MX2014005240A - Proteina de union de antigeno y su uso como producto dirigido para el tratamiento del cancer. - Google Patents

Proteina de union de antigeno y su uso como producto dirigido para el tratamiento del cancer.

Info

Publication number
MX2014005240A
MX2014005240A MX2014005240A MX2014005240A MX2014005240A MX 2014005240 A MX2014005240 A MX 2014005240A MX 2014005240 A MX2014005240 A MX 2014005240A MX 2014005240 A MX2014005240 A MX 2014005240A MX 2014005240 A MX2014005240 A MX 2014005240A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
antigen
seq
axl
protein
sequence
Prior art date
Application number
MX2014005240A
Other languages
English (en)
Inventor
Liliane Goetsch
Charlotte Beau-Larvor
Nicolas Boute
Original Assignee
Pf Medicament
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pf Medicament filed Critical Pf Medicament
Publication of MX2014005240A publication Critical patent/MX2014005240A/es

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5035—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on sub-cellular localization
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2497—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing N- glycosyl compounds (3.2.2)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/02—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2) hydrolysing N-glycosyl compounds (3.2.2)
    • C12Y302/02022—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2) hydrolysing N-glycosyl compounds (3.2.2) rRNA N-glycosylase (3.2.2.22)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Abstract

La presente invención se relaciona con una proteína de unión de antígeno, en particular un anticuerpo monoclonal, capaz de unirse específicamente a la proteína Axl así como a las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos que codifican para la proteína. Desde un aspecto, la invención se relaciona con una proteína de unión, o fragmentos de unión de antígenos, capaces de unirse específicamente a Axl y, por inducción de la incorporación de Axl, que se incorpora en la célula. La invención también comprende el uso de la proteína de unión de antígeno como un producto selectivo en la conjugación con otros compuestos anticáncer, como toxinas, elementos o fármacos radioactivos, y el uso de los mismos para el tratamiento de ciertos cánceres.

Description

PROTEINA DE UNION DE ANTIGENO Y SU USO COMO PRODUCTO DIRIGIDO PARA EL TRATAMIENTO DEL CANCER CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con una proteina de una unión de antigeno novedosa, en particular un anticuerpo monoclonal, capaz de unirse específicamente a la proteína Axl así como a las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos que codifican para la proteína. Desde un aspecto, la invención se relaciona con una proteína de unión de antígeno novedosa, o fragmentos de unión de antígeno, capaces de unirse específicamente a Axl y, por inducción de la incorporación de Axl, siendo incorporada hacia la célula. La invención también comprende el uso de la proteína de unión de antígeno como un producto dirigido en conjugación con otros compuestos anticáncer, como toxinas, elementos o fármacos radioactivos, y el uso de uso de los mismos para el tratamiento de ciertos cánceres.
ANTECEDENTES DE LA INVENCON La "Axl" (también referida como "Ufo", "Ark" o "Tyro7") fue clonada de proteínas con leucemia mieloide crónica como un oncogén que activa la transformación cuando es sobreexpresada por NIH3T3 de ratón. Pertenece a una familia de tirosinas cinasas recpetoras (RTK) llamada de la familia AM (Tyro3, Axl, Mer), la cual incluye Tyro3 (Rse, Sky, Dtk, Etk, BRT, Tif) , Axl y Mer (Eyk, NYK, Tyro-12) [Lemke G. Nat . Rev. Immunol. (2008).8, 327-336].
La proteina humana Axl es una proteína de 894 aminoácidos cuya secuencia es representada en el listado de secuencias como SEQ ID NO. 29. Los aminoácidos 1-25 que corresponden al péptido señal, la proteína humana Axl, sin el péptido señal, es representado en el listado de secuencias como SEQ ID NO. 30.
El Gas6, originalmente aislado como gen específico de la supresión del crecimiento, es el ligando común para los miembros de la familia TAM [Varnum B.C. et al. Nature (1995).373, 623-626]. El Gas6 exhibe una mayor afinidad por Axl, seguido por Tyro3 y finalmente por Mer [Nagata K. et al. J. Biol. Chem. (1996).271, 30022 a 30027]. El Gas6 consiste un domino rico en ?-carboxiglutamato (Gla) que media la unión a las membranas fosfolipídicas, cuatro dominios similares al factor de crecimiento epidérmico, y dos dominios similares a la laminina G (LG) [Manfioletti G., Brancolini, C, Avanzi, G. & Schneider, C. Mol. Cell Biol. (1993) 13, 4976-4985]. Como muchos otros RTK, la unión de ligando da como resultado la dimerización del receptor y la autofosforilación de residuos de tirosina (los residuos de tirosina 779, 821 y 866 para la Axl receptora) los cuales sirven como sitios de acoplamiento para una variedad de moléculas de señalización intracelular [Linger R.M. Adv. Cáncer Res. (2008).100, 35-83] . Además, el receptor de Axl puede ser activado a través de un proceso independiente de ligando. Esta activación puede ocurrir cuando el receptor de Axl esté sobreexpresado.
La señalización de Gas6/Axl ha mostrado regular varios procesos celulares incluyendo la proliferación, adhesión, migración y sobrevivencia celular en una gran variedad de células in vitro [Hafizi S. & Dahlback, B. FEBS J. (2006).273, 5231-5244]. Además, los receptores de TAM están implicados en el control de la inmunidad innata; ellos inhiben las respuestas inflamatorias a patógenos en las células dendriticas (DC) y macrófagos. También activan la fagocitosis de células apoptóticas por esas células inmunes y se requieren para la maduración y actividad asesina de las células asesinas naturales (NK) [Lemke G. Nat . Rev. Immunol. (2008) .8, 327-336] .
Es expresada débilmente sobre células normales, se observa de manera predominante en fibroblastos, células progenitoras mieloides, macrófagos, tejidos neuronales, músculo cardiaco y esquelético, donde se apoya principalmente la sobrevivencia celular. El sistema Gas6/Axl juega un papel importante en la biología vascular regulando la homeostasis de las células del músculo liso vascular [Korshunov V.A., Mohán, A.M., Georger, M.A. & Berk, B.C. Circ. Res. (2006).98, 1446-1452; Korshunov V.A. , Daul, M. , Massett, M.P. & Berk, B.C. Hypertension (2007).50, 1057-1062].
En células tumorales, la Axl juega un papel importante en la regulación de la invasión y migración celular. La sobreexpresión de Axl está asociada no únicamente con un pronóstico pobre, sino también con una invasividad incrementada de varios cánceres humanos de acuerdo a lo reportado para el cáncer de mama, colon, carcinoma esofágico, hepatocelular, gástrico, glioma, pulmón, melanoma, osteosarcoma, ovario, próstata, rabdomiosarcoma, renal, tiroideo y uterino endometrial [Linger R.M. Adv. Cáncer Res. (2008).100, 35-83 y Verma A. Mol. Cáncer Ther. (2011) 10, 1763-1773, para revisiones] . En el cáncer de mama, la Axl parece ser un efector fuerte de la transición epitelial a mesenquimal (EMT) ; el programa EMT contribuye activamente a la migración y diseminación de células cancerosas en el organismo [Thiery J.P. Curr. Opin. Cell Biol (2003).15, 740-746] .
La Axl también ha mostrado regular angiogénesis . En realidad el abatimiento de Axl en células endoteliales dañó la formación de túbulos y migración [Holland S.J. et al. Cáncer Res. (2005).65, 9294-9303] asi las vías de señalización angiogénicas especificas distribuidas [Li Y. et al. Oncogene (2009).28, 3442-3455].
Más recientemente varios estudios sobre una gama de modelos celulares describieron la implicación de una sobreexpresion de Axl en el fenómeno de resistencia a fármacos. La siguiente tabla 1 resume esos estudios.
Tabla 1 Las referencias completas citadas en la tabla 1 anterior son las siguientes: - Macleod, K. et al. Cáncer Res. (2005).65, 6789- 6800 - ahadevan D. et al. Oncogene (2007) .26, 3909-3919 - Lay J.D. et al. Cáncer Res. (2007).67, 3878-3887 - Hong C.C. et al. Cáncer Lett . (2008).268, 314-324 - Liu L. et al. Cáncer Res. (2009).69, 6871-6878 - Keating A.K. et al. Mol. Cáncer Ther. (2010).9, 1298-1307 - Ye X. et al. Oncogene (2010) .29, 5254-5264 En ese contexto la Axl RTK se considera como un blanco interesante en oncología. Varios grupos ya han desarrollado estrategias antitumorales dirigidos dirigidas a eje gas6/Axl, ya sea usando anticuerpos monoclonales desnudos o moléculas pequeñas dirigidas [Verma A. Mol. Cáncer Ther. (2011) .10, 1763-1773] .
En una primera modalidad, la invención se relaciona con una proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, la cual i) se une específicamente a la proteína humana Axl, e ii) se incorpora después de su unión a la proteína humana Axl.
De manera más general, la invención se relaciona con el uso de la proteína Axl para la selección de una proteína de unión de antígeno, o un fragmento de unión de antígeno de la misma, capaz de ser incorporada después de su unión a la Axl blanco. De manera más particular, el blanco es el dominio extracelular de Axl.
En este aspecto particular, la presente invención está dirigida de este modo a un método in vitro para la selección de un compuesto, o un fragmento de unión del mismo, capaz de liberar o incorporar una molécula de interés en células de mamífero, siendo la molécula de interés ligada covalentemente al compuesto, donde el método comprende los siguientes pasos de: a) seleccionar un compuesto el cual es capaz de unirse específicamente a la proteína Axl, o el dominio extracelular (ECD) de la misma, o un epítope de la misma; b) opcionalmente, enlazar covalente la molécula de interés, o una molécula de control, al compuesto seleccionado en el paso a) para formar un complejo; c) poner en contacto el compuesto seleccionado en el paso a) , o el complejo obtenido en el paso b) , con una célula de mamífero, preferiblemente una célula viable, que exprese en su superficie la proteína Axl, o un fragmento funcional de la misma; d) determinar si el compuesto, o la molécula de interés o el complejo, ha sido liberado o incorporado intracelularmente en la célula de mamífero; y e) seleccionar el compuesto como un compuesto capaz de liberar o incorporar una molécula de interés en una célula de mamífero viable.
En una modalidad preferida, el compuesto capaz de liberar o incorporar una molécula de interés en una célula de mamífero viable es una proteína (también designada aquí como polipéptido o péptido) o un compuesto similar a una proteína que comprende una estructura peptídica, particularmente una secuencia de aminoácidos de al menos 5, 10, 15 o más aminoácidos residuales, los aminoácidos residuales pueden ser glicosilados .
Cuando el compuesto capaz de liberar o incorporar una molécula de interés en una célula de mamífero viable es una proteína o un compuesto similar a una proteína, el compuesto también es llamado aquí una "proteína de unión de antígeno", la proteína de unión antígeno, o fragmento de unión de antígeno de la misma, puede: i) unirse específicamente a la proteína Axl, preferiblemente la proteína Axl humana, e ii) incorporarse en una célula de mamífero después de su unión a la proteína Axl cuando la proteína Axl es expresada en la superficie de la célula de mamífero.
En una modalidad preferida, la célula de mamífero viable es una célula humana, preferiblemente una célula que expresa de manera natural el receptor de proteína Axl.
En una modalidad particular, las células viables de mamífero en el paso c) son células de mamífero las cuales expresan proteínas Axl recombinante en su superficie.
En una modalidad también preferida, la molécula de interés es una molécula citotóxica (también designada aquí como agente citotóxico o citostático) .
En una modalidad también preferida, la molécula de interés se liga covalentemente al compuesto capaz de unirse a la proteína Axl usando un enlazante, de manera más preferible un enlazante peptídico, de manera más preferible un enlazante peptídico escindible, de manera más preferible un enlazante el cual puede ser escindido por compuestos intracelulares naturales contenidos en la célula de mamífero, particularmente en el citosol de la célula de mamífero.
En una modalidad también preferida, el compuesto capaz de unirse a la proteína Axl es un anticuerpo, o fragmento de unión funcional del mismo, el cual está dirigido específicamente contra la proteína Axl, o contra un epítope del mismo localizado en el dominio Axl EDC.
El paso de selección de e) puede ser realizado por cualquier método conocido por el experto en la técnica para la evaluación de la liberación o incorporación intracelular . El ensayo o prueba capaz de demostrar o evaluar la presencia, ausencia, o la actividad del compuesto capaz de unirse específicamente a la proteína Axl, o el complejo formado por el compuesto y la molécula de interés, o de la molécula de interés la cual se ligó covalentemente al compuesto, son bien conocidos por el experto (véanse algunos ejemplos de esa prueba o ensayo descritos aqui posteriormente, sin limitar esas pruebas a los siguientes ejemplos de prueba) .
De manera más particular, esas pruebas o ensayos pueden ser realizados por FACS, inmunofluorescencia, citometria de flujo, western blot, evaluaciones citotóxicas/ citostáticas , etc.
En este aspecto, la presente invención también está dirigida a un método in vitro para la preparación de un complejo citotóxico o citostático capaz proporcionar un compuesto citotóxico a una célula de mamífero, preferiblemente una célula viable, el método comprende el paso de: - ligar covalentemente un agente citotóxico a un compuesto el cual es: - i) capaz de unirse específicamente a la proteína Axl, preferiblemente la proteína Axl humana, y de ii) incorporarse en una célula de mamífero después de unión a la proteína Axl cuando la proteína Axl esté expresada en la superficie de la célula de mamífero.
Preferiblemente el compuesto es una proteína similar a una proteína, de manera más preferible un anticuerpo el cual está dirigido específicamente contra la proteína Axl, o contra un epítope de la misma localizada en el dominio Axl EDC, o un fragmento de unión funcional del anticuerpo.
En una modalidad preferida, el agente citotóxico es ligado covalentemente al anticuerpo anti-Axl o fragmento funcional del misma, usando un enlazante, de manera más preferible un enlazante peptidico, de manera más preferible un enlazante peptidico escindible, de manera más preferible un enlazante el cual puede ser escindible, como un ejemplo no limitante por compuestos intracelulares naturales.
Al igual que otros miembros de la familia TAM, el dominio extracelular de Axl (ECD) tiene una organización cercana a aquella de las moléculas de adhesión celular. El Axl ECD se caracteriza por una combinación de dos dominios similares a inmunoglobulina seguidos por dos dominios similares a fibronectina tipo III adyacentes [O'Bryan J.P. et al. Mol. Cell Biol. (1991).11, 5016-5031]. Los dos dominios similares a inmunoglobulina N-terminales son suficientes para la unión del ligando de Gas6 [Sasaki T. et al., EMBO J. (2006) .25, 80-87] .
El ECD de la proteina humana Axl es un fragmento de 451 aminoácidos, correspondiente a los aminoácidos 1 a 451 de la secuencia SEQ ID NO. 29, secuencia la cual es representada en el listado de secuencias como SEQ ID NO. 31. Los aminoácidos 1-25 correspondientes al péptido señal, el ECD de la proteina humana Axl sin el péptido señal corresponde a los aminoácidos 26-451 de la secuencia SEQ ID NO. 29, representada por la secuencia SEQ ID NO. 32.
A la fecha han sido identificados diferentes modos de incorporación. Ellos orientan el inicio de las proteínas o complejo proteico incorporado en la célula. Después de la endocitosis, la mayoría de las proteínas o lípidos de las membranas regresan a la superficie celular (reciclaje) , pero algunos componentes de la membrana son proporcionados a endosomas tardíos o al aparato de Golgi [Maxfield F.R. & McGraw, T.E. Nat . Rev. Mol. Cell Biol. (2004).5, 121-132].
En una modalidad preferida, la invención se relaciona con una proteína de unión a antígeno o un fragmento de unión a antígeno de la misma, la cual i) se une específicamente a la proteína humana Axl, y ii) se incorpora después de su unión a la proteína humana Axl, comprendiendo la proteína de unión de antígeno al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo gue consiste en SEQ ID NOs . 1 a 14, o cualquier secuencia que exhiba al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con las SEQ ID NOs. 1 a 14.
En una modalidad más preferida, la invención se relaciona con una proteína de unión de antígeno, o un fragmento de unión de antígeno de la misma, la cual i) se une específicamente a la proteína humana Axl, que tiene preferiblemente la secuencia de SEQ ID NO. 29 o 30 o una secuencia variante natural de la misma, y ii) se incorpora después de su unión a la proteína humana Axl, comprendiendo la proteína de unión a antigeno al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs . 1 a 14.
Una "proteína de unión" o "proteína de unión de antigeno" es una cadena peptídica que tiene una afinidad específica o general con otra proteína o molécula (generalmente referida como antigeno) . Las proteínas son puestas en contacto y forman un complejo cuando es posible la unión. La proteína de unión de antigeno de la invención puede ser preferiblemente, sin limitación, un anticuerpo, un fragmento o derivado de un anticuerpo, una proteína o un péptido .
Por "fragmento de unión de antigeno" de una proteína de unión de antigeno de acuerdo con la invención, se pretende indicar cualquier péptido, polipéptido, o proteína que retenga la capacidad de unirse específicamente al blanco (también referido generalmente como antigeno) de la proteína de unión al antigeno y comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 5 aminoácidos residuales contiguos, al menos 10 aminoácidos residuales contiguos, al menos 15 aminoácidos residuales contiguos, al menos 20 aminoácidos residuales contiguos, al menos 25 aminoácidos residuales contiguos, al menos 40 aminoácidos residuales contiguos, al menos 50 aminoácidos residuales contiguos, al menos 60 aminoácidos residuales contiguos, al menos 70 aminoácidos residuales contiguos, al menos 80 aminoácidos residuales contiguos, al menos 90 aminoácidos residuales contiguos, al menos 100 aminoácidos residuales contiguos, al menos 125 aminoácidos residuales contiguos, al menos 150 aminoácidos residuales contiguos, al menos 175 aminoácidos residuales contiguos, al menos 200 aminoácidos residuales contiguos, al menos 250 aminoácidos residuales contiguos de la secuencia de aminoácidos de la proteina de unión de antigeno.
En una modalidad preferida donde la proteina de unión de antigeno es un anticuerpo, esos "fragmentos de unión de antigeno" son seleccionados del grupo que consiste de Fv, scFv (se para una sola cadena), Fab, F(ab')2, Fab' , fragmentos de scFv-Fc o diacuerpos, o cualquier fragmento cuyo tiempo de vida media se haya incrementado por modificación química, como la adición de poli (alquilen) glicol, como poli (etilen) glicol ("PEGilación") (fragmentos pegilados llamados Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab' )2-PEG o Fab' -PEG) ("PEG" para poli (etilen) glicol) , o por incorporación en un liposoma, teniendo los fragmentos al menos una de las CDR características del anticuerpo de acuerdo con la invención. Preferiblemente, los "fragmentos de unión de antígeno" estarán constituidos o comprenderán una secuencia parcial de la cadena variable pesada o ligera del anticuerpo del cual se derivaron, siendo la secuencia parcial suficiente para retener la misma especificidad de unión que el anticuerpo del cual descienden y una afinidad suficiente, preferiblemente al menos igual a 1/100, en una forma más preferida a al menos 1/10, de la afinidad del anticuerpo del cual descienden, con respecto al blanco. Ese fragmento funcional contendrá al menos 5 aminoácidos, preferiblemente 10, 15, 25, 50 y 100 aminoácidos consecutivos de la secuencia del anticuerpo del cual desciende.
El término "epitope" es una región de un antigeno que es unido por una proteina de unión de antigeno, incluyendo los anticuerpos. Los epitopes pueden ser definidos como estructurales o funcionales. Los epitopes funcionales son generalmente un subconjunto de epitopes estructurales y tienen aquellos residuos que contribuyen directamente a la afinidad de la interacción. Los epitopes también pueden ser conformacionales, es decir, estar compuestos de aminoácidos no lineales. En ciertas modalidades, los epitopes pueden incluir determinantes que sean agrupamientos de superficies químicamente activos de moléculas como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, grupos fosforilo, o grupos sulfonilo, y, en ciertas modalidades, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, y/o características de carga específicas.
En la presente solicitud, el epítope se localiza en el dominio extracelular de la proteina humana Axl.
De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, la proteina de unión de antigeno, o un fragmento de unión de antigeno de la misma, se une específicamente a un epítope localizado en el dominio extracelular de la proteína humana Axl, que tiene preferiblemente la secuencia SEQ ID NO. 31 o 32 o una secuencia variante natural de la misma.
Por "que se une específicamente", "se une específicamente", o similares, se pretende que la proteína de unión de antígeno, o fragmento de unión a antígeno de la misma, forme un complejo con un antígeno que sea relativamente estable bajo condiciones fisiológicas. La unión específica puede ser caracterizada por una constante de disociación en equilibrio de al menos aproximadamente 1 x 10"6 M o menos. Los métodos para determinar si dos moléculas se unen específicamente son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, diálisis en equilibrio, resonancia plasmódica superficial, y similares. Para evitar dudas, no significa que el fragmento de unión de antígeno no pudiera unirse o interferir, a un bajo nivel, con otro antígeno. No obstante, como una modalidad preferida, el fragmento de unión del antígeno se une únicamente al antígeno.
