UA118336C2 - Виділене людське або адаптоване до людини антитіло, що специфічно зв'язується з доменом і людського st2l, і способи його застосування - Google Patents

Виділене людське або адаптоване до людини антитіло, що специфічно зв'язується з доменом і людського st2l, і способи його застосування Download PDF

Info

Publication number
UA118336C2
UA118336C2 UAA201412805A UAA201412805A UA118336C2 UA 118336 C2 UA118336 C2 UA 118336C2 UA A201412805 A UAA201412805 A UA A201412805A UA A201412805 A UAA201412805 A UA A201412805A UA 118336 C2 UA118336 C2 UA 118336C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
zeo
bek
human
shi
still
Prior art date
Application number
UAA201412805A
Other languages
English (en)
Inventor
Карен Даффі
Кетрін Хілі
Роберта Лемб
Раві Малавія
Майкл Пратта
Наталі Фурсов
Цзіньцюань Ло
Майкл Насо
Марк Торнетта
Джон Уілер
Шен-Дзюн У
ЛеРой Холл
Original Assignee
Янссен Байотек, Інк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Янссен Байотек, Інк. filed Critical Янссен Байотек, Інк.
Publication of UA118336C2 publication Critical patent/UA118336C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/01—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof
    • A61K38/012—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
    • Y10S530/809—Fused cells, e.g. hybridoma

Abstract

Винахід належить до виділеного людського або адаптованого до людини антитіла, що специфічно зв’язується з доменом І людського ST2L, полінуклеотиду, що кодує зазначене антитіло, вектора, клітини-хазяїна, способу одержання такого антитіла, фармацевтичної композиції, а також до способу лікування або запобігання ST2L-опосередкованого захворювання шляхом введення зазначеного антитіла, способу інгібування відповіді мастоцитів у пацієнта шляхом введення зазначеного антитіла, та способу інгібування у суб’єкта взаємодії IL-33 та ST2L шляхом введення зазначеного антитіла.

