KR20150008152A - St2l 길항제 및 사용 방법 - Google Patents

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미카엘 나소
마크 토어네타
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생-지운 우
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Abstract

본 발명은 ST2L 길항제, 길항제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편, 및 전술한 것의 제조 방법 및 사용 방법에 관한 것이다.

Description

ST2L 길항제 및 사용 방법 {ST2L antagonists and methods of use}
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 2013년 3월 13일자로 출원된 미국 출원 제13/798,204호, 2013년 3월 13일자로 출원된 미국 출원 제13/798,226호, 2012년 4월 30일자로 출원된 미국 가출원 제61/640,407호, 및 2012년 4월 30일자로 출원된 미국 가출원 제61/640,238호의 이익을 주장하며, 이들의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 ST2L 길항제, 길항제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편, 및 전술한 것의 제조 방법 및 사용 방법에 관한 것이다.
ST2L(IL-1RL1 또는 IL-33Rα)은 T 세포, NK/NKT 세포, 호염기구, 호산구, 비만 세포, 및 최근에 기재된 비-B/비-T 선천성 림프구 유형 2 세포, 뉴오사이트(nuocyte), 및 자연 조력 세포(natural helper cell)를 포함하는 매우 다양한 면역 세포의 세포 표면 상에 발현되는 Toll/IL-1 수용체 패밀리 구성원이다. ST2L 발현은 또한 수지상 세포(DC: dendritic cell), 대식세포, 및 호중구 상에서 유도가능하다. ST2L은 Toll-유사 수용체 TLR2, TLR4, 및 TLR9의 감응성(responsiveness)의 하향조절이 가능할 뿐 아니라, 그의 리간드 IL-33에 의한 활성화 및 보조 단백질(accessory protein) IL-1RAcP와의 회합을 통해 유형 2 사이토카인 방출 또한 유도한다. IL-33은 '알라민(alarmin)'이라고 기재되어 왔으며, 이는 그의 전체-길이 형태가 항상성(homeostasis) 중에는 상피 및 내피 세포의 핵 내에 체류하지만, 괴사 중에는 분해되어 방출될 수 있기 때문이다.
ST2L 신호전달은 사전형성된 ST2L/IL-33 복합체에 대한 보조 단백질 IL-1RAcP의 회합을 필요로 한다. 보조 단백질 IL-1RAcP는 IL-1α/β 신호전달 복합체와 공유된다. ST2L, IL-33, 및 IL-1RAcP 상호작용의 모델이 IL-1R1과 IL-1RAcP 사이의 상호작용과 더불어 제시되어 있다(문헌[Lingel et al., Cell 17:1398-1410, 2009; Wang et al., Nat Immunol 11:905-11, 2010]). 최근에, ST2L/IL-33/IL-1RAcP는 줄기 세포 인자(SCF: stem cell factor)를 위한 수용체인 비만 세포 상의 c-Kit와 신호전달 복합체를 형성하는 것으로 나타났다. IL-33은 초대 비만 세포 내에서 SCF-의존적 방식으로 사이토카인 생성을 유도했다(문헌[Drube et al., Blood 115:3899-906, 2010]).
ST2L의 활성화는 과도한 유형 2 사이토카인 반응(특히 IL-5 및 IL-13), 비만 세포 및 호산구 활성화, 및 기도 과민 반응(airway hyper-reactivity)을 유발하며, 또한 NKT 세포로부터의 IFNg, 및 비만 세포로부터의 IL-1β 및 IL-6의 유도를 통해 Th1 및 Th17 반응을 증폭시키는 것으로 보고되어 있다. ST2L/IL-33 경로의 조절 곤란은, 천식, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 아토피성 피부염, 알러지성 비염, 비강 폴립증(nasal polyposis), 및 전신 경화증을 포함하는 다양한 면역-매개 질환에 연루된 것으로 시사되어 왔다(문헌[Palmer and Gabay, Nat Rev Rheumatol 7:321-9, 2011] 및 문헌[Lloyd, Curr Opin Immunol 22:800-6, 2010]; 문헌[Shimizu et al., Hum Molec Gen 14:2919-27, 2005], 문헌[Kamekura et al., Clin Exp Allergy 42:218-28, 2012]; 문헌[Manetti et al., Ann Rheum Dis 69:598-605, 2010]에 개관됨).
따라서, ST2L 매개 질환 및 장애의 치료에 사용하기에 적합한 ST2L 길항제에 대한 필요성이 존재한다.
<도 1>
도 1은, 비강내 투여된 IL-33에 의해 유도된 폐 염증의 모델에서 ST2L 도메인 I 결합 mAb CNTO3914에 의한 기도 과민성(airway hyper-responsiveness)의 저해를 나타낸다(동형 대조군 CNTO5516에 비교할 경우). 증가된 용량(mg/ml)으로 메타콜린(MCH: methacholine) 투여시에 피크 기도 저항을 측정하였다. **p<0.05(CNTO3914/IL-33 대 CNTO5516/IL-33의 경우); 및 ***p<0.001(CNTO3914/IL-33 대 IL-33을 가진 PBS 처리군의 경우).
<도 2>
도 2는, 비강내 투여된 IL-33에 의해 유도된 폐 염증의 모델에서 ST2L 도메인 I 결합 mAb CNTO3914에 의한 기관지 폐포 세척(BAL: Bronchoalveolar Lavage) 세포 동원(cell recruitment)의 저해를 나타낸다(동형 대조군 CNTO5516에 비교할 경우). ***p<0.001.
<도 3>
도 3은, 비강내 투여된 IL-33에 의해 유도된 폐 염증의 모델의 무세포 BAL 유체에서 ST2L 도메인 I 결합 mAb CNTO3914에 의한 마우스 비만 세포 프로테아제 1(MMCP-1)의 방출의 용량-의존적 저해를 나타낸다. IL-33 처리를 동반하는 CNTO5516(동형 대조군)에 대해, **p<0.01, ***p<0.001.
<도 4>
도 4는, 시험관내에서 ST2L 도메인 I 결합 mAb CNTO3914에 의한, 마우스 골수-유래 비만 세포에 의한 IL-33-유도 GM-CSF(도 4a), IL-5(도 4b), 및 TNFα(도 4c) 방출의 저해를 나타낸다. 사용된 CNTO3914 농도는 ㎍/ml로 나타내고 IL-33 농도는 괄호 안에 ng/ml로 나타낸다.
<도 5>
도 5는, 표시된 IL-33 및 C2494 농도에서 ST2L 도메인 I 결합 mAb C2494(STLM62)에 의한, 인간 제대혈-유래 비만 세포에 의한 IL-33-유도 프로스타글란딘 D2(PGD2) 방출의 저해를 나타낸다. MOX-PDG2: 메톡실사민(methoxylsamine)-PGD2.
<도 6>
도 6은, 스템프로(StemPro)-34 배지 + 100 ng/ml SCF(줄기 세포 인자) 중의 1 ng/ml IL-33의 존재 하에 인간 제대혈 유래 비만 세포(hCBMC)에서 표시된 농도(㎍/ml)의 ST2L 도메인 I 결합 mAb C2244 및 C2494에 의한 GM-CSF(도 6a), IL-8(도 6b), IL-5(도 6c), IL-13(도 6d), 및 IL-10(도 6e) 방출의 저해를 나타낸다.
<도 7>
도 7은, 스템프로-34 배지 + 100 ng/ml SCF 중의 1 ng/ml IL-33의 존재 하에 인간 제대혈-유래 비만 세포에서 표시된 농도(㎍/ml)의 ST2L 도메인 III 결합 mAb C2519 또는 C2521에 의한 GM-CSF(도 7a), IL-8(도 7b), IL-5(도 7c), IL-13(도 7d), 및 IL-10(도 7e) 방출에 대한 효과를 나타낸다.
<도 8>
도 8은, RPMI/10%FCS 배지 + 100 ng/ml SCF 중의 3 ng/ml IL-33의 존재 하에 인간 제대혈-유래 비만 세포(hCBMC)에서 ST2L 도메인 I 결합 mAb C2494 및 ST2L 도메인 III 결합 mAb ST2M48(M48), ST2M49(M49), ST2M50(M50), 및 ST2M51(M51)에 의한 GM-CSF (도 8a); IL-8 (도 8b); IL-5 (도 8c); IL-13 (도 8d), 및 IL-10 (도 8e) 방출에 대한 효과를 나타낸다.
<도 9>
도 9는, IL-33 및 SCF 유도시에 인간 제대혈-유래 비만 세포에 의한 GM-CSF, IL-5, IL-8, IL-10, 및 IL-13 방출에 대한 ST2L의 도메인 I(D1) 또는 도메인 III(D3)에 결합하는 항-ST2L 항체의 평균 퍼센트(%) 저해를 나타낸다(표시된 바와 같이 50 ㎍/ml 또는 2 ㎍/ml의 각각의 시험 항체를 사용함). 음의 값은 % 활성화를 표시한다.
<도 10>
도 10은, 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 유래되고, 후속의 친화력-성숙 캠페인 후의 항-ST2L 항체의 중쇄 가변 영역(VH: heavy chain variable region) 및 중쇄 CDR 서열을 나타낸다.
<도 11>
도 11은, 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 유래되고, 후속의 친화력-성숙 캠페인 후의 항-ST2L 항체의 경쇄 가변 영역(VL: light chain variable region) 및 경쇄 CDR 서열을 나타낸다.
<도 12>
도 12는, 항-ST2L 항체 STLM208 VH ST2H257 HCDR3 변이체의 VH 및 VL 영역 및 중쇄 CDR의 서열을 나타낸다.
<도 13>
도 13은, 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 유래되고, 후속의 친화력-성숙 캠페인 후의 항-ST2L 항체의 VH (도 13a) 및 VL (도 13b) 서열을 나타낸다.
<도 14>
도 14는, 인간 프레임워크로 이전된 C2494 VH 및 VL 항원 결합 부위의 도해를 나타낸다(HFA, "인간 프레임워크 적응화(human framework adaptation)"로 표시되어 이전됨). 카바트(Kabat) CDR은 밑줄로 표시하고 초티아(Chothia) HV는 표시된 이전된 HFA 영역 위에 점선으로 표시한다. VH 및 VL 잔기의 번호화는 초티아에 따른다. VH에서 회색으로 강조된 잔기는 일부 HFA 변이체에서 이전되지 않았다. C2494 VH: 서열 번호 48; C2494 VH: 서열 번호 52.
<도 15>
도 15는, C2494로부터 유래된 인간 프레임워크 적응화(HFA) 항체의 CDR 서열을 나타낸다.
<도 16>
도 16은, 항-ST2L 항체 CNTO3914의 혈청 수준 (도 16a), 기관지 폐포 세척(BAL) 세포 동원의 저해 (도 16b), IL-33으로 자극한 전혈 세포에 의한 IL-6 분비의 저해 (도 16c), 비강내 투여된 IL-33에 의해 유도된 폐 염증의 6 시간 모델에서 투여 후 24 시간에 CNTO3914에 의한, IL-33으로 자극한 전혈 세포에 의한 MCP1 분비의 저해 (도 16d)이다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; NQ = 검출 한계 미만; @ = 1개의 데이터 점이 검출 한계 미만임.
<도 17>
도 17은, 다양한 항-ST2L 항체 사이의 경쟁이다. 마이크로웰 상에 코팅된 ST2L-ECD에 대한 결합에 대해 30 nM 표지된 C2244 Fab가 표시된 항체와 경쟁하였다. C2244는 C2494와 경쟁하였으나 C2539와는 경쟁하지 않았다(도 17a). 마이크로웰 상에 코팅된 ST2L-ECD에 대한 결합에 대해 10 nM 표지된 C2494가 표시된 항체와 경쟁하였다. C2494는 STLM208 및 STLM213과 경쟁하였으나 C2539와는 경쟁하지 않았다(도 17b).
<도 18>
도 18은, C2244 Fab와 복합체를 형성한 인간 ST2-ECD(서열 번호 119)의 단순화된 H/D 교환 맵을 나타낸다. 항체에 의해 보호된 영역을 표시된 바와 같이 상이한 회색 스케일로 나타냈다. 잔기 18 내지 31(점선 상자로 표시)(서열 번호 1의 전체 길이 ST2L 의 잔기 35 내지 48에 상응함)을 포함하는 세그먼트가 Fab에 의해 보호되었다. 잔기 71 내지 100(실선 상자로 표시)(서열 번호 1의 잔기 88 내지 117에 상응함)을 포함하는 영역은 심하게 글리코실화되었으며, 펩티드에 의해 커버되지 않았다.
<도 19>
도 19는, 도면에 표시된 바와 같이 ST2L 변이체의 경우에 ST2L 도메인 I 결합 항체에 대한 동역학 상수 및 친화력 상수를 나타낸다.
<도 20>
도 20은, 항-ST2L 항체 STLM208에 의한, 초대 인간 폐 비만 세포로부터의 GM-CSF(도 20a); IL-5(도 20b); IL-8(도 20c); IL-13(도 20d) 분비의 저해를 나타낸다.
[발명의 내용]
본 발명은 인간 ST2L의 도메인 I(서열 번호 9)에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 또는 인간-적응화(human-adapted) 항체 길항제 또는 그의 단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 소정의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열, 또는 소정의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 서열을 갖는 인간 ST2L에 특이적으로 결합하는 인간-적응화 항체 길항제를 제공한다.
본 발명은 또한, 정의된 에피토프 영역에서 인간 ST2L에 특이적으로 결합하고/하거나 본 명세서에 기재된 바와 같은 소정의 특징을 갖는 인간 또는 인간-적응화 항체 길항제를 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 중쇄 가변 영역(VH) 또는 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 세포로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 단리된 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, ST2L-매개 병태를 치료하거나 예방하기에 충분한 시간 동안 치료적 유효량의 본 발명의 단리된 항체를 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, ST2L-매개 병태의 치료 방법 또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 비만 세포 반응을 저해하기에 충분한 시간 동안 치료적 유효량의 본 발명의 단리된 항체를 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 비만 세포 반응을 저해하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, ST2L의 도메인 I에 특이적으로 결합하는 항체를 IL-33 및 ST2L의 상호작용을 저해하기에 충분한 양으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 IL-33 및 ST2L의 상호작용을 저해하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 인용된, 특허 및 특허 출원을 포함하지만 이에 한정되지 않는 모든 간행물은 마치 완전히 개시되는 것처럼 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에 사용되는 용어는 단지 특정 실시 형태들을 설명하기 위한 것이며, 한정하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않으면, 본 명세서에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 시험 실시에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및 재료가 본 명세서에 기재되어 있다. 본 발명을 개시하고 청구함에 있어서, 하기 용어가 사용될 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "길항제"는 임의의 기전에 의해 ST2L 생물 활성을 부분적으로 저해하거나 완전히 저해하는 분자를 의미한다. 예시적인 길항제는 항체, 융합 단백질, 펩티드, 펩티드 유사체(peptidomimetic), 핵산, 올리고뉴클레오티드, 및 소분자이다. 하기의 ST2L 생물 활성에 대한 어세이를 사용하여 길항제를 동정할 수 있다. ST2L 길항제는 측정된 ST2L 생물 활성을 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 만큼 저해할 수 있다.
용어 "ST2L" 또는 "huST2L" 또는 "인간 ST2L"은 젠뱅크(GenBank) 등록 번호 NP_057316에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 인간 ST2L 폴리펩티드를 지칭한다. 서열 번호 1은 전체 길이 인간 ST2L의 아미노산 서열을 나타낸다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "ST2L 세포외 도메인", "ST2L-ECD", 또는 "huST2L-ECD"는 서열 번호 1의 아미노산 19 내지 328을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. huST2L-ECD는 서열 번호 1의 잔기 19 내지 122(도메인 I, 서열 번호 9), 잔기 123 내지 202(도메인 II, 서열 번호 10), 및 잔기 209 내지 324(도메인 III, 서열 번호 11)를 포괄하는 3개의 Ig-유사 C2-유형 도메인을 갖는다. "도메인 I" 또는 "ST2L 도메인 I" 또는 "huST2L 도메인 I" 또는 "D1"은 서열 번호 9에 나타낸 서열을 갖는 인간 ST2L 상의 제1 면역글로불린-유사 도메인을 지칭한다. "도메인 III" 또는 "ST2L 도메인 III"은 서열 번호 11에 나타낸 서열을 갖는 인간 ST2L 상의 제3 면역글로불린-유사 도메인을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "IL-33"은 전체 길이 IL-33(젠뱅크 등록 번호 NP_254274 서열 번호 3), 그의 변이체 및 활성 형태를 포함한다. IL-33 변이체는 젠뱅크 등록 번호 NP_001186569 및 젠뱅크 등록 번호 NP_001186570에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. IL-33 활성 형태는 서열 번호 3의 잔기 112 내지 270을 갖는 "성숙한 IL-33"을 포함한다. 부가적인 활성 형태는, 서열 번호 3의 잔기 11 내지 270, 115 내지 270, 95 내지 270, 99 내지 270, 또는 109 내지 270을 갖는 IL-33 단편(문헌[LeFrancais et al., Proc Natl Acad Sci (USA) 109:1673-8, 2012]), 또는 IL-33을 내재적으로 발현시키는 세포로부터 단리된 형태의 조합 또는 임의의 형태를 포함한다. "IL-33 활성 형태"는 ST2L 생물 활성을 유도하는 서열 번호 3의 IL-33의 단편 또는 변이체이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 넓은 의미에서 2개 이상의 온전한 항체 또는 항체 단편, 이량체성, 사량체성(tetrameric), 또는 다량체성(multimeric) 항체, 및 단쇄 항체로부터 형성된 쥐과, 인간, 인간-적응화, 인간화, 및 키메라 단클론 항체, 항체 단편, 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 포함하는 다클론 항체, 단클론 항체를 포함하는 면역글로불린 분자를 의미하며, 이를 포함한다.
면역글로불린은 중쇄 불변 도메인 아미노산 서열에 따라, 5개의 주요 분류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 정해질 수 있다. IgA 및 IgG는 동형 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 추가로 하위-분류된다. 임의의 척추동물 종의 항체 경쇄는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 명확하게 별개인 2개의 유형, 즉 카파(κ) 및 람다(λ) 중 하나로 정해질 수 있다.
용어 "항체 단편"은 중쇄 및/또는 경쇄 항원 결합 부위, 예를 들어 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 2, 및 3, 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 2, 및 3, 중쇄 가변 영역(VH), 또는 경쇄 가변 영역(VL)을 보유하는 면역글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 항체 단편은 주지의 Fab, F(ab')2, Fd, 및 Fv 단편과 더불어 1개의 VH 도메인으로 이루어진 도메인 항체(dAb)를 포함한다. VH 및 VL 도메인은 합성 링커를 통해 함께 연결되어 다양한 유형의 단쇄 항체 설계를 형성할 수 있으며, 여기서 VH/VL 도메인은 VH 및 VL 도메인이 별도의 단쇄 항체 작제물에 의해 발현되는 경우에 분자내에서, 또는 분자간에 쌍을 이루어 1가 항원 결합 부위, 예를 들어 단쇄 Fv(scFv) 또는 이중항체(diabody)를 형성한다(예를 들어 국제 특허 공개 제WO98/44001호, 국제 특허 공개 제WO88/01649호; 국제 특허 공개 제WO94/13804호; 국제 특허 공개 제WO92/01047호에 기재됨).
항체 가변 영역은 3개의 "항원 결합 부위"가 개재된 "프레임워크" 영역으로 구성된다. 항원 결합 부위는 다양한 용어를 사용하여 정의된다: (i) 상보성 결정 영역(CDR)(VH 내의 3개(HCDR1, HCDR2, HCDR3), 및 VL 내의 3개(LCDR1, LCDR2, LCDR3))은 서열 가변성을 기반으로 한다(문헌[Wu and Kabat, J Exp Med 132:211-50, 1970]; 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]). (ii) "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV"(VH 내의 3개(H1, H2, H3) 및 VL 내의 3개(L1, L2, L3))는, 초티아 및 레스크(Lesk)에 의해 정의된 바와 같이(문헌[Chothia and Lesk, Mol Biol 196:901-17, 1987]) 구조가 초가변성인 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 다른 용어는 "IMGT-CDR"(문헌[Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003]) 및 "특이성 결정 잔기 용법"(SDRU: Specificity Determining Residue Usage)(문헌[Almagro, Mol Recognit 17:132-43, 2004])을 포함한다. 인터내셔날 이뮤노제네틱스(IMGT: International ImMunoGeneTics) 데이터베이스(http://www_imgt_org)는 항원-결합 부위의 표준화된 번호화 및 정의를 제공한다. CDR, HV, 및 IMGT 도해 사이의 관련성은 문헌[Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003]에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "초티아 잔기"는 알-라지카니(Al-Lazikani)에 따라(문헌[Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273:927-48, 1997]) 번호화된 항체 VL 및 VH 잔기이다.
"프레임워크" 또는 "프레임워크 서열"은 항원 결합 부위인 것으로 정의된 것 이외의 가변 영역의 나머지 서열이다. 항원 결합 부위가 상기와 같이 다양한 용어에 의해 정의될 수 있기 때문에, 프레임워크의 정확한 아미노산 서열은 항원-결합 부위가 어떻게 정의되는지에 따라 달라진다.
"인간 항체" 또는 "완전 인간 항체"는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역 서열을 함유하는 항체를 지칭한다. 본 발명의 인간 항체는 치환을 포함할 수 있으므로, 그들은 발현된 인간 면역글로불린 또는 생식세포 유전자 서열의 정확한 카피가 아닐 수 있다. 그러나, 항원 결합 부위가 비-인간 종으로부터 유래된 항체는 "인간 항체"의 정의에 포함되지 않는다.
"인간-적응화" 항체 또는 "인간 프레임워크 적응화(HFA)" 항체는 미국 특허 공개 제US2009/0118127호에 기재된 방법에 따라 적응화된 항체를 지칭하며, 또한 비-인간 종으로부터 유래된 항원-결합 부위 서열이 인간 프레임워크 상에 이식되는 항체를 지칭한다.
"인간화 항체"는 항원 결합 부위가 비-인간 종으로부터 유래되고 가변 영역 프레임워크가 인간 면역글로불린 서열로부터 유래되는 항체를 지칭한다. 인간화 항체는 프레임워크 영역 내에 치환을 포함할 수 있으므로, 프레임워크는 발현된 인간 면역글로불린 또는 생식세포 유전자 서열의 정확한 카피가 아닐 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로 동일한"은 비교하는 2개의 항체 가변 영역 아미노산 서열이 동일하거나 "미미한(insubstantial) 차이"를 갖는 것을 의미한다. 미미한 차이는, 항체 특성에 불리한 영향을 주지 않는, 항체 또는 항체 가변 영역 서열 내의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개 아미노산의 치환이다. 본 명세서에 개시된 가변 영역 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열은 본 출원의 범주 이내에 있다. 일부 실시 형태에서, 서열 동일성은 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상일 수 있다. 퍼센트 동일성은, 예를 들어 벡터(Vector) NTI v.9.0.0의 얼라인엑스 모듈(AlignX module)(캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠(Invitrogen))의 기본 설정(default setting)을 사용하여 페어와이즈 정렬(pairwise alignment)에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 단백질 서열을 질의 서열(query sequence)로 사용하여, 예를 들어 관련 서열을 동정하기 위해 공공 데이터베이스 또는 특허 데이터베이스에 대한 검색을 수행할 수 있다. 이러한 검색을 수행하기 위해 사용되는 예시적인 프로그램은, 기본 설정을 사용하는 XBLAST 또는 BLASTP 프로그램(http_//www_ncbi_nlm/nih_gov), 또는 게놈퀘스트(GenomeQuest)(상표)(메사추세츠주 웨스트보로우 소재의 게놈퀘스트) 스위트이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "에피토프"는 항체가 특이적으로 결합하는 항원의 부분을 의미한다. 에피토프는 통상 아미노산 또는 다당류 측쇄와 같은 부분의 화학적으로 활성(예를 들어, 극성, 비극성 또는 소수성)인 표면 그룹화(grouping)로 이루어지며, 특이적인 3차원 구조 특징뿐만 아니라 특이적인 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 입체배좌 공간 단위(conformational spatial unit)를 형성하는 인접 및/또는 비인접 아미노산으로 구성될 수 있다. 비인접 에피토프의 경우, 항원의 선형 서열의 상이한 부분으로부터의 아미노산이 단백질 분자의 폴딩으로 통해 3-차원 공간에서 아주 근접한다. 예시적인 에피토프는 서열 번호 9에 나타낸 huST2L의 도메인 I이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "파라토프"는 항원이 특이적으로 결합하는 항체의 부분을 의미한다. 파라토프는 천연에서 선형이거나, 선형의 일련의 아미노산보다는 항체의 비-연속 아미노산 사이의 공간 관계에 의해 형성되는 불연속일 수 있다. "경쇄 파라토프" 및 "중쇄 파라토프" 또는 "경쇄 파라토프 아미노산 잔기" 및 "중쇄 파라토프 아미노산 잔기"는 각각 항원과 접촉되는 항체 경쇄 및 중쇄 잔기를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적인 결합" 또는 "특이적으로 결합하다"는 다른 항원 또는 단백질에 대한 친화력보다 더 큰 친화력을 가진, 소정의 항원에 대한 항체 결합을 지칭한다. 전형적으로, 항체는 1×10-7 M 이하, 예를 들어 1×10-8 M 이하, 1×10-9 M 이하, 1×10-10 M 이하, 1×10-11 M 이하, 또는 1×10-12 M 이하의 해리 상수(KD), 전형적으로는 비-특이적 항원(예를 들어, BSA, 카세인, 또는 임의의 다른 특정 폴리펩티드)에 대한 결합에 있어서의 그의 KD보다 10배 이상 더 작은 KD로 소정의 항원에 결합한다. 해리 상수는 표준 절차를 사용하여 측정될 수 있다. 그러나, 소정의 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 다른 관련 항원에 대해, 예를 들어, 인간 또는 원숭이(예를 들어 마카카 파시큘라리스(Macaca fascicularis)(시노몰구스(cynomolgus)))와 같은 다른 종으로부터의 동일한 소정의 항원(상동체)에 대해 교차-반응성을 가질 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "이중특이적"은 2개의 별개의 항원 또는 항원 내의 2개의 별개의 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단일특이적"은 하나의 항원 또는 하나의 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "~와 조합하여"는 기재된 제제가 혼합물 중에 함께, 단일 제제로서 동시에, 또는 단일 제제로서 임의의 순서로 순차적으로, 동물에게 투여될 수 있음을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "염증성 병태"는, 병원체, 손상된 세포, 물리적 손상, 또는 자극물과 같은 유해 자극에 대한 급성 또는 만성 국소 또는 전신 반응을 지칭하며, 이는 사이토카인, 케모카인, 또는 염증성 세포(예를 들어, 호중구, 단핵구, 림프구, 대식세포)의 활성에 의해 부분적으로 매개되고 대부분의 경우에 통증, 발적, 팽윤, 및 조직 작용의 장애를 특징으로 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "ST2L-매개 염증성 병태"는, 적어도 부분적으로 ST2L 신호전달 경로의 부적절한 활성화로부터 유발되는 염증성 병태를 지칭한다. 예시적인 ST2L-매개 염증성 병태는 천식 및 알러지이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "ST2L-매개 병태"는, 질환 또는 병태의 야기, 전개, 진행, 지속, 또는 병리를 포함하여, 질환 또는 의학적 병태에서 ST2L이 직접적이든 간접적이든 역할을 하는 모든 질환 및 의학적 병태를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "ST2L 생물 활성"은 ST2L에 대한 ST2L 리간드 IL-33 결합의 결과로서 발생하는 임의의 활성을 지칭한다. 예시적인 ST2L 생물 활성은 IL-33에 반응하여 NF-kB의 활성화를 유발한다. IL-33을 이용하는 ST2L의 유도시에 리포터-유전자 어세이를 사용하여 NF-kB 활성화를 어세이할 수 있다(문헌[Fursov et al., Hybridoma 30: 153-62, 2011]). 다른 예시적인 ST2L 생물 활성은 Th2 세포의 증식, 또는 전-염증성 사이토카인 및 케모카인(예를 들어 IL-5, GM-CSF, IL-8, IL-10, 또는 IL-13)의 분비를 유발한다. 세포, 조직 또는 순환 중으로부터의 사이토카인 및 케모카인의 방출은 잘 알려져 있는 면역분석법, 예를 들어 ELISA 면역분석법을 사용하여 측정될 수 있다.