En este caso, "CE50" se refiere a la concentración efectiva del 50%. De manera más precisa, el término concentración efectiva máxima media (CE50) corresponde a la concentración de un fármaco, anticuerpo o entidad tóxica que induce una respuesta a la mitad del camino entre la linea basal y el máximo después de un tiempo de exposición especificado. Este es comúnmente usado como una medida de la potencia del fármaco. La CE5o de una curva de respuesta a la dosis graduada, representa por lo tanto la concentración de un compuesto donde se observa el 50% de su efecto máximo. La CE50 de una curva de respuesta a la dosis cuantificada representa la concentración de un compuesto en un 50% de la población exhibe una respuesta, después de una duración de exposición especificada. Las medidas de concentración típicamente siguen una curva sigmoidal, incrementándose rápidamente sobre un cambio relativamente pequeño en la concentración. Esto se puede ser determinado matemáticamente por derivación de la mejor linea de ajuste.
Como una modalidad preferida, la CE50 determinada en la presente invención caracteriza la potencia de la unión de un anticuerpo sobre el Axl ECD expuesto sobre células tumorales humanos. El parámetro de CE50 es determinado usando análisis por FACS . El parámetro CE50 refleja la concentración de anticuerpo para el cual se obtiene un 50% de la unión máxima sobre la Axl humana expresada sobre células tumorales humanas. Cada valor de CE50 fue calculado como el punto medio de la curva de respuesta a la dosis usando un programa de ajuste de curva por regresión de cuatro parámetros (Prism Software) . Este parámetro ha sido seleccionado como para ser representativo de las condiciones fisiológicas/patológicas.
En una modalidad de la invención, la proteína de unión de antígeno, o un fragmento de unión de la misma, se une a su epítope con una CE50 de al menos 1CT9 M, preferiblemente entre 10" 9 y 10~12 M.
Otra modalidad de la invención es un proceso o método para la selección de una proteína de unión de antígeno, o un fragmento de unión de antígeno de la misma, capaz de incorporarse intracelularmente en una célula de mamífero, preferiblemente en una célula de humana, preferiblemente una célula viable, que comprende los pasos de: - i) seleccionar la proteína de unión de antígeno que se une específicamente a Axl, preferiblemente a su dominio de EDC o a un epítope del mismo; y - ii) seleccionar la proteína de unión de antígeno del paso anterior i) que se incorpora en la célula de mamífero después de su unión a una proteína Axl expresada en la superficie de la célula de mamífero.
En una modalidad particular, la célula de mamífero expresa naturalmente el receptor de proteína Axl en su superficie o son células de mamífero las cuales expresan la proteína Axl recombinante en su superficie, preferiblemente células humanas.
Ese método o proceso puede comprender los pasos de i) seleccionar proteina de unión de antigeno que se une específicamente a Axl con una CE50 de al menos 1CT9 M y ii) seleccionar la proteína de unión de antígeno de pasos anteriores que se incorporan después de su unión a Axl. El paso de selección de ii) puede ser realizado por cualquier método conocido por el experto en la técnica para la evaluación de incorporación. De manera más particular, las pruebas pueden ser realizadas por FACS, inmunofluorescencia, citometría de flujo, western blot, evaluaciones de citotoxicidad, etc.
Otra característica de la proteína de unión a antígeno de acuerdo con la invención es que no tiene ninguna actividad significativa sobre la proliferación de células tumorales. De manera más particular, como se ilustra en los siguientes ejemplos, la proteína de unión de antígeno de acuerdo con la invención no tiene ninguna actividad significativa in vitro sobre el modelo de proliferación SN12C.
En oncología, existen múltiples mecanismos por los cuales los mAbs pueden ejercer eficacia terapéutica, pero con frecuencia su actividad no es suficiente para producir un beneficio duradero. En consecuencia, han sido empleadas varias estrategias para mejorar su actividad particularmente combinándolos con fármacos como agentes quimioterapéuticos .
Como una alternativa eficiente a los protocolos de combinación, las inmunotoxinas se convierten en una opción terapéutica novedosa para tratar el cáncer [Beck A. et al. Discov. Med. (2010).10, 329-339; Alley S.C. et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. (2009).330, 932-938]. Los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) representan un método donde la capacidad para aprovechar la especificidad de mAbs y el blanco para proporcionar un agente citotóxico al tumor de puede mejorar significativamente las actividades tanto de los mAbs y como del fármaco. Idealmente el mAb se unirá específicamente a un antigeno con la expresión sustancial sobre células tumorales pero expresión limitada sobre células normales .
La presente invención se enfoca sobre una proteina de unión anti-Axl especifica, y de manera más particular con un anticuerpo anti-Axl especifico, que presenta una alta capacidad para incorporarse después de la unión de Axl. Esa proteina de unión al antigeno es interesante como uno de los componentes del conjugado inmuno-fármaco para dirigir elementos citotóxico ligados a las células cancerosas blanco. Una vez incorporados los elementos citotóxicos activan la muerte de la célula cancerosa.
Se piensa que las claves importantes para tener éxito con la terapia inmunoconj ugada son la especificidad del antigeno blanco y la incorporación de los complejos de proteína de unión a antígeno en las células cancerosas. Obviamente antígenos no incorporados son menos efectivos que los antígenos incorporados para liberar agentes citotóxicos. Los procesos de incorporación son variables a través de antígenos y dependen de parámetros múltiples que puedan ser influenciados por proteínas de unión. Los RTK de la superficie celular, constituyen una familia de antígenos interesantes para investigar ese método.
En la biomolécula, las entidades citotóxicas llevan la actividad citotoxica y la proteína de unión a antígeno usada lleva su especificidad contra las células cancerosas, así como un vector para entrar dentro de las células para dirigir o controlar correctamente la entidad citotoxica.
De este modo, para mejorar la molécula inmunoconjugada, la proteína de unión de soporte debe exhibir una alta capacidad para incorporarse en las células cancerosas blanco. La eficiencia con la cual las proteínas de unión median la incorporación difiere significativamente dependiendo del epítope blanco. La selección de las proteínas de unión anti-Axl por incorporación potente requiere varios datos experimentales que estudian no únicamente la desregulación de Axl, sino también el seguimiento de las proteínas de unión anti-Axl comenzando en las células.
En una modalidad preferida, la incorporación de la proteína de unión de antígeno de acuerdo con la invención puede ser evaluada preferiblemente por inmunofluorescencia (como se ejemplifica aquí posteriormente en la presente solicitud) o cualquier método o proceso conocido por el experto en la técnica para el mecanismo de incorporación.
En otra modalidad preferida, cuando el complejo Axl-proteina de unión de antigeno, de acuerdo con la invención, se incorpora después de la unión de la proteina de unión de la invención al ECD de la Axl, es inducida una reducción en la cantidad de Axl en la superficie de las células. Esta reducción puede ser cuantificada por cualquier método conocido por el experto en la técnica (western blot, FACS, inmunofluorescencia, etc.).
En una modalidad de la invención, esta reducción, que refleja de este modo la incorporación, puede ser medida preferiblemente por FACS y expresada como la diferencia o delta entre la intensidad de fluorescencia media (MFI) medida sobre células no tratadas con la MFI medida con células tratadas con la proteina de unión de antigeno de acuerdo con la invención.
Como ejemplo no limitante de la presente invención, esta delta es determinada sobre la base de MFI obtenidas con células no tratadas y células tratadas con proteina de unión de antigeno de la invención como se describe en el Ejemplo 9 usando i) células SN12C de tumor renal humano después de un periodo de incubación de 24 horas con la proteina de unión de antigeno de la invención y ii) un anticuerpo secundario marcado con Alexa488. Este parámetro es definido de acuerdo a lo calculado con la siguiente fórmula: A(MFI24h células no tratadas - MFI24h células tratadas con proteína de unión de antígeno) Esta diferencia entre MFI refleja la desregulación de Axl puesto que las MFI son proporcionales a la Axl expresada sobre la superficie celular.
En un aspecto más preferido y ventajoso, la proteína de unión de antígeno, o un fragmento de unión de antígeno de la misma, de la invención consiste de un anticuerpo monoclonal, preferiblemente un mAb aislado, que activa una ? (MFI24h células no tratadas - MFI24h células tratadas) de al menos 200, preferiblemente de al menos 300.
La proteína de unión de antígeno, o un fragmento de unión de antígeno de la misma, de acuerdo con la invención, induce una reducción de MFI de al menos 200.
Con mayor detalle, la delta mencionada anteriormente puede ser medida de acuerdo con el siguiente proceso, el cual debe ser considerado como un ejemplo ilustrativo y no limitante: a) Tratar e incubar células tumorales de interés con la proteína de unión de antígeno de la invención; b) Tratar las células tratadas del paso a) y, en paralelo, las células no tratadas con la proteína de unión de antigeno de la invención, c) Medir la MFI (representativa de la cantidad de Axl presente en la superficie) para las células tratadas y no tratadas con un anticuerpo marcado secundario capaz de unirse a la proteina de unión de antigeno, y d) Calcular la delta como la sustracción de la MFI obtenida con las células tratadas de la MFI obtenida con las células no tratadas.
Los términos, "anticuerpo", "anticuerpos" o "inmunoglobulina" son usados de manera intercambiable en el sentido más amplio e incluye anticuerpos monoclonales, preferiblemente Mab aislado, (por ejemplo, anticuerpos de longitud completa o monoclonales intactos), anticuerpos policlonales , anticuerpos multivalentes o anticuerpos multiespecificos (por ejemplo, anticuerpos biespecificos en tanto exhiban la actividad biológica deseada) .
De manera más particular, esa molécula consiste de una glicoproteina que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región (o dominio) variable de cadena pesada (abreviada aquí como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada aqui como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden ser subdivididas además en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones de determinación de complementariedad (CDR) , intercaladas con regiones que son más conservadas, llamadas regiones estructurales (FR) . Cada VH y VL está comprendida de tres CDR y cuatro FR, arregladas del amino terminal al carboxi terminal en el siguiente orden: FRl, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antigeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores anfitriones, incluyendo varias células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico.
Los anticuerpos en el sentido de la invención también incluyen ciertos fragmentos de anticuerpo, de los mismos. Los fragmentos de anticuerpo exhiben la especificidad y afinidad de unión especificas, sin importar la fuente o tipo de inmunoglobulina (es decir, IgG, IgE, IgM, IgA, etc) , es decir, que son capaces de unirse específicamente a la proteína Axl con una afinidad comparable a la de los anticuerpos de longitud completa de la invención.
En general, para la preparación de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos funcionales, especialmente de origen murino, es posible referirse a técnicas las cuales son descritas en particular el manual "Anticuerpos" (Harlow and Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988) o a la técnica de preparación de hibridomas descrita por Kohler y Milstein (Nature, 256:495-497, 1975).
El término "anticuerpo monoclonal" o "Mab" como se usa aquí se refiere a una molécula de anticuerpo que está dirigida contra un antigeno especifico y que puede ser producida por una sola clona de células de hibridoma B. Los anticuerpos monoclonales también pueden ser recombinantes, es decir producidos modificando la proteina. Además, en contraste con preparaciones de anticuerpos policlonales que típicamente incluyen varios anticuerpos dirigidos contra varios determinantes, o epítopes, cada anticuerpo monoclonal se está dirigido contra un solo epítope del antígeno. La invención se relaciona con anticuerpos aislados u obtenidos por purificación de fuentes naturales u obtenidos por recombinación genética o síntesis química.
Una modalidad preferida de la invención es una proteína de unión de antígeno, o un fragmento de unión de antígeno de la misma, que comprende o que consiste de un anticuerpo, comprendiendo el anticuerpo tres CDR de cadena ligera que comprende las secuencias SEQ ID NOs . 1, 2 y 3, o cualquier secuencia que exhiba al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con las SEQ ID NOs. 1, 2 y 3; y las tres CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias SEQ ID NOs. 4, 5 y 6, o cualquier secuencia que exhiba al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con las SEQ ID NOs. 4, 5 y 6.
En una modalidad más preferida de la invención, la proteina de unión de antigeno, o el fragmento de unión de antigeno de la misma, consiste de un anticuerpo, comprendiendo el anticuerpo las tres CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias SEQ ID NOs. 1, 2 y 3; y las tres CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias SEQ ID NOs. 4, 5 y 6.
En una modalidad más preferida de la invención, la proteina de unión a antigeno o un fragmento de unión a antigeno de la misma, consiste de un anticuerpo, el anticuerpo comprende las tres CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias SEQ ID NOs. 1, 2 y 3; y las tres CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias SEQ ID NOs. 4, 5 y 6.
En un aspecto preferido, por regiones CDR o CDR (s), se pretende indicar las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera de las inmunoglobulinas de acuerdo a lo descrito por IMGT. Sin ninguna mención contradictoria, las CDRs son definidas en la presente especificación de acuerdo con el sistema de numeración IMGT.
La numeración única del IMGT ha sido definida para comparar los dominios variables de cualquiera que sea el receptor de antigeno, el tipo de cadena, o las especies [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz, M . , Giudicelli, V., Foulquier, E . , Truong, L . , Thouvenin-Contet , V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol, 27, 55-77 (2003) ] . En la numeración única del IMGT, los aminoácidos conservados siempre tienen la misma posición, por ejemplo, cisteina 23 (la-CYS), triptófano 41 (TRP CONSERVADO), el aminoácido hidrófobo 89, cisteina 104 (2a-CYS), fenilalanina y triptófano 118 (J-PHE o J-TRP) . La numeración única del IMGT proporciona una delimitación estandarizada de las regiones estructurales (FR1-IMGT: posiciones 1 a 26, FR2-IMGT: 39 a 55, FR3-IMGT: 66-104 y FR4-IMGT: 118 a 128) y de las regiones determinantes de la complementariedad: CDR1-IMGT: 27 a 38, CDR2-IMGT: 56 a 65 y CDR3-IMGT: 105-117. Puesto que los espacios o huecos representan posiciones no ocupadas, las longitudes de las CDR-IMGT (mostradas entre corchetes y separadas por puntos, por ejemplo, [8.8.13]) se convierten en información crucial. La numeración única del IMGT es usada en representaciones gráficas 2D, designadas como Collares de Perlas IMGT [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics , 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], y estructuras 3D en IMGT/Estructura 3D-DB [Kaas, Q. , Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and HC structural data. Nucí. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].
Debe comprenderse que, sin especificación contradictoria en la presente especificación, las regiones determinantes de la complementariedad o CDRs, significan regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas como se define de acuerdo con el sistema de numeración del IMGT .
No obstante, las CDR también pueden ser definidas de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, y últimas ediciones) . Existen tres CDRs de cadena pesada y tres CDR de cadena ligera. Aquí, los términos "CDR" y "CDR" son usados para indicar, dependiendo del caso, uno o más, o aún todas, las regiones que contienen la mayoría de los aminoácidos residuales responsables de la afinidad de unión del anticuerpo para el antígeno o epítope que reconoce.
De acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, la presente invención se relaciona con una proteína de unión de antígeno, o un fragmento de unión de antígeno de la misma, que consiste de un anticuerpo, comprendiendo el anticuerpo las tres CDR de cadena ligera, como se define de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, que comprende las secuencias SEC ID NOs. 9, 10 y 11, o cualquier secuencia que exhiba al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con la SEQ ID NOs. 9, 10 y 11; y las tres CDRs de cadena pesada, como se define de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, que comprenden las secuencias SEQ ID NOs. 12, 13 y 14, o cualquier secuencia que exhiba al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con las SEQ ID NOs . 12, 13 y 14.
En el sentido de la presente invención, el "porcentaje de identidad" entre dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos significa el porcentaje de nucleótidos o aminoácidos residuales idénticos entre dos secuencias a ser comparadas, obtenida después de la alineación óptima, siendo este porcentaje puramente estadístico y las diferencias entre las dos secuencias estando distribuidos aleatoriamente a lo largo de toda su longitud. La comparación de dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos es tradicionalmente llevada a cabo comparando las secuencias después de haber sido alineadas de manera óptima, pudiéndose llevar a cabo la comparación por segmento o usando la "ventana de alineación". La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede ser llevada a cabo, además de la comparación manual, por medio del algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], por medio del algoritmo de homología local de Neddleman y unsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], por medio del método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) [Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444] o por medio de software de computadora usando esos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y FASTA en el Paquete de Software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, o por el software de comparación BLAST NR o BLAST P) .
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico o aminoácidos es determinado comparando las dos secuencias alineadas de manera óptima en las cuales las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos a comparar pueden tener adiciones o supresiones en comparación con la secuencia de referencia para la alineación óptima entre dos secuencias. El porcentaje de identidad es calculado determinando el número de posiciones en las cuales los aminoácidos, nucleótidos o residuo son idénticos entre las dos secuencias, preferiblemente entre las dos secuencias completas, dividiendo el número de posiciones idénticas por el número total de posiciones en la ventana de alineación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre las dos secuencias.
Por ejemplo, el programa BLAST, "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for coraparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol, 1999, Lett. 174:247-250) disponibles en el sitio http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, puede ser usado con los parámetros predeterminados (especialmente, para los parámetros de "penalidad por espacio abierto": , y "penalidad por espacio de extensión": 2, siendo la matriz seleccionada por ejemplo la matriz "BLOSUM 62" propuesto por el programa) ; el porcentaje de identidad entre las dos secuencias a comparar es calculada directamente por el programa.
Para la secuencia de aminoácidos que exhibe al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con una secuencia de aminoácidos de referencia, los ejemplos preferidos incluyen aquellos que contienen la secuencia de referencia, ciertas modificaciones, especialmente una supresión, adición o sustitución de al menos un aminoácido, limitación o extensión. En el caso de la sustitución de uno o más aminoácidos consecutivos o no consecutivos, son preferidas las sustituciones en las cuales los aminoácidos sustituidos son reemplazados por aminoácidos "equivalentes". Aqui, la expresión "aminoácidos equivalentes" indica cualquier aminoácido que probablemente sea sustituido por uno de los aminoácidos estructurales sin modificar sin embargo las actividades biológicas de los anticuerpos correspondientes y de aquellos ejemplos específicos definidos más adelante.
Los aminoácidos equivalentes pueden ser determinados ya sea sobre su homología estructural con los aminoácidos para los cuales están sustituidos o sobre los resultados de pruebas comparativas de actividad biológica entre las diferentes proteínas de unión de antígeno que probablemente estén generadas.
Como un ejemplo no limitante, la siguiente tabla 2 resume las posibles sustituciones que probablemente sean llevadas a cabo sin dar como resultado a una modificación significativa de la actividad biológica de la proteína de unión de antígeno modificada correspondiente; las sustituciones inversas son naturalmente posibles bajo las mismas condiciones.
Tabla 2 Una modalidad de la invención se relaciona con una proteina de unión de antigeno, o un fragmento de unión de antigeno de la misma, que comprende un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEQ ID No. 7, o cualquier secuencia que exhiba al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con la SEQ ID No. 7; y las tres CDRs de cadena pesada que comprenden las secuencias SEQ ID NOs. 4, 5 y 6, o cualquier secuencia que exhiba al menos 80%, preferiblemente 85%, 90% 95% y 98% de identidad con las SEQ ID NOs. 4, 5 y 6.
De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, la proteina de unión de antigeno, o un fragmento de unión de antigeno de la misma, comprende un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEQ ID No. 7, o cualquier secuencia que exhiba al menos 80% de identidad con la SEQ ID No. 7; y las tres CDRs de cadena pesada que comprenden las secuencias SEQ ID NOs. 4, 5 y 6.
De acuerdo con otra modalidad preferida de la invención, la proteína de unión de antígeno, o un fragmento de unión de antígeno de la misma, comprende un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEQ ID No. 7, o cualquier secuencia que exhiba al menos 80% de identidad con la SEQ ID No. 7.
Otra modalidad de la invención se relaciona con una proteína de unión de antígeno, o un fragmento de unión de antígeno de la misma, que comprende las tres CDRs de cadena ligera que comprenden las secuencias SEQ ID NOs. 1, 2 y 3, o cualquier secuencia que exhiba al menos 80%, preferiblemente 85%, 90% 95% y 98% de identidad con las SEQ ID NOs. 1, 2 y 3; y un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEQ ID No. 8, o cualquier secuencia que exhiba al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con las SEQ ID No. 8.
De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, la proteína de unión de o un fragmento de unión de antígeno de la misma, comprende las tres CDRs de cadena ligera que comprenden las secuencias SEQ ID NOs. 1, 2 y 3; y un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEQ ID No. 8, o cualquier secuencia que exhiba al menos 80% de identidad con la SEQ ID No. 8.
De acuerdo con otra modalidad preferida de la invención, la proteina de unión de o un fragmento de unión de antigeno de la misma, comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEQ ID No. 8, o cualquier secuencia que exhiba al menos 80% de identidad con la SEQ ID No. 8.
Otra modalidad de la invención se relaciona con una proteina de unión de antígeno, o un fragmento de unión de antigeno de la misma, que comprende un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEQ ID No. 7, o cualquier secuencia que exhiba al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con la SEQ ID No. 7; y un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEQ ID No. 8, o cualquier secuencia que exhiba al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con las SEQ ID No. 8.
De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, la proteina de unión de antigeno o un fragmento de unión de antigeno de la misma, comprende un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEQ ID No. 7, o cualquier secuencia que exhiba al menos 80% de identidad con la SEQ ID No. 7 y un dominio variable de cadena pesada de la SEQ ID No. 8, o cualquier secuencia que exhiba al menos 80% de identidad con las SEQ ID No. 8.
Para mayor claridad, la siguiente tabla 3a resume las diferentes secuencias de aminoácidos correspondientes a la proteina de unión de antigeno de la invención (con Mu. = murino) .