Description

Винахід належить до виділеного людського або адаптованого до людини антитіла, що специфічно зв'язується з доменом | людського 5Т2І, полінуклеотиду, що кодує зазначене антитіло, вектора, клітини-хазяїна, способу одержання такого антитіла, фармацевтичної композиції а також до способу лікування або запобігання 5121 -опосередкованого захворювання шляхом введення зазначеного антитіла, способу інгібування відповіді мастоцитів у пацієнта шляхом введення зазначеного антитіла, та способу інгібування у суб'єкта взаємодії
ІЇ-33 та 512. шляхом введення зазначеного антитіла.
Перехресне посилання на споріднені заявки
Дана заявка претендує на пріоритет заявки США серійний Мо 13/798,204, поданої 13 березня 2013 р., заявки США серійний Мо 13/798,226, поданої 13 березня 2013 р., попередньої заявки США серійний Мо 61/640,407, поданої 30 квітня 2012 р., і попередньої заявки
США Мо 61/640,238, поданої 30 квітня 2012 р., повний зміст яких включено в даний документ шляхом посилання.
Предмет винаходу
Даний винахід стосується антагоністів 5Т2І., полінуклеотидів, що кодують антагоністи або їх фрагменти, а також способів отримання та використання вищезгаданого.
Передумови винаходу
ЗТ21 (П-1КІ1 або ІІ! -33Ка) є членом сімейства рецепторів ТОП -1, що експресується на клітинній поверхні найрізноманітніших клітин імунної системи, зокрема на поверхні Т-клітин,
МК/МКТ-клітин, базофілів, еозинофілів, тучних клітин і новоописаних вроджених лімфоїдних ні-
В/ні-Т-клітин типу 2, нуоцитів і природніх клітин-хелперів. Експресія 512! також може індукуватися на дендритних клітинах (ОС), макрофагах і нейтрофілах. 5121 здатний пригнічувати реагування ТоїЇІ-подібних рецепторів ТІК2, ТІ К4 і ТІ КУ, а також індукувати вивільнення цитокіну типу 2 шляхом активації за допомогою свого ліганда 1-33 й асоціації з додатковим білком І/-1ВАсР. ІЇ/-33 представлено як алармін (речовина, що діє як сигнал тривоги), оскільки його повнорозмірна форма знаходиться в ядрах епітеліальних та ендотеліальних клітин при гомеостазі, але може бути розщеплена і вивільнена при некрозі.
Сигналізація 572. потребує асоціації додаткового білка ІЇ-1КАсР з попередньо утвореним комплексом 51Т2ІЛІ-33. Додатковий білок І/-1КАсР використовується спільно із сигнальним комплексом І--14/8. У даному винаході запропоновано моделі взаємодій 5121, 1І/-33 та //- 1ЕАСР, а також взаємодій між ІІ -1К1 та ІІ -1ВАсР (І іпдеї єї а!., Сеї! 17:1398-1410, 2009; Мапод єї а!ї., Маї Іттипої! 11:905-11, 2010). Нещодавно було продемонстровано, що 5Т21 ЛІ -33/ЛІ -1 ВАсР утворюють сигнальний комплекс із с-Ки на тучних клітинах, рецептор фактора стовбурових клітин (ЗСЕ). І--33-індуковане продукування цитокінів у первинних тучних клітинах 5СЕ- залежним способом (Огибе еї а!., Віоса 115:3899-906, 2010).
Активація 512 призводить до відповідей із надмірним продукуванням цитокінів типу 2
Зо (особливо ІЇ -5 та ІІ -13), активації тучних клітин та еозинофілів і до гіперреактивності дихальних шляхів, і також повідомлялося, що це зумовлює посилення відповідей ТА1 і Тп17 через індукцію гама-інтерферонів ІЄМУу із МКТ-клітин та ІС-18р й ІІ -6 із тучних клітин. Порушення регуляції шляху
ЗТ21ЛІ-33 спостерігається під час різних імуноопосередкованих хвороб, зокрема астми, ревматоїдного артриту, запальних захворювань кишечника, атопічного дерматиту, алергічного риніту, назального поліпозу й системного склерозу (розглянуто Раїтег і СбСарау, Маї Кем
Апейтаїййо! 7:321-9, 2011 і Поуй, Сигг Оріп Іттипої! 22:800-6, 2010; 5Ніті?и єї аІ., Нит Моїес Сеп 14:2919-27, 2005, Катекига еї а!., Сіїп Ехр АїПегду 42:218-28, 2012; Мапейі еї аІ., Апп Впєит бів 69:598-605, 2010).
Таким чином, існує потреба в антагоністах 512, придатних для використання в лікуванні
ЗТ2І -опосередкованих захворювань і порушень.
Стислий опис рисунків
На фіг.1 показано інгібування гіперреактивності дихальних шляхів шляхом зв'язування моноклонального антитіла (тАбБ) СМТО3914 доменом І 512! у моделі запалення легень, викликаного інтраназальним введенням 1-33, у порівнянні з ізотипним контролем СМТО5516.
Піковий опір дихальних шляхів було виміряно після введення метахоліну (МСН) у збільшених дозах (мг/мл). ""р«0,05 для СМТО3914/ЛІ-33 порівняно з СМТО5516/ЛІ-33; і р«0,001 для
СМТО3914Л/ЛІ -33 порівняно з групою фосфатно-сольового буфера (ФСБ) із введенням ЇЇ -33.
На фіг. 2 показано інгібування рекрутування клітин при бронхоальвеолярному лаважі (БАЛ) шляхом зв'язування тАр СМТО3914 доменом І! 5121. у моделі запалення легень, викликаного інтраназальним введенням ІІ--33, у порівнянні з ізотипним контролем СМТО5516. ""ре«0,001.
На фіг. З показано дозозалежне інгібування вивільнення протеази тучних клітин мишей 1 (ММОР-1) шляхом зв'язування тар СМТОЗ3914 доменом І 5121 у вільній від клітин рідині БАЛУ в моделі запалення легень, викликаного інтраназальним введенням 1-33. "реО0,01, "р«0,001 порівняно з СМТО5516 (ізотипний контроль) із введенням 1І--33.
На фіг. 4 показано інгібування ІІ -33-індукованого вивільнення ЗМ'С5Е (фіг. 4А), ІІ -5 (фіг. 48) і ТМЕа (фіг. 4С) шляхом зв'язування доменом | 5Т2Ї тАБбБ СМТО3914, тучними клітинами, отриманими з кісткового мозку мишей, іп міго. У дужках вказано застосовані концентрації
СМТО3914 у мкг/мл і концентрації 1-33 у нг/мл.
На фіг. 5 показано інгібування вивільнення ІІ -3З3-індукованого простагландину 02 (РОЮ») бо тучними клітинами, отриманими з пуповинної крові людини, шляхом зв'язування тар С2494
(ЗТІ М62) доменом І 5121. при вказаних концентраціях 1-33 і 2494. МОХ-РОС2: метоксиламін- раб».
На фіг. 6 показано інгібування вивільнення СМ'С5Е (фіг. бА), 1-8 (фіг. 6В), 1-5 (фіг. 6С), 1- 13 (фіг. 60) та 1-10 (фіг. 6Е) вказаними концентраціями (мкг/мл) домену І 5Т2., що зв'язує тАБ
С2244 і С2494 у тучних клітинах, отриманих з пуповинної крові людини (ПСВМС5), у присутності 1 нг/мл І--33 в середовищі 5іетРго-34--100 нг/мл ЗСЕ (фактор стовбурових клітин).
На фіг. 7 показано вплив на вивільнення СМ'С5Е (фіг. 7А), 1І--8 (фіг. 7В), 1-5 (фіг. 72), 11-13 (фіг. 703) ї 1-10 (фіг. 7Е) вказаними концентраціями (мкг/мл) домену ПІ 5Т2І, що зв'язує тАБ
С2519 або С2521 у тучних клітинах, отриманих з пуповинної крові людини, у присутності 1 нг/мл
І--33 в середовищі 5іетРго-34--100 нг/мл ЗСЕ.
На фіг. 8 показано вплив на вивільнення А) ЗМ'С5Е; В) І -8; С) 11 -5; 0) 1-13 та Є) 11-10 шляхом зв'язування тАр С2494 доменом І 5121 і зв'язування тАб 5Т2М48 (М48), 512М49 (М49), 5Т2М50 (М50) і 5Т2М51 (М51) доменом ПШ 5Т2Ї у тучних клітинах, отриманих з пуповинної крові людини (ПСВМС), у присутності З нг/мл І/-33 у середовищі КРМІ/1О Фо фетальної телячої сироватки (ЕС5) ж 100 нг/мл ЗСЕ.
На фіг. 9 показано середній відсоток (95) інгібування анти-5Т21І -антитіла- зв'язуючого домену
І (01) або домену ПІ (03) 572. відносно вивільнення ЗМ'С5Е, І -5, ІІ -8, 1-10 та 1-13 у тучних клітинах, отриманих з пуповинної крові людини, після індукції І/-33 та 5СЕ, як зазначено, із використанням або 50 мкг/мл, або 2 мкг/мл кожного досліджуваного антитіла. Від'ємні значення вказують на відсоток активації.
На фіг. 10 показано варіабельні області важких ланцюгів (МН) і послідовності областей, що визначають комплементарність, (СОК) важких ланцюгів антитіл анти-5Т2!, отриманих із бібліотек фагового дисплея і після подальших кампаній дозрівання аффінності.
На фіг. 11 показано варіабельні області легких ланцюгів (МІ) і послідовності СОК легких ланцюгів антитіл анти-5Т2Ї, отриманих із бібліотек фагового дисплея і після подальших кампаній дозрівання аффінності.
На фіг. 12 показано області МН і МІ. і послідовності СОМ. важких ланцюгів різновидів НСОКЗ
МН 512Н257 антитіла анти-5Т2І 5ТІ М208.
На фіг. 13 показано послідовності А) МН і В) Мі для антитіл анти-5Т2І, отриманих із
Зо бібліотек фагового дисплея і після подальших кампаній дозрівання аффінності.
На фіг. 14 показано розмежування антиген-зв'язуючих ділянок С2494 МН і МІ, перенесених на каркаси людського походження (перенесені позначено як НЕА, "адаптація каркасу людського походження"). Кара! СОК підкреслено, і Споїйіа НМ позначено пунктирними лініями над вказаними перенесеними областями НЕА. Нумерацію залишків УН і МІ. проведено відповідно до
Споїйпіа. Залишки УН, виділені сірим кольором, не були перенесені у деяких різновидах НЕА. б2494 УН: 5ЕО І МО: 48; С2494 УН: 5ЕО ІЮ МО: 52.
На фіг.15 показано послідовності СОК антитіл, адаптованих до каркасу людського походження (НЕА) і отриманих із С2494.
На фіг. 16 А) рівні антитіла анти-5Т2Ї СМТО3914 у сироватці крові В) інгібування рекрутування клітин при бронхоальвеолярному лаважі (БАЛ) С) інгібування секреції 1-6 клітинами цільної крові, стимульованими 1-33; 2) інгібування секреції МСРІ клітинами цільної крові, стимульованими 1-33 за допомогоюСМТО3914 через добу після введення дози, у 6- годинній моделі запалення легень, викликаного інтраназальним введенням 1-33. "р«0,05, яхр-0,01, и р«0, 001; МО - нижче межі виявлення; (0 - одна точка даних знаходиться нижче межі виявлення. фіг. 17. Конкуренція між різними антитілами анти-5Т2Г. А) Мічений 30 нМ БРар С2244 конкурував з вказаними антитілами за зв'язування із 5121 -ЕСО, нанесеним на мікролунки.
С2244 конкурував з С2494, але не із С2539. В) Мічений 10 нм С2494 конкурував із вказаними антитілами за зв'язування із 5121 -ЕСО, нанесеним на мікролунки. С2494 конкурував із БТІ М208 і 5 ТІ М213, але не із С2539.
На фіг. 18 показано спрощену Н/О-карту обміну людського 512-ЕСО (ЗЕО ІО МО: 119) у комплексі з бар С2244. Області, захищені антитілами, було представлено в різних градаціях сірого, як зазначено. Сегменти, що охоплюють залишки 18-31 (взяті в рамку пунктирною лінією) (відповідно до залишків 35-48 повнорозмірних 512Ї із 5ЕО ІЮ МО: 1), були захищені Раб.
Області, що охоплюють залишки 71-100 (взяті в рамку суцільною лінією) (відповідно до залишків 88-117 з БЕО ІО МО: 1), були інтенсивно глікозильовані і не покривалися пептидами.
На фіг. 19 показано кінетичні та аффінні константи для домену І 5121, що зв'язує антитіла для різновидів 5121, як показано на Фігурі.
На фіг. 20 показано інгібування А) ЗМ'С5Е; В) І/-5; С) І -8; ОБ) секреція 1-13 із первинних 60 тучних клітин людських легень за допомогою антитіла 5ТІ М208 анти-5Т2І.
Суть винаходу
У винаході запропоновано антагоніст виділеного людського чи адаптованого до людини антитіла або його фрагмента, який специфічно зв'язує домен І (ЗЕО ІО МО: 9) людського 5121.
У винаході також запропоновано антагоністи адаптованих до людини антитіл, причому такі антагоністи специфічно зв'язують людський 5Т2І/, що має певні послідовності варіабельної області легких ланцюгів і важких ланцюгів або певні послідовності, що визначають комплементарність, важких ланцюгів і легких ланцюгів.
У винаході також запропоновано антагоністи людських або адаптованих до людини антитіл, причому такі антагоністи специфічно зв'язують людський 5121. у певних областях епітопів і/або мають певні ознаки, як описано в даному документі.
У винаході також запропоновано виділений полінуклеотид, що кодує варіабельні області важких ланцюгів (МН) або варіабельні області легких ланцюгів (МІ) згідно даного винаходу.
У винаході також запропоновано вектор, що включає виділений полінуклеотид згідно даного винаходу.
У винаході також запропоновано клітину-хазяїна, що включає вектор згідно даного винаходу.
У винаході також запропоновано спосіб отримання антитіла згідно даного винаходу, що включає культивування клітини-хазяїна згідно даного винаходу й отримання антитіла з клітини.
У винаході також запропоновано фармацевтичну композицію, що включає виділене антитіло згідно даного винаходу і фармацевтично прийнятний носій.
У винаході також запропоновано спосіб лікування або запобігання 5121 - опосередкованого стану, що включає введення терапевтично ефективної кількості виділеного антитіла згідно даного винаходу пацієнтові, який його потребує, протягом часу, достатнього для лікування або запобігання 5Т2І -опосередкованого стану.
У даному винаході також запропоновано спосіб інгібування відповіді тучних клітин у пацієнта, що включає введення терапевтично ефективної кількості виділеного антитіла згідно даного винаходу пацієнтові, який його потребує, протягом часу, достатнього для інгібування відповіді тучних клітин.
У винаході також запропоновано спосіб інгібування взаємодії І/-33 і 5Т2Ї в об'єкта, що включає введення об'єктові антитіла, яке специфічно зв'язує домен І 5121, у кількості, достатній для інгібування взаємодії ІІ -33 і 5Т21..
Детальний опис винаходу
Усі публікації, у тому числі, крім іншого, патенти й патентні заявки, наведено у даному документі шляхом посилання так, нібито їх було викладено повністю.
Необхідно розуміти, що термінологія в даному документі вживається виключно для опису певних варіантів втілення і не має обмежувального характеру. Якщо не вказано інше, усі технічні й наукові терміни, використані в даному документі, мають те саме значення, яке зазвичай розуміє середній фахівець у галузі, до якої належить даний винахід.
Незважаючи на те, що будь-які способи і матеріали, аналогічні або еквівалентні тим, які описані у даному документі, можуть бути використані в практиці для тестування даного винаходу, у даному документі описано типові матеріали і способи. В описі і формулі даного винаходу використовуватиметься наступна термінологія.
У контексті даного документа термін "антагоніст" означає молекулу, яка частково або повністю інгібує біологічну активність 5Т2Ї за допомогою будь-якого механізму. Типовими антагоністами є антитіла, гібридні білки, пептиди, пептидоміметики, нуклеїнові кислоти, олігонуклеотиди і невеликі молекули. Антагоністи можна ідентифікувати з використанням описаних нижче аналізів біологічної активності 512Ї. Антагоністи 512ІЇ можуть інгібувати виміряну біологічну активність ЗТ2І на 20 95, 30 95, 40 95, 50 Зо, 60 Зо, 70 90, 75 90, 80 У, 85 9, 90 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 99 95 або 100 95.
Термін "5Т21І", або "пи5Т21І", або "людський 5121" відноситься до людського поліпептиду
ЗТ2І, що має амінокислотну послідовність, представлену в сСепВапК, доступ Мо МР 057316.
ЗБО ІЮ МО: 1 представляє амінокислотну послідовність повнорозмірного людського 51Т21. "Позаклітинний домен 5121", "5Т2І-ЕСО" або "пи5Т2І-ЕСО" у контексті даного документа означає поліпептид, що має амінокислоти 19-328 із БЕО ІЮ МО: 1. пи5Т2Г-ЕСО має три Ід- подібні домени типу С2, що охоплюють залишки 19-122 (домен І, ЗЕО ІО МО: 9), залишки 123- 202 (домен ІІ, БЕО ІЮО МО: 10) ії залишки 209-324 (домен І, 5ЕО ІЮО МО: 11) із БЕО ІЮО МО: 1. "Домен І", або "домен | 5Т2І/", або "домен | пи5Т21І", або "01" відноситься до першого імуноглобулінподібного домену на людському 512, який має послідовність, представлену в
ЗЕО ІО МО: 9. "Домен ПП" або "домен І 5Т21" відноситься до третього імуноглобулінподібного домену на людському 5121, який має послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 11. бо У контексті даного документа термін "1-33" включає повнорозмірний 1-33 (СсепВапкК, доступ
Мо МР. 254274 5ЕО ІЮ МО: 3), його різновиди й активні форми. Різновиди ІІ -33 включають білки, що мають амінокислотні послідовності, представлені в СепВапК, доступ Мо МР 001186569, і
СепВапК, доступ Мо МР 001186570). Активні форми 1//-33 включають "зрілий ІІ/-33", що має залишки 112-270 5ЕО ІО МО: 3. Додаткові активні форми включають фрагменти 1-33, що мають залишки 11-270, 115-270, 95-270, 99-270 або 109-270 5ЕО ІО МО: З (І еЕгапсаїзв єї аї., Ргос Маї!
Асад 5сі (О5А) 109:1673-8, 2012), або будь-яку іншу форму чи комбінацію форм, виділених з клітин, які ендогенно експресують 1-33. "Активна форма 1-33" - це фрагмент або різновид ІІ -33
ЗЕО ІЮ МО: 3, що стимулює біологічну активність 5121.
У контексті даного документа термін "антитіла" використовується в широкому значенні і включає молекули імуноглобуліну, у тому числі поліклональні антитіла, моноклональні антитіла, у тому числі мишачі, людські, адаптовані до людини, гуманізовані і химерні моноклональні антитіла, фрагменти антитіл, біспецифічні або мультиспецифічні антитіла, утворені принаймні з двох інтактних антитіл або фрагментів антитіл, димерних, тетрамерних або мультимерних антитіл й одноланцюгових антитіл.
Імуноглобуліни можна віднести до п'яти основних класів, а саме ІдА, дО, ЧЕ, дос й І9ЗМ, залежно від амінокислотної послідовності константного домену важких ланцюгів. (ДА й дО додатково поділяють на ізотипи ІдА1, ІдАг2, ІДС, Ідс2, доз і Ід04. Легкі ланцюги антитіл будь- якого виду хребетних можна віднести до одного з двох чітко відмінних типів, а саме каппа (к) і лямбда (ХА), на основі амінокислотних послідовностей їх константних доменів.
Термін "фрагменти антитіл" відноситься до частини молекули імуноглобуліну, яка зберігає антиген-зв'язуючу ділянку важких ланцюгів і/або легких ланцюгів, наприклад, області, що визначають комплементарність, важких ланцюгів (НСОК) 1, 2 і 3, області, що визначають комплементарність, легких ланцюгів (ІСОК) 1, 2 і 3, варіабельну область важких ланцюгів (МН) або варіабельну область легких ланцюгів (МІ). Фрагменти антитіл включають добре відомі фрагменти Раб, Е(аб)2, РО і Ем і доменні антитіла (дАБ), що містять один домен МН. Домени МН і МІ можуть бути зв'язані один з одним за допомогою синтетичного лінкера з утворенням різних типів конструкцій одноланцюгових антитіл, де домени МН/Л/І. паруються внутрішньомолекулярно або міжмолекулярно в тих випадках, коли домени МН і Мі експресуються окремими конструкціями одноланцюгових антитіл з утворенням ділянки зв'язування одновалентного антигену, наприклад, одноланцюговим Ем (ЗсСЕм) або димером; описані, наприклад, у публ. міжнар. заявці на патент Мо М/098/44001, публ. міжнар. заявці на патент Мо М/О88/01649; публ. міжнар. заявці на патент Мо М/О94/13804; публ. міжнар. заявці на патент Мо УУО92/01047.
Варіабельна область антитіла складається з області "каркасу", перерваної трьома "антиген- зв'язуючими ділянками". Антиген-зв'язуючі ділянки визначаються з використанням різних термінів: (ї) області, що визначають комплементарність, (СОК), три у МН (НСОКІ1, НОСОК,
НОСОК) і три у М. (СОКІ1, І СО2, СОМ), що базуються на варіабельності послідовності (М/и апа Караї, У Ехр Мей 132:211-50, 1970; Кабаї єї аї., Зедиепсе5 ої Ргоївїп5 ої Іттипоіодісаї
Іптегеві, 5-е вид. Рибіїс Неайй Зегмісе, Майопаї Іпбзійшев ої Неакй, м. Бетесда, штат Меріленд, 1991). (і) "Гіперваріабельні області", "НМА" або "НУ", три у МН (НІ, Н2, НЗ) ітри ум (11,12,
ЇЗ3), відносяться до областей варіабельних доменів антитіл, які мають гіперваріабельну структуру за визначенням СПпоїйпіа і Ге5зК (Споїйпіа апа Гезк, Мої! Віо! 196:901-17, 1987). Інші терміни включають "ІМОТ-СОВ" (Гейапс єї аі., Оем Сотрагаї Іттипо! 27:55-77, 2003) і "використання залишку, який визначає специфічність" (5ОКИ) (АІтадго, Мої! Кесодпії 17:132-43, 2004). Міжнародна база даних ІптМипосСепетТіс5 (ІМОСТ) (пЕр:/Аюимли ітд ого) забезпечує стандартизовану нумерацію і визначення антиген-зв'язуючих ділянок. Відповідність між розмежуванням СОК, НМ та ІМОТ описана / еїгапс еї аіІ., Сем Сотрагаї Іттипої 27:55-77, 2003.
У контексті даного документу "залишки СПпоїйіа" є залишками Мі і МН антитіл, пронумерованих відповідно до А!Г-І агікапі (А!-І агікапі еї аї., У Мої Віої! 273:927-48, 1997). "Каркас" або "каркасні послідовності" - це інші послідовності варіабельної області, крім тих, які визначено як антиген-зв'язуючу ділянку. Оскільки антиген-зв'язуючу ділянку можна визначити за допомогою різних термінів, як описано вище, точна амінокислотна послідовність у каркасі залежить від того, як визначено антиген-зв'язуючу ділянку. "Людське антитіло" або "повністю людське антитіло" відноситься до антитіл, що містять послідовності варіабельної області і константної області, отримані з послідовностей людського імуноглобуліну. Людські антитіла згідно даного винаходу можуть включати заміщення, тому вони можуть не бути точними копіями експресованого людського імуноглобуліну або генних послідовностей зародкової лінії. Однак антитіла, в яких антиген-зв'язуючі ділянки отримано з видів не людського походження, не включено у визначення терміну "людське антитіло". "Адаптовані до людини" антитіла або "адаптовані до каркасу людського походження (НЕА)" 60 антитіла відносяться до антитіл, адаптованих відповідно до способів, описаних у публікації заявці на патент США Мо 0О52009/0118127, а також відносяться до антитіл, в яких послідовності антиген-зв'язуючої ділянки, отримані з видів не людського походження, трансплантовані на каркаси людського походження. "Гуманізовані антитіла" відносяться до антитіл, в яких антиген-зв'язуючі ділянки отримано з видів не людського походження, а каркаси варіабельної області отримано з послідовностей людського імуноглобуліну. Гуманізовані антитіла можуть включати заміщення в областях каркасів, так що каркас може не бути точною копією експресованого людського імуноглобуліну або генних послідовностей зародкової лінії.
У контексті даного документа термін "по суті ідентичні" означає, що дві амінокислотні послідовності варіабельної області антитіла, які порівнюють, є однаковими або мають "несуттєві відмінності". Несуттєві відмінності - це заміщення 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 або 11 амінокислот в антитілі або послідовності варіабельної області антитіла, які не мають негативного впливу на властивості антитіла. Описані у даному документі по суті ідентичні до послідовностей варіабельної області амінокислотні послідовності знаходяться у рамках даної заявки. У деяких варіантах втілення ідентичність послідовності може бути приблизно 90 95, 91 95, 92 Фо, 93 9, 9495, 9595, 9695, 97 95, 9895, 9995 або вище. Відсоток ідентичності можна визначити, наприклад, шляхом попарного вирівнювання з використанням налаштувань за замовчуванням модуля АїЇїдпХ Месіог МТІ 9.0.0 (Іпмігодеп, м. Карлобад, штат Каліфорнія, США). Послідовності білка згідно даного винаходу можна використати як послідовність запиту для здійснення пошуку у публічно доступних або патентних базах даних, наприклад, для визначення споріднених послідовностей. Типовими програмами, які використовують для здійснення таких пошуків, є програми ХВГА5Т або ВІ АЗТР (пр /Луим/лми псбрі піт/пій дом) або комплект СепотеОцеві м (Сепотесицевбі, м. Уестборо, штат Массачусетс, США) із використанням налаштувань за замовчуванням.
У контексті даного документа термін "епітоп" означає частину антигену, з яким специфічно зв'язується антитіло. Епітопи, як правило, складаються 3з хімічно активних (наприклад, полярних, неполярних і гідрофобних) поверхневих скупчень функціональних груп, таких як амінокислоти або бічні ланцюги полісахаридів, і можуть мати специфічні тривимірні структурні характеристики, а також специфічні характеристики зарядів. Епітоп може складатися із замінних
Зо та/або незамінних амінокислот, які утворюють конформаційну просторову одиницю. Для незамінного епітопу амінокислоти з різних частин лінійної послідовності антигену опиняються в безпосередній близькості у З-вимірному просторі в результаті згортання білкової молекули.
Типовим епітопом є домен І пи5Т2., представлений у 5ЕО ІЮО МО: 9.
У контексті даного документа термін "паратоп" означає частину антитіла, з яким специфічно зв'язується антиген. Паратоп може мати лінійну природу або може бути переривчастий, утворений просторовим взаємозв'язком між незамінними амінокислотами антитіла, а не лінійною низкою амінокислот. "Паратоп легкого ланцюга" і "паратоп важкого ланцюга" або "амінокислотні залишки паратопа легкого ланцюга" і "амінокислотні залишки паратопа важкого ланцюга" відносяться до залишків легкого ланцюга і залишків важкого ланцюга антитіла в контакті з антигеном, відповідно.
У контексті даного документа термін "специфічне зв'язування" або "специфічно зв'язується" відноситься до зв'язування антитіла з заданим антигеном з білошою аффінністю, ніж для інших антигенів або білків. Як правило, антитіло зв'язується із заданим антигеном з константою дисоціації (Ко) 1х10-7 М, або менше, наприклад, 1х108 М, або менше, 1х109 М, або менше, 1х10-9 М, або менше, 1х10-7 М, або менше, або 1х10-72 М, або менше, типово з Ко, що принаймні в десять разів менше, ніж його Ко, для зв'язування з неспецифічним антигеном (наприклад, бичачим сироватковим альбуміном (В5БА), казетом або будь-яким іншим специфічним поліпептидом). Константу дисоціації можна виміряти з використанням стандартних процедур. Однак антитіла, які специфічно зв'язуються з заданим антигеном, можуть мати перехресну реактивність до інших споріднених антигенів, наприклад, до того самого заданого антигена з інших видів (гомологів), таких як людина чи мавпа, наприклад, Масаса Газсісціагіб (яванський макак (СупотоїЇдив)).
У контексті даного документа термін "біспецифічний" відноситься до антитіла, яке зв'язує два різних антигени або два різних епітопи в межах антигена.
У контексті даного документа термін "моноспецифічний" відноситься до антитіла, яке зв'язує один антиген або один епітоп.
У контексті даного документа термін "у комбінації 3" означає, що описані агенти можна ввести в організм тварини разом у вигляді суміші, одночасно у вигляді окремих агентів або послідовно у вигляді окремих агентів у будь-якому порядку. 60 У контексті даного документа термін "запальний стан" відноситься до гострих або хронічних локалізованих або системних реакцій на шкідливі подразники, такі як патогени, ушкоджені клітини, фізична травма або подразники, які частково опосередковані активністю цитокінів, хемокінів або запальних клітин (наприклад, нейтрофіли, моноцити, лімфоцити, макрофаги), і характеризується у більшості випадків болем, почервонінням, набряком і порушенням функції тканини.
У контексті даного документа термін "ЗТ2І -опосередкований запальний стан" відноситься до запального стану в результаті, принаймні частково, недоцільної активації сигнального шляху
ЗТ2. Типовими 5Т2І -опосередкованими запальними захворюваннями є астма й алергії.
У контексті даного документу термін "ЗТ2І -опосередкований запальний стан" включає в себе всі захворювання і медичні стани, при яких 512! прямим або непрямим чином відіграє роль у захворюванні або медичному стані, у тому числі причинно- наслідковому зв'язку, розвитку, прогресуванні, тривалості чи патології захворювання або стану.
У контексті даного документа термін "біологічна активність З5Т2І" відноситься до будь-якої активності, що виникає в результаті зв'язування ліганда 5121 1І/-33 із 5712. Типові результати біологічної активності 5Т2І. зумовлюють активацію МЕ-кВ у відповідь на 1-33. Активацію МЕ-кВ можна проаналізувати з використанням аналізу гена-репортера при індукції 5Т2!. за допомогою
І/-33 (Ригзом єї аї., Нубгідота 30: 153-62, 2011). Інші типові біологічні активності 5121. призводять до проліферації клітин Тп2 або секреції прозапальних цитокінів та хемокінів, наприклад, 1-5, ЯМ'С5Е, ЇЇ -8, ІІ -10 або 1-13. Вивільнення цитокінів і хемокінів із клітин, тканин або в кровообігу можна виміряти з використанням добре відомих імунологічних аналізів, таких як імуноаналіз ЕГ І5А.
Термін "вектор" означає полінуклеотид, здатний до дублювання в біологічній системі або який можна перемістити між такими системами. Полінуклеотиди вектора, як правило, містять елементи, такі як точки початку реплікації, сигнал поліаденілювання або маркери селекції, які функціонують для полегшення дублювання або підтримання даних полінуклеотидів у біологічній системі. Приклади таких біологічних систем можуть включати в себе клітину, вірус, тварину, рослину і відновлені біологічні системи, що використовують біологічні компоненти, здатні дублювати вектор. Полінуклеотид, що включає вектор, може бути молекулою ДНК або РНК чи їхнім гібридом.
Зо Термін "вектор експресії" означає вектор, який можна використати в біологічній системі або у відновленій біологічній системі для спрямування трансляції поліпептиду, кодованого полінуклеотидною послідовністю, яка присутня у векторі експресії.
Термін "полінуклеотид" означає молекулу, яка включає ланцюг нуклеотидів, ковалентно зв'язаних між собою цукор-фосфатним скелетом або іншим еквівалентним ковалентним хімічним зв'язком. Подвійно- і одноланцюгові ДНК і РНК є типовими прикладами полінуклеотидів.
Термін "поліпептид" або "білок" означає молекулу, яка містить принаймні два амінокислотні залишки, з'єднані пептидним зв'язком з утворенням поліпептиду. Малі поліпептиди, що містять менше 50 амінокислот, можна називати "пептидами".
Загальноприйняті одно- і трибуквені коди амінокислот, які використовуються в даному документі наступним чином: код код
Аланн. | аа | А
Аргінін | ад 9 | В
Аспартат/ | ар | 0
Глутамн. | сп | 0 2 я; /
Гліцин. | оду | в г КВВЄЮЄ
Пзолейцин. | й | 1
Пролн. | ро | Р код код
Композиції речовини
У винаході запропоновано антитіла, які специфічно зв'язують 5121. та інгібують біологічну активність 5121, і застосування таких антитіл. Винахідники зробили несподіване відкриття, що антитіла, які зв'язують домен І людського 5121 (ЗЕО ІО МО: 9), блокують взаємодію 1 -33/5121. та інгібують спектр біологічних активностей 5121, у тому числі ІІ -33-індуковані відповіді тучних клітин, тоді як антитіла, що зв'язують домен ІЇЇ людського 5121. (5ЕО ІЮ МО: 11), не блокують взаємодію ІІ -33/5Т21,, хоча вони інгібують спектр біологічних активностей 5121. Однак антитіла, які зв'язують домен Ії, мають знижений або відсутній ефект інгібування або, в деяких випадках, стимулюють ІІ -33-індуковані відповіді тучних клітин.
У деяких варіантах втілення, описаних у даному документі, антитіла, які блокують взаємодію
І/-33/5Т121Ї та інгібують спектр біологічних активностей З1Т2ІЇ, у тому числі І -3З-індуковані відповіді тучних клітин, зв'язують епітоп у межах домену | людського 5121, (КСРКОСКРОУУТМУОММ; ЗЕО ІЮО МО: 210) і, необов'язково, амінокислотні залишки 5121. Т93 і 94 (нумерація залишків відповідно до ЗЕО ІЮО МО: 1).
Термін "відповідь тучних клітин" або "активність тучних клітин" відноситься до 1І-33- індукованого вивільнення цитокінів, таких як ЗМ'С5Е, 1-8, 1-5, 11-13 ї 1-10, та алергічних медіаторів, таких як простагландин 02, із тучних клітин.
У винаході запропоновано антиген-зв'язуючі ділянки, які зв'язують домен | людського 5121, як описано в даному документі. Структурою для перенесення антиген- зв'язуючої ділянки, як правило, є антитіло МН або МІ.
Антитіла згідно даного винаходу, як описано в даному документі, можуть бути антагоністом виділеного людського або адаптованого до людини антитіла чи його фрагмента, що специфічно зв'язує домен І (ЗЕО ІО МО: 9) людського 512. Типовим антитіл-зв'язуючим доменом людського 5121 (5ЕО ІО МО: 9) є антитіло 5ТІМ15 (С2244), що містить послідовності НСОКІ,
НСОВ2 ії НСОВЗ 5ЕО ІО МО: 23, 27 і 31, відповідно, і послідовності ЇСОР1, І СОР2 і ГСОВЗ із
ЗЕО ІЮ МО: 35, 39 і 43, відповідно, або антитіло С2494 (5ТІ Мб62), що містить послідовності
НСОР1, НСО2 ІНСОВЗ із 5ЕО ІЮ МО: 24, 28 і 32, відповідно, і послідовності /СОР1, І СО2 і
ІЇСОЗ із БЕО ІО МО: 36, 40 і 44, відповідно (Таблиця 3). Додатковими типовими антитілами, що зв'язують домен І людського 5121, є антитіла, представлені в Таблиці 16 і на фіг. 13, наприклад, антитіла 5ТІМ103, 5ТІМ107, 5ТІМ108, 5ТІМ123, 5 М124, 5ТІМ208, 5 М209, 5ТІ М210,
ЗТІМ211, 5ТІ М212 їі 5ТІМ213. Типові антагоністи людського антитіла показано на фіг. 12 і фіг. 13. Типові адаптовані до людини антагоністи наведено в Таблиці 14.
У деяких варіантах втілення, описаних у даному документі, антагоніст виділеного людського або адаптованого до людини антитіла чи його фрагмента, що специфічно зв'язує домен І (ЗЕО
ІО МО: 9) людського 5121, блокує взаємодію ІІ. -33/5Т21.
Антитіла можна протестувати на їхню здатність блокувати взаємодію 1І-33/5Т121 за допомогою стандартного аналізу ЕГІЗА. Наприклад, планшети покривають позаклітинним доменом людського 512 (пизТ2І-ЕСО) і інкубують з антитілом, після чого вимірюють зв'язування біотинільованого 1-33 на планшетах. Антитіла, які "Слокують взаємодію ІІ -33/5Т21" або "інгібують взаємодію 1 -33/51 21 ", - це антитіла, які в аналізі ЕГІЗА з використанням пластин із покриттям пи5Т21І-ЕСО знижують сигнал, отриманий від біотинільованого 1-33, зв'язаного з пластиною, принаймні на 30 95, 40 95, 50 95, бО о, 70 У, 75 0, 80 95, 85 95, 90 Уо, 95 У, 96 9о, 97 Фо, 98 95, 99 95 або 100 95 при концентрації антитіл 50 мкг/мл, у порівнянні із зв'язуванням ЇЇ - 33 у відсутності антитіла.
Антитіла можна протестувати на інгібування ними відповідей тучних клітин шляхом оцінки їхньої інгібуючої активності, наприклад, на вивільнення ЗМ'С5Е, 1-5, ІІ -10 або 1-13 тучними клітинами, отриманими з людської пуповинної крові, або первинними тучними клітинами людських легенів із використанням стандартних способів і способів, наведених у прикладах іпіта (нижче). У контексті даного документа антитіла, які "інгібують відповідь тучних клітин" або "інгібують активність тучних клітин", являють собою антитіла, які знижують ІІ -33-індуковану 1-3 нг/мл секрецію ЗМ'С5Е, ЇЇ -5, І -13 або ІІ -10 принаймні на 40 95, 45 95, 50 95, 55 У, 60 95, 65 9, 70 965, 75 95, 80 96, 85 95, 90 96, 95 96, 96 в, 97 96, 98 96, 99 95 або 100 95 при концентрації 10 мкг/мл, у порівнянні з тучними клітинами, що не оброблені антитілом. Зазвичай тучні клітини можна отримати з попередників СО34- з пуповинної крові людини або легеневої паренхіми і малих дихальних шляхів за допомогою добре відомих способів, наведених у прикладах іпігта.
Умови для культивування тучних клітин можуть впливати на ступінь інгібування для антитіла у процентах, і, отже, умови культивування і досліджень можна підтримувати згідно стандарту з використанням, наприклад, середовища 5БіетРго-34 протягом 6-10-тижневої процедури диференціації. За 4 дні до початку аналізу вивільнення цитокінів тучні клітини щоденно стимулюють 10 нг/мл 1-4, 10 нг/мл 1-6 ії 100 нг/мл ЗСЕ. Для аналізу цитокінів тучні клітини можна повторно суспендувати у свіжому середовищі 5іетРго-34 або ЕРМІ, що містить 10 95
ЕСЗ без антибіотиків, з 100 нг/мл ЗСР. Відповідні щільності посіву для аналізів становлять від 65 000 до 75 000 клітин/0,16 мл/лунку. Типовими антитілами згідно даного винаходу, описаними у даному документі, що інгібують відповіді тучних клітин, є антитіла 5ТІМ15, 5ТІ Мб62 і
ЗТ М208. Антитіло СМТО3914 зв'язує домен І 5Т12Ї мишей без перехресної реактивності до людського 5721. та інгібує відповіді тучних клітин у клітинах мишей.
Фахівцям у даній галузі буде зрозуміло, що відповіді тучних клітин також включають вивільнення 1//-1 ії І/-32 і хемокінів, таких як ССІ1, ССІ4, СС15, ССІ18 ії ССІ23, а також алергічних медіаторів, таких як цистеїнові лейкотрієни, гістамін, а також різноманітних протеаз тучних клітин, у тому числі триптази, хімази, карбоксипептидази й катепсину 0. Антитіла згідно даного винаходу, описані в даному документі, можна протестувати на їхню здатність пригнічувати ці додаткові відповіді тучних клітин із використанням стандартних способів. Можна очікувати, що антитіла згідно даного винаходу, які зв'язують домен І 5121. і блокують взаємодію
І -33/5Т2Ї, як описано в даному документі, інгібуватимуть ці додаткові відповіді тучних клітин принаймні на 40 95, 50 95, 60 Зо, 70 90, 75 Зо, 80 95, 85 95, 90 о, 95 95, 96 95, 97 У, 98 95, 99 90 або більше при дослідженні в цих умовах при мінімальній концентрації 10 мкг/мл.
Антитіла згідно даного винаходу, як описано у даному документі, зв'язують людський 5121. з константою дисоціації (Ко) між приблизно 5х1072 М до приблизно 7х10-79 М, прямою константою (Кпряма) до людського 512! між приблизно 2х105 М-157 до приблизно 1х105 М157 або зворотною константою (Кзворотня) до людського 5121. між приблизно 1х105 57 до приблизно 1х102 87. Наприклад, антитіла згідно даного винаходу, описані у даному документі, зв'язують людський 5Т2Ї з Ко меншою, ніж приблизно 7х1079 М, меншою, ніж приблизно 1х1079 М,
Ко) меншою, ніж приблизно 5х107! М, меншою, ніж приблизно 1х107! М, або меншою, ніж приблизно 5х1072 М.
Антитіла згідно даного винаходу, як описано у даному документі, можуть перехресно реагувати з Масаса Тазсісціагіє (супо) 5121 (5БО ІЮ МО: 2) і зв'язуватись з 5121 супо з константою дисоціації (Ко) між приблизно 3х1072 М до приблизно 2х109 М, прямою константою (Кпряма) до 5121 супо між приблизно 4х106 М-157 до приблизно 1х108 М-157 або зворотною константою (Кзворотня) до 512Ї супо між приблизно 7х105 87 до приблизно 1х10- 87.
Наприклад, антитіла згідно даного винаходу, описані в даному документі, зв'язують 512. супо з
Ко меншою, ніж приблизно 2х109 М, меншою, ніж приблизно 1х107 М, меншою, ніж приблизно 1х1079 М, меншою, ніж приблизно 1х10-! М, або меншою, ніж приблизно 3х1072 М.
Аффінність антитіл до 5Т2Ї можна визначити експериментально з використанням будь- якого відповідного способу. У таких способах можуть застосовуватися вимірювальні прилади
РгоїєОп ХРЕЗ6, Віасоге 3000 або КіпЕХА, аналізи ЕГІ5А або аналізи конкурентного зв'язування, відомі фахівцям у даній галузі. Виміряна аффінність конкретної взаємодії антитіла/5Т2!. може змінюватися, якщо вимірюється в різних умовах (наприклад, осмолярність, рН). Таким чином, вимірювання аффінності та інших параметрів зв'язування (наприклад, Ко, Кпряма, Кзворотня) переважно проводять зі стандартними умовами та стандартизованим буфером, такими як буфер, описаний у даному документі. Фахівцям у даній галузі буде зрозуміло, що внутрішня помилка при вимірюванні аффінності, наприклад, із використанням Віасоге 3000 або Ргоїеоп (вимірюється як стандартне відхилення, 50), може бути, як правило, у межах 5-33 95 для вимірювання у типових межах виявлення. Таким чином, термін "приблизно" відображає типове стандартне відхилення в аналізі. Наприклад, типове 50 для Ко 1х1079 М становить дож0,33х107
М.
Антитіла, які зв'язують людський 5121 з бажаною аффінністю і які необов'язково перехресно реагують з 5Т2Ї супо, можна вибрати з-поміж бібліотек різновидів або фрагментів шляхом панорамування з людським і/або 5121 супо, і, необов'язково, шляхом додаткового дозрівання аффінності антитіл. Антитіла можна ідентифікувати на основі інгібування ними біологічної активності 5121 із використанням будь-якого відповідного способу. У таких способах можуть застосовуватися аналізи гена-репортера або аналізи, в яких вимірюється продукування цитокінів із використанням добре відомих способів, і як описано в заявці. 60 Одним із варіантів втілення даного винаходу є антагоніст виділеного антитіла, який специфічно зв'язує людський 5121, що містить: область, що визначає комплементарність, важких ланцюгів (НСОК) 1 (НСОКТ) із БЕО ІЮ МО: 160 (ХіХ2ХзМуХа); де
Хі єЄ5,Е,0О,1, с або М;
Хгє М або 0;
Хзє А, О або 5; і
Ха є 5, Е або І;
НСОК 2 (НСОКЗ) із БЕО ІО МО: 161 (ХІХвахХ?сахХв Хе АрЗМУКИ); де Х»5 є А, 5, Т, М або 0;
Хеє 5, К,Е,К, б або А;
Х7 є 5, Е або М;
Хеє5, КЕ, б, ТТ, ЮБабод;іХо єм, Ор, М, А або 5; і
НСОК З (НСОКЗ) із ЗЕО ІО МО: 162 (ХіоХи1МуЗТЕОЗЕЕМІ БУ); де
ХіоєО,А,,М,О, Р,Е,І, Н, 5, Табо М; і
Хі єЄР,А,Н,М,Е, О, ГІ, 5, М, Т, М або І.
Іншим варіантом втілення даного винаходу є антагоніст виділеного антитіла, який специфічно зв'язує людський 5Т21., що містить: область, що визначає комплементарність, легких ланцюгів (СОК) 1 (СОР) із БЕО ІЮ МО: 163 (ВАБОЗМООЮХ 12! А); де
Хіг6- є А або 0; сок 2 (СО) із БЕО І МО: 90 (ОАЗМЕАТ); і
І СОК 3 (І СО) із ЗЕО ІЮ МО: 164 (0ООХізх14х15х16х17х187); де
Хізє Е або х;
Хі Є М, І або М;
ХіБЄМ, о, О або Т;
Хієє ММ або А;
Хі; є Р або видалено; і Хв є І або І.
Антитіла згідно даного винаходу, що містять НСОКІ, НСОК2, НСОКЗ, І СО, І СОК2 і
ГСОМЗ послідовності БЕО І МО: 160, 161, 162, 163, 90 і 164, відповідно, можна отримати добре відомими способами мутагенезу з використанням, наприклад, НСОКІ, НСОМ2, НСОКЗ, І СОКІ1,
ГСОК2 і СОМКЗ послідовностей 5ЕО ІЮО МО: 78, 81, 84, 87, 90 і 92, відповідно, як матриці. СОК важких ланцюгів і СОК легких ланцюгів із «ЕС ІЮО МО: 160, 161, 162, 163, 90 ї 164, відповідно, може бути трансплантовано на каркаси людського походження, наприклад, такі каркаси, що описані іпіта. Антитіла можна проаналізувати на зв'язування із 512ІЇ і на їхню здатність блокувати взаємодію ІІ -33/5Т21. та інші характеристики, такі як аффінність до людського 5121. іабо 5121. супо, та інгібування відповідей тучних клітин із використанням способів, описаних у даному документі.
В одному варіанті втілення антагоніст виділеного антитіла, який специфічно зв'язує людський 5121, як описано в даному документі, містить:
НОСОК із ЗЕО ІО МО: 78 або 95-108;
НСОК2 із ЗЕО ІО МО: 81, 109-118 або 120-129;
НСОКЗ із ЗЕО ІО МО: 84 або 165-185;
ІЇСОК' із БЕО ІО МО: 87 або 130;
СО із БЕО ІО МО: 90; і
ІЇСОКЗ із БЕО ІО МО: 92 або 131-134.
В іншому варіанті втілення антагоніст виділеного антитіла, який специфічно зв'язує людський 512, містить послідовності НСОКІ, НСОК2, НСОКЗ, 1 СОК1, 1 СОК2 і СОКЗ, як показано на фіг. 10, фіг. 11 ї фіг. 12 і як описано в даному документі.
В іншому варіанті втілення антагоніст виділеного антитіла, який специфічно зв'язує людський 5121, як описано в даному документі, містить:
НОСОК із ЗЕО ІЮ МО: 23 або 24;
НСОК2 із ЗЕО ІО МО: 27 або 28;
НСОКЗ із ЗЕО ІО МО: 31 або 32;
ІЇСОК' із БЕО ІО МО: 35 або 36;
СОМ? із БЕО ІО МО: 39 або 40; ії СОКЗ із БЕО ІО МО: 43 або 44.
В іншому варіанті втілення антагоніст виділеного антитіла, який специфічно зв'язує людський 512Ї, як описано в даному документі, містить послідовності НСОК'І,
НеСОоК2, НСОКЗ3, І СОКІ СОК2і1 СОКЗ: (510) ЗЕО ІЮ МО: 23, 27, 31, 35, 39 і 43, відповідно;
ЗЕО ІЮ МО: 24, 28, 32, 36, 40 і 44, відповідно; (НЕА СОК);
ЗЕО ІЮ МО: 24, 28, 146, 36, 40 і 147, відповідно; або
ЗЕО ІЮ МО: 24, 28, 146, 36, 40 і 44, відповідно.
Іншим варіантом втілення даного винаходу є антагоніст виділеного людського або адаптованого до людини антитіла чи його фрагмента, що специфічно зв'язує людський 5121, як описано в даному документі, (ЗЕО ІЮ МО: 1), що містить варіабельну область важких ланцюгів (МН), що містить каркас УН, отриманий із людських каркасних послідовностей ІЗНМ3-23 (ЗЕО 10
МО: 158), ІЖНМ1-24701 (5ЕО ІО МО: 148) або ІЄНМ1-Й01 (5ЕО ІО МО: 149), і варіабельну область легких ланцюгів (МІ), що містить каркас Мі, отриманий із людських каркасних послідовностей ІЗКМ3-11 (І 6) (5ЕО ІЮО МО: 159), І2КМ3-15701 (12) (5ЕО ІЮ МО: 150), ІКМ1-9701 (18) (5ЕО І МО: 151), І2КМ1-5701 (І 12) (ЗЕО ІЮ МО: 152), І2КМ1-12701 (15) (ЗЕО І МО: 153),
ІШКМ1-39701 (012) (ЗЕО І МО: 154), І2КМ1-27701 (А2О) (ЗЕО ІО МО: 155) або ІСКМ1-33701 (018) (ЗЕО ІО МО: 156).
В іншому варіанті втілення виділене антитіло, що специфічно зв'язує домен | людського
ЗІ2Ї, як описано в даному документі, містить МН, що включає каркас МН, отриманий із людських каркасних послідовностей МН 3-23 (ЗЕО ІО МО: 158); і варіабельну область легких ланцюгів (МІ), що містить каркас МІ, отриманий із людських каркасних послідовностей Мк 16 (ЗЕО ІЮ МО: 159). Каркасні послідовності людського походження добре відомі і, як правило, включають послідовності варіабельної області зародкової лінії людського імуноглобуліну, приєднані до послідовностей з'єднання (у). Каркасна амінокислотна послідовність людського походження МН 3-23, представлена у 5ЕО ІО МО: 158, включає послідовність людської зародкової лінії МН 3-23, з'єднану з ІЗНО4, і каркасна амінокислотна послідовність людського походження УК 1.6, представлена у ЗЕО ІЮО МО: 159, включає послідовність людської зародкової лінії Мк 16, з'єднану з ІБК, як описано у Пі еї аї., У Мої Віої 397:385-96, 2010; публ. міжнар. заявці на патент Мо УУО2009/085462; і публ. заявці на патент США Мо О52010/0021477. Типові антитіла, які мають послідовність МН, отриману з людського МН 3-23, і послідовність МІ, отриману з людського Ук І 6, показано на фіг. 12 і фіг. 13.
Людські або адаптовані до людини антитіла, що включають варіабельні області важких або легких ланцюгів, "отриманих з" окремого каркасу або послідовності зародкової лінії, відносяться
Зо до антитіл, отриманих із системи, що використовує гени імуноглобуліну людської зародкової лінії, наприклад, із трансгенних мишей або з бібліотек фагового дисплея, як розглянуто іпіта.
Антитіло, "отримане з" окремого каркасу або послідовності зародкової лінії, може містити відмінності в амінокислотах у порівнянні з послідовністю, з якої його було отримано, як наслідок, наприклад, природніх соматичних мутацій або навмисних заміщень.
В іншому варіанті втілення антагоніст виділеного людського або адаптованого до людини антитіла чи його фрагмента, який специфічно зв'язує домен І (5ЕО ІО МО: 9) людського 5121, як описано в даному документі, конкурує за зв'язування з людським 5121 (5ЕБЕО ІЮ МО: 1) із виділеним антитілом, що містить варіабельну область важких ланцюгів (МН) із ЕО ІЮ МО: 47 і варіабельну область легких ланцюгів (МІ) із ЗЕО ІЮ МО: 51 (антитіло С2244).
В іншому варіанті втілення виділене антитіло згідно даного винаходу, як описано в даному документі, зв'язує людський 512Ї на амінокислотних залишках 35-48 5БО ІЮО МО: 1 (КСРКОСКРОУТУМОМУУ; ЗЕБЕО ІЮ МО: 210). Антитіло, як описано у даному документі, може додатково зв'язувати людський 512 на амінокислотних залишках Т93 і Е94 із БЕО ІЮО МО: 1.
Аналіз конкуренції між специфічним зв'язуванням із людським 5121. антитіл згідно даного винаходу, як описано в даному документі, що містять певні амінокислотні послідовності НСОК'І,
НСОК2 і НСОКЗ, і 1 СОР1, СО і 1 СОв3 або містять певні послідовності МН і МІ, можна проводити іп міго з використанням добре відомих способів. Наприклад, зв'язування М5ЮО би о-
Тад'м МНЗ-ефір-міченого антитіла з людським 512 у присутності неміченого антитіла можна проаналізувати за допомогою аналізів ЕГІЗА або Віасоге, або, для демонстрації конкуренції з антитілами згідно даного винаходу, можна використати проточну цитометрію. Здатність тестованого антитіла інгібувати зв'язування С2244 із людським 5121 показує, що тестоване антитіло може конкурувати з цими антитілами за зв'язування з людським 512. Такі типові антитіла С2494, 5ТІ М208 і 5ТІ М213 показано в Таблиці З і на Фіг. 13.
Антитіла, що конкурують з С2244 за зв'язування з доменом І 512, як описано в даному документі, блокують взаємодію ІІ -33/5Т121 та інгібують спектр біологічної активності 5121, у тому числі І -3З-індуковані відповіді тучних клітин. Ненейтралізуючий (тобто неінгібуючий) епітоп також присутній на домені І 5Т2Г. у ролі другої конкурентної групи антитіла (представлена антитілом С2240, яке зв'язує домен І 5121, не конкурує з С2244 і не інгібує сигналізацію 5121).
Антитіла згідно даного винаходу, які, як описано у даному документі, зв'язують специфічні бо домени або епітопи 5Т2І, можна отримати шляхом імунізації мишей, що експресують локуси людського імуноглобуліну (Гопрегу еї аї., Маїшге 368:856-9, 1994; Рівпм/Ій еї аї., Маїшге
ВіоїесппоЇоду 14:845-51, 1996; Мепае? сеї а!., Майиге Сепеїїсв 15:146-56, 1997, патенти США МоМо 5,770,429, 7,041,870 і 5,939,598) або мишей лінії ВаІБ/с із пепгидами, що кодують епітопи, наприклад, пептидом, що має амінокислотну послідовність домену | людського 5121:
КЕЗКОЗУаЇ ЕМЕА ІМАСРАОСКРОУ ТОМ УУБОТМКОІРТОЕАМАМЕАБЗОО І КЕ РААМАЮВИЇУ
ТСІМе5РТЕМКТОМАММТІМККОЗОСММРОМІ МУБТМ (ЗЕО ІО МО: 9), або пептидом, що має амінокислотну послідовність ЕСРКОСКРОЗУТМОММ (ЗЕО ІЮО МО: 210), і за допомогою способу гіобридоми КопПіег еї аї., Майшиге 256:495-97, 1975. Отримані антитіла тестують на їхнє зв'язування з епітопом із використанням стандартних способів. Наприклад, коли структури обох окремих компонентів є відомими, щоб визначити сумісні ділянки взаємодії, можна провести стикування (докінг) "білок-білок" іп 5іїсо. Для картування областей на антигені, який може бути пов'язаний з антитілом, можна здійснити воднево-дейтерієвий обмін (Н/О) із комплексом антигену й антитіла.
Щоб знайти амінокислоти, важливі для зв'язування антитіла, можна застосувати сегментарний і точковий мутагенез антигену.
Ідентифіковані тАбБ можна додатково модифікувати введенням змінених підтримуючих залишків каркасу, щоб зберегти аффінність зв'язування за допомогою способів, наприклад, розкритих у Оцееп еї аїЇ., Ргос Май Асай 5сі (БА) 86:10029-32, 1989 і Нодозоп еї аї.,
Віо/Тесппоіоду 9:421, 1991.
Антитіла згідно даного винаходу, як описано в даному документі, можуть бути людськими або адаптованими до людини. Антитіла згідно даного винаходу, як описано в даному документі, можуть бути типу ІдА, ІдО, І9Е, Ід або ДМ.
Антитіла, амінокислотні послідовності антиген-зв'язуючих ділянок яких є, по суті, ідентичними тим, що показані на фіг. 10, фіг. 11, фіг. 12, фіг. 13, фіг. 15, у Таблиці 3, Таблиці 9 і
Таблиці 12, знаходяться в рамках даного винаходу. Як правило, це включає одне або кілька амінокислотних заміщень з амінокислотою, що має аналогічний заряд або гідрофобні або стереохімічні характеристики, і проводиться для покращення властивостей антитіл, наприклад, стабільності або аффінності. Наприклад, консервативне заміщення може включати заміщення нативного амінокислотного залишку неприроднім залишком таким чином, що вплив на полярність або заряд амінокислотного залишку в цьому положенні або малий, або відсутній.
Крім того, будь-який нативний залишок у поліпептиді також можна замістити аланіном, як описано вище, для аланін-скануючого мутагенезу (Масі еппап еї аї!., Асіа Рпузіої Зсапа Зиррі 643:55-67, 1998; Зазакі еї а. Айм Віорпуб 35:1-24, 1998). Фахівці у даній галузі можуть визначити бажані заміщення амінокислот (консервативні або неконсервативні) на момент, коли такі заміщення є бажаними. Наприклад, заміщення амінокислот можна використати для ідентифікації залишків, важливих для функції антитіл, таких як залишки, що впливають на аффінність, або залишки, які надають небажаних властивостей, таких як агрегація. Типові заміщення амінокислот показано на фіг. 12 і фіг. 13.
На відміну від антиген-зв'язуючих ділянок, заміщення в каркасних областях також можна проводити, якщо вони не мають негативного впливу на властивості антитіла.
Каркасні заміщення можна проводити, наприклад, на залишках Мегпіег 2опе (патент США Мо 6,649,055) для покращення аффінності або стабільності антитіла. Щоб зменшити можливу імуногенність, можна також проводити заміщення в тих каркасних позиціях в антитілі, які відрізняються послідовністю в порівнянні з гомологічними генними послідовностями людської зародкової лінії. Ці модифікації можна здійснити, наприклад, з антитілами, отриманими з бібліотек антитіл де помо, таких як бібліотеки ріх.
Консервативні амінокислотні заміщення охоплюють також амінокислотні залишки, що не зустрічаються в природі, як правило, включені шляхом хімічного синтезу пептидів, а не синтезом у біологічних системах. Амінокислотні заміщення можна провести, наприклад, за допомогою ПЛР-мутагенезу (патент США Мо 4,683,195).
Бібліотеки різновидів можна генерувати з використанням добре відомих способів, наприклад, із використанням випадкових (ММК) або невипадкових кодонів, наприклад, ОМК кодонів, які кодують 11 амінокислот (АСОЕСКМА5МУМІ), і скринінгу бібліотек або різновидів із бажаними властивостями.
Незважаючи на те, що варіанти втілення, проілюстровані на Прикладах, включають пари варіабельних областей, пари повнорозмірних ланцюгів антитіл або пари областей СОКІ, СОМК2 і СОКЗ, одна з важкого ланцюга й одна з легкого ланцюга, фахівцеві в даній області буде зрозуміло, що альтернативні варіанти втілення можуть включати одиночні варіабельні області важких ланцюгів або одиночні варіабельні області легких ланцюгів, одиночні повнорозмірні ланцюги антитіл або області СОКІ, СОК2 і СОКЗ з одного ланцюга антитіла, важкого або бо легкого. Одиночну варіабельну ділянку, повнорозмірний ланцюг антитіла або область СОКІ,
