UA119226C2 - Антитіло, яке специфічно зв'язується з axl, та його застосування як продукту для адресної доставки при лікуванні раку - Google Patents

Антитіло, яке специфічно зв'язується з axl, та його застосування як продукту для адресної доставки при лікуванні раку Download PDF

Info

Publication number
UA119226C2
UA119226C2 UAA201405805A UA201405805A UA119226C2 UA 119226 C2 UA119226 C2 UA 119226C2 UA A201405805 A UAA201405805 A UA A201405805A UA 201405805 A UA201405805 A UA 201405805A UA 119226 C2 UA119226 C2 UA 119226C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
antigen
cells
binding
protein
Prior art date
Application number
UAA201405805A
Other languages
English (en)
Inventor
Шарлотт БО-ЛАРВОР
Ліліан Гьотш
Ніколя Бут
Original Assignee
Пьєр Фабр Медікамент
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Пьєр Фабр Медікамент filed Critical Пьєр Фабр Медікамент
Publication of UA119226C2 publication Critical patent/UA119226C2/uk

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5035—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on sub-cellular localization
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2497—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing N- glycosyl compounds (3.2.2)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/02—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2) hydrolysing N-glycosyl compounds (3.2.2)
    • C12Y302/02022—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2) hydrolysing N-glycosyl compounds (3.2.2) rRNA N-glycosylase (3.2.2.22)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Abstract

Винахід стосується антитіла, яке специфічно зв'язуватися з білком Ахl, застосування такого антитіла, імунокон’югата, що містить таке антитіло, застосування імунокон’югата, фармацевтичної композиції та гібридоми, яка продукує таке антитіло.