Tabla 3a Un aspecto especifico de la siguiente invención se relaciona con un anticuerpo murino, sus compuestos o fragmentos de unión de antigeno derivados, caracterizado porque el anticuerpo también comprende regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada derivadas de un anticuerpo de una especie heteróloga con el ratón, especialmente el hombre.
Otro aspecto especifico de la presente invención se relaciona con un anticuerpo quimérico, o sus compuestos o fragmentos de unión de antigeno derivados, caracterizado porque el anticuerpo también comprende regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada derivadas de un anticuerpo de una especia heteróloga con el ratón, especialmente el humano.
Otro aspecto especifico más de la presente invención se relaciona con un anticuerpo humanizado, o sus compuestos o fragmentos de unión de antigeno derivados, caracterizado porque las regiones constantes de la cadena ligera y la cadena pesada derivadas del anticuerpo humano son, respectivamente, la región lambda o kappa y la región gamma-1, gamma-2 o gamma-4.
Otro aspecto de la invención es una proteina de unión de antigeno que consiste del anticuerpo monoclonal 1613F12 derivado del hibridoma 1-4505 depositado en el CNCM, Instituto Pasteur, Francia, el 28 de Julio de 2011, o un fragmento de unión de antigeno del mismo.
De acuerdo con otro aspecto, la invención se relaciona con un hibridoma murino capaz de secretar una proteina de unión de antigeno de acuerdo con la invención, especialmente el hibridoma de origen murino presentado con la colección Franciasa de cultivos de microorganismos (CNCM, Instituto Pasteur, París, Francia) el 28 de Julio de 2011, bajo el número 1-4505. El hibridoma fue obtenido por la fusión de esplenocitos/linfocitos de ratón inmunizado Balb/C y células de mieloma Sp 2/línea celular O-Ag 14.
De acuerdo con otro aspecto, la invención se relaciona con un hibridoma murino capaz de secretar un anticuerpo que comprende los tres CDRs de cadena ligera que comprenden las secuencias SEQ ID NOs . 1, 2 y 3; y los tres CDRs de cadena pesada que comprenden las secuencias SEQ ID NOs. 4, 5 y 6, dicho hibridoma siendo presentado en la CNCM, Instituto Pasteur, París, Francia, el 28 de Julio de 2011, bajo el número 1-4505. El hibridoma fue obtenido por la fusión de esplenocitos/linfocitos de ratón inmunizado Balb/C y células de mieloma Sp 2/línea celular O-Ag 14.
Un objetivo de la invención es el hibridoma murino 1-4505 depositado en la CNCM, Instituto Pasteur, Francia, el 28 de Julio de 2011.
La proteína de unión de antígeno de la invención también comprende anticuerpos quiméricos o humanizados.
Un anticuerpo quimérico es uno que contiene una región variable natural (cadena ligera y cadena pesada) derivada de un anticuerpo y una combinación de especies dada con regiones constantes de cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de una especie heterologa a las especies dadas.
Los anticuerpos, o fragmentos quiméricos del mismo, pueden ser preparados usando las técnicas de genética recorabinante . Por ejemplo, el anticuerpo quimérico podría ser producido clonando ADN combinante que contenga un promotor y una secuencia que codifique para la región variable para un anticuerpo monoclonal no humano de la invención, especialmente murino, y una secuencia que codifique para la región constante del anticuerpo humano. Un anticuerpo quimérico de acuerdo con la invención, codificado por ese gen recombinante podría ser, por ejemplo, una quimera de ratón-humano, siendo la especificidad de este anticuerpo determinada por la región variable determinada del ADN murino y su isotipo determinado por la región constante derivada del ADN humano. Remítase a Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988) para métodos para preparar anticuerpos quiméricos.
En otro aspecto, la invención describe una proteína de unión la cual consiste de un anticuerpo quimérico.
En una modalidad preferida, particular, el anticuerpo quimérico, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, de la invención comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 7, y que comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 8.
En otro aspecto, la invención describe una proteína de unión la cual consiste de un anticuerpo humanizado.
"Anticuerpos humanizados" significa un anticuerpo que contiene regiones CDR derivadas de un anticuerpo de origen no humano, siendo las otras partes de la molécula del anticuerpo derivadas de uno (o varios) anticuerpos humanos. Además, algunos de los residuos del segmento del esqueleto (llamados FR) pueden ser modificados para preservar la afinidad de unión (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988).
Los anticuerpos humanizados de la invención o fragmentos de los mismos pueden ser preparados por técnicas conocidas por el experto en la técnica (como, por ejemplo, aquellos descritos en los documentos Singer et al., J. Immun., 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992; y Bebbington et al., Bio/Technology, 10: 169-175, 1992). Esos anticuerpos humanizados son preferidos para su uso en métodos que implican diagnósticos in vitro o tratamiento preventivo y/o terapéutico in vivo. Otras técnicas de humanización, también conocidas por un experto en la técnica, como, por ejemplo, la técnica de "injerto de CDR" descrita por PDL en las patentes EP 0 451 261, EP 0 682 040, EP 0 939 127, EP 0 566 647 ó US 5,530,101, US 6,180,370, US 5,585,089 y US 5,693,761. Las Patentes Estadounidenses 5,639,641 o 6,054,297, 5,886,152 y 5,877,293 también pueden ser citadas.
Además, la invención también se relaciona con anticuerpos humanizados que surgen de los anticuerpos murinos descritos anteriormente.
En una forma preferida, las regiones constantes de la cadena ligera y la cadena pesada derivadas del anticuerpo humano, son respectivamente, la región lambda o kappa y gamma-1, gamma-2 o gamma-4.
En una modalidad preferida, la invención se relaciona con una proteina de unión de antigeno que consiste de un anticuerpo humanizado, o un fragmento de unión de antigeno, el cual comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia SEQ ID NO. 36, o cualquier secuencia que exhiba al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con la SEQ ID NO. 36; y las tres CDRs de cadena pesada que comprenden las secuencias SEQ ID NO. 4, 5 y 6.
Otra modalidad de la invención de relaciona con una proteina de unión de antigeno, o un fragmento de unión de antigeno de la misma, que comprende un dominio variable de cadena ligera de la secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO. 37 a 47, o cualquier secuencia que exhiba al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con la SEQ ID NO. 37 a 47; y las tres CDRs de cadena pesada que comprenden las secuencias SEQ ID NOs. 4, 5 y 6.
Por "cualquier secuencia que exhiba al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con la SEQ ID NO. 36 o 37 a 47", se pretende designar las secuencias que exhiben las tres CDRs de cadena ligera de las SEQ ID NOs. 1, 2 y 3 y, además, que exhiben al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98%, de identidad con las SEQ ID NO. 36 o 37 a 47 de secuencia completa fuera de las secuencias correspondientes a las CDRs (es decir, a las SEQ ID NO. 1, 2 y 3) .
Para mayor claridad, la tabla 3 resume a continuación las diferentes secuencias de aminoácidos correspondientes a la cadena ligera (VL) de la proteina de unión de antigeno humanizada de la invención (con Hz.= humanizada) Tabla 3b Continuación Tabla 3b En una modalidad de la invención, la proteina de unión de antigeno, o un fragmento de unión de antigeno de la misma, comprende un dominio variable de cadena ligera, seleccionado del grupo que consiste de: i) un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEQ ID NO. 7 o cualquier secuencia que exhiba al menos 80% de identidad con la SEQ ID NO.7, ii) un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEQ ID NO. 36 o cualquier secuencia que exhiba al menos 80% de identidad con la SEQ ID NO. 36; y iii) un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEQ ID NO. 37 a 47 o cualquier secuencia que exhiba al menos 80% de identidad con la SEQ ID NO. 37 a 47.
En una modalidad preferida, la invención se relaciona con una proteina de unión de antigeno que consiste de un anticuerpo humanizado, o un fragmento de unión de antigeno, el cual comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia SEQ ID NO. 48, o cualquier secuencia que exhiba al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con la SEQ ID NO. 48; y las tres CDRs de cadena ligera que comprenden las secuencias SEQ ID NO. 1, 2 y 3.
Otra modalidad en la invención se relaciona con una proteina de unión de antigeno, o un fragmento de unión de antigeno de la misma, que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO. 49 a 68, o cualquier secuencia que exhiba al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con la SEQ ID NO. 49 a 68; y las tres CDRs de cadena ligera que comprenden las secuencias SEQ ID NOs. 1, 2 y 3.
Por "cualquier secuencia que exhiba al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con la SEQ ID NO. 48 y 49 a 68", se pretende designar las secuencias que exhiben las tres CDRs de cadena pesada SEQ ID NOs. 4, 5 y 6 y, además, que exhiben al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98%, de identidad con las SEQ ID NO. 48 y 49 a 68 de secuencia completa fuera de las secuencias correspondientes a las CDRs (es decir las SEQ ID NO. 4, 5 y 6) .
Para mayor claridad, la tabla 3c resume a continuación las diferentes secuencias de aminoácidos correspondientes a la cadena pesada (VH) de proteina de unión de antigeno humanizada de la invención (con Hz. = humanizado) Tabla 3c Continuación Tabla 3c En una modalidad de la invención, la proteina de unión de antigeno, o un fragmento de unión de antigeno, comprende un dominio variable de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste de: i) un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEQ ID NO. 8 o cualquier secuencia que exhiba al menos 80% de identidad con la SEQ ID NO.8; ii) un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEQ ID NO. 48 o cualquier secuencia que exhiba al menos 80% de identidad con la SEQ ID NO. 48; y iii) un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEQ ID NO. 49 a 68 o cualquier secuencia que exhiba al menos 80% de identidad con la SEQ ID NO. 49 a 68.
En una modalidad de la invención, la proteina de unión de antigeno, o un fragmento de unión de antigeno de la misma, comprende un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEQ ID NO. 36, o cualquier secuencia que exhiba al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con la SEQ ID NO. 36; y un dominio variable de cadena pesada variable de la secuencia SEQ ID NO. 48, o cualquier secuencia que exhiba al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con la SEQ ID NO. 48.
En otra modalidad de la invención, la proteina de unión de antigeno, o un fragmento de unión de antigeno de la misma, comprende un dominio variable de cadena ligera de la secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO. 37 a 47, o cualquier secuencia que exhiba al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con la SEQ ID NO. 37 a 47; y un dominio variable de cadena pesada variable de la secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO. 49 a 68, o cualquier secuencia que exhiba al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con la SEQ ID NO. 49 a 68.
En otra modalidad de la invención, la proteína de unión de antígeno, o un fragmento de unión de antígeno de la misma, comprende: i) un dominio variable de cadena ligera de las secuencias SEQ ID NO. 7, 36 o 37 a 47 o cualquier secuencia que exhiba al menos 80% de identidad con la SEQ ID NO.7, 36 ó 37 a 47; y ii) un dominio variable de cadena pesada de las secuencias SEQ ID NO. 8, 48 ó 49 a 68 o cualquier secuencia que exhiba al menos 80% de identidad con la SEQ ID NO. 8, 48 ó 49 a 68.
Un aspecto novedoso de la presente invención se relaciona con un ácido nucleico aislado caracterizado porque es seleccionado de entre los siguientes ácidos nucleicos (incluyendo cualquier código genético degenerado) : a) un ácido nucleico que codifica para una proteína de unión de antígeno, o para un fragmento de unión de antígeno de la misma, de acuerdo con la invención; b) un ácido nucleico que comprende: - una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs. 15 a 28 y 69 a 99, o - una secuencia de ácido nucleico que comprende las 6 secuencias de ácido nucleico de las SEQ ID NOs. 15 a 20, o una secuencia de ácido nucleico las dos secuencias de ácido nucleico de las SEQ ID NOs. 21, 22, o las dos secuencias de ácido nucleico seleccionadas de una parte de las SEQ ID NOs. 69 a 79 y la otra parte de las SEQ ID NOs: 80 a 99; c) un ácido nucleico complementario al ácido nucleico como se define en a) o b) ; y d) un ácido nucleico, que preferiblemente tiene al menos 18 nucleótidos, capaz de hibridarse bajo condiciones altamente rigurosas con una secuencia de ácido nucleico como se define en la parte a) o b) , o con una secuencia con al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de la linea óptima con una secuencia de ácido nucleico como se define en la parte a) o b) .
La Tabla 4a resume a continuación las diferentes secuencias de nucleótidos relacionadas con la proteina de unión de la invención (con Mu. = Murina) .
Tabla 4a Para mayor claridad, la Tabla b resume continuación las diferentes secuencias de nucleótido correspondientes a la cadena ligera (VL) de la proteina d unión de antigeno humanizado de la invención (con Hz. humanizado) Tabla 4b Para mayor claridad, la Tabla 4c resume a continuación las diferentes secuencias nucleotidicas correspondientes a la cadena pesada (VH) de la proteina de unión de antigeno humanizada de la invención (con Hz. = humanizada) Tabla 4c Hzl613F12 VH Los términos "ácido nucleico", "secuencia , "secuencia de ácido nucleico", "polinucleótido" , "oligonucleótido" , "secuencia polinucleotidica" y "secuencia nucleotidica" , usados de manera intercambiable en la presente invención, significan una secuencia precisa de nucleótidos, modificada o no que define un fragmento o una región de un ácido nucleico, que contiene nucleótidos naturales o no, y que es un ADN de doble hebra, un ADN de una sola hebra o productos de transcripción de los ADN.
Las secuencias de la presente invención han sido aisladas y/o purificadas, es decir que fueron muestreadas directa o indirectamente, por ejemplo por una copia, habiendo sido su ambiente modificado al menos parcialmente. Los ácidos nucleicos aislados obtenidos por genética recombinante, por medio de, por ejemplo, células anfitrionas, u obtenidos por síntesis química también deberían ser mencionados aquí.
"Secuencias nucleicas que exhiben un porcentaje de identidad de al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98%, después de la alineación óptima con una secuencia preferida" significa secuencias nucleicas que exhiben, con respecto a la secuencia nucleica de referencia, ciertas modificaciones como, en particular, una supresión, una truncación, una extensión, una fusión quimérica y/o una sustitución, especialmente puntual. Preferiblemente, esas son secuencias las cuales codifican para las mismas secuencias de aminoácidos que la secuencia de referencia, estando esas relacionadas con la degeneración del código genético, o secuencias complementarias . que probablemente se hibriden específicamente con las secuencias de referencia, preferiblemente bajo condiciones altamente rigurosas, especialmente aquellas definidas más adelante.
La hibridación bajo condiciones altamente rigurosas significa que las condiciones relacionadas con la temperatura y la fuerza iónica son seleccionadas de tal manera que permitan que la hibridación se mantenga entre dos fragmentos de ADN complementarios. Sobre una base meramente ilustrativa, las condiciones altamente rigurosas del paso de hibridación para definir los fragmentos polinucleótidos descritos anteriormente son, de manera ventajosa, como sigue.
La hibridación ADN-ADN o ADN-ARN es llevada a cabo en dos pasos: (1) prehibridación a 42°C durante tres horas en amortiguador de fosfato (20 mM, pH 7.5) que contiene 5X SSC (IX SSC corresponde a una solución de NaCl 0.15 M + citrato de sodio 0.015 M) , 50% de formaldehído, 7% de dodecil sulfato de sodio (SDS) , Denhardt 10X, 5% de sulfato de dextrano y 1% de ADN de esperma de salmón; (2) hibridación primaria durante 20 horas a una temperatura que depende de la longitud de la sonda (es decir: 42°C para una sonda >100 nucleótidos de longitud) , seguida por dos lavados de 20 minutos a 20°C en 2X SSC + 2% de SDS, un lavado de 20 minutos a 20°C en 0. IX SSC + 0.1% de SDS. El último lavado es llevado a cabo en 0. IX SSC + 0.1% de SDS durante 30 minutos a 60°C para una sonda >100 nucleótidos de longitud. Las condiciones de hibridación altamente rigurosas descritas anteriormente para un polinucleótido de tamaño definido pueden ser adaptada por un experto en la técnica para oligonucleotidos más grandes o más cortos, de acuerdo con los procedimientos descritos en Sambrook, et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 3a edición, 2001) .
La invención también se relaciona con un vector que comprende un ácido nucleico como se describe en la invención.
La invención está dirigida especialmente a la clonación y/o expresión de vectores que contienen esa secuencia de ácido nucleótidos.
Los vectores de la invención preferiblemente contienen elementos los cuales permiten la expresión y/o la secreción de secuencias nucleotidicas en una célula anfitriona dada. El vector debe contener de este modo un promotor, señales de inicio y terminación de la traducción, asi como regiones de regulación de la transcripción adecuadas. Deben ser mantenidas en una forma estable en la célula anfitriona y opcionalmente, pueden tener señales especificas que especifiquen la secreción de la proteina traducida. Esos diferentes elementos son seleccionados y optimizados por un experto en la técnica de acuerdo con la célula anfitriona usada. Para este propósito, las secuencias nucleotidicas pueden ser insertadas en vectores autorreplicantes dentro del anfitrión elegido o ser vectores que se integren en el anfitrión elegido.
Esos vectores son preparados por métodos típicamente usados por un experto en la técnica y los clones resultantes pueden ser introducidos en un anfitrión adecuado por métodos estándar, como lipofección, electroporación, choque térmico o métodos químicos.
Los vectores son, por ejemplo, vectores de origen plasmídico o viral. Ellos son usados para transformar células anfitrionas para clonar o expresar las secuencias nucleotídicas de la invención.
La invención también comprende células anfitrionas aisladas transformadas por o que comprenden un vector como se describe en la presente invención.
La célula anfitriona puede ser seleccionada entre sistemas procarióticos o eucarióticos , como células bacterianas, por ejemplo, también células de levaduras o células animales, especialmente células de mamífero (con la excepción del humano) . También pueden ser usadas células de insectos o plantas.
La invención también se relaciona con animales, además del humano, que tienen una célula transformada de acuerdo con la invención.
Otro aspecto de la invención se relaciona con un método para la producción de una proteína de unión de antígeno de acuerdo con la invención, o un fragmento de unión de antígeno de la misma, caracterizado porque el método comprende las siguientes etapas: a) el cultivo en un medio con las condiciones de cultivo adecuadas para una célula anfitriona de acuerdo con la invención; y b) la recuperación de la proteína de unión de antígeno, o uno de sus fragmentos de unión de antígeno, así producido del medio de cultivo o a partir de las células cultivadas .
Las células transformadas de acuerdo con la invención son de uso en métodos para la preparación de proteínas de unión de antígeno recombinantes de acuerdo con la invención. Los métodos para la preparación de las proteínas de unión de antígeno de acuerdo con la invención en forma recombinante, caracterizados porque los métodos usan un vector y/o una célula transformada por un vector de acuerdo con la invención, también están comprendidos en la presente invención. Preferiblemente, una célula transformada por un vector de acuerdo con la invención es cultivada bajo condiciones que permiten la expresión de la proteína de unión de antígeno anteriormente mencionado y la recuperación de la proteína recombinante.
Como ya se mencionó, la célula anfitriona puede ser seleccionada entre sistemas procarióticos o eucarióticos . En particular, es posible identificar las secuencias nucleotidicas de la invención que facilitan la secreción ese sistema procariótico o eucariótico. Un vector de acuerdo con la invención que contenga esa secuencia puede de este modo ser usado de manera ventajosa para la producción de las proteínas recombinantes a ser secretadas. En realidad, la purificación de esas proteínas recombinantes de interés será facilitada por el hecho de que están presentes en el sobrenadante del cultivo celular más que dentro de las células anfitrionas.
La proteína de unión de antígeno de la invención también puede ser preparada por síntesis química. Uno de esos métodos de preparación también es un objeto de la invención. Una experto en la técnica conoce los métodos de síntesis química, como las técnicas en fase sólida (véase especialmente Steward et al., 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd ed., pp 71-95) o técnicas en fase sólida parcial, por condensación de fragmentos o por síntesis convencional en solución. Los polipéptidos obtenidos por síntesis química, y capaces de contener aminoácidos no naturales correspondientes también están comprendidos en la invención.
La proteína de unión de antígeno, o los fragmentos de unión de antígeno de la misma, que probablemente sean obtenidos por el método de la invención también están comprendidos dentro de la presente invención.
De acuerdo con un aspecto particular, la invención se relaciona con una proteina de unión de antigeno, o un fragmento de unión de antigeno de la misma, como se describió anteriormente para usarse como un producto dirigido para liberar un agente citotóxico en el sitio blanco anfitrión, consistiendo el sitio blanco del anfitrión de un epitope localizado en el dominio extracelular de la proteina Axl, preferiblemente el dominio extracelular de la proteina humana Axl, de manera más preferible, el dominio extracelular de la proteina humana Axl que tiene la secuencia SEQ ID NO. 31 o 32, o la secuencia variante natural de la misma.
En una modalidad preferida, el sitio blanco del anfitrión es el sitio blanco de una célula de mamífero, de manera más preferible de una célula humana, de manera más preferible células las cuales expresan de manera natural o por medio de recombinación genética, la proteína Axl.
La invención se relaciona con un inmunoconjugado que comprende la proteína de unión de antígeno como se describe en la presente especificación conjugada a un agente citotóxico .
En el sentido de la presente invención, la expresión "inmunoconj ugado" o "inmuno-conjugado" se refiere generalmente a un compuesto que comprende al menos un producto de dirigido ligado físicamente con uno o más agentes terapéuticos, creando de este modo un compuesto altamente dirigido o selectivo.