용어 "벡터"는 생물 시스템 내에서 복제될 수 있거나 이러한 시스템들 사이에서 이동할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 전형적으로 벡터 폴리뉴클레오티드는 생물 시스템에서 이들 폴리뉴클레오티드의 복제 또는 유지를 돕는 기능을 하는 복제 기점, 폴리아데닐화 신호 또는 선발 마커와 같은 요소들을 포함한다. 그러한 생물 시스템의 예는 벡터를 복제할 수 있는 생물 구성요소들을 이용하는 세포 시스템, 바이러스 시스템, 동물 시스템, 식물 시스템 및 재구성된 생물 시스템을 포함할 수 있다. 벡터를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 분자 또는 이들의 혼성체일 수 있다.
용어 "발현 벡터는" 발현 벡터에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 번역을 유도하기 위하여 생물 시스템 또는 재구성된 생물 시스템에서 이용될 수 있는 벡터를 의미한다.
용어 "폴리뉴클레오티드는" 당-포스페이트 골격 또는 다른 등가의 공유 결합적 화학적 특성에 의해 공유 결합된 뉴클레오티드의 쇄를 포함하는 분자를 의미한다. 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA 및 RNA가 폴리뉴클레오티드의 전형적인 예이다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 폴리펩티드를 형성하도록 펩티드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. 50개 미만의 아미노산의 작은 폴리펩티드는 "펩티드"로 지칭될 수 있다.
후술되는 바와 같은 통상적인 1-문자 및 3-문자 아미노산 코드를 본 명세서에 사용한다:
Figure pct00001
대상 조성물
본 발명은 ST2L에 특이적으로 결합하고 ST2L 생물 활성을 저해하는 항체, 및 이러한 항체의 용도를 제공한다. 본 발명자들은 인간 ST2L의 도메인 I(서열 번호 9)에 결합하는 항체가 IL-33/ST2L 상호작용을 차단하고 IL-33-유도 비만 세포 반응을 포함하는 여러 가지 ST2L 생물 활성을 저해하는 반면에, 인간 ST2L의 도메인 III(서열 번호 11)에 결합하는 항체는 그들이 여러 가지 ST2L 생물 활성을 저해함에도 불구하고 IL-33/ST2L 상호작용을 차단하지 않는다는 의외의 발견을 했다. 그러나 도메인 III 결합 항체는 IL-33-유도 비만 세포 반응에 대한 저해 효과가 감소되거나 없거나, 일부 경우에는 IL-33-유도 비만 세포 반응을 자극한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, IL-33/ST2L 상호작용을 차단하고 IL-33-유도 비만 세포 반응을 포함하는 여러 가지 ST2L 생물 활성을 저해하는 항체는 인간 ST2L 도메인 I 내부의 에피토프, (RCPRQGKPSYTVDW; 서열 번호 210), 및 임의로 ST2L 아미노산 잔기 T93 및 F94(서열 번호 1에 따른 잔기 번호화)에 결합한다.
용어 "비만 세포 반응" 또는 "비만 세포 활성"은, 비만 세포로부터의 GM-CSF, IL-8, IL-5, IL-13, 및 IL-10과 같은 사이토카인, 및 프로스타글란딘 D2와 같은 알러지 매개체의 IL-33-유도 방출을 지칭한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명은 인간 ST2L의 도메인 I에 결합하는 신규의 항원-결합 부위를 제공한다. 항원-결합 부위를 보유하기 위한 구조는 전형적으로 항체 VH 또는 VL이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 항체는 인간 ST2L의 도메인 I(서열 번호 9)에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 또는 인간-적응화 항체 길항제 또는 그의 단편일 수 있다. 인간 ST2L의 도메인 I (서열 번호 9)에 결합하는 예시적인 항체는, 각각 서열 번호 23, 27, 및 31의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열 번호 35, 39, 및 43의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 항체 STLM15(C2244), 또는 각각 서열 번호 24, 28, 및 32의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열 번호 36, 40, 및 44의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 항체 C2494(STLM62)이다(표 3). 인간 ST2L의 도메인 I에 결합하는 부가적인 예시적인 항체는 표 16 및 도 13에 나타낸 항체, 예를 들어 항체 STLM103, STLM107, STLM108, STLM123, STLM124, STLM208, STLM209, STLM210, STLM211, STLM212, 및 STLM213이다. 예시적인 인간 항체 길항제는 도 12 및 도 13에 나타낸다. 예시적인 인간-적응화 길항제는 표 14에 나타낸다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 인간 ST2L의 도메인 I(서열 번호 9)에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 또는 인간-적응화 항체 길항제 또는 그의 단편은 IL-33/ST2L 상호작용을 차단한다.
IL-33/ST2L 상호작용을 차단하는 항체의 능력에 대해, 표준 ELISA에 의해 항체를 시험할 수 있다. 예를 들어, 인간 ST2L(huST2L-ECD)의 세포외 도메인으로 플레이트를 코팅하고 항체와 함께 인큐베이션한 후, 플레이트 상에 바이오틴화 IL-33의 결합을 측정한다. "IL-33/ST2L 상호작용을 차단"하거나 "IL-33/ST2L 상호작용을 저해"하는 항체는, 50 ㎍/ml의 항체 농도에서 huST2L-ECD 코팅된 플레이트를 사용하는 ELISA 어세이에서 플레이트에 결합된 바이오틴화 IL-33으로부터 유래된 신호를, 항체의 부재 하에서의 IL-33의 결합에 비교할 때, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 이상만큼 감소시키는 항체이다.
표준 방법 및 하기 예시된 방법을 사용하여, 예를 들어, 인간 제대혈-유래 비만 세포 또는 초대 인간 폐 비만 세포에 의한 GM-CSF, IL-5, IL-10, 또는 IL-13 방출에 대한 항체의 저해 활성을 평가함으로써, 항체의 비만 세포 반응 저해에 대해 항체를 시험할 수 있다. "비만 세포 반응을 저해"하거나 "비만 세포 활성을 저해"하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체는, 10 ㎍/ml의 농도에서, 1 내지 3 ng/ml IL-33-유도 GM-CSF, IL-5, IL-13, 또는 IL-10 분비를, 항체에 의해 처리되지 않은 비만 세포에 비교할 때, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 이상만큼 감소시키는 항체이다. 주지의 방법에 의해, 그리고 하기 예시된 바와 같이, 비만 세포는 전형적으로 인간 제대혈 또는 폐 실질 및 소기도 CD34+ 전구세포로부터 유래될 수 있다. 비만 세포 배양 조건은 항체에 대한 %저해의 측정값에 영향을 줄 수 있으므로, 예를 들어 스템프로-34 배지를 사용하여 6 내지 10 주 길이의 분화 절차 전체에 걸쳐 배양 및 시험 조건을 표준으로 유지할 수 있다. 사이토카인 방출 어세이 4 일 전에 10 ng/ml IL-4, 10 ng/ml IL-6, 및 100 ng/ml SCF로 비만 세포를 매일 자극한다. 사이토카인 방출 어세이를 위해, 항생제 없이 10% FCS를 함유하는 새로 만든 스템프로-34 배지 또는 RPMI에 비만 세포를 100 ng/ml SCF와 함께 재현탁시킬 수 있다. 어세이를 위해 적합한 플레이팅 밀도는 65,000 내지 75,000 세포/0.16 ml/웰이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 비만 세포 반응을 저해하는 본 발명의 예시적인 항체는 항체 STLM15, STLM62, 및 STLM208이다. 항체 CNTO3914는 인간 ST2L에 대한 교차-반응성 없이 마우스 ST2L 도메인 I에 결합하고 마우스 세포에서 비만 세포 반응을 저해한다.
비만 세포 반응은 또한 IL-1 및 IL-32, 및 CCL1, CCL4, CCL5, CCL18, 및 CCL23과 같은 케모카인과 더불어 시스테인일 류코트라이엔, 히스타민과 같은 알러지 매개체와 더불어, 트립타아제, 카이마제, 카르복시펩티다제, 및 카텝신 G를 포함하는 다양한 비만 세포 프로테아제의 방출을 포함한다는 것을, 당업자는 인식할 것이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 본 발명의 항체를, 이들 부가적인 비만 세포 반응을 저해하는 그들의 능력에 대해 표준 방법을 사용하여 시험할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 ST2L의 도메인 I에 결합하고 IL-33/ST2L 상호작용을 차단하는 본 발명의 항체는, 이들 조건 하에 10 ㎍/ml의 최소 농도에서 시험할 때 이들 부가적인 비만 세포 반응을 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 저해할 것으로 예상할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 항체는 약 5×10-12 M 내지 약 7×10-10 M의 해리 상수(KD), 인간 ST2L에 대한 약 2×106 M-1s-1 내지 약 1×108 M-1s-1의 결합 속도 상수(on rate constant)(Kon), 또는 인간 ST2L에 대한 약 1×10-6 s-1 내지 약 1×10-2 s-1의 해리 속도 상수(off rate constant)(Koff)로 인간 ST2L에 결합한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 항체는 약 7×10-10 M 미만, 약 1×10-10 M 미만, 약 5×10-11 M 미만, 약 1×10-11 M 미만, 또는 약 5×10-12 M 미만의 KD로 인간 ST2L에 결합한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 항체는 마카카 파시큘라리스(시노(cyno)) ST2L(서열 번호 2)과 교차-반응하고 약 3×10-12 M 내지 약 2×10-9 M의 해리 상수(KD), 시노 ST2L에 대한 약 4×106 M-1s-1 내지 약 1×108 M-1s-1의 결합 속도 상수(Kon), 또는 시노 ST2L에 대한 약 7×10-5 s-1 내지 약 1×10-1 s-1의 해리 속도 상수(Koff)로 시노 ST2L에 결합할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 항체는 약 2×10-9 M 미만, 약 1×10-9 M 미만, 약 1×10-10 M 미만, 약 1×10-11 M 미만, 또는 약 3×10-12 M 미만의 KD로 시노 ST2L에 결합한다.
ST2L에 대한 항체의 친화력은 임의의 적합한 방법을 사용하여 실험적으로 결정할 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 공지된 프로테온(ProteOn) XPR36, 바이아코어(Biacore) 3000, 또는 키넥스A(KinExA) 기기 장치, ELISA, 또는 경쟁적 결합 어세이를 이용할 수 있다. 상이한 조건(예를 들어, 삼투성, pH) 하에 측정할 경우, 특정 항체/ST2L 상호작용의 측정된 친화력은 변동될 수 있다. 따라서, 바람직하게는 표준화된 조건 및 표준화된 완충액, 예를 들어 본 명세서에 기재된 완충액을 이용하여 친화력 및 다른 결합 파라미터(예를 들어, KD, Kon, Koff)의 측정을 실행한다. 예를 들어 바이아코어 3000 또는 프로테온을 사용하는 친화력 측정에 대한 내부 오차(표준 편차, SD로서 측정됨)는, 전형적인 검출 한계 이내의 측정의 경우에 전형적으로 5 내지 33% 이내일 수 있음을, 당업자는 인식할 것이다. 그러므로, 용어 "약"은 어세이에서의 전형적인 표준 편차를 반영한다. 예를 들어, 1×10-9 M의 KD에 대한 전형적인 SD는 최대 ±0.33×10-9 M이다.
인간 ST2L에 목적하는 친화력으로 결합하고 임의로 시노 ST2L과 교차-반응하는 항체는 변이체 또는 단편의 라이브러리로부터 인간 및/또는 시노 ST2L로 패닝(panning)함으로써, 그리고 임의로 추가의 항체 친화력 성숙에 의해 선택될 수 있다. 임의의 적합한 방법을 사용하여 항체의 ST2L 생물 활성의 억제를 기반으로 항체를 동정할 수 있다. 이들 방법은 리포터-유전자 분석, 또는 잘 알려져 있는 방법을 사용하는, 그리고 본 출원서에 기재된 바와 같은, 사이토카인 생성을 측정하는 분석을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태는,
서열 번호 160(X1X2X3MX4)의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1(HCDR1)
(여기서, X1은 S, F, D, I, G, 또는 V이고;
X2는 Y 또는 D이며;
X3은 A, D, 또는 S이고;
X4는 S, F, 또는 I임);
서열 번호 161(X5IX6GX7GGX8TX9YADSVKG)의 HCDR 2(HCDR2)
(여기서, X5는 A, S, T, Y, 또는 D이고;
X6은 S, R, E, K, G, 또는 A이며;
X7은 S, E, 또는 N이고;
X8은 S, R, E, G, T, D, 또는 A이며;
X9는 Y, D, N, A, 또는 S임); 및
서열 번호 162(X10X11WSTEGSFFVLDY)의 HCDR 3(HCDR3)
(여기서, X10은 D, A, R, N, Q, P, E, I, H, S, T, 또는 Y이고;
X11 은 P, A, H, Y, E, Q, L, S, N, T, V, 또는 I임)을 포함하는, 인간 ST2L에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 길항제이다.
본 발명의 다른 실시 형태는,
서열 번호 163(RASQSVDDX12LA)의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1(LCDR1)
(여기서, X12는 A 또는 D임);
서열 번호 90(DASNRAT)의 LCDR 2(LCDR2); 및
서열 번호 164(QQX13X14X15X16X17X18T)의 LCDR 3(LCDR3)
(여기서, X13은 F 또는 Y이고;
X14는 Y, I, 또는 N이며;
X15는 N, G, D, 또는 T이고;
X16은 W 또는 A이며;
X17은 P이거나 결실되고;
X18은 L 또는 I임)을 포함하는 인간 ST2L에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 길항제이다.
각각 서열 번호 160, 161, 162, 163, 90, 및 164의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 본 발명의 항체는, 예를 들어, 각각 서열 번호 78, 81, 84, 87, 90, 및 92의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 주형으로 사용하는 주지의 돌연변이유발 방법에 의해 제조될 수 있다. 각각 서열 번호 160, 161, 162, 163, 90, 및 164의 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR은, 하기의 프레임워크와 같은 인간 프레임워크에 이식될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여, ST2L에 대한 결합 및 IL-33/ST2L 상호작용을 차단하는 항체의 능력 및 다른 특징들, 예를 들어 인간 ST2L 및/또는 시노 ST2L에 대한 친화력, 및 비만 세포 반응의 저해에 대해 항체를 어세이할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 인간 ST2L에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 길항제는,
서열 번호 78 또는 95 내지 108의 HCDR1;
서열 번호 81, 109 내지 118, 또는 120 내지 129의 HCDR2;
서열 번호 84 또는 165 내지 185의 HCDR3;
서열 번호 87 또는 130의 LCDR1;
서열 번호 90의 LCDR2; 및
서열 번호 92 또는 131 내지 134의 LCDR3을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 인간 ST2L에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 길항제는 도 10, 도 11, 및 도 12에 나타내고 본 명세서에 기재된 바와 같이 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 인간 ST2L에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 길항제는,
서열 번호 23 또는 24의 HCDR1;
서열 번호 27 또는 28의 HCDR2;
서열 번호 31 또는 32의 HCDR3;
서열 번호 35 또는 36의 LCDR1;
서열 번호 39 또는 40의 LCDR2; 및
서열 번호 43 또는 44의 LCDR3을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 인간 ST2L에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 길항제는, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열:
각각 서열 번호 23, 27, 31, 35, 39, 및 43;
각각 서열 번호 24, 28, 32, 36, 40, 및 44; (HFA CDR);
각각 서열 번호 24, 28, 146, 36, 40, 및 147; 또는
각각 서열 번호 24, 28, 146, 36, 40, 및 44를 포함한다.
본 발명의 다른 실시 형태는, 인간 IGHV3-23(서열 번호 158), IGHV1 -24*01(서열 번호 148), 또는 IGHV1-f*01(서열 번호 149) 프레임워크 서열로부터 유래된 VH 프레임워크를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 인간 IGKV3-11(L6)(서열 번호 159), IGKV3-15*01(L2)(서열 번호 150), IGKV1-9*01(L8)(서열 번호 151), IGKV1-5*01(L12)(서열 번호 152), IGKV1-12*01(L5)(서열 번호 153), IGKV1-39*01(O12)(서열 번호 154), IGKV1-27*01(A20)(서열 번호 155) 또는 IGKV1-33*01(O18)(서열 번호 156) 프레임워크 서열로부터 유래된 VL 프레임워크를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 본 명세서에 기재된 바와 같이 인간 ST2L에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 또는 인간-적응화 항체 길항제 또는 그의 단편(서열 번호 1)이다.
다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 인간 ST2L의 도메인 I에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는, 인간 VH 3-23 프레임워크 서열(서열 번호 158)로부터 유래된 VH 프레임워크를 포함하는 VH; 및 인간 Vk L6 프레임워크 서열(서열 번호 159)로부터 유래된 VL 프레임워크를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 인간 프레임워크 서열은 주지되어 있으며, 전형적으로 연결(J) 서열에 연결된 인간 면역글로불린 생식세포 가변 영역 서열을 포함한다. 서열 번호 158에 나타낸 인간 VH 3-23 프레임워크 아미노산 서열은 IGHJ4에 연결된 인간 생식세포 VH 3-23 서열을 포함하고, 서열 번호 159에 나타낸 인간 Vk L6 프레임워크 아미노산 서열은 IGKJ1에 연결된 인간 Vk L6 생식세포 서열을 포함한다(문헌[Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010]; 국제 특허 공개 제WO2009/085462호; 및 미국 특허 공개 제US2010/0021477호에 기재된 바와 같음). 인간 VH 3-23으로부터 유래된 VH 서열 및 인간 Vk L6으로부터 유래된 VL 서열을 갖는 예시적인 항체는 도 12 및 도 13에 나타낸 것들이다.
특정 프레임워크 또는 생식세포 서열 "로부터 유래된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 또는 인간-적응화 항체는, 인간 생식세포 면역글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터, 예를 들어 하기 논의된 바와 같이 형질전환 마우스로부터, 또는 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 얻어진 항체를 지칭한다. 특정 프레임워크 또는 생식세포 서열 "로부터 유래된" 항체는, 예를 들어 자연적으로 발생하는 체세포 돌연변이 또는 의도적인 치환으로 인해, 그것이 유래된 서열에 비교하여 아미노산 차이를 함유할 수 있다.
다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 인간 ST2L의 도메인 I(서열 번호 9)에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 또는 인간-적응화 항체 길항제 또는 그의 단편은 인간 ST2L(서열 번호 1)에 대한 결합에 대해 서열 번호 47의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 51의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 단리된 항체(항체 C2244)와 경쟁한다.
다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 본 발명의 단리된 항체는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 35 내지 48(RCPRQGKPSYTVDW; 서열 번호 210)에서 인간 ST2L에 결합한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 T93 및 F94에서 인간 ST2L에 추가로 결합할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 소정의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3, 및 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함하거나 소정의 VH 및 VL 서열을 포함하는 본 발명의 항체와 인간 ST2L에 대한 특이적 결합 사이의 경쟁은 주지의 방법을 사용하여 시험관내에서 어세이할 수 있다. 예를 들어, 표지되지 않은 항체의 존재 하에 MSD 설포-태그(Sulfo-Tag)(상표) NHS-에스테르-표지된 항체의 인간 ST2L에 대한 결합을 ELISA에 의해 평가할 수 있거나, 바이아코어 분석 또는 유세포 분석을 사용하여 본 발명의 항체와의 경쟁을 입증할 수 있다. 시험 항체가 인간 ST2L에 대한 C2244의 결합을 저해하는 능력은 시험 항체가 인간 ST2L에 대한 결합에 대해 이들 항체와 경쟁할 수 있다는 것을 입증한다. 이러한 예시적인 항체는 표 3 및 도 13에 나타낸 C2494, STLM208, 및 STLM213이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 ST2L의 도메인 I에 대한 결합에 대해 C2244와 경쟁하는 항체는 IL-33/ST2L 상호작용을 차단하고 IL-33-유도 비만 세포 반응을 포함하는 여러 가지 ST2L 생물 활성을 저해한다. 비-중화(즉, 비-저해) 에피토프 또한 ST2L 도메인 I 상에 제2 항체 경쟁 기(second antibody competition group)로서 존재한다(ST2L의 도메인 I에 결합하고, C2244와 경쟁하지 않으며, ST2L 신호전달을 저해하지 않는 항체 C2240에 의해 대표됨).
본 발명에 기재된 바와 같이 특이적 ST2L 도메인 또는 에피토프에 결합하는 본 발명의 항체는 인간 면역글로불린 좌위를 발현시키는 마우스(문헌[Lonberg et al., Nature 368:856-9, 1994]; 문헌[Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51, 1996]; 문헌[Mendez et al., Nature Genetics 15:146-56, 1997], 미국 특허 제5,770,429호, 제7,041,870호, 및 제5,939,598호) 또는 에피토프를 암호화하는 펩티드, 예를 들어 인간 ST2L의 도메인 I의 아미노산 서열: KFSKQSWGLENEALIVRCPRQGKPSYTVDWYYSQTNKSIPTQERNRVFASGQLLKFLPAAVADSGIYTCIVRSPTFNRTGYANVTIYKKQSDCNVPDYLMYSTV (서열 번호 9)를 갖는 펩티드, 또는 RCPRQGKPSYTVDW(서열 번호 210)의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 가진 Balb/c 마우스를 면역화하고, 문헌[Kohler et al., Nature 256:495-97, 1975]의 하이브리도마 방법을 사용함으로써 제조할 수 있다. 표준 방법을 사용하여, 생성되는 항체를 에피토프에 대한 그들의 결합에 대해 시험한다. 예를 들어, 개별 성분 둘 모두의 구조가 알려져 있는 경우에, 컴퓨터 모의실험(in silico) 단백질-단백질 도킹(docking)을 수행하여, 양립할 수 있는 상호작용의 부위를 동정할 수 있다. 항원 및 항체 복합체를 사용하여 수소-중수소(H/D) 교환을 수행하여, 항체에 의해 결합될 수 있는 항원 상의 영역을 맵핑(map)할 수 있다. 항원의 세그먼트 및 점 돌연변이생성을 사용하여, 항체 결합에 중요한 아미노산의 위치를 찾을 수 있다. 문헌[Queen et al., Proc Natl Acad Sci (USA) 86:10029-32, 1989] 및 문헌 [Hodgson et al., Bio/Technology 9:421, 1991]에 개시된 것들과 같은 기술에 의해, 결합 친화력을 보존하도록 변경된 프레임워크 지지 잔기를 혼입시킴으로써, 동정된 mAb를 추가로 변형시킬 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 항체는 인간 또는 인간-적응화 항체일 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM 유형의 것일 수 있다.
항원-결합 부위 아미노산 서열이 도 10, 도 11, 도 12, 도 13, 도 15, 표 3, 표 9, 및 표 12에 나타낸 것들과 실질적으로 동일한 항체는 본 발명의 범주 내에 포함된다. 전형적으로, 이는 유사한 전하 또는 소수성 또는 입체화학적 특징을 갖는 아미노산을 이용하며, 항체 특성, 예를 들어 안정성 또는 친화력을 개선하기 위해 실행되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 보존적 치환은 그 위치에서 아미노산 잔기의 극성 또는 전하 상의 효과가 없거나 거의 없도록 천연 아미노산 잔기를 비천연 잔기로 치환하는 것을 포함할 수 있다. 추가로, 폴리펩티드 내의 임의의 천연 잔기는 또한, 알라닌 스캐닝(alanine scanning) 돌연변이유발에 대해 이전에 기재된 바와 같이 알라닌으로 치환될 수 있다(문헌[MacLennan et al., Acta Physiol Scand Suppl 643:55-67, 1998]; 문헌[Sasaki et al., Adv Biophys 35:1-24, 1998]). 요망되는 아미노산 치환(보존적이든지 비-보존적이든지 간에)은 이러한 치환을 원하는 때에, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환을 사용하여 항체의 작용에 중요한 잔기, 예를 들어 친화력에 영향을 주는 잔기, 또는 응집과 같이 바람직하지 않은 특성을 부여하는 잔기를 동정할 수 있다. 예시적인 아미노산 치환은 도 12 및 도 13에 나타낸다.
항원 결합 부위와는 대조적으로, 항체의 특성에 불리한 영향을 주지 않는 한, 프레임워크 영역 내의 치환 또한 실행될 수 있다. 예를 들어 베르니에 구역(Vernier Zone) 잔기(미국 특허 제6,649,055호)에서 프레임워크 치환을 실행하여 항체 친화력 또는 안정성을 개선할 수 있다. 또한, 상동 인간 생식세포 유전자 서열에 비교할 때 서열이 상이한 항체 내의 프레임워크 위치에서 치환을 실행하여 가능한 면역원성을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, pIX 라이브러리와 같은 신생(de novo) 항체 라이브러리로부터 유래된 항체에 이들 변형을 실행할 수 있다.
또한, 보존적 아미노산 치환은 생물학적 시스템 내에서의 합성에 의한 것보다는 전형적으로 화학적 펩티드 합성에 의해 혼입되는 비-자연 발생 아미노산 잔기를 포함한다. 아미노산 치환은, 예를 들어 PCR 돌연변이유발에 의해 실행될 수 있다(미국 특허 제 4,683,195호). 예를 들어 무작위(NNK) 또는 비-무작위 코돈, 예를 들어 11개 아미노산(ACDEGKNRSYW)을 암호화하는 DVK 코돈을 사용하고, 목적하는 특성을 가진 라이브러리 또는 변이체를 스크리닝하는 주지의 방법을 사용하여, 변이체의 라이브러리를 생성시킬 수 있다.