СОК2 і СОКЗ одного ланцюга можна використати для скринінгу на відповідні домени в іншому ланцюзі, два ланцюги здатні утворювати антитіло, яке специфічно зв'язує 5Т2. Скринінг можна здійснити за допомогою способів скринінгу фагового дисплея з використанням, наприклад, комбінаторного ієрархічного подвійного підходу, описаного в публікації договору про патентну кооперацію (РСТ) Мо МУО1992/01047. При такому підході окремі колонії, що містять клон або НУ-, або Ї- ланцюга, використовують для інфікування повної бібліотеки клонів, що кодують інші ланцюги (Ї або Н), і отриманий дволанцюговий специфічний антиген-зв'язуючий домен обирають відповідно до методів фагового дисплея, як описано.
У винаході запропоновано виділені домени МН і Мі антитіл згідно даного винаходу, як описано в даному документі, й антитіла, що містять визначені домени МН і Мі. Варіабельні області МН і МІ. для деяких антитіл згідно даного винаходу, як описано в даному документі, показано на фіг. 13 і в Таблиці 12.
Один із варіантів втілення даного винаходу - антагоніст виділеного людського або адаптованого до людини антитіла чи його фрагмента, який специфічно зв'язує домен І (ЗЕО ІЮ
МО: 9) людського 5121, що містить УН, принаймні на 90 95 ідентичний до ЗЕО ІЮ МО: 191.
Інший варіант втілення даного винаходу - антагоніст виділеного людського або адаптованого до людини антитіла чи його фрагмента, який специфічно зв'язує домен І (ЗЕО ІЮ
МО: 9) людського 5121, що містить МІ, принаймні на 94 95 ідентичний до МІ 5ЕО ІЮО МО: 209.
У деяких варіантах втілення даного винаходу, описаних у цьому документі, пропонується антитіло, що містить МН із БЕО ІЮО МО: 143, 144, 145, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204 або 205.
У деяких варіантах втілення даного винаходу, описаних у цьому документі, пропонується антитіло, що містить МІ із ЗЕО ІЮО МО: 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 206, 207, 208 або 209.
У деяких варіантах втілення даного винаходу, описаних у цьому документі, пропонується антитіло, що містить:
МН із ЗЕО ІЮО МО: 186, 187, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204 або 205 і МІ із БЕО ІЮ МО: 206;
МН із ЗЕО ІЮ МО: 195 або 196 і МІ із ЗЕО ІЮ МО: 207;
Коо) МН із ЗЕО ІЮ МО: 188, 189 або 190 і МІ із БЕО ІО МО: 208; або
МН із ЗЕО ІЮ МО: 187, 191, 192, 193 або 194 і МІ із БЕО ІО МО: 209.
В іншому варіанті втілення даного винаходу пропонується антагоніст виділеного людського або адаптованого до людини антитіла чи його фрагмента, який специфічно зв'язує домен І (ЗЕО
ІО МО: 9) людського 512, що містить:
НОСОК із БЕО ІО МО: 97;
НОСОК? із БЕО ІО МО: 114;
НСОКЗ із БЕО ІЮО МО: 84; -СОКІ із БЕО ІО МО: 130;
СО їз БЕО ІО МО: 90;
ІЇСОКЗ із БЕО ІО МО: 134; або
МН із ЗЕО ІЮ МО: 191 і МІ із ЗЕО ІЮ МО: 209
Людські тАбБ, в яких відсутні будь-які послідовності не людського походження, можна підготувати і оптимізувати з бібліотек фагового дисплея за допомогою методів, що згадуються в, наприклад, Кпаррік еї аї., У Мої Віо! 296:57-86, 2000; і Кгебрз еї аї., У Іттипої Мей 254:67-84 2001. У типовому способі антитіла згідно даного винаходу виділяють із бібліотек, які експресують варіабельні області важких і легких ланцюгів антитіла у вигляді гібридних білків з оболонковим білком бактеріофага РІХ. Бібліотеки антитіл піддають скринінгу на зв'язування з людським 5121 -ЕСО та додатково характеризують отримані позитивні клони, Раб виділяють із лізатів клонів й експресують як повнорозмірні до. Типові бібліотеки антитіл і способи скринінгу описано в Пі еї аїЇ., У Мої! ВіоЇ 397:385-96, 2010; публ. міжнар. заявці на патент Мо
УМО2009/085462, і публ. США Мо 12/546850; патентах США МоМо 5,223,409, 5,969,108 і 5,885,793).
Для заміни певних каркасних залишків на ті, що присутні у відповідній людській зародковій лінії, отримані тАбр можна додатково модифікувати в їхніх каркасних областях.
Імунні ефекторні властивості антитіл згідно даного винаходу можна посилити або пригнітити через Ес-модифікації за допомогою методів, відомих фахівцям у даній галузі. Наприклад, Ес- ефекторні функції, такі як зв'язування Сід, комплемент-залежна цитотоксичність (СОС), антитіла-залежна клітинно-опосередкована цитотоксичність (АЮСС), фагоцитоз, негативна регуляція рецепторів клітинної поверхні (наприклад, В- клітинного рецептора; ВСЕ) і т. п. можна бо реалізувати та/"або контролювати шляхом модифікування залишків у Ес, що відповідає за ці дії.
Фармакокінетичні властивості також можна посилити шляхом мутації залишків у домені Ес, що подовжують період напіврозпаду антитіл (5ігопІ Сигг Оріп Віоїесппої 20:685-91, 2009). Типовими модифікаціями Ес є Ід54 5228Р/І 234АЛ/ 235А, ІдД02 М252у/52541/1256Е (ПраІгАсдпа еї аї., У Віої
Спет 281:23514-24, 2006; або Ідс?2 /М234А/5237А/Р2385, М234А/2237А/Н2680,
Н2б8А/ЛУЗОЗІ /А3305/Р331 або У234А/5237А/Р2385/Н268А/УЗО9І /АЗ3305/Р3315 на Ідс2 (міжнар. заявка на патент Ме МЛО2011/066501) нумерація відповідно до нумерації ЄС).
Крім того, антитіла згідно даного винаходу, як описано у даному документі, можна посттрансляційно модифікувати за допомогою таких процесів, як глікозилювання, ізомеризація, деглікозилювання або ковалентна модифікація, що не зустрічається в природі, наприклад, доповнення функціональними групами полієтиленгліколю (пегілювання) і ліпідизація. Такі модифікації можуть відбуватись іп омімо або іп омйго. Наприклад, для покращення фармакокінетичних профілів антитіл такі антитіла згідно даного винаходу, як описано у даному документі, можна кон'югувати з поліетиленгліколем (ПЕГ). Кон'югацію можна здійснити за допомогою методів, відомих фахівцям у даній галузі. Було продемонстровано, що кон'югація терапевтичних антитіл з ПЕГ покращує фармакодинаміку без перешкоджання функції (Кпідй еї а!., РіаїєЇївїв 15:409-18, 2004; І еопа еї аї., СуюКіпе 16:106-19, 2001; Мапд еї аї., Ргоїєїп Епа 16:761-70, 2003).
Антитіла або їхні фрагменти згідно винаходу, як описано у даному документі, модифіковані для підвищення стабільності, селективності, перехресної реактивності, аффФфінності, імуногенності або іншої бажаної біологічної або біофізичної властивості, знаходяться у рамках даного винаходу. Стабільність антитіла залежить від ряду факторів, у тому числі (1) складу ядра окремих доменів, що впливає на їхню внутрішню стабільність, (2) взаємодій білка/білкового інтерфейсу, які впливають на спарювання НС і с, (3) запасу полярних і заряджених залишків, (4) мережі Н-зв'язування полярних і заряджених залишків; і (5) розподілу поверхневого заряду і полярних залишків серед інших внутрішньо- і міжмолекулярних сил (ММогп еї аї., У Мої Віої 305:989-1010, 2001). Залишки, які мають потенціал для дестабілізації структур, можна ідентифікувати на основі кристалічної структури антитіла або, у певних випадках, молекулярного моделювання, а вплив залишків на стабільність антитіла можна проаналізувати шляхом створення та оцінки різновидів, які несуть мутації в ідентифікованих залишках. Одним із
Зо шляхів підвищення стабільності антитіла є підвищення середньої точки температурного переходу (Тт), яку вимірюють за допомогою диференціальної скануючої калориметрії (ДСК).
Загалом Тт білка корелює з його стабільністю і зворотно корелює з його сприйнятливістю до розгортання і денатурації в розчині та процесів деградації, які залежать від схильності білка до розгортання (Кеттеїе еї а!., Віорпагт 13:36-46, 2000). У ряді досліджень виявлено кореляцію між розподілом за фізичною стабільністю композицій, виміряною методом термічної стабільності за допомогою ДСК, і фізичною стабільністю, виміряною за допомогою інших способів (сиріа еї аіІ., ААР5 Рпагтозсі 5Е8, 2003; 7Напо вї аї., ) Рнапт 5сі 93:3076-89, 2004; Маа еї а!ї., Іпї У Рнапт 140:155-68, 1996; Веди-Адао еї аї., Рпатт Нез 21:1353-61, 2004; Неттвеїіе еї аї.,
Рпагт Нез 15:200-8, 1997). Дослідження композицій показують, що Тт Рар демонструє зв'язок з довготривалою фізичною стабільністю відповідного ІтАБ. Відмінності амінокислот у каркасі або в СОК можуть мати значний вплив на термічну стабільність домену Раб (ХУавиї еї аІ., РЕВЗ І ей 353:143-6, 1994).
Антитіла згідно даного винаходу, які специфічно зв'язують домен | людського 5121, як описано в даному документі, можна створити у формі біспецифічних антитіл, які також включено в рамки даного винаходу. Області МІ. і/або МН антитіл згідно даного винаходу можна створити з використанням опублікованих способів у формі одноланцюгових біспецифічних антитіл, таких як структури конструкцій ТападбФ, (публ. міжнар. заявці на патент Мо
МО1999/57150; публ. заявці на патент США Мо О0О52011/0206672) або у формі біспецифічних 5СЕМ5, таких як структури, що розкриті в патенті США Мо О0О55869620; публ. міжнар. заявці на патент Мо МЛО1995/153884А, публ. міжнар. заявці на патент Мо УУО1997/14719 або публ. міжнар. заявці на патент Мо УМО2011/036460.
Області МІ. і/або МН антитіл згідно даного винаходу, як описано в даному документі, можна створити у формі біспецифічних повнорозмірних антитіл, де кожен відросток антитіла зв'язує певний антиген або епітоп. Такі біспецифічні антитіла звичайно створюють шляхом модуляції взаємодій СНЗ між двома важкими ланцюгами антитіл, отримуючи біспецифічні антитіла, з використанням методів, таких як ті, що описані в патенті США Ме 057695936; публ. міжнар. заявці на патент Мо МУМО04/111233; публ. заявці на патент США Мо Ш52010/0015133; публ. заявці на патент США Мо О0О52007/0287170; публ. міжнар. заявці на патент Мо МУО2008/119353; публ. заявці на патент США Мо 052009/0182127; публ. заявці на патент США Ме 0О52010/0286374; бо публ. заявці на патент США Мо И52011/0123532; публ. міжнар. заявці на патент Мо
УМО2011/131746; публ. міжнар. заявці на патент Мо УМО2011/143545; або публ. заявці на патент
США Мо О0О52012/0149876. Додаткові біспецифічні структури, в які можуть бути включені області
МІ. і/або МН антитіл даного винаходу, - це, наприклад, імуноглобуліни подвійного варіабельного домену (публ. міжнар. заявці на патент Мо УМО2009/134776) або структури, які включають різні домени димеризації для з'єднання двох відростків антитіл із різною специфічністю, таких як домени лейцинової "застібки" або димеризації колагену (публ. міжнар. заявці на патент Мо
УМО2012/022811, патент США Мо 55932448; патент США Мо О5Зб6833441).
Іншим аспектом даного винаходу є виділений полінуклеотид, що кодує будь-яку з варіабельних областей важких ланцюгів антитіла або варіабельних областей легких ланцюгів антитіла або їх фрагменти, згідно даного винаходу, або їхній комплемент.
Певні типові полінуклеотиди розкрито у цьому документі, однак інші полінуклеотиди, які, враховуючи виродженість генетичного коду або переваги кодонів у даній системі експресії, кодують антагоністи антитіла згідно даного винаходу, також знаходяться в рамках даного винаходу. Типові полінуклеотиди згідно даного винаходу представлено в 5ЕО ІЮО МО: 211, 212, 2131214.
Іншим варіантом втілення даного винаходу є вектор, що містить полінуклеотид згідно даного винаходу. Такі вектори можуть бути плазмідними векторами, вірусними векторами, векторами для експресії бакуловірусів, векторами на основі транспозону або будь-якими іншими векторами, придатними для введення в полінуклеотиди даного винаходу в певному організмі або генетичному середовищі за допомогою будь-яких засобів.
Іншим варіантом втілення даного винаходу є клітина-хазяїн, що містить полінуклеотид згідно даного винаходу. Такі клітини-хазяїни можуть бути еукаріотичними клітинами, бактеріальними клітинами, клітинами рослин або клітинами архей. Типовими еукаріотичними клітинами є клітини ссавців, комах, птахів чи інші клітини тваринного походження. Еукаріотичні клітини ссавців включають імморталізовані клітинні лінії, такі як гібридоми або клітини ліній мієломи, такі як клітинні лінії мишей 5Р2/0 (Американська колекція типових культур (АТСС), м. Манассас, штат Вірджинія, США СКІ-1581), МБО (Європейська колекція культур клітин (ЕСАСС), м.
Солебері, графство Вілтшир, Великобританія, ЕСАСС Мо. 85110503), РО (АТСС СНІ -1646) і
А9д653 (АТОС СВІ -1580). Типовою лінією клітин мієломи людини є 0266 (АТТС СЕ-ТІВ-196).
Зо Інші корисні клітинні лінії включають лінії, отримані з яєчника китайського хом'ячка (СНО), такі як
СНО-КІ15М (І опа Віоіодіс5, м. Уолкерсвіль, штат Меріленд, США), СНО-КІ! (АТС СКІ -61) або раї.
Інший варіант втілення даного винаходу - це спосіб продукування антитіла, яке специфічно зв'язує домен І з 5Т12Ї, що включає культивування клітини-хазяїна згідно даного винаходу і виділення антитіл, що продукуються клітиною-хазяїном. Способи отримання антитіл та їхнього очищення добре відомі у даній галузі.
Інший варіант втілення даного винаходу відноситься до способу інгібування взаємодії 5121. із П/-33 в об'єкті, що включає введення об'єкту антитіла, яке специфічно зв'язує домен І із 5Т2. у кількості, достатній для інгібування взаємодії 5121. і 1-33.
Способи обробки
Антагоністи 5121! згідно даного винаходу, як описано у даному документі, наприклад, антагоністи антитіл 512ІЇ, які блокують взаємодію 1/-33/5Т121І і зв'язують домен І з 5121, антитіла, які конкурують за зв'язування з людським 512 (5ЕО ІО МО: 1) із виділеним антитілом, що містить варіабельну область важких ланцюгів 5ЕО ІЮ МО: 47 і варіабельну область легких ланцюгів 5ЕО ІО МО: 51, або антитіла, що зв'язують людський 5Т2Ї на амінокислотних залишках 35-48 із БЕО ІЮО МО: 1 (КСРКОСКРЗУТМОМУ; 5ЕБО ІЮО МО: 210), можна використати для модуляції імунної системи. Антитіла згідно даного винаходу, як описано у даному документі, можуть мати більший ефект антагонізму відносно біологічної активності 5Т12Ї порівняно з антитілами, які зв'язують інші домени і/або області на 5121, оскільки антитіла згідно даного винаходу здатні ефективніше знизити ІІ -33-індуковані відповіді тучних клітин. Будь-які антитіла згідно даного винаходу можна використати в способах, що пропонуються в даному винаході.
Типовими антитілами, які можна використати в способах згідно даного винаходу, є антитіла
ЗІ М62, 5ТІМ15, 5ТІМ103, 5ТІМ107, 5ТІМ108, 5ТІМ123, 5 М124, ТІ М206, 5ТІ М207,
ТІ М208, 51 М209, 5ТІМ210, ЗТ М211, 5ТІМ212, 5ТІМ213. Без наміру обмежитись будь- якою теорією передбачається, що антагоністи антитіла, які зв'язують домен | і блокують взаємодію ІІ -33/5712І, можуть інгібувати утворення комплексу І(/-1ВАсРЛ/ЛІ-33/57121/сКії або знижувати передачу сигналу на тучні клітини, тоді як домен ПІІ-зв'язуючі антитіла, які одночасно мають здатність інгібувати рекрутування І-1КАсР до комплексу 5Т2ІЛІ-33, можуть не мати здатності порушувати утворення більшого комплексу 1І-1ВАсР/І-33/512І/сКії, який можна бо знайти виключно на тучних клітинах. Проведений аналіз микроматриць підтверджує висловлене припущення, що антитіла, які зв'язують домен І анти-5Т2І, пригнічують більшість сигнальних шляхів тучних клітин, індукованих ІІ -33, і що антитіла, які зв'язують домен ЇЇ анти-5121,, здатні інгібувати лише невелику підмножину цих сигнальних шляхів. Можливо, що внаслідок того, що
І/-33 зв'язується із 512! перед приєднанням акцесорного білка ІЇ/-1КАсР, блокування зв'язування 1-33 із 5Т2І домен І-зв'язуючими антитілами може попередити приєднання будь- якого іншого акцесорного білка, у тому числі сКії або ще нерозпізнаних корецепторів. Домен ПІ- зв'язуючі антитіла, які не перешкоджають зв'язуванню 1І/-33 із 5Т21Ї, теоретично можуть блокувати приєднання ІЇ-1КАсР, але не приєднання інших корецепторів, у тому числі ще не розпізнаних корецепторів. Запропоновано множину моделей взаємодії ІІ -1КАсСР із комплексами
І-1/ЛС-1Е або 521 ЛІ -33 (Гіпаєї! єї аїІ., біписішге 17: 1398-1410, 2009; і розглянуто в публікації
Тнотаз еї аї., Маї бігисі 4. Моїєс Віо! 19: 455-457, 2012). Ці моделі вказують, що І/-1КАсР може зв'язуватись з однією частиною комплексу, але не показують переконливо, з якою частиною.
Тому можливо, щоб "інша частина" або "вільна частина" комплексу була доступною для приєднання альтернативних корецепторів, не заблокованих антитілом домену ЇЇ, і можливими є нецільові ефекти, такі як посилення рекрутування іншого корецептора, що призводить до посилення передачі сигналів.
У способах згідно даного винаходу можна застосувати будь-який антагоніст антитіла, який специфічно зв'язує домен | людського 5121, антагоніст антитіла, який блокує взаємодію І-- 33/51Т21. і зв'язує домен І людського 5121, антитіла, які конкурують за зв'язування з людським
ЗТ21 (ЗЕО ІЮ МО: 1) із виділеним антитілом, що містить варіабельну область важких ланцюгів
ЗЕО І МО: 47 і варіабельну область легких ланцюгів ЗЕО ІЮ МО: 51, або антитіла, які зв'язують людський 5121. на амінокислотних залишках 35-48 із «ЕО ІЮО МО: 1 (КСРКОСКРЗУТМОМУ; ЗЕО
ІО МО: 210). Додаткові характеристики таких антитіл включають здатність антитіла блокувати взаємодію 1 -33/5Т21. й інгібувати відповіді тучних клітин людини.
Таким чином, антитіла згідно даного винаходу придатні для лікування ряду 5121- опосередкованих процесів, 5Т2І-опосередкованих запальних захворювань і процесів, де бажаним є інгібування відповідей тучних клітин.
Способи згідно даного винаходу можна використовувати для лікування хворих тварин, що належать до будь-якої класифікації. Приклади таких тварин включають ссавців, таких як люди, гризуни, собаки, кішки і свійські тварини. Наприклад, антитіла згідно даного винаходу можна використати для профілактики і лікування 512І-опосередкованих захворювань, таких як запальні захворювання, у тому числі астма, гіперреактивність дихальних шляхів, саркоїдоз, хронічне обструктивне захворювання легень (ХОЗЛ), ідіопатичний легеневий фіброз (ІЛФ), кістозний фіброз (муковісцидоз), запальне захворювання кишечника (З3З3К), ревматоїдний артрит, еозинофільний езофагіт, склеродермія, атопічний дерматит, алергічний риніт, бульозний пемфігоїд, хронічна кропив'янка, діабетична нефропатія, інтерстиціальний цистит або захворювання "трансплантат проти хазяїна" (ЗМНО). Антитіла згідно даного винаходу можуть бути корисні у профілактиці і лікуванні імунних хвороб, опосередкованих, принаймні частково, тучними клітинами, таких як астма, екзема, свербіж, алергічний риніт, алергічний кон'юнктивіт, а також аутоїмунних захворювань, таких як ревматоїдний артрит, бульозний пемфігоїд і розсіяний склероз.
Антитіла згідно даного винаходу також корисні у виготовленні лікарського засобу для такого лікування, де лікарський засіб готують для введення в дозах, визначених у даному документі.
Тучні клітини відіграють центральну роль у розвитку алергічного запалення й астми через вивільнення ними різних медіаторів (розглянуто Атіп, Кезріг Мей 106: 9 - 14, 2012). 5121 експресується на високому рівні на тучних клітинах, і його активація призводить до експресії багатьох прозапальних цитокінів й інших медіаторів. Для перешкоджання опосередкованому тучними клітинами рекрутуванню запальних клітин і модуляції хронічного запалення пропонується інгібування активності 5121.
Тучні клітини є швидкими респондерами на стимуляцію, в тому числі алергеном, холодним повітрям, патогеном; ушкодження епітелію цими стимулами може призвести до вивільнення ЇЇ - 33 (розглянуто 2пао апа Ни, Сеї! 5. Моїес Іттипої 7: 260-2, 2012).
Тучні клітини виділяють лейкотриєни, гістамін, простагландини і цитокіни, що призводить до збільшення проникності судин і бронхоспазму, а також притягують інші імунні клітини, такі як нейтрофіли, еозинофіли і Т-лімфоцити, до місця патології (Непадегзоп еї а!І., УЕМ 184:1483-94, 1996; МУніє єї аї., УАСІ 86:599-605, 1990). Додатково вони посилюють імунну реакцію, викликаючи підвищену регуляцію молекул адгезії на ендотеліальних клітинах для збільшення міграції імунних клітин (Мепд еї аїЇ., У СеїЇ Рпузіої 165:40-53, 1995). Тучні клітини відіграють важливу роль у ремоделюванні дихальних шляхів; у хворих на астму кількість тучних клітин у бо шарі клітин гладких м'язів дихальних шляхів (АЗМ) збільшена і вони секретують медіатори для стимуляції проліферації АБМ (розглянуто ОКауата еї а!., Си Оріп Іттипої 19:687-93, 2007).
Запальний легеневий процес є прикладом запального процесу. Типові запальні легеневі процеси включають: легеневі процеси, викликані інфекцією, у тому числі ті, що пов'язані з вірусними, бактеріальними, грибковими, паразитарними або пріоновими інфекціями; алерген- індуковані легеневі процеси; легеневі процеси, викликані полютантами, такі як азбестоз, силікоз або бериліоз; легеневі процеси, викликані аспірацією шлункового вмісту, імунною дисрегуляцією, запальні процеси з генетичною схильністю, такі як кістозний фіброз, та легеневі процеси, викликані фізичною травмою, такою як травма внаслідок штучної вентиляції легень. Ці запальні процеси також включають астму, емфізему, бронхіт, хронічне обструктивне захворювання легень (ХОЗЛ), саркоїдоз, гістіоцитоз, лімфангіоматоз, гостре пошкодження легень, гострий респіраторний дистрес-синдром, хронічні захворювання легень, бронхолегеневу дисплазію, позалікарняну пневмонію, нозокоміальну пневмонію, вентилятор- асоційовану пневмонію, сепсис, вірусну пневмонію, грипозну інфекцію, інфекцію парагрипу, ротавірусну інфекцію, людську метапневмовірусну інфекцію, респіраторно-синцитіальну вірусну інфекцію та аспергільоз або інші грибкові інфекції. Типові запальні захворювання, пов'язані з інфекцією, можуть включати вірусну або бактеріальну пневмонії, в тому числі важку пневмонію, муковісцидоз, бронхіт, загострення хвороб дихальних шляхів і гострий респіраторний дистрес- синдром (ГРДС). Такі процеси, пов'язані з інфекцією, можуть включати в себе множину інфекцій, таких як первинна вірусна інфекція та вторинна бактеріальна інфекція. Порушення регуляції сигналізації 512! може відігравати роль у патології легеневих захворювань, таких як астма і хронічне обструктивне захворювання легень (ХОЗЛ) (розглянуто АїЇсогп еї аї., Аппи Кем РПубвіої! 72:495-516, 2010). Поширені моделі астми та запалення дихальних шляхів у тварин включають модель із стимуляцією овальбуміном, моделі метахолінової сенсибілізації і сенсибілізації за допомогою АзрегоїНи5 Тштідаг» (Неззеї еї а!., Еиг У Рпагтасої 293:401-12, 1995). Як модель іп міго також можна використати інгібування продукування цитокінів і хемокінів з культивованих людських бронхіальних епітеліальних клітин, фібробластів або клітин гладких м'язів дихальних шляхів. Уведення антагоністів згідно даного винаходу в будь-яку з цих моделей можна використати для оцінки можливості застосування цих антагоністів для полегшення симптомів і зміни перебігу астми, запалення дихальних шляхів, ХОЗЛ та подібного.
Зо Астма - це запальне захворювання легень, яке характеризується гіперреактивністю дихальних шляхів (ГДШ), бронхоспазмом, свистячим диханням, еозинофільним /-чи нейтрофільним запаленням, гіперсекрецією слизу, субепітеліальним фіброзом і підвищенням рівнів ІЛЕ. Пацієнти з астмою відчувають "загострення", посилення симптомів найчастіше внаслідок мікробної інфекції дихальних шляхів (наприклад, риновірусної, грипозної, гемофільної палички і т. п.). Астматичні напади можуть викликати фактори навколишнього середовища (наприклад, аскариди, комахи, тварини (наприклад, коти, собаки, кролики, миші, щури, хом'яки, морські свинки і птахи), гриби, забруднювачі повітря (наприклад, тютюновий дим), подразнюючі гази, дим, пари, аерозолі, хімічні речовини, пилок, фізичні навантаження або холодне повітря).
Крім астми, декілька хронічних запальних захворювань, що вражають легені, характеризуються нейтрофільною інфільтрацією дихальних шляхів, наприклад, хронічне обструктивне захворювання легень (ХОЗЛ), бактеріальна пневмонія і муковісцидоз (І іпдеп еї аї., Єиг Кезріг У 15:973-7, 2000; Бантап еї аї., Сіїп Іттипої 115:268-76, 2005), а такі захворювання, як ХОЗЛ, алергічний риніт і муковісцидоз, характеризуються гіперреактивністю дихальних шляхів (Бапу апа ОС'Вугпе, Ат .) Везріг Стії Саге Мей 163:822-3, 2001). Поширені моделі астми та запалення дихальних шляхів у тварин включають модель метахолінової стимуляції після сенсибілізації і стимуляції овальбуміном (Неззеї еї аІ., Еиг У Рпагтасої 293:401-12, 1995). Як модель іп міго також можна використати інгібування продукції цитокінів і хемокінів із культивованих людських бронхіальних епітеліальних клітин, фібробластів або клітин гладких м'язів дихальних шляхів.
Уведення антагоністів антитіла згідно даного винаходу в будь-яку з цих моделей можна використати для оцінки можливості застосування цих антагоністів для полегшення симптомів і зміни перебігу астми, запалення дихальних шляхів, ХОЗЛ та подібного.
Сигналізація ІІ-33 через рецептор 5121. на секрецію клітин ТН2, базофілів, тучних клітин і новоописаних вроджених клітин лімфоїдного типу 2 призводить до секреції ЇЇ -5 і І--13 (цитокіну типу 2) (вроджені лімфоїдні клітини (ІС) розглянуто Зрії5 еї аїЇ., Маїшге Кеміем5 ІттипоЇоду 13:145-149, 2013). Сприятливий вплив терапії, спрямованої на І/-5 або 1ІЇ/-13 при астмі, підтверджує актуальність цих шляхів. ІЇ-5 активує еозинофіли, і лікування підгрупи хворих із важкою астмою, з еозинофілією у мокротинні, моноклональним антитілом, яке нейтралізує ІІ -5, призвело до зменшення числа загострень (Маїс еї а. М Епді У Мей. 2009; 360(10):985-93).
Повідомляється, що ІЇ/-13 бере участь у синтезі ДЕ, секреції слизу і формуванні фіброзу. бо Лікування хворих із важкою астмою моноклональним антитілом анти- І/-13 призвело до покращення функції легень у підгрупі, яка продемонструвала більш виражене покращення (Сотеп еї аїЇ., М. ЕпаЇ. У. Меайа., 365:1088-1098, 2011). Інші медіатори диференціальних імунологічних шляхів також беруть участь у патогенезі астми, і блокування цих медіаторів, крім
ЗІ2І, може мати додатковий терапевтичний ефект. Види лікування, які націлені на множину цитокінів типу 2 або висхідні шляхи утворення цитокінів типу 2, можуть бути корисними при важкому захворюванні.
Домени МН і Мі антитіл 512ІЇ згідно даного винаходу можна включити в біспецифічні антитіла і молекули, описані у даному документі, де біспецифічне антитіло специфічно зв'язує домен І із 512. ї другий антиген, такий як стромальний лімфопетин тимуса (Т51І Р), 1-25, І- 178 або Т5І РЕ.
І -25 ї Т5І Р, як і 1-33, за допомогою різних сигнальних комплексів запускають вивільнення цитокінів типу 2: І--25 (І/-17ЄЕ) є членом сімейства 1-17 і сигналізує через 1/-17ВАЛІ-17КВ, і
Т5ІР є членом сімейства ІЇ/-7 і сигналізує через гетеродимери Т5ІРКЛІ-7Ка (розглянуто
Коуази евї а!., Іттипої! 132:475-481, 2011). Тварини, які мають недостатність ІІ -33, 5121, 1-25,
І/-17К8В, Т5І Р або Т5І РЕ, демонструють менш важке запалення дихальних шляхів у принаймні одній із багатьох різних типів моделей астми у мишей; однак недостатній захист від запалення дихальних шляхів може мати місце в більшості з цих моделей захворювань у тварин, збільшуючи можливість того, що вплив різних алергенів або патогенів на епітелій може викликати одночасне вивільнення ІІ -33, ІІ -25 ії Т5І Р. Наттаоє еї а. повідомили, що введення екстракту домашніх пилових кліщів мишам призвело до вивільнення 1-25, ТІ Р і 1-33 (а також
І/-5 ії ІС-13 нижче 1-33) в дихальні шляхи (Наттасє еї а!., Маї Меа 15:210-216, 2009). Це свідчить про те, що блокування 5Т2І і Т5І Р і/або І/-25 може мати позитивні ефекти, особливо при важкому захворюванні дихальних шляхів.
В іншому варіанті втілення даного винаходу антагоністи антитіла, що специфічно зв'язує домен І людського 512Ї, можна використати для створення біспецифічних молекул, які зв'язують 5121 і Т5І Р, 5121 і1-25, 5121 і Т5І РЕ, 5121 і11-17КА або 57121 і 1 -1788.
В іншому варіанті втілення даного винаходу антагоністи антитіла, що специфічно зв'язує домен І людського 5121, - це біспецифічне антитіло, причому антитіло додатково зв'язує Т5І Р,
І -25, ТО РА, 1І-17БА або ІІ -1788.
Антитіла, що зв'язують Т5ЗІР, І/-25, Т5І РА, ІІ/-17КА і І/-17КВ, можна отримати з використанням способів, описаних у даному документі, таких як імунізація мишей з експресією локусів людського імуноглобуліну (Іопрегд еї аї!., Маїшге 368:856-9, 1994; Ріпа еї аї., Маїшге
ВіоїесппоЇоду 14:845-51, 1996; Мепае? сеї а!., Майте Сепеїїсв 15:146-56, 1997, патенти США МоМо 5,770,429, 7,041,870 і 5,939,598) або лінії мишей ВаїЇр/с із відповідними білками або позаклітинними доменами білків або з використанням бібліотек фагового дисплея, як описано в даному документі. Як альтернатива, існуючі антитіла до ТОЇ Р, ІЛ-25, Т5І РЕ, ІЛ-17КА і 1 -1788 можна використати для створення біспецифічних молекул. Типовими антитілами ІІ -25, які можна використати, є ті, що описані, наприклад, у публ. міжнар. заявці на патент Мо
МО2011/123507.
Артрит, у тому числі остеоартрит, ревматоїдний артрит, травматичний артрит суглобів та подібне, належать до поширених запальних процесів, на які позитивно впливає терапевтичне застосування протизапальних білків, таких як антагоністи згідно даного винаходу. Активація сигналізації 572. може підтримувати запалення і додаткове пошкодження тканин у запаленому суглобі. Відомо декілька моделей ревматоїдного артриту у тварин. Наприклад, у моделі колаген-індукованого артриту (СІА) мишей розвиток хронічного запального артриту є дуже подібним до ревматоїдного артриту в людини. У 5121 -дефіцитних (5Т2КО) мишей розвивалася легша форма захворювання в цій моделі, і патологія в цій моделі залежала від експресії 5Т21. тучними клітинами (Хи еї аІ., РМАБ 105:10913-8, 2008). У цій моделі спостерігалася знижена інфільтрація мононуклеарних і поліморфоядерних клітин, а також знижена синовіальна гіперплазія у суглобах мишей 5Т2КО. Дренуючі лімфовузли мишей 5Т2КО, які культивували з колагеном (СІЇ), продемонстрували значне зниження рівня продукування 1-17, ІЕМу та ТМЕа. У
ЗТ21- дефіцитних мишей із адоптивно перенесеними тучними клітинами дикого типу (М/Т), отриманими з кісткового мозку (ВММС), перед стимуляцією СІА розвивалися важчі форми СІА, ніж у тих, яких щепили з ВММОС 5Т2КО. Тому 5121 -сигналізація тучними клітинами має вирішальне значення для розвитку артриту в моделі захворювань у мишей, що подібна на ревматоїдний артрит людини. Уведення антитіл 5121! згідно даного винаходу, які інгібують відповіді тучних клітин, мишам моделі СІА можна використовувати для оцінки застосовування цих антагоністів для полегшення симптомів і зміни перебігу захворювання.
Типовими шлунково-кишковими запальними процесами є запальні захворювання кишечника бо (ЗЗК), виразковий коліт (ОС) і хвороба Крона (СО), коліт, індукований несприятливими впливами
(наприклад, шлунково-кишкове запалення (наприклад, коліт) викликане або пов'язане з (наприклад, як побічний ефект) лікувальним режимом, таким як проведення хіміотерапії, променевої терапії, тощо), інфекційний коліт, ішемічний коліт, колагеновий або лімфоцитарний коліт, некротичний ентероколіт, коліт у таких умовах, як хронічне гранулематозне захворювання або целіакія, харчові алергії, гастрит, інфекційний гастрит або ентероколіт (наприклад, хронічний активний гастрит, пов'язаний з інфікуванням Неїїсобрасіег руїогі) та інші форми шлунково-кишкового запалення, викликаного інфекційним агентом. Існує декілька моделей шлунково-кишкових запальних процесів у тварин. До моделей, що використовуються найбільш широко, належить модель коліту, індукованого 2,4,6-тринітробенесульфоновою кислотою/етанолом (ТМВ5), або оксазалонова модель, які викликають хронічне запалення і виразкування товстої кишки (Меишгайй еї аї., Іпїегп Кем Іттипої! 19:51-62, 2000). В іншій моделі використовують декстран сульфату натрію (055), який індукує гострий коліт, що проявляється кривавим проносом, втратою ваги, вкороченням товстої кишки і виразкуванням слизових із нейтрофільною інфільтрацією. Інша модель передбачає адоптивне перенесення ненавчених Т- клітин СО45КВПпідпи СО4 до мишей КАС або 5СІЮ. У цій моделі ненавчені Т-клітини донора атакують кишечник реципієнта, викликаючи хронічне запалення кишечника і симптоми, схожі на такі при запальних захворюваннях кишечника людини (Кеай апа Роуліє, Си Ргоїос Іттипої, глава 15, розділ 15.13, 2001). Уведення антагоністів згідно даного винаходу в будь-яку з цих моделей можна використати для оцінки потенційної ефективності цих антагоністів для полегшення симптомів і зміни перебігу захворювань, пов'язаних із запаленням у кишечнику, таких як запальні захворювання кишечника.
Фіброз нирок може розвинутися або внаслідок гострого інсульту, такого як ішемія/реперфузія трансплантата (Егеезе еї аї., Мерпгої Оіа! Тгап5ріапі 16:2401-6, 2001), або хронічного процесу, такого як діабет (Кії» еї аї., Мерпго! іа! Тгапоріапі 11 додаток 9:38-44, 1996). Патогенез, як правило, характеризується початковою запальною реакцією з подальшим стійким фіброгенезом системи клубочкової фільтрації і тубулярного інтерстицію (Сім, Кіапеу Іпі 69:213-7, 2006). Доведено, що тубулоінтерстиціальний фіброз відіграє важливу роль у патогенезі ураження нирок на термінальній стадії ниркової недостатності і клітину проксимальних канальців визначено як центральний медіатор (РНйіре апа бівєадтап, Нівіо!
Ко) Нівіораїйної 17:247-52, 2002; РийШрзх, Спапд Сипуд Мей У 30:2-6, 2007). Фіброгенез у тубулоінтерстиціальному відділі частково опосередковується активацією місцевих фібробластів, які секретують прозапальні цитокіни, що стимулюють секрецію медіаторів місцевого запалення і фіброгенезу епітелієм проксимальних канальців. Крім того, цитокіни хемотаксису секретуються фібробластами і епітеліальними клітинами і забезпечують спрямований градієнт, що спрямовує інфільтрацію моноцитів/макрофагів і Т-клітин у тубулоінтерстицій. Запальний інфільтрат продукує додаткові фіброгенні і запальні цитокіни, які додатково активують вивільнення цитокінів фібробластами й епітеліальними клітинами, а також стимулює проходження епітелієм фенотипового переходу, при якому клітини депонують надлишкові компоненти позаклітинного матриксу (Зітопзоп, Кідпеу Іпі 71:846-54, 2007).
Інші типові процеси фіброзу можуть включати фіброз печінки (у тому числі, крім іншого, алкогольний цироз, вірус-індукований цироз, аутоїмунний гепатит); фіброз легень (у тому числі, крім іншого, склеродермію, ідіопатичний легеневий фіброз); фіброз нирок (у тому числі, крім іншого, склеродермію, діабетичний нефрит, гломерулонефрит, вовчаковий нефрит); фіброз шкіри (у тому числі, крім іншого, склеродермію, гіпертрофічні і келоїдні рубці, опіки); мієлофіброз; нейрофіброматоз; фіброму; кишковий фіброз; і фіброзні спайки в результаті хірургічних втручань. Фіброз може бути органоспецифічним фіброзом або системним фіброзом.
Органоспецифічний фіброз може бути пов'язаний із фіброзом легень, фіброзом печінки, фіброзом нирок, фіброзом серця, фіброзом судин, фіброзом шкіри, фіброзом очей або фіброзом кісткового мозку. Фіброз легень може бути пов'язаний з ідіопатичним легеневим
БО фіброзом, легеневим фіброзом, зумовленим медикаментами, астмою, саркоїдозом або хронічним обструктивним захворюванням легень. Фіброз печінки може бути пов'язаний із цирозом печінки, шистосомозом або холангітом. Цироз може бути вибраний з-поміж алкогольного цирозу печінки, цирозу печінки після гепатиту С, первинного біліарного цирозу печінки. Холангіт може бути склерозуючим холангітом. Фіброз нирок може бути пов'язаний із діабетичною нефропатією або вовчаковим гломерулосклерозом. Фіброз серця може бути пов'язаний із інфарктом міокарда. Судинний фіброз може бути пов'язаний з артеріальним рестенозом після ангіопластики або атеросклерозом. Фіброз шкіри може бути пов'язаний з опіковими рубцями, гіпертрофічними рубцями, келоїдом або нефрогенною фіброзуючою дерматопатією. Фіброз очей може бути пов'язаний із ретро-орбітальним фіброзом, операцією 60 після катаракти або проліферативною вітреоретинопатією. Фіброз кісткового мозку може бути пов'язаний з ідіопатичним мієлофіброзом або мієлофіброзом, зумовленим медикаментами.
Системний фіброз може бути системним склерозом або захворюванням "трансплантат проти хазяїна".
Іншими запальними процесами і невропатіями, які можна попередити або лікувати за допомогою способів згідно даного винаходу, є ті, які викликані аутоїмунними захворюваннями.
До оцих запальних процесів і невропатій належать системний червоний вовчак і нейродегенеративні порушення та порушення центральної нервової системи (ЦНС), у тому числі хвороба Альцгеймера, хвороба Паркінсона, хвороба Хантінгтона, біполярні розлади і бічний аміотрофічний склероз (БАС), захворювання печінки, у тому числі первинний біліарний цироз печінки, первинний склерозуючий холангіт, неалкогольна жирова хвороба печінки/стеатогепатит, фіброз, вірус гепатиту С (ВГС) і вірус гепатиту В (ВГВ), діабет й інсулінорезистентність, серцево-судинні порушення, у тому числі атеросклероз, крововилив у мозок, інсульт й інфаркт міокарда, артрит, ревматоїдний артрит, псоріатичний артрит і ювенільний ревматоїдний артрит (ЮРА), остеопороз, остеоартрит, панкреатит, фіброз, енцефаліт, псоріаз, гігантоклітинний артеріїт, анкілозуючий спондилоартрит, аутоіїмунний гепатит, вірус імунодефіциту людини (ВІЛ), запальні захворювання шкіри, трансплантацію, рак, алергії, ендокринні захворювання, загоєння ран, інші аутоімунні захворювання, гіперчутливість дихальних шляхів і клітинні, вірусні або пріонно-опосередковані інфекції або порушення.
Одним із варіантів втілення даного винаходу є спосіб лікування або попередження 5121 - опосередкованого процесу, що включає введення терапевтично ефективної кількості антагоніста виділеного людського або адаптованого до людини антитіла, що специфічно зв'язує домен І (5ЕО ІЮ МО: 9) людського 5121, блокує взаємодію ІІ -33/5Т21,, конкурує за зв'язування з людським 5121 (ЗЕО ІЮО МО: 1) із виділеним антитілом, яке містить варіабельну область важких ланцюгів (МН) із ЗЕО ІЮ МО: 47 і варіабельну область легких ланцюгів (МІ) із «ЕО ІЮ МО: 51, мМабо зв'язує людський 512! на амінокислотних залишках 35-48 5БЕО ІЮ МО: 1 (КСРКОСКРЗУТМОУМ; ЗЕБЕО ІО МО: 210) пацієнту, який цього потребує, протягом часу, достатнього для лікування або попередження 5121 -опосередкованого процесу.
Іншим варіантом втілення даного винаходу є спосіб інгібування відповіді тучних клітин у пацієнта, що включає введення терапевтично ефективної кількості антагоніста виділеного
Ко) людського або адаптованого до людини антитіла, що специфічно зв'язує домен І (ЗЕО ІЮ МО: 9) людського 512, блокує взаємодію ІІ -33/5Т2І., конкурує за зв'язування з людським 5121 (5ЕО
ІО МО: 1) із виділеним антитілом, яке містить варіабельну область важких ланцюгів (МН) із ЗЕО
ІО МО: 47 і варіабельну область легких ланцюгів (МІ) із ЗЕО ІЮО МО: 51, і/або зв'язує людський
ЗТ2Ї. на амінокислотних залишках 35-48 5ЕО ІЮ МО: 1 (АЯСРАОСКРОМТМОМУ/; 5ЕО ОО МО: 210) пацієнту, який цього потребує, протягом часу, достатнього для інгібування відповіді тучних клітин.
Іншим варіантом втілення даного винаходу є спосіб інгібування взаємодії ІЇ/-33 і 5121 в об'єкта, що включає введення об'єкту антагоніста виділеного людського або адаптованого до людини антитіла, що специфічно зв'язує домен І (ЗЕО ІЮ МО: 9) людського 5121, блокує взаємодію 1 -33/5Т21І, конкурує за зв'язування з людським 5121 (5ЕО ІЮО МО: 1) із виділеним антитілом, яке включає варіабельну область важких ланцюгів (МН) із 5ЕБЕО ІЮ МО: 47 і варіабельну область легких ланцюгів (МІ) із ЗЕО ІЮ МО: 51, і/або зв'язує людський 572 на амінокислотних залишках 35-48 5ЕБО ІЮ МО: 1 (КСРКОСКРБЗУТМОМУМ; 5БО ІЮ МО: 210) у кількості, достатній для інгібування взаємодії ІІ. -33 і 5121.
В іншому варіанті втілення 5Т12І -опосередкованим процесом є астма, гіперреактивність дихальних шляхів, саркоїдоз, хронічне обструктивне захворювання легень (ХОЗЛ), ідіопатичний легеневий фіброз (ІЛФ), кістозний фіброз (муковісцидоз), запальне захворювання кишечника (ЗЗ3К), ревматоїдний артрит, еозинофільний езофагіт, склеродермія, атопічний дерматит, алергічний риніт, бульозний пемфігоїд, хронічна кропив'янка, діабетична нефропатія, інтерстиціальний цистит або захворювання "трансплантат проти хазяїна" (ЗМНО).
В іншому варіанті втілення 5Т2І-опосередкований процес пов'язаний із рекрутуванням запальних клітин у легенях, гіперплазією келихоподібних клітин або підвищеною секрецією слизової оболонки.
В іншому варіанті втілення 5Т2І -опосередкований процес пов'язаний із відповіддю тучних клітин.
В іншому варіанті втілення інгібування відповіді тучних клітин включає інгібування рівня СМ-
СБ, 11/-5, І/-8, 1/-10 або 1-13, вивільнених тучними клітинами, отриманими з людської пуповинної крові, принаймні на 50 95 за допомогою 50 мкг/мл антитіла.
В іншому варіанті втілення антагоністом антитіла, який вводять пацієнту, що цього потребує, 60 є біспецифічне антитіло, що специфічно зв'язує домен І (5ЕО ІЮ МО: 9) людського 5121, блокує взаємодію 1 -33/5Т21І, конкурує за зв'язування з людським 5121 (5ЕО ІЮО МО: 1) із виділеним антитілом, яке містить варіабельну область важких ланцюгів (МН) із 5ЕО ІЮ МО: 47 і варіабельну область легких ланцюгів (МІ) із ЗЕО ІЮО МО: 51, і/або зв'язує людський 5121 на амінокислотних залишках 35-48 5ЕО І МО: 1 (КСРКОСКРЗУТМОМУ; ЗБО ІЮО МО: 2109), ії додатково зв'язує Т5І Р, ІІ -25, Т5І РА, І-17КА або 1 -1788.
Введення/фармацевтичні композиції "Терапевтично ефективну кількість" антитіл анти-5Т2Ї, яка ефективна при лікуванні процесів, при яких бажаною є модуляція біологічної активності 512Ї, можна визначити за допомогою стандартних методів дослідження. Наприклад, дозування антитіла анти-5Т2І, що буде ефективним при лікуванні запального процесу, такого як астма або ревматоїдний артрит, можна визначити шляхом введення антитіла анти-512Ї у відповідні моделі захворювання тварин, такі як моделі, описані в даному документі.
Крім того, аналізи іп міго можна додатково використати як допоміжний засіб при визначенні оптимальних діапазонів дозування. Вибір конкретної ефективної дози можуть визначити (наприклад, шляхом клінічних досліджень) фахівці у даній галузі з урахуванням декількох факторів. До таких факторів належать захворювання, яке потрібно лікувати або попередити, пов'язані симптоми, маса тіла пацієнта, імунний статус пацієнта й інші фактори, відомі фахівцям у даній галузі. Точна доза для застосування в композиції буде також залежати від способу введення та важкості захворювання і її необхідно підбирати відповідно до оцінки лікаря, що проводить лікування, а також обставин кожного пацієнта. Ефективні дози можна екстраполювати з кривих доза-ефект, отриманих із дослідних систем іп міго або тваринних моделей випробування.
Способом введення для терапевтичного застосування антитіла згідно даного винаходу може бути будь-який відповідний спосіб, який забезпечує доставку агента до хазяїна.
Фармацевтичні композиції цих антитіл особливо корисні для парентерального введення, наприклад, внутрішньошкірного, внутрішньом'язового, внутрішньочеревного, внутрішньовенного, підшкірного або інтраназального.
Антитіло згідно даного винаходу можна отримати у вигляді фармацевтичних композицій, що містять ефективну кількість агента як активного інгредієнта у фармацевтично прийнятному носії.
Термін "носій" означає розчинник, ад'ювант, наповнювач або носій, з яким вводять активну сполуку. Такі фармацевтичні носії можуть бути рідинами, такими як вода й олії, у тому числі олії з нафти, тваринного, рослинного або синтетичного походження, такі як арахісова олія, соєва олія, мінеральна олія, кунжутна олія та подібне. Наприклад, можна використати 0,4 95 сольовий розчин і 0,3 95 гліцин. Ці розчини повинні бути стерильними і повністю вільними від твердих частинок. Їх можна стерилізувати за допомогою загальноприйнятих, добре відомих способів стерилізації (наприклад, фільтрації). Ці композиції можуть містити фармацевтично прийнятні допоміжні речовини, які необхідні для наближення до фізіологічних умов, такі як рН-регулюючі і буферні агенти, стабілізуючі, згущуючі, змащувальні і фарбуючі агенти і т. п. Концентрація антитіла згідно даного винаходу в такій фармацевтичній композиції може варіювати в широких межах, тобто від менше ніж приблизно 0,5 95, звичайно або принаймні приблизно 1 95, до 15 або 20 95 за вагою, і її подрібно визначати насамперед на основі необхідної дози, об'ємів рідини, в'язкості і т. п., залежно від конкретного обраного способу введення.
Таким чином, фармацевтичну композицію згідно даного винаходу для внутрішньом'язової ін'єкції можна приготувати так, щоб вона містила 1 мл стерильної буферної води і від приблизно 1 нг до приблизно 100 мг, наприклад, від приблизно 50 нг до приблизно 30 мг або бажаніше від приблизно 5 мг до приблизно 25 мг, антитіла анти- 5121 згідно даного винаходу. Так само фармацевтичну композицію даного винаходу для внутрішньовенної інфузії можна виготовити так, щоб вона містила приблизно 250 мл стерильного розчину Рінгера і від приблизно 1 мг до приблизно 30 мг і бажаніше від 5 мг до приблизно 25 мг, антагоніста даного винаходу. Існуючі способи приготування композицій, які вводять парентерально, добре відомі і детальніше описані, наприклад, у Кетіпдіоп Рпаптасеціїса! Зсіепсе, 15-е вид., Маск Рибіїзпіпд Сотрапу, м.
Істон, штат Пенсильванія, США.
Антитіла згідно даного винаходу можна ліофілізувати для зберігання і відновлювати у відповідному носії перед використанням. Доведено, що ця методика є ефективною при використанні звичайних імуноглобулінів і білюових препаратів, і можна використовувати відомі у галузі методики ліофілізації й відновлення.
Даний винахід далі буде описаний з посиланням на наступні специфічні, не обмежуючі приклади.
Матеріали і способи (загальна інформація)
Аналіз інгібування зв'язку рецептора людини і яванського макака (Масаса газсісціагі5, супо) та ліганда (КІ В-аналіз) 96-лунковий планшет покривали 50 мкл 4 мкг/мл людського 5Т2І-ЕСО (амінокислоти 19-328 із БЕО ІЮ МО: 1) або 2 мкг/мл 5Т2І-ЕСО супо (амінокислоти 19-321 із ЗЕО
ІО МО: 2) із С-термінальною міткою Нізб у бікарбонатному буфері при 4 "С протягом 16 год. Усі наступні стадії виконували при кімнатній температурі. Планшет блокували 200 мкл блокуючого буфера і промивали З рази 300 мкл промивного буфера, що містив натрій-фосфатний буферний розчин (РВ5) ж 0,05 95 речовини Ту'ееп. 30 мкл анти-5Т2Ї! тАбБ різного ступеня розведення додавали у лунки й інкубували протягом 1 години. Для аналізу зв'язку людського рецептора і ліганда додавали 20 мкл біотинільованого людського 1-33 (залишки 112-270 із ФБЕО
ІО МО: 3) при кінцевій концентрації 100 нг/мл й інкубували протягом 30 хвилин. Для аналізу зв'язку рецептора яванського макака (супо гесеріог) і ліганда додавали 20 мкл біотинільованого
І/-33 супо (залишки 112-269 із ЗЕО ІО МО: 4) при кінцевій концентрації 200 нг/мл й інкубували протягом 30 хвилин. Планшет промивали З рази 300 мкл промивного буфера. Додавали 50 мкл 0,2 мкг/мл стрептавідину-пероксидази хрону (НКР) (даскбоп Ітітипогезеагс!) й інкубували протягом 30 хвилин. Планшет З рази промивали 300 мкл промивного буфера, що містив
РВ5--0,05 95 речовини Тугееп. У кожну лунку додавали 50 мкл субстрату тетраметилбензидину (ТМВ) (ЕМО Віозсіепсе5). Реакцію зупиняли додаванням 100 мкл 0,2 М сірчаної кислоти. 00450 вимірювали з використанням планшет-рідера Епмізіоп (РегКіп ЕІтег).
Створення химерних конструкцій 5721.
Різні конструкції, що містять обміни доменів І, ІІ ї ІП людського і мишачого 5121, розробили і створили з використанням стандартних методів молекулярної біології. Конструкції перераховано в Таблиці 1. Нумерація амінокислот відповідає людському 512. (512) (ЗЕО І
МО: 1; МР. 057316) і мишачому 5121. (т5Т21І) (ЗЕО ІО МО: 5; МР 001020773) білкам.
Таблиця 1
ПИШИ Пінкі іній конструкціях о Назваконструкцїі | Домен! | Домен | Домен |/ пОТ2І: людський 5121. 5ЕО ІЮО МО: 1 те5т2: мишачий 5121. 5ЕО ІЮ МО: 5
Аналіз визначення зв'язування доменів
Зв'язування антитіл із доменом І, ЇЇ ї ПІ 572. визначали з використанням стандартного аналізу захоплення ЕБЕїІ5А з використанням електрохемілюмінесцентного формату виявлення (технологія Мезо-Зсаіе Оізсомегу (М50О)). 10 мкг/мл кожного антитіла наносили на
Зо кожну лунку планшета М5О НідпВіпа (5 мкл/лунку) на 2 год. при кімнатній температурі. Планшет блокували за допомогою 150 мкл 5 95 блокуючого буфера М5О протягом 2 год. при кімнатній температурі і промивали З рази промивним буфером НЕРЕ5, з подальшим додаванням до планшета 25 мкл міченого 5!йіт їад пи5Т21І -ЕСО, або мишачого 5121 -ЕСО (амінокислоти 28- 326 із БЕО ІЮО МО: 5), або химер ННМ-5Т21Г. (ЗЕО ІО МО: 6), або НМН-5Т21Г. (ЗЕО ІО МО: 8), або
НН-5572Г. (залишки 19-205 з 5ЕО ІО МО: 1) у зростаючих концентраціях від 5 НМ до 40 нм.
Планшет накривали алюмінієвою фольгою й інкубували протягом 1 год. при кімнатній температурі з обережним струшуванням. Далі планшет З рази промивали промивним буфером
НЕРЕ5. Буфер для зчитування М5О (150 мкл) додавали у кожну лунку і далі проводили зчитування планшета з використанням Зесіог Ітадег МБО 6000.
Ті антитіла, що зв'язуються людськими 5121 -ЕСО, ННМ.5Т21. і НМН-5Т21, але не мишачим
ЗТ21-ЕСО, розпізнають домен | людського 5Т2І-ЕСО. Антитіла, які зв'язуються людськими
ЗТ21-ЕСО і НМН-5Т21Ї,, але не мишачими ННМ 512. і 5121 -ЕСО, розпізнають домен І людського 5121 -ЕСО. Антитіла, які зв'язуються людським і мишачим 5121 -ЕСО, але не НН-5Т21,, розпізнають домен ІІЇ людського і мишачого 5Т21І -ЕСО.
Вимірювання аффінності анти-5Т2Ї тАр
Анти-5Т2Ї тАБ, пи5Т21-ЕСО їі супозТ2І! -ЕСО експресували з використанням стандартних способів. Козяче Есж-фрагмент-специфічне антитіло до людського Їде (Мо по кат. 109-005-098) отримали від ЧУаскзоп ІттипокКезеагсі Іабогафогіез (м. Вест Гроув, штат Пенсильванія, США).
Сенсорні чіпи газово-рідинної хроматографії (ГРХ) (Віо-Каай, Ме по кат. 176-5011), сенсорні чіпи
СМ5 (ЗЕ Неайпсаге, Мо по кат. ВК100014) і реагенти для підготовки поверхні захоплення отримали від Віасоге (ЗЕ Неайсаге, м. Піскатауей, штат Нью-Джерсі, США) або Віо-Най І їїте
Зсіепсез (Віо-Кай, м. Геркулес, штат Каліфорнія, США).
Взаємодії антитіл анти-5Т21. із людським Нізб-міченим 5Т21І-ЕСО і Нізб-міченим 5Т2І-ЕСО супо вивчали за допомогою РгоїеоОп із використанням ХРЕЗ6 при 25 "С.
Поверхню біосенсора приготували з'єднанням козячого Есж-фрагмент-специфічного антитіла (АБ) до людського ідо із поверхнею сенсорного чіпа ГРХ з використанням інструкцій виробника з хімічного амінозв'язування. Зв'язуючим буфером був 10 мм ацетат натрію, рН 4,5.
Козяче Есу фрагмент-специфічне антитіло до людського до (приблизно 4500 одиниць відповіді) іммобілізували в горизонтальній орієнтації. Антитіла анти-5Т2Ї постачалися для дослідів очищеними або у вигляді неочищених супернатантів. В обох випадках ці антитіла розводили в
РЕВ (РВ5, рН 7,4, із додаванням З мМ ЕДТА і 0,005 95 Тмееп 20) до досягнення концентрації приблизно 0,5 мкг/мл. Антитіла захоплювалися (60- 130 КІ) у вертикальній орієнтації на чіп
ГРХ, модифікований антитілом до людського Есу. Захоплення анти-5Т2Ї тА супроводжувалося введенням пиЗзТ2І! ЕСО у розчин (від 0,024 нМ до 15 нМ, при 5-кратному розведенні) або супо5Т2! ЕСО у розчин (від 0,020- 5 нМ, при 4-кратному розведенні) у горизонтальній орієнтації. Асоціацію контролювали протягом 4 хвилин у всіх дослідах (200 мкл вводили при 50 мкл/хв.). Дисоціацію контролювали протягом 30 хвилин. Регенерацію поверхні сенсора отримували з трьома 15- секундними впорскуваннями 10 мМ гліцину, рН 1,5. Дані узгоджували з використанням програмного забезпечення Ргоїеоп і з використанням моделі зв'язування 1:1 із масообміном. Експерименти Віасоге проводили з використанням оптичного біосенсора (Віасоге АВ) Віасоге 2000 або Віасоге 3000. Усі експерименти проводили в ВКВ (РВ5, рН 7,4, із додаванням З мМ ЕДТА і 0,005 95 Тм'ееп 20) з або без 0,1 95 ВЗА при 25 "С.