En una modalidad preferida, esos agentes terapéuticos consisten de agentes citotóxicos.
"Agente citotóxico" o "citotóxico", pretende ser un agente el cual, cuando es administrado a un sujeto, trata o evita el desarrollo de la proliferación celular, preferiblemente el desarrollo del cáncer en el cuerpo del sujeto, inhibiendo o previniendo la función celular y/o causando muerte celular.
Muchos agentes citotóxicos han sido aislados o sintetizados y hacen posible inhibir la proliferación celular, o destruir o reducir, si no es que definitivamente, al menos significativamente las células tumorales. Sin embargo, la actividad citotóxica de estos agentes no se limita a las células tumorales, y las células no tumorales también son efectuadas y pueden ser destruidas. De manera más particular, los efectos laterales son observados sobre células que se renuevan rápidamente, como las células hematopoyéticas o células del epitelio, en particular de las membranas mucosas. A manera de ilustración, las células del tracto gastrointestinal son efectuadas en gran medida por el uso de esos agentes citotóxicos.
Uno de los propósitos de la invención es también poder proporcionar un agente citotóxico que haga posible limitar los efectos laterales sobre células normales y al mismo tiempo conservar una citotoxicidad alta sobre las células tumorales.
De manera más particular, el agente citotóxico puede consistir preferiblemente de, sin limitación, un fármaco (es decir, "conjugado de anticuerpo-fármaco") , una toxina (es decir, "inmunotoxina" o "conjugado de anticuerpo-toxina") , un radioisótopo (es decir, "radioinmunoconj ugado" o "conjugado de anticuerpo-radioisótopo"), etc.
En una primera modalidad preferida de la invención, el inmunocon ugado consiste de una proteina de unión ligada a al menos un fármaco o un medicamento. Ese un inmunoconj ugado es referido como un conjugado anticuerpo-fármaco (o "ADC") cuando la proteina de unión es un anticuerpo, o un fragmento de unión de antigeno del mismo.
En una primera modalidad, esos fármacos pueden ser descritos sin importar su modo de acción. Como ejemplo no limitante, pueden mencionarse agentes alquilantes como la mostaza nitrogenada, alquilsulfonatos , nitrosourea, oxazoforinas , aciridinas o iminetilenos , antimetabolitos, antibióticos antitumorales , inhibidores mitóticos, inhibidores de la función de la cromatina, agentes antiangiogénesis, antiestrógenos, antiandrógenos, agentes quelantes, estimulantes de la absorción de hierro, inhibidores de ciclooxigenasa, inhibidores de fosfodiesterasa, inhibidores de ADN, inhibidores de la síntesis de ADN, estimulantes de la apoptosis, inhibidores de timidilato, inhibidores de células T, agonistas de interferón, inhibidores de la ribonucleósido trifosfato reductasa, inhibidores de aromatasa, antagonistas del receptor de estrógeno, inhibidores de tirosina quinasa, inhibidores del ciclo celular, taxano, inhibidores de tubulina, inhibidores de la angiogénesis, estimulantes de los macrófagos, antagonistas del receptor de neuroquinina, agonistas del receptor de cannabinoide, agonistas del receptor de dopamina, agonistas del factor de estimulante de los granulocitos, agonistas del receptor de eritropoyetina, agonistas del receptor de somatostatina, agonistas de LHRH, sensibilizadores del calcio, antagonistas del receptor de VEGF, antagonistas del receptor de interleucina, inhibidores de los osteoclastos, estimulantes de la formación de radicales, antagonistas del receptor de endotelina, alcaloides de Vinca, antihormonas o inmunomoduladores o cualquier otro fármaco novedoso que satisfaga los criterios de actividad de un citotóxico o una toxina.
Esos fármacos son, por ejemplo, citados en el VIDAL 2010, en la página dedicada a los compuestos unidos a los "citotóxicos" de la columna de cancerología y hematología, esos compuestos citotóxicos citados con referencia a estos documentos son citados aquí como agentes citotóxicos preferidos .
De manera más particular, sin limitación, los siguientes fármacos son preferidos de acuerdo con la invención: mecloretamina, clorambucol, melfalen, clorhidrato, pipobromen, prednimustina, fosfato disódico, estramustina, ciclofosfamida, altretamina, trofosfamida, sulfofosfamida, ifosfamida, tiotepa, trietilenamina, altetramina, carmustina, estreptozocina, fotemustina, lomustina, busulfan, treosulfan, improsulfan, dacarbacina, cis-platino, oxaliplatino, lobaplatino, heptaplatino, miriplatino hidratado, carboplatino, metotrexato, pemetrexed, 5-fluorouracilo, floxuridina, 5-fluorodesoxiuridina, capecitabina, citarabina, fludarabina, arabinósido de citosina, 6-mercaptopurina (6-MP) , nelarabina, ß-tioguanina (6-TG), clorodesoxiadenosina, 5-azacitidina, gemcitabina, cladribina, desoxicoformicina, tegafur, pentostatina, doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, valrubicina, mitoxantrona, dactinomicina, mitramicina, plicamicina, mitomicina C, bleomicina, procarbacina, paclitaxel, docetaxel, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorrelbina, topotecan, irinotecan, etopósido, valrubicina, clorhidrato de amrubicina, pirarubicina, acetato de eliptinio, zorubicina, epirubicina, idarubicina y tenipósido, razoxina, marimastato, batimastato, prinomastato, tanomastato, ilomastato, CGS-27023A, halofuginona, COL-3, neovastato talidomida, CDC 501, DMXAA, L-651582, escualamina, endostatina, SU5416, SU6668, interferón-alfa, EMD121974, interleucina-12, IM862, angiostatina, tamoxifén, toremifén, raloxifén, droloxifén, yodoxifén, anastrozol, letrozol, exemestano, flutamída, nilutamida, esprironolactona, acetato de ciproterona, finasterida, cimitidina, bortezomib, Velcade, bicalutamida, ciproterona, flutamida, fulvestran, exemestan, dasatinib, erlotinib, gefitinib, imatinib, lapatinib, nilotinib, sorafenib, sunitinib, retinoide, rexinoide, metoxaleno, metilaminolevulinato, aldesleucina, OCT-43, denileucina diflitox, interleucina 2, tasonermina, lentinan, sizofilan, roquinimex, pidotimod, pegademasa, timopentina, poli I:C, procodazol, Tic BCG, Corynebacterium parvum, NOV-002, ucraina, levamisol, 1311-chTNT, H-101, celmoleucina, interferón alfa2a, interferón alfa2b, interferón gammala, interleucina-2 , mobenaquina, Rexin-G, teceleucina, aclarubicina, actinomicina, arglabina, asparaginasa, carcinofilina, cromomicina, daunomicina, leucovorina, masoprocol, neocarcinostatina, peplomicina, sarcomicina, solamargina, trabectedina, estreptozocina, testosterona, cunecatequinas , sinecatequinas, alitretinoin, clorhidrato de belotecan, calusterona, dromostanolona, acetato de eliptinio, etinilestradiol, etopósido, fluoximesterona, formestano, fosfetrol, acetato de goserelina, aminolevulinato de hexilo, histrelina, hidroxiprogesterona, ixabepilona, leuprolida, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megesterol, metilprednisolona, metiltestosterona, miltefosina, mitobronitol, fenilpropionato de nadrolona, acetato de noretindrona, prednisolona, prednisona, temsirrolimus, testolactona, triamconolona, triptorelina, acetato de vapreotida, estimalámero de cinostatina, amsacrina, trióxido de arsénico, clorhidrato de bisantreno, clorambucilo, clortrianiseno, cis-diamin dicloro platino, ciclofosfamida, dietilestilbestrol , hexametilmelamina, hidroxiurea, lenalidomida, lonidamina, mecloretanamina, mitotano, nedaplatino, clorhidrato de nimustina, pamidronato, pipobromano, porfimero sódico, ranimustina razoxano semustina, sobuzoxano, mesilato, trietilenmelamina, ácido zoledrónico, mesilato de camostat, fadrozol HC1, nafoxidina, aminoglutetimida, carmofur, clofarabina, arabinósido de citosina, decitabine, doxifluridina, enocitabina, fosfato de fludarabeno, fluorouracilo, ftorafur, mostaza de uracilo, abarelix, bexaroteno, raltiterxed, tamibaroteno, temozolomida, vorinostat, megastrol, clodronato disódico, levamisol, ferumoxitol, isomaltósido de hierro, celecoxib, ibudilast, bendamustina, altretamina, mitolactol, temsirolimus , pralatrexato, TS-1, decitabina, bicalutamida, flutamida, letrozol, clodronato disódico, degarelix, citrato de toremifén, diclorhidrato de histamina, D -166HC, nitracrina, decitabina, clorhidrato de irinotecano, amsacrina, romidepsina, tretinoína, cabazitaxel, vandetanib, lenalidomida, ácido ibandrónico, miltefosina, vitespen, mifamurtida, nadroparina, granisetrona, ondansetrona, tropisentrona, alizaprida, ramosetrona, mesilato de dolasetrona, dimeglumina de fosaprepitan, nabilona, aprepitant, dronabinol, TY-10721, maleato ácido de lisurida, epiceram, defibrotida, etexilato de dabigatrán, filgrastim, pegfilgrastim, reditux, epoetina, molgramostim, oprelvequina, sipuleucel-T, M-Vax, acetil L-carnitina, clorhidrato de donepecil, ácido 5-aminolevulinico, aminolevulinato de metilo, acetato de cetrorelix, icodextrina, leuprorelina, metilfenidato, octreotida, amlexanox, plerixafor, menatetrenona, ditioletiona de anetol, doxercalciferol, clorhidrato de cinacalcet, alefacept, romiplostim, timoglobulina, timalfasina, ubenimex, imiquimod, everolimus, sirolimus, H-101, lasofoxifén, trilostano, incadronato, gangliósidos, pegaptanib octasódico, vertoporfina, ácido minodrónico, ácido zoledrónico, nitrato de galio, alendronato sódico, etidronato disódico, pamidronato disódico, dutasterida, estibogluconato sódico, armodafinilo, dexrazoxano, amifostina, WF-10, temoporfina, darbepoetina alfa, ancestim, sargramostim, palifermin, R-744, nepidermina, oprelvequina, denileucina, diftitox, crisantaspasa, buserelina, deslorelina, lanreótida, octreotida, pilocarpina, bosentano, caliqueamicina, mitansinoides y ciclonicato.
Para más detalle, el experto en la técnica podría referirse al manual editado por la "Association Frangaise des Enseignants de Chimie Thérapeutique" y titulado "traité de chimie thérapeutique, vol. 6, Medicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers, edition TEC & DOC, 2003".
En una segunda modalidad preferida de la invención, el inmunoconj ugado consiste de una proteína de unión ligada a al menos un radioisótopo. Ese semiconj ugado es referido como un conjugado de anticuerpo-radioisótopo (o "ARC") cuando la proteína de unión es un anticuerpo, o un fragmento de unión de antígeno del mismo.
Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Una variedad de isótopos radioactivos están disponibles para la producción de ARC como, sin limitación, At211, C13, N15, O17, Fl19, I123, I131, I125, in111, Y90, Re186, Re188, Sm153, Tc"m, Bi212, ,32 Pb 212 isótopos radiactivos de Lu, gadolinio, manganeso o hierro , Cualquier método o proceso conocido por el experto en la técnica se puede usar para incorporar esos radioisótopos (véase, por ejemplo, Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" , Chatal, CRC Press 1989) . Como un ejemplo no limitante, el Tc"m o I123, Re186, Re188 e In111 pueden ser unidos vía un residuo de cisterna. Y90 puede ser unido vía un residuo de lisina. El I123 puede ser unido usando el método IODOGEN (Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57).
Pueden ser mencionados varios ejemplos para ilustrar el conocimiento de un experto en la técnica el campo de ARC como el Zevalin®, el cual es una ARC compuesto del anticuerpo monoclonal anti-CD20 y radioisótopos In11 o Y90 unidos por un quelante enlazante de tiourea (Wiseman et al. (2000) Eur. Jour. Nucí. Med. 27(7): 766-77; Wiseman et al. (2002) Blood 99 ( 12 ): 4336-42 ; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20 (10) :2453-63; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20 ( 15) : 3262-69) ; o Mylotarg® el cual está compuesto de un anticuerpo anti-CD33 logado a caliqueamicina, (US 4,970,198; 5,079,233; 5,585,089; 5,606,040; 5,693,762; 5,739,116; 5,767,285; 5,773,001). Más reciente, también puede ser mencionado el ADC conocido como Adcetris (correspondiente al Brentuximab vedotin) el cual ha sido recientemente aceptado por la FDA el el tratamiento de linfoma de Hodgkin (Nature, vol. 476, pp380-381, 25 Agosto 2011) .
En una tercera modalidad preferida de la invención, el inmunoconjugado consiste de una proteina de unión ligada a al menos una toxina. Ese inmunoconj ugado es conocido como conjugado anticuerpo-toxina (o "ATC") cuando la proteina de unión es un anticuerpo, o un fragmento de unión de antigeno del mismo.
Las toxinas son venenos efectivos específicos producidos por organismos vivientes. Ellos usualmente, consisten de una cadena de aminoácidos la cual puede variar en peso molecular entre un par de cientos (péptidos) y miles de cientos (proteínas) . Ellos también pueden ser compuestos orgánicos de bajo peso molecular. Las toxinas son producidas por numerosos organismos, por ejemplo, bacterias, hongos, algas y plantas. Muchos de ellos son extremadamente venenosos, con una toxicidad que es varias veces del orden de magnitud mayor a los agentes nerviosos.
Las toxinas usadas en ATC pueden incluir, sin limitación, todos los tipos de toxinas que puedan ejercer sus efectos citotóxicos por mecanismos que incluyen la unión de tubulina, unión de ADN, o inhibición de topoisomerasa .
Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden ser usadas incluyen la cadena de la difteria A, fragmentos activos no unidos de toxina de la difteria, cadena de la exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricina A, de abrina A, cadena de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, la gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos .
Las toxinas de molécula pequeña, como las dolastatinas, auristatinas, un tricoteceno y CC-1065, y los derivados de esas toxinas que tienen actividad de toxina, también están contempladas aqui . Las dolastatinas y auristatinas ha mostrado interferir con la dinámica de los microtúbulos, hidrólisis de GTP, y división nuclear y celular y tienen actividad anticáncer y antimicótica .
"Enlazante", "Unidad Enlazante", o "enlace" significa una porción química que comprende un enlace covalente o una cadena de átomos que une covalentemente una proteina de unión a al menos un agente citotóxico.
Los enlazantes pueden ser producidos usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteina bifuncionales como propionato de N-succinimidil-3- ( 2-piridilditio) (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) , iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como el dimetil adipimidato HC1) , ésteres activos (como el suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (como el glutaraldehido) , compuestos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (como bis-(p-diazoniobenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (como 2,6-diisocianato de tolueno) , y compuestos de flúor bis-activos (como 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenceno) . El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminopentaacético (MX- DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación de agente citotóxicos al sistema dirigido. Otros reactivos enlazantes cruzados pueden ser BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-S CC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS , sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil- (4-vinilsulfon) enzoato) los cuales se encuentran comercialmente disponibles (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, 111., U.S. A).
El enlazante puede ser uno "no escindible o escindible" En una modalidad preferida, este consiste de un "enlazante escindible" que facilita la liberación del agente citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede ser usado un enlazante lábil ácido, enlazante sensible a peptidasa, enlazante fotolabil, enlazante de dimetilo o enlazante que contenga disulfuro. El enlazante es, en una modalidad preferida, escindible bajo condiciones intracelulares, de modo que la escisión del enlazante, libere el agente citotóxico de la proteina de unión en el ambiente intracelular .
Por ejemplo, en algunas modalidades, el enlazante es escindible por un agente de escisión que esté presente en el ambiente intracelular (por ejemplo, dentro de un lisosoma o endosoma o caveolea) . El enlazante puede ser, por ejemplo, un enlazante de peptidilo que sea escindido por una enzima peptidasa o proteasa intracelular, incluyendo pero sin limitarse a, una proteasa lisosomal endosomal. Típicamente, el enlazante de peptidilo es de al menos dos aminoácidos de longitud o al menos tres aminoácidos de longitud. Los agentes de escisión pueden incluir catepsinas B y D y plasmina, todos los cuales se sabe hidrolizan derivados de fármacos peptídicos dando como resultado la activación del fármaco dentro de las células blanco. Por ejemplo, un enlazante de peptidilo que es escindible por la proteasa dependiente tiol catepsina B, la cual está altamente expresada en tejido canceroso, de ser usado (por ejemplo, un enlazante de Phe-Leu o Gly-Phe-Leu-Gly} . En modalidades específicas, el enlazante de peptidilo escindible por una proteasa intracelular es un enlazante de Val-Cit o un enlazante de Phe-Lys. Una ventaja de usar la liberación proteolítica intracelular del agente citotóxico es que el agente es atenuado típicamente cuando está conjugado y las estabilidades en suero de los conjugados son típicamente altas.
En otras modalidades, el enlazante escindible es sensible al pH, es decir, sensible a la hidrólisis a ciertos valores de pH. Típicamente, el enlazante sensible al pH es hidrolizable bajo condiciones ácidas. Por ejemplo, puede ser usado un enlazante lábil ácido en el lisosoma (por ejemplo, una hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, cis-amida aconitica, ortoéster, acetal, cetal o similares). Esos enlazantes son relativamente estables bajo condiciones de pH neutro, como aquellas en la sangre, pero son inestables a pH inferior a 5.5 o 5.0, el pH aproximado del lisosoma. En ciertas modalidades, el enlazante hidrolizable es un enlazante de tioéter (como, por ejemplo, un tioéter unido al agente terapéutico vía un enlace de acilhidrazona.
En otras modalidades más, el enlazante es escindible bajo condiciones reductoras (por ejemplo, un enlace disulfuro) . Una variedad de enlazantes de disulfuro es conocida en la técnica, incluyendo, por ejemplo, aquellos que pueden ser formados usando SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato) , SPDP (N-succinimidil-3- ( 2-piridilditio) propionato) , SPDB (N-succinimidil-3- ( 2-piridilditio) butirato) y SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa- (2-piridil-ditio) tolueno) -, SPDB y SMPT.
Como un ejemplo no limitante de enlazantes no escindibles o "no reducibles" puede ser mencionado el inmunoconjugado Trastuzumab-DM 1 (TDM 1) el cual combina trastuzumab con un agente quimioterapéutico enlazado maitansina (Cáncer Research 2008; 68: (22). 15 de Noviembre de 2008) .
En una modalidad preferida, el inmunoconjugado de la invención puede ser preparado por cualquier método conocido por el experto en la técnica como, sin limitación, i) reacción de un grupo nucleofílico de la proteína de unión de antígeno con un reactivo enlazante bivalente seguido por la reacción con un agente citotóxico ó ii) reacción de un grupo nucleofílico de un agente citotóxico con un reactivo enlazante bivalente seguido por reacción con el grupo nucleofílico de la proteína de unión de antígeno.
Los grupos nucleofílieos sobre la proteína de unión de antígeno incluyen, sin limitación, grupos amina N-terminales, grupos amina de la cadena lateral, por ejemplo lisina, grupos tiol de la cadena lateral, y grupos hidroxilo o amino de azúcar cuando la proteína de unión de antígeno esté glicosilada. Los grupos amina, tiol e hidroxilo son nucleofílieos y capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofílicos sobre los fines enlazantes y reactivos enlazantes, incluyendo, sin limitación ésteres activos como ásteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformatos, y haluros de ácido; haluros de alquilo y bencilo como las haloacetamidas ; aldehidos, cetonas, grupos carboxilo y maleimida. La proteína de unión de antígeno puede tener disulfuros intercadena reducibles, es decir fuentes de cisteína. Las proteínas de unión de antígeno pueden ser reactivas para la conjugación con reactivos enlazantes por tratamiento con un agente reductor como DTT (ditiotreitol) . Cada fuente de cisteína forma de este modo, teóricamente, dos nucleófilos de tiol reactivos. Pueden ser introducidos grupos nucleofilicos adicionales a la proteína de unión de antígeno a través de cualquier reacción conocida por el experto en la técnica. Como un ejemplo no limitante, los grupos tiol reactivos pueden ser introducidos en la proteína de unión de antígeno introduciendo uno o más residuos de cisteína.
Los inmunoconjugados también pueden ser producidos mediante la modificación de la proteína de unión de antígeno para introducir porciones electrofílicas , las cuales pueden reaccionar con sustituyentes nucleofilicos sobre el reactivo enlazante o agente citotóxico. Los azúcares de la proteína de unión de antígeno gliscosilada pueden ser oxidados para formar grupos aldehido o cetona los cuales pueden reaccionar con el grupo amina del reactivo enlazante o agente citotóxico. Los grupos de base de Schiff de amina resultantes pueden formar un enlace estable, o pueden ser reducidos para formar enlaces de amina estables. En una modalidad, la reacción de la porción de carbohidrato de una proteína de unión de antígeno glicosilada con galactosa oxidasa o metaperyodato de sodio puede producir grupos carbonilo (aldehido y cetona) en la proteína que pueden reaccionar con grupos apropiados sobre el fármaco. En otra modalidad, las proteínas que contienen residuos de serina o treonina N-terminales pueden reaccionar con metaperyodato de sodio, dando como resultado la producción de un aldehido en lugar del primer aminoácido.
