KR20240007766A

KR20240007766A - CLDN18.2에 대한 단클론 항체 및 이의 Fc 조작된 형태

Info

Publication number: KR20240007766A
Application number: KR1020237043680A
Authority: KR
Inventors: 젠후아 지아
Original assignee: 쉬지아주앙 일링 파머서티컬 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2021-05-31
Filing date: 2022-05-30
Publication date: 2024-01-16
Also published as: WO2022253156A1; JP2024521885A; WO2022253155A1; CN116761826A; CN117642425A; AU2022284994A1; AU2022287071A1; EP4347659A1; EP4347664A1; JP2024521212A; JP2024519650A; AU2022284146A9; AU2022284146A1; ZA202307483B; KR20240015616A; CA3220892A1; CN117377697A; WO2022253154A1; CA3201134A1; KR20240007767A

Abstract

본 발명은 CLDN18.2에 특이적으로 결합하고 CLDN18.1에 특이적으로 결합하지 않으며 선택적으로 조작된 Fc 영역을 갖는 단클론 항체의 패널을 제공한다.

Description

CLDN18.2에 대한 단클론 항체 및 이의 Fc 조작된 형태

관련 출원의 상호 참조

본 발명은 2021년 5월 31일에 제출한 PCT 특허 출원번호 PCT/CN2021/097239 및 PCT/CN2021/097240과 2021년 7월 16일에 제출한 PCT 특허 출원번호 PCT/CN2021/106783 및 PCT/CN2021/106784의 우선권을 주장하는 바, 이의 내용은 참조로서 본 발명에 인용된다.

본 발명은 CLDN18.2에 특이적으로 결합하고 CLDN18.1에 특이적으로 결합하지 않으며 선택적으로 조작된 Fc 영역을 갖는 단클론 항체를 제공한다.

밀착 연결 분자 클라우딘(Claudin) 18 스플라이스 변이체 2(클라우딘 18.2, CLDN18.2)는 밀착 연결 단백질의 클라우딘 패밀리 구성원이다. CLDN18.2은 4개의 막횡단 도메인과 2개의 작은 세포외 루프를 포함하는 27.8 kDa의 막횡단 단백질이다.

위를 제외한 정상 조직에서, RT-PCR는 CLDN18.2의 발현을 검출할 수 없다. CLDN18.2 특이적 항체를 사용한 면역조직화학은 위가 유일한 양성 조직임을 나타냈다.

CLDN18.2는 수명이 짧은 분화된 위의 상피 세포에서만 발현되는 고도로 선택적인 위 계통 항원이다. CLDN18.2는 악성 형질전환 과정에서 유지되므로, 인간 위암 세포의 표면에서 종종 발현된다. 이 밖에, 이 범종양 항원은 식도 선암종, 췌장 선암종 및 폐 선암종에서 상당한 수준으로 이소성으로 활성화된다. CLDN18.2 단백질은 또한 위암 선암종의 림프절 전이와 원격 전이에 국한되고, 특히 난소(소위 크루겐버그 종양)에 국한된다.

본 발명은 항-CLDN18.2 항체를 제공한다.

본 발명은 인간 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 분리된 단클론 항체(특히 Fc 조작된)를 제공하며, 상기 항체는,

(1) 서열번호 1로 표시되는 VH에 포함된 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3, 및 서열번호 2로 표시되는 VL에 포함된 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3;

(2) 서열번호 3으로 표시되는 VH에 포함된 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3, 및 서열번호 4로 표시되는 VL에 포함된 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3;

(3) 서열번호 5로 표시되는 VH에 포함된 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3, 및 서열번호 6으로 표시되는 VL에 포함된 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3; 또는

(4) 서열번호 7로 표시되는 VH에 포함된 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3, 및 서열번호 8로 표시되는 VL에 포함된 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하고,

예를 들어, 도 1a, 도 1b, 도 1c 또는 도 1d에 도시된 바와 같이, 또한

선택적으로, Fc 영역 중 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.

일 실시형태에서, 상기 항체는,

(1) 서열번호 11로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 12로 표시되는 HVR-H2, 서열번호 13으로 표시되는 HVR-H3, 서열번호 14로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 15로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 16으로 표시되는 HVR-L3;

(2) 서열번호 17로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 18로 표시되는 HVR-H2, 서열번호 19로 표시되는 HVR-H3, 서열번호 20으로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 21로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 22로 표시되는 HVR-L3;

(3) 서열번호 23으로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 24로 표시되는 HVR-H2, 서열번호 25로 표시되는 HVR-H3, 서열번호 26으로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 27로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 28로 표시되는 HVR-L3; 또는

(4) 서열번호 29로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 30으로 표시되는 HVR-H2, 서열번호 31로 표시되는 HVR-H3, 서열번호 32로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 33으로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 34로 표시되는 HVR-L3을 포함한다.

일 실시형태에서, 상기 항체는,

(1) 서열번호 41로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 42로 표시되는 HVR-H2, 서열번호 43으로 표시되는 HVR-H3, 서열번호 44로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 45로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 46으로 표시되는 HVR-L3;

(2) 서열번호 47로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 48로 표시되는 HVR-H2, 서열번호 49로 표시되는 HVR-H3, 서열번호 50으로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 51로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 52로 표시되는 HVR-L3; 또는

(3) 서열번호 53으로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 54로 표시되는 HVR-H2, 서열번호 55로 표시되는 HVR-H3, 서열번호 56으로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 57로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 58로 표시되는 HVR-L3을 포함한다.

본 발명은 인간 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 분리된 단클론 항체(특히 Fc 조작된)를 더 제공하며, 상기 항체는,

(1) 서열번호 11로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 12로 표시되는 HVR-H2 및 서열번호 13으로 표시되는 HVR-H3을 포함하는 VH, 및 서열번호 14로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 15로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 16으로 표시되는 HVR-L3을 포함하는 VL;

(2) 서열번호 17로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 18로 표시되는 HVR-H2 및 서열번호 19로 표시되는 HVR-H3을 포함하는 VH, 및 서열번호 20으로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 21로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 22로 표시되는 HVR-L3을 포함하는 VL;

(3) 서열번호 23으로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 24로 표시되는 HVR-H2 및 서열번호 25로 표시되는 HVR-H3을 포함하는 VH, 및 서열번호 26으로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 27로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 28로 표시되는 HVR-L3을 포함하는 VL; 또는

(4) 서열번호 29로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 30으로 표시되는 HVR-H2 및 서열번호 31로 표시되는 HVR-H3을 포함하는 VH, 및 서열번호 32로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 33으로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 34로 표시되는 HVR-L3을 포함하는 VL을 포함하고, 또한

선택적으로, Fc 영역 중 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.

(1) 서열번호 41로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 42로 표시되는 HVR-H2 및 서열번호 43으로 표시되는 HVR-H3을 포함하는 VH, 및 서열번호 44로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 45로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 46으로 표시되는 HVR-L3을 포함하는 VL;

(2) 서열번호 47로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 48로 표시되는 HVR-H2 및 서열번호 49로 표시되는 HVR-H3을 포함하는 VH, 및 서열번호 50으로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 51로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 52로 표시되는 HVR-L3을 포함하는 VL; 또는

(3) 서열번호 53으로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 54로 표시되는 HVR-H2 및 서열번호 55로 표시되는 HVR-H3을 포함하는 VH, 및 서열번호 56으로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 57로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 58로 표시되는 HVR-L3을 포함하는 VL을 포함하고, 또한

선택적으로, Fc 영역 중 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.

(1) 서열번호 1로 표시되는 VH 및 서열번호 2로 표시되는 VL;

(2) 서열번호 3으로 표시되는 VH 및 서열번호 4로 표시되는 VL;

(3) 서열번호 5로 표시되는 VH 및 서열번호 6으로 표시되는 VL; 또는

(4) 서열번호 7로 표시되는 VH 및 서열번호 8로 표시되는 VL을 포함하고, 또한

선택적으로, Fc 영역 중 하나 이상의 돌연변이를 포함하며,

선택적으로, 상기 VH의 처음 2개의 N 말단 아미노산 잔기는 존재하지 않는다.

일 실시형태에서, 상기 Fc 영역 중 상기 하나 이상의 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 이펙터 기능(예를 들어, ADCC 및/또는 CDC)을 변형(예를 들어, 증가 또는 감소)시키는 하나 이상의 돌연변이이다. 일 실시형태에서, 상기 Fc 영역 중 상기 하나 이상의 돌연변이는 L235V, F243L, R292P, Y300L 및 P396L로부터 선택되는 하나 이상의 치환이다. 일 실시형태에서, 상기 Fc 영역 중 상기 하나 이상의 돌연변이는 L235V, F243L, R292P, Y300L 및 P396L이다.

i) 인간 CLDN18.2에 결합하기 위해 항-CLDN18.2 항체와 경쟁하고, 상기 항체는 (1) 서열번호 1로 표시되는 VH 및 서열번호 2로 표시되는 VL; (2) 서열번호 3으로 표시되는 VH 및 서열번호 4로 표시되는 VL; (3) 서열번호 5로 표시되는 VH 및 서열번호 6으로 표시되는 VL; 또는 (4) 서열번호 7로 표시되는 VH 및 서열번호 8로 표시되는 VL을 포함하며, 및/또는

ii) 항-CLDN18.2 항체와 인간 CLDN18.2 상의 동일한 에피토프에 결합하고, 상기 항체는 (1) 서열번호 1로 표시되는 VH 및 서열번호 2로 표시되는 VL; (2) 서열번호 3으로 표시되는 VH 및 서열번호 4로 표시되는 VL; (3) 서열번호 5로 표시되는 VH 및 서열번호 6으로 표시되는 VL; 또는 (4) 서열번호 7로 표시되는 VH 및 서열번호 8로 표시되는 VL을 포함하며; 및/또는

iii) 인간 CLDN18.2를 발현하는 세포(예를 들어, 293T 세포 또는 CHO 세포 또는 CT26 세포 또는 KATOIII 세포 또는 NCI-N87 세포)에 대한 PBMC의 ADCC를 매개하고, 예를 들어 EC₅₀ 값은 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.1 nM, 0.09 nM, 0.08 nM, 0.07 nM, 0.06 nM, 0.05 nM, 0.04 nM, 0.03 nM, 0.02 nM, 0.01 nM, 0.009 nM, 0.008 nM, 0.007 nM, 0.006 nM, 0.005 nM, 0.004 nM, 0.003 nM, 0.002 nM 또는 0.001 nM 좌우 또는 미만이며, 예를 들어 LDH 또는 FACS에 의해 결정되고; 및/또는

iv) 인간 CLDN18.1을 발현하는 세포(예를 들어, 293T 세포 또는 CHO 세포 또는 CT26 세포 또는 KATOIII 세포 또는 NCI-N87 세포)에 대한 PBMC의 ADCC를 매개하지 않으며; 및/또는