Поверхню біосенсора Віасоге обробляли шляхом зв'язування козячого Есу-фрагмент- специфічного антитіла до людського дс із карбоксиметильованою декстрановою поверхнею чіпа СМ'5, з використанням інструкцій виробника з хімічного амінозв'язування. Зв'язуючим буфером був 10 мМ ацетат натрію, рН 4,5. У середньому 6000 одиниць відповіді (КО) АБ іммобілізували у кожній з чотирьох проточних камер. Анти-5Т2Ї тАБ захоплювалися
Зо (приблизно 33 КІ) на модифіковану антитілом до людського Есу поверхню сенсорного чіпа.
Захоплення анти-5Т2І тАБб супроводжували введенням пи5Т2І ЕСО у розчин (від 0,2 нМ до 15
НМ, при 3-кратному розведенні) або супо5:Т2І ЕСО у розчин (від 0,2 до 15 нМ або від 0,02 до 5
НМ, при З-кратному розведенні) у горизонтальній орієнтації. Асоціацію контролювали протягом 4 хвилин або 8 хвилин (200 мкл вводили при 50 мкл/хв або 20 мкл/хв для С2521 і С2519).
Дисоціацію контролювали протягом 10 хвилин або до 2,5 годин. Регенерацію поверхні сенсора отримували шляхом впорскування 50 мМ Маосон і/або впорскування 100 нМ НзРох.
Дані обробляли з використанням програмного забезпечення Зсгиррег 1.1 д (програмного забезпечення Віо! одіс). Подвійне контрольне віднімання даних проводили шляхом віднімання кривих, згенерованих введенням буфера, від контрольних кривих введення аналіту з відніманням для корекції частки буфера в сигналі та шумі приладів. (Му52Ка, Щдоигпа! ої Мої
Весодп 12:279-84, 1999).
Після обробки дані, згенеровані для визначення кінетики й аффінності, аналізували з використанням програмного забезпечення Зсгиррег або програмного забезпечення
ВІАемаїчайоп 4.0.1 (Віасоге, АВ). Дані кінетики аналізували з використанням простої моделі зв'язування 1:1, що включала член масообміну.
Вимірювання аффінності тАБб до мишачого 512! (С1999/СМТ03914) із мишачим 5121 ЕСО
Анти-5Т12Ї. тА (С1999/СМТ03914) і мишачий позаклітинний домен 512. (ти5Т21І-ЕСВО) експресували й очищали з використанням стандартних способів. Есу- фрагмент-специфічне АБ до мишачого ДО отримали від Чдаскзоп ІттипоКезеагсп Іаброгайогіеє (м. Вест Гроув, штат
Пенсильванія, США). Сенсорні чіпи і реагенти для обробки поверхні захоплення отримали від
Віасоге (СЕ Неайвсаге, м. Піскатауей, штат Нью-Джерсі, США). Експериментальний рухомий буфер Віасоге (ВКВ) містив РВ5 рН 7,4 з 0,005 95 Ту'ееп 20 і 0,1 мг/мл В5А, і дані збирали при 2576.
Взаємодію антитіла анти-512І. з ти5Т21І -ЕСО вивчали на Віасоге2000 при 25 "С. Поверхню біосенсора приготували з'єднанням анти-мишачого Ес-специфічного антитіла із поверхнею сенсорного чіпа СМ4 з використанням інструкцій виробника з хімічного амінозв'язування.
С1999/УСМ4Т03914 і ти5зТ21/-ЕСО розводили у ВЕВ. С1999 було захоплено з використанням анти-мишачих Есу антитіл (приблизно 85 КО). Після захоплення проводили введення ти5тТ21.
ЕСО (залишки 28-326 із БЕО ІЮ МО: 5) у розчині (починаючи з 15 нМ, 5 концентрацій, при 3- бо кратному серійному розведенні). Асоціацію контролювали протягом 8 хвилин. Дисоціацію контролювали протягом періоду до 6000 секунд. Регенерацію поверхні сенсора отримували за допомогою розведення фосфорної кислоти 1/100. Дані узгоджували з використанням моделі зв'язування 1:1.
Аналіз базофільної клітинної лінії людини (аналіз вивільнення цитокінів базофілами)
Клітини КО812 (базофільної клітинної лінії людини; АТСС, СКІ -2099) наносили на стерильні 9б-лункові планшети з О-подібним дном для культур тканин по 25 000 або 50 000 клітин на лунку в загальному обсязі 40 мкл живильного середовища КРМІ 1640 (Іпмігодеп) з додаванням 95 ЕВ5З і пеніциліну/стрептоміцину. тАб до людського 5121 і контрольні проби додавали в різних концентраціях (50 мкл/лунку) й інкубували при 37 "С. Після інкубації протягом 1 год. 10 рекомбінантний "зрілий" ІЇ-33 (амінокислоти 111-270 із ЗЕО ІЮ МО: 3) додавали при кінцевій концентрації 10 нг/мл у 10 мкл живильного середовища ЕРМІ. Далі клітини інкубували при 37 "С протягом 18-24 годин, щоб забезпечити ІІ -33- опосередковану індукцію ЇЇ -5 і ІІ -6. Після інкубації клітини збирали і клітинний супернатант збирали для подальшого виявлення ІЇ -33-індукованих
І/-5 ії 1--6 із використанням аналізу ЕГІЗА (К80О Зузіетв5) або мультиплексного аналізу на основі гранул (МіПіроге).
Аналіз вивільнення цитокінів тучними клітинами людини й аналіз вивільнення простагландину 02 (РОЮ»)
Тучні клітини отримували з клітин СОЗ34- пуповинної крові людини (І оп7а).
Заморожені флакони з »1,0х106 клітин СО34 пуповинної крові швидко розморожували і переносили у 50 мл конічну пробірку. Краплі підігрітого або кімнатної температури середовища 5біет-Рго 34 «т добавки (всього 25 мл; Іпмігодеп) повільно додавали до клітин.
Клітини центрифугували при 1000 об./хв. протягом 15 хвилин і ресуспендували у середовищі (10 мл 5(етРго-34 з наступними добавками: 30 нг/мл 1-3, 100 нг/мл І/-б і 100 нг/мл ЗСЕ.
Клітини висівали у 2 лунки б-лункового планшета і культивували протягом 1 тижня. На 4-й день клітини розширювали 1:3 у середовищі Зіет Рго-34 з добавками. На 7-й день неприклеєні клітини видаляли і висівали по 0,5х10б5/мл у середовище 5іетРго-34, що містило 10 нг/мл І/-6 і 100 нг/мл СЕ. Клітини розширювали щотижня для підтримки щільності висіву клітин 0,5х105/мл, поки тучні клітини не досягали 6-10-тижневої зрілості (оцінку проводили шляхом експресії ЕсеКл, сКії і триптази).
Зо Зрілі тучні клітини культивували по 0,5х10б/мл у БіетРго-34 і щоденно стимулювали протягом 4 днів у 1-4 (10 нг/мл; Рергоїесп), 1-6 (10 нг/мл; КО БЗузіетв5) і ЗСЕ (100 нг/мл;
Іпмйгтодеп). Перед аналізом клітини збирали, центрифугували при 1000 об/хв протягом 10 хв і ресуспендували у свіжому середовищі ЗіетРго-34 або РЕРМІ, що містив 1095 ЕС5 без антибіотиків, з 100 нг/мл людського рекомбінантного ЗСЕ. Клітини висівали з щільністю нанесення від 65 000 до 75 000 клітин/0,16 мл/лунку у 96-лунковий планшет із плоским дном, оброблений тканинною культурою. Анти-5Т12Ї тАр додавали до планшета для досягнення кінцевої концентрації 50, 10, 2, 0,4, 0,08, 0,016, 0,0032 мкг/мл протягом 30 хвилин перед додаванням 1-33. Рекомбінантний "зрілий" людський 1-33 (залишки 111-270 із ЕО ІО МО: 3) також готували при 10Х (10 або 30 нг/мл) у середовищі ї 100 нг/мл 5СЕ. 20 мкл 10Х 1-33 додавали у лунки для досягнення кінцевої концентрації 1 (фіг. б ії фіг. 7А-7Е) або 3 нг/мл (фіг. ВА-8Е), і планшети інкубували протягом ночі при 37 "С, 595 СО». Супернатант культури збирали через 18-24 години після стимуляції. Планшети центрифугували при 1000 об/хв протягом 10 хвилин. Супернатант видаляли і поміщали в 9б6-лунковий планшет з О-подібним дном і зберігали при -20"С до проведення аналізу. Набори цитокінів людини з Міїїроге використовували для аналізу рівнів цитокінів з використанням технології І итіпех м. Рівні РОЮ» вимірювали з використанням набору Ргозіадіапаіп 02-МОХ ЕЇА від Саутап Спетіса! Сотрапу, відповідно до інструкцій виробника. З метою підвищення чутливості ЕГІЗА, РОЮ» в супернатантах культури тучних клітин перетворювали на МОХ-РОЮ», що не розкладається (метоксиамін-РаО»г), шляхом обробки гідрохлоридом метоксиаміну (МОХ-НСЇ).
Аналіз інгібування зв'язку рецептора миші і ліганда (аналіз КІ В миші) 9б-лунковий чистий планшет (ММУК) покривали 50 мкл 2 мкг/мл козячого Есу- фрагмент- специфічного (даскзоп ІттипокКезеагсі) антитіла до людського дО приблизно на 16 годин при 4 "С. Решту стадій завершували при кімнатній температурі. Лунки інкубували з блокуючим буфером, промивали і додавали 50 мкл 2 мкг/мл мишачого 5121 -ЕСО, з'єднаного з Ес людини, протягом 1 години. Планшет промивали і додавали 1 мкг/мл біотинільованого ІпіЇ-33 з анти- т5т2. антитілами або без них. Планшет промивали, і проводили виявлення із стрептавідин-
НЕР (даскзхоп Іттипе Кезеагсі), і формували сигнал із субстратом ТМВ (відділ КОЇ компанії
Ейгодегаїай Іпаивігіез), дотримуючись інструкцій виробника.
Аналізи генів-репортерів миші і людини (аналіз ЕОА миші або людини) бо Клітини НЕК293 висівали по 50 000 клітин на лунку у білі 96-лункові планшети з прозорим дном, оброблені тканинною культурою (МОМ), у ОМЕМ, 10 95 ЕВ, й інкубували у зволоженому інкубаторі при 37 "С, 5595 СО» протягом 24 годин. Клітини котрансфікували векторами, що кодують КДНК 5121 -ЕСО людини або миші, вектором МЕ-кВ-люциферази (5ігаї(адепе, Адіїепі
Тесппоодіе5, м. Санта-Клара, штат Каліфорнія, США) з використанням І іроїесіатіпе "м 2000 у середовищі Орії-МЕМ (Іпмігодеп) з використанням стандартних протоколів. Після 24 годин інкубації при 37 "С, 5 95 СО» трансфіковані клітини обробляли мишачим (КО бЗузіетв5, залишки 109-266 із БЕО ІО або без них протягом 16 годин при 37 "С, 595 СО». Активність люциферази вимірювали з використанням реагенту 5іеаду-СІіобю (Рготеда), відповідно до інструкцій виробника.
Аналіз проліферації Т-клітин мишей
Тп2-клітини миші (010.054.1, АТСС) культивували у готовому живильному середовищі: середовище КРМІ 1640 з 2 мМ І-глутаміну доводили до вмісту бікарбонату натрію 1,5 г/л, глюкози 4,5 г/л, НЕРЕ5 10 мМ і пірувату натрію 1,0 мМ, і з додаванням: 0,05 мМ 2- меркаптоетанолу, 10 мкг/мл І-ї (КО Зувіетв5), 10 95 фетальної бичачої сироватки, 10 95 щурячого фактора Т-5ТІМ з Соп А (культуральна добавка щурячого 1-2, доступна від Весіоп ріскіпзоп). Клітини двічі промивали середовищем для аналізу (ЕРМІ, 10 95 ЕВ5, без 1І-1, без Т- 5ТІМ), ресуспендували до 1,25х10» клітин на мл і висівали у 80 мкл середовища у білих 96- лункових планшетах з прозорим дном, оброблених тканинною культурою (МОМС, м. Рочестер, штат Нью-Йорк, США). Різні кількості мишачого І/-33 (залишки 109-266 із 5ЕО ІЮ МО: 5) додавали до клітин для досягнення кінцевого об'єму для аналізу 100 мкл. При тестуванні нейтралізації антитіл контрольні антитіла (впорскнуті у використане середовище гібридоми) або супернатанти гібридоми додавали до клітин й інкубували протягом 1 години з наступним додаванням 20 мкг/мл І/-33. Планшети культивували протягом 24 годин у зволоженому інкубаторі при 37"С, 595 СО». Кількісне визначення життєздатних клітин виконували за допомогою реагентів СеПТйег-СіоФ (Рготеда, м. Медісон, штат Вісконсин, США); протокол виконували відповідно до інструкцій виробника.
Аналіз тучних клітин, отриманих із кісткового мозку мишей
Тучні клітини мишей отримували з кісткового мозку мишей Ваїр/с (6 тижнів).
Клітини висівали по 300 000 клітин/лунку в середовище КРМІ (без ендотоксинів), 10 95 ЕВ5, 10 95 кондиціоноване для клітинної лінії середовище МЕНІ, 10 нг/мл І--3 (Рергоїесі), 0,1 мМ незамінних амінокислот, 1 95 пеніциліну/стрептоміцину (Іпмігодеп). Анти-5Т21Ї тА (100, 10, 1, 0,1 або 0,01 мкг/мл) інкубували з клітинами протягом 1 години перед додаванням рекомбінантного мишачого "зрілого" І--33 (залишки 109-266 із БЕО ІЮ МО: 215 (10 нг/мл; Н.О
Зузіет5)). Приблизно через 24 години супернатанти збирали і заморожували до аналізу з використанням набору Мійроге Моцизе 22-Ріех для Іштіпех"М, відповідно до інструкцій виробника.
Аналіз ендотеліальних клітин супо
Ендотеліальні клітини аорти яванського макака, культивовані в живильному середовищі-2 клітин ЕСМФ-2 (І опа), висівали у 96-лункові планшети для тканинної культури по 10 000 або 20 000 клітин на лунку. 50 мкл антитіл анти-5Т2І додавали до клітин, починаючи з 100 мкг/мл з наступними 4- або 5-кратними розведеннями, і інкубували при 37 "С протягом 1 години перед додаванням рекомбінантного "зрілого" І -33 супо (ЗЕО ІЮ МО: 4). До клітин потім додавали п'ятдесят мікролітрів 20 нг/мл 1ІІ-33 яванського макака і інкубували при 37 "С протягом 24 годин.
Для оцінки 1І/-33- індукованих відповідей із продукуванням цитокінів супернатанти збирали й оцінювали рівні цитокінів за допомогою комплекту І/-8 для приматів, крім людини, для
Гитіпех м (МійПіроге), відповідно до інструкцій виробника.
Аналіз перитонеального лаважу мишей
Для збору перитонеальних клітин очеревини 6 мишей ВаїЇр/с промивали загальною кількістю
З мл РВ5. Виявили, що більшість із цих клітин є лімфоцитами і макрофагами, як визначено експресією В220 і Е4/80 (аналіз ЕАС5). Приблизно 1 95 становили тучні клітини сКі-- (СО117-в).
Клітини центрифугували, й осад ресуспендували по 1х105 клітин/мл у середовищі АїЇІрпа
МЕМ--10 95 ЕВ5.--100 од./мл пеніциліну ї- 100 мкг/мл стрептоміцину (Іпмігодеп). Клітини висівали по 200 мкл на лунку в 96-лунковий планшет і залишали на 2 год. при 37 "С. Анти-5Т121Ї. тАБ додавали до клітин за 30 хвилин до додавання 10 нг/мл "зрілого" мишачого ІІ -33 (НО Бувієтв; залишки 109-266 з ЗЕО ІЮ МО: 215). Супернатанти збирали через 24 год. після додавання ІІ -33, зберігали при -20 "С до аналізу й аналізували з використанням набору МіПіроге Моцизе 22-Ріех для І итіпех "М, відповідно до інструкцій виробника.
Приклад 1. Утворення антитіл до щурячого 5121.
Щурів інтраперитонеально імунізували мишачими 5Т2-ЕРс (На бувієт (бег27- Зег342 із бо ЗБО ІЮО МО: 5), й аналізували на титри специфічних Ідс. Після того як отримували достатні титри, спленоцити виділяли і приєднували до фолікулярних клітин (БО). Отримані гібридоми висівали у 96-лункові планшети або метилцелюлозу і культивували протягом 10 днів. Антиген- специфічні клони визначали відповідно до стандарту захоплення ЕГІЗА на зв'язування з т51Т2-
Ес, і проводили перехресний скринінг відносно одного білка Ес. Специфічні до мишачого 512 гіобридоми додатково аналізували на інгібування зв'язування ІІ -33 із 572 в ЕЇ ІЗА і на інгібування
І. -33-індукованої проліферації Тп2-клітин мишей 010.54.1. Гібридоми, які демонстрували нейтралізацію в обох аналізах - зв'язку рецептор-розведення. У-області гібридом секвенували і клонували у середовище миші Ід0с51. Специфічність домену 5Т21/-ЕСО досліджували з використанням стандартного імуноферментного аналізу з електрохемілюмінесцентним виявленням, з використанням різних конструкцій, що містять обміни людських і мишачих доменів.
Антитіло, секретоване гібридомою С1999, клонували у середовище миші Ідс1 і назвали
СМТО3914. Послідовності варіабельних областей СМТО3914 і СОК наведено в Таблиці 2.
СМТО3914 не реагує перехресно з людським 5121 і зв'язує домен | мишачого ЗТ21І -ЕСО.
Таблиця 2 нНСОВІ1 неова2 нсОоВвЗ
Назва тАдБ . . ЗЕО І . . ЗЕО І . . ЗЕО І
С1999/
СМмтОо3914 НУаМА зІтратзтУУворзУкКка ОБООМЕрУ
ГСОВ1 срв2 ГсорвЗ
Назва тАдБ . . ЗЕО . . ЗЕО . . ЗЕО І
С1999/
СМмтТОоЗ914 КО ЕУБОСОМЕ 16 вУБМАЕ5 ЕОАТНОРЕТ
ЗЕ Ю МО:
ЕМО МЕЗО ОРОВБІ КІ БСТАЗО РІЗНИ МАМУВОАРТКИЇ ЕМ М затрат УУвраіУкКавеЕтІзАОМАКМТОМІ ОМОБ5І В5ЕОТАТУУСАН 19 озорУгрУУаоаУмММУтТУ5о нини
Сто БЕОТО МО:
РУМІТОТРУБІ БМП ЧРрОАБІЗСКОЗОБВІ ЕУБОИОЗМІ ЕМ М ОКРООБР ог ПИаУЗМАЕЗамуРОВРІаЗавзатовТІКІЗВМЕРЕОГ ЯУУМСЕОАТНОР 20
ЕТРазЗзаткКІ ЕІК
Приклад 2. Утворення мишачих антитіл до людського 5121.
Для утворення мишачих антитіл до тАб людського 5121. провели дві різні імунізації. ВАСВ/Сс інтраперитонеально імунізували розчинним 5Т2-Ес (НО бЗувієтв, 5ЕО
ІО МО: 157), й аналізували на титри специфічних до. Після того як отримували достатні титри, спленоцити виділяли і приєднували до фолікулярних клітин (БО). Отримані гібридоми висівали у 96-лункові планшети і культивували протягом 10 днів. Антиген- специфічні клони визначали за допомогою стандартного захоплення ЕГІЗА на зв'язування з С-кінцевим Нівзб- міченим пизТ21І -ЕСО і перехресну реактивність із Нізб-міченим 512 -ЕСО супо. Специфічні до людського 5121. гібридоми, які перехресно реагують з 5Т2І. супо, додатково досліджували на інгібування зв'язування 1-33 із пи5Т21. в аналізі ЕГІЗА і на інгібування активації МЕ-кВ в аналізі репортерного гена. Клони, які демонстрували інгібування в аналізі репортерного гена або в обох аналізах - ЕГІЗА й аналізі репортерного гена, - відбирали для додаткових досліджень.
Для додаткових аналізів відібрали антитіла від гібридом С2494, С25194А і С2521А. С2519А і
С2521А зв'язують людський 5121! на домені І, ї С2494 зв'язує людський 512 на домені І.
Антитіло С2494 клонували в середовище людського Ідс2, і повнорозмірне антитіло назвали
ЗТ М62.
Анти-512І. тАбр отримали від бепомас отр згідно запатентованої технології ДНК-імунізації з використанням повнорозмірних конструкцій 5121. і ревакцинації трансфікованими клітинами з метою експресії людського 57121 -ЕСО. Скринінг гібридом на зв'язування з людським 5121 -ЕСО проводили за допомогою проточної цитометрії. Було підтверджено, що клони, які продемонстрували зв'язування в цьому аналізі, зв'язували пП5Т21-ЕСО, і їх додатково характеризували на зв'язування з 5121І-ЕСО супо за допомогою стандартною захоплення
ЕГІ5А. Вибрані клони характеризували за допомогою інгібування зв'язку рецептор-ліганд ЕГІ5А та аналізу репортерного гена. Клони, які демонстрували інгібування в аналізі репортерного гена або в обох - Е|ГІ5А й аналізі репортерного гена, - відбирали для додаткових досліджень.
Для додаткового аналізу антитіло від гібридоми С2244 Сепомас відбирали та клонували у середовище людського Ід02. Повнорозмірне антитіло назвали 5ТІ М15. 5ТІ М15 зв'язує 512 на домені І.
Послідовності доменів УН, МІ ії СОР мишачих антитіл до людських клітин показано в Таблиці 3.
Таблиця З нНСОВІ1 неова2 нсОоВвЗ
Назва . . ЗЕО . . ЗЕО . . ЗЕО
С2519А | ОУМММ МІМРУМОЗТТУМОКЕКОЇ 25 |ЕСОТМІГАМ/ЕДУ
С2г521А | ТУМ/ ММ ОІТЕРАБОЗТУУМЕМЕКОо ЗЕМІУМІМЕОУМЕДУ сті мі ЗОХАММ РІБУ5СОТЗЕМРІІ К5 УОСУЗЕрУ
С2494/
СТІ Мб роУмМн ВІОРАІСМТЕМАРКЕРОЮ сСОгЕМАМОУ
ІСОВІ1 сова ісоВвЗ . . ЗЕО . . ЗЕО І . . ЗЕО
С2519А | ВББОБІМУЗМО МТМ Е КУ5МВЕ5 ЕОС5ЗНУРРТ
С2г521А | ВАБОМІСТАМН МХАЗЕ5І5 ООБМТМРЕТ
СТІ МБ ВАЗКЗУЗТВО5БУМЕ ГА5МІ Е5 ОН5ВЕЇІРУТ
С2494/
СТІ Мб ІТМТОІОЮОМІН ЕСМТІ ВР гОоБОММІТ
ЗЕО Ю МО:
ЕРОГООБОРЕЇ МУКРОАБУКІЗСКАЗСОУЗЕТОУМММУУКОЗНнаТкві ЕМ
С2519А | ОМІМРУУЯ ЗТ ТИМОКЕКОаКкКАТІ ТМОКЗЗМТАММНІ МЗІ Т5ЕОБАМУУСА 45
ВЕСОТМІ АМ/ЕАУМУуСсОСТІ МУЗА
ОО ОО5аРЕЇ МАРИИТЗУКІЗСКАБЗИахТЕ ТУ ММУУКОАРООСІ ЕМ бгб521А | ООІРРАБОЗТУУМЕМЕКоКкКАТІ ТМОТ55ЗТАММОЇ 55І Т5ЕОТАМУЕСАВН 46
ЗЕМІУМІМЕОУУЕАУМУСсОоСсТТ ТУ
Солі ЕМОГ ОЕБОаРОЇ МКРБЗОБІ БІ ТОТУТавг5ІТЗОМАММУМІВОГРаБКІ ЕУМа
СТІ МІ5 ЕРІБМ5ОаОТ5ЕМРБІ КЗВІЗМТАОТЗКМОЕН ОЇ МЗМТТЕОТАТУМСАБУ 47 рахзеримссоатттУ55
Содом ЕМО ОО5МАЕЇ МАРОАБУКІ ЗСТАЗАЕЄЕМІКООУМНУУКОА!РЕОСГ ЕМУ
СТІ Мб ІСВІОРАІЯСМТЕМАРКЕРООКАТМТАОТ5ЗМТАМІ ОЇ 551 Т5ЕОТАМУУСА 48 г арЕМАМОУМСОСТУТУЗо
ЗЕО Ю МО:
ОМІ МТОТРІ БІ РУБ арОАБІЗСАЗБЗОБІМУЗМаМТ М ЕММ ОКРООБРК б2519А | ППИКУМЗМАЕЗамМРОоВЕЗазавзаТОЕТІ КІЗАМЕАЕОЇ МУУУСЕОСЗНУРР 49 тТРа,асаткКі ЕК
І СТО5РАЇЇ ЗМ5РЕЕВУЗЕЗСВАЗОМІСТАМНУМООВТМаЗРАЦП ІКМА б2гба1А | БЕБІЗИІРОНЕЗОИаЗазаИто ТІ ТІЗОМЕЗЕПІАВУУСОО5МГМУРЕТРОаЗИОТКІ. 50
ЕІК
Сом РІМГ ТО5РАБІ АІБІ ФООВАТІБЗСВАЗКОУЗТЗаЗЗУМЕМУХУООКРИООРРКІ.
СТІ МІ5 ПМГ АЗМІ ЕС МРАНЕЗИаЗавзаИатовТтІ МІНРУЕЕЕВБАААУМСОНЗАЕЇІРУТ 51 га,саткі ЕК
Содом ЕТТУТО5РАБІ 5БМАТОЕКМТІВСІТМТОІЮОМІНУМООКРОЕРРКИ ІЗЕС
МТ А!АРЕМРБЗАЕЗЗБЗамМОа ТОЕМЕТІЕМТІ БЕОМАВУМСІ ОБОММІ тТРаАСИТ 52
ЗІ М62
КГЕСК
Приклад 3. Утворення повністю людських антитіл 5Т2І Рар, що зв'язують 5Т2І. людини, вибрали з бібліотек фагового дисплея де помо ріхХ, як описано в пі еї аї., У Мої Віої 397:385-96, 2010; публ. міжнар. заявці на патент Мо УМО2009/085462; публ. заявці на патент США Мо
О52010/0021477). Коротко, бібліотеки створювали шляхом диверсифікації каркасів людського походження, де гени ІСНМ1-69"01, ІСІНМ3-23701 і ІЗНМ5-51701 зародкової лінії Мн рекомбінували з людським мінігеном ІЗНУО-4 через петлю НЗ, і гени 012 (І5КМ1-39701), І 6 (пКМЗ3-11701), А27 (120КМ3-20"701) і ВЗ (15КМ4-1701) людської зародкової лінії Мі Карра рекомбінували з мінігеном І5КО-1 для складання повних доменів УН і МІ. Для диверсифікації вибрали позиції варіабельних областей важких і легких ланцюгів навколо петель НІ, Н2, 11,12
ІЗ, що відповідають позиціям, визначеним як ті, що часто контактують із білковими і пептидними антигенами.
Відмінність послідовності в обраних позиціях обмежувалася залишками, що зустрічаються в кожній позиції в сімействах генів ІСНМ або ІСІ М зародкової лінії відповідних генів ІЗНМ або
ІСГМ. Відмінність на петлі НЗ створювали з використанням короткої та середньої синтетичних петель довжиною 7-14 амінокислот. Розподіл амінокислот на НЗ створили з метою імітації варіації амінокислот, яку спостерігали в людських антитілах. Розробку бібліотеки докладно описано в зі еї аї., У Мої Віо! 397:385-96, 2010. Каркаси, які використовували для створення бібліотек, назвали відповідно до генів МН і Мі. людської зародкової лінії їхнього походження. Для отримання 24 унікальних комбінацій МН:МІ для скринінгу три бібліотеки важких ланцюгів об'єднали з чотирма легкими ланцюгами зародкової лінії або бібліотеками легких ланцюгів зародкової лінії. Усі 24 комбінації бібліотек МН:МІ. використали для експериментів фагового пеннінгу проти пиЗТ2І-ЕСО-Ес. Пеннінг бібліотек проводили з використанням з'єднання Ес пизТ2І-ЕСО (залишки 19-328 із БЗЕО ІЮ МО: 1). Пеннінг проводили у 2 різних форматах: антиген (Ад) у розчині і дисплей Ад. Для Ад у розчині вкриті стрептавідином магнітні гранули блокували в РВЗ із З 95 знежиреним сухим молоком. З'єднання біотинільованого (ВО) антигену пи5Т21 -ЕСО людського Ес (ВЕпиЗТ2І-ЕСО-Ес) з вищою у 10 разів концентрацією людського білка Ес, як конкурента, змішували з бібліотеками фагів Рар-ріХ. Фаг Раб-РІХ, зв'язаний із ВЕпи5еТ2І -ЕСО-
Ес, захоплювали на блокованих вкритих стрептавідином (ЗА) магнітних гранулах. Фаги
Зо відбирали протягом трьох циклів, де концентрації пи5Т21І -ЕСО-Ес варіювали від 100 нм, 10 нМ, 10 нМ у циклах від 1 до 3, відповідно. Для дисплея Ад ВІі-пи5Т21І -ЕСО-Ес наносили на вкриті ЗА магнітні гранули. Бібліотеки фагів Бар-РІХ разом із 10-кратною надлишковою кількістю людського білка Ес одночасно додали до 5А магнітних гранул, на яких представлено ВІ-пи5Т2І -
ЕСО-Ес. Використані концентрації Ві-Ад становили 100 нм, 10 нМ, 10 нМ у циклах від 1 до 3, відповідно. Скринінг проводили для обох форматів пеннінгу за допомогою ЕГІЗА для Еар, що зв'язується з білюоом пи5Т21І-ЕСО-Ес. Від цих виборок виділили загальну кількість 79 Бар, що зв'язувалися з П5Т21І-Ес. За допомогою градації ЕГІЗБА визначено, що Раб-НиТ2501-39 мали найкращу загальну зв'язуючу активність.
Аналіз інгібування зв'язування 1-33 проводили на основі ЕГІ5А на 79 Раб. Загалом 32 Бар продемонстрували інгібування зв'язування ІЇ/-33 із пи5Т21-ЕСО-Ес. 46 Бар обрали для дозрівання аффінності з кампанії ріХ де помо.
Приклад 4. Дозрівання аффінності повністю людських антитіл 5721.
Дозрівання аффінності вибраних антитіл проводили з використанням способу дозрівання "у лінії", який описано в ЗП еї аї., У Мої Віої! 397:385-96, 2010 ії М/О09085462А1. У цій технології області МН Рар-клонів, отриманих від першої селекції, з'єднують з бібліотеками відповідного каркасу МІ. Всі гени МН із 46 Рабр, визначених у Прикладі 3, клонували у відповідні бібліотеки дозрівання Мі. як сукупності, відповідно до їхнього вихідного сімейства генів МІ. Використані бібліотеки каркасів МІ і їхні схеми диверсифікації наведено в Таблиці 4. Каркасами М. людського походження є наступні: ІЗКМ1-39701 (012), І2КМ3-11 (16), ІЯКМ3-20 (Аг27), 1аКМа4- 1701 (83) і описані, наприклад, у публ. заявці на патент США Мо О52012/0108795. Для пеннінгу дозрівання аффінності бібліотеки фагів спочатку додавали до ВТ-пи5Т2-ЕСО-Ес. Після інкубації комплекс дозрівання бібліотеки фагів/ВТ-Н5Т21 -ЕСО-Бс додавали до вкритих 5А магнітних гранул. Концентрації ВІ-пи5Т2-Ес варіювали, відповідно, від К1! до КЗ при Ло НМ, 1 нМій,1 нм.
Кінцеве промивання циклу З проводили протягом ночі при кімнатній температурі в присутності 10 нМ неміченого пи5Т21 -ЕСО-Ес з метою додаткового покращення аффінності.
Таблиця 4 77717111 |Схемадиверсифікаціїбібліотекидля різнихкаркасів М./-/://:/ССС:(//СУО/
Кабаї о Зба |5МА 0 |вмМобНнУМ//|Ї- 77777777 Її мо 17 8бе | 07777 фвмМобнВУ// |Ї- 77777777 Її
ІЗ
96 |Ммугв 0 фун фм/уговВ //// ЙмувРММГ/З
Від пеннінгів дозрівання загалом отримали 161 послідовність унікальних Бар. Рар, що продемонстрували найбільше зв'язування з пи5121І -ЕСО, перетворювали в до для додаткової характеристики.
МАр 5Т2М48, 5Т12М49, 5Т2М50 їі 5Т2М51 відібрали для додаткової характеристики, і їхні послідовності МН, МІ ї СОК наведено в Таблиці 5. МАБ 5Т2М48, 5Т2М49, 5Т2М50 і 5Т2М51 зв'язують людський 5121. на домені ІІ і перехресно реагують із 512. мишей.
Таблиця 5
ЗЕО ЗЕО
МО: МО: І 5Т2Ма8 5ТІ232 |ВАБОБУВОАСАЇ бо |РАБМВАТ | 64 ООРМТМРІТ 67 5Т2М49 5216 |ВАБОБМАМАГА| 61 |КА5МВАТ | 65 ООУУСМ/РІТ 68 5Т2МБО 5228 |ВАБОБУБЗМАІА| б2 |РАБМВАТ | 64 ООРЕММУРІТ 69 (БТ2МБІ|ТСтІЗ |ВАБОБІББУИМ| 63 |МА5БІОВ | 66 (00О5У5ТРІТу| 70
ВЕ В о і відн піші
ЗТ2М48 | ЧПМРаОЗУТАУЗРОРОСОМТІЗАОКВІЗТАМІ ОМ/55І КАБОТАМУМСАВІ 5 71 свАгруусоаті МТУ
БЕ я в ном інн Й
ЗТ2М49 | ЧИМРаОЗУТАУЗРОЗРОСОМТІЗАОКВІЗТАМІ ОМ/55І КАБОТАМУМСАВІС 72 сМЕриУсОоаті МТУ тн ння
ЗТ2М50 | МЕСПРІБЄИТАМУАОКРОСАМТІТАРЕЗТЗТАУМЕЇ 551 АЗЕОТАУУУСАВН 71
УМЕЕРомУусОості МтУ55 вт ВЕ |в
ЗТ2М51 | МОСПРІБЄЕТАМУАОКРОСАМТІТАРЕЗТЗТАУМЕЇ 551 АЗЕОТАУУУСАВН 73 ртТРОГОУМУСсОСТІ МТУ
ЗМААТИаРАВЕЗИаБИаБаИатТОЕТІ ТІ ЕРЕОЕАМУМСООЕМ ГУ РІТРИ ОСТ КМУЕІК
ЗМААТИаРАВЕЗИаБИава ТОЕТІ ТІ ЕРЕОЕАМУ СОУ Мам РІТЕСОСТ КМЕїІК
ЕІМГТО5РАТІ 5І 5РЕЕВАТІ ЗСВАБОЗМООМІ А МООКРОСАРВІ СУК
ЗТ2М50 | АМВАТа РАВНЕЗазаза Товт ТІЗЗІ ЕРЕОРЕАУУУСООУМААРМТРИаО 76 аТКкМЕїК
РІОМТО5РБОБІ БАБМаО ВМТ СВАБЗОБІЗЗМІ МУМООКРОКАРКІ ПИМА
ЗТ2М51 | ББІ О5аУРЗНЕЗОЗОаБО ТОЕТІ ТІЗ5 ОРЕОБАТУУСООБУЗТРІ ТРСЮОСТК 77
МЕЇІК
Приклад 5. Характеристика антитіл анти-5Т21.
Антитіла, отримані від різних кампаній, як описано вище, додатково характеризували за їхньою здатністю блокувати взаємодію ІІ -33/5Т21,, оскільки інгібування ІІ -33-індукованої сигналізації, як виміряно за допомогою аналізу репортерного гена МЕ-кВ, здатністю антитіл інгібувати відповіді тучних клітин, за їхньою аффінністю з людським і З5Т2Ї супо і перехресною реактивністю з 5Т2Ї мишей. Картування епітопів виконували з використанням химерних конструкцій обміну доменів людського/умишачого 5121, як описано у розділі "Матеріали і способи". Результати експериментів показано в Таблицях 6, 7 і 8. У Таблицях 7 і 8 знак "я" вказує на те, що антитіло блокує взаємодію ІІ -33/5Т21, а знак "-" вказує на те, що антитіло не блокує взаємодію 1/-33/57121Ї. Експерименти з СМТО3914 проводили з використанням клітин мишей і реагентів завдяки відсутності перехресної реактивності до людських клітин.
Людські клітини і людські реагенти використовували в аналізах для всіх інших антитіл.
Характеризовані антитіла поділили на групи: ті, які блокують взаємодію 1 -33/5Т121Ї (тАр
ЗТІМ15, 5ТІ М62 ії СМТОЗ914), і ті, які не блокують взаємодію ІІ -33/5Т121 (тАБ С2519, б2521, 5Т2М48, 5Т2М49, 5Т2М50 і 5Т2М51). Антитіла, що блокують взаємодію ІІ.-33/5Т21., зв'язуються з доменом І 5121, тоді як антитіла, що не блокують взаємодію, зв'язуються з доменом ПП 5121.
Проаналізовані антитіла інгібували низхідну сигналізацію 57121, згідно визначення за допомогою аналізу репортерних генів МЕ-кВ їі І/-33З-індукованого вивільнення цитокінів базофільною клітинною лінією КИ812 людини або, у випадку СМТО3914, визначення за допомогою проліферації клітин Тп2 мишей. Антитіла, що зв'язуються з доменом І! 5121, інгібували на вищому рівні відповіді тучних клітин людини, як визначено секрецією цитокінів і хемокінів, у порівнянні з антитілами анти-512, що зв'язують домен І 5712. СМТОЗ3914, який зв'язує домен
Ї мишачого 5121 ії не реагує перехресно з людським доменом, також здатний інгібувати ІІ -33- індуковані відповіді тучних клітин мишей.
Таблиця 6
Відповідна
Таблиця 7 оте ЛО | вєопом КОТ вне тАр й ВІВ" ваАя цитокінів | цитокінів тучними | Епітоп 5121. гіоридома б . І азофілами клітинами 1110 | - 17754 | 11111717 - 1171 0000 бе5 | - 175 | | - 171 поз о 5Т2МА8 | МА | - я | п 7-7 | п/тоз3 о 5Т2МАУ | МА | - | я | п 7-1 птоз о о5Т2М5О | МА | - | ях | п 77 - | птоз оо5Т2МБ! | МА | - | я | п | - | м/тоз »Інгібування зв'язку рецептор-ліганд
Аналіз репортерних генів
ПО1 - домен 01 512. людини тоО1 « домен 01 512 миші
ПОЗ - домен ОЗ 512. домену п/тО3З - домени 01 і 02 572. людини і миші пе не тестували
Таблиця 8 зле ЕЕ че Ге ЕМ ТЕ ЕД тА й ВІВ" вВОадя й клітин цитокінів тучними гібридома Т-клітин й жк ЗТ2І. очеревини клітинами »Інгібування зв'язку рецептор-ліганд
Аналіз репортерних генів "Отримано з кісткового мозку
Приклад 7. Антитіло СМТОЗ3914, яке зв'язує домен | 5121, інгібує інтраназальну 1І/-33- індуковану гіперреактивність дихальних шляхів (ГДШ), запалення дихальних шляхів і відповіді тучних клітин мишей.
Чотири послідовні щоденні інтраназальні дози по 2 мкг/мишу "зрілого" ІІ -33 (850 бЗувіетв) (залишки 109-266 із БЕО ІЮО МО:215) вводили самкам мишей ВАГ В/с. Антитіло СМТОЗ3914 до
ЗТ2Ї миші дозували підшкірно з профілактичною метою, у дозі 20 мг/кг (або 2 мг/кг або 0,2 мг/кг), за 24 години до першого інтраназального введення 1-33. Контрольні миші отримували ізотипний контроль СМТО5516 або РВ5 за 24 год. до першого інтраназального введення І1Ї-33.
Гіперреактивність дихальних шляхів (ГДШ) до наростаючих доз метахоліну вимірювали з використанням форсованих кроків з системою Ріехімепі (Зсігед, м. Монреаль, Квебек, Канада).
Для вимірювання гіперреактивності дихальних шляхів (ГДШ) мишей анестезували за допомогою 100 мг/кг пентобарбіталу і 13 мг/кг фенітоїну і проводили трахеотомію перед підключенням до
Ріехімепі. Для отримання вихідних показників мишам розпилювали фізіологічний розчин, а потім дві дози (10 і 20 м/мл) метахоліну. Для фізіологічного розчину і кожної дози метахоліну протягом приблизно 2 хвилин збирали значення опору (К) з використанням миттєвої пертурбації. Піковий опір розраховували з використанням тільки значень із коефіцієнтом детермінації (СОЮ) вище 0,9.
В окремій групі мишей проводили лікування і аналіз клітинної відповіді у легенях. Через двадцять чотири години після останнього введення ізотипу ІтпіЇ-33 або РВ5 мишей умертвляли шляхом передозування Зієерамжау?. Лаваж легень мишей проводили за допомогою 0,7 мл холодного РВЗ з 0,1 95 ВЗА. Отримані бронхоальвеолярні (ВАГ) рідини центрифугували при 1200 об/хв протягом 10 хвилин і безклітинні супернатанти зберігали при -80 "С до аналізу цитокінів/хемокінів. Зразки ВАГ використовували для підрахунків загальної кількості клітин із використанням гемоцитометра. Для диференціальних підрахунків ВАГ - 200 клітин підраховували за цитоспіновими мазками після фарбування за Райтом-Гімзою під світловим мікроскопом. Безклітинні супернатанти збирали і зберігали при -80 С до використання у
Зо білкових аналізах І штіпех. Тканини легень видаляли і потім проводили перфузію через правий шлуночок з використанням 5 мл холодного стерильного РВ5 до необхідної перфузії. Долі легень поміщали у пробірку Разі РгерфФ, що містила 1 мл РВ5 « інгібітор протеази, заморожували і зберігали при -80"С для профілювання цитокінів/хемокінів. Мультиплексний аналіз цитокінів/хемокінів виконували відповідно до протоколу виробника для МійПіроге 22-Ріех для мишей. Протеазу тучних клітин мишей 1 (птпМСР-1) у рідині ВАЇ. аналізували за допомогою
ЕПЗА (Могедип 5сіепійіс).
Гіперреактивність дихальних шляхів
СМТО3914 істотно інгібував гіперреактивність дихальних шляхів у моделі запалення легень, яке викликали інтраназальним введенням 1І--33 (фіг. 1). СМТОЗ3914 вводили підшкірно за 24 год. до чотирьох послідовних щоденних інтраназальних введень ті! -33 у дозі 2 мкг/мишу. Піковий опір дихальних шляхів, визначений за допомогою Ріехімепі, істотно знизився при дозі СМТОЗ3914 20 мг/кг. Кожний відрізок представляє середнє значення хх стандартна похибка середнього (ЗЕМ) для мишей в групі від трьох (СМТО5516, антитіло ізотипного контролю) до шести.
Аналогічні результати отримали в двох окремих дослідженнях. Значущість визначали з використанням двофакторного дисперсійного аналізу (двосторонній АМОМА) з повторним тестом Бонферроні, СМТОЗ3914/ЛІ -33 ""р«0,05 у порівнянні з СМТО5516ЛІ -33; ії "р«0,001 порівняно з РВ5 у групі, якій вводили 1-33.
Запалення дихальних шляхів
СМТО3914 суттєво інгібує рекрутування клітин при бронхоальвеолярному лаважі (ВАЇ) у застосованій моделі (фіг. 2). СМТОЗ3914 вводили підшкірно за 24 год. до чотирьох послідовних щоденних інтраназальних введень Іпі!/-33 у дозі 2 мг/мишу. Показник лейкоцитів ВАЇ. був суттєво підвищений при введенні ІІ -33 і значно інгібувався при застосуванні 20 мг/кг СМТО3914.
Кожний відрізок представляє середнє значення х стандартна похибка середнього (ЗЕМ) для мишей в групі від трьох (СМТО5516, антитіло ізотипного контролю) до шести. Аналогічні результати отримали в двох окремих дослідженнях. Значущість визначали з використанням двофакторного дисперсійного аналізу (двостороннього АМОМА) з повторним тестом
Бонферроні, ""р«0,001.
Відповіді тучних клітин іп мімо
Зо Тучні клітини накопичують у своїх гранулах протеази, зокрема триптази і хімази, які швидко вивільняються при активації тучних клітин. Протеаза тучних клітин мишей 1 (птМСР-1) - це |Д- хімаза, яку вивільняють активовані тучні клітини, і, як відомо, вона є важливою для боротьби з паразитарними гельмінтними інфекціями. (Кпідні еї аІ., У Ехр Мей 192:1849-56, 2000; НипіІєу єї аІ., Рагазіє Іттипо! 12:85-95, 1990). Визначення ММСОСР-1 можна використати як маркер активації тучних клітин, яка, як було продемонстровано, індукується у залежній від тучних клітин моделі запалення дихальних шляхів: домашній пиловий кліщ (ми апа Спеп, у Іттипої 171:3808- 15, 2003). За допомогою ЕГІЗА (Могедип Зсіепіййс) визначено, що ММСР-Ї був суттєво підвищений у рідині ВАГ, отриманій від мишей, яким вводили 1-33, і інгібувався СМТО3914 (фіг. 3) дозозалежним чином. Значущість визначали з використанням однофакторного дисперсійного аналізу (односторонній АМОМА) з повторним тестом Тьюкі, "р«б,01, "р«0,001 у порівнянні з групою, якій вводили ІЇ--33.
Приклад 8. Домен І-зв'язучі антитіла анти-5Т21. інгібують відповіді тучних клітин іп міго
Відповіді тучних клітин оцінювали за вивільненням хемокінів і цитокінів мишачими і людськими тучними клітинами, а також простагландину 02 у тучних клітинах людини.
Домен І-зв'язуче антитіло анти-5Т2Ї СМТО3914 інгібувало ІІ -3З-індуковане вивільнення цитокінів, у тому числі ЗМ'Є5Е (фіг. 4А), 1/-5 (фіг. 48) і ТМЕс (фіг. 4С), тучними клітинами, отриманими з кісткового мозку мишей.
Домен І-зв'язуче антитіло тар С2494 (511 М62) до людського 5121 інгібувало ІІ -33- індуковане вивільнення РОЮ» тучними клітинами, отриманими з пуповинної крові людини, індукованими З нг/мл І--33 при концентраціях антитіла 2, 10 і 50 мкг/мл (фіг. 5).
Домен І-зв'язучі антитіла анти-512І С2494 і С2244 інгібували ІІ -33-індуковане вивільнення
СМ'С5Е, ІІ -5, І -8, 11-13 ї І--10 тучними клітинами, отриманими з пуповинної крові людини, при концентраціях антитіла 50 мкг/мл, 10 мкг/мл і 2 мкг/мл (фіг. б і 8А-8Е). Ступінь інгібування залежав від визначеної концентрації цитокіну/хемокіну, аналізованого антитіла та його концентрації і використаного середовища. Розрахований середній відсоток (95) інгібування становив 50,6-100 9о у всіх аналізах, що проводили при концентрації антитіла 2 мкг/мл, і 62- 100 95 при концентрації антитіла 50 мкг/мл (фіг. 9). Домен ПІ-зв'язучі антитіла анти-5Т2І Сб2521, б2519, 5Т2М48, 5Т2М49, 512М50 і 5ЗТ2М51 продемонстрували помірне інгібування, або його відсутність, або стимуляцію ІІ -33- бо індукованого вивільнення цитокінів тучними клітинами (фіг. 7А-7Е і 8А-8Е) при концентраціях антитіла 50 мкг/мл і 10 мкг/мл. Ступінь інгібування залежав від визначеної концентрації цитокіну/хемокіну, аналізованого антитіла і використаного середовища. Розрахований середній відсоток (95) інгібування становив -594,4-31,9 95 у всіх аналізах, що проводили при концентрації антитіла 2 мкг/мл, і -481,5-36 96 при концентрації антитіла 50 мкг/мл (фіг. 9). У деяких аналізах антитіло 5Т2М50 інгібувало секрецію ЗМ'С5Е, 1-5, 1-10 ї 1-13 при концентрації антитіла 10 мкг/мл (фіг. ВА-8Е).
Середній відсоток інгібування розраховували з використанням такої формули: (1- (концентрація цитокіну, вивільненого в присутності тАБ)(концентрація того самого цитокіну, вивільненого у відповідь на 1-33 за відсутності тАб)) х 100. Концентрації цитокінів вказано в пг/мл. У деяких випадках відсоток інгібування має негативне значення, що вказує на те, що вивільнення цитокінів у присутності тАб було фактично вище, ніж вивільнення за відсутності тАб. Незначні зміни ефективності тАб можуть виникнути залежно від концентрацій 1-33, що використовують для індукування вивільнення цитокінів у тучних клітинах. Подібним чином можуть бути незначні варіації активності тАб залежно від середовища, яке використовували для аналізу (ЗіетРго-34 проти КРМІ/ЛО 95 ЕС5). Всі проаналізовані домен І-зв'язучі антитіла анти-5Т2І інгібували всі виміряні вивільнення цитокінів і хемокінів принаймні на 50 95, що виміряно середнім відсотком інгібування при концентрації 2 мкг/мл, 10 мкг/мл або 50 мкг/мл.
Приклад 9. Домен І-зв'язучі антитіла анти-5Т21Ї інгібують індуковане інтраназальним введенням І--33 ремоделювання дихальних шляхів.
С57ВІ /Є-мишам інтраназально вводили "зрілий" ІІ -33 (або РВ5) у дозі 1 мкг/мишу (залишки 109-266 із БЕО ІО МО: 215) у дні 01, 03, 05, 007 і 09 і проводили аналіз легень на 10-й або 20-й день. Антитіло СМТОЗ3914 до 5121 миші або ізотипний контроль (СМТО5516) вводили підшкірно у дозі 2 мг/кг за 6 год. до першого інтраназального введення 1-33. Контрольні миші отримували ізотипний контроль СМТО5516 або РВ5 за 6 год. до першого інтраназального введення ІІ -33.
Роздуті легені фіксували у 1095 буферному формаліні для гістологічного дослідження; барвники, які використовували для аналізу, включали НУЕ, Мабзоп Тгіспготе і Шифф-йодну кислоту (РАБ).
Введення 1-33 викликало помірну або значну гіпертрофію епітелію бронхіол і гіперплазію келихоподібних епітеліальних клітин, і перибронхіолярні інфільтрати головним чином
Зо змішувалися з еозинофілами. Бронхіолярна епітеліальна гіпертрофія і гіперплазія не були очевидними у тварин, які отримували СМТОЗ3914. Барвники Маз55оп Тгіспоте були необхідні для визначення кількості наявного колагену; це фарбування дозволило виявити гіпертрофію келихоподібних клітин у тварин, які отримували І/-33. У тварин, які отримували СМТОЗ3914, інфільтрати в альвеолах і перибронхіальних областях були відсутні.
Приклад 10. Утворення повністю людських антитіл 5121.
Додаткові Раб, які зв'язують 512! людини, вибрали з бібліотек фагового дисплея ріхХ де помо, по суті, як описано в Прикладі 3, за винятком того, що пеннінг бібліотек проводили з використанням химерної конструкції ННМ-5Т2І (5ЕО ІО МО: 6, Таблиця 1) з біотинільованим антигеном, захопленим на покритих стрептавідином магнітних гранулах. Бібліотеку фагів блокували в РВ5З-Т із З 956 знежиреним сухим молоком. Для спрямування фагового відбору до
Еарб, які специфічно зв'язувались із амінокислотними послідовностями домену І людського 5121, конкурентний білок, химеру МНМ'5Т2І (ЗЕО ІЮ МО: 7, Таблиця 1) додавали до блокуючого розчину. Фаги відбирали протягом трьох циклів із подальшим скринінгом за допомогою ЕГІ5А на зв'язок Раб із білком 521 -Ес.
Для картування специфічності домену дев'ятнадцять Бар, що зв'язувалися з П5Т21-Ес, виділили з цих виборок і провели додатковий скринінг на зв'язування з химерними конструкціями 5121. (Таблиця 1), а також із білками: мишачим 5121. і людським 5121, і до того ж охарактеризували за їхньою здатністю блокувати взаємодію 1 -33/п5тТ2І. Бар 5Т2НЕ1, 5724 і 5126 блокували взаємодію ПІІ -33/57121 і зв'язували домен І 5121, і їх переносили на етап дозрівання аффінності.
Таблиця 9
ЗЕО ЗЕО ЗЕО
Го ен енер
МО: МО: МО: тата яиме во іувовотиувнеков | но |отлоннннокох 5
ЗЕО ЗЕО ЗЕО
МО: МО: МО: 5Т2ЕбІЗтгі24|УКкІ6 |ВАБОБМОРАГА | 87 |ОАБМНАТ | 90 ГООРУММУРІТ 952 5ТаР4|5т2гі23|УКІ6 |ВАБОБУВОРІА | 88 |ОАБМААТ | 90 ЇООМІНАРІТ / 93 (5ТаР1|5тгІ20|Мк-в3 |К55О5МІ У55ММКМУСА 89 |М/АТВЕВ | 91 ЇОО5МТУРЕТ | 94
Приклад 11. Дозрівання аффінності Раб, які зв'язують людський 5121.
Проведено дозрівання аффінності ЗТ2Е1, 5Т12Б4 і 5Т12Е6 із використанням способу дозрівання "у лінії", який описано в ЗпПі еї аї., | Мої Віо! 397:385-396, 2010 і публ. міжнар. заявці на патент Мо У/О2009/085462, і Прикладі 4. Бібліотеки дозрівання аффінності створили для 5Т2Е1, 5Т2Б4 і 5126 шляхом диверсифікації відповідних бібліотек легких ланцюгів, ВЗ, 16 і 16, відповідно, і комбінуванням бібліотек із областями МН Раб. Схему диверсифікації для залишків легких ланцюгів для бібліотек дозрівання аффінності 6 і ВЗ показано в Таблиці 10. Нумерація позицій відповідає Кабаї. Для пеннінгу дозрівання аффінності біотинільований пиЗТ2-ЕСО-Ес захоплювали на покритих стрептавідином (5А) магнітних гранулах при концентраціях 10 нМ для циклу 1, 1 нМ для циклу 2 і 0,1 нМ для циклу 3.
Кінцеве промивання циклу З проводили протягом ночі при кімнатній температурі в присутності 10 нМ неміченого пи5Т21І -ЕСО-Ес.
Таблиця 10
Зба | - | вмранму і | Збе | - | вморанвзу
ІЗ
96 | мує | УМН
Вибірки бібліотек дозрівання легких ланцюгів 5Т2Е6 дали покращені сполучення (51214, 5Т2Е17, 5Т2Е31 і 5Т2Е41) (фіг. 10 і фіг. 11). їх розглядали як Раб із використанням Ргоїеоп, і вони продемонстрували помірні покращення аффінності від 2 нМ до 400 пМ.
Для додаткового покращення аффінності 51214, 5Т2Е17, 5Т2Е31 їі 5Т2Е41 стандартний важкий ланцюг 5Т2НА1 у 5Т2Е14, 5Т2Е17, 5Т2Е31 і 5Т2Е41 рандомізували в позиціях НСОКТІ і
НСОКО2 31, 32, 33, 35, 50, 52, 53, 56 і 58 по Кабраї з використанням схеми диверсифікації, яку показано в Таблиці 11. Отриману бібліотеку важких ланцюгів парували з чотирма легкими ланцюгами 5121-32, 5121 35, 5121 49 і 5121 59 із покращеною аффінністю,
пеннінг і скринінг цієї бібліотеки проводили, як описано для бібліотек дозрівання легких ланцюгів. баб з покращеним зв'язуванням відносно 57214 виділяли і перетворювали в до для додаткової характеристики. Отримані антитіла (ЗТ М103, 5ТІМ107, 5ТІМ108, 5ТІМ123,
ЗІ М124, 5 М206, ЗІ М207, 5 М208, ЗІ М209, 5ТІ М210, ТІ М211, 5ТІ М212, 5ТІ М213,
ЗТ М214, ТІ М215, 5 М216, 5 М217, 5ТІ М218, 5ТІ М219,
ЗТ М220, 5ТІ М221, ЗІ М222) (фіг. 10 ї фіг. 11) мають каркаси, отримані з МНЗ-23 або Мк- 6. Усі антитіла зв'язують домен І 5121 і блокують взаємодію 1І.-33/5Т21.
Таблиця 11
Додаткові різновиди створили й експресували для 5121257 МН 5ТІМ208 для заміщення елементу ОР на початку НСОКЗ. Послідовності різновидів показано на Фіг.12.
Приклад 11. Адаптація каркасу людського походження (НЕА) С2494
Адаптацію каркасу людського походження проводили, по суті, як описано у публ. заявці на патент США Мо 052009/0118127 і Егапо5зоп еї аїЇ., У Мої! Віо! 398:214-231, 2010. Коротко, послідовності важких і легких ланцюгів порівнювали з послідовностями людської зародкової лінії (тільки алелі "01" станом на 1 жовтня 2007 р.) із використанням пошуку ВІ А5Т у базі даних
ІМТ (Каах, єї аї., Мисі. Асіаз. Нев. 32, 0208-0210, 2004; І еїгапс еї аї., Мисі. Асіа Невз., 33, 0593- р597, 2005). З даного набору генів зародкової лінії людини видалили вироджені гени (100 95 ідентичні на амінокислотному рівні) та гени з неспареними залишками цистеїну. Решту найближчих за сумісністю генів зародкової лінії людини, як у каркасі, так і в областях СОБК, вибрали як акцепторні каркаси людського походження. На основі загальної гомології послідовностей та довжини СОК, а також подібності СОК, загалом вибрали 9 МІ і 7 МН каркасів людського походження зародкової лінії. ЕЕ-4 вибрали на основі подібності послідовностей генів
ІСНОЛОУК зародкової лінії, УК2 для ланцюгів МІ. і УНІ для ланцюгів МН (Каазв, еї аї., Мисі. Асіа
Ве5. 32, 0208-0210, 2004; І ейапс М.-Р еї аї., МисіІ. Асій Невз., 33, 0593-0597, 2005) з послідовністю С2494). Потім для створення різновидів НЕА дані СОК з С2494 (підкреслено на фіг. 14) переносили в обрані акцепторні каркаси людського походження, за винятком тієї області, що відповідає СОК-НІ МН. Для цієї області комбінація СОК і НМ або коротший НСОК2 (називається Кабраї-7, див. публ. заявці на патент США Мо 052009/0118127) переносили з антитіла нелюдського походження до людських ЕК, оскільки залишки НСОК2, виділені сірим кольором на фіг.14, не контактували з комплексами антиген-антитіло відомих структур (АІтаадго, У Мої Несоопії. 17, 132, 2004).
Послідовність зрілого білка С2494 (МІ: ЗЕО ІЮ МО:52; МН: 5ЕО ІЮ МО: 48) показано на фіг. 14. На фіг. 14 залишки СОК (Кара!) підкреслено, петлі НМ Споїпіа показано нижче СОК, і залишки, перенесені у вибрані каркаси людського походження, показано під НМ (НЕА). Залишки
НОСОК, виділені сірим кольором, не переносили в усіх різновидах.
ЗО-модель гомології для фрагмента Ем з С2494 будували з використанням модуля моделювання антитіла з молекулярного операційного середовища (Моїесціаг Орегайїпд
Епмігоптепі, МОЕ) (ССО, м. Монреаль, Канада). Дану модель використовували для оцінки порушень здатності до прояву, таких як відкриті залишки метіоніну і триптофану, потенційні елементи М-глікозилювання і деамідування. У ЇСОМКЗ є потенційно відкритий залишок Меї (МУ94), який грунтується на структурній моделі Ем. Для його видалення створили та охарактеризували різновид (511 І 280, 0126) з мутацією М94Г. Для важкого ланцюга залишок К елемента САК (залишки 92-94 Сппоїйпіа, фіг. 14) безпосередньо перед НСОКЗ може мати негативний вплив на кластер негативно заряджених залишків (залишки 031, 032, 096 і 0101а
Споїпіа, фіг. 14), які можуть бути важливими для зв'язування. Створили та охарактеризували МН із заміщенням аргініну лейцином у залишках 94 СпоїШіа (САК - СА). тАБ, які поєднують розроблені важкі і легкі ланцюги, разом із батьківськими С2494 експресували та аналізували на зв'язування з людським 512. Від створених тАБб НЕА, тАб з ланцюгами МН, які мають каркаси важких ланцюгів І5ІНМ1-24701 (5БО ІЮ МО: 148) ї ІЗНМ1-01 (5БО ІЮ МО: 149), (5ТІ НІ195 і
ЗТ НІ194), добре експресували антитіла і зв'язували 5Т2Ї при з'єднанні з різними легкими ланцюгами НЕА, що містили каркаси ІБКМ3-15701 (12) (ЗЕО І МО: 150), ІКМ1-9701 (18) (5ЕО
ІО МО: 151), І2КМ1-5701 (112) (5ЕО ІЮО МО: 152), І2КМ1-12701 (15) (5ЕО ІО МО: 153), І2КМ1- 39701 (012) (5ЕО ІО МО: 154), ІШКМ1-27701 (А20) (5ЕО ІО МО: 155) або ІБКМ1-33701 (018) (5ЕО
ІО МО: 156), (ЗТ 280, 51 278, 51277, 51 276, 511 275, 5111 274, 511 273, ЗТ І 272).
Послідовності різновидів МН і МІ. з НЕА представлено в Таблиці 12. Перенесені залишки підкреслено, а описані вище додаткові заміщення виділено сірим кольором. У Таблиці 13 показано 5ЕО ІО МО: а також унікальні РОК (плазмід) і СВІ5 ІО для кожного МН і МІ. НЕА.
З'єднання важкого і легкого ланцюгів для створених тАбр, обраних для додаткової характеристики, наведено в Таблиці 14.
У Таблиці 15 представлено каркаси людського походження (з'єднані області М ії У), використані для перенесення СОК С2494.
Таблиця 12.
Адаптовані до каркасу ланцюги МІ. (з'єднані з послідовністю УК2г). СОК підкреслено. »МІ 2494 (батьківський) (ЗЕО ІЮ МО: 52)
ЕТТУТО5РАБІ БМАТОЕКМТІВСІ ТМ ОІОСМІНУУООКРИОЕРРКІ ІЗЕСМТІ АР
СУРБЗАЕЗБЗБЗаМаТОЕМЕТЕМТІ БЕОМАВУМСІ ОБОММІТРС,АСТКІ ЕІ К »МІ 2494-І24КМ1-33701 018 (5ЕО ІО МО: 135)
РІОМТО5РБОБІ БАБМааОВАвМТІТСІТМТОІОМІНУМООКРОКАРКІ ГІМЕСМТІ АР
СуРЗАЕЗОаБИаБаТОЕТЕТІЗ5І ОРЕБІАТУМСТГ ОБОММІ ТРСОСТКІ БІК »МІ 2494-І24КМ1-27701 А2О (ЗЕО І МО: 136)
РІОМТО5РББІ БАБМООВМТІ СІМ ВІООМІНУМООКРОКМУРКІ ІМЕСМТІ АР суРЗАЕЗОаБИаБаИтТОгЕТІ ТЗІ ОРЕОМАТУМСЇ ОБОММІТРС,СОСТКІ БІК »МІ 2494-І24КМ1-39701012 (ЗЕО І МО: 137)
РІОМТО5РББІ БАБМООВМТІТ СІМ ВІООМІНУМУООКРОКАРКІ ІМЕСМТІ АР
СуРЗАЕЗОаБаБаИаИтТОгЕТІ ТЗІ ОРЕОБАТУМСІ ОБОММІТРСаОСТКІ БІК »МІ 2494-І24КМ1-1270115 (ЗЕО ІЮ МО: 138)
Коо) РПІОМТО5РОБУЗАЗУСОВМТІТСІТМГОІВОМІНУМООКРОаКАРКІ ПІМЕСМТІ ВР
СуРЗАЕЗОаБаБаИаИтТОгЕТІ ТЗІ ОРЕОБАТУМСІ ОБОММІТРСаОСТКІ БІК »МІ 2494-І24КМ1-5701112 (ЗЕО ІЮ МО: 139)
РІОМТО5РБЗТІ БАБМОСОВМТІТ СТ МГ ОІООМІНУУОСОКРОКАРКИ ІМЕСМТІ АР
СуРЗАЕЗИаБаБЗаИтЕНЕТІ ТІ ОРОСБАТУМСЇ ОБОММІТРаОСТКІ БІК »МІ 2494-І24КМ1-970118 (З5ЕО ІО МО: 140)
РІОГТО5РЗЕЇ ЗАБМООВМТІТ СІМ ОІОСМІНУУОСОКРОКАРКІ ІМЕСМТІ АР
СуРЗАЕЗИаБаБЗатЕНЕТІ ТІ ОРЕОБАТУМСІГ ОБОММІ ТРСОСТКІ БІК »МІ 2494-І24КМ3-1570112 (ЗЕО ІЮ МО: 141)
ЕІММТО5РАТІ БМЗРОЕВАТІ БСІТМТОІООМІНУМООКРООСАРА І ІМЕСМТІ АР
СІРАВЕЗаЗаЗатЕРЕТІ ТІЗ5І О5БЕОБАУУУСТ О5БОММІТЕСОСТКІ ЕК »МІ 2494-І(БКМ1-39701 0125 (5ЕО І МО: 142)
РІОМТО5РБОБІ БАБМОИаОАМТІТО ІТМТОІВОМІН УУМООКРОаКАРКІ ІМ ЕСМТІ АР
СМуРЗАЕЗИаБавзатовТтІ ТЗІ ОРЕОБАТУМСІ ОБОМІ ТРСОСТКІ БІК
Адаптовані до каркасу ланцюги МН, з'єднані з УНІ. »МНа2494 (батьківський) (5ЕО ІЮ МО: 48)
ЕМО ОО5МАЕЇ МАРОАБЗУКІ БСТАЗАЕМІКОВ'УМНУ/УКОВРЕОСІ ЕУЛЛОИаВІОРАІЯСЄМТЕМАРКЕО
РКАТМТАОТ5ЗМТАМІ ОЇ 551 Т5ЕОТАУУУСАЇ СВЕМАМОУМУСОСТОУТУЗО »МН2г494-І2НМ1-МК01 (ЗЕО ІЮ МО: 143)
ЕМОЇ МОБ АЕУККРОАТУКІЗСКУЗАЕМІКОВУМНУУ/МООСАРИаКаї! ЕУУМаВІОРАІСМТЕМАЕКЕ ба ВМТІТАОТЗТОТАММЕЇ 551 В5ЗЕОТАУУУСАТОаОЕМАМОУМУСОСТІ МТУ »МН2г494-І2НМ1-24701 (5ЕО І МО: 144)
ОМОЇ МОБСАЕУККРАБУКУЗСКУЗАЕМКОВУМНУУВОАРИаКаИагєЕМУМаИавІОРАІСМТЕМАРК
РОЮ ВМТМТЕОТЗТОТАМУМЕЇ 551 А5ЕОТАУУУСАТОарЕМАМОУУСОСЄТІ МТУ
Таблиця 13 77111110 ВаріантнийНнЕА | ровйя | СВІБІЮ | 5ЕОЮМО.
НЕА
Таблиця 13 ши Варіантний НЕА СВІ ІЮ 5ЕО І МО:
НЕА МІ 2494-І4КМ3-15'0112 9873 51278 »МІ 2494-І2КМ1-9701 18 9874 51277
МІ 2494-І4КМ1-501 112 9875 51276
МІ 2494-І4КМ1-1270115 9876 51275 »МІ2494-І4КМ1-39701 012 9877 5274
МІ 2494-І0КМ1-27701 А2Оо 9878 51273 »МІ 2494-І4КМ1-33701 018 9879 51272
Таблиця 14
Ланцюги МН
Батьківський» | "УНга9АЛенм1- |хуНг494-1ОНМ1- 24201 "ОЇ
Ланцюги МІ. 084211 0089870 089871 0084212 ЗТ М126 ЗТ М186 5ТІМ196 »МІ 2494-І3КМ1-39701 0125 | роОВо865 ЗТ. М127 ЗТ М187 5ТІМ197 »МІ 2494-І3КМ3-15'0112 2089873 ЗТ М129 5ТІМ189 5ТІМ199 »МІ 2494-І3КМ1-970118 0089874 5ТІМ130 5ТІМ190 ЗтТІМ200 »МІ 2494-І3КМ1-5701 112 0089875 ЗТ. М131 ЗТ М191 ЗТ М201 »МІ 2494-І30КМ1-120115 0089876 5ТІМ132 5ТІМ192 ЗТ М202 »МІ 2494-І3КМ1-39701 012 0089877 5ТІМ133 5ТІМ193 5ЗТІМ2о3 »МІ 2494-І3КМ1-27701 А2О 0089878 ЗТ М134 5ТІМ194 ЗТ М204 »МІ 2494-ІЗ3КМ1-33701 018 0089879 5ТІ.М135 5ТІМ195 ТІ М205 «Батьківський - МН і МІ. С2494
Таблиця 15
Каркаси, використані для людини Адаптація каркасу
НЕА Послідовність зЗЕО Ю
Походження |Походження д МО: області М області У каркасу каркасу
ОМОГ МОЗСОАЕУККРОАБУКУЗСКУВИТІ ТЕ ЗМНУУВОА
; РОКИ ЕМ/МОСЕОРЕ внут гато УНІ ТосєтуУАОКРОСВУТМТЕОТОТОТАУМЕІ 55185ЕОТАМУХУ | 0179
САТМСОСТІ УТУ55
ЕМО МОЗСаАЕУМККРОАТУКІЗСКУЗОУТЕТОУУМНУМООСА , РОКИ ЕМ Ма МмоРЕЮ
ІвНУТ-го УНІ оєтмАЄКЕОСВУТІТАОТОТОТАУМЕЇ 55185ЕОТАМУУСА | 179
ТУСОСсТІ ТУ
ЕІММТО5РАТІ 5М5РОЕВАТІ ЗСВАБОЗУ55ЗМІ АММООКРО
ІаКМ3-15701 ко ОАРВИ ІМОА5ТВАТСІ 150
І2 РАВЕЗО5О5ОИТЕЕТІ ТІЗ5І ОБЕОЕАМУУСООУМММРТЕСО
ОТКІ ЕК
РІО ТО5РОЕЇ БАЗМОЮВМТІТСВАБОСІБЗОУІ АМ/УМООКРОК
Й АРКИ ІМААБТІ О5ОМР
ІШКМТ-0118| УК2 0 |58Б505050ТЕЕТІ ТІЗ5 ОРЕОБАТУУСООІ МЗУРТЕСОСТІ 1?!
КІ ЕК
ПІОМТО5РБ5ТІ ЗБАБМАЮВМТІТСВАБОБІЗЗУМ АМУМООКРО акм1-5701 ко КАРКИ У ОАБОІ ЕОМ 152
І12 РОВЕЗО5ОЗОИТЕЕТІ ТІЗЗІ ОРООЕАТУУСООУМОУЗТЕвО
ОТКІ ЕК
Таблиця 15
Каркаси, використані для людини Адаптація каркасу
НЕА Послідовність зБОИО
Походження |Походження МО: каркасу каркасу
РПІОМТОБРОБУЗАЗУИОВМТІТСВАБОСІЗБЗУМ АММООКРа
ІаКкМм1-12701 уко КАРК ІМААББІ ОС 153
І 5 МРЗАЕЗаБазЗаТОгРТІтТІЗБВІ ОРЕОБАТУМСООАМЗЕРТЕРСО
СТКІ ЕК
РІОМТО5РББІ БАБМОаОАМТІТ СВАБОБІЗЗМІ МУ УООКРИа
ІСКМІ-39701 уко КАРК ІМААББІ ОБИМР 154 012 знНЕЗИаБаБатТОЕТІ ТЗІ ОРЕОБАТУМСООБУЗТРТРаОС
ТКГЕІК
РІОМТО5РББІ БАБМООВМУТІТ СВАБОСІЗММІ АМУМООКРО
ІаКкМ1-27701 уко КУРКІМААЗТІ ОБИМ 155
Аг20 РОВЕБЗаБаБаТОЕТІ ТІ ОРЕОМАТУУСОКУМЗАРТЕСО
СТКІ ЕК
РІОМТО5РББІ БАБМОаОАМТІТ СОАБОВІЗММУІ МУМООКРаа
