疫性肝炎を含むがこれらに限定されない）：肺線維症（強皮症、特発性肺線維症を含むがこれらに限定されない）；腎臓線維症（強皮症、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、ループス腎炎を含むがこれらに限定されない）；真皮線維症（強皮症、肥厚性及びケロイド瘢痕、火傷を含むが、これらに限定されない）；骨髄線維症；神経線維腫症；線維腫；腸線維症；及び外科手術による線維性癒着などが挙げられる。線維症は、臓器特異的な線維症又は全身性線維症であり得る。臓器特異的な線維症は、肺線維症、肝線維症、腎臓線維症、心臓線維症、血管線維症、皮膚線維症、眼線維症、又は骨髄線維症に関連し得る。肺線維症は、特発性肺線維症、薬剤誘起性肺線維症、喘息、サルコイドーシス、又は慢性閉塞性肺疾患に関連し得る。肝線維症は、肝硬変、住血吸虫症、又は胆管炎に関連し得る。肝硬変は、アルコール性肝硬変、Ｃ型肝炎後肝硬変、原発性胆汁性肝硬変の中から選択され得る。胆管炎は硬化性胆管炎であり得る。腎臓線維症は、糖尿病性腎症又はループス糸球体硬化症に関連し得る。心臓線維症は、心筋梗塞に関連し得る。血管線維症は、血管形成術後の動脈再狭窄、又はアテローム性動脈硬化に関連し得る。皮膚線維症は、火傷瘢痕、肥厚性瘢痕、ケロイド、又は腎性線維化性皮膚症に関連し得る。眼線維症は、後眼窩線維症、白内障手術後の硝子体網膜症又は増殖性硝子体網膜症に関連し得る。骨髄線維症は、特発性骨髄線維症又は薬剤誘発性骨髄線維症に関連し得る。全身性線維症は、全身性硬化症及び移植片対宿主病から選択され得る。
本発明の方法によって予防又は治療し得る他の炎症性状態及び神経障害は、自己免疫疾患によって引き起こされるものである。これらの状態及び神経障害としては、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、並びにアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、双極性傷害、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む神経変性及び中枢神経系（ＣＮＳ）疾患；原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、非アルコール性脂肪性肝疾患／脂肪性肝炎、線維症、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）等の肝疾患；糖尿病及びインスリン抵抗性；アテローム性動脈硬化症、脳出血、脳卒中、及び心筋梗塞等の心血管疾患；関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎及び若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）、骨粗鬆症、変形性関節症、膵炎、線維症、脳炎、乾癬、巨細胞動脈炎、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、炎症性皮膚状態、移植、癌、アレルギー、内分泌疾患、創傷治癒、他の自己免疫性疾患、気道過敏症、並びに細胞、ウイルス又はプリオンによって介在される感染症又は疾患が挙げられる。
本発明の一実施形態は、単離されたヒト若しくはヒト適合性抗体拮抗物質の治療上の有効量を、それを必要とする患者に、ＳＴ２Ｌ介在状態を治療又は予防するうえで十分な時間にわたって投与する工程を含む、ＳＴ２Ｌ介在状態の治療又は予防方法であって、単離されたヒト若しくはヒト適合性抗体拮抗物質が、ヒトＳＴ２ＬのドメインＩ（配列番号９）に特異的結合し、ＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ相互作用を阻止し、ヒトＳＴ２Ｌ（配列番号１）との結合に関して配列番号４７の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号５１の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離された抗体と競合し、並びに／又は配列番号１のアミノ酸残基３５〜４８（ＲＣＰＲＱＧＫＰＳＹＴＶＤＷ、すなわち配列番号２１０）においてヒトＳＴ２Ｌに結合するものである、方法である。
本発明の他の実施形態は、単離されたヒト若しくはヒト適合性抗体拮抗物質の治療上の有効量を、その必要のある患者に、マスト細胞応答を阻害するうえで十分な時間にわたって投与する工程を含む、患者のマスト細胞応答を阻害する方法であって、単離されたヒト若しくはヒト適合性抗体拮抗物質が、ヒトＳＴ２ＬのドメインＩ（配列番号９）に特異的結合し、ＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ相互作用を阻止し、ヒトＳＴ２Ｌ（配列番号１）との結合に関して配列番号４７の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号５１の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離された抗体と競合し、並びに／又は配列番号１のアミノ酸残基３５〜４８（ＲＣＰＲＱＧＫＰＳＹＴＶＤＷ、すなわち配列番号２１０）においてヒトＳＴ２Ｌに結合するものである、方法である。
本発明の別の実施形態は、単離されたヒト若しくはヒト適合性抗体拮抗物質を、対象に、ＩＬ−３３とＳＴ２Ｌとの相互作用を阻害するうえで十分な量で投与する工程を含む、対象のＩＬ−３３とＳＴ２Ｌとの相互作用を阻害する方法であって、単離されたヒト若しくはヒト適合性抗体拮抗物質が、ヒトＳＴ２ＬのドメインＩ（配列番号９）に特異的結合し、ＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ相互作用を阻止し、ヒトＳＴ２Ｌ（配列番号１）との結合に関して配列番号４７の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号５１の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離された抗体と競合し、並びに／又は配列番号１のアミノ酸残基３５〜４８（ＲＣＰＲＱＧＫＰＳＹＴＶＤＷ、すなわち配列番号２１０）においてヒトＳＴ２Ｌに結合するものである、方法である。
別の実施形態では、ＳＴ２Ｌ介在状態は、喘息、気道過敏症、サルコイドーシス、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、肺嚢胞性線維症、炎症性大腸炎（ＩＢＤ）、好酸球性食道炎、強皮症、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、水泡性類天疱瘡、慢性じん麻疹、糖尿病性腎症、関節リウマチ、間質性膀胱炎又は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である。
別の実施形態では、ＳＴ２Ｌ介在状態は、肺における炎症性細胞動員、杯細胞の肥厚化、又は粘液分泌の増加を伴う。
別の実施形態では、ＳＴ２Ｌ介在状態はマスト細胞応答を伴う。
別の実施形態では、マスト細胞応答の阻害は、ヒト臍帯血由来マスト細胞により放出されるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０又はＩＬ−１３の量を５０μｇ／ｍｌの抗体で少なくとも５０％阻害することを含む。
別の実施形態では、それを必要とする患者に投与される抗体拮抗物質は、ヒトＳＴ２ＬのドメインＩ（配列番号９）に特異的結合し、ＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ相互作用を阻止し、ヒトＳＴ２Ｌ（配列番号１）との結合に関して配列番号４７の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号５１の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離された抗体と競合し、並びに／又は配列番号１のアミノ酸残基３５〜４８（ＲＣＰＲＱＧＫＰＳＹＴＶＤＷ、すなわち配列番号２１０）においてヒトＳＴ２Ｌに結合し、そして更に、ＴＳＬＰ、ＩＬ−２５、ＴＳＬＰＲ、ＩＬ−１７ＲＡ又はＩＬ−１７ＲＢにも結合する、二重特異性抗体である。
投与／医薬組成物
ＳＴ２Ｌ生物学的活性を調整することが望ましい状態の治療において有効な抗ＳＴ２Ｌ抗体の「治療上の有効量」は、標準的な研究技術によって決定することができる。例えば、喘息又は関節リウマチ等の炎症性状態の治療において有効となる抗ＳＴ２Ｌ抗体の用量は、本明細書に記載のモデル等の、関連する動物モデルに抗ＳＴ２Ｌ抗体を投与することによって決定することができる。
加えて、インビトロアッセイを、至適用量の範囲を同定する一助として所望により選択することもできる。特定の有効用量の選択は、当業者であれば幾つかの要因の考慮に基づいて（例えば、臨床試験によって）決定することができる。こうした要因には、治療又は予防しようとする疾患、疾患症状、患者の体重、患者の免疫状態、及び当業者には既知の他の要因が含まれる。製剤に用いられる正確な用量は、投与経路、及び疾患の重篤度にも依存し、医師の判断及び各患者の状況に基づいて決定されなければならない。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導出される用量反応曲線から外挿することができる。
本発明の抗体の治療上の使用のための投与方法は、薬剤を宿主に送達する任意の好適な経路であってよい。これらの抗体の医薬組成物は、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、又は鼻腔内等の非経口投与に特に有用である。
本発明の抗体は、有効量の薬剤を製薬上許容される担体中の有効成分として含有する医薬組成物として調製することができる。「担体」という用語は、活性化合物と共に投与する希釈剤、補助剤、賦形剤又は溶媒のことを指す。こうした薬剤用ビヒクルは、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油等の、石油、動物油、植物油又は合成油由来のものを含む、水及び油などの液体であり得る。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを用いることができる。これらの溶液は滅菌液であり、一般的に、粒子状物質を含まない。これらは、従来周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。この組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる製薬上許容される補助物質、例えばｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤等を含むことができる。かかる医薬製剤中の本発明の抗体の濃度は幅広く変化してよく、すなわち約０．５重量％未満、通常は約１重量％又は少なくとも約１重量％か、最大で１５又は２０重量％までであってよく、また、選択される特定の投与方法にしたがって、主として必要とされる用量、液体の体積、粘度等に基づいて選択される。
したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌済み緩衝水、及び約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、又はより好ましくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明の抗ＳＴ２Ｌ抗体を含むように調製することができる。同様に、静脈内注射用の本発明の医薬組成物は、２５０ｍＬの滅菌リンゲル溶液、及び約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、好ましくは５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明の拮抗物質を含むように調製することができる。非経口投与可能な組成物を調製する実際の方法は周知であり、例えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」、第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）に、より詳細に記載されている。
本発明の抗体は、保存のために凍結乾燥させ、使用前に好適な担体に溶解させることができる。この手法は、これまでに、従来の免疫グロブリン及びタンパク製剤に有効であることが分かっており、当該技術分野において既知の凍結乾燥法及び再構成法を用いることができる。
ここで、以下の具体的な非限定例を参照して、本発明を説明する。
材料及び方法（概要）
ヒト及びカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、ｃｙｎｏ）受容体−リガンド結合阻害アッセイ（ＲＬＢアッセイ）
９６ウェルプレートを重炭酸塩緩衝液中、４μｇ／ｍｌのヒトＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ（配列番号１のアミノ酸１９〜３２８）又はＣ末端Ｈｉｓ6標識の付いた２μｇ／ｍｌのｃｙｎｏ ＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ（配列番号２のアミノ酸１９〜３２１）５０μｌを用いて４℃で１６時間コーティングした。その後の工程はいずれも室温で行った。プレートを２００μｌブロッキング用緩衝液でブロッキングして、ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎを含む洗浄用緩衝液３００μｌで３回洗浄した。抗ＳＴ２Ｌ ｍＡｂの様々な希釈剤３０μｌをウェルに加えて１時間インキュベートした。ヒト受容体−リガンド結合アッセイでは、ビオチン化ヒトＩＬ−３３（配列番号３の残基１１２〜２７０）２０μｌを最終濃度１００ｎｇ／ｍｌで加えて、３０分間インキュベートした。ｃｙｎｏ受容体−リガンド結合アッセイでは、ビオチン化ｃｙｎｏ ＩＬ−３３（配列番号４の残基１１２〜２６９）を最終濃度２００ｎｇ／ｍｌで加えて、３０分間インキュベートした。プレートを洗浄用緩衝液３００μｌで３回洗浄した。０．２μｇ／ｍｌストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）５０μｌを加えて、３０分間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎを含む洗浄用緩衝液３００μｌで３回洗浄した。各ウェルにＴＭＢ基質（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）５０μｌを加えた。２Ｎ硫酸１００μｌを加えることによって反応を止めた。Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてＯＤ４５０を測定した。
キメラＳＴ２Ｌ構築物の作製
