JP2024521885A - ＣＬＤＮ１８．２に対するモノクローナル抗体及びそのＦｃ改変されたバージョン - Google Patents
ＣＬＤＮ１８．２に対するモノクローナル抗体及びそのＦｃ改変されたバージョン Download PDFInfo
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Abstract
任意に改変されたＦｃ領域を有してもよく、ＣＬＤＮ１８.２に特異的に結合し、ＣＬ
ＤＮ１８.１に特異的に結合しないモノクローナル抗体パネルを提供する。
ＤＮ１８.１に特異的に結合しないモノクローナル抗体パネルを提供する。
Description
本出願は、２０２１年５月３１日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０９７２３９、ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０９７２４０号、および２０２１年７月１６日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／１０６７８３、ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／１０６７８４号の優先権を主張するものであり、それらの内容は参照により本明細書に組み込まれている。
任意に改変されたＦｃ領域を有してもよく、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合し、ＣＬＤＮ１８．１に特異的に結合しない抗体パネルを提供する。
密着結合分子クローディン１８スプライスバリアント２（クローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２））は、密着結合タンパク質のクローディンファミリーのメンバーである。ＣＬＤＮ１８．２は、２つの小さな細胞外ループを有する４つの膜貫通ドメインを含む２７．８ｋＤａの膜貫通タンパク質である。
正常組織では、胃を除いて、ＲＴ－ＰＣＲによって検出可能なＣＬＤＮ１８．２の発現はない。ＣＬＤＮ１８．２特異抗体による免疫組織化学は、胃が唯一の陽性組織であることを明らかにする。
ＣＬＤＮ１８．２は、もっぱら短命の分化胃上皮細胞で発現される、高度に選択的な胃系列抗原である。ＣＬＤＮ１８．２は、悪性形質転換の過程において維持されており、したがって、ヒト胃ガン細胞の表面にしばしば呈示される。そのうえ、この汎腫瘍抗原は、食道腺ガン、膵臓腺ガンおよび肺腺ガンにおいて顕著なレベルで異所性に活性化される。ＣＬＤＮ１８．２タンパク質はまた、胃ガン腺ガンのリンパ節転移物に、また、とりわけ卵巣内への遠位転移物（いわゆるクルケンベルグ腫瘍）に局在化する。
本発明は、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を提供する。
本発明は、ヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体、特に、Ｆｃ改変されたものを提供するが、ここで抗体は
（１）配列番号１で表されるとおりのＶＨ内に含まれる ＨＶＲ－Ｈ１、ＨＶＲ－Ｈ２およびＨＶＲ－Ｈ３、および配列番号２で表されるとおりのＶＬ内に含まれる ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＶＲ－Ｌ２およびＨＶＲ－Ｌ３；
（２）配列番号３で表されるとおりのＶＨ内に含まれる ＨＶＲ－Ｈ１、ＨＶＲ－Ｈ２およびＨＶＲ－Ｈ３、および配列番号４で表されるとおりのＶＬ内に含まれる ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＶＲ－Ｌ２およびＨＶＲ－Ｌ３；
（３）配列番号５で表されるとおりのＶＨ内に含まれる ＨＶＲ－Ｈ１、ＨＶＲ－Ｈ２およびＨＶＲ－Ｈ３、および配列番号６で表されるとおりのＶＬ内に含まれる ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＶＲ－Ｌ２およびＨＶＲ－Ｌ３； または
（４）配列番号７で表されるとおりのＶＨ内に含まれる ＨＶＲ－Ｈ１、ＨＶＲ－Ｈ２およびＨＶＲ－Ｈ３、および配列番号８で表されるとおりのＶＬ内に含まれる ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＶＲ－Ｌ２およびＨＶＲ－Ｌ３を含むものであって、
例えば、図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ或いは１Ｄで表されるとおりのものであって、任意に、Ｆｃ領域に１つ以上の変異を含んでいてもよい。
（１）配列番号１で表されるとおりのＶＨ内に含まれる ＨＶＲ－Ｈ１、ＨＶＲ－Ｈ２およびＨＶＲ－Ｈ３、および配列番号２で表されるとおりのＶＬ内に含まれる ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＶＲ－Ｌ２およびＨＶＲ－Ｌ３；
（２）配列番号３で表されるとおりのＶＨ内に含まれる ＨＶＲ－Ｈ１、ＨＶＲ－Ｈ２およびＨＶＲ－Ｈ３、および配列番号４で表されるとおりのＶＬ内に含まれる ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＶＲ－Ｌ２およびＨＶＲ－Ｌ３；
（３）配列番号５で表されるとおりのＶＨ内に含まれる ＨＶＲ－Ｈ１、ＨＶＲ－Ｈ２およびＨＶＲ－Ｈ３、および配列番号６で表されるとおりのＶＬ内に含まれる ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＶＲ－Ｌ２およびＨＶＲ－Ｌ３； または
（４）配列番号７で表されるとおりのＶＨ内に含まれる ＨＶＲ－Ｈ１、ＨＶＲ－Ｈ２およびＨＶＲ－Ｈ３、および配列番号８で表されるとおりのＶＬ内に含まれる ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＶＲ－Ｌ２およびＨＶＲ－Ｌ３を含むものであって、
例えば、図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ或いは１Ｄで表されるとおりのものであって、任意に、Ｆｃ領域に１つ以上の変異を含んでいてもよい。
一態様では、当該抗体は、
（１）配列番号１１で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号１２で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、配列番号１３で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３、配列番号１４で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号１５で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号１６で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３；
（２）配列番号１７で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号１８で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、配列番号１９で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３、配列番号２０で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号２１で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号２２で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３；
（３）配列番号２３で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号２４で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、配列番号２５で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３、配列番号２６で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号２７で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号２８で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３；あるいは
（４）配列番号２９で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号３０で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、配列番号３１で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３、配列番号３２で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号３３で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号３４で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３を含む。
（１）配列番号１１で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号１２で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、配列番号１３で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３、配列番号１４で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号１５で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号１６で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３；
（２）配列番号１７で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号１８で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、配列番号１９で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３、配列番号２０で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号２１で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号２２で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３；
（３）配列番号２３で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号２４で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、配列番号２５で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３、配列番号２６で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号２７で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号２８で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３；あるいは
（４）配列番号２９で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号３０で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、配列番号３１で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３、配列番号３２で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号３３で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号３４で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３を含む。
一態様では、当該抗体は、
（１）配列番号４１で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号４２で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、配列番号４３で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３、配列番号４４で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号４５で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号４６で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３；
（２）配列番号４７で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号４８で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、配列番号４９で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３、配列番号５０で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号５１で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号５２で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３；あるいは
（３）配列番号５３で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号５４で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、配列番号５５で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３、配列番号５６で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号５７で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号５８で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３を含む。
（１）配列番号４１で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号４２で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、配列番号４３で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３、配列番号４４で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号４５で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号４６で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３；
（２）配列番号４７で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号４８で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、配列番号４９で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３、配列番号５０で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号５１で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号５２で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３；あるいは
（３）配列番号５３で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号５４で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、配列番号５５で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３、配列番号５６で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号５７で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号５８で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３を含む。
本発明はさらに、ヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、特に、Ｆｃ改変されたものを提供するが、ここで抗体は：
（１）配列番号１１で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号１２で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、および配列番号１３で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨ、および配列番号１４で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号１５で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号１６で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬ；