실시예에 예시된 실시 형태는 가변 영역의 쌍, 전체 길이 항체 쇄의 쌍, 또는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역의 쌍(중쇄로부터 하나 및 경쇄로부터 하나)을 포함하지만, 대안적인 실시 형태는 단일 중쇄 가변 영역 또는 단일 경쇄 가변 영역, 단일 전체 길이 항체 쇄, 또는 중쇄 또는 경쇄의 하나의 항체 쇄로부터의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역을 포함할 수 있음을, 당업자는 인식할 것이다. 단일 가변 영역, 전체 길이 항체 쇄, 또는 하나의 쇄의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역을 사용하여 다른 쇄에서 상응하는 도메인에 대해 스크리닝할 수 있으며, 그 2개의 쇄는 ST2L에 특이적으로 결합하는 항체를 형성할 수 있다. 예를 들어, PCT 공개 제WO1992/01047호에 개시된 계층적 이중 조합 접근법(hierarchical dual combinatorial approach)을 사용하는 파아지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 스크리닝을 수행할 수 있다. 이러한 접근법에서, H 또는 L 사슬 클론 중 하나를 함유하는 개별 콜로니를 사용하여, 다른 사슬(L 또는 H)을 코딩하는 클론의 완전한 라이브러리를 감염시키고, 생성되는 2-사슬 특이적 항원-결합 도메인을 기재된 바와 같은 파지 디스플레이 기술에 따라 선택한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 항체의 단리된 VH 및 VL 도메인, 및 소정의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체를 제공한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 본 발명의 소정의 항체에 대한 VH 및 VL 가변 영역은 도 13 및 표 12에 나타낸다.
본 발명의 일 실시 형태는, 서열 번호 191의 VH와 90% 이상 동일한 VH를 포함하는 인간 ST2L의 도메인 I(서열 번호 9)에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 또는 인간-적응화 항체 길항제 또는 그의 단편이다.
본 발명의 다른 실시 형태는, 서열 번호 209의 VL과 94% 이상 동일한 VL을 포함하는 인간 ST2L의 도메인 I(서열 번호 9)에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 또는 인간-적응화 항체 길항제 또는 그의 단편이다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 143, 144, 145, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 또는 205의 VH를 포함하는 항체를 제공한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 206, 207, 208, 또는 209의 VL을 포함하는 항체를 제공한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 본 발명은
서열 번호 186, 187, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 또는 205의 VH 및 서열 번호 206의 VL;
서열 번호 195 또는 196의 VH 및 서열 번호 207의 VL;
서열 번호 188, 189, 또는 190의 VH 및 서열 번호 208의 VL; 또는
서열 번호 187, 191, 192, 193, 또는 194의 VH 및 서열 번호 209의 VL을 포함하는 항체를 제공한다.
본 발명의 다른 실시 형태는,
서열 번호 97의 HCDR1;
서열 번호 114의 HCDR2;
서열 번호 84의 HCDR3;
서열 번호 130의 LCDR1;
서열 번호 90의 LCDR2;
서열 번호 134의 LCDR3; 또는
서열 번호 191의 VH 및 서열 번호 209의 VL을 포함하는, 인간 ST2L의 도메인 I(서열 번호 9)에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 또는 인간-적응화 항체 길항제 또는 그의 단편이다.
임의의 비-인간 서열이 결여된 인간 mAb는, 예를 들어, 문헌[Knappik et al., J Mol Biol 296:57-86, 2000]; 및 문헌[Krebs et al., J Immunol Meth 254:67-84 2001]에 언급된 기술에 의해 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 제조되고 최적화될 수 있다. 예시적인 방법에서, 본 발명의 항체는 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 박테리오파아지 pIX 코트 단백질과의 융합 단백질로서 발현시키는 라이브러리로부터 단리된다. 항체 라이브러리를 인간 ST2L-ECD에 대한 결합에 대해 스크리닝하고, 얻어진 양성 클론을 추가로 특성화하고, 클론 용해물로부터 Fab를 단리하고, 전체 길이 IgG로서 발현시킨다. 예시적인 항체 라이브러리 및 스크리닝 방법은 문헌[Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010]; 국제 특허 공개 제WO2009/085462호, 및 미국 출원 제12/546850호; 미국 특허 제5,223,409호, 제5,969,108호, 및 제5,885,793호에 기재되어 있다.
생성되는 mAb를 그들의 프레임워크 영역 내에서 추가로 변형시켜 소정의 프레임워크 잔기를 일치하는 인간 생식세포에 존재하는 것들로 변경할 수 있다.
당업자에게 공지된 기술에 의한 Fc 변형을 통해 본 발명의 항체의 면역 효과 특성을 증진하거나 억제할 수 있다. 이들 활성을 담당하는 Fc 내의 잔기를 변형시킴으로써, 예를 들어, C1q 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC: complement dependent cytotoxicity), 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC: antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity), 식작용, 세포 표면 수용체의 하향 조절(예를 들어, B 세포 수용체(BCR: B cell receptor)) 등과 같은 Fc 효과 작용을 제공하고/하거나 제어할 수 있다. 항체 반감기를 연장하는 Fc 도메인 내의 잔기를 돌연변이시킴으로써 약물 동태학적 특성 또한 증진될 수 있을 것이다(문헌[Strohl Curr Opin Biotechnol 20:685-91, 2009]). 예시적인 Fc 변형은 IgG4 S228P/L234A/L235A, IgG2 M252Y/S254T/T256E(문헌[Dall'Acqua et al., J Biol Chem 281:23514-24, 2006]); 또는 IgG2 V234A/G237A/P238S, V234A/G237A/H268Q, H268A/V309L/A330S/P331, 또는 IgG2 상의 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S(국제 특허 출원 제WO2011/066501호)(EU 번호화에 따른 번호화)이다.
부가적으로, 본 명세서에 기재된 바와 같이 본 발명의 항체는 글리코실화, 이성체화, 탈글리코실화(deglycosylation), 또는 비-자연 발생 공유적 변형, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 부분의 첨가(페길화(pegylation)) 및 지질화와 같은 과정에 의해 번역-후 변형될 수 있다. 이들 변형은 생체 내에서 또는 시험관 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 본 발명의 항체는 폴리에틸렌 글리콜에 접합되어(페길화됨), 이들의 약물 동태학적 프로파일을 개선할 수 있다. 접합은 당업자에게 알려져 있는 기술에 의해 수행될 수 있다. 치료 항체와 PEG의 접합은 작용을 방해하지 않으면서 약물 동력학 특성을 증진하는 것으로 나타났다(문헌[Knigh et al., Platelets 15:409-18, 2004]; 문헌[Leong et al., Cytokine 16:106-19, 2001]; 문헌[Yang et al., Protein Eng 16:761-70, 2003]).
본 명세서에 기재된 바와 같이, 안정성, 선택성, 교차-반응성, 친화력, 면역원성, 또는 다른 바람직한 생물학적 특성 또는 생물물리학적 특성을 개선하기 위해 변형된 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 본 발명의 범주 내에 있다. 항체의 안정성은 (1) 그들의 고유 안정성에 영향을 주는 개별 도메인의 코어 패킹(core packing), (2) HC 및 LC 페어링에 영향을 갖는 단백질/단백질 계면 상호작용, (3) 극성 및 하전된 잔기의 매립(burial), (4) 극성 및 하전된 잔기에 대한 H-결합 네트워크; 및 (5) 다른 분자-내 및 분자-간 힘 중 특히 표면 전하 및 극성 잔기 분포를 포함하는 다수의 인자에 의해 영향을 받는다(문헌[Worn et al., J Mol Biol 305:989-1010, 2001]). 유력한 구조 불안정화 잔기는 항체의 결정 구조에 기초하여 또는 특정 경우에 분자 모델링에 의하여 동정할 수 있으며, 동정된 잔기 내에 돌연변이를 갖는 변이체를 생성하고 평가함으로써, 항체 안정성 상의 잔기의 영향을 시험할 수 있다. 항체 안정성을 증가시키는 방법 중 하나는 시차 주사 열량계(DSC)에 의해 측정되는 열 전이 중간점(Tm)을 상승시키는 것이다. 일반적으로, 단백질 Tm은 그의 안정성과 비례하며, 용액 내에서의 언폴딩(unfolding) 및 변성, 및 단백질이 언폴딩되는 경향에 따라 달라지는 분해 과정에 대한 그의 감수성과 반비례한다(문헌[Remmele et al., Biopharm 13:36-46, 2000]). 수많은 연구에서 DSC에 의해 열 안정성으로 측정한 제형의 물리적 안정성의 순위와 다른 방법에 의해 측정된 물리적 안정성 간의 상관관계를 찾아내었다(문헌[Gupta et al., AAPS PharmSci 5E8, 2003]; 문헌[Zhang et al., J Pharm Sci 93:3076-89, 2004]; 문헌[Maa et al., Int J Pharm 140:155-68, 1996]; 문헌[Bedu-Addo et al., Pharm Res 21:1353-61, 2004];문헌[Remmele et al., Pharm Res 15:200-8, 1997]). 제형 연구는 Fab Tm이 상응하는 mAb의 장기 물리적 안정성에 대한 영향을 갖는다는 것을 제안한다. 프레임워크 또는 CDR 내의 아미노산의 차이는 Fab 도메인의 열 안정성 상에 유의적인 효과를 가질 수 있다(문헌[Yasui et al., FEBS Lett 353:143-6, 1994]).
본 명세서에 기재된 바와 같이, 인간 ST2L의 도메인 I에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체는 이중특이적 항체로 조작될 수 있으며, 이 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다. 공개된 방법을 사용하여 본 발명의 항체의 VL 및/또는 VH 영역을 탠드Ab(TandAb)(등록상표) 설계와 같은 구조로서 단쇄 이중특이적 항체로 조작하거나(국제 특허 공개 제WO1999/571506호; 미국 특허 공개 제US2011/0206672호), 미국 특허 제US5869620호; 국제 특허 공개 제WO1995/15388A호, 국제 특허 공개 제WO1997/14719호, 또는 국제 특허 공개 제WO2011/036460호에 개시된 것들과 같은 구조로서 이중특이적 scFV로 조작할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 항체의 VL 및/또는 VH 영역은 이중특이적 전체 길이 항체로 조작될 수 있으며, 여기서 각각의 항체 팔은 별개의 항원 또는 에피토프에 결합된다. 이러한 이중특이적 항체는 전형적으로, 미국 특허 제US7695936호; 국제 특허 공개 제WO04/111233호; 미국 특허 공개 제US2010/0015133호; 미국 특허 공개 제US2007/0287170호; 국제 특허 공개 제WO2008/119353호; 미국 특허 공개 제US2009/0182127호; 미국 특허 공개 제US2010/0286374호; 미국 특허 공개 제US2011/0123532호; 국제 특허 공개 제WO2011/131746호; 국제 특허 공개 제WO2011/143545호; 또는 미국 특허 공개 제US2012/0149876호에 기재된 것들과 같은 기술을 사용하여 이중특이적 항체를 형성하도록 2개의 항체 중쇄 사이의 CH3 상호작용을 조절함으로써 제조된다. 본 발명의 항체의 VL 및/또는 VH 영역이 혼입될 수 있는 부가적인 이중특이적 구조는, 예를 들어 이중 가변 도메인 면역글로불린(국제 특허 공개 제WO2009/134776호), 또는 상이한 특이성을 가진 2개의 항체 팔을 연결하기 위한 다양한 이량체화 도메인, 예를 들어 류신 지퍼 또는 콜라겐 이량체화 도메인(국제 특허 공개 제WO2012/022811호, 미국 특허 제US5932448호; 미국 특허 제US6833441호)을 포함하는 구조이다.
본 발명의 다른 태양은, 본 발명의 항체 중쇄 가변 영역 또는 항체 경쇄 가변 영역 또는 그의 단편 또는 그의 보체 중 임의의 것을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 소정의 예시적인 폴리뉴클레오티드가 본 명세서에 개시되나, 주어진 발현 시스템 내에서 유전자 코드의 축퇴성 또는 코돈 선호도를 고려하여, 본 발명의 항체 길항제를 암호화하는 다른 폴리뉴클레오티드 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 본 발명의 예시적인 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 211, 212, 213, 및 214에 나타낸 것들이다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다. 이들 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 배큘로바이러스(baculovirus) 발현용 벡터, 트랜스포존(transposon) 기반의 벡터, 또는 임의의 수단에 의한 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 주어진 유기체 또는 유전자 백그라운드(genetic bac㎏round)로의 도입에 적절한 임의의 다른 벡터일 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포이다. 이들 숙주 세포는 진핵 세포, 박테리아 세포, 식물 세포 또는 고세균(archeal) 세포일 수 있다. 예시적인 진핵 세포는 포유동물, 곤충, 조류 또는 다른 동물 기원의 것일 수 있다. 포유동물 진핵 세포는 불멸화 세포주, 예를 들어 하이브리도마 또는 골수종 세포주, 예를 들어 SP2/0(버지니아주 머내서스 소재의 미국 미생물 보존 센터(ATCC: American Type Culture Collection), CRL-1581), NS0(영국 윌트셔 샐리스버리 소재의 유럽 세포주 은행(ECACC: European Collection of Cell Cultures), ECACC No. 85110503), FO(ATCC CRL-1646), 및 Ag653(ATCC CRL-1580) 쥐과 세포주를 포함한다. 예시적인 인간 골수종 세포주는 U266(ATTC CRL-TIB-196)이다. 다른 유용한 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예를 들어 CHO-K1SV(Lonza Biologics, Walkersville, MD), CHO-K1(ATCC CRL-61) 또는 DG44로부터 유래된 것을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 형태는, 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 숙주 세포에 의해 생성된 항체를 회수하는 단계를 포함하는, ST2L의 도메인 I에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법이다. 항체의 제조방법 및 이들의 정제방법은 해당 분야에 잘 알려져 있다.
대상 내에서 IL-33과 ST2L의 상호작용을 저해하는 방법의 본 발명의 다른 실시 형태는 ST2L의 도메인 I에 특이적으로 결합하는 항체를 ST2L과 IL-33의 상호작용을 저해하기에 충분한 양으로 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
치료 방법
본 명세서에 기재된 바와 같이 본 발명의 ST2L 길항제, 예를 들어 IL-33/ST2L 상호작용을 차단하고 ST2L의 도메인 I에 결합하는 ST2L 항체 길항제, 인간 ST2L(서열 번호 1)에 대한 결합에 대해 서열 번호 47의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 51의 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체와 경쟁하는 항체, 또는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 35 내지 48(RCPRQGKPSYTVDW; 서열 번호 210)에서 인간 ST2L에 결합하는 항체를 이용하여 면역 시스템을 조절할 수 있다. 본 발명의 항체는 IL-33-유도 비만 세포 반응을 더 효율적으로 감소시킬 수 있으므로, 본 명세서에 기재된 바와 같이, ST2L 상의 다른 도메인 및/또는 영역에 결합하는 항체에 비교할 때, 본 발명의 항체는 ST2L 생물 활성을 길항함에 있어서 더 효율적일 수 있다. 본 발명의 임의의 항체를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 예시적인 항체는 항체 STLM62, STLM15, STLM103, STLM107, STLM108, STLM123, STLM124, STLM206, STLM207, STLM208, STLM209, STLM210, STLM211, STLM212, STLM213이다. 임의의 이론에 구애되고자 하는 것은 아니나, 도메인 I에 결합하고 IL-33/ST2L 상호작용을 차단하는 항체 길항제는 IL-1RAcP/IL-33/ST2L/cKit 복합체의 형성 또는 비만 세포 상의 다운스트림 신호전달을 저해할 수 있는 반면에, 도메인 III 결합 항체는 IL-1RAcP의 ST2L/IL-33 복합체로의 동원을 저해할 수 있지만, 비만 세포 상에서 특이적으로 확인된 더 큰 IL-1RAcP/IL-33/ST2L/cKit 복합체의 형성을 방해하지 못할 수 있다는 것이 제안된다. 항-ST2L 도메인 I 결합 항체는 IL-33에 의해 유도된 대부분의 비만 세포 신호전달 경로를 억제했고, 항-ST2L 도메인 III 결합 항체는 이들 신호전달 경로 중 작은 서브세트를 저해할 수 있을 뿐이었음이 입증되었으므로, 수행된 마이크로어레이 분석은 그 제안을 지지한다. 보조 단백질 IL-1RAcP의 회합 전에 IL-33이 ST2L에 결합하므로, ST2L에 대한 IL-33 결합이 도메인 I-결합 항체에 의해 차단되면 cKit 또는 아직 동정되지 않은 공동-수용체를 포함하는 임의의 다른 보조 단백질의 회합을 방지할 수 있는 개연성이 있다. ST2L에 대한 IL-33 결합을 방해하지 않는 도메인 III-결합 항체는, 이론적으로 IL-1RAcP 회합을 차단할 수 있을 것이나, 아직 동정되지 않은 공동-수용체를 포함하는 다른 공동-수용체의 회합은 차단하지 못할 것이다. IL-1RAcP가 어떻게 IL-1/IL-1R 또는 ST2L/IL-33 복합체와 상호작용하는지에 관해 다중 모델이 제시되었다(문헌[Lingel et al., Structure 17: 1398-1410, 2009]; 및 문헌[Thomas et al., Nat Struct & Molec Biol 19: 455-457, 2012]에 개관됨). 이들 모델은 IL-1RAcP가 복합체의 한 측면에 결합할 수 있을 것임을 시사하나, 어느 측면인지는 확정적으로 나타나 있지 않다. 그러므로 복합체의 '다른 측면' 또는 '자유 측면'이 대체 공동-수용체와의 회합에 대해 이용가능할 개연성이 있으며, 그것은 도메인 III 항체에 의해 차단되지 않을 것이고, 증가된 신호전달을 유발하는 다른 공동-수용체의 증가된 동원과 같은 부정확한 효과(off-target effect)가 가능하다.
본 발명의 방법에서, 인간 ST2L의 도메인 I에 특이적으로 결합하는 임의의 항체 길항제, IL-33/ST2L 상호작용을 차단하고 인간 ST2L의 도메인 I에 결합하는 항체 길항제, 인간 ST2L(서열 번호 1)에 대한 결합에 대해 서열 번호 47의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 51의 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체와 경쟁하는 항체, 또는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 35 내지 48(RCPRQGKPSYTVDW; 서열 번호 210)에서 인간 ST2L에 결합하는 항체를 사용할 수 있다. 이러한 항체의 부가적인 특징은 IL-33/ST2L 상호작용을 차단하고 인간 비만 세포 반응을 저해하는 항체의 능력을 포함한다.
그러므로, 본 발명의 항체는 여러 가지 ST2L-매개 병태, ST2L-매개 염증성 병태, 및 비만 세포 반응의 저해를 목적하는 병태의 치료에 적합하다.
본 발명의 방법은 임의의 분류에 속하는 동물 환자를 치료하기 위해 사용할 수 있다. 이들 동물의 예에는 포유동물, 예를 들어 인간, 설치류, 개, 고양이 및 가축이 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 ST2L-매개 병태, 예를 들어 천식, 기도 과민 반응, 유육종증, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD: chronic obstructive pulmonary disease), 특발성 폐 섬유증(IPF: idiopathic pulmonary fibrosis), 낭포성 섬유증, 염증성 장 질환(IBD: inflammatory bowel disease), 류머티스 관절염, 호산구성 식도염, 피부경화증, 아토피성 피부염, 알러지성 비염, 수포성 유사천포창, 만성 두드러기, 당뇨병성 신증, 간질성 방광염, 또는 이식편 대 숙주 질환(GVHD: Graft Versus Host Disease)을 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료에 유용하다. 본 발명의 항체는 적어도 부분적으로 비만 세포에 의해 매개되는 면역 질환, 예를 들어 천식, 습진, 소양증, 알러지성 비염, 알러지성 결막염과 더불어, 자가면역 질환, 예를 들어 류머티스 관절염, 수포성 유사천포창, 및 다발성 경화증의 예방 및 치료에 유용하다.
본 발명의 항체는 또한 이러한 치료를 위한 의약품의 제조에 유용하며, 여기서 의약품은 본 명세서에 정의된 투여량으로 투여하기 위해 제조된다.
비만 세포는 그들의 다양한 매개체의 방출을 통해 알러지성 염증 및 천식에서 중심 역할을 한다(문헌[Amin, Respir Med 106:9-14, 2012]에 개관됨). ST2L은 비만 세포 상에 고도로 발현되며, 그의 활성화는 다수의 전염증성 사이토카인 및 다른 매개체의 발현을 유발한다. ST2L 활성의 저해는 비만 세포 매개 염증성 세포 동원을 방해하고 만성 염증을 조절하는 것으로 제시된다.
비만 세포는 알러지원, 차가운 공기, 병원체를 포함하는 자극에 대한 신속한 반응자(responder)이며; 이들 자극에 의한 상피의 손상은 IL-33의 방출을 유발할 수 있다(문헌[Zhao and Hu, Cell & Molec Immunol 7: 260-2, 2012]에 개관됨). 비만 세포는 류코트라이엔, 히스타민, 프로스타글란딘, 및 사이토카인을 방출하여 혈관 투과성 및 기관지수축을 증가시키고, 호중구, 호산구, 및 T 림프구와 같은 다른 면역 세포를 현장에 동원한다(문헌[Henderson et al., JEM 184:1483-94, 1996]; 문헌[White et al., JACI 86:599-605, 1990]). 부가적으로, 그들은 내피 세포 상에 접착 분자 상향 조절을 유도하여 면역 세포 이동을 증가시킴으로써 면역 반응을 증진한다(문헌[Meng et al., J Cell Physiol 165:40-53, 1995]). 비만 세포는 기도 개형(airway remodeling)에서 중요한 역할을 하며; 천식 환자에서는, 증가된 수의 비만 세포가 기도 평활근(ASM: airway smooth muscle) 세포 층 내부에서 발견되고, ASM 증식을 촉진하는 매개체를 분비한다(문헌[Okayama et al., Curr Opin Immunol 19:687-93, 2007]에 개관됨).
염증성 폐 병태는 염증성 병태의 예이다. 예시적인 염증성 폐 병태는 바이러스, 박테리아, 진균류, 기생충 또는 프리온(prion) 감염과 관련된 것을 비롯한 감염-유도성 폐 병태; 알러지원-유도성 폐 병태; 석면증(asbestosis), 규폐증(silicosis), 또는 벨릴륨증(berylliosis)과 같은 오염물질-유도성 폐 병태; 위 흡인-유도 폐 병태, 면역 조절 곤란, 낭포성 섬유증과 같은 유전적 소인이 있는 염증성 병태, 및 호흡기 손상(ventilator injury)과 같은 물리적 외상-유도 폐 병태를 포함한다. 이들 염증성 증상은 또한 천식, 폐기종, 기관지염, 만성폐쇄폐질환(COPD), 사코이드증, 조직구증, 림프관근종증, 급성 폐 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 만성 폐 질환, 기관지폐형성이상, 지역사회-획득 폐렴, 병원내 폐렴, 호흡기-관련 폐렴, 패혈증, 바이러스성 폐렴, 인플루엔자 감염, 파라인플루엔자 감염, 로타바이러스 감염, 인간 메타뉴모바이러스(metapneumovirus), 호흡기 세포융합 바이러스 감염 및 아스파르길루스 또는 다른 진균류 감염을 포함한다. 예시적인 감염-관련 염증성 질환은 중증 폐렴, 낭성섬유증, 기관지염, 기도 결절(airway exacerbations), 및 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS)를 비롯한 바이러스 또는 박테리아 폐렴을 포함할 수 있다. 그러한 감염-관련 증상은 일차 바이러스 감염 및 이차 박테리아 감염과 같은, 다중 감염을 포함할 수 있다. 조절 곤란 ST2L 신호전달은 천식 및 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)과 같은 폐 질환의 병리에서 역할을 담당할 수 있다(문헌[Alcorn et al., Annu Rev Physiol 72:495-516, 2010]에 개관됨). 통상적으로 사용되는 천식 및 기도 염증에 대한 동물 모델은 오브알부민 챌린지 모델, 메타콜린 감작 모델, 및 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)를 이용하는 감작을 포함한다(문헌[Hessel et al., Eur J Pharmacol 293:401-12, 1995]). 또한, 배양된 인간 기관지 상피 세포, 기관지 섬유모세포 또는 기도 평활근 세포로부터의 사이토카인 및 케모카인 생성의 억제는 시험관 내 모델로 사용될 수 있다. 이들 모델 중 임의의 것에 본 발명의 길항제의 투여를 사용하여, 천식, 기도 염증, COPD 등의 경로를 변경하고 증상을 개선하기 위한 이들 길항제의 용도를 평가할 수 있다.
천식은 기도 과민성("AHR"), 기관지수축, 천명, 호산구 또는 호중구 염증, 점액 과다분비, 상피하 섬유증, 및 상승된 IgE 수준을 특징으로 하는 폐의 염증성 질환이다. 천식 환자는 가장 통상적으로 호흡기의 미생물 감염(예를 들어, 리노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 헤모필루스 인플루엔자 등)에 기인하여, 증상이 나빠지는 "악화"를 경험한다. 천식 발작은 환경 인자(예를 들어, 회충, 곤충, 동물(예를 들어, 고양이, 개, 토끼, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니아 피그 및 새), 진균류, 공기 오염물질(예를 들어, 담배 연기), 자극성 가스, 퓸(fume), 증기, 에어로졸, 화학물질, 화분, 운동 또는 찬 공기)에 의해 촉발될 수 있다. 천식과 별개로, 폐에 영향을 미치는 몇몇 만성 염증성 질환, 예를 들어, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 세균성 폐렴, 및 낭포성 섬유증은 기도로의 호중구 침윤을 특징으로 하며(문헌[Linden et al., Eur Respir J 15:973-7, 2000]; 문헌[Rahman et al., Clin Immunol 115:268-76, 2005]), COPD, 알러지성 비염, 및 낭포성 섬유증과 같은 질환은 기도 과민성을 특징으로 한다(문헌[Fahy and O'Byrne, Am J Respir Crit Care Med 163:822-3, 2001]). 통상적으로 사용되는 천식 및 기도 염증에 대한 동물 모델은 오브알부민 감작 및 챌린지 후의 메타콜린 챌린지 모델을 포함한다(문헌[Hessel et al., Eur J Pharmacol 293:401-12, 1995]). 또한, 배양된 인간 기관지 상피 세포, 기관지 섬유모세포 또는 기도 평활근 세포로부터의 사이토카인 및 케모카인 생성의 억제는 시험관 내 모델로 사용될 수 있다. 이들 모델 중 임의의 것에 본 발명의 항체 길항제의 투여를 사용하여, 천식, 기도 염증, COPD 등의 경로를 변경하고 증상을 개선하기 위한 이들 길항제의 용도를 평가할 수 있다.