ヒト及びマウスＳＴ２ＬドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩ交換を特徴とする様々な構築物は、標準的な分子生物学的手法を用いて設計及び作製された。構築物を表１に挙げる。アミノ酸ナンバリングは、ヒトＳＴ２Ｌ（ｈＳＴ２Ｌ）（配列番号１、ＮＰ＿０５７３１６）タンパク質及びマウスＳＴ２Ｌ（ｍＳＴ２Ｌ）（配列番号５、ＮＰ＿００１０２０７７３）タンパク質に対応する。
Figure 2015516817
ドメイン結合定量アッセイ。
ＳＴ２ＬドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩに結合する抗体は、電気化学発光検出形式を利用した標準的な捕集ＥＬＩＳＡ法（Ｍｅｓｏ−Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）法）を用いて求めた。各抗体１０μｇ／ｍＬでＭＳＤ ＨｉｇｈＢｉｎｄプレートの各ウェルを室温において２時間コーティングした（ウェル１個当たり５μＬ）。プレートは、５％ ＭＳＤブロック用緩衝液１５０μＬを用いて室温において２時間ブロッキングして、ＨＥＰＥＳ洗浄用緩衝液で３回洗浄した後、スルホタグで標識化したｈｕＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ若しくはマウスＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ（配列番号５のアミノ酸２８〜３２６）又はＨＨＭ−ＳＴ２Ｌ（配列番号６）又はＨＭＨ−ＳＴ２Ｌ（配列番号８）キメラ又はＨＨ−ＳＴ２Ｌ（配列番号１の残基１９〜２０５）２５μＬを５ｎＭ〜４０ｎＭまでの段階的な濃度でプレートに加えた。プレートにアルミ箔で蓋をして、穏やかに振盪させながら室温で１時間インキュベートした。次に、プレートをＨＥＰＥＳ洗浄用緩衝液で３回洗浄した。各ウェルにＭＳＤリードバッファー（１５０μｌ）を加えた後、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００を用いてプレートの読み取りを行った。
ヒトＳＴ２Ｌ−ＥＣＤのドメインＩは、ヒトＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ、ＨＨＭ−ＳＴ２Ｌ及びＨＭＨ−ＳＴ２Ｌには結合するがマウスＳＴ２Ｌ−ＥＣＤには結合しない抗体であると認めれる。ヒトＳＴ２Ｌ−ＥＣＤのドメインＩＩＩは、ヒトＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ及びＨＨＭ−ＳＴ２Ｌには結合するがマウスＳＴ２Ｌ−ＥＣＤには結合しない抗体であると認められる。ヒト及びマウスＳＴ２Ｌ−ＥＣＤのドメインＩＩＩは、ヒトＳＴ２Ｌ−ＥＣＤには結合するがＨＨ−ＳＴ２Ｌには結合しない抗体であると認められる。
抗ＳＴ２Ｌ ｍＡｂの親和性測定。
抗ＳＴ２Ｌ ｍＡｂ、ｈｕＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ及びｃｙｎｏＳＴ２Ｌ−ＥＣＤは標準的な方法を用いて発現させた。ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγフラグメント特異的Ａｂ（カタログ番号１０９−００５−０９８）はＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）から入手した。ＧＬＣセンサーチップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄカタログ番号１７６−５０１１）、ＣＭ−５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号ＢＲ１０００１４）及び捕捉表面調製用試薬は、Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）又はＢｉｏ−Ｒａｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）から入手した。
抗ＳＴ２Ｌ抗体とＨｉｓ6標識化ヒトＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ及びＨｉｓ6標識化ｃｙｎｏ ＳＴ２Ｌ−ＥＣＤとの相互作用については、ＰｒｏｔｅＯｎによりＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６を用いて２５℃で調べた。バイオセンサー表面は、アミンカップリング化学反応についての製造業者の説明書を用いてヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγフラグメント特異的抗体（Ａｂ）をＧＬＣセンサーチップの表面にカップリングさせることにより調製した。カップリング用緩衝液は、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ ４．５）であった。ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ（約４５００反応単位）を水平方向に固定した。抗ＳＴ２Ｌ抗体を精製してから又は未精製の上清として供給した。いずれにしても、これら抗体をＰＲＢ（ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）に、３ｍＭのＥＤＴＡ及び０．００５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を補充したもの）で約０．５μｇ／ｍＬの濃度まで希釈した。抗体を、抗ヒトＦｃγ抗体変性ＧＬＣチップ上に垂直方向に捕捉した（６０〜１３０ＲＵ）。抗ＳＴ２Ｌ ｍＡｂを捕捉した後、ｈｕＳＴ２Ｌ ＥＣＤを溶解状態で（０．０２４〜１５ｎＭ、５倍希釈）又はｃｙｎｏＳＴ２Ｌ ＥＣＤを溶解状態で（０．０２０〜５ｎＭ、４倍希釈）水平方向に注入した。すべての実験において会合を４分間モニタリングした（２００μＬを５０μＬ／分で注入）。解離を３０分間モニタリングした。センサー表面の再生は、１０ｍＭグリシン（ｐＨ １．５）の１５秒パルスを３回用いて行った。ＰｒｏｔｅＯｎソフトウェアを用い、物質移動を含む１：１結合モデルを用いてデータをフィッティングした。
Ｂｉａｃｏｒｅ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００又はＢｉａｃｏｒｅ ３０００光バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を用いて実施した。実験はいずれも、０．１％ＢＳＡを含む又は含まないＢＲＢ（ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）に、３ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．００５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を補充したもの）中で２５℃において行った。
Ｂｉａｃｏｒｅバイオセンサーの表面は、アミンカップリング化学反応についての製造業者の説明書を用いてヤギ抗ヒトｌｇＧ Ｆｃγフラグメント特異的Ａｂを、ＣＭ−５チップのカルボキシメチル化デキストラン表面にカップリングさせることにより調製した。カップリング用緩衝液は、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ ４．５）であった。平均６０００反応単位（ＲＵ）のＡｂを４つのフローセルそれぞれに固定した。抗ＳＴ２Ｌ ｍＡｂは、抗ヒトＦｃγ抗体変性センサーチップ表面で捕捉した（約３３ ＲＵ）。抗ＳＴ２Ｌ ｍＡｂを捕捉した後、ｈｕＳＴ２Ｌ ＥＣＤを溶解状態で（０．２〜１５ｎＭ、３倍希釈）又はｃｙｎｏＳＴ２Ｌ ＥＣＤを溶解状態で（０．２〜１５ｎＭ又は０．０２０〜５ｎＭ、３倍希釈）注入した。会合を４分〜８分間モニタリングした（Ｃ２５２１及びＣ２５１９の場合、２００μＬを５０μＬ／分又は２０μｌ／分で注入した）。解離を１０分間又は最長２．５時間モニタリングした。センサー表面の再生は、５０ｍＭのＮａＯＨを注入する及び／又は１００ｍＭのＨ3ＰＯ4を注入することによって行った。
Ｓｃｒｕｂｂｅｒソフトウェア、バージョン１．１ｇ（ＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてデータを処理した。データは、バッファー注入によって作成した曲線を検体注入に関する参照を差し引いた曲線から差し引き、ノイズ信号及び装置からのノイズへのバッファーの寄与を補正することで、二重の参照の差分除去を行った。（Ｍｙｓｚｋａ著、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎ、第１２巻、２７９〜２８４頁、１９９９年）。
データ処理後、反応速度及び親和性の測定で得たデータは、Ｓｃｒｕｂｂｅｒソフトウェア又はＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア、バージョン４．０．１（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＡＢ）を用いて解析した。物質移動項を含む単純な１：１結合モデルを用いて反応速度データを解析した。
抗マウスＳＴ２Ｌ ｍＡｂ（Ｃ１９９９／ＣＮＴＯ３９１４）のマウスＳＴ２Ｌ ＥＣＤに対する親和性の測定。
抗マウスＳＴ２Ｌ ｍＡｂ（Ｃ１９９９／ＣＮＴＯ３９１４）及びマウスＳＴ２Ｌ細胞外ドメイン（ｍｕＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ）は標準的な方法を用いて発現させて精製した。抗マウスＩｇＧ Ｆｃγフラグメント特異的Ａｂは、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）から入手した。捕捉表面を調製するためのセンサーチップ及び試薬はＢｉａｃｏｒｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から入手した。実験用Ｂｉａｃｏｒｅ泳動用バッファー（ＢＲＢ）は０．００５％ Ｔｗｅｅｎ−２０及び０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを有するＰＢＳ（ｐＨ ７．４）を含んでおり、データは２５℃で収集した。
抗ＳＴ２Ｌ抗体とｍｕＳＴ２Ｌ−ＥＣＤとの相互作用については、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００において２５℃で調べた。バイオセンサー表面は、アミンカップリング化学反応についての製造業者の説明書を用いて抗マウスＦｃ特異的抗体をＣＭ４センサーチップの表面にカップリングさせることにより調製した。Ｃ１９９９／ＣＮＴＯ３９１４及びｍｕＳＴ２Ｌ−ＥＣＤをＢＲＢで希釈した。Ｃ１９９９は、抗マウスＦｃγ抗体（約８５ＲＵ）を用いて捕捉した。捕捉後、溶液中ｍｕＳＴ２Ｌ ＥＣＤ（配列番号５の残基２８〜３２６）を溶解状態で注入した（１５ｎＭで開始した、濃度は３倍希釈で５種類）。会合を８分間モニタリングした。解離を最大６０００秒にわたってモニタリングした。再生は、１／１００希釈リン酸を用いて行った。１：１結合モデルを用いてデータをフィッティングした。
ヒト好塩基球細胞株アッセイ（好塩基球サイトカイン放出アッセイ）
ＫＵ８１２細胞（ヒト好塩基球細胞株、ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−２０９９）を滅菌済み９６ウェル丸底組織培養プレートに入れた、１０％ ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０成長培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）合計４０μｌ中に、ウェル１個当たり細胞２５，０００〜５０，０００個プレーティングした。抗ヒトＳＴ２Ｌ ｍＡｂ及び対照群を様々な濃度で加えて（ウェル１個当たり５０μｌ）、３７℃でインキュベートした。１時間インキュベートした後、組み換え型「成熟」ＩＬ−３３（配列番号３のアミノ酸１１１〜２７０）をＲＰＭＩ成長培地１０μｌ中、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで加えた。その後、細胞を３７℃で１８〜２４時間インキュベートすることで、ＩＬ−３３が媒介するＩＬ−５及びＩＬ−６の誘導を行わせた。インキュベート後、ＥＬＩＺＡ法（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）又はビーズを用いた多重分析法（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のいずれかを用いた後続のＩＬ−３３誘発ＩＬ−５及びＩＬ−６の検出のために、細胞を採取して、細胞上清を回収した。
ヒトマスト細胞サイトカイン放出アッセイ及びＰＧＤ2放出アッセイ
マスト細胞はＣＤ３４+ヒト臍帯血細胞（Ｌｏｎｚａ）由来のものであった。冷凍用バイアル瓶に入れた＞１．０×１０6のＣＤ３４+臍帯血細胞を素早く解凍して５０ｍｌコニカルチューブに移した。この細胞に、温めた又は室温のＳｔｅｍ−Ｐｒｏ３４培地＋補充物（合計２５ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をゆっくり滴下した。細胞を１，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離にかけ、培地（ＳｔｅｍＰｒｏ−３４ １０ｍｌに次の補充物を加えたもの：３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６及び１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ）に再懸濁した。細胞を６ウェルプレートのうち２ウェルにプレーティングして、１週間培養した。４日目に、細胞は、補充物を含むＳｔｅｍ Ｐｒｏ−３４培地で１：３倍で継代した。７日目に、非接着性細胞を取り出して、０．５×１０6／ｍｌで１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６及び１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦを含むＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地にプレーティングした。細胞を毎週継代して、マスト細胞が６〜１０週で成熟するまで（ＦｃｅＲ１、ｃＫｉｔ及びトリプターゼの発現により判定）細胞密度を０．５×１０6／ｍｌで保持した。