（２）配列番号１７で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号１８で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、および配列番号１９で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨ、および配列番号２０で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号２１で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号２２で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬ；
（３）配列番号２３で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号２４で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、および配列番号２５で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨ、および配列番号２６で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号２７で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号２８で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬ；あるいは
（４）配列番号２９で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号３０で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、および配列番号３１で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨ、および配列番号３２で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号３３で表されるとおりのＨＶＲ
－Ｌ２、および配列番号３４で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬを含むものであって、
任意に、Ｆｃ領域に１つ以上の変異を含んでいてもよい。
（１）配列番号１１で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号１２で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、および配列番号１３で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨ、および配列番号１４で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号１５で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号１６で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬ；
（２）配列番号１７で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号１８で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、および配列番号１９で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨ、および配列番号２０で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号２１で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号２２で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬ；
（３）配列番号２３で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号２４で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、および配列番号２５で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨ、および配列番号２６で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号２７で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号２８で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬ；あるいは
（４）配列番号２９で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号３０で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、および配列番号３１で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨ、および配列番号３２で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号３３で表されるとおりのＨＶＲ
－Ｌ２、および配列番号３４で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬを含むものであって、
任意に、Ｆｃ領域に１つ以上の変異を含んでいてもよい。
本発明はさらに、ヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、特に、Ｆｃ改変されたものを提供するが、ここで抗体は：
（１）配列番号４１で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号４２で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、および配列番号４３で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨ、および配列番号４４で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号４５で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号４６で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬ；
（２）配列番号４７で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号４８で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、および配列番号４９で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨ、および配列番号５０で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号５１で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号５２で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬ；あるいは
（３）配列番号５３で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号５４で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、および配列番号５５で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨ、および配列番号５６で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号５７で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号５８で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬ、を含むものであって、
任意に、Ｆｃ領域に１つ以上の変異を含んでいてもよい。
（１）配列番号４１で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号４２で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、および配列番号４３で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨ、および配列番号４４で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号４５で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号４６で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬ；
（２）配列番号４７で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号４８で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、および配列番号４９で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨ、および配列番号５０で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号５１で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号５２で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬ；あるいは
（３）配列番号５３で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号５４で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、および配列番号５５で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨ、および配列番号５６で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号５７で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号５８で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬ、を含むものであって、
任意に、Ｆｃ領域に１つ以上の変異を含んでいてもよい。
本発明はさらに、ヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、特に、Ｆｃ改変されたものを提供するが、ここで抗体は、
（１）配列番号１で表されるとおりのＶＨおよび配列番号２で表されるとおりのＶＬ； （２）配列番号３で表されるとおりのＶＨおよび配列番号４で表されるとおりのＶＬ；
（３）配列番号５で表されるとおりのＶＨおよび配列番号６で表されるとおりのＶＬ；あるいは
（４）配列番号７で表されるとおりのＶＨおよび配列番号８で表されるとおりのＶＬを含むものであって、
任意に、Ｆｃ領域に１つ以上の変異を含んでいてもよく、
任意に、ＶＨのＮ末端の最初の２つのアミノ酸残基は存在しない。
（１）配列番号１で表されるとおりのＶＨおよび配列番号２で表されるとおりのＶＬ； （２）配列番号３で表されるとおりのＶＨおよび配列番号４で表されるとおりのＶＬ；
（３）配列番号５で表されるとおりのＶＨおよび配列番号６で表されるとおりのＶＬ；あるいは
（４）配列番号７で表されるとおりのＶＨおよび配列番号８で表されるとおりのＶＬを含むものであって、
任意に、Ｆｃ領域に１つ以上の変異を含んでいてもよく、
任意に、ＶＨのＮ末端の最初の２つのアミノ酸残基は存在しない。
一態様では、Ｆｃ領域における１つ以上の変異はＦｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能、例えばＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ、を修飾（例えば、増加または減少）させる１つ以上の変異である。一態様では、Ｆｃ領域における１つ以上の変異は、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００ＬおよびＰ３９６Ｌからなる群から選択される１つ以上の置換である。一態様では、Ｆｃ領域における１つ以上の変異は、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００ＬおよびＰ３９６Ｌである。
本発明はさらに、ヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体、特に、Ｆｃ改変されたものを提供するが、ここで抗体は：
ｉ）ヒトＣＬＤＮ１８．２への結合について、（１） 配列番号１で表されるとおりのＶＨおよび配列番号２で表されるとおりのＶＬ； （２） 配列番号３で表されるとおりのＶＨおよび配列番号４で表されるとおりのＶＬ； （３） 配列番号５で表されるとおりのＶＨおよび配列番号６で表されるとおりのＶＬ；あるいは（４） 配列番号７で表されるとおりのＶＨおよび配列番号８で表されるとおりのＶＬを含む抗ＣＬＤＮ１８．２抗体と競合するものである、および／または
ｉｉ） （１） 配列番号１で表されるとおりのＶＨおよび配列番号２で表されるとおりのＶＬ； （２） 配列番号３で表されるとおりのＶＨおよび配列番号４で表されるとおりのＶＬ； （３） 配列番号５で表されるとおりのＶＨおよび配列番号６で表されると
おりのＶＬ； または （４） 配列番号７で表されるとおりのＶＨおよび配列番号８で表されるとおりのＶＬを含む抗ＣＬＤＮ１８．２抗体と、ヒトＣＬＤＮ１８．２の同じエピトープに結合するものである；および／または
ｉｉｉ）ヒトＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞（例えば、２９３Ｔ細胞またはＣＨＯ細胞またはＣＴ２６細胞またはＫＡＴＯＩＩＩ細胞またはＮＣＩ－Ｎ８７細胞）上のＰＢＭＣのＡＤＣＣを、例えば、ＬＤＨまたはＦＡＣＳにより決定される、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．００９ｎＭ、０．００８ｎＭ、０．００７ｎＭ、０．００６ｎＭ、０．００５ｎＭ、０．００４ｎＭ、０．００３ｎＭ、０．００２ｎＭ、または０．００１ｎＭの、その付近の、またはそれ未満のＥＣ５０値で媒介するものである；および／または
ｉｖ）ヒトＣＬＤＮ１８．１を発現する細胞（例えば、２９３Ｔ細胞またはＣＨＯ細胞またはＣＴ２６細胞またはＫＡＴＯＩＩＩ細胞またはＮＣＩ－Ｎ８７細胞） 上のＰＢＭＣのＡＤＣＣを媒介しないものである；および／または
ｖ）ヒトＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞（例えば、２９３Ｔ細胞またはＣＨＯ細胞またはＣＴ２６細胞またはＫＡＴＯＩＩＩ細胞またはＮＣＩ－Ｎ８７細胞） 上のＣＤＣを、例えば、ＬＤＨまたはＦＡＣＳにより決定される、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．００９ｎＭ、０．００８ｎＭ、０．００７ｎＭ、０．００６ｎＭ、０．００５ｎＭ、０．００４ｎＭ、０．００３ｎＭ、０．００２ｎＭ、または０．００１ｎＭ、の、その付近の、またはそれ未満のＥＣ５０値で媒介するものである；および／または
ｖｉ）ヒトＣＬＤＮ１８．１を発現する細胞（例えば、２９３Ｔ細胞またはＣＨＯ細胞またはＣＴ２６細胞またはＫＡＴＯＩＩＩ細胞またはＮＣＩ－Ｎ８７細胞）上のＣＤＣを媒介しないものである；および／または
ｖｉｉ）細胞表面上にヒトＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞（例えば、２９３Ｔ細胞またはＣＨＯ細胞） に、例えば、５０ｐＭ、４５ｐＭ、４０ｐＭ、３８．６ｐＭ、３５ｐＭ、３０ｐＭ、２５ｐＭ、２０ｐＭ、１５ｐＭ、１３．１ｐＭ、１０ｐＭ、９．５ｐＭ、９ｐＭ、または５ｐＭの、その付近の、またはそれ未満のＫｄ値で結合するものである；および／または
ｖｉｉｉ）細胞表面上にヒトＣＬＤＮ１８．１を発現する細胞（例えば、２９３Ｔ細胞またはＣＨＯ細胞） に結合しないものである；および／または
ｉｘ）ヒトＣＬＤＮ１８．２に、例えば、１０ｎＭ、９．５ｎＭ、９ｎＭ、８．５ｎＭ、８ｎＭ、７．５ｎＭ、７ｎＭ、６．５ｎＭ、６．４ｎＭ、６ｎＭ、５．５ｎＭ、５ｎＭ、４．５ｎＭ、４ｎＭ、３．８ｎＭ、３．５ｎＭ、３ｎＭ、２．５ｎＭ、２ｎＭ、１．７ｎＭ １．５ｎＭ、または１ｎＭの、その付近の、またはそれ未満のＫｄ値で特異的に結合するものである；および／または
ｘ）ヒトＣＬＤＮ ＣＬＤＮ１８．１に特異的に結合しないものである。
ｉ）ヒトＣＬＤＮ１８．２への結合について、（１） 配列番号１で表されるとおりのＶＨおよび配列番号２で表されるとおりのＶＬ； （２） 配列番号３で表されるとおりのＶＨおよび配列番号４で表されるとおりのＶＬ； （３） 配列番号５で表されるとおりのＶＨおよび配列番号６で表されるとおりのＶＬ；あるいは（４） 配列番号７で表されるとおりのＶＨおよび配列番号８で表されるとおりのＶＬを含む抗ＣＬＤＮ１８．２抗体と競合するものである、および／または
ｉｉ） （１） 配列番号１で表されるとおりのＶＨおよび配列番号２で表されるとおりのＶＬ； （２） 配列番号３で表されるとおりのＶＨおよび配列番号４で表されるとおりのＶＬ； （３） 配列番号５で表されるとおりのＶＨおよび配列番号６で表されると
おりのＶＬ； または （４） 配列番号７で表されるとおりのＶＨおよび配列番号８で表されるとおりのＶＬを含む抗ＣＬＤＮ１８．２抗体と、ヒトＣＬＤＮ１８．２の同じエピトープに結合するものである；および／または
ｉｉｉ）ヒトＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞（例えば、２９３Ｔ細胞またはＣＨＯ細胞またはＣＴ２６細胞またはＫＡＴＯＩＩＩ細胞またはＮＣＩ－Ｎ８７細胞）上のＰＢＭＣのＡＤＣＣを、例えば、ＬＤＨまたはＦＡＣＳにより決定される、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．００９ｎＭ、０．００８ｎＭ、０．００７ｎＭ、０．００６ｎＭ、０．００５ｎＭ、０．００４ｎＭ、０．００３ｎＭ、０．００２ｎＭ、または０．００１ｎＭの、その付近の、またはそれ未満のＥＣ５０値で媒介するものである；および／または
