CN105722531B - 抗ccl17抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性结合CCL17的抗体、编码该抗体或片段的多核苷酸以及制备和使用前述物质的方法。

Description

抗CCL17抗体
本专利申请要求于2013年11月6日提交的美国临时专利申请 61/900,596的权益，该专利申请的全部内容以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及特异性结合CCL17的抗体、编码该抗体或片段的多核苷酸以及制备和使用前述物质的方法。
背景技术
内环境稳定性趋化因子CCL17(TARC，趋化因子(C-C基序)配体 17)是一种强效的淋巴细胞化学吸引剂。CCL17是CCR4(一种GPCR，据信对T细胞的功能以及免疫细胞向发炎部位的趋化和迁移很重要)的配体。CCR4主要在Th2淋巴细胞、自然杀伤细胞和iNKT细胞上表达。
CCL17与影响各种器官的人类疾病相关，诸如溃疡性结肠炎(UC)、特应性皮炎(AD)、特发性肺纤维化(IPF)和哮喘(Belperio等人，J Immunol,173: 4692-469,2004；Christophi等人，Inflamm Bowel Dis.doi:10.1002/ibd.2295； Inoue等人，Eur RespirJ,24:49-56,2004；Kakinuma等人，J Allergy Clin Immunol,107:535-541,2001；Saeki和Tamaki，J Dermatol Sci,43:75-84, 2006；Tamaki等人，J Dermatol,33:300-302,2006)。在小鼠中，CCL17可能通过募集CCR4+免疫细胞来诱导Th2响应而与多种炎性病症和感染相关，诸如存在于纤维化模型和哮喘模型中的慢性肺部炎症、结肠炎和血吸虫病。 CCL17的中和作用改善了烟曲霉(A.fumigatus)和卵清蛋白(OVA)哮喘模型中疾病的影响，并减轻了通过阻止T细胞内流而诱导的肝损伤的痤疮丙酸杆菌 (P.acnes)小鼠模型中的肝脏损伤(Carpenter和Hogamoam，Infect Immun, 73:7198-7207,2005；Heiseke等人，Gastroenterology,142:335-345； Hogamoam等人，Med Mycol,43Suppl 1,S197-202,2005；Ismailoglu等人， Therapeutic targeting of CCL17via the systemic administrationof a monoclonal antibody ameliorates experimental fungal asthma，Am J RespirCrit Care Med, 2011上发表的论文；Jakubzick等人，Am J Pathol,165:1211-122,2004；Kawasaki等人，J Immunol,166:2055-2062,2001；Yoneyama等人，J Clin Invest,102:1933-1941,1998)。
CCL22(MDC)是CCR4的第二配体。CCR4与每种趋化因子的相互作用会产生不同的结果(Allen等人，Annu Rev Immunol 25:787-820,2007；Imai 等人，J Biol Chem 273:1764-1768,1998)，这可能是由于CCR4的两种配体的结合亲和力不同所导致。相比于CCL17，CCL22结合CCR4的亲和力更高，并且更容易引起受体内化(Baatar等人，J Immunol 179:1996-2004, 2007；Imai等人，J Biol Chem 273:1764-1768,1998；Mariani等人，Eur J Immunol34:231-240,2004)，并且更容易促进细胞粘附(D’Ambrosio等人， J Immunol 169:2303-2312,2002)。CCL22的表达更加受限并且仅限于由免疫细胞产生，而CCL17可由包括非免疫细胞的多种不同细胞类型表达和分泌 (Alferink等人，J Exp Med 197:585-599,2003；Berin等人，Am J Respir Cell Mol Biol 24:382-389,2001；Godiska等人，J Exp Med185:1595-1604,1997； Imai等人，J Biol Chem 271:21514-21521,1996；Saeki和Tamaki，JBermatol Sci 43:75-84,2006)。在实验性败血病的小鼠盲肠结扎和穿孔(CLP)模型中，CCL22促进先天性免疫力，而CCL17似乎会干扰先天性免疫力并在一些情况下导致器官损伤(Matsukawa等人，Rev Immunogenet 2:339-358,2000)。在侵袭性肺曲霉菌病的小鼠模型中，CCL22对先天性抗真菌响应起到保护作用，而CCL17却起抑制作用(Carpenter和Hogaboam，Infect Immun 73:7198- 7207,2005)。由于CCL22比CCL17对Treg募集更有利从而对Treg内稳态造成的差动效应，这两种趋化因子在形成局部炎症中可起到对比作用(Heiseke等人，Gastroenterology 142:335-345,2011；Montane等人，J Clin Invest,121:3024-30,2011；Weber等人，J Clin Invest 121:2898-2910,2011)。
在接触性超敏反应的动物模型中，与具有一种功能性CCL17等位基因的杂合子小鼠相比，在心脏移植存活性增强的这些小鼠中，CCL17是引发炎性响应并驱动接触性超敏反应(CHS)使用FITC或DNFB以及CCL17敲除基因攻击的主要因素(Alferink等人，J Exp Med197:585-599,2003)。
CCR4拮抗剂可为非选择性的，并抑制CCL17和CCL22的功能。因此，需要用于潜在治疗各种CCL17介导的疾病包括哮喘的抗CCL17抗体。
发明内容
本发明的一个实施方案是一种特异性结合人CCL17的包含重链可变区 (VH)和轻链可变区(VL)的分离抗体，其中该抗体与包含SEQ ID NO:45的 VH和SEQ ID NO:52的VL的抗体竞争结合人CCL17。
本发明的另一个实施方案是一种特异性结合具有SEQ ID NO:1序列的人CCL17的分离抗体，其中该抗体至少在CCL17第21-23位、第44-45位和第60-68位氨基酸残基内结合人CCL17。
本发明的另一个实施方案是一种特异性结合人CCL17的分离抗体，其中在将抗体与人CCL17在4℃下共温育48小时之后利用溶液平衡亲和力在包含0.05％Tween-20的基于tris的盐水缓冲液中测量亲和力常数(KD)时，该抗体以约1×10-10M或更小的KD结合人CCL17。
本发明的另一个实施方案是一种分离抗体，其特异性结合包含特定 HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的人CCL17。
本发明的另一个实施方案是一种分离抗体，其特异性结合包含特定 VH和VL序列的人CCL17。
本发明的另一个实施方案是一种特异性结合人CCL17的分离抗体，其中该抗体包含VH和VL，该VH的氨基酸序列与SEQ ID NO:46的VH具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，该VL的氨基酸序列与SEQ ID NO:62的VL具有至少90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本发明的另一个实施方案是一种药物组合物，其包含本发明的抗体和药学上可接受的载体。
本发明的另一个实施方案是一种编码本发明的VH或VL的分离的多核苷酸。
本发明的另一个实施方案是一种包含本发明的多核苷酸的载体。
本发明的另一个实施方案是一种包含本发明的载体的宿主细胞。
本发明的另一个实施方案是一种制备本发明的抗体的方法，该方法包括在制备该抗体的条件下培养本发明的宿主细胞。
本发明的另一个实施方案是一种治疗CCL17介导的疾病的方法，该方法包括将本发明的抗体施用于有需要的受治疗者足以治疗CCL17介导的疾病的时间。
本发明的另一个实施方案是一种治疗哮喘或气道过度反应的方法，该方法包括将本发明的抗体施用于受治疗者足以治疗哮喘的时间。
附图说明
图1A示出在CCRF-CEM细胞中，抗CCL17抗体B302对由1nM人 CCL17所引起的趋化性的抑制。B302为C17B302。
图1B示出在CCRF-CEM细胞中，抗CCL17抗体B311对由1nM人CCL17所引起的趋化性的抑制。B311为C17B311。
图1C示出在CCRF-CEM细胞中，IgG2同种型对由1nM人CCL17所引起的趋化性的控制效应。
图1D示出在CCRF-CEM细胞中，IgG4同种型对由1nM人CCL17所引起的趋化性的控制效应。
图2A示出在HSC-F细胞中，抗CCL17抗体B302对由1nM食蟹猕猴 CCL17所引起的趋化性的抑制。B302为C17B302。
图2B示出在HSC-F细胞中，抗CCL17抗体B311对由1nM食蟹猕猴 CCL17所引起的趋化性的抑制。B311为C17B311。
图2C示出在HSC-F细胞中，IgG2同种型对由1nM食蟹猕猴CCL17 所引起的趋化性的控制效应。
图2D示出在HSC-F细胞中，IgG4同种型对由1nM食蟹猕猴CCL17 所引起的趋化性的控制效应。
图3示出以100nM或更小的KD结合人CCL17的抗CCL17抗体的VH 序列。
图4示出图3所示的以100nM或更小的KD结合人CCL17的抗 CCL17抗体的共有VH和HCDR序列。
图5示出以100nM或更小的KD结合人CCL17的抗CCL17抗体的VL 序列。
图6A示出图5所示的以100nM或更小的KD结合人CCL17的抗 CCL17抗体的共有VL序列。
图6B示出图5所示的以100nM或更小的KD结合人CCL17的抗 CCL17抗体的共有LCDR序列。
图7示出抗体C17B236的表位和互补位残基。VH和VL互补位残基被框出，并且CCL17表位残基被圈出。根据SEQ ID NO:45(VH)、SEQ ID NO:52(VL)、SEQ ID NO:1(CCL17)对残基进行编号。
具体实施方式
本说明书中所引用的所有出版物(包括但不限于专利和专利申请)均以引用方式并入本文，如同在本文中完整给出。
应当了解，本文所用的术语只是为了描述具体实施方案的目的，并非旨在进行限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。
虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等效的任意方法和材料都可以用于检验本发明的实践中，然而本文中描述示例性材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。
如本文所用，“特异性结合”或“特异性地结合”或“结合”是指抗体以比针对其他抗原更高的亲和力结合到预先确定的抗原。通常，抗体以约1×10-7M或更小，例如约1×10-8M或更小、约1×10-9M或更小、约1×10-10M或更小、约1×10-11M或更小、约1×10-12M或更小、约1×10-13M或更小、或者约1×10-14M或更小的解离常数(KD)结合到预先确定的抗原，通常 KD比其结合到非特异性抗原或表位(例如，BSA、酪蛋白)的KD小至少十倍。可以使用标准程序来测量解离常数。然而，特异性结合到预先确定的抗原的抗体可能对其他相关的抗原具有交叉反应性，例如对于来自其他物种(同源)的相同预先确定的抗原，诸如人或猴，例如食蟹猕猴 (Macaca fascicularis)(cynomolgus,cyno)或黑猩猩(Pan troglodytes)(chimpanzee,chimp)具有交叉反应性。
“特异性结合人CCL17的单克隆抗体”是指特异性结合具有SEQ ID NO:1中所示序列的人成熟CCL17的抗体。
如本文所用，“中和”或“中和抗体”或“抗体拮抗剂”是指通过任意机制部分抑制或完全抑制CCL17的生物活性的抗体或抗体片段。中和抗体可使用下述CCL17生物活性测定法来鉴定。CCL17中和抗体可使所测量的CCL17生物活性抑制20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、 80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
如本文所用，“人CCL17”或“huCCL17”可互换地指具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的人CCL17蛋白。包括信号序列的全长CCL17 的序列可从GenBank获得，其登录号为NP_002978。