TH2 세포, 호염기구, 비만 세포, 및 새로 기재된 선천성 림프구 유형 2 세포 상의 ST2L 수용체를 통한 IL-33 신호전달은 IL-5 및 IL-13(유형 2 사이토카인) 분비를 유발한다(문헌[Spits et al., Nature Reviews Immunology 13:145-149, 2013]에 의해 ILC가 개관됨). 천식에서 IL-5 또는 IL-13을 표적으로 하는 치료제의 유익한 효과는 이들 경로의 타당성을 확증한다. IL-5는 호산구를 활성화시키며, 객담 호산구 증가증을 동반하는 중증 천식 환자의 하위군을 IL-5를 중화시키는 단클론 항체로 치료하면 더 적은 결절이 유발되었다(문헌[Nair et al. N Engl J Med. 2009; 360(10):985-93]). IL-13은 IgE 합성, 점액 분비, 및 섬유증에 기여하는 것으로 보고되어 있다. 중증 천식 환자를 항-IL-13 단클론 항체로 치료하는 것은 폐 작용에 개선을 유발했다(하위군이 더 큰 개선을 입증함(문헌[Corren et al., N. Engl. J. Med., 365:1088-1098, 2011]). 차별적인 면역학적 경로의 다른 매개체 또한 천식 발병 기전에 관련되며, ST2L에 부가하여 이들 매개체를 차단하는 것은 부가적인 치료적 이익을 제공할 수 있다. 다중 유형 2 사이토카인, 또는 유형 2 사이토카인 생성의 업스트림의 경로를 표적으로 하는 요법이 중증 질환에 유익할 수 있다.
본 발명의 ST2L 항체의 VH 및 VL 도메인을 본 명세서에 기재된 이중특이적 항체 및 분자 내로 혼입시킬 수 있으며, 여기서 이중특이적 항체는 ST2L의 도메인 I 및 제2 항원, 예를 들어 TSLP(흉선 스트로마 림포포이에틴(thymic stromal lympohpoietin)), IL-25, IL-17RB, 또는 TSLPR에 특이적으로 결합한다.
IL-25 및 TSLP는, IL-33과 같이, 별개의 신호전달 복합체를 통해 유형 2 사이토카인 방출을 촉발한다: IL-25(IL-17E)는 IL-17 패밀리의 구성원이고 IL-17RA/IL-17RB를 통해 신호를 전달하며, TSLP는 IL-7 패밀리의 구성원이고 TSLPR/IL-7Ra 이종이량체를 통해 신호를 전달한다(문헌[Koyasu et al., Immunol 132:475-481, 2011]에 개관됨). IL-33, ST2L, IL-25, IL-17RB, TSLP, 또는 TSLPR이 결핍된 동물은 다수의 상이한 유형의 천식 마우스 모델 중 하나 이상에서 덜 중증인 기도 염증을 나타내지만; 이들 동물 모델 중 대부분에는 기도 염증으로부터의 보호의 결여가 존재할 수 있으며, 이는 다양한 알러지원 또는 병원체에 대한 상피의 노출이, IL-33, IL-25, 및 TSLP의 방출을 동시에 촉발할 수 있다는 가능성을 높인다. 함매드(Hammad) 등은 집먼지 진드기 추출물을 마우스에 투여했을 때 기도 내로의 IL-25, TSLP, 및 IL-33(IL-33의 다운스트림의 IL-5 및 IL-13과 더불어)의 방출이 유발되었음을 보고하였다(문헌[Hammad et al., Nat Med 15:210-216, 2009]). 이는 ST2L 및 TSLP 및/또는 IL-25를 차단하는 것이, 특히 중증 기도 질환에서 유익한 효과를 가질 수 있음을 제안한다.
본 발명의 다른 실시 형태에서는, 인간 ST2L의 도메인 I에 특이적으로 결합하는 항체 길항제를 사용하여 ST2L 및 TSLP, ST2L 및 IL-25, ST2L 및 TSLPR, ST2L 및 IL-17RA, 또는 ST2L 및 IL-17RB에 결합하는 이중특이적 분자를 생성시킬 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 인간 ST2L의 도메인 I에 특이적으로 결합하는 항체 길항제는 이중특이적 항체이며, 여기서 항체는 TSLP, IL-25, TSLPR, IL-17RA, 또는 IL-17RB에 추가로 결합한다.
인간 면역글로불린 좌위를 발현시키는 마우스(문헌[Lonberg et al., Nature 368:856-9, 1994]; 문헌[Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51, 1996]; 문헌[Mendez et al., Nature Genetics 15:146-56, 1997], 미국 특허 제5,770,429호, 제7,041,870호, 및 제5,939,598호) 또는 상응하는 단백질 또는 단백질의 세포외 도메인을 가진 Balb/c 마우스를 면역화하는 단계와 같은 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여, 또는 본 명세서에 기재된 파아지 디스플레이 라이브러리를 사용하여, TSLP, IL-25, TSLPR, IL-17RA, 및 IL-17RB 결합 항체를 생성시킬 수 있다. 대안적으로, TSLP, IL-25, TSLPR, IL-17RA, 및 IL-17RB에 대한 기존의 항체를 사용하여 이중특이적 분자를 생성시킬 수 있다. 사용할 수 있는 예시적인 IL-25 항체는, 예를 들어 국제 특허 공개 제WO2011/123507호에 기재된 것들이다.
골관절염, 류마티스 관절염, 손상의 결과로서 관절염이 있는 관절 등을 포함하는 관절염은 본 발명의 길항제와 같은 항염증성 단백질의 치료적 사용으로부터 이익을 얻을 통상적인 염증성 병태이다. ST2L 신호전달의 활성화는 염증을 영구화시키고, 염증이 생긴 관절에서 추가의 조직 손상을 영구화시킬 수 있다. 류머티스 관절염에 대한 몇몇 동물 모델이 공지되어 있다. 예를 들어, 콜라겐-유도성 관절염(CIA) 모델에서, 마우스에는 인간 류마티스성 관절염과 매우 유사한 만성 염증성 관절염이 생긴다. 이 모델에서 ST2L-결핍(ST2KO) 마우스는 발병이 약화되었고, 이 모델에서 병리는 비만 세포에 의한 ST2L 발현에 의존적이었다(문헌[Xu et al., PNAS 105:10913-8, 2008]). 이 모델에서는 ST2KO 마우스의 관절 내의 활막 과형성 및 단핵 세포 및 다형핵 세포의 침윤이 감소되었다. 콜라겐으로 배양한 ST2KO 마우스(CII)의 배출 LN(draining LN)은 유의적으로 감소된 IL-17, IFNg, 및 TNFa 생성을 나타냈다. CIA를 유도하기 전에 야생형(WT) 골수-유래 비만 세포(BMMC)가 입양 전달된(adoptively transferred) ST2L-결핍 마우스는, ST2KO BMMC를 이식한 것들보다 더 중증인 CIA가 발병했다. 그러므로 인간 류머티스 관절염과 유사한 마우스 모델에서 비만 세포에 의한 ST2L 신호전달은 관절염의 발병에 결정적이었다. CIA 모델 마우스에 비만 세포 반응을 저해하는 본 발명의 ST2L 항체의 투여를 사용하여 질환의 경로를 변경하고 증상을 개선하는 이들 길항제의 용도를 평가할 수 있다.
예시적인 위장 염증성 병태는 염증성 장 질환(IBD), 궤양성 대장염(UC) 및 크론 병(CD), 환경 자극에 의해 유도되는 대장염(예를 들어, 치료 요법, 예를 들어 화학 요법, 방사선 요법 등의 시행에 의해 유발되거나 이와 연계된(예를 들어, 부작용) 위장염증(예를 들어, 대장염)), 감염성 대장염, 허혈성 대장염, 교원성 또는 림프구성 대장염, 괴사성 장염, 만성 육아종 질환 또는 셀리악 병(celiac disease)과 같은 병태의 대장염, 음식물 알러지, 위염, 감염성 위염 또는 장염(예를 들어, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)-감염된 만성 활성 위염), 및 감염성 물질에 의해 유발되는 다른 형태의 위장 염증이다. 위장 염증성 병태에 대한 몇몇 동물 모델이 존재한다. 가장 널리 사용되는 모델의 일부는 2,4,6-트라이니트로벤설폰산/에탄올(TNBS)-유도 대장염 모델 또는 옥사잘론 모델이며, 이들은 결장에서 만성 염증 및 궤양을 유도한다(문헌[Neurath et al., Intern. Rev Immunol 19:51-62, 2000]). 또 다른 모델은 덱스트란 설페이트 소듐(DSS)을 사용하며, 이는 피가 섞인 설사, 체중 감소, 결장의 단축 및 호중구 침윤이 있는 점막 궤양으로 나타나는 급성 대장염을 유도한다. 또 다른 모델은 RAG 또는 SCID 마우스로의 나이브(
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) CD45RB고 CD4 T 세포의 입양 전달(adoptive transfer)을 포함한다. 이 모델에서는, 공여자 나이브 T 세포가 수용자 장을 공격하여 만성 장 염증 및 인간 염증성 장 질환과 유사한 증상을 유발한다(문헌[Read and Powrie, Curr Protoc Immunol Chapter 15 unit 15.13, 2001]). 이들 모델 중 임의의 것에서 본 발명의 길항제의 투여를 사용하여, 증후를 개선하고, 장의 염증, 예를 들어 염증성 장 질환과 관련된 질환의 경과를 변경시키기 위한 이들 길항제의 잠재적인 효능을 평가할 수 있다.
신장 섬유증은 이식편 허혈/재관류와 같은 급성 자극(문헌[Freese et al., Nephrol Dial Transplant 16:2401-6, 2001]) 또는 당뇨병과 같은 만성 병태(문헌[Ritz et al., Nephrol Dial Transplant 11 Suppl 9:38-44, 1996])로부터 발병할 수 있다. 전형적으로 발병 기전은 초기 염증성 반응 후에 이어지는 사구체 여과 장치 및 요세관 간질의 지속적인 섬유화(문헌[Liu, Kidney Int 69:213-7, 2006])를 특징으로 한다. 요세관간질 섬유증은 신장 손상의 말기 신부전으로의 발병 기전에서 결정적인 역할을 하는 것으로 나타났으며, 근위 세뇨관 세포가 중심 매개체로 밝혀졌다(문헌[Phillips and Steadman, Histol Histopathol 17:247-52, 2002]; 문헌[Phillips, Chang Gung Med J 30:2-6, 2007]). 요세관간질 구획 내의 섬유화는 부분적으로 체류 섬유모세포(resident fibroblast)의 활성화에 의해 매개되며, 이는 국소적 염증성 매개체 및 섬유화 매개체를 분비하도록 근위 세뇨관 상피를 자극하는 전-염증성 사이토카인을 분비한다. 부가적으로, 화학주성 사이토카인(chemotactic cytokine)이 섬유모세포 및 상피 세포에 의해 분비되고 단핵구/대식세포 및 T-세포의 요세관간질 내로의 침윤을 인도하는 방향성 구배를 제공한다. 염증성 침윤은 부가적인 섬유화 사이토카인 및 염증성 사이토카인을 생성시키며, 이는 섬유모세포 및 상피 사이토카인 방출을 추가로 활성화시키는 한편, 또한 상피를 자극하여 표현형 이행(phenotypic transition)을 겪도록 하며, 여기서 세포는 과량의 세포외 기질 구성요소를 침착시킨다.(문헌[Simonson, Kidney Int 71:846-54, 2007]).
다른 예시적인 섬유성 병태는, 간 섬유증(알코올성 간경변, 바이러스성 간경변, 자가면역성 간염을 포함하나 이로 제한되지 않음); 폐 섬유증(피부경화증, 특발성 폐 섬유증을 포함하나 이로 제한되지 않음); 신장 섬유증(피부 경화증, 당뇨병성 신장염, 사구체신염, 루푸스 신장염을 포함하나 이로 제한되지 않음); 피부 섬유증(피부 경화증, 비후성 및 켈로이드 흉터 형성, 화상을 포함하나 이로 제한되지 않음); 골수 섬유증; 신경 섬유종증; 섬유종; 장 섬유증; 및 외과적 처치로부터 야기된 섬유성 유착을 포함할 수 있다. 섬유증은 기관 특이적 섬유증 또는 전신 섬유증일 수 있다. 기관 특이적 섬유증은 폐 섬유증, 간 섬유증, 신장 섬유증, 심장 섬유증, 혈관 섬유증, 피부 섬유증, 안구 섬유증, 또는 골수 섬유증과 연계될 수 있다. 폐 섬유증은 특발성 폐 섬유증, 약물 유도 폐 섬유증, 천식, 유육종증, 또는 만성 폐쇄성 폐 질환과 연계될 수 있다. 간 섬유증은 간경변, 주혈흡충증, 또는 담관염과 연계될 수 있다. 간경변은 알코올성 간경변, C형 간염-후 간경변, 원발성 담즙성 간경변으로부터 선택될 수 있다. 담관염은 경화 담관염일 수 있다. 신장 섬유증은 당뇨병성 신병증 또는 루푸스 사구체 경화증과 관련될 수 있다. 심장 섬유증은 심근경색과 관련될 수 있다. 혈관 섬유증은 혈관확장술후 동맥 재협착 또는 죽상동맥경화증과 관련될 수 있다. 피부 섬유증은 화상 흉터형성, 비대 흉터형성, 켈로이드 또는 신장기원 섬유화 피부병과 관련될 수 있다. 안구 섬유증은 안와-후(Retro-orbital) 섬유증, 백내장 수술후 안구 섬유증 또는 증식유리체망막병과 관련될 수 있다. 골수 섬유증은 특발성 골수섬유증 또는 약물 유도성 골수섬유증과 관련될 수 있다. 전신 섬유증은 전신 경화증 또는 이식편 대 숙주 질환일 수 있다.
본 발명의 방법으로 예방하거나 치료할 수 있는 다른 염증성 증상 및 신경병증은 자가면역 질환에 의해 야기되는 것이다. 이들 병태 및 신경병증은 다발성 경화증, 전신홍반루푸스, 및 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 양극성 장애와 근위축성 측삭경화증(ALS)을 포함하는 신경변성 및 중추신경계(CNS) 장애, 원발 담즙성 간경변, 원발 경화성 담관염, 비-알코올성 지방간 질환/지방간염(steatohepatitis), 섬유증, C형 간염 바이러스(HCV)와 B형 간염 바이러스(HBV)를 포함하는 간 질환, 당뇨병 및 인슐린 내성, 죽상동맥경화증, 뇌출혈, 뇌졸중 및 심근경색을 포함하는 심혈관 장애, 관절염, 류마티스 관절염, 건선성 관절염 및 소아 류마티스 관절염(JRA), 골다공증, 골관절염, 췌장염, 섬유증, 뇌염, 건선, 거세포동맥염, 강직성척추염, 자가면역 간염, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 염증성 피부 병태, 이식, 암, 알러지, 내분비 질환, 상처 회복, 다른 자가면역 장애, 기도 과민성 및 세포, 바이러스, 또는 프리온-매개 감염 또는 장애를 포함한다.
본 발명의 일 실시 형태는, 인간 ST2L의 도메인 I(서열 번호 9)에 특이적으로 결합하고, IL-33/ST2L 상호작용을 차단하며, 인간 ST2L(서열 번호 1)에 대한 결합에 대해 서열 번호 47의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 51의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 단리된 항체와 경쟁하고/하거나, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 35 내지 48(RCPRQGKPSYTVDW; 서열 번호 210)에서 인간 ST2L에 결합하는 치료적 유효량의 단리된 인간 또는 인간-적응화 항체 길항제를, 그를 필요로 하는 환자에게 ST2L-매개 병태를 치료하거나 예방하기에 충분한 시간 동안 투여하는 단계를 포함하는, ST2L-매개 병태의 치료 방법 또는 예방 방법이다.
본 발명의 다른 실시 형태는, 인간 ST2L의 도메인 I(서열 번호 9)에 특이적으로 결합하고, IL-33/ST2L 상호작용을 차단하며, 인간 ST2L(서열 번호 1)에 대한 결합에 대해 서열 번호 47의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 51의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 단리된 항체와 경쟁하고/하거나, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 35 내지 48(RCPRQGKPSYTVDW; 서열 번호 210)에서 인간 ST2L에 결합하는 치료적 유효량의 단리된 인간 또는 인간-적응화 항체 길항제를, 그를 필요로 하는 환자에게 비만 세포 반응을 저해하기에 충분한 시간 동안 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 비만 세포 반응을 저해하는 방법이다.
본 발명의 다른 실시 형태는, 인간 ST2L의 도메인 I(서열 번호 9)에 특이적으로 결합하고, IL-33/ST2L 상호작용을 차단하며, 인간 ST2L(서열 번호 1)에 대한 결합에 대해 서열 번호 47의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 51의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 단리된 항체와 경쟁하고/하거나 서열 번호 1의 아미노산 잔기 35 내지 48(RCPRQGKPSYTVDW; 서열 번호 210)에서 인간 ST2L에 결합하는 단리된 인간 또는 인간-적응화 항체 길항제를, IL-33 및 ST2L의 상호작용을 저해하기에 충분한 양으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 IL-33 및 ST2L의 상호작용을 저해하는 방법이다.
다른 실시 형태에서, ST2L-매개 병태는 천식, 기도 과민 반응, 유육종증, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 특발성 폐 섬유증(IPF), 낭포성 섬유증, 염증성 장 질환,(IBD), 호산구성 식도염, 피부경화증, 아토피성 피부염, 알러지성 비염, 수포성 유사천포창, 만성 두드러기, 당뇨병성 신증, 류머티스 관절염, 간질성 방광염, 또는 이식편 대 숙주 질환(GVHD)이다.
다른 실시 형태에서, ST2L-매개 병태는 폐에서의 염증성 세포 동원, 배상 세포 과형성, 또는 증가된 점액 분비와 연계된다.
다른 실시 형태에서, ST2L-매개 병태는 비만 세포 반응과 연계된다.
다른 실시 형태에서, 비만 세포 반응을 저해하는 단계는 인간 제대혈-유래 비만 세포에 의해 방출되는 GM-CSF, IL-5, IL-8, IL-10, 또는 IL-13의 수준을 50 ㎍/ml 항체로 50% 이상 만큼 저해하는 단계를 포함한다.
다른 실시 형태에서, 그를 필요로 하는 환자에게 투여되는 항체 길항제는 인간 ST2L의 도메인 I(서열 번호 9)에 특이적으로 결합하고, IL-33/ST2L 상호작용을 차단하며, 인간 ST2L(서열 번호 1)에 대한 결합에 대해 서열 번호 47의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 51의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 단리된 항체와 경쟁하고/하거나 서열 번호 1의 아미노산 잔기 35 내지 48(RCPRQGKPSYTVDW; 서열 번호 210)에서 인간 ST2L에 결합하고, TSLP, IL-25, TSLPR, IL-17RA, 또는 IL-17RB에 추가로 결합하는 이중특이적 항체이다.
투여/약제학적 조성물
ST2L 생물 활성의 조절이 바람직한 병태의 치료에 효과적인 항-ST2L 항체의 "치료적 유효량"은 표준 연구 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 천식 또는 류머티스 관절염과 같은 염증성 병태의 치료에 효과적일 항-ST2L 항체의 투여량은, 본 명세서에 기재된 모델과 같은 적절한 동물 모델에 항-ST2L 항체를 투여함으로써 결정할 수 있다.
또한, 시험관 내 분석을 임의로 사용하여, 최적의 투여량 범위를 동정하는 것을 도울 수 있다. 유효한 특정 투여량의 선택은 몇몇 인자의 고려사항에 기초하여, 당업자에 의해 결정될 수 있다.(예를 들어, 임상 시험을 통해). 이러한 인자는 치료 또는 예방되는 질환, 수반 증후, 환자의 체중, 환자의 면역 상태 및 당업자가 알고 있는 다른 인자를 포함한다. 제형에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 질환의 중증도에 좌우될 것이며, 전문의의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 검사 시스템으로부터 유래하는 용량-반응 곡선으로부터 추정될 수 있다.
본 발명의 항체의 치료적 용도를 위한 투여 방식은 제제를 숙주에게 전달하는 임의의 적합한 경로일 수 있다. 이들 항체의 약제학적 조성물은 비경구 투여, 예를 들어 피부내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 또는 비강내 투여에 특히 유용하다.
본 발명의 항체는 약제학적으로 허용가능한 담체 중에 활성 성분으로서 제제의 유효량을 함유하는 약제학적 조성물로서 제조될 수 있다. 용어 "담체"는 활성 화합물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약제학적 비히클은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들, 예를 들어 피넛유, 대두유, 광물유, 참기름 등을 포함하는 물 및 오일과 같은 액체일 수 있다. 예를 들어, 0.4% 염수 및 0.3% 글리신을 사용할 수 있다. 이들 용액은 무균성이고 일반적으로 입자상 물질이 없다. 이들은 통상적인 잘 알려져 있는 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다(예를 들어, 여과). 조성물은 pH 조절제 및 완충제, 안정화제, 농후제, 윤활제, 및 착색제 등과 같이 생리적 조건에 근접시키기 위하여 필요한, 약제학적으로 허용가능한 보조 물질을 함유할 수 있다. 이러한 약제학적 제형에서 본 발명의 항체의 농도는 광범위하게, 즉, 약 0.5 중량% 미만, 통상적으로 약 1 중량%, 또는 약 1 중량% 이상 내지 15 또는 20 중량% 정도로 변동될 수 있고, 선택된 특정 투여 방식에 따라, 주로 필요한 용량, 유체 부피, 점성 등을 기반으로 선택될 것이다.
따라서, 근육내 주사를 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 1 ml의 멸균 완충수 및 약 1 ng 내지 약 100 mg, 예를 들어 약 50 ng 내지 약 30 mg, 또는 더욱 바람직하게는 약 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 항-ST2L 항체를 함유하도록 제조될 수 있다. 유사하게, 정맥내 주입을 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 약 250 ml의 멸균 링거 용액 및 약 1 mg 내지 약 30 mg, 바람직하게는 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 길항제를 함유하도록 제조할 수 있다. 비경구적으로 투여할 수 있는 조성물을 제조하기 위한 실제의 방법은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌["Remington's Pharmaceutical Science", 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA]에 더욱 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 항체는 보관을 위해 동결건조되고, 사용 전에 적합한 담체 중에 재구성될 수 있다. 이 기술은 통상의 면역글로불린 및 단백질 제제에 유효한 것으로 보이며, 해당 업계에 공지된 동결건조 및 재구성 기술을 사용할 수 있다.
이제 본 발명을 하기의 구체적인 비제한적 실시예를 참고로 하여 설명할 것이다.
재료 및 방법(일반)
인간 및 시노몰구스(마카카 파시큘라리스, 시노) 수용체-리간드 결합 저해 어세이(RLB 어세이)
바이카르보네이트 완충액 중의 50 ㎕의 4 ㎍/ml 인간 ST2L-ECD(서열 번호 1의 아미노산 19 내지 328) 또는 C-말단 His6 태그를 갖는 2 ㎍/ml의 시노 ST2L-ECD(서열 번호 2의 아미노산 19 내지 321)로 4℃에서 16 hr 동안 96-웰 플레이트를 코팅하였다. 모든 후속 단계는 실온에서 수행하였다. 200 ㎕의 차단 완충액으로 플레이트를 차단하고, PBS+0.05% 트윈을 함유하는 300 ㎕의 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 항-ST2L mAb의 다양한 희석액 30 ㎕를 웰에 첨가하고 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 인간 수용체-리간드 결합 어세이의 경우에는 20 ㎕의 바이오틴화 인간 IL-33(서열 번호 3의 잔기 112 내지 270)을 100 ng/ml의 최종 농도로 첨가하고 30 분 동안 인큐베이션하였다. 시노 수용체-리간드 결합 어세이의 경우에는 20 ㎕의 바이오틴화 시노 IL-33(서열 번호 4의 잔기 112 내지 269)을 200 ng/ml의 최종 농도로 첨가하고 30 분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 300 ㎕의 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 50 ㎕의 0.2 ㎍/ml 스트렙타비딘-HRP(잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch))를 첨가하고 30 min 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS+0.05% 트윈을 함유하는 300 ㎕의 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 각각의 웰에 50 ㎕의 TMB 기질(EMD 바이오사이언시즈(EMD Biosciences))을 첨가하였다. 100 ㎕의 0.2N 황산을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 인비전(Envision) 플레이트 판독기(퍼킨 엘머(Perkin Elmer))를 사용하여 OD450을 측정하였다.
키메라 ST2L 작제물의 생성
표준 분자생물학 기술을 사용하여 인간 및 마우스 ST2L 도메인 I, II, 및 III 스왑(swap)을 특징으로 하는 다양한 작제물을 설계하고 생성시켰다. 작제물은 표 1에 열거되어 있다. 아미노산 번호화는 인간 ST2L(hST2L)(서열 번호 1; NP_057316) 및 마우스 ST2L(mST2L)(서열 번호 5; NP_001020773) 단백질에 상응한다.
[표 1]
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도메인 결합 결정 어세이.
전기화학발광 검출 포맷(메조-스케일 디스커버리(MSD: Meso-Scale Discovery) 기술)을 사용하는 표준 포획 ELISA 어세이를 사용하여 ST2L 도메인 I, II, 및 III에 대한 항체 결합을 결정하였다. 실온에서 2 hr 동안 MSD 하이바인드(HighBind) 플레이트의 각각의 웰 상에 10 ㎍/mL의 각각의 항체를(5 ㎕/웰) 코팅하였다. 플레이트를 150 ㎕의 5% MSD 차단 완충액으로 실온에서 2 hr 동안 차단하고, HEPES 세척 완충액으로 3회 세척한 후에, 25 ㎕의 설포 태그 표지된 huST2L-ECD 또는 마우스 ST2L-ECD(서열 번호 5의 아미노산 28 내지 326) 또는 HHM-ST2L(서열 번호6) 또는 HMH-ST2L(서열 번호 8) 키메라 또는 HH-ST2L(서열 번호 1의 잔기 19 내지 205)을 5 nM 내지 40 nM의 증가하는 농도로 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 알루미늄 포일로 덮고 온화하게 진탕하면서 실온에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 HEPES 세척 완충액으로 3회 세척하였다. MSD 판독 완충액(150 ㎕)을 각각의 웰에 첨가한 후, MSD 섹터 이미저(MSD Sector Imager) 6000을 사용하여 플레이트를 판독하였다.