ｉｖ）ヒトＣＬＤＮ１８．１を発現する細胞（例えば、２９３Ｔ細胞またはＣＨＯ細胞またはＣＴ２６細胞またはＫＡＴＯＩＩＩ細胞またはＮＣＩ－Ｎ８７細胞） 上のＰＢＭＣのＡＤＣＣを媒介しないものである；および／または
ｖ）ヒトＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞（例えば、２９３Ｔ細胞またはＣＨＯ細胞またはＣＴ２６細胞またはＫＡＴＯＩＩＩ細胞またはＮＣＩ－Ｎ８７細胞） 上のＣＤＣを、例えば、ＬＤＨまたはＦＡＣＳにより決定される、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．００９ｎＭ、０．００８ｎＭ、０．００７ｎＭ、０．００６ｎＭ、０．００５ｎＭ、０．００４ｎＭ、０．００３ｎＭ、０．００２ｎＭ、または０．００１ｎＭ、の、その付近の、またはそれ未満のＥＣ５０値で媒介するものである；および／または
ｖｉ）ヒトＣＬＤＮ１８．１を発現する細胞（例えば、２９３Ｔ細胞またはＣＨＯ細胞またはＣＴ２６細胞またはＫＡＴＯＩＩＩ細胞またはＮＣＩ－Ｎ８７細胞）上のＣＤＣを媒介しないものである；および／または
ｖｉｉ）細胞表面上にヒトＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞（例えば、２９３Ｔ細胞またはＣＨＯ細胞） に、例えば、５０ｐＭ、４５ｐＭ、４０ｐＭ、３８．６ｐＭ、３５ｐＭ、３０ｐＭ、２５ｐＭ、２０ｐＭ、１５ｐＭ、１３．１ｐＭ、１０ｐＭ、９．５ｐＭ、９ｐＭ、または５ｐＭの、その付近の、またはそれ未満のＫｄ値で結合するものである；および／または
ｖｉｉｉ）細胞表面上にヒトＣＬＤＮ１８．１を発現する細胞（例えば、２９３Ｔ細胞またはＣＨＯ細胞） に結合しないものである；および／または
ｉｘ）ヒトＣＬＤＮ１８．２に、例えば、１０ｎＭ、９．５ｎＭ、９ｎＭ、８．５ｎＭ、８ｎＭ、７．５ｎＭ、７ｎＭ、６．５ｎＭ、６．４ｎＭ、６ｎＭ、５．５ｎＭ、５ｎＭ、４．５ｎＭ、４ｎＭ、３．８ｎＭ、３．５ｎＭ、３ｎＭ、２．５ｎＭ、２ｎＭ、１．７ｎＭ １．５ｎＭ、または１ｎＭの、その付近の、またはそれ未満のＫｄ値で特異的に結合するものである；および／または
ｘ）ヒトＣＬＤＮ ＣＬＤＮ１８．１に特異的に結合しないものである。
一態様では、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体は、マウス、キメラ、またはヒト化抗体である。
一態様では、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体は、抗原結合抗体フラグメントである、任意に、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２ フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、およびダイアボディからなる群から選択されてもよい。
一態様では、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体は完全長抗体である。一態様では、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体は、ヒトＩｇＧ（特にＩｇＧ１）の重鎖定常領域、任意に配列番号９で表されるとおりのものを含む。一態様では、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体は変異ヒトＩｇＧ（特にＩｇＧ１）の重鎖定常領域、任意に配列番号４０で表されるとおりのものを含む。一態様では、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体は、ヒトカッパ軽鎖定常領域、任意に配列番号１０で表されるとおりのものを含む。一態様では、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体はキメラ抗体、例えば、マウス／ヒトキメラ抗体である。一態様では、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体は、Ｆｃ改変されたものである。
一態様では、本発明のモノクローナル抗体 （ｍＡｂ）またはＦａｂフラグメントは、交差形式（ｘ－ｍＡｂもしくはｘ－Ｆａｂ）を有し、ここで、軽鎖および重鎖の可変ドメインまたは（第１の）定常ドメインのいずれかが交換される。
本発明は、本発明のモノクローナル抗体をコードする単離された核酸を提供する。本発明は、本発明の核酸を含むベクター、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターを提供する。本発明は、本発明の核酸あるいは本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明は、抗体が産生されるように宿主細胞を培養することを含む本発明のモノクローナル抗体を産生する方法を提供する。一態様では、当該方法はさらに、及び宿主細胞又は細胞培養培地から抗体を回収することを含む。
本発明は、本発明のモノクローナル抗体を含む組成物を提供する。本発明は、本発明のモノクローナル抗体および薬学上で許容される担体を含む薬学的製剤を提供する。
本発明は、薬剤として使用するための本発明のモノクローナル抗体を提供する。本発明は、がん治療のために使用する本発明のモノクローナル抗体を提供する。本発明は、薬剤の製造のための本発明のモノクローナル抗体の使用を提供する。一態様では、薬剤は、がん治療のために使用される。本発明は、個体に治療有効量の本発明のモノクローナル抗体を投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法を提供する。
Ｉ． 定義
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および所望の抗原結合活性を示す限り抗体断片を含むが、それに限定されない、様々な抗体構造を包含する。
「抗体フラグメント」とは、インタクト抗体以外の分子であって、インタクト抗体のうち、インタクト抗体が結合する抗原に結合する部分を含む分子を指す。抗体フラグメントの例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／または軽鎖の一部分が特定の源または種に由来し、重鎖及び／または軽鎖の残りの部分が異なる源または種に由来する抗体を指す。
抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域の型を指す。５つの主要な抗体クラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちの数個は、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分類され得る。免役グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（「κ」）及びラムダ（「λ」）と呼ばれる２つの明らかに異なる種類のうちの１つに割り当てることができる。
「エフェクター機能」は、抗体アイソタイプにより異なる抗体のＦｃ領域に起因し得る生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、ならびにＢ細胞活性化が挙げられる。
本明細書に使用される「改変する、改変された、改変すること」という用語は、ペプチド主鎖の任意の改変、または天然に存在するもしくは組換えのポリペプチドもしくはその
断片の翻訳後修飾を含むと考えられる。改変には、アミノ酸配列、グリコシル化パターン、または個別のアミノ酸の側鎖基の修飾のみならず、これらの手法の組み合わせが含まれる。
断片の翻訳後修飾を含むと考えられる。改変には、アミノ酸配列、グリコシル化パターン、または個別のアミノ酸の側鎖基の修飾のみならず、これらの手法の組み合わせが含まれる。
本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。本用語は、ネイティブな配列のＦｃ領域および変異Ｆｃ領域を含む。一態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで延長する。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在する場合もあれば、存在しない場合もある。一態様では、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプであり、配列番号９または配列番号４０の重鎖定常領域を含む。一態様では、Ｃ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）をさらに含む。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ，
１９９１に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
１９９１に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲおよびＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（またはＶＬ）中に以下の順序で出現する：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又はＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は、互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を、このような細胞の子孫を含めて指す。宿主細胞には、初代形質転換細胞および継代回数に関係なくそれに由来する子孫が含まれる「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれる。子孫は、親細胞と核酸含有量が完全には同一でない場合があり、変異を含有し得る。本来の形質転換細胞においてスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物活性を有する変異子孫が、本明細書に含まれる。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基およびヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのうち実質的に全てを含み、可変ドメイン中のＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のうち全てまたは実質的に全ては、非ヒト抗体のＨＶＲに対応し、ＦＲのうち全てまたは実質的に全ては、ヒト抗体のＦＲに対応する。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含み得る。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
本明細書に使用される「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」）であり、かつ／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成し、かつ／または抗原接触残基（「抗原接触部」）を含有する、抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）中に３つおよびＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）中に３つの、６つのＨＶＲを含む。本明細書における例示的なＨＶＲには：
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、および９６～１０１（Ｈ３）に存在する超可変ループ（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、および９５～１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、および９３～１０１（Ｈ３）に存在する抗原接触部（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））；ならびに
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６～５６（Ｌ２）、４７～５６（Ｌ２）、４８～５６（Ｌ２）、４９～５６（Ｌ２）、２６～３５（Ｈ１）、２６～３５ｂ（Ｈ１）、４９～６５（Ｈ２）、９３～１０２（Ｈ３）、および９４～１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、および／または（ｃ）の組み合わせ
ＨＶＲ残基は、ウェブサイト、例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｏｖｏｐｒｏ．ｃｎ／ｔｏｏｌｓ／ｃｄｒ．ｈｔｍｌ、で同定され得る。
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、および９６～１０１（Ｈ３）に存在する超可変ループ（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、および９５～１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、および９３～１０１（Ｈ３）に存在する抗原接触部（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））；ならびに
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６～５６（Ｌ２）、４７～５６（Ｌ２）、４８～５６（Ｌ２）、４９～５６（Ｌ２）、２６～３５（Ｈ１）、２６～３５ｂ（Ｈ１）、４９～６５（Ｈ２）、９３～１０２（Ｈ３）、および９４～１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、および／または（ｃ）の組み合わせ
ＨＶＲ残基は、ウェブサイト、例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｏｖｏｐｒｏ．ｃｎ／ｔｏｏｌｓ／ｃｄｒ．ｈｔｍｌ、で同定され得る。
特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従って本明細書において番号が付けられる。
本明細書に使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団中に含まれる個別の抗体は、例えば、天然に存在する変異を含有する、またはモノクローナル抗体調製物の精製の間に生じる、可能性のある変異抗体（このような変異体は、一般的に少量存在する）を除き、同一であり、かつ／または同じエピトープに結合する。典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特性を示すのであって、任意の特定の方法により抗体を産生することを必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明により使用されるべきモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージ－ディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン座位の全てまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、それに限定されない多様な技術により製造される場合があり、モノクローナル抗体を製造するための、このような方法および他の例示的な方法が、本明細書に記載される。
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗原への抗体の結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。ネイティブな抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、一般的に、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む、類似構造を有する。例えば、Ｋｉｎｄｔら、Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、９１頁（２００７）を参照されたい。単一のＶＨまたはＶＬドメインが、抗原結合特異性を付与するために十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体のＶＨドメイン又はＶＬドメインを使用し、それぞれ、相補的なＶＬドメイン又はＶＨドメインのライブラリをスクリーニングして、単離してもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０：８８０－８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６
２８（１９９１）を参照されたい。
２８（１９９１）を参照されたい。
「ベクター」という用語は、本明細書において使用されるように、連結されている別の核酸を増やすことができる核酸分子をさす。その用語には、自己複製性の核酸構造としてのベクターも含まれるし、導入された宿主細胞のゲノムへ組み込まれたベクターも含まれる。ある特定のベクターは、機能的に連結されている核酸の発現を指図することができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
ＩＩ． 例示的な抗体
本発明は、ヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体、特に、Ｆｃ改変されたものを提供するが、ここで抗体は以下を含む：配列番号１１で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号１２で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、および配列番号１３で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨ、および配列番号１４で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号１５で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号１６で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬ。一態様では、当該抗体は、配列番号１で表されるとおりのＶＨおよび配列番号２で表されるとおりのＶＬを含む。任意に、ＶＨのＮ末端の最初の２つのアミノ酸残基は存在しない。