Description

Винахід стосується антитіла, яке специфічно зв'язуватися з білком Ахі, застосування такого антитіла, імунокон'югата, що містить таке антитіло, застосування імунокон'югата, фармацевтичної композиції та гібридоми, яка продукує таке антитіло.
Даний винахід стосується нового антигензв'язувального білка, зокрема моноклонального антитіла, здатного специфічно зв'язуватися з білком Ахі, а також амінокислотної та нуклеотидної послідовностей, що кодують вказаний білок. В одному аспекті винахід стосується нового антигензв'язувального білка або антигензв'язувальних фрагментів, здатних специфічно зв'язуватися з Ахі і, викликаючи інтерналізацію Ахі, зазнавати інтерналізації в клітину. Винахід також стосується застосування вказаного антигензв'язувального білка як продукту для адресної доставки при кон'югації з іншими протипухлинними сполуками, такими як токсини, радіоактивні елементи або лікарські засоби, а також його застосування при лікуванні деяких форм раку. "Ахі" (також позначуваний "То", "АК" або "Туго7") був клонований з клітин пацієнтів з хронічним мієлоїдним лейкозом як онкоген, який при надекспресії в мишачих МІНЗТЗ викликав трансформацію цих клітин. Він належить до сімейства рецепторів, що мають тирозинкіназну активність (КТК, від англ. гесеріог їугозіпе Кіпазе5), яке носить назву сімейства ТАМ (Туго3, АХІ,
Мег), що включає ТугоЗ (К5е, 5Ку, БІК, ЕК, Вгі, Ті), Ах! та Мег (ЕУК, МУК, Туго-12) ШетКе С. Маї.
Вем. Іттипої. (2008).8, 327-336).
Людський білок АхіІ є білком, що складається з 894 амінокислот, послідовність якого представлена послідовністю 5ЕО ІЮ МО. 29. Амінокислоти 1-25 відповідають сигнальному пептиду, а людський білок Ахі без вказаного сигнального пептиду представлений амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО. 30.
Са56б, спочатку виділений як ген блокування росту, є спільним лігандом для представників сімейства ТАМ |Магпит В.С. еї а. Мабиге (1995).373, 623-626). Са5зб має найбільшу афінність до
АХІ, за ним йде ТугоЗ і, зрештою, Мег ІМадаїа К. еї аї. 9. Віої. Спет. (1996).271, 30022-30027).
Са5б містить домен, багатий у-карбоксиглутаміновою кислотою (Сіа), який опосередковує зв'язування з фосфоліпідними мембранами, чотири домени, подібних епідермальному фактору росту, та два ламінін с-подібних (І С, від англ. Іатіпіп О-ІїкКе) домени (Мапійо|ені ., Вгапсоїїпі, С,
Амапі, й. в ЗсПпеїдег, С. Мої. Сеї! Віої. (1993).13, 4976-4985). Як і у багатьох інших КТК, зв'язування ліганду приводить до димеризації рецептора та аутофосфорилування залишків тирозину (тирозинові залишки 779, 821 та 866 рецептора АХІ), які служат сайтами приєднання множини внутрішньоклітинних сигнальних молекул ІСіпдег К.М. Адм. Сапсег Кев5. (2008).100, 35- 831. Крім того, рецептор Ах! може активуватися при ліганд-незалежних процесах. Така активація
Зо може мати місце при надекспресії рецептора АХІ.
Відомо, що сигнальний шлях (за5б/Ахі регулює різні клітинні процеси у цілого ряду клітин іп міго, включаючи клітинну проліферацію, адгезію, міграцію та виживаність (ІНаїїйі 5. 5 Бапібаск,
В. РЕВ5 3). (2006).273, 5231-5244). Крім того, рецептори ТАМ беруть участь в контролюванні природженого імунітету; вони інгібують запальні відповіді на патогени у дендритних клітин (ДК) та макрофагів. вони також сприяють фагоцитозу апоптотичних клітин цими клітинами імунної системи та є необхідними для дозрівання та цитолітичної активності природних кілерних (МК, від англ. пайгаї КкіПег) клітин |ГеткКе 0. Маї. Кем. Іттипої. (2008).68, 327-336).
При слабкій експресії нормальними клітинами, він переважно виявляється на фібробластах, мієлоїдних клітинах-попередниках, макрофагах, нервовій тканині, серцевій та скелетній мускулатурі, де він переважно підтримує виживаність клітин. Система Сабзб/Ахі відіграє важливу роль в судинній біології, регулюючи гомеостаз гладком'язових клітин судинної стінки (Когепипом
М.А., Монпап, А.М., Сеогоаег, М.А. а Веїк, В.С. Сікс. Ве5. (2006).98, 1446-1452; Когзпипом У.А.,
Башці, М., Маззей, М.Р. 4. Вегк, В.С. Нурепепвіоп (2007).50, 1057-1062.
АХхі відіграє важливу роль в регуляції інвазії та міграції пухлинних клітин. Надекспресія АХхі асоційована не тільки з несприятливим прогнозом, але також з підвищеною пухлинною інвазією при різних формах раку людини, яка описана для раку молочної залози, товстої кишки, карциноми стравоходу, гепатоцелюлярної карциноми, раку шлунка, гліоми, раку легені, меланоми, остеосаркоми, раку яєчників, передміхурової залози, рабдоміосаркоми, раку нирки, щитоподібної залози та раку ендометрія матки (див. огляди Гіпдег К.М. Адм. Сапсег Кев. (2008).100, 35-83, та Мегта А. Мої. Сапсег Тег. (2011).10, 1763-1773). При раку молочної залози
АхІ є потужним ефектором епітеліально-мезенхімального переходу (ЕМП); механізм ЕМП відіграє важливу роль в міграції та дисемінації пухлинних клітин в організмі | Піегу У.Р. Сиїтт.
Оріп. Сеї! Вісі. (2003).15, 740-746.
Також було показано, що Ахі регулює ангіогенез. Дійсно, інактивація (нокдаун) Ахі в ендотеліальних клітинах порушує формування мікротрубочок та міграцію (НоМПапа 5.9. єї аї.
Сапсег Вез. (2005).65, 9294-9303), а також порушує роботу певних сигнальних шляхів, що беруть участь в регуляції ангіогенезу (і У. еї аІ. Опсодепе (2009).28, 3442-3455).
Зовсім недавно в декількох дослідженнях з використанням ряду клітинних моделей було продемонстровано, що надекспресія Ах! зв'язана з феноменом резистентності до лікарських бо препаратів. В наведеній нижче Таблиці 1 узагальнені дані цих досліджень.
Таблиця 1
Недрібноклітинний рак . Клони СІ-1 ! . Лапатиніб (інгібітор НЕКТ |НЕВ2 (-) ВТА74 . Темозоломід Карбоплатин |с12 легені
У Таблиці 1 згадуються такі публікації: - Масієса, К. єї а). Сапсег Вевз. (2005).65, 6789-6800 - Манпадемап 0. єї аї. Опсодепе (2007).26, 3909-3919 - І ау У.О. еі аї. Сапсег Вез. (2007).67, 3878-3887 - Нопд С.С. ві а). Сапсег І ен. (2008).268, 314-324 - Ци М. егаІ. Сапсег Вез. (2009).69, 6871-6878 - Кеаїйіпд А.К. єї аІ. Мої. Сапсег Тнег. (2010).9, 1298-1307 - Ме Х. ві аі. Опсодепе (2010).29, 5254-5264
У зв'язку з цим, АхіІ КТК є мішенню, цікавою з погляду онкології. Декілька груп дослідників вже розробили протипухлинні стратегії, націлені на вісь да5б/Ахі, в яких використовуються голі моноклональні антитіла або низькомолекулярні інгібітори (Мегта А. Мої. Сапсег Тпег. (2011).10, 1763-1773).
В першому втіленні винахід стосується антигензв'язувального білка або його антигензв'язувального фрагмента, який ї) специфічно зв'язується з людським білком АХІ|, та ії) зазнає інтерналізації після його зв'язування з вказаним людським білком АХІ.
Загалом, винахід стосується застосування білка Ахі для відбору антигензв'язувального білка або його антигензв'язувального фрагмента, здатних зазнавати інтерналізації після зв'язування з вказаною мішенню Ахі. Більш конкретно, вказана мішень є позаклітинним доменом АХІ.
Таким чином, цей конкретний аспект даного винаходу стосується способу проведення скринінгу іп мійго по відношенню до сполуки або її зв'язувального фрагмента, здатних здійснювати доставку в клітини ссавців або інтерналізацію клітинами ссавців молекули, що представляє інтерес, де вказана молекула, що представляє інтерес, ковалентно зв'язана з вказаною сполукою, при цьому вказаний спосіб включає такі етапи: а) відбір сполуки, здатної специфічно зв'язуватися з білком АхіІ або його позаклітинним доменом (ЕСО) або його епітопом;
Б) можливо, ковалентне зв'язування вказаної молекули, що представляє інтерес, або молекули, що служить контролем, з вказаною сполукою, відібраною на етапі а), з утворенням комплексу;
Зо с) приведення в контакт вказаної сполуки, відібраної на етапі а), або вказаного комплексу, одержаного на етапі Б), з клітиною ссавця, краще, з життєздатною клітиною, що експресує на своїй поверхні білок Ахі або його функціональний фрагмент; а) визначення, чи були вказана сполука або вказана молекула, що представляють інтерес, або вказаний комплекс, доставлені усередину клітини або чи зазнали інтерналізації вказаною клітиною ссавця; та е) відбір вказаної сполуки як сполуки, здатної забезпечувати доставку в життєздатну клітину ссавця або інтерналізацію життєздатною клітиною ссавця молекули, що представляє інтерес.
В кращому втіленні вказана сполука, здатна забезпечувати доставку в життєздатну клітину ссавця або інтерналізацію життєздатною клітиною ссавця молекули, що представляє інтерес, є білком (також називаним в даному документі поліпептидом або пептидом) або подібною до білка сполукою, що має пептидну структуру, зокрема, амінокислотною послідовністю з принаймні 5, 10, 15 чи більше амінокислотних залишків, де вказані амінокислотні залишки можуть бути глікозиловані.
Коли вказана сполука, здатна забезпечувати доставку в життєздатну клітину ссавця або інтерналізацію життєздатною клітиною ссавця молекули, що представляє інтерес, є білком або подібною до білка сполукою, вказана сполука в даному документі також називається "антигензв'язувальним білком", де вказаний антигензв'язувальний білок або його зв'язувальний фрагмент здатні: - |) специфічно зв'язуватися з білком Ахі, краще, з людським білком Ахі, та - ії) зазнавати інтерналізації в клітину ссавця після зв'язування з вказаним білком АХІі, коли вказаний білок Ахі експресується на поверхні вказаної клітини ссавця.
В кращому втіленні вказана життєздатна клітина ссавця є людською клітиною, краще, клітиною, що характеризується природною експресією білкового рецептора АХІ.
В конкретному втіленні життєздатні клітини ссавців на етапі с) є клітинами ссавців, що експресують на своїй поверхні рекомбінантний білок (рекомбінантні білки) Ахі.
В іншому кращому втіленні вказана молекула, що представляє інтерес, є цитотоксичною молекулою (також називаною в даному документі цитотоксичним або цитостатичним агентом).
В іншому кращому втіленні вказана молекула, що представляє інтерес, ковалентно зв'язана з вказаною сполукою, здатною зв'язувати білок Ахі, за допомогою лінкера, ще краще, пептидного лінкера, ще краще розщеплюваного пептидного лінкера, ще краще, лінкера, який може розщеплятися під дією природних внутрішньоклітинних компонентів, що містяться в клітинах ссавців, зокрема, в цитозолі вказаних клітин ссавців.
В ще одному кращому втіленні вказана сполука, здатна зв'язувати білок Ахі, є антитілом або його функціональним зв'язувальним фрагментом, специфічними по відношенню до білка Ахі або по відношенню до його епітопа, розташованого в складі позаклітинного домену АХІі.
Етап відбору згідно е) можна здійснювати будь-яким способом, відомим фахівцям в даній області, для оцінки внутрішньоклітинної доставки або інтерналізації. Дослідження або аналіз, здатні продемонструвати або оцінити наявність, відсутність або активність вказаної сполуки, здатної специфічно зв'язувати білок Ахі, або вказаного комплексу, утвореного вказаною сполукою та вказаною молекулою, що представляє інтерес, або вказаної молекули, що представляє інтерес, ковалентно зв'язаної з вказаною сполукою, є добре відомими фахівцям (див. деякі приклади таких аналізів або досліджень, які розкриті нижче, але не є вичерпними).
Більш конкретно, ці аналізи або дослідження можна здійснювати з використанням методу
Зо ЕАС5 (від англ. Пиогезсепсе-асіїмаїєй се зопіпу, флуоресцентне сортування клітин), імунофлуоресцентних методів, протокової цитомерії, вестерн-блотингу, дослідження цитотоксичного/цитостатичного ефекту і т.д.
В цьому аспекті даний винахід також стосується способу одержання іп міго цитотоксичного або цитостатичного комплексу, здатного забезпечувати доставку цитотоксичного компонента в клітину ссавця, краще, життєздатну клітину, де вказаний спосіб включає етапи: - ковалентного зв'язування цитотоксичного агента зі сполукою, яка: - ) є здатною специфічно зв'язувати білок Ахі, краще білок Ахі людини, та - ії) зазнає інтерналізації клітиною ссавця після зв'язування з вказаним білком Ахі, причому вказаний білок Ахі експресується на поверхні вказаної клітини ссавця.
Краще, вказана сполука є подібною до білка сполукою, ще краще, антитілом, яке є специфічним по відношенню до білка Ахі або по відношенню до його епітопа, розташованого в позаклітинному домені Ахі, або функціонального зв'язувального фрагмента вказаного антитіла.
В кращому втіленні вказаний цитотоксичний агент ковалентно зв'язаний з вказаним антитілом до АхіІ або його функціональним фрагментом за допомогою лінкера, ще краще пептидного лінкера, ще краще розщеплюваного пептидного лінкера, ще краще лінкера, який може бути розщеплений, наприклад, під дією природних внутрішньоклітинних сполук, що не має ограничительного характера.
Як і у інших представників сімейства ТАМ, позаклітинний домен (ЕСО) Ахі має будобу, близку до будови позаклітинного домену адгезивних молекул. Позаклітинний домен АХІ містить
БО два імуноглобулін-подібних домени, до яких примикають два фібронектин ПІ-подібних домени
ІО'Вгуап ..Р. єї аї. Мої. Сеї! Віої. (1991).11, 5016-5031). Для зв'язування ліганду Са5б достатньо двох М-кінцевих імуноглобулін-подібних доменів (Зазакі Т. еї ам. ЕМВО .). (2006).25, 80-87.
Позаклітинний домен людського білка Ахі є фрагментом з 451 амінокислотних залишків, що відповідають амінокислотам 1-451 послідовності 5Е0 10 МО. 29, ця послідовність представлена в переліку послідовностей як 5ЕО ІЮО МО. 31. Амінокислоти 1-25 відповідають сигнальному пептиду, позаклітинний домен людського білка Ахі без сигнального пептиду відповідає амінокислотам 26-451 послідовності ЗЕО ІО МО.29 та представлений послідовністю 5ЕО ІЮ МО. 32.
На даний момент виявлено декілька способів інтерналізації. Вони визначають шлях білків бо або білкових комплексів, що зазнали інтерналізації, у клітині. Після ендоцитозу більшість мембранних білків або ліпідів повертаються на клітинну поверхність (рециркуляція), але деякі мембранні компоненти надходять в пізні ендосоми або комплекс Гольджі ІМахйєЇй Р.К. 8
Мсатгам, Т.Е. Маї. ВНеу. Мої. Сеї! Віої. (2004).5, 121-192.
В кращому втіленні винахід стосується антигензв'язувального білка або його антигензв'язувального фрагмента, який ї) специфічно зв'язується з людським білком АХІ|, та ії) зазнає інтерналізації після зв'язування з вказаним людським білком Ахі, вказаний антигензв'язувальний білок містить принаймні амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з послідовностей 5ЕО ІЮ МО5. 1-14 або будь-якої послідовності, ідентичної принаймні на 80 95, краще на 85 95, 90 Фо, 95 95 та 98 95, послідовностям ЗЕО ІЮ МО5. 1-14.
В найкращому втіленні винахід стосується антигензв'язувального білка або його антигензв'язувального фрагмента, який ї) специфічно зв'язується з людським білком Ахі, який краще має послідовність ЗЕО ІЮ МО. 29 або 30 або природний варіант його послідовності, та її) зазнає інтерналізації після зв'язування з вказаним людським білком АХІі, вказаний антигензв'язувальний білок містить принаймні амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МОз5. 1-14. "Зв'язувальний білок" або "антигензв'язувальний білок" є пептидним ланцюгом, який має специфічну або загальну афінність до іншого білка або молекули (яка звичайно називається антигеном). Білки приводять в контакт і вони утворюють комплекс, коли зв'язування є можливим. Антигензв'язувальний білок за винаходом краще може бути антитілом, фрагментом або похідним антитіла, білка або пептиду, але не вичерпується цими прикладами.
Під "антигензв'язувальним фрагментом" антигензв'язувального білка за винаходом розуміють будь-який пептид, поліпептид або білок, який зберігає здатність специфічно зв'язуватися з мішенню (як правило, також називаною антигеном), і який містить амінокислотну послідовність принаймні з 5 суміжних амінокислотних залишків, принаймні з 10 суміжних амінокислотних залишків, принаймні з 15 суміжних амінокислотних залишків, принаймні з 20 суміжних амінокислотних залишків, принаймні з 25 суміжних амінокислотних залишків, принаймні з 40 суміжних амінокислотних залишків, принаймні з 50 суміжних амінокислотних залишків, принаймні з 60 суміжних амінокислотних залишків, принаймні з 70 суміжних
Зо амінокислотних залишків, принаймні з 80 суміжних амінокислотних залишків, принаймні з 90 суміжних амінокислотних залишків, принаймні зі 100 суміжних амінокислотних залишків, принаймні зі 125 суміжних амінокислотних залишків, принаймні зі 150 суміжних амінокислотних залишків, принаймні зі 175 суміжних амінокислотних залишків, принаймні з 200 суміжних амінокислотних залишків або принаймні з 250 суміжних амінокислотних залишків амінокислотної послідовності антигензв'язувального білка.
В кращому втіленні, у якому антигензв'язувальний білок є антитілом, такі "антигензв'язувальні фрагменти" вибрані з групи, що складається з Ем, 5сЕм (5с позначає одноланцюговий, від англ. 5іпдіє спаїіп), Раб, Е(аб)», Раб", всЕм-Ес фрагментів або діател або будь-яких фрагментів, час напівжиття яких збільшений шляхом хімічної модифікації, наприклад, такої як додавання полі(алкілен)гліколю, такого як полі(етилен)гліколь ("пегілювання") (пегільовані фрагменти позначають Ехм-ПЕГ, 5сЕм-ПЕГ, Рар-ПЕГ, Е(аб)2-ПЕГ або БРар'-ПЕГ) ("ПЕГ" позначає Полі(Етилен)Гліколь), або шляхом включення в ліпосоми, при цьому вказані фрагменти містять принаймні один з СОК, притаманних антителу за винаходом. Краще, вказані "антигензв'язувальні фрагменти" будуть складатися з або будуть містити частину варіабельної ділянки послідовності важкого або легкого ланцюга антитіла, з якого вони одержані, вказана частина послідовності є достатньою для збереження такої саме специфічності зв'язування, що й у антитіла, з якого вони походять, та достатньої афінності до мішені, краще принаймні рівної 1100, ще краще принаймні 1/10 від афінності антитіла, з якого вони походять. Такий функціональний фрагмент буде містити як мінімум 5 амінокислот, краще 10, 15, 25, 50 та 100 послідовних амінокислот послідовності антитіла, з якого він походить.
Термін "епітоп" позначає ділянку антигену, зв'язану з антигензв'язувальним білком, включаючи антитіла. Епітопи можна охарактеризувати як структурні або функціональні.
Функціональні епітопи звичайно є підгрупою структурних епітопів та мають залишки, які роблять безпосередній внесок в афінність зв'язування. Епітопи можуть також бути конформаційними, тобто складатися з амінокислот, розташованих нелінійно. В деяких втіленнях епітопи можуть включати детермінанти, які є хімічно активними поверхневими групами молекул, таких як амінокислоти, вуглеводні бічні ланцюги, фосфорильні групи або сульфонільні групи і, в деяких втіленнях, можуть мати визначену тривимірну структуру та/або визначений заряд.
В даному описі епітоп локалізується в позаклітинному домені людського білка АХІі. бо Згідно з кращим втіленням винаходу, антигензв'язувальний білок або його антигензв'язувальний фрагмент специфічно зв'язується з епітопом, локалізованим в позаклітинному домені людського білка Ахі, який краще має послідовність 5ЕО ІЮО МО. 31 або 32 або природний варіант його послідовності.
Поняття "специфічне зв'язування", "специфічно зв'язується" тощо означають, що антигензв'язувальний білок або його антигензв'язувальний фрагмент утворює комплекс з антигеном, який є відносно стабільним у фізіологічних умовах. Специфічне зв'язування можна охарактеризувати рівноважною константою дисоціації, рівною принаймні приблизно 1х105 М чи менше. Способи визначення специфічного зв'язування двох молекул є добре відомими в області техніки та включають, наприклад, рівноважний діаліз, поверхневий плазмонний резонанс тощо. Щоб уникнути сумнівів, це не означає, що вказаний антигензв'язувальний фрагмент не може зв'язуватися або взаємодіяти з іншим антигеном в низьких концентраціях.
Тим не менш, в кращому втіленні вказаний антигензв'язувальний фрагмент зв'язується тільки з вказаним антигеном.
В цьому контексті "ЕСво" позначає 50 96 ефективну концентрацію. Більш конкретно, термін напівмаксимальна ефективна концентрація (ЕСвхо) відповідає концентрації ліків, антитіла або токсичної речовини, яка викликає відповідь, яка має значення посередині між базовою лінією та максимумом після певного визначеного часу впливу. Її часто використовують як показник ефективності ліків. Таким чином, значення ЕСво безперервної кривої "доза-ефект" є концентрацією сполуки, при якій спостерігається ефект, який становить 505965 від максимального. ЕСво дискретної кривої "доза-ефект" є концентрацією сполуки, що викликає очікуваний ефект у 50 95 особин популяції після визначеної тривалості впливу. Залежність ефекту від концентрації, як правило, описується сигмоїдною кривою, і ефективність різко зростає при відносно невеликій зміні концентрації. Її можна вивести математично при проведенні лінії найкращої відповідності.
В кращому втіленні даного винаходу визначення ЕС5о характеризує ефективність зв'язування антитіла з позаклітинним доменом Ахі, експресованого пухлинними клітинами.
Показник ЕСв5о визначають за допомогою ЕАСб-аналізу. Показник ЕС5о відображає концентрацію антитіла, при якій зв'язування з людським Ахі, експресованим пухлинними клітинами, становить 50 95 від максимально можливого. Кожне значення ЕСхо визначають як
Зо середню точку на кривій залежності "доза-ефект", за допомогою програми для побудови чотирипараметричної регресійної моделі (прикладна програма Ргі5т). Цей показник вибраний як репрезентативний для фізіологічних/патологічних станів.
У втіленні винаходу антигензв'язувальний білок або його антигензв'язувальний фрагмент зв'язуються зі своїм епітопом із значенням ЕсСбво, рівним принаймні 1079 М, краще між 109 та 1072
М.
Інше втілення винаходу є процесом або способом для відбору антигензв'язувального білка або його антигензв'язувального фрагмента, здатних зазнавати внутрішньоклітинної інтерналізації клітиною ссавця, краще людською клітиною, краще життєздатною клітиною, що включає етапи: - Ї) відбору антигензв'язувального білка, який специфічно зв'язується з Ахі, краще з його позаклітинним доменом або його епітопом; і - ї) відбору вказаного антигензв'язувального білка з попереднього етапу Її), який зазнає інтерналізації клітиною ссавця після зв'язування з білком АхіІ, експресованим на поверхні вказаної клітини ссавця.
В конкретному втіленні вказана клітина ссавця природно експресує білковий рецептор Ахі на своїй поверхні або є клітиною ссавця, що експресує рекомбінантний білок Ахі на своїй поверхні, краще людською клітиною.
Такий спосіб або процес може включати етапи Її) відбору антигензв'язувального білка, який специфічно зв'язується з Ахі із значенням ЕСво, рівним принаймні 109 М, та її) відбору антигензв'язувального білка з попереднього етапу, який зазнає інтерналізації після зв'язування з Ахі. Етап відбору згідно ії) можна здійснювати способом для оцінки інтерналізації, відомим фахівцю в даній області. Більш конкретно, дослідження можна здійснювати з використанням методу БАС5, імунофлуоресцентних методів, протокової цитомерії, вестерн-блотингу, дослідження цитотоксичного/цитостатичного ефекту і т.д.
Іншою характерною особливістю антигензв'язувального білка за винаходом є те, що він не виявляє істотної активності по відношенню до проліферації пухлинних клітин. Більш конкретно, як показано в наступних прикладах, антигензв'язувальний білок за винаходом не виявляє будь- якої істотної активності іп міго по відношенню до проліферації на моделі клітин 5М1260.
В онкології існує множина механізмів, згідно з якими моноклональні антитіла (МкАт) можуть 60 виявляти свою терапевтичну дію, але часто їх активність є недостатньою для забезпечення тривалого ефекту. У зв'язку з цим було розроблено декілька стратегій для підсилення їх активності, зокрема їх комбінування з такими ліками, як хіміотерапевтичні агенти. Імунотоксини є новим можливим методом лікування раку, який є ефективною альтернативою комбінованій терапії |Веск А. еї а. Оієсом. Меа. (2010).10, 329-339; АПеу 5.0. єї аї. У. Рнаптасої. Ехр. Тнег. (2009).330, 932-938). Кон'югати антитіло-ліки (АОС, від англ. апіроду-агид сопісдаїе) є одним з подходів, при якому можливість використовувати специфічність МкАт та здійснювати спрямовану доставку цитотоксичного агента до пухлини можуть істотно підвищувати активність як МкАт, так і лікарського засобу. Краще, МкАт буде специфічно зв'язуватися з антигеном, що характеризується значною експресією на пухлинних клітинах, але низьким рівнем експресії на нормальних клітинах.
Даний винахід стосується специфічного білка, що зв'язується з Ахі, більш конкретно, специфічного антитіла, спрямованого проти Ахі, що має високу здатність зазнавати інтерналізації після зв'язування з АхіІ. Такий антигензв'язувальний білок є цікавим як один з компонентів імунокон'югата з лікарським засобом, оскільки він здійснює адресну доставку приєднаного цитотоксичного агента в пухлинні клітини-мішені. Після інтерналізації цитотоксичний агент запускає загибель пухлинної клітини.
Важливою складовою успіху терапії імунокон'юЮюгатами вважається специфічність до антигену-мішені та інтерналізація комплексів антиген-зв'язувальний білок пухлинними клітинами. Очевидно, що антигени, які не зазнають інтерналізації, менш ефективно здійснюють доставку цитотоксичних агентів порівняно з антигенами, які зазнають інтерналізації. Процеси інтерналізації можуть варіювати в залежності від антигену та залежать від множини парамерів, на які можуть чинити вплив приєднувані білки. ЕТК клітинної поверхні є сімейством антигенів, цікавим для дослідження цього підходу.
Цитотоксичний агент в складі біомолекули забезпечує цитотоксичну активність, а антигензв'язувальний білок забезпечує її специфічність по відношенню до пухлинних клітин, та служить вектором, що проникає в клітини та забезпечує належну адресну доставку цитотоксичного агента.
Таким чином, для поліпшення властивостей молекули імунокон'югата білок, що зв'язується з носієм, повинен виявляти виражену здатність до інтерналізації пухлинними клітинами-
Зо мишенями. Ефективність, з якою зв'язувальні білки опосередковують інтерналізацію, істотно відрізняється в залежності від епітопа, який є мішенню. Для відбору білків, що ефективно зв'язуються з Ахі та зазнають інтерналізації, потрібне експериментальне вивчення не лише зниження рівня експресії Ахі, але й відслідковування походження Ахі-зв'язувальних білків у клітині.
В кращому втіленні інтерналізацію антигензв'язувального білка за винаходом краще оцінюють методом імунофлуоресценції (як показано в Прикладі, наведеному нижче в даному документі) або іншим способом чи процесом, специфічним по відношенню до механізму інтерналізації, відомим фахівцю в даній області.
В іншому кращому втіленні комплекс Ахі-антигензв'язувальний білок за винаходом зазнає інтерналізації після приєднання зв'язувального білка за винаходом до позаклітинного домену вказаного Ахі, викликаючи зниження кількості АхІ на поверхні клітин. Це зниження можна оцінити будь-яким способом, відомим фахівцю в даній області (вестерн-блотинг, ЕАС5, імунофлуоресценція і т.д.).
У втіленні винаходу дане зниження, що відображає інтерналізацію, краще оцінюють методом РГАСЗ та виражають як різницю або показник дельта між середньою інтенсивністю флуоресценції (МРЇ, від англ. Меап РіІпогезсепсе Іпіеп5йу) необроблених клітин та МЕЇ клітин після впливу антигензв'язувального білка за винаходом.
Необмежувальним прикладом даного винаходу є визначення показника дельта на основі
МЕЇ, одержаної для необроблених клітин та клітин після впливу антигензв'язувального білка за винаходом згідно з описом в Прикладі 9 з використанням і) пухлинних клітин нирки людини
ЗМ12С через 24 години інкубації з антигензв'язувальним білком за винаходом, та ії) вторинного антитіла, міченого АіІеха488. Цей параметр обчислюють за такою формулою:
А (МЕїЇгагод. необроблених клітин - МЕіІгагод. клітин після впливу антигензв'язувального білка).
Ця різниця між МРЕЇ відображає зниження рівня експресії АхіІ, оскільки значення МРЕЇ є пропорційним експресії Ахі на клітинній поверхні.
В ще кращому та переважному аспекті антигензв'язувальний білок або його антигензв'язувальний фрагмент за винаходом є моноклональним антитілом, краще виділеним
МкАт, яке обумовлює різницю між МЕ|гагод. необроблених клітин та МЕЇгагод. оброблених клітин (значення 4), що становить принаймні 200, краще принаймні 300. бо Антигензв'язувальний білок або його антигензв'язувальний фрагмент за винаходом викликають зниження МРЇ, що становить принаймні 200.
Більш конкретно, вищезгадуване значення дельта можна визначити згідно з таким способом, який слід розглядати як ілюстративний та необмежувальний приклад: а) обробка та інкубація пухлинних клітин, що представляють інтерес, з антигензв'язувальним білком за винаходом;
Б) дія антигензв'язувального білка за винаходом на клітини, оброблені на етапі а) і, паралельно, на необроблені клітини, с) вимірювання МРЕЇ оброблених та необроблених клітин (репрезентативних по відношенню до кількості АхіІ, присутнього на поверхні) з використанням вторинного антитіла, здатного зв'язуватися з антигензв'язувальним білком, та
Я) розрахунок значення дельта шляхом віднімання значення МЕїЇ, одержаного для оброблених клітин, від значення МЕЇ, одержаного для необроблених клітин.
Терміни "антитіло", "антитіла" або "імуноглобуліни" використовуються взаємозамінно в самому широкому розумінні і включають моноклональні антитіла, краще, виділені МкАт, (наприклад, повнорозмірні або інтактні моноклональні антитіла), поліклональні антитіла, мультивалентні антитіла або мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла, що виявляють бажану біологічну активність).
Більш конкретно, така молекула є глікопротеїном, який містить принаймні два важких ланцюги (Н) та два легких ланцюги (ГІ), з'єднані між собою дисульфідними зв'язками. Кожен важкий ланцюг містить варіабельну ділянку (або домен) важкого ланцюга (в даному документі позначається абревіатурою НСМК або МН) та константну ділянку важкого ланцюга. Константна ділянка важкого ланцюга містить три домени, СНІ, СН2 та СНЗ. Кожен легкий ланцюг містить варіабельну ділянку легкого ланцюга (в даному документі позначається абревіатурою І СУК або
МУ) та константну ділянку легкого ланцюга. Константна ділянка легкого ланцюга містить один домен, СІ. Ділянки МН та Мі можна далі поділити на гіперваріабельні ділянки, називані ділянками, що визначають комплементарність (СОК, від англ. сотріетепіагцу аегегтіпіпод гедіоп5), які перемежаються більш консервативними ділянками, називаними каркасними ділянками (ЕК, від англ. їтатемогкК гедіоп5). Кожна ділянка УН та Мі. складається з трьох СОК та чотирьох ЕК, розташованих в напрямку від аміно-кінця до карбокси-кінця в такому порядку: ЕК,
СОКІ, ЕК2, СОК2, ЕКЗ, СОКЗ, ЕК4. Варіабельні ділянки важкого та легкого ланцюгів містять зв'язувальний домен, який взаємодіє з антигеном. Константні ділянки антитіл можуть опосередковувати зв'язування імуноглобуліну з тканинами або факторами організму-хазяїна, включаючи різні клітини імунної системи (наприклад, ефекторні клітини) та перший компонент класичного шляху активації комплементу (С14).
Антитіла за винаходом також включають деякі фрагменти антитіл. Вказані фрагменти антитіл виявляють необхідну специфічність та афінність зв'язування, незалежно від джерела або типу імуноглобуліну (тобто, Ідс, ІДЕ, ІМ, ІдА і т.д.), тобто вони здатні специфічно зв'язуватися з білком Ахі з афінністю, яка є порівнянною з афінністю повнорозмірних антитіл за винаходом.
Як правило, для одержання моноклональнх антитіл або їх функціональних фрагментів, особливо таких, що мають мишаче походження, можна звертатися до методів, описаних, зокрема, в посібнику "Апіїродіев" (Нагіом/ апа І апе, Апііїбодіев: А І арогагу Мапиаї, Соїй бргіпд
Нагбог Іарогаюгу, Соїй ріпа Натбог МУ, рр. 726, 1988) або до методики одержання з використанням гібридом, описаної Копіег апа Міїстеїп (Маїиге, 256:495-497, 1975).
Термін "моноклональне антитіло" або "МкАт" в даному документі позначає молекулу антитіла, спрямовану проти специфічного антигену, яку може продукувати один клон В-клітин або гібридома. Моноклональні антитіла також можуть бути рекомбінантними, тобто одержаними методами білкової інженерії. Крім того, на відміну від препаратів поліклональних антитіл, які, як правило, містять різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант або епітопів, кожне моноклональне антитіло спрямоване проти одного епітопа антигену. Винахід стосується антитіл, виділених або одержаних шляхом очистки з природних джерел, або одержаних рекомбінантним методом або за допомогою хімічного синтезу.
Краще втілення винаходу стосується антигензв'язувального білка або його антигензв'язувального фрагмента, який включає або є антитілом, вказане антитіло містить три
СОК легкого ланцюга, що містять послідовності ЗЕО ІО МО5. 1, 2 та 3 або будь-які послідовності, ідентичні принаймні на 80 95, краще на 85 95, 90 95, 95 95 та 98 95, послідовностям
ЗЕО ІЮО МОЗ. 1, 2 та 3; та три СОК важкого ланцюга, що містять послідовності ЗЕО ІЮ МОЗ5. 4, 5 та 6 або будь-які послідовності, ідентичні принаймні на 80 95, краще на 85 95, 90 95, 95 95 та 98 95, послідовностям ЗЕО ІЮ МОЗ5. 4, 5 та 6. бо В ще кращому втіленні винаходу антигензв'язувальний білок або його антигензв'язувальний фрагмент є антитілом, вказане антитіло містить три СОК легкого ланцюга, що містять послідовності зЕО ІЮ МОЗ5. 1, 2 та 3; та три СОК важкого ланцюга, що містять послідовності
ЗЕО ІЮ МОЗ. 4, 5 та 6.
В кращому аспекті ділянки СОК або СОК(5) позначають гіперваріабельні ділянки важкого та легкого ланцюгів імуноглобулінів, згідно з ІМСТ. Без будь-якого протиріччя, в даній заявці СОК визначають згідно із системою нумерації ІМОТ.
Єдина нумерація ІМСТ була розроблена для порівняння варіабельних доменів будь-яких антигенних рецепторів, типів ланцюгів або видів (Геїгапс М.-Р., Іттипоіоду Тодау 18, 509 (1997) / Гепапс М.-Р., Те Іттипоіодівї, 7, 132-136 (1999) / І еїйапс, М.-Р., Роттіє, С, Виї7, М.,
Сіцаісеїйї, М., Еоцідціег, Е., Тгиопа, Г., Тиоимепіп-Сопівї, У. апа І еїгапс, Оєм. Сотр. Іттипої, 27, 55-77 (2003))|. В єдиній нумерації ІМОТ консервативні амінокислоти завжди займають однакове положення, наприклад, цистеїн 23 (1-й СУ5), триптофан 41 (консервативний ТЕР), гідрофобна амінокислота 89, цистеїн 104 (2-й СУ5), фенілаланін або триптофан 118 (2-РНЕ або .-ТАР).
Єдина нумерація ІМСТ дозволяє стандартно встановити границі каркасних ділянок (ЕК1-ІМОТ: позиції 1-26, ЕН2-ІМОаТтТ: 39-55, ЕВЗ-ІМОТ: 66-104 та ЕК4-ІМСТ: 118-128) та ділянок, що визначають комплементарність: СОК1-ІМатТ: 27-38, СОВ2-ІМИТт: 56-65 та СОМЗ3-ІМОТ: 105-117.
Оскільки розриви позначають незайняті позиції довжини СОК-ІМОТ (показані в лапках та розділені точками, наприклад, І8.8.131) набувають принципіального значення. Єдина нумерація
ІЇМОТ використовується для двовимірних графічних зображень, що носять назву ІМСТ Соїеге де Репез ("жемчужні буси") (Киї, М. апа І еїапс, М.-Р., Іттиподепеїйсв, 53, 857-883 (2002) /
Каав, О. апа І еїтапс, М.-Р., Ситепі Віоіптоптаїсв, 2, 21-30 (2007)| та для тривимірних структур в базі даних ІМОСТ/З3О5ігисіиге-ОВ (Каах, О., Виї7, М. апа І еїапс, М.-Р., Т сеїЇ тгесеріогї апа МНС взігисімигаї дата. Мисі. Асіа5. Невз., 32, 0208-0210 (2004)|.
Слід розуміти, що в даній заявці, не викликаючи протиріч, ділянки, що визначають комплементарність, або СОК, позначають гіперваріабельні ділянки важкого та легкого ланцюгів імуноглобулінів згідно із системою нумерації ІМОТ.
Однак встановлювати границі СОК можна і згідно із системою нумерації Кабаї (Кабаї еї аї.,
Зедиепсез ої ргоївїн5 ої іттипоіодіса! іпієтеві, 5" Ейа., 0.5. ЮОєрайтепі ої Неаййп апа Нитап зегмісе5, МІН, 1991, та пізніші видання). Існує три СОК важкого ланцюга та три СОК легкого
Зо ланцюга. В даному документі терміни "СОК" та "СОК5" використовуються для позначення, в залежності від обставин, однієї чи більше, або навіть усіх ділянок, що містять більшість амінокислотних залишків, що відповідають за афінність зв'язування антитіла з антигеном або епітопом, які він розпізнає.
Згідно із системою нумерації Кабваї, даний винахід стосується антигензв'язувального білка або його антигензв'язувального фрагмента, які є антитілом, вказане антитіло містить три СОК легкого ланцюга, границі яких встановлені згідно із системою нумерації Караї, що включають послідовності ФЕО ІЮ МО5. 9, 10 та 11, або будь-які послідовності, ідентичні принаймні на 80 95, краще на 85 95, 90 95, 95 95 та 98 95, послідовностям ЗЕО ІЮ МОз5. 9, 10 та 11; та три СОК важкого ланцюга, границі яких встановлені згідно із системою нумерації Караї, що включають послідовності ЗЕО ІЮ МО5. 12, 13 та 14, або будь-які послідовності, ідентичні принаймні на 80 95, краще на 85 95, 90 9, 95 905 та 98 95, послідовностям ЗЕО ІЮО МОЗ. 12, 13 та 14.
В даному винаході виражений в процентах показник "ідентичності" між двома послідовностями нуклеїнових кислот або амінокислот позначає процентний вміст ідентичних нуклеотидів або амінокислотних залишків для двох порівнюваних послідовностей, одержаний при оптимальному вирівнюванні, цей показник є виключно статистичним та розбіжності між двома послідовностями розподілені в послідовностях случайно. Порівняння двох нуклеотидних або амінокислотних послідовностей, як правило, здійснюють шляхом порівняння послідовностей після їх оптимального вирівнювання, вказане порівняння можна виконувати з використанням "вікна порівняння". Оптимальне вирівнювання порівнюваних послідовностей можна здійснювати, крім порівняння вручну, за допомогою алгоритму пошуку локальної гомології Сміта та Уотермана (тій апа У/атептап (1981) Аа. Арр. маїйй. 2:4821І), за допомогою алгоритму пошуку локальної гомології Нідлмана та Вунша (МедаІетап апа М/п5сп (1970) |.
Мої. Віої. 48:443)), за допомогою пошуку подібності методом Пірсона та Ліпмана (Реагхоп апа
Іртап (1988) |Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА 85:2444Ї) або за допомогою комп'ютерної програми, що використовує ці алгоритми (АР, ВЕ5ТЕРІТ, РГАЗТА та ТЕА5ТА в пакеті програм Умізсопвіп
Сепеїїс5 боймаге РасКаде, Сепеїїс5 Сотршег Сгоцпр, 575 бсієпсе Ог., Мадізоп, УЛ, або за допомогою програм для порівняння ВІ А5Т МЕ чи ВІ А5Т Р).
Виражений в процентах показник ідентичності між двома нуклеотидними або амінокислотними послідовностями визначають шляхом порівняння двох оптимально вирівняних бо послідовностей, причому порівнювані нуклеотидні або амінокислотні послідовності можуть мати вставки або делеції відносно референсної послідовності для досягнення оптимального вирівнювання двох послідовностей. Виражений в процентах показник ідентичності розраховують, визначаючи число позицій, у яких амінокислотні залишки або нуклеотиди ідентичні між двома послідовностями, краще, між двома повними послідовностями, шляхом ділення числа ідентичних позицій на загальне число позицій у вікні порівняння та множення результату на 100 для одержання вираженого в процентах показника ідентичності між двома послідовностями.
Наприклад, можна використовувати програми ВІ АЗТ, "ВІ А5Т 2 зедиепсевз" (Тайзома еї аї., "Віаві 2 зедиепсевз - а пему/ ї00! ог сотрагіпд ргоїєїп апа писіеоїіде зедоепсев5", ЕЕМ5 Місгобіо!, 1999, І ен. 174:247-250) доступ до яких надається на сайті пЕрулммли. пові. піт.пій дом/догі/р12.пті, з настройками за умовчанням (зокрема, з параметрами "штраф за введення розриву": 5 та "штраф за подовження розриву": 2; наприклад, з вибором матриці "В ОБИМ 62", пропонованої програмою); виражений в процентах показник ідентичності між двома порівнюваними послідовностями розраховується безпосередньо програмою.
Для амінокислотної послідовності, ідентичної принаймні на 80 95, краще на 85 95, 90 95, 95 95 та 98 95, референсній амінокислотній послідовності, кращі приклади включають такі, які мають визначення модифікації у порівнянні з референсною послідовністю, зокрема, делеції, вставки або заміни принаймні однієї амінокислоти, вкорочення або подовження. У випадку заміни одного чи декількох розташованих послідовно або ні амінокислотних залишків, кращі заміни, в яких заміщені амінокислоти замінені "еквівалентними" амінокислотами. В даному описі вираз "еквівалентні амінокислоти" позначає будь-які амінокислоти, які можуть бути заміщені однією з основних амінокислот без будь-якої модифікації біологічної активності відповідних антитіл та згідно з конкретними прикладами, наведеними нижче.
Еквівалентні амінокислоти можна визначити чи то за їх структурною гомологією з амінокислотами, якими вони заміщені, чи то на основі результатів порівняння біологічної активності різних антигензв'язувальних білків, які можуть утворюватися.
Як приклад, який не є вичерпним, в Таблиці 2 нижче наведені можливі заміни, при здійсненні яких, як вважають, не відбувається істотної модифікації біологічної активності відповідного модифікованого антигензв'язувального білка; зрозуміло, за таких саме умов можливі й зворотні
Зо заміни.
Таблиця 2
Шеф щен
Втілення винаходу стосується антигензв'язувального білка або його антигензв'язувального фрагмента, що містить варіабельний домен легкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО. 7 або будь-якою послідовністю, ідентичною принаймні на 80 95, краще на 85 95, 90 95, 95 95 та 98 95, послідовності зЕО ІЮО МО. 7; та три СОК важкого ланцюга, що містять послідовності БЕО ІЮ
МОЗ5. 4, 5 та 6 або будь-яку послідовність, ідентичну принаймні на 80 95, краще на 85 95, 90 95, 95 95 та 98 95, послідовностям 5ЕО ІЮ МОЗ5. 4, 5 та 6.
Згідно з кращим втіленням винаходу, антигензв'язувальний білок або його антигензв'язувальний фрагмент містять варіабельний домен легкого ланцюга з послідовністю
ЗЕО ІО МО. 7 або будь-якою послідовністю, ідентичною принаймні на 80 95 послідовності ЗЕО
ІО МО.7; три СОК важкого ланцюга, що містять послідовності ЗЕО ІЮО МОЗ. 4, 5 та 6.
Згідно з іншим кращим втіленням винаходу, антигензв'язувальний білок або його антигензв'язувальний фрагмент містять варіабельний домен легкого ланцюга з послідовністю
ЗЕО ІЮ МО. 7, або будь-якою послідовністю, ідентичною принаймні на 80 95 послідовності ЗЕО
ІО МО.7.
Інше втілення винаходу стосується антигензв'язувального білка або його антигензв'язувального фрагмента, який містить три СОЖК легкого ланцюга, що містять послідовності ФЕО ІЮ МОЗ5. 1, 2 та З або будь-яку послідовність, ідентичну принаймні на 80 95, краще на 85 95, 90 95, 95 95 та 98 95, послідовностям ЗЕО ІЮ МОЗ5. 1, 2 та 3; та варіабельний домен важкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІО МО. 8, або будь-якою послідовністю, ідентичною принаймні на 80 95, краще на 85 95, 90 Фо, 95 95 та 98 95, послідовності 5ЕО ІЮ МО. 8.
Згідно з кращим втіленням винаходу, антигензв'язувальний білок або його антигензв'язувальний фрагмент містять три СОК легкого ланцюга, що містять послідовності
ЗЕО ІО МО5. 1, 2 та 3; та варіабельний домен важкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО. 8 або будь-якою послідовністю, ідентичною принаймні на 80 95 послідовності ХЕ ІЮ МО.8.
Згідно з іншим кращим втіленням винаходу, антигензв'язувальний білок або його антигензв'язувальний фрагмент містять варіабельний домен важкого ланцюга з послідовністю
ЗЕО ІО МО. 8 або будь-якою послідовністю, ідентичною принаймні на 80 95 послідовності ЗЕО
ІО МО.8.
Інше втілення винаходу стосується антигензв'язувального білка або його антигензв'язувального фрагмента, що містять варіабельний домен легкого ланцюга з послідовністю ЗЕО ІЮ МО. 7 або будь-якою послідовністю, ідентичною принаймні на 80 95, краще на 85 95, 90 9», 95 95 та 98 95, послідовності БЕО ІЮ МО. 7; та варіабельний домен важкого ланцюга з послідовністю ЗЕО ІЮО МО. 8, або будь-якою послідовністю, ідентичною принаймні на
Ко) 80 95, краще на 85 95, 90 95, 95 905 та 98 95, послідовності 5Е0 ІЮ МО. 8.
Згідно з кращим втіленням винаходу, антигензв'язувальний білок або його антигензв'язувальний фрагмент містять варіабельний домен легкого ланцюга з послідовністю
ЗЕО ІО МО. 7 або будь-якою послідовністю, ідентичною принаймні на 80 95 послідовності ЗЕО
ІО МО. 7, та варіабельний домен важкого ланцюга з послідовністю ЗЕО ІЮО МО. 8 або будь-якою послідовністю, ідентичною принаймні на 80 95 послідовності ЗЕО ІЮ МО. 8.
Для більшої ясності, в Таблиці За нижче наведені різні амінокислотні послідовності, що відповідають антигензв'язувальному білку за винаходом (Ми - мишачий).
Таблиця За 771. |НумерацяСОвВ)| ВБажкийланцюг | Легкийланцюг | ЗЕСІЮ МО 11111 совл Її 1 11111111 сові | 2 11101111 совіз/ ЇЇ з мето Соотеояні 010303037--ї 14 1 совне 7 ЇЇ 5 7 совн 7 ЇЇ 6 1111111 совл Її 9 11111111 сові | юю
ЯР ква 22202021 сова 00111 1 совні 7 її 1 совне Її 77777777777777771111171Ї1 1 совнІ ЇЇ
ПИ іі нні ШВЕЛИВ домен
Бій НИ НС домен
Конкретний аспект даного винаходу стосується мишачого антитіла або похідних від нього компонентів або антигензв'язувальних фрагментів, які відрізняються тим, що вказане антитіло також містить константні ділянки легкого ланцюга та важкого ланцюга, одержані з антитіла біологічного виду, гетерологічного для миши, зокрема, людини.
Інший конкретний аспект даного винаходу стосується химерного антитіла або похідних від нього компонентів або антигензв'язувальних фрагментів, які відрізняються тим, що вказане антитіло також містить константні ділянки легкого ланцюга та важкого ланцюга, одержані з антитіла біологічного виду, гетерологічного для миши, зокрема, людини.
Ще один конкретний аспект даного винаходу стосується гуманізованого антитіла або похідних від нього компонентів або антигензв'язувальних Фрагментів, які відрізняються тим, що константні ділянки легкого ланцюга та важкого ланцюга, одержані з людського антитіла, є, відповідно, ділянками типу лямбда або каппа або ділянками гамма-1, гамма-2 чи гамма-4.
Інший аспект винаходу стосується антигензв'язувального білка, який є моноклональним антитілом 1613Е12, одержаним з гібридоми 1І-4505, депонованої в Національній колекції культур мікроорганізмів (СМСМ) в Інституті Пастера, Франція 28 липня 2011 р. або його антигензв'язувального фрагмента.
Згідно з іншим аспектом винахід стосується мишачої гібридоми, здатної секретувати антигензв'язувальний білок за винаходом, зокрема, гібридоми мишачого походження, депонованої у Французській колекції культур мікроорганізмів (СМСМ, Інститут Пастера, Париж,
Франція) 28 липня 2011 р., за номером 1-4505. Вказана гібридома була одержана при злитті спленоцитів/лімфоцитів імунізованих мишей Ваї!Б/С та клітин мієломи лінії р 2/0-Ад 14.
Згідно з іншим аспектом винахід стосується мишачої гібридоми, здатної секретувати антитіло, яке містить три СОК легкого ланцюга, що містять послідовності 5Е0О ІЮ МОЗ. 1, 2 та 3; та три СОК важкого ланцюга, що містять послідовності зХЕО ІЮ МОЗ5. 4, 5 та 6, вказана гібридома була депонована в СМСМ, Інститут Пастера, Париж, Франція, 28 липня 2011 р. за номером І- 4505. Вказана гібридома була одержана при злитті спленоцитів/лімфоцитів імунізованих мишей
Ва!р/С та клітин мієломи лінії 5р 2/0-Ад 14.
Об'єктом винаходу є мишача гібридома І-4505, депонована в СМСМ, Інститут Пастера,
Париж, Франція, 28 липня 2011 р.
Антигензв'язувальний білок за винаходом також включає химерні або гуманізовані антитіла.
Химерне антитіло є антитілом, що має в своєму складі варіабельну ділянку природного
Зо походження (легкого ланцюга та важкого ланцюга), одержану з антитіла визначеного біологічного виду в комбінації з константними ділянками легкого ланцюга та важкого ланцюга антитіла біологічного виду, гетерологічного для вказаного заданого виду.
Антитіла або їх химерні фрагменти можна одержувати за допомогою рекомбінантних генетичних методів. Наприклад, химерне антитіло можна одержувати шляхом клонування рекомбінантної ДНК, що містить промотор та послідовність, кодуючу варіабельну ділянку моноклонального антитіла за винаходом, яке має не-людське походження, зокрема мишаче, та послідовність, кодуючу константну ділянку людського антитіла. Химерне антитіло за винаходом, кодоване одним з таких рекомбінантних генів, может, наприклад, бути химерним антитілом миши-людини, специфічність такого антитіла визначається варіабельною ділянкою, кодованою
ДНК миши, а його ізотип визначається константною ділянкою, кодованою ДНК людини. Способи одержання химерних антитіл описані Метпоеуп еї аї. (ВіоЕг55заув, 8:74, 1988).
В іншому аспекті винаходу описаний зв'язувальний білок, який є химерним антитілом.
В конкретному кращому втіленні химерне антитіло за винаходом або його антигензв'язувальний фрагмент містять варіабельну ділянку легкого ланцюга, послідовність якого містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО. 7, а також містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, послідовність якого містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО. 8.
В іншому аспекті винаходу описаний зв'язувальний білок, який є гуманізованим антитілом. "Гуманізоване антитіло" позначає антитіло, що містить ділянки СОК, одержані з антитіла, яке не має людського походження, та інші частини молекули антитіла, що походять з одного (або декількох) людських антитіл. Крім того, деякі залишки сегментів скелета (позначувані ЕК) можуть бути модифіковані для збереження афінності зв'язування (Чопез еї аї!., Майиге, 321:522- 525, 1986; Метоеуеєп вї аі!., Зсієпсе, 239: 1534-1536, 1988; Віеєсптапп вї а!., Майте, 332:323-327, 1988).
Гуманізовані антитіла за винаходом або їх фрагменти можна одержати за допомогою методів, відомих фахівцям в даній області (наприклад, таких, які описані в публікаціях Зіпдег еї а|., У. Іттип., 150:2844-2857, 1992; Мошпіаїп еї аї., Віоїесппої. (зепеї. Епа. Неу., 10: 1-142, 1992; та Вербіпдіюп еї а!., Віо/Гесппоїоду, 10: 169-175, 1992). Такі гуманізовані антитіла є кращими для застосування в способах, що включають діагностику іп мійго або превентивне та/або терапевтичне застосування іп мімо. Можна згадати інші способи гуманізації, також відомі 60 фахівцям в даній області, наприклад, такі як методика "пересадження СОК", описана заявником
Ргоївєїп ЮОезідп ар в патентах ЕР 0451261, ЕР 0682040, ЕР 0939127, ЕР 0566647 або 05 5530101, 05 6180370, 05 5585089 та 05 5693761. Також можна процитувати патенти США 5 5639641 або 6054297, 5886152 та 5877293.
Крім того, винахід також стосується гуманізованих антитіл, одержаних на основі мишачих антитіл, описаних вище.
Краще, константні ділянки легкого ланцюга та важкого ланцюга, одержані з людського антитіла, відповідно є ділянками типу лямбда або каппа та гамма-1, гамма-2 або гамма-4.
В кращому втіленні винахід стосується антигензв'язувального білка, який є гуманізованим антитілом або його антиген-зв'язувальним фрагментом, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який містить послідовність ЗЕО ІЮ МО. 36 або будь-яку послідовність, ідентичну принаймні на 80 95, краще на 85 95, 90 95, 95 95 та 98 95, послідовності 560 ІЮ МО. 36; та три
СОК важкого ланцюга, що містять послідовності 5ЕО ІЮ МО. 4, 5 та 6.
Інше втілення винаходу стосується антигензв'язувального білка або його антигензв'язувального фрагмента, що містить варіабельний домен легкого ланцюга з послідовністю, вибраною з групи, що складається з послідовностей 5ЕО 10 МО. 37-47, або будь- якою послідовністю, ідентичною принаймні на 80 95, краще на 8595, 9095, 9595 та 98 95, послідовностям ЗЕО ІЮ МО. 37-47; та три СОК важкого ланцюга, що містять послідовності зЗЕО
ІО МОЗ. 4, 5 та 6. "Будь-яка послідовність, ідентична принаймні на 80 95, краще на 85 95, 90 Фо, 95 95 та 98 95, послідовностям 5ЕО ІЮ МО. 36 або 37-47" позначає послідовності, що містять послідовності трьох СОК легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МОЗ5. 1, 2 та З і, крім цього, ідентичні принаймні на 80 95, краще на 85 95, 90 Фо, 95 95 та 98 95, повнорозмірним послідовностям 5ЕО ІЮ МО. 36 або 37-47 за межами послідовностей, що відповідають СОК (тобто ЗЕО ІО МО. 1, 2 та 3).
Для більшої ясності в Таблиці 3б нижче наведені різні амінокислотні послідовності, що відповідають варіабельному домену легкого ланцюга (МІ) гуманізованого антигензв'язувального білка за винаходом (Н7 - гуманізований)
Таблиця 36 11111111 Версія. | 5ЕОЮМО. патвтзетя М
У втіленні винаходу антигензв'язувальний білок або його антигензв'язувальний фрагмент
Зо містять варіабельний домен легкого ланцюга, вибраний з групи, що складається з: ї) варіабельного домену легкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО. 7 або будь-якою послідовністю, ідентичною принаймні на 80 95 послідовності ЗЕО ІЮ МО.7, ії) варіабельного домену легкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО. 36 або будь-якою послідовністю, ідентичною принаймні на 80 95 послідовності ЗЕО ІЮ МО. 36; і ії) варіабельного домену легкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО. 37-47 або будь-якою послідовністю, ідентичною принаймні на 80 95 послідовностям ЗЕО ІЮ МО. 37-47.
В кращому втіленні винахід стосується антигензв'язувального білка, який є гуманізованим антитілом або антигензв'язувальним фрагментом, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, який містить послідовність ЗЕО ІЮ МО. 48 або будь-яку послідовність, ідентичну принаймні на 80 95, краще на 85 95, 90 95, 95 95 та 98 95, послідовності 560 ІЮ МО. 48; та три
СОК легкого ланцюга, що містять послідовності 5ЕО ІЮО МО. 1, 2 та 3.
Інше втілення винаходу стосується антигензв'язувального білка або його антигензв'язувального фрагмента, які містять варіабельний домен важкого ланцюга з послідовністю, вибраною з групи, що складається з 5БО ІЮ МО. 49-68 або будь-якою послідовністю, ідентичною принаймні на 8095, краще на 8595, 9095, 9595 та 98 965,
послідовностям 5ЕО ІЮ МО. 49-68; та три СОК легкого ланцюга, що містять послідовності БЗЕО
ІО МО5. 1, 2 та 3. "Будь-яка послідовність, ідентична принаймні на 80 95, краще на 85 95, 90 Фо, 95 95 та 98 95, послідовностям 5ЕО ІЮ МО. 48 та 49-68" позначає послідовності, що містять три СОК важкого ланцюга з послідовностями 5ЕО ІЮО МОЗ. 4, 5 та 6 і, крім того, ідентичні принаймні на 80 95, краще на 85 95, 90 9, 95 95 та 98 95, повнорозмірним послідовностям ЗЕО ІЮО МО. 48 та 49-68 за межами послідовностей, що відповідають СОР (тобто ЗЕО ІО МО. 4, 5 та 6).
Для більшої ясності в Таблиці Зв нижче наведені різні амінокислотні послідовності, що відповідають варіабельному домену важкого ланцюга (УН) гуманізованого антигензв'язувального білка за винаходом (Н7 - гуманізований)
Таблиця Зв
Натвтзитя ун
КАР: ЕТ: ВО КОН о ТО мназознУВА 77777777 17777171 66 71 мн 1111171вв
У втіленні винаходу антигензв'язувальний білок або його антигензв'язувальний фрагмент містять варіабельний домен важкого ланцюга, вибраний з групи, що складається з: її варіабельного домену важкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО. 8 або будь-якою послідовністю, ідентичною принаймні на 80 95 послідовності ЗЕО ІЮ МО.8; ії) варіабельного домену важкого ланцюга з послідовністю ЗЕО ІЮО МО. 48 або будь-якою послідовністю, ідентичною принаймні на 80 95 послідовності ЗЕО ІЮ МО. 48; і ії) варіабельного домену важкого ланцюга з послідовністю ЗЕО ІЮ МО. 49-68 або будь-якою послідовністю, ідентичною принаймні на 80 95 послідовностям ЗЕО ІЮ МО. 49-68.
У втіленні винаходу антигензв'язувальний білок або його антигензв'язувальний фрагмент містять варіабельний домен легкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО. 36 або будь-якою послідовністю, ідентичною принаймні на 8095, краще на 8595, 9095, 9595 та 98 965, послідовності ЗЕО ІЮ МО. 36; та варіабельний домен важкого ланцюга з послідовністю 5ЕО І
МО. 48 або будь-якою послідовністю, ідентичною принаймні на 80 95, краще на 85 95, 90 9», 95 96 та 98 95, послідовності ЗЕО ІЮ МО. 48.
В іншому втіленні винаходу антигензв'язувальний білок або його антигензв'язувальний фрагмент містять варіабельний домен легкого ланцюга з послідовністю, вибраний з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО. 37-47, або будь-якою послідовністю, ідентичною принаймні на 80 95,
Ко) краще на 85 95, 90 95, 95 95 та 98 95, послідовностям ЗЕО ІЮО МО. 37-47; і варіабельний домен важкого ланцюга з послідовністю, вибраною з групи, що складається з ЗЕО ІЮО МО. 49-68, або будь-якою послідовністю, ідентичною принаймні на 80 95, краще на 85 95, 90 95, 95 95 та 98 95, послідовностям ЗЕО ІЮ МО. 49-68.
У втіленні винаходу антигензв'язувальний білок або його антигензв'язувальний фрагмент містять:
ї) варіабельний домен легкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО. 7, 36 або 37-47 або будь-якою послідовністю, ідентичною принаймні на 80 95 послідовностям ЗЕО ІЮО МО.7, 36 або 37-47; та і) варіабельний домен важкого ланцюга з послідовністю ЗЕО ІЮ МО. 8, 48 або 49-68 або будь-якою послідовністю, ідентичною принаймні на 80 95 послідовностям ЗЕО ІЮО МО.8, 48 або 49-68.
Новий аспект даного винаходу стосується виділеної нуклеїнової кислоти, яка відрізняється тим, що вона вибрана з таких нуклеїнових кислот (включаючи будь-який вироджений генетичний код): а) нуклеїнової кислоти, кодуючої антигензв'язувальний білок або його антигензв'язувальний фрагмент за винаходом; р) нуклеїнової кислоти, що містить: - нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з послідовностей ЗЕО ІЮ МО5. 15-28 та 69-99, або - нуклеотидну послідовність, що містить 6 нуклеотидних послідовностей 5ЕО ІЮ МО5.: 15-20, або - нуклеотидну послідовність, що містить дві нуклеотидні послідовності «ЕО ІЮО МОЗ5.: 21, 22, або дві нуклеотидні послідовності, вибрані з одного боку з БЕО ІЮ МО5.: 69-79, а з іншого боку з
