TW201345923A - Ｓｔ２ｌ拮抗劑及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於ST2L拮抗劑、編碼該拮抗劑或其片段之多核苷酸，及製造及使用前述之物的方法。

Description

ST2L拮抗劑及使用方法
本發明係關於ST2L拮抗劑、編碼該拮抗劑或其片段之多核苷酸，及製造及使用前述之物的方法。
ST2L(IL-1RL1或IL-33Rα)係Toll/IL-1受體家族之成員，表現在多種免疫細胞之細胞表面上，包括T細胞、NK/NKT細胞、嗜鹼性細胞、嗜酸性細胞、肥大細胞及新發現的非B/非T第二型先天性淋巴細胞、諾細胞(nuocytes)及自然輔助細胞。亦可在樹突細胞(DCs)、巨噬細胞及嗜中性白血球上誘發ST2L表現。ST2L能夠調降類鐸受體(Toll-like Receptors)TLR2、TLR4及TLR9之反應性，但亦能經由被其配體IL-33活化及與輔助蛋白IL-1RAcP結合而誘發第二型細胞介素之釋放。IL-33已被稱為「警報器(alarmin)」，因為恆定狀態期間其以全長形式存在於表皮細胞及內皮細胞之細胞核中，但在細胞壞死過程中即可被切開及釋放。
ST2L訊息傳遞需要輔助蛋白IL-1RAcP之結合以形成ST2L/IL-33複合物。輔助蛋白IL-1RAcP係與IL-1α/β訊息傳遞複合物共用。ST2L、IL-33及IL-1RAcP交互作用以及IL-1R1及IL-1RAcP之間交 互作用的模型已經提出(Lingel et al.,Cell 17：1398-1410,2009；Wang et al.,Nat Immunol 11：905-11,2010)。近來發現，ST2L/IL-33/IL-1RAcP與c-Kit(幹細胞因子(SCF)的受體)在肥大細胞上形成訊息傳遞複合物。IL-33以SCF依賴方式在初級肥大細胞中誘發細胞介素產生(Drube et al.,Blood 115：3899-906,2010)。
ST2L之活化造成過度的第二型細胞介素反應(尤其是IL-5及IL-13)、肥大細胞及嗜酸性細胞活化，及呼吸道過度反應，且亦已發現可經由誘發來自NKT細胞之IFNγ及來自肥大細胞的IL-1β及IL-6放大Th1及Th17反應。ST2L/IL-33訊息傳遞路徑失調已證明與多種免疫調介疾病有關，包括氣喘、風濕性關節炎、發炎性腸道疾病、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、鼻瘜肉及全身性硬化症(回顧於Palmer and Gabay,Nat Rev Rheumatol 7：321-9,2011 and Lloyd,Curr Opin Immunol 22：800-6,2010；Shimizu et al.,Hum Molec Gen 14：2919-27,2005，Kamekura et al.,Clin Exp Allergy 42：218-28,2012；Manetti et al.,Ann Rheum Dis 69：598-605,2010)。
因此，需要適合用於治療ST2L調介疾病及失調的ST2L拮抗劑。
本發明提供一種單離的人類或人類適應性抗體拮抗劑或其片段，其特異性結合人類ST2L之域I(SEQ ID NO：9)。
本發明亦提供特異性結合具有下列之人類ST2L的人類適應性抗體拮抗劑：特定輕鏈及重鏈可變區序列，或特定重鏈及輕鏈互補決定序列。
本發明亦提供特異性結合人類ST2L之限定抗原決定區及/或具有本文所述之特定特徵的人類或人類適應性抗體拮抗劑。
本發明亦提供一種單離的多核苷酸，其編碼本發明之重鏈可變區(VH)或輕鏈可變區(VL)。
本發明亦提供一種載體，其包含本發明之多核苷酸。
本發明亦提供一種宿主細胞，其包含本發明之載體。
本發明亦提供一種製造本發明之抗體的方法，其包含培養本發明之宿主細胞及從該細胞取得抗體。
本發明亦提供一種醫藥組合物，其包含本發明之單離抗體及醫藥上可接受之載劑。
本發明亦提供一種治療或預防ST2L調介症狀的方法，其包含在足夠治療或預防該ST2L調介症狀的時間長度中，將治療有效量之本發明之單離抗體施予有需要的病患
本發明亦提供一種抑制病患體內肥大細胞反應的方法，其包含在足夠抑制該肥大細胞反應的時間長度中，將治療有效量之本發明單離抗體施予有需要的病患。
本發明亦提供一種在個體中抑制IL-33及ST2L之交互作用的方法，其包含施予該個體足夠抑制IL-33及ST2L之交互作用量的、特異性結合ST2L之域I的抗體。
圖1顯示與同型控制組CNTO5516比較，在經鼻施予IL-33而誘發的肺部發炎模型中，藉由ST2L域I結合單株抗體CNTO3914抑制氣道 過度反應。隨著甲基膽鹼(MCH)施予劑量(mg/ml)逐漸提升，可測量到呼吸道阻力的峰值。CNTO3914/IL-33與CNTO5516/IL-33對照，**p<0.05；CNTO3914/IL-33與IL-33處理之PBS組對照，***p<0.001。
圖2顯示與同型控制組CNTO5516比較，在經鼻施予IL-33而誘發的肺部發炎模型中，藉由ST2L域I結合單株抗體CNTO3914抑制支氣管肺泡灌洗(Bronchoalveolar Lavage(BAL))細胞聚集。***p<0.001。
圖3顯示在經鼻施予IL-33而誘發的肺部發炎模型中，藉由ST2L域I結合單株抗體CNTO3914在無細胞的BAL液中劑量依賴性抑制小鼠肥大細胞蛋白酶1(MMCP-1)之釋放。與IL-33處理之CNTO5516(同型控制組)對照，**p<0.01，***p<0.001。
圖4顯示在體外藉由ST2L域I結合單株抗體CNTO3914，抑制小鼠骨髓衍生肥大細胞釋放IL-33誘發的GM-CSF(圖4A)、IL-5(圖4B)及TNFα(圖4C)。在括號中，所使用的CNTO3914濃度顯示為μg/ml，且IL-33濃度顯示為ng/ml。
圖5顯示在指定IL-33及C2494濃度，藉由ST2L域I結合單株抗體C2494(STLM62)，抑制IL-33所誘發的人類臍帶血衍生肥大細胞之前列腺素D2(PGD2)釋放MOX-PDG2：甲氧胺-PGD2。
圖6顯示在存有1ng/ml IL-33之StemPro-34培養基及100ng/ml SCF(幹細胞因子)中，藉由指定濃度(μg/ml)之ST2L域I結合單株抗體C2244及C2494，抑制人類臍帶血衍生肥大細胞(hCBMCs)之GM-CSF(圖6A)、IL-8(圖6B)、IL-5(圖6C)、IL-13(圖6D)及IL-10(圖6E)釋放。
圖7顯示在存有1ng/ml IL-33之StemPro-34培養基及100ng/ml SCF (幹細胞因子)中，指定濃度(μg/ml)之結合ST2L域III之單株抗體C2519或C2521，對人類臍帶血衍生肥大細胞之GM-CSF(圖7A)、IL-8(圖7B)、IL-5(圖7C)、IL-13(圖7D)及IL-10(圖7E)釋放的影響。
圖8顯示對下列之釋放的影響：A)GM-CSF；B)IL-8；C)IL-5；D)IL-13及E)IL-10；條件為在存有3ng/ml IL-33之RPMI/10%FCS培養基及100ng/ml SCF中，以ST2L域I結合單株抗體C2494及結合ST2L域III之單株抗體ST2M48(M48)、ST2M49(M49)、ST2M50(M50)及ST2M51(M51)對人類臍帶血衍生肥大細胞(hCBMCs)進行試驗。
圖9顯示結合ST2L之域I(D1)或域III(D3)的抗ST2L抗體，在各受測抗體依指示使用50μg/ml或2μg/ml時，抑制人類臍帶血衍生肥大細胞受IL-33及SCF誘發釋放GM-CSF、IL-5、IL-8、IL-10及IL-13之平均百分比(%)。負值代表活化%。
圖10顯示抗ST2L抗體之重鏈可變區(VH)及重鏈CDR序列，其係從噬菌體呈現技術基因庫得到，且後續經親和力成熟之競爭挑選。
圖11顯示抗ST2L抗體之輕鏈可變區(VL)及輕鏈CDR序列，其係從噬菌體呈現技術基因庫得到，且後續經親和力成熟之競爭挑選。
圖12顯示抗ST2L抗體STLM208 VH ST2H257 HCDR3變異體之VH及VL區，及重鏈CDRs之序列。
圖13顯示抗ST2L抗體之A)VH及B)VL序列，其係從噬菌體呈現技術基因庫得到，且後續經親和力成熟之競爭挑選。
圖14顯示將C2494 VH及VL抗原結合位轉換成人類框架之概略圖(受轉換部份標記為HFA(human framework adaptation))。Kahat CDRs以底線標示而Chothia HVs則在受轉換HFA區的上方以虛線代表。VH及VL殘基之編號係依照Chothia為之。VH中以灰色強調的殘基，在某些HFA變異體中未被轉換。C2494 VH：SEQ ID NO：48；C2494 VH：SEQ ID NO：52。
圖15顯示衍生自C2494之人類框架適應性(HFA)抗體的CDR序列。
圖16A)抗ST2L抗體CNTO3914之血清值；B)支氣管肺泡灌洗(BAL)細胞聚集之抑制；C)受IL-33刺激之全血細胞分泌IL-6之抑制；D)在經鼻施予IL-33而誘發肺部發炎6小時模型中，給藥後24小時藉由CNTO3914抑制以IL-33刺激之全血細胞的MCP1分泌。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；NQ=在偵測限度以下；@=一個資料點在偵測限度以下。
圖17、多種抗ST2L抗體間的競爭。A)30nM經標記的C2244 Fab與指定抗體競爭結合至塗覆在微孔槽的ST2L-ECD。C2244會與C2494競爭，但不與C2539競爭。B)10nM經標記的C2494與指定抗體競爭結合至塗覆在微孔槽的ST2L-ECD。C2494會與STLM208及STLM213競爭，但不與C2539競爭。
圖18顯示與C2244 Fab複合之人類ST2-ECD(SEQ ID NO：119)的簡化H/D交換圖。被抗體保護的區域以不同的灰階表示。包含第18-31個殘基(虛線方框內)(對應由SEQ ID NO：1組成之全長ST2L的第35-48個殘基)的部分係由Fab保護。包含第71-100個殘基(實線方框內)(對應SEQ ID NO：1之第88-117個殘基)的部分經重度醣化，且未被胜肽覆蓋。
圖19顯示ST2L域I結合抗體對圖中所示之ST2L變異體的動力性質及親和力常數。
圖20顯示抗ST2L抗體STLM208對初代人類肺部肥大細胞分泌下列所為之抑制作用：A)GM-CSF；B)IL-5；C)IL-8；D)IL-13。
所有在本說明中引用、包括但不限於專利及專利申請文件之發表文獻在此全部併入作為參照。
如本文所述的術語應理解為僅係用於描述特定實施例，而非用於限制本發明。除非另有定義，否則本文使用之所有技術及科學術語，均與具有本發明有關技藝之通常知識者所一般了解之意義相同。
雖然任何相似或相同於本文描述之方法及材料，可用於實施本發明之測試，然而本文所描述者僅為例示性材料及方法。在本發明之描述及申請專利範圍中，將使用下列術語。
如本文所述的術語「拮抗劑」意指一種分子，其藉由任何機制部分或完全抑制ST2L的生物活性。例示性拮抗劑係抗體、融合蛋白質、胜肽、擬肽類(peptidomimetics)、核酸、寡核苷酸及小分子。拮抗劑可利用下述檢測ST2L生物活性的分析法辨別。ST2L拮抗劑可抑制測量到的ST2L生物活性至20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
術語「ST2L」或「huST2L」或「人類ST2L」代表具有GenBank登錄號NP_057316中顯示之胺基酸序列的人類ST2L多肽。SEQ ID NO：1顯示全長人類ST2L之胺基酸序列。如本文所述的「ST2L細胞外域」、「ST2L-ECD」或「huST2L-ECD」意指具有SEQ ID NO：1之第19-328個胺基酸的多肽。huST2L-ECD具有三個似Ig C2型域，序列範圍係SEQ ID NO：1之第19-122個殘基(域I，SEQ ID NO：9)、第123-202 個殘基(域II，SEQ ID NO：10)及第209-324個殘基(域III，SEQ ID NO：11)。「域I」或「ST2L域I」或「huST2L域I」或「D1」代表人類ST2L上的第一個似免疫球蛋白域，其具有SEQ ID NO：9所顯示之序列。「域III」或「ST2L域III」代表人類ST2L上的第三個似免疫球蛋白域，其具有SEQ ID NO：11所顯示之序列。
如本文所述的術語「IL-33」包括全長IL-33(GenBank登錄號NP_254274 SEQ ID NO：3)、及其變異體與活性型。IL-33變異體包括具有GenBank登錄號NP_001186569及GenBank登錄號NP_001186570中所顯示之胺基酸序列的蛋白質。IL-33活性型包括「成熟IL-33」，其具有SEQ ID NO：3之第112-270個殘基。額外的活性型包括IL-33片段，其具有SEQ ID NO：3之第11-270個殘基、第115-270個殘基、第95-270個殘基、第99-270個殘基或第109-270個殘基(LeFrancais et al.,Proc Natl Acad Sci(USA)109：1673-8,2012)或任何單離自內源性表現IL-33之型式或型式之組合。「IL-33活性型」係由SEQ ID NO：3組成之IL-33的片段或變異體，其可誘發ST2L生物活性。
如本文所述的術語「抗體」含義廣泛且包括：免疫球蛋白分子，包括多株抗體；單株抗體，包括鼠、人類、人類適應性、擬人化及嵌合單株抗體；抗體片段；由至少二完整抗體或抗體片段所形成的雙特異性抗體或多特異性抗體；雙體、四體或多體抗體；及單鏈抗體。
依照重鏈恆定區的胺基酸序列，免疫球蛋白主要可劃分為五個種類，即IgA、IgD、IgE、IgG與IgM。IgA及IgG進一步次分類為IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3及IgG4亞型。任何脊椎動物的抗體輕鏈皆可依據彼等之恆定區的胺基酸序列劃分到兩個清楚區分的類型之一，即κ(kappa)與λ(lambda)。
術語「抗體片段」代表免疫球蛋白分子的一部分，其保留重鏈及/或輕鏈抗原結合位，例如：重鏈互補決定區(HCDR)1、2及3，輕鏈互補決定區(LCDR)1、2及3，重鏈可變區(VH)或輕鏈可變區(VL)。抗體片段包括習知的Fab、F(ab')2、Fd及Fv片段以及由一VH域組成之域抗體(dAb)。VH及VL域可經由合成連接子彼此連接以形成各種單鏈抗體設計，其中當VH及VL域係以不同的單鏈抗體建構物表現得到的情況下，VH/VL域可在分子內或分子間配對，以形成一單價抗原結合位，例如單鏈Fv(scFv)或雙功能抗體(diabody)；例如在國際專利公開號WO98/44001、國際專利公開號WO88/01649；國際專利公開號WO94/13804；國際專利公開號WO92/01047中之描述。
抗體可變區係由一被三「抗原結合位」中斷之「框架」區所組成。抗原結合位由多個術語定義：(i)互補決定區(Complementarity Determining Regions(CDRs))，VH中有三個(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，且VL中有三個(LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其係基於序列變異性(Wu and Kabat,J Exp Med 132：211-50,1970；Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。(ii)「高度可變區」、「HVR」或「HV」，VH中有三個(H1、H2、H3)且VL中有三個(L1、L2、L3)，參見如Chothia及Lesk定義之結構中，抗體可變域之高度變異區(Chothia and Lesk,Mol Biol 196：901-17,1987)。其他術語包括「IMGT-CDRs」(Lefranc et al.,Dev Comparat Immunol 27：55-77,2003)及「特異性決定殘基用途」(Specificity Determining Residue Usage(SDRU))(Almagro,Mol Recognit 17：132-43,2004)。國際免疫基因學(International ImMunoGeneTics，IMGT)資料庫(http：//www_imgt_org)提供標準化編號及抗原結合位之界定。 CDRs、HVs及IMGT輪廓之間的相似性在Lefranc等人的著作中(Dev Comparat Immunol 27：55-77,2003)中已有描述。
如本文所述的「Chothia殘基」係指依據Al-Lazikani編號之抗體VL及VH殘基(Al-Lazikani et al.,J Mol Biol 273：927-48,1997)。
「框架」或「框架序列」係指可變區中除了抗原結合位以外的剩餘序列。因為抗原結合位可由上述多種術語定義之，故框架的確切胺基酸序列應視抗原結合位的定義方式而定。
「人類抗體」或「完全人類抗體」代表包含衍生自人類免疫球蛋白序列之可變區序列及恆定區序列的抗體。本發明之人類抗體可包括取代，因此彼等可能不會與表現出來的人類免疫球蛋白或胚源基因序列完全等同。然而，「人類抗體」的定義並不包括抗原結合位係衍生自非人類物種的抗體。
「人類適應性」抗體或「人類框架適應性(HFA)」抗體代表依據美國專利公開案第US2009/0118127號中所描述之方法適應化的抗體，且亦代表將衍生自非人類物種之抗原結合位序列移植到人類框架之抗體。
「擬人化抗體」代表抗原結合位係衍生自非人類物種且可變區框架係衍生自人類免疫球蛋白序列之抗體。擬人化抗體的框架區可包括取代，因此該框架可能不會與表現出來的人類免疫球蛋白或胚源基因序列完全等同。
如本文所述的術語「實質相同」意指所比較的兩個抗體可變區胺基酸序列係相同的或具有「非實質差異」。非實質差異係在抗體或抗體可變區序列中未對抗體性質造成負面影響的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個胺基酸之取代。實質相同於本文所揭露之可變區序列的 胺基酸序列，係包含在本申請案的範圍中。在某些具體實施例中，序列同一性可為約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。同一性百分比可例如藉由使用Vector NTI v.9.0.0(Invitrogen,Carslbad,CA)之AlignX模組的內定值配對排列而測定。本發明之蛋白質序列可作為檢索公開資料庫或專利資料庫的查詢序列，以(例如)找出關聯序列。用於執行彼等檢索的例示性程式係使用內定值的XBLAST或BLASTP程式(http_//www_ncbi_nlm/nih_gov)或GenomeQuest(GenomeQuest,Westborough,MA)組。
如本文所述的術語「抗原決定位」意指抗體特異性結合抗原的部分。抗原決定位通常由例如胺基酸或多醣側鏈之部分的化學活性(例如極性、非極性或疏水性)表面群集所組成，且可具有特殊的三維結構特徵，以及特殊的電荷特徵。抗原決定位可由形成構型上空間單元的連續及/或不連續胺基酸序列所組成。以不相鄰的抗原決定位而言，抗原線性序列不同部分的胺基酸，經由蛋白質分子的折疊，聚集到三度間中的鄰近處。例示性抗原決定位係huST2L之域I，顯示於SEQ ID NO：9。
如本文所述的術語「互補位(paratope)」意指抗體特異性結合抗原的部分。互補位本質上可為線性的或可為不連續的，由抗體之不相鄰胺基酸之間的空間關係所形成，而非線性串聯的胺基酸。「輕鏈互補位」及「重鏈互補位」或「輕鏈互補位胺基酸殘基」及「重鏈互補位胺基酸殘基」，分別代表與抗原接觸之抗體輕鏈及重鏈殘基。
如本文所述的術語「特異性結合」代表與其他抗原或蛋白質相較，抗體以較大的親和力結合至預定的抗原。一般而言，抗體以1×10-7M或更低之解離常數(KD)結合至預定的抗原，例如1×10-8M或更低、1×10-9M或更低、1×10-10M或更低、1×10-11M或更低、或1×10-12M或更 低，通常該KD至少係該抗體結合至非特異性抗原(例如：BSA、酪蛋白或任何其他特定的多肽)之KD的至少十倍。該解離常數可利用標準程序測量。然而，特異性結合至預定抗原的抗體可能對其他相關的抗原具有交叉反應性，例如對於來自其他物種(同源)的相同預定抗原，例如人類或猴子，例如馬來猴(Macaca fascicularis(食蟹獼猴(cynomolgus)))。
如本文所述的「雙特異性」代表結合至二個不同抗原或結合至一抗原之中二個不同抗原決定位的抗體。
如本文所述的「單特異性」代表結合至一抗原或一抗原決定位的抗體。
如本文所述的術語「結合使用(in combination with)」意指所描述的藥劑可一起在混合物中給予、同時以單獨藥劑給予或以任何次序依序以單獨藥劑給予動物。
如本文所述的「發炎症狀」代表對於有害刺激的急性或慢性局部或全身性反應，例如：病原體、受損細胞、身體傷害或刺激物，其係部分由細胞介素之活性、趨化激素或發炎細胞(例如嗜中性白血球、單核細胞、淋巴細胞、巨噬細胞)調介，在多數情況下特徵為痛、紅、腫及組織功能損傷。
如本文所述的術語「ST2L調介發炎症狀」代表至少部分因為不適當的ST2L訊息傳遞路徑活化而造成的發炎症狀。例示性ST2L調介發炎症狀係氣喘及過敏。
如本文所述的術語「ST2L調介症狀」包含所有直接或間接與ST2L相關聯的疾病及醫療症狀，包括該疾病或症狀之引發、發展、進程、持久性或病理學。
如本文所述的術語「ST2L生物活性」代表任何由於ST2L配體IL-33結合至ST2L而發生的活性。例示性ST2L生物活性造成NF-κB之活化以回應IL-33。NF-κB活化可在以IL-33誘發ST2L時利用報導基因試驗檢測之(Fursov et al.,Hybridoma 30：153-62,2011)。其他例示性ST2L生物活性造成Th2細胞之增生或促發炎反應細胞介素及趨化激素之分泌，例如IL-5、GM-CSF、IL-8、IL-10或IL-13。釋放自細胞、組織或循環系統中的細胞介素及趨化激素可利用習知的免疫試驗測量，例如ELISA免疫試驗。
術語「載體」意指可在生物系統中複製或可在生物系統之間移動的多核苷酸。載體多核苷酸一般包含例如複製起始點、多腺苷酸訊息或選擇標記之元件，其功能為促進彼等多核苷酸在生物系統中之重製或維持。生物系統之實例可包括細胞、病毒、動物、植物及利用生物組件重組、能夠重製載體的重組生物系統。該多核苷酸包含可為DNA或RNA分子之載體或彼等之混合體。
術語「表現載體」意指可在生物系統或重組生物系統中用來引導多肽之轉譯的載體，該多肽係由存在於該表現載體中之多核苷酸序列所編碼。
術語「多核苷酸」意指包含由糖-磷酸骨架或其他當量共價化學所鏈接之核苷酸鏈的分子。雙股及單股的DNAs及RNAs係多核苷酸之一般實例。
術語「多肽」或「蛋白質」意指包含至少二個由肽鍵所鏈接而形成多肽之胺基酸殘基的分子。少於50個胺基酸之小型多肽可由「胜肽」表示。
如本文所述的習知一字母及三字母胺基酸碼如下：
物質之組成
本發明提供特異性結合ST2L並抑制ST2L生物活性之抗體，及該抗體之用途。本發明做出驚人的發現：結合至人類ST2L之域I(SEQ ID NO：9)的抗體阻斷IL-33/ST2L交互作用並抑制一定範圍的ST2L生物活性，包括IL-33所引發的肥大細胞反應，然而結合人類ST2L之域III(SEQ ID NO：11)的抗體並不會阻斷IL-33/ST2L交互作用，雖然彼等對於一定範圍的ST2L生物活性具有抑制性。然而域III結合抗體對於某些刺激IL-33所引發的肥大細胞作用具有較低的抑制性或不具抑制性。