成熟マスト細胞をＳｔｅｍＰｒｏ−３４中、０．５×１０6個／ｍｌで培養して、ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で４日間毎日刺激した。アッセイを行う前に細胞を採取して、１，０００ＲＰＭで１０分間遠心分離にかけて、新たに調製したＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地、又は抗生物質を含まず１００ｎｇ／ｍｌのヒト組み換え型ＳＣＦを含む１０％ ＦＣＳ含有ＲＰＭＩに再懸濁した。細胞を、９６ウェル平底組織培養プレートにウェル１個当たり細胞数６５，０００〜７５，０００個／０．１６ｍｌの密度でプレーティングした。プレートに抗ＳＴ２Ｌ ｍＡｂを５０、１０、２、０．４、０．０８、０．０１６、０．００３２μｇ／ｍｌの最終濃度で３０分間加えてからＩＬ−３３を加えた。組み換え型ヒト「成熟」ＩＬ−３３（配列番号３の残基１１１〜２７０）もまた、１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦを含む培地中において１０倍（１０又は３０ｎｇ／ｍｌ）で調製した。最終濃度を１ｎｇ／ｍｌ（図６及び７Ａ〜７Ｅ）又は３ｎｇ／ｍｌ（図８Ａ〜８Ｅ）とするためにウェルに１０倍のＩＬ−３３を２０μｌ加えて、プレートを３７℃、５％ ＣＯ2において一晩インキュベートした。刺激後１８〜２４時間で培養上清を採取した。プレートを１，０００ＲＰＭで１０分間遠心分離にかけた。上清を取り出して、丸底９６ウェルプレートに入れて−２０℃で保存した後、評価した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製ヒトサイトカインキットを使用し、Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）法を用いてサイトカイン濃度を分析した。ＰＧＤ２濃度は、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ製プロスタグランジンＤ２−ＭＯＸ ＥＩＡキットを用い、製造者の取扱説明書に従って求めた。ＥＬＩＳＡ法の感度を高めるために、マスト細胞培養上清中のＰＧＤ2を、メトキシルサミン塩酸塩（ＭＯＸ−ＨＣｌ）によって非分解性ＭＯＸ−ＰＧＤ2（メトキシルサミン−ＰＧＤ2）へ転換した。
マウス受容体−リガンド結合阻害アッセイ（マウスＲＬＢアッセイ）
９６ウェル透明プレート（ＶＷＲ）に２μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）抗体５０μｌを、４℃において約１６時間コーティングした。残りの工程は室温で行った。ウェルをブロッキング用緩衝液と共にインキュベートし、洗浄して、ヒトＦｃに融合した２μｇ／ｍｌマウスＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ ５０μｌを１時間かけて添加した。プレートを洗浄して、抗ｍＳＴ２Ｌ抗体を含む又は含まない１μｇ／ｍｌのビオチン化ｍＩＬ−３３を添加した。プレートを洗浄して、ストレプトアビジンＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて検出を行い、ＴＭＢ基質（ＲＤＩ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を用い、製造者の取扱説明書に従って信号を現像した。
マウス及びヒトレポーター遺伝子法（ヒト又はマウスＲＧＡアッセイ）
ＨＥＫ２９３細胞を、白色透明底組織培養処理用９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ）にＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ中、ウェル１個当たり細胞５０，０００個でプレーティングし、加湿したインキュベータにおいて、３７℃、５％ ＣＯ2で２４時間インキュベートした。細胞は、ヒト又はマウスＳＴ２Ｌ−ＥＣＤのｃＤＮＡのいずれかをコードするベクター、ＮＦ−κＢ−ルシフェラーセベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）と共にＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００を用いて標準プロトコルを利用して同時形質移入した。３７℃、５％ ＣＯ2において２４時間インキュベートした後、形質移入したエル（ｅｌｌ）を、抗ＳＴ２Ｌ抗体を含む又は含まないマウス（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、配列番号５の残基１０９〜２６６）又はヒトＩＬ−３３（配列番号３の残基１１２〜２７０）で３７℃、５％ ＣＯ2において１６時間処理した。ルシフェラーゼ活性は、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製造者の取扱説明書に従って測定した。
マウスＴ細胞増殖アッセイ
マウスＴｈ２細胞（Ｄ１０．Ｇ４．１、ＡＴＣＣ）は、細胞増殖完全培地、すなわち１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１．０ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有するように調整しかつ０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．０５ｍＭのＩＬ−１α（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０％ウシ胎仔血清、ＣｏｎＡを有する１０％ラットＴ−ＳＴＩＭ因子（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製ラットＩＬ−２培養補充物）を補充した、２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ １６４０培地において培養した。この細胞を、アッセイ培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ＩＬ−１含まず、Ｔ−ＳＴＩＭ含まず）で２回洗浄し、１ｍｌ中細胞１．２５×１０5個で再懸濁して、白色透明底の組織培養処理用９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）に入れた培地８０μｌ中にプレーティングした。様々な量のマウスＩＬ−３３（配列番号５の残基１０９〜２６６）を最終アッセイ体積１００μｌとなるように細胞に加えた。抗体中和を試験する場合、抗体対照群（使用済みハイブリドーマ培地に添加されたもの）又はハイブリドーマ上清を細胞に添加して、１時間インキュベートした後、２０ｐｇ／ｍｌのｍＩＬ−３３を添加した。プレートを加湿したインキュベータ内で３７℃、５％ ＣＯ2において２４時間培養した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用い生細胞の定量を行った。プロトコルは製造者の取扱説明書に従って行った。
マウス骨髄由来マスト細胞アッセイ
マウス骨髄は、Ｂａｌｂ／ｃマウス（６週）の骨髄由来のものであった。細胞をＲＰＭＩ培地（エンドトキシン非含有）、１０％ ＦＢＳ、１０％ ＷＥＨＩ細胞株培養上清、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、０．１ｍＭ必須アミノ酸、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にウェル１個当たり細胞３００，０００個でプレーティングした。抗ＳＴ２Ｌ ｍＡｂ（１００、１０、１、０．１又は０．０１μｇ／ｍｌ）を細胞と共に１時間インキュベートしてから、「成熟」ＩＬ−３３（配列番号２１５の残基１０９〜２６６（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した。約２４時間後、上清を採取して、Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）製Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｏｕｓｅ ２２−ｐｌｅｘキットを用いて製造者の取扱説明書に従って分析するまで凍結させた。
Ｃｙｎｏ内皮細胞アッセイ
ＥＧＭ（登録商標）−２内皮細胞増殖培地−２（Ｌｏｎｚａ）中で培養したカニクイザル大動脈内皮細胞を、９６ウェル組織培養プレートに、ウェル１個当たり細胞１０，０００個又は２０，０００個でプレーティングした。この細胞に抗ＳＴ２Ｌ抗体５０μｌを１００μｇ／ｍｌで開始してその後、４倍又は５倍希釈して添加した後、３７℃で１時間インキュベートしてから、組み換え型ｃｙｎｏ「成熟」ＩＬ−３３（配列番号４）を添加した。続いてこの細胞に２０ｎｇ／ｍｌカニクイザルＩＬ−３３ ５０マイクロリットルを添加して、３７℃で２４時間インキュベートした。ＩＬ−３３誘発サイトカイン反応を評価するために、上清を採取して、Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）製非ヒトＰｒｉｍａｔｅ ＩＬ−８キットによって製造者の取扱説明書に従ってサイトカイン濃度を評価した。
マウス腹膜潅流アッセイ
６匹のＢａｌｂ／ｃマウスの腹膜をＰＢＳ合計３ｍｌで洗浄することで、腹膜細胞を回収した。この細胞の大部分は、Ｂ２２０及びＦ４／８０の発現（ＦＡＣＳ分析法）で決定すると、リンパ細胞及びマクロファージであることが分かった。約１％はｃＫｉｔ+（ＣＤ１１７+）マスト細胞であった。細胞を遠心分離にかけて、沈殿物を細胞１×１０6個／ｍｌで、Ａｌｐｈａ ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１０％ ＦＢＳ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを加えたものに再懸濁した。細胞を、９６ウェルプレートウェルに、ウェル１個当たり２００μｌでプレーティングして、３７℃で２時間休ませた。この細胞に抗ＳＴ２Ｌ ｍａｂを３０分添加した後、１０ｎｇ／ｍｌのマウス「成熟」ＩＬ−３３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、配列番号２１５の残基１０９〜２６６）を添加した。ＩＬ−３３を添加して２４時間後に上清を回収して、分析するまで−２０℃で保存し、Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）用Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｏｕｓｅ ２２−ｐｌｅｘキットを用いて製造者の取扱説明書に従って分析した。
実施例１．ラット抗マウスＳＴ２Ｌ抗体の作製
マウスＳＴ２−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（配列番号５のＳｅｒ２７〜Ｓｅｒ３４２）を腹腔内に用いてラットを免疫化して、特異的ＩｇＧ力価を評価した。十分な力価が得られた直後に、膵細胞を単離してＦＯ細胞と融合した。得られたハイブリドーマを９６ウェルプレート又はメチルセルロースにプレーティングして１０日間培養した。抗原特異的クローンを、ｍＳＴ２−Ｆｃとの結合について標準的な捕捉ＥＬＩＳＡ法で確認し、そしてＦｃタンパク質単独と比較してクロススクリーニングした。マウスＳＴ２特異的ハイブリドーマは、ＩＬ−３３のＳＴ２との結合阻害についてＥＬＩＳＡで更に試験し、また、ＩＬ−３３誘発Ｄ１０．Ｇ４．１マウスＴｈ２細胞増殖阻害についても試験した。受容体−リガンド結合アッセイと細胞系増殖アッセイの両者における中和を示すハイブリドーマを、限界希釈法によってクローン的に選択した。ハイブリドーマのＶ領域の配列を決定して、マウスＩｇＧ１バックグラウンドにクローン化した。ＳＴ２Ｌ−ＥＣＤドメイン特異性については、様々なヒト−マウスドメイン交換構築物を用いて、電気化学発光検出による標準的な免疫吸着法で対応した。
ハイブリドーマＣ１９９９が分泌した抗体は、マウスＩｇＧ１バックグラウンドにクローン化されて、ＣＮＴＯ３９１４と命名された。ＣＮＴＯ３９１４可変領域及びＣＤＲの配列を表２に示す。ＣＮＴＯ３９１４は、ヒトＳＴ２Ｌと交差反応せず、また、マウスＳＴ２Ｌ−ＥＣＤのドメインＩに結合する。
Figure 2015516817
実施例２．マウス抗ヒトＳＴ２Ｌ抗体の作製
マウス抗ヒトＳＴ２ ｍＡｂを作製するために２つの異なる免疫化を行った。
ＢＡＬＢ／ｃを可溶性ＳＴ２−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、配列番号１５７）で腹腔内で免疫化して特異的ＩｇＧ力価を評価した。十分な力価を得た後、膵細胞を単離してＦＯ細胞と融合した。得られたハイブリドーマを９６ウェルプレートにプレーティングして１０日間培養した。抗原特異性クローンの、Ｃ末端Ｈｉｓ6標識化ｈｕＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ及びＨｉｓ6標識化ｃｙｎｏ ＳＴ２Ｌ−ＥＣＤへの結合について標準的な捕捉ＥＬＩＳＡ法で確認した。ｃｙｎｏ ＳＴ２Ｌと交差反応するヒトＳＴ２Ｌ特異的ハイブリドーマは更に、ＩＬ−３３のｈｕＳＴ２Ｌへの結合阻害についてＥＬＩＳＡ法で、そしてＮＦ−κＢ活性化についてレポーター遺伝子法で試験した。更なる調査のために、レポーター遺伝子法で又はＥＬＩＳＡ法とレポーター遺伝子法の両方で阻害を示すクローンを選択した。
更なる分析のために、ハイブリドーマＣ２４９４、Ｃ２５１９Ａ及びＣ２５２１Ａから得た抗体を選択した。Ｃ２５１９Ａ及びＣ２５２１ＡはヒトＳＴ２ＬとドメインＩＩＩで結合するが、Ｃ２４９４はヒトＳＴ２ＬとドメインＩで結合する。抗体Ｃ２４９４をヒトＩｇＧ２バックグラウンドへクローン化して、その全長抗体をＳＴＬＭ６２と命名した。
抗ヒトＳＴ２Ｌ ｍＡｂは、全長ＳＴ２Ｌ構築物を用い、しかもヒトＳＴ２Ｌ−ＥＣＤを発現するように形質移入された細胞でブーストして、Ｇｅｎｏｖａｃ Ｇｍｂｈにおいて社有のＤＮＡ免疫法で作製された。ハイブリドーマのヒトＳＴ２Ｌ−ＥＣＤへの結合については、フローサイトメトリーによってスクリーニングした。このアッセイで結合を示したクローンは、ｈＳＴ２Ｌ−ＥＣＤと結合することが確認され、そして更に、標準的な捕捉ＥＬＩＳＡ法によりｃｙｎｏ ＳＴ２Ｌ−ＥＣＤとの結合についても特性評価を行った。選ばれたクローンは、受容体−リガンド結合阻害ＥＬＩＳＡ法及びレポーター遺伝子法で特性評価を行った。更なる調査のために、レポーター遺伝子法又はＥＬＩＳＡ法とレポーター遺伝子法の両方で阻害を示すクローンを選択した。
更なる分析のために、ＧｅｎｏｖａｃハイブリドーマＣ２２４４から得た抗体を選択して、ヒトＩｇＧ２バックグラウンドへクローン化した。全長抗体をＳＴＬＭ１５と命名した。ＳＴＬＭ１５はヒトＳＴ２ＬとドメインＩで結合する。
マウス抗ヒト抗体のＶＨ配列及びＶＬ配列並びにＣＤＲドメイン配列を表３に示す。
Figure 2015516817
実施例３．完全ヒトＳＴ２Ｌ抗体の作製