ЗЕО ІЮ МО: 80-99; с) нуклеїнової кислоти, комплементарної нуклеїновій кислоті, визначення якої наведене в пунктах а) або Б); та 4) нуклеїнової кислоти, яка краще містить принаймні 18 нуклеотидів, здатної гібридизуватися в жорстких умовах з нуклеїновою кислотою з послідовністю, визначення якої наведене в пунктах а) або Б), або з послідовністю, ідентичною при оптимальному вирівнюванні принаймні на 80 95, краще на 85 95, 90 95, 95 95 та 98 95, послідовності нуклеїнової кислоти, визначення якої наведене в пуктах а) або б).
В Таблиці 4а нижче наведені різні нуклеотидні послідовності, що стосуються зв'язувального білка за винаходом (Ми - мишачий).
Таблиця 4а 11111111. | НумерацясСОВ | Важкийланцюг | Легкийланцюг | 5ЕОЇІОМО 1100 совія | 50 1111011 сові2 | 1600 11001 совіз3 | 71717 мот олені 01777770101010101017171011718 і осовнае |! 77777777 1771719 і осовну Ї 77777777 171 20 10 сов | 230 1111011 сові? | 240 1613212 кар 11001 совіЗ3 | 250 воаї і совні Її! 77777771 26 о совнае ЇЇ 77777777 17117127 і осовн Ї 777777777777711711717 28
Мишачий варіабельний 21 домен пен . й 22 варіабельний домен
Зо
Для більшої ясності в Таблиці 4б нижче наведені різні нуклеотидні послідовності, що відповідають варіабельному домену легкого ланцюга (МІ) гуманізованого антигензв'язувального білка за винаходом (Н7 - гуманізований)
Таблиця 46
Ми в
Натвтзети М
Для більшої ясності в Таблиці 4в8 нижче наведені різні нуклеотидні послідовності, що відповідають варіабельному домену важкого ланцюга (ун) гуманізованого антигензв'язувального білка за винаходом (Н7 - гуманізований)
Таблиця 4в м во
Мн 11111187
Натв13в12 УН мнаїМмввК 77777777777777777717Ї1777171717171118871 мнатмвхвМввК 77777777 17777171 9071 мназмВ 77777777 Ї1777171717171711719671 мМнаєЄ 1117977
КУТ х ЕЛ КО: С: ПОН
Терміни "нуклеїнова кислота", "нуклеїнова послідовність", "послідовність нуклеїнової кислоти", "полінуклеотид", "олігонуклеотид", "полінуклеотидна послідовність" та "нуклеотидна послідовність" в даному описі використовуються взаємозамінно, позначають точну послідовність нуклеотидів, модифікованих або немодифікованих, що описують фрагмент або ділянку нуклеїнової кислоти, які містять нуклеотиди, що зустрічаються або не зустрічаються в природі, та які є дволанцюговою ДНК, одноланцюговою ДНК або продуктами транскрипції вказаних ДНК.
Послідовності за даним винаходом були виділені та/або очищені, тобто, їх відібрали напряму або опосередковано, наприклад, через копії, їх оточення було принаймні частково модифіковано. До них також належать виділені нуклеїнові кислоти, одержані рекомбінантними генетичними методами, наприклад, з клітин-хазяїв, або одержані методом хімічного синтезу. "Нуклеїнові послідовності, ідентичні принаймні на 80 95, краще на 85 95, 90 95, 95 95 та 98 95, після оптимального вирівнювання з кращою послідовністю" позначають нуклеїнові послідовності, які мають у порівнянні з референсною нуклеїновою послідовністю деякі модифікації, зокрема, такі як делеція, укорочення, подовження, химеризація та/або заміна,
зокрема точкова. Краще, це послідовності, які кодують ті самі амінокислотні послідовності, що й референсна послідовність, внаслідок виродженості генетичного коду, або комплементарні послідовності, які можуть специфічно гібридизуватися з референсною послідовністю, краще в жорстких умовах, зокрема, описаних нижче.
Гібридизація в жорстких умовах означає, що умови, які стосуються температури та іонної сили, вибрані таким чином, що вони забезпечують гібридизацію двох комплементарних фрагментів ДНК. Виключно в ілюстративних цілях нижче наведені жорсткі умови для етапу гібридизації з метою характеристики полінуклеотидних фрагментів, описаних вище.
Гібридизація ДНК-ДНК або ДНК-РНК здійснюється в два етапи: (1) прегібридизація при 42 С протягом трьох годин в фосфатному буфері (20 мМ, рН 7,5) що містить 5х 550 (їх 556 відповідає розчину 0,15 М МасСіІ я- 0,015 М цитрату натрію), 5095 формамід, 7 90 додецилсульфат натрію (ДСН), 10 х розчин Денхардта, 5 9о сульфат декстрану та 1 95 ДНК молочка лососевих; (2) первинна гібридизація протягом 20 годин при температурі, що залежить від довжини зонда (тобто 42 "С для зонда довжиною 2100 нуклеотидів) з подальшими двома 20- хвилинними відмиваннями при 20 "С в 2 х 55С-2 95 ДСН, одним 20-хвилинним відмиванням при 20"С в 0,1 х 55С--0,1 95 ДСН. Останнє відмивання здійснюють в 0,1 х 55С0--0,1 956 ДСН протягом 30 хвилин при 60"С для зонда довжиною 2100 нуклеотидів. Жорсткі умови гібридизації, описані вище для полінуклеотиду визначеного розміру, фахівець в даній області може адаптувати для більш довгих чи більш коротких олігонуклеотидів згідно з протоколами, описаними Затьгоок, еї аї. (МоЇІесшціаг сіопіпд: А Іабогаюгу тапиаї, Со 5ргіпа Нагбог І абогаїюгу; зга еайоп, 2001).
Винахід також стосується вектора, що містить нуклеїнову кислоту, описану у винаході.
Винахід, зокрема, стосується клонуючих та/або експресуючих векторів, що містять таку нуклеотидну послідовність.
Вектори за винаходом краще містять елементи, що забезпечують експресію та/або секрецію нуклеотидної послідовності в заданій клітині-хазяїні Таким чином, вектор повинен містити промотор, сигнали ініціації та термінації трансляції, а також придатні області, що регулюють транскрипцію. Він повинен зберігати стабільність у клітині-хазяїні та можливо нести певні сигнальні послідовності, що забезпечують секрецію трансльованого білка. Фахівці в даній
Зо області вибирають та оптимізують ці різні елементи в залежності від використовуваної клітини- хазяїна. З цією метою нуклеотидні послідовності можна вбудовувати в самореплікативні вектори, що містяться у вибраних хазяях, або вектори, що інтегруються в геном клітини-хазяїна.
Такі вектори одержують способами, стандартно використовуваними фахівцями в даній області, а одержані клони можна вводити в придатну клітину-хазяїна з використанням стандартних способів, таких як ліпофекція, електропорація, тепловий шок або хімічні методи.
Вектори, наприклад, можуть бути створені на основі плазмід або вірусів. Їх використовують для трансформації клітин-хазяїв для клонування або експресії нуклеотидних послідовностей за винаходом.
Винахід також стосується виділених клітин-хазяїв, трансформованих або таких, що містять вектор, описаний в даному винаході.
Клітина-хазяїн може бути вибрана з прокаріотичних або еукаріотичних систем, наприклад, таких як бактеріальні клітини, а також клітини дріжджів або клітини тварин, зокрема, клітини ссавців (за винятком людини). Також можна застосовувати клітини комах або рослин.
Винахід також стосується тварин, відмінних від людини, які мають трансформовані клітини за винаходом.
Інший аспект винаходу стосується способу одержання антигензв'язувального білка за винаходом або його антигензв'язувального фрагмента, які відрізняються тим, що вказаний спосіб включає такі етапи: а) культивування в середовищі при умовах культивування, придатних для клітини-хазяїна за винаходом; та
Б) виділення антигензв'язувального білка або одного 3 його антигензв'язувальних фрагментів, одержаних у такий спосіб з культурального середовища або з вказаних культивованих клітин.
Трансформовані клітини за винаходом застосовують в способах одержання рекомбінантних антигензв'язувальних білків за винаходом. Способи одержання антигензв'язувальних білків за винаходом в рекомбінантій формі, які відрізняються тим, що у вказаних способах використовують вектор та/або клітину, трансформовану вектором за винаходом, також входять до обсягу даного винаходу. Краще, клітини, трансформовані вектором за винаходом, культивують в умовах, які забезпечують експресію вищезгаданого антигензв'язувального білка 60 та виділення вказаного рекомбінантного білка.
Як вже згадувалося вище, клітина-хазяїн може бути вибрана з прокаріотичних або еукаріотичних систем. Зокрема, можна встановити нуклеотидні послідовності за винаходом, які полегшують секрецію в таких прокаріотичних або еукаріотичних системах. Вектор за винаходом, що несе таку послідовність, можна успішно застосовувати для одержання секретованих рекомбінантних білків. Дійсно, очистка таких рекомбінантних білків, що представляють інтерес, буде полегшена, оскільки вони будуть перебувати в надосадній культуральній рідині, а не усередині клітин-хазяїв.
Антигензв'язувальний білок за винаходом можна також одержувати за допомогою хімічного синтезу. Один з таких способів одержання також є об'єктом винаходу. Фахівцю в даній області відомі способи хімічного синтезу, такі як методи твердофазового синтезу (зокрема, див. бієемага еї аї., 1984, 5оїїа рназе рерііде5 зупіпевів, Ріетсе Снпет. Сотрапу, НКосКіога, 111, 2па єд., рр 71- 95) або методи конвергентного твердофазового синтезу з конденсацією фрагментів або стандартного синтезу в розчині. Поліпептиди, одержані методом хімічного синтезу, що можуть мати в своєму складі відповідні амінокислоти, які не зустрічаються в природі, також входять до обсягу винаходу.
Антигензв'язувальний білок або його антигензв'язувальні фрагменти, які можливо одержати способом за винаходом, також входять до обсягу даного винаходу.
Конкретний аспект винаходу стосується антигензв'язувального білка або його антигензв'язувального фрагмента, описаних вище, для застосування як продукт для адресної доставки цитотоксичного агента в сайт-мішень хазяїна, вказаний сайт-мішень має в своєму складі епітоп, який перебуває в позаклітинному домені білка Ахі, краще в позаклітинному домені людського білка Ахі, ще краще в позаклітинному домені людського білка Ахі, що має послідовність 5ЕО ІЮ МО. 31 або 32, або природні варіанти його послідовності.
В кращому втіленні вказаний сайт-мішень хазяїна є сайтом-мішенню клітини ссавця, ще краще клітини людини, ще краще клітин, які природно або в результаті генетичної рекомбінації експресують білок АХІ.
Винахід стосується імунокон'югата, що містить антигензв'язувальний білок, описаний в даній заявці, кон'югований з цитотоксичним агентом.
В даному винаході вираз "імунокон'югат" або "імуно-кон'югат" позначає сполуку, яка містить принаймні продукт для забезпечення адресної доставки, фізично зв'язаний 3 одним чи декількома терапевтичними агентами, дозволяючи таким чином одержати високоспецифічні сполуки.
В кращому втіленні такі терапевтичні агенти є цитотоксичними агентами.
Під "цитотоксичним агентом" або "цитотоксичною сполукою" розуміють агент, який при введенні суб'єкту впливає на клітинну проліферацію або запобігає їй, краще впливає на або запобігає розвитку раку в організмі суб'єкта, шляхом інгібування або попередження реалізації клітинної функції та/або викликаючи загибель клітини.
Було виділено або синтезовано множину цитотоксичних агентів, що пригнічують клітинну проліферацію або викликають руйнування або скорочення числа пухлинних клітин, якщо не абсолютне, то принаймні істотне. Однак, токсична активність цих агентів не обмежена пухлинними клітинами, і клітини, які не є пухлинними, також зазнають впливу і можуть руйнуватися. Зокрема, побічні ефекти стосуються клітин, які швидко оновлюються, таких як гемопоетичні клітини або клітини епітелія, зокрема епітелію слизових оболонок. Як ілюстрації можна привести клітини шлунково-кишкового тракта, які зазнають значного впливу при застосуванні таких цитотоксичних агентів.
Однією з цілей даного винаходу є створення цитотоксичного агента, який дозволить скоротити побічні ефекти по відношенню до нормальних клітин при збереженні високої цитотоксичної активності по відношенню до пухлинних клітин.
Зокрема, цитотоксичний агент краще може мати в своєму складі, крім іншого, лікарський засіб (тобто "кон'югат антитіло-лікарський засіб"), токсин (тобто "імунотоксин" або "кон'югат антитіло-токсин"), ізоторадіоп (тобто "радіоїмунокон'югат" або "кон'югат антитіло-радіоізотоп") і т.д.
В першому кращому втіленні винаходу імунокон'югат має в своєму складі зв'язувальний білок, з'єднаний принаймні з лікарським засобом або лікарським препаратом. Такий імунокон'югат називається кон'югатом антитіло-лікарський засіб (або "ХОС", від англ. апііроду- дгид сопідаїе), у якому зв'язувальний білок є антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом.
В першому втіленні такі ліки можна описати з урахуванням їх способу дії. Як приклад, який не є вичерпним, можна навести алкілувальні агенти, такі як азотистий іприт (мехлоретамін), бо алкілсульфонати, нітрозосечовину, оксазофорини, азиридини або іміноетилени,
антиметаболіти, протипухлинні антибіотики, інгібітори мітозу, інгібітори функціонування хроматину, антиангіогенні агенти, антиестрогени, антиандрогени, хелатуючі агенти, стимулятори абсорбції заліза, інгібітори циклооксигенази, інгібітори фосфодіестерази, інгібітори
ДНК, інгібітори синтезу ДНК, стимулятори апоптозу, інгібітори синтезу тимідилату, інгібітори Т- клітин, агоністи інтерферону, інгібітори рибонуклеозидтрифосфат-редуктази, інгібітори ароматази, антагоністи естрогенових рецепторів, інгібітори тирозинкінази, інгібітори клітинного циклу, таксани, інгібітори тубуліну, інгібітори ангіогенезу, стимулятори макрофагів, антагоністи нейрокінінових рецепторів, агоністи канабіноїдних рецепторів, агоністи допамінових рецепторів, агоністи гранулоцитарного колоніестимулювального фактора, агоністи рецепторів еритропоетину, агоністи рецепторів соматостатину, агоністи ЛГРГ, кальцієві сенсибілізатори (що підвищують чутливість до іонів кальцію), антагоністи рецепторів фактора росту судинного ендотелію, антагоністи інтерлейкінових рецепторів, інгібітори остеокластів, стимулятори утворення вільних радикалів, антагоністи рецепторів ендотеліну, алкалоїд барвінку, антигормони або імуномодулятори або будь-які інші нові ліки, що відповідають критеріям, висуваним до активності цитотоксичного агента або токсину.
Такі лікарські засоби, наприклад, є згадуваними в довіднику МІСАЇ. 2010, на сторінці, присвяченій сполукам, що належать до розділу "цитотоксичні препарати" в канцерології та гематології, і ці цитотоксичні сполуки, перелічені з посиланням на даний документ, згадуються в даній заявці як кращі цитотоксичні агенти.
Більш конкретно, поміж інших, кращими за винаходом є такі лікарські засоби: мехлоретамін, хлорумбукол, мелфалан, хлоргідрат, піпоброман, преднімустин, динатрій-фосфат, естрамустин, циклофосфамід, алтретамін, трофосфамід, сульфофосфамід, іфосфамід, тіотепа, триетиленамін, алтретамін, кармустин, стрептозоцин, фотемустин, ломустин, бусульфан, треосульфан, імпросульфан, дакарбазин, цисплатин, оксаліплатин, лобаплатин, гептаплатин, міриплатину гідрат, карбоплатин, метотрексат, пеметрексед, 5-фторурацил, флоксуридин, 5- фтордезоксиуридин, капецитабін, цитарабін, флударабін, цитозин-арабінозид, б-меркаптопурин (6-МП), неларабін, б-тіогуанін (6-ТГ), хлордезоксіаденозин, 5-азацитидин, гемцитабін, кладрибін, дезоксикоформіцин, тегафур, пентостатин, доксорубіцин, даунорубіцин, ідарубіцин, валрубіцин, мітоксантрон, дактиноміцин, мітраміцин, плікаміцин, мітоміцин С, блеоміцин, прокарбазин, паклітаксел, доцетаксел, вінбластин, вінкристин, віндезин, вінорелбин, топотекан, іринотекан, етопозид, валрубіцин, амрубіцину гідрохлорид, пірарубіцин, еліптинію ацетат, зорубіцин, епірубіцин, ідарубіцин та теніпозид, разоксин, маримастат, батимастат, приномастат, таномастат, іломастат, СОо5-27023А, галофугінон, СОЇ -3, неовастат, талідомід, СОС 501,
ОМХАА, 1І-651582, скваламін, ендостатин, 505416, 506668, інтерферон-альфа, ЕМО121974, інтерлейкін-12, ІМ862, ангіостатин, тамоксифен, тореміфен, ралоксифен, дролоксифен, йодоксифен, анастрозол, летрозол, екземестан, флутамід, нілутамід, спіронолактон, ципротерону ацетат, фінастерид, цимітидин, бортезоміб, велкейд, бікалутамід, ципротерон, флутамід, фулвестрант, екземестан, дазатиніб, ерлотиніб, гефітиніб, іматиніб, лапатиніб, нілотиніб, сорафеніб, сунітиніб, ретиноїд, рексиноїд, метоксален, метиламінолевулінат, алдеслейкін, ОСТ-43, денілейкін дифтитокс, інтерлейкін-2, тазонермин, лентинан, сизофілан, роквінімекс, підотимод, пегадемаза, тимопентин, полі-І| (полінозинова - поліцитидилова кислота), прокодазол, Тайс БЦЖ, согупебасіегішт раг/ит, МОМУ-002, україн, левамізол, 1311-
СТ, Н-101, целмолейкін, інтерферон альфа-г2а, інтерферон альфа-2Б, інтерферон гамма-іа, інтерлейкін-2, мобенакін, рексин (Кехіп-С), тецелейкін, акларубіцин, актиноміцин, арглабін, аспарагіназа, карцинофілін, хромоміцин, дауноміцин, лейковорин, масопрокол, неокарциностатин, пепломіцин, саркоміцин, соламаргін, трабектедин, стрептозоцин, тестостерон, кунекатехіни (Кипесаїеспіп5), синекатехіни, алітретиноїн, белотекану гідрохлорид, калустерон, дромостанолон, еліптинію ацетат, етиніл естрадіол, етопозид, флюоксиместерон, формістан, фосфетрол, гозереліну ацетат, гексиламінолевулінат, гістрелін, гідроксипрогестерон, іксабепілон, лейпролід, медроксипрогестерону ацетат, мегестролу ацетат, метилпреднізолон, метилтестостерон, мілтефозин, мітобронітол, надролону фенілпропіонат, норетиндрону ацетат, преднізолон, преднізон, темсиролімус, тестолактон, триамцинолон, трипторелін, вапреотиду ацетат, циностатин-стималамер, амсакрин, триоксид арсену, бізантрену гідрохлорид, хлорамбуцил, хлортрианізен, цис-діамінодихлороплатина, циклофосфамід, діетилстилбестрол, гексаметилмеламін, гідроксисечовина, леналідомид, лонідамін, мехлоретамін, мітотан, недаплатин, німустину гідрохлорид, памідронат, піпоброман, порфимер натрій, ранімустин, разоксан, семустин, собузоксан, мезилат, триетиленмеламін, золедронова кислота, камостату мезилат, фадрозол НС, нафоксидин, аміноглутетимід, кармофур, клофарабін, цитозину арабінозид, децитабін, доксифлуридин, еноцитабін, 60 флударабіну фосфат, фторурацил, фторафур, урамустин, абарелікс, бексаротен,
ралтитрексид, тамібаротен, темозоломід, вориностат, мегестрол, динатрію клодронат, левамізол, ферумокситол, заліза ізомальтозид, целекоксиб, ібудиласт, бендамустин, алтретамін, мітолактол, темсиролімус, пралатрексат, 5-1, децитабін, бікалутамід, флутамід, летрозол, динатрію клодронат, дегарелікс, тореміфену цитрат, гістаміну дигідрохлорид, ЮМУ- 166НС, нітракрин, децитабін, іринотекану гідрохлорид, амсакрин, ромідепсин, третиноїн, кабазитаксел, вандетаніб, леналідомід, ібандронова кислота, мілтефозин, вітеспен, міфамуртид, надропарин, гранісетрон, ондансетрон, тропісетрон, алізаприд, рамосетрон, доласетрону месилат, фосапрепітанту димеглумін, набілон, апрепітант, дронабінол, ТУ-10721, лізуриду гідромалеат, епіцерам, дефібротид, дабігатрану етексилат, філграстим, пегфілграстим, редитукс, епоетин, молграмостим, опрелвекін, сипулейцел-Ї, М-Мах, ацетил І -карнітин, донепезилу гідрохлорид, 5-амінолевулінова кислота, метиламінолевулінат, цетрореліксу ацетат, ікодекстрин, лейпрорелін, метилфенідат, октреотид, амлексанокс, плериксафор, менатетренон, анетолу дитіол-тіон, доксеркальциферол, цинакальцету гідрохлорид, алефацепт, роміплостим, тимоглобулін, тимальфазин, убенімекс, іміквімод, еверолімус, сиролімус, Н-101, лазофоксифен, трилостан, інкадронат, гангліозиди, октанатрію пегаптаніб, вертопорфин, мінодронова кислота, золедронова кислота, галію нітрат, натрію алендронат, динатрію етидронат, динатрію памідронат, дутастерид, натрію стибоглюконат, армодафініл, дексразоксан, аміфостин, М/Е-10, темопорфін, дарбепоетин альфа, анцестим, сарграмостим, паліфермін, К-744, непідермін, опрелвекін, денілейкін дифтитокс, крисантаспаза, бусерелін, деслорелін, ланреотид, октреотид, пілокарпін, бозентан, каліхіміцин, майтанзиноїди та циклонікат.
Для більш докладної інформації фахівці в даній області можуть звернутися до посібника під ред. Французської асоціації викладачів медичної хімії, озаглавленого "Трактат з медичної хімії" ("Тайе де спітіє Іегарешідие, мої. 6, Медісатепів апійштогаих еї рег5ресіїме5 дапз І ігайетепі дев сапсегв, еайіоп ТЕС а рос, 20037).
Друге краще втілення винаходу стосується імунокон'югату, який має в своєму складі зв'язувальний білок, зв'язаний принаймні з радіоїзотопом. Такий імунокон'югат називають кон'югатом антитіло-радіоїзотоп (або "АКС", від англ. апііроду-гадіоізоїоре сопіцшдаїе), у якому зв'язувальний білок є антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом.
Зо Для вибіркового руйнування пухлини антитіло може містити високорадіоактивні атоми. Для одержання АКС існує ряд радіоактивних ізотопів, що включає А", 15 М, 017, я, 1128, 81, 25, пт, мо Ве86, Вет88 Бл, Тоб9т, Віг12, рзг, рр2г:, радіоактивні ізотопи и, гадолінію, марганцю або заліза, без обмеження ними.
Для інкорпорування цих радіоіїзотопів в склад АКС можна застосовувати будь-які способи або процеси, відомі фахівцям в даній області техніки (див., наприклад, "Мопосіопа! Апіїбодіє5 іп
Ітітипозсіпіідгарпу", СпазаІ, СС Ргев5 1989). Як приклад, який не є вичерпним, То9т або 125,
Ве"86, Ве"88 та |п'її можуть бути приєднані по залишкам цистеїну. М можна приєднувати по залишкам лізину. 123 можна приєднувати за допомогою способу ІОРОСЕМ (Егакег еї аї. (1978)
Віоспет. Віорпуз. Ве5. Соттип. 80: 49-57).
Для ілюстрації відомого рівня техніки можна навести декілька прикладів АКС, таких як
Зевалін?, який є АКС, що складається з моноклонального антитіла до СО20 та радіоізотопів
І!!! або У, зв'язаних з хелатоутворювальним комплексом тіосечовина-лінкер (У/ізетап еї аї (2000) Єик. Чоцг. Мисі. Мед. 27(7): 766-77; Мізетап еї а!. (2002) Віоса 99(12):4336-42; М гід єї аї (2002) 9. Сіїй. Опсої. 20(10):2453-63; МУ/йгід еї аіІ. (2002) 9. Сііп. Опсої. 20(15):3262-69); або
Мілотарг?, що складається з антитіла до СО33, зв'язаного з каліхіміцином (05 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Можна також згадати кон'югат "антитіло-лікарський засіб", який носить назву Адцетрис (або брентуксимаб ведотин), нещодавно схвалений Управлінням з контролю якості харчових продуктів та лікарських засобів
США для лікування лімфоми Ходжкіна (Майиге, мої. 476, рр380-381, 25 Айдиві 2011).
В третьому кращому втіленні винаходу імунокон'югат має в своєму складі зв'язувальний білок, зв'язаний принаймні з токсином. Такий імунокон'югат називають кон'югат "антитіло- токсин" (або "АТС", від англ. апіїбоду-їюхіп сопічшдаїе), у якому зв'язувальний білок є антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом.
Токсини є ефективними та специфічними отрутами, вироблюваними живими організмами.
Вони як правило є амінокислотним ланцюгом, молекулярна вага якого може варіювати від двохсот (пептиди) до ста тисяч (білки). Вони також можуть бути низькомолекулярними органічними сполуками. Токсини продукують множина мікроорганізмів, наприклад, бактерії, гриби, водорості та рослини. Багато з них є надзвичайно ядовитими, їх токсичність на декілька порядків перевищує токсичність отруйних речовин нервово-паралітичної дії. 60 Токсини, застосовувані в складі АТС, можуть включати усі види токсинів, у яких механізм цитотоксичної дії включає зв'язування тубуліну, зв'язування ДНК або інгібування топоізомерази, без обмеження ними.
Застосовувані ензиматично активні токсини та їх фрагменти включають А-ланцюг дифтерійного токсину, незв'язувальні активні фрагменти дифтерійного токсину, А-ланцюг екзотоксину (з Рз5епйдотопаб5 аегидіпоза), А-ланцюг рицину, А-ланцюг абрину, А-ланцюг модецину, альфа-сарцин, білки Аїепгігез гогаї, білки діантини, білки Рпуїіаса атегісапа (РАРІ,
РАРІЇ та РАР-5), інгібітор Мотогаїса спагапііа, курцин, кротин, інгібітор Зараопагіа ойісіпаїї5, гелонін, мітогелін, рестриктоцин, феноміцин, еноміцин та трихотецени.
Низькомолекулярні токсини, такі як доластатини, ауристатини, трихотецен та СС1065 та похідні цих токсинів, що мають токсичну активність, також входять до обсягу даного опису. Було показано, що доластатини та ауристатини порушують динаміку мікротрубочок, перешкоджають гідролізу ГТФ і ядерному та клітинному діленню і виявляють протипухлинну та протигрибкову активність. "Лінкер", "лінкнерна ланка" або "зв'язуюча ланка" позначають хімічну групу, що містить ковалентний зв'язок або ланцюг атомів, які ковалентно приєднують зв'язувальний білок до принаймні одного цитотоксичного агента.
Лінкери можуть бути одержані із застосуванням різних біфункціональних білок-зв'язувальних агентів, таких як М-сукцинімідил-3-(2-піридилдитіо)пропіонат (5РОР), сукцинімідил-4-(М- малеїмідометил)циклогексан-1-карбоксилат (5МСС), імінотіолан (ІТ), біфункціональних похідних імідоефірів (таких як диметиладипімідат НС), активних ефірів (таких як дисукцинімідил- суберат), альдегідів (таких як глутаральдегід), біс-азидосполук (таких як біс-(п- азидобензоїл)гександіамін), похідних бісдіазонію (таких як біс-(п-діазонійбензоїл)етилендіамін), діїзоціанатів (таких як толуол-2,6-діізоціанат) та сполук з двома активними атомами фтору (таких як 1,5-дифтор-2,4-динітробензол). Прикладом хелатуючого агента для кон'югації цитотоксичних агентів із системою для адресної доставки є мічена вуглецем-14 1- ізотіоціанатобензил-З-метилдіетилентриамінопентаоцтова кислота (МХ-ОТРА). Іншими сшивальними агентами можуть бути ВМР5, ЕМСОС5, МВ5, НВМ5, І С-5МСОС, МВ5, МРВН, 5ВАР,
ІА, БІАВ, ЗМОСС, 5МРВ, ЗМРН, сульфо-ЕМСОС5, сульфо-СМВ5, сульфо-КМОИ5, сульфо-МВ5, сульфо-5ІАВ, сульфо-ЗМСС та сульфо-5МРВ і 5М5В (сукцинімідил-(4-вінілсульфо)бензоат), доступні з комерційних джерел (наприклад, від компанії Ріегсе Віоїесппо!Іоду, Іпс., Коскгога, 111.,
И.5.А).
Лінкер може бути "нерозщеплюваним" або "розщеплюваним".
В кращому втіленні він є "розщеплюваним лінкером", що сприяє вивільненню цитотоксичного агента у клітині. Наприклад, можна застосовувати чутливий до кислот лінкер, чутливий до пептидів лінкер, фотолабільний лінкер, диметиловий лінкер або дисульфід-вмісний лінкер. В кращому втіленні лінкер є розщеплюваним у внутрішньоклітинних умовах лінкером, так що розщеплення лінкера приводить до відокремлення цитотоксичного агента від зв'язувального білка у внутрішньоклітинний простір.
Наприклад, в деяких втіленнях лінкер розщеплюється розщеплювальним агентом, присутнім у внутрішньоклітинному середовищі (наприклад, усередині лізосом або ендосом або кавеол).
Лінкер може бути, наприклад, пептидним лінкером, розщеплюваним внутрішньоклітинними пептидазами або протеазами, включаючи лізосомальні або едосомальні протеази, без обмеження ними. Як правило, пептидний лінкер складається принаймні з двох амінокислот або принаймні з трьох амінокислот. Розщеплювальні агенти можуть включати катепсини В та О та плазмін, відомі своєю здатністю гідролізувати дипептидні похідні лікарських засобів, що приводить до вивільнення активних агентів усередині клітин-мишеней. Наприклад, можна застосовувати пептидний лінкер, розщеплюваний тіол-залежною протеазою катепсином-В, високий рівень експресії якої спостерігається в пухлинних тканинах (наприклад, лінкер Рпе-ї ви або СіІу-Рпе-Їец-СУ) У певних втіленнях пептидний лінкер, розщеплюваний внутрішньоклітинною протеазою, є лінкером МаІ-Сй або лінкером РІе-Гуз. Однією з переваг використання цитотоксичних агентів, що вивільняються при внутрішньоклітинному протеолізі, є те, що токсичність агента, як правило, знижується при кон'югації, а стабільність кон'югатів в сироватці, як правило, є високою.
В інших втіленнях розщеплюваний лінкер є рН-чутливим, тобто зазнає гідролізу при певних значеннях рН. Як правило, рН-чутливий лінкер гідролізується в кислому середовищі.
Наприклад, можна використовувати чутливий до кислот лінкер, що гідролізується в лізосомах (наприклад, гідразон, семікарбазон, тіосемікарбазон, цис-аконітовий амід, ортоефір, ацеталь, кеталь тощо). Такі лінкери можуть бути відносно стабільними при нейтральних значеннях рн, таких як характерні для крові, але нестабільними при рН нижче 5,5 або 5,0, що є приблизними бо значеннями рН в лізосомах. У певних втіленнях лінкер, що гідролізується, є тіоефірним лінкером (наприклад, таким як тіоефір, приєднаний до терапевтичного агента через ацилгідразоновий зв'язок).
В інших втіленнях лінкер розщепляється у відновних умовах (наприклад, дисульфідний лінкер). Фахівцям відома множина дисульфідних лінкерів, включаючи, наприклад, такі, які можуть бути утворені з використанням ЗАТА (М-сукцинімідил-5-ацетилтіоацетату), ЗРОР (М- сукцинімідил-3-(2-піридилтіо)пропіонату), ЗРОВ (М-сукцинімідил-3-(2-піридилтіо)бутирату) та
ЗМРТ (М-сукцинімідилоксикарбоніл-альфа-метил-альфа-(2-піридилдитіо)толуолу), ЗРОВ та
ЗМРТ.
Як невичерпний приклад нерозщеплюваних або "невідновлюваних" лінкерів можна згадати імунокон'югат трастузумаб-ЮОМІ1 (ТОМІ), в якому об'єднані трастузумаб та хіміотерапевтичний агент майтанзин (Сапсег Кезеагсп 2008; 68: (22). Мометрбег 15, 2008).
В кращому втіленні імунокон'югат за винаходом може бути одержаний будь-яким способом, відомим фахівцям в даній області, наприклад, таким як ї) реакція нуклеофільної групи антигензв'язувального білка з бівалентним зв'язуючим реагентом з подальшою реакцією з цитотоксичним агентом, або ії) реакція нуклеофільної групи цитотоксичного агента з бівалентним зв'язуючим реагентом з подальшою реакцією з нуклеофільною групою антигензв'язувального білка.
Нуклеофільні групи антигензв'язувального білка включають М-кінцеві аміногрупи, аміногрупи бічних ланцюгів, наприклад, лізину, тіолові групи бічних ланцюгів та гідроксильні або аміногрупи вуглеводів у випадку, якщо антигензв'язувальний білок є глікозилованим, без обмеження ними.
Аміногрупи, тіолові групи та гідроксильні групи є нуклеофільними групами та здатні вступати в реакцію з утворенням ковалентних зв'язків з електрофільними групами лінкерних компонентів та лінкерних реагентів, які включають активні складні ефіри, такі як М-гідроксисукцинімідні ефіри, гідроксибензотриазольні ефіри, галогенформіати та галогенангідриди; алкілгалогеніди та бензилгалогеніди, такі як галоацетаміди; альдегіди, кетони, карбоксильні та малеїмидні групи, без обмеження ними. Антигензв'язувальний білок може мати відновлювані внутрішньоланцюгові дисульфідні зв'язки, тобто цистеїнові місточки. Під дією відновного агента, такого як ДТТ (дитіотреїтол), антигензв'язувальним білкам можна надати здатність вступати в реакцію кон'югації з лінкерними реагентами. Таким чином, кожний цистеїновий місточок теоретично
Зо здатний утворювати дві реакційноздатні тіолові нуклеофільні групи. Додаткові нуклеофільні групи можна вводити в антигензв'язувальний білок за допомогою будь-якої реакції, відомої фахівцям в даній області техніки. Як приклад, який не є вичерпним, можна навести введення реакційноздатних тіолових груп в антигензв'язувальний білок за рахунок введення одного чи декількох залишків цистеїну.
Імунокон'югати також можна одержувати шляхом модифікації антигензв'язувального білка з введенням електрофільних компонентів, здатних вступати в реакцію з нуклеофільними замісними групами лінкерних реагентів або цитотоксичних агентів. Вуглеводні компоненти глікозилованих антигензв'язувальних білків можуть бути окисненими та утворювати альдегідні або кетонні групи, здатні вступати в реакцію з амінними групами лінкерних реагентів або цитотоксичних агентів. Утворювані в результаті іміногрупи основ Шифа можуть утворювати стабільні зв'язки або можуть відновлюватися з утворенням стабільних амінних зв'язків. В одному втіленні реакція вуглеводневої частини глікозилованого антигензв'язувального білка з галактозооксидазою або мета-періодатом натрію може давати карбонільні (альдегідні та кетонні) групи білка, які можуть вступати в реакцію з відповідними групами лікарського засобу. В іншому втіленні білки, що містять М-кінцеві залишки серину або треоніну, можуть вступати в реакцію з мета-періодатом натрію з утворенням альдегіду на місці першої амінокислоти.
В деяких кращих втіленнях лінкерна ланка може мати таку загальну формулу: --Га--Миму--МУу--, де: -Т- позначає подовжувальну ланку;
БО а дорівнює 0 або 1; -М/- позначає амінокислотну ланку; м незалежно позначає ціле число від 1 до 12; -ї- позначає спейсерну ланку; у дорівнює 0, 1 або 2.
Подовжувальна ланка (-Т-), при наявності, з'єднує антигензв'язувальний білок з амінокислотною ланкою (-М/-). Придатні функціональні групи, які можуть бути присутніми в антигензв'язувальному білку чи то природно, чи то в результаті хімічних маніпуляцій, включають сульфгідрильні, амінні, гідроксильні, аномерні гідроксильні та карбоксильні групи вуглеводів.
Придатними функціональними групами є сульфгідрильні та амінні. Сульфгідрильні групи можуть бо бути одержані при відновленні внутрішньомолекулярних дисульфідних зв'язків антигензв'язувального білка, при їх наявності. В альтернативному випадку сульфгідрильні групи можуть бути одержані при реакції аміногрупи лізину антигензв'язувального білка з 2- імінотіолзаном або іншим реагентом, що утворює сульфгідрильні групи. У певних втіленнях антигензв'язувальний білок є рекомбінантним антитілом та створюється у такий спосіб, що несе один чи декілька лізинів. Ще краще, антигензв'язувальний білок створюється таким чином, що несе один чи декілька цистеїнів (порівн. ТпіоМабрв).
В деяких конкретних втіленнях подовжувальна ланка утворює зв'язок з атомом сірки антигензв'язувального білка. Атом сірки може походити з сульфгідрильної (-5Н) групи відновленого антигензв'язувального білка.
В деяких інших конкретних втіленнях подовжувальна ланка зв'язана з антигензв'язувальним білком за допомогою дисульфідного зв'язку між атомом сірки антигензв'язувального білка та атомом сірки подовжувальної ланки.
В інших конкретних втіленнях реакційноздатна група подовжувальної ланки містить реакційноздатний центр, який може вступати в реакцію з аміногрупою антигензв'язувального білка. Аміногрупа може бути аміногрупою аргініну або лізину. Придатні реакційноздатні амінні групи включають активовані складні ефіри, такі як сукцинімідні ефіри, 4-нітрофенілові ефіри, пентафторфенілові ефіри, ангідриди, хлорангідриди, сульфонілхлориди, ізоціанати та ізотіоціанати, без обмеження ними.
В іншому аспекті реакційноздатна група подовжувача містить реакційноздатний центр, здатний вступати в реакцію з модифікованими вуглеводними групами, які можуть бути присутніми в антигензв'язувальному білку. В конкретному втіленні антигензв'язувальний білок піддають ферментативному глікозилуванню з утворенням вуглеводного компонента (слід відзначити, що коли антигензв'язувальний білок є антитілом, вказане антитіло, як правило, є природно глікозилованим). Під дією такого реагенту, як періодат натрію, може відбуватися неповне окиснення вуглеводу, і утворюваний в результаті карбонільний компонент окисненого вуглеводу може вступати в реакцію конденсації з подовжувачем, що містить таку функціональну групу, як гідразид, окКсим, реакційноздатний амін, гідразин, тіосемікарбазид, гідразинкарбоксилат або арилгідразид.
Амінокислотна ланка (-М/-) з'єднує подовжувальну ланку (-Т-) зі спейсерною ланкою (-У-),
Зо якщо спейсерна ланка є присутньою, і з'єднує подовжувальну ланку з цитотоксичним агентом, якщо спейсерна ланка відсутня.
Як вказано вище, -МУм- може бути дипептидом, трипептидом, тетрапептидом, пентапептидом, гексапептидом, гептапептидом, октапептидом, нонапептидом, декапептидом, ундекапептидом або додекапептидом.
В деяких втіленнях амінокислотна ланка може містити амінокислотні залишки, такі як аланін, валін, лейцин, ізолейцин, метіонін, фенілаланін, триптофан, пролін, лізин з ацетильною або формільною захисною групою, аргінін, аргінін із захисною тозильною групою або нітрогрупою, гістидин, орнітин, орнітин з адетильною або формільною захисною групою та цитрулін, без обмеження ними. Ілюстративні приклади амінокислотних лінкерних компонентів краще включають дипептид, трипептид, тетрапептид або пентапептид.
Ілюстративні приклади дипептидів включають: Ма1І-Сії, Аіа-Маї, І уб-І ув, Сп-Сії, Ма!-І уз, Аїа-
Рпє, Ріе-Гуз, Аїа-І уз, Рпе-Сії, І еи-Сії, Пе-Сії, Ттр-Сії, Рпе-Аіа, Рие-МУ-тозил-Агу, Рпе-МеУ-нітро-
Ага.
Ілюстративні приклади трипептидів включають: Ма1!-АІа-Маї, АіІа-А5п-Маї, Ма!-Г еш-Г ув, Аіа-Аїа-
Авп, Рпе-РНе-Гуз, Спу-СТу-сіу, О-Рпе-РНе-Гув, Сіу-РНе-Г ув.
Ілюстративні приклади тетрапептидів включають: сіу-Рпе-І еи-сСіу (ЗЕО ІЮ МО. 33), АІа-І еи-
Аа-І єи (5ЕО ІЮ МО. 34).
Ілюстративні приклади пентапептидів включають: Рго-МаІ-Сіу-МаІ-Ма! (ЗЕО ІО МО. 35).
Амінокислотні залишки, які складають амінокислотний лінкерний компонент, включають ті, що існують в природі, а також мінорні амінокислоти та аналоги амінокислот, які не зустрічаються в природі, такі як цитрулін. Амінокислотні лінкерні компоненти можна конструювати та оптимізувати за їх вибірковістю для ферментативного розщеплення конкретними ферментами, наприклад, пухлина-асоційованими протеазами, катепсином В, С та р або протеазою плазміном.
Амінокислотна ланка лінкера може зазнавати ферментативного розщеплення для вивільнення цитотоксичного агента під дією ферментів, що включають пухлина-асоційовану протеазу, без обмеження ними.
Амінокислотну ланку можна створювати та оптимізувати за її вибірковістю для ферментативного розщеплення конкретними пухлина-асоційованими протеазами. Придатними бо ланками є такі, розщеплення яких каталізується протеазами катепсином В, С та О та плазміном.
Спейсерна ланка (-У-), при наявності, з'єднує амінокислотну ланку з цитотоксичним агентом.
Спейсерні ланки належать до двох основних типів: саморуйнівні спейсери та спейсери, які не зазнають саморуйнування. Спейсерна ланка, яка не зазнає саморуйнування, залишається частково або повністю зв'язаною з цитотоксичним агентом після ферментативного відщеплення амінокислотної ланки від імунокон'югата. Приклади спейсерних ланок, які не зазнають саморуйнування, включають спейсерні ланки (гліцин-гліцин) та гліцинові спейсерні ланки, без обмеження ними. Для вивільнення цитотоксичного агента необхідно проведення незалежної реакції гідролізу усередині клітини-мішені для розщеплення зв'язку між гліцином та лікарським компонентом.
В іншому втіленні спейсерною ланкою (-У-), що не зазнає саморуйнування, є -С1у-.
В одному втіленні імунокон'югат не має спейсерної ланки (у-0). В альтернативному випадку, імунокон'югат, який містить саморуйнівну спейсерну ланку, може вивільняти цитотоксичний агент без необхідності в проведенні окремого етапу гідролізу. В цих втіленнях -У- є р- амінобензиловим спиртом (РАВ), з'єднаним з -М/м/- через атом азоту групи РАВ та приєднаний безпосередньо до -О через карбонатну, карбаматну або ефірну групу.
Інші приклади саморуйнівних спейсерів включають ароматичні сполуки, які є електронно- схожими з групою РАВ, такі як похідні 2-аміноіїмідазол-5--метанолу та орто- або пара- амінобензилацеталі, без обмеження ними. Можна застосовувати спейсери, які легко зазнають циклізації при гідролізі амідних зв'язків, такі як заміщені та незаміщені аміди 4-амінобутирової кислоти, відповідно заміщені циклічні системи біцикло|2.2.1| та біцикло|2.2.2)| і аміди 2- амінофенілпропіонової кислоти.
В альтернативному втіленні спейсерною ланкою є розгалужений біс-(гідроксиметил)стирол (ВНМ5), який можна застосовувати для інкорпорування додаткових цитотоксичних агентів.
Наконец, винахід стосується імунокон'югата, описаного вище, для застосування в лікуванні раку.
Рак краще може бути вибраний з Ахі-залежних форм раку, включаючи пухлинні клітини, які характеризуються експресією або надекспресією білка Ахі або його частини на своїй поверхні.
Більш конкретно, вказаний рак є раком молочної залози, товстої кишки, карциномою стравоходу, гепатоцелюлярною карциномою, раком шлунка, гліомою, раком легені, меланомою,
Зо остеосаркомою, раком яєчників, передміхурової залози, рабдоміосаркомою, раком нирки, щитоподібної залози та раком ендометрія матки, а також будь-яким феноменом лікарської резистентності. Іншии об'єктом винаходу є фармацевтична композиція, що містить імунокон'югат, описаний в даній заявці.
Більш конкретно, винахід стосується фармацевтичної композиції, яка має в своєму складі імунокон'югат за винаходом з принаймні одним ексципієнтом та/або фармацевтично прийнятним носієм.
В даному описі вираз "фармацевтично прийнятний носій" або "ексципієнт" призначений для позначення сполуки або комбінації сполук, включених до фармацевтичної композиції, які не викликають побічних реакцій та дозволяють, наприклад, полегшити введення діючої речовини (діючих речовин), збільшити тривалість її перебування та/або ефективність в організмі, збільшити її розчинність в розчині або поліпшити її збережність. Такі фармацевтично прийнятні носії та ексципієнти є добре відомими і можуть бути адаптовані фахівцем в даній області в залежності від природи вибраної діючої речовини (діючих речовин) та способу їх введення.
Краще, ці імунокон'югати вводять системно, зокрема, внутрішньовенним, внутрішньом'язовим, внутрішньошкірним, внутрішньоочеревинним або підшкірним шляхом або оральним шляхом. Ще краще, композицію, що містить імунокон'югати за винаходом, вводять декілька разів послідовно.
Способи введення, дозування та оптимальні лікарські форми можна встановити згідно з критеріями, які звичайно беруть до уваги при доборі лікування, придатного для конкретного пацієнта, наприклад, вік або маса тіла пацієнта, тяжкість його/її загального стану здоров'я, переносності лікування та спостережуваних побічних ефектів.
Інші ознаки та переваги винаходу будуть очевидні з продовження опису, Прикладів та графічних матеріалів, підписи до яких наведені нижче.
Стислий опис графічних матеріалів
Фіг. 1: дослідження цитотоксичності по відношенню до клітин ЗМ12С іп міїго із застосуванням кон'югованого вторинного антитіла Маб-г2ар.
Фіг. 2А, 28 та 2С: визначення специфічності зв'язування 1613Е12 з іммобілізованими білками гпАхі-Ес (2А), гАиріК-Ес (28) або гпМег-Ес (2С) за допомогою твердофазового ІФА.
Фіг. 3: ЕАС5-аналіз зв'язування 1613Е12 з людськими пухлинними клітинами. бо Фіг. 4: твердофазовий ІФА з використанням іммобілізованого білка гтАхі-Ес ("тт" позначає мишачий рекомбінантний).
Фіг. 5: визначення зв'язування 161312 з клітинзами СО57/ методом непрямої імунофлуоресценції з оцінкою результатів за допомогою протокової цитометрії.
Фіг. 6: дослідження зв'язування са56б методом конкурентного ІФА з використанням 1613Е12.
Фіг. 7: аналіз епітопів методом вестерн-блотингу із застосуванням лізату клітин 5М12С. МН (без нагрівання); МК (в невідновних умовах); Н (з нагріванням); К (у відновних умовах). Для підтвердження того, що в гель завантажено однакову кількість зразків, використовували
САРОН.
Фіг. 8А та 8В: дослідження зниження рівня експресії Ах!І після зв'язування 1613Е12 з клітинами ЗМ12С методом вестерн-блотингу. Фіг. 8А: репрезентативний вестерн-блот для З незалежних експериментів (дослідження методом вестерн-блотингу проводили через 4 год. та 24 год. інкубації 1613212 з клітинами 5М12С); Фіг. 8В: для вимірювання оптичної густини проявленої плівки використовували програмне забезпечення "ОцпапійуОпе".
Фіг. ЗА, 98 та 9С: імунофлуоресцентна мікроскопія клітин З5М12С після інкубації з 1613Е12.
Фіг. 9А: їзотиповий контроль тідб1 для оцінки неспецифічного поверхневого та внутрішньоклітинного забарвлювання. Фіг. 9В: забарвлення клітинної мембрани. Фіг. 9сС: внутрішньоклітинне забарвлювання рецептора Ах! з використанням 1613Е12, а також ранніх ендосом з використанням маркера ЕЕАТ1. Нижче представлені суміщені зображення, а ділянки колокалізації вказані стрілками.
Фіг. 10: вплив 1613212 на проліферацію клітин 5М12С іп міго у порівнянні з впливом антитіла тідс1, яке служило ізотиповим контролем.
Фіг. 11А-11К: дослідження прямого цитотоксичного ефекту імунокон'югата 1613Е12-сапорин з використанням різних ліній пухлинних клітин людини. А-5М12С, В-Са|ш-1, С-А172, 0-А431, Е- 0и145, -МОА-МВ4355, С-МОА-МВ231, Н-РСЗ, І-МСІ-Н2г26, У-МСІ-Н125, К-Рапсі.
Фіг. 12: дослідження зв'язування білка гпАхі-с з антитілами т1613Е12 та п721613Е12 методом твердофазового ІФА.
Фіг. 13: порівняння зв'язування мишачого, химерного та гуманізованого антитіл 1613Е12 з клітинами 5М12С.
Фіг. 14: дослідження прямого цитотоксичного ефекту в присутності імунокон'югата мишачого
Зо та гуманізованого 1613212 із сапорином та ізотипових контролей з використанням лінії пухлинних клітин нирки людини 5М12С.
Фіг. 15: дослідження прямого цитотоксичного ефекту в присутності імунокон'югата мишачого та гуманізованого 1613Е12 із сапорином та ізотипових контролей з використанням лінії клітин карциноми легені людини Саїш-1.
Опис прикладів здійснення винаходу
В наведених нижче Прикладах експресія антитіл 1613Е12 або т!'613Е12 позначає мишачу форму антитіла 1613Е12. Гуманізовані форми антитіла 1613Е12 позначені п21613Е12.
Аналогічно, антитіло, використовуване як ізотиповий контроль, є ЇД1 миши та позначається 904. Це означає, що в наведених нижче Прикладах вирази контроль тідс1 та 954 позначають одне й те саме.
Приклад 1. Інтерналізація рецептора Ахі
Оскільки використання імунокон'югата є більш ефективним у випадку, коли цільовий антиген є білком, який зазнає інтерналізації, вивчали інтерналізацію рецептора Ах! шляхом дослідження цитотоксичності по відношенню до ліній пухлинних клітин людини з використанням реагенту
Мабр-2ар. Більш конкретно, реагент Мар-2ар є хімічним кон'югатом, який має в своєму складі афінно очищене антитіло кози до Їд миши та інактивуючий рибосоми білок сапорин. При інтерналізації імунного комплексу сапорин відокремлюється від агента, який забезпечує адресну доставку, та інактивує рибосоми, що в результаті приводить до пригнічення синтезу білка і, в кінцевому підсумку, до клітинної загибелі. Визначення життєздатності клітин через 72 години інкубації клітин, позитивних по Ахі, з 161312 або з антитілом, яке є ізотиповим контролем (тідс1), дозволяє зробити висновок про те, що 1613Е12 індукує інтерналізацію рецептора АХІ.
В даному Прикладі використовували клітини, що характеризуються високим рівнем експресії
АХхіІ, згідно з результатами визначення з використанням реагенту ОПКИ (Оако). Результати представлені нижче в Таблиці 5.
Таблиця 5 виміряна з використанням пухлинних клітин нирки людини 5М12С рим сс ПОН УНН
В цьому Прикладі клітини 5М12С використовували як приклад, який не є вичерпним. Можна використовувати будь-які інші клітинні лінії, що експресують достатню кількість рецепторів Ахі на своїй поверхні.
Антитіла 161312 або ізотиповий контроль тідс1 в різних концентраціях преінкубували з вторинним антитілом Маб-2гар (Адмапсей Тагдейпд Зу(етв) в кількості 100 нг в середовищі для культивування клітин протягом 30 хв. при кімнатній температурі. Цю суміш додавали до субконфлюентних клітин 5М12С, висіяних в білі 9б-лункові планшети для мікротитрування.
Планшети інкубували протягом 72 год. при 37 "С в присутності 5 96 СО». Життєздатність клітин визначали за допомогою набору для дослідження клітинної проліферації Сеї! Тйег сіо згідно з інструкціями виробника (Рготеда). Використовували декілька контролей: ії) без вторинного імунокон'югата та ії) без первинного антитіла. Паралельно проводили дослідження з ізотиповим контролем тідсі.
Одержані результати представлені на Фіг. 1.
Максимальний цитотоксичний ефект 1613212 по відношенню до клітин 5М12С складав -36 90. В присутності антитіла 9054, яке використовувалося в експерименті як ізотиповий контроль, цитотоксичний ефект не спостерігався. В лунках, що містять тільки первинні антитіла, цитотоксичність не спостерігалася (результати не наведені). Таким чином, рецептор Ахі є придатним антигеном для створення імунокон'югатів, оскільки імунний комплекс, який містить
АхІ-1613Е12-Мар/7ар, чинить виражений цитотоксичний вплив на цільові клітини.
Приклад 2. Одержання антитіла, спрямованого проти позаклітинного домену гпАХхі
Для одержання мишачих моноклональних антитіл (МкАт), спрямованих проти позаклітинного домену (ЕСО) людського рецептора АХхіІ, 5 мишей ВАГ В/с імунізували 5-кратно п/ш клітинами СНО-АХІ в кількості 15-20х105 та двократно іп Ах! ЕСО в кількості 20 мкг. Першу імунізацію проводили в присутності повного ад'юванта Фрейнда (5Зідта, 51 І оці5, МО, О5А). Для подальших імунізацій використовували неповний ад'ювант Фрейнда (Зідпа).
За три дні до проведення злиття, імунізовані миши одержували бустерну ін'єкцію клітин
СНО-АХІ в кількості 20х106 та гпАхі ЕСО в кількості 20 мкг разом з неповним ад'ювантом
Фрейнда.
Для одержання гібридом виділяли спленоцити та лімфоцити шляхом перфузії селезінки та подрібнення проксимальних лімфовузлів, відповідно, відібраних у 1 з 5 імунізованих мишей (відібраної за результатами титрування сироватки) та зливали з клітинами мієломи ЗР2/0-Адії (АТСС, ВосКміПе, МО, ОА). Протокол злиття описаний Копйіег апа Міївіеїп (Майиге, 256:495-497, 1975). Потім проводили відбір гібридних клітин в селективному середовищі, що містить гіпоксантит, аміноптерин та тимідин. Як правило, для одержання моноклональних антитіл або їх функціональних Фрагментів, зокрема, мишачого походження, можна використовувати методики, описані, зокрема, в посібнику "Апіїрбодієв" (Нагіом апа І апе, Апіїбодієв5: А І арогагу Мапиаї, Соїй
Зргіпу Наог І арогаюгу, Соїа бргіпа Натбог МУ, рр. 726, 1988).
Приблизно через 10 днів після процедури злиття проводили скринінг колоній гібридних клітин. При первинному скринінгу в супернатанті гібридом визначали рівень секреції МкАт, спрямованих проти позаклітинного домену білка Ахі методом твердофазового ІФА. Паралельно проводили ЕАСсС5-аналіз для відбору МкАт, здатних зв'язувати клітинну форму Ахі, присутнього на поверхні клітин, з використанням клітин СНО дикого типу та клітин СНО, що експресують Ахі (АТС).
Відібрані гібридоми якомога раніше клонували шляхом предельного розведення і потім проводили скринінг їх здатності взаємодіяти з позаклітинним доменом білка Ахі. Потім визначали ізотип клонованих МкАт з використанням набору для ізотипування антитіл (саї й5300.05, боційегп Віоїесп, Віппіпдапат, АГ, ОБА). Для кожної гібридоми відбирали та культивували один клон.
Твердофазовий ІФА виконували, як описано нижче, з використанням нерозведеного супернатанта гібридом або, після визначення вмісту до в супернатанті, проводили титрування,
починаючи з концентрації 5 мкг/мл. Потім виконували послідовні розведення 75 в наступних 11 рядах. Стисло, 96-лункові планшети для ІФА (Совзіаг 3690, Соппіпуд, МУ, О5А) покривали білком
АХІ-Ес в кількості 50 мкл/лунку (Е апа О бузіетв, кат. Мо 154-АГІ) або гпАХі ЕСО в концентрації 2 мкг/мл в фосфатно-сольовому буфері (ФСБ) протягом ночі при 4 "С. Потім планшети блокували
ФСБ, що містить 0,5 906 желатину (422151, 5егма ЕІесігорпогезі5 отрнН, Неїдеїрегод, Сегтапу) протягом 2 год. при 37 "С. Після видалення блокувального буфера шляхом різкого струшування планшетів, в планшети для ІФА додавали 50 мкл нерозведеного супернатанта гібридом або 50 мкл розчину з концентрацією 5 мкг/мл та інкубували протягом 1 год. при 37 "С. Після трьох відмивань додавали по 50 мкл поліклонального антитіла кози до ЇД миши, кон'югованого з пероксидазою хрону (4115-035-164, дасквоп Іттипо-Везеагсі І арогайогієв, Іпс., М/езі Стгоме, РА,
ОА) в розведенні 1/5000 в ФСБ, що містить 0,1 95 желатину та 0,05 95 Туееп 20 (мас.:мас.) та інкубували протягом 1 год. при 37 "С. Потім планшети для ІФА відмивали З рази та додавали субстрат ТМВ ЖРБбб64782, Орійта, Іпіегопіт, Егапсе). Після 10-хвилинної інкубації при кімнатній температурі реакцію зупиняли додаванням 1 М сірчаної кислоти та визначали оптичну густину при 450 нм.
Для відбору методом протокової цитометрії 105 клітин (СНО дикого типу (м/)) або СНО-АХІ) висіювали в кожну лунку 96-лункового планшета в ФСБ, що містить 1 95 бичачого сироваткового альбуміну (БСА) та 0,01 95 азиду натрію (буфер БАС5) при 4 "С. Після центрифугування протягом 2 хв. при 2000 об/хв буфер видаляли і додавали досліджувані супернатанти гібридом або очищені МкАт (1 мкг/мл). Через 20 хв. інкубації при 4 "С клітини двічі відмивали та додавали кон'юговане з АІеха 488 антитіло кози до імуноглобулінів миши, розведене 1/500 в буфері ЕАС5 (ЖА1 1017, МоїІесшаг Ргобезх Іпс., Еидепе, О5А) та інкубували протягом 20 хв. при 4 "С. Після фінального відмивання буфером БАС5 клітини аналізували на протоковому цитометрі (Расзсаїїриг, Весіоп-бісКіпбоп) після додавання в кожну пробірку пропідію йодиду в кінцевій концентрації 40 мкг/мл. Лунки, що містять тільки клітини та клітини, що інкубувалися з вторинним антитілом, кон'юЮгованим з АІеха 488, служили негативним контролем. В кожному експерименті використовували ізотиповий контроль (Зідта, геї МО0351МО). Для розрахунку середніх значень інтенсивності флуоресценції (МЕїЇ, від англ. теап Пиогезсепсе іпепзйу) аналізували принаймні 5000 клітин.
Зо Більш конкретно, для злиття використовували 300х105 одержаних спленоцитів та 300х105 клітин мієломи (співвідношення 1:1). Двісті клітин з одержаної клітинної суспензії висіювали в концентрації 2х105 клітин/мл в 30 96-лункових планшетів.
Перший скринінг (приблизно на 14 день після злиття) шляхом твердофазового ІФА з використанням білка ПАхХІ ЕСО та за допомогою ГАС5-аналізу з використанням клітин СНО дикого типу та клітин СНО, експресуючих Ахі, дозволив відібрати 10 гібридом, у яких значення оптичної густини (00) при покритті гп АХІЕСО перевищували 1, а значення МРЕЇ становили менше 50 для клітин СНО дикого типу та вище 200 для клітин СНО-АХІ.
Ці 10 гібридом культивували та клонували методом предельного розведення. Кожний 96- лунковий планшет мав кодове позначення. Через 9 днів після висівання супернатанти з планшетів, у яких здійснювали клонування, піддавали скринінгу методом ІФА по відношенню до специфічності зв'язування з позаклітинним доменом білка "п АХІЕСО. Для кожного планшета з одним кодовим позначенням відбирали три клони та здійснювали їх культивування та ізотипування. Після одержання антитіл до Ахі вивчали їх здатність зазнавати інтерналізації при зв'язуванні з АХІі на клітинній поверхні.
Приклад 3. Специфічність зв'язування Ахі
В даному Прикладі спочатку вивчали зв'язування 1613Е12 з білком гпАхХі-Ес. Потім вивчали його зв'язування з двома іншими представниками сімейства ТАМ, гпрІК-Ес та гпМетг-Ес.
Стисло, рекомбінантні людські білки Ахі-Ес (К апа О Зузіетв, кат. Мо 154АЇ /СЕ), ПОІК (Є апа
О Зувіетв5, кат. Мо 859-ОК) або пМег-Ес (К апа ОО Зувіет5, кат. Мо 891-МЕ) наносили на 96- лункові планшети Іттиіоп ІІ та залишали при 4 "С протягом ночі. Після блокування протягом 1 год. 0,5 96 розчином желатину додавали очищене антитіло 1613Е12 в початковій концентрації 5 мкг/мл (3,33х103 М) та інкубували ще 1 год. при 37 "С. Потім виконували послідовні розведення
У в 12 рядах. Планшети відмивали та додавали антитіло кози, специфічне до імуноглобулінів миши, кон'юговане з пероксидазою хрону (Часкбоп) на 1 год. при 37 "С. Для проявлення забарвлення використовували розчин субстрату ТМВ. Паралельно також використовували ізотиповий контроль (тіде1) та доступне для придбання антитіло Мар 154, спрямоване проти
АхІ. Для підтвердження того, що планшети були покриті досліджуваним білком, використовували мічене НКР антитіло кози, спрямоване проти дб людини, специфічне до фрагмента Ес (дасКвоп, геї 109-035-098) та/або кон'юговане з НЕР антитіло, спрямоване проти бо гістидину (К апа О Бузіет5, геї: МАВО5БОН). Результати представлені на Фіг. 2А, 2В та 2С,
відповідно.
В даному Прикладі показано, що антитіло 1613Е12 зв'язується тільки з білком гпАхХі-Ес і не зв'язується з двома іншими представниками сімейства ТАМ, гпрІК або гпМег. Перехресна специфічність зв'язування антитіла 1613212 з представниками сімейства ТАМ не спостерігалася. За відсутності первинного антитіла (дилюент) неспецифічного зв'язування не спостерігалося. В присутності ізотипового контрольного антитіла зв'язування не спостерігалося.
Приклад 4: 1613Е12 розпізнає клітинну форму АхХі, експресовану пухлинними клітинами
Рівень експресії АхІ на поверхні пухлинних клітин людини спочатку визначали з використанням доступного для придбання антитіла проти Ахі (КЕ апа О бузіетв5, геї МАВ 154) одночасно з використанням калібрувальних бусин для кількісної оцінки рівня експресії Ахі. Потім вивчали зв'язування АХі, присутнього на клітинній поверхні, з використанням 1613Е12.
Для дослідження поверхневого зв'язування готували послідовні двократні розведення розчину первинного антитіла з концентрацією 10 мкг/мл (6,66х108 М) (1613Е12, антитіло
МАВТІ154 або ізотиповий контроль (тіде1) МкАт 9054) та додавали до клітин в кількості 2х105 на хв. при 4 "С. Після З відмивань фосфатно-сольовим буфером (ФСБ) з додаванням 1 95 БСА та 0,0195 МаМ», клітини інкубували з вторинним антитілом кози, спрямованим проти імуноглобулінів миши, кон'югованим з АЇеха 488 (в розведенні 1/500) протягом 20 хвилин при 4 Сб. Після З додаткових відмивань ФСБ з додаванням 195 БСА та 0,195 МаМ"», клітини аналізували на протоковому цитометрі (Расзсаїїриг, Весіоп-ОісКіп5оп). Для розрахунку середніх 20 значень інтенсивності флуоресценції аналізували принаймні 5000 клітин.
Для кількісного визначення антигенів клітинної поверхні в одиницях АВС (від англ. апіроду
Біпаіїпуд сарасійу, антитіло-зв'язувальна здатність) з використанням антитіла МАВ 154 застосовували калібрувальні бусини ОІРІКІТФ). Потім клітини інкубували одночасно з бусинами
ОПІРІКІТФ та поліклональним антитілом кози (Е(ар)г) до імуноглобулінів миши, кон'югованим з
ІТС, в насичувальній концентрації. Потім визначали кількість антигених сайтів на поверхні клітин в досліджуваному зразку при інтерполяції калібрувальної кривої (залежності інтенсивності флуоресценції окремих популяцій бусин від числа молекул МкАт на бусинах). 4.1. Кількісне визначення рівня експресії Ахі на клітинній поверхні