在本文所描述的某些具體實施例中，阻斷IL-33/ST2L交互作用並抑制包括IL-33所引發的肥大細胞反應之一定範圍ST2L生物活性的抗體，結合人類ST2L域I之中的抗原決定位(RCPRQGKPSYTVDW；SEQ ID NO：210)，及視情況結合ST2L胺基酸殘基T93及F94(殘基編號依據SEQ ID NO：1)。
術語「肥大細胞反應」或「肥大細胞活性」代表IL-33所引發的細胞介素釋放，例如GM-CSF、IL-8、IL-5、IL-13及IL-10，及過敏介質，例如前列腺素D2，彼等係由肥大細胞釋放。
本發明提供新穎的抗原結合位，其結合如本文所述之人類ST2L的域I。用於攜載抗原結合位的結構通常係抗體VH或VL。
本文中所描述的本發明之抗體，可為單離人類或人類適應性抗體拮抗劑或其片段，其特異性結合人類ST2L之域I(SEQ ID NO：9)。例示性結合人類ST2L域I(SEQ ID NO：9)之抗體係抗體STLM15(C2244)，包含分別為SEQ ID NOs：23、27及31之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別為SEQ ID NOs：35、39及43之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列，或抗體C2494(STLM62)，包含分別為SEQ ID NOs：24、28及32之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別為SEQ ID NOs：36、40及44之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列(表3)。額外的例示性結合人類ST2L之域I的抗體係表16及圖13中所顯示的抗體，例如：抗體STLM103、STLM107、STLM108、STLM123、STLM124、STLM208、STLM209、STLM210、STLM211、STLM212及STLM213。例示性人類抗體拮抗劑顯示於圖12及圖13中。例示性人類適應性拮抗劑顯示於表14中。
在本文所描述的某些具體實施例中，特異性結合人類ST2L域I(SEQ ID NO：9)之單離人類或人類適應性抗體拮抗劑或其片段阻斷IL-33/ST2L交互作用。
抗體可藉由標準ELISA測試彼等阻斷IL-33/ST2L交互作用之能力。例如：在培養盤塗覆人類ST2L之細胞外域(huST2L-ECD)並與抗體進行培養，其後測量生物素標記IL-33結合至該培養盤之情況。「阻斷IL-33/ST2L交互作用」或「抑制IL-33/ST2L交互作用」之抗體係在使用塗覆huST2L-ECD之培養盤的ELISA試驗中，減低衍生自結合到培養盤之生物素標記IL-33之訊息的抗體，與缺少抗體時IL-33之結合相較，50μg/ml抗體濃度減低訊息至少達30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
可藉由利用標準方法及下文所例示之方法，分析抗體對於例如由人類臍帶血衍生肥大細胞或初代人類肺部肥大細胞釋放GM-CSF、IL-5、IL-10或IL-13之抑制活性，而測試彼等對肥大細胞之抑制作用。本文中所描述之「抑制肥大細胞反應」或「抑制肥大細胞活性」之抗體，係在抗體濃度為10μg/ml，與未經抗體處理之肥大細胞相較時，減低1-3ng/ml由IL-33引發之GM-CSF、IL-5、IL-13或IL-10分泌，達至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之抗體。一般的肥大細胞可藉由習知方法及如下文之例示而衍生自人類臍帶血或肺實質及小呼吸道CD34+先驅細胞。肥大細胞培養條件可影響抗體之抑制作用%的測量，因此培養及測試條件在6-10週長的分化過程中，可利用例如StemPro-34培養基維持標準。在細胞介素釋放試驗的4天前，每天以10ng/ml IL-4、10ng/ml IL-6及100ng/ml SCF刺激肥大細胞。以細胞介素釋放試驗而言，肥大細胞可 再懸浮於新鮮的StemPro-34培養基中，或含有10%無抗生素之FCS及100ng/ml SCF的RPMI中。適合進行試驗的細胞接種密度為65,000至75,000個細胞/0.16 mls/孔槽。如本文所描述之本發明抑制肥大細胞反應之抗體，係抗體STLM15、STLM62及STLM208。抗體CNTO3914結合小鼠ST2L域I，而無對於人類ST2L之交叉反應性，並在小鼠細胞中抑制肥大細胞反應。
所屬技術領域中具有通常技藝者將領會，肥大細胞反應亦包括IL-1及IL-32之釋放，及例如CCL1、CCL4、CCL5、CCL18及CCL23之趨化激素，以及例如半胱胺醯基白三烯素、組織胺之過敏調介物，以及多種肥大細胞蛋白酶，包括中性蛋白酶、凝乳酶、羧肽酶及組織蛋白酶G。本文中所描述之本發明之抗體，可利用標準方法測試其抑制彼等額外肥大細胞反應之能力。本文中所描述之結合ST2L之域I及阻斷IL-33/ST2L交互作用的本發明之抗體，當在彼等條件下、以10μg/ml之最小濃度測試時，可預期抑制至少40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高之彼等額外肥大細胞反應。
本文中所描述之本發明之抗體以下列常數結合人類ST2L：約5×10-12M至約7×10-10M之間的解離常數(KD)，對人類ST2L在約2×106M-1s-1至約1×108M-1s-1之間的結合速率常數(Kon)，或對人類ST2L在約1×10-6s-1至約1×10-2s-1之間的脫附速率常數(Koff)結合人類ST2L。例如，本文中所描述之本發明之抗體以下列KD結合人類ST2L：少於約7×10-10M、少於約1×10-10M、少於約5×10-11M、少於約1×10-11M或少於約5×10-12M。
本文中所描述之本發明之抗體可與馬來猴(Macaca fascicularis(cyno))ST2L(SEQ ID NO：2)交叉反應，並以下列常數結 合至馬來猴ST2L：在約3×10-12M至約2×10-9M之間的解離常數(KD)，對馬來猴ST2L在約4×106M-1s-1至約1×108M-1s-1之間的結合速率常數(Kon)，或對馬來猴ST2L在約7×10-5s-1至約1×10-1s-1之間的脫附速率常數(Koff)。例如，本文中所描述之本發明之抗體以下列KD結合馬來猴ST2L：少於約2×10-9M、少於約1×10-9M、少於約1×10-10M、少於約1×10-11M或少於約3×10-12M。
抗體對ST2L之親和力可利用任何適合之方式實驗測定。該方法可利用所屬技術領域中具有通常知識者所習知的ProteOn XPR36、Biacore 3000或KinExA測量儀器、ELISA或競爭性結合試驗。特定抗體/ST2L交互作用在不同條件下(例如滲透壓、pH)所測得之親和力可能不同。因此，親和力及其他結合參數(例如：KD、Kon、Koff)之測量較佳為以標準化條件及標準化緩衝液(例如本文中所描述之緩衝液)進行。所屬技術領域中具有通常知識者將領會，利用例如Biacore 3000或ProteOn進行親和力測量的內部誤差(測量為標準偏差，SD)，在偵測的一般限制中，該誤差一般可在5-33%之內。因此術語「約」反映試驗中的一般標準偏差。例如，1×10-9M之KD的一般SD係高達±0.33×10-9M。
具所欲親和力及視情況與馬來猴ST2L交互反應之人類ST2L結合抗體，可從變異體或片段之基因庫藉由以人類及/或馬來猴ST2L淘選，並視情況藉由進一步抗體親和力成熟技術篩選出來。抗體可利用任何合適的方法，依據彼等對ST2L生物活性之抑制作用辨別。該方法可利用報導基因試驗進行，或使用習知方法及如本申請文件所描述之方法測量細胞介素製造之試驗進行。
本發明之一具體實施例係一種特異性結合人類ST2L之單離抗體拮抗劑，其包含： 一重鏈互補決定區(HCDR)1(HCDR1)，其序列為SEQ ID NO：160(X1X2X3MX4)；其中X1係S、F、D、I、G或V；X2係Y或D；X3係A、D或S；以及X4係S、F或I；一HCDR 2(HCDR2)，其序列為SEQ ID NO：161(X5IX6GX7GGX8TX9YADSVKG)；其中X5係A、S、T、Y或D；X6係S、R、E、K、G或A；X7係S、E或N；X8係S、R、E、G、T、D或A；以及X9係Y、D、N、A或S；以及一HCDR 3(HCDR3)，其序列為SEQ ID NO：162(X10X11WSTEGSFFVLDY)；其中X10係D、A、R、N、Q、P、E、I、H、S、T或Y；以及X11係P、A、H、Y、E、Q、L、S、N、T、V或I。
本發明之另一具體實施例係一種特異性結合人類ST2L之單離抗體拮抗劑，其包含：一輕鏈互補決定區(LCDR)1(LCDR1)，其序列為SEQ ID NO：163(RASQSVDDX12LA)；其中X12係A或D； 一LCDR 2(LCDR2)，其序列為SEQ ID NO：90(DASNRAT)；以及一LCDR 3(LCDR3)，其序列為SEQ ID NO：164(QQX13X14X15X16X17X18T)；其中X13係F或Y；X14係Y、I或N；X15係N、G、D或T；X16係W或A；X17係P或不存在；以及X18係L或I。
本發明之抗體包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，序列分別為SEQ ID NOs：160、161、162、163、90及164，可藉由習知突變方法利用例如HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，序列分別為SEQ ID NOs：78、81、84、87、90及92，作為模板而製造。序列分別為SEQ ID NOs：160、161、162、163、90及164之重鏈CDRs及輕鏈CDRs，可嫁接到人類框架，例如下文中所描述的框架。該抗體可利用本文中所描述之方法進行下列分析：對ST2L之結合力，及彼等阻斷IL-33/ST2L交互作用之能力，及其他特徵，例如對人類ST2L及/或馬來猴ST2L之親和力，及對肥大細胞反應之抑制作用。
在一具體實施例中，如本文所描述之特異性結合人類ST2L之單離抗體拮抗劑包含：HCDR1，其序列為SEQ ID NOs：78或95-108；HCDR2，其序列為SEQ ID NOs：81、109-118或120-129；HCDR3，其序列為SEQ ID NOs：84或165-185； LCDR1，其序列為SEQ ID NOs：87或130；LCDR2，其序列為SEQ ID NO：90；以及LCDR3，其序列為SEQ ID NOs：92或131-134。
在另一具體實施例中，特異性結合人類ST2L之單離抗體拮抗劑包含圖10、圖11及圖12所示及如本文中所描述之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一具體實施例中，如本文所描述之特異性結合人類ST2L之單離抗體拮抗劑包含：HCDR1，其序列為SEQ ID NOs：23或24；HCDR2，其序列為SEQ ID NOs：27或28；HCDR3，其序列為SEQ ID NOs：31或32；LCDR1，其序列為SEQ ID NOs：35或36；LCDR2，其序列為SEQ ID NOs：39或40；以及LCDR3，其序列為SEQ ID NOs：43或44。
在另一具體實施例中，如本文所描述之特異性結合人類ST2L之單離抗體拮抗劑包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3序列：分別為SEQ ID NOs：23、27、31、35、39及43；分別為SEQ ID NOs：24、28、32、36、40及44；(HFA CDRs)；分別為SEQ ID NOs：24、28、146、36、40及147；或分別為SEQ ID NOs：24、28、146、36、40及44。
本發明之另一具體實施例係一種如本文所描述之、特異性結合人類ST2L的單離人類或人類適應性抗體拮抗劑或其片段，(SEQ ID NO：1)其包含重鏈可變區(VH)，包含衍生自人類IGHV3-23(SEQ ID NO： 158)、IGHV1-24*01(SEQ ID NO：148)或IGHV1-f*01(SEQ ID NO：149)框架序列之VH框架，及輕鏈可變區(VL)，包含衍生自人類IGKV3-11(L6)(SEQ ID NO：159)、IGKV3-15*01(L2)(SEQ ID NO：150)、IGKV1-9*01(L8)(SEQ ID NO：151)、IGKV1-5*01(L12)(SEQ ID NO：152)、IGKV1-12*01(L5)(SEQ ID NO：153)、IGKV1-39*01(O12)(SEQ ID NO：154)、IGKV1-27*01(A20)(SEQ ID NO：155)或IGKV1-33*01(O18)(SEQ ID NO：156)框架序列之VL框架。
在另一具體實施例中，本文所描述之特異性結合人類ST2L域I的單離抗體包含VH，其包含衍生自人類VH3-23框架序列(SEQ ID NO：158)之VH框架；及輕鏈可變區(VL)，其包含衍生自人類VκL6框架序列(SEQ ID NO：159)之VL框架。人類框架序列係為習知，且一般包括連接到連接(joining(J))序列的人類免疫球蛋白胚源可變區序列。顯示在SEQ ID NO：158中的人類VH3-23框架胺基酸序列包括連接到IGHJ4的人類胚源VH3-23序列，及顯示在SEQ ID NO：159中的人類Vk L6框架胺基酸序列包括連接到IGKJ1的人類Vκ L6胚源序列，如Shi等人在J Mol Biol第397卷：第385-96頁，2010年；國際專利公開號WO2009/085462；及美國專利公開號US2010/0021477中之描述。具有衍生自人類VH3-23之VH序列及衍生自人類Vκ L6之VL序列的例示性抗體係彼等顯示於圖12及圖13者。
包含「衍生自」特定框架或胚源序列之重鏈可變區或或輕鏈可變區的人類或人類適應性抗體，代表從使用人類胚源免疫球蛋白基因之系統得到的抗體，例如：從轉殖基因小鼠或從嗜菌體呈現技術基因庫，如下文中所討論者。「衍生自」特定框架或胚源序列之抗體，與其所衍生 之序列相較，由於(例如)自然發生的體細胞突變或有意的取代，可能含有胺基酸差異。
在另一具體實施例中，如本文所描述之特異性結合人類ST2L之域I(SEQ ID NO：9)的單離人類或人類適應性抗體拮抗劑或其片段，與下列單離抗體競爭結合至人類ST2L(SEQ ID NO：1)：包含序列為SEQ ID NO：47之重鏈可變區(VH)及序列為SEQ ID NO：51之輕鏈可變區(VL)的單離抗體(抗體C2244)。
在另一具體實施例中，如本文所描述之本發明之單離抗體結合序列為SEQ ID NO：1之人類ST2L的第35-48個胺基酸殘基(RCPRQGKPSYTVDW；SEQ ID NO：210)。如本文所描述之抗體可進一步結合序列為SEQ ID NO：1之人類ST2L的殘基T93及F94。
如本文所描述之本發明之抗體，包含某些HCDR1、HCDR2及HCDR3及LCDR1、LCDR2及LCDR3胺基酸序列，或包含某些VH及VL序列，彼等抗體之間特異性結合至人類ST2L之競爭作用，可利用習知之方法在體外分析。例如：MSD Sulfo-TagTMNHS酯標記抗體在未標記抗體存在下對人類ST2L之結合可藉由ELISA分析之，或可利用Biacore分析法或流動式細胞測量術呈現與本發明之抗體的競爭作用。測試抗體抑制C2244結合至人類ST2L之能力證明該測試抗體可與彼等抗體競爭結合至人類ST2L。此等例示性抗體係顯示於表3及圖13中的C2494、STLM208及STLM213。
如本文所描述之與C2244競爭結合至ST2L之域I的抗體，阻斷IL-33/ST2L交互作用並抑制多種ST2L生物活性，包括IL-33引發之肥大細胞反應。ST2L域I上亦存有非中和性的(意即非抑制性)抗 原決定位，作為第二抗體競爭團(由結合ST2L之域I的抗體C2240呈現，不與C2244競爭，且不抑制ST2L訊息傳遞)。
本文所述之本發明之結合特定ST2L域或抗原決定位的抗體，可藉由以編碼該抗原決定位之多肽免疫接種表現人類免疫球蛋白基因座之小鼠(Lonberg et al.,Nature 368：856-9,1994；Fishwild et al.,Nature Biotechnology 14：845-51,1996；Mendez et al.,Nature Genetics 15：146-56,1997，美國專利號5,770,429、7,041,870及5,939,598)或Balb/c小鼠而製造，例如具有人類ST2L之域I之胺基酸序列的多肽：KFSKQSWGLENEALIVRCPRQGKPSYTVDWYYSQTNKSIPTQERNRVFASGQLLKFLPAAVADSGIYTCIVRSPTFNRTGYANVTIYKKQSDCNVPDYLMYSTV(SEQ ID NO：9)，或具有胺基酸序列為RCPRQGKPSYTVDW(SEQ ID NO：210)之多肽，並使用Kohler等人在Nature，第256期(1975年)：頁495-97中所述之融合瘤細胞方法。所得到的抗體利用標準方法測試彼等結合至該抗原決定位之能力。例如：當二個別元件之結構係已知，可進行模擬蛋白質-蛋白質對接以辨別交互作用的相容位。可用抗原及抗體複合物進行氫-氘(H/D)交換，以定位該抗原上可被該抗體結合的區域。該抗原之段突變及點突變可用以定位對於抗體結合重要的胺基酸。所識別的單株抗體可進一步藉由，例如彼等揭露於Queen等人(Proc Natl Acad Sci(USA)86：10029-32,1989)及Hodgson等人(Bio/Technology 9：421,1991)之著作中的技術，結合經改變的框架支撐殘基而修飾以保留結合親和力。
本文所述之本發明之抗體可為人類抗體或人類適應性抗體。本文所述之本發明之抗體可為IgA、IgD、IgE、IgG或IgM型。
抗原結合位胺基酸序列實質等同彼等顯示在圖10、圖11、圖12、圖13、圖15、表3、表9及表12中之抗體，係包含於本發明之範圍中。一般而言，此牽涉一或多個以具有相似電荷或疏水性或立體化學特徵的胺基酸進行之胺基酸取代，且係為了改善抗體特性，例如安定性或親和力。例如，保守性取代(conservative substitution)可能牽涉以外來殘基取代原生胺基酸殘基，使得對該位置之胺基酸殘基的極性或電荷產生些微影響或無影響。再者，任何多肽中的原生殘基皆可被丙胺酸取代，如已見於關於丙胺酸掃描突變法之先前描述(MacLennan et al.,Acta Physiol Scand Suppl 643：55-67,1998；Sasaki et al.,Adv Biophys 35：1-24,1998)。所欲之胺基酸取代(不論是保守性或非保守性)可由所屬技術領域中具有通常知識者在需要該取代之時決定。例如，可利用胺基酸取代識別對抗體之功能具重要性的殘基，例如影響親和力之殘基，或與如聚集之非所欲之特性有關的殘基。例示性胺基酸取代顯示於圖12及圖13中。
相對於抗原結合位，只要對抗體之特性不會產生不良之影響，亦可在框架區內進行取代。可在例如Vernier Zone殘基(美國專利第6,649,055號)進行框架取代以改善抗體親和力或安定性。亦可在抗體中序列異於同源人類胚源基因序列之框架位置進行取代，以減低可能的免疫原性。彼等修飾可對例如衍生自從新抗體基因庫(de novo antibody libraries，例如pIX基因庫)之抗體為之。
保守性胺基酸取代亦包括外來發生的胺基酸殘基，其一般係藉由化學胜肽合成法而非藉由生物系統中的合成法併入。胺基酸取代可藉由例如PCR突變法(美國專利第4,683,195號)為之。可利用習知方法產生變異體基因庫，例如利用隨機(NNK)或非隨機密碼子(例如DVK 密碼子，其編碼11胺基酸(ACDEGKNRSYW))，並以所欲之特性篩選該基因庫或變異體。
雖然實例中所示的具體實施例，包含一者來自重鏈及一者來自輕鏈的可變區之配對、全長抗體鏈之配對或CDR1、CDR2及CDR3區之配對，但所屬技術領域中具有通常知識者將認可替代性具體實施例，可包含單一重鏈可變區或單一輕鏈可變區、單一全長抗體鏈或來自一抗體鏈之重鏈或輕鏈任一者的CDR1、CDR2及CDR3區。可利用該單一可變區、全長抗體鏈或一鏈之CDR1、CDR2及CDR3區篩選另一鏈中的相對應域，該二鏈能夠形成一特異性結合ST2L之抗體。該篩選可利用例如揭露於PCT專利公開案第WO1992/01047號中的階層雙重組合法(hierarchical dual combinatorial approach)，藉由嗜菌體呈現篩選方法實現。在此方法中，含有H或L鏈菌株的個別菌落被用來感染編碼該其他鏈(L或H)之菌株的完全基因庫(complete library)，並依據所述之嗜菌體呈現技術篩選得到的二鏈特異性抗原結合域。
本發明提供如本文所述之本發明抗體的單離VH及VL域，及包含特定VH及VL域之抗體。本文所述之某些本發明抗體的VH及VL可變區係顯示於圖13及表12中。
本發明之一具體實施例係一種單離人類或人類適應性抗體拮抗劑或其片段，其特異性結合人類ST2L之域I(SEQ ID NO：9)，包含VH，其至少90%相同於序列為SEQ ID NO：191之VH。
本發明之另一具體實施例係一種單離人類或人類適應性抗體拮抗劑或其片段，其特異性結合人類ST2L之域I(SEQ ID NO：9)，包含VL，其至少94%相同於序列為SEQ ID NO：209之VL。
在本文所述之某些具體實施例中，本發明提供一種抗體，包含序列為SEQ ID NOs：143、144、145、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204或205之VH。
在本文所述之某些具體實施例中，本發明提供一種抗體，包含序列為SEQ ID NOs：135、136、137、138、139、140、141、142、206、207、208或209之VL。
在本文所述之某些具體實施例中，本發明提供一種抗體，包含序列為SEQ ID NOs：186、187、197、198、199、200、201、202、203、204或205之VH及序列為SEQ ID NO：206之VL；序列為SEQ ID NOs：195或196之VH及序列為SEQ ID NO：207之VL；序列為SEQ ID NOs：188、189或190之VH及序列為SEQ ID NO：208之VL；或序列為SEQ ID NOs：187、191、192、193或194之VH及序列為SEQ ID NO：209之VL。
本發明之另一具體實施例係一種單離人類或人類適應性抗體拮抗劑或其片段，其特異性結合人類ST2L之域I(SEQ ID NO：9)，包含：HCDR1，其序列為SEQ ID NO：97；HCDR2，其序列為SEQ ID NO：114；HCDR3，其序列為SEQ ID NO：84；LCDR1，其序列為SEQ ID NO：130； LCDR2，其序列為SEQ ID NO：90；LCDR3，其序列為SEQ ID NO：134；或VH，其序列為SEQ ID NO：191及VL，其序列為SEQ ID NO：209。