如本文所用，“Cyno CCL17”或“cCCL17”可互换地指具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的食蟹猕猴(cyno)CCL17蛋白。
如本文所用，“抗体”广义上是指且包括免疫球蛋白分子，其包括单克隆抗体，例如鼠科动物、人类、人源化和嵌合抗体，抗体片段，由至少两种完整抗体或抗体片段形成的双特异性或多特异性抗体，二聚、四聚或多聚抗体，单链抗体，以及包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰的构型。
免疫球蛋白可根据重链恒定结构域氨基酸序列被指定为五种主要种类，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步被亚分类为同种型 IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。任何脊椎动物物种的抗体轻链可基于其恒定结构域的氨基酸序列被分配到两种完全不同的类型中的一种，即κ(κ)和λ(λ)。
术语“抗体片段”是指免疫球蛋白分子的一部分，其保留重链和/或轻链抗原结合位点，诸如重链互补决定区(HCDR)1、2和3，轻链互补决定区(LCDR)1、2和3，重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)。抗体片段包括 Fab片段，即由VL或VH组成的单价片段；F(ab)2片段，即包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的双价片段；由VH和CHI结构域组成的 Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；dAb片段 (Ward等人，Nature 341:544-546,1989)，其由VH结构域组成。VH结构域和VL结构域可被改造并经由合成接头连接在一起以形成各种类型的单链抗体设计，其中在VH结构域和VL结构域由单独的单链抗体构建体表达的情况下，VH/VL结构域在分子内或分子间配对，以形成单价抗原结合位点，诸如单链Fv(scFv)或双价抗体；例如在国际专利公布 WO1998/44001、国际专利公布WO1988/01649、国际专利公布 WO1994/13804、国际专利公布WO1992/01047中有所描述。使用熟知的技术获得这些抗体片段，并以与表征完整抗体相同的方式表征这些片段。
术语“分离抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合人CCL17的分离抗体基本上不含特异性结合人 CCL17之外的抗原的抗体)。然而，特异性结合人CCL17的分离抗体可能对其他抗原具有交叉反应性，诸如对于人CCL17的直系同源抗原，诸如食蟹猕猴(cynomolgus)CCL17。此外，分离抗体可基本上不含其他细胞物质和 /或化学物质。
抗体可变区由被3个“抗原结合位点”中断的“框架”区组成。使用多个术语来定义抗原结合位点：(i)三个在VH(HCDR1、HCDR2、 HCDR3)中并且三个在VL(LCDR1、LCDR2、LCDR3)中的互补决定区 (CDR)基于序列变异性(Wu和Kabat，J Exp Med 132:211-50,1970；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。(ii)三个在VH (H1、H2、H3)中并且三个在VL(L1、L2、L3)中的“超变区”、“HVR”或“HV”是指抗体可变结构域的在结构上超变的区域，如Chothia 和Lesk所定义(Chothia和Lesk，Mol Biol 196:901-17,1987)。其他术语包括“IMGT-CDR”(Lefranc等人，Dev Comparat Immunol 27:55-77,2003) 和“特异性决定残基用途”(SDRU)(Almagro Mol Recognit,17:132-43, 2004)。国际ImMunoGeneTics(IMGT)数据库(http://www_imgt_org)提供了抗原结合位点的标准化编号和定义。CDR、HV与IMGT划分之间的对应性在 Lefranc等人，Dev Comparat Immunol 27:55-77,2003中有所描述。
如本文所用，“Chothia残基”是抗体VL和VH残基，其根据Al- Lazikani来编号(Al-Lazikani等人，J Mol Biol 273:927-48,1997)。
“框架”或“框架序列”是可变区的除了被定义为抗原结合位点的那些序列之外的其余序列。因为抗原结合位点可以由如上所述的各种术语定义，所以框架的精确氨基酸序列取决于如何定义抗原结合位点。
“人源化抗体”是指其中抗原结合位点来源于非人物种并且可变区框架来源于人免疫球蛋白序列的抗体。人源化抗体在框架区中可包括置换，使得该框架可能不是表达的人免疫球蛋白或种系基因序列的精确拷贝。
“人抗体”是指具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中框架和抗原结合位点区均来源于人起源的序列。如果所述抗体包含恒定区，则该恒定区也来源于人起源的序列。
如果人抗体的可变区来源于使用人种系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因的系统，则人抗体包含“来源于”人起源序列的重链可变区或轻链可变区。此类系统包括人免疫球蛋白基因文库(例如在噬菌体上展示的文库)和转基因非人动物(诸如携带如本文所述的人免疫球蛋白基因座的小鼠)。在与人种系或重排免疫球蛋白序列进行比较时，“人抗体”可包含由于例如天然存在的体细胞突变或特意引入置换所引起的氨基酸差异。通常，“人抗体”的氨基酸序列与由人种系或重排免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些情况下，“人抗体”可包含由人框架序列分析得到的共有框架序列(例如Knappik等人，J Mol Biol 296:57-86,2000中所述)；或结合到展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库中的合成HCDR3(例如Shi等人，J Mol Biol 397:385-96,2010和国际专利公布WO2009/08546中所述)。
分离的人源化抗体可以是合成的。当人抗体来源于人免疫球蛋白序列时，可使用诸如噬菌体展示系统结合合成的CDR和/或合成的框架来生成该人抗体，或者可对其进行体外诱变以改善抗体特性，从而得到并非在体内天然存在于整套人抗体种系内的抗体。
人抗体可包括框架中或抗原结合位点中的置换，使得其可能不是表达的人免疫球蛋白或种系基因序列的精确拷贝。然而，“人抗体”的定义中不包括抗原结合位点来源于非人物种的抗体。
如本文所用，术语“重组抗体”包括通过重组方法制备、表达、构建或分离的所有抗体，诸如从动物(例如，小鼠)分离的抗体，即人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体，或从其制备的杂交瘤分离的抗体(在下文中进一步描述)；从经转化以表达抗体的宿主细胞分离的抗体；从重组的、组合的抗体文库分离的抗体；以及通过任何其他方法制备、表达、构建或分离的抗体，所述方法涉及将人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列拼接。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指单分子组合物的抗体分子制剂。
如本文所用，术语“基本上相同”意指被比较的两个抗体可变区氨基酸序列是相同的或具有“非显著性差异”。非显著性差异是指抗体可变区序列中有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸被置换，这些置换不会对抗体的特性造成不利影响。与本文所公开的可变区序列基本上相同的氨基酸序列在本发明的范围内。在一些实施方案中，序列同一性可为约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或更高。同一性百分数可以例如通过使用Vector NTI v.9.0.0(Invitrogen,Carlsbad,CA)的AlignX模块的默认设置的配对比对而确定。本发明的蛋白质序列可以用作查询序列以针对公共或专利数据库进行检索，以例如鉴定相关序列。用来进行此类检索的示例性程序是使用默认设置的XBLAST或BLASTP程序(http_//www_ncbi_nlm/nih_gov)或 GenomeQuestTM(GenomeQuest,Westborough,MA)软件包。
如本文所用，术语“表位”意指抗原的与抗体特异性结合的部分。表位通常由部分(moiety)(诸如氨基酸或多糖侧链)的化学活性(诸如，极性、非极性或疏水性)表面定群(grouping)构成，并且可以具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。表位可由形成构象空间单元的连续和/或不连续氨基酸构成。对于不连续表位，来自抗原的线性序列的不同部分的氨基酸因蛋白质分子的折叠而在三维空间上靠近。
如本文所用，“双特异性”是指结合两个不同抗原或抗原内的两个不同表位的抗体或分子。
如本文所用，“单特异性”是指结合一个抗原或一个表位的抗体。
如本文所用，术语“与...组合”是指所述的试剂可以在混合物中一起、作为单一试剂同时地或作为单一试剂以任何顺序依次地施用于动物。
术语“载体”是指能够在生物系统内复制或可以在此类系统之间移动的非天然多核苷酸。载体多核苷酸通常包含编码所关注蛋白的cDNA和其他元件，诸如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记，其用于促进这些多核苷酸在生物系统中的复制或保持。此类生物系统的示例可包括细胞、病毒、动物、植物和用能够复制载体的生物组分再造的生物系统。包含载体的多核苷酸可为DNA或RNA分子或这些分子的杂合分子。
术语“表达载体”是指可在生物系统或再造生物系统中用于指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列所编码的多肽的翻译的载体。
术语“多核苷酸”是指包含由糖-磷酸主链或其他等同的共价化学方式所共价连接的核苷酸链的分子。双链DNA和单链DNA以及双链RNA和单链RNA是多核苷酸的典型示例。
“互补DNA”或“cDNA”是指熟知的合成多核苷酸，其序列元件排列与存在于具有邻接的外显子的自然成熟mRNA物种中的序列元件排列相同，其中存在于基因组DNA中的居间内含子被移除。编码起始甲硫氨酸的密码子可存在或可不存在于cDNA中。例如，可通过逆转录或合成基因组件合成cDNA。
如本文所用，术语“合成”或“非天然”是指非天然存在的多核苷酸或多肽分子。
术语“多肽”或“蛋白质”是指包含由肽键连接以形成多肽的至少两个氨基酸残基的分子。少于50个氨基酸的小多肽可以称作“肽”。
本文使用如表1中所示的常规单字母和三字母氨基酸代码。
表1
氨基酸 三字母代码 单字母代码
丙氨酸 Ala A
精氨酸 Arg R
天冬酰胺 Asn N
天冬氨酸 Asp D
半胱氨酸 Cys C
谷氨酸 Glu E
谷氨酰胺 Gln Q
甘氨酸 Gly G
组氨酸 His H
异亮氨酸 Ile I
亮氨酸 Leu L
赖氨酸 Lys K
甲硫氨酸 Met M
苯丙氨酸 Phe F
脯氨酸 Pro P
丝氨酸 Ser S
苏氨酸 Thr T
色氨酸 Trp W
酪氨酸 Tyr Y
缬氨酸 Val V
物质的组成
本发明提供了特异性结合人CCL17的单克隆抗体。本发明的抗体抑制细胞中的CCL17的生物活性，并可任选地与cyno CCL17交叉反应。本发明提供了编码抗体和其片段、载体和宿主细胞的合成多核苷酸，以及制备和使用本发明的抗体的方法。
本发明的一个实施方案是一种特异性结合人CCL17的分离抗体。
本文所述发明的另一个实施方案是一种特异性结合人CCL17的包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的分离抗体，其中该抗体与包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:52的VL的抗体竞争结合人CCL17。
使用熟知方法，可体外测定特异性结合人CCL17的抗体与包含特定VH 和VL氨基酸序列的本发明的抗体之间的竞争。例如，MSD Sulfo-TagTM NHS 酯标记抗体在未标记抗体的存在下对人CCL17的结合可通过ELISA进行评估，或者可使用Biacore分析法或流式细胞术来证实与本发明的抗体的竞争作用。测试抗体抑制包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:52的VL的抗体结合人CCL17的能力表明，测试抗体可与这些抗体竞争结合人CCL17。