인간 ST2L-ECD, HHM-ST2L, 및 HMH-ST2L에 의해서는 결합되나, 마우스 ST2L-ECD에 의해서는 결합되지 않는 항체는 인간 ST2L-ECD의 도메인 I을 인식한다. 인간 ST2L-ECD 및 HMH-ST2L에 의해서는 결합되나, HHM-ST2L 및 마우스 ST2L-ECD에 의해서는 결합되지 않는 항체는 인간 ST2L-ECD의 도메인 III을 인식한다. 인간 및 마우스 ST2L-ECD에 의해서는 결합되나, HH-ST2L에 의해서는 결합되지 않는 항체는 인간 및 마우스 ST2L-ECD의 도메인 III을 인식한다.
항-ST2L mAb의 친화력 측정.
표준 방법을 사용하여 항-ST2L mAb, huST2L-ECD, 및 시노ST2L-ECD를 발현시켰다. 염소 항-인간 IgG Fcg 단편-특이적 Ab(cat# 109-005-098)는 잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈(Jackson ImmunoResearch laboratories)(펜실베니아주 웨스트 그로브 소재)로부터 입수하였다. GLC 센서 칩(바이오-라드(Bio-Rad) cat# 176-5011), CM-5 센서 칩(GE 헬스케어(GE Healthcare) cat# BR100014), 및 포획 표면의 제조를 위한 시약은 바이아코어(뉴저지주 피스카타웨이 소재의 GE 헬스케어) 또는 바이오-라드 라이프 사이언시즈(캘리포니아주 허큘리스 소재의 바이오-라드)로부터 입수하였다.
항-ST2L 항체와 His6-태깅된 인간 ST2L-ECD 및 His6-태깅된 시노 ST2L-ECD의 상호작용을 25℃에서 프로테온 XPR36을 사용하는 프로테온에 의해 연구하였다. 아민-커플링 화학에 대한 제조자 지침을 사용하여 염소 항-인간 IgG Fcg 단편 특이적 항체(Ab)를 GLC 센서 칩의 표면에 커플링함으로써 바이오센서 표면을 제조하였다. 커플링 완충액은 10 mM 소듐 아세테이트(pH 4.5)였다. 염소 항-인간 IgG Fcg(약 4500 반응 단위)를 수평 배향으로 고정시켰다. 항-ST2L 항체는 정제되어 제공되거나 비정제 상등액으로 제공되었다. 어느 경우이든 이들 항체를 PRB(PBS pH 7.4, 3 mM EDTA 및 0.005% 트윈 20으로 보충됨) 중에 약 0.5 ㎍/mL의 농도로 희석하였다. 항-인간 Fcgδ항체-변형된 GLC 칩 상에 수직 배향으로 항체를 포획하였다(60 내지 130 RU). 항-ST2L mAb의 포획 후에 용액 중의 huST2L ECD(5-배 희석에서 0.024 내지 15 nM) 또는 용액 중의 시노ST2L ECD(4-배 희석에서 0.020 내지 5 nM)를 수평 배향으로 주입하였다. 모든 실험에서 4 분 동안 회합을 모니터링하였다(50 ㎕/min으로 200 ㎕를 주입함). 해리는 30 분 동안 모니터링하였다. 10 mM 글리신 pH 1.5의 15 sec 펄스 3회를 이용하여 센서 표면의 재생을 얻었다. 프로테온 소프트웨어를 사용하고 물질 전달(mass transfer)을 동반하는 1:1 결합 모델을 사용하여 데이터를 적합시켰다.
바이아코어 2000 또는 바이아코어 3000 광학 바이오센서(바이아코어 AB)를 사용하여 바이아코어 실험을 수행하였다. 0.1% BSA의 존재 또는 부재 하에 25℃에서 BRB(PBS pH 7.4, 3 mM EDTA 및 0.005% 트윈 20으로 보충됨) 중에 모든 실험을 실행하였다.
아민-커플링 화학에 대한 제조자 지침을 사용하여 염소 항-인간 IgG Fcg 단편 특이적 Ab를 CM-5 칩의 카르복시메틸화 덱스트란 표면에 커플링함으로써 바이아코어 바이오센서 표면을 제조하였다. 커플링 완충액은 10 mM 소듐 아세테이트(pH 4.5)였다. 4개의 플로우 셀(flow cell) 각각에 평균 6000 반응 단위(RU)의 Ab가 고정되었다. 항-인간 Fcg 항체-변형된 센서 칩 표면 상에 항-ST2L mAb를 포획하였다(약 33 RU). 항-ST2L mAb의 포획 후에 용액 중의 huST2L ECD(3-배 희석에서 0.2 내지 15 nM) 또는 용액 중의 시노ST2L ECD(3-배 희석에서 0.2 내지 15 nM 또는 0.020 내지 5 nM)를 주입하였다. 4 분 또는 8 분 동안 회합을 모니터링하였다(C2521 및 C2519의 경우에 50 ㎕/min 또는 20 ㎕/min으로 200 ㎕를 주입함). 해리는 10 분, 또는 최대 2.5 시간 동안 모니터링하였다. 50 mM NaOH의 주입 및/또는 100 mM H3PO4의 주입을 이용하여 센서 표면의 재생을 얻었다.
데이터를 스크러버 소프트웨어(Scrubber software), 버전 1.1g(바이오로직 소프트웨어(BioLogic Software))을 사용하여 처리하였다. 완충액 주입에 의해 생성된 곡선을 분석물 주입에 대한 기준-감산된 곡선으로부터 감산함으로써 데이터의 이중 참조 감산(Double reference subtraction)을 수행하여 신호에 대한 완충액 기여 및 기기 잡음을 보정하였다(문헌[Myszka, Journal of Mol Recogn 12:279-84, 1999]).
데이터 처리 후에, 동역학 및 친화력 결정을 위해 생성된 데이터를 스크러버 소프트웨어 또는 바이아이밸류에이션(BIAevaluation) 소프트웨어, 버전 4.0.1(바이아코어, AB)을 사용하여 분석하였다. 물질 전달에 대한 항을 포함하는 단순한 1:1 결합 모델을 사용하여 동역학 데이터를 분석하였다.
쥐과 ST2L ECD에 대한 항-마우스 ST2L mAb(C1999/CNTO3914)의 친화력 측정.
표준 방법을 사용하여 항-ST2L mAb(C1999/CNTO3914) 및 쥐과 ST2L 세포외 도메인(muST2L-ECD)을 발현시키고 정제하였다. 항-쥐과 IgG Fcg 단편-특이적 Ab는 잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈(펜실베니아주 웨스트 그로브 소재)로부터 입수하였다. 포획 표면의 제조를 위한 시약 및 센서 칩은 바이아코어(뉴저지주 피스카타웨이 소재의 GE 헬스케어)로부터 입수하였다. 실험용 바이아코어 실행 완충액(BRB: Biacore running buffer)은 0.005% 트윈 20 및 0.1 mg/mL BSA와 함께 PBS pH 7.4를 함유하였으며, 데이터는 25℃에서 수집하였다.
바이아코어2000 상에서 항-ST2L 항체와 muST2L-ECD의 상호작용을 25℃에서 연구하였다. 아민-커플링 화학에 대한 제조자 지침을 사용하여 항-마우스-Fc 특이적 항체를 CM4 센서 칩의 표면에 커플링함으로써 바이오센서 표면을 제조하였다. C1999/CNTO3914 및 muST2L-ECD를 BRB에 희석하였다. 항-마우스 Fcg 항체를 사용하여 C1999를 포획하였다(약 85 RU). 포획 후에 용액 중의 muST2L ECD(서열 번호 5의 잔기 28 내지 326)를 주입하였다(15 nM에서 시작하여 3-배 연속 희석으로 5개 농도). 8분 동안 회합을 모니터링하였다. 해리는 최대 6000 초 동안 모니터링하였다. 인산의 1/100 희석액을 사용하여 재생을 수행하였다. 1:1 결합 모델을 사용하여 데이터를 적합시켰다.
인간 호염기구 세포주 어세이 (호염기구 사이토카인 방출 어세이)
KU812 세포(인간 호염기구 세포주; ATCC, CRL-2099)를 10% FBS 및 페니실린/ 스트렙토마이신으로 보충된 총 40 ㎕의 RPMI 1640 성장 배지(인비트로젠) 중에 25,000 또는 50,000 세포/웰로 멸균 96-웰 U-바닥 조직 배양 플레이트에 플레이팅하였다. 항-인간 ST2L mAb 및 대조군을 다양한 농도(50 ㎕/웰)로 첨가하고 37℃에서 인큐베이션하였다. 1 시간의 인큐베이션 후에, 재조합 "성숙한" IL-33(서열 번호 3의 아미노산 111 내지 270)을 10 ㎕의 RPMI 성장 배지 중에 10 ng/ml의 최종 농도로 첨가하였다. 이어서, 세포를 37℃에서 18 내지 24 시간 동안 인큐베이션하여 IL-5 및 IL-6의 IL-33-매개 유도를 가능하게 하였다. 인큐베이션 후에 세포를 수확하고, 이후에 ELISA(R&D 시스템즈(R&D systems)) 또는 비드-기반 멀티플렉스 분석(밀리포어(Millipore))을 사용하여 IL-33-유도 IL-5 및 IL-6을 검출하기 위해 세포 상등액을 수집하였다.
인간 비만 세포 사이토카인 방출 어세이 및 PGD 2 방출 어세이
비만 세포는 CD34+ 인간 제대혈 세포(론자(Lonza))로부터 유래되었다. 냉동 바이알(>1.0 ×106 CD34+ 제대혈 세포)을 신속하게 해동시켜 50 ml 원추형 튜브에 이전하였다. 가온되거나 실온의 스템-프로(Stem-Pro) 34 배지 + 보충제(총 25 ml; 인비트로젠)의 방울을 세포에 천천히 첨가하였다. 세포를 1,000 rpm에서 15 분 동안 원심분리하고 배지(하기의 보충제를 가진 10 ml의 스템프로-34: 30 ng/ml IL-3, 100 ng/ml IL-6, 및 100 ng/ml SCF)에 재현탁하였다. 6-웰 플레이트의 2개 웰에 세포를 플레이팅하고, 1 주 동안 배양하였다. 제4일에, 세포를 보충된 스템 프로-34 배지에 1:3 확장하였다. 제7일에, 비-부착 세포를 제거하고 10 ng/ml IL-6 및 100 ng/ml SCF를 함유하는 스템프로-34 배지에 0.5×106/ml로 플레이팅하였다. 세포를 매주 확장하여 6 내지 10 주에 비만 세포가 성숙할 때까지(FceR1, cKit, 및 트립타아제의 발현에 의해 평가) 세포 밀도를 0.5×106/ml로 유지하였다.
성숙한 비만 세포를 스템프로-34 내에서 0.5 × 106/ml로 배양하고 4 일 동안 매일 IL-4(10 ng/ml; 페프로테크(Peprotech)), IL-6(10 ng/ml; R&D 시스템즈), 및 SCF(100 ng/ml; 인비트로겐) 중에 자극하였다. 어세이 전에, 세포를 수확하고, 1,000 RPM에서 10 min 동안 원심분리하고, 항생제 없이 10% FCS를 함유하는 새로 만든 스템프로-34 배지 또는 RPMI에 100 ng/ml의 인간 재조합 SCF와 함께 재현탁하였다. 평바닥의 조직 배양-처리된 96-웰 플레이트에 65,000 내지 75,000 세포/ 0.16 ml/웰의 밀도로 세포를 플레이팅하였다. IL-33의 첨가 전에 30 분 동안 항-ST2L mAb를 50, 10, 2, 0.4, 0.08, 0.016, 0.0032 ㎍/ml의 최종 농도로 플레이트에 첨가하였다. 재조합 인간 "성숙한" IL-33(서열 번호 3의 잔기 111 내지 270) 또한 배지 + 100 ng/ml SCF 중에 10X(10 또는 30 ng/ml)로 제조하였다. 20 ㎕의 10X IL-33을 1(도 6 및 7a 내지 7e) 또는 3 ng/ml(도 8a 내지 8e)의 최종 농도로 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 자극 후 18 내지 24 시간에 배양 상등액을 수확하였다. 플레이트를 1,000 RPM에서 10 분 동안 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 U 바닥 96 웰 플레이트에 넣어 어세이 전에 -20℃에서 저장하였다. 루미넥스(상표) 기술을 사용하여 사이토카인 수준을 분석하기 위하여 밀리포어로부터의 인간 사이토카인 키트를 사용하였다. 케이맨 케미칼 컴퍼니(Cayman Chemical Company)로부터의 프로스타글란딘 D2-MOX EIA 키트를 사용하여 제조자의 지침에 따라 PGD2의 수준을 측정하였다. ELISA의 감도를 증진하기 위하여, 비만 세포 배양 상등액 중의 PGD2를 메톡실사민 하이드로클로라이드(MOX-HCl)로 처리함으로써 비-분해성 MOX-PGD2(메톡실사민-PGD2)로 변환하였다.
마우스 수용체-리간드 결합 저해 어세이(마우스 RLB 어세이)
96-웰 투명 플레이트(VWR)를 50 ㎕의 2 ㎍/ml 염소 항-인간 IgG, Fcγ 단편-특이적(잭슨 이뮤노리서치) 항체로 4℃에서 대략 16 시간 동안 코팅하였다. 나머지 단계들은 실온에서 완료하였다. 차단 완충액과 함께 웰을 인큐베이션하고, 세척하여 인간 Fc에 융합된 마우스 ST2L-ECD(2 ㎍/ml) 50 ㎕를 1 시간 동안 첨가하였다. 플레이트를 세척하고 항-mST2L 항체가 있거나 없는 1 ㎍/ml의 바이오틴화 mIL-33을 첨가하였다. 플레이트를 세척하고 제조자의 지침에 따라 스트렙타비딘-HRP(잭슨 이뮨 리서치(Jackson Immune Research))로 검출을 실행하고, TMB 기질(피츠제랄드 인더스트리즈(Fitzgerald Industries)의 RDI 사업부)로 신호를 발생시켰다.
마우스 및 인간 리포터 유전자 어세이(인간 또는 마우스 RGA 어세이)
백색 투명 바닥의 조직 배양-처리된 96-웰 플레이트(넌크(NUNC))에 HEK293 세포를 DMEM(10% FBS) 중에 50,000 세포/웰로 플레이팅하고, 가습 인큐베이터 내에 37℃, 5% CO2에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 표준 프로토콜을 사용하는 옵티-MEM(Opti-MEM) 배지(인비트로젠) 중의 리포펙타민(Lipofectamine)(상표) 2000을 사용하여 인간 또는 마우스 ST2L-ECD cDNA를 암호화하는 벡터, NF-kB-루시페라아제 벡터(스트라타젠(Stratagene), 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies), 캘리포니아주 산타 클라라 소재)로 세포를 공동-형질감염시켰다. 37℃, 5% CO2에서 24 시간 인큐베이션 후에, 형질감염된 세포를 항-ST2L 항체의 존재 또는 부재 하에 16 시간 동안 37℃, 5% CO2에서 마우스(R&D 시스템즈, 서열 번호 5의 잔기 109 내지 266) 또는 인간 IL-33(서열 번호 3의 잔기 112 내지 270)으로 처리하였다. 스테디-글로(Steady-Glo)(등록상표) 시약(프로메가(Promega))을 사용하여 제조자의 지침에 따라 루시페라아제 활성을 측정하였다.
마우스 T-세포 증식 어세이
마우스 Th2 세포(D10.G4.1, ATCC)를 하기의 완전 성장 배지에서 배양하였다: 1.5 g/L 소듐 바이카르보네이트, 4.5 g/L 글루코스, 10 mM HEPES, 및 1.0 mM 소듐 피루베이트를 함유하도록 조정되고, 0.05 mM 2-머캅토에탄올, 10 pg/ml IL-1aδ(R&D 시스템즈), 10% 우태아 혈청, Con A(벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)으로부터 입수가능한 랫트 IL-2 배양 보충제)를 가진 10% 랫트 T-STIM 인자로 보충된, 2 mM L-글루타민을 가진 RPMI 1640 배지. 세포를 어세이 배지(RPMI, 10% FBS, IL-1 없음, T-STIM 없음)로 2회 세척하고, 1.25×105 세포/ml로 재현탁하고, 백색 투명 바닥의 조직 배양 처리된 96-웰 플레이트(뉴욕주 로체스터 소재의 넌크)에 80 ㎕의 배지 중에 플레이팅하였다. 100 ㎕의 최종 어세이 부피를 위해 다양한 양의 마우스 IL-33(서열 번호 5의 잔기 109 내지 266)을 세포에 첨가하였다. 항체 중화를 시험하는 경우, 대조군 항체(소진된 하이브리도마 배지에 스파이킹함) 또는 하이브리도마 상등액을 세포에 첨가하고 1 시간 동안 인큐베이션한 후에 20 pg/ml의 mIL-33을 첨가하였다. 가습 인큐베이터 내에 37 C, 5% CO2에서 24 시간 동안 플레이트를 배양하였다. 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)(등록상표) 시약(위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가)으로 생존 세포의 정량화를 달성하였으며; 제조자의 지침에 따라 프로토콜을 수행하였다.
마우스 골수 유래 비만 세포 어세이
마우스 비만 세포는 Balb/c 마우스(6 주)의 골수로부터 유래되었다. RPMI 배지(무 내독소), 10% FBS, 10% WEHI 세포주-조건화 배지, 10 ng/ml IL-3(페프로테크), 0.1 mM 필수 아미노산, 1% 페니실린/스트렙토마이신(인비트로젠) 중에 300,000 세포/웰로 세포를 플레이팅하였다. 재조합 마우스 "성숙한" IL-33(서열 번호 215의 잔기 109 내지 266 (10 ng/ml; R&D 시스템즈))을 첨가하기 전에 항-ST2L mAb(100, 10, 1, 0.1, 또는 0.01 ㎍/ml)를 세포와 함께 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 대략 24 h 후에 상등액을 수확하고 제조자의 지침에 따라 루미넥스(상표)를 위한 밀리포어 마우스 22-플렉스 키트(Millipore Mouse 22-plex kit)를 사용하여 분석할 때까지 냉동하였다.
시노 내피 세포 어세이
EGM(등록상표)-2 내피 세포 성장 배지-2(론자)에서 배양한 시노몰구스 대동맥 내피 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트에 10,000 또는 20,000 세포/웰로 플레이팅하였다. 100 ㎍/ml에서 시작하여 후속의 4- 또는 5-배 희석으로 50 ㎕의 항-ST2L 항체를 세포에 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후에 재조합 시노 '성숙한' IL-33(서열 번호 4)을 첨가하였다. 이어서, 50 마이크로리터의 20 ng/ml 시노몰구스 IL-33을 세포에 첨가하고 37℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. IL-33-유도 사이토카인 반응을 평가하기 위하여, 상등액을 수확하고 제조자의 지침에 따라 루미넥스(상표)를 위한 비-인간 영장류 IL-8 키트(밀리포어)에 의해 사이토카인 수준을 평가하였다.
마우스 복막 세척 어세이
6 마리의 Balb/c 마우스의 복막을 총 3 ml의 PBS로 세척하여 복막 세포를 수집하였다. B220 및 F4/80 발현(FACS 분석)에 의해 결정된 바와 같이, 이들 세포의 대다수는 림프구 및 대식세포인 것으로 확인되었다. 대략 1%는 cKit+(CD117+) 비만 세포였다. 세포를 원심분리하고 펠렛을 알파 MEM 배지 + 10% FBS + 100 U/ml 페니실린 + 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(인비트로젠) 중에 1×106 세포/ml로 재현탁하였다. 세포를 96-웰 플레이트에 200 ㎕/웰로 플레이팅하고 37oC에서 2 h 동안 그대로 두었다. 10 ng/ml 마우스 "성숙한" IL-33(R&D 시스템즈; 서열 번호 215의 잔기 109 내지 266)을 첨가하기 전에 항-ST2L mAb를 세포에 30 분 동안 첨가하였다. IL-33 첨가 후 24 h에 상등액을 수집하고, 분석할 때까지 -20℃에서 저장하고, 제조자의 지침에 따라 루미넥스(상표)를 위한 밀리포어 마우스 22-플렉스 키트를 사용하여 분석하였다.
실시예 1. 랫트 항-마우스 ST2L 항체의 생성
랫트를 마우스 ST2-Fc(R&D 시스템즈(서열 번호 5의 Ser27 내지 Ser342)로 복강내 면역화하고 특이적 IgG 타이터에 대해 평가하였다. 일단 충분한 타이터가 얻어지면, 비장 세포를 단리하고 FO 세포와 융합시켰다. 생성되는 하이브리도마를 96 웰 플레이트 또는 메틸셀룰로오스에 플레이팅하고 10 일 동안 배양하였다. 표준 포획 ELISA에 의해 항원 특이적 클론을 mST2-Fc에 대한 결합에 대해 동정하고 Fc 단백질 단독에 대해 교차 스크리닝(cross screening)하였다. 쥐과 ST2-특이적 하이브리도마를, ELISA에서 ST2에 대한 IL-33 결합의 저해에 대해, 그리고 IL-33-유도 D10.G4.1 마우스 Th2 세포 증식의 저해에 대해 추가로 시험하였다. 수용체-리간드 결합 및 세포-기반 증식 어세이 양자 모두에서 중화를 나타내는 하이브리도마를 한계 희석에 의해 클론 선택하였다. 하이브리도마 V-영역을 서열 분석하고 마우스 IgG1 배경에 클로닝하였다. 다양한 인간-마우스 도메인-스왑 작제물을 사용하는 전기화학발광 검출을 동반하는 표준 면역흡착 어세이에 의해 ST2L-ECD 도메인 특이성을 고찰하였다.
하이브리도마 C1999에 의해 분비된 항체를 마우스 IgG1 배경에 클로닝하고 CNTO3914라고 명명하였다. CNTO3914 가변 영역 및 CDR의 서열을 표 2에 나타낸다. CNTO3914는 인간 ST2L과 교차-반응하지 않으며 마우스 ST2L-ECD의 도메인 I에 결합한다.
[표 2]
Figure pct00004
실시예 2. 마우스 항-인간 ST2L 항체의 생성
마우스 항-인간 ST2 mAb의 생성을 위해 2가지의 상이한 면역화를 수행하였다.
가용성 ST2-Fc(R&D 시스템즈, 서열 번호 157)로 BALB/c를 복강내 면역화하고 특이적 IgG 타이터에 대해 평가하였다. 일단 충분한 타이터가 얻어지면, 비장 세포를 단리하고 FO 세포와 융합시켰다. 생성되는 하이브리도마를 96 웰 플레이트에 플레이팅하고 10 일 동안 배양하였다. 표준 포획 ELISA에 의해 C-말단 His6-태깅된 huST2L-ECD에 대한 결합 및 His6-태깅된 시노 ST2L-ECD에 대한 교차-반응성에 대해 항원 특이적 클론을 동정하였다. 시노 ST2L과 교차 반응하는 인간 ST2L-특이적 하이브리도마를, ELISA 어세이에서 huST2L에 대한 IL-33 결합의 저해에 대해, 그리고 리포터 유전자 어세이에서 NF-kB 활성화의 저해에 대해 추가로 시험하였다. 리포터 유전자 어세이에서 저해하는 클론, 또는 ELISA 및 리포터 유전자 어세이 양자 모두에서 저해하는 클론을 추가의 연구를 위해 선택하였다.
하이브리도마 C2494, C2519A, 및 C2521A로부터의 항체를 추가의 분석을 위해 선택하였다. C2519A 및 C2521A는 도메인 III에서 인간 ST2L에 결합하고, C2494는 도메인 I에서 인간 ST2L에 결합한다. 항체 C2494를 인간 IgG2 배경에 클로닝하고, 전체 길이 항체를 STLM62라고 명명하였다.
항-인간 ST2L mAb는 게노백 Gmbh(Genovac Gmbh)에서 전체 길이 ST2L 작제물을 사용하고 인간 ST2L-ECD를 발현시키도록 형질감염된 세포로 부스팅하는 전매 DNA 면역화 기술에 의해 생성되었다. 인간 ST2L-ECD에 대한 결합에 대해 유세포 분석으로 하이브리도마를 스크리닝하였다. 이 어세이에서 결합을 나타낸 클론들은 hST2L-ECD에 결합하는 것으로 확증되었으며, 표준 포획 ELISA에 의해 시노 ST2L-ECD에 대한 결합에 대해 추가로 특성화되었다. 선택된 클론을 수용체-리간드 결합 저해 ELISA 및 리포터 유전자 어세이에서 특성화하였다. 리포터 유전자 어세이에서 저해하는 클론, 또는 ELISA 및 리포터 유전자 어세이 양자 모두에서 저해하는 클론을 추가의 연구를 위해 선택하였다.
추가의 분석을 위해 게노백 하이브리도마 C2244로부터의 항체를 선택하고 인간 IgG2 배경에 클로닝하였다. 전체 길이 항체를 STLM15라고 명명하였다. STLM15는 도메인 I에서 인간 ST2L에 결합한다.
마우스 항-인간 항체의 VH, VL, 및 CDR 도메인의 서열을 표 3에 나타낸다.