本発明は、ヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体、特に、Ｆｃ改変されたものを提供するが、ここで抗体は、以下を含む：配列番号１７で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号１８で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、および配列番号１９で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨ、および配列番号２０で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号２１で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号２２で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬ。一態様では、当該抗体は、配列番号３で表されるとおりのＶＨおよび配列番号４で表されるとおりのＶＬを含む。任意に、ＶＨのＮ末端の最初の２つのアミノ酸残基は存在しない。
本発明は、ヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体、特に、Ｆｃ改変されたものを提供するが、ここで抗体は、以下を含む：配列番号２３で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号２４で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、および配列番号２５で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨ、および配列番号２６で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号２７で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号２８で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬ。本発明は、ヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体、特に、Ｆｃ改変されたものを提供するが、ここで抗体は、以下を含む：配列番号４１で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号４２で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、および配列番号４３で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨ、および配列番号４４で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号４５で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号４６で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬ。本発明は、ヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体、特に、Ｆｃ改変されたものを提供するが、ここで抗体は、以下を含む：配列番号４７で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号４８で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、および配列番号４９で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨ、および配列番号５０で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号５１で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号５２で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬ。本発明は、ヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体、特に、Ｆｃ改変されたものを提供するが、ここで抗体は、以下を含む：配列番号５３で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号５４で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、および配列番号５５で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨ、および配列番号５６で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号５７で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号５８で表されるとおり
のＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬ。一態様では、当該抗体は、配列番号５で表されるとおりのＶＨおよび配列番号６で表されるとおりのＶＬを含む。任意に、ＶＨのＮ末端の最初の２つのアミノ酸残基は存在しない。
のＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬ。一態様では、当該抗体は、配列番号５で表されるとおりのＶＨおよび配列番号６で表されるとおりのＶＬを含む。任意に、ＶＨのＮ末端の最初の２つのアミノ酸残基は存在しない。
本発明は、ヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体、特に、Ｆｃ改変されたものを提供するが、ここで抗体は、以下を含む：配列番号２９で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ１、配列番号３０で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ２、および配列番号３１で表されるとおりのＨＶＲ－Ｈ３を含むＶＨ、および配列番号３２で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ１、配列番号３３で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ２、および配列番号３４で表されるとおりのＨＶＲ－Ｌ３を含むＶＬ。一態様では、当該抗体は、配列番号７で表されるとおりのＶＨおよび配列番号８で表されるとおりのＶＬを含む。任意に、ＶＨのＮ末端の最初の２つのアミノ酸残基は存在しない。
一態様では、Ｆｃ領域における１つ以上の変異はＦｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能、例えばＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ、を修飾（例えば、増加または減少）させる１つ以上の変異である。一態様では、Ｆｃ領域における１つ以上の変異は、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００ＬおよびＰ３９６Ｌからなる群から選択される１つ以上の置換である。一態様では、Ｆｃ領域における１つ以上の変異は、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００ＬおよびＰ３９６Ｌである。
一態様では、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体は、マウス、キメラ、またはヒト化抗体である。
一態様では、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体は、抗原結合抗体フラグメントである、任意に、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２ フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、およびダイアボディからなる群から選択されてもよい。
一態様では、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体は完全長抗体である。一態様では、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体は、ヒトＩｇＧ（特にＩｇＧ１）の重鎖定常領域、任意に配列番号９で表されるとおりのものを含む。一態様では、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体は変異ヒトＩｇＧ（特にＩｇＧ１）の重鎖定常領域、任意に配列番号４０で表されるとおりのものを含む。一態様では、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体は、ヒトカッパ軽鎖定常領域、任意に配列番号１０で表されるとおりのものを含む。一態様では、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体はキメラ抗体、例えば、マウス／ヒトキメラ抗体である。一態様では、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体は、Ｆｃ改変されたものである。
一態様では、本発明のモノクローナル抗体 （ｍＡｂ）またはＦａｂフラグメントは、交差形式（ｘ－ｍＡｂもしくはｘ－Ｆａｂ）を有し、ここで、軽鎖および重鎖の可変ドメインまたは（第１の）定常ドメインのいずれかが交換される。
ＩＩＩ． 組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号で説明したように、組換えの方法及び組成物を用いて製造することができる。これらの方法では、抗体をコードする１つまたは複数の単離された核酸が提供される。
ネイティブ抗体またはネイティブ抗体フラグメントの場合、２つの核酸、すなわち軽鎖またはそのフラグメント用に１つと、重鎖またはそのフラグメント用に１つとが必要であ
る。そのような核酸は抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および／または抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードする。これらの核酸は同じ発現ベクター上または異なる発現ベクター上に存在することができる。
る。そのような核酸は抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および／または抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードする。これらの核酸は同じ発現ベクター上または異なる発現ベクター上に存在することができる。
一態様では、本明細書に記載する方法において使用される抗体をコードする単離された核酸が提供される。
さらなる一態様では、そのような核酸を含む１つまたは複数のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。
さらなる一態様では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。
そのような一態様において、宿主細胞は、以下のベクターを含む（例えば以下のベクターで形質転換されている）：
（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または
（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１ベクターおよび抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２ベクター。
（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または
（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１ベクターおよび抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２ベクター。
一態様において、宿主細胞は真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ球系細胞（例えばＹ０、ＮＳ０、Ｓｐ２／０細胞）である。一態様では、抗体を作製する方法であって、上で提供された抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養する工程、および任意で抗体を宿主細胞または宿主細胞培養培地から回収する工程を含む方法が提供される。
抗体の組換え生産のために、例えば上述したように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために１つ以上のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができ、あるいは組換え法によって産生することも、化学合成によって得ることもできる。
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は細菌で産生することができる。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、第５７８９１９９号及び第５８４０５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体の発現を説明している、Ｃｈａｒｌｔｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
Ｖｏｌ． ２４８ （Ｂ．Ｋ．Ｃ． Ｌｏ， ｅｄ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，
Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ， ２００３）， ｐｐ． ２４５－２５４も参照）。発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され、更に精製することができる。
Ｖｏｌ． ２４８ （Ｂ．Ｋ．Ｃ． Ｌｏ， ｅｄ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，
Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ， ２００３）， ｐｐ． ２４５－２５４も参照）。発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され、更に精製することができる。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されている菌類や酵母菌株を含む抗体をコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２２：１４０９－１４１４ （２００４）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２４：２１０－２１５ （２００６）を参照。
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）にも由来している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。
植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。
脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合した哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（Ｇｒａｈａｍ
Ｆ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ３６：（１９７７） ５９－７４に記載された２９３細胞又は２９３細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（Ｍａｔｈｅｒ Ｊ．Ｐ．， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２３：（１９８０） ２４３－２５２に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頚がん細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）； 例えばＭａｔｈｅｒ Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
３８３：（１９８２） ４４－６８に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ
Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：（１９８０） ４２１６－４２２０）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；並びにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ，Ｐ． ａｎｄ Ｗｕ，Ａ．Ｍ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２４８， Ｌｏ， Ｂ．Ｋ．Ｃ． （ｅｄ．）， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ（２００４）， ｐｐ． ２５５－２６８を参照。
Ｆ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ３６：（１９７７） ５９－７４に記載された２９３細胞又は２９３細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（Ｍａｔｈｅｒ Ｊ．Ｐ．， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２３：（１９８０） ２４３－２５２に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頚がん細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）； 例えばＭａｔｈｅｒ Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