Рівень експресії Ахі на поверхні пухлинних клітин людини визначали непрямим
Зо імунофлуоресцентним методом за допомогою протокової цитометрії з використанням набору для кількісного визначення антигенів клітинної поверхні (ОІРІКІТФ, бако, Оепітагк). Побудова графіка залежності середньої інтенсивності флуоресценції (МЕЇ) від антитіло-зв'язувальної здатності калібрувальних бусин дозволяє визначити антитіло-зв'язувальну здатність клітинних ліній.
В Таблиці 6 представлений рівень експресії Ахі, виміряний на поверхні різних ліній клітин пухлин людини (ЗМ12С, Саїцш-1, А172, А431, 00145, МОА-МВ4355, МОА-МВ231, РОЗ, МОСІ-Н226,
МСІ-НІ125, МСЕ7, Рапеї) (АТСС, МС) з використанням набору ОІРІКІТФ та доступного для придбання антитіла МАВ154 (К апа О БЗувіет5). Значення виражені як антитіло-зв'язувальна здатність (АВС).
Таблиця 6 ен енероюеї в Где сти | его залоза залоза залоза залоза орган 11117111 АТИВ | АЯЗТ| 00-45 | РОЗ | Моі-негв карцинома залоза залоза орган
ОК
Результати, одержані з доступним для придбання моноклональним антитілом, спрямованим проти АХіІ (МАВ154), показали, що рецептор АХхі експресується на різних рівнях, в залежності від досліджуваних людських пухлинних клітин.
4.2. Детекція Ахі на людських пухлинних клітинах з використанням 1613Е12
Більш конкретно, зв'язування Ахі вивчали з використанням 1613Е12.
Будували криві залежності доза-ефект для 1613Е12. Значення МРЇ, одержані для різних людських пухлинних клітин, аналізували в програмі Ргізт. Результати представлені на Фіг. 3.
Результати показують, що 1613Е12 специфічно зв'язується з мембранним рецептором АХІ, що підтверджується профілем кривої насиченості. Однак, спостерігається різна інтенсивність мічення, що відображає різний рівень експресії поверхневого рецептора Ахі на людських пухлинних клітинах. При використанні лінії пухлинних клітин молочної залози людини МСЕ7 зв'язування з рецептором АХІ не спостерігалося.
Приклад 5: Міжвидова перехресна специфічність 161312
Міжвидову перехресну специфічність 1613212 вивчали з використанням двох біологічних видів: миши та мавпи. Спочатку досліджували зв'язування рекомбінантного мишачого (пт) рецептора АхіІ методом твердофазового ІФА (Фіг. 4). Потім виконували дослідження методом протокової цитометрії з використанням клітин мавпи СО57, оскільки ці клітини експресують на своїй поверхні рецептор АХІ (Фіг. 5). Клітинна лінія СО57 була одержана шляхом імморталізації клітин лінії СМ-1, одержаних з клітин нирок африканської зеленої мавпи, за допомогою вірусу 5М40 з версією геному, що забезпечує продукцію великого Т-антигену, але є дефектною по реплікації.
Імуноферментний аналіз гтАхі-Ес
Стисло, рекомбінантні мишачі білки Ахі-Ес (К апа О Зузіетв5, кат. Мо 854-АХ /СЕ) наносили на 96-лункові планшети Іттиоп І та залишали при 4 "С протягом ночі. Після блокування протягом 1 год. 0,5 95 розчином желатину додавали очищене антитіло 1613Е12 ще на 1 год. при 37 "С в початковій концентрації 5 мкг/мл (3,33х108 М). Потім виконували послідовні розведення
У в 12 рядах. Планшети відмивали та додавали антитіло кози, специфічне до імуноглобулінів миши, кон'юговане з пероксидазою хрону (Часкбзоп) на 1 год. при 37 "С. Для проявлення забарвлення використовували розчин субстрату ТМВ. Паралельно також використовували ізотиповий контроль (тідс1) та доступне для придбання антитіло Мар 154. Для підтвердження того, що планшети були покриті досліджуваним білком, використовували мічене НЕР антитіло кози, спрямоване проти (Дб людини, специфічне до фрагмента Ес (Часкзоп, геї 109-035-098)
Зо та/лабо кон'юговане з НЕКР антитіло, спрямоване проти гістидину (К апа О Зувзіетв, геї:
МАВОБОН).
Результати представлені на Фіг. 4. На даній Фіг. показано, що 1613Е12 не зв'язується з позаклітинним доменом Ахі миши. За відсутності первинного антитіла (дилюент) специфічного зв'язування не спостерігалося.
ЕАСЗ СО57
Для дослідження зв'язування з клітинами 1613212 використовували клітини СО57, 2х105 клітин інкубували з антитілом в діапазоні концентрацій, одержаних при послідовному розведенні 7 (12 точок) розчину антитіла 1613Е12 з концентрацією 10 мкг/мл (6,66х103 М) або ізотипового контролю (тідс1) протягом 20 хв. при 4 "С. Після З відмивань фосфатно-сольовим буфером (ФСБ) з додаванням 1 95 БСА та 0,01 95 Мам», клітини інкубували з вторинним антитілом кози, спрямованим проти імуноглобулінів миши, кон'югованим з АїЇеха 488 (в розведенні 1/500) протягом 20 хвилин при 4 "С. Після З додаткових відмивань ФСБ з додаванням 1 95 БСА та 0,1 95 МаМіз, клітини аналізували на протоковому цитометрі (Расзсаїїриг, Весіоп-ОісКіпзоп). Для розрахунку середніх значень інтенсивності флуоресценції аналізували принаймні 5000 клітин.
Дані аналізували в програмі Ргізт.
Результати представлені на Фіг. 5. Крива титрування, побудована для клітин СО57 з використанням 1613Е12, підтверджує, що антитіло 1613Е12 є здатним розпізнавати клітинну форму рецептора Ах! мавп, експресовану на поверхні клітин СО57. Плато досягається при концентраціях 161312 вище 0,625 мкг/мл (4,2х1079 М). В присутності ізотипового контролю (тіІдс1) зв'язування не спостерігалося.
Даний Приклад ілюструє той факт, що 161312 не має перехресної реактивності по відношенню до рецептора Ах! миши. Навпаки, він міцно зв'язується з рецептором Ах! мавпи, експресованим на поверхні клітин СО57.
Приклад 6. Аналіз конкурентного зв'язування Са5б, що проводився в присутності 1613Е12
Для додаткової характеристики 1613Е12 досліджували його конкуренцію з Са56б. В даному дослідженні вільний білок гпАхі-Ес та 161312 інкубували для утворення комплексу антиген- антитіло і потім комплекси наносили на поверхність аналітичних планшетів, покритих Са56.
Незв'язані комплекси антиген-антитіло потім відмивали перед додаванням міченого ферментом вторинного антитіла, спрямованого проти со-частини білка гпАхХі-с, що має людське 60 походження. Потім додавали субстрат та визначали концентрацію антигену за величиною сигналу, що розвивався в результаті реакції фермент-субстрат.
Стисло, реакційну суміш, що містить білок гпАхі-с в присутності або за відсутності досліджуваних моноклональних антитіл до Ахі, готували в окремих планшетах, заблокованих 0,5 95 розчином желатину в ФСБ 1х. Виконували послідовні розведення 1:2 мишачих антитіл до
АХІ (в 12 рядах, починаючи з 80 мкг/мл). Потім додавали білок гпАхі-Ес в концентрації 0,5 мкг/мл (К апа О 5узіетв, геї. 154АГ/СЕ) за винятком ряду, що служив негативним контролем, у якому находився тільки дилюент (0,1 96 желатин, 0,05 956 Тмееп 20 в ФСБ 1х). Після перемішування зразки для проведення конкурентного аналізу додавали в планшети, покриті Сазб, з використанням розчину гпСа5б в ФСБ (К апа О Зувхіет»5 кат. Мо 885-45-55 / СЕ) в концентрації б мкг/мл. Після інкубації та декількох відмивань зв'язаний білок гпАхі-с детектували з використанням кон'югованого з НЕР антитіла кози до ЇдО людини (даскзоп, геї. 109-035-098).
Після зв'язування в планшети додавали субстрат ТМВ. Реакцію зупиняли додаванням 1М розчину Н25О» та вимірювали одержану оптичну густину при 450 нм за допомогою планшетного спектрофотометра.
Даний експеримент показує (Фіг. 6), що 1613Е12 конкурує з іммобілізованим лігандом за зв'язування гпАхі-Ес. Конкуренція з Са56б за зв'язування спостерігається в присутності антитіла 161312 в концентраціях вище 2,5 мкг/мл (1,67х103 М). Зв'язування гпАХІі-Ес з іммобілізованим
Сазб в присутності 1613212 в концентраціях вище 10 мкг/мл (6,67х108 М) вже не спостерігалося. 1613Е12 блокує зв'язування Са56б з гппАхХі-Ес.
Приклад 7. Дослідження епітопів методом вестерн-блотингу
Для визначення, чи розпізнає 1613212 лінійний або конформаційний епітоп, проводили аналіз методом вестерн-блотингу з використанням лізатів клітин 5М12С. Зразки обробляли у відновних або невідновних умовах. Якщо виявляється смуга, що відповідає відновленій формі зразка, досліджуване антитіло розпізнає лінійний епітоп позаклітинного домену, в противному випадку воно спрямоване проти конформаційного домену Ахі ЕСО.
Клітини 5М12С висіювали в середовищі КРМІ з додаванням 10 95 інактивованої нагріванням ембріональної телячої сироватки (ЕВ5, від англ. Тегаі роміпе бегит) - 2 мМ І-глутаміну в концентрації 5х107 клітин/см? у флаконах Т162 см: на 72 год. при 37 "С в атмосфері з вмістом 5 95 СО». Потім клітини двічі відмивали фосфатним сольовим буфером (ФСБ) та лізували в 1,5
Зо мл льодяного лізуючого буфера |І50 мМ Тті5-НСЇІ (рН 7,5); 150 мМ Масі; 1 95 Мопіаєї Р40; 0,5 95 дезоксихолат та 1 таблетка повного коктейлю інгібіторів протеаз «ж 1 95 антифосфатазі|. Клітинні лізати перемішували протягом 90 хв. при 4 "С та центрифугували при 15000 об/хв протягом 10 хв. для видалення клітинного дебрису. Концентрацію білка визначали методом з біцинхоніновою кислотою. Завантажували різні зразки. Спочатку готували 10 мкг клітинного лізату (10 мкг в 20 мкл) у відновних умовах (їх буфер для внесення зразків (ВІОКАЮВ) «т їх відновний агент (ВІОКАЮВБ)) та після 2 хв. інкубації при 96 "С завантажували в ДСН-ПАГ. Потім в невідновних умовах (тільки в їх буфері для внесення зразків (ВІОКАВ)) готували два інших зразки клітинного лізату по 10 мкг. До завантаження в ДСН-ПАГ, один з цих двох останніх зразків нагрівали протягом 2 хв. при 96 "С; інший залишали на льоді. Після закінчення міграції білки переносили на нітроцелюлозну мембрану. Мембрани блокували протягом 1 год. при кімнатній температурі за допомогою ТВ5-Гмуеєп 20 0,1 95 (ТВ5Т) з 5 9о знежиреного молока та інкубували з 161312 в концентрації 10 мкг/мл протягом ночі при 4 "С. Антитіла розводили в
Трис-сольовому буфері з додаванням 0,1 95 Тмееп 20 (об6./о6.) (ТВ5Т) з 5 95 знежиреного сухого молока. Потім мембрани відмивали ТВ5Т та інкубували з вторинним антитілом, кон'югованим з пероксидазою (розведення 1/1000) протягом 1 год. при кімнатній температурі. Для виявлення імунореактивних білків використовували ЕСІ. (Ріегсе 2532209). Після візуалізації Ахі мембрани знов промивали однократно ТВ5Т та інкубували протягом 1 год. при кімнатній температурі з мишачим антитілом до САРОН (в розведенні 1/200000). Потім мембрани відмивали ТВ5Т та інкубували з вторинними антитілами, кон'югованими з пероксидазою, протягом 1 год. при кімнатній температурі. Мембрани відмивали і для виявлення САРОН використовували ЕСІ.
Результати представлені на Фіг. 7. 1613212 переважно розпізнає конформаційний епітоп, оскільки специфічна смуга в основному спостерігається в невідновних умовах. Однак, слабкий сигнал спостерігається при міграції лізату клітин 5М12С в денатуруючих умовах, що вказує на те, що 1613Е12 має здатність слабко зв'язуватися з лінійним епітопом.
Приклад 8. Вимірювання знижувальної регуляції Ахі, викликуваної 1613Е12, методом вестерн-блотингу
В наступному Прикладі для вивчення активності антитіл, спрямованих проти АХІі, по відношенню до експресії рецептора Ахі, вибрали лінію клітин карциноми нирки людини 5М12С бо (АТС). Клітини лінії 5М412С характеризуються підвищеною експресією рецептора Ахі. Зниження експресії Ах! вивчали методом вестерн-блотингу з використанням клітинних екстрактів, як показано на Фіг. 8А-88.
Клітини 5М12С інкубували в середовищі ЕРМІ з додаванням 10 95 інактивованої нагріванням
ЕВ5 та 2 мМ І-глутаміну в концентрації бх107 клітин/см" в б-лункових планшетах протягом 48 год. при 37 "С в атмосфері з вмістом 595 СО». Після двох відмивань фосфатно-сольовим буфером (ФСБ) клітини піддавали сироватковому голодуванню в середовищі, що містить або ліганд - рекомбінантний да5б миши в концентрації 800 нг/мл (К апа О Зувіетв, геї: 986-45/СЕ), або антитіло 9054 в концентрації 10 мкг/мл, що використовувалося як ізотиповий контроль (тідс1), або антитіло до АхІ за даним винаходом в концентрації 10 мкг/мл та інкубували додатково протягом 4 год. або 24 год. Потім середовище акуратно видаляли, а клітини двічі промивали холодним ФСБ. Клітини лізували в 200 мкл льодяного лізуючого буфера |50 мМ Ттгів-
НС (рН 7,5); 150 мМ Масі; 1 95 Мопіаєї Р4АО; 0,5 95 дезоксихолат та 1 таблетка повного коктейлю інгібіторів протеаз «ж 1 95 антифосфатазі|. Клітинні лізати перемішували протягом 90 хв. при 4 "С та центрифугували при 15000 об/хв протягом 10 хв. для видалення клітинного дебрису.
Концентрацію білка визначали методом з біцинхоніновою кислотою. Клітинні лізати (10 мкг в 20 мкл) розділяли методом ДСН-ПАГ та переносили на нітроцелюлозну мембрану. Мембрани блокували протягом 1 год. при кімнатній температурі за допомогою ТВ5-Тмееп 20 0,1 95 (ТВ5Т) з 595 знежиреного молока та інкубували з доступним для придбання антитілом МО2, спрямованим проти АХі, в концентрації 0,5 мкг/ммл (АрМома НООО00558-МО2) протягом ночі при 4 С. Антитіла розводили в Трис-сольовому буфері з додаванням 0,195 Тмееп 20 (об./об.) (ТВ5Т) з 5 95 знежиреного сухого молока. Потім мембрани відмивали ТВ5Т та інкубували з вторинним антитілом, кон'юЮгованим з перокидазою (розведення 1/1000) протягом 1 год. при кімнатній температурі. Для виявлення імунореактивних білків використовували ЕСІ (Ріегсе й32209). Після візуалізації Ах! мембрани знов промивали однократно ТВ5Т та інкубували протягом 1 год. при кімнатній температурі з мишачим антитілом до САРОН (в розведенні 1/200000). Потім мембрани відмивали ТВ5Тї та інкубували з вторинними антитілами, кон'югованими з пероксидазою, протягом 1 год. при кімнатній температурі. Мембрани відмивали і для виявлення САРОН використовували ЕсСІ. Інтенсивність сигналу визначали за допомогою денситометрії.
Результати, представлені на Фіг. 8А та 8В, є репрезентативними для З незалежних експериментів та показують, що 1613Е12 знижує рівень експресії АхІ в пухлинних клітинах людини, що характеризуються надекспресією АХхі. Через 4 год. 1613Е12 знижує рівень експресії
АХІі на 66 95, а через 24 год. інкубації з 1613Е12 - на 87 95.
Приклад 9. Дослідження впливу 1613212 на експресію АхіІ на поверхні клітин методом протокової цитометрії
Методика протокової цитометрії дозволяє детектувати поверхневі рецептори АХІ.
Застосування цієї методики дозволяє продемонструвати вплив антитіл на експресію Ахі на клітинній мембрані. В даному Прикладі використовували пухлинні клітини нирки людини 5М12С, що експресують високий рівень АХІі.
Пухлинні клітини лінії 5М12С культивували в середовищі КМРІ1640 з додаванням 1 95 1- глутаміну та 10 95 ЕС5 протягом З днів до початку експерименту. Потім клітини трипсинізували та висіювали в б-лункові планшети в середовищі КРМІ1640 з додаванням 1 95 І-глутаміну та 595 ЕВ5. Наступного дня додавали досліджувані антитіла в концентрації 10 мкг/мл. Декілька лунок залишали необробленими. Клітини інкубували при 37 "С, 5595 СО». Через 24 години клітини відмивали ФСБ, відділяли та інкубували з тими самими досліджуваними антитілами в буфері РАСЗ5 (ФСБ, 1 95 БСА, 0,01 95 азид натрію). Необроблені лунки також забарвлювали тим самим антитілом для порівняння інтенсивності сигналу, одержаного з тим самим МкАт у оброблених та необработаних клітин. Клітини інкубували протягом 20 хвилин при 4 "С та відмивали три рази буфером ЕАС5. Мічене АїЇеха 488 антитіло кози до (до миши інкубували протягом 20 хвилин і клітини відмивали три рази перед проведенням ЕАСо5-аналізу клітинної популяції, негативної по пропідію йодиду.
Визначали два показники: (і) різницю між флуоресцентим сигналом на поверхні необроблених (без антитіла (Ат)) клітин у порівнянні з обробленими антитілом клітинами через 24 год., та (і) процентний вміст залишку Ахі на клітинній поверхні. Процентний вміст залишку Ахі розраховували у такий спосіб: оо залишку Ахі (МЕЇ з Ат 24 год. / МЕЇ без дт 24 год.) х 100
В Таблиці 7 представлені результати одного експерименту, який є репрезентативним.
Результати відтворювалися в трьох незалежних експериментах.
Різниця в значеннях МЕ! при забарвленні МкАт необроблених клітин та забарвленні тим 60 самим антитілом в умовах обробки відображає зниження рівня експресії білка Ахі на поверхні
Зо клітин внаслідок зв'язування досліджуваного МкАт. В умовах без антитіла та в присутності ізотипового контрольного антитіла (тос4) були одержані схожі результати.
Таблиця 7
А (МЕ без Ат 24год.
Мічення Обробка МРЇ через 24 год. необроблених клітин -- Залишок дхі
МЕРІ з-дт гагод. (о)
З д
Результати показують, що середня інтенсивність флуоресцентного сигналу, зареєстрованого на поверхні клітин, оброблених 1613Е12 протягом 24 годин, знижена (-514) порівняно з МЕЇ, одержаною для необроблених клітин, мічених 161312. Через 24 год. інкубації з антитілом 1613Е12 на поверхні клітин 5М12С залишається 45,2 95 рецепторів АХхі клітинної поверхні.
Приклад 10. Вивчення інтерналізації 1613212 імуногістохімічним методом з флуоресцентною детекцією
Додаткові результати були одержані при вивченні інтерналізації методом непрямої імунофлуоресценції з використанням конфокальної мікроскопії.
Стисло, пухлинні клітини лінії з-М12С культивували в середовищі ЕМРІ1640 з додаванням 195 І-глутаміну та 1095 РС5 протягом З днів до початку експерименту. Потім клітини відокремлювали за допомогою трипсину та висіювали в б-лункові планшети з накривним склом, що містять КРМІ1640 з додаванням 1 95 І-глутаміну та 5956 ЕС5. Наступного дня додавали 1613212 в концентрації 10 мкг/мл. Крім того, використовували клітини, оброблені нерелевантним антитілом. Потім клітини інкубували протягом 1 год. та 2 год. при 37 "С, 5 95
СО». Для точки часу 0 год. клітини інкубували протягом 30 хвилин при 4 "С для визначення зв'язування антитіла з клітинною поверхністю. Клітини відмивали ФСБ та фіксували параформальдегідом протягом 15 хвилин. Для детекції антитіла, що залишилося на клітинній поверхні, клітини промивали та інкубували з антитілом кози, спрямованим проти ДС миши, кон'югованим з Аїеха 488, протягом 60 хвилин при 4 "С. Для реєстрації проникнення антитіла усередину клітин, клітини фіксували та пермеабілізували сапоніном. Для забарвлення антитіла на поверхні мембрани та усередині клітини використовували антитіло кози, спрямоване проти
ІДб миши, мічене АїЇеха 488 (Іпмігодеп). Ранні ендосоми ідентифікували за допомогою поліклонального кролячого антитіла, спрямованого проти ЕЕАЇТ та антитіла кози, спрямованого проти дО кроля, міченого АЇеха 555 (Іпмігодеп). Клітини відмивали три рази та забарвлювали
Зо ядра Огад5. Після забарвлення клітини заключали в гістологічне середовище РгоЇопу соїй (Іпмігодеп) та аналізували за допомогою конфокального мікроскопа 2еї55 І ЗМ 510.
Фотографії представлені на Фіг. 9А-960.
Зображення були одержані за допомогою конфокальної мікроскопії. В присутності ізотипового контролю тідс1 (954) не спостерігалося ані мембранного, ані внутрішньоклітинного забарвлення (Фіг. 9А). Вже через 1 год. інкубації клітин 5М12С з 1613Е12 спостерігалося поступове зниження інтенсивності забарвлення мембрани на АХі (Фіг. 98). Через 1 год. та 2 год. виразно спостерігалося накопичення антитіла 1613Е12 усередині клітин (Фіг. 9С). Відзначалася колокалізація антитіла усередині клітин з маркером ранніх ендосом ЕЕАт. Ці знімки підтверджують, що відбувається інтерналізація 1613Е12 клітинами 5М12С.
Приклад 11. Протипухлинна активність іп міго, опосередковувана антитілом, спрямованим проти АХІ
Дослідження проліферації 5М12С
Клітини 5М12С в кількості 10000 на лунку висіювали в середовищі, що не містить ЕС5, в 96- лункові планшети на ніч при 37 "С в атмосфері, що містить 5 956 СО». Наступного дня клітини попередньо інкубували з кожним антитілом в концентрації 10 мкг/мл протягом 1 год. при 37 "С.
Клітини обробляли в присутності або за відсутності птпбзабзб (К апа О бувіетв5, кат. М"986-
С5/СЕ), додаючи ліганд безпосередньо в лунку, а потім залишали рости протягом 72 год.
Проліферацію оцінювали за включенням ЗН тимідину.
Результати представлені на Фіг. 10. При додаванні 1613212 до клітин 5М12С ефект не спостерігався.
Приклад 12. Цитотоксичність імунокон'югата 1613Е12-сапорин по відношенню до різних ліній пухлинних клітин людини
Даний Приклад демонструє цитотоксичність 1613Е12, зв'язаного із сапорином. З цією метою досліджували прямий цитотоксичний ефект іп мійго з використанням великої панелі ліній пухлинних клітин людини (Фіг. 11А-11К). Ця панель пухлинних клітинних ліній характеризується різною експресією Ахі на клітинній поверхні.
Стисло, 5000 клітин висіювали в 96-лункові культуральні планшети в 100 мкл відповідного середовища для культивування, що містить 595 ЕВ5 (день 0). Через 24 години інкубації в атмосфері з вмістом 5 96 СО» при 37 "С, до клітин додавали різні концентрації імунокон'югата (1613Е12-сапорин або 9654-сапорин) або голого антитіла (1613Е12 або 964). Потім культуральні планшети інкубували при 37 "С в інкубаторі у вологій атмосфері, що містить 5 95 СО», протягом 72 годин.
На 4 день оцінювали життєздатність клітин люмінесцентним методом за допомогою набору
Се Піег-сіот (Рготеда Согр., Мадізоп, М/і5.), що дозволяє визначити число життєздатних клітин в культурі по кількості АТФ, як індикатору метаболічно активних клітин. Люмінесценцію реєстрували за допомогою люмінометра.
За величиною люмінесцентного сигналу розраховували цитотоксичність, виражену в процентах, за такою формулою: цитотоксичність (95) - 100 - МАГ дт-сап х 100) / ЕІ Ш без дт
На Фіг. 11А-11К представлені графіки, які зображують цитотоксичність, виражену в процентах, в залежності від концентрації імунокон'югатів, одержану в окремих дослідженнях цитотоксичності іп міго по відношенню до пухлинних клітин (А) ЗМ12С, (В) Саїш-1, (С) А 172, (0)
А4З31, (Е) 00145, (Е) МОА-МВ-4355, (С) МОА-МВ-231, (Н) РОЗ, (І) МСІ-Н226, (У) МСІ-НІ125 або (К)
Рапс1ї, оброблених різними концентраціями імунокон'югата 1613Е12-сапорин.
На Фіг. 11А-11К показано, що імунокон'югат 1613Е12-сапорин виявляє цитотоксичність по відношенню до цих різних ліній пухлинних клітин людини. Потужність цитотоксичного ефекту залежить від лінії пухлинних клітин людини.
Приклад 13. Гуманізація варіабельних доменів антитіла 1613212
Зо Застосування мишачих антитіл (МкАт) в терапевтичних цілях у людей, як правило, приводить до серйозних небажаних ефектів, у пацієнтів розвивається імунна відповідь на мишачі антитіла (НАМА-відповідь, від англ. питап апіі-тоизе апіїбоду), тим самим знижуючи ефективність лікування та роблячи неможливим тривале введення. Одним з підходів до подолання даної проблеми є гуманізація мишачих МкАт шляхом заміни мишачих послідовностей їх еквівалентами людського походження без зміни антигензв'язувальної активності. Цього можна досягти двома способами: (ї) шляхом конструювання химерних антитіл миша/людина, в яких мишачі варіабельні ділянки приєднані до людських константних ділянок (Вошіаппе еї а!., 1984), та (і) шляхом пересадження ділянок, що визначають комплементарність (СОК), з варіабельних ділянок миши на ретельно вибрані людські варіабельні ділянки і потім приєднання цих "реконструйованих людських" варіабельних ділянок до людських константних ділянок (Кіесптапп еї аї., 1988). 13.1. Створення гуманізованих версій антитіла 1613212 13.1.1. Гуманізація варіабельного домену легкого ланцюга МІ.
На попередньому етапі нуклеотидну послідовність 161312 Мі порівнювали з послідовностями мишачих генів зародкової лінії з бази даних ІМТ (пер:/АЛммлу. тої ого). Були ідентифіковані мишачі гени зародкової лінії ІЗКМ16-104701 та ІБК.ОБ5Б"01. Для ідентифікації найкращих людських кандидатних послідовностей для пересаджування СОК проводили пошук людських генів зародкової лінії, які мають найбільшу ідентичність з послідовністю 161312 МІ. миши. За допомогою опції для аналізу бази даних ІМОТ ідентифікували можливі акцепторні людські М-ділянки для мишачих СОВА 161312 МІ: ІаКМ 1-27701 та І6К.4702. Для гуманізації варіабельного домену легкого ланцюга усі залишки, що відрізняються між людською та мишачою послідовностями, були ранжовані за значущістю. Ці порядкові номери (1-4) використовували для створення 11 різних гуманізованих варіантів варіабельної ділянки легкого ланцюга, які мають до 14 зворотних мутацій.
ВІН ЛОВІ ТМ мл ПИ
НПотхшаг БУКУІТНЛІ ПІММТОВЕЕБМАНУ СВУ ЕМ Ця ХУ САШХСОИЕКМІИКиЬВІЇ БА
ЧІ Ж АТ Р БТІ Ж БЕ тя ре а х пе я З3Е З 35 пЕІБІДРРИ СЛ ПРО ТспеашМлАБУЄОВУ ТІ ТИВАТ ЖК... .. МКУ БАШУСОКІАКУТАВИТУ ТХ пЕВхеіЧКІ СУК ТУ ПАКЕТІ ТСВАРО Кт... ...ШКУ Беж ОКУпЕКЕХ п ввмУттКкІіб МІ МАТі ПТДІТСИРІММОЛВШУТИАУТЕ ВОСВАВ БІТ. сао ЩИХ БАЩТЦДЕКОВЕИВЬКХ ВО пЕТ1ЕАЗЕТР УКЛ. ПУЕТ ОНЕЕНКЬЗАБУ ОВУ ХХ ВІКАВ ЖІ. и ЗАТ ОАНХСОКЕЗЕИКИЬМІЇ ПХ пЕМЕЗИЯКіК СУТ .1Т1МаТ ГПУЗТТОШсАЖЕЛАУОНиТІТСВАВ ОКиІ......БКІ БАЖУСОКІОЕТИКІВІХ п ввувтікід мк. ВОМ ПУТІ ТОРІ ЛАЖУТАЯЗІТЕ ТИПА ОБЖ. аа ШУ БОМ ЕСЕУМИиВЬМУ КО пЕТБІЗКТВ рУБІ,хі ПУЕТ ОПЕК ВМ, я ЗК ЗАВІС ИНЕУ АВМ МИ пхІШІїЗВЕтІТпП гУТЛО Ма ПАРОВІ АНУ ТІВСВАВО КТ. 00. МАТОМ ХУКТІКІЬМІ У ваМеіакіфп (МКМ ТЕ5ОМ) ПУТ ТОВ ЛАШУС КУТІ МОМАНВО ВЕ. а ШИХ Корок УМИи БЕХ КЗ вЖ1яАЗЕУІ ГУБІ. ПАЛ ТОЗРЕЛЬЕМОУСОВУТХМСВАВ ЖОІ......ВКУ ІАЕУОЕКРОМТНЕВОІХ З
ВЕІБАЗЕМО ГУК УЧЕТ ЖШЕМВЛІМУОТЕККВИКА ЖІКЕ. 5. 2 АУ ХАТИ ХКТИЖМЕХ МЕ іжізвігУх ТТ ТУВ ВНУ, ЗвЕННиНи ПОТ ТІЛІ Ди ЕСЕ АНЯКЕ
Пехзаг УОКУЇ-ІТпІ та ТМОНОМЕВКЕНВУХ. ЗОТИКТВВ НО ОМВО УВЕЖЕ
Е ЕНЕ пківІіЗві гладі ак -ЇВ ТЕ УуВЯ ВО ПЕ БІНМХ. ОПШТБЕКТМВІІ ВИМОГ мУАКТ Й вЕхе1ЗкІс МК тУ са ТОД ХУВ КИМ, БТІ ТБ ОГЕПУАТХ паІБІІКТо УТІМ шою -- ОО ХІМ БО ЗКТРІМУВІ. ІТК ЕТ ТТ ОЗЛІСВКОУАТУХС пкіКудкМИ ГУ. часова ТіІКИШОМ В. БК МА Я ШОУМЕКУ РІК КИОЧАТТЕИ цвЕакеійні (МБЕ.І1Ма зт) якою ВДЕ М КР ВИ КІТМХУ. ІТИ ХІ МОГ дХ
БиххеБіпкКрРи ГУТІ. РРОМІ он -О ТТАМКУУБОДВУТИХВИІ. УББ ЕТ УЛАМКИ МАВЯИТИ пЕІЕДІЕТУ Бл. Хі яю -- ОРЕ, КРИ. З Ж ХКЕККТ НЕО ЕВ пЕіБІУЗрІТХ гУМЛОХМа ВТ я яю ІА БІЙКИ В. ПВ ВІНМХ. ОВИУБУКМРРНІІАККЕИУАТУЖИ
ВЕАФ1ІБІТ СМІХ. ТЕБОМ) ка ВЕОВСУР. НЕПВОВО, НТК ТЬВЖ НМ ККМАТУЖС
Битків УК. шок ТАН М Б. ЗК. ШИК ШЕТ КТ ТІВ АТУЖ вВЕТТАЗЕМИ г ЖМХ аа А КОМ ВО НІЖ ЕМІМХ о. ШІ ХМШЕМАКТІМВІАКЗКІМИ МАЕ токл-ТМсюк о жк - КУ
ІІЗКІгУЄ СТИ НЕУКИВ КОКО ВОВІВО іхллайо ХК ЛЯ ОЇ ШУ ОЗ КУБІК а Ж пкішіЗКіВ (ії УИБНЕУВУВ ВЗМОТЕМКІК вБжІБІЗКІсТ Смілі У, МАНКИ БВХУЕУЕТЕ вхійітаКр ТІМ содншЕуВИТ РОТ КУВБІК пхігІлЮТ у УБХ.О В, жуМупнЕжкаВ БУлелтЕХКіК пЕахОіЧКіт (МІ. 1У5т ШЕПІТ Є БУХ ваіУРТКІіт Мт. їм ХЛ ВУ БУКБУКГКУКІК пх1вАЗКТР ТУБЛ.гІі МЕЖ ус тКУКВІК пал ЛКіК СУТ сеиИМьЕМЕ ЕМУСТаУКХК ввузьРівій (мк. ОоМІ ХИБНЕ Т ЕЕБУТКУАТК
ПЕКТИ Ул. ШИ ЕЕЖІЦТ Же кУБІК впхі1тІсюЕЗИ г глі ящику БсаствьпіК 13.1.2 Гуманізація варіабельного домену важкого ланцюга УН
Для ідентифікації найкращих людських кандидатних послідовностей для пересаджування
СОК, проводили пошук мишачих та людських генів зародкової лінії, які мають найбільшу ідентичність з послідовністю 1613Е12 МН. Нуклеотидну послідовність 1613Е12 МН зіставляли з послідовностями генів зародкової ліні миши та людини за допомогою програми для вирівнювання послідовностей "ІМеТ//-ОШОЕ5БТ", яка є частиною бази даних ІМОСТ. Також здійснювали вирівнювання амінокислотних послідовностей для верифікації вирівнювання нуклеотидних послідовностей за допомогою програми "АїЇдп Х" пакету програм МесіогмТІі.
Вирівнювання з мишачими генами зародкової лінії показало, що мишачі зародкові М-ген
ІСШНМ14-3702 та .-ген ІЗНУО2"0О1 є найбільш гомологічними мишачими генами зародкової лінії. За допомогою бази даних ІМОТ мишачий зародковий ЮО-ген ІЗНО1-1701 ідентифікували як гомологічну послідовність. Для відбору придатних людських генів зародкової лінії для пересадження СОК ідентифікували людські гени зародкової лінії, які мають найбільшу гомологію з послідовністю мишачого 1613212 МН. Використовуючи базу даних та опції для аналізу ІМСТ, як людську акцепторну послідовність для мишачих СОК 1613Е12 МН вибрали людський ген зародкової лінії ІЗНМІ-2'02 та людський зародковий .-ген ІЗНОБ5"0О1. Для гуманізації варіабельного домену важкого ланцюга усі залишки, що розрізняються між людською та мишачою послідовностями, були ранжовані за значущістю. Ці порядкові номери (1- 4) використовували для створення 20 різних гуманізованих варіантів варіабельної ділянки важкого ланцюга, які мають до 18 зворотних мутацій.
ЕІ -КМУТ ПОНІ МУЕ ЕЕ Ам 7 1-5 3-3 р-ні Н 1БЕЗГЙ КОМІ. КУКИ АНУКІКИТЕВ ЯЕНКО КБУ ТНЕУКОЕРИОНТЕМИК ВОМ
Нстел ДОЖУк-еНУ щиті. МК лА БМ В СТЕ ВЕ ОЇ. ЖЛЖЕУ МЕЖУБЛАРБОМИХЕНМОВ ЇХ жкно пт т Її ве хв пхісквКУ ХЕ З де ке 1 5 4 ма пхівБІІЕлЛІ УНІ цен вІМ,, Укра КУ УААН сх шу.. ОЗ МУКУ МНшХМЛУ НБН пххБІЛЕЛО ТСЦЬБАУ, цеЖиМ ЛВ ВУККИАПУЖЧІМІКАТОМЕЧХ Оз МЕТ ІтІНшУПОДІ вич ПО ваті ЗМР МУ МНВК делі КОСАМИ ТЕЖ... ОБІГУ МмЕшЕБолЛі нау ЕМВ 10
ВЖЕ П УНН Усі ЕУКЖЕПАУКУВОКІ ПЕМР.. О.Б МНК МЯ о вхісаЗЕЕ ТЗНІБЕК, пУсвУМЕОВ УКОЛУ КИ мЕМі.. БОЖЕ МНЖУКОВ ЕС СЕММИЯ ВО пЕхшІоЕоя ЗМІ МІМОМ пед ИЕИА ПУКЕКСЛАМУКчІИКО СМЕМУ О.О. КУ МНИХ лолІ ОН кмМОм Бі пиххБІлЛУП ЯВИ. Пе БУККИЧАНПТКЧІМІМАН СЕНУ О.О. КУБКУ тНЕХДОА ІБ МІМ ОС ввібіЗкКІл о ЯеВхоАЗІВІ жЖвіо М. ВУСА БМ АЄ СЕМ... ШУВАР МоЯ Що фхівБІВКІЛ МНЕ УМОВ Ши НМ.УАВЕСАШЧИУКВИМЬШ ОЕМ... ТПУ НІОщВМУВ СОЮ вхішЕЗЕРУ ТИН. ІМК пустив УМОВА ші... БОЖЕ ЖНЯУКОА ЕСЕ МУЯ ВО пхівБЦШШЕЖІХ ЗНИЗУ ЗИМОБКІ пеки, ВУАН КУКИ ЕХ. МЮУ пня ОБО
ВЕЕФІШКЛІ БР. ЛОВ, медійних БУКИРадпоЖУссхАН ЛЕЖХ....БОКХ ЖННУВОЕСОХНЕММОИ ввібідкКхО зво косо ИиеВі Мі ИИцА ЖЕКи СЕМ, ВИТ тку Ким ХО вхід УНИ.х пУнІЗОпОоА ЕУККРОАЖУнМЙОСХМа ПЕМІ....ВІЕХ ТНУУВОАРЛОЛТКНМОМ ОО вхїжАЛЕТИ ЯУНВ МИ З яви Бек ЖЕ УК МЕМІ....ОЖЖ ВНУ ВОВ ГОЛИМИ МУ пкІБІЗЕЛя ТП. ТУ дили пУКЕРЯАПУКЖИСТКП СЕМІ....5ОТУ ІННУ ДОДЛІ ПВ ММОМ БИ пак КЛЯ то. ЗМ ел . УТА ЖАВ СЕК... ОС КОТЕ фо МКЕ КИМ 1 вжІВІКІ ЗУНУ НУ ШУВІДЮНЦ ХМ ЮКМУВКРЛАЧИВЕСТАВ ПЕМІ. О.О БЖ ТНУЧКУАІНВЕБЕММИВОО вВЕЇПЕЗЕТЕ ТХНО Я ЧУ ФИНІМ, УКВ УКЬИТЬХ МЕМі.е БОЖХ КНУ ВОВОщЕМИ ІНВ МО пісок ТО ЖЕННІ СЕУ КелАНУКТІОТАОЗ ШЕМНТ... МОУ ІНКОЛИ МІСвВ МИ
ЖИТ АМТ КІ - ІМ ие вал!
НЕ ЕНН вах ММК ХК вОо, МАГМИ З шиВе
Кожсяро лажчх- Оу ВМ..ПІМИВ МТАСКЕФпНУГТМУВИТВІКХгАУМс КВІТАХ
Кк БР А е МЕ ту БТ
Блетлл у - по Я їх Мх п Я 3 4 пжхвІійЕпІ ВІ КА. МВТ ТАКО СИМ ЕТАЕМЕІМА МІК впЕ ІБК ЯМНІМОУ І ЕВ.-МИНТ шо ІМТ ТМОЯ ТАМИ ТАМ ХУ
ВЕ ФІБАЗКІЛ ТНМК ИХ вм. МИНЛО КАШКРО УВУ ТМТВ ТЕН ТАУМЕО КВИТКА У
ВЕТЕЦВЕКЕ ЗМНУІШЯЦ ША. МЕН МУК ТАМИ МІ ВІТА ВИМИ ВІ ШТАМИ вЕАШІЗКІЇ УНІЙЯБИ) ВА. МІН МУАОКЕО-СЕХТМ КЕТІ ВТАУМИ ВВ а УУ ТУ пахви кКип с ТеМІІЗаКІЖОМІ БА. МК ЕЖТАЦЕКО СРМІВУМОХІВМІВІМКІ ММ пиЗБІдКло ЯсВо.лі ВА. МТУАФККО. ЛИСТИ ТММ УМ КВУ
БшБІБІЗКІП ІУВо НІ гж, МІН Т шоку ЕМ ІМТВТИВМІАКЖВИВВОНПИПТАУХХ У
ЗВЖІ1ЕПЛВКІТлЛ ЯМНИ о тухі А.О ВШИТИ мУВЖЕЦ ам МІУТаВИ АК ВКММ КИТА ТІ пхАЕІЯЕПЯ Нр. ЛКК ВА. М УУ КАЖЕ. МІСТУ МКММ ЗСУ пххвІілЕ ІП ЛО БиМасК пд. Мур БУАСКМО СИТІ оТВВМІ ЕММА Ниви пЕІБІЗКІЛ ЯНОМ, В.М ШТАМУ МТВ ТеВМ ТАТИ ВОМ ТАМХІИ
БЕБІБІЛКІЛ фени, кКейКиВохИ їд, ВИНТ ЩУЛИЕРО СЕУ ХМІВИ ТИВИ АВС ТАНТКО пхіпуВЕІ ЯН. А. МИТ щУЛОКЕЦ ММ ТАВМ ТАМИ ТАКУ пххшІйКіш ОП. ХМ За кА..М УТ ВАСКО ІН вВоХОВеТАХВЕБМ Зп наїбІЗКІЯ ех. Кв..КОНТ ХАЕС МІМТВОТОВМ ТУ СВОИ СТ
БжіБІВКІЛ ЗУНрО МВ Вв..МОНТ ЖУК ШЕМІМІВИТОВМ ТАКСІ УВА ОЇ хі МН. ЗУ УКаХ ВА..МІНТ КУМИР ЛЕМ ТУТ МУ АБИ КУМ УК впхішціжЖтх Зно, пАОоМІНуУ щУАПКЕФ МІГ МІВОТАВМІАУШЕЬАБН ОСА У Є пЕМОІПКЦЯя ЯТЬ пл. ЖБК. Гу ствОоТОВМУ ВХІДНИМ миле У спа - Ми тна-їМоУтТ 11 КУЄ ХВОЛУХУІМЦКХКИ МОТИВ
Недшовю ШХНОВУВІ яестОТУ ша ті
БЕТА тя За
ЕІ ТВ ЕКО МиМЕ ЖЕ МІУ ТИВ вЕехЕІЛКІхХ іфУміМіИ І) АкБАКУМиЗНКСПЮ ВщОЖТЬУЖХиИ
ВЕІБЛШЖЛ Я УНІ АЮЖЕКІ ВИМ ЖЕИМИИ ЖЕ ха КУВХ пабі дкхх їУНІії1855) ЗЕСАЖлЛУ КІВІ ВИЙДУ УЮУИ пВхТАДИЖІЇ ЯУНІВНЕК АВИХУХУЦОНОСЕУКІЄ КОМ ТУЗЕ ваї1биак.х ТУНІКА МІ КОДЕК ТБІяЯ ие КУНЕ
ВхУВІПЖиИ ГУМИ. АКИПлУХТУЦУМОСЕЖКІУЄ БІНУТІАЄБУХХ вЕіБІ3УІ:ї УЗН АКЛАЖУУПЕО2КУрТВ корту тУна
ВЕМФІПЖВИ Яни. МОУ АКПАЖХТІММИЕ КІ МІТКУ И вхівї3уІт УВО КОЮ) АКсКЕЖУ ЦИМ ЕЖКІЮ ХОоСТУТвАа
БахеОлжУх ЗенІ. Ж БаМмаКК АВПАЖЛТ ММК ВОВУТІЛЄКМЛК вхішхлКтІї ув, МаоБі ДІЗЗАЖЕЕНЕМІБЕУКІМ Вау КУНА
ВЕ МеІпЕМИ ЯУНро ОВК клоЮі АБПАЛУЛТІМУМВТОЕЖЕТУЮЄ ЗУМІВ ХЕ вкіжІЗУІт 42,8 АМЛАЖЕУ МІ ЕЖВОЕ КОбоТІУ ТВА пЕУШІЛЖВИ ЯУНОО М МА АБПАЖЛУЦЮМИХОЕКЕІУЮ ВНУТ КУХИ ввійдауй (ВЕ. ЕСЕ ЕЖЕЦНАСЬЕККЕЮ Моро ТВА
БакМЕІйЖУй МН йМ Зх АБПАЖХУ МЕЖИКОКТІМ ВІВ ТІЖТчАлИ піалу (УНІ ЛОЮ ЄУВі, аБСАТЕУСаВОСЕУвЦУ МОСТІ ТУВа пахФІшЕХХ УНП, АКСАЖІУСЕІНЗКЕП вет пеіБІіЕЖІя (ЧНІ, АВИЛТтЖпОБИСЕУВИХ КОООТІТиВЕ 13.2. Валідація п721613Е12 у порівнянні з т1613Е12
Для порівняння гуманізованого 1613212 з мишачою формою 1613Е12 досліджували зв'язування методом ІФА з використанням білка гпАхХі-Ес, а також за допомогою РАСзЗ-аналізу з використанням клітин ЗМ12С. Додатково досліджували прямий цитотоксичний ефект іп міїго з використанням пухлинних клітин нирки людини 5М12С та лінії клітин карциноми легені людини
Саїш-1.
Спочатку здійснювали імуноферментний аналіз. Для експерименту в 96-лункові планшети (Іттшоп І, Тпегто Різпег) вносили розчин 1613212 в їх ФСБ з концентрацією 5 мкг/мл та інкубували протягом ночі при 4 "С. Після етапу блокування в покриті планшети вносили білок гп
АХІ-Ес (В апа О 5увієтв, геї: 154-АЇ) в діапазоні концентрацій від 5 мкг/мл до 0,02 мкг/мл) та інкубували протягом 1 год. при 37 "С. Для детекції додавали біотиніловане антитіло, спрямоване проти Ахі (приготовлене в лабораторії), в концентрації 0,85 мкг/мл на 1 год. при 37 "б. Це антитіло до Ахі розпізнає інші антигенні детермінанти. Потім в лунки додавали розчин пероксидази хрону, кон'югованої з авідином, в розведенні 1/2000 в буфері для розведення.
Потім додавали розчин субстрату ТМВ на 5 хв. Після додавання розчину для зупинення пероксидази, вимірювали оптичну густину при 405 нм за допомогою планшетного спектрофотометра.
На Фіг. 12 показано, що як мишаче, так і гуманізоване антитіла 1613212 однаково зв'язуються з білком гпАхХі-Ес.
Для ЕАСсСзЗ-аналізу клітини 5М12С культивували в середовищі КРМІ 1640 з додаванням 2 мМ
Ї-глутаміну та 10 95 сироватки. Клітини трипсинізували та доводили концентрацію клітин до 1х105 клітин/мл в буфері ЕАС5. Клітинну суспензію в об'ємі 100 мкл інкубували зі зростаючими концентраціями ізотипового контролю або антитіл, спрямованих проти АхХі, протягом 20 хв. при 4 "б. Потім клітини відмивали три рази буфером ЕГАСЗ та інкубували протягом 20 хв. або з вторинним антитілом, що розпізнає (До миши, міченим АїІеха488, або з вторинним антитілом, що розпізнає (0 людини, міченим АїПІеха488, при 4 "С в темряві. Клітини відмивали три рази буфером ЕАСЗ та ресуспендували в 100 мкл буферу ЕАС5 перед додаванням пропідію йодиду.
Зо Клітини інкубували зі зростаючими концентраціями ізотипового контролю або антитіл до АХІ. т?1613Е12 відповідає мишачому 1613Е12, с1613Е12 відповідає химерному 1613Е12, а п2І613Е12 відповідає гуманізованому антитілу. Значення ЕСвзо визначали з використанням програми Ргізт.
Як показано на Фіг. 13, зв'язування гуманізованої форми 1613Е12 з клітинами 5М12С характеризувалося значеннями ЕСзхо, еквівалентними для химерної та мишачої форм 161312.
Ці результати вказували, що п21613Е12 за здатністю розпізнавати та зв'язувати антиген АХі є порівнянним з мишачим 161312.
Експерименти з оцінки прямого цитотоксичного ефекту іп мйго були описані раніше в
Прикладі 12. В даному Прикладі готували чотири імунокон'югати із сапорином: то(с4-сапорин, спосСі4-сапорин, 1613Е12-сапорин та п21613Е12-сапорин, та досліджували на двох клітинних моделях (пухлинні клітини нирки людини 5М12С та клітини карциноми легені людини Са|ш-1).
На Фіг. 14 показано, що ізотипові контролі для антитіл тобс4-сапорин та сп9с4-сапорин були неактивними, а гуманізоване антитіло 1613Е12-сапорин, спрямоване проти АХі, викликало схожий цитотоксичний ефект по відношенню до клітин 5М12С, що й імунокон'югат мишачого антитіла 1613Е12 із сапорином.
На Фіг. 15 показано, що імунокон'югат гуманізованого антитіла 1613212 з сапорином викликає схожий цитотоксичний ефект по відношенню до клітин СаЇшШ-1ї, що й імунокон'югат мишачого антитіла 1613Е12 із сапорином. Навпаки, ізотипові контролі тоб4-сапорин та сп9с4- сапорин виявляли слабку активність (10 95 макс. цитотоксичного ефекту) при концентраціях антитіла вище 107 М.
Приклад 14. Кінетика зв'язування 1613Е12 з позаклітинним доменом людського Ахі
Потім визначали афінність 1613212 за допомогою інструмента Віасоге. Для визначення кінетики зв'язування 1613Е12 з позаклітинним доменом людського Ахі використовували Віасоге
Х.
Інструмент, принцип работи якого оснований на оптичному феномені поверхневого плазмонного резонанса (ЗРК), який випускається компанією Віасоге БЗувзіет5, дозволяє детектувати та оцінювати взаємодії білок-білок в реальному часі, без використання міток.
Стисло, для проведення експериментів як біосенсор використовували чип СМ5. В протокових комірках 1 та 2 чипа СМ5 іммобілізували Їдс кроля (ЕС 1 та ЕС2) до рівня 9300- 10000 одиниць КИ (від англ. гезропбхе ипії5, одиниць відповіді), приєднуючи антитіла через аміногрупи.
Зв'язування оцінювали в декількох циклах. В кожному циклі вимірювання проводили при швидкості потоку 30 мкл/хв в буфері НВ5-ЕР. Потім на поверхні чипа іммобілізували досліджуване антитіло, спрямоване проти АХІі, протягом 1 хв. тільки в протоковій комірці ЕС2 до досягнення середнього рівня іммобілізації 1613Е12, що становить 311,8 КО (50-5,1 КУ). Ін'єкції аналіта (антиген АХхІ ЕСО) починали з концентрації 200 нМ та виконували двократні послідовні розведення для визначення приблизних значень Ка та Ка в реальному часі.
Наприкінці кожного циклу поверхні регенерували, пропускаючи 10 мМ розчин гідрохлориду гліцину з рН 1,5 для видалення комплексів антитіло-антиген, а також захоплювального антитіла.
Спостережуваний сигнал відповідає різниці між сигналами, одержаними в комірках ЕС1 та ЕС2 (ЕС2-ЕСТ1). Константи швидкості асоціації (Ка) та дисоціації (Ка) розраховували з використанням моделі зв'язування один-до-одного Ленгмюра. Рівноважну константу дисоціації (КО) визначали як співвідношення Ка/ка. Експериментальні значення аналізували в програмі Віаема|Ічацоп версії 3.0. Відповідність моделі експериментальним даним оцінювали за допомогою критерію хХ2.
Результати представлені нижче в Таблиці 8.
Коо)
Таблиця 8
Для одержання позаклітинного домену (ЕСО) людського АхІ спочатку клонували КДНК людини, що кодує розчинний людський рецептор АХІ,, в експресуючий вектор РСЕР4 методом
ПЛР. Очищений продукт потім піддавали розщепленню рестрикційними ферментами НіпанІ та
Ватні та лігували в експресуючий вектор рСЕРА4, який розрізали тими самими ферментами.
Зрештою, одержання рекомбінантної плазміди РСЕРІАХЦНіб підтверджували за допомогою секвенування ДНК.
Потім клітини НЕК29ЗЕ, адаптовані для росту в суспензії, культивували в середовищі Ех-сеїЇ 293 (ЗАЕС Віозсіепсе5) з додаванням 4 мМ глутаміну. Усі трансфекції здійснювали з використанням лінійного поліетиленіміну (ПЕЇ) 25 кДа. Трансфековані клітини підтримували при 37 "С в шейкер-інкубаторі з вмістом 5 95 СО»г в атмосфері при перемішуванні зі швидкістю 120 об/хв протягом 6 днів. Клітини збирали шляхом центрифугування і супернатант, який містить рекомбінантний білок з гістидиновою міткою, підготовлювали для очистки на колонці з агарозою, модифікованою нікель-нітрилотриацетатом (Мі-МТА-агарозою).
УЮ Жук уєт Пр димі
ПЕРЕКОСУ ЛОВНОСТКМ руту тре и нею ЗА ТК ди Тумиет ки ІКощш шле МЕЛяк ММК
КЕЙ помел піші, Туш А ШОУ Ми уцвльиям мк У ууиМм пх ківих дитин дУУделЬьнММ БАНОК ЖА ОКО удо СУБаАМННя ЯК ПРОДУ ДЯ окт птизнід хутір мтс Амит мим
ВНЕСОК ЛОНІТАВКИ ПРИ ЛІКУВАННІ БАКУ
«ча трах ик д «Іа дві БЕ ТУЯ єди Й дежи ТУТ гу Я Ту 8 ДА с агра їх аж ЗТ З
А КОДІВ МК
КК ше то вин ШИНИ «тат их шк зихю оз прю дочку «ШИ Вол ЗпвЯВ.ю о па
КУ» жваві 1-0 «іх За
Ст Зх ев іхем жк і чу йо кА КК гадгмбвКтпай МеиБіислв с, сту и я жи І сії» 5 плюс Кю У во ЕЖУ
КИ лу У УМ
Бе ОІа крхМУчх
САНЯ
Хіт «сі ту Урич Мовна ТЕКА порегетхевї їб у СОМ ЛЕМ б стюукисхахсзиті є Ж ЕМИХ «Ей лЛепмие ствамцює Смкема «жита на МеХарьк іме рья ЖІ «й У хз я жі Занм М Тих ую Ж ххх у у зму о сошжЖ АФ о мтжХ мух ТЖХ ч Я ту гу - ками ок «БАК З
Ох, Аж ев ве ЕХ пр тку шлесмид ках шу «ЕІрх мети статти гпруузаітимує РМІМІ..0РО смасят п ТУ СИ гом гувчії о ТУ Х «Ки дпекким пПамцЕК Си си БЖ ИЙ АЗИ ВУ МІЛОНЧЬММ УКХ
КН ту
КН УУ х ле ух І
АХ ому сошЕ з
І
4 кежчичи -ї
Ж их що, стул, х ки Х ялвх вд
А ик ях 0 пипсухт м високе ПЦЕВучк а сетрухт «КАХ
ЛУ, Трухлхкляи ву ут уктмм о ФУТХКУЦЯВ ОТ осклзазжауйй уж ОО АЛ Тх глхлуклкумтк ут ху СТИХ
Ходи зи кЕнИиИ леБЦцюЕй Сиве ап хшенл ох сок Ак КУМ АМКУ я дух ту «АК» З «4 з шт 124 2-4 не х мк зимі та али М Я о ста бух Му Там КУ
ТХАХР їж ТИЖ Р АЮ жо МК ера аена
Хх З ие АХ ка МИХ що стужтух х ші й ек КУ саке їмер везе ЕХ лише ж я
Сен х ПИЛИ ще жо Ки Нр ула т
ШИЯН
ЖИМ поту Од нж по чад Я бич З Ку Що севкч ер ра мсек ій філУ тіж МЖК дееаматії мдо ВМО пеевдиикі СКМЕНИАУ кисляку ІМК ЗБЕ іде УА ЗБ ЖХНІВ АТАК КК СМУМЕ вав ЕОАБНУКІ едіцх в. ех 7 а О Я ре КО оче Уч ач І Чч пі вне АЕМ обі Дж лено ЖБК ОтУХ м в
А во «мух у ж Х я нету - сх З «ЕМ З клю тм «тт
А т При: ме, ЕЕ ес УМ КМ «кА щштУЧчЧНИА «22» сОза» Важенйй пами ПИв-еМХ діритіна ЗАЗ ЕЛ ОО св рмеазаі в ЛМШтТ
ЖАХУ зажим панцює Сосна вита ла ші сх У НМ АБУ,
КО я рех ках ве
Зак Ак у Же Вл Щаіт їх 3 що ую
МІ ЯМУ БЖс Мащ ямМмЬ ХК ІВ ХК
Б Ж ог й
МОУ Ну
Ск леень я Ко вина Кк: чеки ук
Же АХ КАТЯ хе шКучна чи
Ер
ХА М туту туя я . СЯ захочу ж еку 114 : : о и ех : дис
УТ прода и др т Т.О сумі З щаЕ Об УдУлуду Ул МКУ зику паежЕиМм плеамцюк сис зитихапа займ аМмУМиМаМмая МЮУ Х
Кана г гмих
Ру я
ЩЗ що жу Мрію Мі и хм тиху лу аю ср КЛ У Тахо аква не й
Мі ов Бу Ма ую гую Ух сему птХ сек їі У мі КТ Т МО БІ МБО 4 п Зк зи
У - й я
ХУ я «
С гру ї
Вази ї му у, зоря таку м
ОК БАЗА ЕН
Мекки НС тю пуп оті дО штучна
СН: лено Фіз У Км АХ еще тре ер тт Мах ай пварузиовивикки мХовем УшиКОижс даю Ми «НК З
Уа п ях, з суч тк дя Ку, Му су Хоч хі У ор дих с ях ох тльх он х дек Зо БЕ 13 ти о щіхя Щбаж фбч ца се Теплі ід т Шожху Ух З ши омща міц Тіе Жак АТ БЕК КЕ Бо жк АК ток тп пек Бжо У
У С ЕНН Зк
Х - У їх ов нене нан з и Не НН о НН На НН АН НН НН я НН А НЯ ж нн ЧО Я т Мк тт ах і ІЗ рої х й су ще и ух Где Же тлх х сш вх дае тп бує дпа ЖІ ОЖЕ г МО А КЕШ Ей мух мА ІВ МЖК МЖК КУ и ук су г Ух І
А Ма о
Удод Мо лику буки Б му ХВ ух тяжко Шюрия МУ шко Тічими с ую буоуля Жохую бо я Ж дю У мем Ам КЕ УК бат УМ су же ЗУ мулом х МАТИ МУуюш омам де ХА я кт я о Б п як р, Я
Ууха тож С ча Гамео Фі с лох Под пі ками ТОД хи Уа Ух, реа -- Ро Кн СХ жосжк С ку же Сх їх бу 11 зе ту мох жу Зі та МЕХ Хот Ж и тя
Ж НК юю ХНМУ КУБ НЯ АЛ КК ХУ у тУвиі вже ак Фо вик су кг «5 ту кг ноя ТУ
І ВЕ: З. док ЛУК Жив рт ся КД мо ую Муха тоюви фр СКЛ будує думі мо Тож ит а
Ех З обшакотіцм ем вет ВЕ Св їдм; Ту Біо щеу бошк Лама сліз; Шут о си НМ ЗВ ННЯ дае ОКщОЗе Кп дя дБ лож зе ми лам; сла МК ик Ук; ек, сут т НЕ ней Ба
У р ен не НН На бхугю т шт ло ІДД у ЗИ ун Ми и Мушу
Ті ху хря - ДИМ ІМ1ку Звійі тах Те Фі м ЩО я м М сх уво Де пл хе Вр ЕТ де ББЖ ух ета Су Ап ОсАТ М пхв'зацш лук Ес и сут» тк -к
Мох м вач
Ох ша М чн Ши 1 хе ЗА у 2 я ме 21115 Ук ТІ 1: їх їжи тус ц
Ж ІК Оу що ЖМиХ ЗАМ ВЖИ Сб БеМ ОБУ і ВН зп юю КА еиутя їх «ФМ» хх стулья ШО сх ж
МАСА ЧУ їх долю лу. туйти сх їди
Зоеду т ГУ ККЯ ок ту с - «ох їх пихи гх
НА пре а
ОС ха клю ю Ту і ти чІхакмї то ки Уч телів М ота Я дтУ Зими Уха пожевчюеу помити що Мі
М ХМ агави дзен паж пак м
СК г
АЕН. х кам у я Х
Ух ж БК шо Ж хі ру: 711 х;мо йти що Усе її стано Жрулх спрхю КТ. ; х а Зі У ло бік Ти р 81 Тк б тихих Феучєю Яр зх -ай жа вів сш і АТ МЖК ОА МУ Мая АВ маю Уж КО мух вже ща я їх ха чик : х х. хх х ро. КУ ДУ
Фо дату Жди Тим Ціжхує сзхми реє Ж що шуму іх: луку Ву фею емо йкх УК я
Же ше Буг їй ек УЮ ДВ МО СЯ а ЩО ОЖХВ ЯАйЯ о АХНІ А й А ТЕ луг -ц А ві КН О як ту пров сини ЗМУ тах Хр фр Мун т Уч ти оду й я ам СК
Ччюв г тшх й бу ді ук сі Я: мист щі кл зх лим тА Ук, ті шо КАВОЮ М УЖ МВА СБУ с їп ока кКОо бай МОХ я щем ОошММ хКБОЕ --х до кг ху ДТ ях ц
МАН ко Бу ех АННА ос Фати ЛЯ Туш АЛ у БЖ ОМ Хом Нім Й Її жим. х ниж у
ТЗ «юку Там Мих бує З що дух Зк шо сук о Ти Пі ТО буку оху Зк
Ті КО фам сьо Кт я Ах ЗУ ця мак о Му УУжЖ ші БО АБ КІНО с щік ше
М ЛЗ ще ех г УЗ юю оку ВО я а ке окон нн нев ни и НН и НН НН пів обі ДЕЧ Аба таж Мех жк ах дво» тТАх Бек ек КХепоТах мера Тух ех т ре ще па Та ТЕ що жо Ся Фе фює бітум ХХ зує ах ТА з М ух Узі Мі шо ху Чіа о УУчакух Кк ші ТР Лахр й КУ у НИК ух у М НАЧНИЯ «у п ку» хі: зом Те Кік у «х ім Ка а НН Бех ЩА Кп ож А НЕ ХХ па А мВ і; Ж Ух УК ую їх ту тео це Зк при гне пе З хі ой пі М бум Пат спПакюо Мч, бок Шеамк Б Таз Б-Р: сбоаяу фі» Мак
АЗОТ ші Б ЗА ОО КУК У УХ ЖЕО кАУ СК ЗХ бла да КІ ХУуК куш ле ї2 тож з кох
НЯ Бех НН
МН ЗАКО А АЙ пе тихую Я тую пздя Му Ж дхтя фу ж ях ще
Чу беж фл би 2 ха ку Тр кух ти ХУ х Зк ше Мих
МЖК ЖшЕ (щу зЗАЩЦ о шАШ КЛ СКЛО МЕ ле М ж НК НИК
Ру лог
А Не потуж ру г «иа 5 хшАк З стра я
У Кчки Кк
Ех вл
ВО КА
ОК ееіогк
ОК ВК КЗ ект вути а вала Ук СК нак Кох мозкнч у. Ж т. пе муках ї рапс тлі єх ЕІ к. дух, Яооих Б с л
Кожен теЕхачвінія зтпрудтідчу КУ пазтеві ва 1 их троха уцитії я Мо
БА Негхий занцюн СОВеЬі антевіна 15131 ес я В ВИ СН Я
ДТ учу І
ЗАТ х
Туя чи Фу у с Фильюо ж лок. Фк Ж ожУх хан В : КО
Ту еху йог сах у ТО мМ. їж Мр. отих їх Тех КОТ
ТАКІ ЛАЄ ВИК М АЖ ОК ЖО КК су й А УК ЛАМАХ р ; е я ж ї ту НИ і «З КН тут гу жо киш ДО ря гу
ХАА Ж З скосу сих
Ки х Ж ення ЖУКА емох м й .
Ком зецит ми хх 0 ШУ хар и я МУ
МОЖЕ ТЕ я Уж чуток спеідіт ую У РОМ ут ге здох суюн я Каже ке ках ке Ж УЖ сх ху
КА ох Урі ии подЕТВУ ЩА Ж ррееї грд ОО Я вревлюмміті і кед
МА іш Км ЛЕН КА Те ЖЕННЯМ КОКО ЗМУ ММ КУРОК. ходою 4 -еашИм 1Ю
ЇВ. ока ше я. ЯК че ока Жук ек. К аку уч НІ х : у ШІхуУ
ЖЖ ОКУ НВК КК лОЖНХ хАЛЮр ОХ 4 є і що дич 4 стю дру 4 с АКТ КУ 1 дк Ко сих їх сек До КУ
СОБАК пУЮНИ «ій вкл ну ух ситуа ту «Ж шву чна
Кит, си а грох иа
ЛЕТ тегу іх зд ля ЖУКА ЛК освлахуєтем ої тую СЕКСУ КІ б ідхуклех кити Кок
МУ неа Ми жМми МН ОК Ева Ко БРУК КОМІ хх їх Е хе я чі її реч Чів Мів обі бек бре Ти тт ж ух НЕО З що та їх См іх мл Кир. -а ЗАТ па МАМО Аж ЕЕ мМ УВУ і т 4 -2 ких зу
КЕ А хе хи я ш
КУТ Ех щ
АЖ щ
Кен уд дк шк мок муж, су - «Ж реж чь
Чи Му гі ктюфуху вчу вжи, ті УЖ моді БУ ДЗ суму си Ж ТЕЖ фаху с п Е
СО ух Таж пдицшУх пам мае; мо Я басма тмумо у Бабмті весно шпажкмиМ нак С чі зутитіна БАЗІ ке ВЕС КО МЕ З ВОМ ит КА пох
ЯК КА зв . кечиачи чо. зал, яні довуєу СИВрю бар їі МА.
АКЦОБ М АК КО СЮ Аг ж
І щу х З ж иа аль ою вк пе С «сеї р
Ов и кари КЕКА оон рем жт
БОКАХ МКУ ситі
Кер
Бо
ТТ Жвлієшантя й телефісзшч ТІ ..О0ТА7 сфе зи З ОО ТЕХ в НК хо пажикн пяивикУ Карт жена АБ ГМуМнакичи кВ кас хІі
ОХ БУ.
НИ М
Заг Ж вм Щек ТК що Млкк БЕ Щі ашо сиву тот Су УТ ха шк Тв т Б
КЗ ЩО мо СЕ Ом ЕМ ух у ЗДО пе МУ УК Ж Кз І ЕТ ХУ
ХА М НК Кк кА
КУ кру й ок КУ У
Аль а зрох
Ко Ко;
Кене ти
Бекон ЕК ж у прі хх про оду дк МЕЖ 3. шиуюту «Ки
Тих школі палі Т.О пащинті ма Я КАТЕ голе кю Жак жи БзжкмнЕ лпенцюий сом знЕквілне 1БІЗБКЕд см'Умерацяя асувгі с длугух у «авг х 18 пах що бує сою Жах ТЛ вк их уч рік бах У иУ бю НІХ бю хе
У мі У пеи УК А У ХМК о с У жо пе чує пе ЕЕ ОКУ
З ц Ох в
Х М ке Кк а гу чт к хи й
Ки З їх
Хек А КІ че сті ти
Ся М її ноут вира сю
ОК деки
КУН Уч
Ук лютх
ХМ
ОО Утиу є треті: УЖ ТС соусі іль ОБО Я УК ЛУ 0 бітзікауєч саду м СИВА
Ху ших перен пав Скла авжииьНня ЕЕ іМУуМеуМНувя Бе
ОДОрКТК я чн М і домовик вже прдді кв В запам М Я Е я гу їх шу ру - «ей м а
Как «з «МТМ т но «куще
Фа хх Не «міх НУ ек АК еСжя
Кочан пед гумі хо 0 ЩЕ УчиВи оди
УВК Ве ва жтЕлюту питуеіи у мохіто ТУТ се СЮ СИ іаххукактуутіЯ ж Му тх
Кох петгкиМи павцюЕК особи чнІвтІМЕ БАЛ іх знумешвавя ЗкКхХ жк ттхе, ях
ВК Ка
Фон их пуф их
МАЛЯ х шує ших теж Ат КЗ шику у оди Я
ШИК ТК ТЕХ ходи КОЖ
КИ кю змлеха а саЖАВИЄ КАК ЕМ штуку
Я У: вза куту Тоня пд суєюі КИЖУЮВ ОХ стУккАнММ е сн а село ю й ко жкшоух ши Ст, іш тд ІМ и шщрід ит ВЕ ОК УА ом укии І. МИ охо УК ВІКИ ВЖК ЕІ ХЖ а и КЕ ЖК ДЖЕМ 0 ЗУМІВ ІДУ джу Я ках НКУ пад ще щиве тити КК щих а мо ен нн ВЕ о М В Ви А ВЛ ЗУ «шк
ШЕ ЗЕ тк ММ КЕ шт Я
МУКУ ЖАЕ кдд «кі
ФК УМ ТІ
СУ КУЗЯ
КооеЯ ЗК и,
ТК КО А пу ОСЧЕВ
Аня
Уошу ки КК я УКТУ ТЕМ Хнпженое й з пт, УМ 0 - с С ВИ м їх - То ВУ ХВ
ОК К ЕМу Тоня фхохівууихюх МОЗ. садів ох же ЕХ ЕМ 0 б фдзскакхющув я ТУ ХМ
БеСНКна МЕНЯ КО ЯН. Хм КМ ЕЕ И Ин мм ов ККУ МЕМ КК че ж А ги ОТ
КІМ Ж гук о ки СО одежу Ко
МАВКИ ВА ОКО ВИХ СМ ХВ МУ ше
МАХ
ФЛ Кутя В
ЖЕ ДАМ их дл стук тек
ООН НУ лу мкА ту
Кора г
КеЖО ни МАКЕТ
Кене ЧО
ОА, сти
Ж Ки МЕДОК УКХ хом тари
МОЛ Ах
КІМ
КО 2. пх . год с ижжх их плн К рос мні. ї сет до пеки ди ЕМ Ех лек свою юних ТАЖ А БТ пемзи ми фу Р ее ШК ТЇ хає Уж В Ж КИ
Може ий МКК: ВЕНИ МИ ІМК ІВ ОК ГКУ А МЖК
Саня жу оз в:
У НОМУ Как шафа ут зе Ко Ку рн ан и І ок м и В А жк ку у мя, хе я дриж В. тю ДА росу лю шо ши ке лУкімУ
КУ Ве
ОЕМ, КК сь те
ШТ жиму к і, ска МИХ ЗУКІКУ тю іх «их тт. «КУ. т, скоиюю с де У Му дез. ч шим. роми ни и НІ и си зе Що лежу
СТУ Шафи древа ль БУ 0 шву ее К ИН Я НУ Тіла т ЩЕ ТАТИ в в ЖИВУ ЗАВАЖАТИ МИ шЖМу о ШІШИМАЛЬХА УМИКВЛА
Кошеня рея
А ДК жи смужками ше мих В В стю Мою усувууї щи шк. ее у ди В ди пи ж ж уч У
НК В КН о КЕ ВМ СК НЕ КЕ КЕ Я В о ВМО Ки ВО В а ВИ У КЕ ВИ ВЕ В С ВЕУ п гу хм хх кити т о; ше а ка
ЗУ хх ж, ето
ШОСЕ шу хх ДОМА Еш мя тю у кт
УНН К- ля
МА я «КК ки зали иа пшх
КУ «МЕАТХ
Не чея
СВ Ем пере кі же МАК ВУХ КИ «Ше и ЛЕ аск стих МА меми Хіти ра МД
Жоден хи ТАКА «МЕЖАМИ МЕМ УЧ МИ МИ ЖАТИ ШК МО КАХ
Са Ук
КЕ АВИ Я еУпю р алу би г Фо ук аю м ер вс МО ши ху у ух уУмух Я» СІК М жк и попити Же їх
ШЕВ І ВІДІ ОМ КІВ К УКІЕК М ЕЕІКВМКУ УККИ ПОМ Я КУ МТ звис сао бооесеоає мтс состава сао шо
БУ ек в и В Нв и НН
МУ ї шк У ЕТ УХИ МАЕ М ЗЕ БЕК КУКА І ЛОЛХДХ АТАМВХМЕ ЛІВ ВУХ ТИ Її. СЕНИК В КИ МЕС
КК ох г. перо ст пкт оо о и Он ЕК НИ ту су уки, в АН НИ ли ен Енея се. к. пи В и, туди Ко ЕЕ й уп ду к фут к до куту аа в КН я в ма вн и о м о В п п и ВВ А з и и В В ПВ СВ У З М С У КН а В порт
А пу гм. сек куки ем арж рисовим БД шик ет им ик дує а уд ул
І МК МЕ ІА МБ МЕМ УКХ КЛІК ле ХВ ХЕ
КІ
Угох фут Вих тд у р ЕВ ВУ ам умів луєю Фо и ук, ро і і
МХЕХЕ ІК ЩО ММА МЕМ лес. МА МИД ОКХ ВЕ БК Ка ЕМ ВИК КІВ ЕЕ МЕНІ
Ек
АКА ум о ОК НО
Хв о В М КВ А З кл у мя пеклі клин пютю хе М ДУЖУ
МУ ЕК лі ши Ох НКУ о я хх мол олож 0 Ех
Аня МІХ
ШУМ ДАХ ко же кох
Коди ня тити
ЕК Цю МЕМ МКУ стру ек
ОО ве
Как жмнкя Є гу А пи имя поро пепсин перо піки г. пили пси тииигуи тя С кр т ж і фена ДЕ еще ями Баітіею Я ях ЕМО ККЕОЕХ ОДУМОВЯМТЖЕ ХАНА ЕН АК ТУБАХ
УК, холу
ЕК Б пе ев Кк ух туф их ди КК пох сову их ду сим Кк
М хи МАО КАТ НК Х - ХЕ Ми ЛЕ ТАИ їх МЕМ лм ла М -Е МАМИ КУКИ са де КЕКС А ПЕ М М М
КУ
ХУ ера и ин НН НА НН
СОЦ ЗКУ В ЕВ КЕ КУКИ ДА В С ОО яв ж
Бе
Бо ке Кн о По Ж КК З а нь о и тд жк лу в узи ух они ЖУК
МИ ТЕ АЖ ч КАМ МЕ КЕ КЕ ТК М. МЕ МІ Ех се су МУМОМД КМ тю М КЕ У ОКЕАН ІМК Ва чу
КК поросі етді Я фак фев пере в ужив сви соки ет пе шк киев рф и
ММММиу ММ ОМ Ку ЯМ МИ МК КІ КІМ КАВА ІНН АВ КД КВ тях
АК
ХМ ен В В НН
СИМ МИ ЕК СТИК Ви Шк УТ ЕВ ЩО «ЕЕ ВЕАХИ М МЕЛІ КУ шШЕ КЕ МДУ ОККО ЕЕ КЕ Толя мега
УКХ то щлх св тт М од тир вм пи кв тд КОЮ оф ж авуєВ ще дити хи тече изд р дя и нн о и и в М а з в п В а В З ОО В В ВВ С МЕХІКО КІ ЦО ВИ КОХ ту я в оо Я
МКК КІМ ХХ кеуку
ЕК ших, пра
З ЕЮЖ С
ЕК я Кене пе хи
КТК лю ЧК: и Божу
Ти Кия
ККУ НКся х АХ еоео суч Ек ве ХЕ Уч Я лак
Мей
СИ м чик лико, почти кла, УКЯКнКи мо ач ку Но ПОМ ЛДКЦ Олю Ж дує жк шиєю нич чн
ЗОЛЯ їіжзжмиК тва КТК узами тки пока КТ. Затим вання зажими М ник уко евА ЕКО ЮЬЗ дБА НУ МЕ ХВО КИМ Я
КО аа вия вв МОЖ дуги ех прово ми доп В що ро сур
ОВ В дат ня па МУ
ОТЬ
«МХ се й «ТК МКУ
А дк м ХЖ сх хх Я ою чик шо Ж вка ХАТУ иа У ск дик де -м,
ХМ ж сект хц як
ОА МОУ яп ож АЛТИХ
Сас Кестювкнк й булка НД «ж вух Сом тра У ль В засри ж ажих купив со СВ ак ве зак ш лавки Сет ВЖЕ дж дМмуВеюаи м Кс сих Ек хуя «ту. феоакі кутки джію до ве прижився мекв о и ви М и С З В та
Кк у Ми теж як ж ик шк ку
Зх пк
ЗОНИ ТЕ
БУК ни БЯ вч :
ЗО МКК І вн МЕМУу ТІВ пед я
СТУ
ОА
Ох, т. ско Ффожкиск в и мо н р чн в ТОЖ Тему СЯ щ. с. че ще и. пу м кт теки Фі тіую ЗІАЮ В схаииху ви СЕ ЩІ ЕМУСЮ п атхоклвмичстхЯ со Шут ве ЗАщЕЖ ЛІНІЮ СІНА АМИБВУСБ ЛИ: КБ УМ Ах ЇДЕ КОН ХМ
Он Шк шк « птахи Зк и жи луии
СТВІ КА ХВО КІ ЗО КАХ кукі
ЗУ
Кока ск «Б В
Ж ММ БУ
Керч з їх ве Кая шт тю паче шо ле хх т 5 ик Мих пох ме я пил: ее НКУ ТЕКУ, кру
Ох
ЕЕ Жфкокжежети У фежукітує БОТИ сірі ух ЗУ СК гад шо пакт
ДКНС ож ри ЕввІ ТЕ парі Ух ЩО СЕ їли що Кок
Том я ЩМИУІК ІМ ХМВЕХАКИХ КОЛ КАТЕ ХВБЮКрУ КІМ КАК Дах ЛІ МИЙХОВ ОБО
ВЖЕ ск «ЕЕ БЕ
А ке спружтютч етикою ду ут и ж и п Ки а ОН ки са
Ка шежж в ух мух
СИ С и шк
ВЕ Ж
ФУ хх
КО МЕЖ
Км охух зе
Я ТІК КО
ВО ЖАХ,
Тв у зе квт
Ме МКУ МЕМ жк т
ЕН сп ую Жігупевтя й ель іш ІРО ММ врлітм нн їх пі І 3 гаків у щу
ХУ пащі к ЗМ км ШЕ І Ву БМК
ОТ ж ва кт паті жи юих сої ів мух Бі кскло М куикртеиуи свт Каток х Ме ХХ КО М а і о а, М о п о СЕ МН ШК ЕК Мих КУКА Ям
ОА
«ії й
Ми ТУ кА ОХ как ШИЯ
Ех (МАХ
УЖ ну, -
КД спека во ен 0 ІЕЕ Я им бу ко АХ
Мр тк он нн НН а НН се ко. кжресторе що ом мул хх доудютек коти го у и М. Усик тітушки ОСЕООН КО дюрідоідняк ко уд х Ж шлак ол леух ї веде: ММ КНЕ УМА СОМ СЕО МОБ УЄЮ ХУ АЖ м ок БК МНЕ Я каш Кі
У я кі «М Цю Ко
ХЖЕЛИККХ 5 ре о о С А Чо а В м В м п п М А а ЕК
ХІХЕМАЩЕ Ти В ШАХ ЕХО ІК ТЕМИ ОХ ом а ми и нт и и ОХ КОКО
БО пк дж ск
СТЕ ох
ЖАХ ке: овен щосхи
Кк я ен ж пек Кия таз хе то Кім сови кут ях МОЛ КІТОММЯ ХІМ КТА ХХ ди АВ ккд
КМ я : де ч зе
Ки У змо ії ше уч
Ж УК МЕЛЮЛІМУ ХА ЛЕХУ У МЕ
ОТ х, У оз ск хх Коха Я щ с пз вч дою 3 мли ТИ миє щої їж скуті КоККХ ою у МОМ КЮХУМ ОХ Тл ПЕТРИК КУ АН ку» Бо теку «5 Е
КА ек осв НК нн Ки НК о НН НО КЗ НН З о НУ Сухе Туджхт Ж скупо
МиЗЕ ХІМ СКК Ж ж шк КВ М ще ЖК ля ЖЖ Ж м СТЕ КАМ БОЖІ «5 їх хз лк х не МО Кв бат Щі хо Жах бтТкУух 0 Тхх Мбеху ЛЮ так шу ХО Жук ХЛ ж Лу же МИ ех 0 Зх
Ов ом ме осСжа шу ЖЕК А су шт Ба ЖЕ ЛЕК У СУК М АХЮ ХХІ сх ЕЕ т г т т
М «ОМ «ЖАХ жк й Фуко о баниу че КА я юю них Ше ІЗ Ж же ж М МУ м» Щі Мох
ФІ Ж їх пештию о УМ: ьо рожа НИ коло НИК 2х їх. НІК І ТІ їх ми м о км и и М КО З КК Я м М С МЕ ДЕ В З ОК о З КУ А МК СЯ ЧЕ ОХ Ж Фе ск ту ж док
Кая де Ко
Сх ще о кое че кан КН х п нн о НН «ха ху и, І.
ХУ шко Жду: СМЖу сх Ж ами Що лк Б Кк; Тож ФІ ку Тк 1 лю т ко ди
ХА АЙ СЕК ОКХ ТК о ЗЕ ЯК УЖ КЕ ся ХА ШУ Бе АЖ КК КО т Бе ФЛ «М ХЕ Ти хх дюни А тА Ії клі их фу дя т ша я Ех В - В х
Же ТІ а КУ КЕ бами «КТ ІК. ВОМ ІОН о Кн їх СОТНИК НЕ УЧЯ
ЖЖ ща жа МЕ ХК м КК НН ба ХУ ЛУ ОА ВБМИМ хх БА НА Б яЕНЕМ хо чия ек: меті
Ох З СЯ г
ЕКОУ ЕХ КО КО х. я роли Ом КК. є я. ним Ж ом поси У У - сь КУ г УяК Хости УЖ.
Ма бе Фі бе ЕК Юа маю Хом пі Іі Демо і ім Ме Ме ру
ХМК ТК АК СДТКК КЕ Ж КК Ж М АВМ ни с м З В В М ОМ У соду хо 2-х их І ШЕ п ва ЦІЙ «3 ЧА ну хх Аж З щодо СЯ «ех х Ще ут Фхсмосую Ж ух ЩЕ
Ж З та бпяжоух є 1Ю ТЕМм шчуОТоз шу СКУ ду бом МИ я Та Ха Жоху ЗМ жа ШЕ М кс ее зм ка з а о о и пк п па м и ма, п а С о о в п м а а М п В КИМ ВИ
З дрху зчгпарї СКЗ
УМА АХ КА
У жа шт са у ШИХ м бю мі ЗХ Щука Жах Я м Му їі жу Ж Зіна їх Фе їх КЗ МАТ УК А МУ меш жо БМ М У лю МАЮ ЖЖ ТЕМ УВА пешКУ ча досту чх тк М АК
АТХ ХА Дол
КОДУ Кл ФО ою ях. о кя ка Кк окт лСОНЯ Ь м Жодйеух Ме Тел и т. Ук ен Же СА хи 1
ОО а КН же їй ле Ти рої ж ді Жемих ке и я же ОО Ж у и а м ЗМ са З о В ОЗ І ОМ М А А З ИН У ОМ В а В А М ЗЕ КО М я СЕК А КЕ ЕЕ ха те содтх хи у їх хх АОЖУХЕ КУ їююує ТУ хх Фо. муку уч Щтс ЕН НКИ» їм, МТМ Шказжу. їЛЮиМ Жах Жом о на Я секух її 3х ЩеуУх йо руту З СО ех Тра ач Шеету ЛК М тища МИ нь КУ х КСЕНЯ МОМ Ух га ММ Же АЮ ДА ОЖУЮК 3 ЕАДУ ШОЮ ЖОМУ УМ. ОМИШУЄЮ ОЄКМИ АХ ОМ Ко хо ЖИ бяомош, пог 7 ГБ хомут ВК ії Х Ал ЗУ тах Кіш Ж хх их ож КАБ шина У що днк ом - п А а НН
КОЖ ха у ха» уки їх фен ка С ох то ж го пух СЖЛЇ кі кум
МАХ ЖАЄ АЮ АЮ ЖЖ Ж ЖМ БАХ КЕ ЖЕХИ ду» ШК ММА ЖЕ М АВ АЮ чи М. ЖУК, «ож
КУ ДНУ Не в ее Жан Хе мя у ШО зх ХЕ. Є ж ЖАХ хм ах ючи ПЧеожеимо Фо Жим
Хе де шу зп Ж Е щи бак ЩІ б іх су фі мо Же їм Щщомх сих хх ач ща Кк ще А ЛК ТАН шт ЖЖ УдоМ у ов и о З М о и ЗМ ЧО
ЖЕ ЗК ох
А АТ ММ
МЕ у ЗЕ шен п ж Ж дя Зк шух Толі жує Жим у фу ЖИМ ик их хау ЗЕ их мл щі Шктю «3 їх) їх ХВ бом Српжтую ща бурею Ума фін сля ГІ Що в М КМ В М С НК В о С я З В ЗВИК З Я СМ КК М ЯЗ я У ЗИ Я ЖЕ жАМ В ККУ яд куюх пе
ТО, Ех пор
ОЕМ И КОХА ШУМ ма Ж У п не я НН сх Жежмо М. ож ХМ черг єр дя г ат Міші ж ж ще Кох хе зн ШАХ НИ ання тіж Пи її їх
ЕХ МАХ Ж ме у ж А КАК МЩКТ ях А ДИ ЗК, ОМ Е АК Ж. МЛ ефе ж оче кри
З их Ж
Бе ху йо «ух. М кн ун НН На и НН и НН УК ВН У Кон Но о а На пе Ко (1 ж ще т х хека ох, жі ще Мах щих З Кк їх ту БІ ух ж ВХ АЛЬ ККУ ЗУКХІ УЖ мМ ТД ЗАЙ ЗА ТИЩА МКК АЛЬ ЖЖ МИ ВАХ т Ж, сити ик хх
СІЯ ЕХ БЕ ХІІ
Кс КА «ЕЙ ШТАМ я о и А НН о НЯ та х РОШЕН и не ННЯ Жде кА їди 14 АК а а Не ач нн са на НЕ и НН НН ЧНО Код Межа ук їди Км ух коми м М В м а о М МЕ в В Я З М а В М В і ЕК и М В А М ВО З В В В ВЕ М ЯЗ «ек сво, вх вад Ж МІ
З о-о йЗахх Змє Жоамут 0 що м ж Ко Шах Що юю КУ зу Що 1 Ж уко ОМ чн ї- її ОБУ КЛої Кл че ух. ик. «І ЯКЕ Я ень я ШМК ОК Х У Ж ЧК
ЕОМ а нн ни М и в і ки М М В в М нн В п В м п пл в с В ОК І М ЕВ
ТЕХ ТВ ЗТ де МОХИ ОВ кої гі дж п зх т т шия 2 хе « ху т ут щ г
Во ТА вх У її є оце бе фе Жах ШУ КіУу ших Я ех ПУ Фа 0 жу хм «ій мам і КЕ ОК жа ОК КК їли ше ж М М диво ха т щі
Ук ху ск
ТЕ п КК нау хх ККУ ше мух Кок т Ус Кая 5 Б ж ко щу - уч Ук поч ЖжЕм хо ки г Ху Кг тло т м шу мя Томи Ж КМУ би З хо Хе оо Мт жу: ж
Уа Еш вхо па МАХ им хх І ВЗ м МЕ и А ВЕ М Я о ИН З З М ВО Я ШИН ха хх иї сь. «их
КК ле. ГСК
ОМ «ЛІВ ОК
Хураше ВЖА що МОЖ шу Жди Ж М о екю МА дек што Лю у У ду кам бохо ж уд динит
Мк ДА со тю Мана лу То ле МОЖ. «ша дк (От М у 0 ХУ Хе ши
НЯ З НМ о НЕ М Я М В В В В І, М КМ З М КМ В М а М АНЯ КМ лиж, п вл, Ех «БЕ Не хи КК: те щі м Зівух бли Мж 2 53 маю ЩУмчнм 27 4я3 БУЛ дж хжщї ши бо МИ Сея прик о : х пт М СА» . Ух зе «1 ож жУщї дути МЕ І КІ
ЖК О ЖК ЖЕК ще КК аа САБО ОУМЕ КС САМ ОМмАШЖ Ж жи НИ БА КК
ВК зола ЖК
ЕНН ВИКО СОЦ ден ки. х ж рт. що ху, х шо ех се й Кл ж т Ж сх тен 1 ою ТіК 5 См ух Мел Ех М т і1Щту що Вчи бу щі хх АЖ ЖК КУ а ЕКО КА ЖАКА МАЮ АЮ ОО ХЕАКЖА. МАЮ ШКО ЖАБУ МАО ТКА Ж ко. «КЕ ско