本文所述发明的另一个实施方案是一种特异性结合具有SEQ ID NO:1 序列的人CCL17的分离抗体，其中该抗体至少在CCL17第21-23位、第 44-45位和第60-68位氨基酸残基内结合人CCL17。“至少在人CCL17第 21-23位、第44-45位和第60-68位氨基酸残基内”是指抗CCL17抗体结合位于SEQ ID NO:1的第21-23位残基的氨基酸延伸区内的至少一个残基，并且结合位于SEQ ID NO:1的第44-45位残基的氨基酸延伸区内的至少一个残基，并且结合位于SEQ ID NO:1的第60-68位残基的氨基酸延伸区内的至少一个残基。该抗体可结合第21-23位、第44-45位和第60-68位残基内的一个以上的残基，以及SEQ ID NO:1的第21-23位、第44-45位和第 60-68位残基之外的附加残基。
在本文所述的一些实施方案中，该抗体至少在SEQ ID NO:1的残基 R22和K23处结合人CCL17。
在本文所述的一些实施方案中，该抗体至少在SEQ ID NO:1的残基 L21、R22、K23、V44、Q45、N60、Y64、S67和L68处结合人CCL17。
在SEQ ID NO:1的第21-23位、第44-45位和第60-68位CCL17氨基酸残基内结合人CCL17的示例性抗体为具有SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:52的VL的C17B236。根据晶体结构分析，基于这些残基与抗体 VH残基之间的接触数目，C17B236结合的主要表位残基为SEQID NO:1 的CCL17的R22和K23。
在第21-23位、第44-45位和第60-68位CCL17氨基酸残基内结合人 CCL17的其他示例性抗体为C17B236的亲和力成熟变体，所有这些抗体均来源于相同亲本抗体的亲和力成熟体。示例性抗体的VH和VL序列示于图 3和图5中。抗体的亲和力成熟通常涉及CDR或游标区(带下划线的CDR 的框架区)的氨基酸置换。通过淘选组合文库选出成熟变体，其可包含最多108个突变体。如果所有20个氨基酸均被允许用于每个位置，那么文库大小的上限会将可变位置数目限制为6-7个。大多数互补位残基被保留在每个组合文库中，这确保结合表位也被保留。亲本和成熟抗体的若干晶体学研究已表明，亲和力成熟期间表位总是被保留(例如，Fransson等人，J. Mol.Biol.2010,398:214-231；Gustchina等人，PLoS Pathog.2010,6:e1001182；La Porte等人，MAbs 2014；6:1059-1068)。
在第21-23位、第44-45位和第60-68位CCL17氨基酸残基内结合人 CCL17的抗CCL17抗体以高亲和力结合人CCL17，通常以小于约1×10-10M的KD。
例如，可通过下列方法制备在第21-23位、第44-45位和第60-68位 CCL17氨基酸残基内结合人CCL17的抗体：用在第21-23位、第44-45位和第60至68位残基位置处具有人CCL17序列的CCL17嵌合蛋白质来免疫小鼠，或者用野生型人CCL17淘选噬菌体展示文库，并采用本文所述方法用CCL17变体(在人CCL17第21-23位、第44-45位和第60至68位残基内的每个残基位置或若干残基位置处发生置换)交叉筛选所得命中。
在本文所述发明的一些实施方案中，特异性结合人CCL17的抗体阻断 CCL17/CCR4相互作用。
可通过标准流式细胞术测试抗体阻断CCL17/CCR4相互作用的能力。例如，将表达CCR4的细胞与荧光标记的人CCL17和测试抗体一起温育，然后使用标准方法评估荧光标记的人CCL17到CCR4表达细胞上的结合。与不存在抗体的情况下CCL17的结合相比，“阻断CCL17/CCR4相互作用”或“抑制CCL17/CCR4相互作用”的抗体可将CCL17到CCR4表达细胞的结合抑制30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、 90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
本文所述发明的另一个实施方案是一种特异性结合人CCL17的分离抗体，其中在将抗体和人CCL17在4℃下共温育48小时之后利用溶液平衡亲和力在包含0.05％Tween-20的基于tris的盐水缓冲液中测量亲和力常数 (KD)时，该抗体以约1×10-7M或更小、约1×10-8M或更小、约1×10-9M或更小、约1×10-10M或更小、约1×10-11M或更小、约1×10-12M或更小、约 1×10-13M或更小、或约1×10-14M或更小的KD结合人CCL17。
在本文所述的一些实施方案中，在将抗体和人CCL17在4℃下共温育 48小时之后利用溶液平衡亲和力在包含0.05％Tween-20的基于tris的盐水缓冲液中测量亲和力常数(KD)时，该抗体以约1×10-10M或更小的KD结合人CCL17。
在本文所述的一些实施方案中，该抗体以约5×10-12M或更小的KD结合人CCL17。
在本文所述的另一个实施方案中，在将抗体和食蟹猕猴(cyno)CCL17 在4℃下共温育48小时之后利用溶液平衡亲和力在包含0.05％Tween-20 的基于tris的盐水缓冲液中测量亲和力常数(KD)时，本发明的特异性结合人CCL17的抗体以约1×10-6M或更小、约1×10-7M或更小、约1×10-8M或更小、约1×10-9M或更小、约1×10-10M或更小、约1×10-11M或更小、或约 1×10-12M或更小的KD结合cyno CCL17。
在本文所述的一些实施方案中，在将抗体和食蟹猕猴(cyno)CCL17在 4℃下共温育48小时之后利用溶液平衡亲和力在包含0.05％Tween-20的基于tris的盐水缓冲液中测量该KD时，本发明的抗体以约1×10-8M或更小的 KD结合cyno CCL17。
可使用任何合适的方法，通过实验测量抗体对具有SEQ ID NO:1的序列的人CCL17或具有SEQ ID NO:2的序列的cyno CCL17的亲和力。此类方法可采用Proteon、Biacore或KinExA仪器(诸如ProteOn XPR36或Biacore 3000)通过溶液平衡亲和力(SEA)、ELISA或本领域技术人员已知的竞争性结合测定法来进行。示例性方法为在实施例3中描述的那些。如果在不同的条件(例如，同渗容摩、pH、缓冲液、洗涤剂浓度)下测量，特定抗体 /CCL17相互作用的测量亲和力可变化。因此，亲和力和其他结合参数(例如，KD、Kon、Koff)的测量优选地用标准化条件和标准化缓冲液(诸如本文所述的缓冲液)进行。本领域技术人员将会知道，使用例如溶液平衡亲和力、Biacore 3000或ProteOn进行亲和力测量的内部误差(测量为标准偏差， SD)通常可在典型检出限内的测量值的5-33％内。因此术语“约”反映测定中的典型标准偏差。例如，1×10-9M的KD的典型SD最多为±0.33×10-9M。
本文所述发明的另一个实施方案是一种特异性结合人CCL17的分离抗体，其中该抗体抑制CCL17生物活性。
如本文所用，“CCL17生物活性”是指由于CCL17结合至其受体 CCR4而出现的任何活性。示例性CCL17生物活性导致细胞内钙动员或细胞的趋化性，例如CCRF-CEM细胞(来自患有急性白血病的患者的T淋巴母细胞系)。可以使用标准方法和本文所述方法来测试本发明的抗体抑制CCL17生物活性的能力。例如，可通过使用荧光染料(诸如Fluo-8 NW、Fluo-4AM或Fluo-3AM)测量抗体对CCL17诱导的钙动员的影响来测量本发明的抗体抑制CCL17依赖性细胞内钙动员的能力。可通过测量两室培养系统中CCRF-CEM细胞穿过半渗透性5μM过滤器的迁移，以及通过测量迁移穿过过滤器的细胞的活性来测量本发明的抗体抑制CCL17诱导的趋化性的能力。本发明的抗体可将CCL17生物活性抑制约20％、 30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
本文所述发明的另一个实施方案是一种特异性结合CCL17的抗体，其中该抗体抑制CCRF-CEM细胞中的使用Fluo-8NW以约1×10-7M或更小、约1×10-8M或更小、或约1×10-9M或更小的IC50值测量的10ng/mL人 CCL17诱导的钙动员。
本文所述发明的另一个实施方案是一种特异性结合CCL17的抗体，其中该抗体包含重链互补决定区(HCDR)1(HCDR1)、2(HCDR2)和3 (HCDR3)，以及轻链互补决定区(LCDR)1(LCDR1)、2(LCDR2)和3 (LCDR3)，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3 分别包含SEQ ID NO:4、5、71、72、73和74的氨基酸序列。
包含SEQ ID NO:4、5、71、72、73和74的HCDR和LCDR序列的抗体以1×10-10或更小的KD结合人CCL17。
HCDR1：SYWIG(SEQ ID NO:4)
HCDR2：IIDPSDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO:5)
HCDR3共有序列：
VGPADVWDX1FDY(SEQ ID NO:71)，
其中
X1为S、A或T
LCDR1共有序列：
KSSQSVLX1SX2X3NX4NX5LA(SEQ ID NO:72)，其中
X1为L、Y、S或N；
X2为F、P、H或I；
X3为D、Y、W、T或V；
X4为I、F、S、T、Y、N、K或V；并且
X5为K、A、Q、T或D。
LCDR2共有序列：
X1ASTRE(SEQ ID NO:73)，
其中
X1为N、H、G、E、T或D。
LCDR3共有序列：
QQX1X2X3X4PX5T(SEQ ID NO:74)；
其中
X1为F、Y、T或H；
X2为Y、L、N或W；
X3为S、A、L、I、T、Q或H；
X4为V、T、I、Y、L或D；并且
X5为S、F、A或L。
在本文所述的一些实施方案中，本发明的特异性结合CCL17的抗体中的HCDR1包含SEQ ID NO:4的序列，HCDR2包含SEQ ID NO:5的序列，并且HCDR3包含SEQ ID NO:6、42、43或44的序列。
在本文所述的一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且HCDR3包含SEQ ID NO:6、42或43的氨基酸序列。
在本文所述的一些实施方案中，本发明的特异性结合CCL17的抗体中的LCDR1包含SEQ ID NO:7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17 或18的序列，LCDR2包含SEQ ID NO:19、20、21、22、23、24、25、 26、39、40或41的序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、37或38的序列。
在本文所述的一些实施方案中，LCDR1包含SEQ ID NO:8、9、10、 13、14、15、17或18的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:20、21、 22、24、25和26的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:28、29、 30、33、34、35、37或38的氨基酸序列。
在本文所述的一些实施方案中，特异性结合CCL17的抗体包含SEQ ID NO:75的VH和SEQ ID NO:76的VL。
VH共有序列(SEQ ID NO:75)
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWM GIIDPSDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARV GPADVWDX1FDYWGQGTLVTVSS
其中
X1为S、A或T。
VL共有序列(SEQ ID NO:76)：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLX1SX2X3NX4NX5LAWYQQKPG QPPKLLIYX6ASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQX7 X8X9X10PX11TFGQGTKVEIK；其中
X1为L、Y、S或N；
X2为F、P、H或I；
X3为D、Y、W、T或V；
X4为I、F、S、T、Y、N、K或V；