缺少任何非人類序列之人類單株抗體可從嗜菌體呈現基因庫藉由例如Knappik等人(J Mol Biol 296：57-86,2000)及Krebs等人(J Immunol Meth 254：67-84 2001)之著作中引用之技術製備及優化。在一例示性方法中，本發明之抗體係單離自表現抗體重鏈可變區及輕鏈可變區為具有噬菌體pIX外套蛋白質的融合蛋白質之基因庫。在該抗體基因庫篩選結合至人類ST2L-ECD者，並進一步測定所得之陽性株的特徵，從該株溶解物單離Fabs，並表現為全長IgGs。例示性抗體基因庫及篩選方法描述在Shi等人之著作(J Mol Biol 397：385-96,2010)；國際專利公開號WO2009/085462及美國專利申請號第12/546850號；美國專利第5,223,409號、第5,969,108號及第5,885,793號。
由此產生的單株抗體可進一步在彼等之框架區進行修飾，以改變某些框架殘基成為存在相符之人類胚源序列者。
可藉由所屬技術領域中具有通常知識者所習知之技術修飾Fc而增強或壓制本發明之抗體的免疫效應物性質。例如，Fc效應物功能，例如C1q結合、補體依賴型細胞毒殺作用(CDC)、抗體依賴型細胞調介細胞毒殺作用(ADCC)、吞噬作用、調降細胞表面受體(例如：B細胞受體；BCR)等等，可藉由修飾Fc中負責彼等活性之殘基而提供及/或控制之。藥物動力學性質亦可藉由突變Fc域中延長抗體半衰期的殘基加強之(Strohl Curr Opin Biotechnol 20：685-91,2009)。例示性Fc修飾係IgG4 S228P/L234A/L235A、IgG2 M252Y/S254T/T256E(Dall’Acqua et al., J Biol Chem 281：23514-24,2006)；或IgG2 V234A/G237A/P238S、V234A/G237A/H268Q、H268A/V309L/A330S/P331或IgG2上之V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S(國際專利申請號WO2011/066501)(依據EU編號系統編號)。
因此，本文所述之本發明之抗體可藉由下列程序進行轉譯後修飾，例如：醣化作用、異構化作用、去醣化作用或非自然發生的共價修飾作用，例如：增加聚乙二醇部分(聚乙二醇化作用)及脂化作用。該修飾作用可發生於體內或體外。例如：本文所述之本發明之抗體可共軛連結到聚乙二醇(聚乙二醇化作用)以改善彼等之藥物動力學剖繪數據。共軛作用可藉由所屬技術領域中具有通常知識者所習知的方法進行。治療性抗體與PEG之共軛作用已經證明可增強藥物動力學特性而不干擾其功能(Knigh et al.,Platelets 15：409-18,2004；Leong et al.,Cytokine 16：106-19,2001；Yang et al.,Protein Eng 16：761-70,2003)。
經修飾之本文所述之本發明之抗體或其片段，以增進安定性、選擇性、交互反應性、親和力、免疫原性或其他所需之生物性質或生物物理性質者，係在本發明之範圍內。抗體之安定性受多種因素影響，包括(1)影響彼等之固有安定性之各域的核心堆積方式，(2)影響HC及LC配對之蛋白質/蛋白質界面交互作用，(3)極性及帶電殘基之埋藏，(4)極性及帶電殘基之H鍵網絡；及(5)表面電荷及在其他分子內及分子間力中的極性殘基分布(Worn et al.,J Mol Biol 305：989-1010,2001)。可根據抗體的晶體結構或在某些案例中藉由分子建模識別潛在的結構減穩殘基，且該殘基對於抗體安定性之影響，可藉由製造及評估在該識別殘基容有突變的變異體而測試之。增加抗體安定性的方法之一，係提升藉由微差掃描熱量法(DSC)測量的熱轉換中點溫度(Tm)。一般而言，蛋 白質Tm與其安定性成正相關，且與其在溶液中展開(unfolding)及變性，及取決於蛋白質展開傾向之降解作用的容易度呈負相關(Remmele et al.,Biopharm 13：36-46,2000)。數個研究發現藉由DSC測量為熱安定性之製劑物理安定性排序，與藉由其他方法所測量之物理安定性之間具有關聯性(Gupta et al.,AAPS PharmSci 5E8,2003；Zhang et al.,J Pharm Sci 93：3076-89,2004；Maa et al.,Int J Pharm 140：155-68,1996；Bedu-Addo et al.,Pharm Res 21：1353-61,2004；Remmele et al.,Pharm Res 15：200-8,1997)。製劑研究指出Fab Tm與相對應製劑之長期物理安定性有關。在框架或CDRs中的胺基酸差異，可對Fab域之熱安定性具有重大影響(Yasui Et al.,FEBS Lett 353：143-6,1994)。
本文所述之特異性結合人類ST2L域I的本發明之抗體，可加工成雙特異性抗體，其亦包括在本發明之範圍中。本發明之抗體的VL及/或VH區，可利用已公開之方法加工成結構如TandAb® designs(國際專利公開號WO1999/57150；美國專利公開號US2011/0206672)的單鏈雙特異性抗體，或加工成結構如彼等揭露於美國專利第US5869620號；國際專利公開號WO1995/15388A，國際專利公開號WO1997/14719或國際專利公開號WO2011/036460的雙特異性scFVs。
如本文所述之本發明之抗體的VL及/或VH區，可加工成雙特異性全長抗體，其中各抗體臂(antibody arm)結合不同的抗原或抗原決定區。一般係藉由調整二抗體重鏈之間的CH3交互作用製造該雙特異性抗體，以利用如彼等描述於美國專利第US7695936號；國際專利公開號WO04/111233；美國專利公開號US2010/0015133；美國專利公開號US2007/0287170；國際專利公開號WO2008/119353；美國專利公開號US2009/0182127；美國專利公開號US2010/0286374；美國專利公開號 US2011/0123532；國際專利公開號WO2011/131746；國際專利公開號WO2011/143545；或美國專利公開號US2012/0149876中之技術形成雙特異性抗體。本發明之抗體的VL及/或VH區可結合額外的雙特異性結構，例如雙可變域免疫球蛋白(Dual Variable Domain Immunoglobulins)(國際專利公開號WO2009/134776)，或包括多種二聚合域之結構以連接具有不同特異性之二抗體臂，例如白胺酸鏈區或膠原蛋白二聚合域(國際專利公開號WO2012/022811、美國專利第US5932448號；美國專利第US6833441號)。
本發明之另一態樣係單離多核苷酸，其編碼本發明之任何抗體重鏈可變區或抗體輕鏈可變區或其片段，或彼等之互補。某些例示性多核苷酸已揭露於本文中，然而編碼本發明之抗體拮抗劑的其他多核苷酸(提供特定表現系統之遺傳密碼簡併性或密碼偏好者)，亦包括在本發明之範圍中。本發明之例示性多核苷酸係彼等顯示在SEQ ID NOs：211、212、213及214中者。
本發明之另一具體實施例係一種載體，其包含本發明之多核苷酸。該載體可為質體載體、病毒載體、用於桿狀病毒表現之載體、轉位子式載體或適合藉由任何方法用於引導本發明之多核苷酸進入特定生物體或基因背景之任何其他載體。
本發明之另一具體實施例係一種宿主細胞，其包含本發明之多核苷酸。該宿主細胞可為真核細胞、細菌細胞、植物細胞或古生菌細胞。例示性真核細胞可源自哺乳動物、昆蟲、鳥類或其他動物。哺乳類真核細胞包括不朽化細胞株，例如融合瘤細胞或骨髓瘤細胞株，例如SP2/0(American Type Culture Collection(ATCC),Manassas,VA,CRL-1581)、NS0(European Collection of Cell Cultures(ECACC),Salisbury,Wiltshire, UK,ECACC No.85110503)、FO(ATCC CRL-1646)及Ag653(ATCC CRL-1580)鼠類細胞株。一例示性人類骨髓瘤細胞株係U266(ATTC CRL-TIB-196)。其他有用的細胞株包括彼等衍生自中國倉鼠卵巢(CHO)細胞者，例如CHO-K1SV(Lonza Biologics,Walkersville,MD)、CHO-K1(ATCC CRL-61)或DG44。
本發明之另一具體實施例係一種製造特異性結合ST2L之域I的方法，包括培養本發明之宿主細胞及取得該宿主細胞所製造之抗體。製造抗體及純化抗體之方法係為所屬技術領域中所習知。
本發明之另一具體實施例係一種在個體中抑制ST2L與IL-33交互作用的方法，包含施予該個體抑制ST2L與IL-33交互作用足夠量的特異性結合ST2L之域I的抗體。
治療方法
本文所述之本發明之ST2L拮抗劑，例如阻斷IL-33/ST2L交互作用並結合ST2L域I之ST2L抗體拮抗劑、與包含序列為SEQ ID NO：47之重鏈可變區及序列為SEQ ID NO：51之輕鏈可變區的單離抗體競爭結合至人類ST2L(SEQ ID NO：1)的抗體、或結合序列為SEQ ID NO：1(RCPRQGKPSYTVDW；SEQ ID NO：210)之人類ST2L胺基酸殘基35-48的抗體，可用於調節免疫系統。本文所述之本發明之抗體，與結合ST2L其他域及/或區的抗體相較，可更有效的拮抗ST2L生物活性，例如本發明之抗體能夠更有效的減低IL-33引發之肥大細胞反應。本發明之任何抗體可用在本發明之方法中。可用在本發明之方法中的例示性抗體係抗體STLM62、STLM15、STLM103、STLM107、STLM108、STLM123、STLM124、STLM206、STLM207、STLM208、STLM209、STLM210、 STLM211、STLM212、STLM213。並非希望受任何理論約束，但推論結合域I及阻斷IL-33/ST2L交互作用之抗體拮抗劑可抑制肥大細胞中IL-1RAcP/IL-33/ST2L/cKit複合物形成或下游的訊息傳遞，然而域III結合抗體，雖然能夠抑制IL-1RAcP聚集到ST2L/IL-33複合物，卻不會破壞專見於肥大細胞之大規模IL-1RAcP/IL-33/ST2L/cKit複合物形成。進行微陣列分析之結果支持上述推論，該結果顯示抗ST2L域I結合抗體抑制大多數由IL-33引發之肥大細胞信息傳遞，而抗ST2L域III結合抗體僅能抑制彼等訊息傳遞的一小部分。可能原因為IL-33優先於輔助蛋白IL-1RAcP結合至ST2L，藉由域I結合抗體阻擋IL-33結合至ST2L，即可避免任何其他輔助蛋白的結合，包括cKit或尚未辨識出來的共同受體(co-receptors)。不會干擾IL-33結合至ST2L的域III結合抗體，理論上可阻斷IL-1RAcP結合，但不會阻斷其他共同受體的結合，包括尚未辨識出來的共同受體。目前已提出多個模型解釋IL-1RAcP如何與IL-1/IL-1R或ST2L/IL-33複合物交互作用(Lingel et al.,Structure 17：1398-1410,2009；並回顧於Thomas et al.,Nat Struct & Molec Biol 19：455-457,2012)。彼等模型指出，IL-1RAcP可結合至該複合物之一側，但結合至哪一側則尚無定論。因此，該複合物的「其他側」或「閒置側」可能與不會被域III抗體阻斷的替代性共同受體結合，且例如增加另一共同受體聚集之脫靶效應(off-target effects)，可能造成訊息傳遞增加。
在本發明之方法中，可使用任何特異性結合人類ST2L域I之抗體拮抗劑、阻斷IL-33/ST2L交互作用並結合人類ST2L域I之抗體拮抗劑、與包含序列為SEQ ID NO：47之重鏈可變區及序列為SEQ ID NO：51之輕鏈可變區之單離抗體競爭結合至人類ST2L(SEQ ID NO：1)的抗體，或結合序列為SEQ ID NO：1之人類ST2L的第35-48個胺基酸殘基 (RCPRQGKPSYTVDW；SEQ ID NO：210)的抗體。該抗體的額外特徵包括該抗體阻斷IL-33/ST2L交互作用及抑制人類肥大細胞反應的能力。
因此，本發明之抗體適合用於治療多種ST2L調介症狀、ST2L調介發炎症狀及所欲抑制肥大細胞反應的症狀。
本發明之方法可用於治療屬於任何分類之動物病患。該動物之實例包括哺乳動物，例如：人類、囓齒類、狗、貓及家畜。例如：本發明之抗體可用於預防及治療ST2L調介症狀，例如：發炎疾病，包括氣喘、呼吸道過度反應、類肉瘤病、慢性阻塞性肺臟疾病(COPD)、原發型肺纖維化病變(IPF)、囊腫纖維化、發炎性腸疾(IBD)、風濕性關節炎、嗜酸細胞性食道炎、硬皮症、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、大水疱性天孢瘡樣病、慢性蕁麻疹、糖尿病腎病變、間質性膀胱炎或移植物抗宿主病(GVHD)。本發明之抗體可用於預防及治療至少部分由肥大細胞調介之免疫疾病，例如：氣喘、濕疹、癢、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎，以及自體免疫疾病，例如：風濕性關節炎、大水疱性天孢瘡樣病及多發性硬化症。
本發明之方法亦可用於製備該治療之藥劑，其中該藥劑係製備用於以本文所定義之劑量施予。
肥大細胞經由釋放多種調介物，而在過敏性發炎作用及氣喘中扮演核心角色(回顧於Amin,Respir Med 106：9-14,2012)。ST2L在肥大細胞上大量表現，且其之活化導致多種發炎性細胞介素及其他調介物之表現。抑制ST2L活性被推測會干擾肥大細胞調介的發炎細胞聚集並調節慢性發炎作用。
肥大細胞對於刺激會快速反應，包括過敏原、冷空氣、病原體；彼等刺激帶來的上皮細胞損傷可造成IL-33之釋放(回顧於Zhao and Hu,Cell & Molec Immunol 7：260-2,2012)。肥大細胞釋放白三烯、組織胺、前列腺素及細胞介素，以提高血管通透性及支氣管收縮，並聚集其他免疫細胞，例如嗜中性白血球、嗜酸性白血球及T淋巴細胞到該位置(Henderson et al.,JEM 184：1483-94,1996；White et al.,JACI 86：599-605,1990)。此外，彼等藉由提升黏附分子在內皮細胞上的表現，以增加免疫細胞的移動(Meng et al.,J Cell Physiol 165：40-53,1995)。肥大細胞在呼吸道重塑中扮演重要角色；就氣喘而言，呼吸道平滑肌(ASM)細胞層中的肥大細胞數量增加，並分泌調介物促進ASM增生(回顧於Okayama et al.,Curr Opin Immunol 19：687-93,2007)。
發炎性肺臟症狀係發炎症狀的實例。例示性發炎肺臟症狀包括感染引發的肺臟症狀，包括彼等與病毒、細菌、真菌、寄生蟲或病原性蛋白顆粒感染相關者；過敏原引發的肺臟症狀；汙染物引發的肺臟症狀，例如：石綿沉著病、矽肺病或鈹中毒症。胃吸入引發的肺臟症狀，免疫失調，例如囊腫纖維化之帶有基因因素之發炎症狀，及物理創傷引發的肺臟症狀，例如呼吸器傷害。彼等發炎症狀亦包括氣喘、肺氣腫、支氣管炎、慢性阻塞性肺臟疾病(COPD)、類肉瘤病、組織球增生症、淋巴管肌瘤增生、急性肺傷害、急性呼吸窘迫症候群、慢性肺病、肺支氣管發育不全、社區性肺炎、院內肺炎、呼吸器相關肺炎、敗血症、病毒性肺炎、流感病毒感染、副流感病毒(parainfluenza)感染、輪狀病毒感染、人類偏肺病毒(metapneumovirus)感染、呼吸道融合病毒(respiratory syncitial virus)感染及麴菌屬或其他真菌感染。例示性感染相關發炎疾病可包括病毒性或細菌性肺炎，包括重症肺炎、囊腫纖維化、支氣管炎、呼吸道惡化及急性呼吸窘迫症候群(ARDS)。該感染相關症狀可牽涉多重感染，例如初級病毒感染及次級細菌感染。失調的ST2L訊息傳遞可能在例如氣喘 及慢性阻塞性肺臟疾病(COPD)之肺臟疾病的病理學中有其功能(回顧於Alcorn et al.,Annu Rev Physiol 72：495-516,2010)。常用的氣喘及呼吸道發炎動物模式包括白蛋白刺激模式、甲基膽鹼敏化模式及以薰煙色麴菌敏化(Hessel et al.,Eur J Pharmacol 293：401-12,1995)。抑制培養的人類支氣管上皮細胞、支氣管纖維母細胞或呼吸道平滑肌細胞製造細胞介素及趨化激素亦可作為體外模式。施予本發明之拮抗劑給任何彼等模式，可用來評估彼等拮抗劑改善症狀及改變氣喘、呼吸道發炎、COPD等之進程的用途。
氣喘係一種肺部的發炎疾病，其特徵為呼吸道過度反應(airway hyperresponsiveness，「AHR」)、支氣管收縮、哮喘、嗜酸性白血球性或嗜中性白血球性發炎反應、黏液過度分泌、皮下腺纖維化及IgE量升高。病患經歷氣喘「惡化」(症狀變差)，最常見的原因係呼吸道的微生物感染(例如：鼻病毒、流感病毒、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza)等)。氣喘發作可由環境因素引發，例如：蛔蟲、昆蟲、動物(例如：貓、狗、兔、小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠及鳥類)、真菌、空氣汙染(例如：二手煙)、刺激性氣體、有害氣體、蒸汽、噴霧劑、化學品、花粉、運動或冷空氣。除了氣喘以外，許多影響肺部的慢性發炎性疾病，特徵皆為嗜中性白血球滲入呼吸道，例如：慢性阻塞性肺臟疾病(COPD)、細菌性肺炎及囊腫纖維化(Linden et al.,Eur Respir J 15：973-7,2000；Rahman et al.,Clin Immunol 115：268-76,2005)，而例如COPD、過敏性鼻炎及囊腫纖維化之疾病，特徵則為呼吸道過度反應(Fahy and O’Byrne,Am J Respir Crit Care Med 163：822-3,2001)。氣喘及呼吸道發炎的常見動物模式包括在白蛋白敏化與刺激之後予以甲基膽鹼刺激之模式(Hessel et al.,Fur J Pharmacol 293：401-12,1995)。抑制培養的人類支氣管上皮細胞、支 氣管纖維母細胞或呼吸道平滑肌細胞製造細胞介素及趨化激素亦可作為體外模式。施予本發明之抗體拮抗劑給任何彼等模式，可用來評估彼等拮抗劑改善症狀及改變氣喘、呼吸道發炎、COPD等之進程的用途。
經由在TH2細胞、嗜鹼性白血球、肥大細胞及新發現的先天性第2型淋巴細胞上的ST2L受體傳遞之IL-33訊息，造成IL-5及IL-13(第2型細胞介素)分泌(ILCs回顧於Spits et al.,Nature Reviews Immunology 13：145-149,2013)。氣喘的IL-5或IL-13標靶治療，其良益效果確認彼等訊息傳遞路徑之間的關聯性。IL-5活化嗜酸性白血球，且以中和IL-5之單株抗體治療一小群帶有唾液嗜酸性白血球增生症之重症氣喘，結果為減低惡化情形(Nair et al.N Engl J Med.2009；360(10)：985-93)。IL-13經報導為促成IgE合成、黏液分泌及纖維化。以抗IL-13單株抗體治療重症氣喘，結果為肺部功能改善，有部分則顯示更大幅度的改善(Corren et al.,N.Engl.J.Med.,365：1088-1098,2011)。差別性免疫路徑的其他媒介物亦牽連在氣喘致病機轉中，且除了ST2L以外，阻斷彼等媒介物對於治療有額外的益處。標靶多重第2型細胞介素或製造第2型細胞介素之上游路徑的治療，對多種疾病而言皆是有益的。
本發明之ST2L抗體的VH域及VL域可結合到雙特異性抗體及本文所描述之分子中，其中該雙特異性抗體特異性結合ST2L之域I及一第二抗原，例如TSLP(胸腺基質淋巴生成素(thymic stromal lympohpoietin))、IL-25、IL-17RB或TSLPR。
IL-25及TSLP，如IL-33一般，透過不同的訊息傳遞複合物觸發第2型細胞介素釋放：IL-25(IL-17E)係IL-17族的一員並經由IL-17RA/IL-17RB傳遞訊息，而TSLP係IL-7族的一員並經由TSLPR/IL-7Rα異源二聚體(回顧於Koyasu et al.,Immunol 132：475-481, 2011)傳遞訊息。IL-33、ST2L、IL-25、IL-17RB、TSLP或TSLPR有缺陷的動物在多種不同類型之氣喘小鼠模式的至少其中一種當中，呼吸道發炎作用較不嚴重；然而在多數彼等動物模式中，可能缺少呼吸道發炎作用之保護，因而提高上皮細胞暴露於多種過敏原或致病原的機會，伴隨觸發IL-33、IL-25及TSLP之釋放。Hammad等人報導，施予家塵蟎萃取物給小鼠，造成IL-25、TSLP及IL-33(以及IL-33下游的IL-5及IL-13)釋放到呼吸道(Hammad et al.,Nat Med 15：210-216,2009)。此項結果顯示，阻斷ST2L及TSLP及/或IL-25具有好處，特別是對於嚴重的呼吸道疾病而言。
在本發明的另一具體實施例中，該特異性結合人類ST2L域I之抗體拮抗劑可用於產生結合ST2L及TSLP、ST2L及IL-25、ST2L及TSLPR、ST2L及IL-17RA或ST2L及IL-17RB的雙特異性分子。
在本發明的另一具體實施例中，該特異性結合人類ST2L域I之抗體拮抗劑係一種雙特異性抗體，其中該抗體進一步結合TSLP、IL-25、TSLPR、IL-17RA或IL-17RB。
TSLP、IL-25、TSLPR、IL-17RA及IL-17RB結合抗體可利用本文所述之方法產生，例如免疫接種表現人類免疫球蛋白基因座之小鼠(Lonberg et al.,Nature 368：856-9,1994；Fishwild et al.,Nature Biotechnology 14：845-51,1996；Mendez et al.,Nature Genetics 15：146-56,1997，美國專利號5,770,429、7,041,870及5,939,598)或Balb/c小鼠，該免疫接種係以相對應的蛋白質或該蛋白質的細胞外區域進行，或利用本文所述之嗜菌體呈現基因庫。另一方面，可使用現存的TSLP、IL-25、TSLPR、IL-17RA及IL-17RB抗體產生雙極性分子。可使用的例示性IL-25抗體係彼等描述於例如國際專利公開號WO2011/123507者。
關節炎(包括骨關節炎、風濕性關節炎、受傷造成的關節炎等等)係常見的發炎症狀，其將從抗發炎蛋白質的治療性使用獲益，例如本發明之拮抗劑。ST2L訊息傳遞的活化可使發炎關節中的發炎作用持續並進一步傷害組織。目前已知多種風濕性關節炎的動物模式。例如：在膠原蛋白引發的關節炎(CIA)模式中，小鼠發展出非常類似於人類風濕性關節炎的慢性發炎性關節炎。ST2L缺陷(ST2KO)小鼠在此模式中所發展的疾病輕微，且在此模式中的病變係依賴於肥大細胞的ST2L表現(Xu et al.,PNAS 105：10913-8,2008)。在此模式中，ST2KO小鼠關節內的單核細胞及多形核細胞浸潤，以及滑膜增生減少。與膠原蛋白(CII)一起培養的ST2KO小鼠引流淋巴結，顯示出IL-17、IFNγ及TNFα製造明顯減少。在誘發CIA前過繼性移植野生型(WT)骨髓源性肥大細胞(BMMC)的ST2L缺陷小鼠，與彼等移植ST2KO BMMCs的小鼠相較，發展出較嚴重的CIA。因此肥大細胞的ST2L訊息傳遞，在類似人類風濕性關節炎的小鼠模式中，對關節炎的發展佔關鍵性地位。施予本發明之ST2L抗體(其抑制肥大細胞反應)給CIA模式小鼠，可評估彼等拮抗劑用來緩和症狀及改變病程的用途。