ヒトＳＴ２Ｌに結合するＦａｂを、Ｓｈｉら著、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、第３９７巻、３８５〜３９６頁、２０１０年、国際特許出願公開第ＷＯ２００９／０８５４６２ｈ号、米国特許出願公開第２０１０／００２１４７７号の記載と同様にして、デノボｐＩＸファージディスプレイライブラリから選択した。簡潔に言えば、ライブラリは、ヒトスキャフォールドを多様化することによって作製されたものであり、生殖細胞系列ＶＨ遺伝子であるＩＧＨＶ１−６９*０１、ＩＧＨＶ３−２３*０１及びＩＧＨＶ５−５１*０１をＨ３ループを介してヒトＩＧＨＪ−４ミニ遺伝子で組み替え、そしてヒト生殖細胞系列ＶＬκ遺伝子であるＯ１２（ＩＧＫＶ１−３９*０１）、Ｌ６（ＩＧＫＶ３−１１*０１）、Ａ２７（ＩＧＫＶ３−２０*０１）及びＢ３（ＩＧＫＶ４−１*０１）をＩＧＫＪ−１ミニ遺伝子で組み替えることで、完全なＶＨ及びＶＬドメインが構築された。多様化に際し、重鎖及び軽鎖可変領域内の、タンパク質抗原及びペプチド抗原と高頻度に接していると確認された位置に相当するＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３ループ周辺の位置を選択した。選択した位置での配列多様性は、それぞれのＩＧＨＶ又はＩＧＬＶ遺伝子に含まれるＩＧＨＶ又はＩＧＬＶ生殖細胞系列遺伝子ファミリーそれぞれの位置で見られる残基に制限した。長さがアミノ酸７〜１４個分の単鎖〜中鎖型の合成ループを用いることで、Ｈ３ループにおいて多様性が発生した。Ｈ３でのアミノ酸分布は、ヒト抗体において観察されるアミノ酸の変動を模倣するよう設計された。ライブラリ設計の詳細は、Ｓｈｉら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第３９７巻、３８５〜３９６頁、２０１０年に記載されている。ライブラリを作製するために利用したスキャフォールドは、これらのヒトＶＨ及びＶＬ生殖細胞系列遺伝子起源に準じて命名した。スクリーニングにあたって、３つの重鎖ライブラリを、４個の生殖細胞系列軽鎖又は生殖細胞系列軽鎖ライブラリと組み合わせることで２４個の固有ＶＨ：ＶＬの組み合わせを作製した。ｈｕＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ−Ｆｃに対するファージパニンク実験では、２４個のＶＨ：ＶＬライブラリの組み合わせを利用した。
ライブラリは、ｈｕＳＴ２Ｌ−ＥＣＤのＦｃ融合物（配列番号１の残基１９〜３２８）を用いてパニングした。パニングは、溶液状態の抗原（Ａｇ）及び表示されたＡｇという、２つの異なるフォーマットで行った。溶液状態のＡｇの場合、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズを、３％脱脂粉乳を含むＰＢＳ中でブロッキングした。１０倍高濃度のヒトＦｃタンパク質を競合相手として含むビオチン化（Ｂｔ）抗原ｈｕＳＴ２Ｌ−ＥＣＤヒトＦｃ融合物（Ｂｔ−ｈｕＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ−Ｆｃ）を、Ｆａｂ−ｐＩＸファージライブラリと混合した。Ｂｔ−ｈｕＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ−Ｆｃに結合したＦａｂ−ｐＩＸファージを、ブロッキングされたストレプトアビジン（ＳＡ）被覆磁気ビーズ上に捕捉した。選抜を３ラウンド行い、そのうち、１〜３ラウンドにおけるｈｕＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ−Ｆｃ濃度はそれぞれ１００ｎＭ、１０ｎＭ、１０ｎＭであった。Ａｇディスプレイでは、Ｂｔ−ｈｕＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ−ＦｃをＳＡ被覆磁気ビーズにコーティングした。Ｆａｂ−ｐＩＸファージライブラリと１０倍過剰のヒトＦｃタンパク質との混合物を、Ｂｔ−ｈｕＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ−ＦｃディスプレイＳＡ磁気ビーズと同時に添加した。１〜３ラウンドで使用したＢｔ−Ａｇ濃度はそれぞれ１００ｎＭ、１０ｎＭ、１０ｎＭであった。ｈｕＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ−Ｆｃタンパク質に結合するＦａｂのために、ＥＬＩＳＡ法によって両方のパニングフォーマットでスクリーニングを行った。この選抜からはｈＳＴ２Ｌ−Ｆｃと結合した合計７９個のＦａｂが単離された。全体で最も高い結合活性を有するＦａｂ ＨｕＴ２ＳＵ−３９が、ＥＬＩＳＡの順位によって判明した。
ＥＬＩＳＡ法を基にしたＩＬ−３３結合阻害アッセイを７９個のＦａｂで行った。合計３２個のＦａｂが、ＩＬ−３３のｈｕＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ−Ｆｃへの結合阻害を示した。４６個のＦａｂを、ｐＩＸデノボ活動から親和性成熟のために選択した。
実施例４．完全ヒトＳＴ２Ｌ抗体の親和性成熟
選抜した抗体を、Ｓｈｉら著、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、第３９７巻、３８５〜３９６頁、２０１０年及び国際特許出願公開第ＷＯ０９／０８５４６２Ａ１号に記載の「インライン」成熟化方法を用いて親和性成熟させた。この技法では、第一選抜において生成されたＦａｂクローンのＶＨ領域を、対応するＶＬスキャフォールドのライブラリと組み合わせる。実施例３で確認した４６個のＦａｂから得られたＶＨ遺伝子を全て、その元のＶＬ遺伝子ファミリーに従ってプールとして適切なＶＬ成熟ライブラリへとクローン化した。使用したＶＬスキャフォールドライブラリ及びその多様化スキームを表４に示す。ヒトＶＬスキャフォールドは、次に示すもの、すなわちＩＧＫＶ１−３９*０１（Ｏ１２）、ＩＧＫＶ３−１１（Ｌ６）、ＩＧＫＶ３−２０（Ａ２７）及びＩＧＫＶ４−１*０１（Ｂ３）であって、例えば米国特許出願公開第２０１２／０１０８７９５号に記載されているものである。親和性成熟パニンクでは、ファージライブラリを先ずＢｔ−ｈｕＳＴ２−ＥＣＤ−Ｆｃに添加した。インキュベート後、成熟ライブラリファージ／Ｂｔ−ｈＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ−Ｆｃ複合体をＳＡ被覆磁気ビーズに添加した。Ｂｔ−ｈｕＳＴ２−Ｆｃ濃度は、ラウンド１〜３ではそれぞれ１０ｎＭ、１ｎＭ及び０．１ｎＭであった。ラウンド３での最終洗浄は、親和性改善を更に促進させるために、１０ｎＭの非標識化ｈｕＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ−Ｆｃ存在下において室温で一晩行った。
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成熟パニングからは、合計１６１個の配列固有のＦａｂが得られた。ｈｕＳＴ２Ｌ−ＥＣＤと最高の結合を示すＦａｂを、更なる特性評価のためにＩｇＧへと転換した。
更なる特性評価のために、ＭＡｂであるＳＴ２Ｍ４８、ＳＴ２Ｍ４９、ＳＴ２Ｍ５０及びＳＴ２Ｍ５１を選択した。それらのＶＨ配列及びＶＬ配列並びにＣＤＲ配列を表５に示す。ＭａｂであるＳＴ２Ｍ４８、ＳＴ２Ｍ４９、ＳＴ２Ｍ５０及びＳＴ２Ｍ５１はヒトＳＴ２ＬとドメインＩＩＩで結合し、また、マウスＳＴ２Ｌと交差反応する。
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実施例５．抗ＳＴ２Ｌ抗体の特性評価。
上述のように様々な活動から生じた抗体は更に、そのＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ阻止能について、ＮＦ−κＢレポーター遺伝子法で測定されるそのＩＬ−３３誘発シグナル伝達の阻害について、抗体のマスト細胞応答阻害能について、ヒト及びｃｙｎｏ ＳＴ２Ｌに対するその親和性について、並びにマウスＳＴ２Ｌとの交差反応性についても特性評価を行った。エピトープマッピングは、材料及び方法にも記載したヒト／マウスＳＴ２Ｌドメイン交換キメラ構築物を用いて行った。実験結果を表６、７及び８に示す。表７及び８において、「＋」は、抗体がＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ相互作用を阻止することを表し、そして「−」は、抗体がＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ相互作用を阻止しないことを表す。ＣＮＴＯ３９１４を含む実験は、ヒトと交差反応性しないので、マウス細胞及び試薬を用いて行った。他の抗体ではいずれも、ヒト細胞及びヒト試薬をアッセイで使用した。
特性評価した抗体は、ＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ相互作用を阻止する群（ｍＡｂであるＳＴＬＭ１５、ＳＴＬＭ６２及びＣＮＴＯ３９１４）と、ＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ相互作用を阻止しない群（ｍＡｂであるＣ２５１９、Ｃ２５２１、ＳＴ２Ｍ４８、ＳＴ２Ｍ４９、ＳＴ２Ｍ５０及びＳＴ２Ｍ５１）とに分類された。ＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ相互作用を阻止する抗体は、ＳＴ２ＬドメインＩに結合するが、阻止しない抗体はＳＴ２ＬドメインＩＩＩに結合する。試験した抗体は、ＮＦ−κＢレポーター遺伝子法で評価されるＳＴ２Ｌ下流シグナル伝達と、ＫＵ８１２ヒト好塩基球細胞株による、又はＣＮＴＯ３９１４の場合はマウスＴｈ２細胞増殖で評価される、ＩＬ−３３誘発サイトカイン放出と、を阻害した。ＳＴ２ＬドメインＩに結合する抗体は、サイトカイン及びケモカインの分泌で評価されるヒトマスト細胞応答を、ＳＴ２ＬドメインＩＩＩに結合する抗ＳＴ２Ｌ抗体と比べると更に高い水準で阻害した。マウスＳＴ２ＬドメインＩに結合するがヒトと交差反応しないＣＮＴＯ３９１４は、ＩＬ−３３誘発マウスマスト細胞応答をも阻害することができた。
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実施例７．ＳＴ２ＬドメインＩ結合抗体ＣＮＴＯ３９１４の、鼻腔内ＩＬ−３３誘発気道過敏症（ＡＨＲ）、気道の炎症及びマスト細胞応答阻害。
４日間毎日連続して用量２μｇ／マウスの「成熟」ＩＬ−３３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（配列番号２１５の残基１０９〜２６６）をメスＢＡＬＢ／ｃマウスに鼻腔内投与した。抗マウスＳＴ２Ｌ抗体ＣＮＴＯ３９１４を２０ｍｇ／ｋｇ（又は２ｍｇ／ｋｇ又は０．２ｍｇ／ｋｇ）で、最初のＩＬ−３３鼻腔内投与の２４時間前に予防として皮下投与した。対照群マウスには、アイソタイプ対照ＣＮＴＯ５５１６又はＰＢＳを、最初のＩＬ−３３鼻腔内投与の２４時間前に投与した。メタコリンを段階的に投与する気道過敏症（ＡＨＲ）については、Ｆｌｅｘｉｖｅｎｔシステム（Ｓｃｉｒｅｑ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、カナダ）を用いた強制法を利用して測定した。気道過敏症（ＡＨＲ）の測定では、マウスを１００ｍｇ／ｋｇのペントバルビタール及び１３ｍｇ／ｋｇのフェニトインで麻酔して、気管切開してからＦｌｅｘｉＶｅｎｔにつないだ。ベースラインを判読するためにマウスに生理食塩水を噴霧した後、２種の用量（１０及び２０ｍｇ／ｍＬ）のメタコリンを噴霧した。生理食塩水及び各用量のメタコリンについて、抵抗（Ｒ）値を、「Ｓｎａｐｓｈｏｔ」パータベーションを利用して約２分間集めた。ピーク抵抗値は、０．９超のＣＯＤ（決定定数）を有する値のみを用いて算出した。
別の群のマウスは、肺の細胞性応答に関して処置して解析した。最後のｍＩＬ−３３アイソタイプ又はＰＢＳ投与から２４時間後に、マウスを、Ｓｌｅｅｐａｗａｙ（登録商標）Ｉ．Ｐ．の過剰投与によって屠殺した。マウスの肺を、０．１％ ＢＳＡを含む冷ＰＢＳ ０．７ｍｌで洗浄した。得られた気管支肺胞（ＢＡＬ）体液を１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけて、無細胞上清を、サイトカイン／ケモカインを分析するまで−８０℃で保存した。ＢＡＬ試料は、血球計を用いた総カウントのために用いた。様々なＢＡＬでは、光学顕微鏡下でライトギムザ染色を行った後、サイトスピンのスメアによって約２００個の細胞をカウントした。
無細胞上清を回収して、Ｌｕｍｉｎｅｘタンパク質分析に用いるまで−８０℃で保存した。肺組織を取り出した後、好適なかん流が生じるまで、冷却した滅菌ＰＢＳ ５ｍｌを用いて右心室からかん流させた。次いで、肺葉を、ＰＢＳ １ｍｌとプロテアーゼ阻害剤が入ったＦａｓｔ Ｐｒｅｐ（登録商標）チューブに入れて、サイトカイン／ケモカインプロファイリングのために−８０℃で冷凍保存した。Ｍｕｒｉｎｅ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ２２−ｐｌｅｘに関する製造者のプロトコルに従ってサイトカイン／ケモカイン多重アッセイを行った。ＢＡＬ体液中のマウスマスト細胞プロテアーゼ−１（ｍＭＣＰ−１）をＥＬＩＳＡ法（Ｍｏｒｅｄｕｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で解析した。
気道過敏症
ＩＬ−３３を鼻腔内投与することで誘発された肺の炎症モデルでは、ＣＮＴＯ３９１４が気道過敏症をかなり阻害した（図１）。２μｇ／マウスのＭＩＬ−３３を４日間連続して鼻腔投与する２４時間前に、ＣＮＴＯ３９１４を皮下投与した。Ｆｌｅｘｉｖｅｎｔで測定されるピーク気道抵抗は、ＣＮＴＯ３９１４を２０ｍｇ／ｋｇ投与するとかなり低下した。エラーバーはそれぞれ、一群当たり３匹（ＣＮＴＯ５５１６、アイソタイプ対照抗体）〜６匹のマウスの平均値の標準誤差を表している。２回の別個の調査でこの結果が繰り返された。ボンフェローニ法（Bonferroni post test）による二元配置分散分析法（Two-Way ANOVA）を用いて有意性、ＣＮＴＯ５５１６／ＩＬ−３３に対するＣＮＴＯ３９１４／ＩＬ−３３**ｐ＜０．０５、及びＩＬ−３３治療群によるＰＢＳに対する***ｐ＜０．００１を求めた。
気道の炎症
使用したモデルにおいて、ＣＮＴＯ３９１４は気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）細胞動員を大幅に阻害した（図２）。２ｍｇ／マウスのｍＩＬ−３３を連続して４日間鼻腔内投与する２４時間前に、ＣＮＴＯ３９１４を皮下投与した。ＢＡＬ白血球は、ＩＬ−３３の投与によりかなり増加したが、２０ｍｇ／ｋｇのＣＮＴＯ３９１４でかなり阻害した。エラーバーはそれぞれ、一群当たり３匹（ＣＮＴＯ５５１６、アイソタイプ対照抗体）〜６匹のマウスの平均値の標準誤差を表している。２回の別個の調査でこの結果が繰り返された。ボンフェローニ法（Bonferroni post test）による二元配置分散分析法（Two-Way ANOVA）を用いて有意性を求めた。すなわち、***ｐ＜０．００１。
インビボにおけるマスト細胞応答