КІ ЯНИ ХК ЩІ
АЖ УН ОКУ «ОЗ
Фе ЗК її лих зе ук Ложку й т т т з. ом, пу - хх оч К пох беквав щі БЕЗ Вч дід ке сам; біг щі ТВБЖ Бі їі щі бек ди
ВЖЕ УА КАК КОЮ ЛУК ж УК ЖЖ ХА ХОМ МАМ МЕМ Ж ОКО ри «км ска
Ол я -ІХУШ
Ко кл хх умі ОТ я А х с Жид СЖлюжеию МИ ше Гео 2 с чл ох ше ду
Хек Ж Зк Ка ШО зк ті б дух ен о НВ о НН як Но НИ НЕ мкА КМ Аж хе ме меМАЮ лаву ДА ОБЖ жа АД п ю щяМ БНаМ б ДА щу г гу хх
СУА ря ІЗ ее «КОЛ ХХХ
Ж г о АНЯ СВК У ки НК и НО ох Ж ж Ж ххх ххї со НЬ Хі ща г їх КК ТЕХ я ж На шиї ПК а ЛЬНІ 3 МІЖ лаУдтаМ ЖК УЮ м ел ЮЮ жу У ТО МКЧХ Ах ЖАВ ле КХ Х саше ВЕУ шою жа. ХИМХ ки, луки се ще
КУ БАН У І
«3 и Ящ А
; ж хг. (ОС Баму, кх. жк А се мо хх ке шо вч чо а со
Зак То вою М ек 1 та ох Фавор Жах ло і як жк МУ 4 Ку з з М а у М НК В о В В В В С ЗИ КК М ВК В У ЕХ ВИ КУ ВСЯ їх ЕМ У Ки
УК пот ОК
А п ХР ТЕ
Ятнюх балу їоахта Шемтх т жи Ж щі ст Мої омо Моджші оду 0 Де Ко ШИН тк тпуеже їж бошхїа КЕ ії З кі 13 МК що кн почи ЩЕ ХХ Кк ВІ що у и вн А МЕ м М М А МЕ В М В НН ЕМ ЕЕ ВЕ В М НН ЕВ О де КУя ож
МА Ж «ск
Зах ХХ Ма г ж Ж ех (У Ух 4 4 иа Жид МК Мних Же со Жерке Сол Му
Ку с 3 Її ух КОТА ї ТІ 21 пору ж туру кни В ХЕКУє Ко я ен
МЕ 2.5 З БлОЖ ОО ЕЗ ЗА ді ех хіт. їх з ПЕ ре х ТТ уЕх дя Кока
КК ж ЗСУВ се З жА МУ хжАЛЯ КК ТК хХЕМ ОО ЖК кА УМ ІК КК
СУ а хх 5. хусх га хЕтуса
Ше сш Мбкежу Пі ує хХущ р Не а НН Ж НКУ Не НЕ Я У ха 5 0 о їі 32. ша АК АК АХ ІЗ кв во А а В о ВХ МО В ЗК І и В и М МО як ЖлВ шко дих че
ЖК Би МЕ с не чвАеУ МК
Тов блем о їлшті Лют ж Жоювії (шо) її дах жа Щфш у бул чию Тор божі 2 їх Жду Кома
КВ КЕ В 4 Кк да ми НМ А ЗД АХ ЩОЯММІ ож МИМО Ва ОМ ЯКЕ хі що х. МЕ Ян их
БК а ча зу
СОЯ они кла ни Я вки чиЛЬш пси ХК, ли ке гони Ач Каша г хх ух Ош яю жи іно ТА р у ШУ гілля Кт ЖЕ ТО ЇХ хх Фу БІЛІ ту Ед щої р нн НН м о ЗМ ЕЕ ЗМ Не и п В с а и п а М В С я М С м М о ПЕ ЗИ еВ М ВИ Я
Сеня АН ак
Зо Зми "КОЛЕ було Мкюхя Моди ВК Фе СХ ж ан НН Мои А лю ЖК кА М ах ку ти букету окт Ток Же тн Ох джек Доу фЧаск Са: ші ї53 Мід ще вич Ук жк ж їй аа ам З М ЧО В І В М З В п МВ ОН З З НК І М Ки КЕ ща Кг В м ю УМА ХЕ ХОМ д я пеилоу КО пд ль їх я чі кн жо, Єжи Ух х У зх ж тузі: Си Ств У Здшал Ж С З щу гл КТ дер БИ ФО я Бк тн У ххх кА м Ка В м В М ВЕ З ВЕ І а М о В о НЕ В В З В МК КМ ко Тула ЩЕ
Х У щу мок ее УВА
Яга щем о її боту бе її жо Ж жЕщі ах сх маіх (ях т кухню оди Ех си еоЕМ ЛЬ ЯМИ ху МО же у ЖІ УЗ ШУ Ж х Би УОМЖОМО Ж МОЩІ М ж еко, ЗАЖЖА ОЮА ших «а шо дт
ТОК С ЕН ої Кук Кн оон ВК НН З Нр и НН НИ Ух ль Ж З вк ж Хо рН тіж Ж фУНщо 2131 кю і 33 ре 2 Р її щі Мая їм Може Зшкі Жук їм те КТК Зм ТЯ ж ММ М Ж М Кедт зи БК ЗЕМ ДАНА УМХ ох -Е
МК шоп т ом
У Не З МЕЖІ «ТК ие РА, ЕЛЕ кА кож жо их моя ум Жди СУК А ЖхУхЯ У ж А ЗК тва МУК юю М -
Її лах га хі 2 хх ще ту тт М Тов її й ти дамо бор Кухх уж
ЕК А З ко м М С Б М АК М в М В ОМ Я ВК ОН В ВХ НЕ НН ПЕ МВ В КЕ пав ща ше,
ТЕ Зо КЕ
ХЕ Ж ЕХ ня ен А о А НН о суч пон шт БИ, оо вени ан нн а НН З НН Ул. щавах ЕЛ т лещі 831 сх ЗЗР Талі ХК Жук фо щої «ко Бк пс ж Ед
ША АТ МК ЖАХ МАК ЖЖ ММ УМ А ЖК ЖАКА УЖЕ ММК дош МК А щДгх Яр ох «ЕІ «ЕК ПЕ бю Хо Ух Мокез ЖЖ жи М мя ч оку У хг гм УК я ше и пет мл шо бем й орі блю Бо шк Ж го ії чо Шк тт її хе ЖБщю
ШТУК МО Кк МО ЖМІХ ЖК ЩО ЕМ ВЕ АЖАЖУХ А. МКАОУ у Не Ж ЩА ЖЖИ ЖЕ МИХ тою я пет ка ши НЯ
ЛЮЩ ЩА шо жов Ме Са Ж Мур уче ен нн НН НЕ НН НН НН ут ща Та. ЖК опи о ож ов ев ГРА т ЕЕ сля жу ЩЕ БАЛ їх ям КМ МЕ ЖК КТ Кт тА КК що ЖАВИ КК КРБ КМУ МУ п Год ща ща А М
Ії мк їх. Кок. т о . СИ Хата х Зіже т. Келих ом и Ток, сччья КхлКя я Со.
Хложк ЕЛ х КО І сени ж Зх хх тм 0 Алею Усе коми Ос ях Жьсуєх Пл х
ІІ ха ма їх нем мващ шшЕ ши щМмо МЕМ Бе СВ ЗАМ А хх ке ЖМБЕ ХМ
КУ поч шх сих
С що ВАК хо щи ї НК; Ки
ХК шКІ НК КЕ х . Кей - ж т што х . їШнх и Бі Мох Зх - на ее хе сих, го зешо НЕ дих хі: ЩЕ 1 5
Вк обі тшк дер Бр ЖК ст ВК їх щі їх Б ЕП ВН дів ДЕ МОЖЕ
МЕ ом ММ ХІІ А ЖАТИ ХОМА ЗДАВ ТАМИ Ха х ХО. ЕХ йЕЗ -чХ ДЖ, В ож : КК
Ах, ре КРТ
Мас Ме дей й Я - ях ЗК - і хх ж . Фросутни 0 ККУ Ті ІЖ 5 хх Ху Ол ххх . «я дей бохо де МУК буд ок ІК дх їх тя Мих ЛУ
Щі Жнаж і У Ше щі бек їн у Ко зжв АК БТ фі міш А ах
Кк им АО УЖ АОЖ СІ ЗЕД ООХ домо тат й - Що сиокию т, схо о шт ху жу СЕУ
ЕХ яти ча ух . тату ЗЖодкн СН ших уз КУ ї"ім Ед - К сли ще Коди кулю х хом МІЖ У ОО хх хх - с . че. с - ЯЖ дою Бо то т с 53 м І ЕХ У ОХ НН У УМХ х. - 8 Ж З бот щує с Мох о ЖІ х ЗА ЖАСИХЕ КЕ СЕК У мем обі ля ко бяєб Сбую Мо Зо ат
МУ вх хх: ке й ее
Б ща ваша ЩІ КІ
Кн режеєчУ ТК х - о ПО хм башт Ук оч с щ схід он Жака Ж лу ща ТУ ее де М Де СФЕ пох фриш Ж хх Ж мії фік ує Хо Тек Хот А ХХ дО Ж жу кокс хі Бе Ме і її ех Бой Бе її о п ми а о в В Зх її 7
Ж ЄМ шо хо де КУМ ОХ ке Я і й
ЖК Е З «же
КИЯ ЕЕ сек ще НЕ ща Ва п
МИ т . че сх. : жах том ЗКтошх Що і 34 ех й -- ке ох зх ад їх их Хі ії Ся КЕ дош дл Мо МИ ОХ щі осі ва їі дів та Ме БКкеа Уві УЖ бе бів Баш Ж 3 мех хм я 3 І шЄЖ В ЖОІ МО жо у і: Е Ах
ЖЕО яку ню З Ех вче тлу 7 са в СК оЯ с-м
КМ 7 с Ко х Рибне Шум Нац ТУ ско їт АН Хожак дує Мету ЗРАЇ дик Ти бу їжа Іі дО дж щі бо тв Бек бе Же ЖИ У шеК БЖК ХМОК ЕжТий Ум
МЕМ ТА ЛежЮ ЖЕК А Кк КК АК Оу 7 тклу її
Ка 7 рожа ШЕ сус а ОІВ оку ХХ
Мом . їх д Ж сх хо ик йжече ж учну шия фраєуу Д лх х ї3З2е; Бі ве йуща щі ів лю фужу Чмеює фрюу СЕ ду жі дмх Ки М ук В тик ло вх Мох ІМ ЕТО ТІ АЖ КК АК М МАХ МАУ
Уві тТвЕ Ме о Ттев БАЧ Тіз Аза ТтТВвЕ Ба біб бай тТвЖж Буєх во й
ЖАБА ді УК О КЖр ом я і: зро м СХ ХО
ОН Я Иено
Я ТК. й Й шк шт Уж куту Ж ших к А не х зт Жеча (Ра ті 4к Мехуї баса Ж міх гуму з що чи гоже ба боже Пішкже Кох Ко ЧА хм ТАТІ КОХ
Уві 3 аа ще ші Те тек дж ех їх ме і і ЩО нанес
ЖЕ ще ЗМІЮ шшЖ см ХУ клин зи що
ОМ ЩА Ко ех дух ТЕ чуми ххх
ВЗЖЯ ше ни
Еш - х х Жду ЖЕ» білу Щошух й - й «ек - ха Кі їла ТУю Кіз ба Ме йзу дк я се г р нн ОН шах го А а З а З М З КВК Я
Бив о а Вуз Бі да сте бл Ада У ід сенс т
Мт ША Є ль МИКОЛУ Х х
Уже с г Й «верх
Ех УМ тухк т ЕК ІЗ
СЯ т г ка СУ МИНЕ я Хоч г тт ни Жл мох КУМ ка її ща Мою « ди ан о ШК їжи МЕ МЕ КУ рт тещі ди їв ск Ї5313; іхщ йщим ух» Щігв ОМ дже нн и а и С с п м
Беж ЖЖ МАЗЬ КН ЗАВІВ БК сл о Е ск З КОХ пкожк
М КК У споух сх ІІ
Но суть паху и хв СНІ ТК
Гщх ЕеУ
Тк їз суч СВО лю Вт в я дух й. г А Не а Ша зт бує флюси кв Є. Ще й . ц межи Мих ев оду Тож ТО Т.В ЖАХ АТ АК КО я щі Му лико томі до Оля ох щу тає ЗОН АЧХ а М С Ми З че - її Хощю тщії с АН АК МИ МО мує А ЩАЛАС
ХЕ ААХ ЖК ЗАЯАХ аміх ВИМО ОК » в: Ух " " вра
Е ПИ ж ше пух г МОХ
Мк, МАХ
МАХ їн хуя шт ки лу бзЗжжж о шах Б я с 7 бом Вод ож пф КЛІ ДІ У НКУ КАХ ЩЕ й «хх «з жах) ббаве Я щит Ме М тел іш хі ож ВИШ МЕ З а що г 2 Тех ст пк ЗБ ННХ ТОЖ р ще хх МАМ Ух ВУ ї тп ша Ока ли УК А ВТ РБК У і; і їх мА ОА їх о те х Й се ьо т
КК ЩО ЖК, ТОК
МО ЖЕ ЛУ
Ми М : ке мк фетиш Женя Фня ж м хо ох бі їШкт.у бю їіїж; Мету шк шк г Є ді вів ід іш щі Аа шк: Бу ут; КМЖ ЖЕ КІЗ дош КУ
МЕ ож А ж І В КО Хо Як яю МОМ. х
МАО Юм ки МАЕ Ми Бу в; ще не таті мере щих КУН Мед й с і доти хт У Жах ку й й ума оз Ж гож ах дя Со ка МК НН
Й ї сх бтатжи Ж та Б у 4711 Зо ТОЖ ЕК БО ху жіхи м бли б'ю беж жх бат Жук ХЕЖО ЖОВ ЯК АЖАЛА Ж БАХ БО ЖЕ ху
ТУчЕш Даж лев бом КЕ Ме Ж десш ЮЛІЯ УА, є
МУ ЖК БЕ о ух хх У що ; ОХ том пщл
ТУ ХІТ ее ж ЦИ
Он - кох Ухуче МОХ я . с й їх Ж дих Моя ТОЖ ух уч МОЗ сх г ук їх в тв Бже» це ко дій ПР бр дід с хх З иа їх с кг хм Мк т рома т пОМоОя жк о М о
Вк тех Ущі Сей о сбев Бо бе Те Те о бхое бек З
Жах ШК ж аж КЕ - ск
ОТ ех в'я щі суд ЩО МОГО
ТТ моя х Я з 2 ко кх - Кн ех шх ; зх як
Фіхте гт М хо жа Шу ЛК Мах лінку 1 хх Я і ІТ Маша Ж в 0 щ
ЖМЗМ ЖК ху ЄМ КК ХВАЛА ЖУК ЮК ЖАХ Баш МІХ АХ ЯКШО ЗАМ КА г соку пгт их
У вена кож хх «іп 33 я дет ту рееСНяне ТМ
УЖ ОСВОМЕ у уУшУ «леж КК
МУК Ек я шк сп і М їх сх СКУ Я кожи ОПТ сечу
КА А МАЛИК УМ ЛЮК межують «ТК
МАХ мя щи ми пом що
ЗМК Я Ух ще тк пк
М А МЕЖІ ОНЕУ шиття ух кої зх пранні ех ХО лжуущ Мр Та ІІІ Ід тед в її оно ЛУК ЗАКО Бо пЕЛУСМмдНсКчЗУ сиг М: п И І
ОК
М мне ни НН НИ Фе Же Шювлям У ий А іа ждкІ Мт КІ тя Фі До Ії: тії бах Мт) Бах З щі хі Шрвгх щіщ ЖИс ЗЕ У ТК се АТЬ М УК ака ВХ КЕ КИ УВО с БТ ЕК « х хх 5 т 1 я хх Мт 8 сх М с шен А в НН НА НН А спря дя Ко ен Не сі ща Кл Мак Щі хх МІ ж Іл Ттх ТЕ Ка ут гару Мет б ТІ Ю
ЖАХ ФЕх КАМ МКМ У р и ма м Ко М в МЕ М Я КК М В В В КЕ п м НН НН КІ сих БЯКня БУЯ я во «СХ У доля Ву ЖЕО том нон нн на нн НЕ в и НА тії Ж т г д тт ху Шк шт УЗ щі тт Тиашлая о Ву бите 711 5 озиме км ж, ЕМ м З кн ки В п а о м Ек з М В В В В М В У МН сот че я
В С ЗА со лу У р сля - У. дл У М ож ГО - мих х син хухї - соль ЩЕ З дин оку Ух б -щ її їкх Її 031 Там Мід бли ах КУ іш бье іт Ж ШУ іа МА хе нн ни о м на м кн МЕ ок кн кн нн о и, нн нн, и, ни мн нн км о п, НЕ ЕЕ МЕ ЕВ
КН ГЗЯ БшЯ
АК ОХ ау озна и як Ж Ух шию Жуки Ек Янь м шко ик ти мог нн АН
ТІ Ж УЛ ла ЩІ Щади Мк п тіж щі ХУ ОКО шо ж тиху вам ШИ Я Тк
Мам УВО АЛА МАТОМ ОЮ ФК КМ ОКА жа ЖЩщА шк ОК МЕМ АК КА КХЕХ «г хг па п
ЩІ У я І паж Там ТЛА Тай Хижа Шеш ул ск м БА и ЖИ ж і МУЗ у гак бах: З лльм Ком
ХЕМИМ ОМА М п Кв о З М У М о а З п В ЗОМ а М ех щ ОДА ШОБУМИІ Ка
ГУ ях і: Ко що І ЩЕЖ,
УК У ох
Ж же Ж ох спа ню Щит. в чиУ р Се СО м СО ет х еко АН х Жоум : СХ іа Ул.
ОН а Зо Ж Зх ха їх дЄгу (1 ле лу С КН хх ПІТ «3 ве ШЕ и не В М в Ку НМ а п С о М В В М и НЕ ЕВ нн о о в т В М В КК хи ча ях кох зх ЗЕ ЗВ
Ме АХ А МА
З свахи Чт юкя Ура Ж АХ ди С я Укази ЛО зд М Ух Хосе МУК лу ее Ух Мом
Бей БЕ Тек бра Бен оба бБаАв Бо бін двБю ЗО Тл Щі аа Вів ав « ХЕ са лк лскех те ой мкА ке
Жкфеає Буучх ММ Мем Ж ду: б шуує бат ФК ен А до й ку уч Тих Б о Хр ХЕ прах щу жічка ем ра жу «г іт ід ст Щі Мк вух гі фев ех Хо
КК ОБУ КТ ЖМЬ БЕ ХУ ОХ А А мА їв ЖОХЯХ КЖе ше КК ех
ЖЕ отр хг
КОХ Ше хг ке «ДУ МОХ моз Жбмрі Ж безе Ж омії (5 ще Бі а фе бі Кіш св ж Моє Шрі ст
ЕН о М З М ЕВ Ко т м у І и , В ІМ НМ и НК В В В М ВЕ та тд зак зи їх ЗЕ ЗУ М
Зх сх У я. Шк ду У ж, ст. ФВ сте Ж ох Ех хау нт я х Ходи ших ох ТУТ схе о лож ЖІ Зк ше т хх Кл ду їх роми г ше ДІ Же щаЯ Ту ик ока маш СА ї не он нм МК п з В М М і МК М М НН Ж В В КЛ М В В и М КК М ЯМИ КИ док логік зро
НЕО ЕН ЗО ту
Сх их я т. ч ЖК дю а. є УТ -. ОО; КОЖ с шк по з. т в шу «Еш Киуя УМ лег ФУ тися кож да ох бок хек Ії: х їх о кі ЩО Тло ЖУК зе лісу пір рат бач т сш Кп ОК С сам ог пл б лом МУЖА У мЖщ ОБР КС ЗК ІНВ МАХ З х ду ЖК. ОК Ет уко І їз тик ує Ок ЩО Ж Би бЗфек пт Том у пі Кум шує Ммсу щбтжх бом 415 8 Її ху х В Еш Я УМ УК ЯиМ а ЗК ИН З НЯ ДАМ ЖК жа АТ ОХ хи ЖлЛЬКІ Ще ОБРЛОЛІ Ка я же, тут кудкх
АХ кА «УКМЕЕ се Но о понечння в и НН АНЯ ие но но ни НН а НЕ
Їх Хе «ее Бах фета т її я їх А хх 1 пкт чи ТТ хо Та
ЖІ НЕК АК ек КАК АК їм МК ОА МО Ж ААУ ОМ о МАК ЖАХУ У МІШКУ МЕ
УСЮ ту Ве
Ж де АЙ УМ
У ях виш «т Жди. жо КУ м. Ех сн пи ХЕ сх Ж ШОСЕ ко я хо М е я ра зам Ж Кх іо оду й Ж ві КУ ЩЕ жо фаду СЛКуУє їх БУТ кі У се ж їм Жду и АЮ А КК МА дев ДОМУ ОТ УЖ АВМ ОО ДУШАХ и ОК хх ММА ДУХ ту лютих яр, «ж
БЛКЖЯ КІ ШІ БЕЗ
ХО ше М ше У «ЗА
Хот Во ех у Машу т ши Же т У кю ях Шуня ші ТХяам Тратияо УЗ о Фтя
ТОДІ кан нн М ЗК не и а ЗК Не А ІН о А НС НН З шатк І13 ТЕХ
ЖУК: ФУ хг ШО МУКУ худу ОК АЮ АХА УМ Ам КА ЮК х ЩО ЖК АТ А
КЕ ЗЕД тт хх их ве и
Ши Там бвю бою 2 щ5 Мій Зк а бут Ффтту Мі їі бами клеї 81
ОА де ДІА ОКУ ЗЛИМ Х б Й ЩА. ЖК. ЖОКШИ домо ше МИТА ЛИЖІ ЖАТИ ОЛІЧЕВЮ ДОМ ОХ «р тре ством «УА «ОМ ОА
ХХ х Ж ШОЕ ке Кия 12 ХЕ сх Фр ук До Меч пох жу КУ А муж Дюк
Уже сн ЖЕ шо факт, МА Фа Му хну та Що ТЗ ду ЗБ еку 3 М д ож МОЖ, є Щи дж ж маш КО мав ол Км УМ па Аж ВИК ще ЄАВТ КК МК т ще иа
ОБ БК ІК Х х се тд се У с я о ЖЖ ть ЕХ, тах ж с я Тут ок Ж ких, хх ЩІ СИ ех. их я Жусютих ще Ер Кл хе фар АННИ М ЗИ жеКУ Тр ХХ ху Песту тТажів ща щі А ПптркЗ ку мч а м ку м м КЕ В КМ М В НЕ піш ТЕ ЩО МшКК ШОК жк ол ОККО ЮК КАХ
ТІК ТЕ туги яшЛИМ У І жу аж кі при т. хо я фіни З о НА не ША НА шо я тоди
ЕЗАШУНН ус і зач їжі ЖАХ Беж їх я7155 хм іх Шу М що бух Щщезиї кох х
МАО ії ЖК юю МЕ хау СКК ЮК мем ВУ КА М БОЮ ТІК ОК ЗАЛИ ак ТЕ іх ЗЕ
М У их ее пі Щек Щі бід шШтех ві ніш шт їзіт; із шує Де Від БЕЖ іш ТМ
В Я ЗИ я ФЕМ ОМА. У ОХ В неси им нм в М В м пи м и МСЕ ач Ух туї
БУК БУ ЕД
КЕН: НКУ «ДВ ХА не не На На с НН НН НН Не На НК Но бФеамах бул Ком
ИН М ТД ат Б У ск ДК таці Ві 2 ріж ші а І щи б их
МО КХЕК о ЗМ шт КА У ж М дуАК КУлА ФА МУ У ча ЖЕ м Мо УВАЗІ Ж ВАК ОО АХАХ ша
У Х і: 5 В Я Ех зах зи УЗ Я леву ее кеш ан ху т е ще Ж шо Кл т Ки ни о АК КД а а НИ ОН НЯ
Чи БО «КОХ. Соч ХУ 1.3 її 3 їі КАС КОТ ха: їх С т ж ШІ І кА с ж 1 МО ТЕ м ОК ка у ЗХ МЕ КО МеМА хх ЖЕ ЖАЛО ОКУВУ ДУ ж дк
Ек У ТЕ
Же УКХ АК вич ла дян ж, Жлам ж и ЖЕО ниж Хол х кн І Ба НКУ МОВ ою лк їхХї м (і шу 1 Мі щУх ХР ОХ ока пк сш рук Ї їх Мол нак;
УА АЮ АВМ А М ХМ М ж ек лам веж ХК жк ХК ж Фк ям ух
СУ шк СК
КВ КК Ж
ТІЛА їх чн ЛАТ раслечя охо ТЕ їх ПО мех, Тк Шо дих ххх Жим он Доу ї хіх Код що
Ма М сі що гі хх щоки бух ше; Лу БОКУ їі ее ТІ ше ІА 15 м
Ж ма щ ж А АВ їн ККУ ГЗУ шеК Вшм ущ УшА шжщК МІ АЦОІАВ тех худих люду ат
ВЖЕ М У шу
КУ С УЛь " Хол ту УЖ я КОХ НЯ ллє ж ЖА я М ух Хо: пли пох. ШУ йди в уж о Хе Сх Пп ху А нн ГО ПеЯКея пі їду Я ти га тк
ДОМ ЖК КК А, Ж ОК а ок я М я нов х З М В С ЕК м А В п а В МК с СОМ С МК ВИК Х хх ШО ОКО жі ЖОЖ й шах рЕШОНч «і
ВК ОК ходом як кН як з о Аня щк Меню Под Хуст ; КУ п 4
Же Же Шінтю М: Бббхз бак сб ро М'рту Же Ячею За їі Ті іє Ах
ХК КІРКОЮ жде ВЕРОНІКА КОЮ ХА КМ МИ М АЮ ДВ мом дос к кт
ЕХ, ДОК до шо сх ок х. У ЛК пе ні НН АН п НА Но Я ок - яв пт « о А
Ху б ї Ха ії Щі їх хе ток 5 що Хома МО Жюль скл їх КУ
У Ск т й ща: М їх КІ СОС ДО КОЛО лу. ЛЕ «Е2 ти бал щі МЕЛлО шо жа А КЕ Мо МеУ ЖІ а ДОМУ демАХ де меш ЖЕНЕ М ЖАБУ век НККЯ ха щ
УК вве НУ нн ЧНУ нн З ЗА НН НАННЯ ку пох ши у ей ся ше -к кх- х
Же Мови Тахо Бош УК: СКК о фоишу бою ТО хх 135 ЗЕ щ ті а Жуау ОК її вич КО ме муж Ам ОЖВКМ УК КК АЖ У АКА УКХ шЕні Ба У пи Ма
ВК пох Се хї3 хх й
І ЗЛУ хх її боку їх Я о Жаміум А щу Жук Хокеи Ху Що ХУ жк о ХХ мМ юс ду мкА ОК ОА ше мем Же хви Же АТ Ж ОпЕ ие нн я М Кв М В М С НК хх ді деки як
Я У Се ВН «Модох Моск ххкфі ше ОИМ, ем хо А КМ шАО Во дих М дн ня чо шоу ж сх щу ж іа Дж Ху ТИ Мру 213 З де «см; Ка ца жала ЇХ Ех о а Я вла зи Що їй зам Ол ЖпХ Бе УЗ сю Беш оку дош ше АБ САМ
Я МОСК ЛОЮ: ее ЕК Ме
КУ ж КОЖ - КУ С Е ож хо пуд : з ВІ У Фу хо
Хо єкт Ту КА жо ла бах і Кгт боту Ка Же щі М Муює нд зх жи іх
Бек БУ ій Без ії БжЖоа даю Уа ек обла ВЕ ЗК НІВ ПУ да МАВ
КУ с ХУ їх т їх М -х
АК БЖ га
СК АЖ А ко тк Фо Фк у кожи --х Б ту Уміст ж кох пк жи хи кт ї дміх ж Я де пу їла Щі їх ШТ лу їх чих (ДІ хх ЩІ ГК нн ке НК
ЖАХ Х ку ОДУ ЗМК и Кк ВУБо Х ЗОМ М МОВАМИ МИ А х КО У що У ОА АХ во похктх як
ЗИ п ЕІ т зх чщИ с з жо шехошм т - т Не дак пк що ті їм мі Її ще шля аю бід їде Тл і їх поза ливу Ви
ХА ОМЖМХ ЗМ мех жашжум яю шву Уа ть ж Бут ше МИш мох що йоду
Ве щу ЧУ Я «ЛО МКУ ІХ МЕЖ КІ с З НАШ дер фжк ти Піо хуя Фищук подо ех то у Я с схожа
ТОМУ Ж лж міш т гшВ се СКК рве НИ в зи М ДН ие З І НН по Уа ток сл Ох
БЖ а Б ЩО у АЛЯЮ БЕК Е Ки БЕХ ЗМ МеАЯХ ОБ КТ дз жо Ам кг охо шодо їх дек ко у Я Р ен ПМ ХЕХЕ аю щої ко НН НААН тео сх -х «кі іх М ле У
Уже хи жлкк Вище Теж ЖОВ; ЖК сх клни. «і «ж фі її щ бує Ффоузе Ток ря тд ОА У хз МООКИША му хх ОХ те ЇХ ЕЕ ТОД ОКА ЖАХ ОКА ЕЕ ОАЕ МЕНІ АК шо шви шок х
НЕ ВУШНІ СОН
ЖК шо ТЕ ж ке НК ухк я мен ен и о А о ВАНН си дфлюдето ОО їх УМ їх х- Стежжі Ак ш її Щи У КЕ ди їх ща МР Ше щі що Ми щі м кн с п в кп м п а пк В НЕ в В ЕІ МИ іш БМ БУ КК ж молю ще еко пт ІЗ я Си Я
М ХЕ ЕК
СД ті тохіх їисучу ЩЕ Жах тонн ЖЕ У ЛО ли 0ЖодУ ти ОРІ хх їду: НК туш ОТ ущхх а да Бе Кк ЕТ Бий М ОО хх Х ЩО МЯМО Бех МНК КРУ ХУТАаХ АЖ а ГУ КЕ,
АБИ Х ее оо - шко подхию о щ- мому у я ень не У ом о я х т пі Жак Щомту Тахаз Фі шу її ах щоках 0 Сб Зам жу Бк 3 і вро Мал. ту
КЗ ЖАХ ТА. Бе фо мащем АЖ АОЮ ЖК ЕХ Зх ЗЕ ОЯ ХХ ДЕК КА т ї ЩІ ФАК ММ сечоих ск пс
Ор МІ ОН ру КАС хх по ни нн и НЕ З НН п и НН Бл фодутє деки ТЕМ
ЧН У ХЕ. Ме о Щі й 3 Ко ухжх шт 15 Вб їла ріку бор бу ЗСЖ
ЖЕ ще ЖЖ МА ОМВК ЖЕК бари ОхОМЛЯ ЖЖ УМ ККУ мес Маю рек зм де ЖМХ шк Ох КО ПО их Оля КОЛЬ СУА
Же Же ТЕ ве вн и НВ НН НН я го кі ке Жду Д їж нев ШКех їм 5 щ5 ЗК жж щрожкаь тб вмх із хі ет ща їли Мерк Т сіщт
М КК ж ВАВ ЛАВ МЕ М ОО Я ма ЯК ж Ж ЖК А Си ож ме дод т, ОК А
КИ ЛА Боже се Жду Вфн би у ЕХ «ки кож -х кн и кое - ке що їх3 5 М Щи а п Ви З НН НН НН НК НН НК ННЯ «ку т шум ЗУ ВШ ек ж Вч шжжХ а ми ККш БО вшЦщ БЕЖ ему У сп ря січі
ЗЕ шко І «раху Щохт Іл ле о дущжу беж сраеє щу сі щі мн й ії Же би УЮ вух ЗЕ
Ока ни ли КЗ М НК МЕ В КЕ м кл В З В п М ЕЕ п М С п В В В В Я мот Кажан мож шу ОЛЯ чЯКЯХ
ОЇ І си МЕ
ХК ТК ХАТА
- ке шо Кк які еще «а оз з ДЖошее вх ща ше мох а не о ШЕ НО о ІА о А я о Ов Б Че НО НН о ВН ЗК НН ОН
МЕ АЖ АВ лах ОАЕ щеККК жк МО 13 тех АВІА ща УЖ КТ В Ж сах зЕЗЕч ЖИ сут сх ЩО ТІ
ЕК ТЕХ дя сш Фокс Кф ких болюче Ж я оши ЖЕ МУ Вина пн Ж зд СК шу М хх Моди бик о фати г щ їбатюх сЖапюю ЖЕ 2 дк ЗЕ щ є Миру до и У нн и НН Ж КО
ХМК ЖК ж ЖК ХХ КМУ у ЖАКА ББЖ АКВА ХА МОЖ м ЯЖЯЮ ЖК зи зай уж, тус т х УА: ме та ко С же ЖЕК ж Яд кох Уч ке Ж ХЕ Ух і. Ти - я М 2Кх. ло Кк тах «ах їм ар Ли 073 5 Ка її; фаз ик (34 Св сх щих Ме
Уж АТХ КЕ ЖУК КК АВ А їзАШ МИ шо са АВ ОК и ЮшЕ сулуху гукцих Ух
У в, Я щ Же
ДИНІ См То - й сх кох 2-х ня х У п ни не ж х шт - - Ух їх Мои жом І хи мм Лют ух То тем 3 жу у Мо шу люк лах Ті Ух І їх
ВІ ЖЕК ХА УА МО ДК Я МУ ШУ. Я МОМ ши ЖЕ ж сх хори ЛШ Ж У ху ува кожи «вом хх ОК ТЗ тах
БЖ Кх ЕЕ -у оощу дх чо. у чИчННя толо я «т сх - х з сх іх з т сб М от щах МИ редке ня смт їду тіючзуєю ЕТО г» міх бу хухх бах 07 Ух УМ. ут
ДЮ Ж ЖУЛЯ ТУ ж ше ЖК її КОЖ ОКО су ОКХ ХК МАЛО МУЛоТХ ЖЕ ЖІ зкилдх «пропо х рт чн Ів, Тов
Я г Кия ками бод КО ді уко У АК чи ж п АННИ Щоиже БУ нь пожя. Ук еННКУ шо дю х
Шк КЕ ках ННКчек, Ту бух щі фу Ж ЖІ: 35 ЖЕ мЕУ СКК тм тож ху
ЖК АД АЄ ША УКЖ ОДеЮМВАО Р АСТА ШАХИ МІ Ж А ЯК МОдЕшНИА АК ЖК Х ЖЕК ХАКА де ж ДАХИ сих зе «ет
НЯ ТВ Ід
ЕК ек ТМ та спі Жкже --х кеш я ШЕ Б Сяечни г Жоахьх СХ жи в со даум Ск т «жі Мч МК 5 її що ШО ОЗ з: лю УП ух У шк Ух оч Ма ра Ки ЗЖУЖЯ
Ко а а в ян В А ЕН НН ж КВ с и о КУ Х дО В ІМІЮ ЖМИ ЗМО ках зх суду туту, м Тк ЕТ щік
ІЗ КОЖ Се КК с, ть оч ННЯ мк п А ж Ух ТЕ ох хо - м мо Посмжуя
ЕП Ж Ж Б и ЇХ ек ЛИ У базу ГЛ дати ХШееую Пл щі Моз що Кл ІА тод уки кл ІА Му кА КеЯ ІЗ ку Ж ке ль о спи З Те СМ В СОНЯ ХО ЖЕЛЕ А ЖОМУ м ША х ке пк пох гр МО КВН
ТІ ЩОКИ ХА їх ЖУдеш МЧеж є ШТ ше шен ж Лу Ж феошкх Шужу їх Жан ко їЗажую Ж ема СПювьу Щі ч жен м ами и З М В М С М В В пок М Ст М М а В В я В Я ОН ЕМ вх ліз
З У їх сх : че се ух мл МУ ЩО
У ГОНКУ КАТА хо У шо ди жо Удлрє т т «хі Мах ОАЕ я у чи у: СУ п». ху
Мої 03 ев я он Жан М В ЕХ Кк фею Мах М бля бак Фр ЩМЕе ур їх ж ие ко км з Кн ки м а мк п М п п В а І ВС М о ХК КЛ и Ж и п МЕ КК МЕ їх Ж ох КК Х,
Кк, Зла ТК
УТ Мона ШК как битою 0 ЖК ож и уУчски севе и У нн нь Но Ул БОФе и Ук п ха
Кк ОМЯУ ке, тд ОА ЕК дл ее не В ТЛ уж КАН 21 З М ху
ЕЕ ОК КОМ Я АТ мох жо ж сТЬКАЯ шу ОХ ЖК кое КК З ИН
ТЕЖ РИБУ ре мли ЖЕ УКХ ОХ ех «Лу фе М її хю ТЕ
ХА ШЕ ШОМУ БМІМІЄ ММ Ж жа Кх є; я
ТК.
ХК т сх -у
ОХ ух СУ «тре 3 пе А че хоп рве ес ку
КИ я «сут ша
Ж Ах шмА ту баки єют ВУ УК МИ МУ ки А ВиЗИицИи БЕН
СК ДОЦ НИ ЖЖ БУКеТЕХ ше
Ж
КТК Фо с Жди м я МВ кеша:
ТК М утеккщіояих «ріки ко зе вашиві Бух жи м. у їзш пасаж сікУуЄИ БУД КВ УК
БУКА пошани ен фл Я ЕЛЕ ЕМО Є МУ ДЕН под ет ще
ОК Є Ж о вне в ро ШИ и НК Кон о НК НН ОН НК НН З ОК ИН Кк нн А В НЯ щат опа ТЕВ АХ СМ кОм ВМ ЛУ вк МОЖЕ Б КЖЕ хв о КІ Оу х г хг ї ї Тй хо МЕ
Ж ххх Бе ке дебет жи ту ну Ку мч жко хи Ж ою уче бкекк ФС дих скруи ИК вх тан в бана гл ФЛ тт під Схкщо МБ Бі ща Мих щу Вік Ки чл ЗК
Ме дн ре ОМ ма ЕКО ЖАВ БИ БЮ МУ ОЖУКАР ба КО МКК ФАК я Я х ї в; З сх -- 8 т
СНУ хг І
ККУ «Ух «КЕ сно м ис. ях, ще Люди Ух і отю ке ЗА Ж ож го УЖ ТЕО ня їх и ТОЮ. БУШОе т Ж хе ТЕХ ау х Шуми ОШИМет тот ті жо оквує мух Ух ких їх ПЦіжу У тю СТЬ пи
Ще вк Б БЖ ож ма. ли ж Ж їх КМ Бош ря Яви ду ХА х ДІ ОКХ
ТЕ Бе ЕК сем ше «КИ ях У хх че Ьх стю, ім. г М. СОшХ я К пет Цю Кк Я Го о їх
Те божу Се до аю бара: Щееу фу І Там ЖЕ Мн га Б Ок ух
ММ ме дю Аж Ам МЕМ Оу МОЖУ УМА ХМ ХДМА ЖК. СЕЛО МК ЕХО ЮК СЕМ ЖОЖУТЯ р Беж ЩІ
НУ ве М
Ки т. и м ХА н СК ЕЕ я, Кеш г що п ся ее ЛИЖ Ж Ск У Гая У ох аж ах и Б ех божу бом оку «ку іш Я. шу тлу мо їм до оту
ХЕ МАК ож ЕМО ОК ШЕ ЖУКА ЯМА МУ БАК ДОЮ СМеМИЬ МаАЖХ АЖ МО ЖЕ ЖК ЇХ у хут ух дет тя хх зх ху; я Н 25 М
БеУ ве ТУ М
Яхащов Я А тро КУ дню о кашу Ж єкт жк ЖЖ іо я о ЙТИ о зе В ек
Са бе блю у шому ЛК Же З ккру 02 хз ФЛ хо ск 0 0 оку суєх МЖержкх
ТЕЖ ЮТЬ КАЖЕ СЕ ККЄ УА ЛЬ шжЕКАО ЖК НЯ ОМ бій МІК ЖАХ БеЕЖР ЖИВ лм ЕВ -к гії су
М що що ее не нн НН зуп екран ан НЯ три УНН миля хе їх «шик жа Ж ошкрх рю. ор юю Ждаті х спро ке Фк Б
І ЩЕ жк дек жо ЇДИ Ще я ТК 53 шої пк ху прю кое в М з о а З МК і З В В В м В В В В В п п В ЕХ З З ЕЕ МЕ З ВЕН за БЕ чо
М НАУ ОКУ
ШТ ку Ол кущ КО їЗжх мех Ловмх тк ел НН Уж ліку тА ж ПИ КМ ж З ЕМеМ жк Жук у й ШТ де тому сб мкх між ЛЕ пкт: м Ех ВІ а т Ух Тече ої І жк У
МАМ МАТ АЖ ЗА еВ дим ж щА Ю Гая ДЖШАХ Бе АЮ ОКЖУЮ ОКХ ЖОУЖУХ ЖЖ. МИХ зак ож кВ
ААЕ ра Ка їж Шоеча В Еає чав Же? бах бурі ЖІ 35» Теща еру же Нею ба Іі ДЕ
БОНН ж М Ко М М З КН ВЕ ВН З о І М КК В ЕВ МЕ М І З А З М а ВЕ М ЕЕ ЕЕ очуаму "Ух ОО гчАечНКЯ ВККЯ На
І МЛ КЕ еУ пкачею тт ж и думи мирі. ус Юм лу. дж октх Миерисюю Уу Ох ее мн пит шШежчю їх фу ЩуМу тв ші щі аль щі шк дж Ди мк. БД сю лк
МЖК КА КУ мА АТХ т Ж СЖжкдюХ ОЖуща ЖИ ДІДУХ ОшОКККІ сМЖЕЖУЮ ОБЕКТАМ ША КИ 5, КО ж ОК м
КА ЖИТ «ЧЕТ ЩІ їж що ж юю ди сушу о Жаовоюу БИ а йде Ж жа Ж бокшії сп жом МА У ву
Ті щі ку хо Жкиюею ж ї лу ої су Бай би пу їн Її ух о ах я ОВ ВН ЗВ НН З ьо А УП Я ПИ В КА В КК ЕЕ З ПМК ВЕ М о Я З ЗА ВК КБ ик, зт тк
МД ди МОМ що ж жати Ж. о НК НК БА он Фуссдко МИ у ше Ше і ен і ох їкт Зам ща лим Кк Ж шк БР мо Зх жо (53 Шк і ють ко їв
СВ Ки ЗИ заТЯ ЗМК КК ок У ЗМИВ В ЗК ОК МЕ З А ОН ВОК о ЯКО М ЕВ М З З ВА В ОВ З С З В Ва
Есе т зх
ЖИМ КЛ АХ чо ж й ся і « с с. «сту У дя «М ке ач ть г Я Ж
Ка ам. ЖЖ уд я ше й дк з ОСТ єю Шк ЖК жодну. екю ТЕ п сь НЯ є ом Жудеї Же ту Ж о їм мах би ЖЖ бими Шахи МЕ Же флакщ сі по їх
ВО м КЕ Ск ФІ ФО КЕ СМ ЕВ ДЖЕ НК ша с КАК т х МНК Ж ЮХ. УМХ ЖИМУ. МАТОМ КЛ пох ОК их дор стук тих 1 а СКК Гр
МИ КОМІ шк і: у пе шк КИ ФІ м ЖІ Дт «хоче МЖК у ук ше Уж о тожкка
Ох хіх тож Да КН Мт у жу сїіащею жа ЛК Я хі не ке ТУ стю ТОК
ЕК Я шо КАСУ чада мли мк ж Ах ОКУ ел ДМ ДАЛИ ю ТЕ Ма А МЕ ту 215 ДЕК
Кен шк Х ПОМ дк ОМ пох о У НЕ ше бок. ЖК лам ЩО юх о о о НК
Шен (1 хх Тл ха Уж хх кл КЗ т х Та Зх оку ги ПЕ же же ТТ ЧК ННЯУ шЖЗЗ Бім бах Жхчз ЖК Ма Аз О БпХхя зе УА М же б КК Тл ЖК Б АМ
ЖЖ х ту ух сх У кт ще пихАт ей ФОТКУ ле коня иеЛЬ мо Бх УУЖ и ЖК ХХ. м. Ям М, з. Жосч Фо или КУ лока реч - НК тки я Хе м. тат і ща Ві р Ви аж КІ пі Майк І Ж Ех ян ЗУ бл Су меш Баш ЯК ва КЖ жк су Се ЖК су АК КУ КОЖ лип СЕ п пк хе кух
Ка «У ВПЛИ ту оз хх Му Ж дю шу Ж зу ході б окує Машу Мн Я а Маю я ха я у плюс ха хх хо їж З с гц Ті Між у ФК ж ше МЕМ ТІ хо ті б Ех на а а М М З и М м М ВК ОО М Км з п В ВК п м в М З МК п В В Я сот ух же
ЕУ ХЛ ІХ ЕК щх песх т ща 5 й А н не холи Жде «У пт кож око ше
Олі т хх КЛ ах ую Думу Жеми Кз ух ЕХ тях ЩІ їх їЕКих їм СббКре буюю гу і що КуУую
КІЗ М АЛІ Б БУ ВУ кВ ОМ ак ВЕ ВМО З КЕ СК ОК З МИ ЗМК В З З М КЗ Я Я ЗИМ КН ИН Я
Бе ск т
ОТ КЕ чна жи о фрази Бужнух Ж мо ет Ж Мане Ташу хх: Маму Ж мі Ма шо Кен ДО ко Мах бух
У Ма ЕК В ЗТ А УКХ МО Ку ОО ЖЖЕТ МО дж ТАЛУДе БЖ Жук АХ пе ша ско зе тут
БЕ ОК ЕН
КОЖ Ки З ха нн в ши НН и З А о АН ННЯ хан шудути СХХ м
Зак Мо шо їі даху щі М що єн ва щує Мову її 51 5 ет, ду МЕ Су
Ек НО КМ КМ У м В З С Я М ки М а и В В В В І МЕ І ЕК сту - т З Ж. сут
ЗМ КК «АТ Ба в я ВЕЖ ех йому пердем УЖ ТТЛ я ЖИ Дж х мл Ж ЗЕ лях м Бак Ч НШ не тпжх у ЛЕ Гу йожаа щанеч ЗЕ КщОВ Ол Кожух ЯКУ ЕЕ тА КОЖ я оон Я ЖЕ
ХТО г СКК лк БИК ЖЖ А дк АК ШМК ДОЮ ЗА. ЖЖ ДИМ ДеЖУЄХ Ох ПОМ сл г ТА «ВЕ «ЛУ «ВИК ч я сао щ їх ран ФК. Зх Хе с Що Ку ще Се хх Фе - ЕТ ух мох тки БЕ ЖЕ
Ту ша жу Бк біб о Жиму ЩІ З ру Ту ех йхооу у Поїлчх хїшу СЛУ КРИ кує С ЕХ су
МІ ЛА ж БА сш еВ ЮРКО АК ЗАТ М ЩИХ АТ де ЕМВ ж А А таж Же ва
Б хх БУК
АХ «ЛИМЕЇ «ЕХ т. Ж м я ЖЕ Є оч МО яки ЖЕ Ву їжу КУ Ж ет Ж ЩО я пихи ак Щомом тадче Ус їз ее Ех фо Ж в см фії як ВЕУ ії Хом 24 о Докчх ка ше а Ка дах ее М В а а Ж ЗМ М В ЗМ а С З М НО ЗМИВ ЕЕ
ОКА и Ку
НІ ТИЖ ЯКУ го ЖЖ «фут ж шк т жи Жах схожа Пух Жжазаю ОХ Б ух т є Жду У ею т1х їн Ва бек ж їх М кох лем ше кі тиша Яд а жУ Ті г
МБИМО фюАК у УВА КЕ А Ж УА ММК ОККО КОАКХ УЖ МО ЖІ ХЕКУКХ СР МО ХА УЮ се кох зт ЕЕ
ККУ ДК КЕ
Фоми Ще ЕХ о гола ху мк гм ТХ3а ект 22 875 ота лк бу Я бу
Фоми ет ЖІ гола хх Му ТГайлі їм т хода Ж жк божу ба ОК
Еш І ХАІ ЗА ЖК УХЕК МАЮ АБАЯ ЕМО са АХ ОД Я МмоАжАЖ МКМ А КМУ зна ща з ащ
Е с «х х «хк. зв ср и з и З ОН о А НН КЕ Я Я о
Фе ух Коша Ен ХА шк Зб І и а ОК я МІ що КИ и Кв І х ЛИж
ЖЖ ЩИХ Мп УНН И жо ж ях, ГУК З ЕХО ек ЖАВ их ЖОМУ Аж ОЖОКх кох ххх 3
Ба т хі 37
Зо А ЗЛУ
БУ рах т туя В шану Код МИ З о Мк о в о и АН НН НЯ
Мем Фа її жхії дове УНН З Тон Б а: їж Ме т ше ЕТ У щ їх
МЕ їЗ ЕІ ж ша Кс з Ім БА ОЕ В Жщч ЖЕ с УМО яма МОГ ет шк КЕ
БА: КАЛУ ОХ: хи лю х ож їбееі її Щі їй їохі: ща Таз іі Мку Дав жвк окт щі Мах бок бух
МЕЖ ж КЕ мкм Цим ж МО ї цовжЖО --е жйаЖ Ж: В Кун шк УДК ка, Я тх а
МО Ії я
ЖК ЕІ ;
Хату бббеух люк
ІА Хом Мк х - дж
У
Іо ко ТК оче «Ти єх У
З «Ж
ШИК, 2 «У ЕЗЯОУ
ІКАО ж «ПК ЖАВИ се Кк КУ
УЖ. ЕТ КН пок
Кт, ВЕбМмИйут щі
Ж ЖЖ ЮК КАЛ КК
ПУХУ ення
КК тм шух о жо зу ХМ ДЕКУ КОМ ОКХ не Шо хотіли кю й кети жк хом: КЕ зма Шу їжу тих сраату тих штук хіх міх Х, ря ІншжечЕ нини дон КА Мою УНН пес см У: ож ект хжзх
ВУАН ЗХ
ФМ «Ж тм - КУ пи о и ННЯ че я Ся ам НН ен Ул прдинюні пк осв ою Же Тек Бк уж КЛ жа МО ше Хі ЕІ слідує їх МКрщо ХМ ач пк ж
І КИ АЖ ща АЖ ек ЖК ЖАХ Ж АТА ММК ММА ОБЖ ж Я Ум ж КОМ
Б Кк З гу щу
Ех іже кх
Кя х: що М тх Ж же Ждути Ж Яд Ен В кю що ще жо Жмія Че т хм ож омяа бра бтяжк Ежх
Ша ФМ Же ЛК са ю ЗА ТЯ БУ ше ла ше ЖЕ А ВН ОА Ат ту ке Не. я: Я З: З
За з КЕ
УТ оем ее
Жахи (ми ЗХ да. с ке 1 Журн у ех Ті А ще лах Тор ам уник Бе дай сш Же МКК МК ХА лУ Е жа ша М жи ЖК Ж КУЧМА Ж Кс Ти Я.О в реч ж, ж
Ко З Ж
Мах У я
Ки оч у лих. ШК пок ох Ж т ки ЖЕК ж Я хи Тв и ших ГУКЗАХНИН Тюшх ох а їтісїУ бі бдУуг гІ31хї Тана Щіщ беж Муша СКРИую КЗ Кк СКМ Теж Хар беж лох Оу
Мих ЖОА ИШЕк ЗщКАЮ МАЮ Ту ТУ ОМ ЖК А. КБ ОА ТОСТІВ ве м о и и во в я КОМУ хх ФЕ РУ ра ж я тр ому жук же Са ех я ку Жов бохало фржж Я кх 3
Ма ЖЖ ха АЮ да МЕ СКК а ЖЕ жа ХМш КМ меж Бен ж Ом КУ
У зх. Е 5 З Я хх тут Ух г
БУ СЛУ ТУ БУ хе Я шк с ж ТЕ я. Лотки, ст -- СХ ж Лоу. Ех я и Межі Су и ж КЕ Жоихе. тех Тазі: ТІ їм ВМО щи Вк БЕ дл т Си 8 мо СУ Талі Ядра Фах Том ше Ме шт шим КЗ КТК Юм жо КУ ЖАЛЬ МЖК ана УА г ЖАХ х.лх ЕЗ ХЕ М Х що БК ХХ я щи Е их їх ду : -к з Ко ее т НЯ ха Уч мето її я шою 3 ЧИМ ух (ЗБ: Ес и й ха баса ШЛЕ ТИ ЗЕ щої хх ТУ УЮ У ях маш ма Жш АТ БМК ЮК се ХМ ес жк у УМ же М БЕК СККАЮ сБау 120 15 їз «АЖАК ХХ АсУ ш-кя Ме. ц ще НК ЗІ. сх кома ич МТ шия. соео ул прожи ХХ Ух дм. и чу МОЖ РАН Кок
Тож Жак пек руш тями: За Іа сумує ЩІ п ШК КК І ОК щи що щем
НЯ ЖК СЕК ОО БЖ Б ше ше МК хе ШК Я ТК ЖІ АВ ЕІ ЯМ ях ВЗ ХЕ КУ чек скохк г зх г; 135 зв хз
ЕКО; А шоу : не Я г й НУ сх я хх. я ке - ЧК стжеу Му кам Крах Кові йду б шою Ж тк Ж у їх ШУ «1 б сх ХЕ щі кН а з нн ке м ик в в Кп нн а и М п м п п м п п Ж п в в п В В НІ
ЕХ З з
Мам дл КК
Ко Я що ге г кос У жо жк га чок ц МО см уч жу я Ж ке зх Ж жі. РИ жов Хом Гх Я Око ЕХ НЯ тд хо Ото КІМ ду Ел ек ТО
Мк ху т ж Поу хи ОХ Мод В гі ХУ де У зе ТЕ: фгзжу жу
КО ГУ Мем шкі МшЬ МАМ Я У я жом. МОЖ АБ КК ОК КО ККУ У
ЗО С ТК О
ВЯ дО УЮ МЛ
Фе су. сх ж - ї ке н КОЖ и У де. жи ФУ ди ПКожят Мод Я ех: я шин. жд шк ЖК і Матея М З уд ЗЕ ХМ Хждтут ТО Б ажо ошк: Мошла ох б раує Ж
МИ ХМ У МКК ска А мим. ОдакйМ уд ле б АКТУ Ми А ОМ ях ку -Е ОКА А. дод дк док
Ка кя ШОТАХ ке їх сли ЖЕ ши слою ка А ща шо ша ха оо СЯ КВУ ЕИООООЖеду тику їх Кк
Ядте тих Ковх «ж її ща ія о ов у; Же сх бою Ж ху ЖйщО емо пек Же жу
Таж МІ КК Мел ше Я дю ЛАЛЮЮ КАХ ОХ З я Я Ме ско У ЗМК ІТ ОХ ЛУ 4 огрух дру ох іще типа хх
АЛУЮ КАЕжНК ОТИХ екю Ж о ою у ту З Ташех Кешу Я у 07155 кх що пом ох ща - ук Ж до М, хе їх Бу ЗВ їо б7ашіух Фк ах Ле Зх Меч жу хі В о і
В ЖАКА ОК ЩІК Мк УЛ ЖК ха кт КІ КЕ СОУ. Ха Ку ОМА ци Ех тугу,
ЗУ МІ МТ пе чНичИ зле с ххх ому як к т ш ке хх СК хо ма по о НИ
І бою бек 1 фе се їх Там стра ді Віа бек жк бере ах Та
Уа АК З ЧЕ НИ а М ЗА НМ КО НС НЕ В В А В М І В В в о М М ЕМ НИ В В В ЕВ
З г ле сх ж ОК ММА шк п и А КН А фею ку см ши ЗИ А Бо - шов пох ди, й г ге божу СТІ хх пол теж Шу томі Ку Зі базу Ме тот КУТ х й їїщ Толя Кн пах Бе Еве ум Бже еп жлХ Б СУ УпЛХ мем зай мав МА ДМА со рожа ЕІ Ех сю хіх кни ХУ и ХАЛЕ
Зкшеах Модуєю ЕХ хх Мн (УЛ хі Ж с є щодо млл кх т уч Жоахжу берих Шерех (Мі
ЩІ ТМ Гм оОлхР що 15 МХОКОдТ он ІНЬ У САЛА яки МІХ Ка БУ ща ги Баш НК б ха БР; АЖ їх У Ме Еш М ЖЖ юЖ ЗАС маю дк суку де
Са КУ г
КЗ УК «МАМ
Жук то буку бижує (73-х що ау З Фкечх ну Мо їж Кеш ба Ку вх БеМм о їбдцо бшк АЙ МАВ БЕК ЩА ШКО КІ М ЮК ше ще ме КУ
З я стул ки туту
МЕНЯ Ка ак ж ХХ ме евоя хи й кн «ЕЕ шо жін здо МН Мушу Жде ЖД о СКОБ що семи ж М мо їхущм жах «ту тишу Вашу Я у оо пух цент "Я УрУк ов сЯ У НЕ У ТО ді їх нео
МЕМ БИ т БМ МОЗ Бах ЖЖ окуУж УМО Ма В шлю я ее ЖМм шмЖ ОХ «ех ск жук ож
СК ОК х іх
ХО ЕХ Ж шт пеохм ШУ Ух ж ЖІ ше їх ик КК хо ЖИ мо по тк яко «ех 24
Зруюм її 5 ЇМ 32 Жінеу бом ШМозах сбйбюу баб Я ж туз Жеми фМет б Ба: Чек деку
МУ щи КОХ У що шк ее ЛЮ ЖК Ме У ЕЕ ект Ж м УВАМО АЛІ МОЖ Ми ух шх пут її лю
Б ОХ А
ХОЖМ ака «МО ух п не я до ск «х «х -у з чу о ох хх Фое ох
Тл тік М шлю фо с жк кни фас фі Ми Ж ж и нн НН
Тхлі жі гаї боту Чахтк с їк фе р: тії б Ж За Жук й щр ств М у хидо ХК осн и и нн м з т п М З СЕ ще оса ово лаАш с БО БУК УК ЯК с срок уч усу
ДК Кх ОК СУ У «КЗ ОК ЕКОН Ех М
Еко фодоує ИМЯ щі ОМ жк АС ЮК що Щі УМ их люди СМ ож у ук моделю МУ
ТХ хе кує Я жу з ТІВ єх Ж ща ж ех соя зх Щех зе де тод КУ
ІІ ЗК а ЮІМмХ З КА Ох Кж шо ЩА МО мит ма Ба же шЖА ЗАМ вч суху чт я З їх
ЕК М «ВЛУК тою божу фо боті дк ат саше ко мої м Маки М ях хи т ших Зх ук
Та: бю тей тм ОЗ о спа уж її щі Бім би ми 14 щі Беж труб ках
ХЕ АХ ШОМТДО ох А мА Оу Вот КН мож Ух МТМ А Ж ОАКК дж ДІ Кк
Бек ЗІ ва «ВАМ КЗ Я гук дек У ли жде божу КОбах БТ я, тот укожчим б ж уві ххх пен нн о ті ЗО їх тез що КО в сі тні дк БІ т МО од ТЕ зах Еї -ій в ей Ме да бБа сі їні Бк пайок УЗА ВЕ Бей осмос
Е К Кх сгуоте же вит «м
Кеня з жеякоя
ВХ ки веж ту Її ку Жук МУЗ ут давл Зк балу М т во ех ЗЕ ек Фі ІЗ Ох тк паж Сх ох ОЗ Щемк Ма щих Туш здо ТЕХ ді здо їщ іа щі: пек
МАХ АОС я КМ ВУЖ ЖК МІХ УЖ МИ жк из М о В ХУ ЗК В а КО Я уки сут орех ее У ЗХ мли МОХ екю ох - х с ре Фу У сек Хо ха А маже Моя ук ях Мо я: руш Мих хну поемі Жуан ку ХВ 0 Хату - г В с
Ук Тр фі Ж зе ух 21 у ШУ: Поч им о Тему: КЕ Кан Жах Тов 15 щі д
МО А ЕХ САТ МОЖ ОКУ ЮХ ке МОХ мА шок ЖАКА ШОКУ МИШАХ Юта ОМ их УК ак хг леж Дю «МІ. хх шкі. шок ді я ех хх Ам ни нн НН У я моих жо шк їх ра о а Кк ек У А ВЕ Кар НН В Ах о З 5 є І 1 їх Та щі У лхзщо Б іх їу
ЖЕ МОХ х КІВ Ам БУМ ІЮ КА ЖМЕЖ МЕжК ж МАЛ ЗАТВ НО жк м МАМО КАК аг Св я ц
ЗМУ АЕН Я
Фа ОВ йіних Лу дних Ше Жук йікУУ ЧебвеУ сба дж ЛЬ БО о Мт УВК МК ОКУ сОБЕ МАМ
Аа ККУ ее ОК
Ка ТЕХ ка Ах ХУ
КУ КІ
«ММ я ень Я и жнЬЯ
ЖК мкА
Уч ос зику кт к кое типа их ж ють ЩОКА КІС
Ох ги
Жак Лю ноя УЖ ий муху тв пли Ки
С х ОК А У ху ЕК ІМО ВИК кА КТ
І В
АТАК ЛЬ з тк ко ве їз «ех Дах см СП 4
БАМОЖ ЖВК дж ду
Кт ї х
ЕК ср хх же
Качан 4
Жди КОЖ Що «Ех шт де КЕ АКА м сек от
ФЛ нта мц
Он МУ мя
ОМ ли,
КВ кутю поршня
ФОКС птЕМОЛ ККД ПИ
КИ Ах ТВЕН ПЕКИ коли БК
КН же
Ми ех о ИН Я
ЖК МАМУ ЖУКА АеКОЯ ї си Ку Ед кА «ЗХ са, «2 сл ее х
ВК х
УМ жк пт
Кк КІС
ФК сухе ча КУТАХ
УК УЮ у «ем
ОТ Ух УТ чи г. п Ех он вро уже ХІІ КА КЕ ТКА КА с Кт х зх
БЕН «КУ
Хюжлує хх Му ж КИ уете бля хіх Ку у
МОМ КО ВЗА ЩІ
Ь х ї І
Х -Х с мух СЕ хяшв
З нечя зв
ВОК І
ЖК Ка
ЗНУ ще хОЖХ КК ших ою шЖумия
КЕ ми Ки соя іс й смогу хіх ВЕ 0 Ухечадмомь Уфмотухе Ух суті ЩЕ
Хек я МІ АЖУНТ вм МОм ЗАКО ІОН Ж ї. х
От хх ех. ие сей ою Ж У Ух
Ж 0 МІНА КЕ СМ
Овен ТЕХ їх а и Ше НЕ НУ жене х сени ке їх г. ще щи шт
НОЯ їх ІФ ЖК В ОМОДЮВ ХЕ ТИНИ Її щі со се М вже лю цеви ХХ СМ х
БОКИ
«и» щі баси в м 2 М щОожЖе ЗаміЩажи Моз Ж «ВО «ВМ шійо Безпека каш Б. ИЙ
КИ Ж вжЕуже заміщати с аа х сан сеї Мав бєелиОКв сег ТЕ, ЕЕ ше М моще ЗІ с ем рес «ШЕ йшов бюд «Шах яр. «і Х ее заміщати ЩО т
ХЕ ках «міх щі гЕеВкиКе «3» 18,01 «їх ХХ може Заміна М о авш ї ем «хі ще Кедка киеше ЕВЕР. . 1
ЛЕК ру щх дичних силі і мех я МИ дефіня КХ и сх МИМО ПЕЧАМИ Ю.О ЛИ З ких ие
ЕК т ща охси Жук зах
УЖ Сх ХМ ЛЕО ОХ хай ВЖК. ЯКІ кишка» Ж може замішално ос ас Б кю чжиіт щас Кеацке «нев (а, Я «Еш Ж вВОже защмійати ж ау
КТ ТЕ я кі щі бавсцеЕ «ав» Яд. 4 «МОЇМ Ж вемюе заміщати Бо аічх М сх «ші щіВИ беаКиЕв и ИН ВН «й» Ж вк Замішван Х ах Є жеЖоМ уч, су кю КА «кіш щЕщо бвВанЕВ «ше НК. УЗ шко х Ж мОжи жеМміша вм 5 ана
Ех іх щі ев цЕ «ВУХ 103.60 «ий ХХ може заміщати К ан хи як ее
КН ко у Кох, сеї Хо ча г.
СТ я поси Защох в кюух лпеку юю ІНлЖИМ ММ УКХ их ик ою, кох ел
ОКО ля гі 11 куди КК кое ХХ ААУ
МОХИ туз г «ха: сзізка і жом ЇЇ сіна ї «І Я а о ОО ОН НН ННЯ ож и соя вки х СЕ п же. Км ох сх сх Б дк зе хом, хо м «У ка
Бйхжух Жщоа гм Жид вк її У Му жи МІЖ до їм Жощ щі шЕУю ую Бі
МЕ ФО сх. 2 ОЖЖВКО За ЖЕ СХ МО Я ЖИ мах склі я ж жу ч Кк г « ї х у жу ІТ їх с ен І НК Не Ж дю пек Мох Ж Жак Хо хм Жах МО дже ох нюх хе І ри ті да сс АЖ їх Зх ее ТбжО Ж ТК ЗЕ во а дай Сп Ма ха С пев лів вжК МУ ЗЕ зе век Бу Ум сх худ си я Ек М
Жди МОНО жу и о Ну а и пе не и З На НК НИ НК та Я тост Од те тк я ДА Живи Ко жи Деу КИ Ух ОЕМ ши ОКО тек 1 ИК ГК по
МЕНА ЖЕК КД ЮК цкАТЬ ха муш ЕК У МмУуЖ се НИ мМ еВ БАНЯ ОВ чт Кк хх
Оу и Я: «ху Мк Ша хо МулюЮчи ЗМ у Уоитнкя т мі Жежиз їЗлоше ЗКщ каже дю нн не НН НАННЯ
АЖ ЗК А ТЕ МК Од и ЗУ мих Мах ж ШОВК ХО Кт са Ух КЗ ос. Мох ОК
Сое т ЖІ вОж Ме КУ
За М ше де 1 о бах Мох Фр МУК Тоді МЕ СК хо «их уче Жора Ж жу ба 1 Мох 1-х Ко щі УКХ Ж То пе Ід ом ХА ее НЕ ие ь нка
Ж ему ВЖК СА КЕР ФМ Я ХІК мем ж Ме ОО ЯМ КАМ ух МК ще ту «зх КК
ГУ Ух Зх ТІ
Ба КУ Ка пе паж е шк ШЬ І УЯУНе» сн Же Жуан «Ж ж Ж м А Кк «лі Мих Ех Х т тії ж д щід кре шк Ма д Іе аж ях її Мт Ка ж ут аАКю ПОЕТ тм м МО ТО КЕ БК АК ж ж За ут МАМУ ЗАЛА ЗТ М маш Ін ЖК шу ХХІХ ох тк тк
Ко» що я сію Шу у як ТО шк ММ Ху ж ов НЕ МН Я ее тм лі мо Ждщд гі тк хди Ждщ ТАКЕ Ті фах їж пе Бі мае па жиЖ аа май А А мух кщ зх хг ТЕХ
ДЕТЯ КО
«КВ У
ДК ме ее зх кими ЯН ку ук уча
КВ Ки ше ик ее имету рек
Еш 0 НЕ УХИМ мер вед оо ех м Я . - нем кх чия й чи ку ет соту щем дк Мем Мову муХ мамі У
ООН я ка а ЗМОВУ: ОНИ ВЕ КМ ОЗ НІКА ТЕХ хоч тх сану с: с зе НМ нь - «4 пк зк К пз -т-г сх хя - я ах пох Е чи ох тЗ а Мам Ма Уже вух Тему дахи бдшиемо бує деку Мк ДО ка» Лтд щі хх
ЖАХ КЗ Ко п МЕ я М ВК У В В я А З а я КК М сс ВА ос В С а о М о М ЗО МО з Я 4 Як 3 х НУ 15 х ке МУ доз
ТІ Зкесу їх ясмішею СО ух МУюю таж ок КО Шев Жоєуєу лохе пам даму Жук Миж у теж се І: Ех ух а ен КИ ие х Кк хх хз ХУ их
ЖАХ нан З ше ж и м я І Ку Я я ох а ж на М а В М ОЗ МЕ п С З В В Я сх ук ж ск сх У ЕТ
КУ Хей КМ
З ех Бої мк бЧіххм дю БАС жу лодки ТИ КО сті ху Ти ді фен їимах Теми Там ТІ
АК Є.А МК Ка УОшИ хх У ОМКАСЕХ АТХ КД ДКХ ЮК, ху ЖОВ Мк м ФМ АХ МК АЯМИ ХХ ДОЮХЕ -е Кк СУЯ ге тА ож
Ту ж па У ЕК ду бод ВО юю Ж ху пк ХЕ «ие ож их ХЖЕМенщо Шах ж її 4
Пи Са КТ шо мух Саух сем Її щу м ох пт Оса жи пили МОУ Х їх
КЕ ВЖЕ СЕК ММ ме ЕК ЗАЛОМ ЖАЛО ЖИ ЖУКА МК СЗШ МОУ ах - їх Ії
А ХО У
Ки ж пом ння М дух а ЖУК ду Хо м Ук Ук я ож КЕУЗ хх я я соня Зоя. Ох ч Жжх
Уршк оо сш пр км щік УТ: у пкеА зжкя ї їх ОН т.і жо у ут
ЖЕ їх фш ХК бю Ср: КК ОБЖ СХТЕК ДУХ ВУЖ ХОДІВ ХВ ХХ ТК леж тва г КУ
Ох Ж т ЩІ шо з 2 БО тех за Му хв с «ссжю ин не а Но в НЕ р НН НО НН я Шкоду Коша
ОА ЧК Х ФАО АВ СЕТ К ЕК КК УМ КАТЮ бадях МОБ мА У У шо се п - ку ті
ХО ЩІ т.
Мох реж ХЕ
Зою рем с хх ЕР кі ШОУ хі є Жди За а би хи
КУ О ЖЕ ЗОМ ХА ЖОМкА У МАУ дах ЖК ІїБАОМО А Ж АЮ ХУ ик Вк
Ах ДМ
Кок а вики «І
КУЛЬ з ук
УВС ДН ДЯ ТЗ бек я МОЯ кер о уст хе
Кох ЕешКчя
МЕ тя зихуєк Кк вия А Кит УМ ЗЕхк ееохулють ке М ке о джек денних потече коки и єкти ик чу.
УТ Уход пр ух і ска Еаі сто рхтк уж дховірттщвахої ЩЕ божу ки и МАК МИИИКМУУЮЕХУХ ОДуХРЮЧЕЖЕХ ТЕМУ МК ІК УКІДУЮ М ДАК дод жк сх ем ж ія їщ
Жокх Ко ж сх мує Мр а Же бах сіб Мах боєм бою ДЛ оо ока уз ФО хх
Мер о я МАК ОКНЕЄ ЗК ЗАТЕ ЖК Еш МЖК жи БНЯ ХУ жу ЕК Км АХ 4 к ж У.
З С КІ З
Кя ХУ ле ХУ їб«їех би а Яжвиу Ж б ону бич фбатох о Воитжх МО що бах Ж духу Яфиху Ст кю бух Ж глум кує
КК м ВХ ЖВАВО ДО ОЖЛРК хо УДЕ БК ЕМ хе КЕ дяк ЗТ Од ах ж КУ х
МА В Угу жа БУ ек
Ж мк щ Жук КА Ж ую ле чин кн кн НН НН и НН
Таж Мо сш ба жд ж ГЛ бом ФК тВ УЛ Х Зишш МД ше. Ти Ба бом СЕ ТЕХ
КК ям дю АЖ М ЖАХ МАМІ ЛУ М БЕ я Ж ух АК шал леж ММ АКшАК АХ «й ж ке
С КО дл хх М чх с ко ЩО пре Фчижсин ЩИХ лк ик УТ их ШФедаоюх. ЖЖ жа Ки Ху Фхи я кутах Ту, ет Птах хх ЖК аа фам їі Куц лм у тома ща Ж дім БІ о ЗЕ 0 Жим жу км би ЕІ ки м о м км м В м о з М М НИ З Е.Б М М ЕВ В п м СЕ М І З НЕ В хх ШЕ шгу
АХ Зах во
Ух пт 5 Ах - хх й - хУухї. г се ох сх. ще я од їх с
Жим іх Жрю 01 5 СОУ шт Би ббвре бю бу 1 ж Маки Сід х Юм (85 Шеча
СЕК ху КЗ я ОХ У МІВ ОО Єх ле Мі ВЕ ПЕН КЛЕМ дБ ЕК ІМК М ЗА МИ у яку ух хр КК
Бор хг їх У
ХХ: їх БІ щОЄ
ТЗ Кам хв Хі мі сб че ба т хм Я ож З хх її бе буром фо «ДИМ ОЩ ЖХ У ОКУ Т КАХ. МОЖ КОЖ ек о оо о Я а ВК п з и о я ВЗ Я ЗК їх. ши ОО АК КХ мкл се Ох
МТУ ТО І
УЖ. жУю Св. ль шкя я Ек то п ок Я у оди йтре о Шкуюю ЇЇ к кхх 2 кує тиж щі Ім ж ТУЮ п мих В Ва ЗМ ЛЬ ЗІ ВА Сп ЗО Сп М о и У МИ МА НА Ь дих мк,
Аа МИ ник ех че
ЗВ т ху ЖЕ
НА чих чу же хх їх
ЗК КО Дя І:
ХК ку У
ККУ ТЕ
Же я ОК да нич ч я
КЕ мит ех штучна мОтЕ ТЕ Тучи и ХХ пе еь юмор уєю тім іх гру зжк КІ суреж жовто жи кві тд
ККУ У МЕДИ ЛІМУВІ ВІЖУВХ ІАЕ ШРІ ККУ СКВЕЕІН УМ
ВО У
ОХ «ЛЕ
Мода СУ с що КОХ «шдоїм З дики Фу ЖЕ дк брлдюнй Ше ОР су м ших
Моєнех Ех Как в Же Жшею а ех Біди Мі Бодвах біду Бо са що. ВЕ
ХАТИ МАЮ САКЕ. ЩЕ АКА ЖК АЖ ж МЕЖ ЗМК Же БВ ЩА же МК СУМА «Б 4 щ 18 їх
Х го дом М пода Я ХЕ Бан ХХ З жу тм що ЛВ одну Ста КЕ 3 ше м бук Може ввоОз од Уущі Таж ТІ бви С чещв оеМм а шал ши в Мол ЕК ми СХ х вин З е й У ван й я не КТК. лИАСтИою нн ОД
БЖ п Б кА я Я ож. У УЖжяиНих, Тра ик я Хо ч со КАК жк т. дя ин ГК М. її Кая х х я як
ЕК 2 ду УЖ ТИ їх гоже Тож тую ЕХ хе т олеку с ее НИ ННЯ ск щі: ЛІ ТККх 7 її Оу си ши хх сш щої іч пШМ їм ба З
ММ ФАК КК КК БУВ АЖ ОМ ЖК УЮ му Ж ЕК МИЖІУ УМА МАЮ ДОМ з ау а « Б З
Ж М хюхю С я ХА юю ТМ де Лк ях Ва е су Ах ан НЯ Зх Жито МЕ ГУ
ТЕЖ ЕХ З ми ДЗ пра док ОН НН сплю ом ЩЕ ших КУ Ми хх
ДОМ МУКИКО АС ху ди ОК жо ще ХХ ЛУ жд ТЕЖ Фа КІХУ А кї ТАМИ ОЛУЖТО св п «5 ще
АК ме Банан он ен о а НК НН я ННЯ про, су. меч с фест уд Ук Я сода їх» ЗМК Моюу ДМ СМР Ж ую. Ху хо куди бек ска Є кни
ВЖЕ ОС ха Не М у М у М М З М С З МАЯ Ос р З Не С я Я КУ А ек Я як, тк
ХК Ка УТ М ту Ж ДЕ Ж уєш дари дю ШЕ му Шоу Вас М щу Ж Жид жо
МОМ БЖ ЖЕ ЖК ЖЖ Же СК АЖ О оМЕ МАЯ М а ЩЕ ЗЕД ТА САМО У КЕ и
ЩЕ Та ТЕЖ
М ТЕ ЛЕ тех жі Я хх ше аою лику хх чо. І, Жак со хх
РУ лез ж ши СВ ек да ТЕТУ і-й дк
ЖЖ ДАМУ ЗК АЖ ши Ж ВК Оу пйОООЖЯВ А ше ОМ Ж кох где зн ЗК ау МКУ «ТК Б
Тед ММ ТМ
КУН орех ше я ие пор торгу
ЗЕ Дудии ХОКУ ше МК Км его т «Ух їх промо содо М МЕККА ТО
Диня
А
Я КТ Тек вові ІЕМ вручав бе ме пащі Сех ва ЖЕХВ ЕМ КАМ Т ЕМ ЖИМ ОУЕН ЖИ КАЛ ЮЧ ІЕЕ ВІ КЛ КЕТУ ї 2 Я с ВЕУ Кв
БЕК НЯ
Федюк Су се АН Тк ж. щу екю ДО шоуко 0 л ххх КЛ у или жк Ж ж
Тек ЖЖ Оу сх І я НАНУ їжюж же уж шле кю БО т ух тот аж ж Вт мн Хо : жо
ЖАХ ї ЖЖ Аж ЗМО СЕРА лк А Ош АМЖУ ТЕЕ шва ДУ сх СД ПМ УА їх х т т хх ке
Х нем Кк ОХ бах Мен Мо ЕК жом Мк фо ок ВИ о не У НА Не ШЖижю юс ож ТК
Фу ши ХедЕ ї пкт Коко МтКюх чт др Я Хе бики су Хошк оетуу под Тих
Сея ОК ОМ М о п М у п о о с М В З В М в В В КЕ В Я СВ ВК М ВАХ ке ки ух
М я М
Он пекли Касети А ші Хо Фухетмо СУ ЛЮ і ж т мо суки Кит ст коли Ж З
ЦИ За поту Лк КЕ Б ж ложки Ще Її АС току ХЕдО ДШЕаЕ тоже ку «ект ЛУК У
МЕМ АХ ХХ ія ДЖ ОКХ им ЕХ ОК З МАЯ Жак ЖАЛЮ Я ЖИ їх ЩА ОЛІЄЮ ДОДОМУ с в для их й й сх Я 5
Мо сх. СИЧ сх «кі ки х ху яд я Уд, ГОДИНИ сх 4 ко хх н шо х он ни Не НО НН А їх «т ЗК уж о бл нку Жах ще
КК Кк х ж Ку З ШИ ТУ ж ОК К.Л во Ж УКХ. СЯ КК В КК,
ЖЖ мМ ММ СЯЄ ЖЕК ДАХ БЖ ЖОВ ОКХ я ЖЕО ЖОММО ОК Вр КИ ж ху ях ще ШК:
ЕМ и Божу ше ен и нн НН з «Хе ко У їх джек, туя Хол УЖ дою «де лк Жеху 28 ше ЖК Зеуу хи Мб Тоді я ши рах ока Косктї сл фен «ЖК Б ЖЕНА КУ СА КЕЖО ЯКУ ОХ СМАК О ХИЯБАЮ ЕТ СМАК СВ ДМА МКК МЕЖ яви пи ЕК шк
І КД ру ІМ укл ж чи «ку як - по яки ок -4 т -
Тс: ще м Бі РМ блю паю їбаму ЗУ дО 133 5 ВЕБ КО сбаюум дура Жоедя а я М В а нн В М В ЗК ЗМ С ЖЕО МВКР ХЛ КК УЮ ТРЛОХУ КУА СК ХО БЕЖУ МИ сут до Й що
Зх с се,
ЕН М МО зе би и пу ук у м. Фа хв жу дом тонко же СБУ Б хх кі 3 у Має жилі Ха сті т де топ
МАК ЖЕКу ХА ОХ З У. Х А му що шадУу до Ву ХЕ яті срок пи у
М АТ я ж еВ й
КА и рок
Меч зору
КИЙ КІ яром КК
КИ ях ме в Ох шо хм тя Мих
Ко и КРЖУ ЧІ куту туя
БОКИ дик ча хк ух - Й х кДж нене о и он НН
Ко и ДЕН ЕМЕІЕ М ІАВМ ДУСНяВ ЯМ ИМЕНИ ДЕ ГЕ
ХО гу Бе
АНЯ ії х кН чех ях ск с - ве г « : Я бе тк То ноу м и Же ЇЖУ си Ж жхіх ЖЖ КО кош ТК Ж,
М ВА ША АЖ УДК КВ ще ю ЖК ХМ МО ЖЕ ПЕНЯ ЗЕ іт ше щі У
ВУ ч - 4 гу я ж ї хо т т ях
А х Ах я мо - пе КК сх як - що г « т -
Тут ща ої тую їх ни я ки НО о НН НН ел. з ш ми Ж Бе
ТЕ БЖ жА АЛЬ АЖ АК -ЖВ ЗК Ва шк ВМО ЮК Кая мех душе ХЕ а Ех г хи до Сн х - с Я ке з я с с шою Ж А бйих бурю ЖИ ко Хокюкши смбуке ге У ях Жітею Сх з т. кл км щі Няня с СМ о З НЯ ак КИ у НИ У о нн о ЗІ зе НН я НН о я НН КН
МЕ МК НЕ, У ку о а о А о о ХМК МІ Мих НК НОЯ ПД МАХ КОДИ ї М АК УЖ С хх Же ж МУ МЖле МТК КМ ОдАЖ ль БАКА ЛИШ АХ КОДАХ ох «хх хх
Ме 5 З щхжах фак КЗ щ хе ж кер ух ях чЕАЛ т пе Я Е - бе дУК ік ау бе їм 1 ще іх ТЕЖ иа ЗК їїких Тілько Ж хх
ЖЕ МА АКА У КТК АБС МУ Сеть МЖК пам шк Кс Х Кв бок ем спа кг Ох ЩІ
Ка МАЯ мМ она нн А В А з т мур Ж -хх чу г с - ;.
Ха 0 їх Жду ЇМ Її де бок фркеух ЗМ ках о Жошіх Стє їж Ж бика Ж ФВ теж
КОМ В У ДМ в Та СИМ ХА СУ ТЕХ маш СВК и ОА ЕХ
МК ху М МАМ Ж: сх жен еВ я м З ЗМ В С А В М З ЗМ ВЕК У М НК где де че шк ух се З що КД ХХ Ми деку як. кі т пох сг є ях я соя з : ща . я пок. хоккию Увесь но КК но З яко В їж 12 хх те
Ті: башт» ЗБщії ОК Не ти ух хг стилю Їж КУ: 1:55 323 5 КІ ср ж ее КН хом Ж ю ЄЕС КУ ІБК ж ж А хеухх МЕМ хм пай мав А КУ сю тими щої г пр
ЕН АХ ЩА нях То якіх М -Я ж ех ті ж оч - х кіс їм й жк Тл кі ст Ек Мо Ж зго тах Ж шо б дуУхУ
АБС ОК ваш шАШЖ А ЖЕ Ммшш УФХ А ха Ву
Х З І; і сх. ЕКО ДК ху
ЕІ З ча ЛИХ у я ок Ат Беж
ТК ня З ж, «11» ТК
Мах я КУН кА їх тУЮИИ
Бу КМ хр ту й ка ДІМ
МК я ШУ чи ссууюлух,
МИ ож ку - КУ х сх
ОКХ Ті сжкди мм Мед сем міна БУ окт МК КЛІК ЖаКАМ ДУШІ ОКЖИ КК ІЧ лами и «Ко по
КОЖ КИ ще
КМУ хх ща а с пе шкалу їх пт У -е аз хх гу ре йо Чаї біт тТіщд о ббюье пів шок ферум Бек бак Та Ша е ія бик би іх
ДАЕ Ж ЖАХ АБО дІЖК ЖАЛЮ УБЕ ЖЕ М ЖК ММ сх Ох В НЕ -к що х 7
Ії їх 4 шк
Ії щ 3 ху
Х я: Ми ХЕ зн ачтих Мі Ж шу ХММах бі М ко Що би Жах Жидуюк Ж бує ЖК угш Мхр
Мохікх шти Е ПЕК Ті хх пт т оуєи іже КОЖ її тм б хУю її Пи тах Зх
ЖЕ УК Ж АК АОС ККУ ЖЕО ЖК Кю ви МУ сек АФ ЗЕ муж КУ
Іх ях Ж, Їх ях. я ЗИ меш -к а на Ач И т о ЧУ ко и чу нан - я
Тих їду Таз и дж ТІ ТУ 3 ик їх Мжеим М ж тах Ух Щи ти що Тату Ку тік:
МЕжщ я шу ух МБ см що шк МО КОКО ОЗЕМА ТМ М ММ УЮ меш ОМ КД жУЕ І СЯ реше я п «да юю Ж ку шию фран Ж жі умо Ж я хх жу Жах бук Жвих бик 14 «рашу июю ЖІ ою ХУ шо Жов 01 т бум ВО и щі жахіття Хе фу ХК им сш
МЖК ОК ху МНК АТАК ЦЕНА ЗАТ Ме су УА ЖК УВА ДАК же ск БА у шо шт ше
Ві ОЗ ЩО баню ЕТ бан Ж ду Су Мова Жах ПМ; Ка ВМ Ех де Саша З зів ЇХ Шу
ЗК ЗАМ ах АЛ КЕ ЖЕ ЖТМО БУК ЗНМ СХТУМ КАЖЕ СОЮ ЗУБ їз КУ
Ба хуя сук, ск
ХЕ Ех я :
ЕХ Сан їх А па фс ж В Мусю М Жах в м Я ж 2-1 буки тази Ж
ТЗ ха одежу 3 Ж ях М ує Ме ос біз її Я ух 0 хе Щ23 «3 Б 5 ух пек Жах
ЦБ ше ЗМАЖКА СУК Ж ОО Ющук Ко ББАТЬ зи ЖЕ БЕБ ал у ЖЖ КК вих цк «а дру сом о Жевчєи ОХ ж Ж я, т лу МКь у Чохехі Зфіж й фл їх Ж шу ляхи
ЖЖЕК ЖЯМа ме У АСУ КА ОБЖ К Мо МІ А шХ т МУ «шу хх
НА Іа
АТАКА МАЙ се тк дО еще я КУ ше чия дика
АТО ху СЕК
Б А Ж ЯКІ ке ки ЕМ
Од СУ Х «м зт и кі В
КВ МКК
«Те
ЖАХУ
Корок Ши скит ж сег ре я держ зни склу дики Ще
ЗНОВ З Шолом гама жі ічКЦюткі: удо МИХ «ХВ ПК ЛО МІМвиш ОД ЕВ КшИКЬ МЛН ТІ жим ах
ЯМ Я
Си я У кре НИ ке Ук ке ми ман о НН х ОН я
З кая я Кок ІН Пе їх Же ку їм Щит хх Пк НИК ж в ЛеЕнАЧНИТІ ж ше АТ КД СЖККМО ект ЕК КІВ ЗМО МИХ ІА ЕМ ЖАН ЕЛ Же ца КЗ і: с з 15
Ж же я ях
Коди Как Ес МУКУ их ке Ие рОчх ач Соки. УШИНя ди СЕМ З Кк ро Кс Хлх ря пк ж ючи
Хтжх Шум Зкщ тр ТЗ жк беж тк Тож Тако баках Зх; году тд» ух с НН
ДІМ ЖК ж х ТЕ Ж ЛУ Ол Х її ТАМ МИХ ем МІК І ВКМ Ум АХ єхіх тек о
ІЗ Ку хе щї? А ве тема Й ек Ферум Я ен фо фониш Ж енку сф базу щі За фо Том: бю СОТ Ех
Мацола ЖЖ ОБЖ К о АВ САТ БУВ КЕ БЖ ЗЕ ЗК ЖЕК пе Б меш КА
БО хг й
ЛЕ ОК ЗХ см чия Шк или УХУК - м ци шли УКХ меч дай Сток тоскеттю Мих ухили шх «ех МЮУ 35 юю СЄкує Жим С жу бщат ПІТ лі фата жу Ух що А Ме БАЗ
ЖЖ ВК м с ее и С МЕ я З М а о В ВМ а С ЗМ КВ Й В В З ВК В З ВО КЕ З
Гея що І і с ЕОМ
МА ТЕ ки са ЕХ як сбшею Її З хх Урни ш ЖК бе тах яз жо без Шев Муз лій ЕТ ку Щ кт м В В и я ин и о а в и м и м кн, НЕ ла п, ЗМ ик, нн и м ЕЕ В ее сеї мя ЩЕ кож Б Її А т х хх ж пише Жххе Жайчую Кт не МАНІ з Ж УЖ хо св Меузує Ж осклх
КАВУН Кн нн не КН На 3 жі У Ма з Міф іо пе Ще кл завод Ума АЖ СБК Ж УЖ МУушо аТь АТ МА ТЕ АВ ОСЮ ЖК ЖЕО СБ я до мот
Вк НЕ ТЕТ
Ще Ж Б щ- тк сх Я Ж хе г яко хх -
ЧК ких як Ж ху ТІ лю хх З ххх
КО ІНК ОУ Х ж Ши и Не М я М м мн ЕЕ М М І ого З
КЕ ПА
А М зем щи и
ОК БУ о ВО зкуо яті они ья ІДЕЯ че ДН и
МУК Кук де УМ
КК М
Ач ще
ШО скло
АК ДА КМУ
Че
ШОК
Жуки я
Фа, шу ММ зумів те ударі уко
ТК КА ПМЖ ДВО МТРЕКІХМУк ОДУТУТУЮКТУХ МКК ГеМИдОши МВТ Ь Сх
З пк М дод «ВІН КОН
ЗЕ ся прог яку моя у с ШИ жи Жевуцю Фу им шт Ху бфжамвю МО кни ХУ КТК г. дж їжи Ж х т ж Мум ЖИ їжу ХЕ екон Хижє ОКУ ТошУрЬ Ах т ех ЖІ Ух
Ма жа же док БУК А АН М ок я СЕ АЖ ЖяЕ ЯК М Ук у х х ложу я ї хо хх їх х ТЕ КУ ЖК їх Си ОКА ух хи. и ух а ние у и НН У ННН НЯ Яд да Ох Мк ее ов ЗЕ Я НЕ М о ЗМ КО М А З ВИ М о М С в у МН В ЗМ ВО ЕК крах «ко зу
АХ п КІ «ВЛ ІхИ я
Жосарк мочИЬ г Фета ж у сок ЕК ож ЧПУ ЕЕ г. Жосдоиим, Беж м. Ду С тя. попе т КК г. ПО жк СВ сетує ж м Ж оєу ЗЛУ кож рено НИК км ТУ са НК тек: Ж У ЖЖ фа СКУ ЖЕК ок ЗХ мВ ЖК хе М ДЮЖ УЕВЖМО МЗ МУ НАД ФВ ОХ ХЕ ї як де З Я я
БУ ЕЕ ах
С же З емумщше У от до дифе хи форм Ж ке Св М у ЖЕО Жкнших Мод Може ЖУКУОЮ Ше ЕД жі Мешках С ди Каже Сб3а Зак Ж 8 їй Їй к З фея. Яжшуж: Бут ЗКУ щи ю Ж пох
МОМ ХУК КОЗА У МОМ АТХ КИ ЖАВ УХО УМХ орки ча З Ко и а Оп М ОО В В М У дов ку х Ка
ЗЕ По жк
ХЕ я ХЕ яки КА Фа Кт хх Му Же Дам Ку. Жов См Кі У ших Же. лиш жом дич
ЕЕ з со ЗНИК КО о КОХ. од дя іх «Ех х. НИКИ Ха р сх. ук КК щ т. кеоУ
УВА КМУ СЕМИ ХА ТАКО КВ МОЖЕ ЕК Ам О ХХ МОЖУ Ж АЛ ВЕЖА КК ТК ших ре хе три ц т рак ЩЕ
ЕМ ЕВ КЗ ще
Ж гу щи Ж ких. Кая Бор тиском КИ ие Мои, кон їх Ха ах ФВ ЖК. їх Дух т. чо тіше фо ХО ЩО до М ую ЖУК її р ВУ Мох їжа же рю учи дм
МИХ ОЖАЮЮШУІ СКУ КУ ЗИ НУ ЕОМ А ІКТ о ЖАВ СОЯ Х КАК. ЖАКА МАШІ СХ ШИ. САЖА ож стю пк
М БУ ЧЕ т сь А НИ НЕ ЗЕ жи Ж ххх оокаяко Зйж (тк ФО дк ДО РУ Ууа Ук ІТ хх шк Ток
ШЕМО ОБЕО УКХ, х о З якя ЕК зе ОСА. Ж МИМОМЕ Оз. Я пог ау
МАХ ЕМ
«Ер а
МКК ЖК
Кене туту
ФІ хх М с КН я УК я куту
ФО Ткю ср ефе я ЖЕК оч дити кри
УНК А мих ка емкої
Кок НЕК ЕК
УТ Уку
ЖЕ МК ктууумух, яки й и вому, З еетуюих, шик жахом кл тісним Кт ках Толедо кдихі ФУкВХі ех ох МІХ се МЕДІАНИ МЕ ШИРМОЮ КМ МКИН ЕЕ кожи т «ак 4 ел ша й Жах Сб вм Жах Шут бок буд їжи Ше Ді пише трі іх
ЖЕК же МАК Баш СБК СХ ле ХО ДОК ЖК лий ЗМ хи ЖМАЖА С ВМ ЖАХ
Н в з К
Кя НУ ке хх ок жи хуя що ен ня с ин НН ши бу сени бїмшкх Му щу тиж їх Щи Сем Ку ЛЮ що 0Оа бетеющо ИУде Бк аю Ки Лету и ек СМ КН 5 КО БОАА ЕМА и Ж о о о З ЕВ ЗК СЯ ХК ЯКЕ. МАК Ах ке Ах хол хе - Е З В; - : гори жККо сах сг Ж зт хі М ша КУ
Жошкра у М жу іду ОВ де МТ яю СК де гонка лок Ж тет цу Вод Жах Зоо НИ НИ ИН ші в СК пу т дл. пит ж Ку ОО шо Мам: КК І
ММА АЖ СБК ОЦ шк я їз Б КК су ЖЖ: МКМ жах дах УБИМО ММ ОМА х 5; ЗХ я: Х З
ТЕ КЗ Я ак ху КУ «й с їх
УНН оз їйшмає ТДМУ бик тка Жах й а ЖИ Жук Жах усе Фу В
ЖЖ ше А ХЕ Ст їм сю с адм ще ЖЕЖе СИМ АК БТ дик іде
МД я ох ня - ни - винен ОК ТЕ - кот М щи не ХХ що
Фк ех хо ХХ ну шо жом У ма МИХ - -х ок нн чн «тек іл с ШЕ ТЖ ох НУ Ум, їх. том ср хКу: ТОЖ ли іже лож Філ ХХ «ША МКК ОЖ таж ОКХ ШЕ и З ВД а З Ж ОВЕН КІМ дж сМаЖ с Бе АТ Ки «5 за з аа очня пшоно І шу, «лх ше Ж сн п шу Ж ую М я м с «60 Жюнууі ЖЕ с їЩі 5 дохух лід Зоіщ Си ек тка фак ФДМ м іт ТАТ КЯ мис 1ОЕМІХ
МАМО А АЮ УЮ У УМ БУМ З МАТ МАТ ЗУРАОУ ВЕАЛЮ МБ М БК ЗАЗ ск Ух тк
В Б хХЖУ пт бно ШТ и 23 У ЖІ ха й Км о їжу ЩІ 221 ху б ше тиху
КУ ІА хх ж ях хо КК мух ЖЕ ММ Долі МОЖ ха 48
У М яви вх
ОН Я БК же АХ Ж ки тю «І 15
Ме МОЯ КМ сек ож «ух
ЗА АК я оч
КЕ, - ще
ТА пе сх о них МАУ
Кран
СЕМА
«ую тю ї- Сн хх «у
ФК ка ск зд уееаужна спо пт юс іхігкі В
АН ЖУКИ АМІКІЯМН ВК: ДЕКАН ОЧІ КОЖНЕ ЗИМА КХЮ МЕ дім Кук
ЖУКИ ч зх
Фест ШЕ Ж ую грам ах шт ж дя жим Зах бал бах лює МО хх лекхує ЗХ Ж хх
МК жа АВ Ка ЖУК ЗА НМ ме ОЗшЖ ще Бе ху люд ЕМО МЕ шу
ВУ т іх сл
Х З М ЛЕ
Фо Моюоет ЗКУ ЧЕННЯ Ж м їн ж Вл о ток ню УМ ШИ Тл Женя рек В я м М и з М В З М В о М І М В В І А ЕЕ В Б В З ЗМ ОК тах ту ух 13 КО С
У ЕЗЖ Же
Зою ЩО шо плебусвяу Мих ух ШТ жу Кт ух Ж ке Шум Ж жу Тохихі жує брав Ж Ту Тихі СІ
ЖК ЕХ МУ їх мМ А и КУ М ОК Ух я ме йк КІ БАХ м шУ Ме ВАЛИ А ОКО бук хх до ре ДІ З
КУ Б реч току уже Б Фо лою Ме Ж їі Я ух Шедух кул ка ХЕ Ж шах Фе іч бах ТТ ак бе а у х уже ан сема 1 г Хе ПАНЕ ЯЗ пори Ех іш ду М
МшЖ КМ ше ТМЖХ СУТ зей АРТ се фе А ЖЖ ЖЖ ВЖК Туя М А по ко ще хх в Сея
У ее ХА дхиюоши ММ у хх му ХУ. Мо У уки кі МИ СОБеННИ «х «з. ко пк Кт кочну
Хдхж Їх Моя СХ хе СКУ сб Ка. Ся бкхія МК тд ам Бах З ам й м Шут
КЕ в о М СПИ КИ З З М ЗИ З М Б ЗИ Я З У М МЕ Я М ШЕ ЗУ За ЗИ А ХК КЕ ВК МК їз я Ек У ха Ми Мою Ме «т УУвох хг У, хау шле МЕ ою МУ 4 ливу Жодчух У ду
ЇХ вх лю Ти Не ту слух зви Теми КТ ж ТЛ У Ох ко ГІ 14 Пк Па Мод хАЯ АН У вна АК КОЖ КЕ Ам ЗА ЯК т ХКАОЖ ІА М ЖЖ мМ ех хх трі:
МЕ ОК я тує ШУМ ЛА ха Ер ШТ аю ЖОВ жи ХЕ их КІ их дих лек с ЕЕ Її А ша а ЕН КД и. ЖАЛА ОВО хо. У Ж «аожкх зе 143 Га
ВИМ сок с Кх З ще БУ У ель «ох «З У ГАБЯК
ММ КМ як тк УМ «ІК мкл
МКК СК кю лу умах ох ке піл
М их МераткУ а
КОЖУХ пад Код сік: ЕЕ ток поем жерЇ паці юуюа МО дк КУЗЯ ЛА МУ КІН ЗЕМ КИМ МЕЖ К МКМ ЗІБРАНЕ ГЕ хх ДожЕкию дух «М. т й Я -к іх ких -к - соч хо шо жлюю Ж ан А А ох дж чи с ж ж ах Кору кою КО ЖУ сЖу Фах юс л ж ток 0 УЗ о дах як ЕХ хх м в и и п м п.м В о М В ВМ ОМ ви М в о З ЧЕ ЗМ ВС ХА ЖАХ : м хо кЕ 3 Ба ЇМ 1
Ще ЛО т ра З еюм СО Ух Ждежує ї7чум ких щі ух томи СЮ ух Жов Саха ох кх бтехк
ЖАЛЮ КІМОНО БЕХ ходом МІЖ Мои ЖК ЄЮ АЮ ЖИ МАХ Ко о о З п З М о І АК ВИМ СЯ
Уж Б сежху км яОХ -КК3
Ж Ж жо Мун бМежах ж ж кт фожнк ки Ха тк ах фу Жде Жосуя Жодшитю СМТ їди Від ги тУ хек жалко ЖАБ Тир Ех стае тим БЕ щік ж Дод ДЕ Ех»
НАУ ЖЖ КК КЕ ха ха м Ж БЕХ БУХ У МОЕХЮ ЖК яЗІЖЖ жу ОД АХ ДАХ кою Жх - доїх я ще я Сх
Ен х г «ХЕ ХХ БУ ЯК
Ззує Жук 1 ях Фу СВК Та (3 дю і щі ЗКУ ек ут шу» аа с
КЗ С ЗІ Но Я І я ММ ВЕ а и ОМ а В М М а ВЕ З А Я Я В ММ КЕ М В С шо: шок сх
Б Не Ущо
У ХО М ск их Шк Уч ЯК я рек чи тк. Ж хх. Ох Ж м. МТ г Сх Хор о ж У сне і Женеві Бі шк Шкру СВ жщх бе те сю пошу їалії (323 шу мок мм а м у м в п м м В в и М в М о п В В п МЕ ВЕ А В І М І М ВЕ Б ЕВ БЕ ше сждх, «жк КК
ТУ ЕХ З ЕД
УХЯ о тус ую А у Ту ує лає ЖУвісх їх Я ж й кі А ак ЖЕ що Ух ба дних Ж еУНЕЧ У БУХ К с ОБУ їх ЗКУ. У З НЕ М КА ПОН ВО - її УК От
А М ее МЕ КК З У и ЯК МЖК ж УуУдЕ би БА ЗА ПАХ мА ОЮУюЮ КЕ ОО ММ
Тк ЩЕ шу
ХУ: хх ШО
Уві Лех Фк Ох Тл ть їж шу Ж зу тло т дих
МЕ еп БАУ БІАІЩ ЗМУ САМЕ БА НІ і Ка зт Ше
МЕТ Б де ут с
Учня УК ек КИ ХЕ шу хх
КД М: од я ЖК ях що ек А ЕЗЕЯКЯ содео Яне що сю я кнопку
Хохх 0 ВРежч На
У ЖІ и ВИ ран ке Уся ссхатмє БЖ чілуі й юка х іч окол яУТЕ І хх Укл міти ЩЕ хв Кок КО КІКШХ трек дуМ емо БажеЕний ленцюєе МЯЖ везе сеньнНниМ домен
У сек хрке ку
ЖЖ ки
Бе зай ких Жак вк у
Хей 0 ЗНЖНМИ КЕКВ И
ОХ У ї У КО шу її їх
Ку Ки УЖ хх КІ коУу Ху руни - Ж жк пк м їх
Ус тую М худих клі чом У мех їй
ЕК ть МЕШКО МАН ВМ с ОЮО
Кн вання мату ан чи хи и й іх Боді ту я НЕК ВИ МАО некоу я ах ке їх: 5
КАЖЕ жі ХВ. я іх пуху х пожжі ки - ск я ТЕ Х хека мем ць щит
Хек тя Ж може ема юя ще КАМАЗ
КО ачЯе
С ОЛОК си ичьшка ро Н мг с. пскжко
КІ ту У ощіх Є фе ща во ХУ КОМА
ОХ ТУх Кох т мушки ЗАЖЕ са ШІ
ТЕХ Ж межи сад меачих М виб її зе жк БИК ОЛЕНА МИС Х ОЖО щимеКх ЩХ «ФО
АК
С тЮК ох мк МО и ик ко кх ка кош Жук кю их
Он Мід ОМА АВК
СК УК пок х лен
ХЕ ТУ 3 уе МТУ - НУ «іст кі ши етух КО у
ЖАКА СМАК ВИНЕН М ЩІ дю тух
КК дОхЕ Ки, яд оку. Види Я чи «ТЕЛЕ Ки догохицих кіна ід ек дО ДІСТАТИ ше ТЕ лу ЕК ху у ому ЦААК юю ХАЙ оч ше годжі ВЕ Ж зх п ; гужжУ сна МО В ї
Б М може замішщашв я ЗМ У «М х "« ХЕ З Не и НЯ кКюЖА УЮ 0 КН И КЕ віп жк гою «Я ІК ЗЕ
ХХ ЖК УМ ок М і пи т щЕ 5 їй кесищ АСЕ НН З х
БО нея - ще алла У ЕМ ст кУж ЕК
КУ Е вве
М Я под Жоден ож 0 ПЬОМ МВ МЛН мак І Ел
МАУ КТ ух Кі
ДЕ ДЕ ня т салтдору систе здо Ж ик ЩЕ ення же Ва Ж Ж ЕКО се Ер
КОМ
Ж у соми Жив Жан
РКО шо КЕ ета мч хх
ХУ к хх зх Уа ке ЖЕ я ук
ЕВ До жагу хижа пастили БЖ сайти ет Фа Ма ОПН ОАЕ В ОТО см
МИ М
СК
АЕН ко але уми аичте. «Вч громи ит литиг «и НЕЖИТІ МУХА
Ванни ФК Кт
ДОЛЕЮ та їла зх
Се екн их МЕ сжож М МЕ жучки Кк - с -х сук АХ сек тю «ух пи Имя хх
ШМК тя а НН КУ бюдже їх ВИМИ НМ ЕК ОО КО Їх ее вени хуя р й
ЛУ Ух шкі ша Ж
ПЛИТКИ мії що ЗІЗ: век дк ОЖАЛЮЮ КУКИ стук, тях Ід
Бен г Ах
МКС: Ж фо ХХ
УТ ЗК ваги ха ща МО з кВ Ж Ми ам е БО шКОї и ух, вок кпк Кі зах й ик Шут ли ук, яхехев і 0 МКУ ЕВ
КОХ кт БТ
АФК ІТЖУКК ком КВ
Вих ко кни дет Кир оих. Що лек лу то кжщш ОК аа МО ск.
Хе А МОЖ МАМ ж МИ шЕТКОВ ЕЕ
ОКУ МИХ
ПК КК сек йо. Жде луку
ОК пкт бр кюих
МУЖА ЦО ШМК ОМлБТА ХУ УМХ
Кк я ТЕМ коту
Мом хнх ТК зок ЛК
ДУ ЛЮК м с Фкусач худі тім В мі Ж ша Ж МОще замі М ак Є ях
ПУХ
КЕ ким Же
ЖК Же М МЕМ ТТ МАХ ВОМ,
ШИК ах іш: вен ХК кож ДОШКА
Кв ка пи Кк ї х зе М пу и
Кия о здиужи са маше МО КК
КК Ж ЯМ ВИНИ ХМ Ж ОО ВОК їх
КЕ же
Вч щі ше є Н
ЕЛЕ хх тк м юю дв
ЖИМ МІДОшюМИ ЛЮ ШЕ МКК пи В Ох, ново НЯ
ЗАМ ТК ях
ОД У а ме а ЕЕ
ККУ яки, крою дощ с ї ми с ух їх хуя меш МІ АХ У пе «и МИЛЕ СБК ЕМ ОО ШОК сю стю лют
ХІМ
УВК, ня -
ОКХ МКМ ХЛ ЛК
КУ шк Уж
ХОТКЕТХ ЕЕ ТЕКА
Те и ий ОКХ хо ОСІ І
Ух хо ков пдекж Ом НА ННЯ жу ІД и ПУЕТ У ЮТЬ УК ЕІ МИ КІ я хх. еко жи ЖАКА ОД В МЖАТЕХ КО шНО сєжфту жи сю КУ и
СКК яе с лет Жюдовира, ро В ХО ОКХ, ЗМК ех МАЮ ВА АЖ МЕВИМЬ М МО се Ртжк втуткх
МК с нене НЕ хожж хх х г до сх м
ЕВ ау скид ква нт Жуль хо к Ж мизжае смів б ща М
Ден хх КІ хр я : Е х «ле пе жд сот в БО КА ОК я тех сік я Ех їм ЕКЗ коки Хо ХМК
КОДАК щх лузщеих худу ха Со цитую КЕ оЖиЖю к вкаже аміни Мона чи
СЯ їКе ки МАН ЖЕ ЕЕ сере Де, ЖД и М КК КІ
У и Ж юю МАУ
У юх ЖЖ дфофевшия па лувц й зх ЖЕО сю сих У жаєхжсх дя соні Що дере ТЕ
Мишеня 2 МИ МЕНІ НМ БО КУ жо ех Ух ЩІ
Бах Іае ХЕ
Мк шо Хавсть су Ж ду ЩІ У ад і 4х 33 шк -ї1145 Ж Мод Бохжи їй Ух БОБ ях От лу ква чі хал се Ка ща сх щі м ОА СА АЖ ЖАВ Ж ша ХАЛяД ч - ще Ж
В Б та Я до Ке кешу Ах се М блок Жах ще гом Жах Мі Маре їз ХЖюехх гу лу т Цажу ие «ШХИ М ЖЖ ла ЖК бУШУМ ОЙ И А хижі ЛЕМ Ж МЬ ЖИХЕ. ко ХАОСУ ЖЕО щЕЮ ЖИ ЖУК А ІХ
Кияк сеї хо
ЕЕ я СЯ
КЗ ке М леж Ж Ал ж ск Ж Жрвща їі Міо ег і і х; Бид іа си Жоу
Ку о о з за м М З З В я ЗМ З М М В С В В М В А МЕ ВВ М НК М В М В НЕ з че зт
У Я 5 су « «. он мох шодо ик 12 по - ПО АНА - що
ТтхУ Жм сук Ж аж їхеж З що ффемк О х ВІї су хх Жозіх Сб Ж и ї ж Ж ок ХМ шу ттяк Жщдю б х тиж жж 3 що дм Зх ОВ ще хдд т Жащ Іл їн Мах
ММК Ж МЕ КМ НВ ЖК ДЛЯ Ж ЖАТЬ КУ ОБОВ КАТА АЖ ОК УЖ жащ са МеВ КЕ шт до я
Рея не По
Тур Єр аю чт ква смрру Моха слефє бо Малу бін дит Мо Мох ою що ню -лк У АгЯ Уда б мес же» ха З жмвш Бек жаа а Тл Аля Ух
Б СУ Е ех «хх жк пох я г її сх
БеКУ СУ Са шо нн ни НУ Моно яті Кожен ки Мои Мосиуиио 0 ПК т с НН Ух зЖзжою деуюл Тудют: обедам божмж З сіі: брову стих бач ща іа Ж що що слух бут гу мі жа Бе сне МЕ о З о З З З Я МК Я В З ВИ ЧЕ В ЕХ М В ПОМ ЗК пк мжю -х
Ко її Бе
ХА п ШИХ
Щі Меч сх Мі що їм Каву ем Я о Же дю й ши ЖІ Саух ММ, ик аж м у м З М ня ЗМ ЕМ В КЕ В м и М КК В п М п М В В В М З НЕ а мух де т з гітх хо НЯ
АК А Кш
Ум Ж отхя сон не 2 я Ж ол що ух пвх Фу ж
Таку Же її Мур кі Сріує Жодуєю ЖКлрі сю 3254 бук Мк син нн о в ну в а в м М М Ех п М КЕ А В ВЗ
ЗБ т охкех ем Ку сет В фун, Кк
Он ТЕ. у ж, чех хі хе есе Кох
ХОМ и Беж
Зо н КЕ х ЖК тр с Й «А 00 вк хж ках с Пре мк вах
Кен
ОВО
Кен Жхоітї де дугувкниа сетер них жести ех
МВТ Худтх ех. ім гудки хі пою Же ІК се
ОО маминих мив Бажкегро пам Б
Ве хх «гу 5 о У АХ о НЕ в нн о Не а и НОЯ ТО шт ух У Жохких о и фазу ху М
АТ УК З І у б СВК КУ Ба щі Ул У мВ ЖЕ САУ БЕ в Б З 3 я х чи хщ
Я пк ран дою жходогАО ж ииВ жо ни мн м З нН ЯЬе хоча ФУ хо Ум Моне ие НН СН мае Мі ток хи туда жи їжак болі ЇМ де Мише Тю шкі Її 1 Що Мекку і жк ЖЕК мМ А Ж Ушш мЕЕ ТАЄ ок АЖ ЖУКВ сажу ДА УК ВК АТХ «т «ї ср
БЖ С її
МОМ КУ МА тиха Мем 15 шо бу 173 Малих Фу АС у учи, Я п стр та ТМ її шк Вдлую ле Мо бік бу зд Ще їх захо Шини (Зх КУ й яміз Ж р: ау Вау а Ззея не ЯК ПНЕ Х МО З М К а в Е Я ЗЕ С КЕ М Я В СЛ НК М КИ КИ МИ У хе ск дог ах х З ах
УА чуби Жов нн о досл КК У и пон я о в о ОН СИ
ТТ Бк ке Туш СД хв ою їз я х Ах сх жі Мо яю Тл й пл Ку
М КК ема ж ше ЛЬХНЯ хе у КА ВО жВЖ ЖАН ХУ о жа ма мує Ух по шк ши
ТЕ вия ЕН нх Ах ян Й пе Ж ма ож ЩО т Клер Моди ому ВИфі о дфбишм КЯ о бу М м що світу
Кк піхе щу щі Ук мч тку мтж Поу ТП м Фе їй тю у пу Її баку
АНА ж ХХ в ЩА АЗК Мих ОО АЖЕК КК жа КК Х Ле додому МЕМ тло А ЖХ
Б сут скж со
ТУ т Р ТЕ же МУ хх жу За ух Ка оче ШЕ Жосгмх ож Ж сно НК зач нки чи Не І
Ол ТТ єю бат ШЕУ Їзки Бу Хоч Щі уХ ом ша ЕК У ТК ря Баку о шк
БУ а а п З В З М Я З НВ В о З М М С В ЗУ по а З В ВЕ М В З я т рих ох
М І хат
Оси, Я Кк о и ча ЖЕ кл ЖК сю пжожо КОХ м. їх. ВАНЯ ель Моиисх І у. ТЕХ ин жх РА дах в щу ска ню бїбжую КОЛ хе фо даю БО їх Жах Брав біт ЕМ ах ема
Аж УК за За ЕК Еш СК сю се сю хм мим кт рух ме у 2 су Є - Х Кк; З З ГУ скожьтх пре ях пог