ІСКМІ-33701 уко КАРКМОАБМІ ЕТИаМ 156 018 РОВЕБЗаБЗаБаТОЕТЕТІЗІ ОРЕПІАТУУСООМОМІ РТЕРСОС
ТКГЕІК
Приклад 12. Створення мутантів аланіну та зародкової лінії людини для сканування паратопів
Сайт-спрямований мутагенез проводили для оцінки значення зв'язування окремих залишків
СОБ, а також деяких залишків, які мають потенційний вплив на інші характеристики антитіла. На основі вищевказаної молекулярної моделі Ем С2494 передбачено, що підмножина оброблених розчинником залишків СОК причетна до зв'язування антигена. Вони пройшли мутацію до аланіну та/або відповідного "подібного до людського" залишку, який є відповідним залишком у найбільш сумісному гені зародкової лінії. Заміщення О101аА (залишки Споїпіа), (0104А у 5ЕО
ІО МО: 48) у МН С2494 знизило Кзворотну приблизно у 4 рази, з 1,43х107 до 3,2х105.
Оскільки заміщення 0101аА знизило Кзворотну Баб С2494 зв'язку до 5121, очікували, що та сама мутація може також підвищити зворотний коефіцієнт у різновидах С2494 НЕА. Таким чином, 0101аА (нумерація Споїпіа) включили у МН із 5ТІНІ194 (хМнН2494-ІС2НМ1- "01, 5ЕО І
МО: 143) для створення МН 51 Н201 (5БО ІО МО: 145). 5ТІН201 парували з 7 легкими ланцюгами 5111280, 5111277, 5111276, 5111275, 5111274, 5111273 і 57111272 (Таблиця 13 і
Таблиця 14) для створення тАб 5ТІ М226, ТІ М227, 5ТІ М228, ЗТ М229, 5ТІ М230, 5ТІ М231 ї
ЗТ М232, які додатково характеризували. Тому тАр 5ТІ М226, 5 М227, 5ТІ М228, 51 М229,
ЗТ М230, 5ТІ М231 і 5ТІ М232 мають ідентичні послідовності | СОМК1, І СОМ2, СО, НОСОК і
НОСОК, при порівнянні з батьківським антитілом С2494, і відмінний НСОМКЗ (ЗЕО ІЮ МО: 146,
СОБЕМАМАХУ). Крім того, антитіло ТІ М266 МІ 5ТІМ280 мало унікальний СОКУ: ГО5ОМСТ (ЗЕО ІО МО: 147)
ЗТ Н2гО1 (ЗЕО ІЮ МО: 145):
ЕМОЇ МОБ АЕУККРОАТУКІЗСКУЗАЕМІКОО УМНУУМООСАРИаКаїі ЕУУМаВІОРАІМТЕМАЕКЕ ба ВМТІТАОТЗТОТАММЕЇ 551 В5ЕОТАУУМСАТарРЕМАМАУМУСОЮСТІ МТУ
Заміщення 0101аА включення НСОКЗ (нумерація Споїпіа):
ЗЕО ІЮ МО: 146: Ф0ООЕМАМАУ
Антитіло ЗТІ М266 МІ. 5ТІ М280 мало унікальний І СОМКЗ: ГОБОМИ ТТ (ЗЕО ІЮ МО: 147)
Приклад 13. Характеристика антитіл анти-5Т21
Зо Антитіла, отримані з фагового дисплея, гібридоми й операції з адаптації каркасів людського походження характеризували в перебігу різних аналізів, у тому числі зв'язування з пи5Т21 -ЕСО, супо5Т2І-ЕСО, вимірювання аффінності, зв'язування з людськими/мишачими химерами для визначення зв'язування домену, аналізів інгібування рецептор-ліганд, аналізів репортерного гена й аналізів відповіді тучних клітин.
Аффінність антитіл, отриману в операціях фагового дисплея, до людського і 512. супо, а також специфічність їхнього зв'язування з людським 5121. показано в Таблиці 16. Усі антитіла в
Таблиці 16 зв'язували домен І людського 5121.
Таблиця 16 77 | АффінністьдолюдськогоЗТ2І | Аффінністьдо 5Т2І супо |Зв'язування в корм кенепину кр коти «МВ,
ЗТШМ2гоб| 6,39ЕО6 | 1,60Е-04 | 25 | 940Е407 | 583Е04 | 6 | п
ЗТШМ2г09| 6б,59ЕО6 | 1,70Е-04 | 26 | 339407 | Зл1Ее04 | 9 | п
ЗТШМеаТо| пеїЕн07 | 227Е-04 | 19 | 570407 | Б528Е04 1 Й.-.Й9 | п
ЗТШМ2г13| 7,54ЕО6 | 108Е-04 | 14 | т1,64Ее407 | ї24е04 | 8 | п
ЗТШМ2го| 5,80ЕО6 | 9,53Е-05 | 16 | 1,60Е407 | 140041 Щ--9 | п
ЗТШМ226| 2,16ЕО7 | 1,93Е-03 | 90 | т,00Еч408 | 30102 301 | 1 о5ТіМ2з2| 1,78Е:407 | 449Е-04 | 25 | т00Еч.08 | 79703 80 | о
Аффінність до антитіл анти-5Т2І в операції НЕА відносно батьківського (ЗТ М62, С2494) наведено в Таблиці 17. Аффінність аналізували за допомогою РгоїеОп. Експерименти проводили при 25 "С із використанням буфера РВЗ-ТЕ Ргоїеоп (РВ5, 0,005 95 Р20 і З мМ ЕДТА) як рухомого буфера. Для проведення експериментів сенсорний чіп ГРХ приготували шляхом ковалентної іммобілізації козячих анти-людських Ес (- 5800 КІ), захоплено 122-146 одиниць відповіді (КО) Маб. Захоплення Мар супроводжували введенням 5121 -ЕСО від 0,024-15 нМ (5- кратні розведення) протягом 4 хв. (200 мкл, при 50 мкл/хв). Дисоціацію контролювали протягом 30 хвилин для всіх реакцій. Регенерацію виконували з використанням двох 15-секундних впорскувань 10 мМ гліцину, рН 1,5. Дані узгоджували 1:1 із моделлю дрейфу базової лінії.
Темпи асоціації для зразків є швидкими, для побудови кривої та оцінки аффінності використали модель Ленгмюра з масообміном. Усі зразки мали швидші зворотні показники, ніж такі у батьківського клону і контрольного Маб. Різниця у зворотних показниках була головною причиною нижчої аффінності різновидів НЕА у порівнянні з батьківським антитілом.
Таблиця 17 11111011 АффінністьдолюдськогоЗТ2Ї. | Аффінністьдо ЗТ2 супо
Таблиця 17 7711111 Аффінністьдолюдського5Т2Ї | Аффінністьдо ЗТ2 супо.//-/-:-:УСО «БТІ М62-С2494, батьківське антитіло
Таблиця 18
Походження тАБ ВІВ ВбА ендотеліальних питомі 250, но/ті ІС50, ро/ті клітин супо базофілами
Фаговий дисплей о 5ТШМ22о | 039 | 060 | м | -
НЕА
Гібридома и ж- Сильне інгібування т Деяке (часткове) інгібування - Відсутнє інгібування
МТ не тестували " Тестували як гібридому
ЕІ В :- Інгібування зв'язку рецептор-ліганд КОСА - Аналіз репортерних генів
Вибрані антитіла аналізували на відповіді тучних клітин вимірюванням інгібування З нг/мл ЇЇ -
ЗЗ3-індукованого вивільнення ЇЇ -5, ІІ -13 і І--8 тучними клітинами, отриманими з пуповинної крові людини, як описано з використанням 100 мкг/мл, 10 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,1 мкг/мл або 0,01 мкг/мл антитіла в КРМІ-10 95 ЕС5. У даних умовах аналізу всі аналізовані антитіла інгібували ІІ -33- індуковане вивільнення цитокінів ІЇ-5, ІЇ/-13 ї 1/-8 приблизно на 40-100 95 при концентрації антитіла 100 мкг/мл, у порівнянні з контрольним зразком, індукованим 1-33.
Приклад 14. Антитіло анти-5121 інгібує низхідні сигнальні шляхи у базофілах людини
Антитіла анти-5Т2| аналізували на їхню здатність інгібувати сигналізацію р38 МАРК у базофілах людини.
Цільну кров збирали в пробірки з гепарином і доводили до кімнатної температури (КТ) до початку аналізу. 1 мл аліквоти крові переносили в 50 мл конічні пробірки та додавали антитіло анти-5Т2І. (5ТІ 8252) або ізотипний контроль (СМТО 8937), розведені в РВ5, для досягнення кінцевої концентрації 2, 20 або 200 мкг/мл. Пробірки обережно збовтували для перемішування і поміщали у термостат при 37 "С х 30 хвилин, обережно збовтуючи через 15 хвилин. Кров потім фарбували міченими флуорохромом антитілами до антигенів клітинної поверхні (СО123-РІТС,
САТН2-РСР-Суб.5 і СО45-АРС-С7) і пробірки інкубували при 37 "С протягом 15 хвилин. 1 мл нагрітого культурального середовища (КРМІ-1640/1095 ЕВ5/1 95 пеніцилін-стрептоміцин) додавали у кожну пробірку перед додаванням розведеного у нагрітому культуральному середовищі ІІ -33 для досягнення кінцевої концентрації 10 нг/мл. Зразки інкубували при 37 "С х 10 хвилин перед додаванням 20 мл підігрітого буфера ВО РіозпйПому І узе/Ріх у кожну пробірку, з метою одночасного лізису еритроцитів і фіксації зразків. Вміст пробірок перемішували шляхом 10-кратного перевертання й інкубували при 37 С х 10 хвилин. Зразки промивали 20 мл стерильного РВ5 КТ, ресуспендували в 2 мл буфера їх ВО Регт/Л/азі КТ й інкубували при КТ хвилин. Зразки промивали один раз 2 мл буфера ВО Регт/Л//авпй та потім ресуспендували в 400 мкл буфера ВО Репгт///а5п. Додавали РЕ-мічене антитіло до р38-МАРК (уСеїї бідпаїїпу, Мо по кат. 69085), і зразки інкубували 30 хв. при кімнатній температурі із захистом від світла.
Зразки промивали один раз 5 мл буфера Регпт//Л/азєпй перед ресуспендуванням у 100 мкл
Зо буфера РАС5 і переносили в 96- лунковий планшет із круглим дном. Зразки аналізували з використанням проточного цитометра ВО І ЗКІЇ із застосуванням системи з високою пропускною здатністю (НТ), збираючи якомога більше подій для кожного зразка. Дані аналізували з використанням програмного забезпечення Ріошо. Базофіли визначали як сра.аб5-АСКТН2СОр123ж, й оцінювали відсоток р38 МАРК-позитивних базофілів для кожного режиму. Попередня інкубація цільної крові з анти-5Т2Ї тАВ (5118252) призвела до дозозалежного інгібування 1 -33- індукованого фосфорилювання 38-МАРК, тоді як з ізотипним контролем (СМТО 8937) такого впливу не спостерігали. Антитіла до людського 512! специфічно блокували активацію базофілів через рекомбінантний людський ІЇ-33 у середовищі цільної крові. Результати свідчать про те, що антитіла анти-5Т21 інгібують сигналізацію ендогенним ЇЇ -
ЗЗ іп мімо.
Таблиця 19 (10 нг/мл) (мкг/мл) (мкг/мл) МАРК 7-1 011711111101111111111111111122гс ни а о ПО пох ПОЕТ Ж о 81121110 сю 112о171111111011111111111111111111115 пи и тт Я ПО ОХ ПО МЕ ВО 8 1110111711111111211117111111111111111117671 сю 11101117111111120111111111111111111781 ою 111011171111112гв1 111111
Приклад 15. З'єднання мішені антитілом анти-512Г. іп мімо
Модель рекрутування базальних клітин при інтраназальному введенні ІпіЇ-33 протягом 6 годин, іп мімо
Разову дозу 1,2 мкг/мишу ті! -33 (850 бЗузіет5 53626-МІ/СЕ) або РВ5 вводили самцям мишей ВаїБ/с (віком 6-8 тижнів, Тасопіс). Щуряче антитіло СМТО 3914 до мишачого 5121 або при 2, 0,2, 0,06 або 0,02 мг/кг, за 24 години до першого інтраназального введення тії! -33. тАр
СМТО 5516 ізотипного контролю (ІТС) вводили підшкірно в дозі 2 мг/кг. Через шість годин після введення ті!/-33 (або РВ5) мишей умертвляли та збирали кров для аналізу сироватки.
Бронхоальвеолярний лаваж (ВАГ) проводили шляхом введення двох об'ємів 0,7 мл РВБЗ/О,1 95
ВЗА в легені і вилучення промивної рідини. Продукти ВАЇ центрифугировали (1200 об/хв, протягом 10 хвилин), і клітинний осад ресуспендували в 200 мкл РВ5 для загального та диференціального підрахунку кількості клітин з використанням гемоцитометра (на фарбованих за Райтом - Гімзою цитоспінових препаратах).
Вимірювання СМТО 3914 у сироватці мишей
Планшети М5О ЗА-5ТО блокували за допомогою буфера для аналізу по 50 мкл на лунку протягом 5 хвилин. Для видалення буфера для аналізу планшети перевертали і вибивали рідину постукуванням на паперових рушниках. До буфера для аналізу додавали 50 мкл на лунку 1,4 мкг/мл біотинільованої мишачої химери ЗТ2ІЛІ1КА/С (КО Зузіет) й інкубували протягом ночі в холодильнику. 150 мкл буфера для аналізу додавали в кожну лунку попередньо покритих планшетів без видалення реагенту покриття й інкубували протягом 30 хвилин. Планшети тричі промивали промивним буфером на мийці планшетів. Для видалення залишків промивного буфера по планшетах злегка постукували на паперових рушниках. У кожну лунку планшета додавали 50 мкл на лунку зразка СМТО 3914. Планшет інкубували протягом однієї години з обережним вихровим перемішуванням при кімнатній температурі. Планшети тричі промивали промивним буфером на мийці планшетів. У кожну лунку планшета додавали по 50 мкл на лунку титрування рутеній-міченого мишачого антитіла до мишачого Ідс16Б (ВО Віозсіепсе5). Планшет інкубували протягом однієї години з обережним вихровим перемішуванням при кімнатній температурі. Планшети тричі промивали промивним буфером на мийці планшетів. У кожну лунку планшета додавали по 150 мкл буфера для зчитування. Планшети негайно зчитували на
Зо рівні люмінесценції на приладі М5О 5есіог ітадег 6000 Кеадег.
Аналіз цільної крові
Кров розводили 1:4 в середовищі ОМЕМ-1 95 розчин пеніциліну ї стрептоміцин х/- 10 нг/мл мишачого 1-33 у фільтрувальних пробірках Загеїейі. Пробірки інкубували при 37 "С протягом ночі, а потім вимірювали рівні цитокінів та хемокінів у супернатантах із використанням набору
МіПіроге Мійіріеєх Моизе СуїоКіпе/Спетокіпе, відповідно до інструкцій виробника.
Результати
Антитіло анти-512Г виявили в сироватці мишей через 24 години після введення СМТО 3914 у дозі 0,2 або 2 мг/кг (фіг. 16А).
Інтраназальне введення 1-33 через 6 год. індукувало рекрутування клітин у дихальні шляхи (фіг. 1688). Введення анти-5Т2Ї тАр знижувало рекрутування клітин ВАЇ; 0,2 мг/кг були мінімальною дозою, необхідною для того, щоб прослідкувати значне інгібування рекрутування клітин ВАГ. (фіг. 168). Статистичну значимість розраховували з використанням однофакторного дисперсійного аналізу АМОМА.
Цільна кров, яку стимулювали мишачим 1-33, продемонструвала підвищення рівнів цитокінів та хемокінів, у тому числі 1-6 (фіг. 16С) і МСР-1 (фіг. 160), через 24 години. У мишей, яким вводили 20 мг/кг або 2 мг/кг анти-512Ї тА СМТО 3914, рівні І--6 ії МСР-1 у плазмі були нижчими порівняно з СМТО5516 (контроль ізотипу антитіла до мишачого Ідс1), що свідчить про залучення мішені. Мінімальна доза, яка корелювала з інгібуванням в аналізі цільної крові, 2 мг/кг, також інгібувала рекрутування клітин ВАГ. (фіг. 166).
У сукупності ці дані підтверджують, що анти-5Т2І тАБ досягали сайту дії і передбачуваний фармакологічний ефект було досягнуто (свідчить про залучення мішені).
Приклад 16. Епітопи антитіл анти-5Т21.
Картування епітопів і дослідження конкуренції проводили для відбору антитіл анти-5Т21.
Аналізи конкурентного зв'язування
Аналізи конкурентного зв'язування проводили для оцінки різних зв'язуючих груп епітопів для анти-5Т2Ї тАБ. На планшет М5О НідпВіпа (Мезо бсаіе Оізсомегу, м. Гейтерсберг, штат
Меріленд, США) наносили 5 мкл (10 мкг/мл) білка 5Т2І-ЕСО на лунку на 2 год. при кімнатній температурі. У кожну лунку додавали сто п'ятдесят мікролітрів 5 96 буфера М5О ВіосКег А (Мезо
Зсаіе Оібсомегу, м. Гейтерсберг, штат Меріленд, США) й інкубували протягом 2 год. при бо кімнатній температурі. Планшети тричі промивали за допомогою 0,1 М буфера НЕРЕЗ, рН 7,4,
із подальшим додаванням суміші флуоресцентного барвника М5О (з!иМо гад, ефір МН5), яким було мічено окреме антитіло анти-5121. з різними конкурентами. 10 або 30 нМ міченого антитіла інкубували зі зростаючими концентраціями конкуруючих антитіл, від 1 нм до 2 або 5 мкМ, а потім додавали у призначені лунки по 25 мкл суміші. Після 2-годинної інкубації з обережним струшуванням при кімнатній температурі планшети промивали З рази 0,1 М буфером НЕРЕ5 (рН 7,4). Буфер для зчитування М5О Кеай Вийег Т розбавляли дистильованою водою (4- кратно), розподіляли в об'ємі по 150 мкл/лунку й аналізували за допомогою ЗЕСТОК Ітадег 6О00.
Для аналізів конкурентності використовували наступні антитіла: нейтралізуючі антитіла
ЗТ М208, 5ТІ М213, С2244 (5ТІ М15) і С2494 (5ТІ Мб62), що зв'язують домен І 5121, антитіло
С2539, що зв'язує домен І 512, та не нейтралізуюче антитіло анти-5Т2І! С2240, що зв'язує домен І людського 5Т2Ї. На фіг.17А і 178 представлено експерименти з дослідження конкуренції. На основі експерименту визначили відсіки епітопів: ВіпА: тАр С2244, С2494,
ЗІ М208 або 5ТІМ213; ВіпВ: тА С2240, ВіпС: С2539. Антитіла, що блокують взаємодію
І-33/5Т21. й інгібують відповіді тучних клітин, виявили в одному і тому ж відсіку епітопа, і вони перехресно конкурують одне з одним. Зведені дані конкуренції показано в Таблиці 20.
Таблиця 20 111111011111бгяю | бе539 | бггає | Сга94 ни пи я ПО ПОЛ ПО пи сх: ВИНИ ПО Я ПО ОО ПОЛО НО бе ЇЇ 11111111. 11162494 | 777-11-11 0 8тмМ2гоО8// Ї 77-17 17111171. 11 о 51М2І3 177 -1/ 11111711 1
Картування епітопів: аналіз обміну Н/Ю
Для обміну Н/О використали процедуру аналізу пертурбації антитіла, схожу з описаною раніше (Натиго, У., еї аї., Уоигпаї! ої Віотоїесшаг Тесппідцев, 14:171-182, 2003; Но, ». В., єї аї.,
Віоспетівігу, 45: 8488-8498, 2006), з деякими модифікаціями. Рекомбінантний 5Т2-ЕСО (експресований з НЕК2ОЗЕ з С-кінцевою Нібз-міткою) (залишки 18-328 із 5ЕБЕО ІЮО МО: 157) інкубували в розчині дейтерованої води протягом заданих часових проміжків, що призвело до включення дейтерію на рівні здатних до обміну атомів водню. Дейтерований 512-ЕСО захоплювали на колонку, що містила іммобілізовані молекули Бар С2244 анти-51Т21, ї потім промивали водним буфером. Після зворотного обміну проводили елюцію білка 512-ЕСО з колонки та визначали локалізацію фрагментів, що містили дейтерій, за допомогою обробки протеазою та мас-спектрометричного аналізу.
Зо На фіг. 18 показано спрощену карту обміну Н/О людського 5Т2-ЕСО (розчинний 512) у комплексі з Раб С2244. Залишки 18-31 5Т2-ЕСО із 5ЗЕО ІЮО МО: 119 (амінокислотні залишки
ЕСРКОСКРЗУТМОММ; ЗЕБО ІО МО: 210)були захищені Рар (відповідні до залишків 35-48 повнорозмірного 512 із БЕО ІЮ МО: 1). Дані вказують на те, що С2244 зв'язується з епітопом
КЕСРКОСКРЗУТМОМУ; 5ЕО ІЮ МО: 210), і що антитіла, які конкурують з С2244 (С2494, 5ТІ М2О8 або ЗТ! М213), з високою ймовірністю зв'язуються з тим самим епітопом або епітопом, що перекривається.
Картування епітопів за допомогою мутагенезу
Декілька мутантів 512! утворили так, що вони мали заміщення на відповідні мишачі залишки на домені | 572. Проаналізовані антитіла не вступають у перехресну реакцію з мишачим 5Т21І,, отже, можна очікувати, що різновиди 5121. із зруйнованим та/або ослабленим зв'язком вказують на залишки епітопу на сайтах заміщення на 5121. Різновиди перетворили у конструкцію НН-5Т2Ї із залишками 19-205 повнорозмірного ЗТ2Ї із ЗЕБЕО ІЮ МО: 1 із використанням стандартних способів. Антитіла проаналізували на зв'язування з різновидами 5Т2І. за допомогою ЕЇ ІЗА або Ргоїеоп.
Поверхневий плазмонний резонанс
Дослідження зв'язування проводили з використанням системи РгоїеОп ХРЕКЗб Ргоївіп
Іптегасіоп Аттау (Віо-Най) (Вгамтап Т, еї а. Апа! Віоспет 358:281-288, 2006). Суміш анти- людських/анти-мишачих Ес (дЧаскбоп ІттипоКевзеагсй, Ме по кат. 109-005-098/115-005-071) іммобілізували на сенсорному чіпі ГРХ за допомогою хімічного амінозв'язування. Далі окреме анти-5Т12Ї. тАБ захоплювали проточним (1 мкг/мл) розчином антитіла, який готували у РВ5, що містив 0,595 Мопідеї Р-40 ії 0,595 Ма-дезоксихолату. Сигнал на поверхнях досягав - 250 резонансних одиниць (КО, 1 КШО-1 пг білкалмм2г) на поверхнях з анти-Ес-покриттям, підтверджуючи, що ці антитіла специфічно захоплюють анти-51Т21І. тАБ. Після повороту рідинної системи на 907 дикий тип 5121-0102 або варіантні білки (0,5 мг/мл в РВ5, що містив 0,5 95
Мопідеї Р-40 ї 0,595 Ма-дезоксихолату) вводили в паралельні проточні канали. Усі аналізи проводили при 25". 512І-0102-залежні сигнали на поверхнях отримали за допомогою подвійного порівняння, віднімаючи відповідь, яку спостерігали на поверхнях, що іммобілізували лише антитіла, і сигнал, що спостерігали при введенні лише вектора (що дозволяє провести корекцію відносно незалежних від зв'язування відповідей). Отримані сенсограми узгоджували за допомогою найпростішої моделі взаємодії 1:1 (програмне забезпечення для аналізу Ргоїеоп), щоб отримати відповідні константи швидкості асоціації та дисоціації (Ка і Ка).
На фіг. 19 представлено створені різновиди 5121. й аффінність антитіл анти-512І 5Т28206 і
ЗІ28252 до різновидів. Різновид 93МІ 94 (заміщення 93ТЕ94--93МІ 94) знижував аффінність зв'язування 5ТІ М208 і 5ТІ 8252 у приблизно 5 разів: від приблизно 10,8х10-72 М до приблизно 49,5х1072 М. Відсутність значного зниження аффінності зв'язування означає, що енергія взаємодії між антитілом і 5Т21-0102 є сумою області епітопів (ЕСРКОСКРЗУТМОМУ; 5ЕО І
МО: 210), визначеною аналізом обміну Н/О і додатковою участю даного сайту 9З3МІ 94.
Нумерація залишків відповідає повнорозмірному людському 5121. із БЕО ІО МО: 1.
Приклад 17. Антитіла, які зв'язують домен І 5121, інгібують первинні відповіді тучних клітин легень людини іп міго
Здатність антитіл, які зв'язують домен І 5121, до інгібування відповідей тучних клітин легень оцінювали за вивільненням хемокінів і цитокінів в первинних тучних клітинах легень людини.
Виділення первинних тучних клітин легень людини
Первинні тучні клітини легень людини виділяли з нормальної тканини некурців, отриманої від Міжнародного інституту прогресу медицини (Іпіегпайопа! Іпбзійше г (Ше Аймапсетепі ої
Меадісіпе). Клітини диспергували з паренхіми легень і малих дихальних шляхів через подрібнення, промивання й обробку тканини паренхіми протягом ночі при 37 "С ферментами колагеназою та гіалуронідазою. Клітини збирали, промивали та піддавали збагаченню з використанням набору СО117 Місгореай (для людини) від МАС5 МіІеїпуі Віотес для позитивного
Зо відбору тучних клітин із популяції. Перед проведенням експериментів тучні клітини культивували протягом 6 тижнів у ЗіетРго-34-200 нг/мл фактора стовбурових клітин. Через два тижні після виділення клітини фенотипово характеризували з використанням проточної цитометрії для визначення відсотка чистоти тучних клітин. Клітини, що використовували в наступних аналізах, були на 8995 подвійно позитивними на СО117 (С-набір або рецептор фактора стовбурових клітин) і Ес КІ (рецептор з високою аффінністю до ІДЕ). Крім того, вони були на 94,2 95 позитивними на 5121; тим самим підтверджуючи їхній фенотип тучних клітин.
Аналіз вивільнення цитокінів із первинних тучних клітин легень людини
Первинні тучні клітини легень людини, які культивували у 5іетРго-34-200 нг/мл фактора стовбурових клітин протягом приблизно б тижнів, збирали і промивали центрифугуванням у середовищі КРМІ (10 95 ЕС5, інактивований нагріванням). Клітини підраховували і висівали в середовище КРМІ/10 96 ЕС5 при щільності 65 000 клітин у 96- лунковому планшеті. Домен І- зв'язуючі анти-512Ї Мар додавали до первинних тучних клітин легень і давали зв'язатися протягом 30 хвилин при 37 "С перед стимуляцією 1І/-33. З метою ініціації накопичення різних медіаторів у культуральному супернатанті клітини стимулювали З нг/мл 1-33 протягом 24 годин.
Культуральний супернатант збирали і зберігали у замороженому вигляді до аналізу зі звичайним набором Мійіріех 9-РіІех.
Домен І-зв'язуюче антитіло анти-5Т21 5ТІ М208 інгібувало ІІ -33-індуковане вивільнення СМ-
С5Е (фіг. 20А), 11 -5 (фіг. 208), 11-68 (фіг. 202) й 1-13 (фіг. 200) у первинних тучних клітинах легень людини при концентраціях антитіла 100 мкг/мл, 10 мкг/мл і 1 мкг/мл. Аналогічні результати отримали з використанням тучних клітин, отриманих з пуповинної крові (дані не показано).
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«10» БиЖЕуУ; Кагей
БаквОоУ, Мабаіїє наїії, йевоу
Незіву, Саєвнегіпв
Батв, КОВектса
Іще, Фіпючат.
Маїйтіув, Бачі
Мао, Міспаві
РІіасба, Місєнаєї
ТтТохпеста, Мак
Щчипееїєжт, «ОПО
Яд, Зпепа-сій «1205 БТ зитлаєсвністи ом свОоСи їх Ззаптосування -1305 свІЗООЗМОВСТ кі4с» всСТуУВ13/38637 «14ї2 20ї3-ба-8а «-505 95 Б1иБад,ча7 «155» 2018-04-39 «150» 05 еБ/540,238 «їі вОти- аа ті Ув'і1зи78В ОА «вт» (011-03-13 «ї5й» Ме ї13/798, 52 «151» Вр З «ї6й» ша «1702 Бабепсіт;, варсїя 3.5 «БМ0О0ж 1 «ії» Б5Е кВійз РК «23» Номо варіепа
Ме сіу Ре тТхр 11е йем Ата ї16е рев Так Те Пец Меб Тух Бек ТЕ 1 Во їо ї5 діа Азїа Був Ре ех Був зів бехє Тр обіу бец 912 Ав обі Аза Пец а 2 30
Т1їе Укі Аху Сув о БІО Ач біп сіу був Бо Бех Тух ТВк Уаї Авр Ткр 35 о 45 тТухк тук бек сіл ТЕ Авп оПув беж т1іе ЕКО тп бів З1із Акч о АвосАка:
ЗО 55 У чаї Рпе Аза. беж 5їу бід пецойемн вує Ріє їх о Рго Аїа Аїа Уаї Аїв 55 та 5 о
Авробек біу тів Тук Тут Сув 116 Хаї Аку бех ро тах рце деп Ах ва За з
Тви біу Тук Аїа Ап Уаії ТВ Тіе Тут Був Був бій бек ЗБр о Сув дви їі 1855 Та
Уаї Бжо дер тук Пес Ме Тук бБеїт ТЕБЕ Уаї бек біу бек січ Був Ава о 185. век сув ї1е Ту Су Рхо ТПх їТїє Аврвоїеоа ТУЮ АБИ Тгр ТВХ Аїя рев їз їЗ5 і4о пев іа Тер оБпе пуб Авіа був З1ій дів Бей віп біу бек бку Ту Аку 145. 150 155 ТО
Аіа нів пув веб рРпе рен уаї діе Авр оАвпоУаі Мех Тк сії авро діа 165 170 ї78 ту Бр отук ТЕ Сув мпув Ре її нів Ав) От дп СТУ АтТа АБпоТУК ї8о 185 ї80 чет уві ТЕ Атїа ТпЕ Ахо Бех Ре ЇВк уаї муз во сін бів зіу РВе 135 200 205 бек без Рпе вко Уві ї1ї6е спі Аїа ро Аза сів Авй о біч Ї1їе був 1 16 215 де
Уаї січ тів біу був Авй Аза Авп рей Тих Сув бдех дів Сув це 91у
Зо 235 30 був біу ТВх бій Ріє Пей діва Аїа Уаф о їец Тер біп пебз дяй піу ТЕ та5 250 в БЕХ уз ті Тит АБр Овна 01у біз жо АкяЯ Ї1е бів ТЯ 9815 біз біу під 25 зв5 270
Авіи сіп веж Рце век оАяп о бСіу рем діа Сув Бей дар омМеє вії пев Аа
Вл. во ев ті Віз Авр оуаї пув бі 01 Авробен без пем сі Тух дво сСуз пей
З80 295 зав діа тей дви тей Нів (1у цец Яка АкЯ Нів тВх уаї дгЯ пе Бех дк 305 зо 315 329 ув Аві Бко Ііе Аво ів Ніє беру Ії Тук Су Тіє Ії діа ува сСув 325 33 235
Чек Уаї Ре бем Мес Без їїє Авпоуаі Пец Узі їїє їіє рем Був Меє з4о 45 350
Рце ткротіе бій Аіа Тк Бей Бей ТжроАку Аврої1а Аїа був Ро тує з55 зо з55 цуз тТвЕ АкУу Авподвробіу був опео Тук о Авродіа Тукє узі Уаї Тук ВКо 370 375 ЗВО дха АВ оТух Пув беж Бех ТЕ Авросіу А1їа Бех Ах Уві бій нів рве зва 350 485 оз уві Ні бів тіє цем рко Аввоуаї ре» ЄСТЬ оАєл був Сув с1у Тук ТВЖЕ ке жЯої 410 415 зей Сув ті тух сі дхкЗ АвроМеї їм рго сі» з1із йвр уві Уві ТЕ аво 425 що діа уаї сіб Твт о Аво» 116 Аку Був Бек Ах Аке Нів Їїе Рпе 1182 Це 235 о. 445
Тк рко біп їіе ТПпж Нів Авєп Пув бід Рре Аза Тут Зі) біп бій Уах 45о аз їіБИ
Ала цем Ні Сув АБа Пец її 310 Ап дар Аза був уві хів Ппей її 355 478 А75 а4во піч Меє сів Аіяа пер обек сій пед АБроМеї пе) біп вів сі Аза ем 485 30 495 біп Авро Бех пе) сбіп нія цей Меб був уаї з1п сі Тк ІЗїе буя Тжр 505 55 30
Акч ото АвроНів Ії Аза Ав був Аха бек Бей АвпобЗех пув Ера ТКо 515 529 Б
Був нів'уві Ага Тук бій Ме ро чаї рго бе Був ї18 рхо дя Був 530 35 а діа Зеїх Беж цей ТЕ РО рен Аїа Дія сів Був З1п
БЖ ве Заб «Й1йз 5 «212 БЕ -8Т22 ВЕЖ «каі3» Масаса Бавсіснівгів «в0йах й мес Ру ем Тхр її пер діа т11іе це) тр от1іе їецй Уа)! тує бек тк
Бей З хо ї5
Аїва Аїї Мув рРпе бек Був біп яві Тр обвіу Шви пів Ап зі Аза Бей вен 8 ке,
ІТїе Уаі Ак Сук реко Аку бід сіу Бук бех Бек тує її Уаї Авр тТкр 35 43 45 тук тує шет СОійп ТЕ Авпоцув Веї ІТ ко ТвкК бів 0105 да АвапоАкУ
БО
Маї Бпе діа Зак бі бій ппеб рей пувБоврМне Без Руб Аа січ Ууаї діа 55 79 78 во
Авроцдех зі ті тук Тих Сув тів уаїі дк бек рт ТЕ Ре Двп о Ахд ве по 5 тих біу тУЖ віз Авпочаї ТИЖ Їіе тТУК муа Пув сій рто АвроСув АБА 100 05 110 чаї рто АДвр Тух Бем Меб Тук бек Тих Маіїі бек С1у беж січ був Ав їТ5 150 аз бек Був тів Ту Суд рко ТНК Ї1є двроеч Тук Ап Тер Твт Аз ро зо 135 140 цем бі ТкроББе цпув Ап Сув бу Аза цес бів б1у бек Аха тує Цув
Та І50 155 іо
Аіїа нів Гуз Бех РББ бец Уаї І112 Дер Дяй уаі Меє тн бвр дар Аїа та Е7О 175
Ч1у Авр оТук Тит Сув ув о вре ї1іе Нів АБи сім АБпос1у Аїа Ав тує 180 185 хо
Щек уві Тік оАіа тТвкЕ АкКа ех Ре Тв Уаі був Авр о сів сій сту вве 1955 200 205
Зек їз бре Ро чаї тів Акш Аза Рко Аза Ні Аєпобію Тих Мув оби 218 ВВ ЗО чаї січ тіє біу бім АБю Тк о бєл цез ТВ Сук бек Аза Сув ке Ху 239 35 аж)
Був бі Аза біз Ве йецп діа Тих уві піз Тгробіп бе: Ав СТУ дво 245 25 255
Му Ті тру Аб5рорйе Бех бОіц орто Ака її сів бів віч біз бТу бів
250 25 570
Авпобіп бек РБе беїг ай сїу Пец Аївї Сув Маї АвпотТвЕ чмаї Ппей дО 275. 280 85 іїіїє Аїа Авр о Уаї був бій 01 Авроцез Гез рез Аа ТукоАвр Сув гей во З за діа Пем Авп опей нів біу Пец Ага Ага Ні Тнж їіє кб Бей бек да 305 за з15 заго
Був Ап РКО ї1е Дер Нія бій бек Тато оТук Сув її ї11е АтТа уві Сув
За5 ЗУ 335
Вех уаї йеи пец о Меб Пай Іі Авєйпоуаї пеп уаї І11с ї11ї2е цех Буш ТВЕ з40 за5 ЗО
Бе тгр Ії с10 Аїа Тс рей цей Тер одкЯ дер їїе Аза пув Рго стук 358 зво 365
Був Тв Ахо Ап оАвр о б1іу був деп Тук Авр Ата Тух Уаіїі Іі Тухк Рко 37 375 зво
Ака дви отук Ту Бек бек тво Авросіу діє Бек Ажа уаї За Тук о РБе 385 390 395 «оп
Ууаї Нів Сі ІтТе Пец Рхо АкроЗаї пе ЗВ Авп був Сув З1У ТУух ТНЕ о5 жо 415 цец Сує Їїє Тук піу Ага Авр Мас без рко с1іу бій АвроЧаї хаї те зо 5 30
Атїа уві б1іЧ Тк о АдЕп Ге Ак був Беж Ага Ак Нів її ре тІ1е гей 435 440 445
ТНт ро біл тії ТБ Нів дви сто Зі Ре Аза ТУук Сі біп бів Маї 15у 55 60
Аїа рей Нів бек діа Пец її біп АяпоАвр Бех пув Уаії ї11е цеш т1е 485 47о 5 «во віз Ме 010 Діта тез бекобій без др оМес без бів Аза сій Аїа ев «85 49 ав5 іп о АБр бек Пец Ако нів цез Меб сі Уаї бій б1у Тк о І112 Був Ттр ьо Зоб ТС
Ака біз Авр Нів Уві Діа дДвлп о Кув Ака бек їеч Дяп беє Пув ББе Ткр вів Ба За
Пув нів Уаї Ага тТук Чій Мек Рго Маї Ркго йех Був Меї Рко Аку Був 3 УЗ БА
Аїа Зег бак цен Тк обех їйви Аза с А1і1а бій був сій 54а8 вва ВВ «З «й1і» 270 «Та ОРЕ «2135. ЩВощо зарієпе «09» З
Меє Був рто був Ме пув Тук Беж Тих Аві їув ї1е Бек ТП ВІЗ Був 1 5 10 15 то цем о Нів діа АвпоАво Був сво Нів Зех Уаї Зі Бей о Нів ув Сув 195 200 205 січ Був рхо цей Рго дер бій Аїа ЕМе Рре узі ей Нів Авп о Мебє Нів: 2-1 215 5-О
Бек дяп Суз Уаз бех рре 51 був був ТВ Дер ро біу Уві Бпе Іїїє о 235 йо біу Заї був АвроАви Нів ей діа па їі був баї беробек Зек 1 во 258
Зяп огви був Так ста Авп тів Беб Ре пу Бей бек Зі тих во. 265 270 «10 о «вуж хе «12» ВЕ «213» Масзса Бавсісціатгів «дп ж
Мек Буш ркЕЗ мув Меб Був Тук Бех ТП лап пу їі Беж Тих АРа Був ї З 18 15 ка їув деп ТНК Аїа бек Ппув діа бе Сув Ббе був цем п1у ГПув беїг 2 Ба З сій зів Був Аза цув би Уаї Сув Нів Уві Тук ВБе Меї Був їєц Ака а 40 ав
Бек іу Бей Меб Ії Був Був сти Бі Сув тує рНе Ах Ага Ста тТВг 50 тТпш Був дк ро Бек рей цу ТП ОТу БіУу пу Нів Пув сіу Нів Пец 85 т Та но
Ууаі рес Аїа Кіа Сув біп біп біп Бек Таж Уаї біз Су Бпе Аїх Рпе 85 ЗО З5 іу їі бек сіу Уа) Рко Був Тук Тіт Ако Дія Бей Нів Авробех бек 105 таз 110 тіє ТБк біу 1іе Єву Рго їіє Твх сім Бек цес діа Бет Пец Бех ТВх 12 1345 тує Авип Авр сії бек її Те РБпе Аіа рей бій Аве бій бек тую 1 135 140 ї1е тух Уві Іс бар демо був пу АвроБує бує був Ар о Пув Мак ви їі їщо МБ ївбо їн Бех Тух Тух бім Зех бій Нів рхо Зех дек бій бек б1іу АДвр бу те 170 та
Таї бвв ЧЗ1у Пув Меб о цез Мес Уві Тих ївй Бех Буо Ту був Авр ВБе
З ї85 во
Ткро без п1п Ата Авп Аеп пув сій нів Бех Уві бій йеч Нів Був Сун їз 200 2а5 сій був рРЖОо Бей рРХОо АБ о сСіп діа рРБе Бпе Уаї цецзо нів Ав Ака ек 219 215 220
Ре деп Сув аз бек Бе біз був був Тих Авр о Бгто: с1у Маї Ре їїе 225 230 235 340
Зіу Маї1ї був Авр бяп Нів цем АтТа гео т11ї6 Був Уаї АБр Тук Бек оц 245 25 255 вва іє; сіу Бех бі; Авап о тіє цей РБе був ем Бех За а 255 «иїійх 5 «її» 557 «2М2о РЕ «2133 Мищ пишвсеціча «0 5
Мет ї1іе зБр Ак біп Аку Меє З1іу цем Тхр діа тей Аза Іі пей ТНЕ ї 5 о ІВ ем Рхо Меє Тух Геч ТБж узі Тк сїій Бі бек був Бек Бех Ткр БІіХ о й 30 реп сій дяй 91 ДІіа Бей їіїі8 Зі Ак Сує Рго біп Аго З1іу Дха вв
З 0 а
Твк Тук о Рко уаї бій Ткр о Тух Тук бек Дар о ТК оАвлобі) Жек 11 РКО
ЗО ва бо тТьЕ біп Був Акта Ап о Ато ІТе РПе Уаї Зех Ач Авр.вжя беб цу свбе
З 75 75 во
Без вхо Аіа Ака Уві зій Авр Звк біу їіе ТУужк діа сСує уУаї 11-е дО 85 80 85
Беж Ро деп цем деп був ТВтоб1у Тук опеп АБа чуаі тт ї1іє Ні Гув ї0о0 05 а
Був Рто Ркб беж СувоАва їі хо днротує пе) Ме тТух бек ТНх Ууаї ї15 130 125 дха сіу бек АБЮ оПув АБ Ре був 116 ТвкоСув ркОо Тік 116 Аво Бей 139 135 180
Тук о Авп тер о ТБх діа Рго ут бів Тур Ре Був Ат Сув Пуя Аіа цей 145 155 хТ55 їБ5О0
Сів З1ій ко дха рре Ака А1їа Нів Аку Век о Тук Бей Рпе їїє Авр Ави 155 ло 75
Уві Тих Ні дер Авр сіб бі Авр Тую Тк Суя біп Ре Трах Ні дта ї8и їв ізо с)ч АвБп О1у Тк оАво тухк тів уаї так о Аїа тах Ах Бех Рпе ТвВх Уві ях ап) еВ зі зі Ппув біу РБе Бех Мек Бде Рко Уугі Тїє Тпх АвпорКО Рто тує зх 215 ай
Авп оНів Так о Меж біз уві бій ті Сі бує Его Аза бек її Аза Сув 825 230 па5 ажо
Бек атя Суб Бра сіу Пув О1у Бех Нів БПпе Бей Аза вввоуаї їв) Ткхр 245 255 255
Зіп тіє Авпобув ТВк о Маї Уаї біу Ав бе ту сій дів Ака їів Зід 250 з85 аз віз біб піз сту Ака дви сій беж Яст беї йвв оАвроМеб ДвроСув йдем алу зно 85.
ТЕ Бнх Маї рей АкЧЯ ї11е ТЕ щу уні Тис біз був АБВ Пбаи бек Пем 280 255 300 сін тТух дир Сує пец АтТа ем Авповецй нів сбіу МебЄ іє Ак Нав ТНК 305 з1о 315 зай
Ії АкЯ Пец ха Аа МПув сій рхо ТІВ Авр о нія АкчЯ бек тів Тук Тут 325 за 335 ті Уаїі Аїа бі Сув бек Пей пев цей Ме рве їБе Ап оуаїі цей чаї зо заз 350 їіїе Маїі без пув ді Бе Ткроїї16 сто Ууаії вів їей ББе Тер Ака Ар 355 зЗео з65
Іїв уві Тих Рко Туг був ТЕ дкчЧ аа Авр піу цУувспрес Тук вар діа. 370 375 зно
Тухк їТе її: тТук рхо Ак баї Ре Аку сСіу бак А1а Акта ЗІ ТБ Нів 285. 395 395 409
Бек уз біз тує Ріш Маї НЕ нів Твж бе) Руб вБроМав Пех зззія дав ох 10 ІБ пу Сув пі Тук Був їви Сув ї1е Ту бі Ауд аБроБей рей ко сту 425 аза сіп оавр діва Аза Те Маї Уві бім бех бек ї1е біп АБ Бех ха Ака аз 340 245 вій Ууаї Рце улі бе Аза Рто Нів Меб Меє Нів Бех Був о біцш Ра Ата 459 ав 450 тус Бій біп Пій Біє Аїа їей Нів Бек Аїа йез ї1е с1й дело два дет 465 470 475 450
Ппує маї тіе пес їіз бзіч Меб Зі Рко Пец пту Сім Аїа бек Ак Пей «85 аз0 495
Сіп Уаі біу Авр оре) біп Ар ех цец сів Нів пе маї Був Їів їй 00 5ОВ. Ба з-іУу так оїтїе пу Тжр Ака сім дев нів Уаї АТа Ав був піз БЕЖ пей 515 ей 25
Зек Чех Був Рпе Ткр Мзув Нів ах йка Тук бій Мес РрРко Чаї рго бін зо 535 ай вжч втїа Бак Був тис діа Бех уаї Ава вата Буо Бей Бек сту пув Аїа
З Б 5а5 тво
Сув бе дер во пуб Нів ре
Бе «рій» 8. «21їх За «Фа» РЕЖ «Віз бивхсетична поспідовнуєсть «ййЗ» БТ мизачаслюдсвив хрмерж ННМ «400з в пув Рве ех Був сій Бек тер СБУ Пец біз АБ бій АЗЯ Пец їїе уві
Е 5 10 15 дхо Сув Рко Аха біло Оіу цув Рго бек Тук Так Уаі Авр Тер о Тук ух
Зі а5 зи
Бек піп Ту Ав Був Зах ї1е вге тТвк сій біа АКЯ Авп о Ато уві вне 35 Ай 45 діа бек піу біп ей бецп ув вве Пец оБго Атїа іа Хаї діа АБроБек 5О во 50 сіу ті Туг ТИЖ бує тів Уа) Акч бек ркго ТБх Рре Авп Аге ТВкЕ ощіу аз то 75 ва тук діа Авп о Уві Тако тів Тук цув Був Зіп бек дво» Суб Вп оУуві рЕо зо 8
Аве Тук йеч Мек тує бек Тпг Уаї Век Отїу дежх ОТ Був дап вет Був 100 105 тіб
Тте тує був Рко ТОЕ Ії Дер пей Тух Ав отр Тв А15 Бо цез СІ 115 128 ї25
Тжкр рРпе пу АвпоСув сій АТа гей сів Ту Бех Ака тТУхХ АКЯ Ага нів 130 їЗ5 1459
Був Шек Ра цей; Уві тів Авр зав уві Мес Три 01) Авр одіа сту ввор 145 МБО ЩЕ 150
Ту ТнроСув їув Рре жів Нів дев бій Авпосіу Аква Авпотук беж Уві 165 іо 175
Тс Аза Тис о Асу бек рве Так оуві Іо сін бу ту Ре Бежш Меб Бае 180 185 ї90 вхо Уві 16 Тк Авпорго Рео Тужх Авп оНів ТВЕ Меб Сів тУаїі біз Їїє
Т95 о 205 сСіу був Рко діа бек Іі діа Сув Бек АЗа Сув Рре біу дув Зі Бек 210 215 з
Нів ре ей Аїа дар таї бе Тур бій їі Аво був Тк уаї аз б1у аа 230 235 240 айви вве піу ЗІ АтТа Ажа їі біп віч бій він у АхУу Ав ост1и вет 245 з50 855
Век шШек дип о одвромМес АБ був рей отах бек Маї Бей Ага Х1е ТВЕ Ту 250 Бо -7О чаї Те бій цув о Авоопей о шек оїейо СЬО Тук АвросСув Мей Аза ей АБ 275 288 285 реч нів біу Меї ї1із Ах нів ТВ тій Ак пе о Вжа ав ве З59 «віх 7 «8118 257 хеї2» ВЕТ «йіїї» Синтетична послідовність евейх чаші: ЗТ момача-людеська химера МНМ «002 7 їув бек бек Тер сІу цей ту АБО 015 Атїа пен ї1їе Чаї Ак Сув рко
1 5 КН) 45 сій вхе сіу Ака Беж Тк Тук Рко уаї сту тЕр отут тук бех Авр Тв 20 «5 30
Авп біо бек Іі го пк бів пу ва Дал о Ако їтіе Бе Уаї Вехс дк 35 4 з дДкройхо Бе Був Впе цес Рхо Аза вхо маї 9165 АБО беж біу 116 тТукг
БО За БО
Аїва сСув уаї І1є Дку бек Ро Авап Бей Авпоцув ТЕ біу Тук о бем Ап «5 то 7а во
Чаї Тв тіє Ців Пув Був Рко Рко Бек Сув Дві 11іе Бго Авр оТук пей во за ВЕ
Меє Тук бек Так Уаі Бех Сіу бех бій був два бек пув тїе Тух Сув; 150 105 Ко
Рко тах Ї1е Аво тез Тух АвбО Тхр о Тпг Аза рро Беб Зіч Тер вве Був 120 1255
Авпосув біп Аїа Без зіз сСіу Бет Акч тує дку АтТа нів пу Бех рде
МУ. тай іви тві ї1іе Авр оляв Чав Має тих шій вер о АТа сту Аво тую Ту бує: 145 їі50 їх85 160 ув КОе їі Нів Авпопім ба БіУ Аїа Би тує бак увк тп АтТао те 155 ї7о їт5
Ака век Рпе ТЕХ Уаії бій піц був СБУ Бл Бек МЕЄ Ре Рго Узі Те 18о 1855 1380 тру Ав рко Рхо тух Ави Нія тат Меб біз уаї бін Ї1есбіу цу Бо 200 205
Аїа бек їіе Аза Сув бер Аїа Суя ре Піу Буз сіу Бех Нів рРПе беч 215 -пї5 ТО діа др Уві зей тка біз ті дви пу Тих Уаї чаї п1у бай реє біу зи 230 235 хо біш діа Ач Іі бів оспій б1іц січ СТУ Аха Авпопра бек Бек бех Ав 245 ЗО БВ
Ав мес Авробув о рей тп БекоУуді Гц; Абу її Те сіу чі Твкобій 258 з65 ато пу Авр пе Бак бе 61 тус АвроСув ем Аїа Бей Ай Бей нів бі 275 280 зав мМеє ті йду Нів ТВ тів да Бей АкУ я) 85 є21і0з 8 «Вії зо0х «війз БЕТ «ві3з Синтетична поеслідовиліить «аг «віз ВТВЇ, микачза-слюдська химера НМУ «РП В цув Ве Бех Був біп бек Ткробіу без ій АБпобій Аза без тіє Уаї ї 5 що 15
Аха Сув рто АхЯ бід Зіу Був ро Бех Тух ТНК чаї Авр оТкротук тук 29 25 30
Бек ій ТИХ Ав Му Бех ї1е Вко ТВ осіп сім дкч Авп Акоа туаї вра 35 430 45 діа Бек біу сій без Бей був ВВЕ ей ро Аза й1іа Уаї Аїа Ар бек о біу щЩ1е тТух ТАК Су І112 Уді Ах Зах РЕо ТОК о РНе Ап Ага ТК обіУ 55 то тк й
Тук Аїа дна уві Трк їїе Тук Був пув біп бБет Аєр Сув двпоуаї Бгто
ЕЕ зо ва
Авротук їец Меї Тук бег Те уаї Ах сіу Бех Авр пу Ав рве обу оо їо5 0
Ії ТЕ Сузв Рко ТНх їіе Авробецй Тух ДбвпотЕротТакК АтТа Рго узі СИ її5 149 ке
Тжр Впе Був Ав СУБ о пу діа Бев 10) сіб обо АкЯ Рпе Ахя діа нів 1730 ї35 240
Ака ет тут рей РО ї11їв Ар дао Ууаії ТЕЖ нія Авзробвросів сіу дер 145 ї50 ї55 БО
Тут Тих Сув' сій ве Тек нів Дій Сі) АБпобіу Тих Аво Тук о їіє уві ї55 ї7а 175
Тих Аїаа Таж Ахе Вех Ре ТПж о Уаї Буш о АДяшр віч свв оЗіу РБе Бех Пий їво 185 130 вБе вхо маї Іїе сіу Аіа Рхо Аїа б5іп Авп обі її Ппув бій уві си 2950 295 їїв щ1у був Авп оз дев ївч ТВ оСув бек діа Сув Ре шіу Був сту 21 ака 22 тах бій Впе пен А1з Аїа уві пез Тур обі їз Авт осіУу Тпх Був ті 225 во 235 жо
Тк дар о Рпе З1іу біш рРко дха ї1з бій бі біз 010 б1у Бій два сбІп 345 а5О 255
Чет Бпе бек Ав Піу рем Аїа Сув цец дер Меє Уві Пе) дтя т1е діа
БО 285 а двр уаі був Зі) біз дер бецй цей реп сів Тук Аво Сув цей йіа Пец 275 зно зак
Ап оїем Нів сіу цей Аку вра Нія Тру Уві Ака їй бек Ага Був 29559 285 Зо «Аз З киїїх 304 «212» РЕТ «вій» Ното варів -4005 З ув Ре бек Був біп Бех Ткроб1іу цей Сто Аво бій Аза пез її Уві ц: 5 10 15
Ака Сув Рго дку бій б1р пу ро Бек Ту Тих Уаї Авр Тур о тух тТук 28 5 39
Бек спіп ТЬх АБп оцув бек їТе хо Тпх Бівобіц Ако Аввп одгая Удаі Рпе 35 49 45 діа бехг біу бій цес без пу оБне рей РКО А1а діа уаї 18 Авробег 50 58 во з1іу ї1їе Тук тре Сув т1є хуаї Зка Зек рЕО ТЕ РВе Авп о дуЯ Твк СБУ ве то 75 во тук Аіа Ап Уві Так оїТіе Тук був Був біг о Зех АДвроСув дБ Уві рЕо з5 зо а внр о тТУук Бец меж Тук Бех Тк Уаї 100: «їз 10 чле1ї» ВО «да БЕТ «2813з Ното варіейв «В» 19 век сіу Зек бій Був вп Бек Пув її Туш Сшжв Бго Так Тіе Авроїєч ії З 10 15 тТук Ави Те тп Аджа РКО цПез о зіс тр ЕНе Був о Аві; Сув Ст Аа Бей 2 88 3 біп сіу бек вко Тут Аку Аїа Ніз Буа бек Рде цей уві її Др Ак а 5
Уві мес так біс Авв діа СТУ ДБр Тух Так Сув Був вце ї1е Ні Ав що 5 БО сій йшп сіу Дія АБ Тус Чех Уві ТпЕоАіа Тк Аку бек вре ти Уаї 55 то 75 во «кій Ії «Вії 115 кій» ЕТ «-813з «Ното зартхетв «400» 1 ех тем Ре РКО Уаї Ї16е 01у Аза Рхо Віа бід дво сій ї1е Пув бі ї 5 та ї5 уаї бів її сіу Був АБа Аза Аза їй їх Суя бех Аза Сув Рре пі1у кої 25 Зо ув о стіу Тв о біп бе їв Аза АтТа Уві Пеш тТжр біл їви дяп Сі лие
Я йк цув ї1е лах Авр оВре щі біц Рго Ака 116 бів бій Чіа біз бї5у біб 5 Б 53
Ав обіп оВек Рпе бек Ап обЗіу Пец Аза Сув Пейсодар Меї Уаї цей Акц ва 70 та во ті діа двроуаї Був б13 іш Авропей Бей пец сої» тух Бр оСув ей а5 ва 55
Аїа цей дав цец Нів ЗТу печ дхеа дк нів о ТВх уві Аз рез век АКд
ТО 105 119
Вув Аза о рКо ї1е «810» 17 ей 10. «вій» РТ «ЗК3м Нато варівнв «400» 12 їув бек бек Ттроу Бей сій веб оЗій АтТа пез її Чаї Аку Су рЕо 1 5 10 15 сіп йха біу Аку Бех Тв Тух Рко Чаї чі ЖТЕр Тух тТух Бек АБО ТДх за
Авп бій бек їіїе Рко ТБ біп Був Ака Ав Акад ї31є вве уаї бЗех Аку ай ху
ВБр Ака Пез мув РБе бен Рго Акта Ахка УВІ бій Авробеє З1у тів Тук
БО 55 Бе
Аїа Сув уві їїе Акжт Бех Бто Ав тей Ав бує Так БіУ Тук бем Авп то 7 8 чуаї ТнНюЕ їі Бів Пцув гув Рко Ра Бек Сув Авв її рРЕжО дар отую рей 55 Зо з5
Ммеб Тук век Ток Уві тво евійз 1 квіїм 5 «217з РЕТ «213» Має йавсчічЕ.
«ч0йх 13
Нів Тут щу. мек йіа 3 5 «21» 1й «ії» 17 «візз РЕТ «2135 Мав жоавспїав каййм 14 бек їїє ті ТИХ Аяр о шіу Тех Беб ТНПх Тук о тТУуг Ах Авр и зЗех Уаї був 1 З то їв сту «й 5 «й1їз 8 «ій» РЕТ «213» Мав пиавсаїча «4005 15
Зіц бек Авр АвротТує Рре Авр Тут 4. 5 «йказ Б «вії» 15 «вайз РКТ «2іЗ» Миш штивсціне «-400з: 16
Пцук бек Зак бій Бек пей біс Тук Бех Аврозіу Авр дет Тух Без си 1 я 10 ї5
«вій ГУ «йіїз 7 «кити» РЕ «і3з Ми шивоців «ай» 17
Зіу Уаі Вавжх АвпоАха Рпе Бех а 5 «Е10х ТВ «тії» З «вій» БЕТ «13» Мав «двемтив «-400з 8
ЕМе біп Аіа Тк Нів двр о рРро Ре ТЕ ї З «Вібх їЗ «вії 117 «Вї2» РЕТ «213» Мив ипавслрцв: «Ой 19 -З-ічм Маї сіп Пе Уаї їй Беї біу БІЇ сту бе пей Бій вка су Аку ї З 16 т бек ем пув о цен бек Сук Тпг о АТа бег Сіу вРБе І1е РБе Зех Нів тук 29 5 30 сіу Меє Азїа Тур Ууаї дкаЯ ЗіпоАза Бк Тк Був сту ей біз Ткр уаї 35; що А бек Бех 112 її ТНК дер б1іу Тв Бек Тит тук тТук Аку АвроБек Уві
5-О З 50
Був бі1у ва Рпе отих Ії8 Зех АЖ АБ оАВа Аїа був АБ Тк бів Тук 55 70 78 о цеч ої Меї Авр Бех рез Ака бек сім Авр тп Аїд Тв ТУЮ Тук Сув ве за 5
Аїа АхаЯ бів Зег дар Авр оТух Рбе дир Тук ТЖе біу О1а сІ1у ХУаї МЕ 100 105 18
Уа тп уаї бек Бек 115 «вій» й «ії» 115 «від» ват «215з Мив павсиїив «ай» 2 ввр уві паї пев тнї бів Ттвх руб уаї бах Пец век аї тих печ БІіУ ї 5 10 15 вар зій іа Бек жї1в бБех Сув цув бек беж бій беж ле) сі Тух Бек
В за
Авробіу Авр бек Тук Бей 910 Тхро тую рей сій Був бхо біу сьо Бех режи 5
Еко Зп Тен о їеб ї1е тут с1у Маї беж Анп Аха Бе дек пту уві БЕо
БВ За бо
АБо о Аху Бе чів шіу бек пі бак Шіу Тйх АвроБйе ТВ ої; Був її аб 7о 75 89
Бех АкЗ чаї зі РхЗз с1із дар рец сіу Маї Тух Тукх Су Рце сій лів
Зо 85 тих: Бів'АвВр бо Ре ТЕ Рпе бу Беш ЗІ Тих Був пем бі хів цу 109 Ток 110 «вай» Я вії З «212» ВНТ «різ» Мав юпавсотав «кп 21 дво отук Ав МеК Дап ї 5 «вах яв «йІї1ї2» 5 «війз РЕТ «ії Мов шивсатиув «пз 8
ТВг отТук Тор о Меє дв ї 5 «210: 23 «2112 6 «212 ЕТ «ії» Мов шивсаіце «єещоох ВЗ
Зет Аво о тТук Аа ТЕБ деп 1 Бе
«210з а «21їх 5 «птйх ВЕт «3132 Мав спювеційв «-4309з 24
Авр о Аво Тек Меї нів ї В «2ї0- и «вії 17 «125 ВЕтТ «Я» Мів тинасліця «400» 25
Авп тів Ав» рхо Тук Тук Піу Бек Тк ТНуУ Тук Ав) біб оПпув РБе Був ї 5 18 5 біу «510» 25 «2їїх 17 «вій РЕТ «213» Ми шфоавсатие «арОм Б
ЗіпоЇїє рРпе Рго Аїа бек біу беж Твт Тук Тух дви Сід Мев вре Був ї З 10 15
Авр «їй 87
«а1їз 16 «їй» ВКТ «в13» Мав шивомійв каві
РОе їїе век тух Бех п1у бер тТржк бех РБа Дям ргОо бек гей Ппуз Бех
Х х 15 Ів «їз» В «Кі1х 17 киійз рИЖ «віз» Ми пидоеціва «00» яв
Аха її дДвр вхо Віа ї1єе БіУу АвБі Тпх сій тТук Аіфа Рхо Був Рве сіз 1 5 30 15
Авр «аз а «їх 1 «Ви» ВВЕ «2138» Мив птавсчіе еа0йз 9
Фіч б1у Авр о ТВК Тук пев Аїта Тер Бе Аіїя тую і 5 15 «8103 35 «їм 5 «212» РЕТ «13» Мов вщшесціне «ОО» 35
Зах бій Авпотів Тує Тук Ііее АвпоРпе біп Тук Тут Ебе Аза тТухк 1 5 10 ЕВ «їй З «віх. й «шій СВЕТ «813» Мив пливсадзив кааом 31 хухо Авв сім Тук о бег ре АвворУК
І 5 «1005 38 «ев іїм В «Ба ВНТ «і» Ми пасів «400» 38
Зіу вБр Рре Тук Аха Ме Ар Тук нз 5 «кеї0» 33 «8115» 15 «дра» РЕ едг13- Мив отовсзіче «вп хх вка дек бек сій беж їТе ві Тук чех Ап оЗіу АвБи Тік отТук без 01 ії х 4А5 ї «піп» за «гії» 1 вій» рЕТ «132 Мив поавосміод «об ЗА
АхЗ Віа Бех Зі Ави ї1е Шіу ТЕкК дта мес нів 1 в 19 «21йз 35 «2112 15 «таз РЕХ «-213з Моа-ж шчвсцуча «400» 35 вдха Віа бек цув бек Уві бек о Тіу бек С1у Бек бетг Тук Меб ве ї 5 То її «війх Же «гаїв 31 «2ї2х РЕТ та139 Мила мивецечв «500» зе
Те тнє дяп тик дер т1тїе АвроАвроузі ї1е НІВ 1 З 8 «10 37 «11 7 «в12з РЕ «9132 Миє шивсцічв «ОО» 3 пув Уаї бех Ав Ака Ре Бек їй 5 «Вій З «ВІТ 7 ев1ій РТ жаїзж Мив пивсліае
«аз 38
Тук діа Бек бій бек Іі бех ї 5 «й1ї0з 39 дії» 7 «і2з РЕТ «3135 Мі пувсміча «ацОх 8
Бей Аїа Чех Ап оцвм ід бет ї 5 «-хї0» 40 «вії 7 «Рій» РЕАТ «813» Мив товеірив «80йз 40 сіш Сіу Ап жтНк пез Ак рХО ії У -ві0з «ак «Вії я «ій ВКЕТ «УЗ» Мира мавсиїов «а Я вва сій щу век ніш уаї Рхо вто Тих ї В «0» 48 «1 «ів» РЕ «21ї3з» Мия шивосціив
«ай» 45 сів біп бек Вкп ТВу Тер орто РБе тру: 1 5 «-ї0з 43. «і З «їй» РЕТ «213» Мив писати «апп» 43 сіп Ні бек Ак зіч Її Бко Тук ТЕ
Е 5 «210» ай «вії» 8 «Щій» вЕт хгіЗз Мав: шпивсиїце «400 4 шви бід бек йвр о Взв Мер тей тех ї 5 «105 45 «Р1їз 120 «ій» РЕТ «ВЗ» сСмЕтЕтиенНа послід «чай» «Ваз СеБзіЗА УМ «аб а той Ре Зів цен бів І бек Зіу рута ЗІБ Бей уві був ВтОо сіу діа 1 5 зо 15
Беж ча1 буяє її Бех Сув Був Авіа Бек сіу Тух вет РБе ТБЕ АвротТує 29 25 Зо
Авп оМеб дво оТхр Уві був обіп бек Між Сіу цув бек Без сте Ткрої1е 35 що 45 біу деп І1їе дей орто Тук Тук б1іу Бех Тк Тік Тукю дир бів пу Ре 5О у 0 їув бі цу діа Вк Шец жає Ууаі Авр ув Бех ет дви Твк Аза тує
Ех те во
Мес Кіш Бей Ази обБех без ТБк бек 51а Аворобехг АтТа уаї Тух Тук Суд в зо 55 діа лкч піц бту двр о Тпк Тух пвец діа Тер РВе дія Тух Ткр біу Біп 100 і05 119 сіу тик пем чаї тій узі Бек АТа 115 120 «й1і0з 46 «діїв 184 «шив» ОРЕ «23 Синтетична послідовність «во «223» сСа5а1А УН «а0йх 46 зів її бій» цей біп біб Бех бу Рко пи тей уаї дже рт сіу ТЕ 1 - 10 15
Зек Уві Ппув їїє Бвг сСув о пув діа беї бБ1Уу тує Тпх РИБ цеч о тве тТук
-О 25 30 тТЕв Мет АБд ТтТЕроуаї Був сЕпоАхо Рко Сі1у сіб щіУу тей біз тЕр тів 35 п 5 іт сів т1Те вре во вія бек сіу бек твг отТук ТУ Ава сій Мес вне 5а 5 66 пув о'айвр Був АТа ТК їв Тв Уукі Ав о Тпк беж дек Бех Так Аїа тТук є5 то 75 во
Меє біп рем зек бек Пе) ТБк Беж Зіч Ар о ТВксАза ув тож Бе сСує
ЯЗ Зо 55
Авіа дгч Зеї с1й Авйп їїє Ту Тук 118 Ав Ре біп тТухк тує це діа оо 105 19
Жук тЕр ві дів сту те ТЕ рез тн Уві дек беж 120 «ЗЕ0О0» 7 «їх Ії «Ми» РЕЖ чаВВЕЗ» Синжетична послідовність «ВО «ВЗ» сайай; 5ТОМІ5 МН хай» ах біс уаї бів дез бів сін бек піу бо З1Уу її уві Пук Рхо дек 010
КВ а 10 15
Век їз бек Ббезп ТК оСув ТБк Маї Тк зу де Бех ї1е Тіг бек Авр хо их 30
Тук Аіаз Тер АвпотТЕр ті Ака зій РНе Рго сту бек Був беч сій ТКр 435 40 45
Мек бі вКе Ііе Бек Тугк Бех піу Авр ОТ Зех це Авп оБхо Бек цей ва Бе во
Був бек Ак ї1іє Бех Маї Тих Аха Аве їх Бех цув АБО Бій Ре вце 55 7о 75 во цей бій Бен Ава Бех Уаії тик о тТлх бій Ав отТвж Віа тик тує Тук о Сув 85 Зо з
АтТа бек тухк Авр о сїу Тук бек Рле Ав Тут ТтТкр ЗіУу сію сіу ЖЕ ТВх їбо тоБ. що зей Тип Уві бек век ї5 ейійх ав «вії» ТІ «212х ВЕК «і13» Симтетичне нослідсвність «20 «ай» сСегазад/ БТІМе УК «Об» 4 зій туаї Зіп Ббемо сій сів беж Уаі Аіав сіц цез уаії Ака Еко сту та ї 5 10 ї5 ек Чаї цув ем Зек Сув тпи вЗіа Вк дуа рРпе Ай ІТ16 Тув Авр вЕр 33)
Тут Меж Нів Ткр Ма1і був біп о дха Бо бін бів сфу цей біб Ткр о ї1е
За зо а5 зЗіу дхч Іі АвроРко Адла 116 б1у зво тах оз тТук АТа рРхо дув ве а 5 «5
Зіп Авр о пу овіа ТпЕ Меж Тато Аза Авр Ту бек беж Авй ТЕ о Аіа Тує ах то 75 во
Пе бій рез бЗех бек їз тп Беї біс Авр ТНК Аква Узі Тук Тук Сув за се
Аїва цец сту АБр Ре Тук Аїа МеЄ Ввр тух ТЕр обтіу сід б3іу ТБк бес 159 їо5 Зо
Чаї так узі Зет бек «ій 85 «21їз 1138 «вїйз БЕЖ «її» Синтетична послішоевнмквь «Ох «235 сшИвВІВА АХ «400» 4
АвроМмаії тес Мес тТБк бід ТВкжорхо бей декоПпец ко уаї Бех їви О1У 1 5 19. ях вАвр Сіп Аза бек їІЗе пет сув вка бек Зак бій бек Ті Узі Тук Бех 3) 25 35
Авз об1у дп Тк Тук їй біб Тур о Тух Без Чіп був Рго Я1іу біп бех 35 «9 що
Еко Був пек ївч ї18 Тук Буш Маї вак АБ Бто Бе Бет Шу Уаї ха 55 6о авроАхка пе ех сту Зет б5Б1у Бех сіу тре ав Рре Таж пей був ї18 55 70 КЕ: о век джя уві піз Аїа ЗІй АБо Бей обі Уаі Тух Ту Суб ЕВе стіп зЗіу як вка 5
Бех Ні уаії Ехо Рсо ТВу Вре Сіу бїу 0)у Тйх пув це біз 1182 Був 1959 105 19 «ваз БО «Мі» 106 «дій» РЕТ «2ї32 Синтетична лослідавнаисть «и кав3з САБО1А М «а00з 5О т1їе цей Без Тік бій бех Рко діа її Бе беж Уаі Бех Рко біу бій ї Б 19 15 вка Уві чес Ре Бех Сув Ако Аі« Зек Зі) Ав її Б01У ТБк ка Має о 25 З пів Тхр Тух бій бій йхо тр деп біу беї Рго йже цей Меп Ї19 Був а 45
Тук Аа бех сі) бек 11е Бет ту 118 Бго бек ака РНе Бек сіу век ва 55 5 сіу Зек о б1іу Таж Авр о Бле ТвкК о бе) ТК От1іе бек бак уві біл Бек сі 65. то 75 о квар їТе Аіа Авр о тТух Тук Сув 012 біп беж дер Тис РЕо РЕо БВ отв
З а0 5. пе 51і1у Бек біу тк Був Пец сій ї11є Був їо00 їо5 «віб» 5 «жі 11 «818» РЕТ «віх пинтетична послідовніть «вх «ай3» сСо244/ БТИМІ5 М «аййх 5 дво її Уві цей те бій Бек о рко Аза бек бе) сА1їа їїе Бек пен Бу 1 5 10 15 сіп дга Афа Тк їїє Бек Сув Ага Аїа Зек Був бек Уві Беж Те беж ре 25 30 піу бек бат Тук Меє РНе Ткр Тук зіп Зіп Гув РІЄ Зі бій Рко ро
З 40 5
Був бе пецп ї12 Ту Без Ата бех АБло бен З14 бак біу Маї Рко діа -Б 5а Сл ака бре бехт біу Бек Сбіу дек біу ТЕ Дар Ріє ТБху Без два їЇТе Ні 65 70 В ва
Рко таї біз 015 ОТО ДвроАїа вів Аза тТук бук Су сіпоНів беж КЗ ва ао ак бій їі Рко Тук Тпх Бе б1у б1у біу Тих ув Бей бій Ії Був а 105 110 «10» 55 «й11їз 106 хвідУ РЕТ «В13з интевнячне листі дОовнаста. «805 «Ра» сСе495аК; БТІМба У «адоОх 5 біс ть Ти уаі Ток бій Бех о Рго Аза Бех рем бек уаї Аіїа тбх 1у я 5 То 15 піс муя Уві тпг Ті лкчЧ Суя Ії Тих Вп отак дар І11іє Дер Авр уаї 23 ра ЗО її Нів Тур тТух сіб. Зів руя Ехо біу піц ро ко пув Пед пес їі1ів 5 дек. біз зіу АвпоТОк Пец да Ро ліу МВ) Рко Бех АкУ ВБе бек Бер ва 58 бо
Бет с1і1у тТух Зіу ТЬк Ав о Раае Уаї Рре тк тіе бій Депотви Бем дек ва 7о 78 во сії Авроузі Аза Авр отух ТтуУК Су це) біп бек двБр Ав о Ммеє реч сотні 85 95 з5
Рпе біу діа піу Те був цей 015 йем Був 152 ТО «ВЗ 5 «й1іїж ов «йійж РЕ «їз сСивуштична послідовність «і «223» В8тТОМав, БТІЬМа9, ЗРТІМ5О НСрКі «п» 5У тиж бек тук ткв тів Су ї 5 «210» 58 «811» є «їз ВЕТ «д1і3з Синтетична послідовна ств «ВИ» «ВЗ» БІБМВІ НСЮКІ «адап» 58 пек Бек Тук дів. тів ек 1 5 «Ві» 55 «пт 18 «125 РЕТ «2ї3х Синтетична пеотлідовністе «єсййй» «23» БТЬМАВ, БЗТЬМаї, ЗТрМБО нСриео «0002 55 су ї112е.т1їє Тух Ркто б51у Авв Бех Тук ТЕХ АкЯ тТух Бек рко Зак Рпе ї З хо 5 сій ЗКУ «війх ББ6 «аїжз СД чі РЕХЕ «13 сСидтетична посліновність «ВИХ «йа3з СВТЬМБІ СОВА -4005 55 сіу ї1е 116 рРко 11іє Ре біу Тс діа Авп ту АтТа ій був ре біл 1 5 ТО 15 сту «ві0жх о.57 «її» 7 «РІЗ СВТ «-5їЗ3З» Синтетична послідовність «ВО «ВЗ» БІСМАаї, ШТЬМ5Оо нерві «а0йз 57 цец Бех сіу Акч РНе Авротух 1 5 «вій» БВ ейТ1з 7 кий ВЕЖ
«ВІЗ СиВтетична послідовність «ЙО «ві» ЗТ МаЗ непу «4905 ЗВ їїе сіу сіУу Меї Ре Авр тує ї Е «й10йх 55 «З11їз 7 «аї1йз РКЕТ «г13з Синтетична пооліцевнаість «ей» «дз ВЗТБМ5І Норка «йбОж 55
АвоО тах ржОо сій Тез Авр о тук ї Е «210 а «1» Її «аійж РЕТ «вї3» Чинтетичнма посльдожнІсть «220 «впаЗ» БЖ Ма шСТЮКІ «або во аАхч Аїв бек бій бек уві Аку Авр Аза Бей діа й 5 410 «ій» 51 «1» АХ «Війх ВЕ «від» Синтетична послідовність
«ай «їх ВТОМаЗ Сов «ай» Бі та Аза бек зЗіп бек Мав Ата АБпоАіа пей дід 1 а то «ввОм б «зії її «2152» -РЕТ «йЩі3» сбивтетичва послідовне тть «виз «ваз БТВМБа АКСОВІ «002 БЕ зкч Аїа бек бій бек баї Бек о АзпоАів Гейл о АТа
І 5 19 «дій 63 «Зх» 1 «вір» РТ «213» Пиптесична послідовності «вах «23» втТОЬМ5І1 БСБВХ «Оз ВЗ
Акад віза йехс сії бек І1їе Бех дек Тук Пец деп 1 В 10 «Ох 4 «їз 7 «Ми» КЕ «2ї3з Синтетична послідовнистіь
«вий» єге3» Б8ТІМІВ, 5ТОМ5О Пера «во» 64
Ейе А1іа беж Ав АкУ А1а ТВЕ 1 5 «Ва Б «аАї» 7 кіз РЕтТ «213з Шийтетична послідовніств «вай» «а23з БТОЬМаЗ СЕ» «або 5
Був Аїа бек два Ака діа Тих ї 8 «2105 856 «їв 7 «в12з ВНТ «-аї3» ин етмена послідовність «2802 «ей БТШМБІі Ср «400» ев тут Аіа Бек Зек Ппей 1 век 1 5 «21йз 67 ч«1їз З «вій» РЕ. «-й135 Синуетичив послідовність -ка0з
«аа» БІТШМАВ Ср «ОО 67 сіп бій Рв Ав Тік ТЕроржо їїе ТаЖх 1 5 «Вуз еВ «Дві З «й РВЕ «213з Смиметпивзна поспідовність «Его «23» БТЬМаЗ ТСрКЗ «400з 68 сій бій Тук тТух ім Тхр Вкго І1їе ТВХ 1 5 «ша ва киїї2 З «й1йз» РЕТ «сії» Пинтетични: посбдідовністев -шах «ші» БТЬМ5ЗО БСОКЗ «а00» Ба бів сій Рпе РрБе деп Тюкр Рко Тіє ТБЕг ї 5 «ій» 75 «21ї» 8 «із РЕТ «213 Шивлетична послідовність
ЕВ
«ей» БТЬМ5І СОКУ.
«Ой» 70
Зіп біп бех Тук Бех їх Рхо Бей ТВ ї В «КО ОТ «її» 116 «їв» ВЕ «шій» бСимеетична послідовність «22» «233» 5тІМмев, Б5ТІМБ0 хН «й30з 07 сів уві сів цей Узі сів бех біу Віа біз уаї пуб5 пув РКО 1у 1 ї 5 ї0 5 цех цей був їТіе бак Сув пув сіу Зек бі Тук бШет БДде тк Бех Тук 29 25 З
Ттр ї1є 21у Тхр Маї Аха бід оМес Рхто ЗІту Був у рви 1: Тер. Меє 3 ря:
О1у г1е їїє Тут Бго біу Авр бек Тут Так Акоу Тук бек ро Бек зе 5О 55 бо сіп біу бід Узі Тр їі» Беж Аїа Аве о Був бек Т12 Бек тк Аїа Тух 65 то 7 во
Кей іп тЕр Зак Бек Бей пув АтТа дек Ар отих Аза Меє тую Тук сСув 85 5О з5 діа Аку ей бек піу Ако Бе Др ТУК Тур обвіу йіп б1у тах дем Уді оо їсь їх
ЖЖ аж Бех Бех 115 «кій 7 се1їїз 116. «932з РЕТ «віз» синтетична послідовність сей «Віз» ББІТМЯаЯ ун «айв Уа січ Чаї Зіп опемз Маї біп бех сбіу Аіа біш Уві йуш був Рко біу бів ї 5 о 5 бек їец пу Ті Ббет Сув був біу Бех біу Туд бек ве Тах бек Туг й 25 35