[표 3]
Figure pct00005
실시예 3. 완전 인간 ST2L 항체의 생성
문헌[Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010]; 국제 특허 공개 제WO2009/085462호; 미국 특허 공개 제US2010/0021477호에 기재된 바와 같이 신생 pIX 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 인간 ST2L-결합 Fab를 선택하였다. 약술하면, 생식세포 VH 유전자 IGHV1-69*01, IGHV3-23*01, 및 IGHV5-51*01이 H3 루프를 통해 인간 IGHJ-4 미니 유전자와 재조합되고, 인간 생식세포 VL카파 유전자 O12(IGKV1-39*01), L6(IGKV3-11*01), A27(IGKV3-20*01), 및 B3(IGKV4-1*01)이 IGKJ-1 미니 유전자와 재조합되어 완전한 VH 및 VL 도메인으로 조립된 인간 스캐폴드를 다양화함으로써 라이브러리를 생성시켰다. 단백질 및 펩티드 항원과 빈번하게 접촉되는 것으로 동정된 위치에 상응하는 H1, H2, L1, L2, 및 L3 루프 주변의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내의 위치를 다양화를 위해 선택하였다. 선택된 위치에서의 서열 다양성은 각각의 IGHV 또는 IGLV 유전자의 IGHV 또는 IGLV 생식세포 유전자 패밀리 내의 각각의 위치에 나타나는 잔기로 제한되었다. 길이가 7 내지 14개 아미노산인 짧은 크기 내지 중간 크기의 합성 루프를 이용함으로써 H3 루프에서의 다양성을 생성시켰다. H3에서의 아미노산 분포는 인간 항체 내의 아미노산의 관찰된 변이를 모방하도록 설계되었다. 라이브러리 설계는 문헌[Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010]에 상술되어 있다. 라이브러리를 생성시키기 위해 이용된 스캐폴드는 그들의 인간 VH 및 VL 생식세포 유전자 기원에 따라 명명하였다. 3개의 중쇄 라이브러리를 4개의 생식세포 경쇄 또는 생식세포 경쇄 라이브러리와 조합하여 스크리닝을 위한 24개의 고유한 VH:VL 조합을 생성시켰다. 24개의 VH:VL 라이브러리 조합 모두를 huST2L-ECD-Fc에 대한 파아지 패닝 실험에 이용하였다.
huST2L-ECD(서열 번호 1의 잔기 19 내지 328)의 Fc 융합체를 사용하여 라이브러리를 패닝하였다. 2가지의 상이한 포맷(용액 중의 항원(Ag) 및 디스플레이된 Ag)으로 패닝을 실행하였다. 용액 중의 Ag의 경우에는 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드를 PBS 중에 3% 탈지 분유로 차단하였다. 바이오틴화(Bt) 항원 huST2L-ECD 인간 Fc 융합체(Bt-huST2L-ECD-Fc)(10x 더 높은 농도의 인간 Fc 단백질을 경쟁자로서 가짐)를 Fab-pIX 파아지 라이브러리와 혼합하였다. Bt-huST2L-ECD-Fc에 결합된 Fab-pIX 파아지를 차단된 스트렙타비딘(SA)-코팅된 자기 비드 상에 포획하였다. huST2L-ECD-Fc 농도가 라운드 1로부터 라운드 3까지 각각 100 nM로부터, 10 nM, 10 nM로 변동되는 3개의 라운드 동안 파아지 선택을 수행하였다. Ag 디스플레이의 경우에는 Bt-huST2L-ECD-Fc를 SA 코팅된 자기 비드 상에 코팅하였다. Bt-huST2L-ECD-Fc가 디스플레이된 SA- 자기 비드에 Fab-pIX 파아지 라이브러리 + 10x 과량의 인간 Fc 단백질을 동시에 첨가하였다. 사용된 Bt-Ag 농도는 라운드 1 내지 3에 대해 각각 100nM, 10nM, 10nM이었다. huST2L-ECD-Fc 단백질에 대한 Fab 결합에 대한 ELISA에 의해 양자 모두의 패닝 포맷에 대해 스크리닝을 실행하였다. 이들 선택으로부터 hST2L-Fc에 결합된 총 79개의 Fab가 단리되었다. 순위화 ELISA에 의해 Fab HuT2SU-39가 전체적으로 최상의 결합 활성을 갖는 것으로 결정되었다.
79개의 Fab에 ELISA 기반의 IL-33 결합 저해 어세이를 수행하였다. 총 32개의 Fab가 huST2L-ECD-Fc에 대한 IL-33 결합의 저해를 나타냈다. pIX 신생 캠페인으로부터 46개의 Fab가 친화력 성숙을 위해 선택되었다.
실시예 4. 완전 인간 ST2L 항체의 친화력-성숙
문헌[Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010] 및 제WO09085462A1호에 기재된 "인-라인" 성숙 과정을 사용하여, 선택된 항체를 친화력-성숙시켰다. 이 기술에서는, 최초 선택에서 얻어진 Fab 클론의 VH 영역을 상응하는 VL 스캐폴드의 라이브러리와 조합하였다. 실시예 3에서 동정된 46개 Fab로부터의 모든 VH 유전자를 그들의 원래의 VL 유전자 패밀리에 따른 풀(pool)로서 적절한 VL 성숙 라이브러리에 클로닝하였다. 사용된 VL 스캐폴드 라이브러리 및 그들의 다양화 스킴을 표 4에 나타낸다. 인간 VL 스캐폴드는, IGKV1-39*01(O12), IGKV3-11(L6), IGKV3-20(A27), IGKV4-1*01(B3)이며, 예를 들어 미국 특허 공개 제US2012/0108795호에 기재되어 있다. 친화력 성숙 패닝을 위하여, 파아지 라이브러리를 먼저 Bt-huST2-ECD-Fc에 첨가하였다. 인큐베이션 후에 성숙 라이브러리 파아지/Bt-hST2L-ECD-Fc 복합체를 SA-코팅된 자기 비드에 첨가하였다. Bt-huST2-Fc 농도를 각각 R1로부터 R3까지 10 nM, 1 nM, 및 0.1 nM로 변동시켰다. 10 nM의 표지되지 않은 huST2L-ECD-Fc의 존재 하에 실온에서 밤새 라운드 3의 최종 세척을 수행하여 친화력 개선을 추가로 추진하였다.
[표 4]
Figure pct00006
성숙 패닝으로부터 총 161개 서열의 고유한 Fab가 얻어졌다. 추가의 특성화를 위하여, huST2L-ECD에 대한 최고의 결합을 나타내는 Fab를 IgG로 변환시켰다.
추가의 특성화를 위해 MAb ST2M48, ST2M49, ST2M50, 및 ST2M51을 선택하였으며, 그들의 VH, VL, 및 CDR 서열은 표 5에 나타낸다. Mab ST2M48, ST2M49, ST2M50, 및 ST2M51은 도메인 III에서 인간 ST2L에 결합하며, 마우스 ST2L과 교차-반응한다.
[표 5]
Figure pct00007
실시예 5. 항-ST2L 항체의 특성화.
상기와 같이 다양한 캠페인으로부터 유래된 항체를, IL-33/ST2L 상호작용을 차단하는 그들의 능력에 대해, NF-kB 리포터 유전자 어세이에 의해 측정되는 그들의 IL-33-유도 신호전달의 저해에 대해, 비만 세포 반응을 저해하는 항체의 능력에 대해, 인간 및 시노 ST2L에 대한 그들의 친화력에 대해, 그리고 마우스 ST2L과의 교차-반응성에 대해 추가로 특성화하였다. 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 인간/마우스 ST2L 도메인 스왑 키메라 작제물을 사용하여 에피토프 맵핑을 실행하였다. 실험 결과는 표 6, 7, 및 8에 나타낸다. 표 7 및 8에서, "+"는 항체가 IL-33/ST2L 상호작용을 차단함을 표시하고, "-"는 그것이 IL-33/ST2L 상호작용을 차단하지 않음을 표시한다. 인간에 대한 교차-반응성의 결여로 인해 마우스 세포 및 시약을 사용하여 CNTO3914를 이용한 실험을 실행하였다. 다른 모든 항체에 대한 어세이에서는 인간 세포 및 인간 시약을 사용하였다.
특성화된 항체를 IL-33/ST2L 상호작용을 차단하는 것들(mAb STLM15, STLM62, 및 CNTO3914), 및 IL-33/ST2L 상호작용을 차단하지 않는 것들(mAb C2519, C2521, ST2M48, ST2M49, ST2M50, 및 ST2M51)로 분류하였다. IL-33/ST2L 상호작용을 차단하는 항체는 ST2L 도메인 I에 결합하는 반면에, 비-차단 항체는 ST2L 도메인 III에 결합한다. NF-kB 리포터 유전자 어세이 및 KU812 인간 호염기구 세포주에 의한 IL-33-유도 사이토카인 방출에 의해 평가된 바와 같이, 또는 CNTO3914의 경우에 마우스 Th2 세포 증식에 의해 평가된 바와 같이, 시험 항체는 ST2L 다운스트림 신호전달을 저해하였다. 사이토카인 및 케모카인 분비에 의해 평가된 바와 같이, ST2L 도메인 I에 결합하는 항체는, ST2L 도메인 III에 결합하는 항-ST2L 항체에 비교할 때, 더 높은 수준에서 인간 비만 세포 반응을 저해하였다. 마우스 ST2L 도메인 I에 결합하고 인간과 교차-반응하지 않는 CNTO3914 또한 IL-33-유도 마우스 비만 세포 반응을 저해할 수 있었다.
[표 6]
Figure pct00008
[표 7]
Figure pct00009
[표 8]
Figure pct00010
실시예 7. ST2L 도메인 I 결합 항체 CNTO3914는 비강내 IL-33-유도 기도 과민성(AHR), 기도 염증, 및 마우스 비만 세포 반응을 저해한다.
2 ㎍/마우스 "성숙한" IL-33(R&D 시스템즈)(서열 번호 215의 잔기 109 내지 266)의 연이은 4회 일일 비강내 용량을 자성 BALB/c 마우스에 투여하였다. 최초 IL-33 비강내 투여 24 h 전에 예방적으로 항-마우스 ST2L 항체 CNTO3914를 20 mg/㎏(또는 2 mg/㎏ 또는 0.2 mg/㎏)으로 피하 투여하였다. 대조군 마우스는 최초 IL-33 비강내 투여 24 h 전에 동형 대조군 CNTO5516 또는 PBS를 투여 받았다. 플렉시벤트(Flexivent) 시스템(캐나다 퀘벡주 몬트리올 소재의 사이레크(Scireq))으로 강제 조작(forced maneuver)을 사용하여 증가하는 용량의 메타콜린에 대한 기도 과민성(AHR)을 측정하였다. 기도 과민성(AHR)의 측정을 위하여, 100 mg/㎏의 펜토바르비탈 및 13 mg/㎏의 페니토인으로 마우스를 마취시키고 기관을 절개한 후 플렉시벤트에 연결하였다. 기준선 판독을 위하여 마우스를 식염수로 분무한 후에 2개 용량(10 및 20 mg/mL)의 메타콜린으로 분무하였다. 식염수 및 각각의 용량의 메타콜린에 대해, "스냅샷" 섭동을 사용하여 대략 2 분 동안 저항(R) 값을 수집하였다. 0.9 초과의 COD(결정 계수(coefficient of determination))를 가진 값들만 사용하여 피크 저항을 계산하였다.
별도의 군의 마우스를 치료하고 폐에서의 세포 반응에 대해 분석하였다. 최종 mIL-33 동형 또는 PBS 투여 후 24 시간에 슬립어웨이(Sleepaway)(등록상표) I.P.의 과잉 투여에 의해 마우스를 희생시켰다. 0.1% BSA를 가진 0.7 ml의 차가운 PBS로 마우스의 폐를 세척하였다. 생성되는 세기관지 폐포(BAL) 유체를 1200 rpm에서 10 분 동안 원심분리하고 사이토카인/케모카인을 분석할 때까지 세포가 없는 상등액을 -80℃에 보관하였다. 혈구 계수기를 사용하는 총 계수에 BAL 샘플을 사용하였다. 차별적인 BAL 계수의 경우, 광학 현미경 하에서 라이트-김사(wright giemsa)로 염색한 후 사이토스핀 스미어(cytospin smear)로부터 약 200개의 세포를 계수하였다.
세포가 없는 상등액을 수집하고 루미넥스 단백질 분석에 사용할 때까지 -80℃에 저장하였다. 폐 조직을 제거한 후, 충분히 관류될 때까지 5 ml의 차가운 멸균 PBS를 사용하여 우심실을 통해 관류하였다. 이어서, 1 ml 의 PBS + 프로테아제 저해제를 함유하는 패스트 프렙(Fast Prep)(등록상표) 튜브에 폐엽을 넣고 사이토카인/케모카인 프로파일링을 위해 -80℃에서 냉동시켜 저장하였다. 쥐과 밀리포어 22-플렉스에 대한 제조자의 프로토콜에 따라 사이토카인/케모카인 멀티플렉스 어세이를 수행하였다. BAL 유체 내의 마우스 비만 세포 프로테아제-1(mMCP-1)을 ELISA(모어던 사이언티픽(Moredun Scientific))에 의해 분석하였다.
기도 과민성
비강내 투여된 IL-33에 의해 유도된 폐 염증의 모델에서 CNTO3914는 기도 과민성을 유의적으로 저해하였다(도 1). CNTO3914는, 2 ㎍/마우스 mIL-33의 연이은 4회 일일 비강내 투여 전 24 hr에 피하 투여하였다. 플렉시벤트에 의해 결정된 피크 기도 저항을 20 mg/㎏의 CNTO3914 용량으로 유의적으로 감소시켰다. 각각의 막대는 3 마리(CNTO5516, 동형 대조군 항체) 내지 6 마리 마우스/군의 평균 ± SEM을 나타낸다. 결과는 2회의 별도의 연구에서 반복되었다. 본페로니 사후 검정(Bonferroni post test)을 동반하는 2-원 ANOVA를 사용하여 유의성을 결정하였으며, CNTO3914/IL-33 **p<0.05(CNTO5516/IL-33에 대해); 및 ***p<0.001(IL-33을 가진 PBS 처리군에 대해)이었다.
기도 염증
사용된 모델에서 CNTO3914는 기관지 폐포 세척(BAL) 세포 동원을 유의적으로 저해하였다(도 2). CNTO3914는, 2 mg/마우스 mIL-33의 연이은 4회 일일 비강내 투여 전 24 hr에 피하 투여하였다. BAL 백혈구는 IL-33 투여에 따라 유의적으로 증가하였으며 20 mg/㎏의 CNTO3914에 의해 유의적으로 저해되었다. 각각의 막대는 3 마리(CNTO5516, 동형 대조군 항체) 내지 6 마리 마우스/군의 평균 ± SEM을 나타낸다. 결과는 2회의 별도의 연구에서 반복되었다. 본페로니 사후 검정을 동반하는 2-원 ANOVA를 사용하여 유의성을 결정하였으며, ***p<0.001이었다.
생체내 비만 세포 반응
비만 세포는 트립타아제 및 카이마제를 포함하는 프로테아제를 그들의 과립 내에 저장하며, 이는 비만 세포 활성화시에 신속하게 방출된다. 마우스 비만 세포 프로테아제 1(mMCP-1)는 활성화된 비만 세포에 의해 방출되는 b 카이마제이며 기생충 감염의 구제에 중요한 것으로 공지되어 있다(문헌[Knight et al., J Exp Med 192:1849-56, 2000]; 문헌[Huntley et al., Parasite Immunol 12:85-95, 1990]). mMCP-1의 측정을 비만 세포 활성화의 표지자로 사용할 수 있으며, 기도 염증: 집먼지 진드기의 비만 세포-의존성 모델에서 유도되는 것으로 나타났다(문헌[Yu and Chen, J Immunol 171:3808-15, 2003]). ELISA(모어던 사이언티픽)에 의해 결정된 MMCP-1은 IL-33 투여 마우스로부터의 BAL 유체에서 유의적으로 증가하였으며, CNTO3914에 의해 용량-의존적으로 저해되었다(도 3). 터키 사후 검정을 동반하는 1-원 ANOVA를 사용하여 유의성을 결정하였으며, IL-33 처리에 대해 **p<0.01, ***p<0.001이었다.
실시예 8. 항-ST2L 도메인 I 결합 항체는 시험관내에서 비만 세포 반응을 저해한다
마우스 및 인간 비만 세포에 의한 케모카인 및 사이토카인의 방출과 더불어, 인간 비만 세포에서의 프로스타글란딘 D2의 방출에 의해 비만 세포 반응을 평가하였다.
항-ST2L 도메인 I 결합 항체 CNTO3914는 마우스 골수-유래 비만 세포에 의한 GM-CSF(도 4a), IL-5(도 4b), 및 TNFα(도 4c)를 포함하는 IL-33-유도 사이토카인 방출을 저해하였다.
항-인간 ST2L 도메인 I 결합 mAb C2494(STLM62)는, 항체 농도 2, 10, 및 50 ㎍/ml에서 3 ng/ml IL-33에 의해 유도된 인간 제대혈-유래 비만 세포에 의한 IL-33-유도 PGD2 방출을 저해하였다(도 5).
항-ST2L 도메인 I 결합 항체 C2494 및 C2244는, 항체 농도 50 ㎍/ml, 10 ㎍/ml, 및 2 ㎍/ml에서 인간 제대혈-유래 비만 세포에 의한 IL-33-유도 GM-CSF, IL-5, IL-8, IL-13, 및 IL-10 방출을 저해하였다(도 6 및 8a 내지 8e). 저해의 정도는 측정된 사이토카인/케모카인, 시험한 항체 및 항체 농도, 및 사용된 배지에 따라 달라졌다. 계산된 평균 퍼센트(%) 저해는 항체 농도 2 ㎍/ml에서 수행된 모든 어세이에서 50.6 내지 100%였고, 50 ㎍/ml의 항체 농도에서는 62 내지 100%였다(도 9).
항-ST2L 도메인 III-결합 항체 C2521, C2519, ST2M48, ST2M49, ST2M50, 및 ST2M51은, 항체 농도 50 ㎍/ml 및 10 ㎍/ml에서 비만 세포에 의한 IL-33-유도 사이토카인 방출에 대한 저해를 나타내지 않거나, 보통의 저해를 나타내거나, 이를 자극하였다(도 7a 내지 7e 및 8a 내지 8e). 저해의 정도는 측정된 사이토카인/케모카인, 시험한 항체, 및 사용된 배지에 따라 달라졌다. 계산된 평균 퍼센트(%) 저해는 항체 농도 2 ㎍/ml에서 수행된 모든 어세이에서 -594.4 내지 31.9%였고, 50 ㎍/ml의 항체 농도에서는 -481.5 내지 36%였다(도 9). 일부 어세이에서, 항체 ST2M50은 항체 농도 10 ㎍/ml에서 GM-CSF, IL-5, IL-10, 및 IL-13 분비를 저해하였다(도 8a 내지 8e).
하기의 수학식을 사용하여 평균 %저해를 계산하였다: (1-(mAb의 존재 하에 방출된 사이토카인의 농도)/ (mAb의 부재 하에 IL-33에 반응하여 방출된 동일한 사이토카인의 농도)) × 100. 사이토카인 농도는 pg/ml의 단위이다. 일부 경우에는, %저해가 음의 값이며, 이는 mAb의 존재 하의 사이토카인 방출이 mAb의 부재 하에 방출된 것보다 사실상 더 높았음을 표시한다. 비만 세포에서 사이토카인 방출을 유도하기 위해 사용된 IL-33 농도에 따라 mAb의 효능에 경미한 차이가 발생할 수 있다. 마찬가지로, 사용된 어세이 배지(스템프로-34 대 RPMI / 10% FCS)에 따라 mAb의 활성에 경미한 차이가 존재할 수 있다. 모든 시험 ST2L 도메인 I 결합 항체가 모든 측정된 사이토카인 및 케모카인 방출을 2 ㎍/ml, 10 ㎍/ml, 또는 50 ㎍/ml의 농도에서 평균 %저해에 의해 측정할 때 50% 이상만큼 저해하였다.
실시예 9. ST2L 도메인 I 결합 항체는 비강내 IL-33-유도 기도 개형을 저해한다.
C57BL/6 마우스에 1 ㎍/마우스 "성숙한" IL-33(또는 PBS)(서열 번호 215의 잔기 109 내지 266)을 제1일, 제3일, 제5일, 제7일, 및 제9일에 비강내 투여하고, 제10일 또는 제20일에 폐를 분석하였다. 최초 IL-33 비강내 투여 전 6 h에 항-마우스 ST2L 항체 CNTO3914 또는 동형 대조군(CNTO5516)을 2 mg/㎏으로 피하 투여하였다. 대조군 마우스는 최초 IL-33 비강내 투여 6 h 전에 동형 대조군 CNTO5516 또는 PBS를 투여 받았다. 조직학적 분석을 위해 팽창시킨 폐를 10% 완충 포르말린에 고정시켰으며; 분석에 사용된 염색은 H&E, 매슨 트라이크롬(Masson Trichrome), 및 PAS를 포함하였다.
IL-33 처리는, 주로 호산구와 혼합된 세기관지 주위 침윤 및 배상 세포 과형성을 동반하는 보통 내지 현저한 세기관지 상피 비대 및 과형성을 유도했다. CNTO3914를 투여 받은 동물에서는 세기관지 상피 비대 및 과형성이 뚜렷하지 않았다. 매슨 트라이콤 염색은 존재하는 콜라겐의 양을 결정하기 위한 것이었으며; 이 염색은 IL-33 처리 동물에서 배상 세포 비대를 규명했다. CNTO3914로 처리한 동물에는 폐포 및 세기관지 주위 영역에 침윤이 없었다.
실시예 10. 완전 인간 ST2L-항체의 생성
스트렙타비딘-코팅된 자기 비드 상에 포획된 바이오틴화 항원과 함께 키메라 HHM-ST2L 작제물(서열 번호 6, 표 1)을 사용하여 라이브러리를 패닝한 점을 제외하고는, 본질적으로 실시예 3에 기재된 바와 같이 신생 pIX 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 부가적인 인간 ST2L-결합 Fab를 선택하였다. 파아지 라이브러리를 3% 탈지 분유를 가진 PBS-T 중에 차단하였다. 경쟁자 단백질, MHM-ST2L 키메라(서열 번호 7, 표 1)를 차단 용액에 첨가하여 인간 ST2L 도메인 I 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 Fab에 대한 파아지 선택을 추진하였다. 3개의 라운드 동안 파아지 선택을 수행한 후에 hST2L-Fc 단백질에 대한 Fab 결합에 대해 ELISA에 의한 스크리닝을 수행하였다.
이들 선택으로부터 hST2L-Fc에 결합된 19개의 Fab가 단리되었으며, 키메라 ST2L 작제물에 대한 결합(표 1)과 더불어 마우스ST2L 및 인간ST2L 단백질에 대한 결합에 대해 추가로 스크리닝하여 특이성의 도메인을 맵핑하고, IL-33/hST2L 상호작용을 차단하는 그들의 능력에 대해 특성화하였다. Fab ST2F1, ST2F4, 및 ST2F6는 hIL-33/ST2L 상호작용을 차단하였고, ST2L의 도메인 I에 결합하였으며, 친화력 성숙으로 진행되었다.
[표 9]
Figure pct00011
실시예 11. 인간 ST2L 결합 Fab의 친화력-성숙
문헌[Shi et al., j Mol Biol 397:385-396, 2010] 및 국제 특허 공개 제WO2009/085462호 및 실시예 4에 기재된 "인-라인" 성숙 과정을 사용하여 ST2F1, ST2F4, 및 ST2F6을 친화력-성숙시켰다. 각각 상응하는 경쇄 라이브러리, B3, L6, 및 L6을 다양화하고, 라이브러리를 Fab VH 영역과 조합함으로써, ST2F1, ST2F4, 및 ST2F6에 대해 친화력 성숙 라이브러리를 제조하였다. L6 및 B3 친화력 성숙 라이브러리를 위한 경쇄 잔기에 대한 다양화 스킴을 표 10에 나타낸다. 위치 번호화는 카바트에 따른다. 친화력 성숙 패닝을 위하여, 라운드 1에서는 10 nM, 라운드 2에서는 1 nM, 라운드 3에서는 0.1 nM의 농도에서 바이오틴화 huST2-ECD-Fc를 스트렙타비딘(SA)-코팅된 자기 비드 상에 포획하였다. 10 nM의 표지되지 않은 huST2L-ECD-Fc의 존재 하에 실온에서 밤새 라운드 3의 최종 세척을 수행하였다.
[표 10]
Figure pct00012
ST2F6 경쇄 성숙 라이브러리 선택은 개선된 결합체(binder)(ST2F14, ST2F17, ST2F31, 및 ST2F41)를 산출하였다(도 10 및 도 11). 프로테온을 사용하여 이들을 Fab로서 검사하였으며, 2 nM 내지 400 pM의 보통의 친화력 개선을 나타냈다.
ST2F14, ST2F17, ST2F31, 및 ST2F41의 친화력을 추가로 개선하기 위하여, 표 11에 나타낸 다양화 스킴을 사용하여 HCDR1 및 HCDR2 카바트 위치 31, 32, 33, 35, 50, 52, 53, 56, 및 58에서 ST2F14, ST2F17, ST2F31, 및 ST2F41 내의 통상적인 중쇄 ST2H41을 무작위화하였다. 생성되는 중쇄 라이브러리를 4개의 친화력 개선 경쇄 ST2L32, ST2L35, ST2L49, 및 ST2L59와 쌍을 이루게 하고, 경쇄 성숙 라이브러리에 대해 기재된 바와 같이 이 라이브러리를 패닝하고 스크리닝하였다. 추가의 특성화를 위해, ST2F14에 대해 개선된 결합을 가진 Fab를 단리하고 IgG로 변환하였다. 생성되는 항체(STLM103, STLM107, STLM108, STLM123, STLM124, STLM206, STLM207, STLM208, STLM209, STLM210, STLM211, STLM212, STLM213, STLM214, STLM215, STLM216, STLM217, STLM218, STLM219, STLM220, STLM221, STLM222)(도 10 및 도 11)는 VH3-23 또는 Vk-L6으로부터 유래된 프레임워크를 갖는다. 모든 항체가 ST2L 도메인 I에 결합하고 IL-33/ST2L 상호작용을 차단한다.
[표 11]
Figure pct00013
HCDR3의 개시부(beginning)에서 DP 모티프를 대체하기 위해 STLM208 VH ST2L257에 대한 부가적인 변이체를 설계하고 발현시켰다. 변이체의 서열을 도 12에 나타낸다.
실시예 11. C2494의 인간 프레임워크 적응화(HFA)
본질적으로 미국 특허 공개 제US2009/0118127호 및 문헌[Fransson et al., J Mol Biol 398:214-231, 2010]에 기재된 바와 같이 프레임워크 적응화 과정을 실행하였다. 약술하면, IMGT 데이터베이스(문헌[Kaas, et al., Nucl. Acids. Res. 32, D208-D210, 2004]; 문헌[Lefranc et al., Nucl. Acid Res., 33, D593-D597, 2005])에 대한 블라스트 검색을 사용하여 중쇄 및 경쇄 서열을 인간 생식세포 서열(2007년 10월 1일의 것과 같은 "01" 대립유전자만)과 비교하였다. 인간 생식세포 유전자의 이러한 세트로부터, 중복 유전자(아미노산 수준에서 100% 동일함) 및 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기를 가진 것들을 제거하였다. 프레임워크 및 CDR 영역 양자 모두에서 가장 근접하게 일치하는 나머지 인간 생식세포 유전자를 수용자 인간 프레임워크로서 선택하였다. 전체적인 서열 상동성 및 CDR 길이와 더불어 CDR 유사성을 기반으로 총 9개의 VL 및 7개의 VH 생식세포 인간 프레임워크를 선택하였다. IGHJ/IGJK 생식세포 유전자, VL 쇄에 대해서는 JK2, 그리고 VH 쇄에 대해서는 JH1의 C2494 서열과의 서열 유사성을 기반으로 FR-4를 선택하였다(문헌[Kaas, et al., Nucl. Acid Res. 32, D208-D210, 2004]; 문헌[Lefranc M.-P et al., Nucl. Acid Res., 33, D593-D597, 2005]). 이어서, VH의 CDR-H1에 상응하는 영역은 제외하고, C2494의 CDR(도 14에 밑줄로 표시)을 선택된 수용자 인간 프레임워크에 이전하여 HFA 변이체를 생성시켰다. 이 영역의 경우, CDR과 HV의 조합, 또는 더 짧은 HCDR2(카바트-7이라고 지칭함, 미국 특허 공개 제US2009/0118127호 참조)를 비-인간 항체로부터 인간 FR로 이전하였으며, 이는 도 14에 회색으로 강조된 HCDR2 잔기가 공지 구조의 항원-항체 복합체에서 접촉되는 것으로 확인되지 않았기 때문이다(문헌[Almagro, J Mol Recognit. 17, 132, 2004]).