例示性腸胃道發炎性症狀係發炎性腸疾(IBD)、潰瘍性結腸炎(UC)及克羅恩氏病(CD)、環境刺激誘發的結腸炎(例如：由下列所造成或與下列有關(例如：作為副作用)的腸胃道發炎(例如：結腸炎)：治療方案，例如施予化學治療、放射治療等)、感染性結腸炎、缺血性結腸炎、生膠性或淋巴性結腸炎、壞死性結腸炎、下列狀況中的結腸炎：例如慢性肉芽腫病或乳糜瀉、食物過敏、胃炎、感染性胃炎或腸結腸炎(例如幽門螺旋桿菌感染的慢性活動性胃炎)及由感染物所造成的其他型腸胃道發炎。有許多腸胃道發炎症狀的動物模式。一些最廣為使用的 模式係2,4,6-三硝苯磺酸/乙醇(TNBS)所誘發的結腸炎模式或噁唑酮模式，其在結腸中誘發慢性發炎及潰瘍(Neurath et al.,Intern Rev Immunol 19：51-62,2000)。另一模式使用聚葡萄糖硫酸鈉(DSS)，其誘發急性結腸炎，徵狀為出血性腹瀉、失重、結腸縮短及帶有嗜中性球之黏膜潰瘍。另一模式與過繼性移植純真(naïve)CD45RBhigh CD4 T細胞到RAG或SCID小鼠有關。在此模式中，供給體純真T細胞攻擊接受者腸，造成慢性腸發炎及相似於人類發炎性腸疾病的症狀(Read and Powrie,Curr Protoc Immunol Chapter 15 unit 15.13,2001)。施予任何彼等模式本發明之拮抗劑，可用來評估彼等拮抗劑緩和症狀及改變與腸發炎有關之病程(例如發炎性腸疾)的潛在功效。
腎纖維化可發展自例如移植物缺血/再灌注(Freese et al.,Nephrol Dial Transplant 16：2401-6,2001)之急性刺激或例如糖尿病之慢性症狀(Ritz et al.,Nephrol Dial Transplant 11 Suppl 9：38-44,1996)。致病機制一般係以初始發炎反應接續腎絲球過濾器(glomerular filtration apparatus)及腎小管間隙組織(tubular interstitium)的持續性纖維化為特徵(Liu,Kidney Int 69：213-7,2006)。已知腎小管間質纖維化(Tubulointerstitial fibrosis)在腎臟損傷到末期腎衰竭的致病機制中扮演關鍵性角色，且腎近端小管細胞(proximal tubule cell)已被發現為中心調介者(Phillips and Steadman,Histol Histopathol 17：247-52,2002；Phillips,Chang Gung Med J 30：2-6,2007)。腎小管間質腔中的纖維化部分係由常駐纖維母細胞的活化所調介，該纖維母細胞分泌促發炎反應細胞介素，刺激腎近端小管上皮細胞分泌局部性發炎反應調介物及纖維生成調介物。此外，趨化性細胞介素係由纖維母細胞及上皮細胞分泌，並提供方向性梯度引導單核細胞/巨噬細胞及T細胞浸潤到腎小管間質中。發炎性浸潤製造 額外的纖維生成細胞介素及發炎性細胞介素，其進一步活化纖維母細胞及上皮細胞性細胞介素釋放，同時亦刺激上皮細胞進行表現型轉化，使該細胞沈積過量的細胞外基質組分(Simonson,Kidney Int 71：846-54,2007)。
其他的例示性纖維化症狀可包括肝纖維化(包括但不限於酒精誘發性肝硬化、病毒誘發性肝硬化、自體免疫誘發性肝炎)；肺纖維化(包括但不限於硬皮症、原發型肺纖維化病變)；腎纖維化(包括但不限於硬皮症、糖尿病性腎炎、腎絲球腎炎、狼瘡性腎炎)；真皮纖維化(包括但不限於硬皮症、肥厚性疤痕及瘢瘤性疤痕、燒傷)；骨髓纖維化；多發性神經纖維瘤；纖維瘤；腸纖維化；及手術過程造成的纖維黏連(fibrotic adhesions)。纖維化可為器官特異性纖維化或全身性纖維化。器官特異性纖維化可與肺纖維化、肝纖維化、腎纖維化、心纖維化、血管纖維化、皮膚纖維化、眼纖維化或骨髓纖維化相關聯。肺纖維化可與原發型肺纖維化病變、藥物誘發性肺部纖維化、氣喘、類肉瘤病或慢性阻塞性肺臟疾病相關聯。肝纖維化可與肝硬化、血吸蟲病(schistomasomiasis)或膽管炎(cholangitis)相關聯。肝硬化可選自酒精性肝硬化、C型肝炎後肝硬化、原發性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)。膽管炎可為硬化性膽管炎。腎纖維化可與糖尿病性腎病變或狼瘡性腎絲球硬化症相關聯。心纖維化可與心肌梗塞相關聯。血管纖維化可與血管形成術後動脈再狹窄(postangioplasty arterial restenosis)或動脈粥狀硬化相關聯。皮膚纖維化可與燒傷疤痕、肥厚性疤痕、瘢瘤性疤痕或腎因性皮膚纖維化(nephrogenic fibrosing dermatopathy)相關聯。眼纖維化可與眼後纖維化(retro-orbital fibrosis)、後天性白內障手術(postcataract surgery)或增殖性玻璃體視網膜病變(proliferative vitreoretinopathy)相關聯。骨髓纖維化可與原發性骨髓纖維化(idiopathic myelofibrosis)或藥物誘發性骨髓纖維變性相關聯。 全身性纖維化可為全身性硬化症(systemic sclerosis)或移植物對抗宿主疾病(graft versus host disease)。
可藉由本發明之方法預防或治療其他發炎性症狀及神經疾病，係彼等由自體免疫疾病所造成者。彼等症狀及神經疾病包括多發性硬化症、紅斑性狼瘡及神經退化性及中樞神經系統(CNS)失調(包括阿茲海默症、帕金森氏症、亨丁頓舞蹈症、躁鬱症及肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS))、肝臟疾病(包括原發性膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎、非酒精性脂肪肝病/脂肪肝炎、纖維化、C型病毒性肝炎(HCV)及B型病毒性肝炎(HBV)、糖尿病及胰島素抗性)、心血管失調(包括動脈粥狀硬化、腦出血(cerebral hemorrhage)、中風及心肌梗塞)、關節炎、風濕性關節炎、乾癬性關節炎及幼年型類風濕性關節炎(JRA)、骨質疏鬆症、骨關節炎、胰臟炎、纖維化、腦炎、牛皮癬、巨大細胞動脈炎(Giant cell arteritis)、僵直性脊椎炎(ankylosing spondolytis)、自體免疫性肝炎(autoimmune hepatitis)、人類免疫缺乏病毒(HIV)、發炎性皮膚症狀、移植、癌症、過敏、內分泌疾病、創傷修復、其他自體免疫失調、呼吸道過度反應及細胞調介、病毒調介或普恩蛋白調介的感染或失調。
本發明之一具體實施例係治療或預防ST2L調介症狀之方法，包含在足夠治療或預防該ST2L調介症狀的時間長度中，將治療有效量之一種特異性結合人類ST2L域I(SEQ ID NO：9)、阻斷IL-33/ST2L交互作用、與下列抗體競爭結合到人類ST2L(SEQ ID NO：1)：包含序列為SEQ ID NO：47之重鏈可變區(VH)及序列為SEQ ID NO：51之輕鏈可變區(VL)的單離抗體，及/或結合到序列為SEQ ID NO：1之人類ST2L的第35-48個胺基酸殘基(RCPRQGKPSYTVDW；SEQ ID NO：210)的單離人類或人類適應性抗體拮抗劑施予有需要的病患。
本發明之另一具體實施例係一種抑制病患體內肥大細胞反應的方法，包含在足夠抑制該肥大細胞反應的時間長度中，將治療有效量之一種特異性結合人類ST2L域I(SEQ ID NO：9)、阻斷IL-33/ST2L交互作用、與下列抗體競爭結合到人類ST2L(SEQ ID NO：1)：包含序列為SEQ ID NO：47之重鏈可變區(VH)及序列為SEQ ID NO：51之輕鏈可變區(VL)的單離抗體，及/或結合到序列為SEQ ID NO：1之人類ST2L的第35-48個胺基酸殘基(RCPRQGKPSYTVDW；SEQ ID NO：210)的人類或人類適應性抗體拮抗劑施予有需要的病患。
本發明之另一具體實例係一種在個體中抑制IL-33及ST2L之交互作用的方法，包含施予該個體足夠抑制IL-33及ST2L交互作用量的，特異性結合人類ST2L域I(SEQ ID NO：9)、阻斷IL-33/ST2L交互作用、與下列抗體競爭結合到人類ST2L(SEQ ID NO：1)：包含序列為SEQ ID NO：47之重鏈可變區(VH)及序列為SEQ ID NO：51之輕鏈可變區(VL)的單離抗體，及/或結合到序列為SEQ ID NO：1之人類ST2L的第35-48個胺基酸殘基(RCPRQGKPSYTVDW；SEQ ID NO：210)的人類或人類適應性抗體拮抗劑。
在另一具體實施例中，該ST2L調介症狀係氣喘、呼吸道過度反應、類肉瘤病、慢性阻塞性肺臟疾病(COPD)、原發型肺纖維化病變(IPF)、囊腫纖維化、發炎性腸疾(IBD)、嗜酸細胞性食道炎(eosinophilic esophagitis)、硬皮症(scleroderma)、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、大水疱性天孢瘡樣病、慢性蕁麻疹、糖尿病腎病變、風濕性關節炎、間質性膀胱炎或移植物抗宿主病(GVHD)。
在另一具體實施例中，該ST2L調介症狀係與發炎細胞聚集在肺部、杯狀細胞增生或黏液分泌增加有關。
在另一具體實施例中，該ST2L調介症狀係與肥大細胞反應有關。
在另一具體實施例中，該抑制肥大細胞反應包含以50μg/ml抗體抑制由人類臍帶血衍生肥大細胞所釋放之GM-CSF、IL-5、IL-8、IL-10或IL-13之量達至少50%。
在另一具體實施例中，該施予有需要之病患的抗體拮抗劑係特異性結合人類ST2L域I(SEQ ID NO：9)、阻斷IL-33/ST2L交互作用、與下列抗體競爭結合到人類ST2L(SEQ ID NO：1)：包含序列為SEQ ID NO：47之重鏈可變區(VH)及序列為SEQ ID NO：51之輕鏈可變區(VL)的單離抗體，及/或結合到序列為SEQ ID NO：1之人類ST2L的第35-48個胺基酸殘基(RCPRQGKPSYTVDW；SEQ ID NO：210)並進一步結合TSLP、IL-25、TSLPR、IL-17RA或IL-17RB的雙特異性抗體。
施予/醫藥組合物
有效治療希望調控ST2L生物活性的症狀之該抗ST2L抗體的「治療有效量」，可藉由標準研究技術決定。例如：將能有效治療發炎症狀(例如氣喘或風濕性關節炎)之抗ST2L抗體的劑量，可藉由施予該抗ST2L抗體給相關動物模式(例如本文所述之)抗ST2L抗體決定。
此外，可視情況利用體外試驗協助找出最佳劑量範圍。所屬技術領域中具有通常知識者可依據多種因素考量而決定選擇特定有效劑量(例如：透過臨床試驗)。該因素包括所欲治療或預防之疾病、所牽涉之病徵、病患之身體質量、病患之免疫狀態及其他為所屬技術領域中具有通常知識者所知的因素。用於該配方的精確劑量亦將取決於施予的途徑 以及疾病的嚴重程度，且應根據醫生的判斷與每個患者的情況來決定。有效劑量可由體外或動物模式測試系統所導出的劑量-反應曲線來推斷。
本發明之抗體治療用途的施予模式可為任何將試劑傳遞至宿主的適當途徑。該些抗體的醫藥組合物對腸胃外施予特別有用，例如皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下或鼻內方式。
本發明之抗體可製備成醫藥組合物，其包括一有效量的試劑於一醫藥上可接受載劑中作為有效成分。術語「載劑」係指與活性化合物一起施予的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。此醫藥載體可為液體(如水及油)，該些液體包括石油、動物、植物或合成來源(如花生油、黃豆油、礦物油、芝麻油及其類似物)。例如，可使用0.4%鹽水及0.3%甘胺酸。該些溶液係無菌且一般無顆粒物。其可利用常見、習知的滅菌技術來滅菌(例如，過濾)。該組合物可包括如模擬生理條件所需的醫藥上可接受輔助物質，如pH調整及緩衝試劑、穩定劑、增稠劑、潤滑劑及著色劑等等。本發明之抗體於該些醫藥配方的濃度可有很大的變化，即由約小於0.5%，通常約1%或至少1%到至多15或20%重量百分比，且主要將根據所選的特定施予模式依所需劑量、液體體積、黏度等等來選擇。
因此，可製備用於肌內注射的本發明之醫藥組合物以包括1ml滅菌緩衝水，以及介於約1ng至約100mg之間(即約50ng至約30mg，或較佳為約5mg至約25mg)的本發明抗ST2L抗體。同樣地，可製備用於靜脈內注射的本發明之醫藥組合物以包括250ml滅菌林格氏液，以及約1mg至約30mg且較佳為5mg至約25mg的本發明拮抗劑。製備可腸胃外施予組合物的實際方法為習知且詳細描述於，例如「Remington's Pharmaceutical Science」，第15版，Mack Publishing Company，Easton，PA。
本發明之抗體可被凍乾以儲存並在使用前於適當的載劑中恢復原狀。此技術已被證明利用常見的免疫球蛋白及蛋白質製備方式是有效的，且可採用技藝習知的凍乾及復原技術。
本發明將參照下面特定、非限制性實例說明。
材料與方法(一般) 人類及馬來猴(Macaca fascicularis，cyno)受體-配體結合抑制分析(RLB分析)
將96孔盤以50μl的4μg/ml人類ST2L-ECD(SEQ ID NO：1之胺基酸19-328)或2μg/ml馬來猴ST2L-ECD(SEQ ID NO：2之胺基酸19-321)塗覆，於碳酸氫鹽緩衝液中在4℃下以C端His6標籤標記16小時。後續所有步驟皆在室溫下進行。以200μl阻隔緩衝液阻隔培養盤，並以300μl含PBS+0.05% Tween的沖洗緩衝液沖洗3次。將30μl之不同抗ST2L單株抗體稀釋加入盤孔並培養1小時。人類受體-配體結合分析中，加入20μl之生物素標記人類IL-33(SEQ ID NO：3之殘基112-270)至最終濃度為100ng/ml並培養30分鐘。馬來猴受體-配體結合分析試驗中，加入20μl之生物素標記馬來猴IL-33(SEQ ID NO：4之殘基112-269)至最終濃度為200ng/ml並培養30分鐘。將培養盤以300μl沖洗緩衝液沖洗3次。加入50μl之0.2μg/ml卵白素-辣根過氧化酶(Streptavidin-HRP)(Jackson Immunoresearch)並培養30分鐘。將培養盤以300μl含PBS+0.05% Tween的沖洗緩衝液沖洗3次。將50μl之TMB基質(EMD Biosciences)加入各盤孔。加入100μl之0.2N硫酸終止反應。利用Envision培養盤分析儀(Perkin Elmer)測量OD450。
產生嵌合ST2L建構
利用標準分子生物技術設計並產生特徵為人類及小鼠ST2L域I、II及III置換的各種建構。該些建構列於表1。對應於人類ST2L(hST2L)(SEQ ID NO：1；NP_057316)及小鼠ST2L(mST2L)(SEQ ID NO：5；NP_001020773)蛋白質的胺基酸編號。
域結合測定分析。
與ST2L域I、II及III結合的抗體係利用標準捕捉ELISA分析使用電化學發光偵測格式(Meso-Scale Discovery(MSD)技術)測定。在室溫下將10μg/mL之各抗體塗覆在MSD HighBind培養盤之各盤孔上(每孔5μL)2小時。在室溫下將培養盤以150μL之5% MSD阻隔緩衝液阻隔2小時，並以HEPES沖洗緩衝液沖洗3次，接著加入25μL之磺酸基標記(sulfo tag)標定的huST2L-ECD或小鼠ST2L-ECD(SEQ ID NO：5之28-326)或HHM-ST2L(SEQ ID NO：6)或HMH-ST2L(SEQ ID NO：8)嵌合體或HH-ST2L(SEQ ID NO：1之殘跡19-205)至培養盤，其濃度由5nM增加 至40nM。將培養盤以鋁箔覆蓋並在室溫下輕輕搖動培養1小時。接著以HEPES沖洗緩衝液沖洗3次。將MSD讀取緩衝液(150μl)加入各盤孔，接著利用MSD Sector Imager 6000讀取培養盤。
該些與人類ST2L-ECD、HHM-ST2L及HMH-ST2L結合但不與小鼠ST2L-ECD結合的抗體辨識人類ST2L-ECD之域I。與人類ST2L-ECD及HMH-ST2L結合但不與HHM-ST2L及小鼠ST2L-ECD結合的抗體辨識人類ST2L-ECD之域III。與人類及小鼠ST2L-ECD結合但不與HH-ST2L結合的抗體辨識人類及小鼠ST2L-ECD之域III。
抗ST2L單株抗體之親和力測量
抗ST2L單株抗體、huST2L-ECD及cynoST2L-ECD係利用標準方法表現。山羊抗人類IgG Fcγ片段特異性Ab(產品編號109-005-098)係購自Jackson ImmunoResearch laboratories(West Grove,PA)。GLC感測器晶片(Bio-Rad產品編號176-5011)、CM-5感測器晶片(GE Healthcare產品編號BR100014)及製備捕捉表面的試劑係購自Biacore(GE healthcare，Piscataway，NJ)或購自Bio-Rad Life Sciences(Bio-Rad，Hercules，CA)。
抗ST2L抗體與His6標記人類ST2L-ECD及His6標記馬來猴ST2L-ECD的交互作用係藉由ProteOn利用在25℃下ProteOn XPR36來研究。生物感測器表面係利用製造商胺耦合化學的說明，將山羊抗人類IgG Fcγ片段特異性抗體(Ab)耦合至GLC感測器晶片的表面而製備。耦合緩衝液為10mM醋酸鈉(pH 4.5)。將山羊抗人類IgG Fcγ(約4500反應單位)以水平方向固定。抗ST2L抗體係以純化或粗上清液方式提供。在任一情況下，這些抗體係稀釋於PRB(PBS(pH 7.4)，添加3mM EDTA 及0.005% Tween 20)至濃度約0.5μg/mL。該些抗體係以垂直方向捕捉(60-130 RU)於抗人類Fcγ抗體修飾的GLC晶片。抗ST2L單株抗體之捕捉後接著以水平方向注射huST2L ECD於溶液(0.024至15nM 5倍稀釋)或cynoST2L ECD於溶液(0.020-5nM 4倍稀釋)。在所有實驗中結合係監測4分鐘(以50μL/min注射200μL)。解離係監測30分鐘。該感測器表面的再生係以10mM甘胺酸(pH 1.5)之三次15秒脈衝所得。利用ProteOn軟體及利用具質量轉移的1：1結合模型適配該數據。
Biacore實驗係利用Biacore 2000或Biacore 3000光學生物感測器(Biacore AB)進行。所有實驗皆在25℃下於具有或不具0.1% BSA的BRB(PBS(pH 7.4)，添加3mM EDTA及0.005% Tween 20)中操作。
Biacore生物感測器表面係利用製造商胺耦合化學的說明，將山羊抗人類IgG Fcγ片段特異性Ab利用耦合至CM-5晶片的羧甲基化聚葡萄糖表面而製備。耦合緩衝液為10mM醋酸鈉(pH 4.5)。將平均6000反應單位(RU)的Ab固定在四個流槽各個之中。將抗ST2L單株抗體捕捉(約33 RU)於抗人類Fcγ抗體修飾的感測器晶片表面上。抗ST2L單株抗體之捕捉後接著注射huST2L ECD於溶液(0.2至15nM 3倍稀釋)或cynoST2L ECD於溶液(0.2至15nM或0.020-5nM，3倍稀釋)。結合係監測4分鐘或8分鐘(對C2521及C2519以50μl/min或20μL/min注射200μL)。解離係監測10分鐘，或至多2.5小時。該感測器表面的再生係以注射50mM NaOH及/或注射100mM H3PO4所得。
利用Scrubber軟體，版本1.1g(BioLogic Software)處理數據。數據的雙參考減法係藉由自分析物注射的參考減去曲線減去由緩衝液注射產生的曲線以校正緩衝液對訊號與儀器雜訊的影響(Myszka,Journal of Mol Recogn 12：279-84,1999)。
數據處理後，用於動力學及親和力測定所產生的數據係利用Scrubber軟體或BIAevaluation軟體，版本4.0.1(Biacore,AB)分析。動力學數據係利用一簡易1：1結合模型，其包括用於質量轉移的術語。
抗小鼠ST2L單株抗體(C1999/CNTO3914)對鼠ST2L ECD之親和力測量
抗ST2L單株抗體(C1999/CNTO3914)及鼠ST2L胞外域(muST2L-ECD)係利用標準方法表現及純化。抗鼠IgG Fcγ片段特異性Ab係購自Jackson ImmunoResearch laboratories(West Grove,PA)。用於製備捕捉表面的感測器晶片及試劑係購自Biacore(GE healthcare，Piscataway，NJ)。實驗的Biacore電泳緩衝液(BRB)包括PBS(pH 7.4)以及0.005% Tween 20與0.1mg/mL BSA，且在25℃下收集數據。
抗ST2L抗體與muST2L-ECD的交互作用係以Biacore2000在25℃下研究。生物感測表面係利用製造商胺耦合化學的說明，將抗小鼠Fc特異性抗體耦合至CM4感測器晶片的表面而製備。C1999/CNTO3914及muST2L-ECD係稀釋於BRB。C1999係利用抗小鼠Fcγ抗體(約85 RU)捕捉。捕捉後接著注射muST2L ECD(SEQ ID NO：5之殘基28-326)於溶液(起始在15nM，5個濃度，3倍序列稀釋)。結合係監測8分鐘。解離係監測達6000秒。再生係利用磷酸之1/100稀釋進行。數據係利用1：1結合模型適配。
人類嗜鹼性球細胞株分析(鹼性細胞細胞介素釋放分析)
KU812細胞(人類嗜鹼性球細胞株；ATCC，CRL-2099)係塗佈於無菌96孔U底組織培養盤，每孔25,000或50,000細胞，總共 40μl之RPMI 1640生長培養基(Invitrogen)添加10% FBS與青黴素/鏈黴素。加入各種濃度(每孔50μl)的抗人類ST2L單株抗體及控制組，並在37℃下培養。培養1小時後，加入重組「成熟」IL-33(SEQ ID NO：3之胺基酸111-270)至最終濃度為10ng/ml於10μl之RPMI生長培養基中。接著將細胞在37℃下培養18-24小時以使IL-33調介誘發IL-5及IL-6。培養後，收取細胞並收集細胞上清液供後續檢測IL-33誘發的IL-5及IL-6，該檢測利用ELISA(R&D systems)或基於微珠的多重分析(Millipore)。
人類肥大細胞細胞介素釋放分析及PGD 2 釋放分析
肥大細胞係衍生自CD34+人類臍帶血細胞(Lonza)。將>1.0×106 CD34+臍帶血細胞之冷凍小瓶快速解凍並轉移至50ml錐形管。緩慢將數滴溫暖或室溫的Stem-Pro 34培養基+添加物(總共25ml；Invitrogen)加入細胞。將細胞在1,000rpm離心15分鐘，並再懸浮於培養基中(10ml之StemPro-34，其添加下列補充物：30ng/ml IL-3、100ng/ml IL-6及100ng/ml SCF。將細胞塗佈於6孔盤的2孔中，並培養1星期。在第4天，細胞係以1：3擴增於添加的Stem Pro-34培養基。在第7天，移除並塗佈非貼附的細胞，在0.5×106/ml於包括10ng/ml IL-6及100ng/ml SCF的StemPro-34培養基)。細胞每週擴增以維持細胞密度在0.5×106/ml直到肥大細胞在6-10週(藉由FcεR1、cKit及中性蛋白酶之表現評估)成熟。