КЕ Я ІВННН
МАУ ЯМ ОО сих Зх Б дк ЕТ у ЖК ви ЖК ую Ж як Жую ск ху сум ух ху
УЖ ОКО ую ша ОА УМ Бец щі ЕМ ел ех ЕК 4 х З шення полю
БУК Кжсеся
Кк ЩА
КО реж вче схуд
ОФИя іа пики кН ож шожю я с птукути м КК У ЕКО
ВО чече ст - «Й її пилки ек МУХИ
Хоми ЖЕ и КК
МЖК, швом ачий лк, - Од пи ще шк та
КО т Шик шРиЗЕВ3У В МО сему дю грозами ль 0 ШАХ нки пава лобльими лоашМм вежах панцюеа МЕ «аг ху
АЛ КК А
ТЗ ж дл Є жо Ж оехю Кт Гб жу лах БТ ає Щі хх лі їх Жов Ж ух ЖХжу птах Зх
А ЖЕ хе мес За АХ ЖК А Я ЗО МА ДВ в БЕ АХ МВА - к хх чЕ я З ККУ ра ех ЖК Ж Ж ках Ж хом б Ж лах М о жах гу Щи шу; ех Ми би Сл у
КЖеху З З ко ЗЕ Жх фе Ул М с Жах їла їни: ау їі йогу шк у
ММК ЖЕК Ада ХМК Мед ух ХЕ ЖЖ МЖК ал ОМІЮМО КОТ АВ Бе Ж СБУ
КЕ Ше Я ших я М я м: о МЕ Поу хх, хх Жодних и КА Ердии и моль и є. Хо. Я х Мох НО пеки їі Мі що бе ща бе (лі щі бут ха ІІ у (1 лаці) Ті р С ках М
Еш Ж меш ОКІСТ ХХАЛТЬ ЗК НИМ хе СКК ОВК
НУ у З Я В:
ЗЕ я Сея аа я БВ
У ху дети Мои коломия Моне Ге зо МК хи Я дк. купини ДК ен о Я кА Ж Ж ДУКИ Ми Її щу МУКУ Кл ЖУК тТх ККУ МІДОлВО СКК ох ГУК БЗ КО ЕМ МАТ; А МХХ МОВІ ней м дя чи шт
Ва хи ек чи Ки ЧАН ИН хуй Мам МИ чи Мошчамю Ж ошки МИК ху дм мол Ка ду ЩЕ МОЖ ох ЗУхк чу
Тіт хх й ЗК МУ Маю сб ще Жде СИ Жах Зо Муужо ШфЕре Мі шо бів
АЛ ААУ яЖщ ж БО ще кЖИЖХ меч Де ж ше АЖ ВК УМХ лам ХМК
Го гу ТЕ ЯН ще Ех ву М г я - шк . с х х 4 ч с: Кк и ке я
Зах Шах То жом вач жодея Мк Єще Влх Хошуку ую М о кої ково ли тк
ЗУ шк Ка НК ЖУК дні Я НК Ж пд Хр А Уж А УК ЖЕ іх З З З Ко З В;
ау Щахех «хх що шу ду Межує хі ШО я Ехо бфшш МИ уи: Жокжц ЩЕ ед. СК Злам Щооужх
КУНА М а У За Ж ОС З а З М ЗВ а ов В с З а В о В М В А В Я В В п В ЗК СВ ВЕ КО У
ЕВ вич чор яких и ОХ іх бут КІ дх ж ГУК Ж ях ХХ УА Кеже Жено саше Ж
УЖ ЮК Е ШОЮ БМ ЕЮ ХОМ СХТЕХ сша ЖяКАО ККЖЮ УА. лиш Ко ую я: ЕЗ З -Е -я полки хе хо
М АТУ Кк кх и МК Ея дО х
ОК и Зк Я мч ЕН ж М дожлх шеексв оту таке
ФАП ЕТ ща ких ЕЕ ення сиву хг я су се в
Аня» МИ ЕМ
Ку КК бики шк Ек дикою ДЕ: ФАПу тк, пе кою ки Я ск хиєкоюу кк Дн нь
КУ М КІТ УАІБ ТЕДДІ ДЕВІД ОБО
ХК МЕ КІ ВОМ Км ООН БОКУ ОТ МЛЕВНЕМИ ОБЖ я ща ше ух ї
І ОХ
2 чещй 33 Ж кю ХХ о схе тт Я шо тт ЩО. Коко бофоемео піаних Ж В шк СВ тіщт ща 3 та) Зб шо ба ті х5 Б що ТІ л4яе що То бар їікуу тах ЗБ щ
МАТ ЖЖ ЮКАТЮ ХМ ЖІ ХВАТ ХУ зл ТуУ А КАХ. ЖАХ муж ЖІ ЕКО ша ю ЯКА х п хо як і С у. я
Х ТЕ М КУ т с ни нн в и НН НН НН НН НН НН нн я
Сея ик й Ток схилу Ха т джш Ху шь У що КА до ЖХаершт. 05 ев Тек Щи у ким Же хе жа зе ом ЖЖ хУУ Ж га Ж ШО МТ ЖАН ОК ш В СУ
КУ 2 Й х и У 2
Ух г Ук ох шо Й ОХ таті Жди доми пед ЖІ Ту ха оту джут Шлях Оу Ух тод КЗ ких. кох пек Акух т» сн ШК НН а у НК Но СН НЕ хе Жовхю 33 ма А
Тех Мет пла ТЕО Ма Я іт 3 МЕ су ла (Я їм і ре БЮ
ВЗ г; з А; 5
МУКНІ І їх
М вс ЩІ де Хе току дя ут. пр КУ я да В ши Ж ше боки Ми хх, с т н КК
Ода и Не Я НІ НК и шо водо кує То. уже Ж Ж мо томи КА
М ЖАКТ ІЗЖМІД ЖЖ ОМС для ОБАХУЖХ бе Тож КТК Ул ХК м АЖ Ля ЩЕ - Ко х - З З - ут ток св
НУ НЕК ях тп жк фу кни ак юшк лекву: ому сдююш У Може діда Ж ад дод пух ЯК шо ж
МАХ АК У ЗК А СТЮ ЖМЕХО УТК вл Ер КЕ сКххХ ие дал ОК БК ВІ ХУ
З -х х3 х по КТ МО ЖеИ КУ
КО ВОК Ах З ха Хе. Мох. НУ кан йла я бух рхм Жюуєтх Жошуєх рми лу Ма ж п ВО У ЗК Ас Три Етчугу шк М «АЮ їзКнМ с АХ хЖОЛУШИУА ОЖЬДУЮЕ ЖІ ЖК М СХ АЕА: ЖАВ Ж ку ОК Ж хх ее па и
КК ж о ме Ж Я ; з Кн пол не я ск сх : сх хх «о мм з с Я хо 5 ще кл жуУ ЩО мо тю кує Же КЛ ху яки ще ШТ Коко Жоазу ДЛЕчИщ бач МіБіхах Ст ки
І ФУ КАХ ЖЕ ЖЕ Оу ХОоОКх ЩОКЖЖИЖ хи ЕКО Ж ЖКЛЮ дУКЖІВ ИН УЖ а и ловлю Фк суож ж
БЕ ГУ НКУ ж МАХ ее
Зб Мах. Ж Жошу МИЛ шя Т пхо ЖОМУ юю Ж ід ЖІ ЩЕК юю У би Стик:
Кв сич т вих КК АТ су ЖОМУ ОА ЖЕ. МАМ Ж хухю ХА МИ
ЗО у
КОДИ І о куту
КУМ акХ ТО
У нсся сту р їси
В НЯ
Юм жк яку хх,
Ж Ллх СТ
Ти ЖЕ МУКАХ
ШЕ т. мурах ку вся МКУ АХ вве
КК
Но я
Кекс хх 3 и уж. я се пк це АК. чу. пад ту, ях
ТЕТУ Хе Бу І зт ЕВ КК кути іт ХХ
Ве ММЗ задииивнвмМ сдисои фа пиши зх ко ек
Катя щу
ВК хіх шк кю у поч и АН А Кен нн Не жу - Кт з тм шко їх Ед їплозр о стю її жк щі іх ж ож Жодне СМеднитю ФО ду а
УЖ и КАК СА Беж се кам о З як В о В ОК З М КО М Ко НА о по В КВК Ж Кая
З а 7 З
З Б їй 15
Х ко Як ке
ФК дн Кс ЗУ дя щи ЖХидокоо бе Ж даже ТК, а Федюк ОКУ пек Укутиж Кк днк тож
ОКУ 2 сх тд са Хе тож: З ень с щі і по щу ту пк Ку
ТЕЩІ ЖЕ. з ШМК ШОЕ ММ я САКЕ Яд ую Ж ББи ОВК ДО БЕК МАК СУХІ ск тА пЕЕх
Ко хи ве
Хм аах ВД В ошо сатхуя ли КОХ слав о о ОВ ши ЖЖ юх тож У фцо лу ВИ лек КЕ Во хх Ми дю ІК щі й фе «ЗЛ І ЖЕО мОТиМ її 13 буку Міс
Ж ММК ЖУКА БЖ ЖІ ОЖХЖКМЕ О МВА ККАЛ ОМ МУ кН ХЕ Ах ПЕМаО МАТ ХК Ж
Бек дех Сн
Ех в Зх ака Ех у Н вино Коша Жах ее ой - сов У хІхХ речи пи х МЕ их. ЗК С жо о ж їж путем шк Щоду фату. ЖЮ д тьму Пт ЩІ мм Хо пс х СЕ пови Шшх:
СО Я І КПА АЛЕ БМ ДО ЖАХ КОЖ КОМ ШФНХІ Ж АШКМЕО ШСК ОМ ЖАХУ МЖАА МУКИ ОК Її док шт ск о 5 й
СК ех ше хх. ж ху. плн у и. прах їх НОЯ ТЕМ Те, С СИХ. зи сажа т м КУ тини и
ФО жу ЖІ Жвиї ЗУ Зх Мих кре щжух зе Жах бе Му амо ЖЕ ЛИЖ Ж охо раку
ММА ХЕ Ух ж ЖК «ОМ. ААДО УДО ЕЕ Ж АЛИ ОА її ДОМОМ О ЖИТЛУ ХАЙ ХО КК МЕ жди Ех ше ко - «ух вче ТАК ТВ. ЖИ хи тож Божих и тиж о Лоючя Хоахт ЖшУую Кона НК УЮ я ШКО Укл Тра Межує так
Я ож Я ЕХ г пі МК ХАКІ. ЩО ща т БО ВА вх ПЕК
МУЖА ЗК АК МЖК ХМ АК ЖК УМА ОКХ ОКУ ЖЕО ІК МУ СКЛО В ЖК Кз о ее
ТУЯ БОКЯМ ГУ хів Вже їх міш чую бум ббхююко бю Шижє бух ах бах: бро: СБ ЖУае ок о І НН в М зн Є ПИШЕ ЗВ З З З ЗЛЕ З п В ХА С о В з п о Кп В і З з п о З ЗК В З Ка хе Х ВЗ КУ ЗХ В й ВЗ як Х ТЕ аску сх же
МЕН тп 11
КК АГ ди
Малою шану сю а Жу це и ек не и иа НУ Шк Ки
Тл базу КІ ТОЇ їх ЕЕ зу Я ще З же СК о сти
ЖЖ ЕЕ М АЖ МАСЖ КЗ МАЮ Ж СУТ У ВМО СЕ хо си о ве ж Хе
Коня пох
ЗК АХ реше «сах ОКХ
ОН ВекЯ ТТ.
ЖЖ Коня ори шукстх
ЗАШ КМ
ШТ у см.
АН НН век я ЕТ
КОКО иНка
Кн пав фани ве шкі ке прдиоуви, кока уєхачох
БО ММЗ ІТ КМТ КЕН ХВ ЯВНУ ЖУК ЛЕ ТІК ОК
У Се «ами е ВА
Ук. СОДИ ке з Б Що мно - Ух інже. сок нь НИ ОО, МИТ у, кА у ч Жорж Ук ч Уилу с. УК
Тов Зжщ КУТ тиха ЗЕ ча Її От ою От мк АВ тех То Жееку СЕ а
Бе а М о о КО п а о В ЗК М о о я КЗ Ж Ю МИ СшУаШШЖ СК ОМА. ММ М ОМ М Х ОМ ХЕ х х. хх б
Х КУ КУ М
УЗ кох ож КАС шує Ж рю ХЖофх он шо дн ЖЕК Ж ЗТ пк С Кжнхх Ян ран С М. В х. ЕКЗ ОО ххх Ку ех. ІМ Е: Ве КУ ЛК х тт. МОЖ оку о ИН КК
ЕК ММ му Ж ЕМ К ЗУМЕ ЖУУЖК БЕЖ ХЕ ОА БІО АН ЖЖ ЮК слив КТ п тету г що жк У
Же ЖИ Б ши Зрежежу пи У ни хх шуй: ШУ ох і ши Кс Хоиху ут кове КОЖ,
Жди Ху хи: у о НКЯ Ко е КА ХО що Ж Фон ЕЛ КУ ХЛ ке дику Мк Тоиюю Ка
Би ме БІБ Бр За АЕОЯ БАЛ ой ВЕБ ЗАШ КЛ ск беМ щаАм жЮ Ме лу ох дош.
КО КАХ сг ее и в о НН нн и в НН не НН тіла слинних Жили Щбоаде кує Щі ще Ва Я о Оуен МЕ Ж бок ЩІ хАОЖ АКА ММ МУ КА ЖАХ БАК ККУ ЇВ БІ БМ ЯМ ТОЖ Ха МР лухМ ДУХ ККУ
МАК САГАЛЬКО МА дар МЖК ЖАХ ЖАХ АЖ ЩО ІММО БІЗ КО Вк БАЖМ УЮ КУ
З 5 ТК ОЇ Х я їх по шгх
ТЕ щ : пЕ тА 3
- ж кю зх Фо жжЖМ жу ПММ ую Жожтемо Ж м, ще о р-н куті Ох хх туї м сті боку що сви це Св ет Бшух М шуй Ті бошує ви іа ох
УА АЖ КК В ТЕ ет и З мо їмЖ Ма да ВИЙ З ла Уч
Ко У мя Е і: пе «ук су же ші І мя ПЕ хо ми» ОО ж
Ру СУЯ ше Жочкк ое Жослшю фоуах жк нн и ин З НН НА здам сх Жома Жаму рн Тож Ки бот Флшу бом Же 3 що ув бра ее гу
ММЗ фам ди с АК ЗИМ АК ОК ж ЗМК Кп БА ЗА Ж УК В хх їх їх ї В в ее щу СУ щи
ХО Ло ко
Соч Молю У ск нн Но о НН на НК о м оеь я я ок в НИ Не о р ОН Я
МА ОЕМ АВК ЯКА ЖК ЖК АЖ ле ММ ж ж ХА У вЕМ жтТМ жу ІМЯ КІТ
ТЕХ ІЕВНЕЯ Ок
ОКХ Кая яко
Ух сект, кутя о, вони льше УЖ т ня Сх вм У я СЕ щи хх.
Мав ну В яд ЖЖ ну жу Б ші ЗЕ Укр Ж ех же
Ж М КАМ шию МАК ВА. У ЕК ЖИ Ж щЕю КАХ Ж ХМ МК Ю я ток
Ко КК
У Ук. Ко
СТУ ЗК оду КТ «ТЕ хх За
КК ху оче таки аа ЕХ ее пухка тт ох МУ Кмин
ОТ вве ту -к а полиикох сс, дю їх ке ТЕ У суку сток ІЗ Мт Мм о мою раму я «ше шніцель вМИи ем важка панове ВЕ гія код
КК НЯ поь нн и НН АН Я НН Я хх, ях ее я хх т. г. ян я У ках Кк вх Ж нля ХУ 3 бдае іхх Жвщ хі: щі хв Жах Шк хе КІ а
САТ що А ша АК К с ВАВ А УА БУМ МЕМ КК за АВ - і Я З но Е че жк 3 г 3 х
Ж є дхУ ох
Фк БАНЯ полкоже ИЦЬЯ ОА ос лШя Жодшкт ОО сх я Я САМ г ли ож - о Ж в с. КУ «Жак ХА Жолудо 452 стр беж Ж вх її; жду ах СХ хх Ще Ж хх щечк о Можу пью
ЖК УА Б ЗА ММ МОДУ му ЖЕ ЩОКУ ЕТ ж Аж вч маю Км
УК ск тех ее Нм УеЛюХ духа с. Жду уж хи оч я си чне ж ре НОЯ Фон хе леми покаже Жде фа жу сучюжу хи юку вх МО ла аж ТУТ юю ув чо ЕМ хе схач ЖІ бу Мах
МЖК ОО КОЖ Вів те Мо лю ль МО Ж хз АТ АЖ БМ ОА УК ОК з а УЖ
БУ тк Соч уч що - 5 ке хх де з: с х Кк. хх ке х кох
Ж ж рами Ж ся шк паю х ту сум зако Вед сх юю Моск ках М ОД ж Ук шуми їі : ху хек кт Біда ща ЗІ щі щ мах сш бчк Міщд ті им МКУ р У Ек їх ЗА ЖК ЕК БА БУЗІЮ МАЮ ДБК ЛІЖКО АХ ХУ ЯАВЬ ХВАЛЬ МОЮ БІМЕ кшх МЕ. у, жо Ох шо пе ІЗ т
А нк У чи каш фон В -к т - я хи ку хе тах ху Кт М Ям Мих фе фрез Жемух ЛО Куюх ств Ще фрі МУК ЩО лк у
МеКЇЮ М ЖК ЖК ХТКЮ жНЖЄ ХК КЕ ЖЕ ЗЛЬК юшХ сх ТБ АХ АВ ух
К З У З ІЗ леж ох ск Кк
М, Ех ТЕ Ге
ТУ Еш КО реч у и ЧОН шиною оку СУ уко дж фею фону Моди Ж ух 3 у Я жмекє юка пу
АТ Їх лу сищою Щоки т Зх тт ВМ бу З 1 Ух СК М КК ОКУ їжа
КН В В Се М С ЗИ ЗЕ М о і С МЕ М В М М В М М В М НН З З НІ пк ХК ТУ що хо дудеєю шах Фо жи у хека ду ха дак зд о дат ефе стаю Жефеди їУлдя ща КМ БА КВ УК ЖК ую хм Ж М ВА ЗежМ шІЮМ КАК Ж ХМ сан хх яса юю Кк х ля ххх ж Сем бок тт ШО Хе УЮ юч Ж шкі т штам о НА бік те Тіла уж ЖИ фа шмії Ед су З5щі б С
ХшЖЖ СККЕ КУ МеКТІ ку ММК ЩАЗМ ЖАХ ЖК ЖИ Ко з луг,
Ж ЯМУ екю лу
Кн х дух «ІС» КТ
З дю ки нерж ж ки
Ше ее І
МЖК я «ОА ЛЕ
Ж рт, тмізех
Ж п
КОКО КИМ 3 КЕ ща чн я сде и пава ке
ВК; ШЕ РКК
Бе ев
Олю, очи ну Фах ги Б ет мм ТУ
У пози У, я ЗЕ жит діри ТЗ тю хе НІ БІ Дей ЖБК ОВЕН ОК ше ЖИ що вже «В со ра нена НН я Нв ІН НН НА у НН НН а я в и НН Я З КН НН х
МАО Ай ММ ЗА АК ШК КУ дал с У БУВ УЮМ жо тал ЖАВ - х. І чЕ
Х в) ж А
Б кожи ям хі Фк м - По Уже она руш ех доли скроуюи. МУК паж МУ Ух шко їз Тим ЩІ тин І їх Шах Мер СТ перо фот СКМ хх ча Див Ма Бе Се мух За са Ж ІМ МН 3 А ма Кл
Є ге Е й; Ко Е
Я «ку, сеї
Ж «0 и дл КТ ж; бака СКК ЖЖ о леж ХК Кар НК ШК ЛЕК їхати ЖЕ хе ФТІ жу ТЛ з» Кок КК х Зах МІХ їж щАш МІ ЮК Ж БЖ з вів КЕ хз АЖ СЮ су НМ АБ Ма 7 х дощ у Су Я сич но И вк о вх МО ох ВУЖ Ж ж, ьо ух пог. «КЕ . с. о оз, По їТ1 хх пух ток хх ух с а Не ННЯ жа о М не Її У Ж хЖ КЗ
Ж ХХ ІЗ ММ ЖМ КУ юкЩш я ЖАХ Са ї мож ДОБ МАХ х КО ЖК МЕ ЛА ДОМЕНІ
Х ; З Кк 4 зу
А Бе В ше МАХ х ечьЯ що ан в ни нн Шо "Мох и У су Фе ел: Ж хх МО ко й
Тіт Кутя дю се пІжрах 2МЕшКО МУюхє ОХ би тро мах ща щи ЛІК у ух
КАХ УКХ ес Ши м НМ кВ СМ КЕ ЕЕ св ж АЖ ХА КРАЮ ЕАЖІМ ЖУК КАМ ОХ КІ хх сш зх худ сх
ГУ ВН Іа що
НКУ НКЯ Ж дкіж Жила Мних Жолм ки не и НН о НН В НН оч На же Ех пет жо ОК ян токах ДК до жу Боже ї іа ох іку Млеко бкд мес сл Сем їж вх їм З роз МО АЖ КЕ сві А ЮМх КУ Ж гу тло як кп РУ ча мли ж як хо се УА п жк ЗК о лм п У х їх мех Же М я бу сажу сіно ж Маре ша ЕР базі Би: стчеї їх боках
УК КЕ В Мн КМЗ ЗМ М М КО З о о З КО М М ЗВ ЗМ ЯН Не т МК шт да
ТЕН зак 3 ее ОК КОМУ ск. т с моя ки их. І. х. жо. ж хо "т. Сх «ки ря Се См. са бак їх ЖІ я СК Хм УЮ жу їв Хиюю
АЖ СЕ Ж А КАТ ЗУ Жах СБМ ЩО КИМ хаОо ем ю
Ко х 4 Е таз Ва
МА Яку ду Ба
ЗВО: БУ
М я КК
КО я Я се кож тя гам
ТК ох ме ше 0 ВЕК
Ух сук
ОВ улахдіі ФК
АЖ жу Зиа «Ех я хе к.с й м ко па ди сток уки У4--
От, їж ж сук кий жі Умевії фбофееі т підсів
ЖАХ МІ АЯ ЕЖМХ КМТ БНАУ БМАЮКа ОХ ей ЖК ам о зах ж МЕ сук УКХ сіло Шах же іх В ШТ «з Хр Ж Ж ких ШИ УЄ ан я че
Зап ОожВва мая ем УМ АВ ВЕК мА АВ Ав А ву мУш ЖЖ НАУ А й ах С У г 4 гх їх ч- 5 із У 11 їх
АХ Во я А -- год т жк. сх 2-х - по сх пт пк Ух Бе я х МУ
Штам ує ї ЕМ хх СТбде Жахи Ж ху М їх б'юмує ТТ Їх Б жюМ щем НІНО ому жиму СИЖУУ. меХ УЗА ж аа меж о -УМ му А ЗК ща МАМ ММ АХ ОО Е ща ме «їх -щ що пк п ті
А «І «Б хе Ж ж: іх су бюл хо Ходи сл м Ж Шен М т Ж БК КО и Ба Аля пишу ВЛА
Еш ВК р СК ж ТА М АК МК ху У ла АЮ ДК ах КО МИЛА.
хх х Ії до
З й ак «МУЇ Б, Б хх дя би Жов Ж шли ДЮ хо рн А дя Дж СМИ Кох флот Мк З дю ШУ я Ковш ММ ещ, хз ЖЕК ще МН ше ма СМ А хі КІ дж Тим о м кА я ОБЕнх ех мк щи сх ко Ех
М ЯКЕ реж
Плюс ШЖЛЬ Жояна ЖЖ же шо Жлоужу МЕ рою Ж кою УЖ Мб: ломки Мем, МКУ ЩО лю бю
ІК КЛ А акт мо бтЕ УВУ КМ БК М ЖЕ ЖИ СЕК СМ ВКшТа МУК Ж УМ що ЕЕ В що
КУ М їх т нн НН в НН І НН НН НН ом ЖЕ СМ ОЖом ЩІ лис. За ух їх Уюх
МЕ с їжнлі Ж АЖ ся ФМ шек ее це ЖМЛЖ Ллл УЖ БУХ МЕ су ак Коня ил до, шЕ тм Щи
ЖЕТу ше Ж
Мі Мат іх Ж що зх Схоже КО хо діду: бах і жк лаків ЇІКих ж Жах ех жи М я ми си ВИ З М Ж а НК М м КО М і М в и Кк В М КК ЕМ в С В КВ В За хіх ОМА, МЬ
А ММ. КОКО
Жукж тля ЖЕК. ик. ско в и и а вх НН ЕК 1 ско ху Фен З ж же
Теж ТТ У УТ у Хо пк х ом ХК а хи шим ж палку
ХЕ ЕЕ ух іш А Ам Ж м же ЖІ ща ЗМ ОБ Е
АК прот
Ах МОЖУТЬ. меня щ хх гр ХУ
Ме я щих шою ВЕ туш В
ЩЕ Вел ше и КОЖ А
ОНЕУ сІЖИЛ АВ сек МИжЖ ТИ БОМ,
Ко хек
Сх Заміеешений помащв важ павиюга Ме о ит ХВИЛЬ МКМ ЖЖ КУМ ЛДОЖХКИХИ ШОМУ КИ ОІВ ІВАНО ЖИ. с Ку оз
ОМ ЕЦУ ти
ЖК ЕХ шт КАС ма Жид ж йо даодя МУ дя, Сором Ж Жоюхі Жди Фут ЖЖ до А
З В о їз ЗЕ іч Жиує їх Кл їі А би Тис баку БІ Кк Що
МЕ ЖЕК БІР МИ Ж АК ШИЖАХ кю юка МК ЖЖ СМЮЖ МО А ЖОММК аю Ж
З 5 пух ох
КЯ щ Кк о сок ії Можу хто дн ббаамо Тоз2ми Же и ді мам шко Крит 0 ше УК ОХ Ху рах лим
ЕЕ ща ев ши ЕК СУТЬ зу ба ШК Ж КІБИ ММ Ж Ме ТАК ФВ МОМ
Ба с тех хи хо раби
БАКУ СТЕ. НК ПО деки, Бан дожити оз УЗ ї з жу ун Ск ою жо са Ж деки жа пуб слея їде КІ шо ббую 0 Вуж хх - жумгх Же Сл СХ хо Бо 1 нюх ща
КК зни НН М МВ В ММ Ше и и и НЕ В С НО М я В ЕС М о М ВЕ В КВ ЕН УЕ
А Б дк «ЩА. п ас я ку вх Жах дра бкенди ЖоКа жоашу К ху ки вро сміє Жде екз жо Ам ав ЖДЕ
ХА дж ув Хуг у а А НН НН Но в НО В НА НН НЯ
МОЖ ЖК ЯВИ БАНЮ МЖК АВ МН їж УКВ СКЖУК ЖАТЬ СИХ ФК ли МО У ка ца щ-КО
МОХ Уж бФеоуткч Ст ЖК к ХЕ Ля Тут жк Мк бак Шия Мк чЧЧівую що Му хх т Можу Хо Тек АЙ Шут фр Маша кю ТОЖ ее ОКУ міх х хе Тх щ-зещт іш ВКМ ст стих Ме жк КАШ ОЕМ СМІХ ЖК МКМ АК ЛЯ ЖеЯ ЕЕ
Ж воно хуй Кеш
ОХ ; УЕ
КІЗ У мо МА
Ху ших фони б банк Хо «цу ЖК же шк хх щих СЛИНІ Що Ли лу башт токо
МК шо Ії ще І БЦ в МЕ ВЕ йо ТвЕ ВІ ХВ СКК Ух В
Фо ще их
Ко В пе
Фе Ж ММ щу Тори ЗИ Мак УК ке с деко Ж хх Жосхая о Кава Пдинки. ШИМрим хе ха бек ідо сб СПаякю. ау ЕВ дих Жююєт ж їм Біде бю. БЕН ос ух
ТКАЖ ЯКЕ КА КАК АК А У Я СМ МКО ХВШК хе МУ. леж Ж лож х МЖК Кк стю хуж коКУх
БЕК Я ІЛ
ДУ Кл КАЄ
Уйзг Мі моду ЖЖ ка Ж що Ж хе мух щу ТАМ Мі и Фах их
УЖ СК маш САТ АЮ СБК КИМ ЖК Хх пе ожеК ше
Ах їхо рр пог кажи ЛУЮ тя за «ВЕ ї55 аа жать ТІ
КЕ БК Х
Ух дали міт «АХ щем «ЕЕ
Клея тож мах жк жу, свати ВМ ОУВИ СІМ ЖЖ МІХ УКХ СТ я
КО кВт сел чие домнМн ЕмужКоУєо анцега МЕ а ут пох «щих Ох їОо7 ж а ж бом ка р шк фл і В'кщ іх В Тит блю ки сх як Ві пАУрОЖЯ мшкК ма) М ХА ЗК у Аг ода тка М яко Муте ко хх МО 3 щ я ЕЕ
Х ве в Я
Фриває ЖК бах Я диво ба бле щу Жан Ху Тр Ха т 1 хе Ми Жир ММ хе веж о мщЩ МУ МЕеА сн Су шуй Вів о очи ам БІБ АЮ КД АЖ АВ СУРЬК тех пк за кА я «А сиххує У о ік сини т о су фаху ХУ Зах Фр хх та ся пня МЕ
Тех 3 ЗЕ н Важ та КМ АЛ ВІВ рт оті м ЖеІЮ ом мій Мо СК ОБ
Беж Би о 4 Беж
МЛ аж Убхух М хз Можт. Фени ОВО соя тлу ХЕ бує Ж су бю ху: То ЕЛ ке Ж хх. и слу ТХвБ би вею БЕЗ ів бів Оу Ні ТВх СУБ о Тук Ак бат Був Ве те ко у
МаЗ ТИ Ба ре лок Мачну Еф вдяки МОм М кох Тож. МУюже ж ЩМосуюо у Вк, ПК що спхи ї У іл ї Її У Як ач те жу. Пуку у У: ХА ко ту ГЕ і: хи
ХЕ МАМ КО Мах п ОБНе СКК ОАЕ З дЕ МОСК СКК шж А МК: ЖК ОМ АХ су «вих тк кое ї СЯНУ я Щщл їх хи ТО ре шаную ЕХ; боку дк Мах Ж їх Мом Жди ушу Мах СМ М жк ін тп кж У їзкуУк ик жа дан сен лКе БМ КО ОК Р МОВ ККЕ гл вва ЖЖ ОККО о сп ще ду ЩО 5
Ле М л віх дей Піт дій бек тут фе 1 Деко бек з їі ба Шок Се йде
З м озАУ па УК юшку БУК У ЗОШ Зх М шу км КУ Х у пали іх іс З с З Е Е; жи Як їх
БО Ту ВІ
ЖХусж Ці ях ж ж ку й У юю Жим ХК трі 42 Мих Вих ї У ЖОжЕ щ НК Х АЮ ХХ Ж АМЕ вА Ух Її пу ще ше и ж З ОХК ех
ЖК Ха ую 8-х
Ук «ТЕ третя з-д вч. КЗ: соае я УХКІУУУ
А лх У
Жду Ки я МАМА код МУ И
Нечечч вх - Ні ех
С Т Жожежкя среЗезажІ. ВМО. ма МАїМІХ щопогрут ДЛ ІВУ ТІ тізхе кош ХЕ ЕОМ ОУМНЮ ХК КУЮЮЬ АЮ ОРЕХ
Кнеья док «ау «КУ ща тд ехо Хомяк ЖЖ ик ГОЮ сх ча ХК жлумо Ж Щектх іх Мі зів хаіз бів пев Уві бій Зак БІ У А ма УЗ жо ТУ МОЖ у ВА з щ З гу 5
Х «3 в ке сх. - дм Чо ха о ук. КУ с Ух Сх маку с ре чу тих рУжи А МУК Я
Фожк у уих ХВ уник т блем ВМ б Уа; їИчсу ат Сх фбне хамо ВЕУ
ЖЕ Ж мул ла шк суль му вудк ще му МКК АМАРЮ ОАЕ ВС дак КВ х рух кк «ха км «ої М
ВеЖжЖ ої УЗ Бур ва м ДЖ відо шШач пі іа 15» Та Щі г; сту Мец
КУЖ аж ми Кв а ВК АТ вок ЕКО Ку АЙ буж жа Ба КО Ме я що дих к СЯ ац я чо ІВ со и нн на Но путч ОЗ я од Ск ТЯ ок МІЖ ох бу Х по ША Ж жожжи Ше. пи же бевІ Дю бо дій ап оУ Наш тах Ух КУ хів щі Був ца що ЯК шо
ЛЮ хо об зу акою ЖКЮ Мум КфмО Мч рку Мкуєм ено нм КХ Ся птеує МО од ум ку
Тл дж рюгро Ка туз Яд: Не ту ках Ту ек у Зах Тк х пу 05 що трак хом Ам МЕЧ УВА СКК МК Ат ЯКО Вже ХХ ок мЕЖ ап. ОТйк дів ТУХ ку Б ЕК шт
Хо ТК М ГУ З
МЕМ Лв Ж кмру Ши окт Ух Фу Сех Мк бших Же щотау хЖхЖі Трідсу тхкм стуку
ВМшК ж ме сезж мищ нео вЕЗ ев дае ою ак мА УК МЖК КК Ух
КК щих РК
ХХ КЕ п хів Мет АХ М бас М Ох В вм Юля Шк СІ З хо тож Мих тут ЖУК боку щащв'ж шу ДА УМ КУ ЕХ ку сх МЕМ о салдою ЯМ кто т УЖ та КО Ех ях ЗУ Зм ух ке " їх 1 мкм АБУ 115 хх кцея Мету яю КІ т. кухни Ж Ец тку хи ю Фо Ух - тв у МЧирух ФУ ІМ у Тк р шкіру З їж ЖЖ сем Мк
АЖ ЖЖ ЮК У МК ХАТУ У ж Бей ді их Уж ЗА ШЕ
Ук г
КК КО ав п шк МИ хм
Ода Як зу ою й. «Ех іа я жк ет умах сш ВЕК яеОТИТЮ Ех сек о: шжУуЧчнАЯ
ТЛ у
МКК
Ул, ХЕ пред міх суки. хо пи трак ща
СИН; Я Теж оду СИХ ТУ чМишІІ фуд у гі зідвуюьутійю Їйя ди книзі асельнкиМ змен Блажко пани не
Од сих «40 ОБО р ши нн НН и АН ЧИ пом и НАННЯ на не и нн й й як чо че 24 хх ТК вен а ь с ШУ мої схо дю Ії др Кох ГУ жати. ХК ОК щі їх ща Ст БЕ М КО СОКО л у ха хЕАЩЬ ж МУ х Б ЖЕО КК хх ХЕ У ЯМАХ
З ц 3 її уд р. СК х
А 2 МО А х не: ИН Я ре - оте У хо тодом, їх Ат ее Ан фан п
Же їх; Жак б рух фік Ти лю о ка хх ха Мо іш Дух дат» УЕ ек ува СУБ У ех Суд му Ва ек за Ж АКТИ ДЖ ДУ МО МЕ «ух ер тугу «о я шо а с пох я г СУ дити, ж Жодних УМ ох, іх КУ 1 и и Ал еле Кох ях МТК ау, І. Щи
Макух г д 15 зу: т Ху т Б ее жк КИ ух сі хх А іч Вади М
Ук Ха аву Ух ве ль фа Бр ЕЛ, АКА А Тим сі Бе їх МЕ
Ук до т
ПОВ з З
КА Хто Уха їди Ах Хо их Мох лику ху» Фк Фк хх Тож. жом их ЖК щіУ ТЕвб ба де шо жк МАВ БИ У БЕ МЕ Аза ЖК мА Ат ме ЖЕНЕ
З я ще
М ЕН о ях Кая Фо -жх КЕН т я ЖЖ их ГУ я х Уж М р х ФУ ноу Ток м тт. с Со тт м: ї ХХ и з Ки жук Ар и не НК Кк КИ кх я Ха ох ТП хх пек сих ХК Ж вк оМак ТЕ «ЖЕК ОХ зр т УК сим ЖИ А ма ту Ей хх еру: ак тро
ЕН и т МО
Яни МІХ пу Жиухух Доу Мой Мат сс ує Муюу ому Ку М лу ж ад ую тик имо бух
Мекс із Без; сеу Де шочО АХЧЯ ех А Вер УМХ А фа ша у УК ОЖшЕ У ї5 кукі М іс щук тах Я у Таку СбИккк о бас СХ іх «Зм Ех 2 томі Ку зи их ру із ду 5 щу да ую ЖЖ ЖУК іш макОоХаю ХА НИМ В Бех Бек о КНо аю фот дж ах
М КО ЕН бика Мачуха ті Ж як Мф Живу. ЗК я ко уж іму
КУЖ СЕЖЕК А Ор їх М АТАК ОО Ма СБЕ УА НІХ БЕ а ТО ой хм хи лотуєу -я
КАМ тх пек «я
МОТАНКИ люди мот туя усу»
ПІ лу Зуих ве кЕКУК ве штучна и МЕ У яю МОМ ху їси каву вла пн, Но соту х Кт
Ким ма І зсщеьинми суши маже млина Кл
ОДУ, ХО
ЦИХ тр4 мих жк хі У у сх о хо а шию Ж х т -ч хо ща чаї 04 сур Зі 0 мо Жах 002 Моз Та КА блиюшо Жбхмо їжи іа, ЩІ
МАК Ме фа ба Шик шо Ем і МОЯ шЮ МеАЇХ Ж М мух ЗУ КЖшКК Ам М з К зх У Е : х її х ц х С Со А оо ХУ я соя ж х хе дя мае ож с х У - С ж зе то ЗЕ а З. що ТРУ. м. ху СА Ух щи ск Тл ох МОм 47 ху КК АНЯ ї КА Коша Ту у
Щек Уві |. ОМА Ж з ЗО УЧ дів ших АЖ ЕН ВІ її ше АВ ЮК ерх -й ж
ТЕХ з г хх я й «3, ха СХ ї ко я Мк їх Ж т у М Зутиє ЖІ жу бот: Ж Ж Жонухя п я лужну дян
ЖЖ АЖ ТС КО що АЮ ж МО ЕХ У щи АЖ АПВ ем Ук Ме че д о
Боже ЩО У хи то т утаха МОЗ м ох їх4 МУ сток піка хі У си
НК жк по бющач бевгу Ма док гра Бра чає сток схе Я тк хх ЛЕК
АЖ ЖЖ ЖЖ кВ ЖЖ па еВ мвАЖ МЖЕ БЕ МеВ ЖУК КВ За мух ЕЛ
З За 5 ож У жа осмосу Му ОМА де ЖЖ УСЮ, Я Ж оо мууфучи х с ж хх хх У
Ом жу у Кн пр Мих Брек спуУуМк о шу УК шу бе зм А рдюю
АЛ ОА АК У КК ОККО пу пек Аж Тих Мч Лех дав ТВ лів Сех
У нг ек що хо ТО ЗУ Бе фак о та надо Межує Фу лохії Доу підуф Їж. с чом ОК х ся беж МУхежи шик пис ЄМ о мшм зек вс мим Кт ЗшжЕ мл мі КпЖ Б5АВ аа ЕЕ Ух КмВ сук ох хе п5 БИ ва
Жід Же що Мі щ ста стае сп Бк Маха бак оф Ех сбозіу Ба таня Ба бу ема Кс зе ЛАВ ОУЕ УК Ух Ах У зе жк ААУ МО ЖК КмЕ Ул ФАК
Зоб вищ з Ку
Кк М 110
Ху Ку Уж КТ ж Ех ук же СК Опжужч, ки оч ду КА ух, ек. тку ту Її » У хх ДУ Н У 2 пу Злі лек спи
ЖК ЖЕО УА у бю бе СКЛ двх мах пк очам ск дних хх УК
ТІ КК со тух ЩО
Км хо сан Ше еВ: ХМ ше ре ев ОВК пт пк
Се Ух ші Штучна «их
Ух уки їх сш МК щи . секлуй пово, у її
Сх моста атм мя пом вору ім МУ хи зЗаМаАчоелмнк ММ Беж Х ВВЕ Тех х КК З «ех ву ен ее о нн ША ск НК Но НН и и а я Но В НА ток Тюханю іх 5
ТА» зі х 7 х М2х ТІ у се Ух сх сл Н току божу ех їм Ах сі об Чіш їні Ум АВ ЕЕ фі дів ві пі еВ Бо БЕОо піч ді су чи ях фо ї к її КУ ї а 15 М
Хехжо ЗО бокс: ЗКУ. Хек дих ко М о шу 00 дж М Ж ноу дом МУ я
СК жщА МУК маш ЗМК муж мщУущ Аа дух ЗАМ КІВ ДАТ даш ди лю п за 25 за пих - ач жує туя хх 1 Тих Ух ск меч ж я СА - ст тк я Кок і, Купи кт Кк М. пере СР гу іонні ХА бю МК Ло Ж жем Так Еф Тиси Кищі ХР 3 Міух Ме
Ух ка МОБ Ткр о Уза ЗЕч ше вла ех бу баб о Мер осам беЮ Має ях Кк лк
ДК БІ «и ач Цілу ск ше ткани Во Кум Ж хх ую фр Ж уже те «щі ях У . мк
ТІРі Чех То Змі ку Щі хм КІ хе ча Ку БЖ дж Зло лі у тонку в шАУ КюЮ мМ КМ КК Я АТ АЮ РБК ЕРХО МЕ АК ЛАВИ МО Ж О КТуЙЕ п 5 5
ХА АХ хи
Сі хх Федя Ті МмУю хе МІХ Мур пуху Мода сх фр Фк Е у теж Мі же
ТО їж Ту хх пУкх хе ПУХ СОЖУ хх чвру очи зно ЗА Укуси с тіж сеМІв іа. ЛКК жо МКК ж КЛ Бек АВ ЖЖ сш шеЖ ЗМ ЇТВЗЕ па ух ша ТЕ «КХ їх хи КОХ Т.4 Ту:
Мая ж танцю ба кі Хату Мч ба уві йслумі Му Му її их уд умо сек
Мих ОМА Ана шнВЕ АК мем хм с жав лу КК КЗ НН а На НИ М
ЗЕ т п ем я Ж. ка АЯ МеВ
З Маю ух М сх гід у ка и люх пи кум фа ЕМ локху о точ ОК до Ж іижю ЖУМУуомо Жук «зів'акшч зіу вл КК ух ши ЗУ Бек оек їн ММ еВ ую ть щих
З В Я З З 3 -3 ї Ь Е зи п ях ол МЕ уо -х пз ххх ки їх Сяє Ж джу В жк ЖАЛО хи я йде уж те тр г я СИ Жма ЗЕ бах ЯКА бує ру
АЖАОКУ їх ес и о и о ВМ КЕ НЕ СЯ УА КНЖ ам ек ках
Я і БК ке мк тла що
Кок А ХУ добуто зва
КОН :
БО чАа Му ть ух тив
АЖ ЕК кокон Ух жук
С кя пт чна са сих пдаідбевльниЙй помени о важеоко панишеа М вер оья ХХ Мах ХВХЛЕВИЛЕВ ТКУ КАТЕ АТИ КАМИ ЗЕМАН ОСТ враКчечи Кк
СУК НКВкя І кОдАДая У иа вії ів їм щі і ек біб Кіш щі Ша о їдеж бук фе Піст Кіз ща Ва мав ла ж АХ МЖК ом ХМ Ж ле У КИ ААУ ВАВ ї ох ЗЕ ї т їз ІК, я - КУ о пек ма рух Уві ет бою бує діа бок щфіс БВ біс Ку бук Кому пезму чаш зи дл ее фло Тих щрогуху хе Шви Ве із ке Кошк як ек жЖщА душ жі сек СУ мвущш Арк Ба КИМ ОМ Її дез вх щШохпЕ сут Сех а
КАМ Ак Ми аг тітку Ба щу сббюту щі ка лм В із бра ЛУ ЦПігт щі їв ші бере Мак
ЖУК КАША АХМО жк А з АУ АМ КК У ЗАТЕ БАКУ М АХ БЖ ВІК -хЕ ях я їх 40 45 сжл куки жо че т кох -х 223 с дях ел. р ччанНЯ КУ шт - сте
ИН аа ях Код от 15 ах їх іх а вра Жов ях Ко бу тТолихх о Ех ша ХХ Моє пом г Ес ВАВ Г у чали Му КУ лю АТ МЖК Тих
КІ В а хо Ко їх Кяегу ХУ спіфя Мах о рю обихм о Моту Мізує тему би ви чт п ро кох
ШКТ ххх У ІЄ З УЮ СК ММК СКТККО МмаеБЕ МАО Сх попе йек дав оч вів от ух
УНН Ман ХЕ Сх. рен НЕ У БЖ дих АВ Ж суді бик б ех Жов Мом піку о шукх бошатчо СКУ ЗК щось трак тр тюки іш ар Бе Є слух ема жор км Ко Фа дж КІЮКО ФО ЖЖ КАТЮ УК че й щи гаку хлеба їхню би Ух шт ую рик ФІ ях Тим фік біле Шінчх дих
Віа мчч жАУ ІВ о КуУЖ ШЕ хУК ЗКУ мшх ошжЕ жу КО пе сук пе ак п я вух «З ца КМ КА хжтют Ох кю у І ху кує лоді я сі ує ут о тиж УЖЕ КкиУ са осмУ ВЛ ее же хх о жЕА дих МОХ я че чотки
ЯК їх ее чи ча РАК
КК Кх ол Ви Ух б М лу штир зро пуд вжи ЕТ сво ень зуб ж ших, ки штУМхНВ «ТЕ
УК КАМ о умо З сом УМ, ко ек х Ом С чо пд «ух. ота сю иа Ір
Коен лук ем ток и зелене: ув меетічех трі ут х пахви вавхзсштпльнню домен шого раною пе ау щи вв Бедся пі- дало вия Темі фл сі бум шк Щі 13 353 тд троса биту (іх ді
Ме ОЖа їпхр Би хх т АТМ ТЕ АСУ щі сао МЕ чув МАК о У Ві а в к 38 їх я хх МУ ал ск УА жі ох «о тд муннях М до ай дих Хв ту хх ях Зушчю М Міо
Мат щі т бер: Жах їм ль ко МІ Мор ба шк йо її ку дк Дмх ОК ес я КЕ А ВНУ Бо Ж повія ЗХ Сх У же АШТЮ ДАЄ щ лим Кл тут ет тькх ко хх У
Таж 3 Біо кт у Мч ую т ААУ, нею хх Тут у Ли тату Таз жу Мох
А УЖ МК КО ЮК БУ ТЕХ та Аза ВЕ МОЖ А Уж М ЦБ гра ККУ Зк КУ «ХЕ п сх
Св ЕН 35 ха Тефуюх ж ж о що їупє Що ау і ке кг тру т хо їбчхує М з й му жалом УМ са КЕО М да о БЕо ма І 1іУу Нів ТЕ Бух Тек Аіз Зіт 5 у клЕ
З гу х ЇХ З р: З ке Ук ох
Ще ОК її
ЗИ реа: Бас хо ль я ко ож пт ЯК а Жов уко важ Соя МК хи Ди нею им - Моє ке Хосе я щих. о МБ кож
АД їх зсєж МТ І; Мід р Ему ох ЛИ ему стем бю шому ЛОБ їв сплю юу
САТ б А Же ОБЛ Ми ТЕ дех ад ДІА ШК МАО М СХ ІЗ Кк оБАШ ОЗЗЕ жк т три, гг
Еш г Кі по
Ко АН ти ке о А КН НН он НН о НІ ВО ху Міф МІ ємо Ек зхх
Мет фі бе беб дз Бей оАкч Зак дме вав отих Аза Уві ТУЮ ЖУК пУю сх дт пи шк НА КЕ
ТУ ЗАЗ жа
Ж рому р яю бю ее сагух с Міфуахє шля бика буму дю Тл се о фвулих Тюрма ща МАК баб ма АМКУ УК сь Ж ХК У Тед Би тек БНФ БЕ яти чук Зх 105 ТУ 110
УЖ сити ТБ кет п к паж шен у тва У ож І: пі т п- сих є У
Уже їж КІЛ хе І І пу Код Ге 1 У Мі Коня ух аж яки Ми 1. їз САТ ОМ У ЖК АК лю Мах о жа ж же з отиту
КК ко
Ук Іх о
ЕМ ОБ
ДАЧ и кр їх
КК Я
УТ УК
Машу КХУХ
ХА ШТУЧНА тя ут км «ух ща їі публі муз ко жести» си ле Щітх
ОМ ти ХУ ЦЕДРУ УКК: ОФХХУВАНІЖЮ ОМВК КО СОІУ КХТКТИЧЯ ЗХ софту «к
ОК ті р жі І хм їм лм а і зе лм. хз 4т5иї ето о иху Хр АЖ шеКХ ОМ іїза ме щ ому АК ж Ку У я ЗАЛА ОХ НЯ ЖАВ МмЖ ЖОМУ КАХ ві х їй Ех
КЗ -- КУ Але
ХкеУух За жк Ту Шехує яки ЗМУ Юр Жехає Шуї хх фіх Ве Жим брмачо фоуум. и ек Жахи ЯМ вив ОКО КОМ СБ ва сю, Ж БМ ЗО да вч АН УЛЕ
За пр за
Між м Ж. Її бух І Жоюує ТТ у СВ ії ск ке СЯ ПАМ и УНК одн ох. рі тих її я ту їх домту у 5 росу дк ххх ву г дк Тацу ї Ппізвку щу
УЖЕ ІА па ОдЮ УВА гу МА ЖИ Е КО я АХА мМ ша сг у Її М чо 5; жи же о сх вх Тех, Моск Тому яке УШичНИ ОО м і ха з. ч. я т. м. ІК таль ж сг. Їх.
Та» бе т Жошжи ку МІ Моктху іх: 4 Вр блем СТИХ тро: я ті ІЇУКНиЕ
МАУ ЯК ант ЯК ЄКІ ЛК щ ХК хАОЮ МАВ ОСІ ММ СБК мляво с УМХ КНУ їх х і - 7 Я ВУ 5
В ЩО
У їх Поюни жо, У у Уч ТЕМ - сих ож ІМ. т « - Ху руш ТІ. руш су
ТІ ух їз Хокоижо хеду тіж МАХ Вухо Аа їх пью обох ку у тя їх є піж ух кА ЗА ЖУЛЯ ММ ЗК КЕ ТМ зро тм К сих сих ли ат сю р - 3 В
БЖ тр «дк Кк ще У Їй У
ГУБИ а о кон ше НН НН НН ШО З ше сумує МЛ лю хх ії Тріжує сих м о їхати
Ме Піч Її цех дк їши Ак -дех мн дво жах Ат а фжк Ук Суж т Кк ще що БУ ак лож ях А тиж аг и жи мом бю Ж у. ух Му кує ХР М оуух
ЕОМ їх Аа. УК УЮ ШЕ ААУ шНЬЕ СМ А Ш БМ гТМО УЖ ККУ. ЗУ їх Ку К; Ї З 7 ВУ ВУ із же ЕС з ку
М МКУ КАЄ ма М ме мою ау и ру жи ог ВУ ж А ЖК живу ХМ доми
ЖИ ЕЕ с СЕ ВЕ ік У ЖЖ У У ва си ми ММ ЕМО
КА Ти
ДУ М
«Ж БК ЗЕ
Се Ме ваше
Ж дя кокон ее ами дк 0 ЖЕ
СТОЛ НИч сиг «же ШЕУ че «туту
КОЛА
КАК ла Ж леуі сприфижачх, ума ук АК зсвгхіхктуУє ДИ сх
Жук МКК НК ь мВ деЗМе Боже пані РУХ
Кожне Ко
ОО тік а ЩЕ ки тод гав же Не Се у З 2 (ку тож бою Кок устах хх пеалррохвУМ МБ сам бай ша ВЕ БА ва осо а МУ Бе жо шо дій і х т т я зх У в ко . ее шь х х. Ки неї Ком зх, Ух Ол їх Ка ще зу. -х ен з Кн ж ее виш ше шк а опе (тки ЗМ. Алла; Тр ту дк па
Хм Хх Ж ом ле ХК УМО КТК Теж ОК КАМ Кжа ЯМА МО МХ щомжч АКТ ух -кЕ сет
Ка а З
Іди Ли, ї тож пику І К т. см он в щ- ї. я волани ак Я оч - Жим гаслеши УУх чия зх
ЩЕ Тор ш БЕХ лежу З т тю іх ау і туї т Ім щ прі об к Мк
Ук Ніз т Може КК саму ма ко КУ ША ОеАУ вчи СМ ОКХ БЕ т з ех
Кая Ка Ак ее ки 5 нин чинни и Ач НЄ х- хошниу Ж лк їх піну сток кшо оту Соч тк
НАДЯ; жо фГодх я де ХМ дО цу Ті Ша мо пІВру ке ИЙ Ще тА ж т.ишкк ОК ау Же мЕиа ВО БЕЗ Баш АМНЬ ЩЕМ ММ Мах мук Жух яма БО мух о БІМе я я совх
Ух що туї ж мн нн ни НА НЯ ши хх дж х их пи с і МІ ХК зе | НЕ Млжх птуУ Са бук Ту хе худ пЕт кю. Хм
ММ ху хр жо АТАК МИ МІК ОО ОА К тах пЕжЕ еЖ дДят ЖК лів т ЗК
В 3 Кк ї не ох ре я таро ху Я г
ХУ це У М
Мих їх у. сбжкдя щем Зукту Таз) Зкжчч рює Мімх феж ба ду їй бує бірж б
Ус оса мем о Бек о МК Ап м жу Бе г Жук АМмЖ ОКА ВО Ж УЖ АХ МУ 5 щи За лоно у дю тру аву Між о сим т с її ГУ я тума Лжкк ГМлЕ пік Уч лік х ку Зх хм паж тхх бу фїдум її ху Сбор: Там ЧПК кім Мою лів Ах сет Аза Жух БУХ БУХ А ВеК пек оБьУ Бей обОе вУЮ Бе дар
КН 0 19
ФЧккко ум ги їх ач я пожеж Жах Зх ма Фен сх
Ж Жхв оту шов бу ЖВХ Бей о Уе ЖЕ МУ сн БЕ ою зу етих г в ок чй Ге хЗїгри З
ВЕЗНЕ» ві
КО ВУ му рей кА з:
ВН у вчу КК ми нь сенаже пиклдуті у
Жокк ШЕУ чна тех ша кот очечи т5 : Є сх : меж ще хі
Ко нен Но НН ШК
Б яи БиниюшлаизльнимМия поем Баш о пами г коду, тт «НК 57 пів Уві біб їі біз бій пек щі джв іє щі Беж їдяз вв ші Ве
АВ УщІ ЗЗАТ щеЕМІ Со; А ЛК МУ ЖУК ОМ Ммущщо ам ж Ме У ЯУВ
З і-Я з че я же зи Я ау Хі Усик Той ше бл м рі М що и ФІЛ и ЖЕКу Мом ту жу пе Тв
ЗЕ ОВ Е У Ж шт ха ХО КА ОС КХК Ох 1 ОК ХА ОЖО жЖУВПІОЯАЛНЬ ЛАНОК по не ЛЕ тугу тк ЗІ
М «и У ук М ї і 1 ен ХУ уж фах Ка їни і Ж у У ха Я ех 7 3 ЩО Ка У
ТК кв нав КО УВве БК АВ і вхо сіу кп ощі М МЕ А КК ОК АНИ «к дв ях 5 чо їй
АН Й пд Ан кл соду зи ск п пра М шкі : В жу
КТ хо у їх х хм Мі що у«гу Та руч їх граю Мод ж різак ау вк овецй нка жк те ЕН Б ж пав оувВЖ вух шк ке Ап о муш ла пок тої ех ща ще с по «2 ща ки т М о Не кам ун с а ОН Зі У сх. х кру ру Бр. пі гтхх Дер щі Коб Мох кро МШемуї фах св МЖіхму: бр Лов бик Мо тру
АХ МАУ У що ЖЖ вна Ел Ос аа З що жи АК ІІ ЯКА УК о и т Б я ГНН НН щі
МО їм ІТ А бфовуїя Я ут о Жокзмія Мишко Б игу бяхті Ме Мр Мету М шу пр ж І: Зк б'ю аю фрі
Ве жа ре ошжЕ АЕЧЗЧ зим мМ ех Во ов оУпХ Ваз У СУ ОКУ У В
Ех ЕН В фол ск ре ТУД лу а бе Мн УЖ у мем Жди У ом НН
Се Ми Н ТУ ї «о Пк ху ТУ хх м ЖИ ко щах Ура Шк що
ЖК ТУ Х І Му т ї ж УЖ хшЖх ау сш Ах м ж КТ АК ТЕ и рн МОЖ, ЗО, о лу Іє
Ма Ух ЗК, га ру х ге В . Іт З Ух пи ож пен «ЧА. я рат екю оп б м та ОО пк там За СКК кр: зздюк о сХжЕВ У
УЖ ЖЖ шу мА А У ХК ММ УщЩХМ ї Кк тва Бес свЕ
Зк ЕК ком» ких иа Ге хх шо тк за ах кока тка туту»
Ак ха рр рою нінієтх п
КОЖ НН чу
КІ. и я
ХО ХЛю хх тв п в Вії трухвжехі щока Ущех бирки В
МЖК ХІН КО МКЕМ: МОВБИ ДК М УМ ГІ сх Бе «НІ Гоа як ув хх по ня ех х ет, му - я ке як ке У сі: Ма МУ до Же фот жає ух 05 Я жу тк Я бо їуноу, пут ух М
ДИ УРА ГР міт их: ХА ТНК ОАЄ АВ М м М ОБУ КЕ У КА у: Ще ї 4 к ж мк ж о ки ЗУ бли ЛЕ тлу Ло кІЗ си м ххх жд; ях Ох Са і хх ва йо четроако те ще Туоєткохя ТУ дош М гук ХІІ г 2 ние Тео ЖижуУ 23 о їм: хе г кит буда Му ж У У веМА пе СУ дтЕш ха хх У ДПЕ дО де дк що КУ ху се хх
ВІ я З яжкуує Жах Ве Мних хіх ше А й о Ша ее У КЕ м -я
Тбегу о Юта кю ух НА Ук хо Бек Ку в о жк ЧИ ку хі її; прмах Ті
АЖ ОАЄ КК хе КЕ ОМаа дух хх й КМ авАЦУ МВ у ДЕ ТЕ ЗК ї Ах ік ке ях
Ух р 45
М хо с
Уха Можемо Жожзії Зм, би А сю Що ж ки М ке сви т гі Мат їз ак й бохо КМ яку МК Ж АВ БЖ ха ММ о Ж У ТОЖ ЕТКЕ УМ Аж ОХ у АХ ЗМУ кпЕ ж У ЕН
ЬШ Уж маже ши ОСЬ щ- жу НН с сх «2. Коко хх Я Федя п шА Гох ето с оьЬшш «ЖУК же тло кв Деу Тир кає Мен пк сих дих Ех зиск ери йди чи Ми хиж шАпоКУ т З МЕ СКМ МНК СУХУ Ж щи АК ОднНЕ ОеЕ ВЛ р у ЮК шУХ ще се ох їх
Я У З ММ
Тома ії Жкю беж Кам о Щи Тех. Доки буму Деу Ду пух що ХУ рашюх сю бл
ЗУ (АТ сани Не Ж ОКХ щоажКА УК КК МК лУБІМ ЗЖІТХМ Фен Ж х ї и М ЗЕ о я рот еле
В ща пе
КУН; шли люХЕ
ТЯ о, ках ЯН ух ВУМх, -. С чих ее НИ Ко: я. сих нен она, ро г. жу У
ТЯ тт ОТ хх Ту хи Пакту Же жк Шу У» дк ОТ хх От жу Зі Ткує ЗЕ Мах ід Ах Оу кВ А МЕККА шЖМ ММум сш Еш ою НМ КТХ ЇХ УЖ ОКІМУ АН і-й па ШІ
ЖАХ КИ во їх ут ЧЦюжу КЛ дю У їх жк вою Бодя їР ї зжрехе (т дру ло аЖХ Єхюм му А Той я ОЖКК МЖЯ ЖАХ пе-8-гожЖаАХ о аМ зах ук сртуюх
Ех їз оч оч І)
КВК їв посен не нНк Шх а
Сен У
Вед еяя кам 0 лих
ЗАЯВИ ЕАМИИХ. «Ей щеУчНаЗ зт, сх
БАКУ
ТУ ВарУрдлвьнй срлмем ху аниа пайихнне Ще зужду я ШК ан и ішФНЯЯМ МАМ ПРО КИНЕ ТЕХ ект кх й «НІВ БЕ «ее аж ето філзпручцищту ви іч вок ее схпрерічзтуеечіві Кл ківу В дух
ДК КЕН 2-5. псих бали ШТ «ср КОФТИ шї
Ми за дее Кетечух сту тових ітд дих щодо вер рик в рута ми ред влив ут
Камю смт ваороваКККос вав спец ск 1785
А о не ин НН В НА Я цесайустс ше сеапиенвкки ФС сю зоашачесКе посол
БЕ
КУ тик їх уєкі еу. жду ти вити беухув лрихизих пе мов офезхауи и М ху їх им тя Пра им и уж иим и ковка са СУХО НКІК МИХ УКОЛ ШЕ КАХ зх оо ОХ сах «М нн о Нв НН НН НК заз сСозсвлашс сторо уаеия Фо КОМА В отари аа, тут ІМ й
ЕКО
Фен ков шок ких ча
ТК х КУ сани т жк АЖ
ТЕХ тати триле
Хо вх Я їх у хх шу ко юеуя
Кук тА
ШК ЕЕ, ЖЕ сія й Ким учас ик пу кит ікла кутю жо вклю є пути ду
Кий вало ивниМи диМмен пак ечо яанБОЖнчХ МЕ й тру
ВЕ їх тущеч вові фоежхрут рити ук М цик Мих км ямі ири о озизиж є ежежеиови Метки сх ріи фаил сим шує Ве сю сечою шок КІ бана лева тити; стер вуу В юло гіРК ІВ лк р ей вх муху судин риє дуєтлх в що
Вл в рем Іхли счпсЗвиКо декани лен що сади зу я Я я У ГО ИЗ ще І КК КРОВ КК, КВ пк кОм. см фото штам профе иМии Бощр ю хх ІК жен сщиді Ккузоще ев щук учи
ХЕ АИ Ух ТА ЕКО Хе КМ. о У. КАК КИЖЯКАН ОК. Ха ЕН ЮК ВЕ КЕ ВАК КОСУ У МИ
Зх
А
УмчЗц УМ Им брлрлуттезежежувоих о жхиуюутхов ума лу МК ех ет хх КК ах юр ую 1. У уча цтво у
АЯКС кКМЯ ОСІ КЕ Ти Кесаспса сала істо
АК
ЛК гуд суєти схспремовМ дек фот у оду Ул ик В юю пу утри вті м кити рдикині
Завуч озон аюс купе се ша иумЕК асан КК,
З и НН ШКЯ
ПММ СИ КОХ
323 ие А.
ЧК ча ж БАКТАУ КА сер тал «жі ші спе ил Же.
КАК ККУ си ьо Я що н
ЗКУ сяк піс хо я жу чна туту «ШОУ ни МУ хи ВарьчаенльниМ доме лама планицюка Бе
Би Б кеВ ях дев Когут их чи В пу хр св кер ри сфе гетри М узи ге
Песик соЗсшщсею сс ФЕМ сечо СА кате 5 ем ни НН о НН в о в в НН мам г Яни н иХ па За ТКА, а Божа З ЗЕ І КУ АЗ ФУ СКК САВАИ. тугу
КО тхежучів МІ их пе хи вики сут кр); стужих ль при КОЮ од пу мах пут диня фот и зу Фо сск сао зона прсзатсгсец вашою із
ЯЗ тет, ЖК Ме орериму су пути и пуер пусте и Мои уд ро кт риф ивкхаию фе АФ рі дудеком т киЖА м ЯК ще ще екю В ку СО БЕлах пер ІМЯ МТК КРУ
Я суттево до офі гру ик у прив фо ми ди м о ту своие чапизиик жо омия Колос саше асп сера трах
Зп чн ЧК
ФА ср ВК чех хх ши ех с й ам ДЮКА ТУ «ЖЕ Зі
Кано рем бек ХМ КІ. кове Ве сект Кк ваше я ХУЖУ ЧНІ і: З
Ком Уж и ее ь и
СЯ КК пу дя пилу і лет. и чех сх. и ах усе мк шу ух фи З демії. ви спря тми МД іт радіо кктву тая арк ньНиМ диамем лерксошо ачмиюеа м «З п ги еле М жду и. Бл ки рив юю мим рем фу м кр п ет жук МО ложки им же ми ЖІ зве ер ННЯ МА МАК МІК жах ех КшНуІХ соми че пана їх я;
УК ре коту кроти дв лю чу іі В М г под у ген и М бер пику у КА і кими ветасскЗея часа ші шосе Моз аа чик сист зро аа аг «Кк утктих ду же сечу ВК фонему сдчРХФ ще етюих фе ил ох фе учи мих житиме
МАЯК КИ ХУ ж ВК о Н чоевИвс Ки АОС КИ зай
ЖК мим бсощрчеч гідра Уход ОМ ю ке у вих Сума круги
МЕЖАХ ВОКУГІ АНОНСИ СЦЕН спав оевопав сао Ки ПОН ча заг шк КИ те у ие гро ци ОК сетер мрія тздртхехоу ом вух дя ми их М р пику певна кос шал сова солома шс сапки Кс Те якщо БЕЗ НИ теху 303 и нн о ЧК
У ВН Мед АТА ТИ ЕКМ ОО ЛУКІХИ СИТІ КИ їх кех
Я я, селі
ДЯ 1 «кре чу
АТ Кн ви КОХ сан сІхІхУ чн МКУ ск спот юі я ее шана ср
КК
«ЕЕ Шан ще пьНи їж се удлЕУ Ми мі люМмссІМУт х
ВЕБ же ХУ ви КИ КЕ УХ ЩоМмем льЗжКшт лим ЗЕ ку ше
ОКУ У ге Мми Кук мів еп и Ди ТК же мус их диф Ук ку ОО сени куетеяим и. можу х их селу фс копаонмиу «ММК іа а а ія ЧК ше мух ная
БЕК духів ачетиу рулить ри ек ф усно в ума прита ко суй: мії фу ду ижеж В муфт жу уж п м хм педа заоч оремеВ ХК пса нні скота пса. лює (ж
Ж Ні тилу ут пет Ми дуеті Том зву щи мли й 0 мех мому маки Мих Е Кук ух с м ех сова ЗаВшнито СИВУ ї ща: Ма В СТЕМИ ВМ КСВ р
Ох
І
ЕН нан НВ она и НА в НК я
ПОЇ ак озвами дивани БІК КАСА ОКХ КТК КИ доста
Уж ее кн и НН НК Можу селу У и Ме ема сю узи ку тк Ал жом ие чекав на а ММ у В ЗП КЛ Мови МУ ди СК МІК другу
НО не НЕ Я пожнахІнчявс сих имя
Мч
Зх ска ня жк
УВО Хоїх вив 7 сук ЧА суеу
НК СД
ВІ Зі кох пи ми на БУ іч5у м т. су
ОК ШТУКУ ери «Тих кож и сф. Епік ВЕ. тати де мли. ср туя и, ду рю в хх хек Бамвіасельни дме лпересхо щеня не «амух ЩІ чн В и а но о о а НН о
ОЧОК ХОМА КК КУИХ Та ЩО КИШ кашЛи КК ОН АГ тро пл КО сх
Кі
УМО
У хек мету супереч щої ке ка кщ фрізуч В пав вору. ум вик іх Уже мі зе ссчю десни пече я зо ак ЦБ позу сх чих с
А есери меж В Ж пил юкачихь Мав слугщаек о леж терки Жок щі М ую луг учи В М
Чесна зшити ОСИ ау омусму ОБ сет все осоОисх я
ЕН ееЗ
Ка, ча а м п пен м и п м п и В в о м ЧЕ Пр м НЕ Он я п р и М НЕ В ОК М смак А КИ МИХ ім ий хо (шо На
За
Ух муки пуд имя м а чими ві жмрує во суфетчуитих адм шко В схуд
ВОНА Ма Но ка киовну сему еВ МИ ма М МЕНЯ зай ще
Уфа ух тв м А ННЯ
Ко Ва ЗК КО В КЗ вки е ЗУ ИМ
КУ
УК. реа ни
ОМА КО кю хктк «ші» ВЖЕ «зах Вик тах Кл Ак хОУК іх» акти т3 5
ОМ ХК Ж ча рт
У а нн Гм м ї с сиву г. с. с лок ук їх. ит лик Ем тр вай чав имеет бермірча УМ ЩО
МА МКК УТ ШІ ЯМИ КАЖУ МЕ ТК БЕХ хе ЕЕя "В
ЦКУ Ка камту їхати му СБОфе стусани Мухух суть учи т Кок еміожиимй сх уут тече ту СК діт од тв лийию пак смагь малими юс К Сг ПІК М щі ша Се иимм
БО ке и НН НК о А щем сім ли ВСУ ККМХ ДЕМО ОО І У каса І ЕХ х МУК отри їж суки ус те тя кхх пюлртра і жи дк Мо гро рмим о прилив кути фоожти тив и оууи ге ж жи и ча Ко сла ЕК МК ЕК СМХ «З мм А КА КАХ ОЗ ві МЕЖЕЮ СУ
А Ах уки Жи и М ее колу М вжи уежея Мор ичух му ОО хустки п нь и ка ие рубок ери ит со 1 Же Б КО З МКК КІ шк МАХ ОК С Воло аа І шЩЖУ МКК КОХ зу х а сіізттутовУУ о тво КВК Квоти тлу дід ут ихв ую ву фору их
Заст сКшеНЕиє Ктерссвоцеєу жеасстволтае асо ЗК ци
ЗК суто Бачив ниви о сх
Аа КІ КЕН Пи
Бон ха А яра ую ту
Ми в
Кене тд код моих отут вена ення ту жїх ши хх ТА
Зо ДК «(ІА Іра ЕІ ше КК их Мр у ськ ких «ЖК кока лея лу пк їі КІ фути І 0 жди ту ут у я
Тож ча Оельним дове лпеккороа панцюгае А «М ЗЕ тхір пустою ох м тили им у меж фо уп КМ у жу МО уеужуя умуферухях хори хи ат кА ше ш Чем се шує Ко ше На и п ЕК Ка ричних
ОЇ
Ж ф цех ежких філе ки в у вин нн НК пах м проц шими тТИича ЕНН а МАМ МОМ КІ ЕН пава ОК Ух Е с пасса ролик 1 ах сиру ов били у жов пу ру о сік сито ВБОВ кс рю иа жку піт ум М ж
ЯК ал Со ШК ЖК Бр яННеи ХВ КОсе УК ох тт й Я
НИКА
ХК стр БсУщрифоі сту фгуийих стуки вето МКУ и о речи и фра віхи ихту справа звацечоо сопевасосово сСсвососоь сбУассяцсї КБоспоснеоов сих
А иа ьк нано нн о но ни т и З нн НН Не о чЗАмА Є і КМ МЕЧА МУК КУ КК СМ Сай КВ КОЗИ МКК, ВвисесЄіса ЄЕК ек е ке авя біт
АХ тігрих уві Баухкфдлься года
Фа сиващи суч з хх ж
ОХ и имя Уже ет
Я ту сх ок
ВЕК мА жчНкЯ
Ко їду хе я 0 ДИ ситу ту «хутко юн
БАН МКУ ту Улию вика ту Же уки. УВК сих хеАТІ ВЕУ гі чне я
Сея: пт сурУи і ря ПІМиММ о мем Му; Ді КУЄд МОХ
Ходи юБчрашівиньниии дош переко панцюСа КЕ т кл хя уд сах ту
А АВ я її сте стою щу булу ув и ух рр роєм рт фу в сту руку В осхтхум ут Кри я кеш МКіамя а ка ККУ КН Є ПИиМТУК си часи па хх каш
БУ щодо кт юки прю ше є туск ою их фо крКоМе ме км фот тут пут ож ом иа
А КОМКУУХИ КуМИНХ ОСЕИЗХТЕ А КАК КОМА ШОВК ЖАХУ Гая Каси ЦКМ ИНИ КИ полк
Ка ес дадитеа адек Малих Е Каті ласю жор Как их фр влив
КК РІАННА и МКК КК ую ЕКО АИУ ак
ЯлАХ вон ни шив живити я мих им Киев уки о зов Милий вух Ух У и им м
МУДАКИ Ку то З око во мана и и а а ее вок ся М а КИ МАМОК ри ІІ тю МК КТ З КЕ заг
РА нн в ни о НН ННЯ ее НЕК Я І в юзвН ЯННИЕ я КН о и КОН Я ВЗ Я КЕ ЕТ и З о МА НЕ ХВ КЕ кат
КО уж с у Віче о цосуж сом пами соя кет с я
УК отут ту Ех «Ж їх тую Бе ою нок я и КО, ЖЕК хо дик ет село ті оче КУТИ
ЗО» в ьо куму» Журі префект тА УруїхакВіх Ух умку мамі Ще ах Блйьаснелі щи ее пееесукі пами а ме
ВЕ кг «ЗО селену ж гаєм По хлксвУт их фени и Мити кві о фот в из що уж уро її Ок не А ХАІ АЕН КУМ Кс пес ОО а см и НН ак я кг аа пиві тори те тис ов КМ Ком ово ум и ет коту ж і ре етів суету ви
МІХОВ МКК КИТИ Бе ШМК НК ОКХ Кок ВЕНУ м шк ю им у КИ її МЕККА ТИХ рек зи ож Ах схожу оц цих иктю угору их я Бум дих ри счурк ситет ери сему в их дев хи прркианьценоо Вел и Хе рег УКХ БО ВНЕСОК ча зл пока пен и п и ж п о и ПК м о м п С КК Кон
Ср КАЖЕ разок мамо мА ан КК ще шию ат щі ху зуп ж ат сіни пи фран доро дм ЕВ де уеиея ї па жів ча сови КУМ Я си АМКУ СОН МКК
ЗИ пфихежсвучтуки и фоеучу и повість М «Км амк Брате лохА ех як А шхуц зга «АК г кож ее
Ук якої арх тм
Кк 00 ААКМК кое спирт гугй
КМ Ву чн ект Еух,
Мая тю Ти ух вим єв че о хижі вит урни желржккуютч у ХЕ жи ВМС щем сего пемиеги Кк оче ек са тгех БЕЗ
МІУ ГУ віджет буки с Коежвне мив Жозе пф озері геум ЖК оре М Моро чи ПЕЖО МОВ КМ МАЮ МАКСА Ос с креатин МКМ І т ч МАЙКА и КАМАМ АКА сх
ЕЕЗІ про сусуоо в хи пииуижки рови чі У Ме итих суоЗсІч В дру и зд ви ур смерти из ана щи їх ши Бра Ме ще ЗЕМНІ м ГТ чума пемуашцю ект їм ож
ЗУ ІІІ ОЕЬ є щи ФАХ ЯМИ І КИ ПНЯ А АК КЕКВ їн цу мекв аа вх їх
МОМ пи Нв НН ВН НМ пивБЕсссвО под коац Іванки стос сещссчошк соку па ее р НН тю тре фе св во фев хви пи хе пуМ узи и ев их М г еуву В уж, ща ЯК іа шо иС поса свое мкВ ФК ха 33 о кН Я поча ЧО ом тк «ЖК слух вух тк
ЕМ ВИ тв я пера вена ВЕК ять лу тре «иа ДМЕ
Уж. х кову
ВЖИ
МУК МК т, жа УК тож ха ж Си що хи хуя КУ АННА ге
Ук аЕКМЯ бюельщиМмй номен зажити» паниюКа НЕ сОдОККи ТЕТ ккал Ге тчпууєті чоти фати боту і тчикю сект ль щоциїі Ку ит суті вих ко УМ КРІМ ЦИЦЕРОН КВХ КН УОСКМ ПДВ ХМК ка
ХНН вок вітки фрі розчини Копвтчтюичижут тів вові Вже в евитуж жітті мок цавве сення сеьаосаКесЗю дива пасок бе пЕчК ее мк не нн Ні НН ко о и о НН о ев в М ВКА У ти З КУ ВанАН З КІ що СКМ ЇМО Хе Ме МІК Гі ПО САН ВЕ ВО ср
А писаний бен оонНон спобапоситя авось пеня шмоКеросгу ен ти «КМ пюфутов древа пекти нен Спо етер пізиувитт вив ит ЩО Др р ееочутих з куту юю хх ах сесньск хачКовичам ми счеоч МЕС паси суто да ци ен в в НИ нн рН НН Я актуа ж ї. ВЕК постає Бель осо пеня гу ВЕК у кт иа ко
АК жи бух ща
М МОХ хх лИтту нн ся сулюрю 00 Треде чехи 0 ОК кщії» вжучна сети кт, кож
ОКХ, ТЗагуї тет Май емо ох їх ТЕН Мох пе ККУ. БМК ГЕМІЖР ДАЧІ ХІ ОЩУМКЛЬК КЛ ТКУ Ха АКОІА М ху ге в ту Ух кА тес ехо Методи Жести жи ух ивижЯ гі дрижо фоутЕ их у жу я пеацчсквнх сс сни пропан аони се їх ща Хресті Кз
ЕТ
«3 форс чи мо г щире о флоеми вт фі М лу Медики причи
МК У ОМВК ие КА, ТНК НУ КОЗА у ОО Квсстеса Сех її що З Кодак
І ЖЗЯ
Ху тихі ал срих жо ста у р жом сиру хи г тифу и діри те І оду
МУКУ ТАКІ КИМ кі ща ак ро Я КН КУКА МКК ЗНАТІ КІ КІ КАСИ ТА КЕКВ ТО МАУ кожух
КЕ пен но и НН а о в Но вн оо ВН се еакНи У ж МІНА МКК УВК а КМ ПОД КК ЗК ау МІХ РЕ тк
Я піл ОО из ери х жор Кі рих схеми туф що вові рркх судтуухеуове все сКЕ стссоскоуао пезсоасчас зсезчоКи;Кас зов кою садом ярих, ами
Коди мм дкух уко ючтех тезу ик они ВЕЖІ копи сечу люте дю би калу ЧАК СНИ ЕТК Кано гум чу ЧА ВК КАХ КА
І ваз тещу КІМ в
ЕКС КУ МАВ. вві их ОКОМ стеку і
Фу до»
КТК М са їх ру я хо
Коль шо УКВ
Сх че ех дя Її
Уч ю сухій шо шЕжЖчКа гум кА МИ скуті Фіухуі справах. іі моху: сиди фу дуф ем Ах ве онов см Божих ДЗК ВЕ сах 5
Мр ктея и пк п а а а ка п м п и м п а а а м пк а п п пат жУ Хол пасмам перше аури Ки щу КУА ГА т- чн о а че и ни а ку в в и м м ки і Ко А и п м и ПК о а а ем и
Кемерон соми ЧАЕС СОНЯ ЧЕК Но Крос НМ ЕХ пбтугу :
МУХИ ши и а НН и НН НН
А И Я КІ КК КК (ві ПК НЯІ ДІАНКВКЯ ЦКХ ЩО ВИ
ЗА їх
Аме ет: Де ка г ту У ому пу дж тю и А НА Є КА чн
ПДК Гоа я Чис апа схо Сам
Аг
А сем тітрдрУи Я ВО О феф рр в ежают вт оуле жор Е еїіут смездрери вих І пов лю божих теку утри асист сдчспочскоа чали ЗВО еко пшоно
ЗМО жедувх й пі ох ч со ик и нанні ї несу Мом яри ікри. Лу в чия
СЕК КК, що кА Ки МОМ ЩЕ МК СК ашм М АБО по З У ПИ МяХ кдх
Ве
ЗУ
Ки и НН
ІІ МК Ка скмуту «У ку. поза а че ее ож НИК:
Жим ОБУ поту тик пе б Кк Я киев пгт, т ве ії ке МЕР МИ шттртк
А
Тут Жуан ик Рі пучках оп еиех уч Зі укв х кА пий КУ ЕХ КЕ пое ЗИБИК ЕК НН мак лу я гул У «их ЯЗ
Узцимак чавуну куки Іду ми их еф гісулісюівіхуих речах учи фу фе ихітуєеуєтих ня сим ХЕ МЕМ ДЕН Оу баз паю Соц но ду г щ Киев ЗИ фер туту туя рт цур жІжІ ВО єесусут и путнмжує те ц Бозрозех фаил Мом аериуК о кове кети поса авичя шоп доп восших Білка Киснева сБНсма сно лоти,
ВУ км сс савя сьо банк скат овал иа Єв
ІН
Сом сут Все угелрорлі йо Мох ем оси р в иу дурх гемо ге сі Ме и ух ред М
МОЯ ва дало да г: ФАО МК КАТ Її: У МИ У З ие Ки рек ши ша НВ ЯК мод ка ке кН В в КН в А НН
ЖАН ОоЄже ще МЕ ча щі КА Зк щу а ЗІ ме А Вик гак Зх КОНТ а КО зх
ШО у а в В В в Нв НН ИН каси що Чую МК Тк ББЖ пал шк похо крихту ем ща ги
ККОЖАІ їх Бу а ана не
Ж чи сх «вх ща су рих кЕКМКХ іх ек зу
КК хх; Те
Ки дик у ту пені ім ень ЖУК
КУ и. ши ух ож шу Ту) джут і мем Жде Фідія ВЕ
ВН а Мати: Мм Деми н Ен елУхнХ пами МЕ
КУТ. ди
СН ше пу Кожух елек Кимих фурор ож ІюТЬКИ М утеоут М и ит В щу ик фе доки и ше кошеня ото сова сения шрооааяюе соя БАХА о дек их сим учити Во дит У дру ЖІ иа Миру джури М Уж
ПОЕМА АЕН СВ ТМ ЕЕ СЕС МАО шерлатеенеці ша у
ОА ня
Кк тек ач еп тжі я ЖК ери тумбу вих нн НН ажежмоажх ях му ух тя псесеросвзУ пас цзае опе нке сезоаасссеа сзавозесв савсвавкао вже
ІМ стузлоує вило фути же люто веж о дити и призу ужити жук и вим юю ет у уки Ох
Тука мис ІсЯ фу Клас Ху ПЕ С
ДІ
ХІТ дефор во рози в уже УВІ аж мили мМ суд лю Ко ув уж аю тую жи м ки Ух -х КК М СКК ОС ФУ Клін Катею пошко ЗО її ЩОКА сум 3 фл кІУуврх тром фуру ее мив у М оту зов и. фетру їутеВаМие о прое М мур г. шк КАК МУ КК щМмо МК М їв БЕ шАМІНОУВ сли миМЯ Зал
ВЕНУ суху ско о ситу как г: т ВХ па
Бі спіу» й века Моз т уче кА КК Дх дао Ух шлЕ тах пок еко ВА: ІК о ше Не ОВеек коту ж ду
СИТА вес
СВ у Зк дала вів руді фол три ікси Зх
Он МВ ЗАМ ИаМУТиК Де ОБМаЖКсе У МАВ М
А гУТу» те «ОО» яв тодтумуВ М івічет Базу бехдекцух Бозретухиилих уж Ер еоки уртитеті ур ли Ор ехо дует севзпеккаце созбссозоаа форс созао чесно ссдобдеН сов кі хх
ЕЕ тзехк тету тульуг хе уехуч тики тре их у у прак хви Море че 0 Ух рим ТУ ду шсескдссаас сн Спаси чвоамКозом сс ци ср
ЕЕ
М
ПИ КтуФЕ В мото гості г Кк ре Ух орі ум ви ск ВІ ря ВК дру
КАШІ то що ОКХ. НУ ККУ ЕВ. БУ Я М о ОДА ва КОРУ Та БО М С ВК КО ККУ оУохтУ
УМ що ушу ехо ж кір: Жоктеч кожи п вій зт у режи (тут сопе уки при шен ин вач Вс оком паску
С Качи кю ск сказу со сх Кочур пи те у ЕК сю В оре де отих схо еру я дик шоком акме Ве со МАЕ ЮШКА СІЧІ З с
ЗЕ ее ни нн НК и НН В о
УМІННЯ КО МА Б Хе Ме КІМ МІ рення ВО КНУ сь в всазоузасчие са ух хх ел Ух у
БОЖЕ реж
Я сту
ХК АД Кк.
Не тід
НЯ сЯ АВ
УК, зум ифкх жим я я Ой 0 ШЕУ НИ «ХОЛ Ех сек М со а Фк ни, зх нд ск. КАХ ие поту хви кт, оч
Уся НС незитьМю я: кожен ден а мух : кодек т
ЧЕН ВЕ
Кн нн о с В НН ше еАк ПОЯС ОМ Є ччч шоечачеаа см що Ка ауКн жі т и В НН КК НН В НК ЧИЯ виска сеааЗз сазсечомх кзасвуобсвЯ пчасаосвбшее Зоо УччЕ Хе ново я хкгу й в и и в НН А НН
Б у Бо ОВО її НО щу шах ОА ори Бо в: ВУ се З ЗИ З КНУ І З ск паси
БО
ЕЕ ВІВ Ух КокогжетиттитуУ с деки г мих жлуєх и М ск ру и их, з рН меми ким ше АКА ОМЛАСЕУ поса бах ВШ
ОК
М щбсрууцуєвею ми; ризму их ху М одризечижечииКО ему етии вве щем лу фе фе хмари кю ф у ке Кл ии ча оотчяа смс осим если возив ака ЕЕ: сш щас
КЕ Й
СХ ват ооуєк лити кітч сюьхі друтичевию огпрухф ие из мрих Мф озмужрее Я уретру рх хи еф их
КУН Уа Фочс у пек маг СЕВИ БУБОМИКНО КНЕУ ПЕЧІЯ СТИ ТОК
ТЕ
О зе рю ех в пк А 2 ік шк у, ож ах хх 5
ШК трех ка
БОНН; Зх пане ШИНКА
Хе ш Ка і т Кк
ОК чі ик пу т. яхлеї ик щу чА «ТЕХ
Ко еЯнЯ ат оз міт муку тіл хе дати ех
Хе вОЗріпошжльниМ домен БваЖжЕОЗ пани на дн їх «БЕН ГО паза илаонить внить Коди трт вих ФК сл І рис куки ке Вся першо Ко кеша поса зссоазивали собу зокав сеисавОе ща
Мф ни у но о и а НН а НН НН
МО уМ Ям жна ях мч мах КМм ма БОМ Бех
ОМ, ї в А зн а аа о ка а п а п п а а о о шшІсшнІссаа чати зчепоЧчегочо слов сссаз савасоачесв сеосеаахее ча
І везе дві фізи уєти ВІВ глив щи хотутуко чує ВУ еп ду п темі ли
МЕДИК ее ух зок есе ше Чева Сак у ас
Заг
МЕТІ зх фе умами М о хе ум у ММ сут пул М ежіут пив же у ку пек орі інтим сім луежежов У
ВшщНМК шК Вк КАХ З Бе нен ФИООЕИМУ НТУ З ОВ КОХ ЖК ЧО ШИ скрути
У
Мріє ду о моих туту и ним учиї сумі в м дих ВОМ Кри пужн В сечу ери уичия др Мих
У тах що шу хе на и ки ие З ОЗ ЩО мен Як ма Як їх КК оди
БЕН прізіз с УТ иИЯ Е
ВАН АХ
ЕТ У кА ТУ ие жи ших ат. вл МКУ «БІО хтЕ
Зі» пи веСиНеи ДИ ет я спе
БОНН МИ ЖК
ХК К хх
М
МЕ Мур ср судах тр КВІЖУ реж ежі хіти МАУ пани Зх жк КК АВК НУК СИМ БОННІ Тео КІТ Тих шия тк кацеВ ВЕ узлвучемф их Вовк Всім тити ух Кт Єж р рив різу си ори Же их усу тргу ет ші ОНИ Кома КЕ ре ВХ КАК їх С ККАЗ ЗК у шк ка хе фчтхух М су цлю соттимешки о гтторе хетех кжию В до др Коб му реж гриму цреея поча сани пааосааАсеО СЕС АКСКВА ККУ КЗ ШО прац А за
Кан кн нн І НВ о НЯ
ПЧ КАМ ЕЕ КЗ Я ЗДАВНА СО ХАН С я АТЕМИНЮЯ КОТОМ
ЕН
А сек свтж у тм уки піЙУф ом цу ВУ пихи и ЕТ Уи юу вух М пу
ФПМ БеСенриеК кр ВУ КОН ЕТ ВИ ПТК ВУАН тут м ее сусіди о фу В Ів сліди кв ум зд ужив воижЯ мух усу хуи В г зіІззачсккк се ша Ка ра р уяНх Ве ОВО еК І Х ще сема ВІТИ вч ее сумі їсу и жу ж ие п ЗА че нич и з КЕ о у КН пн Кн шашки Воя чЧаїоесення соло Еи пого шниу засуФсацще асо
Ед с ю кут ет ери ух
КРЕМАМИ ОХ тат хоК оду. «ах ща птутрр втра ща ж Ей «ЕК Оу дотурр хуя ур ся й НЯ
ОО АТХ кю т шини бе ХО МАК кт тух
А полу тюлух шоу і сум тії фу МУ руху фу сови тих півіздтитсюм ДХ
ЕК ВІЦІ КИ ДОН ХЕНЖВВАК ЯМОК ТЕХ
«Ци» пе пі ивирк віз ивічих Божі уз агирігч Божих ЖЕ мулу етих фо и руту БК мук сезони лиш БЕ УКеоКЯ їх ів МБСЯЖВМІ Я Ку КИ Бе ОККО З
ЩІ
У де зижі жа МИ Круз і хи Ум Ще ТХУИ пуезо их зом сих егісхуХ лих ем тавнк шосе сова Вво шАСАИКЗОА Кс Як ач ум з50
ЯЗ плихачетухієу вих тупик кутики Уж роти ее чих ут ее гель ВІ шко ша м ІААКЦХ з МК ОКУ її СЕН т З ШНМ КА М М ям
ОК ях др дя хх аж камні ше в З в В ОН НК її ЕКЗ Зо Гео МКК СЯНУ ех ЯКО їЗ ФЕВ НУ ща меш З ши УК ЕН у т а г «ЗА проти хлее и КОМ о хи оо жшко ств сов мити кт пек оц в чор го дур у тж и
ВвКсЧавИскх спла ше зе аа Тр є завше сег
АБО й уд лу ую пихи усу ти ж ик уми фо узи кт зви тежКж ери пклри хи ВОК Оу их,
ЕМ С КК К ОВ Мох МКК КАК ух КА ХАН Є ЧК що ее ще св її ВЕЖА ЯК КХ тки ак
КежжяУ претрвк сви, гд
МА Ху Хе ючих ХК сртех «ЖЖ ет Ії «В ОИ я ТЕ кеш М хх як тре «Еш Щи шу их зацвів ки МОЖУ МЕН
ХУ Ух
СК» перу дулі кім роті вк зок МІх холу жі ет еюимО ях
БУ яни Вищі суми ек палка ВЕ код ту
СНІ 5 ке в в НН НН НН НЯ се Ма ІС УМА ВАНЯ БО КІЦ соц шу ОК М НКИ сх и
ЕН
Фоми тери иа ужив Ух дусі ще лет; сти вт туту пилу Води жежУ гових дом
БИ КМХВННИНІ ФМ КУЄ шал КА си Ка СА кН зи ки чих ут ори ге КІ ВК серии вих килимку рижики поможи
СУКОНЬ ІК сеча раєм строма тика аа В скух хх х МЕ ке нн і НН А НН
ИН УНК, ОН НІХ КА па Я г За ПО КПК КМУ пр
М змі умлнчем у. узи фс. жуть киця спиліщежикіс яв сум клюьк же ирих вади КІВ
Ім ме скриня чашечки ас ечи ке НИК сни синя
ЗБ ак не аа на вк нення в в НН НН
КВК Ку ЕП с КО Каежас БЕХ чашки сис ччч вис М зу
ЖЕК пекуче т сви тех рес ку а, а
МЖК БКя ші м ТЕ
Кк, Ж нь ее усі
ДЕН пн
Ок Кая кВ щем
ДК чо ст : : : х
ЕЛ Хан вузов микакзіу щі прі фї ти аа
ХОМ шрами мом шажккч пев ЗЕ «агмух БхЯ тхгрехух мае щуви Фк фо вечечурик КК око щити пизду В кре кри ВМ г ож шицЕкЕе С Мане. ев ссовна шрам У Іі шк щем ЕЕ ет
КАХ я но а а а очи и м п п Ен п а м а ПИ а и ИН ЗО ЗМ М В чн
КЕчКе; зі т: ті : са ; сере лих нт п ку ко дин
КАК НЕСЕ Ти сло ха Мо ку ЗАТОК МО Мр оА АТМ МОХИ КОХ На ЩО НЕ З СО
На
Хе повисла сесія зало спи сеанси шани Ка
КОМА В ї У УК КУ Кан Я що Її М Ку ке хщІх
КК ока Кон рик куту ЖИМУ и ше а Ко нн тво лу тих п УЖ Му туту чо ко ЧИЯ пух сх 2543 ї сІглуУтя т пи тихих пихи пух спи Ух лк д, єс Ути сх
Фк сосен тіо зиск соц СКС сек
БУХ
«и и и ко А я меж или ужив их сходи и жом УМ их сУуєУ думи у їж ливо пуфи ум ик вжи жахи щЕ Фе шик пра лаомасьни ВИС видає Ма сіно ВИ ВИ
КАК
«АК моржі: стиск Мазур спе ож в му М оюсусхох оо МО стучегч от тиху жи що и М оз в ух
Масив вв и В пк Не шани ХЕ о АТ З Ок ЕВ. ОО ЯН КОКО трах ву жо путем удо р
ВОК ЧКа а ерерху вежа стріт точ
Шк 3 ж х вену я
КО ем ЯК вач ря тет
ОА А се підт ве; Кум туру «ЕХ «ТТ хх. де Я ек сте вріх стик ЖИх мо пам чтма при МОХ лю АКА ЖЕК МИТ КУ КХ Ко мив ЗБажзіа пак уви Бе су тр
КМ БЕ
СКМ ух лу их, сечу Е бут еаих Ба чорезкте ит лу хуй уж пуфики фут К ем миро Вохжіх и луку у
МК їе штат чис реаль ск ру вня Ко КІ я
Сашу "хи ру лу феод тики ВО село суті і суд ле щих ду. ЖЖ у рих ку бу очи иго
СХ ЧИТ шен К сазан самим Кс цесу ру
КИ и НН В НН НН шОСоумсмВ ско сама Ів Я ЕВ СЕНИК СЕН аж
ТАК чи БІхдіїдоири МІХ -ї Бугай у ее мк умлуьстето о жи ще о в о В п В В ОКО ХО КАК То УЖ шо жиш о КА ЩЕ шля ВК ЕК КК а ку повоижиу трете ут вуз іду Втр прищик о срок рю тем торі лу ик ях САНКИ з А В ОН й БО ЧУЄ Ям а З ща З а На тужу у
ТМ
КЕ АХ
Фоліо ув Бощіох сум ее фев Ук ую ВО где с сову пу ре супу ут
ОМ КХ Е МИ Со, ки Км Ма МК Ін ех ЗИ МКК кум м Ек: Се З хе с С мА П ія сту
Ще пори
ЕК ЧЕКИ пл що
ФК лим о
МНК Би
Ум пуху гу ких сх кое ие КеЖиНОКИ дих ЗУГАИХ.
КЕ земля
Учня УМ че
ПК ух
Ух
МЕС М зв дру туюі М суєзвищі: ху живи их уд рек Зх речове ТЗ їерасцдьвнимУ мовним важ МАВКИ ТЕ я ик чех
КОНІ ноя тмлвоя жи Ж уло кхумаивими и фе Е кжу ферит ее фож ик люлю і суюти дети ихіу вжи их Же уж Кит ІВ В ач соч сечова пав ся пола соепавешеги ес догу
А
Мк гує в даурву ослдрітузихижежу дулю, Кит Учщрелии Коюи СКрисуеикоежемей бом умум щу икух я ши самі Бема расових шли ката де
Зк
МАХ
Іжа и що Ж жом и У о пром стелу ми ЖЕ ох дуєиихіих ом пу руки им о УК их, сш рат шарах Тх; фам І шли СП ВВ АХ
АХ.
АЛЕ пустив МК ел реугжехучиих же прорив при у о дж Фе Кору фе Кк зоссосваьи оса спішно вис сласВ созшшета касах гуд а ан ни ик Ве А Ну ІНН НК НН
ВЕК ба ваз ва в З НА ОВ ковВх КУМ Хв арх ПОЕТА ЛЬ щи
КМУ
«фе лаи пемтку стук ре оутих М хр вики Ко рехиіди пеМю кугігуиврже утри ри пф и рифи я палає саги ун и нон и и В я п КК В У МВ В КН
М
ЗК о вн Є о в и и М ях
Коня т:
ХА МК МОХ км, сут «ЕХ ЕОЯ пюре св
Ж Я т
Ко че и се вер
КОМ жу м оо пох оду кУ ел У о КК є пах З . лм. к Фа ту ким кити, ж м а сш Ж -х сш Бала ьмим сам вижЖисеа ЯЗИК ле кл г. «ЯВИ» ча ие нн З а он оо и НН з НК
МАМ Ми смс Є шим в) ас соч остає Кия щі ка де кн нн В В и НН НН
МАУ Зват св ЧЕНІ см р емо СПО ММК ох її 3
Молю а КК НН в и а о НН нн в и и а НН В НН нн с Ісая ср Ким те пе КУН Фран ВЕН УНІ КНУ
З
Кая вжи кер ет рив р пику иха тих пут мІвучУ УТ их Ту ше й М прдриви юю Іри ге витки Ялина деп стшея вссрроцчеасв сеча сш кто тут и саке Ее секоснееи іт си ДІ БИК ХЕ еще їх а аа ден ек СКК хто Фу вет се
Бе
ОМ
Мод з фс ел ом фути вх ум и Мо жі СОБКО ЖОВ БЮ учериуужижем суч сут м мех хх твстзЕквоя саке сок ссвс Сб Зсх заз повося звичок лужех
Ж
ЗО пе ееВ ик ух
КК
«фтату «кох
ОТ Ею, Її
ТАК хх
Моро шин прик теми ОК шорт зуртля
І Их ТЗ «фр» ЛИХ ил тк зує ок яви шу ее ие
Оки
Кок в и ННЯ ОНА 2 паж у ти ки шеаЕмвіш ем ДОМИ ХеНжЖЕКча ема ме
ДІ с
КИМ МАХ чн и Ка М м а ПК о п п а і п а а п р І ЕК
ВХ Уч САНЯ Мао Мора н НМ НН
Ух іх в фер к тих г ЕР дк прикрих муху пику М Кіз ет и суми
МАМА иа МН СІК ФЕН КИ ВХ Я КО Ла проц Й Й що Й Шо заг
Мк ст Буххжи ми кіт К чим мих же ружа жи КЗЖоєуєтівиху єс их У гор и Ух пт и що щи опутє скит щас злу ємо рони С АКОТ ІК ВЕ НОУ Вих їх їх п оч п п па в п с п ди о п и о а се моих що ек Вч Ди тих шому лоно Ок еео се сома се зап кю нн и НН З І В и НН КК НН
ЗЕ К МК шо І С орки льш кове ОО ІДИ ВС я за
МК щокою гулує руч жи кн БЕЖ емо В во и В метри роцихин В В рути сасекщк яки ас сеИ мишку ТУ Ко пр жа МИХ ре ес ТЗ ПО ЕК рт ви
САН КІ А З ЗУ що КМ ее
Кк
УБОДННАЯ КЕ в та и Ж іх «хр
СЕК тк
М ФУ
ОК мк х я луж іх г ки пухка ту жрв м я У я
СКУ биків іі птуммМм о пдичути морі ВО
Жоку тА ПМК ЕМ ЯМА ЖУМЖ В ІІ КУКА МОХ ї - соду чи «НК» 5 хи Ком ми Жили ур Качуруувиииюхи ст жІВІВЖУТУ УЮ их фу ку ем лому ож ше ХаНИх Хиоакее меми чаш Фо їх лива касова ше дк их я ие ет суху чеу В люлі туту сце еВ пити ОК чи Воріт и уж рудих на с ак В иа ПН КН ВЕ шах МОЯ дням мая УКАЗІВ холу 5 кум умер сині рт сов пл; Мр ткти тує; ок Кк ужівине ет худу ори фе вив в сис снА ЧО ОСА ЧК спец сскеам саун шах
Со ік:
КМ анна нн во как аа а не ве в о Но о ме сени Сет Се зе оео стола ва песто вни б ве по гуми Ко дути ех хг грек ру ютирих сурт ев ра вні дю южв их есіетк ких ие ас смК Янг свое Вс ВУС Несе ЩО Сан уки
З фдюрк щи ко тлу ую в ихетежух хе жі фею олуєм БОф зок ом кла іжечивиа вес пусто тим их сшасоеикасо бассрічанх соми но есе еру усеоня аск е зЕщ ша
ІІЯНЯ Кона а рук
Пп кове ан Ге кА Ме шк СН
УЧ Не еИсЯ
КЕ тічу прах
МАК щЕк ковка ния их ККУ АТ пт
КоЖАКА КИЙ «ше бабі виениМ помоем важ павича Н
ІЗ ОЕМ АЛАМИВИ ЖИ МЕМ МБлрЖмАьиІ пчКМюКаА лЖХ
«апа» а тут и рик Кожух кит. Лежати хв ежівсв фор тифу и ак оф и ви ри г. пе цхиС пможКус мини овоча моцВо чо ик Бас
Я
КОН и нн НН НН НН В НН
МКМ СУС НІМ За каахуивами Кам проси
ЗУ ту
КАТЯ шик луку у лю Ул К жУИІККоМ мі мл жжех фл их теми ми и Му чи три Ж ус Ек шен «жена а ОК пи оси сеча сао зап
ЄБОК КХ туф і туУ Іл фо и Уж Іжа дити 0 рез рих и и жопу ут ДЮ у пики сита є запо оузчаа сосен саше
Ух
КУН пд сети жару Мазі стружки у ну аа иви сеї ехо ахчмачИК то оск КСВ НВК вх зима Би М МІХ ЗАЛИ
Тег еВ оди Кіт тре ем М ужитих фо мк жду Я КАБ ОМ улузуУтитути рух духу Косів
КК М чеше шию Окис дети по вес е ту
НЕ вн аа и ни их шАМИ ХА г в за З ср
ЗИ как гуд ккаШУ Ми сивая хек у АКА хх лук зе таж ноа те кох Кт МАК
Бе життє хо ДК НЕК. и ик
А У ож Не є побутує т -і ух х - ку мими чиниЖ дише нму ходах пив же «ак ва таки фунти уче рих тує Фетутєх у кіз изеусвих «МК есусєхов щи сухе К кейс ехо пгт ех ге ее ННЯ Ще Мис КічуаемимиЯ Барки ан сома. Ну г че Сер щі жа диких кур пи тім М гелі тирК півзрЖе седій ре ех обгорток су ке пух мно ши саван сало Кун пасок зогу
Мк сну твнно смт За зве оВОм се ос салом сла зни «АКЮ тлі ж вус уж щу кортів х еф сито я из арииу медом що ви р вх вер Ммхкинажкє. Мем микееУсе ее дем СМ ВДЕ КАЄ СХ КЕДИ ЕІ тк ше жерти МК вжи віх гу ІжИ Ух о луцк уж прі Оу ит ж у духи
Же Кох ре А СХ ВЛУЧИВ
З флюс о сови ому рих уми унів ом ліри фр М У руузежуу туту ретия лихах ії и шамани чашки карму ие ЕХ шиасках зп Ач
Зо дю гі ки
ТАМИ А КА умі
З
ЕЕ
ВЧЕчи пе сш Х вк «Мав Сл ее Кок, а пече бо АМК ро не вирі реч ши вул хека» Веріабесльний симезн важкого паннютеа на «НН З цазцілаої. СпеецосВОєс Фсрессесва ско аавво стале осво сус «Е зміс сова сов сва паоасстава шоссе зЗаасяечев ї55 шсхникихив сасрчоааез зпассзчвеЯцєе ссопозтосоз ссвалеачесв Саопаевєає 153 спеКсацнви пссбавцсово зоповзсавея авсосбссоевта сбсееєтссяа сесозеаевк зкзсвзстов честю збебоазосуає асо звсхаскосЯєс Євою свссескасу об осате сов КЕає БешааеКаЕк осо схе З зсвчшсова пе
ЯТЕ