３８３：（１９８２） ４４－６８に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ
Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：（１９８０） ４２１６－４２２０）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；並びにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ，Ｐ． ａｎｄ Ｗｕ，Ａ．Ｍ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２４８， Ｌｏ， Ｂ．Ｋ．Ｃ． （ｅｄ．）， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ（２００４）， ｐｐ． ２５５－２６８を参照。
ＩＶ． アッセイ
本明細書で提供される抗体は、同定され、当技術分野で公知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、又は特徴づけることができる。
結合アッセイおよび他のアッセイ
一態様では、本発明の抗体をその抗原結合活性について、例えば、公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどによって試験する。
別の態様において、ＣＬＤＮ１８．２への結合についてＣＬＤＮ１８．２と競合する抗体を同定するために競合アッセイを使用することができる。特定の実施態様において、そのような競合抗体は、ＣＬＤＮ１８．２によって結合される同じエピトープ（例えば、線形又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． ６６ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ）のＭｏｒｒｉｓ （１９９６） “Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”に
提供される。
提供される。
典型的な競合アッセイにおいて、固定化ＣＬＤＮ１８．２は、ＣＬＤＮ１８．２に結合する第一の標識された抗体、及びＣＬＤＮ１８．２への結合について第一の抗体と競合する能力について試験された第二の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化ＣＬＤＮ１８．２が、未標識の第二の抗体でなく、標識された第一の抗体を含む溶液中でインキュベートされる。ＣＬＤＮ１８．２への第一の抗体の結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の非結合抗体が除去され、固定化されたＣＬＤＮ１８．２に結合した標識の量が測定される。もし、固定化されたＣＬＤＮ１８．２に結合した標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体が、ＣＬＤＮ１８．２への結合において第一の抗体と競合していることを示している。Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
ｃｈ．１４ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）を参照。
ｃｈ．１４ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）を参照。
活性のアッセイ
一態様において、アッセイは、生物学的活性を有するそれらの抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を同定するために与えられる。生物学的活性は、例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のＣＬＤＮ１８．２を発現する標的細胞に対するＰＢＭＣによるＡＤＣＣを含み得る。インビボ及び／又はインビトロでこのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。
最初のスクリーニングの結果、ＣＬＤＮ１８．２発現細胞には特異的に結合するが、ＣＬＤＮ１８．１発現細胞には結合しない、免疫したマウス由来の４つの陽性ハイブリドーマ細胞株が確認された。
実施例１：マウスハイブリドーマ細胞からの４つのＣＬＤＮ１８．２特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のクローニング
この実施例は、抗体のＨ鎖とＬ鎖の遺伝子をマウスハイブリドーマ細胞からクローニングして、ＣＬＤＮ１８．２に特異的な可変領域配列を取得し、キメラ抗体を作製することを示す実施例である。
当技術分野における従来の手順に従い、Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡＴＭ Ｍｉｃｒｏｐｒｅｐ
Ｋｉｔ （ＺＹＭＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｔ． ＃ Ｒ１０５０） を用いてハイブリドーマ細胞からＲＮＡを分離・精製した。第一鎖ｃＤＮＡを合成し、ＳＭＡＲＴｅｒ（Ｒ） ＲＡＣＥ ５’／３’ ｋｉｔ （Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ， Ｉｎｃ． Ｃａｔ． ＃ ６３４８５８） を用いて、ＩｇＧ１ ３’ 定常プライマー （配列番号３５）， ＩｇＧ２ａ ３’ 定常プライマー （配列番号３６） およびＫａｐｐａ ３’ 定常プライマー （配列番号３７） と共にＲＡＣＥを実施した。ＲＡＣＥ
ＤＮＡ産物は、ＮｕｃｅｌｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ とＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ ｋｉｔ
（Ｔａｋａｒａ， Ｃａｔ． ＃ ７４０９８６．２０） を用いてゲル抽出に供した。直線化ｐＲＡＣＥベクターとゲル精製ＰＡＣＥ産物のｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ反応混合物をＳｔｅｌｌａｒコンピテントセル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｃａｔ．＃ ６３６７６６）に形質転換した。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ， Ｃａｔ． ＃ ２７１０４）を用いて形質転換体からプラスミドＤＮＡを分離し、Ｍ１３シーケンシングプライマーを用いてサンガー配列決定（ＧＥＮＥＷＩＺ）に供した。重鎖と軽鎖の４対の最終的な遺伝子配列が得られ（データは示されていない）、これを下
記の通りＣＬＤＮ１８．２ ｍＡｂｓ（ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４）として決定された。
Ｋｉｔ （ＺＹＭＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｔ． ＃ Ｒ１０５０） を用いてハイブリドーマ細胞からＲＮＡを分離・精製した。第一鎖ｃＤＮＡを合成し、ＳＭＡＲＴｅｒ（Ｒ） ＲＡＣＥ ５’／３’ ｋｉｔ （Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ， Ｉｎｃ． Ｃａｔ． ＃ ６３４８５８） を用いて、ＩｇＧ１ ３’ 定常プライマー （配列番号３５）， ＩｇＧ２ａ ３’ 定常プライマー （配列番号３６） およびＫａｐｐａ ３’ 定常プライマー （配列番号３７） と共にＲＡＣＥを実施した。ＲＡＣＥ
ＤＮＡ産物は、ＮｕｃｅｌｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ とＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ ｋｉｔ
（Ｔａｋａｒａ， Ｃａｔ． ＃ ７４０９８６．２０） を用いてゲル抽出に供した。直線化ｐＲＡＣＥベクターとゲル精製ＰＡＣＥ産物のｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ反応混合物をＳｔｅｌｌａｒコンピテントセル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｃａｔ．＃ ６３６７６６）に形質転換した。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ， Ｃａｔ． ＃ ２７１０４）を用いて形質転換体からプラスミドＤＮＡを分離し、Ｍ１３シーケンシングプライマーを用いてサンガー配列決定（ＧＥＮＥＷＩＺ）に供した。重鎖と軽鎖の４対の最終的な遺伝子配列が得られ（データは示されていない）、これを下
記の通りＣＬＤＮ１８．２ ｍＡｂｓ（ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４）として決定された。
実施例２：マウス定常領域をヒト定常領域に置き換えたキメラ抗体の構築
本実施例は、分子クローニングされた４種類のマウスｍＡｂの定常領域を、ヒトＩｇＧ１重鎖およびカッパ軽鎖からのものに置き換えることにより、キメラ抗体を構築することを示す実施例である。
ヒトＩｇＧ１重鎖の定常領域を含むプラスミドｐＦＵＳＥ－ＣＨＩｇ－ｈＧ１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｃａｔ＃ ｐｆｕｓｅ－ｈｃｈｇ１）（配列番号９）およびヒトカッパ軽鎖の定常領域（配列番号１０）を含むプラスミドｐＦＵＳＥ２－ＣＬＩｇ－ｈｋ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｃａｔ ＃ ｐｆｕｓｅ２－ｈｃｌｋ） をＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＮｈｅ Ｉ（ＩｇＧ１用）あるいはＢｓｉＷ Ｉ（カッパ用）（全部ＮＥＢ ｌａｂから）で消化された。線状化したプラスミドを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ と ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ ｋｉｔ （Ｔａｋａｒａ， Ｃａｔ． ＃ ７４０９８６．２０） を用いたゲル精製により精製した。ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４のマウス重鎖および軽鎖可変領域のコード配列は、実施例１で得られたプラスミドからＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ（Ｋａｐａ（Ｒｏｃｈｅ）、ＫＫ２６０２）を用いて特定のプライマーとともにＰＣＲ増幅し（データは示されていない）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ とＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ、 Ｃａｔ．＃ ７４０９８６．２０ ）を用いてゲル精製により精製した。線状化ベクターと挿入断片は、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｒ） ＨｉＦｉ １ Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ （ＳＧＩ （ＶＷＲ）， Ｃａｔ． ＃ ＧＡ１１００－５０）を用いて繋ぎ合せた。アセンブリー反応混合物をＳｔｅｌｌａｒコンピテントセル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｃａｔ．＃ ６３６７６６）に形質転換した。プラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ， Ｃａｔ． ＃ ２７１０４）を用いて形質転換体から分離し、サンガー配列決定（ＧＥＮＥＷＩＺ）に供した。実施例１で作製した４種類のマウスｍＡｂのうち１種類の可変領域を含む４種類のキメラ抗体を構築した。新しいキメラ抗体は、ＹＬ－Ｇ１－１９－０１、ＹＬ－Ｇ１－１９－０２、ＹＬ－Ｇ１－１９－０３、及びＹＬ－Ｇ１－１９－０４と命名された。
実施例３：４つのキメラモノクローナル抗体の特異性の表面染色での確認
本実施例は、４つのキメラモノクローナル抗体のＣＬＤＮ１８．２への結合特異性を、参照ｍＡｂ（ＩＭＡＢ３６２、Ｇａｎｙｍｅｄ）と比較して試験する実施例である。
ＦＡＣＳバッファー中の２×１０６細胞／ｍｌでの密度のＣＬＤＮ１８．２発現２９３Ｔ細胞およびＣＬＤＮ１８．１発現２９３Ｔ細胞（５０μＬ）を、希釈系列のキメラ抗体、参照抗体、またはＩｇＧネガティブコントロール（５０μＬ）（６０．００、２０．００、６．６７、２．２２、０．７４、０．２５、０．０８ μｇ／ｍＬ、ＦＡＣＳバッファー中）を９６ウェルＶボトムプレート中で混合し、氷上で３０分インキュベートさせた。２００μＬ／ウェルＦＡＣＳバッファーで洗浄後、３０μＬ／ウェル二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（Ｒ） ６４７ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ， Ｆｃγ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ （Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｃａｔ． ＃１０９－６０５－０９８） に細胞を再懸濁し、氷上で２０分インキュベートさせた。２００μＬ／ウェルＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した後、細胞を１５０μＬ／ウェルＦＡＣＳバッファーで再懸濁し、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（ＨＴＳ）を用いたＦＡＣＳに供された。データ解析には幾何平均を用い、プロットはＰｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄを使用して作成した。フローサイトメトリー解析の結果、４つのキ
メラ抗体は、参照ｍＡｂと比較して、ＣＬＤＮ１８．２発現細胞に対して高い特異的結合を有することが示された（図２参照）。ＣＬＤＮ１８．１発現細胞への結合は認められず（図３参照）、４つのキメラ抗体の高い特異性が示唆された。
メラ抗体は、参照ｍＡｂと比較して、ＣＬＤＮ１８．２発現細胞に対して高い特異的結合を有することが示された（図２参照）。ＣＬＤＮ１８．１発現細胞への結合は認められず（図３参照）、４つのキメラ抗体の高い特異性が示唆された。
実施例４：ＡＤＣＣアッセイによる４つのキメラ抗体の機能確認
本実施例は、これら４つのキメラ抗体のＡＤＣＣを媒介した傷害活性を、参照ｍＡｂ（ＩＭＡＢ３６２、Ｇａｎｙｍｅｄ）と比較して試験する実施例である。
ＣＬＤＮ１８．２発現２９３Ｔ細胞およびＣＬＤＮ１８．１発現２９３Ｔ細胞は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＴＭ ＣＦＳＥ （Ｔｈｅｒｍｏ， Ｃａｔ． ＃６５－０８５０－８４） を用いてＣＦＳＥで標識した。Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ（Ｒ） Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａ （Ｃｅｄａｒｌａｎｅ， Ｃａｔ． ＃ ＣＬ５１１０）
（５０μＬ）中の４ ｘ １０５細胞／ｍｌでの密度のＣＦＳＥ標識した細胞を、希釈系列（２０．００、６．６７、２．２２、０．７４、０．２５、０．０８、０．０３ μｇ／ｍＬ 培地中）のキメラ抗体、参照抗体、またはＩｇＧネガティブコントロール（１００μＬ）を９６ウェルＶボトムプレート中で混合し、暗所、室温で１５分間インキュベートさせた。次に、５×１０６細胞／ｍｌの密度のＰＢＭＣ（５０μＬ）を加え、プレートを３７℃、暗所で２時間インキュベートさせた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＴＭ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒＴＭ
６６０ （Ｔｈｅｒｍｏ， Ｃａｔ． ＃ ６５－０８６４）の作業溶液を１ウェルあたり１００μＬ添加した。プレートを氷上、暗所で３０分インキュベートさせた。ＰＢＳで洗浄後、７５μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳと２５μＬ／ｗｅｌｌの４％パラホルムアルデヒドを加えて細胞を再懸濁し、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＨＴＳ）を用いてＦＡＣＳに供された。データ解析には傷害率（ＣＦＳＥ陽性集団対ＣＦＳＥ／ＦＶＤ－ＡＦ６６０ダブル陽性集団）が用いられ、プロットはＰｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄを用いて作成した。ＦＡＣＳベース法によるＡＤＣＣ活性は、４つのキメラ抗体がＣＬＤＮ１８．２発現細胞に対するＡＤＣＣ活性を媒介できることを示した（図４参照）。
（５０μＬ）中の４ ｘ １０５細胞／ｍｌでの密度のＣＦＳＥ標識した細胞を、希釈系列（２０．００、６．６７、２．２２、０．７４、０．２５、０．０８、０．０３ μｇ／ｍＬ 培地中）のキメラ抗体、参照抗体、またはＩｇＧネガティブコントロール（１００μＬ）を９６ウェルＶボトムプレート中で混合し、暗所、室温で１５分間インキュベートさせた。次に、５×１０６細胞／ｍｌの密度のＰＢＭＣ（５０μＬ）を加え、プレートを３７℃、暗所で２時間インキュベートさせた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＴＭ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒＴＭ
６６０ （Ｔｈｅｒｍｏ， Ｃａｔ． ＃ ６５－０８６４）の作業溶液を１ウェルあたり１００μＬ添加した。プレートを氷上、暗所で３０分インキュベートさせた。ＰＢＳで洗浄後、７５μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳと２５μＬ／ｗｅｌｌの４％パラホルムアルデヒドを加えて細胞を再懸濁し、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＨＴＳ）を用いてＦＡＣＳに供された。データ解析には傷害率（ＣＦＳＥ陽性集団対ＣＦＳＥ／ＦＶＤ－ＡＦ６６０ダブル陽性集団）が用いられ、プロットはＰｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄを用いて作成した。ＦＡＣＳベース法によるＡＤＣＣ活性は、４つのキメラ抗体がＣＬＤＮ１８．２発現細胞に対するＡＤＣＣ活性を媒介できることを示した（図４参照）。