Тв їі б1Уу Ткроуаї Аха бій Мес бто біу був З1у Бей січ ТЕр Мес 35 40 45 сіу Ввфе її тТух рхо -1у Авр Бек тТух ТВх Ак бух бек Рко бЗеу рРБе
БО БО БО хіп біУу сів Мафботйе Т1іе Бех Азїх Ав обу беж їі ет ТИП Аза тук 70 75 о їем бтТ» Тур о зех бек це Був Аза бех Авро ТО Аіа Меб Тух Тук Суб 85 зе З5
Віа Ага Ії біу С1іу Меє Бе дер Тут Трр о с1у піп бїу Тк обей уві оо Ток Бо
Тих Чаї Бех век «Рій 73 «Ву 16 «йійз ВЕТ «ВЗ» Сивлелична послідовність й «раз «2235 ВТрМ5ї УК «або» 7 бій уаії біп обей уаї бій Бех б1у Аза бій Уаї Ту Був Бо 01у век х 5 10 І5
Зах Ууаї був Заї бек сСув пуб Аіа Бек біу зіу Трж Ріе бек бек Тух ря 25: зо
Аіза тТієє бексоїхр Узі Ака зійп Аіа Рко сіу пів бсіу Бей біз Тер Меїс
За в) 48 бік бі їїе ті Рхо Ії Бле біу То Аїа Дяп оТукодіа біп Був Ра
Зо БЖ БО сіп біу Ак Чаї ТЕ Ії ТвкоАїа вер осій бек ТБЕ Зех ТБх Аза Тук 65 зо 75 во мес зійш їец Бек бек реп АК Бет сій дДвротТвк діа уаї тую тук Сув зо зв
А1в Аку Авр о тТру РХб б1іп Бей Авротує Тв оБьУ піп іу тп рей чаї
Щоб 105 119
Трх узі веж ет їх «Оз 75 «ем 3907 «їз ВЕТ «2їЗ3» сСинтежична послідовність «яз. «ВІЗ» ВТЦМаВ У «Ой» 74 сі» 118 Уді їем Твх сім бек рко АТа Твгкоїєй бек ем бек РКО 01у 1 5 10 15 312 йха діа тЬх ей Зеї Сув Ака Аїа Бек бід Бек Маї Ага дер діа 2 ся за їва йіа Ткр Тук бів бій Був Бхо сіу бій Аза свго Дко пе пев її 315 40 45
Тук РНе Аіїа бБет Авап Ака Аїа ТВБХ сіу ї1е Рго Аза Ак Ре бек сту
БО 5 о
Бех зіу Бек осіу Тйх Ав о Бе ТЕ Сей ТпК ї1їе Зек беї Педй СОЇ: рЖо то 75 ва сд1н дявр рес Аїа Уаї Тук Тут Сув сх біп рве лев твх тк оРКОо 118 ав зб з5 тиж Бе щ1у сів біУу тБх Був уаї сів їі був 100 105 «вій» 75
«жїїз 107 «й1ї2з ВБЕт «2135 Синтетична песлідовинаить «аб» кпв3» ХОМА У «00 75 бій її уаі без ТБ бій ес о рго Атастне рец бек бе; ек Рхо іх ї С їо 5
Зіц Ака Віа Трк о Пео дек Су Аху Атїа Зек біл обек уаі Вїа АвпоАта в, 5 в)
Тез діа Тв тух іп Зіп Був Рко біу бів діа вко дк Пез пей Ї16 385 40 45 тух був іа бек Ав) Ака Аіа Тпх сі 11їе Рхо Біа Аха Ре Бек зіу 5О 55 5 бек спіу Бек Піу Тік Авр Бе ТБ дев; ТВжЖ Її1е бек бек бен біз ро а то 78. до сій дер рмє Зіа Уві Тух Тук Сбуш біп Сід Тук Тук Ф1у Тер рго І18 що 85
Тих БівобрУ біп ЗЕУ Таж пув Уві біз їїє Був по 165 «-й10з 7Б «211їз 107 «ій» РЕТ «-2ї3» Синесетична послідовність «ЙО
«віх БТВМ5О У «Ой» 75 зі тіе уаі Пец ТБт о сЗіп бек рРхо Аза ТпХ Пец; бех печ вес ро с1у 1 5 30 ї5 сіб Ату Аа ТИЖ Бей бек був Ааха Аїа деко Сіп веб Ууаї АвроВер Ткр: о З Зо цей Аїа Тур Тук Зі бів Пув Ро бБіу біп 818 Рко дк ей Без їїе
З5 ща а тТук пув ліва Бех Ав Ага Аза Тс о сСіу ті Рка Аза Аха Бе бек сту
ТІ) 5 БО
ЯЗех з1іу бек біу Ту дер ре ТВК пей тв ї1е Дек Зеу беп бій бо 7 75 ва
Зта Аврорве вата Уаї Тук Тух Сув іп бій Тук Ав Ака Аїа ро Ткр я за ав
Твх ве спіу Біп зі ТНК опує баї 13 ті руб
Та їо5 «810377 «21ї115 107 «вій» ВЕТ етхії3» Синтетична послідовність «ВО» «ай ТОМІ УК «ВО двроііе біп Мес ТБЕ зів Беж Бк Бек Беж ре Бех діа Бек Уві сіу ї 5 10 15
Авр Акч Заї Тв ті тТВЕ Суводха діа беж сій бек тів бег бек Ту 25 25 З їв АБИ ТЕр Тук спіп біб пув ро Щ1у Сув Аза Ро бує цез без І1Є
З ЗО 5 "тТук Тут Віа Беж бек Пец сій бех піу Уаї Рго беж Ахо Рпе бек со1Уу 5 Ба
Зех сіУу бек біу ТНж дар РБЕе ТТН Пец тах тів Зех бек Пей бів РхО 5 то КБ во стаз Авр Бе АтТа Так тТтУжЖ Тук Сув біп Зі бек тує Вес так овхо ехо в о з5 тТвжх РББе сту сій сіб Так опув Уаї Січ тіє Був
Іво 105 «Щійз 8 «її 5 -ййз ВЕЖ «813з Синптетмшене послідовність «Вих «223» БТоББ НОРІ «ай 0078
Бех Тух Аза Меб век ї 5 «0 5 -81Юз 5
«віз ЕТ «-2і38 Синтетична послідовність «ва» «ваг БТІКа НСОрКі «паз 79 бек Тух Тур Ммеб Нів 1 З. «-210з 88 «211» 5 «відх РЕХ «-8135 Синтетична йеєслійдсвність «вай «вва» ВТоКІ НСрКІ «90з о зек тус Тур ті 01У ї 5 «йОх ві «ві» 17 «й12з РЕ «213» Синтетична послідовність жах «ййіх БТОКЕ НСОВО «й ВІ діа її чек біУу Зех с1у сіу вес ТЕБЕ тут тТух АТ Авр Бег Уаї Був ї 53 19 15 іуУ
«їй НЕ «112 1 «їде РЕЖ. «дій» Пруимсетична песліловність «ВА «й23» 5Така НСОВІ «апо» Во біу іє бек бек біу 01у біу бек Твх Тух Тук Аза Авр Зех Уві Був х 5 о ї5 -щУ «2105 З «В 17 «212з ЕВТ «ВІЗ» Синлетична послідовну сяь ей» «Важ БТИКі НСОКа «400» 83 її її Тук Ржхб ліу двр о Чех двр Так АІЯ Тук Бек ро Бек Ре сів ї У що 15 сту «йі0з Ва «аїр 18 «йїйз РК «вій» следтетИихна послідсвність ех
«важ БТОЕа НСОЕЗ «по» 84
Азр о рго Тгробек Тк бій піу бЗех РБе рре уаї без АвроТук ня 5 19 «што 85 «ші М «йиїй» РЕтТ «239» Синтевичах: послідов сть «ах «ВИЗ -е ТоКа НеПИЕЗ «ФОп0О0з я
Аве оБіу Ткросціу Тр Ууаї Тук Бпе рРхо РБе АвоотТух 1 Ес 16 «їй» Во «83119 2 «йій» ВВЕ «ей» пбимтетична послідовність «вва «їз БЕШКІ НСБЕКЗ «400з 86
Авр лих вів Авр оре Аха до Тур вв Ве АБр Тух ї 5 10 «2105 87 «ВІїз 41 «аБаз РВТ «яЕ3» Шинтетишеа послідовність «ВО «й» БАК СОБІ
«доз 87
Яка віз век бів Бек уаії Авродар А1їа йем Дта ії 5 о сиї0м 88 «іт її «від РЕЖ «кіїз Спитетиячна песпідоваиусяь «щі» «22їз БЕйКа БОрКІ «а00х 88
Ака Віа бек ОїІп обЗех Уаї Ака АвроАво Пей Аїа 1 Б 10 «21д)з а «1іїз 17 хват ВББЕ «віч» сСиктетична плоблідоваість
А» «йиЗ» ВтоКкі БОБрЕІ «400» ВЗ іа бек Бех Сіп Бех уак рем ту Бак Вех АвБа Ази Шув ВІ Тук ти їх 5. 10 ї85: дів «вій 90 хеїіїв 7 «вії» РЕТ «гії Синтатичзни послідеовзихсть
«шо «ай3» Та, Таж БСрКе «00» 90
Авровіа Бех Авп оАжкУ діа ТЕ 1 З «-810з 91 «-21їх 7 «й1йз ВВтТ «ЗізЗ» Синтетична песліьдевнисть «ей «29835 дтРКкІ1 БСсрВа «ЧО 9
ТЕр ліз Бех ТП Аха бід Беж 1 5 «КЕОз ЗЕ «а» З «Віз РЕЖ «ВР» интетична послідовність «впй» ки?» втТаБе СОУ «400 92 біп зій Ре стук дай Ткр Рго їй Ту ї С «8102 53 «91 9 «212» РК «З» бимтетична сошлідовмчіснте
«ай «23 БТаВА БСІВЗ «ай» 53 сін осі тує її чів Аза Ро Гбецо Трх 1 5 «210 94 «211 5 «2» ТЕТ «8135 Синтетична послідовність «Вп «823» еТтИиКІ ШО «ап» 94 зіп сій Бек дат ТВХ Ту вщо РНе ТЕ 1 Б. «шїйз 95 кхиіїз З «а212з РЕТ «ії» Синтетична послідовність «вах «В25з БтТІНІіЇ», 5Т2НІЗ? НОерКІ «40аз 95
Бре тут АвроМесє вне 1 У «107 ЗБ коїїх 5 «3125 РЕТ «ії» Сичлєетицни послідовність «80
«а?3» вТІнНвЕ НСБЕ1 «400» 56
Авротухк АтТа Меї РПпе і 5 «10 537 «їз 5 «вій ВВ: «13 Сидтезична чослідськість «Е?05 «й23» ВТІНВО, БТтонІиЗо, ЗТоНн2В5?, ВТІНоЗі1 НСБ «400» 957
Тїе тук Авр Меє їЩе ї 5 «вій В «Еїв 5 «-318з ББТ «вві» Сивтетична послідовна ють «ВВ «23» ВТІнНІаВ нерві «ай» За
Бек тух Ар Меє ТІ1е 1 в «їз» аз «211 5 «їй» РЕЖ «-213з Сичтетична послі повість «0» «223 ВТеНЗІВ НОСОК
«ВО» 3
Авр о Авр Аза Меє їїе
Е 5 кії0з 00 «21 «кі2з» РЕтТ «3ї3в Секнтетична послідовність «ей «ді» вВТеНЗІвБ НОВІ «ай». 300
Зіу Тух А1їа Меб Її16 х В «ЗВОж 191 «ія в «Ви РЕТ кої» Синтатична послпідсвниїсть «й «вв» внз а НСОоКі -400з 40
Уаї ТУх двр Меє їїв їх 5 «аз 102 «їх 5 «ага» ВВЕ «813» Сиктетична послідовма сл «ваз «аз» БТЗНаОМ Сови
«по» 305
Рпе туг Вар Меж 116 ї 5 «аа» ЛлО03 «їв а «ВР ВЕтТ «213» Синтебмзазна послідовність «ах «Зи3» 8тТанНІі7З, 8ТоНі72, ЗТ2НІ73 НСрВі «Або» 103
Нех Тут Аво Меб Ріє ї 5 «ій» 154 київ 5 «212» РЕЖ «ії» Сицтєетична послідовність «ках «йш3» шаТанієЗ НСПВІ «ап 154 маї тух Авр о Меє рве 1 З «210» 1п5 «Вії» 5 «122 РЕтТ «13 Синтетицна поспішив сть ей «айїз аТтенНІівВа нерві «ай» То5 чаї Авр Зеж Має рве ї 5 кг» 106 «-вТХЗ У «їй» ВБЕтТ «213» Синтетична позліІЦДОВНІСТЬ «Вих «223» ВТтТоНІЗе ВОркІ «йЦож 06 біу тТух Акр Мес Ре ї гу «210 197 «саїїж 5 «212 ТЕХ «ві3» Сиктетична послідовність «жи» «Ії» БТЯНІіЗЕ НСОВІ. «00 107 тте Тук о Авр Мес Ре ї 5 «210» 108 -йї1їз 5 «21из РЕ вВіЗ» сСтнуєтнана посліудевнієть «вих «дні» БІДНІ НС. «Або» 108
Іїе тук бек Меє ре 1 Б «віз 103 «Муз 17 «ит» РЕТ «Вії» Синтетична послідовність «5» «й БІеНІіЇВ НОСОВІ «00» М
Бет 116 Ахко зіу сії біу іу Акч Тк дев о тТух А1а двр о Бек уві Був 1 5 То 15 ві «2302 110 «-81із 17 «кві» ВЕЖ «13» сСимтазична псслідавність орав «223» БТІНеО ВСрна «Ах» 119 дата ліе віч віу Зіз сіу бСіу ЗВ тах ап тТук діа Авр бек хуаії Був 1 5 Що І 5іу «вій» 313 «-811з 17 «вах ВЕТ
«-213з Синтетична послідениьсть «ад» «ййії» зна НС «йо» 113
Твт їіе пув 1іу іп біу біу піу ТркЕ ТукотТух А1а Авр Бек Уві Буг їх ь 15 15 су «102 115 -аїїз 47 «аїйз ВЕТ «2ї13з Сибтетична поснідевнісув «20 «из ЗТВНИЗИ СКЗ «00» 11 тТвЕ т1е Ато біу при СТУ бір Бек тк туг тує дія Ар бах уві Був ї 5 їй 15 сіу «їй» 135 «-В1з СЕ «їз РЕТ «2135 Сивтсаетична послідовність. «ев» «й2із Б5ЗТиИНгВ СЕЗ «4505 113
Тк 1іє Ако Зі Фіз бі спіу Тв Так дів Тук Аза дЕЮ Бех Ма1ї Був ї 5 о 15 ву «їйх 114 «Мк хвійз РЕТ «813» Синтетична послідовність «ВИ «ваз» БТВНКІаВІ нСБЕЗ «40305 514
Бек її Аку Зіу січ сіу ОТу стіу Тис о Тук о Тук Аїа с аБр бек таї був 1 8 10 15 щу «»РОм 15
ЕКЗ ШК
«Рій» РЕТ «813» Сратетична послідовність «во «й23з» вТенІЗІ НСрвЗ хаб 15
Тих Іре дха сіу іч Зіу сту Ту Ту бак Тут Аіа АБробехк о уаї Був ї З 30 15 щу
«Ма» 115 «вії» 17 «йї2зх РЕТ
ФЗЕЗ» Скитетична робдідоееність «222» «ваз» БІЗНІІ1А НеСрЯЗ «40аЗ ЛІВ тТуУук ІБ осіу БІУу Авпос1у п1у ТВх тп тТук тук дія Ав обБех Уаї був ї 5 15 15 тіу «йзїйж 117 «ЗІЗ 17 «ій ВЕ кшіЗ» Синтетична послідсвність «29» «283 ВТІНЗІЄ НОРКА «ап 17 тТук Ії біч піу біс піу біу сію Тбу Тур Туюк Аза Авр Бех Уаї був 1 5 то 15
ЗУ
«ха ВВ «Вії 17 «ВР» РЕх «9513 Синтатичняа послідазанистлть «ах
«а03У ВТІНЗІЯ НСКУ «8005 118
ТвЕ 112 Ах сіу вів с31у б1іу с0іу тах тук Тук ліа Авр бек уві цу ї З а ї5 біу «вій» 319 «Вії» ЗІ киїйз» БЕК «213» Нопо варівая «во» 119
Аїа Був Ре Бек Був біп Бех Ткр СТУ Бей сі Ап о біз Аїа Пей Тїе ї В 19 15 чуаї Ака Сув ВБкго Аго біп Зіу пуз ро Беї Тух ТНж Маї Авр Тжротут 20 5 зо
Тук бек ціп твх АБ опув Вех Т1іе Рхо ТЕ бій біз ака Авпобка Чаї 35 чу 5
РМне діа Зех сбіу сій цей емо був о РБе бео Бко діа січ Уві Аїа дер 5 5О бек сту жі тут ТЕ Сув її уУаі Ажщ Беж РКО ТЕ Бпе Ав Ак тих 7 15 я сі тую іа АБю Уаї ТНЖ 1 Тух був пу біб беж АвросСуя Ав Уаї 5 50 в рхо Авр о Тук ем Мес Тук Беж тії Уаї бек о сіу Бек осі Був Авпобек 109 Т05 110 їув її Тух Сув РТО Так тів двропец тут Авп оїтр тТпх Аза ро пе 115 120 т25 їзій Тхр Ре Був Авт Сув біп о Азїа без сій Зіу век Аку Тук Аху А1а ї30 а 140
Ні Був Бех Бе цем маі Т112е дДвроАви Заії Ме Тр озфіц АвроАїа ОїУу їа5 ї55 55 т60 двр о Тук ТвкоСув Був Ре Іїє Нів Ави бій Ана біу діа Авв Тух БЕ 165 170 175
Уві тиж діа ТнЕ Яку Бех Ре ТП уаі Був Авросіц сій зіу Бра бек ї85 1855 89
Пец РПесрго Чаї її8-8 б1іУу Ата Бхо Віа сіп деп Сіда т1є був зіц УВі 155 зо 205 сі т1е 51їу пув Ав Авіа Авіп оте ТВЖ Сув дек оАіа Сув РБе сту Був 710 215 320
Сту Тв обі РБе їв-я Дів Азїа Маі Пец Тур бів їй Вапосіу ТЕ Був
ЗО За рев їБе твг АвроРбв сіу бій рко бжо ті біп біп піц бтий сіу ата Аа зав -5О 255 сій бек вле Бех вп опіу це) Аза Сув це) дер Мах так цей дка тіє 250 Б аа
Віа Авр оМаї цпув 10 б1: Авр обей бей цей сій Тук АБрю Сув вмч Аїа 2 го 5 цем Ав бец Нів Зіу цей Аку дя Нів Тр уві Ак їй бек Ако Був 285 255 зо аЕповгОо бБеї Пув біб Сув ве 3а5 зв «їз ий «Ей т «иа» ОВЕТ «-2135 Сичтетична поснліловніств «вх «23» БТаНЕО» НСрКЗ «400» 129
Тих гів Ат БіУу Бі 01 біу Авр ТнЕ о Аво Тук діа АБр Бек Уві Був 1 5 18 15 «у «ВТО» Би еВ 7 «ві8» РЕ «2і3х бивтетична поспідовністе «Ви» піз Б5ТеНІ НСОКА кайо» 151
АвроІї2 Був б1у б1іц біу піу АкУу ТВКЕ Аіа Тук Аїа Авр бек Маї Пув 1 5 10 ї15 у «Вій» 197 «вії 17 «Ра» РЕ «213з Сянтетичма послідовність «220» «айи3» БвТеНІ7» НСБ кп» їх
Аїа її Аїа бі ст оту ОБу Акта Тиск оТух Тук Аїа Аво бат Уаї пув 1 у 15 ї5 сіу «210» 123 «ії» 17 «вка» РЕТЕ «вії» Синтетична поп нев схх чех» «ЗІЗ» БТЯНІ1ТЗ НСрез «ай» ЗХ аввр гів пу сіу піп сту сп;у Аза Тих Ав Тут Аза Ар Бек уві Був ї 5 о 5 ту вій: 194
«211» 17 «Різ РЕТ «2ї3З-х Сичнтатична послідовність «йФгОх «223 БТаКЕвЗ НОСОК «аб» 2
АБО оті пу піу сій шіуУ с1їу бі: тпх бек туж діа Авр Бех Ууаії Був 1 5 ЕВ 15 сту «2105 155 «юю 17 «МИ РЕТ «13» пинтетичва поспідовність го «8аїз БЕТОНІВ НСОКЗ «абз 125
Зеє іє віз сіу Авпобіу Сіу да ТВ Тук туко Аза Авробек Мі Був ня 5 о 15 ту «2105 КБ «їх 7 «Війх РНК «-3ї13» Синтетична пеблідовнастіх «хх «айв вТтЗНІ1іЗО НСОЕЗ
«400» 125
АвЕ оті с1у БІ ст сіу бу бек ТВ ОАБО) Тух А1а Авробек узі пуб ї х 10 ї5 вщ1У «абз 187 «її» 17 «Ва» ВК «їз сСиктетична послідовність «ай» «йгїз БТЯНЬЗ? НСПВЕЗ «а00з 0097
АБр їі Акч бі зі зіу зіу Б)уУу Тк Аза тТУук Аза АБрБ обвк уаї ув 1 5 19 15 бІУ «ійз 188 -е-БІі1з 17 «яви» РЕТ. «813з Скинтєетуична послідсвність «й» «23 ВТанІЗе НСОВЗ «йод» 128
Тук ї12 Ака піу 0105 піу 01у Авр тих АвБо Тук діа Авр Бех Уаії Був ї ї 10 Е5 сіу
«вій» 1825 «Віва 17 «вій СЕТ «213з Синтетична послідовність «хм «823» ватТІинЕша НСеПВЗ «400» 189 вер її Бі В1У бі п01у сі пу тТНЕ Беж Тук Афйа Ер век Маі Буг ї к 10 15 віт «Ох 30 «2115 11 «йо» ЕТ «Різ» Синтетична пеовідовність «в» «заЗ» 5233 ПСПВІ «паз 139
Ак Аква дек біп бек Маї двр Ввр'Аврв рей АХ 1 5 19 «вій 31 «В З «ій» БТ «313з Сивнтзтична паслідовнаєть «их «223» 5БТЬЗО БОбАЗ
«аз 151 піп обі Тук їЩїе зіУ Аїа ро ї1е ТЕ 1 5 еВ1пв СЕ «Вії» (З «Ех ВИХ «213ж Синтатична послідовнисть «вах «823» ВтТОрБ35 БОПВІ «паз 135 іп зів Тут ті Авр Аіа Рко Бей ТВЖЕ ї 5 «Еїдз 133 «21ї» Я «ВіВ8»х ВНЕ «вЬйаз» синтетична поспідовниьсть «вах «фа» БтТипаа ПСМНЗ «400з 33 сів зв тТук Дей АвроАтТа їТїе ТЕ п 5 «й1йз 134 «Вії 5 «19» РЕТ «ВіЗж Синтетична послідовні сте «вка «пай тав.
ІС «щййх 134 сіп Січ Тухк ЖХіє ТНК оА1а РЕ їв ТЕ
Її су «ій» 135 «вії» 105 «їз РЕТ кві Сплтетична поспідовність «80 «ваз Мілаза-їв5КУТ аажОї ОВ «абз зх
Аврої1ів бій Меє То осіб бек ро Шегк бех Бец беж діа беж Маї о1у 1 5 10 ї5
Анр Акч уаї тру ї1іе ТЕ Сув ть Тік дай тс дер ї1є дар АвБр чаї 28 З 30.
Іїе нів ткв Тух сів бій Був ро біу пуд Дів Рко цув' їм пев Іїв
З 40 45 тТух біж біу АвпотнЕ Бей Ак хо пару Уві Бго Зек БкЯ Рре дак сіїу 50 5 «о вех зтіу бек зіу тру Авровце тах вне ТЕ їі Вех дек Пса бій срКо та в во зіч Двроїіїє діа твЕ Тук ТУю Сув Пез бів ех Анр Авп Меб Пейп ТЕ ве з 55
Ре біу Стп с1у ТНЕ Був печ бі) Їїе бує по Мав
«й1йз 136 «її 106 «вій ББТ «її» Синтеетична послідовна «20 «і» УБтТтаЗаніскуїн2701 АБО «айпз 736
Авріїв зів Меб Тих сіб Беж Ро Беж Бех їею шШеж діа бех таї щу ї 5 я: 15
Авр о Аку уаї Таж Іїе Тпс Сув ї1Те тиж Авп о ТЬВу Авротіє АвроАвО Уаї а 25 30
Іі Нів Жхр Тухк іп біп пу Рто сп1іу Був Уві Еко Був їез Пем тіє з 45 5
Тук біз біу Авп ото Бей АхЯ Рко су Уаі Бхо бек Дхкз Ре бек 0іу що 55 «0 бек бу Бех с1і1у ТБ авр о Бпе ТНК о цей їпх Її бек Бех беч сіб ро ак а 7 ва іш дер уаї Діта трк Тук Тух Сув ев 51п бек АвроАвй Мес Без ТвЕ як зо 5 вне піу біп сС1іу Тих пу ем салі їТе Був
ЕВ 105 «1» 137 «-81ї» 06 «Вій ЕТ «шіЗ» сСМнтетична Послідовність
«вдо» хай» МриаЗ4а-тОоКу1-39901012 «Оз 137 «Вер ІТе бів Меє ТП о Сійп Беж Рко Бек Бек Ппеи зет Аза Бех чаї біу 1 І) 15 Бо
Авр Ага Уві ТК оІ18е тп Суб ті ТК о АвпоТйх АБроїтїе АБроАвроУуаї ай 25 39 її Нів Тр тую віп б1пй був о рко біу Був віз ро був реа без ї16е о 45 тук Віч у двп отНІ без дкЯ Руб спіу чаї ВХо Бех АхЯу Ре бак сту о 5 80 дек п1у бек піу ТЛ Ав оРце ти без ТИ Те беж беж рен чіп вхо 85 та 7 во їси двр оввне Азїа Тр Тух Тук Сув тем сій бек АБЮо Ав Меб Бей ТЕ 85; чо оту
Ре сі біп сіу Тк дув зем бій їТе Був ї9о 105 «ВіОз ЗВ «ВІ» 06 «2їй» РЕЖ «-21їз Синтетична послідовність ие «ваз чУБеаза-пцаКУут тихо 5 «400 уза
Ав ї1е бід Меє Тйк бій бек Рго Бек Бек Уві бек Аіїа Бек Уаї сіу ї 5 10 5
АвроАка Уаі Тіт Ії ТК Сув Ті ТНх Авт ТВх АвБр о І1їе АвБр о Аво ах 29 25 зо
Іі Нів Трр о Тук сів біп Бу Ро сіу Був Аїв Рго Був ївип Бач т1е 35 4і0р 45
Тук Зіц біу ВВ Тк Пец Аха с Рко сту Уаї Бо Бех Аа Ре бЗет Б1у
ВО БВ з
Бех спіу Бек З1іУу ТНХ Авр оре Тк Цей Тах Т1іе бек Бек рей бо ро
КА; 75 59
Січ дар вре діа Так Тух Тух Сук їни бід Зех Авродяй Меб Шей тТвх 85 зо з5
Епе сіу бів ау ТБх Був ем ОМ ї1е Був що 05 «віз 138 «їх 106 «ейій» РЕТ «8139 Сичтетизма послідовність «Зах «ваЗ3» УноазЗа-їаКМі-55ОКю 1 «ай» 139
Авро'їїе зів Меб ТИХ зіп Бех Рко Бех Тк бе) бек аїв бек оуаю 01у ї КЕ 10 ії5
Авр Атч Уаї Тих Ії ТржЖ Сув їі Тв»Е Ав ТЕЖ Авр о ї1е Авр о Авр о Уві що а 3
Ізїе Нів Ткр Тук бій біб Пув Рео с1у Був Аза ро Був Бенц Теч Іїв 35 ай 35 тух пік бу АБпотбк Пед да рко біу чаї Руо Бех Аха РБе Бех бїу 55
Зех бі дек сіу ТЕЖ біти пе ТБг ої ТВх ї3Зе бах ех дже біт бко 55 79 75 во
АвроАвр Бе А1а Тих тТук Тук СУув реч Зіп Бек Аве оАвп Ме цеб тв 5 Зо З
Рпе Ту ПІ ОБу ТНЕ був пе» бі) їіе Був вяв; 105 «й1йз 1940 «В1іїж ї06 «їй» ОБКТ «а» Синтетична полі вові «каз каша» реа 94а-ІЗКУІ- ЗО ТВ «400» ї40
Авр тів сбіп Бец тах біп бек Ро бех Ре цем Бек Аіа Вех ЧУаю їу ї 5 їо ї5
Авробка Маї Тахо ї1є Тих сув 118 Трх Ав» ТВжх двр 11е Авройвр уаї хо 25 30 її нів Ткр оТук зіб біп Був Рко 21у Був Аза Рто цу Бей пей Тів 5 чо 45
Тук січ 01у Два тах цес га Рко біх уді Бко бех Ака Рпе Век 91іу
БО зех сіу бБег бТтУ тТНе біо ре тТпс рес тв ті Бек беж Цеп осів ро
З ТО 5 ві
Зі: Авровне Аїа тк о ТУк Тук Су пев свй бек одно Аво Меб Беи ТВЕ в за 35
Ре пу сій Зіу тв Сук о пей сім лів пуб 190 ща5 «Ві0» 181 «Вії» 06 «12» БЕТ -й13з СивтеФбична послінаВвнЕсте кава» «223 Мь2ева- ІсшКУуЗ-15О ЦЯ «4005 141 біз ї1іе Маїі Меє ТБ бів век Рко Аза Тпх Пей Бех Уеї Бех Рко бсіу 1 В 19 15
Зі Ата Аїа Тпгобеа Бек Сує їіє Тьж АБ ТПх АБО о І1фї6 Авр о Авроуаї 2 25 за її Пів тб Тує бій піп ПУ орто сІіу бій йтТа Еко Ате рев без ої1ї8е 33 40 45
Тух іп су Аа оте Бей Ак Ркто ту Т1е РКО Аза Ак Бпе Бек су во ЕК із)
Бех Сіу Бег сіу ТВу сі Бе ТВкоПеч ТБх ї16є Бех бек без біп бет 55 70 75 во
Сіш Авр Бе Дія Уаї Тух Тук Сув рез біп беж Авродва Меб гей ту зо ЗБ ве віу сій С1у тк Су рез сій ї1т85 Був 106 155 «20» 42. «їз 10 «вій РЕТ «ВЕ» Синтетична послідовність «аж «823з УБзава-їскуї-39901 012Ю «ай» а?
Ажо т11є Зіп Мек Тпх бів дек о Рко бек бех Пец бек Зіва бек тУаї З1У і З 10 ї5
Авродко Уві Тв оїів тих був їі Три дяп о тТБк дер отіе АвроАвр уаї що 5 0 ї1їз дів сгЕр Тук бій біп Був Бко біу цу Аіа Ро Буш пев цем 118 5 тТук біз су АБИ ТпЕ Пен дка РЕ 1іу Уа) РЕ Зак Ака БПпе бек біт -5 «0
Бек зіу Бек ту Типу вар Ре тВУ Бен Тс їіе бек Беї цей біп рРко що 7 та ва січ АвроБйе Аа тв Тук тТух Сув лей со10 Бег Авю» Ав це) цем Ту я 9 з
Ре Сіу піз біу Тв о був Пем бів 118 Бук 100 105 «і» 143 «аз 17 «віз РТ «вїЗх Шичтетична послаідевкість «ваз «23» чнІазЗза-їснУуї- Ехо «а00з ТАЗ сти Уаї біп пе уаї біз Веб 5іу АтТа бій уві (ув о Бує ко б1у 81 1 В 19 ї5 тат уві Був Ії6 Бек Су Був уаї бак лій рів Авпої1іе Був Азр Авр я 25 Зо тТух Меб Ні Тр оуаї бій ЗМ АтТа вкО С1Уу Був а1іу пе січ ТЕб мех їк Я 45
Сі Ах її Авробко діа їїе 21у двп отТпк оса Жук Аїа бі пцуш БАде в вЕ во пів біу дтхе Уві Торт Ії Тпровів Ар о Твбк бек тис вар ТЕ Аза Тут її 73 75 во
Мес бій пес бек Бех їеи Акху бек біз двроТБІ А1іа Уаї Бук Тук був ве и 5 діз ТвК Сіу адвр вне Тут діа Меб двр о Тук Тер ЗБу їла оту ТВ Цей
120 во 110
Уаї Тпг Маї ет Бех 115 «вій» 185 «Віз 117 свй» РЕ -21їі3» Синтетична поспідовність «ай «ад» чнаєча-хснуї-сАжбі1 «0» 144 біп уаї біб оБпел Уаї бій бек бу Аїа Зап уаї був Був рго 21у В1а8
І 5 19 15 бек Уві Був Уа! Бех Сув Пув Уві Бех Вта Рре ДепоїТе Був АвроАБр 29 25 30 тУх Ме Ні Тур Ууаї ла бСіп діа Бко пі? Був сіу рей спів тероМмеє 35 40 45 зі Аг Іі Ар Рко дід І1їе сі деп Тк бій Тук о йіа Рко бує Ре
Бо в вд
Зіп о АвроАку уаї Тву Ме Так січ Авр о Так Зех Так АБЕ ТВ Алла Тук а КЗ я мек сій Пец) дек бех пен Дкч бек бій Аво отих Аза узі Тухк Тек Сув 5 ЗО зЗ5 азїа так осі Авровпе тТук Аза МеЄ Авр Тук тЕр оту біп біу тТвЕ Пец що 195 хо чаї тТпх Уаї Бек век 115 кал» 145 «їз к2їй» РЕТ -е2в3м Синтетична послідовність кешіз ХВ ЕТБНяЯП1 «Об» 145 сти Уа бЗіп Бем увЕ сСіп Бех О1у Аза сії Чаї Був Був БКо 5іу Кіа 1 в То 15
Тнж Уаї був її ет Сув цув Заї бек Аїа Ре Ав) їїе Гуд Вер о Авр зі 25 С;
Тук Меб Нів Тхр Уві бів бій іа РКО сїу Бу б1у цеи б3іш тю Меє а5 сіу вта І112е Авроржо Аіїя тіе сі1у АвпотТнк піч Тук діа бій Був ЕВе ва 50
Сіп біу Яку Мав тТву ті Тпх Ата Аер Так бек ТВ Авр о ТвБЕ Ата тух 70 З за мес свій пео бек Беж ПЦез Ах дет сій Авр Таж оАіа уві Ту Тук о сСув 85 зб 95 вла тнж іу Авр РВЕ Тух Аза Меб Аїа Тук Ткр Біу бїп ос-1у Тк Гей 100 ща5 155
Чаї так Уві Бех дек
155 «йійз 146 «вії» 8 «їй ВЕЖ «-213з Сичтетична послідовність «ах «233» НСРЕЗ ож БТОМ226-2Т1М232 «ап» 145 біУу Ар о Бе тТук Аїа Меб дів тут ї 5 «0 187 «аз 8 х21йх РЕЖ «813: Синсетвчна послідовність «каві к?23» БІ Мав У, «400» 147 їеш щіз бех АдвроАвп Бей їви тТвЕ ї 5 «210 ї4Я8 «иїї 303 «-й12ж РЕТ «її» Свнитетична «ах «идїж ІЇСНУуТ-йАз01 каркас «-а00х 145 вій таз Зіп бен о уаі біп Бек бі Аїа сви уві був Був Рко біу дта 1 5 ЕІ 15 бЗек уві Ццує Уаї Зву Сує Пуя Чаї бек бі Тух Так бе ТВ ій Ген хо раса зо
Зек Меб Нів Тер Уві Ахка Сіп Віа Рко сСіу Був біу ем бів Тр мех
С; Кн 1іу 01у рРНе Ар о Рхо бій лавр зіу сій ТБ ЇТїе Тук Аза бів пу Ре
За 55 іе;
Сіп піу Аа уві Те Меє ТНК бій дер о Твну Шег Р АвротБк діа тує а 7а 7 йо
Меє Зіш гей Бех бек Пе Ако Бек бій Авр Тих Аха Уді Тук тТук Сув 85 зо з
Аїз Так Тер осіу зЗіп сіу Трек Беу уаї Так оуайї бек обеж 599 т1а5 «кі 149 «в1ї5 ЗВ «Ай» ВЕК «из синтетична «вх «йо3» ОНУХ-ЕКО1 каркає «400з 149 сь уві іп пен уаї 5їм век сі Аїа спі уаї ув пув ро 51Уу Атїа ї 5 16 15
Так оУаї Був т1їе бек Су пу Уаї бек З1Уу Ту ТП Вце тик АвБЮ Тук
28 25 зи
Тує Ме Нів тр уаії іп пів діа вго 01іу пув бі бем біз Ткр Меє сьу без аї Авр оБКо іс АврозіуУу ій Тих Іїв Тух Ата сі; Був вде
ЗО а 50 фа біу Акч о Уаї ТрЕ іє тих Аза дар тих беж Три Авр отТНх АТа Тухг 65 о т. 89
Мек бій рей Зек бек бе Мо Бек бій Авр Так одіа уаі Тук Тук Сув ав за а5
Аїа Таж Тр сіу бзіп біу ТБх рей уаї Твх Узі бег Бех що 125 «210» 150 сеї 105 китах РЕТ «еї8в» Синтетична «вве «2233 їЇПКУЗ-15501 2 каркас «400 ач9
Зіч ті уві Мес Тв біп дек Бжо Аїа Жак о реи бек оуаї Бех вто 51 1 5 10 МЕ сій Вк діа ТП пей Бех Суб АкУ Аїа бек бів бек уаї Бек вех дат 29 25 зо
Бен Аїа Тко Тук бій бів їуе ро зіу бій дів Рхо Вже Печ опе) Ї1в 35 о а5
Тук спіу вза ет ТЕ Аку діа твкосіу т11е РКО Віз АкЯ Ре бах СУ в 55 БО
Беж ЯІу Бек б1у Тр о35 РБе ТВЖ без ТК Її бек бек Без сій ЗеЕ 55 7 7 80 січ Авр о РБе Аза Узі Тук Тук Сує бів о бСіп тТух Авпознд ТЕробко ТВЕ ва зо пе тре щу бЕпопіу ТВх Був це ій ІТе пу 108 ї05 «їі Б «811 156 -2ї85 БЕТ «а» СИН текичнае «2 «ази ІБКУїТ- ВО ТЯ коркає -4005 151
Авв ІТ зіпобе) ТЦ бій Бек ро беж вве Бей щчет Атїяа Бе Чаї о1у ії 5 16 15
Авр ака чаї Трх гів Тнк Сув вх Аза Бех сів с1іу Ії Бетобек Тук зо пеп Аза ТжЖроТух сій біп Пув го сіу Буш Атїа Бо Був цем бви ІТ
Я 45
Тут діа АБа Бех Тр: Пец бі БШеб біу їаї рго бех Ак РБе Бех Іу:
БО -5 5
Бех піу ех біу Тих ОТ. Впе ТПУ Пей Трк Ії Беж Бех Бей о біп Ра в 79 5 ва бій Авр РНе Аїа ТБ Тук Тух Сув піп сбіп цем обап Бек Тук око Тк 85: Зо З5
Епе щЩ1у сій 21у Тпж Був о їви біч ІБе Був 105 Т95 «7302» 159 «3115 106 «дра» БЕТ «і32 Синтетична «взох «223» І6КУІ1-вжа1 БІЙ «а0О»м 153
Авр ч1іе біп Меє ТП біз Зех БРко бек ТІ Пес Бех Аїа бек Чаї Зіу ї 5 16 15
Вар Ака Маі Ту тів Так оСув йку віа бек бів Бех ї)е бек Бех Ткр їеа Аза Тер тТух Сів Зіп Був рЕо Зі пу А1їв Ето Ппув пемй о геиа Т1е ай В
Тук Акр А18 бек беж іец сі) Бвж 8іу чаї Рко Бек да ЕБре Бех сту
БО 5 5 бек Ту бек аїу Тит зів Рпє Тис Бей їн пів Бек Беж Бей сій РКО
БА Зо 75 во
АвроАвр Ре Аїа тих тТук Тут Сув бій бів Ту Авп Бех Тук бек Так 55 0 35
Рпе біу Зіп Зіу тп був бем опт їтТе Був 190 тав «вій» 153 «її» 106 «812 ВВЕ «213» Сичтетичне «вай» ква» ІЇ6КМі-тї201 5 ха» 153
Авр їіїієе щі: Меб ТЕ бів бек РкОо Беж Бег уаї Бек Аіа бек Уаії сіу не 5 То 15
Авр ох чаї Тек їз Тк оСув дея А1із бек біп о сзіу ї1еє Беї Бек ткр 20 25 зо
Шев) діа Ткр отух іп спід Був Бко бі цув Аза Бо Був пей бви ї1Тїе 35 40 45 тук Ата Аїа Бех Веб пемшп піп бек сту Маї рто бек АтЯ рРре бех ТУ 5 б
Бех шіу Бек біу тНжх Авр Ре ТВг рей Тр її Бех бЗех цез бів ро «5 то т. во сій дер Рпе діа ТВх Тук Тук Сув б1іп сіп дів Ава бек РБЄє РКО Ту 5 89 З вЕпе біу сій бір тТВх був пей січ їв пув
100 ї05 «2ійз і58 -21ї15 106 «212х ВВЕ «В1Зх бимтетична «шййз «223» Таку о19 кап» 154
Анротїке сій Мебє ть обпів бех Ро бек ех Ппеч бек Аїа бет Уві 519 ї 5 10 15
АБю вха Уві ТОХ її8 ТНК Сув Бк Аївз Бех бій зеї ї1іе бек Бек Тує 25 зо пен дво Тур отут іп сів Був ро З1іу пув Аза вхо Був Бей соїевн ї18 4 5 тТук Аза діа бек бек Беп сі Бех піу Уаї РкЕб5 Беж Аку Бе бек ос1у 0 Б 50
Зак пї1у Зех п01у ТЕ Ар рРБе ТНЖ Бе) ТОК ї112 бек беж Ппей О1п ра ва тйча 75 но сі Аврора Аїа То тТух Тук Су біп сів бех Тук беж Тах рхо тп 85 чо 25 ве сі сіп 1іу ТВКЕ бу пе бів т1е Був 150 155 каїй» 155 «2їіз 105
«212з РЕТ «213». Синтетична. «й «вВаЗжЖ ІОСКУ1Т-27ЗП1 до «ай» 155
Авт ої1їе зпіл Мес ТВж собів Бех Рко бек бек оце) Веж Аїа Бех уаї б1Уу
Її 5 10 І5 вер Ага чаї ТЕ 116 Трк Сув аку Азіз бек бів біу 112 бех Ав о тТуг з 25 За еп одіа Тр отут сї1й зі пує Бко біу був баі РКО Був безпо без їТе
З 45 45 тут Аїв Аїа Бех Тк пев озіп беж сфу Уві рРТо Беж Аа Рре Бех шу о 5а ща
Бек зіу беж сіу ТП Аврорце тп Беу ТЕ т1іє Бес Бех пе сій Бо 65 7 тв во зЗіз АвБроУаї Аза отТвх Тук тТух Сув о с1іпй Пув Тук Авпобек Аба рРЕЗ Тбх 8 за 5 вне бі бів Б1У Тк Був ей пи їїіє Був 199 105 «їй» 156 «ім 195 «Ша вет «ФіЗз Синтетична «в «ий ТОК -35и03 918
«ап» 156
Ав оХ1е зів Меї Тих бід бек Рхо беж Бек Пеюш беж Аїа Бек Уаї Сбіу
Авр о Акоеа Ууаї ТЕ їі тТнх Су біп Аїа бек сіб АвроїБТе бех Авдпотук 5 10 йесп дйшлп Тк отТухк бів біб був РКО бСіу пув дтїа свко тую рей цей І18 33) 5
Тук Авр о Аіа Бек Авп Гей сід Тпж сту чаї реко Зех Акч Ра Бех щу 5О ч5 60 бек сту бех біу тре оАвровце тТвх Ре Тих Ті бек ШЕ Пейп бій БЕ то В во бій дер іє дів Тип Тук тУХ Су біпобіп Тут Аве Ар о Бец о рхо ТОЖ во зо 95 те зіу ЩІів оїу так пу їжа бтш тте тумв. 109 ї95 чАМОз ІБ «її» ЗОВ «вїіхз РЕЖ «213» пошо варієптев «400з 187 меє віу Рпе Ткро тів Пе Аха Т1їе Пецш Тк ої116 цей Мек Тух беж ТЕ ї 5 10 ї5
Аіїз Ата Був РНе бек був піп беї Ткр 015 Пец сій Авт бій дія Бей йо дБ за
Т4Ае Уві Вха су Бо Ак обіп с1у Буд рхо Бех Тук ТИХ Уві Азр ТЕр 35. 40 45 тТук Тук беж біп Таж АвиоМрув бек І1е рРео Твж бів зба Ака4 Ав ліху
БО Б 5 уаї вле Аза бек ПіУ Сів печ Бей їйув Ре бео Бгто діа бід Маії дів
Б 70 75 55
Авр бек біу І11е Тук Тих Сув ї1е Уаі ка бек Рго Твх РвВе Ав Аха 85 во з5 тТлк біу Тук Азїа Авт Уві ТЕ Тіє Тук Був цуя бів бек Вар Су Ап 180 щОо5 її
Ууаі рго Авротуг пез Меб Тух Бех Так Уаї Зек сіу Бек бів Шув дви 115 125 тТ25
Бек Був І11е Тук Суд Буро ТЕЖ тів др рез Тук Ап Тр ТВЕ одіа рго 139 135 ї40 мем Січ їжхо Ве Мув Дей Сув бій лід цей біп бі веж дтЯ Тук АКФф 145 5 їч5 160 діа нів цув дек вне пей уні 118 Авродяй Уаї Меб Тв білі Ав Аїа 165 170 175 сту Абр тує тву Сув пув Де Т1е Нів Ав оса Авіа бу Аїа Ав тут ї8во 185. ї50
Єеї чаї Тік Аіа Трж Ахо Бек Ріе ТВх Уаї Був Авробіц біп сіу рРБе 155 200 255
Зехк цей Бпе рРко Уаї її сіу Віа Рко Віа сота АБ БІЙ Т1їе пу с1х 810 515 дей узі січ їїе піу ув Авподіа Аза Бе Тих Су вех Аїа Сув Ре по1у 285 8230 235 240 ув сіу Тв біб вве бе) Аїа Аза Маї Пйем Ткр Сів Гей Авпосіу Тк 215 250 255. пуя їїє Тр Або РВе сіу бін го да Їїе бів бів біз біз бзу 018
Бо то
Авп олій бек Бпе Зах Авпобіу Пец А1їа Су Бей двр оМеб Уаї Ов Аха 275 80 288 тіе Аїа Дер маї йув Сім бій йвр Тез рем бей біп Тух Авр Сув цем 599 255 395
А1а цей Авп цем Нів б1іу без Аха Акя Нів Тіт Уаї Аку Пец бек ку
З05 310 З15 за
Був Аву Ро Зеж був с зі Сув Рпв
За «а» АБЗ «11 109 «йї0з РЕТ «ж1іїз Симжжетична «Ох «ваші» МН О3-33 каркає
«або» 158
Яіц уаї сіп рей опе) біш беж піу сіу 01у без уаї сій Ро біу щу ї 5 0 5
Зак Бей бко Бей бек був Атїа Аза Беж сіу Ре Тк о Рпе Бек бек тує 2а 5 КІ)
Кіа Мес Век о тжр уаї дк бів Аїа хо СЬу дук бі цец 01 Тер оуяі
З ко) 4
Бек Аїа їїе Зах аіу бек обіу сіу бек ТНу Тук Тукодізв Авробаж чаї во 55 во
Був с1у Бра Ріе Так ої1їе бах АкЯ Авродагй бек ув АБи ОТВЕ Бей тує 55 КЗ 75 о
Фей бій Меє Авпобехк рей Ака Віа сія лвр отих о Аіа Уві тТук Тужх Сув зо зе
Ата Був Тхр п1іу бів сіу ТйжЖ ре) уаї Твк оУаї Беж бек 300 105 «Вб 53 «піїж 106 «вів» РЕТ «ий» СУМИ детТИкНа «80» ква» Ук оба каркзси (ТОКУЗ-11 «й00з ї59 1 ї16 баї цем тбх бій Яек орто діа Твж о бви бех Пец бек орто п1у 1 5 19 15 сій Ака Аїа Тк Без Бех Су Буш Аїа бекосіп бек аї бек Бек Тук 29 25 30 ївиа діа Тр тТук сій бій цу Вко су їв Аза ро АкКЯ Бей бем тів за р З а
Тут Авр о АТа Зах Авйп одхч діа тих біу ї1є Рхо Аіїа бка пе Бех З1Уу 50 Б БО
Яежх б1іУу ет б1у Трг бар ре тТвйк Меч їх ї1іе Зех Ввк це) бій рко
Бо, 75. та Зб сій Авробйе Аїа Уаї Тук Тух Сув 31 ОїІп бку бек дви Ткр Ро ТВЕ
ВЕ зб з5 вве п1у біп цзіу ТВвк Був чаї сі ї18 Був 405 чаї» 15 «1» з «вїійж ВЕК «йїЗ» синхестична «их «вгїз НСЮрКі консеноусняий си» «вії» каві «Ша» 41) «йаЗ3» Хааї ов, Ж, З, Її, б або У. еВ кхаї» Жкаах «жбйх (3)... 8).
«З» Хавй БЖ або В «ей» сагї? Кааз. «ай (3.33 «2о3з ЖХааа є А, Ю Бо В «во «вах Жвайї «вайж 151.15) стей» два є Б, КЕ аа -400з 180
Хаа Хай хаа Меб Хаз. 1 хЗ «вій» Є «1їз Ук «вій» РЕТ «2ї3з Синтетична «вий «йаЗ» НСрЕа хонмнсемсускний кивш» «ї2їз Жаві1 «Шах 1 ..( «8и3з ХхХаві «кА, Б, ТтТ, її абс о «220» «й2ії» Хаа? «ай (ЗУ, «свйів Хай? «в, В, ш- К, Ф ВО А «из «виї» ХагЗ3 «йди с-3 45 «23» Хав3 є 8, Е вбо М ч«Войз
«82ї» Хвай «ВВйа КВК, (В) «223» Хаай є Б, Кк, Б, с, Т, ГП. або А «й» «-882їз Хва5 «ой» (103..118) «вИїь» хХаав ХХ, В, М, А аа В «4003 ІБ хаа їіє Жав піу Ква Ку бі Хва ТЬ»х Хва туї Атїа Ар Бех Хаї Був ї ту 10 15 віу «10 ж ББЕ «калі» 14 «Вій ВНТ «Зх интевкчна «Ваз «ШЩ2З3» НОВЕ ковоєвсуєний жу -2212 Хані «вай» «283» Хайаї є Юр А, Ж, М, 0, Б, ЕЕ, Її, НН, В, Т або ж «аа» «вйї» хХаае «Ваше (8,23 «223» Хаво є БЕ, А, Н, Х, В, 0, й, 8, М, т, Майо ї «-30з 1852
Хаа Хаа Ткр бек ТВк бі б1у Зех ве Ре Уаї бен одер Ту 1 5 10
«205 163 «ВБіз і «Ви РЕТ «йї3з» Синтетична «00» «23» БСОКі ковсвнеусєВиЙ «КУ «?22їз Ххааї «ка 191.. 91 «-323» иХхХааї є А аа В «400х 153
Аха Аїа дет О1й бек Уві Авр Дер Хаа Пем Віа 1 5 НІ «їй» 1655 «їх 5 «ихїй» РНТ «233» СивнтЄєтична «аОх «Вй3з (БСБВЗ коксеєнсусний «ай х «г?ім Хаві «ЕЕ 3)..(31 «223» Кваї е БЕ ав Х «Вау «Фойїз Кай евшйя (4)... ї84) «223» Кава? є У, КТ абе М «ай «в-їж кваз «Шов (8.5
«23» ЖХааз є М, З, В дбо т «вип» к«221з ЖХвай «дай» (61.15 «-223- Хай є Щ дбо А «их «й Ххавї «вай (и «ПаЗ» Хаве є Б оабо видалено «ех «3215 Хваб «айва 8).. (8) «ви» Хавб є її ав І «аз ба
Зіп бів Хаа Хаз Хза Хаа хав Хаа ТИ ня а «ВО» 55 «й1ї2з 14 «212» РЕТ «13» Сиве нична «2202 «03» БТОНаВа НСБ «ій» 165
Атіа Рко ТЕр век ТІ Пій сту бек РЕ Рпе Уві Пео Авротук 1 5 19 «1і10йх 16558 «ей» 1 «Ви КЕ «ІЗ ж ин тетишна «ех
«8232 ВтЬНнІбе нСеркі 400» ї65
Ата Вхо Тер Бет Тк зі біу Бес рде вна уві це АвротТух 1 5 1 «10 167 «її 14 -пійз ВИК квіЗ» бимтетична
ЕЕ
«223» ВІБНочт НОСКА «00» 167 вва Рко Тер Бех ТВк біз біу Бех РБе Ре Уаї Пе: АБр тТук ї 5 10 «В1бж те «алі» 14 «е1їйз РЕтТ «діва синтетична «ах «83» ВТжрнНоВВ НСВЕЗ «а0ох 168 сіп РЕ ТЕр бек Таг обі Сіу Бек ББе Ре Уа? рем Ар о Туг х 5 10 «тім 188 «рії 14 «212 РЕТ «ВЗ сСУуптуетична «вай «ваз» БІШНІАВа Ср
«00 155 сі вро тер обех тТЬЖ сі) сіу Беж Ве Ре Маї де Ар о Тук ї 5 10 «гіїйз 175 кеіїв» ї4 кава» ВЕТ «2ї3з Синтетична «вий «8832 ВТЬнНиео нер «асп» 70
Тїв ко Ткрошеє ТвК осів біу Бех Ре РНа Уві бецоАвротух ії ї а «д21йхж 171 «2115 14 «їй» БЕтТ х213» Синтете на «ве «а83» шТЬНОбІ НСБЕЗ «400» 173
Нів го Тр бек тих біз б1іу Бех впе овде уаї рей овАвр тує і 5 в; ке10х ї78 «Аї» 14 «вій ВвЕтТ «813» Синтетична «ий» «23» втТЬНебва НОСОВІ
«й00з СТИ
Век Вха Ткр бек тб осів 01іу Чех Рре Ре Уві Печ йвБротукє ї 5 10 «2102 173 -Віїз 15 «ч«Жтйх ВЕТ «-й13з Синтевичина «ай «ва» ЕТЬНовІ НОЗІ «-а0п0з 0173
ТЕХ Рхо ТКроБет Тк бі. зіу Беж рве Пе Уді ьЬво; дер тує ї 5 То «Ей» Та «Кім їй «ака» РЕВЕ «13» СР тетивна «Ей» «-823х БТВНнНІБвБА НСПЕЗ «00» 174
Тук Рго Тхр зек ТЕ біз біу бек Рпе РЦе Узі це» АвроТук 3 5 19 «їй» 17 «-1)» їй «вка ЕТ «їі» Синтетична
ВО» «2235» БТШНІвВ НСОВЗ «аз 175
Ар Аїа Тхр Бес тк січ біу Бех Зце Бпе мак теч Дер Тух
З В Та «п» 7 «231їз 14 «ви» РК «жкіж Сивтетична «вих «23 БТІОНоБЬо НОрАЗ «00» Ї75
Авр Ні Тр бек Тр озіц О1у Вес Бле вБбе Маї рем дкр тут
Е В 19 «іх 177 «Кві 14 «Враз» РЕТ. «ВЗ» сСицтатична «ВХ «п23» етТиНІЄТ? НСОВА «Ой БУТ
Авротук Ткр бек Тк бі) чЗІУ Бех Рце Ре Уаі це) АБр тую 1 5 о «Мі пд «вій їв «авоеж ВЕТ «813» Синтетична «ай» «-ж3з БтТЕНавБа НСОКЗ «кайож 178
Авр біц Тер Чек Тк бі сбіу беж Ре Ріє Маі їей АвБроОтТук ї 5 10 «21й» 178 «а11з 14 «йїйз РТ «13» Сантетиучна «23» «газ ЗТБНиеЗз нер «00 5
Аврозіп Ткр бек Тпжх сій Ту Бек Ре Рбє Маї їецй ВвО о тех ї 5 10 «210» 80 «В1їх 18 «їй» ВИХ «233з Сиктетична «зай» «аз» ТІНИ) Нора «4902 180
Авропемп тТкр дет ТИХ сі сіу Бек Рпе Бде увї пек Дер тує 1 5 їо «ЗЬОУ ВХ «кїіїж їй «їй РЕТ «ша» Смнтетична «0 «223» 5тТЬНа?М СПК «аа» 181
Авзр бек Тер бек Твх сі б1іу Бех Рпе Бе Уаї Бей Др Ту
1 5. 10 «21ійз ів? «ВВїз їй «а» РЕТ «ВІЗ» Синтетична «га «ввЗ» БТШНІТаЇ НСрка «Ой Я?
Вар Ав Тер бек тТНу бій стїу беж Рре РБе маї цем бер Тут ї В 10 -210з ї83 «Тіз» 18 «212 ВЕЖ -213х Сяицтетюзна я «зх БТІНИТУ НСБКЗ «00» 183 завр тах тТгр беж Типу сто Біу Зах ра бле уд) емо Авротут ї З та «піз ії84 «21» 14 каїй» РЕЖ «213» Синтитична. «ие «ага» БІСЬНаТА нСриз «ап» з аАвр о уві Тер бек так обід біу беж Ре рРпе Уаї Ппей Авротує
В ту 10
«ій» ї188 «211» 14 «вік РЕТ «213» Синтетична «220» «вй3» 5ТБНІУ5 НСОКЗ «поз 185 йвр іє Тжр бек ТВх бін біу Бак Рце Рпе уаї дев дар Тук 1 В 10 «каВОй» 185 «вії» 191 «вій» РЕТ «йіЗ» ивтетичка «ие х «паЗ» ЕТаНБи «40» 85 ій чаї зі цей їво ази Бек сіу п1у б1іу Бей уаї бів ро 5БуУ 615 ну Б 10 15
Бек їєц дкУ Бей Беї був Аїз Аіїз Бех О1У рРБПе Так Рбе Зех Аврожтук -О В зо
Аїа Меє РБе ТтроМаі Ак бів Аїа ро жіу був сзгу Бей сім ТЕр Уді
З о 45
Ветх Аіа їі піз біу 01й бім З1у 010 Тож бапоТує Віа Авробек Чаї
Зо 55 ба
Був аву АкЯ Рів Трк їі бек Ах о Авр АБ бек Був Авт ТБ Гей туг
ТО 75 БО їец бій Ме Авпобет ва Ак Аза ази Авр ТЕ діа уаї Тух Тут Сув ва що 5
Аїа дра АБр орко Тур Бех ТВБ С31д біу Бек Рле Бе уаї Бей Авв Тух 109 тах 1
Тер біу піп біу ть Печ уаї ТБх баї бек Бек
Ми 20 «-5ї05 187 «1іїж 173 «Ва» ВЕЖ «ав3» Синтетична «ей» «ай» ВК2НБО «вай» 187 бух уві сів йви бе: бін бех біу Ф1іу О01уУ цей уаї бів Бго б1у біу ї 5 Бо 15
Бек це» АтЯ цес бек Сув Аа Ата бек біу Рйе Ту Ре Бех їіве Тух 29 25 ЗО
Авр оМек їіє Тер Уаї Акця Сів Аїа рРЖО Сіу Був б51у їПем біз тЕр чаї 4 25
Бек ТНК Іїе Був іу бій сіу піу шіу ТЕ Тух Тук Аза Авю бек чаї че; 58 во їпув сіу Аку Рпе Тх І1ї6 Бех Ага Явродяп бе ПувоАва тах Пец отух аб та я о цев біп Мес Ав бет пев вк Аїа зо АвроОТВс діа Мав о Тук Тук Сув 85 зо 35
Азїа вто АвроБрхо Тер. бЗех Так озізй сіу Бех РБе рає Уві Пей Авеотух 106 х05 її
Тюв ві Сів біу тах Пез Уаї ТБЕ Уаї бек Бек 115 ща «ж І188 «із БиЗ «8125 РЕТ «вій» Синтетична «520» «йо» БТ»НІЗЗВ «-400х 88
Зім маї бій пез пец піч беж спіу пБу Шіх рес маї 014 рРхо б01у 01У ї 5 15 ї5 цех Без вка Бей: Зех Сув Аіа Аїа Беж б1у Рре Так ре бБег Авр Авр
Кк за
Аїа Меб Ііє ткро Ууаї Ах Сів діа Ро бі ув біу цей БіЗ Тк Уві 5
Зек тує її 51у 01У АБ сту Б1Уу ТЕ Тв Тує тТук Аза АвБ Бек уві
ЗО 5-5 5
Був зіу Аха рРпе твЕ ІТ Бек дгч Ав одап ет Гув Ав ТПж ем тує е5 79 75 ва цем бБіп Меє Авпобеї Беш Ак А1іа с13 Авр о Твх Аза Уаї ТуУух Тук Сув 85 аб 25 діа дк Авр оВке ТЕр бек ТЬк січ біу Зах ре Бре уаї цей дер Тух мо 105 15
Тур о іу 012: біу ТВ бев чаї Тлк Уві бек беж 129 «зї0» 185 «й1їз 183 «вій» ВЕ «РІі13» сСМисевична «абс «заз» ВТаНЗІЕ кайо 185
Зійш уві бій бе) Бей біб ву б1У біу щу рецш уаї 410 Рхо Су Ру 1 5 10 15
Зек цей АкЯ без бек Суд вата Атіа бек бі Ре тТБжх Рп бах піу тує ї5 зо діа мех 118 Ткр чаї Ахч діп Аіа ко сіу Був сіу без бій ТррочУаї о 5
Бек тує тїіе (ій с1у 1ч 1у 01у ЗР тик тук Тухк Аза Авробек о Уаї о 55 во пув сіУу Ак Ре Трек Ії8 бе вка вер АвпобБех був Авп отих ей Тук 65 То а Бо
Тез сію Мебє Ав обех Ппейп Ага діа сіб АвротТбпк діа Уаї Тук Тую Сув 85: за 85
Аза йтч Аяр о вго Тхр чех Твт са б1іу Бех Ра рбе уд) ей дар отук 150 05 110 їжхр сім біп сіу Тпгорей Уа. Тік о Уаії Бек Бех 115 129 «віз 150 «її 183 «гій» РЕТ «-йиї35 Синтетизна «вах «кдв3» БТаНЗІЙ «аа по
Іа уаі бід опе ред біш Зеї О1у біу б1іу Пен; Таї бів Рко Зіу бі 1 5 о їв
Бек їей йха Пед Бас оСув А1їа діа бек бйіу Ве їй Ве Бе Чаї Тук жо 25 30
АпроМеє І1і2:ь Тжхр Чаї бха пів Аза вко біу був біу решт бів То чаї о 45
Беж Тих ті Аказ біб а зі су С1у Твк Тух Тук АТВ Авр бек уві що ве б
Був а1у Аха Ре тк ті бек Ако Авр Ав бек Був ДВ Тк Пец тує 85 7о 75 ва
Бей озіп Месє Ав бек без Ат діа бій АББ отак оАвБа Чаї Тую Тук сСув
85 80 ве діа ака АВвр оБго То Вес Тпг сій біу бек Рпе Ре уаї еп Авротує чо 105 10
Ткр біу сіп Сіу Тпж беч Чаї Три Мах Беїт бву 115 1258 еє-810з 181 «1їз 153 «818» РВЕ «Вї13з сСинтезична «вх кхайз» БІЗНІаБВ7 «ОО ІЗ бій баї іп без їеч біб бек біу Щ1у біу пед уві бі» хо біу у ня 5 0 15
Бек рез Ака Пес бБес Сув Аза Аїз Бех спіу Бре Тс Ре беж тії Ту ва 25 Зо
Авпомек Ії Тр уаї Ба зіп АБа рЕо пфіу Був пу Бей» січ Тхр чаї 35 р 45 вах век Іїе Ака біу піз бі З1іу біу Тйх Тук Тук Аіа Дар Бех Уві
ВО Ба а пу озтіу Акч вне тп ї1їе Щек АкЯ Авр оАвр) бек цув о Авп тіж вед жук 55 70 7. я їз сіб Меб Ав бЗес цем Атч Аза біз дер Тит діа уаї Тук Тух о сСув зо з5 ді Вхо АвроБко Тер бек ТНЕ бі бу Вес Ре Бе Уві пес Авротує 00 05 115 тТко бі біз сту Тк обєц уві Тк Уа) бек ех
ТІ 120 «210: 195 «К1ї» 153 «-212 РЕЖ «ші» Синтетична «Й «ша» Б5ТаНІЗО «Поу 95 сім чаї сій рез ей бів Бех СТу ту Зіу Пепі уаї біт РКО БУ сту і 5 10 15 беж реа АкаЯ пПез о Бех Сув Віа Аїа бек Сіу ББе ТТН РНЕ Беї 116 Тук
З За
Авр о меж Ііє Ткр Уві Акч біп Аза Ро зу Був шіу ден сій тТЕр о уаї
Зк 40 8 сек Твколіє Акс о сіу зі біу зі бек ТУ Тук Тух Аїа Ав» Бех Уаї
БО 55 ви цув сіу Ака Рпе Трт Ііе Бет Аха Авр Двп обетх Гу ви ТОЖ Бей Тут «5 7 75 85
Іеч бів Меб бяп Бек Бей Аку А1ії8 піз вар Тк Аза уаї Тує Жук Сув в зо 55
Віа АЖа Авр РХО Тир бах ТБ б15 сту бек Ре ве Ууаї цей дер тує 100 05 110
Ткр сіу бів 51у ТВе це Уаї ТпкоУуаі бах Беж ї15 189 «хх ВЗ «її» Та «їй РЕТ «3» пивлЄєтична «20» «из» Б5тТЕНаЗі «поз 193 бій уаї біп без беп 015 Бех б1у ЗіУу б1у Бей уві бій Рез бу віт і із ЕКО) ще пет тец с Ака печ бех Сув діа д1а Бех с1у пе ТЕ Ре бек їЇ1Тє Тух: 8 25 Зо
Авр Меє тіє Тур аз дга сіп Аіїа РЖжо сіу Був зх цей біч Тхр чаї 35 46 а5
Вес ТпЕ т1є Ак сіу стій іУ ЗТу ЗО1уУу Тс Бех тує Атїа Ав обЗек чаї 5О 55 56 пув сіу Ака Ре ТУ її Бек о Аса Авродаий пет о пув о АБа Твк їн Тут ев НИ) Те во їем бЗіп мМек АБи бек теп садку Віа сіб АвроТнг Аїв Маї Тут Тук Сув -о з5 йіа ака дер орРхо Тор бек ТК біц сіу бек вБе Рре Уаї Гей Авр Тух 100 хоЗ о тїхр щу біп біу Так рез Уві трЖ Уаі Беж бек її 133 «вї105 154 -21з 153 «й1ї2з ВНТ «вїЇЗв Синтетична «220 киа» БІНІАда «400з Та :
Сім Маі бій Бей пцец біц бек біу Сіу з1іу ізи уаї біп Рко біу С1у 1 З ї0 15 цех Пен дгЯ їемобех Сун Дів Аїа бЗех З1у впе ТЮх Рре Бех Звт Тух ке 25 за
Двр Мет т16 Ттр уаї Ага біп Аза Рко біу був З1у без бій Тгроуаї 35 0 ж
Бек Тйх їТе Ахч бі пі ЗКУ сі Та тик А1а тТук аАїа Авр йШек Уді
БО
Тая 01у Акта Ре Тк Її Вет Ажа АвродДяп бах пувс'вшп ТБж Бей Тут 5 79 5 во
Бей 010 Меб АБп обех Без Ака Аза ЗіБ АвБроОтТВж Ата заз Тух тую сув ве сло а
Аза Ака Аяр Ехо Теровет Таж сій оту бек оре Впе уяві рей Ар оОТуУх
100 105 110
Тр біу сія біу Ти цеч Уа» Так Уді бек Евк 115 їх «Війз 155 «21її» 83 «жій» РКТ «е2і3» Сивтетичнка «вай» кво3з» ВТНЗ «ПО» 195 пім Хаї свій ви Без осі беж біу біу бі Бей ав бів БЕЗ іуУу щу 1 К 10 ї5 дек бен дку ем дек СУБ із діа Бет сіу вБВе Тпт вБде Бех вра Тут
Кк ї5 39
Авр мес ІтТе Тер Уаї Аха біп Ата Рксо бі Був біу Без біз Ткр Уа чо 45 зек лу їТе Ака 5іу пф у СІіу Авр о ТВ лев ТУукК Аїа АвроЗек уві «о вув Щу Ака ре Тву ї1їєе дек Ака Авр Авт бек Був АвротТвк Пец тТух 65 7 т ва їви бій Меє Авй бек бео АхЯ Аза біз АвротТве Аїа уаї Тух Тух був 85 20 95
Віа вже Авр Рхо тТЕр Нетх ТЕ сій Сьу бек РНе Бе Маі Бей Авр о ТУк по та 119
Тюкробіу іп Сіу таж Бей уаї тру Уві бех бах 115 120 «М ТЗ «211» 153 «в1йз ВЕтТ «213-5 «Чинтваична «7202 «23» таНнІі75 «авох ї98
Би Уа) бій цей їв біц Бех с1у біУу біу пец уві сід реко іу С1у 1 З 19 15
Зекг пев Акад пез бек Сув АТа діа бек бі1у Вре Так Ре бек бек Тук
Зо
АвроМеє Ева Ткр Уаї йху бій йїа Рхо З1іу пу сіу без бій Ткроуаї їй 45 бек Ашр 116 цув б5іу сій Зіу сіу Аха Тпх йтТа Тук АтТа Авробек Уві
БО во бо пцув сіу вжта Рре тТвк тів Явк одта авр Ав бек Був АвпотТвЕ цем Тук зо В 5а їеа тб Ммек о Авп Бер їц Вт діа бій Авр тих діа аї Тук Тук сСув 85 за з5 вка Ахч дар рко ТЕр век ТВ сіб Б5іу Беж Ре Бе Уаії Бей одвр тує 109 105 Зо тТЕробіу біпобіу ТБк без уві ТБх Уа) беусбехт
ІБ 120 «210х 197 «1 183 «вій» РКЕЕ «8і3з Скнтатична -й2» каві БВТаНІЛ7З «400з 187 піч уві піп цей без сій Бек о біУу ПЩЩ1Уу Б1У демо чі піп реа бІУ Ту 1 5 19 15
Бех йец ж їв Зех Сув Ата Аза бек су Бпе Так рРНе Вакобех ТУук
АвЕ оМес Рпе Ткр оУді Ага біп Аза Ро яІу зу зіу Бей Зі Тюкр уві. й 5 чек Авр о т1іе Був С1іу ОТ с01у сту АТа Так Ав ТУух Ата АвробБег чаї й 5 СУ їУув сте Агое Бле тп о їїе бек Аба АБО дв одет Був Авт ТЕ бе) отую 65 7 75 8 ем біб Меб бе бек їео Ахо діа біс бар отвк Аза Уві Тух Тук о Сув а зо 5
Аза Аху Авр о ржо Тур беї Ткб бій бІ1уУ бек Рре Ре Увї цей Явр о Туг 150 105. 110
Ткр с1у біп Сіу тру пен маї Те уві бек обех 115 ї28 «із КВ «211» 123 каиїиз НТ «-Вї3з Синтетична «аз «7838 БТЗНІ1І7ТО кароз хавВ бін май Зір йем Бей ій Бек Озу зіїіу щіу пей уаі ЗІ Бгто соіу Ту
Вя 5 10 ї5
Бек Бей Ак Тем бек о Сув Аіїів Біа бек сту Ве Тнжх Ре беж бек Тух -О 25 30
Авр о Меб Рре ТЕр и Уа) Аха бік АТа вхо б1у мув шіу бе Би ТЕр. аї 35 до 45
Бех Аїа 116 АтТа сіу СТ зі» біу Ако Те оТух тТук Аза Авр беж Уві 58 80
Був б1і1у АкУу Ре Тк ї1е Шетх Ахо йвр Ав бек був Ав Та обейш Тукг «5 7 78 во пен обІб Меб дво обек ре) Аке Аза бій о Авр отТвг Аза уаї Туд тує Сув 85 зи я
Аза Аке Авр Ро Ттр Бек Тк Зі. сіу бек рРце Ре Уві цец Дер тУуг 190 165 138
Ткр з1іу біп біу Ту Гез узі Тв Уаї Бех Бех
115 125 «вій 195 «їж й «2125 РЕТ «кіїїз Синтетична «ВО» «223» БТЕИНІЗ «ох 199 отв уаї ій цей ем бій беж сбіу 21у З1у Пей уаїі 015 Бо Шу б1уУ
Зехк ГБеи; оАкЧ гез бек Су Аза Аза Бех спіу Ре Тв Ре Бех Уві Тух 29 В 30
Авр оМеб Бе Ттр чаї Аго бів Аза го біу був піу пец бій Тхтр Увї а 5 бек Авр Іїе Пув бСіу Зі біу йфу бін ТБ дет: Тук Аза Авр чек Уві
БЕ о
Був зіу Ахоа Рпе Тк ої1їе бек одтч Авр о Авп Бехс Був оАБа ТВх Пей ТУук
Бе та ЗВ 80. вацосік Мес вет бек ей АкУу Аза 5зіб Авр о ТБ Аїва Уві Тух Тук сСув
І во за
Аїа дка авровко Ткр бек їпЕ с О01у беж РЦе Ре Узі цем АвВр тує 120 105 КЯЕ тр біу бій біу Тіх рем уаї тре Уаї Бек Берг 115 120
«йиї0з 00 «йіїї» 123 ктійз РЕТ «81312 Синтетична «ве «223 ТІНІ «4002 800
За уві Зій бепотїєвр зви Бех 01у Бу бу пе Уаї бів вго біу піУ 1 Б ї0 15 бБег цей Аіч без бек Сув Ата Ад1а дек Піу ВБе Тьх Ре бек Уаі Дер 20 25 9
Бек Ме БРре ткр уві Аа сіл А1їа Бко біуУ був сіу цем СР) ТЕр Уаї 35 40 аз
Бек бег її 310 б1у Авпосзіу біУ Аза Та Тух Тук АТа Авр Бех ув) во 55 во: пу біу вт вве те Іїе бех АкаЯ Авр о АБпобех цу Аа ТВгогей Тут та 75 ва їей іп Меї Ав бек їе)в Агу Ала яти Авротіх Аза чаї тує Тук о Сув 85 я 95 віз Ах Вар Рхо ТЕв Яеху ТК біз бі Бех РБе РБе Уаї йпеч Авротух 00 105 То
Ттр о зіу біп 0П1уУ ТЕ Пен уаї тіж уаї Бек овех зо
«їйз 251 «811: 153 «їйх РЕЖ «ва3» Синтетична «220» «3» ОЗТ2нНІЗВ «ваз ої
Зіп уві бій без пез сій бек Чіу біу сіу рей уві бів орто сіу Щіу 1 а 10 ІБ век ем вка Ппем Бех Сув аїа А1їа бек 51у Рпе Тв оре бек с1у Тук 20 25 39
Авр о мес Ре Тр о уаі Акч біп Аза ркго біу був БРу йем піз Ттб уаї 35 о а
Бек АВ Іі сіу біУу піч сіу біб Бек тТпх Давп отож вія Авр обех уві во ак во
Був сіу Ач вПе ТИХ І1і6 Бех Ака Дар Авпобех Був АвпотВк Бей тТук 7 те що їм біпоМмеє Аза Бех зем Ага Аїа сліз Аве ТНЕ Аїв маф ТУ Тук Сув 85 за 5
Аїа Ака Авр оржко Ткр бек Тру біз бу бех Бе Ре Уаі Пец двр Тут 09 05 110
Тр біу сій б1у тп їй Уві ТВ Уві бет бек 115 12
«віп оо «21їз ї123 кави РиТ «-813Уи Сийтетична «ви «из» тоні «400» 895 зіч Уаї сіб бец ем біз Бех бО1у с4у б1у Бем Маї ба Рко ту Ку 1 5 15 15 бек цеч дк Пез бег Сує Ліз Аза бегосіу Ре Тк Рбе Бех ре Тук 80 45 36
Авр о Меї Еце тур Чаї Ага Сіп діа Бо бі ру Зіу без біц Ткр уаї 0 45
Бек о Авр 118 Ага С1іу 615 сту бік 51іу Тл Аза Тух діа Двр бвж Уві 5О 55 Гл
Був Ту Ак Бде ТВт Іїе Бех ка Авр дво ех Був АвлотТвх Бей Тут 7У 5 БО їей бій Меб дДвп о бах Без дху Аза бій Авор отак діа Уаї Тух Тух був 85 зо 5
Аїзвз вка веюЮ РКО Ттр Бех Так Біш СТУ Бек РБе вне уаї Бей Авротух тоб 105 118 тІв зву Іа зіУу ТтвЕ ей уаї ТП Уві Бек Бек 115 25 «21 ОЗ
«2115 ІЗ «812» РЕТ «вії» сСивтетична «вай» «ай3» 5Т2НІЗе «з0О0з 203 сій чаї зіп цес їви січ ву сі СТУ б1іу цей Уаїі Зір Рг бр 1у ї 5 15 15 бек ем Ак Пец бек Сув А1їа Ата беж сту Ре ТвБх Ре бек її тую о 45 за
Авр Меб Рпе Тур уві дка бів Діаз хо щЩіу був сСіу без 01 ткр Уді 35 40 45
Бех Тух 1іє Аку Б1у б1ч О01у о1уУ бер Тк Би Тух Аїа бер Веж Уаї во 55 ва ув б1іу дха Рпе ТК о ї16 бек Абу Авр о АБИ бек Був ввп ТНК бвоа Тух то Те во рей сій Меб АбБдобек рей б Аза о1З АВр оту Ліа уяї Тукотук Сув 5 3) 5. дів лк Авр Рго Ткр бек Трек біз сіу беж Ра о вЕпе мМаї гез Авротує 100 105 їв
ТЕр БіуУу біп бРу Тк без Уві ТВк Уаї бвк ех
Тї5 120 «8302 804 «251» 81
«2122» РЕТ -2і3» Синтетична «Ох кеаїУ БТАНІЕЗ «002 0й зіз уаї зів емз без біб бек бі з1іу Біу ем Узі сах Ро 0ІУ Оу 1 5 10 15
Вет рей АхЯ пей бет су Аза АтТа бек сіу ле ТП Бре бе тів Туг й 25 зо бек мех ББе Тер оЗаі Ака біп Аза рт біу ПВ бі цей бій ТЕр уді 35 40 45 щек Янв Іі біу сіу із сСьу щіу 01у Тк Бек Тук Аза АвБр Бек Уві і 55 во
Був сі1у ра Рпе ТНе о їїе о бег Ага Ар оАви Беж Був АБИ Тлх Пец тТух 7 та яо
Бей бій Меї Ай бек без сАха АтТа оій АвротТнх діа Щі Тук тТух Сув
БЕЗ по 5 діа дкч Аврорко ТЕ Зех Так біб ЗІу бек рве вне уаї їез двротук 106 105 ухо
Ткро Зі біл біу Тк їен Чаї Тк Маї Беж бек ї15 129 «230» 805 «Бі» 23 «д1йз РЕТ
«2135 Синтетична «233» ЗТаНІТО «00 805 піс уаї Сіп пйеш цво Сід обех о1у ту 01у їй баї їй Ркб сі Зіу 1 5 то 15 дек пез дуй пйей бек був діа Аїа Зех біу Бре Твк РБе бек Ре Тух 20 25 3 дар Мек Бе Ткр сві дгя сіп дія ро сіу пу осФіу Бей сій Тк Маї 35 40 45 бек Бех Її1іе Аха Бі зіч Зі їу Ажа ТИЖ денротТук АТа Авр Бех Уві ве ББ 50
Був піУ Ак ре ТБЕ о т11іе вех АгЯ Ав Ап обеху Був депо тат пе Тук 85 78 ВЕ 50 пев обід Мек Авй бек цем дхч Аза піц дар о ТЬх Аза уаї Тую Тук Сув стей за
Аіа вВтЗз Авробто То Бех Тахо іа бу бет ре Ре Маї Бей АБО Тух 105 05 ло тСхв сїу біп щу Тк о цва Уаї ТБ Маф пес бек 315 120 «В1йз 7506 «її 107 «1йз ВКТ «2ї14з Синтетична
«вих «223» БІ2ІЗА «00» 806
Фів І1їе маї йо тру біп бек орко Дія ТЕ пви бех рей бек Рго Зі ня 5 хо 15 в1й2 АкЯ діа тТВх лей бек Суч дкч Аіїа Беж бЗіп о бек Уаї Авр ар дер 7 вх 30
Іва Віа ТіІр Тук бій азій Був о рРхо З1у біб Аза Риб Ах Печ Пен от1е жо 45
Тух бер Аїа бет АБИ Ак Аїа тТВТоЗ31у Ще вто Аза дку пе веж біу 5О 55 6О
Зек п1у Бех сі ТПж даю Ре ТВт рей тв ті Бак дет рей сі вгО б 70 75 5О сій Авр о Бпе с Аза маї Тук тую Сув бій бів Тук діе 0зу Азя РКО тіє 85 зо 95
Так рНе о сіу бів біу ВТБ обув Уа сі) ті дує 190 то «ах ВУ «шк а» «8125 ВАТ «К1їз сСукеЕтихмиа: «Оз «шийЗз Ти «00» 207
ЗІ їїе Уаі йей ТИЖ бів Бег рРго іа Тр Бе) Вех цем бек Рхо щу ї 5 16 15 11 Ака Аза тв пей бек оСув Акга Аза бек сів беї Уаї АврозАвр о Авр 29 25 з0 цезч Аіа Ткр о тух бій піп цу орго зіу біп Віа Ро вже Ба ем їте
Тук- дар Аза вех допо дго Аза тт б1у їі Бго Аза Ага Ре Бек Зіу
БО Б -О бек с01іу бек с1у ТИХ АвроБйе Тк без; Так їїе бек Вег цеу Бій Рго 65 не: 75 во біз АБО о РПе діа Узі Тух Тут Сув біпобіп тухк Гі АвроАта Рко Гей 85 за зв
Тих вде біу Зіп о біу ТВс був Уаї бім тів Гуд 100 1055 «810» 208 «вії» 106 «8122 Ват «Х13»5 Синтетична «й «823» БТЗТАЗ «ВПО х 08 сій її маї реп тв бів бек Руб Аіа Тйї пев Бех дей Бех рРто 1у 1 5 19 15 сій: ака йіа ТЕ Бей бек о Сув акЯ Аза бек щліп бек уві дар Авр Дар 25 25. Зо без діа Тхр Тухк бій бі оБув Ро біу бів діа Рко Аха цей йеч їїе 35 ко 45
Тус йо А1аз бетх Авт Ак дІа тв об іу Т1іе ртхо А1іа дк Ре бех З1У аа Я ва
Бех піу бек піу тіж АвроБде ТВ ПцЕч ТБЖжЖ тів беї ває без бій рЕо 7 75 що
Сі) вро рпе дів уві тує тТук о Сув бій біп ТУук Аква АвроАіа 1 Тпх 85 а 5
Ре біу Бій осі Те Був уві шій тів Був по о «вій 09 «8115 107 «вій» РКЕТ «йї13» Синтетичмна «8205 каййаз ОЗТЕЇМВа «жо» жо піч їїє Чаї бе Тр о біп Бех о Ркв діа ТБ о цезз Бех Без бек ржо щіу 1 8 10 15 св аАкУ Аіа тп Без обег Сук Аха Аїва дек бій Бек Хаї Авр бар АБО
Р! в Зо тем Аіїз ТкроТук бій біп Був ро ЗіУу Сійп Азіа Рго Арз Без опе І1е
35 0 45
Тук Авр віз дек АБпоВтч Аза Трю біу їїє Рко Дів дже Зде бек сТУ 50 55 Ба
Бек сіу беж сіу Тпж бвр вББе ТЕ Без ТОЖ І18 бак Бех ев бій овго 7 75 о піз Авр Ре діа аз тує тук Сув пп біп Тук 11е ТВЕ АтТа Ро Бец 85 зо 95 твжовре С1у сій біу Тпг був Уді січ 11е Буз о5 «їй» во «вАїз 14 «25ї2х БТ «8139 Синтетична «из «ВУ» БТ влітоп «кад вхо дЕч сСув Рхо Ака бій біу Був Рхо йех тух Тих Уаії АвроТЕр 1 5 10 кіз 91 «Тіз ЗВ «312» ПМ чав3з Синнатичва «АЙ х «883» ЖхДНК УК для БТЬМоОВ «200» 211 цаздчугасаче сасбоЗзачащ содсзчсвас обоагчсаці ссчдсашсац сегавасву 0 вдстасасся ссадсяазесе сасстссяас абосасдаса сдакссодчеє дедссвочсе 135 сссодсавоєч сдсстодадетя зуссачсвос авбссоасоачса адлпасцдсесту сассбастає Іяй зссеЗасачез счавзадассо стбсвссваєс азоссчодчаса асадсеваова сасостосає 240 стопсавчасзча агачсессася саяассуаузас ассочсечває астастчуєуєсє соцссарсео зп поазчадсасся апдосасесе ссесясоасва частасіоча чесазачесас сосачсвпасо зо чеЗазсаце 365 «аж 519 киії» зді «вій» ОМА «йіЗ»х пинтеЄхтичии. «2205 «223» кКЦНК У дпя ВТЬМОВ «400» 818 чачассукеає сшасссачат ссссдссаєвс сесазесссав Зссссучосча чезсассвис во ссдазссасо чЧооосацдесса зазчсусозає зЗзасаассстоач сссврассвз чевацавоассо, 129 ччссзацссес сосасскасЕ чабєсобсасуас чссваоасвасс Зоассассяє басососчос ї59 соастксавасея чсачсодсат седсассчас ЄсСсасессзча сраєссачсво сободааесс 240 чазчассксеч ссзсасвсса стуссвасач пасакєсаєся ссссоссбає сЕссоцесяя 305 дасассваєе бсддадатсав а з2ї «ія З «еТ1» ЗБ «відйз ОМА «аїЗз Синтєтична
Й
«ВЗ» КДНК ОУН для сита
«100» 813 чачасосвує сесадзазес аЗазесечво сбодсчавас сстстсазес Секасссосе 50 асесцсасйсе всвосцасеє сссзаєсасс азгчЧассасоа сосзазазку чагесучсаєд 120 сЕсссвацва зсавчссазча чав уЯчс вЕсаєааосє асадеЕчаєча сасівоасксо 185 засссавеєс їсвазачксо аасстсокцес асктсоздчаса сабссвдадаа ссававеевко 240 зсадсадтєде аксссакдас сассувачяс зсацссасає аєквсбсаєяє аааксакває 00 ззЕбасесає седасрасвч чадосавачас ассасьсуса сачьсессстс в ЗБ «їй» ТА «еіїз ЗІЗ «їй» ЮНА «іі» Пивтетична «аж «иа» ВЕАНК У шля сива «ах 214 чзасасецсЗе таазсссадес Сосадекссс ссадстагає сгссазадеа чазодсосасо во аєсєссаваєев зуоссачесава засбоассацч асаесечаєсс стадесСабтає зесстазасас 129 сазсачадас сацавсазес асссавассс сосаєставс єсоосвсссав ссіауваєсе ів ачеачЕсссса ссазчсесач Сочсачеечч єссадшасац асвбєсасссв сзасасасає аа сстзрччачиа здчаззасяс сзсвасссає басбзбсаас асасацава чаєсссязкає 305. зсеєссоачаз зЗулазассва зсгтоЗанаса дай 333 «шо» 15 -й1їз 265 «вїйх РЕТ «2135 Мив щовезіче «00 ві
Меб аку РКО Ак Мебє бує Тух Бек Авий бек Ппув Ії Бек Рко діа пуз
Е 5 10 15 ге Бек Бек Таж Аза сСіу січ Аіа ей о хаії Рго Рро Сув вуз ті АКе 30
Яга дек 016 біп о сув ТВ пув 1 кпе Сув нів Ууаї Тук був МЕЄЕ АкКч 35 а 45 цпец Ага бек бі пед ТЕ ті Ак цу бій тик обек Тур ре Ат Був 5 січ орто Тих пув Аку Жук бек ем обув бех зіу Тбк пув Нів біз с1 85 70 75 о
Аав бвпе Бех Аза тук го Аха Бар бек Ака Був Вка Беж ем пей біу 85 ай 5 ех ті біп АтТа Бпе діа йіа ех Уаї Дер Тпу їм бек 118 іп 01у 1380 105 110 тТвжЖ бек бец пеш Тк бій Бах Рко Аза беї йецй Бек Тк Туг Авп дар
Тї15 129 125
Сі бек аї Зех рре аї цец сім Авпобіу Стув тТук уаї ті Авоа ді 130 5 4
Ав АБО бег Сіу Був Авр осів зі біб два біпоуаї пейп бей Ак тує 145 159 їіч5 150
Тук бій Бек Рез Сув Бо Аза бек бів Бек біу Авв опіу тбаї Авр о Біу
Т65 Ето 175 рує Пув йем Меб Узі Ав» оМмек беї рхо Іїї18 був Авр Ту Авр о г1в Тер ї8о 155 І80 пен Нів Аїа Ав двр Був АвротТук бЗех Уаї 5іч їй бін дгоа сСіУу Дер тЗ5 200 205
Ууаї бек Бко рРхо сій біп А1іа це Рре узі Ге) іє Був цує Бех бек 510 зі8 22 деровде уді бетх Бе сід був цу вяп пед вто бу ТЕ тТУукК Ізіе щу 285 239 235 240
Ууаї пує АДЕр Авп о зій Бей Аїа цес Уаї сзій сі Був дер сум Бех Су 245 250 255
Ав) АБ тів мес рце ув бец бех був її