En ciertas modalidades preferidas, la unidad enlazante puede tener la siguiente fórmula general: —Ta--Ww—Yy- donde : -T- es una unidad extensora; a es 0 o 1; -W- es una unidad de aminoácido; w es independientemente un número entero que va de 1 a 12; -Y- es una unidad separadora; y es 0 , 1 o 2.
La unidad extensora (-T-) , cuando está presente, enlaza la proteina de unión de antigeno a una unidad de aminoácido (-W-) . Los grupos funcionales útiles que pueden estar presentes sobre la proteina de unión de antigeno, ya sea de manera natural o via manipulación química, incluyen al grupo sulfhidrilo, amino, hidroxilo, hidroxilo anomérico de un carbohidrato, y carboxilo. Los grupos funcionales adecuados son sulfhidrilo y amino. Los grupos sulfhidrilo pueden ser generados por reducción de los enlaces disulfuro intramoleculares de la proteína de unión de antígeno, si están presentes. De manera alternativa, los grupos sulhidrilo pueden ser generados por la reacción de un grupo amino de una porción de lisina de la proteína de unión de antígeno con 2-iminotiolano u otros reactivos generadores de sulfhidrilo. En modalidades específicas, la proteína de unión de antígeno es un anticuerpo recombinante que es modificado para ser o soportar una o más Usinas. De manera más preferible la proteína de unión de antígeno puede ser modificada para soportar o contener una o más cisteínas (véase ThiMabs) .
En ciertas modalidades específicas, la unidad extensora forma un enlace con un átomo de azufre de la proteína de unión de antígeno. El átomo de azufre puede ser derivado de un grupo sulfhidrilo (-SH) de una proteína de unión de antígeno reducida.
En otras modalidades específicas, la unidad extensora se liga a la proteína de unión de antígeno vía un enlace disulfuro entre un átomo de azufre de la proteína de unión de antígeno y un átomo de azufre de la unidad extensora .
En otras modalidades específicas, el grupo reactivo del extensor contiene un sitio reactivo que puede reaccionar con un grupo amino de la proteína de unión de antígeno. El grupo amino puede ser el de una arginina o una lisina. Los sitios reactivos con amina adecuados incluyen, pero no se limitan a, ásteres activados como los ásteres de succinimida, 4-nitrofenilésteres , pentafluorofenilésteres , anhídridos, cloruros de ácido, cloruros de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos .
En otro aspecto más, la función reactiva del extensor contiene un sitio reactivo que reacciona con un grupo carbohidrato modificado que puede estar presente sobre la proteina de unión de antigeno. En una modalidad específica, la proteína de unión de antígeno es glicosilada enzimáticamente para proporcionar una porción de carbohidrato (debe notarse que, cuando la proteína de unión de antígeno sea un anticuerpo, el anticuerpo está generalmente glicosilado de manera natural) . El carbohidrato puede ser moderadamente oxidado con un reactivo como peryodato de sodio y la unidad de carbonilo resultante del carbohidrato oxidado puede ser condensada con un extensor que contenga como funcionalidad una hidrazida, una oxima, una amina reactiva, una hidrazina, una tiosemicarbazida, un carboxilato de hidrazina, o una arilhidrazida .
La unidad de aminoácido (-W-) enlaza la unidad extensora (-T-) a la unidad separadora (-Y-) y la unidad separadora está presente, y enlaza la unidad extensora al agente citotoxico si la unidad separadora está ausente.
Como se mencionó anteriormente, -Ww- puede ser una unidad dipeptídica, tripeptídica, tetrapeptídica, pentapeptídica, hexapeptídica, heptapeptídica, octapeptídica, nonapeptídica, decapeptídica, undecapeptídica o dodecapeptídica .
En algunas modalidades, la unidad de aminoácido puede comprender aminoácidos residuales como, sin limitación, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano, prolina, lisina protegida con acetilo o formilo, arginina, arginina protegida con tosilo o grupos nitro, histidina, ornitina, ornitina protegida con acetilo o formilo y citrulina. Los componentes del enlazante de aminoácido ejemplares incluyen preferiblemente un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido o un pentapéptido .
Los dipéptidos incluyen: Val-Cit, Ala-Val, Lys-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, Ala-Phe, Phe-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-N9-tosil-Arg, Phe-N9-Nitro-Arg .
Los tripéptidos ejemplares incluyen: Val-Ala-Val, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Phe-Phe-Lys, Gly-Gly-Gly, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys.
Los tetrapéptidos ejemplares incluyen: Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO. 33), Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO. 34).
El pentapéptido ejemplar incluye: Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO. 35) .
Los aminoácidos residuales que comprenden un componente de enlazante de aminoácido incluyen aquellos que se encuentran de manera natural, asi como aminoácidos menores y análogos de aminoácidos no naturales, como la citrulina. Los componentes del enlazante de aminoácido pueden ser diseñados y optimizados en su selectividad para la escisión enzimática por una enzima particular, por ejemplo, una proteasa asociada con el tumor catepsina B, C y D, o una plasminproteasa.
La unidad de aminoácido del enlazante puede ser escindida enzimáticamente por una enzima incluyendo, pero sin limitarse a, una proteasa asociada con el tumor para liberar el agente citotóxico.
La unidad de aminoácido puede ser diseñada y optimizada en su selectividad para escisión enzimática para una proteasa asociada con el tumor particular. Las unidades adecuadas son aquellas cuya escisión es catalizada por las proteasas, catepsina B, C y D, y plasmina.
La unidad separadora (-Y-) , cuando está presente, enlaza una unidad de aminoácido al agente citotóxico. Las unidades separadoras son de dos tipos generales: autoinmolantes y no autoinmolantes . Una unidad separadora autoinmolante es una en la cual parte de o toda la unidad separadora permanece unida al agente citotóxico después de la escisión enzimática de una unidad de aminoácido del inmunoconj ugado . Los ejemplos de una unidad separadora no autoinmolable incluyen, pero no se limitan a una unidad separadora (glicina-glicina) y una unidad separadora de glicina. Para liberar el agente citotóxico, deberá tomar lugar una reacción de hidrólisis independiente dentro de la célula blanco para escindir el enlace de la unidad glicina de fármaco .
En otra modalidad, una unidad separadora no autoinmolante (-Y-) es -Gly-. En una modalidad, el inmunoconjugado carece de una unidad separadora (y=0) .
De manera alternativa, un inmunoconj ugado que contiene una unidad separadora autoinmolante puede liberar el agente citotóxico sin la necesidad de un paso de hidrólisis separado. En esas modalidades -Y- es una unidad de alcohol p-aminobencilo (PAB) que está enlazada a - w- via el átomo de nitrógeno del grupo PAB, y conectada directamente a -D via un carbonato, carmabato o grupo éter.
Otros ejemplos de separadores autoinmolantes incluyen, pero sin limitarse a, compuestos aromáticos que son electrónicamente equivalentes al grupo PAB como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol y orto o para-aminobencilacetales . Los separadores pueden ser usados de modo que experimenten una ciclización fácil después de la hidrólisis de enlace amida, como amidas de ácido 4-aminobutirico sustituidas y no sustituidas, sistemas anulares biciclo [2.2.1] y biciclo [2.2.2 ] apropiadamente sustituidos y amidas de ácido 2-aminofenilpropiónico .
En una modalidad alternativa, la unidad separadora es una unidad de bis ( hidroximetil ) estireno (BH S) ramificada, la cual puede ser usada para incorporar agentes citotóxicos adicionales .
Finalmente, la invención se relaciona con un inmunoconjugado como se describió anteriormente para usarse en el tratamiento del cáncer.
Los cánceres pueden ser preferiblemente seleccionados a través de cánceres relacionados con Axl incluyendo células tumorales que expresen o sobreexperesen toda o parte de la proteína Axl en su superficie.
De manera más particular, los cánceres son cánceres de mama, colon, carcinoma esofágico, hepatocelular, gástrico, glioma, de pulmón, melanoma, osteosarcoma, de ovario, de próstata, rabdomiosarcoma, renal, tiroideo, cáncer uterino endometrial y cualquier fenómeno resistente al fármaco. Otro objetivo de la invención es una composición farmacéutica que comprende el inmunoconj ugado como se describe en la especificación .
De manera más particular, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende el inmunoconjugado de la invención con al menos un excipiente y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En la presente descripción, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "excipiente" pretende indicar un compuesto o combinación de compuestos que entran en una composición farmacéutica sin provocar reacciones secundarias y que permite, por ejemplo, la facilitación de la administración de los compuestos activos, un incremento en su vida útil y/o en su eficacia en el cuerpo, un incremento de su solubilidad en solución o también una mejora en su conservación. Esos vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos y serán adaptados por el experto en la técnica en función de la naturaleza y del modo de administración de los compuestos activos elegidos.
Preferiblemente, esos inmunoconj ugados serán administrados por la ruta sistémica, en particular la ruta intravenosa, por la ruta intramuscular, intradérmica, intraperitoneal o subcutánea, o por la ruta oral. En una forma más preferida, la composición que comprende los inmunoconjugados de acuerdo con la invención será administrada varias veces, en una forma secuencial.
Sus modos de administración, dosis y formas farmacéuticas óptimas pueden ser determinadas de acuerdo con los criterios generalmente considerados en el establecimiento de un tratamiento adaptado para un paciente como, por ejemplo, la edad o el peso corporal del paciente, la seriedad de su condición general, la tolerancia al tratamiento y los efectos secundarios notados.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Otras características y ventajas de la invención aparecerán en la continuación de la descripción con los ejemplos y las figuras cuyas leyendas son representadas a continuación .
Figura 1: ensayo de citotoxicidad in vitro usando anticuerpo secundario conjugado Mab-zap con células SN12C.
Figuras 2A, 2B y 2C: Especificidad de unión de 1613F12 sobre la proteina rhAxl-Fc inmovilizada (2A) , proteínas rhDtk-Fc (2B) o rhMer-Fc (2C) por ELISA.
Figura 3: Análisis FACS de la unión de 1613F12 sobre células tumorales humanas.
Figura 4: ELISA sobre la proteína rmAxl-Fc inmovilizada ("rm" para recombinante murino) .
Figura 5: unión de 1613F12 sobre células COS7 de acuerdo a lo determinado por el protocolo de marcación indirecta usando el método de citometría de flujo.
Figura 6: ELISA competitivo de la unión de Gasl6 usando 1613F12.
Figura 7: análisis del epítope por Western Blot usando lisado de células SN12C. NH (sin calor); NR (sin reducción) ; H (calor) ; R (reducción) . La detección de GAPDH atestigua la carga de muestra correcta sobre el gel.
Figuras 8A y 8B: Estudio de la desregulación de Axl después de la unión de 1613F12 sobre células SN12C por Western Blot con la imagen de western blot de la Figura 8 es representativa de 3 experimentos independientes efectuados (el análisis western blot fue efectuado después de una incubación de 4 h y 24 h de 1613F12 sobre células SN12C) ; y Figura 8B-cuantificación de la densidad óptica de la película presentada usando el software "QuantityOne" .
Figuras 9A, 9B y 9C : microscopía de inmunofluorescencia de células SN12C después de la incubación con 1613F12. Figura 9A - fotografías de las condiciones de control del isotipo mlgGl para ambas tinciones de membrana e intracelular . La Figura 9B - tinción de membrana. Figura 9C -tinción intracelular de ambos del receptor de Axl usando el 1613F12 y del marcador de endosoma inicial EEA1. Las imágenes superpuestas son presentadas a continuación y la localización visualizada es representada por las flechas.
Figura 10: Efecto de 1613F12 sobre la proliferación de células SN12C in vitro en comparación con el efecto del anticuerpo de control de isotipo mlgGl.
Figuras 11A-11K: ensayos de citotoxicidad directa del inmunoconj ugado del 1613F12-saporina usando varias líneas de células tumorales humanas. A-SN12C, B-Calu-1, C-A172, D-A431, E-DU145, F-MDA-MB435 S, G-MDA-MB231, H-PC3 , I-NCI-H226, J-NCI-H125, K-Pancl.
Figura 12: experimentos de ELISA que estudian la unión sobre la proteína rhAxl-Fc de ambos anticuerpos ml613F12 y hzl613F12.
Figura 13: Comparación de unión de los anticuerpos 1613F12 murinos, quiméricos y humanizados sobre células SN12C.
Figura 14: Ensayo de citotoxicidad directa en presencia de inmunoconjugados de 1613F12-saporina de ratón y humanizado y de los controles de isotipo usando la linea celular de tumor renal humano SN12C.
Figura 15: ensayo de citotoxicidad directa en presencia de inmunoconj ugados de 1613F12-saporina de ratón y humanizado y de los controles de isotipo usando la linea celular de carcinoma de pulmón humano Calu-1.
EJEMPLOS En los siguientes ejemplos, las expresiones del anticuerpo 1613F12 o ml613F12 se refieren a una forma murina del anticuerpo 1613F12. Las formas humanizadas del anticuerpo 1613F12 son nombradas hzl613F12.
De la misma manera, el anticuerpo de control de isotipo usado consiste de una IgGl murina conocida como 9G4. Esto significa que, en los siguientes ejemplos, las expresiones control de mlgGl y 9G4 son similares.
Ejemplo 1: incorporación del receptor Axl Puesto que un método de inmunoconj ugado es más eficiente cuando el antigeno blanco es una proteina que se incorpora, se estudió la incorporación del receptor Axl usando el ensayo de citotoxicidad de Mab-Zap sobre lineas de células tumorales humanas. De manera más precisa, el reactivo Mab-Zap es un conjugado químico que incluye un anti-IgG de ratón de cabra purificado por afinidad y la proteina inactivante de ribosomas, saporina. Si ocurre la incorporación del complejo inmune, la saporina se separa del agente selectivo, e inactiva los ribosomas, resultando en la inhibición de la síntesis de proteínas y, finalmente, la muerte celular. La determinación de la viabilidad celular después de 72 horas de incubación con el 1613F12 o con el anticuerpo de control de isotipo mlgGl sobre todas las células positivas a Axl permite concluir sobre la incorporación del receptor de Axl inducida por 1613F12.
Para este ejemplo fueron usadas células altamente positivas a Axl, de acuerdo a lo determinado usando el reactivo Qifikit (Dako) . Los datos se presentan en la siguiente Tabla 5.
Tabla 5 En el ejemplo siguiente, las células SN12C fueron usadas como un ejemplo no limitante. Podría ser usada cualquier otra línea que exprese un nivel apropiado de receptor de Axl sobre su superficie celular.
Los intervalos de concentración del 1613F12 o el anticuerpo de control de isotipo mlgGl fueron preincubadas con 100 ng de anticuerpo secundario Mab-Zap (sistemas selectivos avanzados) en el medio de cultivo celular durante 30 min a TA. Esas mezclas fueron cargadas sobre células SN12C cultivadas en microplacas de 96 pozos, blancas. Las placas fueron incubadas durante 72 h a 37 °C en presencia de 5% de C02. La viabilidad celular fue determinada usando un método de proliferación celular Cell Titer Glo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega). Se efectuaron varios controles: i) sin ningún inmunoconjugado secundario y ii) sin anticuerpo primario. En paralelo, son efectuados ensayos con un control de isotipo de mlgGl.
Los resultados obtenidos son representados en la Figura 1.
El 1613F12 muestra un efecto citotóxico máximo sobre las células SN12C de -36%. No se observó efecto citotóxico en presencia del anticuerpo 9G4, considerado como un control de isotipo de mlgGl en el experimento. No se observó citotoxicidad en los pozos que contenían sólo anticuerpos primarios (no se muestran los datos) . De este modo, el receptor de Axl parece ser un antigeno conveniente como blanco para un método inmunoconj ugado como el complejo inmune que comprende Axl-1613F12-MabZap que activa una citotoxicidad efectiva de las células dirigidas .
Ejemplo 2: Generación de un anticuerpo contra rhAxl ECD.
Para generar anticuerpos monoclonales murinos (Mabs) contra el dominio extracelular (ECD) del receptor de Axl, fueron inmunizados a 5 ratones BALB/c 5 veces s.c. con 15-20.106 células CHO-Axl y dos veces con 20 \iq de rhAxl ECD. La primera inmunización fue efectuada en presencia de adyuvante de Freund completo (Sigma, St. Louis, MD, EUA) . Se agregó adyuvante de Freund incompleto (Sigma) para las siguientes inmunizaciones.
Tres días antes de la fusión, los ratones inmunizados fueron reforzados con 20.106 células CHO-Axl y 20 µg de rhAxl ECD con IFA.
Para generar hibridomas, los esplenocitos y linfocitos fueron preparados por perfusión del bazo y macerando los nodos linfáticos proximales, respectivamente, cosechados de 1 a 5 ratones inmunizados (seleccionados después de la titulación) y fusionados a células de mieloma SP2/0-Agl4 (ATCC, Rockville, MD, USA) . El protocolo de fusión es descrito por Kohler y Milstein (Nature, 256:495-497, 1975) . Las células fusionadas son entonces sometidas a selección HAT. En general, para la preparación de los anticuerpos monoclonales o sus fragmentos funcionales, especialmente de origen murino, es posible referirse a técnicas las cuales son descritas en particular en el manual "Antibodies" (Harlow and Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988) .
Aproximadamente 10 dias después de la fusión, las colonias de células híbridas fueron seleccionadas. Para la selección primaria, los sobrenadantes de los hibridomas fueron evaluadas por la secreción de Mabs dirigidos contra la proteína Axl ECD usando un ELISA. En paralelo, se efectuó un análisis FACS para seleccionar Mabs capaces de unirse a la forma celular de Axl presente sobre la superficie celular usando células CHO que expresan células CHO Axl (ATCC) .
Tan pronto como fue posible, los hibridomas seleccionados fueron clonados por dilución limitante y posteriormente seleccionados por su reactividad contra la proteína Axl ECD. Los Mabs clonados fueron entonces isotipificados usando un equipo de isotipificación (# de cat 5300.05, Southern Biotech, Birmingham, AL, USA). Una clona obtenida de cada hibridoma fue seleccionada y expandida.
Los ensayos de ELISA son efectuados usando sobrenadante de hibridoma puro o, cuando el contenido de IgG en los sobrenadantes fue determinado, se realizó la titulación comenzando de 5µ?/p?1. Entonces se efectuó una dilución en serie de 1/2 en las siguientes 11 hileras. De manera breve, placas de ELISA de 96 pozos (Costar 3690, Corning, NY, USA) fueron recubiertas con 50 µ?/???? de la proteina rhAxl-Fc (R and D Systems, No. de cat 154-AL) o rhAxl ECD a 2 mg/ml en PBS durante la noche a 4°C. Las placas fueron entonces bloqueadas con PBS que contenia 0.5% de gelatina (# 22151, Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemania) durante 2 h a 37 °C. Una vez que el amortiguador de saturación es desechado golpeando las placas, fueron agregados 50 µ? de sobrenadantes de células de hibridoma puros o 50 µ? de una solución de 5 mg/ml a las placas de ELISA incubadas durante 1 h a 37°C. Después de tres lavados, se agregaron 50 µ? de antilgG de ratón de cabra policlonal conjugado con peroxidasa de rábano (# 115-035-164, Jackson Immuno-Research Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA) a una dilución 1/5000 en PBS que contenia 0.1% de gelatina y 0.05% de Tween 20 (p:p) durante 1 h a 37 °C. Entonces, las placas de ELISA fueron lavadas 3 veces y fue agregado el sustrato TMB (# UP664782, Uptima, Interchim, Francia) . Después de un tiempo de incubación de 10 min a temperatura ambiente, la reacción fue detenida usando ácido sulfúrico 1 M y la densidad óptica fue medida a 450 nm.
Para la selección por citometria de flujo, fueron cultivadas 105 células (CHO wt o CHO-Axl) en cada pozo de una placa de 96 pozos en PBS que contenía 1% de BSA y 0.01% de azida de sodio (amortiguador de FACS) a 4°C. Después de una centrifugación de 2 min a 2000 rpm, el amortiguador fue removido y los sobrenadantes de hibridoma o Mabs purificados (1 g/ml) a ser probados fueron agregados. Después de 20 min de incubación a 4°C, las células fueron lavadas dos veces y fue agregado un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con Alexa 488 1/500° diluido en amortiguador de FACS (# A11017, Molecular Probes Inc., Eugene, USA) e incubadas durante 20 min a 4 °C. Después de un lavado final con amortiguador de FACS, las células fueron analizadas por FACS ( Facscalibur, Becton-Dickinson) después de la adición de yoduro de propidio a cada tubo a una concentración final de 40 µg/ml. Los pozos que contenían células únicamente y células incubadas con el anticuerpo conjugado con Alexa 488 secundario fueron incluidos como controles negativos. Fueron usados controles de isotipo en cada experimento (Sigma, ref M90351MG) . Fueron evaluadas al menos 5000 células para calcular el valor medio de intensidad de fluorescencia (MFI) .
De manera más precisa, la fusión fue efectuada con 300.106 de los esplenocitos cosechados y 300.106 células de mieloma (relación 1:1). Doscientas células de la suspensión de células resultantes fueron entonces cultivadas a 2.106 células/ml en 30 placas de 96 pozos.