v) 인간 CLDN18.2를 발현하는 세포(예를 들어, 293T 세포 또는 CHO 세포 또는 CT26 세포 또는 KATOIII 세포 또는 NCI-N87 세포)에 대한 CDC를 매개하고, 예를 들어 EC₅₀ 값은 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.1 nM, 0.09 nM, 0.08 nM, 0.07 nM, 0.06 nM, 0.05 nM, 0.04 nM, 0.03 nM, 0.02 nM, 0.01 nM, 0.009 nM, 0.008 nM, 0.007 nM, 0.006 nM, 0.005 nM, 0.004 nM, 0.003 nM, 0.002 nM 또는 0.001 nM 좌우 또는 미만이며, 예를 들어 LDH 또는 FACS에 의해 결정되고; 및/또는

vi) 인간 CLDN18.1을 발현하는 세포(예를 들어, 293T 세포 또는 CHO 세포 또는 CT26 세포 또는 KATOIII 세포 또는 NCI-N87 세포)에 대한 CDC를 매개하지 않으며; 및/또는

vii) 세포 표면에서 인간 CLDN18.2를 발현하는 세포(예를 들어, 293T 세포 또는 CHO 세포)에 결합하고, 예를 들어 Kd 값은 50 pM, 45 pM, 40 pM, 38.6 pM, 35 pM, 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 13.1 pM, 10 pM, 9.5 pM, 9 pM 또는 5 pM 좌우 또는 미만이며; 및/또는

viii) 세포 표면에서 인간 CLDN18.1을 발현하는 세포(예를 들어, 293T 세포 또는 CHO 세포)에 결합하지 않고; 및/또는

ix) 인간 CLDN18.2에 특이적으로 결합하며, 예를 들어 Kd 값은 10 nM, 9.5 nM, 9 nM, 8.5 nM, 8 nM, 7.5 nM, 7 nM, 6.5 nM, 6.4 nM, 6 nM, 5.5 nM, 5 nM, 4.5 nM, 4 nM, 3.8 nM, 3.5 nM, 3 nM, 2.5 nM, 2 nM, 1.7 nM, 1.5 nM 또는 1 nM 좌우 또는 미만이고; 및/또는

x) 인간 CLDN18.1에 특이적으로 결합하지 않는다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따른 항-CLDN18.2 단클론 항체는 뮤린 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체이다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따른 항-CLDN18.2 단클론 항체는 선택적으로 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, scFv 단편 및 디아바디로부터 선택되는 항원 결합 항체 단편이다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따른 항-CLDN18.2 단클론 항체는 전장 항체이다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 항-CLDN18.2 단클론 항체는 선택적으로 서열번호 9로 표시되는 인간 IgG(특히 IgG1) 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 항-CLDN18.2 단클론 항체는 선택적으로 서열번호 40으로 표시되는 돌연변이된 인간 IgG(특히 IgG1) 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 항-CLDN18.2 단클론 항체는 선택적으로 서열번호 10으로 표시되는 인간 κ 경쇄 불변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 항-CLDN18.2 단클론 항체는 키메라 항체(예를 들어, 뮤린/인간 키메라 항체)이다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 항-CLDN18.2 단클론 항체는 Fc 조작된 것이다.

일 실시형태에서, 본 발명의 단클론 항체(mAb) 또는 Fab 단편은 교차 형태(x-mAb 또는 x-Fab)를 가지고, 여기서 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인 또는 (제1) 불변 도메인은 교환된다.

본 발명은 본 발명의 단클론 항체를 인코딩하는 분리된 핵산을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터)를 제공한다. 본 발명은 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 본 발명의 단클론 항체의 생산 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 숙주 세포를 배양하여 상기 항체를 생산하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 상기 숙주 세포 또는 상기 세포 배양물로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 더 포함한다.

본 발명은 본 발명의 단클론 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 단클론 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약물 제제를 제공한다.

본 발명은 약제로 사용되는 본 발명의 단클론 항체를 제공한다. 본 발명은 암 치료에 사용되는 본 발명의 단클론 항체를 제공한다. 본 발명은 약제의 제조에서 본 발명의 단클론 항체의 용도를 제공한다. 일 실시형태에서, 상기 약제는 암 치료에 사용된다. 본 발명은 암을 앓고 있는 개체의 치료 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 개체에게 유효량의 본 발명의 단클론 항체를 투여하는 단계를 포함한다.

도 1a는 본 발명의 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열의 비교를 보여주고, 여기서 Kabat에 따른 HVR 서열은 음영을 통해 강조 표시된다.
도 1b는 본 발명의 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열의 비교를 보여주고, 여기서 IMGT에 따른 HVR 서열은 음영을 통해 강조 표시된다.
도 1c는 본 발명의 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열의 비교를 보여주고, 여기서 Chothia에 따른 HVR 서열은 음영을 통해 강조 표시된다.
도 1d는 본 발명의 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열의 비교를 보여주고, 여기서 Contact에 따른 HVR 서열은 음영을 통해 강조 표시된다.
도 2는 본 발명의 항체와 CLDN18.2를 발현하는 세포의 결합을 보여준다.
도 3은 본 발명의 항체와 CLDN18.1을 발현하는 세포의 결합을 보여준다.
도 4는 본 발명의 항체에 의해 매개되는 CLDN18.2를 발현하는 세포에 대한 ADCC를 보여준다.
도 5는 본 발명의 항체와 huCLDN18.2의 결합 곡선을 보여준다.
도 6은 본 발명의 항체와 huCLDN18.2를 발현하는 세포의 결합 곡선을 보여준다.
도 7은 본 발명의 항체의 ADCC 측정 결과를 보여준다.
도 8은 본 발명의 항체의 세포 결합 측정 결과를 보여준다.
도 9는 본 발명의 항체의 CDC 측정 결과를 보여준다.
도 10은 본 발명의 항체의 ADCC 측정 결과를 보여준다.
도 11은 LDH 측정에 의해 결정된 본 발명의 항체에 의해 매개되는 CLDN18.2를 발현하는 CT26에 대한 CDC 효과를 보여준다.
도 12는 LDH 측정에 의해 결정된 본 발명의 항체에 의해 매개되는 CLDN18.2를 발현하는 KATOIII에 대한 CDC 효과를 보여준다.
도 13은 LDH 측정에 의해 결정된 본 발명의 항체에 의해 매개되는 CLDN18.2를 발현하는 KATOIII에 대한 ADCC 효과를 보여준다.
도 14는 LDH 측정에 의해 결정된 본 발명의 항체에 의해 매개되는 CLDN18.2를 발현하는 NCI-N87에 대한 ADCC 효과를 보여준다.

I. 정의

본문의 용어 “항체”는 가장 넓은 의미에서 사용되고, 다양한 항체 구조를 포함하며, 단클론 항체, 다클론 항체, 다중 항체(예를 들어, 이중 특이성 항체) 및 필요한 항원 결합 활성을 나타내는 항체 단편을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

“항체 단편”은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체와 상이한 분자를 의미한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; 디아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자(예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 항체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

용어 “키메라” 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종에서 유래되고 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분이 상이한 공급원 또는 종에서 유래되는 항체를 의미한다.

항체의 “클래스”는 중쇄에 구비되는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 의미한다. 항체에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5가지 주요 클래스가 있고, 그 중 일부 클래스는 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA1 및 IgA2와 같은 서브클래스(동종형)로 더 나뉠 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 대응되는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 각각 지칭될 수 있다. 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여, 경쇄는 분명히 다른 2가지 유형(κ 및 λ라고 함) 중 하나로 분류될 수 있다.

“이펙터 기능”은 항체의 동종형에 따라 달라지는 항체 Fc 영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 의미한다. 항체의 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포 독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존적 세포 매개 세포 독성(ADCC); 식세포 작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체)의 하향조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.

본문에 사용된 바와 같이, 용어 “조작(engineer), 조작된(engineered), 조작화(engineering)”는 펩티드 골격에 대한 임의의 조작 또는 천연적으로 존재하거나 재조합된 폴리펩티드 또는 이의 단편의 번역 후 변형을 포함하는 것으로 간주된다. 조작은 아미노산 서열에 대한 변형, 글리코실화 패턴에 대한 변형 또는 개체 아미노산의 측쇄기에 대한 변형, 및 이러한 방법의 조합을 포함한다.

본문의 용어 “Fc 영역”은 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C 말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226 또는 Pro230에서 중쇄의 카르복실 말단까지 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C 말단 라이신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 일 실시형태에서, 본문에 따른 항-CLDN18.2 항체는 IgG1 동종형이고, 서열번호 9 또는 서열번호 40의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 이는 또한 C 말단 라이신(Lys447)을 포함한다. 본문에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 중의 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에 기재된 EU 넘버링 시스템(EU 인덱스라고도 함)에 따른다.

“프레임워크” 또는 “FR”는 초가변 영역(HVR) 잔기를 제외한 가변 도메인 잔기를 의미한다. 가변 도메인의 FR는 통상적으로 4개의 FR 도메인, 즉 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 통상적으로 FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4의 서열에 따라 VH(또는 VL)에 나타난다.

용어 “전장 항체”, “온전한 항체” 및 “전체 항체”는 본문에서 상호교환 가능하게 사용되어 천연 항체 구조와 기본적으로 유사한 구조 또는 Fc 영역의 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.

용어 “숙주 세포”, “숙주 세포주” 및 “숙주 세포 배양물”은 상호교환 가능하게 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포를 의미하며, 이러한 세포의 자손을 포함한다. 숙주 세포는 “형질전환체” 및 “형질전환 세포”를 포함하고, 계대 수와 관계 없이 1차 형질전환 세포 및 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손의 핵산 함량은 친세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만 돌연변이를 포함할 수 있다. 본문은 초기 형질전환 세포에서 스크리닝되거나 선택된 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이형 자손을 포함한다.

“인간화”항체는 비인간 HVR에서 유래된 아미노산 잔기 및 인간 FR에서 유래된 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 의미한다. 일부 실시형태에서, 인간화 항체는 적어도 하나(또한, 통상적으로 2개)의 가변 도메인을 기본적으로 전부 포함할 것이며, 여기서 전부 또는 기본적으로 전부의 HVR(예를 들어, CDR)는 비인간 항체의 HVR에 대응되고, 전부 또는 기본적으로 전부의 FR은 인간 항체의 FR에 대응된다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체에서 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체(예를 들어, 비인간 항체)의 “인간화 형태”는 인간화를 겪은 항체를 의미한다.