X5为K、A、Q、T或D；
X6为N、H、G、E、T或D；
X7为F、Y、T或H；
X8为Y、L、N或W；
X9为S、A、L、I、T、Q或H；
X10为V、T、I、Y、L或D；并且
X11为S、F、A或L。
在本文所述的一些实施方案中，特异性结合CCL17的抗体包含SEQ ID NO:45、46、47或48的VH。
在本文所述的一些实施方案中，特异性结合CCL17的抗体包含SEQ ID NO:49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、 63、64、65或66的VL。
在本文所述的一些实施方案中，特异性结合CCL17的抗体所含的VH 包含SEQ IDNO:45、46或47的氨基酸序列。
在本文所述的一些实施方案中，特异性结合CCL17的抗体所含的VL 包含SEQ IDNO:50、51、52、55、56、57、59、60或62的氨基酸序列。
本文所述发明的另一个实施方案是一种特异性结合CCL17的分离抗体，其中该抗体包含下列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2 和LCDR3序列：
分别为SEQ ID NO:4、5、6、7、19和27；
分别为SEQ ID NO:4、5、6、8、20和28；
分别为SEQ ID NO:4、5、6、9、21和29；
分别为SEQ ID NO:4、5、6、10、22和30；
分别为SEQ ID NO:4、5、6、11、23和31；
分别为SEQ ID NO:4、5、6、12、24和32；
分别为SEQ ID NO:4、5、6、13、21和33；
分别为SEQ ID NO:4、5、6、14、20和34；
分别为SEQ ID NO:4、5、6、15、25和35；
分别为SEQ ID NO:4、5、6、16、21和36；
分别为SEQ ID NO:4、5、6、17、25和37；
分别为SEQ ID NO:4、5、6、18、26和38；
分别为SEQ ID NO:4、5、6、8、39和28；
分别为SEQ ID NO:4、5、6、8、24和28；
分别为SEQ ID NO:4、5、6、8、22和28；
分别为SEQ ID NO:4、5、6、8、40和28；
分别为SEQ ID NO:4、5、6、8、26和28；
分别为SEQ ID NO:4、5、6、8、41和28；
分别为SEQ ID NO:4、5、42、8、24和28；
分别为SEQ ID NO:4、5、43、8、24和28；或
分别为SEQ ID NO:4、5、44、8、24和28。
本文所述发明的另一个实施方案是一种特异性结合CCL17的分离抗体，其中该抗体包含
SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:49、50、51、52、53、54、55、 56、57、58、58、59、60、61、62、63、64、65或66的VL；
分别包含SEQ ID NO:46和62的VH和VL；
分别包含SEQ ID NO:47和62的VH和VL；或者
分别包含SEQ ID NO:48和62的VH和VL。
本文所述发明的另一个实施方案是一种特异性结合CCL17的分离抗体，其中该抗体包含
SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:50、51、52、55、56、57、59 或60的VL；
分别包含SEQ ID NO:46和62的VH和VL；或者
分别包含SEQ ID NO:47和62的VH和VL。
本文所述发明的另一个实施方案是一种特异性结合CCL17的分离抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:50的VL。
本文所述发明的另一个实施方案是一种特异性结合CCL17的分离抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:51的VL。
本文所述发明的另一个实施方案是一种特异性结合CCL17的分离抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:52的VL。
本文所述发明的另一个实施方案是一种特异性结合CCL17的分离抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:55的VL。
本文所述发明的另一个实施方案是一种特异性结合CCL17的分离抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:56的VL。
本文所述发明的另一个实施方案是一种特异性结合CCL17的分离抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:57的VL。
本文所述发明的另一个实施方案是一种特异性结合CCL17的分离抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:59的VL。
本文所述发明的另一个实施方案是一种特异性结合CCL17的分离抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:60的VL。
本文所述发明的另一个实施方案是一种特异性结合CCL17的分离抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO:46的VH和SEQ ID NO:62的VL。
本文所述发明的另一个实施方案是一种特异性结合CCL17的分离抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO:47的VH和SEQ ID NO:62的VL。
本文所述发明的另一个实施方案是一种特异性结合CCL17的分离抗体，其中该抗体包含VH和VL，该VH的氨基酸序列与SEQ ID NO:46的 VH具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或 99％的同一性，该VL的氨基酸序列与SEQ ID NO:62的VL具有至少 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
此类示例性抗体示于表9中。
重链CDR、轻链CDR、VH或VL氨基酸序列与表3、4、6、7和9所示的那些并无显著不同的抗体涵盖在本发明的范围之内。通常，这涉及用电荷、疏水性或立体化学特性相似的氨基酸在抗原结合位点或框架中置换一个或多个保守氨基酸，而不不利地改变抗体的特性。还可作出保守置换以改善抗体特性，例如稳定性或亲和力。可对VH或VL序列作出1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸的置换。例如，“保守氨基酸置换”可以涉及将天然氨基酸残基置换为非天然残基，使得对该位置处的氨基酸残基的极性或电荷影响小或没有影响。此外，多肽中的任何天然残基还可以用丙氨酸来置换，如此前对于丙氨酸扫描诱变所述(MacLennan等人，(1998)Act Physiol.Scand.Suppl.643:55-67；Sasaki 等人，(1998)Adv.Biopsy’s.35:1-24)。所需的氨基酸置换可以由本领域技术人员在需要此类置换时确定。例如，氨基酸置换可用于鉴定分子序列的重要残基，或用于提高或降低本文所述分子的亲和力。以下八组为彼此间发生保守氨基酸置换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸 (D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸 (K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸 (F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及8)半胱氨酸 (C)、甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton,Proteins(1984))。
氨基酸置换可以例如通过PCR诱变来进行(美国专利4,683,195)。可使用熟知方法生成变体文库，例如使用随机(NNK)或非随机密码子(例如 DVK密码子，其编码11个氨基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、 Asn、Arg、Ser、Tyr、Trp)，并在文库中筛选具有所需特性的变体。
尽管实施例中所示的实施方案包括成对的可变区，一个来自重链并且一个来自轻链，但本领域技术人员将认识到另选实施方案可包括单一重链可变区或单一轻链可变区。单一可变区可用于筛选能够形成能够例如结合人CCL17(具有SEQ ID NO:1的序列)的二结构域特异性抗原结合片段的可变结构域。筛选可通过噬菌体展示筛选方法来完成，这些方法使用例如国际专利公布WO1992/01047所公开的分级双组合方法。在此方法中，包含H链克隆或L链克隆的单个菌落被用来感染编码另一链(L或H)的克隆的完全文库，并且所得的双链特异性抗原结合结构域根据所描述的噬菌体展示技术来选择。因此，单独的VH和VL多肽链可用于通过国际专利公布WO1992/01047所公开的方法鉴定特异性结合具有SEQ ID NO:1序列的人CCL17的附加抗体。
可使用多种技术来制备本文所述发明的抗体，从而生成单克隆抗体。例如，可使用Kohler和Milstein,Nature 256:495,1975所述的杂交瘤方法。在杂交瘤方法中，用人CCL17和/或cyno CCL17蛋白或这些蛋白的片段 (诸如人CCL17的细胞外蛋白)来免疫小鼠或其他宿主动物(诸如仓鼠、大鼠或猴)，之后使用标准方法将来自免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Gooding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice，第59-103页(Academic Press,1986))。筛选出由单个永生化杂交瘤细胞产生的菌落，用以制备具有所需特性(诸如结合特异性、交叉反应性或缺乏结合特异性、缺乏交叉反应性，以及抗原的亲和力)的抗体。
可使用不同宿主动物制备抗人CCL17的抗体。例如，可使用Balb/c 小鼠来产生小鼠抗人CCL17抗体。可使用各种技术来人源化由Balb/c小鼠和其他非人动物制备的抗体，从而产生更类似人的序列。包括选择人受体框架的示例性人源化技术是本领域技术人员已知的，包括CDR接枝(美国专利5,225,539)、SDR接枝(美国专利6,818,749)、表面重塑(Palin,Mol Immunol 28:489-499,1991)、特异性决定残基表面重塑(美国专利公布 2010/0261620)、人改型(或人框架改型，美国专利公布 US2009/0118127)、超人源化(美国专利7,709,226)和定向选择(Osborn 等人，Methods 36:61-68,2005；美国专利5,565,332)。
采用诸如国际专利公布WO1990/007861和国际专利公布 WO1992/22653所述的那些公开的方法，可通过引入修改的框架支持残基来保持结合亲和力(回复突变)来进一步优化人源化抗体以改善其对所需抗原的选择性或亲和力。
基因组中携带人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠可用于生成抗目标蛋白质的人抗体，这在例如国际专利公布WO1990/04036、美国专利 6,150,584、国际专利公布WO1999/45962、国际专利公布 WO2002/066630、国际专利公布WO2002/43478；Loner等人，Nature368:856-9,1994；Green等人，Nature Genet7:13-21,1994；Green& Jakobovits Exp Med188:483-95,1998；Lonberg和Huszar Int Rev Immunol 13:65-93,1995；Bruggemann等人，Eur J Immunol 21:1323-1326,1991； Fishwild等人，Nat Biotechnol 14:845-851,1996；Mendez等人，Nat Genet 15:146-156,1997；Green,J Immunol Methods 231:11-23,1999；Yang等人， Cancer Res 59:1236-1243,1999；Brüggemann和Taussig Curr OpinBiotechnol 8:455-458,1997；国际专利公布WO2002/043478中有所描述。可破坏此类鼠中的内源性免疫球蛋白基因座或使该基因座缺失，并且可使用转染色体或微小基因，通过同源或非同源重组将至少一种完整或部分的人免疫球蛋白基因座插入小鼠基因组中。可邀请诸如Regeneron (http://_www_regeneron_com)、Harbour Antibodies (http://_www_harbourantibodies_com)、Open Monoclonal Technology,Inc. (OMT)(http://_www_omtinc_net)、KyMab(http://_www_kymab_com)、 Trianni(http://_www.trianni_com)和Ablexis(http://_www_ablexis_com)等公司使用上述技术以提供抗所选抗原的人抗体。