Un primer tamiz (alrededor del día 14 después de la fusión) , tanto por ELISA sobre la proteína de rhAxl ECD y por análisis FACS usando ambas células CHO y expresan CHO y Axl, permitió seleccionar 10 hibridomas que presentaron densidades ópticas (DO) superiores a 1 sobre el recubrimiento de rhAxlECD y MFI por debajo de 50 sobre células wt CHO y por encima de 200 sobre células CHO-Axl.
Estos 10 hibridomas fueron expandidos y clonados por dilución limitante. Fue preparada una placa de 96 pozos para cada código. Nueve días después del cultivo, los sobrenadantes de las placas de cultivo fueron tamizadas por primera vez por ELISA por especificidad de unión para el dominio extracelular de la proteína rh AxlECD. Tres clonas de cada código fueron expandidas e isotipificadas . Una vez producidos los anticuerpos anti-Axl fueron estudiados adicionalmente por su capacidad para incorporarse después de la unión de Axl sobre la superficie celular.
Ejemplo 3: especificidad de unión Axl En este ejemplo, se estudió por primera vez la afinidad de 1613F12 sobre la proteína rhAxl-Fc. Entonces, se estudió la unión sobre los otros dos miembros de la familia TAM, rhDtk-Fc y rhMer-Fc.
De manera breve, las proteínas Axl-Fc (R and D systems, No. de Cat 154AL/CF) , rhDtk (R and D Systems, No. de cat 859-DK) o rhMer-Fc (R and D Systems, No. de cat 891-MR), humanas recombinantes fueron recubiertas durante la noche a 4°C y placas de 96 pozos Immulon II y, después de un paso de bloqueo de 1 h con solución de gelatina al 0.5%, de anticuerpo purificado 1613F12 purificado fue agregado durante una hora adicional a 37 °C a una concentración inicial de 5 yg/ml (3.33 10~8 M) . Entonces se efectuaron diluciones en serie de ½ sobre 12 columnas. Las placas fueron lavadas y se agregó anti-ratón de cabra (Jackson) especifico IgG-HRP durante 1 hora a 37°C. El desarrollo de la reacción fue efectuado usando la solución de sustrato TMB. También se usaron anticuerpo de control de isotipo mlgGl y anticuerpo anti-Axl ab 154 comercial en paralelo. Se efectuaron controles de recubrimiento en presencia de un suero policlonal anti-IGg Fe humana de cabra marcado con HRP (Jackson, ref 109-035-098) y/o en presencia de un anticuerpo anti-histidina acoplado con HRP (R and D Systems, ref: MAB050H) . Los resultados están representados en las Figuras 2A, 2B y 2C, respectivamente.
Este ejemplo muestra que el anticuerpo 1613F12 únicamente se une a la proteina rhAxl-Fc y no se une a los otros dos miembros de la familia TAM, rhDtk o rhMer. No se observó especificidad cruzada de la unión del anticuerpo 1613F12 entre los miembros de TAM. No se observó unión no especifica en ausencia de anticuerpo primario (diluente) . No se observó unión en presencia del anticuerpo de control de isotipo .
Ejemplo 4: El 1613F12 reconoció la forma celular de Axl expresada sobre células tumorales .
El nivel de expresión de Axl en la superficie celular sobre células tumorales humanas fue establecido por primera vez usando un anticuerpo de Axl comercial (R and D Systems, ref: MAB154) en paralelo con perlas de calibración para permitir la cuantificación del nivel de expresión Axl. En segundo lugar, se estudió la unión de Axl de la superficie celular usando el 1613F12.
Para los estudios de unión a la superficie celular, se prepararon diluciones en serie, de dos veces de una solución de anticuerpo primario 10 µg/ml (6.66 10~8M) (1613F12, anticuerpo MAB154 o 9G4 de control de isotipo de mlgGl) y se aplicaron sobre 2.105 células durante 20 min a 4°C. Después de 3 lavados en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) suplementada con 1% de BSA y NaN3 al 0.01%, las células fueron incubadas con anticuerpo secundario anti-Alexa 488 de ratón de cabra (dilución 1/500) durante 20 minutos a 4°C. Después de 3 lavados adicionales en PBS suplementado con 1% de BSA y NaN3 al 0.1%, las células fueron analizadas por FACS ( Facscalibur, Becton-Dickinson) . Fueron evaluadas al menos 5000 células para calcular el valor medio de la intensidad de la fluorescencia.
Para la determinación de la ABC cuantitativa usando el anticuerpo MAB 154, se usaron perlas de calibración QIFIKIT®. Entonces, las células son incubadas, en paralelo con las perlas QIFIKIT®, con anti-inmunoglobulinas de ratón de cabra policlonales/FITC, F(ab')2 de cabra a concentración saturante. El número de sitios de antigénicos sobre las células de especímenes entonces es determinado por interpolación de la curva de calibración (la intensidad de la fluorescencia de las poblaciones de perlas individuales contra el número de moléculas de Mab sobre las perlas. 4.1. Cuantificación del nivel de expresión de Axl en la superficie celular El nivel de expresión de Axl sobre la superficie de células tumorales humanas fue determinado por citometría de flujo usando el ensayo de inmunofluorescencia directa (método QIFIKIT® (Dako, Dinamarca), un equipo de citometría de flujo cuantitativo para evaluar los antígenos de la superficie celular. Una comparación de la intensidad de fluorescencia media (MFI) de los niveles de antígeno conocidos de las perlas vía una gráfica de calibración permite la determinación de la capacidad de unión del anticuerpo (ABC) de las líneas celulares.
La tabla 6 presenta el nivel de expresión de Axl detectado sobre la superficie de varias líneas celulares tumorales humanas (SN12C, Calu-1, A172, A431, DU145, MDA-MB435S, MDA-MB231, PC3 , NCI-H226, NCI-H125, MCF7 , Panel) (ATCC, NCI) de acuerdo a lo determinado usando el QIFIKIT®, el anticuerpo comercial MAB154 (R and D Systems) . Los valores se dan como complejo de unión de antigeno (ABC) .
Tabla 6 Los resultados obtenidos con el anticuerpo monoclonal de Axl comercial (MAB154) mostraron que el receptor de Axl es expresado en varios niveles dependiendo de la célula tumoral humana considerada. 4.2. Detección de Axl por 1613F12 sobre células tumorales humanas De manera más específica, se estudió la unión de Axl usando el 1613F12.
Se prepararon curvas de respuesta a la dosis de 1613F12. Las MFIs obtenidas usando las diferentes células tumorales humanas fueron entonces analizadas con el software de Prism. Los datos se presentan en la Figura 3.
Los datos indican que el 1613F12 se une específicamente al receptor de Axl en la membrana de acuerdo a lo atestiguado por los perfiles de la curva de saturación. Sin embargo se observaron diferentes intensidades de marcación, revelando niveles variables del receptor de Axl en la superficie celular en células de tumor humano. No se observó unión del receptor de Axl usando la línea celular de tumor de mama humano MCF7.
Ejemplo 5: Especificidad usada interespecies de 1613F12 Para resolver la especificidad cruzadas entre especies de 1613F12, se consideraron dos especies: ratón y mono. Primero se estudió la unión sobre el receptor de Axl del ratón recombinante (rm) por ELISA (Figura 4). Entonces, se efectuaron experimentos de citometría de flujo usando células C0S7 de mono, puesto que esas células expresan el receptor de Axl sobre su superficie (Figura 5) . La línea celular C0S7 se obtuvo inmortalizando una linea celular CV-1 derivada de células de riñon del mono verde africano con una versión del genoma de SV40 que puede producir el antigeno T grande pero tiene un defecto en la replicacion genómica.
ELISA de rmAxl-Fc De manera breve, las proteínas Axl-Fc (R and D systems, No. de cat 854-AX/CF) , de ratón recombinante fueron recubiertas durante la noche a 4°C a placas de 96 pozos Immulon II, y después de un paso de bloqueo de 1 h con una solución de gelatina al 0.5%, el anticuerpo 1613F12 purificado fue agregado durante una hora adicional a 37 °C a concentración inicial de 5 pg / mi (3.33 10~8 H) . Entonces se efectuaron diluciones en serie de ½ sobre 12 columnas. Las placas fueron entonces lavadas y se agregó IgG específico anti-ratón de cabra (Jackson) durante 1 hora a 37°C. El desarrollo de la reacción fue efectuado usando la solución de sustrato TMB. También se usaron control de isotipo de mlgGl y el anticuerpo comercial Mab 154 en paralelo. Se efectuaron controles de recubrimiento en presencia de un suero policlonal anti-IgG Fe humano de cabra acoplado con HRP (Jackson, ref 109-035-098) y/o en presencia de anticuerpo anti-histidina acoplado con HRP (R and D Systems, Ref: MAB050H ) .
Los resultados son representados en la Figura 4.
Esta Figura muestra que el 1613F12 no se une al dominio Axl ECD murino. No se observó unión especifica en ausencia de anticuerpo primario (diluente) .
FACS CQS7 Para los estudios de unión celular de 1613F12 usando células COS7, fueron incubadas 2.105 células con un intervalo de concentración de anticuerpo preparado por dilución en serie de ½ (12 puntos) de una solución de anticuerpo de 10 g/ml (6.66 10"8 M) del 1613F12 o Mab de control de isotipo de mlgGl durante 20 min a 4°C. Después de 3 lavados en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) suplementada con 1% de BSA y NaN3 al 0.01%, las células fueron incubadas con anticuerpo secundario anti-Alexa 488 de ratón de cabra (dilución 1/500) durante 20 minutos a 4°C. Después de 3 lavados adicionales en PBS suplementario con 1% de BSA y NaN3 al 0.1%, las células fueron analizadas por FACS ( Facscalibur, Becton-Dickinson) . Fueron evaluadas al menos 5000 células para calcular el valor medio de la intensidad de fluorescencia. Los datos se analizaron usando el software Prism.
Los resultados se representan en la Figura 5. La curva de titulación establecida sobre células COS7 usando 1613F12 confirma que el 1614F12 es capaz de reconocer la forma celular de mono del receptor de Axl expresado sobre la superficie de las células C0S7. Se alcanzó una . meseta para concentraciones de 1613F12 por encima de 0.625 µg ml (4.2 de 10"10 M) . No se observó una unión en presencia del control de isotipo de mlgGl.
Este ejemplo ilustra el hecho de que el 1613F12 no reacciona de manera cruzada con el receptor de Axl de ratón. En contraste este se une fuertemente al receptor de Axl de mono expresado sobre la superficie de células C0S7.
Ejemplo 6: Experimentos de Competencia de Gas6 Efectuados en presencia del 1613F12 Para caracterizar mejor el 1613F12, se efectuaron ensayos de competencia de GAS6.
En este ensayo, la proteina rhAxl-Fc libre y el 1613F12 se incubaron para formar el complejo antigeno-anticuerpo y entonces los complejos se cargaron en la superficie recubierta con Gas6 en la placa de ensayo. Los complejos de anticuerpo-antigeno no unidos son lavados antes de agregar el anticuerpo secundario ligado a enzimas contra la porción Fe humana de la proteina rhAxl-Fc. El sustrato es entonces agregado y la concentración de antigeno puede ser determinada por la fuerza de la señal producida por la reacción enzima-sustrato.
De manera breve la mezcla de reacción que comprende la proteina rhAxl-Fc en presencia o no de los Mabs anti-Axl a ser probados, es preparada sobre una placa saturada separada (gelatina al 0.5% en PBS IX) . Se efectúan diluciones 1:2 (partiendo de 80 ug/rnl sobre 12 columnas) de anticuerpos anti-Axl murinos. Entonces se agregan 0.5 µ /ta1 de la proteina rhAxl-Fc (R and D Systems, ref. 154AL/CF) , excepto a la linea de control negativo que contiene únicamente diluente de ELISA (gelatina al 0.1%, Tween al 0.05% en PBS IX) . Después de la homogeneización, las muestras de competencia son cargadas sobre placas recubiertas con Gas6 con una solución de 6 g/ml de rhGas6 en PBS (R and D Systems, No. de cat 885-GS-CS/CF) . Después de la incubación y de varios lavados, las proteínas rhAxl-Fc son detectadas usando anti-IgG humano-HRP de cabra (Jackson, ref. 109-035-098) . Una vez unidas, es agregado el sustrato TMB a las placas. La reacción es detenida mediante la adición de solución de ácido H2SO4 1 M y las densidades ópticas obtenidas son leídas a 450 nra usando un instrumento lector de microplacas.
Este experimento (Figura 6) muestra que el 1613F12 es capaz de competir por la unión de rhAxl-Fc sobre su ligando inmovilizado. La competencia con la unión de Gas6 ocurre en presencia de concentraciones de anticuerpos 1613F12 por encima de 2.5 µg/ml (1.67 10~8 M) . No se observa más unión del rhAxl-Fc sobre el Gas6 inmovilizado en presencia de una concentración de 1613F12 superior a 10 µg/ml (6.67 10"8 M) . El 1613F12 bloquea la unión de Gas6 a rhAxl-Fc.
Ejemplo 7: Reconocimiento del Epitope por Western Blot Para determinar 1613F12 reconoce un epitope lineal o conformacional, se efectuó el análisis western blot usando lisado de células SN12C. Las muestras fueron tratadas de manera diferente para estar en condiciones reductoras y no reductoras. Si es visualizada una banda con la muestra reducida, el anticuerpo probado hace blanco en un epitope lineal del dominio ECD; si no, este está dirigido contra un epitope de conformación del Axl ECD.
Las células SN12C fueron sembradas en RPMI + 10% de FBS inactivado con calor + L-glutamina 2 mM a 5.104 células/cm2 en matraces T162 cm2 durante 72h a 37 °C en una atmósfera de C02 al 5%. Entonces las células fueron lavadas dos veces con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y Usadas con 1.5 mi de amortiguador de lisis enfriado con hielo [50 mM Tris-HCl (pH7.5); NaCl 150 mM; Nonidet P40 al 1%; desoxicolato al 0.5%; y una tableta de cocktail de proteasa completo más antifosfatasa al 1%] . Los lisados celulares fueron agitados durante 90 min a 4°C y aclarados a 15 000 rpm durante 10 min. La concentración de proteina fue cuantificada usando BCA. Fueron cargadas varias muestras. Primero se prepararon 10 µg de lisado celular completo (10 \iq en 20 µ?) en condiciones reductoras (lx amortiguador de muestra (BIORAD) + lx agente reductor (BIORAD) ) y cargado sobre SDS-PAGE después de 2 min incubado a 96°C. En segundo lugar, fueron preparadas otras dos muestras de 10 ]ig de Usado celular completo en condiciones no reductoras (en lx amortiguador de muestra (BIORAD) únicamente) . Antes de ser cargado sobre el gel de SDS-PAGE, una de esas dos últimas muestras es calentada durante 2 min de incubación a 96°C; la otra es conservada sobre hielo. Después de la migración, las proteínas son transferidas a una membrana de nitrocelulosa . Las membranas fueron saturadas durante 1 h a TA con TBS-tween 20 al 0.1% (TBST) , leche descremada al 5% y sondeadas con 1613F12 a 10 µg ml durante la noche a 4°C. Los anticuerpos fueron diluidos en solución salina amortiguada con Tris-tween 20 al 0.1% (v/v) (TBST) con leche descremada deshidratada al 5%. Las membranas fueron lavadas con TBST e incubadas con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (dilución 1/1000) durante 1 h a TA. Las proteínas inmunorreactivas fueron visualizadas con ECL (Pierce #32209) . Después de la vizualización de Axl, las membranas fueron lavadas una vez más con TBST e incubadas durante 1 h a TA con anticuerpo anti-GAPDH de ratón (dilución 1/200 000) . Las membranas fueron lavadas en TBST e incubadas con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa durante lh a TA. Las membranas fueron lavadas y el GAPDH fue revelado usando ECL.
Los resultados se presentan en la Figura 7.
El 1613F12 reconoce principalmente un epítope conformacional puesto que es observada esencialmente una banda especifica en condiciones no reductoras. Sin embargo es detectada una señal débil en la condición de migración desnaturalizante del lisado de células SN12C indicando que el 1613F12 es capaz de unirse débilmente a un epitope lineal.
Ejemplo 8: Medición de la desregulación de Axl activada por el 1613F12 por western Blot.
En el siguiente ejemplo, fue seleccionada la linea celular de carcinoma celular renal humano SN12C (ATCC) para tratar la actividad de los anticuerpos de Axl sobre la expresión del receptor de Axl. La linea celular SN12C expresa el receptor de Axl. La desregulación de Axl fue estudiada por western blot sobre extractos de células completas en las Figuras 8A-8B.
Las células SN12C fueron sembradas en RPMI + FBS inactivado con calor al 10% + L-glutamina 2 mM a 6.104 células/cm2 en placas de 6 pozos durante 48 h a 37°C en una atmósfera de C02 al 5% C02. Después de dos lavados con solución salina amortiguada con fosfato (PBS), las células fueron privadas de suero en un medio que contenia 800 ng/ml de ligando de gas6 de ratón recombinante (R and D Systems, ref: 986-GS/CF) o 10 µ?}/p?1 de un anticuerpo de control de isotipo de mlgGl (9G4) o 10 iq/ml del anticuerpo Axl de la presente invención incubada durante 4 h o 24 horas adicionales. Entonces el medio fue removido suavemente y las células lavados dos veces con PBS frío. Las células fueron Usadas con 200 µ? de amortiguador de lisis enfriado con hielo [Tris-HCl 50 m (pH7.5); NaCl 150 mM; Nonidet P40 al 1%; desoxicolato al 0.5%; y 1 tableta de coctel de inhibidor de proteasa completo más antifosfatasas al 1%] . Los lisados celulares fueron agitados durante 90 min a 4°C y aclarados a 15 000 rpm durante 10 min. La concentración de proteína fue cuantificada usando el método BCA. Los lisados de células completas (10 µg en 20 µ?) fueron separados por SDS-PAGE y transferidos a membranas de nitrocelulosa . Las membranas fueron saturadas durante 1 h a TA con TBS-Tween 20 al 0.1% (TBST) , leche descremada al 5% y sondeados con un anticuerpo 02 Axl comercial a 0.5 µg/ l (AbNova H00000558-M02 ) durante la noche a 4°C. Los anticuerpos fueron diluidos en solución salina amortiguada con Tris-tween 20 al 0.1% (v/v) (TBST) con leche deshidratada deshidratada al 5%. Las membranas fueron lavadas con TBST e incubadas con anticuerpos secundarios conjugado con peroxidasa (dilución 1/1000) durante 1 h a TA. Las proteínas inmunorreactivas fueron visualizadas con ECL (Pierce #32209) . Después de la visualización de Axl, las membranas fueron lavadas una vez más con TBST e incubadas durante 1 h a TA con anticuerpo anti-GAPDH de ratón (dilución 1/200000) . Entonces las membranas fueron lavadas en TBST e incubadas con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa, durante lh a TA. Las membranas fueron lavadas y el GAPDH fue revelado usando ECL . La intensidad de la banda fue cuantificada por densitometria .
Los resultados presentados en las Figuras 8A y 8B son representativos de 3 experimentos independientes y demuestran que el 1613F12 es capaz de desregular Axl en una linea celular de tumor humano que sobreexpresa Axl. A las 4 h, el 1613F12 activa una desregulación de Axl del 66%, y hasta 87% después de una incubación de 24 horas con el 1613F12.
Ejemplo 9: Estudio de citómetria de flujo del efecto de 1613F12 sobre la expresión de Axl en la superficie celular La técnica de citometria de flujo permite marcar el receptor de Axl en la superficie celular. El uso de esta técnica puede resaltar el efecto de los anticuerpos sobre la expresión de Axl en la membrana. Las células SN12C de tumor renal humano que expresan altos niveles de Axl fueron usadas en este ejemplo.
La linea celular de tumores SN12C fue cultivada en RMPI1640 con L-glutamina al 1% y 10% de FCS durante 3 días antes del experimento. Las células fueron entonces desprendidas usando tripsina y cultivadas en 6 placas multipozo en RPMI1640 con L-glutamina al 1% y FBS al 5%. El siguiente día, los anticuerpos de interés fueron agregados a 10 µg/ml. Las células no tratadas también fueron incubadas.
Las células son incubadas a 37 °C, C02 al 5%. Cuarenta y cuatro horas más tarde, las células fueron lavadas con PBS, desprendidas e incubadas con los mismos anticuerpos de interés en amortiguador de FACS (PBS, BSA al 1%, azida de sodio al 0.01%)). Las células no tratadas también fueron teñidas con el mismo anticuerpo para comparar la intensidad obtenida con el mismo Mab sobre las células tratadas y no tratadas. Las células fueron incubadas durante 20 minutes a 4°C y lavadas tres veces con amortiguador de FACS. Un anticuerpo anti-IgG de ratón de cabra marcado con Alexa 488 fue incubado durante 20 minutos y las células fueron lavadas tres veces antes del análisis por FACS sobre la población de células negativas a ioduro de propidio.
Son determinados dos parámetros: (i) la diferencia de la señal fluorescente detectada sobre la superficie de células no tratadas (no Ab) en comparación con las células tratadas con ab a 24 h y (ii) el porcentaje de Axl restante sobre la superficie celular. El porcentaje de Axl restante es calculado como sigue: % de Axl restante = (MFI to 24 h / MFI sin ¾b 24 h) 100 Los datos de un experimento representativo se encuentran representados en la Tabla 7. Los resultados fueron producidos en tres experimentos independientes.