マスト細胞は、トリプターゼ及びキマーゼを包含するプロテアーゼをその顆粒内に貯蔵しており、それらはマスト細胞が活性化すると迅速に放出される。マウスマスト細胞プロテアーゼ１（ｍＭＣＰ−１）は、活性化したマスト細胞により放出されるβキマーゼであって、寄生虫感染を制御するのに重要であることで知られている（Ｋｎｉｇｈｔら著、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、第１９２巻、１８４９〜５６頁、２０００年、Ｈｕｎｔｌｅｙら著、Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ、第１２巻、８５〜９５頁、１９９０年）。ｍＭＣＰ−１の測定値は、マスト細胞のマーカーとして用いることもでき、気道の炎症のマスト細胞依存モデル、ハウスダストのダニに誘発されることが分かった（Ｙｕ及びＣｈｅｎ著、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、第１７１巻、３８０８〜３８１５頁、２００３年）。ＥＬＩＳＡ法（Ｍｏｒｅｄｕｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で求められたＭＭＣＰ−１は、ＩＬ−３３投与マウスから得たＢＡＬ体液内では大幅に増加して、ＣＮＴＯ３９１４により用量に応じて阻害された（図３）。チューキー法（Tukey post test）による一元配置分散分析法（One-Way ANOVA）を用いて有意性、ＩＬ−３３処置に対して**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１を求めた。
実施例８．抗ＳＴ２ＬドメインＩ結合抗体の、インビトロでのマスト細胞応答阻害。
マスト細胞応答は、マウス及びヒトマスト細胞によるケモカイン及びサイトカインの放出、並びにヒトマスト細胞内でのプロスタグランジンＤ2の放出によって評価した。
抗ＳＴ２ＬドメインＩ結合抗体ＣＮＴＯ３９１４は、マウス骨髄由来マスト細胞によるＩＬ−３３誘発サイトカインの放出、例えばＧＭ−ＣＳＦ（図４Ａ）、ＩＬ−５（図４Ｂ）、及びＴＮＦα（図４Ｃ）の放出を阻害した。
抗ヒトＳＴ２ＬドメインＩ結合ｍａｂのＣ２４９４（ＳＴＬＭ６２）は、抗体濃度２、１０及び５０μｇ／ｍｌにおいて、３ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３３で誘発されたヒト臍帯血由来マスト細胞によるＩＬ−３３誘発ＰＧＤ2の放出を阻害した（図５）。
抗ＳＴ２ＬドメインＩ結合抗体Ｃ２４９４及びＣ２２４４は、抗体濃度５０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ及び２μｇ／ｍｌにおいて、ヒト臍帯血由来マスト細胞によるＩＬ−３３誘発ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０の放出を阻害した（図６及び８Ａ〜８Ｅ）。阻害の程度は、測定されたサイトカイン／ケモカイン、試験した抗体及び抗体濃度、並びに使用した培地に左右された。平均阻害率（%）計算値は、抗体濃度２μｇ／ｍｌで行ったアッセイではいずれも５０．６〜１００％であり、また、抗体濃度５０μｇ／ｍｌで行ったアッセイでは６２〜１００％であった（図９）。
抗ＳＴ２ＬドメインＩＩＩ結合抗体Ｃ２５２１、Ｃ２５１９、ＳＴ２Ｍ４８、ＳＴ２Ｍ４９、ＳＴ２Ｍ５０及びＳＴ２Ｍ５１は、抗体濃度５０μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌでは、マスト細胞によるＩＬ−３３誘発サイトカインの放出を大きく阻害しないか又は全く阻害しない、すなわち刺激したことが分かった（図７Ａ〜７Ｅ及び図８Ａ〜８Ｅ）。阻害の程度は、測定されたサイトカイン／ケモカイン、試験した抗体、及び使用した培地に左右された。平均阻害率（%）計算値は、抗体濃度２μｇ／ｍｌで行ったアッセイではいずれも−５９４．４〜３１．９％であり、また、抗体濃度５０μｇ／ｍｌで行ったアッセイでは−４８１．５〜３６％であった（図９）。一部のアッセイでは、抗体ＳＴ２Ｍ５０は、抗体濃度１０μｇ／ｍｌにおいてＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−５、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３の分泌も抑制した（図８Ａ〜８Ｅ）。
平均阻害率（%）は、次の式を用いて算出した：（１−（ｍＡｂ存在下で放出されたサイトカインの濃度）／（ｍＡｂ不存在下でＩＬ−３３に応じて放出された同様のサイトカインの濃度））×１００。サイトカイン濃度はｐｇ／ｍｌで表す。一部の例では、阻害率（%）は負の値であるが、これは、ｍＡｂ存在下でのサイトカインの放出が、ｍＡｂの非存在下で放出されるよりも実際には大量であったことを示す。マスト細胞内でサイトカインの放出を誘発するのに用いられるＩＬ−３３の濃度に応じて、ｍＡｂの効力にほんのわずかな変化が生じ得る。同様に、使用されるアッセイ培地に応じて、ｍＡｂの活性にも経度の変化が生じ得る（ＳｔｅｍＰｒｏ−３４対ＲＰＭＩ／１０％ ＦＣＳ）。濃度２μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌにおける平均阻害率（%）で測定すると、試験したＳＴ２ＬドメインＩ結合抗体はいずれも、全てのサイトカイン及びケモカインの放出を少なくとも５０％阻害した。
実施例９．ＳＴ２ＬドメインＩ結合抗体の、鼻腔内ＩＬ−３３誘発気道リモデリング阻害。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１μｇ／マウスの「成熟」ＩＬ−３３（又はＰＢＳ）（配列番号２１５の残基１０９〜２６６）を１日目、３日目、５日目、７日目及び９日目に鼻腔内投与して、１０日目又は２０日目に肺を分析した。抗マウスＳＴ２Ｌ抗体ＣＮＴＯ３９１４又はアイソタイプ対照（ＣＮＴＯ５５１６）を、最初のＩＬ−３３鼻腔内投与の６時間前に２ｍｇ／ｋｇで皮下投与した。対照群のマウスには、最初のＩＬ−３３鼻腔内投与の６時間前にアイソタイプ対照ＣＮＴＯ５５１６又はＰＢＳを与えた。膨張させた肺を組織学的検査のために１０％ホルマリン緩衝液で固定した。分析に用いた染色法としては、Ｈ＆Ｅ、マソントリクローム染色及びＰＡＳ染色が挙げられた。
ＩＬ−３３処置は、杯細胞の肥厚化を伴う細気管支上皮の肥大及び肥厚化並びに主に好酸球と混成された細気管支周囲の浸潤物を中度にないし顕著に誘発した。細気管支上皮の肥大及び肥厚化はＣＮＴＯ３９１４を与えた動物では認められなかった。マッソントリクローム染色法は、コラーゲンの含有量を求めるためのものであったが、この染色法により、ＩＬ−３３処置された動物において杯細胞の肥大が明らかとなった。ＣＮＴＯ３９１４で処置された動物では、肺胞及び気管支周囲の領域に浸潤物が認められなかった。
実施例１０．完全ヒトＳＴ２Ｌ抗体の作製
更なるヒトＳＴ２Ｌ結合Ｆａｂは、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ上に捕捉されたビオチン化抗原と共にキメラＨＨＭ−ＳＴ２Ｌ構築物（配列番号６、表１）を用いてライブラリをパニングしたこと以外は、実施例３の記載と本質的に同様にしてデノボｐＩＸファージディスプレイライブラリから選抜した。ファージライブラリを、３％脱脂粉乳を含むＰＢＳ−Ｔ内でブロッキングした。競合タンパク質であるＭＨＭ−ＳＴ２Ｌのキメラ型（配列番号７、表１）をブロッキング溶液に添加することで、ヒトＳＴ２ＬドメインＩアミノ酸配列に特異的結合するＦａｂを目指したファージの選抜を行った。ファージ選択を３ラウンド行った後、ＦａｂのｈＳＴ２Ｌ−Ｆｃタンパク質への結合についてＥＬＩＳＡ法でスクリーニングした。
こうして選抜したものからｈＳＴ２Ｌ−Ｆｃに結合する１９種のＦａｂを単離して、キメラＳＴ２Ｌ構築物（表１）との結合についてだけでなく、マウスＳＴ２Ｌタンパク質及びヒトＳＴ２Ｌタンパク質との結合についても更にスクリーニングすることで、特異的なドメインをマッピングし、そしてそれらのＩＬ−３３／ｈＳＴ２Ｌ相互作用阻止能についての特性評価を行った。ＦａｂであるＳＴ２Ｆ１、ＳＴ２Ｆ４及びＳＴ２Ｆ６は、ｈＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ相互作用を阻止してＳＴ２ＬのドメインＩに結合し、そして親和性成熟を生じさせた。
Figure 2015516817
実施例１１．ヒトＳＴ２Ｌ結合Ｆａｂの親和性成熟
Ｓｈｉら著、ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、第３９７巻、３８５〜３９６頁、２０１０年及び国際特許出願公開第ＷＯ２００９／０８５４６２号並びに実施例４に記載の「インライン」成熟化法を用いて、ＳＴ２Ｆ１、ＳＴ２Ｆ４及びＳＴ２Ｆ６を親和性成熟した。ＳＴ２Ｆ１、ＳＴ２Ｆ４及びＳＴ２Ｆ６における親和性成熟は、対応する軽鎖ライブラリＢ３、Ｌ６及びＬ６それぞれを多様化してライブラリをＦａｂのＶＨ領域と組み合わせることによって行った。Ｌ６及びＢ３の親和性成熟ライブラリーにおける軽鎖残基の多様化スキームを表１０に示す。位置ナンバリングはＫａｂａｔに準ずる。親和性成熟パニングでは、ビオチン化ｈｕＳＴ２−ＥＣＤ−Ｆｃを、ラウンド１では１０ｎＭ、ラウンド２では１ｎＭ及びラウンド３では０．１ｎＭの濃度においてストレプトアビジン（ＳＡ）被覆磁気ビーズ上で捕捉した。ラウンド３での最終洗浄は、非標識化ｈｕＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ−Ｆｃ１０ｎＭの存在下、室温において一晩行った。
Figure 2015516817
ＳＴ２Ｆ６軽鎖成熟ライブラリの選抜により、改善された結合剤が得られた（ＳＴ２Ｆ１４、ＳＴ２Ｆ１７、ＳＴ２Ｆ３１及びＳＴ２Ｆ４１）（図１０及び図１１）。これらは、ＰｒｏｔｅＯｎを用いてＦａｂとして検査して、２ｎＭから４００ｐＭまでの親和性の適度な改善が証明された。
ＳＴ２Ｆ１４、ＳＴ２Ｆ１７、ＳＴ２Ｆ３１及びＳＴ２Ｆ４１の親和性を更に改善するために、ＳＴ２Ｆ１４、ＳＴ２Ｆ１７、ＳＴ２Ｆ３１及びＳＴ２Ｆ４１中の共通の重鎖ＳＴ２Ｈ４１を、表１１に示す多様化スキームを用いてＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２のＫａｂａｔ位置３１、３２、３３、３５、５０、５２、５３、５６及び５８においてランダム化した。得られた重鎖ライブラリを、親和性が改善された４つの軽鎖ＳＴ２Ｌ３２、ＳＴ２Ｌ３５、ＳＴ２Ｌ４９及びＳＴ２Ｌ５９と組み合わせて、このライブラリを軽鎖成熟ライブラリについての記載と同様にしてパニング及びスクリーニングを行った。ＳＴ２Ｆ１４との結合が改善されたＦａｂを単離して、更なる特性評価のためにＩｇＧへと転換した。生成された抗体（ＳＴＬＭ１０３、ＳＴＬＭ１０７、ＳＴＬＭ１０８、ＳＴＬＭ１２３、ＳＴＬＭ１２４、ＳＴＬＭ２０６、ＳＴＬＭ２０７、ＳＴＬＭ２０８、ＳＴＬＭ２０９、ＳＴＬＭ２１０、ＳＴＬＭ２１１、ＳＴＬＭ２１２、ＳＴＬＭ２１３、ＳＴＬＭ２１４、ＳＴＬＭ２１５、ＳＴＬＭ２１６、ＳＴＬＭ２１７、ＳＴＬＭ２１８、ＳＴＬＭ２１９、ＳＴＬＭ２２０、ＳＴＬＭ２２１、ＳＴＬＭ２２２）（図１０及び図１１）はＶＨ３−２３又はＶκ−Ｌ６由来のフレームワークを有する。抗体は全てＳＴ２ＬドメインＩに結合して、ＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ相互作用を阻止する。
Figure 2015516817
ＨＣＤＲ３の開始部分でＤＰモチーフを置換するために別の変異体を設計してＳＴＬＭ２０８ ＶＨ ＳＴ２Ｌ２５７として発現させた。変異体の配列を図１２に示す。
実施例１１．Ｃ２４９４のヒトフレームワークへの適合化（ＨＦＡ）
フレームワークへの適合化法は、米国特許出願公開第２００９／０１１８１２７号及びＦｒａｎｓｓｏｎら著、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、第３９８巻、２１４〜２３１頁、２０１０年の記載と本質的に同様にして行った。簡潔に言えば、重鎖配列及び軽鎖配列を、ＩＭＧＴデータベースにおけるＢＬＡＳＴサーチ（Ｋａａｓら著、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、第３２巻、Ｄ２０８−Ｄ２１０頁、２００４年、及びＬｅｆｒａｎｃら著、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、第３３巻、Ｄ５９３〜Ｄ５９７頁、２００５年）を用いてヒト生殖細胞系列配列（２００７年１０月１日現在では「０１」アレルのみ）と比較した。この一連のヒト生殖細胞系列遺伝子から、重複する遺伝子（アミノ酸レベルで１００％同一）と、対になっていないシステイン残基を含むものと、を除去した。フレームワーク及びＣＤＲ領域の両者において残りの最もマッチングしたヒト生殖細胞系列遺伝子を受容体ヒトフレームワークとして選択した。合計で９個のヒトＶＬ生殖細胞系列フレームワーク及び７個のヒトＶＨ生殖細胞系列フレームワークを、全体の配列相同性及びＣＤＲ長並びにＣＤＲ類似性に基づいて選択した。ＦＲ−４は、ＩＧＨＪ／ＩＧＪＫ生殖細胞系列遺伝子のＣ２４９４配列との配列類似性、ＶＬ鎖の場合はＪＫ２そしてＶＨ鎖の場合はＪＨ１に基づいて選択した（Ｋａａｓら著、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．第３２巻、Ｄ２０８〜Ｄ２１０頁、２００４年及びＬｅｆｒａｎｃ Ｍ．−Ｐら著、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、第３３巻、Ｄ５９３〜Ｄ５９７頁、２００５年）。次いで、Ｃ２４９４のＣＤＲ（図１４の下線部）は、ＶHのＣＤＲ−Ｈ１に相当する領域を除き、選択されたアクセプターヒトフレームワークに転移してＨＦＡ変異体を産生させた。この領域では、ＣＤＲとＨＶとの組み合わせ又はより短いＨＣＤＲ２（Ｋａｂａｔ−７とも称され、米国特許出願公開第２００９／０１１８１２７号を参照のこと）が非ヒト抗体からヒトＦＲへ転移された。というのも、図１４においてグレーで強調したＨＣＤＲ２残基は、既知の構造体の抗原抗体複合体において接触してないことが分かったためである（Ａｌｍａｇｒｏ著、Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．、第１７巻、１３２頁、２００４年）。
Ｃ２４９４の成熟タンパク質配列（ＶＬ：配列番号５２、ＶＨ：配列番号４８）を図１４に示す。図において、ＣＤＲ残基（Ｋａｂａｔ）には下線を付しており、ＣｈｏｔｈｉａのＨＶループをＣＤＲの下に示し、また、選択されたヒトフレームワークに転移された残基をＨＶの下に示す（ＨＦＡ）。グレーで強調したＨＣＤＲ２残基はどの変異体にも転移されなかった。
Ｃ２４９４のＦｖフラグメントの３次元相同性モデルは、ＭＯＥの抗体モデリングモジュール（ＣＣＧ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ）を用いて構成した。このモデルは、露出したメチオニン残基及びトリプトファン残基、潜在的なＮ−グリコシル化モチーフ及び脱アミド化モチーフなどの、発生傾向を評価するのに用いた。ＬＣＤＲ３中には、Ｆｖ構造モデルに基づいてＭｅｔ（Ｍ９４）残基が潜在的に露出している。Ｍｅｔ（Ｍ９４）残基を除去するために、Ｍ９４Ｌ変異を含む変異体（ＳＴＬＬ２８０、Ｏ１２ｂ）を作製して特性評価を行った。重鎖では、ＨＣＤＲ３直前のＣＡＲモチーフ中のＲ残基（Ｃｈｏｔｈｉａ残基９２〜９４、図１４）は、マイナスの電荷を有する残基のクラスター（Ｃｈｏｔｈｉａ残基Ｄ３１、Ｄ３２、Ｄ９６及びＤ１０１ａ、図１４）に悪影響を及ぼす可能性があり、これらは結合にとって重要な場合がある。Ｃｈｏｔｈｉａ残基９４においてアルギニンをロイシンで置換したＶＨ（ＣＡＲ→ＣＡＬ）を作製して特性評価を行った。