実施例５：Ｆｃ改変されたキメラ抗体の特徴付け
さらに、４つのＦｃ改変されたキメラ抗体が構築された。第１世代の初期キメラ抗体ＹＬ－Ｇ１－１９－０１、ＹＬ－Ｇ１－１９－０２、ＹＬ－Ｇ１－１９－０３及びＹＬ－Ｇ１－１９－０４と比較して、第２世代のＦｃ改変キメラ抗体ＹＬ－Ｇ２－Ａ、ＹＬ－Ｇ２－Ｂ、ＹＬ－Ｇ２－Ｃ及びＹＬ－Ｇ２－Ｄ（ＹＬ－Ｇ１－１９－０４と比較して、ＹＬ－Ｇ２－Ｄでは、ＶＨドメインの最初の２つのＮ末端アミノ酸残基が存在しない）には、ＥＵの番号付けに従って、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｐ３９６Ｌという５つのＦｃ領域の置換が含まれている。ヒトＩｇＧ１重鎖の変異型定常領域（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む）は、配列番号４０に記載されている。
本実施例では、これらのＦｃ改変されたキメラ抗体の特徴付けを説明する。
５．１：抗原・抗体結合相互作用
本実施例は、ＹＬ－Ｇ２－Ｂ、ＹＬ－Ｇ２－ＣおよびＹＬ－Ｇ２－Ｄの抗原抗体結合相互作用の特徴付けを示す実施例である。
ＹＬ－Ｇ２－Ｂ、ＹＬ－Ｇ２－ＣおよびＹＬ－Ｇ２－Ｄのｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性は、ＫｉｎＥｘＡ ４０００システム（ＫｉｎＥｘＡ， ＵＳ）を用いて、組換えｈｕＣＬ
ＤＮ１８．２－ＦｃおよびｈｕＣＬＤＮ１８．２過剰発現ＣＨＯ細胞との結合をモニタリングすることにより分析した。
ＤＮ１８．２－ＦｃおよびｈｕＣＬＤＮ１８．２過剰発現ＣＨＯ細胞との結合をモニタリングすることにより分析した。
ＫｉｎＥｘＡ法を用いて親和性を測定するには、結合パートナーＡ（定結合パートナー、ＣＢＰとして知られている）のバックグラウンドで結合パートナーＢ（滴定剤として知られている）の連続希釈を実行した。つまり、ＣＢＰは一定の濃度を保ち、滴定液は濃度を変化させる。これらの溶液が平衡状態になると、ＫｉｎＥｘＡ ４０００装置は、溶液中に残っている未結合、または遊離な結合パートナーであるＣＢＰの量を直接測定することができる。Ｓａｐｉｄｙｎｅ社のソフトウェアを使用すると、ＣＢＰの遊離率を滴定液の総濃度に対してプロットして、結合曲線を作成し、親和性を決定することができる。
Ｋｄは、まずＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社から購入した抗体と組換えヒトＣＬＤＮ１８．２（Ｐ／Ｎ：２００４７－Ｈ０２Ｈ）を用いて測定した。平衡実験では、滴定液（ｈｕＣＬＤＮ１８．２）をＣＢＰのバックグラウンドで５倍ずつ連続希釈した。２つの平衡実験が行われた。１つは１０ｎＭの高濃度ＣＢＰ（２０ｎＭの結合部位）に５倍に連続希釈１５０ｎＭの滴定剤を加えたものであり、もう１つは１００ｐＭの低濃度ＣＢＰ（２００ｐＭの結合部位）に５倍に連続希釈１５０ｎＭの滴定剤を加えたものである。データはＫｉｎＥｘＡ ４０００で収集し、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ｎ－Ｃｕｒｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．４．２６を使用して解析した。結合曲線を図５に示す。
ＫｉｎＥｘＡ ４０００装置は、インタクトな細胞、すなわちｈｕＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するＣＨＯ細胞の表面タンパク質に対する抗体の結合親和性を測定するためにも使用された。抗体の濃度は定常に保ち（ＣＢＰ）、表面タンパク質を含む全細胞の濃度を変化させた（滴定）。表面タンパク質を含む全細胞の濃度は３倍に希釈した。滴定した細胞を定常結合パートナー（ＣＢＰ）とインキュベートした。平衡に達したところでサンプルを遠心分離し、上清を回収し、蛍光標識した抗ＣＢＰ分子で遊離ＣＢＰを検出した。結合曲線を図６に示す。
より正確なＫｄを設定するために、２つの平衡曲線を作成し、解析した。一つは低濃度のＣＢＰを１００ｐＭ（結合部位２００ｐＭ）と１０６細胞／ｍＬで３倍希釈した曲線であり、もう一つは高濃度のＣＢＰを１０ｎＭ（結合部位２０ｎＭ）と１０６細胞／ｍＬで３倍希釈した曲線である。ＫｉｎＥｘＡ ４０００は、溶液中の未結合ＣＢＰの量を測定した。解析は、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ｎ－Ｃｕｒｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．４．２６を使用して行った。平衡解離定数Ｋｄを表１にまとめて示す。
５．２：細胞結合アッセイ
本実施例では、ＹＬ－Ｇ２－Ｂ、 ＹＬ－Ｇ２－ＣおよびＹＬ－Ｇ２－Ｄの細胞結合アッセイを説明する。
抗体の結合を評価するために、ｈｕＣＬＤＮ１８．２を発現するＣＨＯ細胞を使用した。各サンプルについて、９６ウェルプレートの１ウェルに１００μｌあたり５×１０５個で細胞を播種した。次に、連続希釈した各抗体を１００μｌずつ細胞に加え、各希釈は４０μｇ／ｍｌから始め、５倍に希釈した。したがって、各抗体の最終濃度は２０μｇ／ｍｌから始めて、５倍の連続希釈が行われる。１時間後、細胞を２回洗浄し、１００μｌのＧＡＨ－ＦＩＴＣ（１：２００希釈）を各ウェルに添加した。３０分後、細胞を２回洗浄し、１２０μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。これらの細胞はフローサイトメトリーで分析した。
染色されていない細胞を参照として、標的細胞全体のゲーティングを設定し、ＦＩＴＣ陰性集団を確立することで、各細胞株のＦＩＴＣ陽性細胞ゲートを確立することができた。さらに、ＦＩＴＣ陽性の結果を二次的に検証するために、細胞集団全体の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出した。全生細胞数に対するゲートされた陽性細胞数の比率を陽性細胞の割合とした。結果を図７に示す。
５．３：補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）アッセイ
この実施例では、ＹＬ－Ｇ２－Ｂ、ＹＬ－Ｇ２－ＣおよびＹＬ－Ｇ２－Ｄの補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）アッセイを説明する。
標的細胞（すなわち、ｈｕＣＬＤＮ１８．２を発現するＣＨＯ細胞）は、ＤＰＢＳで１回洗浄した。その後、ＲＰＭＩで２×１０４細胞、１００μＬ／ウェルでＵ底プレートに播種した。抗体を１：２で連続希釈し、５０μｌ／ウェルで細胞と共に室温で１５分間インキュベートした。次に、５０μｌ／ｗｅｌｌの２０％プール血清を、自然放出および最大放出ウェルを含むすべてのウェルに添加した。プレートを３７℃のインキュベーターで３．５時間インキュベートした。インキュベーション終了４５分前に、プレートを１２００ｒｐｍで５分間遠心し、標的細胞を含む最大放出コントロールウェルにのみ２０μＬのＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ （ＣｙＱＵＡＮＴＴＭ ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ
Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，Ｃａｔ．＃ Ｃ２０３００およびＣ２０３０１）を添加した。上清５０μＬを黒壁９６ウェルプレートに移し、５０μＬ／ウェルのＲｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ＣｙＱＵＡＮＴＴＭ ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，Ｃａｔ．＃ Ｃ２０３００およびＣ２０３０１）とともに、すべてのウェル、最大放出ウェルおよび自然放出ウェルにも添加した。プレートは暗所で３０分間インキュベートした。インキュベーション終了後、５０μＬのＳｔｏｐ溶液（ＣｙＱＵＡＮＴＴＭ ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，Ｃａｔ．＃ Ｃ２０３００ ａｎｄ Ｃ２０３０１）をすべてのウェルに加え、タッピングにより穏やかに混合した。４９０ｎＭと６８０ｎＭでＯＤを測定した。活性は、細胞毒性％である。細胞毒性％＝（実験値－標的細胞自発、ｖｏｌ補正なし）／（標的細胞最大放出量－標的細胞自発、ｖｏｌ補正あり）＊１００。結果を図８に示す。
Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，Ｃａｔ．＃ Ｃ２０３００およびＣ２０３０１）を添加した。上清５０μＬを黒壁９６ウェルプレートに移し、５０μＬ／ウェルのＲｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ＣｙＱＵＡＮＴＴＭ ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，Ｃａｔ．＃ Ｃ２０３００およびＣ２０３０１）とともに、すべてのウェル、最大放出ウェルおよび自然放出ウェルにも添加した。プレートは暗所で３０分間インキュベートした。インキュベーション終了後、５０μＬのＳｔｏｐ溶液（ＣｙＱＵＡＮＴＴＭ ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，Ｃａｔ．＃ Ｃ２０３００ ａｎｄ Ｃ２０３０１）をすべてのウェルに加え、タッピングにより穏やかに混合した。４９０ｎＭと６８０ｎＭでＯＤを測定した。活性は、細胞毒性％である。細胞毒性％＝（実験値－標的細胞自発、ｖｏｌ補正なし）／（標的細胞最大放出量－標的細胞自発、ｖｏｌ補正あり）＊１００。結果を図８に示す。
５．４：インターナリゼーションアッセイ
この実施例では、ＹＬ－Ｇ２－Ｂ、ＹＬ－Ｇ２－ＣおよびＹＬ－Ｇ２－Ｄのインターナリゼーションアッセイを説明する。
ＤＭＥＭ培地での５×１０５／ｍｌのｈｕＣＬＤＮ１８．２を発現するＣＨＯ細胞を調製した。Ｕ底９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬの細胞を播種した。試験抗体とコントロール抗体を４０μｇ／ｍｌに希釈し、各抗体を１：４で培養液に連続希釈した。希釈した各抗体を５０μｌ／ｗｅｌｌで細胞に添加した。プレートを３７°Ｃで３０分間インキュベートした。次に、４０μｇ／ｍｌのＰＥＰ－ＺＡＰ（細胞毒性ペプチドと融合した小さなＦｃ結合ペプチド、開発元：ＡＢスタジオＡＢ Ｓｔｕｄｉｏ Ｉｎｃ．；ＷＯ ２０２０／０１８７３２ Ａ１参照）を５０μｌ／ｗｅｌｌで各ウェルに加え、ＰＥＰ－ＺＡＰの最終濃度を１０μｇ／ｍｌとした。プレートを３７°Ｃで７２時間インキュベートした。最後に、細胞をスピンさせ、ＬＤＨ測定のために１００μｌの上清を取った。結果を図９に示す。
５．５：抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）アッセイ
この実施例では、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）アッセイを説明する。
抗体のＡＤＣＣ機能を評価するために、標的細胞（ｈｕＣＬＤＮ１８．２を発現するＣＨＯ細胞）およびエフェクター細胞（ＮＫ ８８３７－Ｆ細胞、ＡＴＣＣ ＰＴＡ－８８３７）を使用した。標的細胞は、ＤＭＥＭ－Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地に、各サンプルについて９６ウェルプレートの１ウェルに５０μｌあたり２×１０４個で播種した。次に、１：１０に連続希釈した各抗体を１００μｌずつ細胞に添加した。２０分後、ＮＫ細胞を５０μｌあたり２×１０５個、標的：エフェクターの比率が１：１０となるようにプレート上に添加した。この添加後、各抗体の最終濃度は５０μｇ／ｍｌから始めて、５、０．５、０．０５μｇ／ｍｌと続く。このプレートを３７°Ｃ、ＣＯ２インキュベーターに２４時間置いた。次に、細胞を７ＡＡＤで染色し、２回洗浄し、約２００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。これらの細胞はフローサイトメトリーで分析した。
染色されていない細胞を参照として、標的細胞全体のゲーティングを設定し、７ＡＡＤ陰性集団を確立することで、７ＡＡＤ（死細胞）と生細胞の区別することができた。
また、ｈｕＣＬＤＮ１８．２を発現するＣＴ２６細胞を標的細胞として使用してもよく、ＬＤＨによってＡＤＣＣを決定しもよい。
ＹＬ－Ｇ１－０２とＹＬ－Ｇ２－Ｂ（Ｆｃ領域のＶＬＰＬＬ置換を除き、同じアミノ酸配列を有する）のＡＤＣＣ活性の比較を図１０に示す。ＥＣ５０は表２にまとめて示す。
実施例６：抗体の機能的特徴づけ
６.１:細胞
６.１:細胞
１０％ＦＢＳ（ＥｘＣｅｌｌ Ｂｉｏ、Ｃａｔ. Ｎｏ. ＦＮＤ５００）含有ＤＭＥＭ培
地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ. Ｎｏ. ３１０５３-０３６）で維持したＣＴ２６ ＣＬＤＮ１８
.２細胞（マウス結腸癌細胞、Ｋｙｉｎｎｏ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ. Ｎｏ. ＫＣ-１１９５）、１０％ＦＢＳ 含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ. Ｎｏ. Ｃａｔ.１４５）で維持したＫＡＴＯＩＩＩ ＣＬＤＮ１８.２細胞（ヒト胃癌細胞、
Ｋｙｉｎｎｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ. Ｎｏ. ＫＣ-１４５３）、および１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ. Ｎｏ. ２２４００-０８９
）で維持したＮＣＩ-Ｎ８７ ＣＬＤＮ１８.２細胞（ヒト胃癌細胞、Ｋｙｉｎｎｏ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ. Ｎｏ. ＫＣ-１２２２）はいずれもヒトＣＬＤＮ１８.２過剰発現腫瘍細胞であって、対象抗体のＣＤＣ活性およびＡＤＣＣ活性を決定するために使用した。
地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ. Ｎｏ. ３１０５３-０３６）で維持したＣＴ２６ ＣＬＤＮ１８
.２細胞（マウス結腸癌細胞、Ｋｙｉｎｎｏ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ. Ｎｏ. ＫＣ-１１９５）、１０％ＦＢＳ 含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ. Ｎｏ. Ｃａｔ.１４５）で維持したＫＡＴＯＩＩＩ ＣＬＤＮ１８.２細胞（ヒト胃癌細胞、
Ｋｙｉｎｎｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ. Ｎｏ. ＫＣ-１４５３）、および１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ. Ｎｏ. ２２４００-０８９
）で維持したＮＣＩ-Ｎ８７ ＣＬＤＮ１８.２細胞（ヒト胃癌細胞、Ｋｙｉｎｎｏ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ. Ｎｏ. ＫＣ-１２２２）はいずれもヒトＣＬＤＮ１８.２過剰発現腫瘍細胞であって、対象抗体のＣＤＣ活性およびＡＤＣＣ活性を決定するために使用した。
６.２：ＣＤＣアッセイ
対象抗体のＣＤＣ活性は、細胞溶解後に培養液中に放出されるＬＤＨレベルの変化を測定することにより評価した。ＣＴ２６ ＣＬＤＮ１８.２細胞またはＫＡＴＯＩＩＩ ＣＬ
ＤＮ１８.２細胞を、それぞれ４Ｅ+０５細胞/ｍｌまたは６Ｅ+０５または１Ｅ+０６細胞/ｍｌの密度で１％ＦＢＳを含むフェノールレッドなしのＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ. Ｎｏ. １１８３５-０３０）中に懸濁した。対象抗体は、１％ＦＢＳを含む
フェノールレッドなしのＲＰＭＩ１６４０培地で２００、５０、１２.５、３.１３、０.
７８、０.１９５、０.０４８８、０.０１２２、０.００３０５、０.０００７６３、０.０００１９１ｎＭに希釈した。正常ヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌ、Ｃａｔ.Ｎｏ.Ａ１１３）を、１％ＦＢＳを含むフェノールレッドなしのＲＰＭＩ１６４０培地で１：５０で希釈した。丸底９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ.Ｎｏ.３７９９）の各ウェルに、５０μＬ抗体希釈液、５０μＬ正常ヒト血清補体希釈液および５０μＬ腫瘍細胞懸濁液を添加した。ネガティブコントロールとして、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体を入れた。参照抗体（ＩＭＡＢ３６２、Ｇａｎｙｍｅｄ）はポジティブコントロールとして入れた。マイクロプレートを３７℃、５％ＣＯ２に設定したインキュベーター中で３～４時間インキュベートした。インキュベーション後、ＬＤＨ細胞毒性アッセイキット（Ｒｏｃｈｅ、Ｃａｔ.Ｎｏ.１１６４４７９３００１）に付属する説明書に従って、細胞培養物の上清へのＬＤＨの放出を検出した。簡単には、マイクロプレートを１５００ｒｐｍで５分間遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ, ｍｏｄｅｌ ５８１０Ｒ）し、各ウェルから７０μＬ
上清を取り、新しいマイクロプレート上のウェルに移した。次に、５０μＬのＬＤＨ検出基質を各ウェルに添加し、マイクロプレートを室温で０.５～２時間インキュベートした
。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＬＬＣ）を用い
て４９２ｎｍの光学密度（ＯＤ）を検出し、６９０ｎｍの光学密度を減算した（ＯＤ４９２ｎｍ - ＯＤ６９０ｎｍ）。対象抗体のＣＤＣ活性は、以下の式を用いて、特異的な細
胞溶解の割合によって算出した：
特異的な細胞溶解（％） = （ＯＤ抗体+補体+腫瘍細胞 － ＯＤ補体+腫瘍細胞） * １０
０ / （ＯＤ腫瘍細胞+Ｔｒｉｔｏｎ － ＯＤ 腫瘍細胞）。
ＤＮ１８.２細胞を、それぞれ４Ｅ+０５細胞/ｍｌまたは６Ｅ+０５または１Ｅ+０６細胞/ｍｌの密度で１％ＦＢＳを含むフェノールレッドなしのＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ. Ｎｏ. １１８３５-０３０）中に懸濁した。対象抗体は、１％ＦＢＳを含む
フェノールレッドなしのＲＰＭＩ１６４０培地で２００、５０、１２.５、３.１３、０.