본문에 사용된 바와 같은 용어 “초가변 영역” 또는 “HVR”는 서열이 초가변(“상보성 결정 영역” 또는 “CDR”)이거나 및/또는 구조적으로 결정된 루프(“초가변 루프”)를 형성하거나 및/또는 항원 접촉 잔기(“항원 접촉(antigen contact)”)를 포함하는 항체 가변 도메인의 각 영역을 의미한다. 통상적으로, 항체는 6개의 HVR를 포함하는 바, 3개는 VH에 있고(H1, H2, H3), 3개는 VL(L1, L2, L3)에 있다. 본문의 예시적인 HVR는,

(a) 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3)(Chothia 및 Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))의 아미노산 잔기에 존재하는 초가변 루프;

(b) 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3)(Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))의 아미노산 잔기에 존재하는 CDR;

(c) 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2) 및 93-101(H3)(MacCallum 등 J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))의 아미노산 잔기에 존재하는 항원 접촉; 및

(d) HVR 아미노산 잔기 46-56(L2), 47-56(L2), 48-56(L2), 49-56(L2), 26-35(H1), 26-35b(H1), 49-65(H2), 93-102(H3) 및 94-102(H3)를 포함하는 (a), (b) 및/또는 (c)의 조합을 포함한다.

HVR 잔기는 웹사이트(예를 들어, https://www.novopro.cn/tools/cdr.html)에서 식별될 수 있다.

달리 지시되지 않는 한, 가변 도메인 중의 HVR 잔기 및 기타 잔기(예를 들어, FR 잔기)는 본문에서 Kabat 등에 따라 상기와 같이 넘버링된다.

본문에 사용된 바와 같은 용어 “단클론 항체”는 기본적으로 동종인 항체의 집단(즉, 상기 집단을 구성하는 각 항체는 동일하거나 및/또는 동일한 에피토프에 결합하지만, 예를 들어 천연적으로 존재하는 돌연변이를 포함하거나 단클론 항체 제제의 생산 기간에 생산된 가능한 변이체 항체를 제외하고 이러한 변이체는 통상적으로 소량으로 존재함)으로부터 얻은 항체를 의미한다. 통상적으로 상이한 결정 인자(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 달리, 단클론 항체 제제의 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정 인자에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 “단클론”은 기본적으로 동종인 항체 집단으로부터 얻은 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정 방법을 통해 항체를 생산해야 하는 것으로 해석해서는 아니 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체는 다양한 기술을 통해 제조될 수 있고, 상기 기술은 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 디스플레이 방법 및 전부 또는 일부 인간 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 유전자 변형 동물의 이용 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않고, 본문에는 단클론 항체를 제조하는 이러한 방법과 다른 예시적인 방법이 기재되어 있다.

용어 “가변 영역” 또는 “가변 도메인”은 항체와 항원의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 통상적으로 유사한 구조를 가지고, 각각의 도메인은 4개의 보존적 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다. 예를 들어, Kindt 등 Kuby Immunology, 제6판, W.H. Freeman and Co., 제91페이지 (2007)를 참조바란다. 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 이 밖에, 특정 항원에 결합하는 항체는 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 각각 스크리닝하기 위해 상기 항원을 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 분리할 수 있다. 예를 들어, Portolano 등, J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson 등, Nature 352:624-628 (1991)을 참조바란다.

본문에 사용된 바와 같이, 용어 “벡터”는 연결된 다른 핵산을 전파할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 상기 용어는 자가복제 핵산 구조인 벡터 및 벡터가 도입된 숙주 세포 게놈에 통합된 벡터를 포함한다. 일부 벡터는 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본문에서 “발현 벡터”로 지칭된다.

II. 예시적 항체

본 발명은 인간 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 분리된 단클론 항체(특히 Fc 조작된)를 제공하고, 여기서 상기 항체는 서열번호 11로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 12로 표시되는 HVR-H2 및 서열번호 13으로 표시되는 HVR-H3을 포함하는 VH, 및 서열번호 14로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 15로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 16으로 표시되는 HVR-L3을 포함하는 VL을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 항체는 서열번호 1로 표시되는 VH 및 서열번호 2로 표시되는 VL을 포함한다. 선택적으로, 상기 VH의 처음 2개의 N 말단 아미노산 잔기는 존재하지 않는다.

본 발명은 인간 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 분리된 단클론 항체(특히 Fc 조작된)를 제공하고, 여기서 상기 항체는 서열번호 17로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 18로 표시되는 HVR-H2 및 서열번호 19로 표시되는 HVR-H3을 포함하는 VH, 및 서열번호 20으로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 21로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 22로 표시되는 HVR-L3을 포함하는 VL을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 항체는 서열번호 3으로 표시되는 VH 및 서열번호 4로 표시되는 VL을 포함한다. 선택적으로, 상기 VH의 처음 2개의 N 말단 아미노산 잔기는 존재하지 않는다.

본 발명은 인간 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 분리된 단클론 항체(특히 Fc 조작된)를 제공하고, 여기서 상기 항체는 서열번호 23으로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 24로 표시되는 HVR-H2 및 서열번호 25로 표시되는 HVR-H3을 포함하는 VH, 및 서열번호 26으로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 27로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 28로 표시되는 HVR-L3을 포함하는 VL을 포함한다. 본 발명은 인간 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 분리된 단클론 항체(특히 Fc 조작된)를 제공하고, 여기서 상기 항체는 서열번호 41로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 42로 표시되는 HVR-H2 및 서열번호 43으로 표시되는 HVR-H3을 포함하는 VH, 및 서열번호 44로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 45로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 46으로 표시되는 HVR-L3을 포함하는 VL을 포함한다. 본 발명은 인간 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 분리된 단클론 항체(특히 Fc 조작된)를 제공하고, 여기서 상기 항체는 서열번호 47로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 48로 표시되는 HVR-H2 및 서열번호 49로 표시되는 HVR-H3을 포함하는 VH, 및 서열번호 50으로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 51로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 52로 표시되는 HVR-L3을 포함하는 VL을 포함한다. 본 발명은 인간 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 분리된 단클론 항체(특히 Fc 조작된)를 제공하고, 여기서 상기 항체는 서열번호 53으로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 54로 표시되는 HVR-H2 및 서열번호 55로 표시되는 HVR-H3을 포함하는 VH, 및 서열번호 56으로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 57로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 58로 표시되는 HVR-L3을 포함하는 VL을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 항체는 서열번호 5로 표시되는 VH 및 서열번호 6으로 표시되는 VL을 포함한다. 선택적으로, 상기 VH의 처음 2개의 N 말단 아미노산 잔기는 존재하지 않는다.

본 발명은 인간 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 분리된 단클론 항체(특히 Fc 조작된)를 제공하고, 여기서 상기 항체는 서열번호 29로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 30으로 표시되는 HVR-H2 및 서열번호 31로 표시되는 HVR-H3을 포함하는 VH, 및 서열번호 32로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 33으로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 34로 표시되는 HVR-L3을 포함하는 VL을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 항체는 서열번호 7로 표시되는 VH 및 서열번호 8로 표시되는 VL을 포함한다. 선택적으로, 상기 VH의 처음 2개의 N 말단 아미노산 잔기는 존재하지 않는다.

일 실시형태에서, 본 발명의 단클론 항체(mAb) 또는 Fab 단편은 교차 형태(x-mAb 또는 x-Fab)을 가지고, 여기서 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인 또는 (제1) 불변 도메인은 교환된다.

III. 재조합 방법 및 조성물

재조합 방법 및 조성물을 사용하여 항체를 생산할 수 있고, 예를 들어 US 4,816,567에 기재된 바와 같다. 이러한 방법에 대해, 항체를 인코딩하는 하나 이상의 분리된 핵산을 제공한다.

천연 항체 또는 천연 항체 단편의 경우, 2가지 핵산이 필요한데, 하나는 경쇄 또는 이의 단편에 사용되고 하나는 중쇄 또는 이의 단편에 사용된다. 하나 이상의 이러한 핵산은 상기 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 상기 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열(예를 들어, 상기 항체의 하나 이상의 경쇄 및/또는 중쇄)을 인코딩한다. 이러한 핵산은 동일한 발현 벡터 또는 상이한 발현 벡터 상에 있다.

일 실시형태에서, 본문에 보고된 방법에 사용되는 항체를 인코딩하는 분리된 핵산을 제공한다.

다른 실시형태에서, 하나 이상의 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)를 제공한다.

다른 실시형태에서, 하나 이상의 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

이러한 일 실시형태에서, 숙주 세포는, (예를 들어, 형질전환된):

(1) 상기 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 상기 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는

(2) 상기 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터, 및 상기 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다.

일 실시형태에서, 상기 숙주 세포는 진핵, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프계 세포(예를 들어, Y0, NS0, Sp2/0 세포)이다. 일 실시형태에서, 항체의 제조 방법을 제공하고, 여기서 상기 방법은 상기 항체를 발현하기에 적합한 조건에서 위에 제공된 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 선택적으로 상기 숙주 세포 또는 숙주 세포 배지로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함한다.

항체의 재조합 생산에 대해, 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 예를 들어 상술한 항체를 인코딩하는 핵산을 분리하고 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 이러한 핵산은 일반적인 절차(예를 들어, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여)를 사용하여 쉽게 분리 및 시퀀싱되거나 재조합 방법을 통해 생산되거나 화학적 합성을 통해 얻어질 수 있다.

항체를 인코딩하는 벡터의 클로닝 또는 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 본문에 따른 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않은 경우 박테리아에서 항체를 생산할 수 있다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는 예를 들어, US 5,648,237, US 5,789,199 및 US 5,840,523을 참조바란다. 또한 Charlton, K.A., Methods in Molecular Biology, 제248권, Lo, B.K.C. (편집), Humana Press, Totowa, NJ (2003), 제245-254페이지에 기술된 대장균(E. coli)에서 항체 단편의 발현을 참조바란다. 발현 후, 박테리아 세포 페이스트(cell paste)에서 가용성 분획으로 상기 항체를 분리할 수 있고 추가로 정제할 수 있다.

원핵 생물 이외에, 진핵 미생물(예를 들어, 사상성 진균 또는 효모)도 항체를 인코딩하는 벡터의 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이고, 이는 글리코실화 경로가 “인간화”되어 부분적 또는 완전한 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생산하는 진균 및 효모 균주를 포함한다. Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; 및 Li, H. 등, Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215를 참조바란다.

글리코실화 항체의 발현을 위한 적합한 숙주 세포도 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)에서 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 세포 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 곤충 세포에 결합하여 사용될 수 있는 수많은 바큘로바이러스 균주가 동정되었다.

식물 세포 배양물도 숙주로 사용될 수 있다. 예를 들어, US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978 및 US 6,417,429(유전자 변형 식물에서 항체의 생산을 위한 PLANTIBODIES™ 기술이 기술됨)를 참조바란다.