人抗体可选自噬菌体展示文库，其中噬菌体被改造以表达人免疫球蛋白或其部分，诸如Fab、单链抗体(scFv)、或者未配对或配对抗体可变区 (Knappik等人，J Mol Biol296:57-86,2000；Krebs等人，J Immunol Meth 254:67-84,2001；Vaughan等人，NatureBiotechnology 14:309-314,1996； Sheets等人，PITAS(USA)95:6157-6162,1998；Hoogenboom和Winter，J Mol Biol 227:381,1991；Marks等人，J Mol Biol 222:581,1991)。可例如用噬菌体pIX外壳蛋白从将抗体重链和轻链可变区表达为融合蛋白的噬菌体展示文库中分离出本发明的抗体，如Shi等人，J Mol Biol 397:385-96,2010和国际专利公布WO2009/085462所述。筛选抗体文库中结合人CCL17细胞外结构域的那些，并进一步表征所得的阳性克隆，从克隆裂解物分离Fabs，并表达为全长IgG。此类用于分离人抗体的噬菌体展示法在本领域是成熟的。参见例如：授予Ladner等人的美国专利5,223,409、5,403,484和5,571,698；授予 Dower等人的美国专利5,427,908和5,580,717；授予McCafferty等人的美国专利5,969,108和6,172,197；以及授予Griffiths等人的美国专利5,885,793、 6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915和6,593,081。
免疫源性抗原的制备以及单克隆抗体的产生可用任何合适的技术诸如重组蛋白产生来进行。免疫原性抗原可以纯化蛋白质或蛋白质混合物(包括全细胞或细胞提取物或组织提取物)的形式施用于动物，或抗原可在动物体内由编码所述抗原或其部分的核酸从头形成。
本文所述的本发明抗体可为人抗体或人源化抗体。
本文所述的本发明抗体可为合成抗体或重组抗体。
本文所述的本发明抗体可为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM型。本文所述的本发明抗体可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4同种型。
本发明的抗体的免疫效应子特性可通过本领域技术人员已知的技术经由Fc修饰得到增强或沉默。例如，Fc效应子功能诸如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等，可通过修饰Fc 中负责这些活性的残基进行调节。药代动力学特性还可通过使Fc结构域中延长抗体半衰期的残基突变得到增强。示例性Fc修饰为IgG4 S228P/L234A/L235A、IgG2M252Y/S254T/T256E(Dall’Acqua等人，J Biol Chem 281:23514–24,2006)；或IgG2V234A/G237A/P238S、 V234A/G237A/H268Q、H268A/V309L/A330S/P331或IgG2 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S(国际专利公布 WO2011/066501)或美国专利6,737,056所述的那些修饰(根据EU编号进行编号)。
在本文所述的一些实施方案中，特异性结合人CCL17的抗体包含Fc 区中的置换。
在本文所述的一些实施方案中，所述置换包括IgG2的V234A、 G237A、P238S、H268A、V309L、A330S或P331S置换，或IgG4的 S228P、L234A或L235A置换，其中根据EU指数进行残基编号。
另外，本文所述的本发明抗体可通过诸如糖基化、异构化、去糖基化或非天然存在的共价修饰(诸如添加聚乙二醇部分(聚乙二醇化)和脂质化)等过程进行翻译后修饰。此类修饰可在体内或体外进行。例如，本发明的抗体可以与聚乙二醇缀合(聚乙二醇化)以改善其药代动力学性质。缀合可通过本领域技术人员已知的技术来执行。治疗抗体与PEG的缀合已显示出增强药效动力学，同时不干扰功能(Knight等人，Plateles 15:409- 418,2004；Leong等人，Cytokine 16:106-119,2001；Yang等人，Protein Eng 16:761-770,2003)。
可经修饰以改善稳定性、选择性、交叉反应性、亲和力、免疫原性或其他所需生物学或生物物理学特性的本文所述发明的抗体或其片段在本发明的范围之内。抗体的稳定性受多种因素的影响，包括(1)影响各个结构域固有稳定性的各个结构域的核心堆积；(2)影响HC和LC配对的蛋白质/蛋白质界面相互作用；(3)极性和带电残基的掩埋；(4)极性和带电残基的H键网络；和(5)表面电荷和极性残基分布连同其他的分子内和分子间力(Worn 和Pluckthun，J Mol Biol 305:989-1010,2001)。潜在的结构不稳定残基可根据该抗体的晶体结构或在某些情况下通过分子建模来鉴定，并且所述残基对于抗体稳定性的影响可通过生成并评估在所鉴定残基中携带突变的变体来测试。一种增加抗体稳定性的方法是升高由差示扫描量热法(DSC)测量的热转变中间点(Tm)。一般来讲，蛋白质的Tm与其稳定性相关联并且与其对溶液中的解折叠和变性以及依赖于该蛋白质解折叠倾向的降解过程的易感性成反向相关(Remmele等人，Pharm Res 15:200-208,1997)。许多研究已经发现在所测量的制剂物理稳定性(如通过DSC测量的热稳定性和通过其他方法测量的物理稳定性)的排序之间存在相关性(Bedu-Addo等人，Pharm Res 21:1353-1361,2004；Gupta和Kaisheva，AAPSPharSci,5E8, 2003；Maa和Hsu，Int J Pharm 140:155-168,1996；Remmele等人，Pharm Res15:200-208,1997；Zhang等人，J Pharm Sci 93:3076-3089,2004)。制剂研究提示，Fab Tm对相应mAb的长期物理稳定性有影响。框架或CDR 内的氨基酸差别对于Fab结构域的热稳定性可具有显著影响(Yasui等人， FEBS Lett 353:143-146,1994)。
本文所述的本发明的CCL17抗体可被改造成双特异性抗体，该双特异性抗体也涵盖在本发明的范围之内。可使用已公布的方法将本发明的抗体的VL区和/或VH区改造成结构诸如
Figure BDA0000983469180000241
设计(国际专利公布 WO1999/57150；美国专利公布US2011/0206672)的单链双特异性抗体，或改造成结构诸如美国专利5,869,620、国际专利公布WO1995/15388、国际专利公布WO1997/14719或国际专利公布WO2011/036460中所公开的结构的双特异性scFV。
本文所述的本发明抗体的VL区和/或VH区可被改造成双特异性全长抗体，其中每个抗体臂结合不同的抗原或表位。通常通过调节这两条抗体重链之间的CH3相互作用来制备此类双特异性抗体，以使用诸如美国专利 7,695,936、国际专利公布WO2004/111233、美国专利公布US2010/0015133、美国专利公布US2007/0287170、国际专利公布WO2008/119353、美国专利公布US2009/0182127、美国专利公布US2010/0286374、美国专利公布US2011/0123532、国际专利公布WO2011/131746、国际专利公布 WO2011/143545或美国专利公布US2012/0149876中所述方法形成双特异性抗体。可在其中结合本发明的抗体的VL区和/或VH区的另外的双特异性结构是例如双可变结构域免疫球蛋白(国际专利公布WO2009/134776)，或包括多种二聚化结构域以连接具有不同特异性的两个抗体臂的结构，诸如亮氨酸拉链或胶原二聚化结构域(国际专利公布WO2012/022811、美国专利 5,932,448、美国专利6,833,441)。
本发明的另一个实施方案是一种分离的多核苷酸，其编码本发明的任一抗体重链可变区或抗体轻链可变区。本文公开了某些示例性的多核苷酸，但是，鉴于在给定表达系统中的遗传密码简并性或密码子优先性而编码本发明抗体的其它多核苷酸也在本发明的范围内。编码本发明抗体的 VH、VL或它们的片段的多核苷酸序列能够有效连接至一个或多个调控元件，诸如启动子和增强子，该调控元件允许核苷酸序列在预期宿主细胞中的表达。多核苷酸可为cDNA。
本发明的另一个实施方案是一种包含本发明的多核苷酸的载体。此类载体可以是质粒载体、病毒载体、用于杆状病毒表达的载体、基于转座子的载体或任何其他适于通过任何手段将本发明的多核苷酸引入给定生物体或遗传背景的载体。例如，将可任选地与恒定区连接的编码本发明抗体的轻链可变区和重链可变区的多核苷酸插入表达载体中。轻链和重链可被克隆在相同或不同的表达载体中。将编码免疫球蛋白链的DNA片段有效连接到确保免疫球蛋白多肽表达的一个或多个表达载体中的对照序列。对此类对照序列包括信号序列、启动子(例如，天然相关联的或异源的启动子)、增强子元件和转录终止子序列进行选择，以使其与选择用于表达抗体的宿主细胞相容。载体被结合到适当的宿主后，将宿主保持在适于蛋白质的高水平表达的条件下，所述蛋白质由结合的多核苷酸编码。
合适的表达载体通常可以在宿主生物体中作为游离基因或宿主染色体 DNA的一部分进行复制。通常，表达载体包含选择标记，诸如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性，以便对那些转化了所需DNA序列的细胞进行检测。
合适的启动子和增强子元件是本领域已知的。对于在细菌细胞中的表达，示例性启动子包括lacl、lacZ、T3、T7、gpt、λP和trc。对于真核细胞中的表达，示例性启动子包括轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件；细胞巨化病毒极早期启动子；单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；早期和晚期SV40启动子；存在于逆转录酶病毒长末端重复序列中的启动子；小鼠金属硫蛋白-I启动子，以及各种本领域已知的组织特异性启动子。对于酵母细胞中的表达，示例性启动子是组成型启动子，诸如ADH1 启动子、PGK1启动子、ENO启动子、PYK1启动子等等；或调控型启动子，诸如GAL1启动子、GAL10启动子、ADH2启动子、PH05启动子、 CUP1启动子、GAL7启动子、MET25启动子、MET3启动子、CYC1启动子、HIS3启动子、ADH1启动子、PGK启动子、GAPDH启动子、ADC1 启动子、TRP1启动子、URA3启动子、LEU2启动子、ENO启动子、TP1 启动子和AOX1(例如，用于毕赤酵母(Pichia))。对合适的载体和启动子的选择在本领域普通技术人员的能力范围内。
大量合适的载体和启动子都是本领域的技术人员已知的；许多可商购获得用于生成受治疗者重组构建体。以下载体以举例的方式提供。细菌： pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、 pNH18a、pNH46a(Stratagene,La Jolla,Calif.,USA)；pTrc99A、pKK223-3、 pKK233-3、pDR540和pRIT5(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。真核：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、 pMSG和pSVL(Pharmacia)。
本发明的另一个实施方案是一种包含本发明载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”是指引入载体的细胞。应当理解，术语宿主细胞不仅旨在指特定的受治疗者细胞，还指此类细胞的子代。因为由于突变或者由于环境影响，在后代中可能发生某些修饰，因此此类子代可能与母体细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。此类宿主细胞可以是真核细胞、原核细胞、植物细胞或古菌细胞。