成熟肥大細胞係培養在0.5×106/ml於StemPro-34，且每天於IL-4(10ng/ml；Peprotech)、IL-6(10ng/ml；R&D systems)及SCF(100ng/ml；Invitrogen)中刺激，持續4天。分析前收取細胞，在1,000 RPM下離心10分鐘並重新懸浮於新鮮StemPro-34培養基或RPMI含10% FCS中，不含抗生素，含100ng/ml人類重組SCF。將細胞以65,000至75,000細胞/0.16毫升/孔之密度塗覆在平坦底部的組織培養處理的96孔盤。在加入IL-33之前30分鐘將抗ST2L單株抗體加入培養盤至最終濃度為50、10、2、0.4、0.08、0.016、0.0032μg/ml。同時製備重組人類「成熟」IL-33(SEQ ID NO：3之殘基111-270)成10X(10或30ng/ml)於培養基+100ng/ml SCF。將20μl之10X IL-33加入盤孔至最終濃度為1(圖6及7A-7E)或3ng/ml(圖8A-8E)，且將培養盤在37℃，5% CO2下培養隔夜。於刺激後18-24小時收取培養上清液。將培養盤以1,000RPM離心10分鐘。將上清液移出並置入U底96孔盤，進行分析前儲存在-20℃。將購自Millipore的人類細胞介素套組用於使用LuminexTM技術分析細胞介素值。PGD2之值係根據製造商說明，使用購自Cayman化學公司之前列腺素D2-MOX EIA套組測量。為了加強ELISA之靈敏度，將肥大細胞培養上清液中的PGD2以甲氧胺鹽酸鹽(MOX-HCl)處理，轉換成不可降解的MOX-PGD2(甲氧胺-PGD2)。
小鼠受體-配體結合抑制分析(小鼠RLB分析)
將96孔乾淨培養盤(VWR)以50μl之2μg/ml山羊抗人類IgG、Fcγ片段特異性(Jackson Immunoresearch)抗體4℃塗覆約16小時。其餘步驟則在室溫下完成。將盤孔以阻隔緩衝液培養、沖洗，並加入50μl之2μg/ml與人類Fc融合的小鼠ST2L-ECD，持續1小時。沖洗培養盤並加入1μg/ml之具有或不具抗mST2L抗體的生物素標記mIL-33。沖洗培養盤並以卵白素-HRP(Jackson Immune Research)完成偵測，且依 據製造商的說明以TMB基質(RDI Division of Fitzgerald Industries)顯影訊號。
小鼠及人類報導基因分析(人類或小鼠RGA分析)
將HEK293細胞以每孔50,000細胞塗佈於白色乾淨底部組織培養處理的96孔盤(NUNC))中的DMEM、10%FBS中，並在37℃、5% CO2的加濕培養箱中培養24小時。利用LipofectamineTM 2000於Opti-MEM培養基(Invitrogen)以標準實驗方式，將細胞以編碼人類或小鼠ST2L-ECD cDNA、NF-κB-螢光素酶載體(Stratagene,Agilent Technologies,Santa Clara,CA)共轉染。在37℃、5% CO2下培養24小時後，將轉染的細胞以具有或不具抗ST2L抗體的小鼠(R&D systems，SEQ ID NO：5之殘基109-266)或人類IL-33(SEQ ID NO：3之殘基112-270)在37℃、5% CO2下處理16小時。使用Steady-Glo®試劑(Promega)根據製造商說明測量螢光素酶活性。
小鼠T細胞增生分析
將小鼠Th2細胞(D10.G4.1，ATCC)培養於完整生長培養基：將具有2mM L-穀醯胺的RPMI 1640培養基調整以包括1.5g/L碳酸氫鈉、4.5g/L葡萄糖、10mM HEPES及1.0mM丙酮酸鈉，並添加：0.05mM 2-巰基乙醇、10 pg/ml IL-1α(R&D systems)、10%胎牛血清、具有ConA(購自Becton Dickinson之大鼠IL-2培養添加物)之10%大鼠T-STIM因子。將細胞以分析培養基(RPMI、10%FBS、無IL-1、無T-STIM)沖洗、以每毫升1.25×105細胞再懸浮並塗佈在80μl之培養基於白色乾淨底部組織培養處理的96孔盤中(NUNC,Rochester,NY)。將各種量的小 鼠IL-33(SEQ ID NO：5之殘基109-266)加入細胞使最終分析體積為100μl。當測試抗體中和時，將控制組抗體(加入使用的融合瘤培養基)或融合瘤上清液加入細胞並在加入20 pg/ml mIL-33後培養1小時。培養盤在37C、5% CO2下於加濕培養箱中培養24小時。以CellTiter-Glo®試劑(Promega,Madison,WI)定量活細胞；實驗方式係根據製造商說明進行。
小鼠骨髓衍生肥大細胞分析
小鼠肥大細胞係衍生自Balb/c小鼠(6週)的骨髓。細胞以300,000細胞/盤孔塗佈於RPMI培養基(無內毒素)、10% FBS、10% WEHI細胞株調整的培養基、10ng/ml IL-3(Peprotech)、0.1mM必須胺基酸、1%青黴素/鏈黴素(Invitrogen)。將抗ST2L單株抗體(100、10、1、0.1或0.01μg/ml)在加入重組小鼠「成熟」IL-33(SEQ ID NO：215之殘基109-266)(10ng/ml；R&D systems)前與細胞培養1小時大約24小時之後，收取上清液並冷凍直到分析，該分析係根據製造商說明利用用於LuminexTM的Millipore小鼠22-plex套組。
馬來猴內皮細胞分析
將食蟹獼猴主動脈內皮細胞培養於EGM®-2內皮細胞生長培養基-2(Lonza)以每孔10,000或20,000細胞塗佈於96孔組織培養盤。將50μl之抗ST2L抗體加入細胞，開始以100μg/ml而後續4或5倍稀釋，並於加入重組馬來猴「成熟」IL-33(SEQ ID NO：4)之前在37℃培養1小時。接著將五十微升之20ng/ml食蟹獼猴IL-33加入細胞並在37℃培養24小時。為了評估IL-33誘發的細胞介素反應，收取上清液並根 據製造商說明以用於LuminexTM的非人靈長類IL-8套組(Millipore)評估細胞介素值。
小鼠腹膜灌洗分析
以總共3ml PBS來沖洗6 Balb/c小鼠的腹膜以收集腹膜細胞。可發現大部分的細胞為淋巴細胞和巨噬細胞，如以B220及F4/80表現(FACS分析)所測定。大約1%為cKit+(CD117+)肥大細胞。將細胞離心，再懸浮沉澱物至1×106細胞/ml於Alpha MEM培養基+10% FBS+100 U/ml青黴素+100μg/ml鏈黴素(Invitrogen)。將細胞以每孔200μl塗佈於96孔盤並在37℃放置2小時。將抗ST2L單株抗體在加入10 ng/ml小鼠「成熟」IL-33(R&D systems；SEQ ID NO：215之殘基109-266)前加入細胞30分鐘。IL-33加入後收集上清液24小時，儲存在-20℃直到進行分析，並根據製造商說明使用用於LuminexTM的Millipore小鼠22-plex套組分析。
實例1、產生大鼠抗小鼠ST2L抗體
以小鼠ST2-Fc(R&D systems(SEQ ID NO：5之Ser27-Ser342)經腹腔內使大鼠免疫，並評估特異性IgG力價。一旦得到足夠的力價，分離脾細胞並與FO細胞融合。將生成的融合瘤塗佈於96孔盤或甲基纖維素並培養10天。利用標準捕捉ELISA鑑別與mST2-Fc結合的抗原特異性選殖株，並單獨對Fc蛋白質交叉篩選。鼠ST2特異性融合瘤係進一步於ELISA測試抑制IL-33結合至ST2，以及測試抑制IL-33誘發的D10.G4.1小鼠Th2細胞增生。融合瘤在抗體-配體結合與基於細胞的增生分析兩者中呈現中和係藉由限制稀釋選殖株性選擇。定序融合瘤V 區並選殖入小鼠IgG1背景。ST2L-ECD域特異性係藉由標準免疫吸附分析以電化學發光偵測利用各種人類-小鼠域交換建構物來處理。
由融合瘤C1999分泌的抗體係選殖入小鼠IgG1背景並命名為CNTO3914。CNTO3914可變區與CDRs的序列係顯示於表2。CNTO3914不會與人類ST2L交叉反應及與小鼠ST2L-ECD之域I結合。
實例2、產生小鼠抗人類ST2L抗體
以兩種不同的免疫法來產生小鼠抗人類ST2單株抗體。
以ST2-Fc(R&D systems，SEQ ID NO：157)經腹腔內使BALB/c免疫，並評估特異性IgG力價。一旦得到足夠的力價，分離脾細胞並與FO細胞融合。將生成的融合瘤塗佈於96孔盤並培養10天。利用標準捕捉ELISA鑑別與C端His6標記的huST2L-ECD結合以及對His6標記的馬來猴ST2L-ECD交叉反應的抗原特異性選殖株。與馬來猴ST2L交叉反應的人類ST2L特異性融合瘤係進一步於ELISA分析測試抑制IL-33結合至huST2L，以及於報導基因分析中測試抑制NF-κB活化。選出於報導基因分析中或是於ELISA及報導基因分析兩者中抑制的選殖株供進一步研究。
來自融合瘤C2494、C2519A及C2521A的抗體被選出供進一步分析。C2519A及C2521A與人類ST2L結合在域III，且C2494與人類ST2L結合在域I。抗體C2494被選殖入人類IgG2背景，且該全長抗體被命名為STLM62。
抗人類ST2L單株抗體係在Gcnovac Gmbh藉由專屬DNA免疫作用技術，利用全長ST2L建構物並以被轉染以表現人類ST2L-ECD的細胞補強(boosting)來產生。藉由流動式細胞測量術篩選與人類ST2L-ECD結合的融合瘤。確認在此分析中呈現結合的選殖株與hST2L-ECD結合，並進一步藉由標準捕捉ELISA分析進行與馬來猴ST2L-ECD結合的特性分析。選擇的選殖株係以受體-配體結合抑制ELISA 及報導基因分析進行特性分析。選出於報導基因分析中或是於ELISA及報導基因分析兩者中抑制的選殖株供進一步研究。
選擇來自Gcnovac融合瘤C2244的抗體供進一步分析，並選殖入人類IgG2背景。全長的抗體係命名為STLM15。STLM15與人類ST2L結合在域I。
小鼠抗人類抗體之VH、VL及CDR域的序列係顯示於表3。
實例3、產生完全人類ST2L抗體
人類ST2L結合Fabs係選自從新pIX噬菌體呈現技術基因庫，如Shi et al.,J Mol Biol 397：385-96,2010；國際專利公開號WO2009/085462；美國專利公開號US2010/0021477)所述。簡言之，藉由多樣化人類骨架產生基因庫，其中VH胚源基因IGHV1-69*01、 IGHV3-23*01及IGHV5-51*01係與人類IGHJ-4袖珍基因透過H3環重組，且人類VLkappa胚源基因O12(IGKV1-39*01)、L6(IGKV3-11*01)、A27(IGKV3-20*01)及B3(IGKV4-1*01)係與IGKJ-1袖珍基因重組以組合完整VH及VL域。選擇H1、H2、L1、L2及L3環附近的重鏈及輕鏈可變區中位置裡對應於確認為與蛋白質及胜肽抗原頻繁接觸的位置用以多樣化。選擇的位置之序列多樣性係限制於發生在IGHV或IGLV基因個別之IGHV或IGLV胚源基因家族中各個位置的殘基。利用長度為7-14個胺基酸之短到中尺寸的合成環產生在H3環的多樣性。設計在H3的胺基酸取代以模擬人類抗體中觀察到的胺基酸變異。基因庫設計詳細說明於Shi et al.,J Mol Biol 397：385-96,2010。用來產生基因庫的骨架係根據其人類VH及VL胚源基因來源命名。將三個重鏈基因庫與四個胚源輕鏈或胚源輕鏈基因庫合併以產生24個獨特的VH：VL組合用以篩選。24個VH：VL基因庫組合皆用於對huST2L-ECD-Fc的噬菌體淘選實驗。
利用huST2L-ECD(SEQ ID NO：1之殘基19-328)的Fc融合淘選基因庫。以2種不同形式：溶液中抗原(Ag)以及呈現的Ag完成淘選。對於溶液中Ag，塗覆卵白素的磁珠係以含3%脫脂奶粉的PBS阻隔。將具有10x較高濃度的人類Fc蛋白質之生物素標記(Bt)抗原huST2L-ECD人類Fc融合(Bt-huST2L-ECD-Fc)作為競爭者與Fab-pIX噬菌體基因庫混合。將結合至Bt-huST2L-ECD-Fc之Fab-pIX噬菌體捕捉於經阻隔的卵白素(SA)塗覆的磁珠上。進行三輪噬菌體選擇，其中huST2L-ECD-Fc濃度從第1輪至第3輪分別改變為100nM、10nM、10nM。對於Ag呈現，將Bt-huST2L-ECD-Fc塗覆於經SA塗覆的磁珠上。同時加入Fab-pIX噬菌體基因庫加上10x過量的人類Fc蛋白質至Bt-huST2L-ECD-Fc呈現的SA磁珠。第1輪至第3輪所使用的Bt-Ag濃 度分別為100nM、10nM、10nM。兩種淘選形式皆藉由ELISA使Fab結合至huST2L-ECD-Fc蛋白質來完成篩選。由這些選擇分離出總共79個結合至hST2L-Fc的Fabs。藉由排序ELISA(ranking ELISA)測定具有整體最佳結合活性的Fab HuT2SU-39。
a.總共32個Fabs顯示抑制IL-33結合至huST2L-ECD-Fc。自pIX從新競爭選擇46個Fabs用於親和力成熟。
實例4、完全人類ST2L抗體之親和力成熟
選擇抗體係利用於Shi et al.,J Mol Biol 397：385-96,2010及WO09085462A1中描述的「沿線(in-line)」成熟過程以親和力成熟。此技術中，將於第一選擇所得到的Fab選殖株的VH區與對應的VL骨架之基因庫合併。將來自實例3所確認的46個Fabs的所有VH基因選殖入適當的VL成熟基因庫作為根據其VL基因家族的庫。使用的VL骨架基因庫及其多樣化方案係顯示於表4。人類VL骨架如下所示：IGKV1-39*01(O12)、IGKV3-11(L6)、IGKV3-20(A27)、IGKV4-1*01(B3)，且係描述於美國專利公開號US2012/0108795的實例。對於親和力成熟淘選，先將噬菌體基因庫加入Bt-huST2-ECD-Fc。培養後，將成熟基因庫噬菌體/Bt-hST2L-ECD-Fc複合物加入SA塗覆的磁珠。Bt-huST2-Fc濃度自R1至R3分別改變為10nM、1nM及0.1nM。在10nM未標定的huST2L-ECD-Fc存在下，於室溫下將第3輪的最後沖洗進行隔夜以進一步驅動親和力改善。
由成熟淘選得到總共161個序列獨特的Fabs。將顯示與huST2L-ECD最高結合的Fabs轉換成IgG供進一步特性分析。
選擇單株抗體ST2M48、ST2M49、ST2M50及ST2M51供進一步特徵分析，且其VH、VL及CDR序列係顯示於表5。單株抗體ST2M48、ST2M49、ST2M50及ST2M51與人類ST2L結合在域III，且與小鼠ST2L交叉反應。
實例5、抗ST2L抗體之特性分析。
衍生自上述各種競爭的抗體係進一步對於其阻斷IL-33/ST2L交互作用的能力、其抑制如NF-κB報導基因分析所測量的IL-33誘發的訊息傳遞、抗體抑制肥大細胞反應的能力、其對人類及馬來猴ST2L的親和力以及與小鼠ST2L的交叉反應進行特性分析。利用如材料與方法所述的人類/小鼠ST2L域交換嵌合建構物完成抗原決定區圖譜比對。實驗的結果係顯示於表6、7及8。表7及8中，「+」表示抗體阻斷IL-33/ST2L交互作用，而「-」表示其未阻斷IL-33/ST2L交互作用。由於缺乏對人類的交互作用，CNTO3914的實驗係利用小鼠細胞及試劑完成。其他所有抗體的分析中則使用人類細胞及人類試劑。
經特性分析的抗體係分組為阻斷IL-33/ST2L交互作用(單株抗體STLM15、STLM62及CNTO3914)以及未阻斷IL-33/ST2L交互作用(單株抗體C2519、C2521、ST2M48、ST2M49、ST2M50及ST2M51)。該些阻斷IL-33/ST2L交互作用的抗體與ST2L域I結合，而該些非阻斷抗體與ST2L域III結合。該些測試的抗體抑制ST2L下游訊息傳遞，其係如NF-κB報導基因分析以及由KU812人類嗜鹼性球細胞株所釋放的IL-33誘發的細胞介素所評估，或者在CNTO3914的情況下，由小鼠Th2細胞增生所評估。如細胞介素與趨化激素分泌所評估，當與結合ST2L域III的抗ST2L抗體比較，結合至ST2L域I的抗體在較高濃度抑制人類肥大 細胞反應。CNTO3914，其結合小鼠ST2L域I且不與人類交叉反應，亦能抑制IL-33誘發的小鼠肥大細胞反應。
實例7、ST2L域I結合抗體CNTO3914抑制鼻內IL-33誘發的呼吸道過度反應(AHR)、呼吸道發炎及小鼠肥大細胞反應。
連續四天施予雌BALB/c小鼠鼻內劑量為2μg/小鼠「成熟」IL-33(R&D systems)(SEQ ID NO：215之殘基109-266)。在初次IL-33經鼻施予前24小時，抗小鼠ST2L抗體CNTO3914係以20mg/kg(或2mg/kg或0.2mg/kg)經皮下注射預防性給藥。控制組小鼠則在第一次經鼻施予IL-33前24小時接受同型控制組CNTO5516或PBS。對增加甲基膽鹼劑量的呼吸道過度反應(AHR)係利用強制策略與Flexivent系統(Scireq,Montreal,Quebec,Canada)測量。對於呼吸道過度反應(AHR)的測量，將小鼠以100mg/kg戊巴比妥與13mg/kg苯妥英(phenytoin)麻醉並在連接至FlexiVent前切開氣管。小鼠係以鹽水噴霧作為基線讀值，接著以兩種劑量(10及20mg/mL)之甲基膽鹼噴霧。對於鹽水及各個甲基膽鹼之劑量，利用「快照(snapshot)」微擾收集阻抗(R)值約2分鐘。僅利用該些COD(決定係數)0.9以上的值計算阻抗峰值。
處理一獨立組的小鼠並分析肺中細胞反應。最後mIL-33同型或PBS施予二十四小時後，藉由過量的Sleepaway® I.P.犧牲小鼠。將小鼠的肺以0.7 mls的冷PBS與0.1% BSA灌洗。產生的支氣管肺泡(BAL)液體係以1200-rpm離心10分鐘，並將無細胞上清液儲存在-80 ℃直到分析細胞介素/趨化激素。BAL樣本係使用血球計用於總計數。對於分類BAL計數，以瑞氏吉姆薩(wright giemsa)染色後在光學顯微鏡下自細胞離心塗片(cytospin smear)計算~200個細胞。
收集無細胞上清液並儲存在-80℃直到用於Luminex蛋白質分析。移除肺組織，接著利用5 mls冷的無菌PBS經右心室灌注直到適當的灌注量。接著將肺葉置於一含1ml之PBS+蛋白酶抑制劑的Fast Prep®試管，且冷凍並儲存在-80℃供細胞介素/趨化激素分析。細胞介素/趨化激素複合分析係依據Murine Millipore 22-plex的製造商的實驗指南進行。BAL液中的小鼠肥大細胞蛋白酶-1(mMCP-1)係藉由ELISA(Moredun Scientific)分析。
呼吸道過度反應
在經鼻施予IL-33所誘發的肺發炎模式中，CNTO3914顯著地抑制呼吸道過度反應(圖1)。在四天連續經鼻施予2μg/小鼠mIL-33的24小時前，經皮下注射施予CNTO3914。如Flexivent所測定的呼吸道阻抗峰值在20mg/kg之CNTO3914劑量顯著降低。各長條代表每組三(CNTO5516，同型控制組抗體)至六隻小鼠的平均值±SEM。該些結果已被重複於在兩個獨立的研究中。利用雙向ANOVA與Bonferroni後測試測定顯著性，CNTO3914/IL-33 **p<0.05與CNTO5516/IL-33對照；及***p<0.001，與PBS與IL-33處理組對照。
呼吸道發炎
在使用的模式中，CNTO3914顯著地抑制支氣管肺泡灌洗(BAL)細胞聚集(圖2)。在四天連續經鼻施予2mg/小鼠mIL-33的24 小時前，經皮下施予CNTO3914。BAL白血球係隨IL-33施予而顯著增加，且顯著地被20mg/kg之CNTO3914抑制。各長條代表每組三(CNTO5516，同型控制組抗體)至六隻小鼠的平均值±SEM。該些結果已被重複於兩個獨立的研究中。利用雙向ANOVA與Bonferroni後測試測定顯著性，***p<0.001。
肥大細胞體內反應
肥大細胞會儲存包括中性蛋白酶與凝乳酶的蛋白酶於其顆粒中，該些顆粒在肥大細胞活化後快速釋放。小鼠肥大細胞蛋白酶1(mMCP-1)為一種由活化的肥大細胞所釋放的β凝乳酶，且已知對寄生蟲感染的控制很重要(Knight et al.,J Exp Med 192：1849-56,2000；Huntley et al.,Parasite Immunol 12：85-95,1990)。mMCP-1之測量可被用作肥大細胞活化的標記，且已被證明可在呼吸道發炎的肥大細胞依賴性模式中被誘發：塵蟎(Yu and Chen,J Immunol 171：3808-15,2003)。如ELISA(Moredun Scientific)所測定的MMCP-1係於來自IL-33施予的小鼠之BAL液中顯著增加，且被CNTO3914劑量依賴性抑制(圖3)。利用單向ANOVA與Tukey後測試決定顯著性，**p<0.01，***p<0.001，與IL-33處理對照。
實例8抗ST2L域I結合抗體體外抑制肥大細胞反應。
肥大細胞反應係藉由小鼠及人類肥大細胞釋放的趨化激素及細胞介素以及人類肥大細胞中的前列腺素D2評估。
抗ST2L域I結合抗體CNTO3914抑制由小鼠骨髓衍生的肥大細胞釋放之IL-33誘發的細胞介素，包括GM-CSF(圖4A)、IL-5(圖4B)及TNFα(圖4C)。
抗人類ST2L域I結合單株抗體C2494(STLM62)抑制在抗體濃度為2、10及50μg/ml下，由3ng/ml IL-33誘發的人類臍帶血衍生的肥大細胞所釋放之IL-33誘發的PGD2(圖5)。
抗ST2L域I結合抗體C2494及C2244抑制在抗體濃度為50μg/ml、10μg/ml及2μg/ml下，由人類臍帶血衍生的肥大細胞所釋放之IL-33誘發的GM-CSF、IL-5、IL-8、IL-13及IL-10(圖6及8A-8E)。抑制的程度取決於所測量的細胞介素/趨化激素、所測試的抗體及抗體濃度及所使用的培養基。所有在抗體濃度為2μg/ml進行的分析所計算的平均抑制百分比(%)介於50.6-100%，而在抗體濃度為50μg/ml的抑制百分比介於62-100%(圖9)。
抗ST2L域III結合抗體C2521、C2519、ST2M48、ST2M49、ST2M50及ST2M51在抗體濃度為50μg/ml及10μg/ml下顯示對由肥大細胞釋放之IL-33誘發的細胞介素不太抑制或無抑制，或是不太刺激或無刺激由肥大細胞釋放之IL-33誘發的細胞介素(圖7A-7E及8A-8E)。抑制的程度取決於所測量的細胞介素/趨化激素、所測試的抗體及所使用的培養基。所有在抗體濃度為2μg/ml進行的分析所計算的平均抑制百分比(%)介於-594.4-31.9%，而在抗體濃度為50μg/ml的抑制百分比介於-481.5-36%(圖9)。在一些分析中，抗體ST2M50在抗體濃度為10μg/ml抑制GM-CSF、IL-5、IL-10及IL-13分泌(圖8A-8E)。
平均抑制%係使用下式計算：(1-(單株抗體存在下所釋放之細胞介素的濃度)/(單株抗體不存在下回應IL-33所釋放之相同細胞介素的濃度))×100。細胞介素濃度以pg/ml表示。在一些情況中，抑制%為負值，表示單株抗體存在下細胞介素釋放確實高於單株抗體不存在所釋放。單株抗體的效力可能依據誘發肥大細胞中細胞介素釋放所用的IL-33濃度而有 細微變化。同樣地，單株抗體的活性可能依據所用的分析培養基(StemPro-34與RPMI/10% FCS)而有細微變化。所有測試的ST2L域I結合抗體在抗體濃度為2μg/ml、10μg/ml或50μg/ml抑制所有測量的細胞介素與趨化激素至少50%，如平均抑制%所測量。
實例9 ST2L域I結合抗體抑制鼻內IL-33誘發呼吸道重塑。
C57BL/6小鼠係以1μg/小鼠「成熟」IL-33(或PBS)(SEQ ID NO：215之殘基109-266)在天數D1、D3、D5、D7及D9經鼻內施予，且在第10天或20天分析肺臟。抗小鼠ST2L抗體CNTO3914或同型控制組(CNTO5516)係在首次IL-33經鼻施予的6小時前以2mg/kg經皮下施予。控制組小鼠則在初次IL-33經鼻施予前6小時接受同型控制組CNTO5516或PBS。充氣的肺臟係以10%經緩衝的福馬林固定供組織學分析；用於分析的染色法包括H&E、馬生三色(Masson Trichrome)及PAS。