C2494의 성숙한 단백질 서열(VL: 서열 번호 52; VH: 서열 번호 48)을 도 14에 나타낸다. 도면에서, CDR 잔기(카바트)는 밑줄로 표시하고, 초티아 HV 루프는 CDR 아래에 표시하며, 선택된 인간 프레임워크에 이전된 잔기는 HV 밑에 표시한다(HFA). 회색으로 강조된 HCDR2 잔기를 모든 변이체에 이전하지는 않았다.
MOE의 항체 모델링 모듈(몬트리올 소재의 CCG)을 사용하여 C2494의 Fv 단편에 대한 3D 상동성 모델을 작제하였다. 노출된 메티오닌 및 트립토판 잔기, 잠재적 N-글리코실화 및 탈아미드화 모티프와 같은 개발가능성 부담(developability liability)의 평가를 위해 모델을 이용하였다. LCDR3에는, Fv 구조적 모델을 기반으로 하는, 잠재적으로 노출된 Met(M94) 잔기가 존재한다. 그것을 제거하기 위하여, M94L 돌연변이를 가진 변이체(STLL280, O12b)를 생성시켜 특성화하였다. 중쇄의 경우에는, HCDR3 직전의 CAR 모티프 내의 R 잔기(초티아 잔기 92 내지 94, 도 14)가 음으로 하전된 잔기(초티아 잔기 D31, D32, D96, 및 D101a, 도 14)의 클러스터에 부정적인 영향을 줄 수 있으며, 이는 결합에 있어서 중요할 수 있다. 초티아 잔기 94(CAR →CAL)에서 류신이 알지닌으로 치환된 VH를 생성시켜 특성화하였다.
C2494 모체와 함께, 설계된 중쇄 및 경쇄를 조합한 mAb를 발현시키고 인간 ST2L에 대한 결합에 대해 어세이하였다. 생성된 HFA mAb 중에서, IGHV1-24*01(서열 번호 148) 및 IGHV1-f*01(서열 번호 149) 중쇄 프레임워크(STLH195 및 STLH194)를 갖는 VH 쇄를 가진 mAb가 항체를 잘 발현시켰으며, IGKV3-15*01(L2)(서열 번호 150), IGKV1-9*01(L8)(서열 번호 151), IGKV1-5*01(L12)(서열 번호 152), IGKV1-12*01(L5)(서열 번호 153), IGKV1-39*01(O12)(서열 번호 154), IGKV1-27*01(A20)(서열 번호 155) 또는 IGKV1-33*01(O18)(서열 번호 156) 프레임워크(STLL280, STLL278, STLL277, STLL276, STLL275, STLL274, STLL273, STLL272)를 갖는 다양한 HFA 경쇄와 조합할 때 ST2L에 결합하였다.
HFA VH 및 VL 변이체의 서열을 표 12에 나타낸다. 이전된 잔기는 밑줄로 표시하고, 상기의 부가적인 치환은 회색으로 강조한다. 표 13은 각각의 HFA VH 및 VL에 대해 서열 번호와 더불어 고유한 pDR(플라스미드) 및 CBIS ID를 나타낸다. 추가의 특성화를 위해 선택된 생성된 mAb에 대한 중쇄 및 경쇄 조합을 표 14에 나타낸다.
표 15는 C2494 CDR을 이전하기 위해 사용된 인간 프레임워크(조합된 V 및 J 영역)를 나타낸다.
[표 12]
프레임워크 적응화 VL 쇄(JK2 서열에 커플링됨).
CDR은 밑줄로 표시한다.
>VL2494(모체)(서열 번호 52)
Figure pct00014
>VL2494-IGKV1-33*01 O18(서열 번호 135)
Figure pct00015
>VL2494-IGKV1-27*01 A20(서열 번호 136)
Figure pct00016
>VL2494-IGKV1-39*01O12(서열 번호 137)
Figure pct00017
>VL2494-IGKV1-12*01 L5(서열 번호 138)
Figure pct00018
>VL2494-IGKV1-5*01 L12(서열 번호 139)
Figure pct00019
>VL2494-IGKV1-9*01 L8(서열 번호 140)
Figure pct00020
>VL2494-IGKV3-15*01 L2(서열 번호 141)
Figure pct00021
>VL2494-IGKV1-39*01 O12b(서열 번호 142)
Figure pct00022
JH1에 커플링된 프레임워크 적응화 VH 쇄
>VH2494(모체)(서열 번호 48)
Figure pct00023
>VH2494-IGHV1-f*01(서열 번호 143)
Figure pct00024
>VH2494-IGHV1-24*01(서열 번호 144)
Figure pct00025
[표 13]
Figure pct00026
[표 14]
Figure pct00027
[표 15]
Figure pct00028
실시예 12. 파라토프 스캐닝을 위한 알라닌 및 인간 생식세포 돌연변이체의 설계
부위-지정 돌연변이유발을 실행하여 개별적인 CDR 잔기의 결합 기여와 더불어 다른 항체 특징에 잠재적 효과를 갖는 일부 잔기를 평가하였다. 상기 C2494 Fv의 분자 모델을 기반으로 용매-노출된 CDR 잔기의 서브세트가 항원 결합에 관련된 것으로 예측되었다. 이들은 알라닌 및/또는 상응하는 '인간-유사' 잔기로 돌연변이화되었으며, 이는 가장 근접하게 일치하는 생식세포 유전자에서 상응하는 잔기이다. C2494 VH 내의 D101aA(초티아 잔기), (서열 번호 48 내의 D104A) 치환은 koff를 약 4배(1.43×10-4으로부터 3.2×10-5으로) 감소시켰다.
D101aA 치환이 ST2L에 대한 결합에서 C2494 Fab의 koff를 감소시켰으므로, 동일한 돌연변이가 C2494 HFA 변이체에서 해리 속도 또한 개선할 수 있을 것으로 예상되었다. 따라서, D101aA(초티아 번호화)를 STLH194의 VH에 혼입시켜(>VH2494-IGHV1-f*01, 서열 번호 143) VH STLH201(서열 번호 145)을 생성시켰다. STLH201은 7개의 경쇄 STLL280, STLL277, STLL276, STLL275, STLL274, STLL273, 및 STLL272(표 13 및 표 14)와 쌍을 이루어 mAb STLM226, STLM227, STLM228, STLM229, STLM230, STLM231, 및 STLM232를 생성하였으며, 이는 추가로 특성화되었다. 그러므로 mAb STLM226, STLM227, STLM228, STLM229, STLM230, STLM231, 및 STLM232는 모체 C2494 항체에 비교할 때 동일한 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, 및 HCDR2 서열 및 상이한 HCDR3(서열 번호 146, GDFYAMAY)을 갖는다. 또한, 항체 STLM266 VL STLM280은 고유한 LCDR3: LQSDNLLT(서열 번호 147)를 가졌다.
STLH201(서열 번호 145):
Figure pct00029
HCDR3 혼입 D101aA(초티아 번호화) 치환:
서열 번호 146: GDFYAMAY
항체 STLM266 VL STLM280은 고유한 LCDR3: LQSDNLLT(서열 번호 147)를 가졌다.
실시예 13. 항-ST2L 항체의 특성화
파아지 디스플레이, 하이브리도마, 및 인간 프레임워크 적응화 캠페인으로부터 얻어진 항체를 huST2L-ECD, 시노ST2L-ECD에 대한 결합, 친화력 측정, 인간/마우스 키메라에 대한 결합을 포함하는 다양한 어세이에서 특성화하여 도메인 결합, 수용체-리간드 저해 어세이, 리포터 유전자 어세이, 및 비만 세포 반응 어세이를 결정하였다.
파아지 디스플레이 캠페인으로부터 유래된 항체의 인간 및 시노 ST2L에 대한 친화력과 더불어 인간 ST2L에 대한 그들의 결합 특이성을 표 16에 나타낸다. 표 16의 모든 항체가 인간 ST2L의 도메인 I에 결합하였다.
[표 16]
Figure pct00030
모체(STLM62, C2494)와 관련하여 HFA 캠페인으로부터의 항-ST2L 항체의 친화력을 표 17에 나타낸다. 친화력은 프로테온에 의해 분석되었다. 프로테온의 PBS-T-E 완충액(PBS, 0.005% P20 및 3 mM EDTA)을 실행 완충액으로 사용하여 25℃에서 실험을 수행하였다. 실험을 수행하기 위하여 염소 항-인간 Fc(~5800 RU)의 공유적 고정화에 의해 GLC 센서 칩을 제조하고, 122 내지 146 반응 단위(RU)의 Mab를 포획하였다. Mab 포획 후에 0.024 내지 15 nM(5-배 희석)의 ST2L-ECD를 4 min 동안 주입하였다(50 ㎕/min에서 200 ㎕). 모든 반응에 대해 30 분 동안 해리를 모니터링하였다. 10 mM 글리신 pH 1.5의 15 sec 펄스 2회를 사용하여 재생을 수행하였다. 기준선 표동 모델(baseline drift model)을 이용하여 데이터를 1:1에 적합시켰다.
샘플에 대한 회합 속도는 빠르며, 곡선 적합 및 친화력의 추산을 위해 물질 전달을 동반하는 랭뮤어(langmuir) 모델을 사용하였다. 모든 샘플이 모클론 및 대조군 Mab보다 더 빠른 해리 속도를 가졌다. 해리 속도의 차이는, 모항체에 비교할 때 HFA 변이체의 더 낮은 친화력의 주원인이었다.
[표 17]
Figure pct00031
[표 18]
Figure pct00032
기재된 바와 같이 RPMI + 10% FCS 중의 100 ㎍/ml, 10 ㎍/ml, 1 ㎍/ml, 0.1 ㎍/ml, 또는 0.01 ㎍/ml 항체를 사용하여 인간 제대혈-유래 비만 세포로부터의 3 ng/ml IL-33-유도 IL-5, IL-13, 및 IL-8 방출의 저해를 측정함으로써, 선택된 항체를 비만 세포 반응에 대해 시험하였다. 이들 어세이 조건에서, 모든 시험 항체가 항체 농도 100 ㎍/ml에서 IL-33-유도 IL-5, IL-13, 및 IL-8 사이토카인 방출을 IL-33으로 유도된 대조군 샘플에 비교할 때 약 40% 내지 100% 만큼 저해하였다.
실시예 14. 항-ST2L 항체는 인간 호염기구에서 다운스트림 신호전달 경로를 저해한다
항-ST2L 항체를 인간 호염기구에서 p38 MAPK 신호전달을 저해하는 그들의 능력에 대해 시험하였다.
헤파린 첨가 튜브에 전혈을 수집하고 어세이의 개시 전에 실온(RT)이 되게 하였다. 1 mL의 혈액을 50 mL 원추형 튜브에 분취하고 PBS에 희석한 항-ST2L 항체(STLB252) 또는 동형 대조군(CNTO 8937)을 2, 20, 또는 200 ㎍/mL의 최종 농도로 첨가하였다. 튜브를 온화하게 회전시켜 혼합하고, 37℃ × 30 분에서 인큐베이터에 넣고, 15 분 후에 온화하게 회전시켰다. 이어서, 세포 표면 항원(CD123-FITC, CRTH2-PCP-CY5.5, 및 CD45-APC-C7)에 대한 플루오로크롬-표지된 항체로 혈액을 염색하고 튜브를 37℃에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 1 mL의 가온된 배양 배지(RPMI-1640/10% FBS/1% 페니실린-스트렙토마이신)를 각각의 튜브에 첨가한 후, 가온된 배양 배지에 희석한 IL-33을 10 ng/mL의 최종 농도로 첨가하였다. 샘플을 37℃ × 10 분에서 인큐베이션한 후에, 적혈구를 용해시키는 동시에 샘플을 고정시키기 위하여, 각각의 튜브에 20 mL의 사전-가온된 BD 포스플로우 용해/고정 완충액(BD Phosflow Lyse/Fix buffer)을 첨가하였다. 튜브를 10회 뒤집어 잘 혼합하고 37℃ × 10 분에서 인큐베이션하였다. 샘플을 20 mL의 멸균된 실온 PBS로 세척하고, 2 mL의 1x 실온 BD 투과/세척 완충액(BD Perm/Wash Buffer)에 재현탁하고, 실온 × 30 분에서 인큐베이션하였다. 샘플을 2 mL의 BD 투과/세척 완충액으로 1회 세척한 후에 400 ㎕의 BD 투과/세척 완충액에 재현탁하였다. 세포내 p38-MAPK에 대한 PE-표지된 항체(v셀 시그널링(vCell Signaling), Cat. 6908S)를 첨가하고, 샘플을 차광하여 실온에서 30 min 인큐베이션하였다. 샘플을 5 mL 투과/세척 완충액으로 1회 세척한 후에 100 ㎕의 FACS 완충액에 재현탁하고 96-웰 둥근-바닥 플레이트에 이전하였다. 각각의 샘플에 대해 가능한 한 많은 이벤트를 수집하는 고효율 시스템(HTS: high-throughput system)을 이용하는 BD LSRII 유세포 분석기를 사용하여 샘플을 분석하였다. 플로조(FloJo) 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. 호염기구는 CD45+CRTH2+CD123+로서 동정되었으며, 각각의 조건에 대해 p38 MAPK 양성 호염기구의 퍼센트를 평가하였다. 항-ST2L mAB(STLB252)와 함께 전혈을 사전-인큐베이션하는 것은 IL-33 유도 p38-MAPK 인산화의 용량-의존적 저해를 유발한 반면에, 동형 대조군(CNTO 8937)으로는 효과가 관찰되지 않았다. 항-인간 ST2L 항체는 전혈에 있어서 재조합 인간 IL-33에 의한 호염기구 활성화를 특이적으로 차단했다. 결과는 항-ST2L 항체가 생체내에서 내재적 IL-33에 의한 신호전달을 저해함을 제안한다.
[표 19]
Figure pct00033
실시예 15. 항-ST2L 항체에 의한 생체내 표적 집중(target engagement)
BAL 세포 동원의 비강내 mIL-33 6 시간 생체내 모델
단일 용량의 1.2 ㎍/마우스 mIL-33(R&D 시스템즈 #3626-ML/CF) 또는 PBS를 웅성 Balb/c 마우스(6 내지 8주령, 타코닉(Taconic))에 투여하였다. 최초 mIL-33 비강내 투여 전 24 hr에 랫트 항-마우스 ST2L 항체 CNTO 3914를 2, 0.2, 0.06, 또는 0.02 mg/㎏으로 투여하였다. 동형 대조군(ITC) mAb CNTO 5516은 2 mg/㎏으로 피하 투여하였다. mIL-33(또는 PBS) 투여 후 6 시간에, 마우스를 희생시키고 혈청 분석을 위해 혈액을 수집하였다. 2 부피의 0.7 mL의 PBS/0.1% BSA를 폐에 주입하고 유출물을 회수함으로써 기관지 폐포 세척(BAL)을 수행하였다. BAL을 원심분리하고(1200rpm, 10 분), 혈구 계수기(라이트-김사-염색 사이토스핀 제제 상에서)를 사용하는 총 세포 계수 및 감별 세포 계수를 위해 세포 펠렛을 200 ㎕의 PBS에 재현탁하였다.
마우스 혈청 내의 CNTO 3914의 측정
MSD SA-STD 플레이트를 50 ㎕/웰의 어세이 완충액으로 5 분 동안 차단하였다. 플레이트를 뒤집어 어세이 완충액을 제거하고 종이 타월 상에 두드렸다. 50 ㎕/웰의 어세이 완충액 중의 1.4 ㎍/mL 바이오틴화 재조합 마우스 ST2L/IL1R4/Fc 키메라(R&D 시스템)를 첨가하고 냉장고 내에서 밤새 인큐베이션하였다. 사전-코팅된 플레이트의 각각의 웰에 코팅 시약을 제거하지 않고 150 ㎕의 어세이 완충액을 첨가하고 30 분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트 세척기 상에서 세척 완충액으로 플레이트를 3회 세척하였다. 플레이트를 종이 타월 상에 가볍게 두드려 잔류 세척 완충액을 제거하였다. 플레이트의 각각의 웰에 50 ㎕/웰의 CNTO 3914 샘플을 첨가하였다. 주위 온도에서 온화하게 보텍싱(vortexing)하면서 플레이트를 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트 세척기 상에서 세척 완충액으로 플레이트를 3회 세척하였다. 플레이트의 각각의 웰에 50 ㎕/웰의 역가(titration)의 루테늄-표지된 마우스 항-마우스 IgG1b(BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences))를 첨가하였다. 주위 온도에서 온화하게 보텍싱하면서 플레이트를 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트 세척기 상에서 세척 완충액으로 플레이트를 3회 세척하였다. 플레이트의 각각의 웰에 150 ㎕의 판독 완충액을 첨가하였다. MSD 섹터 이미저 6000 판독기 상에서 플레이트를 발광 수준에 대해 즉시 판독하였다.
전혈 어세이
사르쉬테드(Sarstedt) 필터 튜브 내에서 DMEM 배지 + 1% 페니실린+ 스트렙토마이신 용액 +/- 10 ng/ml 마우스 IL-33에 혈액을 1:4 희석하였다. 튜브를 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 제조자의 지침에 따라 밀리포어 밀리플렉스(Millipore Milliplex) 마우스 사이토카인/케모카인 키트를 사용하여 상등액에서 사이토카인 및 케모카인 수준을 측정하였다.
결과
0.2 또는 2 mg/㎏ CNTO 3914로 투여한 후 24 시간에 마우스의 혈청에서 항-ST2L 항체가 검출가능했다(도 16a).
IL-33의 비강내 투여는 6 h에 기도로의 세포 동원을 유도했다(도 16b). 항-ST2L mAb 투여는 BAL 세포 동원을 감소시켰으며; BAL 세포 동원의 유의적인 저해를 관찰하기 위해 필요한 최소 용량은 0.2 mg/㎏이었다(도 16b). 통계적 유의성은 1-원 ANOVA를 사용하여 계산했다.
마우스 IL-33으로 자극한 전혈은 24 h 후에 IL-6(도 16c) 및 MCP-1(도 16d)을 포함하는 사이토카인 및 케모카인의 증가된 수준을 나타냈다. 20 mg/㎏ 또는 2 mg/㎏ 항-ST2L mAb CNTO 3914로 투여한 마우스에서는, IL-6 및 MCP-1 수준이 CNTO5516(동형 대조군 항-마우스 IgG1)에 비교하여 감소하였으며, 이는 표적 집중을 시사한다. 전혈 어세이에서의 저해와 관련된 최소 용량인 2 mg/㎏은 BAL 세포 동원 또한 저해하였다(도 16b).
종합적으로, 이 데이터는 항-ST2L mAb가 작용 부위에 도달하며 의도된 약리학적 효과가 달성되었음을 확증한다(표적 집중을 시사함).
실시예 16. 항-ST2L 항체의 에피토프
에피토프 맵핑 및 경쟁 연구를 수행하여 항-ST2L 항체를 선택하였다.
경쟁 결합 어세이
경쟁 결합 어세이를 수행하여 항-ST2L mAb에 대한 상이한 결합 에피토프 기를 평가하였다. MSD 하이바인드 플레이트(메릴랜드주 게이더스버그 소재의 메조 스케일 디스커버리) 상에 웰 당 5 ㎕(10 ㎍/ml)의 ST2L-ECD 단백질을 실온에서 2 hr 동안 코팅하였다. 150 마이크로리터의 5% MSD 차단제 A 완충액(메릴랜드주 게이더스버그 소재의 메조 스케일 디스커버리)을 각각의 웰에 첨가하고 실온에서 2 hr 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.1 M HEPES 완충액, pH 7.4로 3회 세척한 후에, MSD 형광 염료(설포 태그, NHS 에스테르) 표지된 개별적인 항-ST2L 항체와 상이한 경쟁자의 혼합물을 첨가하였다. 표지된 항체(10 또는 30 nM)를 증가하는 농도의 경쟁자 항체(1 nM 내지 2 또는 5 μM)와 함께 인큐베이션한 후, 25 ㎕ 부피의 혼합물로 표기된 웰에 첨가하였다. 실온에서 온화하게 진탕하면서 2 시간 인큐베이션한 후에, 플레이트를 0.1 M HEPES 완충액(pH 7.4)으로 3회 세척하였다. MSD 리드(Read) 완충액 T를 멸균수로 희석하고(4-배), 150 ㎕/웰의 부피로 분배하고, SECTOR 이미져(Imager) 6000으로 분석하였다.
하기의 항체를 경쟁 어세이에 사용하였다: ST2L 도메인 I 결합 중화 항체 STLM208, STLM213, C2244(STLM15), 및 C2494(STLM62), ST2L 도메인 III 결합 항체 C2539, 및 인간 ST2L의 도메인 I에 결합하는 비-중화 항-ST2L 항체 C2240. 도 17a 및 17b는 경쟁 실험을 나타낸다. 실험을 기반으로 동정된 에피토프 빈(bin)은, 빈A: mAb C2244, C2494, STLM208, 또는 STLM213; 빈B: mAb C2240, 빈C: C2539이다. IL33/ST2L 상호작용을 차단하고 비만 세포 반응을 저해하는 항체가 동일한 에피토프 빈 내에서 확인되었으며 서로 교차-경쟁하는 것으로 확인되었다. 경쟁 데이터의 요약을 표 20에 나타낸다.
[표 20]
Figure pct00034
에피토프 맵핑: H/D 교환 분석
H/D 교환에 있어서, 항체 섭동(antibody perturbation)을 분석하기 위해 사용된 절차는, 일부 변형을 동반하여 이전에 기재된 것(문헌[Hamuro, Y., et al., Journal of Biomolecular Techniques, 14:171-182, 2003]; 문헌[Horn, J. R., et al., Biochemistry, 45: 8488-8498, 2006])과 유사하다. 재조합 ST2-ECD(C-말단 His-태그를 동반하여 HEK293E로부터 발현됨)(서열 번호 157의 잔기 18 내지 328)를 중수 용액 중에 소정의 시간 동안 인큐베이션하여 교환가능한 수소 원자에서 중수소 혼입을 유발시켰다. 고정된 항-ST2L C2244 Fab 분자를 함유하는 컬럼 상에 중수소화 ST2-ECD를 포획한 후, 수성 완충액으로 세척하였다. 백(back)-교환된 ST2-ECD 단백질을 컬럼으로부터 용출시키고, 프로테아제 분해 및 질량 분석에 의해 중수소 함유 단편의 위치를 결정하였다.
도 18은 C2244 Fab와 복합체를 형성한 인간 ST2-ECD(가용성 ST2) 의 단순화된 H/D 교환 맵을 나타낸다. 서열 번호 119의 ST2-ECD의 잔기 18 내지 31(아미노산 잔기 RCPRQGKPSYTVDW; 서열 번호 210)은 Fab(서열 번호 1의 전체 길이 ST2L의 잔기 35 내지 48에 상응함)에 의해 보호되었다. 이 데이터는 C2244가 에피토프(RCPRQGKPSYTVDW; 서열 번호 210)에 결합하며, C2244와 경쟁하는 항체(C2494, STLM208, 또는 STLM213)가 동일하거나 중첩되는 에피토프에 결합할 가능성이 있음을 나타낸다.
돌연변이유발에 의한 에피토프 맵핑
ST2L 도메인 I에서 상응하는 마우스 잔기로의 치환을 갖는 몇몇 ST2L 돌연변이체를 생성시켰다. 시험 항체는 마우스 ST2L과 교차-반응하지 않으므로, 결합이 감소하고/하거나 없어진 ST2L 변이체는 ST2L 상의 치환 부위에서의 에피토프 잔기를 의미할 것으로 예상된다. 표준 방법을 사용하여 변이체를 서열 번호 1의 전체 길이 ST2L의 잔기 19 내지 205를 갖는 작제물 HH-ST2L로 제조하였다. ELISA 또는 프로테온에 의해 ST2L 변이체에 대한 결합에 대해 항체를 시험하였다.
표면 플라스몬 공명
프로테온 XPR36 단백질 상호작용 어레이 시스템(바이오-라드)(문헌[Bravman T, et al. Anal Biochem 358:281-288, 2006])을 사용하여 결합 연구를 수행하였다. 항-인간/항-마우스 Fc 혼합물(잭슨 이뮤노리서치, Cat#, 109-005-098/115-005-071)을 아민-커플링 화학에 의해 GLC 센서 칩 상에 고정시켰다. 이어서, 0.5% 노니뎃(Nonidet) P-40 및 0.5% Na-데옥시콜레이트를 함유하는 PBS 중에 제조된 항체 용액을 유동시킴으로써(1 mg /mL) 개별적인 항-ST2L mAb를 포획하였다. 항-Fc-코팅된 표면에서 표면의 신호는 ~250 공명 단위(RU, 1 RU = 1 pg 단백질/㎟)에 도달하였으며, 이는 이들 항체가 항-ST2L mAb를 특이적으로 포획함을 확증한다. 유체 시스템의 90ㅀ 회전 후에, 야생형의 ST2L-D1D2 또는 변이체 단백질(0.5% 노니뎃 P-40 및 0.5% Na-데옥시콜레이트를 함유하는 PBS 중의 0.5 mg/mL)을 평행 유동 채널에 주입하였다. 이들 어세이는 모두 25℃에서 수행하였다. 항체를 단독으로 고정시킨 표면 상에서 관찰된 반응, 및 비히클을 단독으로 주입하여 관찰된 신호를 감산하여(이는 결합-비의존성 반응에 대한 보정을 가능하게 함) 이중 참조(double referencing)에 의해 표면 상의 ST2L-D1D2-의존성 신호를 얻었다. 생성되는 센서그램을 가장 단순한 1:1 상호작용 모델(프로테온 분석 소프트웨어)에 의해 적합시켜, 상응하는 회합 및 해리 속도 상수(ka 및 kd)를 얻었다.
도 19는 제조된 ST2L 변이체, 및 변이체에 대한 ST2B206 및 ST2B252 항-ST2L 항체의 친화력을 나타낸다. 변이체 93NL94(치환 93TF94-> 93NL94)는 STLM208 및 STLB252 양자 모두의 결합 친화력을 약 5-배 만큼 감소시켰다(약 10.8×10-12 M로부터 약 49.5×10-12 M까지). 결합 친화력의 유의적인 감소의 결여는 항체와 ST2L-D1D2 사이의 상호작용에 대한 결합 에너지가 H/D 교환 분석에 의해 동정된 에피토프 영역(RCPRQGKPSYTVDW; 서열 번호 210)과 이러한 93NL94 부위로부터의 부가적인 기여의 합임을 시사한다. 잔기 번호화는 서열 번호 1의 전체 길이 인간 ST2L에 따른다.