大肠杆菌、杆菌诸如枯草芽孢杆菌和其他肠杆菌诸如沙门氏菌、沙雷氏菌和各种假单胞菌属是原核宿主细胞的示例。其他微生物诸如酵母也可用于表达。酵母属(Saccharomyces)(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae))和毕赤酵母是合适的酵母宿主细胞的示例。示例性真核细胞可以是哺乳动物、昆虫、禽类或其他动物来源。哺乳动物真核细胞包括永生细胞系，例如杂交瘤或骨髓瘤细胞系，诸如SP2/0(美国典型培养物保藏中心(ATCC),Manassas,VA,CRL-1581)、NS0(欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC), Salisbury,Wiltshire,UK,ECACC 85110503)、FO(ATCC CRL-1646)和 Ag653(ATCC CRL-1580)鼠细胞系。一种示例性人骨髓瘤细胞系是U266 (ATTC CRL-TIB-196)。其他可用的细胞系包括衍生自中国仓鼠卵巢(CHO) 细胞的那些细胞系，诸如CHO-K1SV(Lonza Biologics,Walkersville, MD)、CHO-K1(ATCC CRL-61)或DG44。
本发明的另一个实施方案是一种制备本发明抗体的方法，该方法包括培养本发明的宿主细胞，以及回收由所述宿主细胞产生的抗体。制备抗体并将其纯化的方法是本领域所熟知的。一旦被合成(以化学方式或重组方式) 后，全部抗体、其二聚体、单个轻链和重链、或者其他抗体片段诸如VH或 VI，可以根据本领域的标准程序进行纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和色谱柱、柱层析法、高效液相色谱(HPLC)纯化、凝胶电泳等等(参见generallyScopes,Protein Purification(Springer-Verlag,N.Y.,(1982))。受治疗者抗体可以基本上是纯净的，例如，至少约80％至85％纯净、至少约85％至90％纯净、至少约90％至95％纯净、或者至少约98％至99％纯净，或者更加纯净，例如，不含污染物，诸如细胞碎片、除受治疗者抗体之外的大分子等。
使用标准分子生物方法将编码本发明的特定VH或VI序列的多核苷酸结合到载体中。使用熟知的方法完成宿主细胞转化、培养、抗体表达和纯化。
治疗方法
特异性结合人CCL17的抗体可以适用于治疗或预防CCL17介导的病症谱。
如本文所用的术语“CCL17介导的病症”包括这样的全部疾病和医学病症，其中CCL17在所述疾病和医学病症中直接或间接地发挥作用，这包括所述疾病或病症的引起、形成、进展、持续或病理学。
如本文所用的术语“CCL17介导的炎性病症”指至少部分地因CCL17 生物学活性产生的炎性病症。示例性CCL17介导的炎性病症是哮喘和过敏。
本发明的方法可用于治疗属于任何分类的动物患者。此类动物的例子包括哺乳动物，诸如人、啮齿动物、犬类、猫类和农畜。例如，本发明的抗体可用于CCL17介导病症的预防和治疗，例如哮喘和呼吸道过敏疾病诸如过敏性哮喘、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化 (IPF)、变态反应性肺疾病等；过敏性疾病诸如全身过敏反应或超敏反应、药物过敏、过敏性支气管肺曲霉病(ABPA)、蚊叮虫咬过敏症和食物过敏；炎性肠疾病诸如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、回肠炎和肠炎、阴道炎；银屑病和炎症性皮肤病诸如皮炎、湿疹、特异反应性皮炎、过敏性接触性皮炎、荨麻疹和瘙痒；血管炎；脊柱关节病；硬皮病；自体免疫疾病诸如关节炎 (包括风湿性关节炎和银屑病)、多发性硬化症、全身性红斑狼疮、I型糖尿病、肾小球性肾炎等等；移植排斥(包括同种异体移植物排斥和移植物抗宿主病)，以及其他疾病，在这些疾病中抑制了不期望的炎症反应，诸如动脉粥样硬化、肌炎、T细胞介导的神经退行性疾病、多发性硬化症、脑炎、脑膜炎、肝炎、肾炎、败血症、肉状瘤病、过敏性结膜炎、耳炎、巨大淋巴结增生症、窦炎、LPS诱导的内毒素休克、贝切特综合征和痛风。
本文所述的本发明的抗体也可用于制备用于此类治疗的药物，其中制备所述药物用于以本文限定的剂量施用。
本发明的方法和用途可以旨在用于动物或患者，所述动物或患者患有与CCL17表达或生物活性相关联的任何疾病或病症或者存在患有此类疾病或病症的风险，或者CCL17在所述动物和患者中发挥生物学作用。
不希望受任何理论的束缚，本发明的抗体可以通过直接抑制Th2细胞募集，因此同时抑制多个Th2细胞因子，从而在各种炎性疾病中发挥其有效作用。本发明的抗体可以通过仅仅选择性地阻断CCL17来提供与抗 CCR4抗体相比改善的安全性。抗体不会与表达CCR4的血小板发生相互作用。此外，抗体不会阻断CCL22对于CCR4的有利先天免疫作用(Matsukawa等人，I.Immunol 164:5382-8,2000)。
如本文所用，“炎性病症”是指对于有害刺激诸如病原体、受损细胞、物理伤害或刺激物的急性或慢性局部或全身性响应，所述响应部分由细胞因子、趋化因子或炎性细胞(例如，嗜中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞、树突细胞、中性粒细胞)的活性介导，并且所述炎性病症在多数情况下的特征在于疼痛、发红、肿胀和组织功能损伤。
炎性肺部病症是CCL17介导的炎性病症的一个例子。示例性炎性肺部病症包括感染诱发的肺部病症(包括与病毒、细菌、真菌、寄生虫或朊病毒感染有关的那些)、过敏原诱发的肺部病症、污染物诱发的肺部病症 (诸如石棉沉着病、硅肺病或铍中毒)、胃内容物吸入诱发的肺部病症、免疫失调、具有遗传倾向性的炎性病症(诸如囊性纤维化)和物理创伤诱发的肺部病症(诸如呼吸机损伤)。这些炎性病症还包括哮喘、肺气肿、支气管炎、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、结节病、组织细胞增多病、淋巴管性肌瘤病、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、慢性肺病、支气管肺发育异常、社区获得性肺炎、医院性肺炎、呼吸机关联性肺炎、败血病、病毒性肺炎、流行性感冒感染、变异流行性感冒病毒感染、轮状病毒感染、人类偏肺病毒感染、呼吸道合胞病毒感染和曲霉(Aspergillus)或其他真菌感染。示例性感染相关炎性疾病可以包括病毒性或细菌性肺炎，包括严重肺炎、囊性纤维化、支气管炎、气道恶化和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。这类感染相关病症可能涉及复性感染，诸如原发病毒感染和继发细菌感染。
哮喘是肺部的炎性疾病，其特征在于气道高反应性(“AHR”)、支气管收缩、哮鸣音、嗜酸性或嗜中性炎症、粘液过分泌、上皮下纤维化以及升高的IgE水平。患有哮喘的患者经历了“急性加重”(症状的恶化)，最常见是因为呼吸道的微生物感染(例如，鼻病毒、流行性感冒病毒、流感嗜血杆菌等)。哮喘发作可由环境因素所触发(例如，蛔虫、昆虫、动物(例如，猫、犬、兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠和鸟类)、真菌、大气污染物(例如，烟草烟雾)、刺激性气体、烟雾、蒸气、气溶胶、化学品、花粉、活动或冷空气。除哮喘之外，影响肺部的多种慢性炎性疾病通过中性粒细胞浸润到气道进行表征，例如慢性阻塞性肺病 (COPD)、细菌性肺炎和囊胞性纤维症(Linden等人，Eur Respir J 15:973-7, 2000；Rahman等人，Clin Immunol115:268-76,2005)，以及疾病诸如 COPD、过敏性鼻炎和囊胞性纤维症通过气道高反应性进行表征(Fahy和 O’Byrne，Am J Respir Crit Care Med 163:822-3,2001)。
在过敏性哮喘中，高含量过敏特异性IgE的存在反应了异常的Th2细胞对常见的吸入型环境过敏原的免疫应答。过敏原通过树突状细胞(DC)呈现在T细胞上，该树突状细胞对进入的外来抗原进行连续取样。通过DC 进行适当激活后，存在于患病气道的过敏原特异性淋巴细胞产生Th2细胞因子白介素(IL)-4、IL-5和IL-13，从而进一步控制白细胞血管渗出、杯状细胞前列腺增生和支气管高反应性(BHR)。由DC产生的CCL17通过触发 CCR4诱导Th2细胞而不是Th1细胞的选择性迁移。在小鼠哮喘模型中，使用CCL17抗体进行治疗减少了支气管肺泡灌洗(BAL)液体中CD4+T细胞和嗜酸细胞的数量，在过敏原刺激之后产生了Th2细胞因子和气道高反应性，这表明CCL17中和反应是抑制人体中过敏性炎症的可行性策略。
常用的哮喘和气道炎症动物模型包括卵清蛋白攻击模型、乙酰甲胆碱致敏模型以及用烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(Hessel等人，Eur J Pharmacol 293:401-12,1995)。抑制由培养的人支气管上皮细胞、支气管成纤维细胞或气道平滑肌细胞产生细胞因子和趋化因子，这也可以用作模体外型。对这些模型的任一者施用本发明的抗体可以用来评估这些抗体用于改善症状和改变哮喘、气道炎症、COPD等病程的功效。
特应性皮炎是CCL17介导的炎性病症的一个例子。
本发明的一个方面是一种治疗CCL17介导的疾病的方法，该方法包括将本发明的抗体施用于有需要的受治疗者持续足以治疗CCL17介导的疾病的时间。
在本文所述的一些实施方案中，CCL17介导的疾病为炎性疾病。
在本文所述的一些实施方案中，炎性疾病是哮喘、溃疡性结肠炎 (UC)、特应性皮炎(AD)或特发性肺纤维化(IPF)。
本发明的一个实施方案是一种治疗哮喘的方法，该方法包括将本文所述的本发明抗体施用于受治疗者持续足以治疗哮喘的时间。
本发明的一个实施方案是一种治疗溃疡性结肠炎的方法，该方法包括将本文所述的本发明抗体施用于受治疗者足以治疗溃疡性结肠炎的时间。
本发明的一个实施方案是一种治疗特应性皮炎的方法，该方法包括将本文所述的本发明抗体施用于受治疗者足以治疗特应性皮炎的时间。
本发明的一个实施方案是一种治疗特发性肺纤维化的方法，该方法包括将本文所述的本发明抗体施用于受治疗者足以治疗特发性肺纤维化的时间。
施用/药物组合物
本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的特异性结合 CCL17的抗体以及药学上可接受的载体。对于治疗性用途，本发明的特异性结合CCL17的抗体可制备为药物组合物，其包含有效量的结构域、分子或抗体作为药学上可接受的载体中的活性成分。术语“载体”是指据以施用该活性化合物的稀释剂、辅助剂、赋形剂或媒介物。此类媒介物可以是液体，诸如水和油，包括那些来源于石油、动物、植物的油或合成的油，诸如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油等。例如，可使用0.4％生理盐溶液和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物。它们可通过熟知的常规灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。组合物可根据需要包含可药用辅助物质，以接近生理条件，诸如pH调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。此类药物制剂中的本文所述的本发明分子或抗体的浓度可广泛改变，即小于约0.5％，通常为或至少约1％至多达15重量％或20 重量％，并且将根据所选择的具体施用方式，主要基于所需剂量、流体体积、粘度等进行选择。包含其它人蛋白例如人血清白蛋白的合适的媒介物和制剂描述在例如Remington:The Science and Practice ofPharmacy，第21 版，Troy，D.B.编辑，Lipincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA2006，第5部分，Pharmaceutical Manufacturing，第691-1092页中有所描述，特别参见第958-989页。