IL-33處理誘發中度至明顯的小支氣管上皮肥大及增生，其具有杯狀細胞增生及主要與嗜酸性球混合的周圍小支氣管滲出液。小支氣管上皮肥大及增生在接受CNTO3914的動物中不明顯。馬生三色(Masson Trichome)染色法係用來測定呈現的膠原蛋白的量；此染色法呈現IL-33處理的動物中之杯狀細胞肥大。在以CNTO3914處理的動物中，肺泡及周圍小支氣管區域滲出液不存在。
實例10產生完全人類ST2L抗體
其他人類ST2L結合Fabs係選自從新pIX噬菌體呈現技術基因庫，其基本上如實例3所述，惟該基因庫係利用嵌合HHM-ST2L建構物(SEQ ID NO：6，表1)與捕捉於卵白素塗覆的磁珠之生物素標記抗 原淘選。該噬菌體基因庫係以含3%脫脂奶粉的PBS-T阻隔。將競爭者蛋白質MHM-ST2L嵌合物(SEQ ID NO：7，表1)加入阻隔溶液以驅動噬菌體選擇朝向會特異性結合至人類ST2L域I胺基酸序列的Fabs。進行三輪噬菌體選擇，接著藉由ELISA篩選出結合至hST2L-Fc蛋白質的Fab。
十九個結合至hST2L-Fc的Fabs係分離自該些選擇，且進一步篩選出結合至嵌合ST2L建構物(表1)以及至小鼠ST2L與人類ST2L蛋白質以圖譜比對特異性的域，並分析其阻斷IL-33/hST2L交互作用的能力之特性。Fabs ST2F1、ST2F4及ST2F6阻斷hIL-33/ST2L交互作用並結合ST2L之域I，且前移至親和力成熟。
實例11人類ST2L結合Fabs之親和力成熟
ST2F1、ST2F4及ST2F6係利用於Shi et al.,j Mol Biol 397：385-396,2010及國際專利公開號WO2009/085462及實例4中描述的「沿線(in-line)」成熟過程進行親和力成熟。ST2F1、ST2F4及ST2F6的親和力成熟基因庫係藉由多樣化對應的輕鏈基因庫，分別為B3、L6及L6，並將該些基因庫與Fab VH區合併而製成。用於L6及B3親和力成熟基因庫的輕鏈殘基的多樣化方案係顯示於表10。位置編號係根據Kabat。對於親和力成熟淘選，在濃度為第1輪10nM、第2輪1nM及第3輪0.1nM時，生物素標記的huST2-ECD-Fc係捕捉於卵白素(SA)塗覆的磁珠。第3輪的最後沖洗係在10nM未標定的huST2L-ECD-Fc存在下於室溫進行隔夜。
ST2F6輕鏈成熟基因庫選擇產出改善的結合物(ST2F14、ST2F17、ST2F31及ST2F41)(圖10及圖11)。該些係如Fabs利用ProteOn檢驗並表現適當的親和力改善由2nM至400pM。
為了進一步改善ST2F14、ST2F17、ST2F31及ST2F41的親和力，ST2F14、ST2F17、ST2F31及ST2F41中常見的重鏈ST2H41係利用表11所示的多樣化方案在HCDR1及HCDR2 Kabat位置31、32、33、35、50、52、53、56及58隨機化。產生的重鏈基因庫係與四個親和力改善的輕鏈ST2L32、ST2L35、ST2L49及ST2L59配對，且此基因庫係如輕鏈成熟基因庫所述淘選與篩選。分離出相對於ST2F14具有改善結合的Fabs並轉換成IgG供進一步特性分析。產生的抗體(STLM103、STLM107、STLM108、STLM123、STLM124、STLM206、STLM207、STLM208、STLM209、STLM210、STLM211、STLM212、STLM213、STLM214、STLM215、STLM216、STLM217、STLM218、STLM219、STLM220、STLM221、STLM222)(圖10及圖11)具有衍生自VH3-23或Vκ-L6的框架。所有抗體結合ST2L域I並阻斷IL-33/ST2L交互作用。
設計並表現STLM208 VH ST2L257的其他變異體以在HCDR3的起始取代DP模體(motif)。變異體的序列係顯示於圖12。
實例11 C2494之人類框架適應(HFA)
框架適應過程係如基本上描述於美國專利公開號US2009/0118127及Fransson et al.,J Mol Biol 398：214-231,2010的方式完成。簡言之，重鏈及輕鏈序列係與人類胚源序列(僅如2007年10月1日之「01」等位基因)比較，該比較利用對IMGT資料庫(Kaas,et al.,Nucl.Acids.Res.32,D208-D210,2004；Lefranc et al.,Nucl.Acid Res.,33,D593-D597,2005)BLAST搜尋。由此組人類胚源基因中移除冗餘基因(在胺基酸層次100%相同)及該些具有未配對半胱胺酸殘基的基因。在框架及CDR區兩者中選擇其餘最接近符合人類胚源基因作為受體人類框架。根據整體序列同源性與CDR長度以及CDR相似性選擇總共9個VL及7個VH胚源人類框架。FR-4係根據IGHJ/IGJK胚源基因之序列相似性選擇，JK2用於VL鏈且JH1用於VH鏈(Kaas,et al.,Nucl.Acid Res.32,D208-D210,2004；Lefranc M.-P et al.,Nucl.Acid Rcs.,33,D593-D597,2005)具有C2494序列)。然後，將C2494之CDRs(圖14中底線處)轉移至該選擇的受體人類框架以產生HFA變異體，除了在對應於VH之CDR-H1的區之外。對於該區，將CDR及HV的組合，或一較短的HCDR2(稱為Kabat-7，見美國專利公開號US2009/0118127)由非人類抗體轉移至人類FRs，因為圖14中灰底標示的HCDR2殘基尚未被發現與已知結構的抗原-抗體複合物接觸(Almagro,J Mol Rccognit.17,132,2004)。
C2494之成熟蛋白質序列(VL：SEQ ID NO：52；VH：SEQ ID NO：48)係顯示於圖14。在該圖中，CDR殘基(Kabat)係以底線表示，Chothia HV環表示下方CDRs，且將殘基轉移至HVs(HFA)之下表示之選擇的人類框架。所有變異體中皆未轉移灰底標示的HCDR2殘基。
利用MOE(CCG,Montreal)之抗體模式化模組建構一種C2494之Fv片段的3D同源模式。該模式用於評估可發展性傾向(developability liabilities)，如暴露的甲硫胺酸及色胺酸殘基、可能的N-糖化作用及脫醯胺作用模體。在LCDR3中，根據Fv結構模式，有一可能暴露的Met(M94)殘基。為了將其移除，產生一具有M94L突變的變異體(STLL280，O12b)並進行特性分析。對於重鏈，僅在HCDR3前的CAR模體(Chothia殘基92-94，圖14)中的R殘基可能對一帶負電荷殘基的群集(Chothia殘基D31、D32、D96及D101a，圖14)(該些帶負電荷殘基可能對結合很重要)造成負面影響。產生一在Chothia殘基94(CAR→CAL)具有精胺酸取代亮胺酸的VH並進行特性分析。
結合設計的重鏈及輕鏈的單株抗體與C2494母體一起被表現並分析其結合至人類ST2L的能力。由產生的HFA單株抗體中，具有帶有IGHV1-24*01(SEQ ID NO：148)的VH鏈及IGHV1-f*01(SEQ ID NO：149)重鏈框架(STLH195及STLH194)的單株抗體表現抗體較佳，且當與各種具有IGKV3-15*01(L2)(SEQ ID NO：150)、IGKV1-9*01(L8)(SEQ ID NO：151)、IGKV1-5*01(L12)(SEQ ID NO：152)、IGKV1-12*01(L5)(SEQ ID NO：153)、IGKV1-39*01(O12)(SEQ ID NO：154)、IGKV1-27*01(A20)(SEQ ID NO：155)或IGKV1-33*01(O18)(SEQ ID NO：156)框架(STLL280、STLL278、STLL277、STLL276、STLL275、STLL274、STLL273、STLL272)的HFA輕鏈結合時結合ST2L。
HFA VH及VL變異體之序列係顯示於表12。轉移的殘基係以底線表示，且上述其他的取代以灰底標示。表13顯示SEQ ID NOs：以及各個HFA VH及VL獨特的pDR(質體)與CBIS ID。被選擇供進一步特性分析之所產生的單株抗體之重鏈及輕鏈組合係顯示於表14。
表15顯示用於轉移C2494 CDRs的人類框架(結合V及J區)。
表12
框架適應性VL鏈(耦合至JK2序列)。CDRs以底線表示。
>VL2494(母體)(SEQ ID NO：52)
>VL2494-IGKV1-33*01 O18(SEQ ID NO：135)
>VL2494-IGKV1-27*01 A20(SEQ ID NO：136)
>VL2494-IGKV1-39*01O12(SEQ ID NO：137)
>VL2494-IGKV1-12*01 L5(SEQ ID NO：138)
>VL2494-IGKV1-5*01 L12(SEQ ID NO：139)
>VL2494-IGKV1-9*01 L8(SEQ ID NO：140)
>VL2494-IGKV3-15*01 L2(SEQ ID NO：141)
>VL2494-IGKV1-39*01 O12b(SEQ ID NO：142)
框架適應性VH鏈耦合至JH1。
>VH2494(母體)(SEQ ID NO：48)
>VH2494-IGHV1-f*01(SEQ ID NO：143)
>VH2494-IGHV1-24*01(SEQ ID NO：144)
實例12抗體決定位(paratope)掃描之丙胺酸及人類胚源突變體之設計
進行定點突變(Site-directed mutagenesis)以評估個別CDR殘基對結合的貢獻以及一些對其他抗體特性具有潛在影響的殘基。根據上述C2494 Fv之分子模型，一溶劑暴露的CDR殘基之子集被預測為涉及結合抗原。這些殘基被突變成丙胺酸及/或對應的「類人類」殘基，其為最接近符合的胚源基因中對應的殘基。C2494 VH中之D101aA(Chothia殘基)(SEQ ID NO：48中的D104A)取代降低koff約4倍，由1.43×10-4至3.2×10-5。
當D101aA取代降低C2494 Fab結合至ST2L之koff時，可預期相同突變亦可改善C2494 HFA突變體中的脫附速率。因此，D101aA (Chothia編號)被併入STLH194之VH(>VH2494-IGHV1-f*01，SEQ ID NO：143)以產生一VH STLH201(SEQ ID NO：145)。STLH201係與7個輕鏈STLL280、STLL277、STLL276、STLL275、STLL274、STLL273及STLL272(表13及表14)配對以產生單株抗體STLM226、STLM227、STLM228、STLM229、STLM230、STLM231及STLM232，其係進一步特性分析。相較於母體C2494抗體及一不同的HCDR3(SEQ ID NO：146，GDFYAMAY)，單株抗體STLM226、STLM227、STLM228、STLM229、STLM230、STLM231及STLM232因此具有相同LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1及HCDR2序列。此外，抗體STLM266 VL STLM280具有一獨特的LCDR3：LQSDNLLT(SEQ ID NO：147)
STLH201(SEQ ID NO：145)：
HCDR3併入D101aA(Chothia編號)取代：SEQ ID NO：146：GDFYAMAY抗體STLM266 VL STLM280具有一獨特的LCDR3：LQSDNLLT(SEQ ID NO：147)
實例13抗ST2L抗體之特性分析
由噬菌體呈現技術、融合瘤及人類框架適應競爭獲得的抗體係於各種分析中進行特性分析，該些分析包括結合至huST2L-ECD、cynoST2L-ECD、親和力測量、結合至人類/小鼠嵌合物以測定域結合、受體-配體抑制分析、報導基因分析及肥大細胞反應分析。
由噬菌體呈現技術衍生的抗體對人類與馬來猴ST2L的親和力以及其對人類ST2L的結合特異性係顯示於表16。表16中所有抗體結合人類ST2L之域I。
由與母體(STLM62、C2494)有關的HFA競爭衍生的抗ST2L抗體之親和力係顯示於表17。親和力係藉由ProteOn分析。實驗係在25℃下進行，利用ProteOn的PBS-T-E緩衝液(PBS，0.005%P20及3mM EDTA)作為電泳緩衝液。為了進行實驗，藉由共價固定山羊抗人類Fc(~5800 RUs)製備GLC感測器晶片，122-146反應單位(RU)的單株抗體被捕捉。單株抗體捕捉後接著由濃度0.024-15nM(5倍稀釋)注射ST2L-ECD 4分鐘(200μL以50μL/min)。於所有反應監測解離30分鐘。再生係利用兩個10mM甘胺酸(pH1.5)之15秒脈衝進行。數據係適配於1：1具有基準線的漂移模式。
樣本的結合速率為快，具有質量轉移模式的朗繆爾(langmuir)係用於曲線適插法及預測親和力。所有樣本具有比母體選植株及控制組單株抗體更快的脫附速率。與母體抗體比較時，脫附速率的差異為HFA變異體之較低親和力的主要原因。
表17
測試選擇的抗體之肥大細胞反應，測量自人類臍帶血衍生的肥大細胞釋放之3ng/ml IL-33誘發IL-5、IL-13及IL-8之抑制，如所述利用100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml或0.01μg/ml抗體於RPMI +10% FCS。在該些分析條件中，與以IL-33誘發的控制組樣本比較時，在抗體濃度100μg/ml下，所有測試的抗體抑制IL-33誘發的IL-5、IL-13及IL-8細胞介素釋放約40%-100%。
實例14抗ST2L抗體抑制人類嗜鹼性球中下游訊息傳遞路徑
測試抗ST2L抗體其抑制人類嗜鹼性球中p38 MAPK訊息傳遞的能力。
將全血收集於肝素處理的試管中，並在分析起始之前移至室溫(RT)。1mL之血液係等分至50mL錐形管，且加入稀釋於PBS的抗ST2L抗體(STLB252)或同型控制組(CNTO 8937)使最終濃度為2、20或200μg/mL。輕輕渦漩試管以混合並置於培養箱在37℃×30分鐘，在15分鐘後輕輕渦漩。接著將血液以螢光染料標記抗體對細胞表面抗原染色(CD123-FITC、CRTH2-PCP-CY5.5及CD45-APC-C7)，並將試管在37℃培養15分鐘。在加入稀釋於溫培養基的IL-33之前，將1mL之溫的培養基(RPMI-1640/10% FBS/1%青黴素-鏈黴素)加入各個試管使最終濃度為10ng/mL。在將20mL之預溫的BD Phosflow溶解/固定緩衝液加入各個試管之前，將樣本培養在37℃×10分鐘，以同時溶解紅血球細胞並固定該樣本。藉由翻轉10次將試管均勻混合，並培養在37℃×10分鐘。樣本以20 mLs無菌RT PBS沖洗，再懸浮於2 mLs之1x RT BD Perm/Wash緩衝液，並培養在RT×30分鐘。樣本以2 mLs BD Perm/Wash緩衝液清洗一次，接著再懸浮於400μL BD Perm/Wash緩衝液。加入對細胞內p38-MAPK(vCell Signaling，Cat.6908S)之PE-標定抗體，且將樣本在RT培養30分鐘，避光處理。再懸浮於100μL FACS緩衝液之前，將樣本以5 mLs Perm/Wash緩衝液沖洗一次，並轉移至96孔圓底培養盤。使用 BD LSRII流式細胞儀利用高通量系統(HTS)對各樣本儘可能地收集更多的事件來分析樣本。使用FloJo軟體分析數據。嗜鹼性球係如CD45+CRTH2+CD123+確認，且評估各條件下p38 MAPK陽性嗜鹼性球之百分比。以抗ST2L單株抗體(STLB252)預培養全血造成IL-33誘發的p38-MAPK磷酸化之劑量依賴性抑制，而以同型控制組(CNTO 8937)培養則未見效果。抗人類ST2L抗體特異性地阻斷藉由全血中重組人類IL-33引起之嗜鹼性球活化。結果顯示抗ST2L抗體抑制劑藉由體內內生性IL-33的訊息傳遞。
實例15體內抗ST2L抗體與目標作用 BAL細胞聚集之鼻內mIL-336小時體內模式
施予單劑1.2μg/小鼠mIL-33(R&D systems #3626-ML/CF)或PBS至雄Balb/c小鼠(6-8週齡，Taconic)。在首次mIL-33經鼻施予的24小時前，大鼠抗小鼠ST2L抗體CNTO 3914或為2、0.2、0.06或0.02 mg/kg。同型控制組(ITC)單株抗體CNTO 5516係以2mg/kg經皮下施予。mIL-33(或PBS)施予六小時後，將小鼠犧牲並收集血液供血清分析。藉由注射兩次體積為0.7mL之PBS/0.1% BSA至肺臟並擷取流出物進行支氣管肺泡灌洗(BAL)。將BALs離心(1200rpm，10分鐘)且將細胞沉澱物再懸浮於總共200μl PBS使用血球計(以瑞氏吉姆薩(Wright’s-Giemsa)染色細胞離心製備)進行總細胞計數或分類細胞計數。
小鼠血清中CNTO 3914測量
將MSD SA-STD培養盤以每孔50μL之分析緩衝液阻隔5分鐘。將培養盤倒置以移除分析緩衝液，並於紙巾上輕敲。每孔加入50μl之分析緩衝液中的1.4μg/mL生物素標記重組小鼠ST2L/IL1R4/Fc嵌合物(R&D System)並在冷藏室中培養隔夜。加入150μL之分析緩衝液至每個預塗覆培養盤的盤孔而不移除該塗覆試劑，並培養30分鐘。將培養盤以沖洗緩衝液於培養盤沖洗器上沖洗三次。於紙巾上輕輕敲培養盤以移除殘留的沖洗緩衝液。每孔加入50μL之CNTO 3914樣本至該培養盤每一盤孔。將培養盤在環境溫度下緩緩震盪培養一小時。將培養盤以沖洗緩衝液於培養盤沖洗器上沖洗三次。每孔加入50μL之釕標定的小鼠抗小鼠IgG1b(BD Biosciences)之滴定至該培養盤每一盤孔。將培養盤在環境溫度下緩緩震盪培養一小時。將培養盤以沖洗緩衝液於培養盤沖洗器上沖洗三次。加入150μL之讀取緩衝液至該培養盤每一盤孔。立刻將培養盤於MSD sector imager 6000分析儀上讀取發光值。
全血分析
血液1：4稀釋於DMEM培養基+1%青黴素+鏈黴素溶液+/- 10ng/ml小鼠IL-33於Sarstedt過濾試管中。將該試管在37℃培養隔夜，接著使用Millipore Milliplex小鼠細胞介素/趨化激素套組根據製造商說明測量上清液的細胞介素及趨化激素值。
結果
施予0.2或2mg/kg CNTO 3914的24小時後，小鼠血清中可檢測到抗ST2L抗體(圖16A)。
經鼻施予IL-33在6小時誘發細胞聚集至呼吸道(圖17B)。施予抗ST2L單株抗體降低BAL細胞聚集；0.2mg/kg為觀察到顯著抑制BAL細胞聚集所需的最小劑量(圖16B)。使用單向ANOVA計算統計顯著性。
以小鼠IL-33刺激全血顯示在24小時後，細胞介素及趨化激素的值增加，包括IL-6(圖16C)及MCP-1(圖17D)。在施予20mg/kg或2mg/kg抗ST2L單株抗體CNTO 3914的小鼠中，IL-6及MCP-1值相較於CNTO5516(同型控制抗小鼠IgG1)係降低，表示與目標作用。與全血分析中抑制相關的最小劑量2mg/kg，亦抑制BAL細胞聚集(圖16B)。
綜上所述，此數據確認抗ST2L單株抗體到達作用位置並達成預期的藥理作用(表示與目標作用)。
實例16抗ST2L抗體之抗原決定區
進行抗原決定區圖譜比對及競爭研究以選擇抗ST2L抗體。
競爭結合分析
進行競爭結合分析以評估抗ST2L單株抗體的不同結合抗原決定區群。將每孔5μl(10μg/ml)之ST2L-ECD蛋白質塗覆於MSD HighBind培養盤(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)在室溫持續2小時。將一百五十毫升之5% MSD Blocker A緩衝液(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)加入每一盤孔並在室溫培養2小時。以0.1M HEPES緩衝液(pH 7.4)沖洗培養盤三次，接著加入MSD螢光染劑(磺酸基標記，NHS酯)標定的個別抗ST2L抗體與不同競爭者的混合物。將10或30nM標定的抗體與濃度遞增的競爭者抗體(從1nM至2或5μM)一起培養，接著將25μL混合物加入指定的盤孔。在室溫緩緩搖晃培養2小時後，以0.1M HEPES緩衝液(pH 7.4)沖洗培養盤3次。MSD讀取緩衝液T係以蒸餾水稀釋(4倍)並以150μL/孔之體積分配，並利用SECTOR Imager 6000進行分析。
以下抗體係用於競爭分析中：ST2L域I結合中和抗體STLM208、STLM213、C2244(STLM15)及C2494(STLM62)、ST2L域III結合抗體C2539及一人類ST2L之非中和抗ST2L抗體C2240結合域I。圖17A及18B顯示該些競爭實驗。根據該實驗，確認的抗原決定區組別(bins)為：BinA：單株抗體C2244、C2494、STLM208或STLM213；BinB：單株抗體C2240，BinC：C2539。阻斷IL33/ST2L交互作用及抑制肥大細胞反應的抗體被發現在相同的抗原決定區組別(bin)且與彼此交叉競爭。競爭數據的概要係顯示於表20。
抗原決定區圖譜比對：H/D交換分析
對於H/D交換，用於分析抗體微擾的步驟係以與前述類似(Hamuro,Y.,et al.,Journal of Biomolecular Techniques,14：171-182,2003；Horn,J.R.,et al.,Biochemistry,45：8488-8498,2006)的步驟稍作修改。將重組ST2-ECD(由具有C端His標記的HEK293E所表現)(SEQ ID NO：157之殘基18-328)培養於含氘的水溶液持續預定的時間，造成在可交換的氫原子併入氘。該含氘的ST2-ECD被捕捉於包括固定抗ST2L C2244 Fab分子的管柱，接著以緩衝水溶液沖洗。自管柱中沖提出反向交換的(back-exchanged)ST2-ECD蛋白質，而含氘片段的定位係由蛋白酶分解及質譜分析測定。
圖18顯示與C2244 Fab複和之人類ST2-ECD(可溶性ST2)的簡化H/D交換圖。SEQ ID NO：119之ST2-ECD之殘基18-31(胺基酸殘基RCPRQGKPSYTVDW；SEQ ID NO：210)係由Fab(對應於SEQ ID NO：1之全長ST2L之殘基35-48)保護。該數據表示C2244結合至抗原決定區RCPRQGKPSYTVDW；SEQ ID NO：210)，以及與C2244(C2494、STLM208或STLM213)競爭的抗體傾向結合相同或重疊的抗原決定區。
以突變誘發進行抗原決定區圖譜比對
產生數個在ST2L域I具有對應的小鼠殘基取代的ST2L突變體。所測試的抗體不會與小鼠ST2L交叉反應，因此可預期結合能力被破壞或降低的ST2L變異體表示抗原決定區殘基在ST2L上的取代位置。使用標準方法將變異體製入具有SEQ ID NO：1之全長ST2L之殘基19-205的HH-ST2L建構物。利用ELISA或Proteon測試抗體結合至ST2L變異體。
表面電漿共振
使用ProteOn XPR36蛋白質交互作用陣列系統(Bio-Rad)(Bravman T,et al.Anal Biochem 358：281-288,2006)進行結合研究。抗人類/抗小鼠Fc混合物(Jackson ImmunoResearch，Cat#,109-005-098/115-005-071)係藉由胺耦合化學方式固定於GLC感測器晶片上。接著藉由流動於含0.5% Nonidet P-40及0.5%去氧膽酸鈉(Na-deoxycholate)之PBS中製備的抗體溶液(1μg/mL)捕捉個別抗ST2L單株抗體。表面中的訊號在抗Fc塗覆表面中達到~250共振單位(RU，1 RU=1 pg蛋白質/mm2)，確認該些抗體特異性捕捉抗ST2L單株抗體。在液體系統旋轉90°後，將ST2L-D1D2之野生型或變異體蛋白質(0.5mg/mL於含0.5% Nonidet P-40及0.5%去氧膽酸鈉(Na-deoxycholate)之PBS)注射於平行的流道中。所有該些分析皆在25℃進行。在該表面上之ST2L-D1D2依賴性訊號係藉由雙重參引、減去單獨於固定抗體的表面上所觀察到的反應以及單獨注射媒介物所觀察到的訊號而獲得(其容許校正結合獨立性反應)。產生的傳感圖係以最簡單的1：1交互作用模式(ProteOn分析軟體)適配以獲得對應的結合及解離速率常數(ka及kd)。