실시예 17. ST2L 도메인 I 결합 항체는 시험관내에서 초대 인간 폐 비만 세포 반응을 저해한다
폐 비만 세포 반응을 저해하는 ST2L 도메인 I 결합 항체의 능력을 초대 인간 폐 비만 세포에서 케모카인 및 사이토카인의 방출에 의해 평가하였다.
초대 인간 폐 비만 세포의 단리
국제 진보 의학 협회(International Institute for the Advancement of Medicine)로부터 입수한 정상 비-흡연자 조직으로부터 초대 인간 폐 비만 세포를 단리하였다. 폐 실질 및 소기도로부터 실질 조직(parenchyma tissue)을 분쇄하고(mincing), 세척하고, 밤새 37℃에서 콜라게나아제 및 히알루로니다아제 효소 중에 분해함으로써 세포를 분산시켰다. 세포를 수집하고, 세척하고, MACS 밀레트나이 바이오텍(MACS Miletnyi Biotec)으로부터의 CD117 마이크로비드 키트(MicroBead Kit)(인간)를 사용하는 강화 절차를 적용하여 개체군으로부터 비만 세포를 양성으로 선택하였다. 실험 전에, 스템프로-34 + 200 ng/ml 줄기 세포 인자 중에 6 주 동안 비만 세포를 배양하였다. 단리 후 2 주에, 퍼센트 비만 세포 순도를 결정하기 위하여 유세포 분석을 사용하여 세포를 표현형에 대해 특성화하였다. 후속의 어세이에 사용된 세포는 CD117(C-kit 또는 줄기 세포 인자 수용체) 및 FcㄳRI(고친화력 IgE 수용체)에 대해 89% 이중 양성이었다. 추가로, 그들은 ST2L에 대해 94.2% 양성이었으며; 이에 의해 그들의 비만 세포 표현형이 확증되었다.
초대 인간 폐 비만 세포로부터의 사이토카인 방출 어세이
스템프로-34 + 200 ng/ml 줄기 세포 인자 중에 대략 6 주 동안 배양된 초대 인간 폐 비만 세포를 수집하고, RPMI(10% 열-비활성화 FCS) 중의 원심분리에 의해 세척하였다. 세포를 계수하고 RPMI / 10% FCS 배지 중에 65,000 세포의 밀도로 96 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 항-ST2L 도메인 I 결합 mAb를 초대 폐 비만 세포에 첨가하고, 30 분 동안 37℃에서 결합시킨 후에 IL-33으로 자극하였다. 배양 상등액 내에 다양한 매개체의 축적을 개시하기 위하여, 세포를 24 시간 동안 3 ng/ml IL-33으로 자극하였다. 배양 상등액을 수확하고 커스톰 밀리플렉스 9-플렉스 키트(custom Milliplex 9-plex kit)에서 어세이할 때까지 냉동 저장하였다.
항-ST2L 도메인 I 결합 항체, STLM208은 항체 농도 100 ㎍/ml, 10 ㎍/ml, 및 1 ㎍/ml에서 초대 인간 폐 비만 세포 내의 IL-33-유도 GM-CSF(도 20a), IL-5(도 20b), IL-8(도 20c), 및 IL-13(도 20d) 방출을 저해하였다. 제대혈-유래 비만 세포를 사용하여 유사한 결과를 얻었다(데이터는 나타내지 않음).
SEQUENCE LISTING <110> Janssen Biotech, Inc. Duffy, Karen Fursov, Natalie Hall, LeRoy Healey, Catherine Lamb, Roberta Luo, Jinquan Malaviya, Ravi Naso, Michael Pratta, Michael Tornetta, Mark Wheeler, John Wu, Sheng-Jiu <120> ST2L antagonists and methods of use <130> JBI5003WOPCT <140> PCT/US13/38637 <141> 2013-04-29 <150> US 61/640,407 <151> 2012-04-30 <150> US 61/640,238 <151> 2012-04-30 <150> US 13/798,204 <151> 2013-03-13 <150> US 13/798,226 <151> 2013-03-13 <160> 215 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 556 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Phe Trp Ile Leu Ala Ile Leu Thr Ile Leu Met Tyr Ser Thr 1 5 10 15 Ala Ala Lys Phe Ser Lys Gln Ser Trp Gly Leu Glu Asn Glu Ala Leu 20 25 30 Ile Val Arg Cys Pro Arg Gln Gly Lys Pro Ser Tyr Thr Val Asp Trp 35 40 45 Tyr Tyr Ser Gln Thr Asn Lys Ser Ile Pro Thr Gln Glu Arg Asn Arg 50 55 60 Val Phe Ala Ser Gly Gln Leu Leu Lys Phe Leu Pro Ala Ala Val Ala 65 70 75 80 Asp Ser Gly Ile Tyr Thr Cys Ile Val Arg Ser Pro Thr Phe Asn Arg 85 90 95 Thr Gly Tyr Ala Asn Val Thr Ile Tyr Lys Lys 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Ser Lys Phe Trp 515 520 525 Lys His Val Arg Tyr Gln Met Pro Val Pro Ser Lys Ile Pro Arg Lys 530 535 540 Ala Ser Ser Leu Thr Pro Leu Ala Ala Gln Lys Gln 545 550 555 <210> 2 <211> 556 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 2 Met Gly Leu Trp Ile Leu Ala Ile Leu Thr Ile Leu Val Tyr Ser Thr 1 5 10 15 Ala Ala Lys Phe Ser Lys Gln Ser Trp Gly Leu Glu Asn Glu Ala Leu 20 25 30 Ile Val Arg Cys Pro Arg Gln Gly Lys Ser Ser Tyr Ile Val Asp Trp 35 40 45 Tyr Tyr Ser Gln Thr Asn Lys Ser Ile Pro Thr Gln Glu Arg Asn Arg 50 55 60 Val Phe Ala Ser Gly Gln Leu Leu Lys Phe Leu Pro Ala Glu Val Ala 65 70 75 80 Asp Ser Gly Ile Tyr Thr Cys Ile Val Arg Ser Pro Thr Phe Asn Arg 85 90 95 Thr Gly Tyr Ala Asn Val Thr Ile Tyr Lys Lys Gln Pro Asp Cys Asn 100 105 110 Val Pro Asp Tyr Leu Met Tyr Ser Thr Val Ser Gly Ser Glu Lys Asn 115 120 125 Ser Lys Ile Tyr Cys Pro Thr Ile Asp Leu Tyr Asn Trp Thr Ala Pro 130 135 140 Leu Glu Trp Phe Lys Asn Cys Gln Ala Leu Gln Gly Ser Arg Tyr Lys 145 150 155 160 Ala His Lys Ser Phe Leu 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Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 200 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> ST2H162 <400> 200 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Asp 20 25 30 Ser Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Glu Gly Asn Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Trp Ser Thr Glu Gly Ser Phe Phe Val Leu Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 201 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> ST2H139 <400> 201 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Asp Ile Gly Gly Glu Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Trp Ser Thr Glu Gly Ser Phe Phe Val Leu Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 202 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> ST2H137 <400> 202 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Asp Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Asp Ile Arg Gly Glu Gly Gly Gly Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Trp Ser Thr Glu Gly Ser Phe Phe Val Leu Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 203 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> ST2H136 <400> 203 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr 20 25 30 Asp Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Arg Gly Glu Gly Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Trp Ser Thr Glu Gly Ser Phe Phe Val Leu Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 204 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> ST2H129 <400> 204 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr 20 25 30 Ser Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Asp Ile Gly Gly Glu Gly Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Trp Ser Thr Glu Gly Ser Phe Phe Val Leu Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 205 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> ST2H112 <400> 205 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Asp Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Arg Gly Glu Gly Gly Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Trp Ser Thr Glu Gly Ser Phe Phe Val Leu Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 206 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> ST2L32 <400> 206 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Asp Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ile Gly Ala Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 207 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> ST2L35 <400> 207 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Asp Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ile Asp Ala Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 208 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> ST2L49 <400> 208 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Asp Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asp Ala Ile Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 209 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> ST2L59 <400> 209 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Asp Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ile Thr Ala Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 210 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> ST2L epitope <400> 210 Arg Cys Pro Arg Gln Gly Lys Pro Ser Tyr Thr Val Asp Trp 1 5 10 <210> 211 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VH cDNA for STLM208 <400> 211 gaggtgcagc tgctggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgcgcctg 60 agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc atctacgaca tgatctgggt gcgccaggcc 120 cccggcaagg gcctggagtg ggtcagcagc atccgcggcg agggcggcgg cacctactac 180 gccgacagcg tgaagggccg cttcaccatc agccgcgaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgcgacccc 300 tggagcaccg agggcagctt cttcgtgctg gactactggg gccagggcac cctggtgacc 360 gtgagcagc 369 <210> 212 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VL cDNA for STLM208 <400> 212 gagatcgtgc tgacccagag ccccgccacc ctgagcctga gccccggcga gcgcgccacc 60 ctgagctgcc gcgccagcca gagcgtggac gacgacctgg cctggtacca gcagaagccc 120 ggccaggccc cccgcctgct gatctacgac gccagcaacc gcgccaccgg catccccgcc 180 cgcttcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctggagccc 240 gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag tacatcaccg cccccctgac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggagatcaa g 321 <210> 213 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VH cDNA for c2244 <400> 213 gaggtgcagc ttcaggagtc aggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60 acctgcactg tcactggctt ctcaatcacc agtgattatg cctggaactg gatccggcag 120 tttccaggaa gcaagctaga gtggatgggc ttcataagct acagtggtga cactagcttc 180 aacccatctc tcaaaagtcg aatctctgtc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240 ctgcagttga attctgtgac tactgaggac acagccacat attactgtgc aagttatgat 300 ggttactcat ttgactactg gggccaaggc actactctca cagtctcctc a 351 <210> 214 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VL cDNA for c2244 <400> 214 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttcc ttagctatat ctctggggca gagggccacc 60 atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct ctagttatat gttctggtac 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct 180 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatacat 240 cctgtggagg aggaggatgc tgcagcctat tactgtcaac acagtaggga gattccgtac 300 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 333 <210> 215 <211> 266 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 215 Met Arg Pro Arg Met Lys Tyr Ser Asn Ser Lys Ile Ser Pro Ala Lys 1 5 10 15 Phe Ser Ser Thr Ala Gly Glu Ala Leu Val Pro Pro Cys Lys Ile Arg 20 25 30 Arg Ser Gln Gln Lys Thr Lys Glu Phe Cys His Val Tyr Cys Met Arg 35 40 45 Leu Arg Ser Gly Leu Thr Ile Arg Lys Glu Thr Ser Tyr Phe Arg Lys 50 55 60 Glu Pro Thr Lys Arg Tyr Ser Leu Lys Ser Gly Thr Lys His Glu Glu 65 70 75 80 Asn Phe Ser Ala Tyr Pro Arg Asp Ser Arg Lys Arg Ser Leu Leu Gly 85 90 95 Ser Ile Gln Ala Phe Ala Ala Ser Val Asp Thr Leu Ser Ile Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp 115 120 125 Gln Ser Val Ser Phe Val Leu Glu Asn Gly Cys Tyr Val Ile Asn Val 130 135 140 Asp Asp Ser Gly Lys Asp Gln Glu Gln Asp Gln Val Leu Leu Arg Tyr 145 150 155 160 Tyr Glu Ser Pro Cys Pro Ala Ser Gln Ser Gly Asp Gly Val Asp Gly 165 170 175 Lys Lys Leu Met Val Asn Met Ser Pro Ile Lys Asp Thr Asp Ile Trp 180 185 190 Leu His Ala Asn Asp Lys Asp Tyr Ser Val Glu Leu Gln Arg Gly Asp 195 200 205 Val Ser Pro Pro Glu Gln Ala Phe Phe Val Leu His Lys Lys Ser Ser 210 215 220 Asp Phe Val Ser Phe Glu Cys Lys Asn Leu Pro Gly Thr Tyr Ile Gly 225 230 235 240 Val Lys Asp Asn Gln Leu Ala Leu Val Glu Glu Lys Asp Glu Ser Cys 245 250 255 Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Ser Lys Ile 260 265

Claims (32)

  1. 인간 ST2L의 도메인 I(서열 번호 9)에 특이적으로 결합하는, 단리된 인간 또는 인간-적응화(human-adapted) 항체 길항제 또는 그의 단편.
  2. 제1항에 있어서, IL-33/ST2L 상호작용을 차단하는, 단리된 항체.
  3. 제2항에 있어서, 인간 ST2L에 대한 해리 상수(KD)가 약 5×10-12 M 내지 약 7×10-10 M이거나, 인간 ST2L에 대한 결합 속도 상수(Kon)가 약 2×106 M-1s-1 내지 약 1×108 M-1s-1이거나, 인간 ST2L에 대한 해리 속도 상수(Koff)가 약 1×10-6 s-1 내지 약 1×10-2 s-1인, 단리된 항체.
  4. 제3항에 있어서, 마카카 파시큘라리스(Macaca fascicularis)(시노(cyno)) ST2L(서열 번호 2)에 대한 해리 상수(KD)가 약 3×10-12 M 내지 약 2×10-9 M이거나, 시노 ST2L에 대한 결합 속도 상수(Kon)가 약 4×106 M-1s-1 내지 약 1×108 M-1s-1이거나, 시노 ST2L에 대한 해리 속도 상수(Koff)가 약 7×10-5 s-1 내지 약 1×10-1 s-1인, 단리된 항체.
  5. 제4항에 있어서,
    a) 서열 번호 160(X1X2X3MX4)의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1(HCDR1)
    (여기서, X1은 S, F, D, I, G, 또는 V이고;
    X2는 Y 또는 D이며;
    X3은 A, D, 또는 S이고;
    X4는 S, F, 또는 I임);
    b) 서열 번호 161(X5IX6GX7GGX8TX9YADSVKG)의 HCDR 2(HCDR2)
    (여기서, X5는 A, S, T, Y, 또는 D이고;
    X6은 S, R, E, K, G, 또는 A이며;
    X7은 S, E, 또는 N이고;
    X8은 S, R, E, G, T, D, 또는 A이며;
    X9는 Y, D, N, A, 또는 S임);
    c) 서열 번호 162(X10X11WSTEGSFFVLDY)의 HCDR 3(HCDR3)
    (여기서, X10은 D, A, R, N, Q, P, E, I, H, S, T, 또는 Y이고;
    X11 은 P, A, H, Y, E, Q, L, S, N, T, V, 또는 I임);
    d) 서열 번호 163(RASQSVDDX12LA)의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1(LCDR1)
    (여기서, X12는 A 또는 D임);
    e) 서열 번호 90(DASNRAT)의 LCDR 2(LCDR2) 및
    f) 서열 번호 164(QQX13X14X15X16X17X18T)의 LCDR 3(LCDR3)
    (여기서, X13은 F 또는 Y이고;
    X14는 Y, I, 또는 N이며;
    X15는 N, G, D, 또는 T이고;
    X16은 W 또는 A이며;
    X17은 P이거나 결실되고;
    X18은 L 또는 I임)을 포함하는, 단리된 항체.
  6. 제5항에 있어서,
    a) 서열 번호 97의 HCDR1;
    b) 서열 번호 114의 HCDR2;
    c) 서열 번호 84의 HCDR3;
    d) 서열 번호 130의 LCDR1;
    e) 서열 번호 90의 LCDR2;
    f) 서열 번호 134의 LCDR3; 또는
    g) 서열 번호 191의 VH 및 서열 번호 209의 VL을 포함하는, 단리된 항체.
  7. 제5항에 있어서,
    a) 각각 서열 번호 78, 81, 84, 87, 90, 및 92;
    b) 각각 서열 번호 78, 81, 84, 130, 90, 및 131;
    c) 각각 서열 번호 78, 81, 84, 130, 90, 및 132;
    d) 각각 서열 번호 78, 81, 84, 130, 90, 및 133;
    e) 각각 서열 번호 78, 81, 84, 130, 90, 및 134;
    f) 각각 서열 번호 95, 109, 84, 130, 90, 및 131;
    g) 각각 서열 번호 96, 110, 84, 130, 90, 및 131;
    h) 각각 서열 번호 97, 111, 84, 130, 90, 및 131;
    i) 각각 서열 번호 96, 110, 84, 130, 90, 및 134;
    j) 각각 서열 번호 97, 111, 84, 130, 90, 및 134;
    k) 각각 서열 번호 97, 112, 84, 130, 90, 및 134;
    l) 각각 서열 번호 98, 113, 84, 130, 90, 및 134;
    m) 각각 서열 번호 97, 114, 84, 130, 90, 및 134;
    n) 각각 서열 번호 97, 115, 84, 130, 90, 및 134;
    o) 각각 서열 번호 99, 116, 84, 130, 90, 및 133;
    p) 각각 서열 번호 100, 117, 84, 130, 90, 및 133;
    q) 각각 서열 번호 101, 118, 84, 130, 90, 및 133;
    r) 각각 서열 번호 102, 120, 84, 130, 90, 및 132;
    s) 각각 서열 번호 103, 121, 84, 130, 90, 및 132;
    t) 각각 서열 번호 103, 122, 84, 130, 90, 및 131;
    u) 각각 서열 번호 103, 123, 84, 130, 90, 및 131;
    v) 각각 서열 번호 104, 124, 84, 130, 90, 및 131;
    w) 각각 서열 번호 105, 125, 84, 130, 90, 및 131;
    x) 각각 서열 번호 106, 126, 84, 130, 90, 및 131;
    y) 각각 서열 번호 95, 127, 84, 130, 90, 및 131;
    z) 각각 서열 번호 107, 128, 84, 130, 90, 및 131;
    aa) 각각 서열 번호 108, 129, 84, 130, 90, 및 131;
    bb) 각각 서열 번호 97, 114, 165, 130, 90, 및 134;
    cc) 각각 서열 번호 97, 114, 166, 130, 90, 및 134;
    dd) 각각 서열 번호 97, 114, 167, 130, 90, 및 134;
    ee) 각각 서열 번호 97, 114, 168, 130, 90, 및 134;
    ff) 각각 서열 번호 97, 114, 169, 130, 90, 및 134;
    gg) 각각 서열 번호 97, 114, 170, 130, 90, 및 134;
    hh) 각각 서열 번호 97, 114, 171, 130, 90, 및 134;
    ii) 각각 서열 번호 97, 114, 172, 130, 90, 및 134;
    jj) 각각 서열 번호 97, 114, 173, 130, 90, 및 134;
    kk) 각각 서열 번호 97, 114, 174, 130, 90, 및 134;
    ll) 각각 서열 번호 97, 114, 175, 130, 90, 및 134;
    mm) 각각 서열 번호 97, 114, 176, 130, 90, 및 134;
    nn) 각각 서열 번호 97, 114, 177, 130, 90, 및 134;
    oo) 각각 서열 번호 97, 114, 178, 130, 90, 및 134;
    pp) 각각 서열 번호 97, 114, 179, 130, 90, 및 134;
    qq) 각각 서열 번호 97, 114, 180, 130, 90, 및 134;
    rr) 각각 서열 번호 97, 114, 181, 130, 90, 및 134;
    ss) 각각 서열 번호 97, 114, 182, 130, 90, 및 134;
    tt) 각각 서열 번호 97, 114, 183, 130, 90, 및 134;
    uu) 각각 서열 번호 97, 114, 184, 130, 90, 및 134; 또는
    vv) 각각 서열 번호 97, 114, 185, 130, 90, 및 134의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는, 단리된 항체.
  8. 제4항에 있어서,
    a) 각각 서열 번호 23, 27, 31, 35, 39, 및 43;
    b) 각각 서열 번호 24, 28, 32, 36, 40, 및 44;
    c) 각각 서열 번호 24, 28, 146, 36, 40, 및 147; 또는
    d) 각각 서열 번호 24, 28, 146, 36, 40, 및 44의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는, 단리된 항체.
  9. 제2항에 있어서, 인간 ST2L(서열 번호 1)에 대한 결합에 대해 서열 번호 47의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 51의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 단리된 항체와 경쟁하는, 단리된 항체.
  10. 제9항에 있어서, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 35 내지 48(RCPRQGKPSYTVDW; 서열 번호 210)에서 인간 ST2L에 결합하는, 단리된 항체.
  11. 제10항에 있어서, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 T93 및 F94에서 인간 ST2L에 추가로 결합하는, 단리된 항체.
  12. 제1항에 있어서, 인간 IGHV3-23(서열 번호 158), IGHV1 -24*01(서열 번호 148), 또는 IGHV1-f*01(서열 번호 149) 프레임워크 서열로부터 유래된 VH 프레임워크를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 인간 IGKV3-11(L6)(서열 번호 159), IGKV3-15*01(L2)(서열 번호 150), IGKV1-9*01(L8)(서열 번호 151), IGKV1-5*01(L12)(서열 번호 152), IGKV1-12*01(L5)(서열 번호 153), IGKV1-39*01(O12)(서열 번호 154), IGKV1-27*01(A20)(서열 번호 155), 또는 IGKV1-33*01(O18)(서열 번호 156) 프레임워크 서열로부터 유래된 VL 프레임워크를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 단리된 항체.
  13. 제1항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 유형인, 단리된 항체.
  14. 제13항에 있어서, Fc 영역 내에 치환을 갖는, 단리된 항체.
  15. 제14항에 있어서, 치환이 치환 M252Y/S254T/T256E, V234A/G237A/P238S/H28A/V309L/A330S/P331S, 또는 P238S/L234A/L235A을 포함하며, 여기서 잔기 번호화는 EU 번호화를 따르는, 단리된 항체.
  16. 제12항에 있어서, 서열 번호 191의 VH와 90% 이상 동일한 VH, 및 서열 번호 209의 VL과 94% 이상 동일한 VL을 포함하는, 단리된 항체.
  17. 제16항에 있어서, 서열 번호 143, 144, 145, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 또는 205의 VH, 및 서열 번호 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 206, 207, 208, 또는 209의 VL을 포함하는, 단리된 항체.
  18. 제17항에 있어서,
    a) 각각 서열 번호 186 및 서열 번호 206;
    b) 각각 서열 번호 187 및 서열 번호 206;
    c) 각각 서열 번호 197 및 서열 번호 206;
    d) 각각 서열 번호 198 및 서열 번호 206;
    e) 각각 서열 번호 199 및 서열 번호 206;
    f) 각각 서열 번호 200 및 서열 번호 206;
    g) 각각 서열 번호 201 및 서열 번호 206;
    h) 각각 서열 번호 202 및 서열 번호 206;
    i) 각각 서열 번호 203 및 서열 번호 206;
    j) 각각 서열 번호 204 및 서열 번호 206;
    k) 각각 서열 번호 205 및 서열 번호 206;
    l) 각각 서열 번호 195 및 서열 번호 207;
    m) 각각 서열 번호 196 및 서열 번호 207;
    n) 각각 서열 번호 188 및 서열 번호 208;
    o) 각각 서열 번호 189 및 서열 번호 208;
    p) 각각 서열 번호 190 및 서열 번호 208;
    q) 각각 서열 번호 187 및 서열 번호 209;
    r) 각각 서열 번호 191 및 서열 번호 209;
    s) 각각 서열 번호 192 및 서열 번호 209;
    t) 각각 서열 번호 193 및 서열 번호 209; 또는
    u) 각각 서열 번호 194 및 서열 번호 209의 VH 및 VL을 포함하는, 단리된 항체.
  19. 서열 번호 143, 144, 145, 186, 187, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 또는 205의 VH, 또는 서열 번호 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 206, 207, 208, 또는 209의 VL을 암호화하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  20. 제19항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  21. 제20항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  22. 제21항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 세포로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 제18항의 항체의 제조 방법.
  23. 제1항 또는 제6항의 단리된 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  24. ST2L-매개 병태를 치료하거나 예방하기에 충분한 시간 동안 치료적 유효량의 제1항 또는 제6항의 단리된 항체를 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, ST2L-매개 병태의 치료 방법 또는 예방 방법.
  25. 제24항에 있어서, ST2L-매개 병태가 천식, 기도 과민 반응, 유육종증, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD: chronic obstructive pulmonary disease), 특발성 폐 섬유증(IPF: idiopathic pulmonary fibrosis), 낭포성 섬유증, 염증성 장 질환(IBD: inflammatory bowel disease), 호산구성 식도염, 피부경화증, 아토피성 피부염, 알러지성 비염, 수포성 유사천포창, 만성 두드러기, 당뇨병성 신증, 류머티스 관절염, 간질성 방광염, 또는 이식편 대 숙주 질환(GVHD: Graft Versus Host Disease)이거나, 폐에서의 염증성 세포 동원, 배상 세포 과형성, 증가된 점액 분비, 또는 비만 세포 반응과 연계되는 방법.
  26. 비만 세포 반응을 저해하기에 충분한 시간 동안 치료적 유효량의 제1항의 단리된 항체를 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 비만 세포 반응을 저해하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 비만 세포 반응을 저해하는 단계가, 인간 제대혈-유래 비만 세포에 의해 방출되는 GM-CSF, IL-5, IL-8, IL-10, 또는 IL-13의 수준을 50 ㎍/ml 항체로 50% 이상 만큼 저해하는 단계를 포함하는 방법.
  28. ST2L의 도메인 I에 특이적으로 결합하는 항체를 IL-33 및 ST2L의 상호작용을 저해하기에 충분한 양으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 IL-33 및 ST2L의 상호작용을 저해하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 대상이 ST2L-매개 병태를 갖는 방법.
  30. 제29항에 있어서, ST2L-매개 병태가 천식, 기도 과민 반응, 유육종증, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 특발성 폐 섬유증(IPF), 낭포성 섬유증, 염증성 장 질환(IBD), 호산구성 식도염, 피부경화증, 아토피성 피부염, 알러지성 비염, 수포성 유사천포창, 만성 두드러기, 당뇨병성 신증, 류머티스 관절염, 간질성 방광염, 또는 이식편 대 숙주 질환(GVHD)이거나, 폐에서의 염증성 세포 동원, 배상 세포 과형성, 또는 증가된 점액 분비, 또는 비만 세포 반응과 연계되는 방법.
  31. 제29항에 있어서, 항체가
    a) 서열 번호 97의 HCDR1;
    b) 서열 번호 114의 HCDR2;
    c) 서열 번호 84의 HCDR3;
    d) 서열 번호 130의 LCDR1;
    e) 서열 번호 90의 LCDR2; 및
    f) 서열 번호 134의 LCDR3; 또는
    g) 서열 번호 191의 VH 및 서열 번호 209의 VL을 포함하는 방법.
  32. 제1항, 제6항, 또는 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 항체.
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