La diferencia de MFI entre la tinzión de un Mab en las células no tratadas y la condición tratada con el mismo anticuerpo refleja una desregulación de la proteina Axl sobre la superficie de las células debido a la unión del Mab considerado. Las condiciones sin anticuerpo dan resultados similares a condiciones en presencia del anticuerpo de control de isotipo (m9G4).
Tabla 7 Los datos demuestran que la intensidad de fluorescencia media detectada sobre la superficie de las células tratadas con 1613F12 durante 24 horas se redujo (- 514) en comparación con las MFI obtenidas con células no tratadas marcadas con 1613F12. Después de una incubación de 24 h con el anticuerpo cl613F12, 45.2% del receptor de Axl en la superficie celular permanece en la superficie celular de SN12C.
Ejemplo 10: Estudio de incorporación de 1613F12 usando marcación inmunoistoquimica fluorescente.
Los resultados de incorporación complementaria son obtenidos por microscopía confocal usando el método de marcación fluorescente indirecta.
De manera breve, la línea celular de tumor SN12C fue cultivada en RMPI1640 con L-glutamina al 1% y 10% de FCS durante 3 días antes del experimento. Las células fueron entonces desprendidas usando tripsina y cultivadas en 6 placas multipozo que contenían cubreobjetos en RPMI1640 con L-glutamina al 1% y FCS al 5%. Al siguiente día, el 1613F12 fue agregado a 10 g/ml. También fueron incluidas células tratadas con un anticuerpo irrelevante. Las células fueron entonces incubadas durante 1 h y 2 h a 37 °C, CO2 al 5%. Para T 0 h, las células fueron incubadas durante 30 minutos a 4°C para determinar la unión de anticuerpo sobre las superficie celular. Las células fueron lavadas con PBS y fijadas para formaldehído durante 15 minutos. Las células fueron enjuagadas e incubadas con un anticuerpo anti-igG de ratón Alexa 488 de cabra durante 60 minutes a 4°C para identificar el anticuerpo restante sobre la superficie celular. Para seguir la penetración del anticuerpo hacia las células, las células fueron fijadas y permeabilizadas con saponina. Se usó un anticuerpo- IgG de ratón Alexa 488 de cabra (Invitrogen) para teñir la membrana y el anticuerpo intracelular . Los endosomas primarios fueron identificados un anticuerpo policlonal de conejo contra EEA1 revelado .con anticuerpo anti-IgG de conejo de cabra-Alexa 555 (Invitrogen) . Las células fueron lavadas tres veces y los núcleos fueron teñidos usando Draq5. Después de la tinción, las células fueron montadas en medio de montaje Prolong Gold (Invitrogen) y analizadas utilizando un microscopio Zeiss LSM 510.
Las fotografías se presentan en las Figuras 9A-9C.
Las imágenes fueron obtenidas por microscopía confocal. En presencia de control de isotipo de mlgGl (9G4), no es observada tinción de la membrana ni marcación intracelular (Figura 9A) . Es observada una perdida progresiva de la marcación anti-Axl en la membrana tan pronto como después de 1 h de la incubación de las células SN12C con el 1613F12 (Figura 9B) . La acumulación intracelular del anticuerpo 1613F12 es observada claramente a 1 h y 2 h (Figura 9C) . El anticuerpo intracelular se colocaliza con EEAl, un marcador de endosoma primario. Esas fotografías confirman la incorporación del 1613CF12 en las células SN12C.
Ejemplo 11: actividad anti-tumoral mediada por anti-Axl in vitro.
Ensayo de proliferación de SN12C Fueron sembradas diez mil células SN12C por pozo en medios sin FCS sobre placas de 96 pozos durante la noche a 37°C en una atmósfera de C02 al 5%. Al siguiente día, las células fueron preincubadas con 10 ug/ml de cada anticuerpo durante 1 hora a 37°C. Las células fueron tratadas con o sin rmGas6 (R and D Systems, No. de cat 986-GS/CF) , agregando el ligando directamente al pozo, y entonces se dejó crecer durante 72 h. La proliferación fue medida siguiendo la proliferación de 3H timidina.
Los datos se presentan en la Figura 10. No se observó efecto con el 1613F12 el cual guarda silencio cuando es agregado a células SN12C.
E emplo 12 : Potencia de la citotoxicidad del inmunoconjugado 1613F12-saporina en varias lineas de célula tumoral humana En el presente ejemplo, se documentó la potencia la citotoxicidad del 1613F12 acoplado a la saporina. Para este propósito se efectuaron ensayos de citotoxicidad directa in vitro usando un panel grande de lineas de células tumorales humanas (Figuras 11A-11K) . El panel de lineas de celulares tumorales ofrece varias expresiones de Axl en la superficie celular .
De manera breve, fueron sembradas 5000 células en placas de cultivo de 96 pozos en 100 µ? de medio de cultivo adecuado con FBS al 5% (DO) . Después de 24 horas de incubación en una atmósfera de C02 al 5% a 37 °C, se aplicó un intervalo de concentración de inmunoconj ugado (1613F12-saporina o 9G4-saporina o 1613F12 o 9G4 solos a la célula) .
Las placas de cultivo son entonces incubadas a 37°C en un incubador con C02 al 5% durante 72 horas.
Al D4, la viabilidad celular es evaluada usando el equipo de Viabilidad Celular Luminiscente CellTiter-Glo® (Promega Corp., Madison, WI) que permite determinar el número de células viables en cultivo sobre la base de la cuantificación del ATP presente, un indicador de las células metabólicamente activas. Las emisiones de luminiscentes son registradas por un dispositivo de medidor de luminiscencia.
De la salida de luminiscencia es calculado el porcentaje de citotoxicidad usando la siguiente fórmula: % de citotoxicidad = 100- [ (RLUAb-sap x 100)/ RLU sin Abl En las Figuras 11A-11K se colocaron juntas las gráficas que presentan el porcentaje de citotoxicidad en función de la concentración de inmunoconj ugado obtenida en distintos en ensayos de citotoxicidad celular in vitro con células tumorales (A) SN12C, (B) Calu-1, (C) A 172, (D) A431, (E) DU145, (F) MDA-MB-435S, (G) MDA-MB-231, (H) PC3, (I) NCI-H226, (J) NCI-H125 o (K) (A) SN12C, (B) Calu-1, (C) un 172, (D) A431 , (E) DU145, (F) DA-MB-435S, (G) MDA-MB-231, (H) PC3, (I) NCI-H226, (J) NCI-H125 o (K) tratadas con un intervalo de concentraciones de inmunoconj ugado de 1613F12-saporina .
Figuras 11A- 11K muestran que el inmunoconj ugado de 1613F12-saporina activó la citotoxicidad en estas diferentes líneas celulares tumorales humanas. La potencia del efecto de la citotoxicidad resultante depende de la línea celular tumoral humana.
Ejemplo 13: Humanización de los dominios variables del anticuerpo 1613F12 El uso de anticuerpos de ratón (Mabs) para aplicaciones terapéuticas en humanos generalmente da como resultado un efecto adverso mayor, los pacientes presentan una respuesta al anticuerpo anti-ratón humano (HAMA) , reduciendo por lo tanto la eficacia del tratamiento y evitando que se continúe la administración. Un método para superar este problema es humanizar Mabs de ratón reemplazando las secuencias de ratón por su contraparte humana, pero sin modificar la actividad de unión de antígeno. Esto puede ser logrado en dos formas principales: (i) por construcción de anticuerpos quiméricos de ratón/humano, donde las regiones variables de ratón son unidas a regiones constantes humanas (Boulianne et al, 1984.) y (ii) insertando las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de las regiones variables de ratón en regiones variables humanas cuidadosamente seleccionadas y entonces uniendo esas regiones variables "humanas reformadas" a las regiones humanas (Riechmann et al., 1988).
Diseño de versión humanizada del anticuerpo 1613F12 13.1.1 Humanización del dominio variable de cadena ligera VL Como un paso preliminar, la secuencia nucleotidica de 1613F12 VL fue compara con la parte de las secuencias del gen germinal murino de la base de datos de IMGT (http://www.imgt.org). Los genes germinales murinos IGKV16-104*01 e IGKJ5*01 fueron identificados. Para identificar el mejor candidato humano injertar la CDR, ha sido buscado el mejor gen germinal humano que presente la mejor de identidad con la secuencia murina 1613F12 VL. Con la ayuda de las herramientas de análisis de la base de datos IMGT, se identificó una región V humana receptora posible para la CDR 1613F12 VL murinas : IGKVl-27*01 y IGKJ4*02. Para efectuar la humanización al dominio variable de cadena ligera a cada residuo que es diferente entre las secuencias de humano y ratón se dio una orden de rango de prioridad. Esas prioridades (1-4) fueron usadas para crear 11 variantes humanizadas diferentes de la región variable de cadena ligera con hasta 14 contramutaciones.
FR1-IMGT CDR1-IMGT FR2-IMGT CD 1613F12VL DVQITQSPSYLATSPGETITINCRAS KSI SKY LA YQEKPGKTNKLLIY SG Homsap IG V1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS QGI SNY LAWYQQ PGKVPKLLIY AA V I Y AT P ETI N E TH Prioridad I I 3 34 4 433 2 3 33 hzl613F12 (VL1) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS KSI SKY LAWYQQKPGKVPKLLIY SG hzl613F12 (VL1I2V) DVQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS KSI SKY LAWYQQKPGKVPKLLIY SG hzl613F12 (VL1M4I) DIQITQSPSSLSASVGDRVTITCRAS KSI SKY LAWYQQKPGKVPKLLIY SG hz!613F12 (VL2.1) DVQITQSPSSLSASVGDRVTITCRAS KSI SKY LA YQQKPGKVPKLLIY SG hz!613F12 (VL2.1V49T) DVQITQSPSSLSASVGDRVTITCRAS KSI SKY LA YQQKPGKTPKLLIY SG hzl613F12 (VL2.1 50N) DVQITQSPSSLSASVGDRVTITCRAS KSI SKY LAWYQQKPGKVNKLLIY SG hzl613F12 (VL2.2) DVQITQSPSSLSASVGDRVTINCRAS KSI SKY LAWYQQKPGKVPKLLIY SG hzl613F12 (VL2.2V49T) DVQITQSPSSLSASVGDRVTINCRAS KSI SKY LAWYQQKPGKTPKLLIY SG hzl613F12 (VL2.2P50N) DVQITQSPSSLSASVGDRVTINCRAS KSI SKY LAWYQQKPGKVNKLLIY SG hzl613F12 (VL2.3) DVQITQSPSSLSASVGDRVTINCRAS KSI SKY LAWYQEKPGKT KLLIY SG hz!613F12 (VL3) DVQITQSPSYLAASVGDTITINCRAS KSI SKY LAWYQEKPGKTNKLLIY SG R2-IMGT FR3-IMGT 1613F12VL . S TLQSGVP. SRFSGSG. . SGTDFTLTI SSLEPEDFAMYFC Homsap IGKVl-27'01 . S TLQSGVP. SRFSGSG. . SGTDFTLTI SSLQPEDVATYYC E F M F Prioridad 4 4 4 2 hz!613F12 (VL1) .S TLQSGVP SRFSGSG SGTDFTLTI SSLQPEDVATYYC hzl613F12 (VL1I2V) . S TLQSGVP SRFSGSG SGTDFTLTI SSLQPEDVATYYC z!613F12 (VL1M4I) . S TLQSGVP SRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDVATYYC hzl613F12 (VL2.1) . s TLQSGVP SRFSGSG SGTDFTLTI SSLQPEDVATYYC hzl613F12 (VL2.1V49T) . s TLQSGVP SRFSGSG SGTDFTLTI SSLQPEDVATYYC h-1613F12 (VL2.1P50N) . s TLQSGVP SRFSGSG SGTDFTLTI SSLQPEDVATYYC hzl613F12 (VL2.2) . s TLQSGVP SRFSGSG SGTDFTLTI SSLQPEDVATYFC hzl613F12 (VL2.2V49T) . s TLQSGVP SRFSGSG SGTDFTLTI SSLQPEDVATYFC hzl613F12 (VL2.2P50N) . s TLQSGVP SRFSGSG SGTDFTLTI SSLQPEDVATYFC hz!613F12 (VL2.3) . s TLQSGVP SRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDVATYFC hz!613F12 (VL3) . s TLQSGVP SRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDVATYFC CDR3-IMGT FR4-IMGT 1613F12VL QQHHEYPLT FGAGTELELK Homsap IGKJ4*02 LT FGGGTKVEIK A EL L Prioridad 3 33 4 Í1Z1613F12 (VL1) QQHHEYPLT FGGGTKVEIK hzl613F12 (VL1I2V) QQHHEYPLT FGGGTKVEIK hzl613F12 (VL1M4I) QQHHEYPLT FGGGTKVEIK hzl613F12 (VL2.1) QQHHEYPLT FGGGTKVEIK hzl613F12 (VL2.1V49T) QQHHEYPLT FGGGTKVEIK hzl613F12 (VL2.1PS0N) QQHHEYPLT FGGGTKVEIK hzl613FI2 (VL2.2) QQHHEYPLT FGGGTKVEIK hzl613F12 (VL2.2V49T) QQHHEYPLT FGGGTKVEIK hzl613F12 (VL2.2P50N) QQHHEYPLT FGGGTKVEIK hzl613F12 (VL2.3) QQHHEYPLT FGGGTKVEIK Í1Z1613F12 (VL3) QQHHEYPLT FGAGTELEIK 13.1.2 Humanización del dominio variable de cadena pesada de VH Para identificar el mejor candidato humano para insertar CDR, fueron buscados los genes terminales de ratón y humanos que presentan la mejor identidad con 1613F12 VH. La secuencia nucleotidica de 1613F12 VH fue alineada con las secuencias del gen germinal de ratón y en humamo usando el software de alineación de secuencias "IMGT/V QUEST", el cual es parte de la base de datos IMGT. También se efectuaron las alineaciones de las secuencias de aminoácidos para verificar los resultados de la alineación de la secuencia nucleotidica usando el software "Align X" del paquete VectorNTI . La alineación con los genes germinales de ratón mostró que el gen germinal de ratón IGHVl4-3*02 y gen J IGHJ2*01 son los genes germinales de ratón más homólogos. Usando la base de datos IMGT se identificó el gen D germinal de ratón IGHD1-1*01 como la secuencia homologa. Para seleccionar una linea germinal humana apropiada para injertar las CDR, se identificó el gen germinal humano con la mayor homología con la secuencia murina 1613F12 VH. Con la ayuda de las bases de datos y herramientas de IMGT, se seleccionó el gen germinal IGHVl-2*02 humano y el gen germinal IGHJ5*01 J humano como las secuencias receptoras para la CDR 1613F12 VH murinas. Para efectuar la humanización al dominio variable de cadena pesada a cada residuo que es diferente entre las secuencias humanas ratón se le dio un orden de rango de prioridad (1-4). Esas prioridades fueron usadas para crear 20 diferentes variantes humanizadas de la región variable de cadena pesada con hasta 18 retromutaciones, FR1-IMGT CDR1-IMGT FR2-IMGT CD (1-26) (27 -38) (39-55) ( 1613F12 EVHLQQSGA. ELVKPGASVKLSCTAS GFNI .. .. DTY IHWVKQRPEQGLEWIGR LD Homsap IGKVl-2*02 QVQLVQSGA . EVKKPGASVKVSCKAS GYTF .. .. TGYY MHWVRQAPGQGLEWMGW IN z a Q LV L I I K R £ I Prioridad 3 2 3 33 3 3 1 3 4 4 3 2 hz!613F12 (VH1) QVQLVQSGA. EVKKPGASVKVSCKAS GFNI .. ..RDTY MHWVRQAPGQGLEWMGW LD hzl613F12 (VH1M39I) QVQLVQSGA . EVKKPGASVKVSCKAS GFNI .. .. RDTY IHKVRQAPGQGLEWMGW LD hzl613F12 (VH1H55R 66K) QVQLVQSGA. EVKKPGASVKVSCKAS GFNI .. .. DTY MH VRQAPGQGLEWMGR LD hz!613F12 (VH1I84S) QVQLVQSGA. EVKKPGASVKVSCKAS GFNI .. .. RDTY MHWVRQAPGQGLEWMGW LD hz!613F12 (VH1S85N) QVQLVQSGA. EVKKPGASVKVSCKAS GFNI .. .. RDTY MHWVRQAPGQGLEWMGW LD hzI613F12 (VH1I84NS85N) QVQLVQSGA. EVKKPGASVKVSCKAS GFNI .. ..RDTY MHWVRQAPGQGLEWMGW LD hzl613F12 (VH2.1) QVQLVQSGA. EVKKPGASVKVSCKAS GFNI .. .. RDTY IHWVRQAPGQGLEWMGW LD hzl613F12 (VH2.1Q3H) QVHLVQSGA. EVKKPGASVKVSCKAS GFNI .. ..RDTY IHKVRQAPGQGLEWMGW LD h2l613F12 (VH2.1W55R) QVQLVQSGA . EVKKPGASVKVSCKAS GFNI .. .. RDTY IHWVRQAPGQGLEWMGR LD hzl613F12 (VH2.1N66K) QVQLVQSGA , EVKKPGASVKVSCKAS GFNI .. .. RDTY IHWVRQAPGQGLEWMGW LD hzl613F12 (VH2.1W55RN66 ) QVQLVQSGA. EVKKPGASVKVSCKAS GFNI .. .. RDTY IHWVRQAPGQGLEWMGR LD hz!613F12 (VH2 , 1R80S) QVQLVQSGA . EVKKPGASVKVSCKAS GFNI .. .. RDTY IHWVRQAPGQGLEWMGW LD hz!613F12 (VH2.1N66KR80S) QVQLVQSGA. EVKKPGASVKVSCKAS GFNI .. .. RDTY IHWVRQAPGQGLEWMGW LD hz!613F12 (VH2.2) QVHLVQSGA. EVKKPGASVKVSCKAS GFNI .. .. DTY IHWVRQAPGQGLEWMGW LD zl613F12 (VH2.2M89L) QVHLVQSGA. EVKKPGASVKVSCKAS GFNI.. .. RDTY IHWVRQAPGQGLEWMGW LD hzl613F12 (VH2.3) QVQLQQ3GA . EVKKPGASVKLSCTAS GFNI .. .. RDTY IHWVRQAPGQGLEWMGW LD hz!613F12 (VH2.3 55R) QVQLQQSGA. EVKKPGASVKLSCTAS GFNI .. .. RDTY IHWVRQAPGQGLEWMGR LD hz!613F12 (VH2.3Q3HW55R) QVHLQQSGA. EVKKPGASVKLSCTAS GFNI .. .. RDTY IHWVRQAPGQGLEWMGR LD hz±613F12 (VH2.4) QVQLQQSGA. EVKKPGASVKLSCTAS GFNI .. .. DTY IHWVRQAPGQGLEWIGR LD hz!613F12 (VH3) EVHLQQSGA . ELVKPGASVKLSCTAS GFNI .. ..RDTY IHWVKQAPGQGLEWIGR LD IMGT FR3-IMGT " 6— 65) (66-104) I613F12 PA. .NGHT KYGPNFQ.
Homsap IGHV1 PN. .SGGT NYAQKFQ .
K GP LQ Prioridad 2 344 11 33 4 4 hz!613F12 (VH1) PA. .NGHT NYAQKFQ. GRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYC hzi613F12 (VH1M39I) PA. .NGHT NYAQKFQ. GRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYC hzlól3F12 (VH1W55RN66K) PA. .NGHT KYAQKFQ. GRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYC hz!613F12 (VH1I84S) PA. .NGHT NYAQKFQ. GRVTMTRDTSSSTAYMELSRLRSDDTAVYYC hz!613F12 (VH1S85N) PA. .NGHT NYAQKFQ. GRVTMTRDTSIMTAYMELSRLRSDDTAVYYC hz!613F12 (VH1I84NS85N) PA. .NGHT NYAQKFQ. GRVTMTRDTSSHTAYMELSRLRSDDTAVYYC hz!613F12 (VH2.1) PA. .NGHT NYAQKFQ. GRVTMTRDTSSMTAYMELSRLRSDDTAVYYC hz!613F12 (VH2.1Q3H) PA. .NGHT NYAQKFQ. G TM RDTSSHTAYMELSRLRSDDTAVYYC hzl613F12 (VH2.1W55R) PA. .NGHT NYAQKFQ. GRVTMTRDTSSHTAYMELSRLRSDDTAVYYC hz!613F12 (VH2.1N66K) PA. .NGHT KYAQKFQ. GRVTMTRDTSSHTAYMELSRLRSDDTAVYYC hzl613F12 (VH2.1W55RN66K) PA. .NGHT KYAQKFQ. GRVTMTRDTSSHTAYMEL3RLRSDDTAVYYC hzl613F12 (VH2.1R80S) PA. .NGHT NYAQKFQ. GRVTMTSDTSSHTAYMELSRLRSDDTAVYYC hz!613F12 (VH2.IN66KR80S) PA. .NGHT KYAQKFQ. GRVTMTSDTSSHTAYMELSRLRSDDTAVYYC hzl613F12 (VH2.2) PA. .NGHT KYAQKFQ. GRV MTSDTSSHTAYMELSRLRSDDTAVYYC hzl613F12 (VH2.2M8 L) PA. .NGHT KYAQKFQ. GRVTMTSDTSSHTAYLELSRLRSDDTAVYYC hzl613F12 (VH2.3) PA. .NGHT KYAQKFQ. GRVTMTSDTSSWTAYMELSRLRSDDTAVYYC hz!613F12 (VH2.3W55R) PA. .NGHT KYAQKFQ. GRVTMTSDTSSNTAYMELSRLRSDDTAVYYC hzl613F12 (VH2.3Q3HW55R) PA. .NGHT KYAQKFQ. GRVTMTSDTSSMTAYMELSRLRSDDTAVYYC hzl613F12 (VH2.4) PA. .NGHT KYAQKFQ . GRVTMTSDTSSKTAYLELSRLRSDDTAVYYC hzI613F12 (VH3) PA. .NGHT KYGQKFQ . GRVTMTSDTSSMTAYLQLSRLRSDDTAVYYC CDR3-IMGT FR4-IMGT 1613F12VH ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTTLSVSS Homsap IGHJ5*01 WGQGTLVTVSS TLS 444 hzl613F12 (VH1) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS hz!613F12 (VH1M39I) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS hzl613F12 (VH1W55RN66K) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS hzl613F12 (VH1I84S) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS hzl613F12 (VH1SS5N) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS hz!613F12 (VH1I84NS85N) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS hzl613F12 (VH2.1) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS hz!613F12 (VH2.1Q3H) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS hz!613F12 (VH2. IW55R) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS hzl613F12 (VH2.1N66K) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS hz!613F12 (VH2.1W55RN66K) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS hzlól3F12 (VH2.1R80S) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS hzl613F12 (VH2.1N66KR80S) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS hzl613FI2 (VH2.2) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS hz!613F12 (VH2.2 M89L) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS hz!613F12 (VH2.3) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS zl613F12 (VH2.3W55R) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS zl613F12 (VH2.3Q3HW55R) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS hz-613F12 .4) WGQGTLVTVSS hzl613F12 (VH3) ARGAYYYGSSGLFYFDY WGQGTLVTVSS 13.2. Validación del hz613F12 contra el ml613F12 Para establecer si el 1613F12 humanizado fue comparable a su forma 1613F12 murina, se efectuaron experimentos de unión tanto por ELISA usando ensayos de proteina rhAxl-Fc y por FACS usando células SN12C. De manera complementaria, se efectuaron ensayos de citotoxicidad directa in vitro usando células tumorales renales humanas SN12C y la linea celular de carcinoma de pulmón humano Calu-1.