用于本文所述的本发明的特异性结合CCL17的抗体的治疗用途的施用方式可以是将药剂递送至宿主的任何合适途径，诸如胃肠外施用，例如，真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下、肺部；经粘膜(口腔、鼻内、阴道内、直肠)；使用在片剂、胶囊、溶液、粉末、凝胶、颗粒中的制剂；以及包含在注射器、植入装置、渗透泵、盒、微型泵中的制剂；或技术人员理解、本领域中熟知的其他方式。可通过例如以下方式实现位点特异性施用：关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心脏内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、血管内、膀胱内、病灶内、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮递送。
因此，本文所述的本发明的用于肌内注射的药物组合物可经制备以包含 1mL无菌缓冲水，以及介于约1ng至约100mg之间的本发明的特异性结合 CCL17的抗体，例如约50ng至约30mg/kg，或更优选地约5mg至约 25mg/kg。
施用给具有CCL17介导病症的患者的剂量足以缓解症状或治疗 CCL17介导的病症(“治疗学上的有效量”)，有时为0.1至10mg/kg体重，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg，但是也可能更高，例如15、20、30、40、50、60、70、80、90或100mg/kg。也可以施用固定的单位剂量，例如，50、100、200、500或1000mg，或者可以根据患者的表面区域确定剂量，例如，400、300、250、200或10mg/m2。通常施用的剂量在1和8之间(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)，但是可以施用 10、12、20或更多的剂量。可以在一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月、五周、六周、七周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更长时间之后重复施用本文所述的本发明的特异性结合CCL17的抗体。也可以重复治疗疗程，按照慢性施用一样。重复施用可为相同剂量或不同剂量。
有效用于治疗炎性疾病诸如哮喘的本文所述的本发明的CCL17/抗体的剂量可通过对本领域熟知的以及如本文所述的相关动物模型施用CCL17/ 抗体来确定。
体外测定可任选地用来帮助鉴定最佳剂量范围。对具体的有效剂量的选择可由本领域的技术人员根据对多种因素的考量(例如，经由临床试验)来确定。此类因素包括待治疗或预防的疾病、所涉及的症状、患者体重、患者免疫状态以及技术人员已知的其他因素。在制剂中待使用的精确剂量也将取决于给药途径以及疾病的严重程度，并且应该根据医生的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可通过来自体外或动物模型测试体系的剂量响应曲线来推导。可以使用本文所述模型中的任何一个来测试本发明抗体的功效和有效剂量。
例如，用于静脉内输注的药物组合物包含本文所述的本发明的特异性结合CCL17的抗体，所述药物组合物可制成为包含约200mL无菌林格氏溶液，以及约8mg至约2400mg、约400mg至约1600mg，或者约400mg至 800mg的本发明特异性结合CCL17的抗体，用于施用给80kg的患者。用于制备可肠胃外施用的组合物的方法是众所周知的，并且更详细地描述在，例如，“Remington's Pharmaceutical Science”，第15版，Mack Publishing Company，Easton，PA。
本文所述的本发明的特异性结合CCL17的抗体可以冻干以便于储存，并且在使用之前可以在合适的载体中复原。此项技术已经显示为对常规的蛋白制剂有效，并且可采用本领域内已知的冻干和复原技术。
本文所述的本发明的特异性结合CCL17的抗体可以与第二治疗剂结合同时地、顺序地或者单独地施用。
本发明现结合以下具体的、非限制性实施例进行描述。
实施例1CCL17中和抗体的生成
结合人CCL17的Fab选自描述于Shi等人，J.Mol.Biol.397:385-396, 2010、国际专利公布WO2009/085462、美国专利公布US2010/0021477、美国专利公布US2012/0108795中的从头pIX噬菌体展示文库。简而言之，通过多样化人支架生成文库，其中种系VH基因IGHV1-69*01、 IGHV3-23*01和IGHV5-51*01与人IGHJ-4微小基因经由H3环重组，并且人种系VLkappa基因O12(IGKV1-39*01)、L6(IGKV3-11*01)、A27 (IGKV3-20*01)和B3(IGKV4-1*01)与IGKJ-1微小基因重组以组装完整VH 结构域和VL结构域。选择在围绕H1、H2、L1、L2和L3环的重链和轻链可变区中的位置用于多样化，所述位置与被鉴别为经常与蛋白和肽抗原接触的位置相对应。在选定位置处的序列多样性限于在各个IGHV或IGLV 基因的IGHV或IGLV种系基因家族中的每个位置处出现的残基。通过使用长度为7-14个氨基酸的短至中等大小的合成环来产生在H3环处的多样性。设计在H3处的氨基酸分布，以模仿在人抗体中观察到的氨基酸变异。文库设计详述于Shi等人，J Mol Biol 397:385-96,2010。根据它们的人 VH和VL种系基因起源，命名用于生成文库的支架。将3个重链文库与4 个种系轻链或种系轻链文库相组合，以产生24个独特的VH:VL组合用于筛选。所有24个VH:VL文库组合均用于对人CCL17的噬菌体淘选实验。
使用SEQ ID NO:1的人CCL17淘选文库。简而言之，使用标准方法生物素酰化人CCL17，将生物素酰化的人CCL17(Bt-huCCL17)在链霉抗生物素蛋白包被的磁珠进行捕获(Dynal,M280)，Fab-pIX噬菌体文库被添加到小珠中。所用的Bt-huCCL17浓度为100nM(第1轮)、2nM(第3 轮)和10nM(第4轮)。通过ELISA将Fab结合到人CCL17蛋白质以完成筛选。对于淘选，使用PBST-M(具有0.05％吐温-20和3％脱脂奶粉的 BPS)清洗和阻断bt-huCCL17包被的磁珠。来自文库的受阻噬菌体被添加到小珠中，在室温下旋转(第1轮)。清洗小珠，然后在对数期的大肠杆菌培养物中温育，让(MC1061F’)细胞和感染的大肠杆菌在LB琼脂平板上在37℃下过夜生长。次日早上将培养物从平板上刮入2mL 2xYT(20％甘油)/平板，将50μL细菌悬液添加到50mL 2xYT(羧苄青霉素)中，并且在37℃下最多振荡2小时。将辅助噬菌体添加到对数中期培养物中，并且在37℃下温育培养物30分钟。将卡那霉素和IPTG添加到每个培养物中，使得最终浓度分别为35μg/mL和1mM，在30℃下振荡过夜生长。使用 PEG/NaCl沉淀从细菌培养基中扩增的噬菌体，并且在1mL PBS中重新悬浮。取200μL用于下一轮淘选。
淘选三轮之后，噬粒DNA与感染的MC1061F’细胞分离，使用限制性酶酶切以除去编码PIX的序列，线性化的质粒DNA被切除，并且经琼脂糖凝胶纯化。然后，该DNA通过T4DNA连接酶进行自连。连接的DNA 被电穿孔到MC1061F’细胞中，并且涂布到LB(羧苄青霉素/葡萄糖)琼脂糖平板上。从该电穿孔法得到的菌落被挑选进行ELISA筛选和Fab表达的评估。Fab在重链的C端包含框内His标签。使用标准方法通过C端His 标签部分地纯化从初始筛选得到的24个Fab，并且还进行表征。
在ELISA检测中，对Fab结合人CCL17(SEQ ID NO:1)、cyno CCL17 (SEQ ID NO:2)和cyno CCL22(SEQ ID NO:3)进行表征。简而言之， Maxisorp 96孔板涂覆有1μg/mL的羊抗人Kappa(Southern Biotech)。将半纯化的Fab添加到每个平板中。将生物素酰化huCCL17、cCCL17或 cCCL22添加到每个Fab捕获的孔中。使用链霉抗生物素蛋白：HRP检测结合到捕获的Fab的蛋白质。选择五种亲和力成熟的Fab(F21、F24、 F34、F43和F44)，所述Fab结合到CCL17而不是cyno CCL22。
实施例2抗CCL17抗体的亲和力成熟
基于初始表征性质选择五种亲和力成熟的Fab。使用Shi等人(Shi等人，J MolBiol 397:385-396,2010)所述的在线成熟技术通过多样化轻链并保持重链不变来对Fab进行亲和力成熟处理。Fab中的重链是VH3-23或 VH5-51。产生的F24亲和力成熟文库改善了CCL17结合剂。
简而言之，使用B3轻链文库对F24进行亲和力成熟处理。表2中显示了B3文库多样化方案。位置以Kabat编号表示。
表2.
Figure BDA0000983469180000341
Figure BDA0000983469180000351
Fab的VH区被克隆到LC文库噬粒中，从而使每个Fab得到LC的完整重新多样化。使用NcoI和ApaI通过DNA小量抽提物的限制性酶切分离 VH区域。VH区域被凝胶分离并且被连接到相似酶切的LC文库DNA 中。连接物被纯化并转化到MC1061F’细胞中。细胞在2xYT(羧苄青霉素)上生长直到实现对数期生长(OD600nm≈0.6)。添加辅助噬菌体，并且在 37℃下温育培养物30分钟。将卡那霉素和IPTG添加到每个培养物中，使得最终浓度分别为35μg/mL和1mM，在30℃下振荡过夜生长。使用 PEG/NaCl沉淀从细菌培养基中噬菌体，并且在PBS中重新悬浮。
对于亲和力成熟淘选，Bt-CCL17被捕获在50μL的经SA涂覆的磁珠上。抗原浓度为100nM(第1轮)、10nM(第2轮)和10nM(第3 轮)。小珠经受PBST的6次清洗和PBS的1次清洗，然后如上所述进行大肠杆菌感染。如上所述完成Fab表达质粒的分离以及Fab的表达。
如上所述在ELISA检测中对亲和力成熟的Fab结合人huCCL17(SEQ ID NO:1)、cCCL17(SEQ ID NO:2)和cCCL22(SEQ ID NO:3)进行筛选。所识别的克隆被测序、转化到全IgG1抗体中，并且使用MSD-SEA确认它们对huCCL17、cCCL17和CCCL22的结合力。
表3和表4分别示出了重链和轻链CDR的亲本和亲和力成熟的抗体的 CDR序列。
表3.
Figure BDA0000983469180000352
Figure BDA0000983469180000361
表4.
Figure BDA0000983469180000362
实施例3.将亲和力成熟的抗CCL17抗体结合到人和cyno CCL17
使用溶液平衡亲和力(SEA)评估抗体结合到人CCL17和cyno CCL17 的能力。这些实验的过程与Haenel等人(Haenel等人，Anal Biochem 339:182-184,2005)所用的类似。为制备抗原-抗体复合物，在96深孔聚丙烯板中以2,000,000pM的起始浓度在包含0.05％吐温-20、TBST(Thermo Scientific)的Tris碱盐水缓冲液中系列稀释人CCL17或cyno CCL17到1:6 的比率。将40pM或200pM下相等体积的抗hCCL17mAb添加到每份趋化因子稀释液中，以获得包含趋化因子系列稀释度的混合物，所述趋化因子始于1μM最终浓度和抗CCL17抗体的恒定浓度(20pM或100pM)。重复制备混合物，并且在4℃下温育48小时以达到平衡。使用SECTOR成像仪6000(Meso Scale Discovery)检测游离的抗体。使用GraphPad Prism软件(v 5.01)通过1:1结合模型对数据进行非线性最小二乘回归法分析，拟合所得的结合曲线，以获得解离平衡常数(KD)。表5示出了抗体对人和cyno CCL17的亲和力。人CCL17的亲和力范围为约2pM至约700pM、cyno CCL17的亲和力范围为约200pM至约9500pM。与结合cynoCCL17相比，生成的抗体结合人CCL17的亲和力高出约2至150倍。
表5.
Figure BDA0000983469180000371
*未测定
实施例4.CCL17抗体的优化
C17B234和C17B240抗CCL17抗体在LCDR2(“NAS”)的开始处包含潜在的N-键合糖基化位点。C17B234的残基位置50(Kabat编号)处的天冬酰胺残基(N)突变为六种不同的氨基酸(A、D、G、S、T和I)。
潜在的天冬氨酸异构化基序“DS”在亲本C17F24的HCDR3中被识别，其全部亲和力是已成熟的变体。为了在此位置测试置换作用，在mAb C17B234的重链中，位置100c(Kabat编号)处的丝氨酸残基突变为A、T 或S，或者在位置100b处D突变为E。所得的重链与mAbC17B258的轻链成对。
将抗体表达为IgG1，并且测量了该抗体对人和cyno CCL17的亲和力。图6和表7示出了最优化的抗体的重链和轻链CDR序列。表8示出了抗体对人和cyno CCL17的亲和力。N50在轻链中的诱变得到了具有改善的结合力，2至100倍。
表6.