척추동물 세포도 숙주로 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액 성장에 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인(COS-7); 인간 배아 신장 라인(예를 들어 Graham, F.L. 등, J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74에 기재된 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 서톨리 세포(예를 들어 Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252에 기재된 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부암 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유방 종양(MMT 060562); 예를 들어 Mather, J.P. 등, Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68에 기재된 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포(Urlaub, G. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)를 포함하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 골수종 세포주(예를 들어 Y0, NS0 및 Sp2/0)를 포함한다. 항체 생산에 적합한 일부 포유동물 숙주 세포주의 요약에 관하여, 예를 들어, Yazaki, P. 및 Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, 제248권, Lo, B.K.C. (편집), Humana Press, Totowa, NJ (2004), 제255-268페이지를 참조바란다.

IV. 측정

본문에 제공된 항체는 본 분야에 공지된 다양한 측정을 통해 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성을 동정, 스크리닝 또는 특성화할 수 있다.

결합 측정 및 기타 측정

일 양태에서, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 등 공지된 방법을 통해 본 발명의 항체의 항원 결합 활성을 테스트한다.

다른 양태에서, 경쟁 측정은 CLDN18.2에 결합하기 위해 aCLDN18.2와 경쟁하는 항체를 동정하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 경쟁 항체는 aCLDN18.2가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프(예를 들어, 선형 에피토프 또는 구조 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 매핑하기 위한 상세한 예시적 방법이 Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” Methods in Molecular Biology 제66권 (Humana Press, Totowa, NJ)에 제공되어 있다.

예시적인 경쟁 측정에서, CLDN18.2에 결합하는 제1 표지 항체 및 CLDN18.2에 결합하기 위해 제1 항체와 경쟁하는 능력이 테스트되는 제2 미표지 항체를 포함하는 용액에서 고정된 CLDN18.2를 배양한다. 제2 항체는 하이브리도마 상층액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 제1 표지 항체를 포함하지만 제2 미표지 항체를 포함하지 않는 용액에서 CLDN18.2를 배양한다. 제1 항체가 CLDN18.2에 결합하는 것을 허용하는 조건에서 배양한 후 과량의 결합되지 않은 항체를 제거하고 고정된 CLDN18.2에 결합된 표지의 양을 측정한다. 대조군 샘플에 비해 테스트 샘플에서 고정된 CLDN18.2에 결합된 표지의 양이 유의하게 적은 경우, CLDN18.2에 결합하기 위해 제2 항체와 제1 항체가 경쟁함을 나타낸다. Harlow 및 Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual 제14장 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)을 참조바란다.

활성 측정

일 양태에서, 생물학적 활성을 갖는 항-CLDN18.2 항체의 동정을 위한 측정을 제공한다. 생물학적 활성은 예를 들어 CLDN18.2를 발현하는 표적 세포에 대한 PBMC의 ADCC에 대한 항-CLDN18.2 항체의 작용을 포함할 수 있다. 또한 체내 및/또는 시험관내에서 이러한 생물학적 활성을 갖는 항체를 제공한다.

실시예

초기 스크리닝 후, CLDN18.2를 발현하는 세포에 특이적으로 결합하지만 CLDN18.1을 발현하는 세포에 특이적으로 결합하지 않는 면역 마우스에서 유래된 4개의 양성 하이브리도마 세포주를 동정하였다.

실시예 1: 마우스 하이브리도마 세포로부터 4개의 CLDN18.2 특이적 단클론 항체(mAb)의 클로닝

본 실시예는 마우스 하이브리도마 세포에서 항체의 H쇄 및 L쇄 유전자를 클로닝하여 CLDN18.2에 대해 특이성을 갖는 가변 영역 서열을 얻어 키메라 항체를 생산하였다.

본 분야의 일반적인 절차에 따라 Quick-RNA™ Microprep 키트(ZYMO Research, 카탈로그 번호 R1050)를 사용하여 하이브리도마 세포에서 RNA를 분리 및 정제하였다. 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하고, SMARTer® RACE 5'/3' 키트(Takara Bio USA, Inc., 카탈로그 번호 634858)를 IgG1 3' 불변 프라이머(서열번호 35), IgG2a 3' 불변 프라이머(서열번호 36) 및 κ 3' 불변 프라이머(서열번호 37)와 함께 사용하여 RACE를 수행하였다. RACE DNA 생성물은 NuceloSpin 겔 및 PCR Clean-Up 키트(Takara, 카탈로그 번호 740986.20)를 사용하여 겔 추출을 수행하였다. 선형화 pRACE 벡터 및 겔 정제된 PACE 생성물의 in-fusion 반응 혼합물을 Stellar 컴피턴트 세포(Clontech, 카탈로그 번호 636766)로 형질전환시켰다. QIAprep Spin Miniprep 키트(Qiagen, 카탈로그 번호 27104)를 사용하여 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 분리하고, M13 시퀀싱 프라이머를 사용하여 Sanger 시퀀싱(GENEWIZ)을 수행하였다. 4쌍의 중쇄 및 경쇄의 최종 유전자 서열(데이터는 나타내지 않음)을 얻고, 아래에서는 이를 CLDN18.2 mAb(mAb1, mAb2, mAb3 및 mAb4)로 결정하였다.

실시예 2: 마우스 불변 영역을 인간 유래 불변 영역으로 대체한 키메라 항체의 구축

본 실시예는 4개의 분자 클로닝 마우스 mAb의 불변 영역을 인간 IgG1 중쇄 및 κ 경쇄에서 유래된 불변 영역으로 대체하여 키메라 항체를 구축한 것을 설명한다.

인간 IgG1 중쇄의 불변 영역(서열번호 9)을 포함하는 플라스미드 pFUSE-CHIg-hG1(InvivoGen, 카탈로그 번호 pfuse-hchg1) 및 인간 κ 경쇄의 불변 영역(서열번호 10)을 포함하는 플라스미드 pFUSE2-CLIg-hk(InvivoGen, 카탈로그 번호 pfuse2-hclk)를 Hind III 및 Nhe I(IgG1에 사용) 또는 BsiW I(κ에 사용)(모두 NEB lab에서 유래)로 소화시켰다. NucleoSpin 겔 및 PCR Clean-up 키트(Takara, 카탈로그 번호 740986.20)를 사용하여 겔 정제를 통해 선형화 플라스미드를 정제하였다. mAb1, mAb2, mAb3 및 mAb4의 마우스 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 코딩 서열에 대해 실시예 1에서 얻은 플라스미드로부터의 HiFi HotStart(Kapa(Roche), KK2602)을 특이적 프라이머(데이터는 나타내지 않음)와 함께 사용하여 PCR 증폭을 수행하고, NucleoSpin 겔 및 PCR Clean-up 키트(Takara, 카탈로그 번호 740986.20)를 사용하여 겔 정제를 통해 정제하였다. Gibson Assembly® HiFi 1단계 키트(SGI(VWR), 카탈로그 번호 GA1100-50)를 사용하여 선형화 벡터 및 삽입 단편을 조립하였다. 조립 반응 혼합물을 Stellar 컴피턴트 세포(Clontech, 카탈로그 번호 636766)로 형질전환시켰다. QIAprep Spin Miniprep 키트(Qiagen, 카탈로그 번호 27104)를 사용하여 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 분리하고, Sanger 시퀀싱(GENEWIZ)을 수행하였다. 4개의 키메라 항체를 구축하고, 각 항체는 실시예 1에서 생산된 4개의 마우스 mAb 중 하나로부터의 가변 영역을 포함한다. 새로운 키메라 항체를 YL-G1-19-01, YL-G1-19-02, YL-G1-19-03 및 YL-G1-19-04로 지정하였다.

실시예 3: 표면 염색에 의한 이들 4개의 키메라 단클론 항체의 특이성의 확인

본 실시예는 참조 mAb(IMAB362, Ganymed)와 비교하여 CLDN18.2 결합 특이성을 갖는 4개의 키메라 단클론 항체의 테스트를 설명한다.

FACS 완충액(50 μL)에서 밀도가 2 x 10⁶개 세포/ml인 CLDN18.2를 발현하는 293T 세포 및 CLDN18.1을 발현하는 293T 세포와 키메라 항체, 참조 항체 또는 IgG 음성 대조군의 희석 시리즈(FACS 완충액에서 60.00, 20.00, 6.67, 2.22, 0.74, 0.25, 0.08 μg/mL)(50 μL)를 96웰 V 바닥 플레이트에서 혼합하고, 얼음 위에서 30분 동안 배양하였다. 200 μL/웰의 FACS 완충액으로 세척한 후, 세포를 30 μL/웰의 2차 항체 Alexa Fluor® 647 AffiniPure 염소 항 인간 IgG(Fcγ 단편 특이적)(Jackson, 카탈로그 번호 109-605-098)에 재현탁하고, 얼음 위에서 20분 동안 배양하였다. 200 μL/웰의 FACS 완충액으로 3회 세척한 후, 세포를 150 μl/웰의 FACS 완충액으로 재현탁하고, BD LSR II 유세포 분석기(HTS)를 사용하여 FACS를 수행하였다. 기하학적 평균값을 사용하여 데이터 분석을 수행하고, Prism GraphPad를 사용하여 플롯을 작성하였다. 유세포 분석에서는 참조 mAb와 비교하여 4개의 키메라 항체가 CLDN18.2를 발현하는 세포에 대해 더 높은 특이성 결합을 가짐을 나타낸다(도 2 참조). CLDN18.1을 발현하는 세포에 대한 결합은 나타나지 않았고(도 3 참조), 이는 이들 4개의 키메라 항체의 높은 특이성을 나타낸다.

실시예 4: ADCC 측정에 의한 이들 4개의 키메라 항체의 기능적 활성의 동정.

본 실시예는 참조 mAb(IMAB362, Ganymed)와 비교하여 이들 4개의 키메라 항체의 ADCC 매개 살상 활성의 테스트를 설명한다.