設計された重鎖及び軽鎖をＣ２４９４親と共に組み合わせたｍＡｂｗの、ヒトＳＴ２Ｌへの結合について評価した。作製されたＨＦＡ ｍＡｂからは、ＩＧＨＶ１−２４*０１（配列番号１４８）及びＩＧＨＶ１−ｆ*０１（配列番号１４９）重鎖フレームワーク（ＳＴＬＨ１９５及びＳＴＬＨ１９４）を有するＶＨ鎖を含むｍＡｂが、ＩＧＫＶ３−１５*０１（Ｌ２）（配列番号１５０）、ＩＧＫＶ１−９*０１（Ｌ８）（配列番号１５１）、ＩＧＫＶ１−５*０１（Ｌ１２）（配列番号１５２）、ＩＧＫＶ１−１２*０１（Ｌ５）（配列番号１５３）、ＩＧＫＶ１−３９*０１（Ｏ１２）（配列番号１５４）、ＩＧＫＶ１−２７*０１（Ａ２０）（配列番号１５５）又はＩＧＫＶ１−３３*０１（Ｏ１８）（配列番号１５６）フレームワーク（ＳＴＬＬ２８０、ＳＴＬＬ２７８、ＳＴＬＬ２７７、ＳＴＬＬ２７６、ＳＴＬＬ２７５、ＳＴＬＬ２７４、ＳＴＬＬ２７３、ＳＴＬＬ２７２）を有する様々なＨＦＡ軽鎖と組み合わせたときに、抗体を十分に発現してＳＴ２Ｌに結合した。
ＨＦＡのＶＨ変異体及びＶＬ変異体の配列をそれぞれ表１２に示す。転移された残基には下線を付し、そして更なる置換をグレーで強調した。表１３には、配列番号に加えて、固有のｐＤＲ（プラスミド）並びに各ＨＦＡのＶＨ及びＶＬに関するＣＢＩＳ ＩＤも示している。更なる特異性評価のために選択された発現ｍＡｂにおける、重鎖と軽鎖の組み合わせを表１４に示す。
表１５は、Ｃ２４９４のＣＤＲを転移するのに用いたヒトフレームワーク（Ｖ領域とＪ領域の組み合わせ）を示す。
表１２．
フレームワーク適合したＶＬ鎖（ＪＫ２配列に組み合わせたもの）
ＣＤＲには下線を付している。
［配列表１］
Figure 2015516817
［配列表２］
Figure 2015516817
［配列表３］
Figure 2015516817
［配列表４］
Figure 2015516817
［配列表５］
Figure 2015516817
［配列表６］
Figure 2015516817
［配列表７］
Figure 2015516817
［配列表８］
Figure 2015516817
［配列表９］
Figure 2015516817
ＪＨ１に組み合わせたフレームワーク適合化ＶＨ鎖
［配列表１０］
Figure 2015516817
［配列表１１］
Figure 2015516817
［配列表１２］
Figure 2015516817
Figure 2015516817
Figure 2015516817
Figure 2015516817
実施例１２．抗原結合部位スキャンのためのアラニン及びヒト生殖細胞系列の突然変異体の設計
部位特異的変異誘発を行って、各ＣＤＲ残基並びに他の抗体特性に潜在的影響を及ぼすいくつかの残基の結合への寄与を評価した。上記Ｃ２４９４のＦｖの分子モデルに基づいて、溶媒暴露ＣＤＲ残基のサブセットは抗原の結合に関与すると予測された。これらは、アラニン、及び／又は最もマッチングした生殖細胞遺伝子中の対応残基である対応する「ヒト様の」残基へと変異された。Ｃ２４９４のＶＨ中のＤ１０１ａＡ（Ｃｈｏｔｈｉａ残基）（配列番号４８中のＤ１０４Ａ）の置換により、ｋoffが１．４３×１０-4から３．２×１０-5まで約４倍低下した。
Ｄ１０１ａＡの置換により、ＳＴ２Ｌと結合する際にＣ２４９４ Ｆａｂのｋoffが低下したので、同様の変異は更にＣ２４９４ ＨＦＡ変異体の解離速度をも改善し得ると見込まれた。そのため、Ｄ１０１ａＡ（Ｃｈｏｔｈｉａナンバリング）をＳＴＬＨ１９４のＶＨ（＞ＶＨ２４９４−ＩＧＨＶ１−ｆ*０１、配列番号１４３）に組み込んでＶＨ ＳＴＬＨ２０１（配列番号１４５）を作製した。ＳＴＬＨ２０１を、７個の軽鎖ＳＴＬＬ２８０、ＳＴＬＬ２７７、ＳＴＬＬ２７６、ＳＴＬＬ２７５、ＳＴＬＬ２７４、ＳＴＬＬ２７３及びＳＴＬＬ２７２（表１３及び表１４）とそれぞれ組み合わせてｍＡｂであるＳＴＬＭ２２６、ＳＴＬＭ２２７、ＳＴＬＭ２２８、ＳＴＬＭ２２９、ＳＴＬＭ２３０、ＳＴＬＭ２３１及びＳＴＬＭ２３２を作製し、これらの特性評価を更に行った。そのため、ｍＡｂであるＳＴＬＭ２２６、ＳＴＬＭ２２７、ＳＴＬＭ２２８、ＳＴＬＭ２２９、ＳＴＬＭ２３０、ＳＴＬＭ２３１及びＳＴＬＭ２３２は、親Ｃ２４９４抗体及び異なるＨＣＤＲ３（配列番号１４６、ＧＤＦＹＡＭＡＹ）と比べて同一のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２配列を有している。更に、抗体ＳＴＬＭ２６６ ＶＬ ＳＴＬＭ２８０は、固有のＬＣＤＲ３：ＬＱＳＤＮＬＬＴ（配列番号１４７）をも有していた。
［配列表１３］
Figure 2015516817
Ｄ１０１ａＡ（Ｃｈｏｔｈｉａナンバリング）の置換を組み込んだＨＣＤＲ３：
配列番号１４６：ＧＤＦＹＡＭＡＹ
抗体ＳＴＬＭ２６６ ＶＬ ＳＴＬＭ２８０は、固有のＬＣＤＲ３：ＬＱＳＤＮＬＬＴ（配列番号１４７）を有していた。
実施例１３．抗ＳＴ２Ｌ抗体の特性評価
ファージディスプレイ、ハイブリドーマ及びヒトフレームワークへの適合化活動から得た抗体の特性評価を、ｈｕＳＴ２Ｌ−ＥＣＤ及びｃｙｎｏＳＴ２Ｌ−ＥＣＤとの結合、親和性測定、ドメイン結合を決定するためのヒト／マウスキメラとの結合、受容体−リガンド阻害アッセイ、レポーター遺伝子法並びにマスト細胞応答アッセイを包含する様々なアッセイで行った。
ファージディスプレイ活動由来の抗体のヒト及びｃｙｎｏ ＳＴ２Ｌに対する親和性、並びにそのヒトＳＴ２Ｌとの特異的結合を表１６に示す。表１６中の抗体はいずれも、ヒトＳＴ２ＬのドメインＩに結合した。
Figure 2015516817
ＨＦＡ活動から得た抗ＳＴ２Ｌ抗体の、親（ＳＴＬＭ６２、Ｃ２４９４）との関連において親和性を表１７に示す。親和性はＰｒｏｔｅＯｎで分析した。実験は、２５℃においてＰｒｏｔｅＯｎのＰＢＳ−Ｔ−Ｅ緩衝液（ＰＢＳ、０．００５％Ｐ２０及び３ｍＭのＥＤＴＡ）を泳動用バッファーとして用いて行った。実験を行うために、ＧＬＣセンサーチップをヤギ抗ヒトＦｃ（約５８００ＲＵ）の共有結合固定化によって調製して、１２２〜１４６反応単位（ＲＵ）のＭａｂを捕捉した。Ｍａｂを捕捉した後、０．０２４〜１５ｎＭ（５倍希釈）のＳＴ２Ｌ−ＥＣＤを４分間（５０μＬ／分で２００μＬ）で注入した。解離は、全ての反応において３０分間モニタリングした。再生は、１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）の１５秒パルスを２回用いて行った。ベースラインドリフトモデルを用いて１：１でデータをフィッティングした。
試料の会合速度は速いので、曲線のフィッティング及び親和性の予測には、ラングミュア型の物質移動モデルを用いた。どの試料も、解離速度は、親クローン及び対照Ｍａｂよりも速かった。解離速度の差は、ＨＦＡ変異体に対する親和性が親抗体に比べて低いことの主要因であった。
Figure 2015516817
Figure 2015516817
選ばれた抗体のマスト細胞応答について試験して、３ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３３によって誘発されるＩＬ−５、ＩＬ−１３及びＩＬ−８の、上述のヒト臍帯血由来マスト細胞からの放出の阻害を、ＲＰＭＩ＋１０％ ＦＣＳ中抗体１００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ又は０．０１μｇ／ｍｌを用いて測定した。これらアッセイ条件において、試験した抗体はいずれも、ＩＬ−３３誘発ＩＬ−５、ＩＬ−１３及びＩＬ−８サイトカイン放出を、抗体濃度１００μｇ／ｍｌでＩＬ−３３で誘発された対照試料に比べて約４０％〜１００％阻害した。
実施例１４．抗ＳＴ２Ｌ抗体による、ヒト好塩基球中での下方シグナル伝達経路阻害。
抗ＳＴ２Ｌ抗体の、ヒト好塩基球中でのｐ３８ＭＡＰＫシグナル伝達阻害能について試験した。
ヘパリン化チューブで全血を回収し、室温（ＲＴ）にしてからアッセイを開始した。血液１ｍＬを５０ｍＬコニカルチューブに分注して、ＰＢＳで希釈した抗ＳＴ２Ｌ抗体（ＳＴＬＢ２５２）又はアイソタイプ対照（ＣＮＴＯ８９３７）を最終濃度２、２０又は２００μｇ／ｍＬを目指して添加した。チューブを穏やかに回転させて混合し、インキュベータ内に３７℃で３０分間入れて、１５分後穏やかに回転させた。その後、血液の細胞表面抗原（ＣＤ１２３−ＦＩＴＣ、ＣＲＴＨ２−ＰＣＰ−ＣＹ５．５及びＣＤ４５−ＡＰＣ−Ｃ７）を蛍光色素標識抗体で染色し、そしてチューブを３７℃で１５分間インキュベートした。それぞれのチューブに、温めた培地（ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ ＦＢＳ／１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液）１ｍＬを添加した後、温めた培地で希釈したＩＬ−３３を最終濃度１０ｎｇ／ｍＬを目指して添加した。試料を３７℃で１０分間インキュベートした後、予め温めておいたＢＤ Ｐｈｏｓｆｌｏｗ製Ｌｙｓｅ／Ｆｉｘ緩衝液２０ｍＬをそれぞれのチューブに添加することで、赤血球を一斉に溶解させて試料を固定した。チューブを１０回反転させて十分に混合して、３７℃で１０分間インキュベートした。試料を２０ｍＬ滅菌室温ＰＢＳで洗浄し、室温の１倍希釈ＢＤ Ｐｅｒｍ／洗浄用緩衝液２ｍＬに再懸濁して、室温で３０分インキュベートした。試料をＢＤ Ｐｅｒｍ／洗浄用緩衝液２ｍＬで１回洗浄してから、ＢＤ Ｐｅｒｍ／洗浄用緩衝液４００μＬに再懸濁した。細胞内のｐ３８−ＭＡＰＫ（ｖＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号６９０８Ｓ）に対するＰＥ標識抗体を添加して、試料を室温で３０分間インキュベートし、遮光した。試料をＰｅｒｍ／洗浄用緩衝液５ｍＬで１回洗浄した後、ＦＡＣＳ緩衝液１００μＬに再懸濁して、９６ウェル丸底プレートに移した。試料は、各試料においてできるだけ多くのイベントを収集するハイスループットシステム（ＨＴＳ）を用いたＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメトリーを使用して分析した。ＦｌｏＪｏソフトウェアを用いてデータを解析した。好塩基球はＣＤ４５+ＣＲＴＨ２+ＣＤ１２３+として同定されて、それぞれの条件においてｐ３８ ＭＡＰＫ陽性好塩基球の割合を評価した。全血を抗ＳＴ２Ｌ ｍＡＢ（ＳＴＬＢ２５２）でプレインキュベートすることにより、ＩＬ−３３によって誘発されるｐ３８−ＭＡＰＫリン酸化反応が用量に応じて阻害されたが、アイソタイプ対照（ＣＮＴＯ ８９３７）では効果が全く見られなかった。抗ヒトＳＴ２Ｌ抗体は、全血の場合は、組み換え型ヒトＩＬ−３３によって好塩基球の活性が特異的に阻止された。この結果からは、抗ＳＴ２Ｌ抗体が、インビボでの内因性ＩＬ−３３によるシグナル伝達を阻害することが分かる。
Figure 2015516817
実施例１５．抗ＳＴ２Ｌ抗体によるインビボでの標的会合
ｍＩＬ−３３を６時間鼻腔内投与するＢＡＬ細胞動員のインビボモデル
１．２μｇ／マウスのｍＩＬ−３３（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、番号３６２６−ＭＬ／ＣＦ）又はＰＢＳを単回投与でオスＢａｌｂ／ｃマウス（６〜８週、Ｔａｃｏｎｉｃ）に投与した。最初のｍＩＬ−３３鼻腔内投与の２４時間前に、ラット抗マウス抗体であるＣＮＴＯ３９１４を又は２、０．２、０．０６又は０．０２ｍｇ／ｋｇ。アイソタイプ対照（ＩＴＣ）ｍＡであるＣＮＴＯ ５５１６を２ｍｇ／ｋｇで皮下投与した。ｍＩＬ−３３（又はＰＢＳ）投与から６時間後に、マウスを屠殺して血清分析のために血液を採取した。０．７ｍＬのＰＢＳ／０．１％ ＢＳＡを肺に２回注入して流出液を回収することにより、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行った。ＢＡＬを遠心分離にかけて（１２００ｒｐｍ、１０分）、血球計を用いて（Ｗｒｉｇｈｔ’ｓ−Ｇｉｅｍｓａ染色したサイトスピンプレパラートで）細胞の総数と分類別数とを計測するために細胞ペレットをＰＢＳ ２００μｌに再懸濁した。
マウス血清中のＣＮＴＯ ３９１４の測定
ＭＳＤ ＳＡ−ＳＴＤプレートをウェル１個当たり５０μＬのアッセイ用緩衝液で５分間かけてブロッキングした。プレートをひっくり返してアッセイ用緩衝液を取り除き、ペーパータオルで軽くたたいた。アッセイ用緩衝液中１．４μｇ／ｍＬのビオチン化組み換え型マウスＳＴ２Ｌ／ＩＬ１Ｒ４／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）をウェル１個当たり５０μｌ添加して、冷蔵庫で一晩インキュベートした。前被覆プレートの各ウェルに、コーティング試薬を除去せずに評価用緩衝液１５０μＬを添加して、３０分間インキュベートした。プレートをプレート洗浄機において洗浄用緩衝液で３回洗浄した。プレートをペーパータオルで軽くたたいて残留洗浄用緩衝液を取り除いた。プレートの各ウェルにＣＮＴＯ ３９１４試料をウェル１個当たり５０μＬ添加した。プレートを、穏やかに撹拌しながら周囲温度において１時間インキュベートした。プレートをプレート洗浄機において洗浄用緩衝液で３回洗浄した。プレートの各ウェルに、ルテニウム標識化マウス抗マウスＩｇＧ１ｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をウェル１個当たり５０μＬの用量設定で添加した。プレートを、穏やかに撹拌しながら周囲温度において１時間インキュベートした。プレートをプレート洗浄機において洗浄用緩衝液で３回洗浄した。プレートの各ウェルに、リードバッファーを１５０μＬ添加した。プレートの発光レベルを直ぐに、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００リーダーで読み取った。
全血分析
血液をＳａｒｓｔｅｄｔ製フィルターチューブ内においてＤＭＥＭ培地＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液＋／−１０ｎｇ／ｍｌマウスＩＬ−３３（１：４）で希釈した。フィルターチューブを３７℃で一晩インキュベートした後、上清におけるサイトカイン濃度及びケモカイン濃度をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘマウスサイトカイン／ケモカインキットを用い、製造者の取扱説明書に従って測定した。
結果
抗ＳＴ２Ｌ抗体は、０．２ｍｇ／ｋｇ又は２ｍｇ／ｋｇのＣＮＴＯ ３９１４を２４時間投与した後のマウスの血清中で検出することができた（図１６Ａ）。
ＩＬ−３３の鼻腔内投与により、気道への誘発細胞動員が６時間で誘発された（図１６Ｂ）。抗ＳＴ２Ｌ ｍＡｂの投与により、ＢＡＬ細部動員が低下した。ＢＡＬ細胞動員の大幅な阻害を見込むのに必要とされる最少用量は０．２ｍｇ／ｋｇであった（図１６Ｂ）。統計的有意性は、一元配置分散分析法を用いて算出された。
マウスＩＬ−３３で刺激された全血からは、ＩＬ−６（図１６Ｃ）及びＭＣＰ−１（図１６Ｄ）を含むことで、２４時間後にサイトカインレベル及びケモカインレベルが増加したことが分かる。抗ＳＴ２Ｌ ｍＡｂであるＣＮＴＯ ３９１４を２０ｍｇ／ｋｇ又は２ｍｇ／ｋｇ投与されたマウスでは、ＣＮＴＯ ５５１６が投与されたマウス（アイソタイプ対照の抗マウスＩｇＧ１）に比べてＩＬ−６及びＭＣＰ−１の濃度が低下したが、これはターゲット・エンゲージメントを示唆するものであった。全血分析において阻害と関連付けられる最少用量は２ｍｇ／ｋｇであって、これによってＢＡＬ細胞動員も阻害された（図１６Ｂ）。