Figure BDA0000983469180000381
表7.
Figure BDA0000983469180000382
表8.
Figure BDA0000983469180000383
在C17B236mAb中的位置100a(Kabat编号)处，在HCDR3中的色氨酸残基被识别为不期望的翻译后氧化的推定位点。该残基突变为 C17B236、C17F319mAb的Fab亲本中的17种其他氨基酸(除了C和M 之外的全部)。使用“NNK”或限定的密码子寡核苷酸进行Kunkel诱变以产生这组物质。然后使用排序ELISA筛选这些Fab，以便结合bt-人和bt- cyno CCL17。五种突变体(W→R、Y、F、T、I)示出了结合Fab的 ELISA中的一些结合(表5)。最佳的三种突变体被转化为mAb (M17B288、C17B289、C17B290)进行表达和MSD-SEA(表6)。大部分突变体显示对人和cyno CCL17具有更小的亲和力。
表9示出了抗体的VH和VI序列。
表9.
mAb VH SEQ ID NO: VL SEQ ID NO:
C17F24(亲本) 45 49
C17B234 45 50
C17B235 45 51
C17B236 45 52
C17B237 45 53
C17B238 45 54
C17B239 45 55
C17B240 45 56
C17B241 45 57
C17B242 45 58
C17B243 45 59
C17B244 45 60
C17B257 45 61
C17B258 45 62
C17B260 45 63
C17B262 45 64
C17B263 45 65
C17B264 45 66
C17B293 46 62
C17B294 47 62
C17B295 48 62
实施例6.常数区域的选择
使用标准方法将选择抗体克隆为具有以下置换的IgG2或IgG4：IgG4 S228P/L234A/L235A或IgG2 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S。表10示出了所得到的抗体。
表10.
mAb名称 同种型 mAb的可变区
C17B302 IgG2V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S C17B293
C17B311 IgG4S228P/L234A/L235A C17B293
C17B301 IgG2V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S C17B294
C17B312 IgG4S228P/L234A/L235A C17B294
以下示出了某些抗体的重链和轻链：
CB302 HC(SEQ ID NO:67)
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMG IIDPSDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARVG PADVWDAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQT YTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTF RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
CB302 LC(SEQ ID NO:68)
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CB301 HC(SEQ ID NO:69)
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMG IIDPSDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARVG PADVWDTFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQT YTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTF RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
CB301 LC(SEQ ID NO:70)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLLSFDNINKLAWYQQKPGQPP KLLIYDASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQFYSV PSTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
实施例7.抗CCL17抗体的表征
通过钙通量、β-止动报告基因测定以及趋化性测定对所选抗CCL17抗体进行表征，以评估它们抑制CCL17生物活性的能力。
钙通量测定。钙动员测定用于测试杂交瘤mAb中和CCL17信号传导的能力。CCRF-CEM细胞(
Figure BDA0000983469180000411
CCL-119TM)在具有GlutaMAX；10％ FBS；10mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸、1mM丙酮酸钠、4500mg/L葡萄糖和 1500mg/mL碳酸氢钠的RPMI中于37TM培养箱中培养，所述培养箱具有5％的CO2饱和度。使用购自ABD Bioquest,Inc.的Fluo-8NW免清洗钙检测试剂盒(#36315)采用染料标记细胞。测试抗体和10ng/mL人CCL17或 5ng/mL cyno CCL17与测试抗体一起进行预先温育，并且向细胞中添加混合物。使用FDSS 6000(Hamamatsu,Bridgewater,NJ)在490nm激发光和 525nm发射光下检测荧光信号。
β-止动报告基因测定。β-止动测定用于测定抗CCL17抗体中和CCL17 功能的能力。使用PathHunter eXpressβ-止动测定试剂盒(DiscoveRx)进行测定。简而言之，抗CCL17抗体抑制CCL17-诱导的β-止动募集的能力在与CCR4共表达的Hek293细胞中进行评估，CCR4与小酶片段ProLinkTM和β-止动融合蛋白以及β-半乳糖苷酶的N端缺失突变体(称为酶受体或EA)一同融合在框中。在各种浓度(0.15nM–1μM)下的抗CCL17抗体与 20nM CCL17结合，在将抗体-CCL17复合物添加到细胞之前，混合物在 37℃下温育20-30分钟。然后将混合物施加于细胞，并且在37℃(95％ O2/5％CO2)下温育90分钟。在每个孔中添加55μL检测试剂，并且在室温下温育60分钟。在标准发光读板机上读取样品，并且计算IC50值。
趋化性测定：趋化性测定用于展示抗CCL17抗体抑制CCL17的功能。 HSC-F细胞(HSC-F细胞通过NIH非人灵长类试剂资源获得)或CCRF- CEM细胞(
Figure BDA0000983469180000421
CCL-119TM)的迁移使用96孔趋化性室采用5μm聚碳酸酯滤光器，根据Imai等人，1997；Imai等人，1999所述的方法进行测定。简而言之，下部腔室填充有320μL RPMI/BSA、0.1％和1nM人或cyno CCL17，具有或不具有不同浓度(0.125、0.25、0.5、1和10μg/mL)的抗体，然后使用聚碳酸酯膜小心地进行重叠。使用PBS清洗细胞，并且在 0.5×106细胞数/mL下以RPMI/BSA 0.1％悬浮，并且细胞悬浮液被添加到上部腔室。将腔室在5％CO2潮湿培养箱中于37℃下温育60分钟，采用Cell Titer-Glo Luminescence Cell Viability测定从膜迁移到下部腔室的细胞。
表11示出用于钙通量测定的IC50值。数据是三次独立实验的平均值。每个mAb完全中和了使用10ng/mL(1.25nM)人CCL17或5ng/mL (0.625nM)cyno CCL17通过人或cynoCCL17诱导的钙通量，如表11所示，IC50值大约相当于每个针对抗人或抗cyno蛋白的抗体。
表11.
Figure BDA0000983469180000422
Figure BDA0000983469180000431
表12示出用于β-止动测定的IC50值。数据是三次独立实验的平均值。所有mAb均能够在20nM处完全抑制人或cyno CCL17诱导的β-止动募集，并且以剂量依赖性地抑制通过具有等同效能的人或cyno CCL17诱导的β-止动募集。
表12.
Figure BDA0000983469180000432
图1A-1D和图2A-D分别示出了选择抗体对人和cyno细胞的趋化性抑制。在抗体浓度为0.5μg/mL下约50％的抑制水平处，所有经测试的抗体均可抑制人 CCL17诱导的CCRF-CEM细胞趋化性。在0.5μg/mL的抗体浓度下， C17B302和C17B311以约50％的抑制水平抑制了cyno CCL17诱导的cyno HSC-F细胞趋化性。
实施例8.抗CCL17抗体C17B236的表位作图
抗体C17B236(VH:SEQ ID NO:45；VL:SEQ ID NO:52)的结合表位通过X涉嫌晶体学进行确定。
人CCL17在从包涵体中分离的大肠杆菌中进行表达和重折叠。mAb C17B236的Fab片段在HEK293F细胞中进行表达。CCL17：C17B236复合物通过在摩尔比为1.6:1的条件下使用过量的CCL17进行制备。然后通过尺寸排阻色谱法纯化复合物。复合物通过蒸汽扩散方法从包含20％PEG 3350和0.2M K/Na酒石酸盐的溶液中结晶。以
Figure BDA0000983469180000433
的分辨率采集X射线衍射数据采。通过分子替换确定结构，并且提纯为18.0％的R因子。
C17B236是CCL17分子的3个片段的构象和跨越，即两个环(残基 21-23和44-45)以及C端的螺旋(残基60-68)。关键交互作用涉及 CCL17的碱性残基Arg22和Lys23，以及HCDR2中酸性残基簇，包括 Asp52、Asp55和Asp57。除这些静电交互作用之外，表位中心的范德瓦尔斯触点发生在VH的Trp33和Trp105以及CCL17的Arg22之间。给定多个触点，表位的关键残基是Arg22，其与VH的Trp33叠堆并且对于 HCDR3形成多个触点。互补位和表位残基示于图7中。
互补位(抗体残基参与结合CCL17)包括18种残基，所述残基属于6 个CDR中的5个(除LCDR2之外的全部)。
C17B236表位在其二聚反应表面处的CCL17单体的相对侧。因此， C17B236不会阻断CCL17的二聚反应。C17B236的中和作用产生于CCR4 对于重叠表位的竞争。
序列：
Figure BDA0000983469180000441
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Claims (20)

1.一种特异性结合人CCL17的分离抗体，所述抗体包含SEQ ID NO: 46的重链可变区(VH)和SEQ ID NO: 62的轻链可变区(VL)。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体为人抗体或人源化抗体。
3.根据权利要求2所述的抗体，其中所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
4.根据权利要求3所述的抗体，其中所述抗体包含Fc区域中的一个或多个置换。
5.根据权利要求4所述的抗体，其中所述置换包括IgG2的V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S或P331S置换，或者IgG4的S228P、L234A或L235A置换，其中根据EU索引进行残基编号。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中所述抗体阻断CCL17/CCR4相互作用。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中在将所述抗体和人CCL17在4℃下共温育48小时之后利用溶液平衡亲和力在包含0.05% Tween-20的基于tris的盐水缓冲液中测量亲和力常数(KD)时，所述抗体以1×10-10M或更小的KD结合人CCL17。
8.根据权利要求7所述的抗体，其中所述抗体以5×10-12M或更小的KD结合人CCL17。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中在将所述抗体和食蟹猕猴(cyno)CCL17在4℃下共温育48小时之后利用溶液平衡亲和力在包含0.05% Tween-20的基于tris的盐水缓冲液中测量KD时，所述抗体以1×10-8M或更小的KD结合cyno CCL17。
10.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中所述抗体抑制CCRF-CEM细胞中的使用Fluo-8 NW以1×10-9M或更小的IC50值测量的10ng/mL人CCL17诱导的钙动员。
11.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至10中任一项所述的抗体以及药学上可接受的载体。
12.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1至10中任一项所述的抗体的VH或VL。
13.一种载体，所述载体包含根据权利要求12所述的多核苷酸。
14.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求13所述的载体。
15.一种制备抗体的方法，所述方法包括在所述抗体得以被制备的条件下培养根据权利要求14所述的宿主细胞。
16.权利要求1至10中任一项所述的抗体在制备治疗患有CCL17介导的疾病的受治疗者的药物中的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述CCL17介导的疾病为炎性疾病。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述炎性疾病是哮喘、溃疡性结肠炎(UC)、特应性皮炎(AD)或特发性肺纤维化(IPF)。
19.根据权利要求16所述的用途，其中所述CCL17介导的疾病是哮喘。
20.根据权利要求11所述的药物组合物，其用于治疗。
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