CLDN18.2를 발현하는 293T 세포 및 CLDN18.1을 발현하는 293T 세포는 eBioscience™ CFSE(Thermo, 카탈로그 번호 65-0850-84)를 사용하여 CFSE로 표지하였다. Lympholyte® 세포 분리 매질(Cedarlane, 카탈로그 번호 CL5110)(50 μL)에서 밀도가 4 x 10⁵개 세포/ml인 CFSE 표지 세포와 키메라 항체, 참조 항체 또는 IgG 음성 대조군의 희석 시리즈(매질에서 20.00, 6.67, 2.22, 0.74, 0.25, 0.08, 0.03 μg/mL)(100 μL)를 96웰 V 바닥 플레이트에서 혼합하고, 실온 하에 암실에서 15분 동안 배양하였다. 그런 다음, 밀도가 5 x 10⁶개 세포/ml인 PBMC(50 μL)를 첨가하고, 플레이트를 37℃ 하에 암실에서 2시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고, 100 μL의 eBioscience™ 정착성 생존도 지시염료 eFluor™ 660(Thermo, 카탈로그 번호 65-0864)의 작업 용액을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 암실에서 얼음 위에서 30분 동안 배양하였다. PBS로 세척한 후, 75 μL/웰의 PBS 및 25 μL/웰의 4% 파라포름알데히드를 첨가하여 세포를 재현탁하고, BD LSR II 유세포 분석기(HTS)를 사용하여 FACS를 수행하였다. 살상 백분율(CFSE/FVD-AF660 이중 양성 집단을 CFSE 양성 집단으로 나눔)을 사용하여 데이터 분석을 수행하고, Prism GraphPad를 사용하여 플롯을 작성하였다. FACS 기반의 방법에 의해 얻은 ADCC 활성은 4개의 키메라 항체가 CLDN18.2를 발현하는 세포에 대한 ADCC 활성을 매개할 수 있음을 나타낸다(도 4 참조).

실시예 5: Fc 조작된 키메라 항체의 특성화.

또한, 4개의 Fc 조작된 키메라 항체를 구축하였다. 1세대 초기 키메라 항체 YL-G1-19-01, YL-G1-19-02, YL-G1-19-03 및 YL-G1-19-04와 비교하여, 2세대 Fc 조작된 키메라 항체 YL-G2-A, YL-G2-B, YL-G2-C 및 YL-G2-D(YL-G1-19-04와 비교하여, YL-G2-D에서, VH 도메인의 처음 2개의 N 말단 아미노산 잔기는 존재하지 않음)는 Fc 영역에서 5개의 치환, 즉 L235V, F243L, R292P, Y300L 및 P396L(EU 넘버링에 따라)을 포함한다. 인간 IgG1 중쇄의 돌연변이형 불변 영역(CH1, 힌지, CH2 및 CH3 포함)은 서열번호 40으로 표시된다.

본 실시예는 이러한 Fc 조작된 키메라 항체의 특성화를 설명한다.

5.1: 항원-항체 결합 상호작용.

본 실시예는 YL-G2-B, YL-G2-C 및 YL-G2-D의 항원-항체 결합 상호작용의 특성화를 설명한다.

KinExA 4000 시스템(KinExA, 미국)을 사용하여 재조합 huCLDN18.2-Fc 및 huCLDN18.2를 과발현하는 CHO 세포에 대한 결합을 모니터링함으로써 YL-G2-B, YL-G2-C 및 YL-G2-D의 시험관내 생물학적 활성을 분석하였다.

KinExA 방법을 사용하여 친화력을 결정하기 위해, 결합 파트너 A(불변 결합 파트너, CBP라고 함)의 배경 하에 결합 파트너 B(적정제라고 함)의 연속 희석을 수행하였다. 이는 CBP가 불변 농도를 유지하고 적정제의 농도는 변한다는 것을 의미한다. 이러한 용액이 평형에 도달하면 KinExA 4000 기기는 용액에 남아 있는 CBP의 결합되지 않은 또는 유리된 결합 파트너의 양을 직접 측정할 수 있다. Sapidyne의 소프트웨어를 사용하여 결합 곡선을 생성하고 친화력을 결정하기 위해 전체 적정제 농도에 대해 유리 CBP의 백분율을 플롯할 수 있다.

먼저 항체 및 Sino Biological(P/N: 20047-H02H)에서 구입한 재조합 인간 CLDN18.2를 사용하여 Kd를 결정하였다. 평형 실험의 경우, CBP의 배경 하에 적정제(huCLDN18.2)를 5배 연속 희석하였다. 2개의 평형 실험 수행: 하나는 10 nM의 고농도 CBP(20 nM 결합 부위)와 150 nM의 5배 연속 희석된 적정제를 사용하고, 하나는 100 pM의 저농도 CBP(200 pM 결합 부위)와 150 nM의 5배 연속 희석된 적정제를 사용하였다. KinExA 4000에서 데이터를 수집하고, Sapidyne Instruments n-Curve 분석 소프트웨어 버전 4.4.26을 사용하여 분석하였다. 결합 곡선은 도 5에 도시되어 있다.

또한 KinExA 4000 기기를 사용하여 항체와 온전한 세포(즉, huCLDN18.2를 과발현하는 CHO 세포)의 표면 단백질의 결합 친화력을 측정하였다. 항체 농도를 일정하게 유지하고(CBP), 표면 단백질을 갖는 전체 세포의 농도를 변경하였다(적정제). 표면 단백질을 가진 전체 세포의 농도를 3배 희석하였다. 적정 세포를 불변 결합 파트너(CBP)와 함께 배양하였다. 평형에 도달하면 샘플을 원심분리하고 상층액을 회수하며 형광 표지된 항-CBP 분자로 유리 CBP를 검출하였다. 결합 곡선은 도 6에 도시되어 있다.

보다 정확한 Kd를 설정하기 위해 2개의 평형 곡선을 작성하고 분석하였다. 하나의 곡선은 100 pM의 저농도 CBP(200 pM 결합 부위) 및 3배 희석도를 갖는 10⁶개 세포/mL를 사용하고, 하나의 곡선은 10 nM의 고농도 CBP(20 nM 결합 부위) 및 3배 희석도를 갖는 10⁶개 세포/mL를 사용하였다. KinExA 4000으로 용액에서 결합되지 않은 CBP의 양을 측정하였다. Sapidyne Instruments n-Curve 분석 소프트웨어 버전 4.4.26을 사용하여 분석하였다. 평형 해리 상수 Kd는 표 1에 요약되어 있다.

표 1. YL-G2-B, YL-G2-C 및 YL-G2-D의 Kd 값

ID	재조합 huCLDN18.2-Fc에 대한 결합(nM)	huCLDN18.2를 과발현하는 CHO 세포에 대한 결합(pM)
YL-G2-B	1.7	9.4
YL-G2-C	3.8	38.6
YL-G2-D	6.4	13.1

5.2: 세포 결합 측정.

본 실시예는 YL-G2-B, YL-G2-C 및 YL-G2-D의 세포 결합 측정을 설명한다.

huCLDN18.2를 발현하는 CHO 세포를 사용하여 항체의 결합을 평가하였다. 각 샘플의 경우, 세포를 5 x 10⁵개 세포/100 μl로 96웰 플레이트에 접종하였다. 그런 다음, 연속 희석된 각 항체 100 μl를 세포에 첨가하고, 각 희석액은 40 μg/ml에서 시작하고 5배 희석하였다. 따라서, 각 항체의 최종 농도는 20 μg/ml에서 시작한 다음 5배 연속 희석하였다. 1시간 후, 세포를 2회 세척하고 100 μl의 GAH-FITC(1:200 희석도)를 각 웰에 첨가하였다. 30분 후, 세포를 2회 세척하고 120 μl의 FACS 완충액에 재현탁하였다. 유세포 분석에 의해 세포를 분석하였다.

염색되지 않은 세포를 전체 표적 세포 게이트를 설정하고 FITC 음성 집단을 설정하기 위한 기준으로 사용하여 각 세포주에 대한 FITC 양성 세포 게이트를 설정할 수 있었다. 또한, 전체 세포 집단의 평균 형광 강도(MFI)를 계산하여 FITC 양성 결과를 2차 입증하였다. 게이트된 양성 세포의 수와 살아 있는 세포의 총 수의 비율을 양성 세포의 백분율로 고려하였다. 결과는 도 7에 도시되어 있다.

5.3: 보체 의존적 세포 독성(CDC) 측정.

본 실시예는 YL-G2-B, YL-G2-C 및 YL-G2-D의 보체 의존적 세포 독성(CDC) 측정을 설명한다.

표적 세포(즉, huCLDN18.2를 발현하는 CHO 세포)를 DPBS로 1회 세척하였다. 그런 다음 세포를 2 x 10⁴개 세포, 100 μL/웰로 U 바닥 플레이트의 RPMI에 접종하였다. 항체를 1:2로 연속 희석하고, 실온에서 50 μl/웰로 세포와 함께 15분 동안 배양하였다. 그런 다음 20% 풀링된 혈청을 50 μl/웰로 자발적 방출 웰 및 최대 방출 웰을 포함하는 모든 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 하에 인큐베이터에서 3.5시간 동안 배양하였다. 배양 종료 45분 전에 플레이트를 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 20 μL의 용해 완충액(CyQUANT™ LDH 세포 독성 측정 키트, 카탈로그 번호 C20300 및 C20301)을 표적 세포를 포함하는 최대 방출 대조 웰에만 첨가하였다. 50 μL의 상층액을 50 μL/웰의 반응 완충액과 함께 흑색벽 96웰 플레이트에 옮기며, 상기 반응 완충액을 모든 웰(최대 방출 웰 및 자발적 방출 웰에도 첨가함)에 첨가하였다. 플레이트를 암실에서 30분 동안 배양하였다. 배양 종료 시, 50 μL의 정지 용액(CyQUANT™ LDH 세포 독성 측정 키트, 카탈로그 번호 C20300 및 C20301)을 모든 웰에 첨가하고, 가볍게 두드려 혼합하였다. 490 nm 및 680 nm에서 OD를 측정하였다. 활성은 세포 독성 백분율: % 세포 독성 = (실험값 - 표적 세포 자발적 방출, 부피 보정 없음) / (표적 세포 최대 방출 - 표적 세포 자발적 방출, 부피 보정) * 100이다. 결과는 도 8에 도시되어 있다.

5.4: 인터널리제이션 측정.

본 실시예는 YL-G2-B, YL-G2-C 및 YL-G2-D의 인터널리제이션 측정을 설명한다.

DMEM 배지에서 5 x 10⁵/mL로 huCLDN18.2를 발현하는 CHO 세포를 제조하였다. U 바닥 96웰 플레이트의 각 웰에 100 μL의 세포를 접종하였다. 테스트 항체 및 대조 항체를 40 μg/ml로 희석한 다음, 배지에서 각 항체를 1:4로 연속 희석하였다. 각 희석된 항체를 50 μl/웰로 세포에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 그런 다음, 40 μg/ml의 PEP-ZAP(세포 독성 펩티드에 융합된 작은 Fc 결합 펩티드, AB Studio Inc.에서 개발; WO 2020/018732 A1 참조)를 50 μl/웰로 각웰에 첨가하여 PEP-ZAP의 최종 농도가 10 μg/ml이 되도록 하였다. 플레이트를 37℃에서 72시간 동안 배양하였다. 마지막으로, 세포를 회전시키고 LDH 측정을 위해 100 μl의 상층액을 취했다. 결과는 도 9에 도시되어 있다.

5.5: 항체 의존적 세포 매개 세포 독성(ADCC) 측정.

본 실시예는 항체 의존적 세포 매개 세포 독성(ADCC) 측정을 설명한다.