７８、０.１９５、０.０４８８、０.０１２２、０.００３０５、０.０００７６３、０.０００１９１ｎＭに希釈した。正常ヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌ、Ｃａｔ.Ｎｏ.Ａ１１３）を、１％ＦＢＳを含むフェノールレッドなしのＲＰＭＩ１６４０培地で１：５０で希釈した。丸底９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ.Ｎｏ.３７９９）の各ウェルに、５０μＬ抗体希釈液、５０μＬ正常ヒト血清補体希釈液および５０μＬ腫瘍細胞懸濁液を添加した。ネガティブコントロールとして、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体を入れた。参照抗体（ＩＭＡＢ３６２、Ｇａｎｙｍｅｄ）はポジティブコントロールとして入れた。マイクロプレートを３７℃、５％ＣＯ２に設定したインキュベーター中で３～４時間インキュベートした。インキュベーション後、ＬＤＨ細胞毒性アッセイキット（Ｒｏｃｈｅ、Ｃａｔ.Ｎｏ.１１６４４７９３００１）に付属する説明書に従って、細胞培養物の上清へのＬＤＨの放出を検出した。簡単には、マイクロプレートを１５００ｒｐｍで５分間遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ, ｍｏｄｅｌ ５８１０Ｒ）し、各ウェルから７０μＬ
上清を取り、新しいマイクロプレート上のウェルに移した。次に、５０μＬのＬＤＨ検出基質を各ウェルに添加し、マイクロプレートを室温で０.５～２時間インキュベートした
。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＬＬＣ）を用い
て４９２ｎｍの光学密度（ＯＤ）を検出し、６９０ｎｍの光学密度を減算した（ＯＤ４９２ｎｍ - ＯＤ６９０ｎｍ）。対象抗体のＣＤＣ活性は、以下の式を用いて、特異的な細
胞溶解の割合によって算出した：
特異的な細胞溶解（％） = （ＯＤ抗体+補体+腫瘍細胞 － ＯＤ補体+腫瘍細胞） * １０
０ / （ＯＤ腫瘍細胞+Ｔｒｉｔｏｎ － ＯＤ 腫瘍細胞）。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェアを用いて４つのパラメータを含む非線形回帰によってデータを解析し、ＥＣ５０値を算出した。
６.３：ＡＤＣＣアッセイ
対象抗体のＡＤＣＣ活性は、細胞溶解後に培養液中に放出されるＬＤＨの量の変化を測定することにより評価した。ＮＣＩ-Ｎ８７ ＣＬＤＮ１８.２細胞またはＫＡＴＯＩＩＩ ＣＬＤＮ１８.２細胞を、フェノールレッドなしのＲＰＭＩ１６４０培地に６Ｅ+０５細胞/ｍＬの密度で懸濁した。対象抗体は、１％ＦＢＳを含むフェノールレッドなしのＲＰＭ
Ｉ１６４０培地で２０、４、０.８、０.１６、０.０３２、０.００６４、１.２８Ｅ-０３、２.５６Ｅ-０４、５.１２Ｅ-０５、１.０２Ｅ-０５、２.０５Ｅ-０６、４.１０Ｅ-０７
、８.１９Ｅ-０８、１.６４Ｅ-０８、３.２８Ｅ-０９、６.５５Ｅ-１０、１.３１Ｅ-１０、２.６２Ｅ-１１ 及び ５.２４Ｅ-１２ｎＭに希釈した。新鮮なヒトＰＢＭＣ細胞（Ｓａｉｌｙ、ボランティア#ＸＣ１１０５７Ｗから）を、１％ＦＢＳを含むフェノールレッド
なしのＲＰＭＩ１６４０培地に、１.２Ｅ+０７細胞/ｍＬの密度で懸濁した。丸底９６ウ
ェルマイクロプレートの各ウェルに、５０μＬ抗体希釈液、５０μＬヒトＰＢＭＣ細胞懸濁液および５０μＬ腫瘍細胞懸濁液を加えた。ネガティブコントロールとして、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体を入れた。参照ｍＡｂ（ＩＭＡＢ３６２、Ｇａｎｙｍｅｄ）はポジティブコントロールとして入れた。マイクロプレートを３７℃、５％ＣＯ２に設定したインキュベータで４～６時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞培養物の上清へのＬＤＨの放出を、上記のＬＤＨ細胞毒性アッセイキットに付属する説明書に従って検出した。対象抗体のＡＤＣＣ活性は、以下の式を用いて、特異的な細胞溶解の割合によって算出した：
特異的な細胞溶解（％） = （ＯＤ抗体+ＰＢＭＣ+腫瘍細胞－ ＯＤＰＢＭＣ+腫瘍細胞） * １００ / （ＯＤ腫瘍細胞+Ｔｒｉｔｏｎ － ＯＤ腫瘍細胞）。
Ｉ１６４０培地で２０、４、０.８、０.１６、０.０３２、０.００６４、１.２８Ｅ-０３、２.５６Ｅ-０４、５.１２Ｅ-０５、１.０２Ｅ-０５、２.０５Ｅ-０６、４.１０Ｅ-０７
、８.１９Ｅ-０８、１.６４Ｅ-０８、３.２８Ｅ-０９、６.５５Ｅ-１０、１.３１Ｅ-１０、２.６２Ｅ-１１ 及び ５.２４Ｅ-１２ｎＭに希釈した。新鮮なヒトＰＢＭＣ細胞（Ｓａｉｌｙ、ボランティア#ＸＣ１１０５７Ｗから）を、１％ＦＢＳを含むフェノールレッド
なしのＲＰＭＩ１６４０培地に、１.２Ｅ+０７細胞/ｍＬの密度で懸濁した。丸底９６ウ
ェルマイクロプレートの各ウェルに、５０μＬ抗体希釈液、５０μＬヒトＰＢＭＣ細胞懸濁液および５０μＬ腫瘍細胞懸濁液を加えた。ネガティブコントロールとして、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体を入れた。参照ｍＡｂ（ＩＭＡＢ３６２、Ｇａｎｙｍｅｄ）はポジティブコントロールとして入れた。マイクロプレートを３７℃、５％ＣＯ２に設定したインキュベータで４～６時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞培養物の上清へのＬＤＨの放出を、上記のＬＤＨ細胞毒性アッセイキットに付属する説明書に従って検出した。対象抗体のＡＤＣＣ活性は、以下の式を用いて、特異的な細胞溶解の割合によって算出した：
特異的な細胞溶解（％） = （ＯＤ抗体+ＰＢＭＣ+腫瘍細胞－ ＯＤＰＢＭＣ+腫瘍細胞） * １００ / （ＯＤ腫瘍細胞+Ｔｒｉｔｏｎ － ＯＤ腫瘍細胞）。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェアを用いて４つのパラメータを含む非線形回帰によってデータを解析し、ＥＣ５０値を算出した。
６.４：ＬＤＨ アッセイによる、ＣＴ２６ ＣＬＤＮ１８.２細胞に対するＣＤＣ効果
図１１および表３に示すように、２つのバッチのＹＬ-Ｇ２-Ｂは、ＣＴ２６ ＣＬＤＮ
１８.２細胞に対して同等のＣＤＣ効果を示した（図１１、パネルＡ）。ＹＬ-Ｇ１-１９-０２、ＹＬ-Ｇ２-Ｂ、ＹＬ-Ｇ１-１９-０３、ＹＬ-Ｇ２-Ｃ、ＹＬ-Ｇ１-１９-０４、およびＹＬ-Ｇ２-Ｄはいずれも、ＣＴ２６ ＣＬＤＮ１８.２細胞に対して、ポジティブコントロールよりも強いＣＤＣ効果を示した（図１１）。
１８.２細胞に対して同等のＣＤＣ効果を示した（図１１、パネルＡ）。ＹＬ-Ｇ１-１９-０２、ＹＬ-Ｇ２-Ｂ、ＹＬ-Ｇ１-１９-０３、ＹＬ-Ｇ２-Ｃ、ＹＬ-Ｇ１-１９-０４、およびＹＬ-Ｇ２-Ｄはいずれも、ＣＴ２６ ＣＬＤＮ１８.２細胞に対して、ポジティブコントロールよりも強いＣＤＣ効果を示した（図１１）。
６.５：ＬＤＨ アッセイによるＫＡＴＯＩＩＩ ＣＬＤＮ１８.２細胞に対するＣＤＣ効果
図１２および表４に示すように、２つのバッチのＹＬ-Ｇ２-Ｂは、ＣＴ２６ ＣＬＤＮ
１８.２細胞に対して同等のＣＤＣ効果を示した（図１２、パネルＡ）。ＹＬ-Ｇ１-１９-０２、ＹＬ-Ｇ２-Ｂ、ＹＬ-Ｇ１-１９-０３、ＹＬ-Ｇ２-Ｃ、ＹＬ-Ｇ１-１９-０４およびＹＬ-Ｇ２-Ｄのいずれも、ＫＡＴＯＩＩＩ ＣＬＤＮ１８.２細胞に対してポジティブコントロール、ポジティブコントロールより強いＣＤＣ効果を示した（図１２）。
１８.２細胞に対して同等のＣＤＣ効果を示した（図１２、パネルＡ）。ＹＬ-Ｇ１-１９-０２、ＹＬ-Ｇ２-Ｂ、ＹＬ-Ｇ１-１９-０３、ＹＬ-Ｇ２-Ｃ、ＹＬ-Ｇ１-１９-０４およびＹＬ-Ｇ２-Ｄのいずれも、ＫＡＴＯＩＩＩ ＣＬＤＮ１８.２細胞に対してポジティブコントロール、ポジティブコントロールより強いＣＤＣ効果を示した（図１２）。
６.６：ＬＤＨ アッセイによるＫＡＴＯＩＩＩ ＣＬＤＮ１８.２細胞に対するＡＤＣＣ効果
図１３および表５に示すように、２つのバッチのＹＬ-Ｇ２-Ｂは、ＫＡＴＯＩＩＩ Ｃ
ＬＤＮ１８.２細胞に対して同等のＡＤＣＣ効果を示した（図１３、パネルＡ）。ＹＬ-Ｇ２-Ｂ（異なるバッチではＥＣ５０ = ０.０２８ｎＭまたは０.０１８ｎＭ）、ＹＬ-Ｇ２-Ｃ（ＥＣ５０ = ０.０１９ｎＭ）およびＹＬ-Ｇ２-Ｄ（ＥＣ５０ = ０.０２１ｎＭ）は、より強いＡＤＣＣ効果（低ＥＣ５０）を示し、ＹＬ-Ｇ１-１９-０２（ＥＣ５０ = ０.１
６ｎＭ）、ＹＬ-Ｇ１-１９-０３（ＥＣ５０ = ０. ２１ｎＭ）、ＹＬ-Ｇ１-１９-０４（
ＥＣ５０ = ０.１４ｎＭ）は、ＫＡＴＯＩＩＩ ＣＬＤＮ１８.２細胞に対して、ポジティブコントロール（３つのランでＥＣ５０ = ０.１２ｎＭ、０.２２ｎＭまたは０.２７ｎＭ）と比較して同等のＡＤＣＣ効果を示した（図１３）。
ＬＤＮ１８.２細胞に対して同等のＡＤＣＣ効果を示した（図１３、パネルＡ）。ＹＬ-Ｇ２-Ｂ（異なるバッチではＥＣ５０ = ０.０２８ｎＭまたは０.０１８ｎＭ）、ＹＬ-Ｇ２-Ｃ（ＥＣ５０ = ０.０１９ｎＭ）およびＹＬ-Ｇ２-Ｄ（ＥＣ５０ = ０.０２１ｎＭ）は、より強いＡＤＣＣ効果（低ＥＣ５０）を示し、ＹＬ-Ｇ１-１９-０２（ＥＣ５０ = ０.１
６ｎＭ）、ＹＬ-Ｇ１-１９-０３（ＥＣ５０ = ０. ２１ｎＭ）、ＹＬ-Ｇ１-１９-０４（
ＥＣ５０ = ０.１４ｎＭ）は、ＫＡＴＯＩＩＩ ＣＬＤＮ１８.２細胞に対して、ポジティブコントロール（３つのランでＥＣ５０ = ０.１２ｎＭ、０.２２ｎＭまたは０.２７ｎＭ）と比較して同等のＡＤＣＣ効果を示した（図１３）。
６.７：ＬＤＨ アッセイによるＮＣＩ-Ｎ８７ ＣＬＤＮ１８.２細胞に対するＡＤＣＣ効
果
果
図１４および表６に示すように、２つのバッチのＹＬ-Ｇ２-Ｂは、ＮＣＩ-Ｎ８７ ＣＬＤＮ１８.２細胞に対して同等のＡＤＣＣ効果を示した（図１４、パネルＡ）。ＹＬ-Ｇ２-Ｂ（異なるバッチではＥＣ５０ = ０.００６７ｎＭまたは０.０１２ｎＭ）、ＹＬ-Ｇ２-Ｃ（ＥＣ５０ = ０.００７８ｎＭ）およびＹＬ-Ｇ２-Ｄ（ＥＣ５０ = ０.００８９ｎＭ）は、より強いＡＤＣＣ効果（低ＥＣ５０）を示し、ＹＬ-Ｇ１-１９-０２（ＥＣ５０ = ０.０７２ｎＭ）、ＹＬ-Ｇ１-１９-０３（ＥＣ５０ = ０.１３ｎＭ）、ＹＬ-Ｇ１-１９-０
４（ＥＣ５０ = ０.０６７ｎＭ）は、ＫＡＴＯＩＩＩ ＣＬＤＮ１８.２細胞に対して、ポジティブコントロール（３つのランでＥＣ５０= ０.０５７ｎＭ、０.０８２ｎＭまたは０.１０ｎＭ）と比較して同等のＡＤＣＣ効果を示した（図１４）。
４（ＥＣ５０ = ０.０６７ｎＭ）は、ＫＡＴＯＩＩＩ ＣＬＤＮ１８.２細胞に対して、ポジティブコントロール（３つのランでＥＣ５０= ０.０５７ｎＭ、０.０８２ｎＭまたは０.１０ｎＭ）と比較して同等のＡＤＣＣ効果を示した（図１４）。
６.８：ＳＰＲ
対象抗体の結合親和性は、ＵＳＰ ４３ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＴＥＳＴ ＭＥＴＨＯＤＳ -- ＳＵＲＦＡＣＥ ＰＬＡＳＭＯＮ ＲＥＳＯＮＡＮＣＥ <１１０５>およびＣ
Ｐ, ２０２０ ｅｄｉｔｉｏｎ, Ｐａｒｔ ＩＶ, Ｇｅｎｅｒａｌ Ｒｕｌｅｓ, ３４２９ ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ, ＮＯＮ-ＬＡＢＥＬＩＮＧ ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ （ＩＶ） ＳＵＲＦＡＣＥ ＰＬＡＳＭＯＮ ＲＥＳＯＮＡＮＣＥに