圖19顯示被製造的ST2L變異體以及ST2B206與ST2B252抗ST2L抗體對該些變異體之親和力。變異體93NL94(93TF94->93NL94取代)降低STLM208與STLB252兩者的結合親和力約5倍，從約10.8×10-12M至約49.5×10-12M。缺乏結合親和力顯著降低代表在抗體與ST2L-D1D2之間的交互作用的結合能為由H/D交換分析確認的抗原決定區(RCPRQGKPSYTVDW；SEQ ID NO：210)與來自此93NL94位置額外之貢獻的總和。殘基編號係根據SEQ ID NO：1之全長人類ST2L。
實例17 ST2L域I結合抗體抑制體外初代人類肺肥大細胞反應
ST2L域I結合抗體抑制肺肥大細胞反應的能力係藉由初代人類肺部肥大細胞中的趨化激素及細胞介素的釋放來評估。
分離初代人類肺部肥大細胞
初代人類肺部肥大細胞係分離自國際醫藥促進機構(International Institute for the Advancement of Medicine)取得的正常非吸煙者組織。藉由在37℃於膠原蛋白酶及玻尿酸酶酵素中切碎、沖洗及分解薄壁組織過夜使細胞自肺實質及小呼吸道分散。收集細胞、沖洗，並經富集步驟，使用來自MACS Miletnyi Biotec的CD117 MicroBead Kit(人類)由該族群中積極選擇肥大細胞。進行實驗之前，將肥大細胞於StemPro-34+200ng/ml幹細胞因子中培養6週。分離兩週後，使用流動式細胞測量術分析細胞表型特徵以測定肥大細胞純度百分比。用於後續分析的細胞係對CD117(C-kit或幹細胞因子受體)及Fc£RI(高親和力IgE受體)89%雙陽性。此外，其對ST2L為94.2%陽性；因而確認其肥大細胞表型。
來自初代人類肺部肥大細胞之細胞介素釋放分析
收集已培養於StemPro-34+200ng/ml幹細胞因子持續6週的初代人類肺部肥大細胞，並藉由於RPMI(10%熱失活的FCS)中離心來沖洗。細胞進行計數並以65,000個細胞的密度塗佈於96孔盤中的RPMI/10% FCS培養基。將抗ST2L域I結合單株抗體加入初代肺部肥大細胞，並在以IL-33刺激之前使其在37℃結合30分鐘。以3ng/ml IL-33刺激細胞24小時以引發各種媒介物累積於培養上清液中。收取培養上清液並冷凍儲存直到於慣用Milliplex 9-plex套組進行分析。
在抗體濃度為100μg/ml、10μg/ml及1μg/ml下，抗ST2L域I結合抗體(STLM208)抑制初代人類肺部肥大細胞中IL-33誘發的GM-CSF(圖20A)、IL-5(圖20B)、IL-8(圖20C)及IL-13(圖20D)釋放。使用臍帶血衍生的肥大細胞得到相似的結果(數據未呈現)。
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2F1 LCDR1
<400> 89
<210> 90
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2F6,ST2F4 LCDR2
<400> 90
<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2F1 LCDR2
<400> 91
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2F6 LCDR3
<400> 92
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2F4 LCDR3
<400> 93
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2F1 LCDR3
<400> 94
<210> 95
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H112,ST2H137 HCDR1
<400> 95
<210> 96
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H52 HCDR1
<400> 96
<210> 97
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H50,ST2H232,ST2H257,ST2H231 HCDR1
<400> 97
<210> 98
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H228 HCDR1
<400> 98
<210> 99
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H318 HCDR1
<400> 99
<210> 100
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H316 HCDR1
<400> 100
<210> 101
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H314 HCDR1
<400> 101
<210> 102
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H202 HCDR1
<400> 102
<210> 103
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H179,ST2H172,ST2H173 HCDR1
<400> 103
<210> 104
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H163 HCDR1
<400> 104
<210> 105
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H162 HCDR1
<400> 105
<210> 106
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H139 HCDR1
<400> 106
<210> 107
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H136 HCDR1
<400> 107
<210> 108
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H129 HCDR1
<400> 108
<210> 109
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H112 HCDR3
<400> 109
<210> 110
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H52 HCDR3
<400> 110
<210> 111
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H50 HCDR3
<400> 111
<210> 112
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H232 HCDR3
<400> 112
<210> 113
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H228 HCDR3
<400> 113
<210> 114
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H257 HCDR3
<400> 114
<210> 115
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H231 HCDR3
<400> 115
<210> 116
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H318 HCDR3
<400> 116
<210> 117
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H316 HCDR3
<400> 117
<210> 118
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H314 HCDR3
<400> 118
<210> 119
<211> 311
<212> PRT
<213> 人類
<400> 119
<210> 120
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H202 HCDR3
<400> 120
<210> 121
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H179 HCDR3
<400> 121
<210> 122
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H172 HCDR3
<400> 122
<210> 123
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H173 HCDR3
<400> 123
<210> 124
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H163 HCDR3
<400> 124
<210> 125
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H162 HCDR3
<400> 125
<210> 126
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H139 HCDR3
<400> 126
<210> 127
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H137 HCDR3
<400> 127
<210> 128
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H136 HCDR3
<400> 128
<210> 129
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2H129 HCDR3
<400> 129
<210> 130
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2L32 LCDR1
<400> 130
<210> 131
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2L32 LCDR3
<400> 131
<210> 132
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2L35 LCDR3
<400> 132
<210> 133
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2L49 LCDR3
<400> 133
<210> 134
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2L59 LCDR3
<400> 134
<210> 135
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL2494-IGKV1-33*01 O18
<400> 135
<210> 136
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL2494-IGKV1-27*01 A20
<400> 136
<210> 137
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL2494-IGKV1-39*01O12
<400> 137
<210> 138
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL2494-IGKV1-12*01 L5
<400> 138
<210> 139
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL2494-IGKV1-5*01 L12
<400> 139
<210> 140
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL2494-IGKV1-9*01 L8
<400> 140
<210> 141
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL2494-IGKV3-15*01 L2
<400> 141
<210> 142
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL2494-IGKV1-39*01 O12b
<400> 142
<210> 143
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2494-IGHV1-f*01
<400> 143
<210> 144
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH2494-IGHV1-24*01
<400> 144
<210> 145
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH STLH201
<400> 145
<210> 146
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR3 of STLM226-STLM232
<400> 146
<210> 147
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> STLM266 VL
<400> 147
<210> 148
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IGHV1-24*01框架
<400> 148
<210> 149
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IGHV1-f*01框架
<400> 149
<210> 150
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IGKV3-15*01 L2框架
<400> 150
<210> 151
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IGKV1-9*01 L8框架
<400> 151
<210> 152
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IGKV1-5*01 L12
<400> 152
<210> 153
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IGKV1-12*01 L5
<400> 153
<210> 154
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IGKV1-39*01 O12
<400> 154
<210> 155
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IGKV1-27*01 A20
<400> 155
<210> 156
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IGKV1-33*01 O18
<400> 156
<210> 157
<211> 328
<212> PRT
<213> 人類
<400> 157
<210> 158
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> VH 3-23框架
<400> 158
<210> 159
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Vk L6框架(IGKV3-11)
<400> 159
<210> 160
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> HCDR1保守性
<220>
<221> Xaa1
<222> (1)..(1)
<223> Xaa1 is S,F,D,I,G or V
<220>
<221> Xaa2
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2 is Y or D
<220>
<221> Xaa3
<222> (3)..(3)
<223> Xaa3 is A,D or S
<220>
<221> Xaa4
<222> (5)..(5)
<223> Xaa4 is S,F or I
<400> 160
<210> 161
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> HCDR2保守性
<220>
<221> Xaa1
<222> (1)..(1)
<223> Xaa1 is A,S,T,Y or D
<220>
<221> Xaa2
<222> (3)..(3)
<223> Xaa2 is S,R,E,K,G or A
<220>
<221> Xaa3
<222> (5)..(5)
<223> Xaa3 is S,E or N
<220>
<221> Xaa4
<222> (8)..(8)
<223> Xaa4 is S,R,E,G,T,D or A
<220>
<221> Xaa5
<222> (10)..(10)
<223> Xaa5 is Y,D,N,A or S
<400> 161
<210> 162
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> HCDR3保守性
<220>
<221> Xaa1
<222> (1)..(1)
<223> Xaa1 is D,A,R,N,Q,P,E,I,H,S,T or Y
<220>
<221> Xaa2
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2 is P,A,H,Y,E,Q,L,S,N,T,V or I
<400> 162
<210> 163
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> LCDR1保守性
<220>
<221> Xaa1
<222> (9)..(9)
<223> Xaa1 is A or D
<400> 163
<210> 164
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> LCDR3保守性
<220>
<221> Xaa1
<222> (3)..(3)
<223> Xaa1 is F or Y
<220>
<221> Xaa2
<222> (4)..(4)
<223> Xaa2 is Y,I or N
<220>
<221> Xaa3
<222> (5)..(5)
<223> Xaa3 is N,G,D or T
<220>
<221> Xaa4
<222> (6)..(6)
<223> Xaa4 is W or A
<220>
<221> Xaa5
<222> (7)..(7)
<223> Xaa5為P或刪除
<220>
<221> Xaa6
<222> (8)..(8)
<223> Xaa6為L或I
<400> 164
<210> 165
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> STLH255 HCDR3
<400> 165
<210> 166
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> STLH256 HCDR3
<400> 166
<210> 167
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> STLH257 HCDR3
<400> 167
<210> 168
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> STLH258 HCDR3
<400> 168
<210> 169
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> STLH259 HCDR3
<400> 169
<210> 170
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> STLH260 HCDR3
<400> 170
<210> 171
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> STLH261 HCDR3
<400> 171
<210> 172
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> STLH262 HCDR3
<400> 172
<210> 173
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> STLH263 HCDR3
<400> 173
<210> 174
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> STLH264 HCDR3
<400> 174
<210> 175
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> STLH265 HCDR3
<400> 175
<210> 176
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> STLH266 HCDR3
<400> 176
<210> 177
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> STLH267 HCDR3
<400> 177
<210> 178