Claims (5)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, яке: ї) специфічно зв'язується з людським білком АХІі, та ії) зазнає інтерналізації після зв'язування з зазначеним людським білком Ахі, де зазначене антитіло включає три СОК легкого ланцюга, що містять послідовності «ЕО ІЮ МО: 1, 2 та З; та три СОК важкого ланцюга, що включає послідовності ЗЕО ІЮ МО: 4, 5 та 6.
2. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за п. 1, яке відрізняється тим, що людський білок Ахі має послідовність 52ЕО ІЮ МО: 29 або 30.
3. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за п. 1, яке відрізняється тим, що специфічно зв'язується з епітопом, розташованим в позаклітинному домені людського білка АХІі.
4. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за п. 3, яке відрізняється тим, що позаклітинний домен людського білка Ахі має послідовність ЗЕО ІЮО МО: 31 або 32.
5. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за п. 1, яке відрізняється тим, що він викликає зниження середньої інтенсивності флуоресценції - МЕЇ, що становить щонайменше
200.
6. Антитіло, або його антигензв'язувальний Фрагмент, за п. 1, яке відрізняється тим, що воно є моноклональним антитілом.
7. Антитіло, або його антигензв'язувальний Фрагмент, за п. 1, яке відрізняється тим, що воно містить варіабельний домен легкого ланцюга, вибраний з групи, що складається з: ї) варіабельного домену легкого ланцюга з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 7, і) варіабельного домену легкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮО МО: 36; і ії) варіабельного домену легкого ланцюга з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 37-47.
8. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 1, яке відрізняється тим, що воно містить варіабельний домен важкого ланцюга, вибраний з групи, що складається з: ї) варіабельного домену важкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 8; ії) варіабельного домену важкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 48; та Зо ії) варіабельного домену важкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 49-68.
9. Антитіло, або його антигензв'язувальний Фрагмент, за п. 1, яке відрізняється тим, що воно містить: ї) варіабельний домен легкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 7, 36 або 37-47; і ії) варіабельний домен важкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 8, 48 або 49-68.
10. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що воно є моноклональним антитілом 1613Е12, одержаним з гібридоми 1-4505, депонованої в Національній колекції культур мікроорганізмів в інституті Пастера, Франція, або його антигензв'язувальним фрагментом.
11. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за п. 1, для застосування як продукту для адресної доставки цитотоксичного агента в сайт-мішень хазяїна, де зазначений сайт- мішень хазяїна є епітопом, розташованим в позаклітинному домені білка АХІ.
12. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, для застосування за п. 11, яке відрізняється тим, що позаклітинний домен білка АхІ являє собою позаклітинний домен людського білка АХі.
13. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, для застосування за п. 11, яке відрізняється тим, що позаклітинний домен білка Ахі має послідовність зЗЕО ІЮ МО: 31 або 32.
14. Імунокон'югат для лікування раку, який характеризується надекспресією білка Ахі, при цьому зазначений імунокон'югат, що містить антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за п. 1, кон'югований з цитотоксичним агентом.
15. Імунокон'югат за п. 14, де зазначений цитотоксичний агент являє собою лікарський засіб, радіоїзотоп або токсин.
16. Імунокон'югат за п. 15, де зазначений лікарський засіб вибраний з групи алкілувальних агентів, таких як азотистий іприт - мехлоретамін, алкілсульфонати, нітрозосечовину, оксазофорини, азиридини або іміноетилени, антиметаболіти, протипухлинні антибіотики, інгібітори мітозу, інгібітори функціонування хроматину, антиангіогенні агенти, антиестрогени, антиандрогени, хелатуючі агенти, стимулятори абсорбції заліза, інгібітори циклооксигенази, інгібітори фосфодіестерази, інгібітори ДНК, інгібітори синтезу ДНК, стимулятори апоптозу, інгібітори синтезу тимідилату, інгібітори Т-клітин, агоністи інтерферону, інгібітори рибонуклеозидтрифосфатредуктази, інгібітори ароматази, антагоністи естрогенових рецепторів, інгібітори тирозинкінази, інгібітори клітинного циклу, таксани, інгібітори тубуліну, інгібітори ангіогенезу, стимулятори макрофагів, антагоністи нейрокінінових рецепторів, агоністи канабіноїдних рецепторів, агоністи допамінових рецепторів, агоністи гранулоцитарного колонієстимулювального фактора, агоністи рецепторів еритропоетину, агоністи рецепторів соматостатину, агоністи ЛГРГ, кальцієві сенсибілізатори, що підвищують чутливість до іонів кальцію, антагоністи рецепторів фактора росту судинного ендотелію, антагоністи інтерлейкінових рецепторів, інгібітори остеокластів, стимулятори утворення вільних радикалів, антагоністи рецепторів ендотеліну, алкалоїд барвінку, антигормони або імуномодулятори. Зо 17. Імунокон'югат за п. 15, який відрізняється тим, що зазначений радіоїзотоп вибраний з групи, що включає Ді, С Мб, 07, РИ, 23 зі 25 90 Де!86 Де!88, 5пти53, Тоб9тп, Віг!2, раг, Рр-"2, і радіоактивні ізотопи Гм, гадолінію, марганцю або заліза.
18. Імунокон'югат за п. 15, який відрізняється тим, що зазначений токсин вибраний з групи, що включає А-ланцюг дифтерійного токсину, незв'язувальні активні фрагменти дифтерійного токсину, А-ланцюг екзотоксину, одержаного з Рзеййотопаз аєегидіпоза, А-ланцюг рицину, А- ланцюг абрину, А-ланцюг модецину, альфа-сарцин, білки А/ешлез гаї, білки діантини, білки Рруюіаса атегісапа, такі як РАРІ, РАРИ та РАР-5, інгібітор Мотогаїса сНагапіа, курцин, кротин, інгібітор бараопагта онНісіпа!із, гелонін, мітогелін, рестриктоцин, феноміцин, еноміцин та трихотецени, доластатини, ауристатини, трихотецен та СС1065 та їх похідні.
19. Імунокон'югат за п. 14, який відрізняється тим, що зазначений імунокон'югат додатково містить лінкер.
20. Імунокон'югат за п. 19, який відрізняється тим, що зазначений лінкер являє собою розщеплюваний лінкер або нерозщеплюваний лінкер.
21. Імунокон'югат за п. 19, який відрізняється тим, що зазначений розщеплюваний лінкер являє собою чутливий до кислот лінкер, чутливий до пептидів лінкер, фотолабільний лінкер, диметиловий лінкер або дисульфідвмісний лінкер.
22. Застосування імунокон'югата за п. 14 для виготовлення лікарського засобу для лікування раку.
23. Фармацевтична композиція для лікування раку, яка характеризується надекспресією білка АХІ, при цьому зазначена фармацевтична композиція містить кон'югат за п. 14 та щонайменше ексципієнт та/або фармацевтично прийнятний носій.
24. Мишача гібридома І-4505, депонована в Національній колекції культур мікроорганізмів в інституті Пастера, Франція, для одержання антитіла за п. 1.
Дослідження цитотоксичної ДИ ТОК И на клітина ЗМІ ле «то ж к МО М єв вок вний и З Е й ни : ! З Ме: х
Н о. «ї й як «й. 5 «В х В Погармом концентрації антитіла МИ
ФІГ. Гени ження зв'язУувлва Ах во те Даспідження з язуюння птАХЬКИ та НЕО методом ВоА Кі ОВТ аеКТе Ж хв вих г за п ше а тп
М.О ще я розріджувач х ни з хх Я ее Я хе Ж їх З хо аю й ж Щ з Шо 28 3 Бош Кн о се З 55 кі «а 2 «В «Ї Погарифм концентрації антитнна (М)
ФІГ. УА
Лослідження за'язування "ОТ ККе та 1112 матодом фА Ки: . . пд ря У ун Ме, кн ТО ЗКУ є . не еф ПАТО що як яв розріджувач х Зм сефее ДІВА 156 ант АХІ
4. и нене ДНТИК Є ДОТОКЦІЯ щ ! ре» анти Нів детекців У В Я ї В Ж БО о і а М ооо В 3 ЕК «З «В «КЕ Гемарисфм концентрації дитита (М ФІГ, Б Дослаження зв'язування гіимееке тала методом ВА За ж шк : - БЕ Е З 2 х Сенсор ж тс Ж най хернн ВОЖЯДЖУВАУ в Зв ефе МОВІ анти Ах Ж вк хейдек ДЕТОВКЦІВ НТ Є ЛЮДИНИ 5 іже : М З 5 3 ж г. ; 5 Се «ій «В «В «Й Лемарифим конментовуй анти СМ) ЧІ, В 5
АСВ знали зв'язування 15131 Що З пуклианими клітинами людини
Б. що че 3 і я Сад! БО щи а МОБ? х З ж рок 5 - Ул суху З і в к- я МОАМО5 м З КЗ т З З Х оо н ху меча У КЕ З КЗ Е я КОЖ їЯ ; о дове Ж ї КО - й оо ооо ї «1 «о «В «А «Її с - Логависфм концентрації антитіла МІ
ФГ. ДЛостоження зв'язузання АХ та ТКУ методом ФА в ен ДЯ ЗЕ г ; що згоср-ю не 15 НеТи й ях жо с Хо «ПВ сій с ше віть шк ШНЕК ї І З ск щ- Н з Ж сен. ПОЗЗПІДЖУВИЧ З зо сеофее Мі ціх 154 анти-дхі Не а жене ВИТИНКО ДеТеКЦІЯ - Ху КУ г З че КЕ. ча з у ш : «ве ВНТ Нів детеюців ж У З о кЗ З «й й - «В Я Логан концентрації антитіла (М) «ФІГ, 4
-- ЕАСО аиагна зв'язуванні 11 З клітинами СОУ З тю» клас Ф : в во ЗЕ хх ся 5. ЩО х в Є Шо: ш й шо ЇМ БО0Я в й : ща ве Як Ка їх ; й Ж З КЕ я ЇВ У авнннннннн м вонн а В о ша ше «В «В «ї ПЛогарнфм конценцзвції антитіла ОМ)
ФГ. Дослідження зв'язування саво методом конкурентно А в приситнест ЧИЙ з дя ев С «фе ТЕЗЕ ТО Ж 5 Я ко х о кон ше НС М х З дон Ж ра з. ДО Е х ик. сере Мідії 15 дети кі х Ще «/ У - Те ав зовн ВОЗріДКУВИч К сх сх ж Є що у І 2 ї нене у Ам а З ; 0 -а «В «т «в Пегаряюм каенцевтрації антитіла (МО
ФІГ. В 5 вн І ОК 5 ОК 5
; о. 0 о. . . Х ЗК їх дхі о . КО У М З / ВО ОО я с Ех Є МКК 5 С о. МО с х і. ж ОКО У МОХ ААРОН - о Жах я Бак с Я хе ї зі ЖОВ, сен Я ре Б т Бе ще Ом: Зима ех дО ЕЕ й с Й Ми о м ВУ а їЄ ве КВК о. ОКХ ж Ох с. Я ж ГО й о. о. с Шо ще с о ! й с с СК Ж З ХО ах Ах сок СЕ СОКОМ с 0 С КС ОК сх ЕК Кене о. о. с о. . о о о. ЕЕ Б . г КО МК п о Хе В ОВ В о. г . М КОКО Ка с о. ЩО ЗО В СМ КО с о ; о с с о. Со с с .
о . п с .
о. о. . с с З о о о с ЗО с о. З КХ с о о с с ТК ОО ЗО о . ! КОХ КОХ ІЗ Ух ОВ УКХ ОХ У ЗХ ОК ох МО х с. . В ОО с г с їх І що с - МЕН ди ВА
Зниження експресії ремептора Ах на клітинах МТС півня інкуєац з То хо ФР 1 ПД КОД фея тс нн пн нн нн ач я зе ПЕВ М івоа ще х ОХ ОО Му о о о миня Ж З пря с УУУУ Ух о У В ВВ г. щх ВИК М ооо ХО - у їх с г с ОК о. ЯКО дон он -- / ше ши свредевище пе пт сАВе ВІЗУ Середовище "п СА ТКУ УМОВИ іх ООН
ФІГ. 85 ОКО: и і Б ов о з ВН а, В о її: ЇЇ» Ж У
ФІГ. ОА о ен ен нн нн нн НН В и и и М КК С п жмюмфмєМжиннНньвнНн а ан а ан нн ам ан НМ М НН НН На М, ІІ М М М я М ІЕМ ПО ОО ОО ЗЕ М ІІІ ІВ ІІІ І І Б М ВОМ в В ов в І ОО В В С ЇЇ 3-3 8 х ах АЙ ФО
ДНА пен В нт вн нн о ун нон кни Но пн нон нн нн вн нини -е ПК КК ЕВ С ЕКОН в. ус с с дО я Я Б ЕК НК Я У ОО ОО ж М М ОК ж ПИШИ КК ня КК КК Кн ХА А ВК З ОК ОК ОО ХО Зх ПІ ООН В ОХ І ВЕ с ЕКОН 5 Я ее М с ОН с ОК 5 ВОМ М о В м ОМ У С с ВО с я с Я: СВ п В ПОС ОО ОК СОКОМ В Я о Я ЕК КВ о НВО а 5 ВЕ ККУ о КЕ в МОХ ши ОО В Я ВА ПК с ПК ОО ОХ 5 п В ПОБ о. ї ее ен хни не ее НН ООН ооо За ММ М ПОВ ММ ОК В Зоя зх с КК с ЩО с В В В В В В КО Я В с с ща ас М М М М ВХ ОО В ЗХ МОМ М В В З с МО с ек с х я, М М М В МО М ІН ПО - фонем пн ри нн що, г" с цп.щя о. о. З Іф А КО ОО М ПВ М Х о с ММ В В ОХ ПК В п М В ДО НК У и Ел М З с о У М КТ ооо ОО ОО ОО Я КО ПК МО ОХ Он ОК в т 5 0 ЕН 0. ООН с Оу м М А ІТ 5. с нео о о о М ОО В У нт тн А В В В КО Канн го це
ФІГ. ЗВ зе піки печу нееая ККЗ зв. пи г дур Дослідження пропкрерації кп ЗМ в присутності 113 -кожчклях 0 без СквО : г І З Зо : ЖОДЕН сонне о : ех і : Ж Н т ке : щ : «че З : м КЗ ока НИ Кок за Ї о. : - : ооосюююютюю у. я зе У ок ОО ї Км : вн с с Я КЕ сне: З с ЕІ ! З КЕНЕ -- 000 ши о. с ! З Я с о ОО ши о Хв : ВО о. о 5 о ! В БО З ВОК о. В хх Н яра с с с : ОВ З ТОВ В о : щі о. с с ! пи НН о... люшнНнш ! ВІВ я ние ту иа гою 5
Ж хх я в ЗМ й Сави Хоч ну з МО соків Ек. 4 г ще р в В ЕЕ Що: т З - М а «З вах ай Ж х ; М й ех БО хо я Х За Я ж - хх мк хо х ож ; що я Ве Х КЕ й М з З З песо ще ве «й «а Ку ї їх : «КЕ й -в и во З В егарим кониентоавії дититіза п ЗП рН Ногарифм концентрації антетіпа (М) Погарифм концентрвий антитіла (М) АТ КИ В 805 г ЩЕ в шо по І Й о і ї Бя у
З 2. і 3 м Ж я Бу ї но ХУ 3 совно їв со сх З їв УКХ кю фей ЕК «З -а В « яв Б З а В Погариюрм хонментовця зититіа ОМ Погарифм концентоації аититема (М цімає МСА МВА 5 г З ЧО ех х о М 33 З - К -я Щі ш З Ка ж Ба: со ; ванн її Зоб ою ; зу ; щи 3 5 їх я зах че й «о 7 що з що і Ко Кг: а Е: Погарифюм концентрації вититійа (МІ Логарифня концентовиї антитма (М) МОАМВМИ З шт що б в 3 В а та З в Х о зв йо Еш КЗ у Ще жо Я 5 30 Й дин з Її й ак зся й ; СО фроевенвня ій мехоютннкс Й
БЕ. й «ів З Кз -8 В «В «5 В Логарифм ковцентвації вититійа Погарифм концентовці антитив М се ВСІХ я СНІ Я ке Ж ше що от щОМ Ж с і; Ж я зу М В У Вк ОК с 5 Ше і Є ще Я ефе р їй кре зни нн зн ж Дом ямах х деоотеююнхх с а й «В В «В «3 Не: В а КЗ Пегарицям конусної зетпилла (Мі Логариєм концентрації вититив (МІ авг -Ж ве шах до 2 я о ром р щі В о й в - -е Ко у Легарнфм кенцентевції антична (М
ЯН. 1 Баєцинація гуманізованого знята ТВ, сприМмОннОогОо проти АХі, методом ФА хх в щ - за Й в Б Й их Ж ! я ! чех . е ! М ЗО ! я і но | ! ЖК : хх Н Ук я ! м ки ! В я : ра ! щ 16 : Ж їх | ее тів : Я ОО рани С я и ШЕ З 05 ї Мине Б ща К З 18 Концевтовція антитіла гмкгАми)
ФІГ. 12
Пеаспідження зи'язування з клітинами КМІ2О У методом протокової цитометоії Ж 1 м З Я Ех ХК ; Ши. я ПН ТЕ це х нен й ох ру я г й т а В1ВІЗЕТО В ау Йо з ВЕ Ї її х до р Е е г ще В й ОВО ; Бу х й Кох В КЕ; КЕ ГЕ нини ча ОО де с оеегоорре хі КЯ ОВ «В «а «В «І с Погарифм концентрації вититіва мМ) ОБО Тя 3 БОБ Оде ХТЗ КЕ З БУВеО0В ТИ ЗКТЕ Її Волею о Цитотококчна дія імумокон'югатів пиві ЗВ» сапорин, пет ВІ13Е 12 сапорин, тоба-свлорин та у еЗо4 свзпорин ій уйго на клітини ЗМАЗО мо» ваш и КВ ЯК ог : ев ПТО ОМ ще Х сКВх зак и ша що як ріст кове ВИ ОВ ЗТВВВ 7 : Ба ще І В во и наднн ОПОСЮ ВАВ ге Ж яв» ПОСМ-ЗВО ве ЕІ : Ко, У З Ка Кам у я Ге З - о шо? шк ЗХ зак Х НВ ши нан о ЯВИ КЕ СУММУ УМКККМХ Ей що «Та 41 0 а «В ка я й Щі Щщк . Погарифем концентрації антитіва (МІ ФГ Я
. Цитотоксична дія імунокончогатів поз освповин, ПЕТ ЯЕТИх сапорин, тоСн-сампорин, спос саповин ій мйго на клітини Саішнї Воч сек МК ши чи Ж во ж зей» ДТ ЗК Те ВаЮ Ка їх К оре кн х - - Б Зо Ши хек ДТЕК ТУ» 5ДО пах ж Зою ще нен ОСНОВІ хе 5 х й и де «В оеветеОсм-зар ОК ; я І Днем їй хх ши М ноу веру г со, пе 4 В В В «Ж 00 Погпарибм концентовиой антитіла (М)
ФГ. 15
UAA201405805A 2011-11-03 2012-05-11 Антитіло, яке специфічно зв'язується з axl, та його застосування як продукту для адресної доставки при лікуванні раку UA119226C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11306416.6A EP2589609A1 (en) 2011-11-03 2011-11-03 Antigen binding protein and its use as addressing product for the treatment of cancer
PCT/EP2012/071833 WO2013064685A1 (en) 2011-11-03 2012-11-05 Antigen binding protein and its use as addressing product for the treatment cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA119226C2 true UA119226C2 (uk) 2019-05-27