표적 세포(huCLDN18.2를 발현하는 CHO 세포) 및 이펙터 세포(NK 8837-F 세포, ATCC PTA-8837)를 사용하여 항체의 ADCC 기능을 평가하였다. 각 샘플의 경우, 표적 세포를 2 x 10⁴개 세포/50 μl로 96웰 플레이트의 웰의 DMEM-F12 + 10% FBS 배지에 접종하였다. 그런 다음, 1:10로 연속 희석된 각 항체 100 μl를 세포에 첨가하였다. 20분 후, NK 세포를 2 x 10⁵개 세포/50 μl로 플레이트에 첨가하고, 표적:이펙터 비율이 1:10이 되도록 하였다. 첨가 후, 각 항체의 얻은 최종 농도는 50 μg/ml에서 시작한 다음 5, 0.5 및 0.05 μg/ml였다. 플레이트를 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 방치하였다. 그런 다음, 세포를 7AAD로 염색하고 2회 세척하며, 약 200 μl의 FACS 완충액에 재현탁하였다. 유세포 분석법에 의해 세포를 분석하였다.

염색되지 않은 세포를 전체 표적 세포 게이트를 설정하고 7AAD 음성 집단을 설정하기 위한 기준으로 사용하여 7AAD(죽은 세포)와 살아 있는 세포를 구별할 수 있었다.

huCLDN18.2를 발현하는 CT26 세포를 표적 세포로 사용할 수도 있고 LDH에 의해 ADCC를 결정할 수도 있다.

YL-G1-02와 YL-G2-B(Fc 영역 중의 VLPLL 치환을 제외하고, 동일한 아미노산 서열을 가짐) 사이의 ADCC 활성의 비교는 도 10에 도시되어 있다. EC₅₀은 표 2에 요약되어 있다.

표 2. YL-G2-B와 비교한 YL-G1-02의 ADCC

ID	LDH		FACS
ID	EC₅₀(nM)	Max(%)	EC₅₀(nM)	Max(%)
YL-G1-02	0.30	29.8	~0.2244	32.0
YL-G2-B	0.012	55.1	0.0073	44.1
동종형	NA	1.5	NA	8.3

실시예 6: 항체의 기능적 특성화.

6.1: 세포

10% FBS(ExCell Bio, 카탈로그 번호 FND500)를 포함하는 DMEM 배지(Gibco, 카탈로그 번호 31053-036)에서 유지되는 CT26 CLDN18.2 세포(마우스 결장암 세포, Kyinno biotechnology, 카탈로그 번호 KC-1195), 10% FBS를 포함하는 RPMI1640 배지(Gibco, 카탈로그 번호 22400-089)에서 유지되는 KATOIII CLDN18.2 세포(인간 위암 세포, Kyinno biotechnology, 카탈로그 번호 KC-1453) 및 10% FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 유지되는 NCI-N87 CLDN18.2 세포(인간 위암 세포, Kyinno biotechnology, 카탈로그 번호 KC-1222)는 모두 인간 CLDN18.2를 과발현하는 종양 세포이고, 이들을 사용하여 주제 항체의 CDC 활성 및 ADCC 활성을 결정하였다.

6.2: CDC 측정

세포 용해 후 배지에 방출된 LDH 수준의 변화를 측정하여 주제 항체의 CDC 활성을 평가하였다. CT26 CLDN18.2 세포 또는 KATOIII CLDN18.2 세포를 각각 4E+05개 세포/ml 또는 6E+05개 세포/ml 또는 1E+06개 세포/ml의 밀도로 1% FBS를 포함하고 페놀 레드를 포함하지 않는 RPMI 1640 배지(Gibco, 카탈로그 번호 11835-030)에 재현탁하였다. 주제 항체를 1% FBS를 포함하고 페놀 레드를 포함하지 않는 RPMI 1640 배지로 200, 50, 12.5, 3.13, 0.78, 0.195, 0.0488, 0.0122, 0.00305, 0.000763 및 0.000191 nM로 희석하였다. 정상 인간 혈청 보체(Quidel, 카탈로그 번호 A113)를 1% FBS를 포함하고 페놀 레드를 포함하지 않는 RPMI 1640 배지로 1:50로 희석하였다. 둥근 바닥 96웰 마이크로플레이트(Corning, 카탈로그 번호 3799)의 각 웰에 50 μL의 항체 희석액, 50 μL의 정상 인간 혈청 보체 희석액 및 50 μL의 종양 세포 현탁액을 첨가하였다. 인간 IgG1 동종형 항체를 음성 대조군으로 포함하였다. 참조 항체(IMAB362, Ganymed)를 양성 대조군으로 포함하였다. 마이크로플레이트를 37℃ 및 5% CO₂로 설정된 인큐베이터에서 3-4시간 동안 배양하였다. 배양 후, LDH 세포 독성 측정 키트(Roche, 카탈로그 번호 11644793001)와 함께 제공된 지침에 따라 세포 배양물의 상층액으로의 LDH의 방출을 검출하였다. 간단히 말해서, 마이크로플레이트(Eppendorf, 모델 5810R)를 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 각 웰에서 70 μL의 상층액을 취한 다음 새로운 마이크로플레이트의 웰에 옮겼다. 그런 다음, 50 μL의 LDH 검출 기질을 각 웰에 첨가하고, 마이크로플레이트를 실온에서 0.5-2시간 동안 배양하였다. SpectraMax M5e(Molecular Devices LLC)를 사용하여 492 nm에서의 광학 밀도(OD)를 검출하고, 690 nm에서의 광학 밀도를 뺐다(OD_{492 nm} - OD_{690 nm}). 하기 공식의 특이적 세포 용해 백분율을 사용하여 주제 항체의 CDC 활성을 계산하였다.

특이적 세포 용해(%) = (OD_{항체+보체+종양 세포} - OD_{보체+종양 세포}) * 100 / (OD_{종양 세포+Triton} - OD_{종양 세포}).

GraphPad Prism 7 소프트웨어를 사용하여 4 파라미터 비선형 회귀를 통해 데이터를 분석하고 EC₅₀ 값을 계산하여 얻었다.

6.3: ADCC 측정

세포 용해 후 배지에 방출된 LDH 수준의 변화를 측정하여 주제 항체의 ADCC 활성을 평가하였다. NCI-N87 CLDN18.2 세포 또는 KATOIII CLDN18.2 세포를 6E+05개 세포/mL의 밀도로 페놀 레드를 포함하지 않는 RPMI 1640 배지에 재현탁하였다. 주제 항체를 1% FBS를 포함하고 페놀 레드를 포함하지 않는 RPMI 1640 배지로 20, 4, 0.8, 0.16, 0.032, 0.0064, 1.28E-03, 2.56E-04, 5.12E-05, 1.02E-05, 2.05E-06, 4.10E-07, 8.19E-08, 1.64E-08, 3.28E-09, 6.55E-10, 1.31E-10, 2.62E-11 및 5.24E-12 nM로 희석하였다. 신선한 인간 PBMC 세포(Saily, 지원자 #XC11057W)를 1.2E+07개 세포/mL의 밀도로 1% FBS를 포함하고 페놀 레드를 포함하지 않는 RPMI 1640 배지에 재현탁하였다. 둥근 바닥 96웰 마이크로플레이트의 각 웰에 50 μL의 항체 희석액, 50 μL의 인간 PBMC 세포 현탁액 및 50 μL의 종양 세포 현탁액을 첨가하였다. 인간 IgG1 동종형을 음성 대조군으로 포함하였다. 참조 mAb(IMAB362, Ganymed)를 양성 대조군으로 포함하였다. 마이크로플레이트를 37℃ 및 5% CO₂로 설정된 인큐베이터에서 4-6시간 동안 배양하였다. 배양 후, 상술한 LDH 세포 독성 측정 키트와 함께 제공된 지침에 따라 세포 배양물의 상층액으로의 LDH의 방출을 검출하였다. 하기 공식의 특이적 세포 용해 백분율을 사용하여 주제 항체의 ADCC 활성을 계산하였다.

특이적 세포 용해(%) = (OD_{항체+PBMC+종양 세포} - OD_{PBMC+종양 세포}) * 100 / (OD_{종양 세포+Triton} - OD_{종양 세포}).

6.4: LDH 측정에 의해 얻은 CT26 CLDN18.2 세포에 대한 CDC 효과

도 11 및 표 3에 나타낸 바와 같이, YL-G2-B의 두 배치는 비교 가능한 CT26 CLDN18.2 세포에 대한 CDC 효과를 나타냈다(도 11의 A). YL-G1-19-02, YL-G2-B, YL-G1-19-03, YL-G2-C, YL-G1-19-04 및 YL-G2-D는 모두 양성 대조군보다 더 강한 CT26 CLDN18.2 세포에 대한 CDC 효과를 나타냈다(도 11).

표 3: CT26 CLDN18.2 세포에 대한 CDC 효과

항체	농도 (mg/mL)	순도 (%)	CT26 CLDN18.2
항체	농도 (mg/mL)	순도 (%)	EC₅₀(nM)	max(% 세포 독성)
양성 대조군 실행 A	20.63	96.80%	~11.54	72.52
YL-G1-19-02	0.74	97.30%	0.26	73.44
YL-G2-B 배치 1	18.96	97.90%	0.14	75.99
YL-G2-B 배치 2	50	98.70%	0.12	74.74
hIgG1_동종형 실행 A	13.6	99.40%	NA	10.80
양성 대조군 실행 B	20.63	96.80%	~10.70	54.74
YL-G1-19-03	10.73	96.00%	0.24	62.21
YL-G2-C	5.55	93.22%	0.10	65.24
hIgG1_동종형 실행 B	13.6	99.40%	NA	-0.23
양성 대조군 실행 C	20.63	96.80%	~11.86	51.65
YL-G1-19-04	9.03	98.00%	0.19	59.21
YL-G2-D	4.37	98.01%	0.12	71.85
hIgG1_동종형 실행 C	13.6	99.40%	NA	-0.38

6.5: LDH 측정에 의해 얻은 KATOIII CLDN18.2 세포에 대한 CDC 효과

도 12 및 표 4에 나타낸 바와 같이, YL-G2-B의 두 배치는 비교 가능한 CT26 CLDN18.2 세포에 대한 CDC 효과를 나타냈다(도 12의 A). YL-G1-19-02, YL-G2-B, YL-G1-19-03, YL-G2-C, YL-G1-19-04 및 YL-G2-D는 모두 양성 대조군, 양성 대조군보다 더 강한 KATOIII CLDN18.2 세포에 대한 CDC 효과를 나타냈다(도 12).