このデータからは全体として、抗ＳＴ２Ｌ ｍＡｂが作用部位に到達し、そして目的とする薬理作用が達成されたことが認められる（ターゲット・エンゲージメントを示唆する）。
実施例１６．抗ＳＴ２Ｌ抗体のエピトープ
抗ＳＴ２Ｌ抗体を選抜するために、エピトープマッピング及び競合試験を行った。
競合結合アッセイ
競合結合アッセイを行って、抗ＳＴ２Ｌ ｍＡｂに対するエピトープ群の結合差異を評価した。ＭＳＤ ＨｉｇｈＢｉｎｄプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）に、ウェル１個当たり５μＬ（１０μｇ／ｍＬ）のＳＴ２Ｌ−ＥＣＤタンパク質を室温で２時間かけてコーティングした。各ウェルに、５％のＭＳＤブロッカーＡ緩衝液（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を１００マイクロリットル及び５０マイクロリットル添加して、室温で２時間インキュベートした。プレートを０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．４）で３回洗浄した後、ＭＳＤ蛍光染料（スルホタグ、ＮＨＳエステル）で標識化された各抗ＳＳＴ２Ｌ抗体と様々な競合相手との混合物を添加した。１０又は３０ｎＭの標識抗体を、１ｎＭから２μＭ又は５μＭまでの段階的な競合抗体を加えてインキュベートした後、混合物容量２５μＬの指定されたウェルに添加した。プレートを、穏やかに振盪しながら室温で２時間インキュベートした後、０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．４）で３回洗浄した。ＭＳＤリードバッファーＴを蒸留水で希釈して（４倍）ウェル１個当たり１５０μＬの量で分配し、そしてＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ６０００で分析した。
以下の抗体を競合アッセイで使用した。すなわち、ＳＴ２ＬドメインＩ結合性中和抗体であるＳＴＬＭ２０８、ＳＴＬＭ２１３、Ｃ２２４４（ＳＴＬＭ１５）及びＣ２４９４（ＳＴＬＭ６２）、ＳＴ２ＬドメインＩＩＩ結合性中和抗体であるＣ２５３９、並びにヒトＳＴ２ＬドメインＩに結合する抗ＳＴ２Ｌ非中和抗体であるＣ２２４０。図１７Ａ及び図１７Ｂは競合実験結果を表している。実験結果によれば、確認されたエピトープ・ビンは、ビンＡがｍＡｂ Ｃ２２４４、Ｃ２４９４、ＳＴＬＭ２０８若しくはＳＴＬＭ２１３であり、ビンＢがｍＡｂ Ｃ２２４０であり、そしてＢｉｎＣがＣ２５３９である。ＩＬ３３／ＳＴ２Ｌ相互作用を阻止しかつマスト細胞応答を阻害する抗体は、同一エピトープ内にあって、互いに交差競合することが分かった。競合データ一覧を表２０に示す。
Figure 2015516817
エピトープマッピング：Ｈ／Ｄ交換分析
Ｈ／Ｄ交換において、抗体のパータベーション分析に用いた手順は、いくつかの変更点を含むが前述のものと同様である（Ｈａｍｕｒｏ，Ｙ．ら著、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第１４巻、１７１〜１８２頁、２００３年、Ｈｏｒｎ，Ｊ．Ｒ．ら著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４５巻、８４８８〜８４９８頁、２００６年）。組み換え型ＳＴ２−ＥＣＤ（Ｃ末端にＨｉｓ−タグを有するＨＥＫ２９３Ｅから発現したもの）（配列番号１５７の残基１８〜３２８）を重水溶液中で所定の時間インキュベートすると、交換可能な水素原子に重水素取り込みが生じた。重水素化ＳＴ２−ＥＣＤを、固定化抗ＳＴ２Ｌ Ｃ２２４４ Ｆａｂ分子を含むカラム上で捕捉した後、水性緩衝液で洗浄した。逆交換したＳＴ２−ＥＣＤタンパク質をカラムから溶出させて、重水素を含むフラグメントの位置の特定を、プロテアーゼ消化及び質量分析法によって調べた。
図１８は、Ｃ２２４４ Ｆａｂと複合体を形成したヒトＳＴ２−ＥＣＤ（溶解性ＳＴ２）の単純化したＨ／Ｄ交換マッピングを示している。配列番号１１９のＳＴ２−ＥＣＤの残基１８〜３１（アミノ酸残基ＲＣＰＲＱＧＫＰＳＹＴＶＤＷ、配列番号２１０）をＦａｂ（配列番号１の完全長ＳＴ２Ｌの残基３５〜４８に相当）で保護した。このデータからは、Ｃ２２４４がエピトープＲＣＰＲＱＧＫＰＳＹＴＶＤＷ；配列番号２１０）に結合していることと、Ｃ２２４４と競合する抗体（Ｃ２４９４、ＳＴＬＭ２０８又はＳＴＬＭ２１３）も同様の又は重複するエピトープに結合する可能性があることが分かる。
変異誘発によるエピトープマッピング
ＳＴ２ＬドメインＩにおける対応するマウス残基に置換基を有するいくつかのＳＴ２Ｌ変異体を作製した。試験された抗体は、マウスＳＴ２Ｌとは交差反応しなかったことから、結合が消失及び／又は抑制されたＳＴ２Ｌ変異体は、ＳＴ２Ｌ上の置換部位にエピトープ残基を示すと見込まれる。変異は、標準的な方法を用いて、配列番号１の完全長ＳＴ２Ｌの残基１９〜２０５を有する構築物ＨＨ−ＳＴ２Ｌに導入された。抗体の、ＳＴ２Ｌ変異体との結合については、ＥＬＩＳＡ法又はＰｒｏｔｅＯｎによって試験した。
表面プラズモン共鳴法
結合試験は、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６タンパク質相互作用アレイシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて行った（Ｂｒａｖｍａｎ Ｔ．ら著、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、第３５８巻、２８１〜２８８頁、２００６年）。抗ヒト／抗マウスＦｃ混合物（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−００５−０９８／１１５−００５−０７１）を、アミンカップリング反応によってＧＬＣセンサーチップ上に固定した。その後、０．５％ ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０及び０．５％デオキシコール酸Ｎａ塩を含むＰＢＳ中で調製した抗体溶液を流す（１ｍｇ／ｍＬ）ことによって個々の抗ＳＴ２Ｌ ｍＡｂを捕捉した。表面内シグナルは、抗Ｆｃ被覆表面では約２５０共鳴単位（ＲＵ、１ＲＵ＝タンパク質１ｐｇ／ｍｍ2）に到達し、このことから、これら抗体が抗ＳＴ２Ｌ ｍＡｂに特異的に捕捉されたことが確認された。流体系を９０°回転させた後、野生型ＳＴ２Ｌ−Ｄ１Ｄ２又は変異タンパク質（０．５％ ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０及び０．５％デオキシコール酸Ｎａ塩を含むＰＢＳ中、０．５ｍｇ／ｍＬ）を平行流路に注入した。これらアッセイはいずれも２５℃で行った。表面上でのＳＴ２Ｌ−Ｄ１Ｄ２依存性シグナルを二重の参照によって獲得し、抗体のみを固定した表面上で認められた反応と溶媒のみを注入して認められたシグナルとを差し引く（これにより、結合依存性反応が補正できる）。得られたセンサーグラムを、最も単純化した１：１相互作用モデル（ＰｒｏｔｅＯｎ解析ソフトウェア）でフィッティングすることで、対応する会合速度定数及び解離速度定数（ｋa及びｋd）が得られた。
図１９は、作製されたＳＴ２Ｌ変異体、並びに抗ＳＴ２Ｌ抗体ＳＴ２Ｂ２０６及びＳＴ２Ｂ２５２の当該変異体に対する親和性を表している。変異体９３ＮＬ９４（９３ＴＦ９４から９３ＮＬ９４へ置換されたもの）は、ＳＴＬＭ２０８及びＳＴＬＢ２５２両者との結合親和性が約１０．８×１０-12Ｍから約４９．５×１０-12Ｍまで約５倍低下した。結合親和性が大幅に低下しなかったことは、抗体とＳＴ２Ｌ−Ｄ１Ｄ２との間の相互作用としての結合エネルギーが、Ｈ／Ｄ交換分析で同定されたエピトープ領域（ＲＣＰＲＱＧＫＰＳＹＴＶＤＷ；配列番号２１０）とこの９３ＮＬ９４部位からの追加寄与との合計であることを意味する。残基のナンバリングは、配列番号１の全長ヒトＳＴ２Ｌに準ずる。
実施例１７．ＳＴ２ＬドメインＩ結合抗体による、インビトロでの初代ヒト肺マスト細胞応答阻害。
ＳＴ２ＬドメインＩ結合抗体の肺マスト細胞応答阻害能は、初代ヒト肺マスト細胞内でのケモカイン及びサイトカインの放出によって評価した。
初代ヒト肺マスト細胞の分離
初代ヒト肺マスト細胞を、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅから入手した正常な非喫煙者組織から分離した。細胞は、柔組織を細かく切って洗浄し、そして酵素コラゲナーゼ及びヒアルロニダーゼ中において３７℃で一晩消化させることによって肺柔組織及び末梢気道から分散した。細胞を回収して洗浄し、そしてＭＡＣＳ Ｍｉｌｅｔｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製ＣＤ１１７マイクロビーズキット（ヒト）を用いた濃縮プロセスに付すことで、最終的にこの集団からマスト細胞を選抜した。実験を行う前に、マスト細胞は、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４＋２００ｎｇ／ｍｌ幹細胞因子中で６週間培養した。分離してから２週間後に、細胞を、フローサイトメトリーを用いて表現型で特性評価することで、マスト細胞の純度（％）を確認した。その後のアッセイで用いた細胞は、ＣＤ１１７（Ｃ−ｋｉｔ又は幹細胞因子受容体）及びＦｃ≦ＲＩ（親和性の高いＩｇＥ受容体）に対して８９％二重陽性であった。さらに、ＳＴ２Ｌに対しては９４．２％陽性であったことから、そのマスト細胞表現型が確認された。
初代ヒト肺マスト細胞からのサイトカイン放出に関する評価
ＳｔｅｍＰｒｏ−３４＋２００ｎｇ／ｍｌ幹細胞因子中で約６週間培養した初代ヒト肺マスト細胞を回収し、ＲＰＭＩ（１０％加熱不活性化ＦＣＳを含む）中で遠心分離にかけることによって洗浄した。細胞数を計数し、９６ウェルプレートあたりＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ培地に細胞数６５，０００個の密度でプレーティングした。抗ＳＴ２ＬドメインＩ結合Ｍａｂを初代肺マスト細胞に添加して、３７℃において３０分間結合させてからＩＬ−３３で刺激した。細胞は、３ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３３で２４時間刺激することで、様々な介在物質の培養上清への蓄積が開始した。培養上清を採取して、専用のＭｉｌｌｉｐｌｅｘ製９−ｐｌｅｘキットで評価するまで冷凍保存した。
抗ＳＴ２ＬドメインＩ結合抗体であるＳＴＬＭ２０８は、抗体濃度１００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ及び／又は１μｇ／ｍｌにおいて、初代ヒト肺マスト細胞内でのＩＬ−３３に誘発されたＧＭ−ＣＳＦの放出（図２０Ａ）、ＩＬ−５の放出（図２０Ｂ）、ＩＬ−８の放出（図２０Ｃ）及びＩＬ−１３の放出（図２０Ｄ）を阻害した。臍帯血由来マスト細胞を用いても同様の結果が得られた（図示せず）。

Claims (32)

  1. ヒトＳＴ２ＬのドメインＩ（配列番号９）に特異的結合する、単離されたヒト若しくはヒト適合性抗体拮抗物質又はそのフラグメント。
  2. 前記抗体がＩＬ−３３／ＳＴ２Ｌ相互作用を阻止する、請求項１に記載の単離された抗体。
  3. ヒトＳＴ２Ｌに対する解離定数（ＫD）約５×１０-12Ｍ〜約７×１０-10Ｍ、ヒトＳＴ２Ｌに対する会合速度定数（Ｋon）約２×１０6Ｍ-1ｓ-1〜約１×１０8Ｍ-1ｓ-1、又はヒトＳＴ２Ｌに対する解離速度定数（Ｋoff）約１×１０-6ｓ-1〜約１×１０-2ｓ-1を有する、請求項２に記載の単離された抗体。
  4. カニクイザル（ｃｙｎｏ）ＳＴ２Ｌ（配列番号２）に対する解離定数（ＫD）約３×１０-12Ｍ〜約２×１０-9Ｍ、ｃｙｎｏ ＳＴ２Ｌに対する会合速度定数（Ｋon）約４×１０6Ｍ-1ｓ-1〜約１×１０8Ｍ-1ｓ-1又はｃｙｎｏ ＳＴ２Ｌに対する解離速度定数（Ｋoff）約７×１０-5ｓ-1〜約１×１０-1ｓ-1を有する、請求項３に記載の単離された抗体。
  5. ａ）配列番号１６０の重鎖相補的決定領域（ＨＣＤＲ）１（ＨＣＤＲ１）（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＭＸ4）であって、式中、
    Ｘ1はＳ、Ｆ、Ｄ、Ｉ、Ｇ又はＶであり、
    Ｘ2はＹ又はＤであり、
    Ｘ3はＡ、Ｄ又はＳであり、そして
    Ｘ4はＳ、Ｆ又はＩであるもの、
    ｂ）配列番号１６１のＨＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）（Ｘ5ＩＸ6ＧＸ7ＧＧＸ8ＴＸ9ＹＡＤＳＶＫＧ）であって、式中、
    Ｘ5はＡ、Ｓ、Ｔ、Ｙ又はＤであり、
    Ｘ6はＳ、Ｒ、Ｅ、Ｋ、Ｇ又はＡであり、
    Ｘ7はＳ、Ｅ又はＮであり、
    Ｘ8はＳ、Ｒ、Ｅ、Ｇ、Ｔ、Ｄ又はＡであり、そして
    Ｘ9はＹ、Ｄ、Ｎ、Ａ又はＳであるもの、そして、
    ｃ）配列番号１６２のＨＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）（Ｘ10Ｘ11ＷＳＴＥＧＳＦＦＶＬＤＹ）であって、式中、
    Ｘ10はＤ、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｐ、Ｅ、Ｉ、Ｈ、Ｓ、Ｔ又はＹであり、そして
    Ｘ11はＰ、Ａ、Ｈ、Ｙ、Ｅ、Ｑ、Ｌ、Ｓ、Ｎ、Ｔ、Ｖ又はＩであるもの、そして、
    ｄ）配列番号１６３の軽鎖相補的決定領域（ＬＣＤＲ）１（ＬＣＤＲ１）（ＲＡＳＱＳＶＤＤＸ12ＬＡ）であって、式中、
    Ｘ12は、Ａ又はＤであるもの、
    ｅ）配列番号９０のＬＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）
    （ＤＡＳＮＲＡＴ）、そして、
    ｆ）配列番号１６４のＬＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）（ＱＱＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18Ｔ）であって、式中、
    Ｘ13はＦ又はＹであり、
    Ｘ14はＹ、Ｉ又はＮであり、
    Ｘ15はＮ、Ｇ、Ｄ又はＴであり、
    Ｘ16はＷ又はＡであり、
    Ｘ17はＰであるか又は欠失しており、そして
    Ｘ18はＬ又はＩであるもの、を含む、請求項４に記載の単離された抗体。
  6. ａ）配列番号９７のＨＣＤＲ１、
    ｂ）配列番号１１４のＨＣＤＲ２、
    ｃ）配列番号８４のＨＣＤＲ３、
    ｄ）配列番号１３０のＬＣＤＲ１、
    ｅ）配列番号９０のＬＣＤＲ２、及び、
    ｆ）配列番号１３４のＬＣＤＲ３、又は
    ｇ）配列番号１９１のＶＨ及び配列番号２０９のＶＬ、を含む、請求項５に記載の単離された抗体。
  7. 前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、前記ＨＣＤＲ３、前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２及び前記ＬＣＤＲ３が、