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> STLH268 HCDR3
<400> 178
<210> 179
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> STLH269 HCDR3
<400> 179
<210> 180
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> STLH270 HCDR3
<400> 180
<210> 181
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> STLH271 HCDR3
<400> 181
<210> 182
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> STLH272 HCDR3
<400> 182
<210> 183
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> STLH273 HCDR3
<400> 183
<210> 184
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> STLH274 HCDR3
<400> 184
<210> 185
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> STLH275 HCDR3
<400> 185
<210> 186
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> ST2H52
<400> 186
<210> 187
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> ST2H50
<400> 187
<210> 188
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> ST2H318
<400> 188
<210> 189
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> ST2H316
<400> 189
<210> 190
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> ST2H314
<400> 190
<210> 191
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> ST2H257
<400> 191
<210> 192
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> ST2H232
<400> 192
<210> 193
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> ST2H231
<400> 193
<210> 194
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> ST2H228
<400> 194
<210> 195
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> ST2H202
<400> 195
<210> 196
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> ST2H179
<400> 196
<210> 197
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> ST2H173
<400> 197
<210> 198
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> ST2H172
<400> 198
<210> 199
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> ST2H163
<400> 199
<210> 200
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> ST2H162
<400> 200
<210> 201
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> ST2H139
<400> 201
<210> 202
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> ST2H137
<400> 202
<210> 203
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> ST2H136
<400> 203
<210> 204
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> ST2H129
<400> 204
<210> 205
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> ST2H112
<400> 205
<210> 206
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> ST2L32
<400> 206
<210> 207
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> ST2L35
<400> 207
<210> 208
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> ST2L49
<400> 208
<210> 209
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> ST2L59
<400> 209
<210> 210
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> ST2L epitope
<400> 210
<210> 211
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> VH cDNA for STLM208
<400> 211
<210> 212
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> VL cDNA for STLM208
<400> 212
<210> 213
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> VH cDNA for c2244
<400> 213
<210> 214
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> VL cDNA for c2244
<400> 214
<210> 215
<211> 266
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 215

Claims (32)

  1. 一種單離人類抗體拮抗劑或人類適應性抗體拮抗劑或其片段，其特異性地結合人類ST2L之域I(SEQ ID NO：9)。
  2. 如申請專利範圍第1項之單離抗體，其中該抗體阻斷IL-33/ST2L交互作用。
  3. 如申請專利範圍第2項之單離抗體，其具有對人類ST2L之約5×10-12M至約7×10-10M之間的解離常數(KD)、對人類ST2L之約2×106M-1s-1至約1×108M-1s-1之間的結合速率常數(Kon)或對人類ST2L之約1×10-6s-1至約1×10-2s-1之間的脫附結速率常數(Koff)。
  4. 如申請專利範圍第3項之單離抗體，其具有對馬來猴(Macaca fascicularis(cyno))ST2L(SEQ ID NO：2)之約3×10-12M至約2×10-9M之間的解離常數(KD)、對馬來猴ST2L之約4×106M-1s-1至約1×108M-1s-1之間的結合速率常數(Kon)或對馬來猴ST2L之約7×10-5s-1至約1×10-1s-1之間的脫附速率常數(Koff)。
  5. 如申請專利範圍第4項之單離抗體，包含：a)重鏈互補決定區(HCDR)1(HCDR1)，其係SEQ ID NO：160(X1X2X3MX4)；其中X1係S、F、D、I、G或V；X2係Y或D；X3係A、D或S；以及X4係S、F或I；b)HCDR 2(HCDR2)，其係SEQ ID NO：161(X5IX6GX7GGX8TX9YADSVKG)；其中X5係A、S、T、Y或D； X6係S、R、E、K、G或A；X7係S、E或N；X8係S、R、E、G、T、D或A；以及X9係Y、D、N、A或S；以及c)HCDR 3(HCDR3)，其係SEQ ID NO：162(X10X11WSTEGSFFVLDY)；其中X10係D、A、R、N、Q、P、E、I、H、S、T或Y；以及X11係P、A、H、Y、E、Q、L、S、N、T、V或I；以及d)輕鏈互補決定區(LCDR)1(LCDR1)，其係SEQ ID NO：163(RASQSVDDX12LA)；其中X12係A或D；e)LCDR 2(LCDR2)，其係SEQ ID NO：90(DASNRAT)；以及f)LCDR 3(LCDR3)，其係SEQ ID NO：164(QQX13X14X15X16X17X18T)；其中X13係F或Y；X14係Y、I或N；X15係N、G、D或T；X16係W或A；X17係P或不存在；以及X18係L或I。
  6. 如申請專利範圍第5項之單離抗體，包含： a)HCDR1，其為SEQ ID NO：97；b)HCDR2，其為SEQ ID NO：114；c)HCDR3，其為SEQ ID NO：84；d)LCDR1，其為SEQ ID NO：130；e)LCDR2，其為SEQ ID NO：90；以及f)LCDR3，其為SEQ ID NO：134；或g)VH，其為SEQ ID NO：191，及VL，其為SEQ ID NO：209。
  7. 如申請專利範圍第5項之單離抗體，包含下列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3：a)分別為SEQ ID NOs：78、81、84、87、90及92；b)分別為SEQ ID NOs：78、81、84、130、90及131；c)分別為SEQ ID NOs：78、81、84、130、90及132；d)分別為SEQ ID NOs：78、81、84、130、90及133；e)分別為SEQ ID NOs：78、81、84、130、90及134；f)分別為SEQ ID NOs：95、109、84、130、90及131；g)分別為SEQ ID NOs：96、110、84、130、90及131；h)分別為SEQ ID NOs：97、111、84、130、90及131；i)分別為SEQ ID NOs：96、110、84、130、90及134；j)分別為SEQ ID NOs：97、111、84、130、90及134；k)分別為SEQ ID NOs：97、112、84、130、90及134；l)分別為SEQ ID NOs：98、113、84、130、90及134；m)分別為SEQ ID NOs：97、114、84、130、90及134；n)分別為SEQ ID NOs：97、115、84、130、90及134；o)分別為SEQ ID NOs：99、116、84、130、90及133； p)分別為SEQ ID NOs：100、117、84、130、90及133；q)分別為SEQ ID NOs：101、118、84、130、90及133；r)分別為SEQ ID NOs：102、120、84、130、90及132；s)分別為SEQ ID NOs：103、121、84、130、90及132；t)分別為SEQ ID NOs：103、122、84、130、90及131；u)分別為SEQ ID NOs：103、123、84、130、90及131；v)分別為SEQ ID NOs：104、124、84、130、90及131；w)分別為SEQ ID NOs：105、125、84、130、90及131；x)分別為SEQ ID NOs：106、126、84、130、90及131；y)分別為SEQ ID NOs：95、127、84、130、90及131；z)分別為SEQ ID NOs：107、128、84、130、90及131；aa)分別為SEQ ID NOs：108、129、84、130、90及131；bb)分別為SEQ ID NOs：97、114、165、130、90及134；cc)分別為SEQ ID NOs：97、114、166、130、90及134；dd)分別為SEQ ID NOs：97、114、167、130、90及134；ee)分別為SEQ ID NOs：97、114、168、130、90及134；ff)分別為SEQ ID NOs：97、114、169、130、90及134；gg)分別為SEQ ID NOs：97、114、170、130、90及134；hh)分別為SEQ ID NOs：97、114、171、130、90及134；ii)分別為SEQ ID NOs：97、114、172、130、90及134；jj)分別為SEQ ID NOs：97、114、173、130、90及134；kk)分別為SEQ ID NOs：97、114、174、130、90及134；ll)分別為SEQ ID NOs：97、114、175、130、90及134；mm)分別為SEQ ID NOs：97、114、176、130、90及134； nn)分別為SEQ ID NOs：97、114、177、130、90及134；oo)分別為SEQ ID NOs：97、114、178、130、90及134；pp)分別為SEQ ID NOs：97、114、179、130、90及134；qq)分別為SEQ ID NOs：97、114、180、130、90及134；rr)分別為SEQ ID NOs：97、114、181、130、90及134；ss)分別為SEQ ID NOs：97、114、182、130、90及134；tt)分別為SEQ ID NOs：97、114、183、130、90及134；uu)分別為SEQ ID NOs：97、114、184、130、90及134；或vv)分別為SEQ ID NOs：97、114、185、130、90及134。
  8. 如申請專利範圍第4項之單離抗體，包含下列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3：a)分別為SEQ ID NOs：23、27、31、35、39及43；b)分別為SEQ ID NOs：24、28、32、36、40及44；c)分別為SEQ ID NOs：24、28、146、36、40及147；或d)分別為SEQ ID NOs：24、28、146、36、40及44。
  9. 如申請專利範圍第2項之單離抗體，其中該抗體與包含SEQ ID NO：47之重鏈可變區(VH)及SEQ ID NO：51之輕鏈可變區(VL)的單離抗體競爭結合到人類ST2L(SEQ ID NO：1)。
  10. 如申請專利範圍第9項之單離抗體，其中該抗體結合到SEQ ID NO：1(RCPRQGKPSYTVDW；SEQ ID NO：210)之人類ST2L的第35-48個胺基酸殘基。
  11. 如申請專利範圍第10項之單離抗體，其中該抗體進一步結合到SEQ ID NO：1之人類ST2L的胺基酸殘基T93及F94。
  12. 如申請專利範圍第1項之單離抗體，包含重鏈可變區(VH)，其包含衍生自下列之VH框架：人類IGHV3-23(SEQ ID NO：158)、IGHV1-24*01(SEQ ID NO：148)或IGHV1-f*01(SEQ ID NO：149)框架序列；及輕鏈可變區(VL)，其包含衍生自下列之VL框架：人類IGKV3-11(L6)(SEQ ID NO：159)、IGKV3-15*01(L2)(SEQ ID NO：150)、IGKV1-9*01(L8)(SEQ ID NO：151)、IGKV1-5*01(L12)(SEQ ID NO：152)、IGKV1-12*01(L5)(SEQ ID NO：153)、IGKV1-39*01(O12)(SEQ ID NO：154)、IGKV1-27*01(A20)(SEQ ID NO：155)或IGKV1-33*01(O18)(SEQ ID NO：156)框架序列。
  13. 如申請專利範圍第1項之單離抗體，其係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型。
  14. 如申請專利範圍第13項之單離抗體，其在Fc區具有殘基取代。
  15. 如申請專利範圍第14項之單離抗體，其中該殘基取代包含M252Y/S254T/T256E、V234A/G237A/P238S/H28A/V309L/A330S/P331S或P238S/L234A/L235A之殘基取代，其中殘基編號係依據EU編號系統(EU numbering)。
  16. 如申請專利範圍第12項之單離抗體，其包含與SEQ ID NO：191之VH至少90%相同的VH及與SEQ ID NO：209之VL至少94%相同的VL。
  17. 如申請專利範圍第16項之單離抗體，其包含SEQ ID NOs：143、144、145、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204或205的VH；及SEQ ID NOs：135、136、137、138、139、140、141、142、206、207、208或209的VL。
  18. 如申請專利範圍第17項之單離抗體，其包含之VH及VL：a)分別為SEQ ID NO：186及SEQ ID NO：206；b)分別為SEQ ID NO：187及SEQ ID NO：206；c)分別為SEQ ID NO：197及SEQ ID NO：206；d)分別為SEQ ID NO：198及SEQ ID NO：206；e)分別為SEQ ID NO：199及SEQ ID NO：206；f)分別為SEQ ID NO：200及SEQ ID NO：206；g)分別為SEQ ID NO：201及SEQ ID NO：206；h)分別為SEQ ID NO：202及SEQ ID NO：206；i)分別為SEQ ID NO：203及SEQ ID NO：206；j)分別為SEQ ID NO：204及SEQ ID NO：206；k)分別為SEQ ID NO：205及SEQ ID NO：206；l)分別為SEQ ID NO：195及SEQ ID NO：207；m)分別為SEQ ID NO：196及SEQ ID NO：207；n)分別為SEQ ID NO：188及SEQ ID NO：208；o)分別為SEQ ID NO：189及SEQ ID NO：208；p)分別為SEQ ID NO：190及SEQ ID NO：208；q)分別為SEQ ID NO：187及SEQ ID NO：209；r)分別為SEQ ID NO：191及SEQ ID NO：209；s)分別為SEQ ID NO：192及SEQ ID NO：209；t)分別為SEQ ID NO：193及SEQ ID NO：209；或u)分別為SEQ ID NO：194及SEQ ID NO：209。
  19. 一種單離多核苷酸，其編碼SEQ ID NOs：143、144、145、186、187、197、198、199、200、201、202、203、204或205的VH；或編碼SEQ ID NOs：135、136、137、138、139、140、141、142、206、207、208或209的VL。
  20. 一種載體，包含如申請專利範圍第19項的單離多核苷酸。
  21. 一種宿主細胞，包含如申請專利範圍第20項的載體。
  22. 一種製造如申請專利範圍第18項之抗體的方法，包含培養如申請專利範圍第21項之宿主細胞及從該細胞取得抗體。
  23. 一種醫藥組合物，包含如申請專利範圍第1項或第6項之單離抗體及醫藥上可接受之載劑。
  24. 一種治療或預防ST2L調介症狀的方法，包含在足夠治療或預防該ST2L調介症狀的時間長度中，將治療有效量之如申請專利範圍第1項或申請專利範圍第6項之單離抗體施予有需要的病患。
  25. 如申請專利範圍第24項之方法，其中該ST2L調介症狀係氣喘、呼吸道過度反應、類肉瘤病、慢性阻塞性肺臟疾病(COPD)、原發型肺纖維化病變(IPF)、囊腫纖維化、發炎性腸道疾(IBD)、嗜酸細胞性食道炎(eosinophilic esophagitis)、硬皮症、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、大水疱性天孢瘡樣病、慢性蕁麻疹、糖尿病腎病變、風濕性關節炎、間質性膀胱炎或移植物抗宿主病(GVHD)，或與發炎細胞聚集在肺部、杯狀細胞增生、黏液分泌增加或肥大細胞反應增加有關的症狀。
  26. 一種抑制病患體內肥大細胞反應的方法，包含在足夠抑制該肥大細胞反應的時間長度中，將治療有效量之如申請專利範圍第1項之單離抗體施予有需要的病患。
  27. 如申請專利範圍第26項之方法，其中該抑制肥大細胞反應包含以50μg/ml抗體抑制由人類臍帶血衍生肥大細胞所釋放之GM-CSF、IL-5、IL-8、IL-10或IL-13之量達至少50%。
  28. 一種在個體中抑制IL-33及ST2L之交互作用的方法，包含施予該個體足夠抑制IL-33及ST2L之交互作用的，特異性結合ST2L之域I的抗體。
  29. 如申請專利範圍第28項之方法，其中該個體具有由ST2L調介之症狀。
  30. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該由ST2L調介之症狀係氣喘、呼吸道過度反應、類肉瘤病、慢性阻塞性肺臟疾病(COPD)、原發型肺纖維化病變(IPF)、囊腫纖維化、發炎性腸疾(IBD)、嗜酸細胞性食道炎、硬皮症、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、大水疱性天孢瘡樣病、慢性蕁麻疹、糖尿病腎病變、風濕性關節炎、間質性膀胱炎或移植物抗宿主病(GVHD)，或與發炎細胞聚集在肺部、杯狀細胞增生、黏液分泌增加或肥大細胞反應增加有關的症狀。
  31. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該抗體包含：a)HCDR1，其為SEQ ID NO：97；b)HCDR2，其為SEQ ID NO：114；c)HCDR3，其為SEQ ID NO：84；d)LCDR1，其為SEQ ID NO：130；e)LCDR2，其為SEQ ID NO：90；以及f)LCDR3，其為SEQ ID NO：134；或g)VH，其為SEQ ID NO：191及VL，其為SEQ ID NO：209。
  32. 一種如申請專利範圍第1項、第6項或第9項之抗體的用途，係用於治療。
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