표 4: KATOIII CLDN18.2 세포에 대한 CDC 효과

항체	농도 (mg/mL)	순도 (%)	KATOIII CLDN18.2
항체	농도 (mg/mL)	순도 (%)	EC₅₀(nM)	max(% 세포 독성)
양성 대조군 실행 A	20.63	96.80%	~38.08	29.71
YL-G1-19-02	0.74	97.30%	1.95	35.43
YL-G2-B 배치 1	18.96	97.90%	1.24	39.65
YL-G2-B 배치 2	50	98.70%	1.33	39.42
hIgG1_동종형 실행 A	13.6	99.40%	NA	-0.85
양성 대조군 실행 B	20.63	96.80%	~22.73	45.96
YL-G1-19-03	10.73	96.00%	~4.98	67.00
YL-G2-C	5.55	93.22%	~6.04	74.56
hIgG1_동종형 실행 B	13.6	99.40%	NA	-2.46
양성 대조군 실행 C	20.63	96.80%	~27.48	34.89
YL-G1-19-04	9.03	98.00%	4.76	48.32
YL-G2-D	4.37	98.01%	2.40	49.19
hIgG1_동종형 실행 C	13.6	99.40%	NA	-1.53

6.6: LDH 측정에 의해 얻은 KATOIII CLDN18.2 세포에 대한 ADCC 효과

도 13 및 표 5에 나타낸 바와 같이, YL-G2-B의 두 배치는 비교 가능한 KATOIII CLDN18.2 세포에 대한 ADCC 효과를 나타냈다(도 13의 A). 양성 대조군(3회 실행된 EC₅₀ = 0.12 nM, 0.22 nM 또는 0.27 nM)과 비교하여, YL-G2-B(상이한 배치의 EC₅₀ = 0.028 nM 또는 0.018 nM), YL-G2-C(EC₅₀ = 0.019 nM) 및 YL-G2-D(EC₅₀ = 0.021 nM)는 더 강한 KATOIII CLDN18.2 세포에 대한 ADCC 효과(더 낮은 EC₅₀)를 나타내고, YL-G1-19-02(EC₅₀ = 0.16 nM), YL-G1-19-03(EC₅₀ = 0.21 nM) 및 YL-G1-19-04(EC₅₀ = 0.14 nM)는 비교 가능한 KATOIII CLDN18.2 세포에 대한 ADCC 효과를 나타냈다(도 13).

표 5: KATOIII CLDN18.2 세포에 대한 ADCC 효과

항체	농도 (mg/mL)	순도 (%)	KATOIII CLDN18.2
항체	농도 (mg/mL)	순도 (%)	EC₅₀(nM)	max(% 세포 독성)
양성 대조군 실행 A	20.63	96.80%	0.12	27.89
YL-G1-19-02	0.74	97.30%	0.16	19.90
YL-G2-B 배치 1	18.96	97.90%	0.028	19.90
YL-G2-B 배치 2	50	98.70%	0.018	15.78
hIgG1_동종형 실행 A	13.6	99.40%	NA	0.3
양성 대조군 실행 B	20.63	96.80%	0.22	24.46
YL-G1-19-03	10.73	96.00%	0.21	16.72
YL-G2-C	5.55	93.22%	0.019	17.57
hIgG1_동종형 실행 B	13.6	99.40%	NA	-5.51
양성 대조군 실행 C	20.63	96.80%	0.27	24.54
YL-G1-19-04	9.03	98.00%	0.14	15.44
YL-G2-D	4.37	98.01%	0.021	18.42
hIgG1_동종형 실행 C	13.6	99.40%	NA	-7.64

6.7: LDH 측정에 의해 얻은 NCI-N87 CLDN18.2 세포에 대한 ADCC 효과

도 14 및 표 6에 나타낸 바와 같이, YL-G2-B의 두 배치는 비교 가능한 NCI-N87 CLDN18.2 세포에 대한 ADCC 효과를 나타냈다(도 14의 A). 양성 대조군(3회 실행된 EC₅₀ = 0.057 nM, 0.082 nM 또는 0.10 nM)과 비교하여, YL-G2-B(상이한 배치의 EC₅₀ = 0.0067 nM 또는 0.012 nM), YL-G2-C(EC₅₀ = 0.0078 nM) 및 YL-G2-D(EC₅₀ = 0.0089 nM)는 더 강한 KATOIII CLDN18.2 세포에 대한 ADCC 효과(더 낮은 EC₅₀)를 나타내고, YL-G1-19-02(EC₅₀ = 0.072 nM), YL-G1-19-03(EC₅₀ = 0.13 nM) 및 YL-G1-19-04(EC₅₀ = 0.067 nM)는 비교 가능한 KATOIII CLDN18.2 세포에 대한 ADCC 효과를 나타냈다(도 14).

표 6: NCI-N87 CLDN18.2 세포에 대한 ADCC 효과

항체	농도 (mg/mL)	순도 (%)	NCI-N87 CLDN18.2
항체	농도 (mg/mL)	순도 (%)	EC₅₀(nM)	max(% 세포 독성)
양성 대조군 실행 A	20.63	96.80%	0.057	26.05
YL-G1-19-02	0.74	97.30%	0.072	16.80
YL-G2-B 배치 1	18.96	97.90%	0.0067	19.04
YL-G2-B 배치 2	50	98.70%	0.012	21.05
hIgG1_동종형 실행 A	13.6	99.40%	NA	-6.73
양성 대조군 실행 B	20.63	96.80%	0.082	22.06
YL-G1-19-03	10.73	96.00%	0.13	15.21
YL-G2-C	5.55	93.22%	0.0078	14.93
hIgG1_동종형 실행 B	13.6	99.40%	NA	-11.72
양성 대조군 실행 C	20.63	96.80%	0.10	21.11
YL-G1-19-04	9.03	98.00%	0.067	12.59
YL-G2-D	4.37	98.01%	0.0089	18.60
hIgG1_동종형 실행 C	13.6	99.40%	NA	-9.22

6.8: SPR

USP 43 면역학적 테스트 방법 -- 표면 플라즈몬 공명<1105>(USP 43 IMMUNOLOGICAL TEST METHODS -- SURFACE PLASMON RESONANCE <1105>) 및 CP, 2020 에디션, 파트 IV, 일반 원칙, 3429 면역화학, 비표지 면역화학 방법(IV) 표면 플라즈몬 공명(CP, 2020 edition, Part IV, General Rules, 3429 IMMUNOCHEMISTRY, NON-LABELING IMMUNOCHEMICAL METHODS (IV) SURFACE PLASMON RESONANCE)에 따라 SPR에 의해 인간 항체 포획 키트 타입 2(Cytiva, 카탈로그 번호 29234600)를 사용하여 주제 항체의 결합 친화력을 결정하였다. 간단히 말해서, 항-인간 IgG(Fc) 항체를 고정화 완충액으로 25 μg/mL로 희석하고, 10 μL/분의 유속으로 S 시리즈 센서 CM5 칩(Cytiva, 카탈로그 번호 BR100530)에 6분 동안 주입하여 약 7000-14000 반응 단위(RU)의 접합된 2차 항체를 달성하였다. 그런 다음, 주제 항체를 실행 완충액으로 5 μg/mL로 희석하고, 10 μL/분의 유속으로 주입하여 약 200 RU의 접합된 1차 항체를 달성하였다. 동역학 측정의 경우, 30 μL/분의 유속으로 His 태그된 인간 클라우딘 18.2의 2배 연속 희석액(0.195-50 nM)을 주입하고, Biacore 8K(Cytiva)에서 결합을 위해 120초 동안, 해리를 위해 300초 동안 결합을 모니터링하였다. 간단한 일대일 결합 모델을 사용하여 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 결합률(ka) 및 해리율(kd)을 계산하였다. 평형 해리 상수 (K_D)는 비율 kd/ka로 계산되었다. 결과는 하기 표 7에 나타내어 있다.