従って、ヒト抗体捕捉キット、タイプ２（Ｃｙｔｉｖａ、Ｃａｔ. Ｎｏ. ２９２３４６００）を用いてＳＰＲにより測定した。簡単に、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を固定化バッファーで２５μｇ/ｍＬに希釈し、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ ＣＭ５チップ（Ｃｙｔｉｖａ社、Ｃａｔ Ｎｏ.ＢＲ１００５３０）に１０μＬ/分の流速で６分間注入し、カップ
リング二次抗体が約７０００～１４０００応答単位（ＲＵ）となった。次に、対象抗体をランニングバッファーで５μｇ/ｍＬに希釈し、１０μＬ/分の流速で注入し、カップリング一次抗体が約２００ＲＵとなった。動態測定には、Ｈｉｓタグ付きヒトＣｌａｕｄｉｎ-１８.２の２倍連続希釈液（０.１９５-５０ｎＭ）を３０μＬ/分の流速で注入し、Ｂｉ
ａｃｏｒｅ ８Ｋ（Ｃｙｔｉｖａ）で結合は１２０秒、解離は３００秒間モニターした。
結合速度（ｋａ）と解離速度（ｋｄ）は、単純な１対１結合モデルを用いて、結合と解離のセンサーグラムを同時にフィッティングさせることにより算出した。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｄ/ｋａ比率として算出した。結果を下記表７に示す。
Ｐ, ２０２０ ｅｄｉｔｉｏｎ, Ｐａｒｔ ＩＶ, Ｇｅｎｅｒａｌ Ｒｕｌｅｓ, ３４２９ ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ, ＮＯＮ-ＬＡＢＥＬＩＮＧ ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ （ＩＶ） ＳＵＲＦＡＣＥ ＰＬＡＳＭＯＮ ＲＥＳＯＮＡＮＣＥに
従って、ヒト抗体捕捉キット、タイプ２（Ｃｙｔｉｖａ、Ｃａｔ. Ｎｏ. ２９２３４６００）を用いてＳＰＲにより測定した。簡単に、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を固定化バッファーで２５μｇ/ｍＬに希釈し、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ ＣＭ５チップ（Ｃｙｔｉｖａ社、Ｃａｔ Ｎｏ.ＢＲ１００５３０）に１０μＬ/分の流速で６分間注入し、カップ
リング二次抗体が約７０００～１４０００応答単位（ＲＵ）となった。次に、対象抗体をランニングバッファーで５μｇ/ｍＬに希釈し、１０μＬ/分の流速で注入し、カップリング一次抗体が約２００ＲＵとなった。動態測定には、Ｈｉｓタグ付きヒトＣｌａｕｄｉｎ-１８.２の２倍連続希釈液（０.１９５-５０ｎＭ）を３０μＬ/分の流速で注入し、Ｂｉ
ａｃｏｒｅ ８Ｋ（Ｃｙｔｉｖａ）で結合は１２０秒、解離は３００秒間モニターした。
結合速度（ｋａ）と解離速度（ｋｄ）は、単純な１対１結合モデルを用いて、結合と解離のセンサーグラムを同時にフィッティングさせることにより算出した。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｄ/ｋａ比率として算出した。結果を下記表７に示す。
配列表
配列表（続き）
配列表（続き）
配列表（続き）
配列表（続き）
Claims (21)
- ＣＬＤＮ１８.２に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、配列番号５で表され
るとおりのＶＨ内に含まれるＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｈ３、および配列
番号６で表されるとおりのＶＬ内に含まれるＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２およびＨＶＲ-Ｌ
３を含む、モノクローナル抗体。 - （１）配列番号２３で表されるとおりのＨＶＲ-Ｈ１、配列番号２４で表されるとおりの
ＨＶＲ-Ｈ２、配列番号２５で表されるとおりのＨＶＲ-Ｈ３、配列番号２６で表されるとおりのＨＶＲ-Ｌ１、配列番号２７で表されるとおりのＨＶＲ-Ｌ２、および配列番号２８で表されるとおりのＨＶＲ-Ｌ３；
（２）配列番号４０で表されるとおりのＨＶＲ-Ｈ１、配列番号４１で表されるとおりの
ＨＶＲ-Ｈ２、配列番号４２で表されるとおりのＨＶＲ-Ｈ３、配列番号４３で表されるとおりのＨＶＲ-Ｌ１、配列番号４４で表されるとおりのＨＶＲ-Ｌ２、および配列番号４５で表されるとおりのＨＶＲ-Ｌ３；
（３）配列番号４６で表されるとおりのＨＶＲ-Ｈ１、配列番号４７で表されるとおりの
ＨＶＲ-Ｈ２、配列番号４８で表されるとおりのＨＶＲ-Ｈ３、配列番号４９で表されるとおりのＨＶＲ-Ｌ１、配列番号５０で表されるとおりのＨＶＲ-Ｌ２、および配列番号５１で表されるとおりのＨＶＲ-Ｌ３；あるいは
（４）配列番号５２で表されるとおりのＨＶＲ-Ｈ１、配列番号５３で表されるとおりの
ＨＶＲ-Ｈ２、配列番号５４で表されるとおりのＨＶＲ-Ｈ３、配列番号５５で表されるとおりのＨＶＲ-Ｌ１、配列番号５６で表されるとおりのＨＶＲ-Ｌ２、および配列番号５７で表されるとおりのＨＶＲ-Ｌ３を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。 - 配列番号５で表されるとおりのＶＨ、および配列番号６で表されるとおりのＶＬを含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
- マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１～３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
- 完全長抗体である、請求項１～３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
- 以下を含む、請求項５に記載のモノクローナル抗体：
任意に配列番号９で表されるとおりのものである、ヒトＩｇＧ、特にＩｇＧ１の重鎖定常領域、および/または任意に配列番号１０で表されるとおりのものである、ヒトカッパ軽
鎖定常領域。 - 抗原結合抗体フラグメントであり、任意に、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、およびダイアボディからなる群から選択されるものである、請求項１～３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
- 前記モノクローナル抗体が、単離された、裸の、および/またはコンジュゲート化された
ものである、請求項１～７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。 - ＣＬＤＮ１８.２に特異的に結合する、Ｆｃ改変されたモノクローナル抗体であって、配
列番号５で表されるとおりのＶＨ内に含まれる ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｈ３、および配列番号６で表されるとおりのＶＬ内に含まれる ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ
２およびＨＶＲ-Ｌ３を含み、Ｆｃ領域において１つ以上の変異を含む、モノクローナル
抗体。 - （１）配列番号２３で表されるとおりのＨＶＲ-Ｈ１、配列番号２４で表されるとおりの
ＨＶＲ-Ｈ２、配列番号２５で表されるとおりのＨＶＲ-Ｈ３、配列番号２６で表されるとおりのＨＶＲ-Ｌ１、配列番号２７で表されるとおりのＨＶＲ-Ｌ２、および配列番号２８で表されるとおりのＨＶＲ-Ｌ３；
（２）配列番号４１で表されるとおりのＨＶＲ-Ｈ１、配列番号４２で表されるとおりの
ＨＶＲ-Ｈ２、配列番号４３で表されるとおりのＨＶＲ-Ｈ３、配列番号４４で表されるとおりのＨＶＲ-Ｌ１、配列番号４５で表されるとおりのＨＶＲ-Ｌ２、および配列番号４６で表されるとおりのＨＶＲ-Ｌ３；
（３）配列番号４７で表されるとおりのＨＶＲ-Ｈ１、配列番号４８で表されるとおりの
ＨＶＲ-Ｈ２、配列番号４９で表されるとおりのＨＶＲ-Ｈ３、配列番号５０で表されるとおりのＨＶＲ-Ｌ１、配列番号５１で表されるとおりのＨＶＲ-Ｌ２、および配列番号５２で表されるとおりのＨＶＲ-Ｌ３；あるいは
（４）配列番号５３で表されるとおりのＨＶＲ-Ｈ１、配列番号５４で表されるとおりの
ＨＶＲ-Ｈ２、配列番号５５で表されるとおりのＨＶＲ-Ｈ３、配列番号５６で表されるとおりのＨＶＲ-Ｌ１、配列番号５７で表されるとおりのＨＶＲ-Ｌ２、および配列番号５８で表されるとおりのＨＶＲ-Ｌ３を含む、請求項９に記載のモノクローナル抗体。 - 配列番号５で表されるとおりのＶＨ および配列番号６で表されるとおりのＶＬを含み、
任意に、ＶＨのＮ末端の最初の２つのアミノ酸残基は存在しない、請求項９に記載のモノクローナル抗体。 - キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項９～１１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
- 前記Ｆｃ領域における１つ以上の変異は、Ｆｃ受容体への結合および/またはエフェクタ
ー機能、例えばＡＤＣＣおよび/またはＣＤＣ、を修飾（例えば、増加または減少）させ
る１つ以上の変異である、請求項９～１２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。 - 前記Ｆｃ領域における１つ以上の変異は、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００ＬおよびＰ３９６Ｌからなる群から選択される１つ以上の置換である、請求項１３に記載のモノクローナル抗体。
- ヒトＩｇＧ、特にＩｇＧ１、の重鎖定常領域、任意に配列番号４０で表されるとおりのものを含む、および/またはヒトカッパ軽鎖定常領域、任意に配列番号１０で表されるとお
りのものを含む、請求項９～１１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。 - 前記モノクローナル抗体が、単離された、裸の、および/またはコンジュゲート化された
ものである、請求項９～１５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。 - 請求項１～１６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体をコードする、単離された核酸。
- 請求項１７の核酸を含む、ベクター。
- 請求項１７の核酸または請求項１８のベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項１～１６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を生産する方法であって、抗体が産生されるように請求項１９に記載の宿主細胞を培養することを含み、任意に、宿主細胞又は細胞培養培地から抗体を回収することを含む、方法。
- 請求項１～１６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を含む、組成物。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNPCT/CN2021/097239 | 2021-05-31 | ||
| CNPCT/CN2021/097240 | 2021-05-31 | ||
| CNPCT/CN2021/106783 | 2021-07-16 | ||
| CNPCT/CN2021/106784 | 2021-07-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2024521885A true JP2024521885A (ja) | 2024-06-04 |
Family
ID=
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