    ａ）それぞれ配列番号７８、８１、８４、８７、９０及び９２からなるもの、
    ｂ）それぞれ配列番号７８、８１、８４、１３０、９０及び１３１からなるもの、
    ｃ）それぞれ配列番号７８、８１、８４、１３０、９０及び１３２からなるもの、
    ｄ）それぞれ配列番号７８、８１、８４、１３０、９０及び１３３からなるもの、
    ｅ）それぞれ配列番号７８、８１、８４、１３０、９０及び１３４からなるもの、
    ｆ）それぞれ配列番号９５、１０９、８４、１３０、９０及び１３１からなるもの、
    ｇ）それぞれ配列番号９６、１１０、８４、１３０、９０及び１３１からなるもの、
    ｈ）それぞれ配列番号９７、１１１、８４、１３０、９０及び１３１からなるもの、
    ｉ）それぞれ配列番号９６、１１０、８４、１３０、９０及び１３４からなるもの、
    ｊ）それぞれ配列番号９７、１１１、８４、１３０、９０及び１３４からなるもの、
    ｋ）それぞれ配列番号９７、１１２、８４、１３０、９０及び１３４からなるもの、
    ｌ）それぞれ配列番号９８、１１３、８４、１３０、９０及び１３４からなるもの、
    ｍ）それぞれ配列番号９７、１１４、８４、１３０、９０及び１３４からなるもの、
    ｎ）それぞれ配列番号９７、１１５、８４、１３０、９０及び１３４からなるもの、
    ｏ）それぞれ配列番号９９、１１６、８４、１３０、９０及び１３３からなるもの、
    ｐ）それぞれ配列番号１００、１１７、８４、１３０、９０及び１３３からなるもの、
    ｑ）それぞれ配列番号１０１、１１８、８４、１３０、９０及び１３３からなるもの、
    ｒ）それぞれ配列番号１０２、１２０、８４、１３０、９０及び１３２からなるもの、
    ｓ）それぞれ配列番号１０３、１２１、８４、１３０、９０及び１３２からなるもの、
    ｔ）それぞれ配列番号１０３、１２２、８４、１３０、９０及び１３１からなるもの、
    ｕ）それぞれ配列番号１０３、１２３、８４、１３０、９０及び１３１からなるもの、
    ｖ）それぞれ配列番号１０４、１２４、８４、１３０、９０及び１３１からなるもの、
    ｗ）それぞれ配列番号１０５、１２５、８４、１３０、９０及び１３１からなるもの、
    ｘ）それぞれ配列番号１０６、１２６、８４、１３０、９０及び１３１からなるもの、
    ｙ）それぞれ配列番号９５、１２７、８４、１３０、９０及び１３１からなるもの、
    ｚ）それぞれ配列番号１０７、１２８、８４、１３０、９０及び１３１からなるもの、
    ａａ）それぞれ配列番号１０８、１２９、８４、１３０、９０及び１３１からなるもの、
    ｂｂ）それぞれ配列番号９７、１１４、１６５、１３０、９０及び１３４からなるもの、
    ｃｃ）それぞれ配列番号９７、１１４、１６６、１３０、９０及び１３４からなるもの、
    ｄｄ）それぞれ配列番号９７、１１４、１６７、１３０、９０及び１３４からなるもの、
    ｅｅ）それぞれ配列番号９７、１１４、１６８、１３０、９０及び１３４からなるもの、
    ｆｆ）それぞれ配列番号９７、１１４、１６９、１３０、９０及び１３４からなるもの、
    ｇｇ）それぞれ配列番号９７、１１４、１７０、１３０、９０及び１３４からなるもの、
    ｈｈ）それぞれ配列番号９７、１１４、１７１、１３０、９０及び１３４からなるもの、
    ｉｉ）それぞれ配列番号９７、１１４、１７２、１３０、９０及び１３４からなるもの、
    ｊｊ）それぞれ配列番号９７、１１４、１７３、１３０、９０及び１３４からなるもの、
    ｋｋ）それぞれ配列番号９７、１１４、１７４、１３０、９０及び１３４からなるもの、
    ｌｌ）それぞれ配列番号９７、１１４、１７５、１３０、９０及び１３４からなるもの、
    ｍｍ）それぞれ配列番号９７、１１４、１７６、１３０、９０及び１３４からなるもの、
    ｎｎ）それぞれ配列番号９７、１１４、１７７、１３０、９０及び１３４からなるもの、
    ｏｏ）それぞれ配列番号９７、１１４、１７８、１３０、９０及び１３４からなるもの、
    ｐｐ）それぞれ配列番号９７、１１４、１７９、１３０、９０及び１３４からなるもの、
    ｑｑ）それぞれ配列番号９７、１１４、１８０、１３０、９０及び１３４からなるもの、
    ｒｒ）それぞれ配列番号９７、１１４、１８１、１３０、９０及び１３４からなるもの、
    ｓｓ）それぞれ配列番号９７、１１４、１８２、１３０、９０及び１３４からなるもの、
    ｔｔ）それぞれ配列番号９７、１１４、１８３、１３０、９０及び１３４からなるもの、
    ｕｕ）それぞれ配列番号９７、１１４、１８４、１３０、９０及び１３４からなるもの、又は
    ｖｖ）それぞれ配列番号９７、１１４、１８５、１３０、９０及び１３４からなるもの、を含む、請求項５に記載の単離された抗体。
  8. 前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、前記ＨＣＤＲ３、前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２及び前記ＬＣＤＲ３が、
    ａ）それぞれ配列番号２３、２７、３１、３５、３９及び４３からなるもの、
    ｂ）それぞれ配列番号２４、２８、３２、３６、４０及び４４からなるもの、
    ｃ）それぞれ配列番号２４、２８、１４６、３６、４０及び１４７そからなるもの、又は
    ｄ）
    それぞれ配列番号２４、２８、１４６、３６、４０及び４４からなるもの、を含む、請求項４に記載の単離された抗体。
  9. 前記抗体が、ヒトＳＴ２Ｌ（配列番号１）との結合に関して配列番号４７の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号５１の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離された抗体と競合する、請求項２に記載の単離された抗体。
  10. 前記抗体が、配列番号１のアミノ酸残基３５〜４８（ＲＣＰＲＱＧＫＰＳＹＴＶＤＷ、配列番号２１０）においてヒトＳＴ２Ｌと結合する、請求項９に記載の単離された抗体。
  11. 前記抗体が更に、配列番号１のアミノ酸残基Ｔ９３及びＦ９４においてもヒトＳＴ２Ｌと結合する、請求項１０に記載の単離された抗体。
  12. ヒトＩＧＨＶ３−２３（配列番号１５８）フレームワーク配列、ＩＧＨＶ１−２４*０１（配列番号１４８）フレームワーク配列又はＩＧＨＶ１−ｆ*０１（配列番号１４９）フレームワーク配列由来のＶＨフレームワークを含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、ヒトＩＧＫＶ３−１１（Ｌ６）（配列番号１５９）フレームワーク配列、ＩＧＫＶ３−１５*０１（Ｌ２）（配列番号１５０）フレームワーク配列、ＩＧＫＶ１−９*０１（Ｌ８）（配列番号１５１）フレームワーク配列、ＩＧＫＶ１−５*０１（Ｌ１２）（配列番号１５２）フレームワーク配列、ＩＧＫＶ１−１２*０１（Ｌ５）（配列番号１５３）フレームワーク配列、ＩＧＫＶ１−３９*０１（Ｏ１２）（配列番号１５４）フレームワーク配列、ＩＧＫＶ１−２７*０１（Ａ２０）（配列番号１５５）フレームワーク配列又はＩＧＫＶ１−３３*０１（Ｏ１８）（配列番号１５６）フレームワーク配列由来のＶＬフレームワークを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む、請求項１に記載の単離された抗体。
  13. ＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型又はＩｇＧ４型である、請求項１に記載の単離された抗体。
  14. Ｆｃ領域内に置換を有する、請求項１３に記載の単離された抗体。
  15. 前記置換が、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ又はＰ２３８Ｓ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換を含み、残基のナンバリングがＥＵナンバリングに準ずる、請求項１４に記載の単離された抗体。
  16. 配列番号１９１の前記ＶＨと少なくとも９０％同一のＶＨと、配列番号２０９の前記ＶＬと少なくとも９４％同一のＶＬと、を含む、請求項１２に記載の単離された抗体。
  17. 配列番号１４３、１４４、１４５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４又は２０５の前記ＶＨと、配列番号１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、２０６、２０７、２０８又は２０９の前記ＶＬと、を含む、請求項１６に記載の単離された抗体。
  18. 前記ＶＨおよび前記ＶＬが
    ａ）それぞれ前記配列番号１８６及び前記配列番号２０６からなる、
    ｂ）それぞれ前記配列番号１８７及び前記配列番号２０６からなる、
    ｃ）それぞれ前記配列番号１９７及び前記配列番号２０６からなる、
    ｄ）それぞれ前記配列番号１９８及び前記配列番号２０６からなる、
    ｅ）それぞれ前記配列番号１９９及び前記配列番号２０６からなる、
    ｆ）それぞれ前記配列番号２００及び前記配列番号２０６からなる、
    ｇ）それぞれ前記配列番号２０１及び前記配列番号２０６からなる、
    ｈ）それぞれ前記配列番号２０２及び前記配列番号２０６からなる、
    ｉ）それぞれ前記配列番号２０３及び前記配列番号２０６からなる、
    ｊ）それぞれ前記配列番号２０４及び前記配列番号２０６からなる、
    ｋ）それぞれ前記配列番号２０５及び前記配列番号２０６からなる、
    ｌ）それぞれ前記配列番号１９５及び前記配列番号２０７からなる、
    ｍ）それぞれ前記配列番号１９６及び前記配列番号２０７からなる、
    ｎ）それぞれ前記配列番号１８８及び前記配列番号２０８からなる、
    ｏ）それぞれ前記配列番号１８９及び前記配列番号２０８からなる、
    ｐ）それぞれ前記配列番号１９０及び前記配列番号２０８からなる、
    ｑ）それぞれ前記配列番号１８７及び前記配列番号２０９からなる、
    ｒ）それぞれ前記配列番号１９１及び前記配列番号２０９からなる、
    ｓ）それぞれ前記配列番号１９２及び前記配列番号２０９からなる、
    ｔ）それぞれ前記配列番号１９３及び前記配列番号２０９からなる、又は
    ｕ）それぞれ前記配列番号１９４及び前記配列番号２０９からなる、請求項１７に記載の単離された抗体。
  19. 前記配列番号１４３、１４４、１４５、１８６、１８７、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４又は２０５の前記ＶＨ又は前記配列番号１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、２０６、２０７、２０８又は２０９の前記ＶＬをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
  20. 請求項１９に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  21. 請求項２０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  22. 請求項２１に記載の宿主細胞を培養する工程と、前記細胞から抗体を回収する工程と、を含む、請求項１８に記載の抗体の製造方法。
  23. 請求項１又は請求項６に記載の単離された抗体と、製薬上許容された担体と、を含む、医薬組成物。
  24. 請求項１又は請求項６に記載の単離された抗体の治療上の有効量を、ＳＴ２Ｌ介在状態の治療又は予防を必要とする患者に、ＳＴ２Ｌ介在状態を治療又は予防するうえで十分な時間にわたって投与する工程を含む、ＳＴ２Ｌ介在状態の治療又は予防方法。
  25. 前記ＳＴ２Ｌ介在状態が、喘息、気道過敏症、サルコイドーシス、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、肺嚢胞性線維症、炎症性大腸炎（ＩＢＤ）、好酸球性食道炎、強皮症、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、水泡性類天疱瘡、慢性じん麻疹、糖尿病性腎症、関節リウマチ、間質性膀胱炎又は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）であるか、或いは肺における炎症性細胞動員、杯細胞の肥厚化、粘液分泌又はマスト細胞応答の増加を伴う、請求項２４に記載の方法。
  26. 請求項１に記載の単離された抗体の治療上の有効量を、マスト細胞応答を阻害する必要のある患者に、前記マスト細胞応答を阻害するうえで十分な時間にわたって投与する工程を含む、患者のマスト細胞応答を阻害する方法。
  27. 前記マスト細胞応答の阻害が、ヒト臍帯血由来マスト細胞により放出されるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０又はＩＬ−１３の量を５０μｇ／ｍｌの抗体で少なくとも５０％阻害することを含む、請求項２６に記載の方法。
  28. ＳＴ２ＬのドメインＩに特異的結合する抗体を、対象に、ＩＬ−３３とＳＴ２Ｌとの相互作用を阻害するうえで十分な量で投与する工程を含む、対象におけるＩＬ−３３とＳＴ２Ｌとの相互作用を阻害する方法。
  29. 前記対象がＳＴ２Ｌ介在状態にある、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記ＳＴ２Ｌ介在状態が、喘息、気道過敏症、サルコイドーシス、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、肺嚢胞性線維症、炎症性大腸炎（ＩＢＤ）、好酸球性食道炎、強皮症、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、水泡性類天疱瘡、慢性じん麻疹、糖尿病性腎症、関節リウマチ、間質性膀胱炎又は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）であるか、或いは肺における炎症性細胞動員、杯細胞の肥厚化、又は粘液分泌若しくはマスト細胞応答の増加を伴う、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記抗体が、
    ａ）配列番号９７のＨＣＤＲ１、
    ｂ）配列番号１１４のＨＣＤＲ２、
    ｃ）配列番号８４のＨＣＤＲ３、
    ｄ）配列番号１３０のＬＣＤＲ１、
    ｅ）配列番号９０のＬＣＤＲ２、及び、
    ｆ）配列番号１３４のＬＣＤＲ３、又は
    ｇ）配列番号１９１のＶＨ及び配列番号２０９のＶＬ、を含む、請求項２９に記載の方法。
  32. 治療に使用される、請求項１、請求項６又は請求項９のいずれか一項に記載の抗体。
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