Family

ID=47116011

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201405805A UA119226C2 (uk) 2011-11-03 2012-05-11 Антитіло, яке специфічно зв'язується з axl, та його застосування як продукту для адресної доставки при лікуванні раку

Country Status (18)

Country Link
US (3) US9689862B2 (uk)
EP (3) EP2589609A1 (uk)
JP (3) JP2015504302A (uk)
KR (2) KR102033805B1 (uk)
CN (2) CN103998468B (uk)
AU (3) AU2012331069B2 (uk)
BR (2) BR112014010383B1 (uk)
CA (2) CA2854126A1 (uk)
HK (2) HK1197073A1 (uk)
IL (1) IL232342B (uk)
MA (1) MA35659B1 (uk)
MX (2) MX2014005240A (uk)
MY (1) MY174259A (uk)
RU (2) RU2650771C1 (uk)
TN (1) TN2014000148A1 (uk)
UA (1) UA119226C2 (uk)
WO (2) WO2013064685A1 (uk)
ZA (1) ZA201403141B (uk)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2589609A1 (en) 2011-11-03 2013-05-08 Pierre Fabre Medicament Antigen binding protein and its use as addressing product for the treatment of cancer
EP2888283B1 (en) 2012-08-24 2018-09-19 The Regents of The University of California Antibodies and vaccines for use in treating ror1 cancers and inhibiting metastasis
EP2914630B1 (en) * 2012-11-05 2021-03-03 Pierre Fabre Medicament Novel antigen binding proteins and their use as addressing product for the treatment of cancer
WO2015013579A1 (en) 2013-07-26 2015-01-29 Update Pharma Inc. Compositions to improve the therapeutic benefit of bisantrene
RU2685259C2 (ru) * 2014-04-25 2019-04-17 Пьер Фабр Медикамент Конъюгат антитела и лекарственного средства и его применение для лечения рака
GB201410825D0 (en) 2014-06-18 2014-07-30 Bergenbio As Anti-axl antibodies
GB201410826D0 (en) 2014-06-18 2014-07-30 Bergenbio As Anti-axl antibodies
AU2015286569B2 (en) 2014-07-11 2021-04-15 Genmab A/S Antibodies binding AXL
EP3229836B1 (en) * 2014-12-09 2019-11-13 Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM) Human monoclonal antibodies against axl
KR102453227B1 (ko) 2014-12-18 2022-10-11 베르젠 테크놀로지오버포링 에이에스 항-axl 길항성 항체
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
EP3319993B1 (en) 2015-07-10 2020-01-15 Genmab A/S Axl-specific antibody-drug conjugates for cancer treatment
US9669106B2 (en) 2015-10-26 2017-06-06 Pierre Fabre Medicament Conjugate of monomethyl auristatin F and trastuzumab and its use for the treatment of cancer
SG11201805534TA (en) 2016-01-13 2018-07-30 Genmab As Formulation for antibody and drug conjugate thereof
JP6943872B2 (ja) * 2016-03-25 2021-10-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重全抗体及び抗体複合体化薬物定量化アッセイ
EP3458482A4 (en) * 2016-05-20 2020-01-15 Agency for Science, Technology and Research ANTI-AXL TYROSINE KINASEPEPTOR ANTIBODIES AND USES THEREOF
GB201610902D0 (en) 2016-06-22 2016-08-03 Bergen Teknologioverforing As And Bergenbio As Anti-Axl Antagonistic Antibodies
US10688181B2 (en) 2016-06-27 2020-06-23 The Regents Of The University Of California Cancer treatment combinations
KR101909955B1 (ko) * 2016-11-28 2018-10-19 재단법인 목암생명과학연구소 신규 항-에이엑스엘 항체 및 이를 포함하는 약학적 조성물
CN108456251A (zh) * 2017-02-21 2018-08-28 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗pd-l1抗体及其应用
EP3454063B1 (de) * 2017-09-06 2022-05-18 AVA Lifescience GmbH Durchflusszytometrie-messverfahren
WO2019197506A1 (en) 2018-04-10 2019-10-17 Genmab A/S Axl-specific antibodies for cancer treatment
CN110540592B (zh) * 2018-05-29 2022-08-09 杭州尚健生物技术有限公司 结合axl蛋白的抗体及其应用
WO2021013746A1 (en) 2019-07-19 2021-01-28 Genmab A/S Axl antibody-drug conjugates for use in treating cancer
GB201912059D0 (en) 2019-08-22 2019-10-09 Bergenbio As Combaination therapy of a patient subgroup
CN110448557A (zh) * 2019-09-05 2019-11-15 黄筱茜 抗凝血药达比加群酯的新药用途
CA3152316A1 (en) * 2019-10-04 2021-04-08 Scott C. Jeffrey Camptothecin peptide conjugates
CN110982791A (zh) * 2019-12-26 2020-04-10 百泰生物药业有限公司 一种分泌axl抗体的杂交瘤细胞的制备筛选方法
GB202004189D0 (en) 2020-03-23 2020-05-06 Bergenbio As Combination therapy
WO2021204713A1 (en) 2020-04-08 2021-10-14 Bergenbio Asa Axl inhibitors for antiviral therapy
GB202006072D0 (en) 2020-04-24 2020-06-10 Bergenbio Asa Method of selecting patients for treatment with cmbination therapy
CN112194726B (zh) * 2020-09-02 2023-06-23 沣潮医药科技（上海）有限公司 用于病理性蛋白聚集物清除的嵌合抗原受体及其应用
GB202104037D0 (en) 2021-03-23 2021-05-05 Bergenbio Asa Combination therapy
CN113444180B (zh) * 2021-06-16 2023-03-31 上海鑫湾生物科技有限公司 靶向axl蛋白的抗体及其抗原结合片段、其制备方法和应用

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4970198A (en) 1985-10-17 1990-11-13 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US5079233A (en) 1987-01-30 1992-01-07 American Cyanamid Company N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics, composition and methods for using the same
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
GB8924581D0 (en) 1989-11-01 1989-12-20 Pa Consulting Services Bleaching of hair
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US20110045005A1 (en) * 2001-10-19 2011-02-24 Craig Crowley Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
US20040202666A1 (en) 2003-01-24 2004-10-14 Immunomedics, Inc. Anti-cancer anthracycline drug-antibody conjugates
JP4462964B2 (ja) * 2003-03-10 2010-05-12 第一三共株式会社 癌特異的抗原を標的とした抗体
KR101200133B1 (ko) * 2004-06-01 2012-11-13 제넨테크, 인크. 항체 약물 접합체 및 방법
WO2006066408A1 (en) 2004-12-21 2006-06-29 Viventia Biotech Inc. Cancer specific antibody and cell surface proteins
CA2673282A1 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 Schering Corporation Antibodies to cd200r
CN101687924A (zh) * 2007-07-04 2010-03-31 株式会社未来创药研究所 抗Muc17抗体
ES2556214T3 (es) * 2007-11-12 2016-01-14 U3 Pharma Gmbh Anticuerpos para AXL
AR069333A1 (es) * 2007-11-15 2010-01-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos monoclonales que se unen al receptor tirosin quinasa anexelekto (axl), hibridomas que los producen y sus usos
EP2238169A1 (en) 2007-12-26 2010-10-13 Biotest AG Method of decreasing cytotoxic side-effects and improving efficacy of immunoconjugates
WO2010014755A1 (en) * 2008-07-29 2010-02-04 The Regents Of The University Of Colorado Methods and compounds for enhancing anti-cancer therapy
EP2270053A1 (en) * 2009-05-11 2011-01-05 U3 Pharma GmbH Humanized AXL antibodies
CA2759836A1 (en) * 2009-05-11 2010-11-18 U3 Pharma Gmbh Humanized axl antibodies
WO2011014457A1 (en) * 2009-07-27 2011-02-03 Genentech, Inc. Combination treatments
CN102574917A (zh) 2009-08-17 2012-07-11 株式会社未来创药研究所 含有抗hb-egf抗体作为有效成分的药物组合物
US8926976B2 (en) * 2009-09-25 2015-01-06 Xoma Technology Ltd. Modulators
KR101951410B1 (ko) * 2010-01-22 2019-02-26 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 항-전이성 요법에서 ａｘｌ 신호전달의 저해
CA2839508A1 (en) * 2011-06-22 2012-12-27 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Anti-axl antibodies and uses thereof
EP2589609A1 (en) 2011-11-03 2013-05-08 Pierre Fabre Medicament Antigen binding protein and its use as addressing product for the treatment of cancer
US20160106861A1 (en) * 2013-04-26 2016-04-21 Spirogen Sarl Axl antibody-drug conjugate and its use for the treatment of cancer

Also Published As

Publication number Publication date
US10161930B2 (en) 2018-12-25
ZA201403141B (en) 2015-04-29
AU2017219091A1 (en) 2017-09-21
CA2854126A1 (en) 2013-05-10
KR102033805B1 (ko) 2019-10-17
CA2851941A1 (en) 2013-05-10
US9689862B2 (en) 2017-06-27
AU2017219091B2 (en) 2019-05-02
BR112014010383A2 (pt) 2017-04-25
US9173962B2 (en) 2015-11-03
RU2650771C1 (ru) 2018-04-17
CN103998468B (zh) 2017-04-19
BR112014010383B1 (pt) 2022-02-01
CA2851941C (en) 2021-01-12
IL232342A0 (en) 2014-06-30
MA35659B1 (fr) 2014-11-01
MX2014005240A (es) 2014-08-22
RU2659094C2 (ru) 2018-06-28
JP2018052970A (ja) 2018-04-05
JP2014532687A (ja) 2014-12-08
CN104039829B (zh) 2021-01-08
US20160131639A1 (en) 2016-05-12
US20140141023A1 (en) 2014-05-22
HK1199460A1 (en) 2015-07-03
EP2773663A1 (en) 2014-09-10
TN2014000148A1 (en) 2015-09-30
EP2773666A1 (en) 2014-09-10
HK1197073A1 (en) 2015-01-02
JP6685270B2 (ja) 2020-04-22
JP6345595B2 (ja) 2018-06-20
WO2013064685A1 (en) 2013-05-10
AU2012331068A1 (en) 2014-05-22
RU2014120629A (ru) 2015-12-10
CN104039829A (zh) 2014-09-10
US20150037340A1 (en) 2015-02-05
BR112014010591A2 (pt) 2017-05-02
KR20140094589A (ko) 2014-07-30
WO2013064684A1 (en) 2013-05-10
NZ624989A (en) 2016-08-26
IL232342B (en) 2021-03-25
AU2012331069B2 (en) 2017-01-05
CN103998468A (zh) 2014-08-20
KR102089114B1 (ko) 2020-04-14
MY174259A (en) 2020-04-01
KR20140091035A (ko) 2014-07-18
EP2589609A1 (en) 2013-05-08
JP2015504302A (ja) 2015-02-12
AU2012331069A1 (en) 2014-06-05
MX2014005244A (es) 2015-03-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA119226C2 (uk) Антитіло, яке специфічно зв'язується з axl, та його застосування як продукту для адресної доставки при лікуванні раку
UA124615C2 (uk) АНТИТІЛО ПРОТИ ПОДІБНОГО ДО Fc-РЕЦЕПТОРА БІЛКА 5 (FcRH5)
UA125382C2 (uk) Антитіла проти людського vista та їх застосування
CN114106099B (zh) 蛋白裂解酶和u型纤溶酶原激活物的底物和其它可裂解部分及其使用方法
UA126656C2 (uk) Біспецифічна конструкція антитіла до psma і cd3, яке залучають t-клітини
UA120596C2 (uk) Моноклональне антитіло проти інгібітора шляху тканинного фактора (tfpi)
UA125718C2 (uk) Композиції антитіл до ror1 і пов'язані з ними способи
UA113838C2 (xx) Антитіло, яке зв'язує мезотелін, та імунокон'югат
UA126441C2 (uk) Химерні антигенні рецептори, націлені на bcma, та способи їх застосування
CN108135968A (zh) 嵌合多肽组装体及其制备和使用方法
UA127450C2 (uk) Рекомбінантний поліпептид, що зв'язується з cd123
UA103912C2 (uk) Антитіла проти ангіопоетину-2 людини
UA126281C2 (uk) Антитіла проти сигнал-регуляторного білка альфа та способи їх застосування
UA117446C2 (uk) Гуманізоване антитіло до cxcr5
UA74330C2 (uk) СПОСОБИ ВИКОРИСТАННЯ РОЗЧИННОГО РЕЦЕПТОРА BR43x2
UA98762C2 (uk) Моноклональне антитіло, яке зв'язується з tat226, та імунокон'югат
HUE026089T2 (hu) NGF elleni antitestek és eljárás alkalmazásukra
UA125577C2 (uk) Антигензв'язуюча молекула, які містить тримерний ліганд сімейства tnf
UA118954C2 (uk) АНТИ-FcRn АНТИТІЛО
CN101925612A (zh) 针对癌相关的nfkbib变体的表位的抗体及其用途
UA127308C2 (uk) Активована протеазою біспецифічна молекула, яка зв'язує т-клітини
CN107207591A (zh) 血脑屏障受体抗体及使用方法
CN101679512A (zh) 抗丙型肝炎病毒（hcv）人抗体及其用途
UA126972C2 (uk) Аденовірус, озброєний біспецифічним рекрутером t-клітин (bite)
KR20210050535A (ko) 항-bcma 단일 도메인 항체 및 그 적용