Claims (1)

  1. 280 365 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
    1. Виділене людське або адаптоване до людини антитіло або його фрагмент, що специфічно зв'язується з доменом І (ЗЕО ІЮО МО: 9) людського 5121, які містять ділянку, яка визначає комплементарність, важкого ланцюга (НСОК) 1 (НСОК1), НСОК 2 (НСОК2), НСОК з (НСОКЗ), ділянку, яка визначає комплементарність, легкого ланцюга (СОМ) 1 (СОК1), сок 2 (СО) і сок з (І СОКЗ), де НСОКІ1, НСОК2, НСОКЗ, І СОКІ1, І СОК2 ії СОКЗ містять: а) ЗЕО ІО МО: 78, 81, 84, 87, 90 і 92 відповідно; В) ЗЕО ІО МО: 78, 81, 84, 130, 90 ї 131 відповідно; с) ЗЕО ІЮ МО: 78, 81, 84, 130, 90 і 132 відповідно; 9) 5ЕО ІО МО: 78, 81, 84, 130, 90 і 133 відповідно; е) ЗЕО ІЮО МО: 78, 81, 84, 130, 90 їі 134 відповідно; У ЗЕО І МО: 95, 109, 84, 130, 90 і 131 відповідно; 9) ЗЕО ІЮО МО: 96, 110, 84, 130, 90 і 131 відповідно; Р) ЗЕО ІЮО МО: 97, 111, 84, 130, 90 ї 131 відповідно; ї) ЗЕО ІЮ МО: 96, 110, 84, 130, 90 ї 134 відповідно; І) ЗЕОЮ МО: 97, 111, 84, 130, 90 і 134 відповідно; К) ЗЕО ІЮ МО: 97, 112, 84, 130, 90 і 134 відповідно; І) ЗЕО ІЮ МО: 98, 113, 84, 130, 90 ї 134 відповідно; т) ЗЕО ІО МО: 97, 114, 84, 130, 90 і 134 відповідно; п) ЗЕО ІО МО: 97, 115, 84, 130, 90 ї 134 відповідно; о) 5ЕО ІЮО МО: 99, 116, 84, 130, 90 їі 133 відповідно; р) ЗЕО ІО МО: 100, 117, 84, 130, 90 і 133 відповідно; а) ЗЕО ІЮО МО: 101, 118, 84, 130, 90 і 133 відповідно; г) ЗЕО ІЮО МО: 102, 120, 84, 130, 90 і 132 відповідно;
    5) ЗЕО ІЮ МО: 103, 121, 84, 130, 90 і 132 відповідно; О 5ЕО ІЮ МО: 103, 122, 84, 130, 90 і 131 відповідно; и) ЗЕО ІЮО МО: 103, 123, 84, 130, 90 і 131 відповідно; М) ЗЕО ІЮО МО: 104, 124, 84, 130, 90 і 131 відповідно; Б м) 5ЕОІЮ МО: 105, 125, 84, 130, 90 і 131 відповідно; х) ЗЕО ІЮ МО: 106, 126, 84, 130, 90 і 131 відповідно; у) ЗЕО ІЮО МО: 95, 127, 84, 130, 90 ї 131 відповідно; 7) ЗЕО ІЮ МО: 107, 128, 84, 130, 90 і 131 відповідно; аа) ЗЕО ІЮ МО: 108, 129, 84, 130, 90 ї 131 відповідно; Б) 5ЕО ІЮ МО: 97, 114, 165, 130, 90 і 134 відповідно; сс) ЗЕО ІЮ МО: 97, 114, 166, 130, 90 і 134 відповідно; аа) 5ЕО І МО: 97, 114, 167, 130, 90 і 134 відповідно; ее) ЗЕО ІЮ МО: 97, 114, 168, 130, 90 ї 134 відповідно; Я 5ЕО ІЮ МО: 97, 114, 169, 130, 90 і 134 відповідно; 99) ЗЕО ІЮ МО: 97, 114, 170, 130, 90 ї 134 відповідно; ПИ) 5ЕО ІЮ МО: 97, 114, 171, 130, 90 і 134 відповідно; ії) ЗЕО ІЮО МО: 97, 114, 172, 130, 90 їі 134 відповідно; Ї) ЗЕО ІЮ МО: 97, 114, 173, 130, 90 і 134 відповідно; КК) ЗЕО ІЮ МО: 97, 114, 174, 130, 90 і 134 відповідно; І) ЗЕО ІЮ МО: 97, 114, 175, 130, 90 і 134 відповідно; тт) ЗЕО ІО МО: 97, 114, 176, 130, 90 і 134 відповідно; пп) 5ЕО ІЮ МО: 97, 114, 177, 130, 90 і 134 відповідно; 00) 5ЕО ІЮ МО: 97, 114, 178, 130, 90 ї 134 відповідно; рр) 5ЕО ІЮ МО: 97, 114, 179, 130, 90 і 134 відповідно; аа) ЗЕО ІЮ МО: 97, 114, 180, 130, 90 ї 134 відповідно; ") ЗЕО ІЮ МО: 97, 114, 181, 130, 90 ії 134 відповідно; 55) ЗЕО ІЮ МО: 97, 114, 182, 130, 90 і 134 відповідно; Ю 5ЕО ІО МО: 97, 114, 183, 130, 90 і 134 відповідно; ци) 5ЕО ІЮ МО: 97, 114, 184, 130, 90 і 134 відповідно; Зо мм) ЗЕО ІЮ МО: 97, 114, 185, 130, 90 і 134 відповідно; млм) ЗЕО ІЮО МО: 23, 27, 31, 35, 39 і 43 відповідно; хх) ЗЕО ІЮ МО: 24, 28, 32, 36, 40 і 44 відповідно; УУ) ЗЕО ІЮ МО: 24, 28, 146, 36, 40 і 147 відповідно або 77) 5ЕО ІЮ МО: 24, 28, 146, 36, 40 і 44 відповідно.
    2. Виділене антитіло за п. 1, де НСОМ1, НСОК2, НСОКЗ, СОР 1, СО1 і СО містять 5ЕО ІО МО: 97, 114, 84, 130, 90 і 134 відповідно.
    3. Виділене антитіло за п. 1 або 2, яке містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН) і варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ), де: а) МН містить каркас УН, отриманий з людської каркасної послідовності ІЗНМ3-23 (5ЕО ІЮ МО: 158), ІАНМ1-24701 (ЗЕО ІЮ МО: 148) або ІЗНМ1-701 (ЗЕО ІЮ МО: 149) і р) МІ. містить каркас МІ, отриманий з людської каркасної послідовності ЗКМ3-11 (І 6) (5ЕО 10 МО: 159), І2КМ3-15701 (12) (ЗЕО ІС МО: 150), І2КМ1-9701 (18) (5ЕО ІЮО МО: 151), ІШКМ1-5701 (112) (ЗЕО ІО МО: 152), І2КМ1-12701 (15) (ЗЕО ІО МО: 153), І12КМ1-39701 (012) (ЗЕО ІЮ МО: 154), ІАКМ1-27701 (А2О) (ЗЕО ІЮ МО: 155) або ІЗКМ1-33701 (018) (5ЕО ІЮО МО: 156).
    4. Виділене антитіло за п. З, де: а) каркас МН отримують з І2НМЗ3-23 (5ЕО ІО МО: 158) людини і Б) каркас МІ. отримують з І2КМ3-11 (16) (ЗЕО ІО МО: 159) людини.
    5. Виділене антитіло за п. З або 4, де МН і МІ. містять: а) ЗЕО ІЮО МО: 186 і 5ЕО ІЮ МО: 206 відповідно; БО В) ЗЕО І МО: 187 ії БЕО ІЮ МО: 206 відповідно; с) ЗЕО ІЮ МО: 197 ї БЕО ІО МО: 206 відповідно; 9) 5ЕО ІЮО МО: 198 ії БЕО ІО МО: 206 відповідно; е) ЗЕО ІЮО МО: 199 і 5ЕО ІЮ МО: 206 відповідно; 9 5ЕО ІЮО МО: 200 і БЕО ІЮО МО: 206 відповідно; 9) ЗЕО ІЮ МО: 201 ї БЕО ІО МО: 206 відповідно; Р) ЗЕО ІЮ МО: 202 ії БЕО ІЮ МО: 206 відповідно; ї) ЗЕО ІЮ МО: 203 і 5ЕО І МО: 206 відповідно; І) ЗЕО ІЮ МО: 204 і БЕО ІЮ МО: 206 відповідно; К) 5ЕО ІЮ МО: 205 і 5ЕО ІЮ МО: 206 відповідно; 60 І) ЗЕО ІЮ МО: 195 і 5ЕО ІЮ МО: 207 відповідно;
    т) ЗЕО ІЮ МО: 196 і 5ЕО ІЮ МО: 207 відповідно; п) ЗЕО ІЮ МО: 188 ії БЕО ІЮО МО: 208 відповідно; о) 5ЕО ІЮО МО: 189 і 5ЕО ІЮ МО: 208 відповідно; р) ЗЕО ІЮ МО: 190 ї БЕО ІЮО МО: 208 відповідно; а) ЗЕО ІЮО МО: 187 ії БЕО ІО МО: 209 відповідно; г) ЗЕО ІО МО: 191 їі БЕО ІЮО МО: 209 відповідно; 5) ЗЕО ІЮ МО: 192 ї БЕО ІЮО МО: 209 відповідно; 9 5ЕО ІЮ МО: 193 ї БЕО ІО МО: 209 відповідно або и) ЗЕО ІЮ МО: 194 і БЕО ІЮО МО: 209 відповідно.
    6. Виділене антитіло за п. 5, де МН і Мі містять 5ЕО ІЮО МО: 191 і 5ЕО ІЮ МО: 209, відповідно.
    7. Виділене антитіло за будь-яким з пп. 1-6, де виділене антитіло стосується типу ІДС1, Ідс2, ІЧОЗ або Ідсаі.
    8. Виділене антитіло за п. 7, де Ес-ділянка виділеного антитіла містить заміну.
    9. Виділене антитіло за п. 8, в якому заміна містить М252Уу/52541/1256Е, М2З4А/5237А/Р2385/Н268АЛ/ЗОЗІ /А3305/Р3315 або 5228Р//234А/Л235А, де нумерація залишків відповідає прийнятій в ЄС нумерації.
    10. Виділене антитіло за будь-яким з пп. 1-9, де виділене антитіло блокує взаємодію ІІ -33/5Т21.
    11. Виділене антитіло за будь-яким з пп. 1-10, де виділене антитіло має константу дисоціації (Кдис) з людським ЗТ2Ї від приблизно 5х1072 М до приблизно 7х1079 М, константу швидкості асоціації (Кас) з людським 512 від приблизно 2х106 М" с! до приблизно 1х108 М" с", або константу швидкості дисоціації (Кдис) З ЛЮДСЬКИМ 5121 від приблизно 1х105 с" приблизно 1х1072 с,
    12. Виділене антитіло за будь-яким з пп. 1-11, де виділене антитіло має константу дисоціації (Кдис) з 5Т2І Масаса азсісшиагіх (яванської макаки) (ЗЕО ІЮ МО: 2) від приблизно Зх1072 М до приблизно 2х1079 М, константу швидкості асоціації (Кас) 3 5121 яванської макаки від приблизно 4х106 МИ" с до приблизно 1х1085 М" с", або константу швидкості дисоціації (Кдис) з 512. яванської макаки від приблизно 7х105 с до 1х107 с.
    13. Виділений полінуклеотид, який кодує виділене антитіло за будь-яким з пп. 1-12.
    14. Вектор, що містить виділений полінуклеотид за п. 13. Зо 15. Клітина-хазяїн, що містить вектор за п. 14.
    16. Спосіб отримання антитіла, який включає культивування клітини-хазяїна за п. 15 і виділення антитіла з клітини-хазяїна.
    17. Фармацевтична композиція, що містить виділене антитіло за будь-яким 3 пп. 1-12 і фармацевтично прийнятний носій.
    18. Спосіб лікування або запобігання 5Т2І -опосередкованому захворюванню, що включає введення терапевтично ефективної кількості виділеного антитіла за будь-яким з пп. 1-12 або фармацевтичної композиції за п. 17 пацієнту, який потребує лікування, протягом періоду часу, достатнього для лікування або запобігання 5Т2І -опосередкованому захворюванню.
    19. Спосіб за п. 18, в якому 5ЗТ2І-опосередковане захворювання являє собою астму, гіперреактивність дихальних шляхів, саркоїдоз, хронічне обструктивне легеневе захворювання (СОРБ), ідіопатичний легеневий фіброз (ІРЕ), муковісцидоз, запальне захворювання кишечнику (ЗЗК), еозинофільний езофагіт, склеродерму, атопічний дерматит, алергійний риніт, бульозний пемфігоїд, хронічну кропивницю, діабетичну нефропатію, ревматоїдний артрит, інтерстиціальний цистит або реакцію "трансплантат проти хазяїна" (ЗМНО) або пов'язане з рекрутингом запальних клітин в легені, гіперплазією келихоподібних клітин, збільшеною секрецією слизу або відповіддю мастоцитів.
    20. Спосіб інгібування відповіді мастоцитів у пацієнта, що включає введення терапевтично ефективної кількості виділеного антитіла за будь-яким з пп. 1-12 або фармацевтичної композиції за п. 17 пацієнту, який потребує лікування, протягом періоду часу, достатнього для інгібування відповіді мастоцитів.
    21. Спосіб за п. 20, в якому інгібування відповіді мастоцитів включає інгібування рівня вивільнення СМ-СОЕ, 11/-5, І/-8, І/-10 або 1/-13 мастоцитами пуповинної крові людини щонайменше на 50 95 антитілом в концентрації 50 мкг/мл.
    22. Спосіб інгібування у суб'єкта взаємодії І/-33 ії 5Т12Ї, що включає введення суб'єкту виділеного антитіла за будь-яким з пп. 1-12 і фармацевтичної композиції за п. 17 в кількості, достатній для інгібування взаємодії 1ІІ--33 і 5121.
    23. Спосіб за п. 22, в якому суб'єкт має 5121 -опосередковане захворювання.
    24. Спосіб за п. 23, в якому 5Т2І-опосередковане захворювання являє собою астму, гіперреактивність дихальних шляхів, саркоїдоз, хронічне обструктивне легеневе захворювання 60 (СОРБ), ідіопатичний легеневий фіброз (ІРЕ), муковісцидоз, запальне захворювання кишечнику
    (ЗЗК), еозинофільний езофагіт, склеродерму, атопічний дерматит, алергійний риніт, бульозний пемфігоїд, хронічну кропивницю, діабетичну нефропатію, ревматоїдний артрит, інтерстиціальний цистит або реакцію "трансплантат проти хазяїна" (ЗМНО) або пов'язане з рекрутингом запальних клітин в легені, гіперплазією келихоподібних клітин, збільшеною секрецією слизу або відповіддю мастоцитів. я хо : | ака -- РВВ/РВ5 Ж | п ак РВБЛІ-33 т 5 р | як СМТОЗ91А4ЛІ-33 5 4 -к-. СМТОББІВЛІ-3З гЗ о ! не й че ! ; і ше : 5. х п їж в йон : се й 5 то 15 20 25 Мен Фе 1 Всього ВА! для АМОМА ий мини ! жк у ння ння ш ев5 ка ! вину СН 1-35 х, 100- й | СМТОЗ3914Л1.-33 ко С3 сМТоБ5516ЛІ.-33 в во - ші нт и КОуХ в й ше в НО 0-3 СН. ' не пМоР-АЯ ЕІЗА у ж
    20. М | ?е шо 154 2 І ! зей ння зе ! т Ф т, шо -одк М о І 7 т ж |. а Фе ХМ ЗИ пси ж ж «і « « Ум У йо ь. у к в ще в Фіс З
    МЕ во0о- 5000: Е 400044 ч їх ! ме З000 - | !
    ко 2000 ЕЕ 1000. т пив кі ще ще ще ще Фо З є 5 є ев З ех хз -8 ш її ооо шу у и и х НК 5 5 ях з т? ооо ч в в ОО 85 шо віщі ово ові Дн ме и о о г. : ши ж ШЕ ее» бе ж а за шо ж о 55 б х з їх Ж ва о Мане: І-Ш Я ФО о 5 ВО ка Об ЕХО ЕЕ ж 0 з ж 0 75 о б Фі: ЧА
    П.-5 3004 | и Е т- 2004 ! рей Її Ї І це | жк й | | :
    що. щі 04 утри поролон - т - Я О- Я О-ЯЩ ЩЕ ЩЕ. Фо - а є а 8 т о 2 у ве -ї 5 Б п 5 "Нв сь Ше З ст т то оч жо й зе Фе Фе ж ее їни че Ех го У і: Е ЕХ х з 5 оо 5 віщі Ор ьЕшв5Бь Б шок о хх 8 З в о ко ьо я - 5 5 ВІ т оо 5 5 ок г Об ех о (3 хх 09 5 ж о о 5 фіг 48
    ТМКе ш Ж ча М - Се ше ! зк Ж не Жю- | ! че 55856595 ща жо еко те - ний зеоеооооозежожк и а я т бю єю со о ч її 5 хз т оз ши ж в ИН и п не в Око ож ож ож ж е-6 ж в ші а м хх 59502 о її 5: 65 щ о ж їх у 8 Ко З О о Фо З - о ве Б ж ко жо хе о З ж о о фіг 40
    МАБб С2494 РОЮ.
    8000 т о в00о3 . 8 5о0ої - ШИ ЩО. ж 000 ше ше ще 20004 ще ще ше ще ЩО 10009 І ще ! ШИ ся Же Б866 в Б5 Бб бро БЕ Б ши ше ше: не ше Ше Ше ше з Фо со чооо з во оЗочоо 5858 рес зе а р пи КИ -к Зх: 555955 п о Но НН У НН б ач Ос з 88235289 ух У шт"т ш- й -Е я -33 (3 нг/мл) Фіг 5
    ОМ-СВЕ 20004 Ї 17504 : 15005 ШЕ і я 12504 | а в 10005 ! ше. 5004 "І І 2504 В Ії І звеоооотоо поро ев сок сосок сват сс зовчтововвов зазетоесвсев веачозоОшавзо вечОосвоОовао С2244 (мкімл! Без С2494 (Мк/мп! раз я -ЗЗ (1 номл) йозз 16-33 0 номл) у оз3 Фіг А
    І.-8 12004 1000- Т. 5 0 В00 то - вод Крутий я
    200.3 АЕН у чі | «Її шевшошоствеве ФФфсссюю веве5ьБВ85 ЯББУ55ЕВЯВ о счплиасєссосвоно пос сезсснос і ше пінка а " і Х С2244 (МКМ! Без С2494 (Миімпто рьз
    «Т.-33 (1 нг/мл) ц-33 я 33 (1 НИМЛ) дз фії 58
    Н-5 2504 щі - 1000 ш- БО шина г
    250. І | "її ббесосетовоюв звсювссснво осаотосвосвво овотТовосвоес озчаозОзоео оочОозавосо С2244 (меми) Без С2494 (мкімл) рез СЗЗ ними) п-33 ССЗ 0 нумл) -33 г вс І-13 БО 5ОдО ! 5 40004 Е 7 2000 І щи шт. 10002 ц щш а й Я зосбовзопеос оосзшсювтес сусзсосоо сс сс ово сосдачоОосзоссвовоов ссвсотосвсюсю Сег44(мнімл) Без 92494 (Ммк/мл) Без ЯЗ ними) н-з3 Я З нумл) по-з3 Фіг: 80
    І.-10
    12004 10005 З ВО Ша: Рш с 600 Ї що. най 4004 | г "1 2004 ЩІ ай ЩІ І о-весососоков совок вевоОоотоавоо босом своотосзоосо ооОотТОовОосо виечоввоза вче С2244 (мкімл) Без С2494 (мкімл) Без я П-ЗЗ(ніимл) Н-З3 ІЗ нумл) н-З3 фік бЕ ОМ-С5Е 90004 , 40004 НТ ооо ШЩШШ. й є 20004 ШШИЩ «й син В ЕЕ Є Є Є ЕЕ ши її я Я особове сс ссссотоюссос систе зоочтозосооо ооо сссчсствесессто ссчостсоо я 1 й і - ІА С2519(мкмМл) Без С2521(мкімл) Без я И-ЗЗ (ними) 1-33 33 (і ними) 1-33 Фіг тА
    1-8
    20004 ший - 15004 її ЩІ оссосюосетто шою сосссотсссс сс сСссчтестосзсс сиза возчоосвовоо Зоо відн ш- й - -- й С2БІо (меми) без С2521(мюімл) Без я НИ-ЗЗ(1нимл) БАЗ 0-33 1 нумл) 1-33 Фіс 7В І-5 80007 с 60003 г.
    Е 0001 і и й 20003 ШШШИ.
    ПІ вас зооазоскюосеос шоссе ссоес стою По Дєстосзосовсвс зоотОовзосво Ранннннннннннннннннннннний З В нотні В С2519 (меми) без С2521(мкмл) Без «І ЗЗ (І нгімп) 16533 Ж -ЗЗ 0 ними) 1-33 Фіг 76
    1 3 о 000. 80004 и І З 60004 Шх с.
    Е 40004 ШШИ а ЩІ 20004 ШШЕШи ай ре Оноосоосюсков совет спос сзсоввксосвсва вОоЗвОвкоОоово зЗзоочооовоо ооочоовеве сесвосвосвоо бочововосго С2519(мкімп) Без С2521(мк/мл) Без 33 (нед) 1-33 331 нгма) -33 Фіг 70 /-1о 30002 25004 ше 20004 сх ! 2 15004 Ше І. 7 10004 ШЕ з ше є ЩІ 5004 ШІ | | п сс соц ю о о зевчосовово воЗчсоовево Се519імкіми) Без СоБО21(МКШМИ) Без «П-ЗЗ (ними) Й-33 я -33 (1 нимл) 1-33 Фі ТЕ
    ОМ-СБЕ З 2500 Я у т. Од Ж. ї й. Ж 15005 й. ДИ щі ще Шоста : КЕ со 10004 ПІ п г | | ВШ 5004 ЕК | ! | ї і Ей Ор ВЖК. тен ЛЮБЛЮ ЛЖВ дрон МОЛЬ. у ВВЕ шенччочис ся скоса вро касова посох 2 ша а с з Фо З З За ее Пе! п В жна Б оооноцоланьзововововтютьноо ен п ВИ п ВИН у З ВИН С2494 (мкимл) Мивімеінл 0 МАО (Мкнлі МБО (мими М чикомл) Ж -3З (З ними) жі З3(З ними) Я Н-ЗЗ(З ними 333 ними) 08-33 (З нг/мл) сен ДНІВ нен нннннннніннндоднняння ПІДВІВ фенів нокотння ГІДА Й. пненнтекеннт конк Фії, ВА. -8 2500 2000 зі І 1500 й | й | й : р 000 | І і ІТ Її ! ! 5001 ай ШИН и ЕВ аа Пес юс СОС ся сито со оия С ет итертя пу ОБ пе щує що хЕ Пенн совее і міт вав КЗ шує дез З -- о З зх ви з с с в «Фощея он а о о а , Ві їі ях «Ва | ; Ба С2454 (мепмп! Мабішкми) 00 МЯЗ мкл) М5О імкепая) МО (кими) з Й-33 (З нг/мл) жа нймл) з -З3 (З нума) 0-33 (З ними ) 1-33 (З ними) с ДИВНІ Зсяняо0 пнеттненкксюня ПИВНИНВХУ Т ясною 00 ененннєннткчкння ДАДНИ до ененяттттнеенннятня Фі: 88 -5 "300 зо 3005 ш оБОЯ - - 200 н ЕЕ Б5Оя Е 1 в. Я В. ; "и їФо ; КЕЙ ших Ї зо . ЩІ ; ще дЕеоою ше аеро шов еоюю ше вою ше ори се й сс ці о ще в ес ва ть, -е се ЗО 5 Фе Ех Ф В «ФО се Фо о -5 ши п чан пн ПИ, Сг494 (нкМл мав (шгімт МО КИМЛ МБО (МКТЛИЛІ МБ1 (МКМ яи-ЗЗ(ЗнИМА) п оЗ3З(З ми) я Н-ЗЗ (3 НИМИ) З ми) 00-33 (З Вг/МИ) снткнє ПЛаНШЩет З нняя 0 метнненектюякояя ПрАНЦНТ Ї ссненнннннняняю 00 пнтттнелнкклнютиня ГЛ ЯНВ денною кнтонт нання фіг 8
    Щ-1З3 1250 ва ; шо лО00 | ; І | , жо о | хай: Нас: «ИН: й к воб ЕЕ | и В.Н І й . 250 и КЕН ве дю я вт ооо Я ве дев є т дав є шк дак го З кі ст су ші сте З С щі с еру сс Фу ст 80 ки НЕ ув в ве Фо з 5 во З є ма рев) і ща Волопоніннінонотентаннноной нен пи СИ» Вид ЗИ ть ЗИ ЗИ с УЯВА (МкПМл) МАВ (МкпМл! МА9 (мкм М5ОчМкИМл) МБ (мкм) яіазіЗнимиу ж Н-ЗЗіЗ нуми) ж -ЗЗ(З ними) єНЗЗ(ЗнИМИ) 00333 номл) песто ланцетні няння ан З сення тннннтюннтю ПИВНІ Я сво окютннннтекння "вір ВО пло 120, яка 5004 шо 7504 ! І | : ; --о 800 й | ша. й : . ; айах во о Р | ї 411: : ї зо З | ШИ 1505 | КІ ! й і паній СЛАЛе ль ; ; ! й. пий ; ; Ге) ч ї жк. ВЕС е од ше ще Я ше щОвО т ше даю є ше дове й ОБО нд ОВ ці ОО ок ож ші зва іш бе пе З с в яке; 55 «В В в най . с А з а -й з вишня » й зійійн і : - ях С2494 (кпмл | МАВ сакмлі МА9 (нкгімп) МБО (меми) МЕ (мкпмл) «П-ЗЗ(Зніми) о П.-З3(Зними) жиЗ3(Зніми) о ЗЗ(Зними) 0-33 (Знмлі) се ВНІ З сення пеня Планшет З ссенннтенюняни 0 пететманкінтннко ПІВНІ Й сіни тінню Фі ВЕ Стимупяців з т нелап -33 усередовищі віта ЗА в 100 німи ЗСЕ ії втщА мазь Середній відсоток інгібування з 50 меслат Мав | Середній відсоток інгібування з 2 мкслий Мав я а : воша попоанин мае нн миши п ви заита домен ш-5 | 8 дно) з омнсвЕ їе-5 | ово | ой-ю | 3 01 сгза з16 | 863 | 100 | 6211 83 | 51 506 1 625 994 | 935 | 8йз | 1000 | 861 952 754 958 оз заві5 | 55 012060 1800 205.3, 815,9) 108,3 | 144.5 | «195,6 Стимуляція з З нНемл 1-33 у ЕРМУТО9В СВ я 100 нглма ЗЕ
    І І. мав Середній відсоток інгібування з 50 мкг/мл Мав "Середній відсоток інпбування з 2 мкл Мав й відання : : ; домен Ме: о 3-8 н-10 | із | оМсеР 5 в-в но паз І БІ | смеа | 950 994 670 1 878 ії заз 1 939 1 996 | 22 ва? ні вва о3 с5Т2Ма8І 232 20,7. 287 83 150 3) бьб | бі «Я 0-79 808 Її оз 25.7. М за 24 зва 760 | 16 за | з ме Повз о 5т2М51| 19 273. | 50 | 13 | 2856 | 53 | 12 18 Б | зо "Днтитідо домену ЗТ ЛІ. зв'язується а хріг. 9.
    Ї тек ШИ! "нер 1 нс пе: ЕК жпдвижх Нева УНО фонлетттттихя п пнетттетттетт пеня - нію сжкінініннятя іш, се -
    ; ши не Послідсенсть зЕатБно) --- бслідовнть ЗБОНМО: Постдовнють ЗМО.
    ВОЄН ЗХ дн нн ЗОЗ ЛУВОВУКО ВІ рРАеТовЕМЮХ В штегія 0 БТНАї ТАМ і 78 АБОбОб5ТИАЮОУКО ВІ ОРУЄТЕОМЕЛОЇ ОВ гЗ а СІЙ Бтана 5УАМУ 000Б-.78. 15555057 УУАОЄМКО 81 Пий В їхтжа; 5ТоНа: 5УАМ5 4.8 АІБОЗОО5ІТЖХАОВУКИ 3 ЩЕ 0 ОРМІТЕОЗБЕМЦЄ в |і БЖ я САМ 21 Мово АОБУКЕ ши ЩИ ПРЖБТЕЕЕЕМЮ В4 їпМІЗ Бан 1РУДМЕ ії В 5НОЕССВТОУАЮВУКО ме ОРАБТЕОЗРЕЛОМ ВА пМІЮ? Себ 0 АЕСЕОСЕТМУАОУУКО 110 ОРМУЄТРОЗЕЕМЦОЯ о тмІов 5ІЗНІЮ ХОМ 000033.87..- ПКОБОБОГААОБМКО 011 ОРЖЕТЕОВЕЕМНО р сов ия ПМ 5ТОНБ2 СЦОХАМЕ 80 У - ЕОСООЕТНХАОВУК ОО бен Тенв в БиМІМ Н томі 77770772 тковоботтаювуке с ЕВРО В ТМІОБ еТаНеЗА ОМ рон КОС УТУАВУКО 0002 ЗОРОМ вам; (яна, УМ а СВСЕОСТТАУАОУУКС 003 ОРБУВОБЕИАОМ 1 ГМО О5НІИ МЕМ пре МАО ЕК С ТМАов БІДНОЮ: ПУОМЕ «87 0. ПНОБООСТУАОВУКО 0000150 ДОКМ ТОНУ ТМ О5ТНМЯ рам 78 МосмовттуАРеУКО 6 дОРЖЄТЕОЗЕРУММ Ве ПлМНЕ апІНЗі6. СТАВ понісннн оЕОЕОСЕІАЄЕМКО ши ЛК дл ЗА зн 15ТМОі5 Тана УМ об.
    ААСЕбОСТУАОВУКо ме о ОРНОЇ Ва щ 5ТОМ213 ню ЕМ 0100409 ПАОЕБООТМУВОЗУКЮЮ.
    ЛО ОПРИЯЄТЕОЄЕМНОХ в й й ЕМУМЕ оон 0 ОНКОЕОСКТАТАЮЬУЮ. 021. ДОРМТЕОВЕР В МІ БІНІ ОБЖОМЕ 0100105 АІАсІОСНІУТАОЬУКО 0092. ОБЖБТВОМЕНЮХ 00204 БАМиЄ, БТ ЗОМЕ і-й РІКОБОСАТМТАВІУКО 0003 ОрАТоМЮю Ва ІПМ; УНІВ ОМ сн.
    ВІКвЕЗОєТ5УАОВуКО ОН вас із ВИНИ НИ ЗМ ЛМОЇВ 5танІва ОДМО5МЕ 00105 ЗЕОМОСАТУТАОВУКО 10125 ОРМБТВОЗЕЕИНОУ ОВ тиме диТаНІза ДО ХОМЕ Члнноб ОБ ЕОББТМАОУКО 00160 ОРУУТЕООУОХ ЛАМИ УеНІ87. ЕФМЕ 757 раевовєтатаюємко ш- ВМО ов БМ НЄ ТОМ ср ОМКСЕССОТМУАЮУУКО 00328 0 ОРМЛЕСУРЕ УВУ В ІБПМЯЛЯ МНІІУ УМ сні ОБО ОСТТАВЬУКО 100280 ОРМТЕОБЕЕМНОХ В
    «рі о Ума ши шишши ши шшш: ше др ет сном, ЗННВНО.
    Вести НВ БМ Леля ВЕОТБНО: ЕЕ 5НОК ВАБОМОСАА 02082 ОАЯМНАТ 02020021 - 250. ОБЕУНИВИ 08 пеня шу вана вот вквйх ТІРІ?» 55 НАЗОСУВОВА - 130 ОАЗМВАТ Фо 0 ООМІЮАРІТ | 132. 5ТЛЕЗІ 51 0 ІВАБОЗУПОВА 130. |ра5МАТ ---3.6Ю.
    ООН 0.3 с 852 св БАЗМВАТ он сення ОЗНАК, ння ОЛОВА 0 ВАБО5УВОсА 0С130.ООВАБМНАЄ ол нин ОА нн ння ПЕ А І ! БЮ 0 ОАБМААТ Й Шк. джаР 000 ол ши Осо МНЕ СВ с ЗВ М он он В НН БПМНІВ 51258 НАБОР они кни зпміз тизя ВАЗОБМЮЮЮА 000 БАЖННАТ 00000100 ОМАР 000010 ЗПИМОБ БІЛО КАЗЛЕМОВОА 0 0 ОАБМНАТ 098 ОМАР сн ПМ? БІЛЕ | ВАБОУУОРІА 00130 ОАБМНАТ о --щ0 ОДА 000 іБИМрОв зе ІНАЗОБУСОМА 130 ОА5МНАТ 80 ООУНАРЕЕ 20. - зів УОЯ си ши ВАННАХ рн ва ДОА 00001 ЗНО ТЯ 0 ВАЗОБМООВА 0380 СБАЗМНАТ, нон ОА нти п ЗМ Я ВАВ Я ОАБМНАЄ 80 дл ВН ші Я і5пМаіх 5ІЛЯЗ ВАБОУУВОВІА МО РАЗМААУ ії ЯЖ ДОУМоАт ШЕ ЗТМІЗ ТНБ НАЗОБУООТА 0130. ОАЗМВАТ | «50. ООУЮАР Й рн ІМ ЗНМохя ЗЛІ У ВАБОЕМООЮА 0030 0БАБМНАТ 000 00ОМОА пен пив ВАЗОБУСОПЬА 000 0А09АЗМААТ 00 А 0 шк ФПЛІБ 52 КАБОБМООРЕА. 130 ОАяМВАТ за ПОУСАРИ ЕН ОВТИМОІ? УЛ» ВАЗОБУОООМА 100130 08ОАЗМКАТ ен в с ни древо (ВАБОБМОООА МАК ст ЖАР 0ссний ши ТНМИЯ 5 кАнБУрОвА САУНА доня нн ння пабсАВИ 00 ЕМВ ння ВАЗОБУВОВА 00000 ДОАЗМНАТ оон БАРВ ЗТААНЕРІ ЗЛ АБО УООВ 00130 0ООАЗМНАТ 30000023 2050 0 |ДОМОАВИ ОВ Ім: 5130 ВАбОБУВОЮА І 330. ТОА5МВАТ За ОДХІЧАРІТ | а Фк шо н-сові сю вся Нажатав | | БЕ ст 5ЕСНО регі 5ЕДЮ оспідоВність Мо; Поспідовність ча: послідовність Мо. ОБПЦЛЮЮВ БНВО ПУБМІ 0000097 БІНОКОбОТУУАОСЬКО 004 ОРМЕТЕОЗЕВИОЄ ТОМІ? Зпіновв | впрова мом 5 - ЕЕ АВК ал АРМУТЕОБЕЕМЦШОУ 155 ОБИМУМІ |5ПНОВЄ) 579159 ПУОМІ 97 |ІКОБОССТУАОЕМУКО 0014 ІНРУМОТЕОЗЕКУТОУ 166 ТЕМІ І5ПНОБІ БП ОМ ОО СИ ШЕСЛ зт. тю ЧОМ! 97 МАСЕСССТУХАЮ5УКО | й ОРМЄТЕСЗРЕМІОЇ | 1858 5ТШМ3Я8 ЗПНОБа. ГБО КОМІ в ЕРМЄТЕСЯЕЕУЦЯ | 9 /ОБ5ТМЯ4, УПНОВО тла ОМ Ї 97 ІфвскоостухАрЄУЮС | М ПРИЗТЕСЗБЕМЦЮУ но 5ТНМ3а5 М я, 5івоєсостттловУко тя ІБРМБТЕОЗЕРМІОМ 12 5ТІМ344 5пНОВІУІ 512159. ХОМ! 97 БІАСЕООСТУУАЮСУКО СВОЄ лЕКНЕ 5ТЕОМЗЯЗ. ТОНІВ БтаБО УОМІ 97 |АСЕОССтТУуАЮУКО Щй УРМТЕОСРЕМІВУ ЕМ 5ТНмЗао |ЗЛНОЄ5| ве НОМІ 000097 БАСЕОООТУАОВУК пам: | 5пНІЖЄ 8ілі5о пЖОМм: 197 ЗБАСЕООСТЄАОВУЮ: 0 314 ОНМТЕОБЕЕМЦЮ б етінов? | 512159. ПУСМІ 97 |МАсЕОсстТеАОвУКо 0 424 ООМЕТЕСОРЕМЦОЯ 1? БТЕМ33а БПНІЄЯ БТ МОМ -2;-Естсептавнке. Та. ВЕМТЕОНЕМНМ. ШЕСТИ п БПМУЗа стос 5тлі5о ПУОМІ 97 |ІАсЕсовтиуАЮЗУКО 14 рОМЗТЕЯЗЕЕУЦХ 179 5ТІМ337 епНноМЮю ще МОМ рІМТЕЄЗЕРИНЯ | ло 5ПНОЛІ 52159 ОМ З? |МВОВОЄСТУТАЮЄМКО | 114 О5МУЄТЕОЗРЕМЦЮХ ВІ тла МОМ 87 МНОКОБОТУАЮЄУКО 00014 ООМУУБТЕОБЕКМЦЮЮ | 182 т ВБласвнх сс ШЕННЯ С ЗОНА ВА 571М3а3 ПНО 51258 ОМ 97 |БІВСЕСОСТУТАЮВУКО та ОУМУбТЕСЕЕМЦЮМ | ВА 5ТМУ3 | 5ПНОЇВ| 5259 87 ІМАсСЕосстууАЮєУюс ) Ме 0УБТЕОЗЕЕУЦОМ | 85 «вік 12
    1 надо тт - ши ! - Коди А ря с ун те 1 Я М й на р 1 нин 103 сте т и - 36 і У т ТТ те тин с Б ві стен 2 ПЕУФ шо 2 ! т с ОБЕ ше : я шк - ОБЛ дляля ТІНЬ нава Те пт це р-н З нини ТА птн М зв 7 БИ тане с: ТИШЕКе пт о ІА ії в ані пе - ! май й С-ЩЕ ' тт не не 1 КОМ в я КІ НИ мл КЕ дядя ях З. ЕН КЕ й ро У я хх 1 чит : 335 теічіх ге шї КЕ ши жан ТЛАЙ пасті т і пт КОЖ, ДЕ ПЕН Тх а: СЕТ "підові не ф-ня 12347 не як. по ЕІ пророт пс пеня ПЕ ь пня гц . і ТЗНеЗ і: ЗМІВ п паінж и ех ЗК є ся му дення : ІМ КТ З0ї ХЕ пек ПТ "ді ОА п СЕ Іо ВЕК прое п ще повна пет Ян шк і Н ше схе ЩЕ МАЕ мето с СЛ ше з МЕ пр : ск оленя : Я : КИ пвоютквь їй М Я ати ус нс Оу сих ї ЛАД Т- 23у ІБАХ УЛК АВ ті вл вид Кл ТЕСАК дод НИЙ пах пллчян й- п сен : УМ Кхх ЖОВ ТВ НиЖА їй пт РЕ ЕМ Бак пет пллля ех ї3У МА кі Біх ОВ чив АК НЕД: Ук Кая «те хх ІУЕя АК ТЕ г Щі У » всожння то поонвян РАКИ й тек грог т ОН ГТ г-- 22 х СЕ пихи Ки шви ММА ТЕ и кшА ТЕС еВ ве шо і Ме н МБ де ВО ей МОНА я пт ЗМО іа пятх ін Од І що Е пі г УК ЗБ хв "КУТ Ах є ІТ ТНТУ. У ОБЕЦЬ ВА жу 33 ча ! пе с ЗЕКЕ ов при) ІНК А аТАх вт осям СЕ после ск що У : М нляи МИ некі ТК ПЕ те рей Ве ки попе ЦЕ вай Г їм зх ши ННЯ Кк кине ькАЕ зва лак вза БОМ Е " ЕС ТЕ нн з НВ М Й я ха пі ше що ж н У ЕТУ І КН, ВЕК КЕХІ птн м 5 05 : мне лк щ і ігЕ т хля Б СЕ жи да: ГУК УТІМ ие Кл ЕЕ с кп йо пт І рент Й нн КЯ Се С ше Ен поло не пу МЕ ЗИ ЕЕ ши ї стен : ЖЕ ще най 2 ПЕВ не ен - и сте | тен, ІЗ ім Конння зі и ТИ сидЕ КЕ п ту пет і ф в й в іч, ря І аа ся ШИ АКТУ її хКш УЕЕ КМ у пт ФАО Я5 й тн» ї- я. ОВ СЕП жди ДУ ТКА п ви: и еВ ВОК ех шт 86 І5ї й 52 ЗА вно ЕЕ кому тон пли як свт ВЕЖІ се е ун ке поко БЕХ жан ІТК тУсл хво КИНЕ й, шо НН 211 1 8 пт ця нееткят; тити АХ й Коглкесь ЕК сиву п ду Е сх Ія 1 115 п ші НЕ «ке ши УТ зЗеии стук ФК ІК вжи плн т 15 п ГятІна пк сеЕЕНт ший ие пеня Ку ЕЕ веж ІЕшНХо чих ШІ нку й й. Н ЖУК ММ снжжн КУ ПІ де хх СУ ій ше ТЕН ее: же Ж а Її се і ме г ЗІБ це и Дело ен пн я КОЗА мини В й вн ін Е що и, що вики 7 петттх РУК АХ їв: ку ТАТ Є ї ОК р ОКХ ОХ а з с соя сля ГАЗ М -- МИХ ОЇ Му ЗЕ БК ї - 5 муж Од вОч5 ВНУ а ЯК пи па Ач СЕК - п 5 п і Е т І В Кок ПІН м ие поет ОК кн Ор жи НЯ йо К Н зим інн і3та. ЕН МенЕХх нене: КМТЕ вКЕ и Ку хи КОоАЕ ан аа ХМ) не жннй пиши у Н ке от Ех «е ца тку иа еАКІ КЕ схе УА нят ТТ тд Я ! в - 3 ние сеї 1 їх У СТА 2 УК і п ЧЕ А ОК ГУДАТТя я як ху ХУ я пику НХЕХ ОЕМ, пт пт те УА ке кл щи 5Е г зна ї хв ЕЕ в ТЕ Н пок мух СА кг; Ух ХО пет Е ПКУ З ха НИ ЦЕ щої ВЕ МКК Тед срІтх ДЕ нок ГЬаю сте ТАК МІ Й ТК жв я ЕТІВ дм Тех ВЕСА ве сг их ма ке де ве пл що ХЕ сеннрня 18; 4 Н ши м же Ід ха тут Же под ЗЯн Птн ЗК дя ТЗ їх не ше б Е ЗЕ Ех я ВЕ и. лок КАМЕ сте с шь ин я м о; і СТЬ Е зві я жи Ти рі КАХ вах я пе хе ТОК тен УК стих Е каг1. г 79 КЕ С шу Я Мо АК ПИВ, АК тех сити ТУУА не: І ї 35 ВО те и певен т ТААЇ ЕТ ЗУЖАМ я ооке КЕ: ВО вн по пи й . і ре що ст т темних АХ як ТЕЕ Я: МАО; пр ї Й : і: 15 | «ТЕН. ГУКХМ ди ІЙ БК дір! МЕ ІН ГЕ пня ост З ча : під ІН 7 ні з яоНеЕ КК ЕМ НЕІЕ ІЕЕ 7 спос УКОАХ ке чо Мне Й птах ій зв т у. Є 7 їх чи ЕВ У нення 1 зх «ПО г яд У АКЕ - я вт; ЕЕ ЩІ я пеня «к ЯМАХ І. ! | зе. щі В, авт я й саходтво рних ВУЖ шк я Е їх "ні Б СК Ме вне ЧЕ їНаКт ОН УК БЕ; М КУ п " пот ! пас см САГНУ ан МОНО: дим : лини са пи ТежИх а хи: ще мні Н 173 Пк ЕТ кі о п пот па зн ШЕ КиТЕ ВЕК ее 13 їх! їв ЗІ їні ше ІІ пЕжВ гоогвлттнх АКТ, я сту - а слляя тат дик кше ЗБК ЗеОьКя сн ся гериня Те ТЕ. ЛЕ Б ще гот 85 ; птн СБ ше: РЕ КАН ОКО В ВІВ в Е тЕІщх ох он кох ШИ: їх МО ха Н се в: сне І; щі ча ОБ ЯН клУВ Зх ЯН ЕОМ пк ка ТО ГОМ ТАТ В скл І сто ші ЩЕ Я; ПЕ На; ОВО УА лк пи Ех хе пЕш Ох і цк хо Я злих зві я ІА ЩІ шк с ОК МИХ пит С, у песнх а нях ще жо о 5 Н БТ те ніБ2 ее стека, ПК хІвА шо Кук осететмя жк. Ще із! іжісій кт ТІВ й НА тім все мода тн прот й г слот рат мае 189 : а йти воші ІМ сл ет Ме ЯК ЗК лихих пк я З Н ЗНЕ ше сок ДІВ під ПЕ Уже яку кра тк й ар Не Я ще: дання Ко ТЕ дяк ПУХ для У Яея ОАЕ БЕ тА МадЕ п ий Же ясКзТХ їж я З опнннш 2015 -- Н УшЬ я пп ех МЕ УЕОКТ З; тт тя ХА Іо лжж Й ; пенні Мих Б. ЕЕ Еш як нау ОНИ ЗБУСух й с от моя пої к. ща зни 137 и ЗИ им У ші ЕВ - ЕВ вОАХ що ко щОря ЕРА 4 ліг НИВИ З ДІ ЕК п КХ ОА КЕ пух В ване я АЛ ва дев І ті М ее ке р; вин тт АХ АБОТЕ ях ОМ ле РКО Тл Ве ДУ УНН но І пллятя Н 52 пи - их па п У я Ей ТЛІ Ме гУци п
    Зп. ши на Клен ЕТ МІЖ омізівя КЕ ва. ТУ не ТКА на дове МІ за пе й 2. Ми Го ил ЕІ ІЕЕ З виде г УА Ус: оз са с ни у ще ся 27 Н не : Ії АЖ - нет НЕ ПТ, кі Ка КЕ. -ї кг ВЕ ГЕТЕ нКл суді З йони вий ви во денне Ек ТК шко лах ТЕЗЕ ДУ пе оре -Ш-0В4 єТІНЕ МК ння МАХ Мак Е Шк ст пон, ше Бей хо ЗЕ п Б нь зна Не патіх во кА ІК шк БЕ є х ок Ук не вчи пан хи кн Ел Ед я ще ЖЕ й пет з я ЕЕ; ДЕ ЇЖА їв : ен НУ ши Маси г еп над си се та ТК ІЕЕ Нас ек, Іще ІЖИЕ пи Аг Б ІБК ше з с му МЕЖ щі лот з лКиКеЕяВ : ЗКИХ пе ТЕ ох УПА й соду ке касет -х п МЕТІ д НН т МАН по пидтетих ше й вЕДРСОЮИ о : плн котел. ін 7 "РЕК? п ще Ух аа щі сти ЕВ й я ї КН я снстньк що пон ящгу Ше Ех нак ПЕ ат ух пот же - СВА Кт. шення не петля пт ТВ г. іа Й Еш, АВС га шевеНК кої и ЗЕ «УМ З і КМ тонн че Гая У ТЕВ пот Ко мето Же не ЕМУКЕ ще а. ; СМ вен ти т ка сх пек Ен ке хх ве ТШУЖУ гани п Н офі ваша НЕ ЕТЕ свея СЕКЕУ па Ба жи тп те Ух я Н іх 1 ХУСАК се ОВК у синя УГА СА В ЗА АК ВКОК БЕЧЕ й МК ЖАХ щі КК й пон чех ВИ Ім Я пісня х питне Кп: жшгх пн З У зи : им ке тк ща ЗЕ Е КА кім ще Ед 2 шк КАлКх чі що ЯеиІх ПЕ тд і ЗП веж т, ня и | я Мій ій ТЕ, й ЩИХ ск кентьх ІЗ Хот ни о пит, В З ван і
    Б і. Й ши щи у й пдв | шо А 11 «р не У юю і я счйхМАЖКАтніК, 833 6 спмни ср сне с у і83 у шішннй лис р вт ше З НІ Ул сект длнияллннх їм: ! шк ТЕС я сі. В- КЕ я я оп овсавклгетевкіжжннко Бін Е сте вТЬЗЕ сто ЗМ ; ша ІБ гвоЗе й ДЕК Лосні . п ІВ «т ато но сля ОА г підовніст спо пеню | ; тт ТКА ер ВЕ кт пЕСНАХІ Щі ірстіннккякк сексі ; -я 7132 5 сет с ага ТЕ їй пАшТКОВ в А ст я і ва ї пон воВо уж тпвх У сет ДА Ї чнкя і РЕ ЕБеБОВ. Яд пищ ЕВ КАМ сани ши лжллнн з м ШК нини ОКУ ван ЕЕ ЬщИ тен С ву КАШУЙОЯ ЩО
    -. А ТЕ »а НН ну га подо ; ше - н я пе. те реве ее СІ8В спиттт же ПЛІД пнніннн я тм . | шк 1 У сова а сю Й УЖ ще С МЖРООКВ со для мя піснях 1Ат5 Й се ряажня й ВАГ БЕРЕ т в ве ІЗ сОодЕрІ Кнннаннноні й ст? Гоше в ши 1 пути ПЕТТІ ек, ЕСЕ во пт шт ХЕ сут і пику се 159. 1 ї потер БЕ пок пе й АХ АУх з. ж ст щи т СГ КО. і яя ій іх Й пестет па роки яки шиї пек УхСею ак, я КОцех дими. з р рота і 30 ц!| Але ТЕЗ те ко за ТАТ ЕВ де ЯН сш кад Й ЗІ: їх сна. ЗК А ще Те сне тя Нд тах ША тин ми АТ М ТІре згї м з ще зах ши ТИ я ла : тес Ех ЧК й сет ГБ ши Вт ІА діння у ЕВ ее лі ї стчннитня тання т2(5 ТЕ пЕАКЕ гене о ЗЕЖЕЯ яСКАсе СТА спосте - се с Кк шах т т ва ТАКИХ По иКЕ тв кт тео ШОКІ То ТУрАМЕ 206 екю Ух С ЗЕ ее Ноя Те ня МГ ШІ дме Мо? ше ПІТЕР. пон СЕР ЗБ УВе СО ення суч ВИН
    207. ша я те АТ о гер ЗІ полю У ЧАК шенню» Ко Гея пях ЛЕ 5 Мак т ЗЕ з). Роде Ки ще БЕХ ВХ. ме пд ЯН пеня ЗШ - Й Е їй к г. В К тд їх. 1 т Ме нку : ме ЗЕКеТАХ пок тя ЯНА І КУІК гедіченк ше Іа кон ЗЕ хе ШІ нан ТАКТИ КУ ес. ІТ: Ір і - їн Б й - ТЯ птн хи : ПІК е Нав пи каня лек, г ОК т КЕ СА ще ІВ ж п ОВ 18 ту кіт пештЕя АТ ЗБЕ сети тт пло як поееснаня сту « т КЕШ ї норок ТЕТ. ВО НаЗех хо плн, ШЕ Ре стен БІК й нище І М З В с. Я КК: їКУї ее ТЕ ще х КА і: БОЖУ о ех пня виє Мк ї вк Ух 4 - щі Голля дій ан с ОК пав інж РЕ Оу Ж ре жной ТЕО о ж 20 А опе їх труд КУ ро ес пи ВМ шк атак ві пня пост їй СЕК п В. ща я зе р; ач ену ши конях ЖЕ т ст : ТУ сн ТЕ ВТК после : а 5 т щи зЕті патре в ПИТЕТКІЯ ка Ж ТтА ЗЕЕБІТ свт сх т : п пд ті т - пет ще ДІ ганаай Я ; ер «Кк ВЛ стен БІК отит ІЙ т як БЕчоя КЗ пишним тА є ІК жи: щ св гі 58 БІ Екс о МТ тику АмЖя У АшТЕ стук їй сті ; ка тм нихх еВ «ВВ не ше У пт ше поз ТЕ увщем 20 : ім дт І сік й сиве СЕБЕ ШОУ. сти ПОН ПА БоОСтК Не 8. я зі ст Я т Шен ст їх ВЕК ля нан УЗ пото ЕЕ Не плн То Іе 1 соках пЕчі тя п. жд я по Чен ЗИ п БВ З и й з ле АвЕдО 5 пбісвотьх СА ТАК тост тр Мих Х ЕТ : в ТЕТ і Кеш й дО ВВЕ М ще пото Я Вона дишло ке жив дек гу ПМ с -- ьІш5 Сена ПЕ конем Кей шим гторот Ко йон і ВОМ 9 що уз жешкй ГУКА поле аЗВАЖ Й Ж ; АТ: пд є ТЕН ой а в, тах ам КЕ я х піелкатятоєнчя : : ШИ ; В сдснтнне ЕЕ пЕЯ і ппощще ЗК А ТАРІ шої Сстнн ЖЕ 4 Н - аа ТУ РвКЕасс: -в ТЕТ: сист канві не птЕе рен: В з Щ с ше Ух ех ен Ки дл я для кут ТЯ тент Б хв -е БТ? й Е з То ее виш ще ПАК ОЕ Гей КЕ тя пах чю ув АК ТО КО ВЕКА. МЕ ПЕ шк Ж. СНИ ЯОЖЕ КК сен рити я ї клея АТІВ ПЕ тла ТУ й ПА ї п Ше а Ной УНН що й 49 ЕІ ІтАвг ТИВ СЕТЬТ Ох ККАЛ БІЄ мий се лу що муч як З МІ ве БЕ Ме ЖІ У Я СОК, рин КЕ тА 20 В М не г пта МО лев т паї У сою с Кз) рент ЕК маАд перо я З ІЗ Б ух леж Гяст ке по са Нм хо поу я Б ще єК Ган полін ЦК чо щу я ї. 23 сеть. ГСх Бе а У мА ЕК щ - за ж 1 СНй нт КА 5 - й сп з хі нн ще ВАТ Сена те ЕЕ З. ;ТТІ САКЕ сот ЕЕ з т з тт ТЕя АТ Затв Меси ОКА ОЕАМ СГТАг вБітля се М, сх З: ги БВ ТЕХ Фкк з рен; УЛ ДУ. пт 4» одн ся . і - і35 ТУ ТЕАЖЕВ тт ОКА духу У ОВ што в пет тм -- і щу ТІЙ ТИВ ще шує еВ тих ЕК о Оси ЕВ пі х ПА дя ЛН У рт ї Кк їх в ше ЕВ 5НЕЕЕЕ ЗУ ОХ ос хх оце с ння Ши АТ не ЕЕ Кеті ВАТ ВЖК ЕМ ку Ве ях ТЕМ Е НЕ ШИ : соч ТУ - ГОД тент ЕТ ат КИ ОА паї ме МЕ се . Ка тла БАК а й ТІ ване А я А щит Її і маш щі 3 ІК ЛКК УВІ ша Ки ОАЄ КЕНЕ к ня 5 38 7 хУХ аз їх їн про ІН АКОВ ХО ОК се ій Зо ТМ ще НЕ ЕЛЕ ОХ снснн та Е: Саух ване МКС аЕее НАМ а Щі : т ВО й Я ВВ дива ЗК а СА ЛЕВ ЕК М Е 15 СЕМА ІТ тот а і пОБКЕЕЇ ЕН я З. -х ПАР в Бе - М В Е 213 па? ЕАКЕ ШИ пн я КА - Ач ой ІТ жу 7 37 іш кт ЕЕ ТО ЗІ КАХ н-к Я їні те ол т ло мії 77 соту СЕЕОХ ОнриКо ТІВ АОЕ Нови сі ек ЛЕ ТТ 20 ЗК Е Ніч т олЕ Я ВЕХяУ щ СМ сно Та вп чи КАН й їху зе Ат еко аЕої ВАТ пет БЕК СНО пт Ін КИ ТИЧ Й ШИ 15, ТЕ ВАТ отр МК рани вшпх СА -пі- чад лек Хо : ! : тзї що ІВАЖЕ ть ЕЕ ав пРЕрУВУ сопе ше сини : ях» ет - 2 У ще КЕ ВБІБЕО ТЕТІ5 сти пт ЕдОЄ У зба ІК й 1. я жех ВИНО Есе пт шк са и НАУ: пеня я: пасів я ме пет тах - БО, шИдт во БАН ТС ОСА Яма не ик Не я г КЕ си й УКХ Е АГ БЕРЕ МНЕ п те їх пен МЕТ Кк пот. І 5 в. Ще АТ: УТ. ГО На й пами МАР АВВІ ваша діжа птннк 23: и де ЕК "Зх нтіт ПОДА Жду ПДК ре іт м п | піні «у шо ОБ й ТЕТУ и: У т 1. : ЗШ мин и жеНоХ ще п 7 БА ще х ДІ БТ, С й Пт ЗОВ х5ВБЕ БОНУВ тусоюі пекло ості БАНІ Ов ііі ПАТО пера ЗАЧ МВА Іди ТЕ М Оке: п огиду ча 5 щі ГО Е РЕА зх ех Аж ЯВИ А ЕКЕд я І тел цк т, іще й 2. шт Ах СУК тики ПЕТ ви : БЛУА я БЕ; хара ЕХ тт БА ни ій з т же ДНК БЕ пока тме дих о Ух Із ІВ з вас о «и У ТІ поні й хІ що СТІ ТАКИХ ТЕ ОО НеНЕсКе ее і за : 219 т дет оц пи БВ. с «ВЖЕ ЗМУ п Є шшН Аме 7 я ; ж аж дж Бе їх гі пт га ІЗ:ДІ тах ЕшИжЕ СУ ління -- ср пот ВВЕ х сот ел ПЯСИА КОКАХЗ Ід ЖО павтт ве Я - і Й «Фе пт ОМ Е іх ви Ат Ух БУК реж ТТ МБіжв - ее ТЕМ ре ж Кт во Кк пеня с АК Тула Оки РЕ ттдАх І 307 й : ач хе Тем ал їх сте хі г Беж х й пк шля хх ре КО ВУ з Ко жк сф ЖК. з ді дл супе писок ок вік ЗНЗ УТ псодитом х НК ЖК Уч акцію Я хі в я х й х ЗУО я. ще зт г - УК же с Ве я, х Ж у УГе неси З АТ тт Вт що сКке Ера ВОМ ХЕЗАВ ЕК КК І перетнснтнтя переви лк я Зі ж Бе те М те - т. дойух Укл ІВ й КЕ ок п ге Н ст 155 ве пе ТЬтЕ й окшитттттт СА ІТК СЕІЖО Ко з І, ТМи2і, з ет ВОК ЕЕПЛЕ ОКУ УК Кри ткодткук : вв КУ КЕ МТ ко ЗЕ пече У х ке й ри ЯГН поши У Е МИ х ней и КХ и се Н Ко тех вал НЯ хугі кНяй но пк лим ЛЖ и КЕ АЖУх й и: 7 ІА УК пиття ТЕТ Кох - т. й Бен ад ик КЕ не 135 еОтх пд ТИ, веде ЗЕеЕ ну; пен АЖ ее РІ ие а і ті тре ЗХ ТОВ ГЕН ЕВ ІБ ооЕтЕ я ен свосст ет дк: ГМ222 і - де тоже ОК ЕК овес й пе ок й вк в ВАЛ й «96 Е 335 ШИ Б з ек к Ж ІТ З ше З ВЕ ЕВКЯх ва ян лах полки ваш ТЕМ, В Ба у; ТБТТХ АТ УК ОО щу ЕЕ и пек ТА В поля я те кв - «хх - ТЗ що и тля хм НС спіль хЕ тк ях щ п Е. те 4 Е. да? шт ї ККЗ БеМЕЕ ЕТЬТХ - пути КАЖЕ т сти и вчи ТТ М КК ОЗ НН в дЕТЕц Ж сХ «Кут о ві ТЕ Й г ТИ А пов же нев НО ех яму ДК я пет пу 206 і АТ ПІ ОЗ ТКА ж БЕ ЖИ поточ СЕ А е ек МК НЕ А Ме Мт АЛЕ ЕД . ГЕ кт, ЕЕ ОАЕ плснтя КУ х ІВ ТІ. за КУ АК МЯя ТУ. тн МА: ей КІ т ВВЕ три те ЗК ксеА: ВУ Не Іі кі я БІК шо 4 КАХ ог о те птн й ма тих Те 2 (Я ноя чої в «міш, Ко Ех ми хх пет осооот ТЕ як і сотку: 5 НИ рек 2 їж У : пІЖУ МУ 7 жен лк; Мч: Он В. б Її. й мери шт УКВ и г СО СА д-- ТК І оте 1 ЗЛЕ М ЖЕ ІНД РУТА АгВІЛ, кук їх штнжх ЗИ ТБ КЛ Ах мем ЕЕ усе УБІК нн ЕТО ОА: тат ДУ КО, АвІТВ як; ся КЕ ! го ше Др с с г ГК ве З т 235 ЕУа й ие КО пд пос В СН ще ну ще " а «ех ДЕ ПДВ в ам да ; ! я: КЕ У я ВЕ ЗК У КИ тет Бах Еш КЕ ше Фі дух сто шо, «ВАЖІ ІА шк ші Гей . Ж окис ДОМУ КІ Б В ЗК хо КК Е КІ ! Ах ув Я От ІТ КІУБА пе 20 яму АК Но Ів т КУЩ м КУ їК
    Ми 1 2 т 4 5 8 ізо ваоз3азатазохохаветяЗог заяві вкІвапт за ат ЗМБгяЗа ЕТТУТОЕВРАЗОВУАТСоВКУТТВСІТМТВІПЛОУІНИТОСКВОКРРЕЮЬТОЕОМТІВНОМВЕ ЛО Дожежетнтетя ШО нка між ве кн явка то па ту ч япк пщотутю тить я З Я р їй ігз4асетазпіззаветяови вва БЕТВОВі о Ур, зУугг4За ВЕБбОВСХОТОКУКТІЮМІ ЕВ АрУХСЬОВИММОГКВАБЕ КЕ спосвід пет нта піпетею жа Че іг345отазЗазгзанетвао1ух3азатаЗпрозавезвоВігхавзооавоі1галавнт во зУнгаая яУОБООВУАЕСУВРОАВУКОВСТАБАЕНІКОПІМЕКУКОВРЕОСЬКВІОВТ РАХ ОМТЕТАВЕВОВ снопів тен кб тенти Нед, дак сржзню сіє тесті інте те чт пеню нічні пін кін часть - 7 В і Ід 11 Бікаотівлазетнасітавсзаввівовіа5овІвазОвавіоа5678З019 уні КАТЕТАСЕЗЕМТАХ ОО ВІВЕПІДУХХСАІСрКуДМоуисостТочТи своїй плин НА шпик Філе. пив пн пон пс по п п нн пон зручний ї | і вечті нн? нема нич й ЦЕНА КК же оди пен я ково нен Кв ро: УНІ | міх Мого ОЇ послідовність ЗБОЮ постівюоїь ше Песлідввний о Н х й Н денти їх не чиї ра у шк ши ни и Пн В пиши зх сТМоІ6 | яТОВО 1 єн ЦІ но аб роуми ще: Двома Її В ІСОЕУАМАХ с 148 ЗМ | 5І2?7 1 япАі | їх 1715 трохмн | з роєм твнає їз СОРАМАУ їде пок пити нн: рони пили ПЕК Зоо КАБАН Де на Червня ШМК Монстер ЗИМ: 57 ЗВ ї5 5 ОУМН ре мон Я З СОКУАМАУ і 135 ЩЕ втимола І 5и2у5 | пн І 788. ї5 роумн За ДВОРАЮМУЄУАЄКРОЄ | 28 |С0ЕУАМАУ - 145 поет ер кт жк жту оу кет Кк фата ктттянях зими з я пектини - 5тимоЗа | пі | Зно Не зо пбоуМн 24 ІВІСРАЮМТЄТАЄККОЮ 0 28 |СОБАМАУ б плвижнтннк юки жтинажлня тк теж кт жаже фета ажттттеюня тир т ово спониво оно ин пннннн сопнннвоснй пеня них етимозі ЮК 5ТоУ3 | НО 16 два 0 оБуМН за вБАюТн 28 |бОЕАМАХ 1 ще пав ол по на М на ев ; : яТиМози | 5172 Р ЛЬНОЇ Її 135 за 0 0оуМн за "Тораюнтичяєиною ов |срютамАу | 6 ї | | лять ! невоЮ І сем | І-СВНІ | сов ; і ; тк МБО Ж ВЕС ф-т птн ніжністю о Ши ме "бо Мао ве Поспідпеність звю Послідовність зва Послідеаність | з ШЕ | плн» | но; о о: я і Ме плов.
    ТШоВО | ЯНюЮ 02 за5 0 птетоюрм І зб вомпях вазони 1 см? єтрмозі ціх | Банк лю зав овюрмтн зв Ом ине 40 пахомміт ий Й т 7 пи пиши меншин по копа потіння Мод В ня но писана зи ЗТИМ2Я8 І 5 0 ТОВ: І ще 45 ПТО роя омИиЖе 4 позови її да; 5тигав 1 5тпизу5 1 УЦНЮх 38. т 345 0 нтмтОЮрмів Зв ТЕОМТІХР 80 обом ин п тон ВИКО СОМИ пос ПІДЕ и нин них НЕД ВИН Нветни нки ВИНИ Зп: еп ян 3 45 0 Птмтрюви 36 ЕОМ го поБомМ ж вже кидку пелена ис ? пи: нення і енклн нн ниття ен ПИ Ки сн нос вони айви варни 5ТМ23Я 1 НІ Її УВІ 4. 136 дах 0 ОЮЮМ ЗБ БОМ ЯР | а |осоММіт о пн копи мне см ання інн нн них ння Пн нн нн сонні полин пили 5ПЛМІа І 5НАаРУХ З ПАМ 00035 00300450 АтОЮЮЬиН. вв зЕомтьке | о Ю|охоюмі Фіг 15.
    х я Кк 10000004 (43, | пт 4 1000005 і ще а 100005 й ЕЕ 10004 ЖЕ, ! Ф 1004 Є А
    5. 10. І: у до и о ом о о ФМ и и и о «ОКО КОКО я А ААУ ОО ЕОМ У «У ФА ж ше - пи г нові пи ТО питаю що бо- о ща Ра в ОЗ - шк Рв ЗІ їз 5 ше | ЕВ 2 між СМТО5518 ні -33 х БЕ оюіюд ЕХ Обом: СМТОЗ914 я Н.-33 ж 40. бно ро | С 0,06 мг/кг: СОМТОЗ914 є Ї.-33 ЕО Ж | 0.2. мг/кг СМТО3914 ж П.-33 5 304 ше о що Не 2мгйф СМТОЗ914 я Н.-З3 ог КУ чен 5 мі ше шк, вих о Бе ше Бе тиетонех щш 70 тет ней шен роя ни НН перу ее КМУ пи БЕН іо Бен КИМ, 21... Статистична значимість з використанням однофакторного АМОУА зередов; ере о ха б ереб 01 Фіг то
    1-8 ЗО Ве 2000 ЖЖ ЩЕ 1000 т ві ж : Ф о ' си ще иа де й я я я КЯ жи СА п и МК о У о І) (- Соми зх а а чи в т ом х ке ох ок Кк м ! ї Кт м КК М М ОО хе е вх хе Ух КК в Ф Фе Статистичну значимість пАб порівнювали з ізотипним контролем при тій самій конуєентрації фу Во
    МОР 6БОйОя Ка с А ! пе 4000 ку ї З 2000 щш З ! ще ях а жи ж І о сл Не І Ко ЕМ о Ф ХО и «у Ко с ий «їй що ж КУ Ка Ку й млн ан нн нн З НО МО ОДНИНИ А НИО Я ки ни ше НО НО «о що) « г ме) я ши І СО Око се Я ше че щи Фо дае а вже З ДКС У ве Ух Статистичну значимість тАб порівнювали з ізотипним контролем при тій самій концентрації фік 160 пня 09 ДИВ й в й М Ас жанни ит з- ме оо жит одн нини ї х ч хз ч З т ех х Во К ; а й хе З бо не в К. р ша. х е хх 9 40 са г ще ще В | с2539 204 є с2244 Шик як Ф А 62494 0 1 2 З 4 Год (Конкурент (НМ)) Фіг 17А ї Її Й Я зв -8 : | джин як Е 100 о дет й - же вже ю юю юютжжн ях Ех) ФВ» п о Ж акт Ж ех В, й тв ма Б ; і м Я « «У. Й св! | р. т че 8 504 ,я 53 ся Геї ! Ж
    З. з в по б2539 Фо т а Кг - І Мо одна ни а зтмг13 І пе о ї 2 З й Моз ІКонкурент (нм) фі 17 рин 1 зо КЕ го з 40 5 6 то во чо чав АКЕОКОВ У СЬЕМЕЛИЧВСРКООКРЕУ ТУСУЖУВатМКЕЇ РТОБАМНУК ВВ СОЦ КК ВАЛИАОВСІУ ТОТУВБРТЕНАТОУАМУТУККОВОСМУЄОМ. СОТ пусто ст . й й Ї ошношношнонооснкї . їв 1 396 ЕК ї40 156 18о 420 чо 180 200 МУВТУ ВО ВЕК СР ТО МИУТАР ЕКО ОАСОЗВВУНАНКВКОЯ. ОМУМТЕ ОАСТТОКЕІНМЕМСАНУВУТА ТНК ТУИВЕОСКАТЕРУЮАР СПОТИ СО пропо риоиии я пк ни 2 о 220 230 аа зво тей 219 2805 290 зов ЛЕЩЕЖЕУЄІ ОКМАМСТОВАСЕОКО ТОР СААУСУЮЬМОТКІ ТОЕСЕВВІ ООБЕСИМОВЕ МОЇ АССТМАЯ НАПУКЕЕВИ ОТО СІ А ВССНВНТУНЕ пня С ССО Ст реитурртнх 302 Зю ВАКМРЗКЕСЕ І МИ Сильшу захищений вититілом НЛО-обмім ТИМ Слабко захищений антитілом НЯЗ-абмін С Не захищений ФВ
    Антитіпо Різновид БТІ тЕВ206 (511М208) | УНВ25 пи ши о и з а М В, : ме тишина о Дикий тил тіявої | 12зе04 10801 яяБеЮв рало Ії в нини ин в п НН и и пзАКЕ о ТЕ 1.330507 2295-04 19.8. Взавню | зозБ0О4 0000232 рт ниття в ту тілу пай тт ль тт тс ль ф м тіл вл з чт че чт ччя ги с 3 с КоЕ 126507 1592-04 їб 10729307 В і25ЕеО8 | МВ ! я с - р нин спини пн опе нанинни спнс нин попки нон ств ЕК 1555307 1.262-04 ві 1565507 | роїво4 | 7.8 в ВИН Ина Коннов ЕНН ва ЗИ фо НИК нія Кн вибайр о ВоА 1025307 9275-05 | 9,6 о ВОБЕНЮЄ 936605 | 006 Ав 1242307 18306604 000 м 1о8Ез07 1235-04 114 рт по п а Ав віБЕа7 1.27Е-04 І 1 1135307 | 189504 | 12.4 певен пив денє пити НИМ пет тт зад я й УМА : І К) : | ан і я. ПДК пос айнн ііі М не сно Ніна Ниннн если 128Еє0 | 1195-04 10 г вяеЕєЄ | З47БО4 ІЗ Фі 19 Первинні тучні клітини легень людини ОМС 500 12504 ї 10004 | - дБ БОЮ | шини 2505 о щ ззіз:05 зЗ3338835 5 ЖЕ Ж ш Б ші Ь в Б Б Б Ж ЖОБ Ж б Ж ОБОЄ ЩО 008. 8. Я. 5. З. Б. Ж што у 7 Се Ді че Ж пи ие со от во з во дней ЩО 00 бнннннннююттюятннннннннй І са ще
    Т.М Мкмп) СМТОВОЗ (МКМ 5 «п-зз(знімл) З Н-33 (Знмл) Р гл --х о Фіг 20А.
    Первинні тучні клітини легень людини З000 25004 -. - а в 20004 ЩІ. й - 1500. ї- ЩЕ - І Ї 1000 її ЖЕ 500» - ЩЕ ЩЕ 'Е ваза 2338335 Об дош Ос а ч ФО жЖУ сш, 5ТІШМ2О8 (МК МЛІЮ /СМТОВ8937 (МКЇМЛ) «И-З3(Знумл) Ж 1-33 (Знумл) З б х о Фіг: 208 Первинні тучні клітини легань людини ї.-8 БО: 5004 1004 й ЩО І заз530еЕ 3239235 ш Б БВ Б 5 ЕЕ Б ЕЕ Б Б
    Я.О. я ж ожою Ж ще І М Ве ЕІ лани ще НН не с шоЄ - о іс бо
    5ТІ.М208 ( меми) щ СМТОВ937 (мюкімл) 2 ж -33 (З нг/мл) п -ЗЗ (Знімл) о (л ра в. Фіг 20с
    Первинні тучні клітини легень людини 1-13 7004 00» - 4004 ; т 800- | - а 290 . Шина 100- | ши
    . Й я . тк . - аз 4 я стіні 2833855 8323185 Б БЕ БЕ Б Б Б Б 555 т. 5. 5. 5. 5.5 5. 5. 5 5 БВ БЕ осотгстсово вОопгплозЗо о" во што ввосв в В | знонний ннновопнвйвоттювьвоьькитоввовосівввовюьний СУ ! ща І ге ЗТ М2О8 (мем) СМТО8937 (мкл) яИ-ЗЗ(Знимл) 2 0-33 (Знумл) 9 г ЕЕ до - о ФЕ 200
UAA201412805A 2012-04-30 2013-04-29 Виділене людське або адаптоване до людини антитіло, що специфічно зв'язується з доменом і людського st2l, і способи його застосування UA118336C2 (uk)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261640407P 2012-04-30 2012-04-30
US201261640238P 2012-04-30 2012-04-30
US13/798,204 US9090694B2 (en) 2012-04-30 2013-03-13 ST2L antibody antagonists
US13/798,226 US9212227B2 (en) 2012-04-30 2013-03-13 ST2L antibody antagonists for the treatment of ST2L-mediated inflammatory pulmonary conditions
PCT/US2013/038637 WO2013165894A2 (en) 2012-04-30 2013-04-29 St2l antagonists and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA118336C2 true UA118336C2 (uk) 2019-01-10