서열목록

서열번호	기술	서열
1	YL-G1-19-01 VH	QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWVKQRPGQGLEWIGVINPGSGGTNYNEKFKGKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVYYGNSFGYWGQGTLVTVSA
2	YL-G1-19-01 VL	DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNEYFYPFTFGSGTKLEIK
3	YL-G1-19-02 VH	EVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYKMNWVKQSNGKSLEWIGNIDPYYGGTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYYCARYGKGNTMDYWGQGTSVTVSS
4	YL-G1-19-02 VL	DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQRPGQPPKLLIYWASTRESGVPVRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNAYIYPLTFGTGTKLELK
5	YL-G1-19-03 VH	QIQLVQSGPELRKPGETVKISCKASGFPFTTDGMSWVKQAPGKGLKWMGWINTYSGVPTYADDFKGRVAFSLETSASTAYLQIKNLKNEDTATYFCARFRRGNALDNWGQGTSVTVSS
6	YL-G1-19-03 VL	DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYYCQNNYFYPLTFGAGTRLELK
7	YL-G1-19-04 VH	EVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYKMNWVKQSNGESLEWIGNIDPYYGDTTYTQKFKGKATFTVDTSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYFCARYNRGNTMDYWGQGTSVTVSS
8	YL-G1-19-04 VL	DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTLSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQRPGQPPKLLIYWASTRESGVPVRFTGSGSGADFTLTISSVQAEDLAVYFCQNAYFYPLTFGTGTKLELR
9	인간 IgG1 CH	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
10	인간 κ CL	RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
11	YL-G1-19-01 HVR-H1	GYAFTNYL
12	YL-G1-19-01 HVR-H2	INPGSGGT
13	YL-G1-19-01 HVR-H3	ARVYYGNSFGY
14	YL-G1-19-01 HVR-L1	QSLLNSGNQKNY
15	YL-G1-19-01 HVR-L2	WAS
16	YL-G1-19-01 HVR-L3	QNEYFYPFT
17	YL-G1-19-02 HVR-H1	GYSFTGYK
18	YL-G1-19-02 HVR-H2	IDPYYGGT
19	YL-G1-19-02 HVR-H3	ARYGKGNTMDY
20	YL-G1-19-02 HVR-L1	QSLLNSGNQKNY
21	YL-G1-19-02 HVR-L2	WAS
22	YL-G1-19-02 HVR-L3	QNAYIYPLT
23	YL-G1-19-03 HVR-H1 IMGT	GFPFTTDG
24	YL-G1-19-03 HVR-H2 IMGT	INTYSGVP
25	YL-G1-19-03 HVR-H3 IMGT	ARFRRGNALDN
26	YL-G1-19-03 HVR-L1 IMGT	QSLLNSGNQKNY
27	YL-G1-19-03 HVR-L2 IMGT	WAS
28	YL-G1-19-03 HVR-L3 IMGT	QNNYFYPLT
29	YL-G1-19-04 HVR-H1	GYSFTGYK
30	YL-G1-19-04 HVR-H2	IDPYYGDT
31	YL-G1-19-04 HVR-H3	ARYNRGNTMDY
32	YL-G1-19-04 HVR-L1	QSLLNSGNQKNY
33	YL-G1-19-04 HVR-L2	WAS
34	YL-G1-19-04 HVR-L3	QNAYFYPLT
35	IgG1 3' 불변 프라이머	GATTACGCCAAGCTTTCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGCTC
36	IgG2a 3' 불변 프라이머	GATTACGCCAAGCTTTCATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAGCTC
37	κ 3' 불변 프라이머	GATTACGCCAAGCTTTCAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG
38	huCLDN18.2(261 aa)	MAVTACQGLG FVVSLIGIAG IIAATCMDQW STQDLYNNPV TAVFNYQGLWRSCVRESSGF TECRGYFTLL GLPAMLQAVR ALMIVGIVLG AIGLLVSIFA LKCIRIGSME DSAKANMTLT SGIMFIVSGL CAIAGVSVFA NMLVTNFWMS TANMYTGMGG MVQTVQTRYT FGAALFVGWV AGGLTLIGGV MMCIACRGLA PEETNYKAVS YHASGHSVAY KPGGFKASTG FGSNTKNKKI YDGGARTEDE VQSYPSKHDY V
39	huCLDN18.1(261 aa)	MSTTTCQVVA FLLSILGLAG CIAATGMDMW STQDLYDNPV TSVFQYEGLWRSCVRQSSGF TECRPYFTIL GLPAMLQAVR ALMIVGIVLG AIGLLVSIFA LKCIRIGSME DSAKANMTLT SGIMFIVSGL CAIAGVSVFA NMLVTNFWMS TANMYTGMGG MVQTVQTRYT FGAALFVGWV AGGLTLIGGV MMCIACRGLA PEETNYKAVS YHASGHSVAY KPGGFKASTG FGSNTKNKKI YDGGARTEDE VQSYPSKHDY V
40	돌연변이형 인간 IgG1 CH	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELVGG PSVFLLPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYN STLRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPLVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
41	YL-G1-19-03 HVR-H1 Kabat	TDGMS
42	YL-G1-19-03 HVR-H2 Kabat	WINTYSGVPTYADDFKG
43	YL-G1-19-03 HVR-H3 Kabat	FRRGNALDN
44	YL-G1-19-03 HVR-L1 Kabat	KSSQSLLNSGNQKNYLT
45	YL-G1-19-03 HVR-L2 Kabat	WASTRES
46	YL-G1-19-03 HVR-L3 Kabat	QNNYFYPLT
47	YL-G1-19-03 HVR-H1 Chothia	GFPFTTD
48	YL-G1-19-03 HVR-H2 Chothia	NTYSGV
49	YL-G1-19-03 HVR-H3 Chothia	FRRGNALDN
50	YL-G1-19-03 HVR-L1 Chothia	KSSQSLLNSGNQKNYLT
51	YL-G1-19-03 HVR-L2 Chothia	WASTRES
52	YL-G1-19-03 HVR-L3 Chothia	QNNYFYPLT
53	YL-G1-19-03 HVR-H1 Contact	TTDGMS
54	YL-G1-19-03 HVR-H2 Contact	WMGWINTYSGVPT
55	YL-G1-19-03 HVR-H3 Contact	ARFRRGNALD
56	YL-G1-19-03 HVR-L1 Contact	LNSGNQKNYLTWY
57	YL-G1-19-03 HVR-L2 Contact	LLIYWASTRE
58	YL-G1-19-03 HVR-L3 Contact	QNNYFYPL

SEQUENCE LISTING <110> SHIJIAZHUANG YILING PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> Monoclonal Antibodies against CLDN18.2 and Fc-engineered Versions thereof <130> F21W0941PCTC <160> 58 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 2 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 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Arg Tyr Gly Lys Gly Asn Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Val Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Ala Tyr Ile Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 5 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Pro Phe Thr Thr Asp 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Lys Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Arg Arg Gly Asn Ala Leu Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asn Tyr Phe Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 7 <211> 118 <212> PRT 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Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr Leu 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr 1 5 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 Ala Arg Val Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Gly Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 15 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 Trp Ala Ser 1 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 Gln Asn Glu Tyr Phe Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Lys 1 5 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr 1 5 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 19 Ala Arg Tyr Gly Lys Gly Asn Thr Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 21 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 21 Trp Ala Ser 1 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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5 <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 30 Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Asp Thr 1 5 <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 31 Ala Arg Tyr Asn Arg Gly Asn Thr Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 33 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 33 Trp Ala Ser 1 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 Gln Asn Ala Tyr Phe Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 35 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 35 gattacgcca agctttcatt taccaggaga gtgggagagg ctc 43 <210> 36 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 gattacgcca agctttcatt tacccggagt ccgggagaag ctc 43 <210> 37 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 37 gattacgcca agctttcaac actcattcct gttgaagctc ttg 43 <210> 38 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 38 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 39 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 39 Met Ser Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu 1 5 10 15 Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Glu Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 40 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 40 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Val Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Leu Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 41 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 41 Thr Asp Gly Met Ser 1 5 <210> 42 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 42 Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 43 Phe Arg Arg Gly Asn Ala Leu Asp Asn 1 5 <210> 44 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 44 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Thr <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 45 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 46 Gln Asn Asn Tyr Phe Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 47 Gly Phe Pro Phe Thr Thr Asp 1 5 <210> 48 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 48 Asn Thr Tyr Ser Gly Val 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 49 Phe Arg Arg Gly Asn Ala Leu Asp Asn 1 5 <210> 50 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 50 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Thr <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 51 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 52 Gln Asn Asn Tyr Phe Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 53 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 53 Thr Thr Asp Gly Met Ser 1 5 <210> 54 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 54 Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr 1 5 10 <210> 55 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 55 Ala Arg Phe Arg Arg Gly Asn Ala Leu Asp 1 5 10 <210> 56 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 56 Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr 1 5 10 <210> 57 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 57 Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu 1 5 10 <210> 58 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 58 Gln Asn Asn Tyr Phe Tyr Pro Leu 1 5

Claims

CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 단클론 항체로서,
상기 단클론 항체는,
서열번호 5으로 표시되는 VH에 포함된 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3, 및 서열번호 6로 표시되는 VL에 포함된 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 단클론 항체.
제1항에 있어서,
상기 단클론 항체는,
(1) 서열번호 23로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 24로 표시되는 HVR-H2, 서열번호 25로 표시되는 HVR-H3, 서열번호 26으로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 27로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 28로 표시되는 HVR-L3;
(2) 서열번호 40으로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 41로 표시되는 HVR-H2, 서열번호 42로 표시되는 HVR-H3, 서열번호 43으로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 44로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 45로 표시되는 HVR-L3;
(3) 서열번호 46으로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 47로 표시되는 HVR-H2, 서열번호 48로 표시되는 HVR-H3, 서열번호 49로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 50으로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 51로 표시되는 HVR-L3; 또는
(4) 서열번호 52로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 53으로 표시되는 HVR-H2, 서열번호 54로 표시되는 HVR-H3, 서열번호 55로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 56으로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 57로 표시되는 HVR-L3을 포함하는 단클론 항체.
제1항에 있어서,
상기 단클론 항체는,
서열번호 5으로 표시되는 VH 및 서열번호 6로 표시되는 VL을 포함하는 단클론 항체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단클론 항체는 뮤린 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체인 단클론 항체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단클론 항체는 전장 항체인 단클론 항체.
제5항에 있어서,
상기 단클론 항체는 선택적으로 서열번호 9로 표시되는 인간 IgG, 특히 IgG1 중쇄 불변 영역 및/또는 선택적으로 서열번호 10으로 표시되는 인간 κ 경쇄 불변 영역을 포함하는 단클론 항체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단클론 항체는 선택적으로 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, scFv 단편 및 디아바디로부터 선택되는 항원 결합 항체 단편인 단클론 항체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단클론 항체는 분리, 나출 및/또는 접합된 것인 단클론 항체.
CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 Fc 조작된 단클론 항체로서,
서열번호 5으로 표시되는 VH에 포함된 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3, 및 서열번호 6로 표시되는 VL에 포함된 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하고,
Fc 영역 중 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 단클론 항체.
제9항에 있어서,
상기 단클론 항체는,
(1) 서열번호 23로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 24로 표시되는 HVR-H2, 서열번호 25로 표시되는 HVR-H3, 서열번호 26으로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 27로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 28로 표시되는 HVR-L3;
(2) 서열번호 41로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 42로 표시되는 HVR-H2, 서열번호 43으로 표시되는 HVR-H3, 서열번호 44로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 45로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 46으로 표시되는 HVR-L3;
(3) 서열번호 47로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 48로 표시되는 HVR-H2, 서열번호 49로 표시되는 HVR-H3, 서열번호 50으로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 51로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 52로 표시되는 HVR-L3; 또는
(4) 서열번호 53으로 표시되는 HVR-H1, 서열번호 54로 표시되는 HVR-H2, 서열번호 55로 표시되는 HVR-H3, 서열번호 56으로 표시되는 HVR-L1, 서열번호 57로 표시되는 HVR-L2 및 서열번호 58로 표시되는 HVR-L3을 포함하는 단클론 항체.
제9항에 있어서,
상기 단클론 항체는,
서열번호 5으로 표시되는 VH 및 서열번호 6로 표시되는 VL을 포함하고,
선택적으로, 상기 VH의 처음 2개의 N 말단 아미노산 잔기는 존재하지 않는 단클론 항체.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단클론 항체는 키메라 항체 또는 인간화 항체인 단클론 항체.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Fc 영역 중 상기 하나 이상의 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 이펙터 기능, 예를 들어 ADCC 및/또는 CDC를 변형, 예를 들어 증가 또는 감소시키는 하나 이상의 돌연변이인 단클론 항체.
제13항에 있어서,
상기 Fc 영역 중 상기 하나 이상의 돌연변이는 L235V, F243L, R292P, Y300L 및 P396L로부터 선택되는 하나 이상의 치환인 단클론 항체.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단클론 항체는,
선택적으로 서열번호 40으로 표시되는 인간 IgG, 특히 IgG1 중쇄 불변 영역, 및/또는
선택적으로 서열번호 10으로 표시되는 인간 κ 경쇄 불변 영역을 포함하는 단클론 항체.
제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단클론 항체는 분리, 나출 및/또는 접합된 것인 단클론 항체.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 단클론 항체를 인코딩하는 분리된 핵산.
제17항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
제17항에 따른 핵산 또는 제18항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 단클론 항체의 생산 방법으로서,
상기 방법은 제19항에 따른 숙주 세포를 배양하여 상기 항체를 생산하고, 선택적으로 상기 숙주 세포 또는 상기 세포 배양물로부터 상기 항체를 회수하는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 단클론 항체를 포함하는 조성물.