Family

ID=49477497

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201412805A UA118336C2 (uk) 2012-04-30 2013-04-29 Виділене людське або адаптоване до людини антитіло, що специфічно зв'язується з доменом і людського st2l, і способи його застосування

Country Status (37)

Country Link
US (4) US9090694B2 (uk)
EP (2) EP2844292B1 (uk)
JP (3) JP6283354B2 (uk)
KR (2) KR102147140B1 (uk)
CN (2) CN107098973A (uk)
AR (1) AR090909A1 (uk)
AU (2) AU2013256645B2 (uk)
BR (1) BR112014027165A2 (uk)
CA (1) CA2871948C (uk)
CL (1) CL2014002955A1 (uk)
CO (1) CO7240389A2 (uk)
CR (1) CR20140488A (uk)
CY (1) CY1122308T1 (uk)
DK (1) DK2844292T3 (uk)
EA (2) EA031047B1 (uk)
EC (1) ECSP14025178A (uk)
ES (1) ES2755094T3 (uk)
HK (1) HK1208182A1 (uk)
HR (1) HRP20191884T1 (uk)
HU (1) HUE045864T2 (uk)
IL (2) IL235401B (uk)
LT (1) LT2844292T (uk)
MX (2) MX358134B (uk)
MY (1) MY166062A (uk)
NI (1) NI201400125A (uk)
NZ (3) NZ702136A (uk)
PE (1) PE20150641A1 (uk)
PH (2) PH12014502435A1 (uk)
PL (1) PL2844292T3 (uk)
PT (1) PT2844292T (uk)
RS (1) RS59511B1 (uk)
SG (2) SG11201407028WA (uk)
SI (1) SI2844292T1 (uk)
TW (3) TWI687440B (uk)
UA (1) UA118336C2 (uk)
UY (1) UY34774A (uk)
WO (1) WO2013165894A2 (uk)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10053513B2 (en) * 2009-11-30 2018-08-21 Janssen Biotech, Inc. Antibody Fc mutants with ablated effector functions
DK2506871T3 (da) * 2009-11-30 2017-01-02 Janssen Biotech Inc ANTISTOF-Fc-MUTANTER MED ABLATEREDE EFFEKTORFUNKTIONER
US9090694B2 (en) * 2012-04-30 2015-07-28 Janssen Biotech, Inc. ST2L antibody antagonists
AR091069A1 (es) 2012-05-18 2014-12-30 Amgen Inc Proteinas de union a antigeno dirigidas contra el receptor st2
JO3532B1 (ar) 2013-03-13 2020-07-05 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد انترلوكين-33 واستعمالاتها
JP6404314B2 (ja) 2013-03-15 2018-10-10 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｉｌ−３３拮抗薬とその使用法
SG10201805934RA (en) 2014-01-10 2018-08-30 Anaptysbio Inc Antibodies directed against interleukin-33 (il-33)
WO2015164354A1 (en) 2014-04-21 2015-10-29 The Childen's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for treating cytokine-related disorders
EP3157634B1 (en) * 2014-06-23 2018-12-12 Bionomics, Inc. Antibodies that bind lgr4
US10093730B2 (en) 2014-11-10 2018-10-09 Genentech, Inc. Anti-interleukin-33 antibodies and uses thereof
JP7231326B2 (ja) 2014-11-10 2023-03-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｉｌ－３３媒介性障害のための治療及び診断方法
AU2016226415B2 (en) * 2015-03-02 2021-09-09 180 Therapeutics Lp Method of treating a localized fibrotic disorder using a TNF receptor 2 antagonist
JP7114460B2 (ja) * 2015-06-26 2022-08-08 サノフィ・バイオテクノロジー モノクローナル抗ＩＬ－１ＲＡｃＰ抗体
SG11201805900YA (en) * 2016-01-14 2018-08-30 Anaptysbio Inc Inhibition of allergic reaction using an il-33 inhibitor
US20190202907A1 (en) * 2016-09-02 2019-07-04 180 Therapeutics Lp Method of treating systemic fibrotic disorders using an il-33/tnf bispecific antibody
US20190225682A1 (en) * 2016-09-02 2019-07-25 180 Therapeutics Lp Method of treating localized fibrotic disorders using an il-33/tnf bispecific antibody
JOP20190093A1 (ar) 2016-10-28 2019-04-25 Lilly Co Eli أجسام مضادة لـ il-33 واستخداماتها
TW202332696A (zh) 2016-12-01 2023-08-16 美商再生元醫藥公司 治療發炎症狀的方法
CN110494453B (zh) 2017-02-10 2023-05-26 豪夫迈·罗氏有限公司 抗类胰蛋白酶抗体、其组合物及其用途
SG11201909457XA (en) 2017-04-13 2019-11-28 Regeneron Pharma Treatment and inhibition of inflammatory lung diseases in patients having risk alleles in the genes encoding il33 and il1rl1
EP3401332A1 (en) 2017-05-08 2018-11-14 MAB Discovery GmbH Anti-il-1r3 antibodies for use in inflammatory conditions
MA51741A (fr) 2018-02-09 2021-05-19 Hoffmann La Roche Procédés thérapeutiques et de diagnostic pour des maladies inflammatoires médiées par des mastocytes
IL307286A (en) 2018-04-11 2023-11-01 Regeneron Pharma Methods and preparations for quantification of IL-33
CN113286814A (zh) * 2018-10-31 2021-08-20 德里尼亚公司 多价调节性t细胞调节子
KR102353568B1 (ko) * 2018-11-14 2022-01-20 주식회사 헬릭스미스 안정성이 향상된 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편
CN110045131B (zh) * 2019-06-14 2019-09-03 迈威(上海)生物科技有限公司 用于测定人il-33/st2通路抑制剂的生物学活性的方法
CA3158323A1 (en) 2019-11-04 2021-05-14 Medimmune Limited Methods of using il-33 antagonists
WO2021089559A1 (en) 2019-11-04 2021-05-14 Medimmune Limited Anti il-33 therapeutic agent fpr treating renal disorders
MX2022011156A (es) 2020-03-13 2022-10-13 Genentech Inc Anticuerpos anti-interleucina-33 y usos de estos.
US20230110203A1 (en) 2020-03-13 2023-04-13 Medimmune Limited Therapeutic methods for the treatment of subjects with risk alelles in il33
WO2021204707A1 (en) 2020-04-06 2021-10-14 Medimmune Limited Treating acute respiratory distress syndrome with il-33 axis binding antagonists
MX2022014243A (es) 2020-05-12 2022-12-02 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co Ltd Proteina de union al antigeno st2.
CN113501878B (zh) * 2021-02-03 2022-12-02 北京智仁美博生物科技有限公司 针对人tslp的多种抗体及其用途
AR125753A1 (es) 2021-05-04 2023-08-09 Agenus Inc Anticuerpos anti-tigit, anticuerpos anti-cd96 y métodos de uso de estos
WO2023086807A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Genentech, Inc. Anti-interleukin-33 antibodies and uses thereof
WO2023160610A1 (en) * 2022-02-24 2023-08-31 Sinomab Bioscience Limited Bispecific binding proteins against alarmins and uses thereof

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
DE3785186T2 (de) 1986-09-02 1993-07-15 Enzon Lab Inc Bindungsmolekuele mit einzelpolypeptidkette.
US5869620A (en) 1986-09-02 1999-02-09 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
CA2050918A1 (en) 1990-01-12 1991-07-13 Raju Kucherlapati Generation of xenogeneic antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6800738B1 (en) 1991-06-14 2004-10-05 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
EP0672142B1 (en) 1992-12-04 2001-02-28 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
AU690171B2 (en) 1993-12-03 1998-04-23 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
AUPO591797A0 (en) 1997-03-27 1997-04-24 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation High avidity polyvalent and polyspecific reagents
BR9606706A (pt) 1995-10-16 1999-04-06 Unilever Nv Análogo de fragmento de anticorpo biespecífico ou bivalente uso processo para produzir o mesmo
DE69738806D1 (de) 1996-10-10 2008-08-14 Invitrogen Corp Tierzellkulturmedium mit pflanzlichen nährstoffen
GB9727172D0 (en) 1997-12-24 1998-02-25 Univ Glasgow Reagents specific for st2l and uses therefor
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
GB9911569D0 (en) 1999-05-18 1999-07-21 Oxford Biomedica Ltd Antibodies
US6323334B1 (en) * 1999-09-24 2001-11-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules encoding a 103 gene product and uses therefor
WO2001070817A1 (fr) 2000-03-21 2001-09-27 Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. Anticorps monoclonal et methode et kit d'immunodosage de st2 humaine soluble l'utilisant
JP3523245B1 (ja) 2000-11-30 2004-04-26 メダレックス，インコーポレーテッド ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物
EP2357187A1 (en) * 2000-12-12 2011-08-17 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
US6649055B1 (en) 2002-05-07 2003-11-18 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy Pump station for radioactive waste water
JP4794301B2 (ja) 2003-06-11 2011-10-19 中外製薬株式会社 抗体の製造方法
EP1718602A4 (en) * 2004-01-30 2007-12-12 Peplin Biolipids Pty Ltd THERAPEUTIC AND CARRIER MOLECULES
NZ549040A (en) 2004-02-17 2009-07-31 Schering Corp Use for interleukin-33 (IL33) and the IL-33 receptor complex
CA2587627A1 (en) 2004-11-15 2006-05-26 Eli Lilly And Company Desacyl ghrelin antibodies and therapeutic uses thereof
WO2006106905A1 (ja) 2005-03-31 2006-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 会合制御によるポリペプチド製造方法
PL1999154T3 (pl) 2006-03-24 2013-03-29 Merck Patent Gmbh Skonstruowane metodami inżynierii heterodimeryczne domeny białkowe
WO2007147901A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
US7560530B1 (en) 2006-07-20 2009-07-14 Schering Corporation IL-33 receptor
AU2007285855B2 (en) 2006-08-18 2013-03-07 Novartis Ag PRLR-specific antibody and uses thereof
AU2008234248C1 (en) 2007-03-29 2015-01-22 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
EP2069784A4 (en) * 2007-05-18 2009-11-18 Medimmune Llc IL-33 IN INFLAMMATORY DISEASE
US8748356B2 (en) 2007-10-19 2014-06-10 Janssen Biotech, Inc. Methods for use in human-adapting monoclonal antibodies
WO2009085462A1 (en) 2007-12-19 2009-07-09 Centocor, Inc. Design and generation of human de novo pix phage display libraries via fusion to pix or pvii, vectors, antibodies and methods
DE102007061963A1 (de) 2007-12-21 2009-06-25 Merck Patent Gmbh Pyridazinonderivate
CA2709847C (en) 2008-01-07 2018-07-10 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
KR20110014607A (ko) 2008-04-29 2011-02-11 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
CA2744235A1 (en) 2009-01-06 2010-07-15 Dyax Corp. Treatment of mucositis with kallikrein inhibitors
US8817596B2 (en) 2009-01-09 2014-08-26 Futurewei Technologies, Inc. Protecting ingress and egress of a label switched path
US7879978B2 (en) * 2009-03-31 2011-02-01 Centocor Ortho Biotech, Inc. Macaca fascicularis ST2L
JP2012525149A (ja) 2009-04-27 2012-10-22 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ヘテロ多量体分子を作製するための方法
GB201005063D0 (en) 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products
DK2506871T3 (da) * 2009-11-30 2017-01-02 Janssen Biotech Inc ANTISTOF-Fc-MUTANTER MED ABLATEREDE EFFEKTORFUNKTIONER
US20110206672A1 (en) 2010-02-25 2011-08-25 Melvyn Little Antigen-Binding Molecule And Uses Thereof
JP5887337B2 (ja) 2010-03-30 2016-03-16 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド ヒト化ｉｌ−２５抗体
CA2795200C (en) 2010-04-09 2020-01-14 Critical Care Diagnostics, Inc. Soluble human st-2 antibodies and assays
MX353144B (es) 2010-04-20 2017-12-20 Genmab As Proteinas que contienen fc de anticuerpos heterodimericos y metodos para produccion de las mismas.
WO2011143545A1 (en) 2010-05-14 2011-11-17 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
EP2420253A1 (en) 2010-08-20 2012-02-22 Leadartis, S.L. Engineering multifunctional and multivalent molecules with collagen XV trimerization domain
JP6126991B2 (ja) 2010-09-27 2017-05-10 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド ヒトｉｉ型コラーゲンに結合する抗体
PL2635607T3 (pl) 2010-11-05 2020-05-18 Zymeworks Inc. Projekt stabilnego przeciwciała heterodimerowego z mutacjami w domenie FC
US8785153B2 (en) 2011-02-23 2014-07-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Antibodies against human IL33R and uses thereof
US9090694B2 (en) * 2012-04-30 2015-07-28 Janssen Biotech, Inc. ST2L antibody antagonists
AR091069A1 (es) 2012-05-18 2014-12-30 Amgen Inc Proteinas de union a antigeno dirigidas contra el receptor st2

Also Published As

Publication number Publication date
IL254569B (en) 2020-10-29
IL254569A0 (en) 2017-11-30
PH12014502435A1 (en) 2015-01-12
US20170066831A1 (en) 2017-03-09
EP2844292A2 (en) 2015-03-11
EP2844292B1 (en) 2019-08-21
JP2015516817A (ja) 2015-06-18
SG11201407028WA (en) 2015-01-29
JP2019162136A (ja) 2019-09-26
AU2017202610B9 (en) 2019-06-20
KR102147140B1 (ko) 2020-08-25
ECSP14025178A (es) 2015-08-31
EA031047B1 (ru) 2018-11-30
CL2014002955A1 (es) 2015-01-16
TW201345923A (zh) 2013-11-16
CN107098973A (zh) 2017-08-29
AU2017202610B2 (en) 2019-06-13
TWI589588B (zh) 2017-07-01
JP6622274B2 (ja) 2019-12-18
LT2844292T (lt) 2019-11-25
HRP20191884T1 (hr) 2020-02-07
TWI700299B (zh) 2020-08-01
CR20140488A (es) 2015-01-12
HUE045864T2 (hu) 2020-01-28
IL235401A0 (en) 2014-12-31
MX358134B (es) 2018-08-06
PH12018501839A1 (en) 2020-09-14
MX2018009430A (es) 2020-09-02
US9212227B2 (en) 2015-12-15
TW201730216A (zh) 2017-09-01
TW202019969A (zh) 2020-06-01
AR090909A1 (es) 2014-12-17
CA2871948A1 (en) 2013-11-07
EP3597219A1 (en) 2020-01-22
SG10201608525SA (en) 2016-12-29
EA201891264A2 (ru) 2018-11-30
US9090694B2 (en) 2015-07-28
US20130336980A1 (en) 2013-12-19
SI2844292T1 (sl) 2020-02-28
US20190062439A1 (en) 2019-02-28
MY166062A (en) 2018-05-22
WO2013165894A2 (en) 2013-11-07
ES2755094T3 (es) 2020-04-21
JP2018064560A (ja) 2018-04-26
DK2844292T3 (da) 2019-10-21
MX2014013200A (es) 2014-12-08
CA2871948C (en) 2020-09-08
CN104411333B (zh) 2017-04-26
AU2013256645A1 (en) 2014-11-13
PL2844292T3 (pl) 2020-03-31
RS59511B1 (sr) 2019-12-31
IL235401B (en) 2020-10-29
TWI687440B (zh) 2020-03-11
US9951137B2 (en) 2018-04-24
EP2844292A4 (en) 2016-05-25
US20130287777A1 (en) 2013-10-31
NI201400125A (es) 2016-11-30
NZ729913A (en) 2018-07-27
AU2017202610A1 (en) 2017-05-11
WO2013165894A3 (en) 2014-03-27
US10450377B2 (en) 2019-10-22
UY34774A (es) 2013-11-29
HK1208182A1 (en) 2016-02-26
CY1122308T1 (el) 2021-01-27
EA201491996A1 (ru) 2015-04-30
CN104411333A (zh) 2015-03-11
CO7240389A2 (es) 2015-04-17
PT2844292T (pt) 2019-11-26
EA201891264A3 (ru) 2019-02-28
PE20150641A1 (es) 2015-05-11
KR20150008152A (ko) 2015-01-21
AU2013256645B2 (en) 2017-06-08
NZ702136A (en) 2017-03-31
KR20200037886A (ko) 2020-04-09
JP6283354B2 (ja) 2018-02-21
NZ740221A (en) 2019-11-29
BR112014027165A2 (pt) 2017-07-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA118336C2 (uk) Виділене людське або адаптоване до людини антитіло, що специфічно зв'язується з доменом і людського st2l, і способи його застосування
JP5856480B2 (ja) 汎用性抗体フレームワークを用いたイエウサギ抗体のヒト化
JP2022036949A (ja) Ｐｄ－１及びｔｉｍ－３に特異的に結合する抗体及びそれらの使用
CN110914304B (zh) Cd96抗体、其抗原结合片段及医药用途
UA115316C2 (uk) Зв'язувальна молекула, яка зв'язується з cd134 людини, та фармацевтична композиція, що її містить
UA127200C2 (uk) Молекула антитіла до pd1
WO2021027674A1 (zh) 一种含有抗体的肿瘤治疗剂的开发和应用
ES2961791T3 (es) Anticuerpos que neutralizan el virus de la hepatitis B y usos de los mismos
UA112050C2 (uk) Терапевтична композиція, що містить моноклональне антитіло проти інгібітора шляху тканинного фактора (tfpi)
CN112500485B (zh) 一种抗b7-h3抗体及其应用
US20200223924A1 (en) Dosage regimens for anti-tim-3 antibodies and uses thereof
US20230120270A1 (en) New polypeptide complex
CN112513087B (zh) 抗cd38抗体、其抗原结合片段及医药用途
CN112969716A (zh) 抗pd-1抗体、其抗原结合片段及医药用途
UA112282C2 (uk) Антагоніст толл-подібного рецептора 3
CN110790839A (zh) 抗pd-1抗体、其抗原结合片段及医药用途
CN116096863A (zh) 免疫疗法组合物
WO2022199590A1 (zh) 一种靶向bcma的纳米抗体及其应用
WO2021132638A1 (ja) Ｉｌ－３６ｒシグナル特異的阻害抗体
TWI789679B (zh) 抗人程序性死亡配體-1（pd-l1）的抗體及其用途
EP4269437A1 (en) Pd-1 binding molecule and application thereof
JP6568557B2 (ja) 汎用性抗体フレームワークを用いたイエウサギ抗体のヒト化
WO2023104138A1 (zh) Bcma抗体及其应用
WO2024017336A1 (en) Anti-siglec15 antibodies and uses thereof
CN114106174A (zh) 低毒性抗ox40抗体、其药物组合物及应用