Primero fueron realizados los experimentos de ELISA. En el ensayo, fueron recubiertas placas de 96 pozos (Immulon II, Thermo Fisher) con 5 g/ml de la solución de 1613F12 en lx PBS, durante la noche a 4°C. Después de un paso de saturación, se incubó un intervalo de concentración de proteina rh Axl-Fc (R and D Systems, ref: 154-AL) (Calu-1 de 5 µg/ml a 0.02 g/ml) durante 1 hora a 37°C sobre las placas recubiertas. Para el paso de revelación, se agregó un anticuerpo de Axl biotinilado (un producto local) de 0.85 µg/ml durante 1 hora a 37°C. Ese anticuerpo de Axl pertenece a un grupo epitópico distinto. Entonces se agregó una solución de avidina-peroxidasa de rábano a 1/2000 en amortiguador diluyente a los pozos. Entonces es agregada la solución de sustrato T B durante 5 min. Después de la adición de la solución de interrupción de peroxidasa, se midió absorbancia a 405 nm con un lector de microplacas.
La Figura 12 muestra que ambos anticuerpos 1613F12 murinos y humanizados se unen de manera similar a la proteina rhAxl-Fc.
Para el análisis por FACS, las células SN12C fueron cultivadas en RPMI 1640 + L-glutamina 2 mM + 10% de suero. Las células fueron desprendidas usando tripsina y la concentración celular fue ajustada a 1 x 106 células/ml en amortiguador de FACS. Se incubó un volumen de 100 2 µ? de suspensión celular con concentraciones crecientes de controles de isotipo o anticuerpos anti-Axl durante 20 min a 4°C. Las células fueron entonces lavadas tres veces con amortiguador de FACS y e incubadas durante 20 min, la mayoría usando anticuerpo secundario anti-IgG de ratón Alexa488 o anticuerpo secundario anti-IgG humano Alexa488 a 4°C en la oscuridad. Las células fueron lavadas tres veces con amortiguador de FACS y resuspendidas con 100 µ? de amortiguador de FACS antes agregar yoduro de propidio.
Las células fueron incubadas con concentraciones crecientes de control de isotipo o anticuerpos anti-Axl. m613F12 corresponde al 1613F12 murino, cl613F12, corresponde al 1613F12 quimérico y el hzl613F12 corresponde al anticuerpo humanizado. Las CE50 fueron determinadas usando el software Prism.
Como se ilustra en la Figura 13, la' forma humanizada de 1613F12 unido a células SN12C con una CE50 equivalente a la de la forma quimérica y murina del 1613F12. Aquellos resultados indican que el hzl613F12 reconoció el antigeno de Axl con propiedades de unión similares al 1613F12 murino .
Los procedimientos experimentales del ensayo de citotoxicidad directa in vítro fueron descritos previamente en el Ejemplo 12. En el presente ejemplo, se prepararon cuatro inmunoconjugados de saporina: m9G4-saporina, ch9G4-saporina, 1613Fl2-saporina y hzl613Fl2-saporina y se probaron en dos modelos celulares (células tumorales renales SN12C humanas y células de carcinoma pulmonar Calu-1 humanas) .
La Figura 14 muestra que ambos controles de isotipo m9G4-saporina y ch9G4-saporina guardaron silencio, y que el anticuerpo 1613F12-saporina de Axl humanizado activa efectos citotóxicos similares sobre células SN12C que el inmunoconjugado de 1613F12-saporina de ratón.
La Figura 15 muestra que el inmunoconj ugado de 1613F12-saporina humanizado activa efectos citotóxicos similares sobre las células Calu-1 que el inmunoconj ugado 1613F12-saporina de ratón. En contraste, ambos controles de isotipo m9G4-saporina y ch9G4-saporina mostraron actividad débil (~10% de la citotoxicidad máxima) para concentraciones de anticuerpos superiores a 10" 9 M.
Ejemplo 14: Cinética de unión de 1613F12 al Axl ECD humano La medición de la afinidad de 1613F12 fue determinada entonces usando Biacore. De usó un Biacore X para medir la cinética de unión de 1613F12 sobre Axl ECD humano.
El instrumento basado en el fenómeno óptico de resonancia plasmódica superficial (SPR) usado por los sistemas Biacore permite la detección y medición de interacciones proteina-proteina en tiempo real, sin el uso de marcas.
De manera breve, los experimentos fueron realizaos usando un microcircuito integrado detector CM5 como el biosensor. Se inmovilizaron IgG de conejo sobre las células de flujo 1 y 2 (FC1 y FC2) de un microcircuito integrado detector CM5 a un nivel de 9300-10000 unidades de respuesta (RU) usando una química de acoplamiento de amina para capturar anticuerpos.
La unión es evaluada usando ciclos múltiples. Cada ciclo de medición es efectuado usando una velocidad de flujo de 30µ1/???? en amortiguador HBS-EP. Entonces, el anticuerpo de Axl a ser probado es capturado sobre un microcircuito integrado durante 1 min sobre FC2 únicamente para alcanzar un valor de captura media de 311.8 RU (DE = 5.1 RU) para el 1613F12. El analito (antígeno de Axl ECD) es inyectado comenzando en 200 nM y usando diluciones en serie de doble para medir ka y kd aproximadas en tiempo real.
Al final de cada ciclo, las superficies son regeneradas inyectando una solución de clorhidrato de glicina 10 mm pH 1.5 para eliminar los complejos anticuerpo-antigeno y el anticuerpo de captura también. La señal considerada corresponde a la diferencia de la señal observada entre FC1 y FC2 (FC2-FC1) . Las velocidades de asociación (ka) y las velocidades de disociación (kd) fueron calculadas usando un modelo de unión de Langmuir uno a uno. La constante de disociación en equilibrio (KD) es determinada como la relación de ka/kd. Los valores experimentales fueron analizados en el software Biaevaluation versión 3.0. Se efectuó un análisis ?2 para evaluar la exactitud de los datos .
Los datos se resumen en la siguiente Tabla 8.
Tabla 8 Para producir el dominio extracelular humano (ECD) de Axl, primero fueron clonados los ADNc humanos que codifican para el receptor de AXL soluble humano en un vector de expresión pCEP4 por PCR. El producto purificado fue entonces digerido con las enzimas de restricción HindIII y BamHI y ligado en el vector de expresión pCEP4 el cual ha sido precortado con las mismas enzimas. Finalmente, el plásmido recombinante identificado pCEP [AXL] His6 fue confirmado adicionalmente por secuenciamiento de ADN.
Las células adaptadas por suspensión HEK293E fueron cultivadas en medios Ex-cell 293 (SAFC Biosciences) con glutamina 4 mM. Todas las transfecciones fueron efectuadas usando polietilenamina (PEI) lineal de 25 kDa. Las células transfectadas fueron mantenidas a 37 °C en un agitador incubador con C02 al 5% y con agitación a 120 rpm durante 6 dias . Las células fueron recolectadas por centrifugación, y el sobrenadante que contenia la proteina marcada con His fue tratado para purificación sobre una columna de agarosa con Ni-NTA.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una proteina de unión de antigeno, o un fragmento de unión de antigeno de la misma, la cual: i) Se une específicamente a la proteína humana Axl, que tiene preferiblemente la secuencia SEQ ID NOS. 29 o 30 o una secuencia variante natural de la misma, y ii) Se incorpora después de su unión a la proteína Axl, caracterizándose la proteína de unión de antígeno porque comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos. 1 a 14 o 36 a 68.
2. La proteína de unión de antígeno, o un fragmento de unión de antígeno de la misma, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque se une específicamente a un epítope localizado en el dominio extracelular de la proteína humana Axl, que tiene preferiblemente la secuencia SEQ ID No. 31 o 32 o una secuencia variante natural de la misma.
3. La proteína de unión de antígeno, o un fragmento de unión de antígeno de la misma, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque induce una reducción de la FI de al menos 200.
4. La proteína de unión de antígeno, o un fragmento de unión de antígeno de la misma, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque consiste de un anticuerpo monoclonal.
5. La proteína de unión de antígeno, o un fragmento de unión de antigeno de la misma, caracterizada porque consiste de un anticuerpo, el anticuerpo comprende las tres CDRs de cadena ligera que comprenden las secuencias SEQ ID Nos. 1, 2 y 3; y las tres CDRs de cadena pesada que comprenden las secuencias SEQ ID Nos. 4, 5 y 6.
6. La proteína de unión de antígeno, o un fragmento de unión de antígeno de la misma, de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque comprende un dominio variable de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste de: i) un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEQ ID NO. 7 o cualquier secuencia que exhiba al menos 80% de identidad con la SEQ ID NO. 7, ii) un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEQ ID NO. 36 o cualquier secuencia que exhiba al menos 80% de identidad con la SEQ ID NO. 36; y iii) un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEQ ID NO. 37 a 47 o cualquier secuencia que exhiba al menos 80% de identidad con la SEQ ID NO. 37 a 47.
7. La proteína de unión de antígeno, o un fragmento de unión de antígeno de la misma, de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque comprende un dominio variable de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste de : i) un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEQ ID NO. 8 o cualquier secuencia que exhiba al menos 80% de identidad con la SEQ ID NO. 8, ii) un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEQ ID NO. 48 o cualquier secuencia que exhiba al menos 80% de identidad con la SEQ ID NO. 48; y iii) un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEQ ID NO. 49 a 68 o cualquier secuencia que exhiba al menos 80% de identidad con la SEQ ID NO. 49 a 68.
8. La proteina de unión de antigeno, o un fragmento de unión de antigeno de la misma, de conformidad con las reivindicaciones 5, 6 y 7 caracterizada porque comprende: i) un dominio variable de cadena ligera de las secuencias SEQ ID NO. 7, 36 o 37 a 47 o cualquier secuencia que exhiba al menos 80% de identidad con la SEQ ID NO.7, 36 o 37 a 47; y ii) un dominio variable de cadena pesada de las secuencias SEQ ID NO. 8, 48 ó 49 a 68 o cualquier secuencia que exhiba al menos 80% de identidad con la SEQ ID NO. 8, 48 o 49 a 68.
9. La proteina de unión de antigeno, de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque consiste del anticuerpo monoclonal 1613F12 derivado del hibridoma 1-4505 depositado en la CNCM, Instituto Pasteur, Francia, el 28 de Julio de 2011, o un fragmento de unión de antigeno de la misma .
10. El hibridoma murino 1-4505 depositado en la CNCM, Instituto Pasteur, Francia, el 28 de Julio de 2011, o un fragmento de unión de antigeno de la misma.
11. La proteina de unión de antigeno, o un fragmento de unión de antigeno de la misma, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para usarse como un producto selectivo para proporcionar un agente citotóxico en un sitio blanco anfitrión, consistiendo el sitio blanco anfitrión de un epitope localizado en el dominio extracelular de la proteina Axl, preferiblemente el dominio celular de la proteina Axl humana, preferiblemente el dominio extracelular de la proteina Axl humana que tiene las secuencias SEQ ID NO. 31 o 32 o una secuencia variante natural de la misma.
12. Un inmunoconjugado, caracterizado porque comprende la proteina de unión de antigeno, o un fragmento de unión de antigeno de la misma, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 11 conjugada a aun agente citotóxico.
13. El inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 12, para usarse en el tratamiento del cáncer.
14. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 13 y al menos un excipiente y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable.
MX2014005240A 2011-11-03 2012-11-05 Proteina de union de antigeno y su uso como producto dirigido para el tratamiento del cancer. MX2014005240A (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11306416.6A EP2589609A1 (en) 2011-11-03 2011-11-03 Antigen binding protein and its use as addressing product for the treatment of cancer
PCT/EP2012/071833 WO2013064685A1 (en) 2011-11-03 2012-11-05 Antigen binding protein and its use as addressing product for the treatment cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MX2014005240A true MX2014005240A (es) 2014-08-22

Family

ID=47116011

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2014005240A MX2014005240A (es) 2011-11-03 2012-11-05 Proteina de union de antigeno y su uso como producto dirigido para el tratamiento del cancer.
MX2014005244A MX2014005244A (es) 2011-11-03 2012-11-05 Proteina de enlace de antigeno y su uso como producto de direccionamiento para tratamiento del cancer.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2014005244A MX2014005244A (es) 2011-11-03 2012-11-05 Proteina de enlace de antigeno y su uso como producto de direccionamiento para tratamiento del cancer.

Country Status (18)

Country Link
US (3) US9689862B2 (es)
EP (3) EP2589609A1 (es)
JP (3) JP6345595B2 (es)
KR (2) KR102033805B1 (es)
CN (2) CN103998468B (es)
AU (3) AU2012331068A1 (es)
BR (2) BR112014010591A2 (es)
CA (2) CA2851941C (es)
HK (2) HK1197073A1 (es)
IL (1) IL232342B (es)
MA (1) MA35659B1 (es)
MX (2) MX2014005240A (es)
MY (1) MY174259A (es)
RU (2) RU2650771C1 (es)
TN (1) TN2014000148A1 (es)
UA (1) UA119226C2 (es)
WO (2) WO2013064685A1 (es)
ZA (1) ZA201403141B (es)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2589609A1 (en) 2011-11-03 2013-05-08 Pierre Fabre Medicament Antigen binding protein and its use as addressing product for the treatment of cancer
EP2888283B1 (en) 2012-08-24 2018-09-19 The Regents of The University of California Antibodies and vaccines for use in treating ror1 cancers and inhibiting metastasis
CN104955842B (zh) * 2012-11-05 2018-04-10 皮埃尔法布雷医药公司 抗原结合蛋白及其作为定位产品用于治疗癌症的用途
WO2015013579A1 (en) 2013-07-26 2015-01-29 Update Pharma Inc. Compositions to improve the therapeutic benefit of bisantrene
SI3134125T1 (sl) * 2014-04-25 2020-02-28 Pierre Fabre Medicament Konjugat zdravila s protitelesom in uporaba le-tega za zdravljenje raka
GB201410825D0 (en) 2014-06-18 2014-07-30 Bergenbio As Anti-axl antibodies
GB201410826D0 (en) 2014-06-18 2014-07-30 Bergenbio As Anti-axl antibodies
IL296633A (en) 2014-07-11 2022-11-01 Genmab As Antibodies that bind axl
WO2016091891A1 (en) * 2014-12-09 2016-06-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Human monoclonal antibodies against axl
AU2015366213B2 (en) * 2014-12-18 2021-10-07 Bergenbio Asa Anti-Axl antagonistic antibodies
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
ME03772B (me) 2015-07-10 2021-04-20 Genmab As Konjugati antitijela specifičnog za axl i lijeka za liječenje kancera
US9669106B2 (en) 2015-10-26 2017-06-06 Pierre Fabre Medicament Conjugate of monomethyl auristatin F and trastuzumab and its use for the treatment of cancer
EP3402465B1 (en) 2016-01-13 2024-03-13 Genmab A/S Formulation for antibody and drug conjugate thereof
WO2017165734A1 (en) * 2016-03-25 2017-09-28 Genentech, Inc. Multiplexed total antibody and antibody-conjugated drug quantification assay
EP3458482A4 (en) 2016-05-20 2020-01-15 Agency for Science, Technology and Research ANTI-AXL TYROSINE KINASEPEPTOR ANTIBODIES AND USES THEREOF
GB201610902D0 (en) 2016-06-22 2016-08-03 Bergen Teknologioverforing As And Bergenbio As Anti-Axl Antagonistic Antibodies
WO2018005519A2 (en) 2016-06-27 2018-01-04 The Regents Of The University Of California Cancer treatment combinations
KR101909955B1 (ko) * 2016-11-28 2018-10-19 재단법인 목암생명과학연구소 신규 항-에이엑스엘 항체 및 이를 포함하는 약학적 조성물
CN108456251A (zh) * 2017-02-21 2018-08-28 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗pd-l1抗体及其应用
EP3454063B1 (de) * 2017-09-06 2022-05-18 AVA Lifescience GmbH Durchflusszytometrie-messverfahren
CN112218895A (zh) 2018-04-10 2021-01-12 健玛保 用于癌症治疗的axl特异性抗体
CN110540592B (zh) 2018-05-29 2022-08-09 杭州尚健生物技术有限公司 结合axl蛋白的抗体及其应用
US20220273809A1 (en) 2019-07-19 2022-09-01 Genmab A/S Axl antibody-drug conjugates for use in treating cancer
GB201912059D0 (en) 2019-08-22 2019-10-09 Bergenbio As Combaination therapy of a patient subgroup
CN110448557A (zh) * 2019-09-05 2019-11-15 黄筱茜 抗凝血药达比加群酯的新药用途
EP4037717A1 (en) * 2019-10-04 2022-08-10 Seagen Inc. Camptothecin peptide conjugates
CN110982791A (zh) * 2019-12-26 2020-04-10 百泰生物药业有限公司 一种分泌axl抗体的杂交瘤细胞的制备筛选方法
GB202004189D0 (en) 2020-03-23 2020-05-06 Bergenbio As Combination therapy
WO2021204713A1 (en) 2020-04-08 2021-10-14 Bergenbio Asa Axl inhibitors for antiviral therapy
GB202006072D0 (en) 2020-04-24 2020-06-10 Bergenbio Asa Method of selecting patients for treatment with cmbination therapy
CN112194726B (zh) * 2020-09-02 2023-06-23 沣潮医药科技（上海）有限公司 用于病理性蛋白聚集物清除的嵌合抗原受体及其应用
GB202104037D0 (en) 2021-03-23 2021-05-05 Bergenbio Asa Combination therapy
CN113444180B (zh) * 2021-06-16 2023-03-31 上海鑫湾生物科技有限公司 靶向axl蛋白的抗体及其抗原结合片段、其制备方法和应用

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4970198A (en) 1985-10-17 1990-11-13 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US5079233A (en) 1987-01-30 1992-01-07 American Cyanamid Company N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics, composition and methods for using the same
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
GB8924581D0 (en) 1989-11-01 1989-12-20 Pa Consulting Services Bleaching of hair
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US20110045005A1 (en) * 2001-10-19 2011-02-24 Craig Crowley Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
US20040202666A1 (en) 2003-01-24 2004-10-14 Immunomedics, Inc. Anti-cancer anthracycline drug-antibody conjugates
JP4462964B2 (ja) * 2003-03-10 2010-05-12 第一三共株式会社 癌特異的抗原を標的とした抗体
EP2286844A3 (en) * 2004-06-01 2012-08-22 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
US8084576B2 (en) 2004-12-21 2011-12-27 Viventia Biotechnologies Inc. Cancer associated glucose transporter 8 variant
AR064610A1 (es) * 2006-12-22 2009-04-15 Schering Corp Anticuerpos contra el cd200r
AU2008272330A1 (en) * 2007-07-04 2009-01-08 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Anti-Muc17 antibody
CN101939336B (zh) * 2007-11-12 2014-05-14 U3制药有限公司 Axl抗体
JP5554993B2 (ja) * 2007-11-15 2014-07-23 中外製薬株式会社 Ａｎｅｘｅｌｅｋｔｏに結合するモノクローナル抗体、およびその利用
EP2238169A1 (en) 2007-12-26 2010-10-13 Biotest AG Method of decreasing cytotoxic side-effects and improving efficacy of immunoconjugates
WO2010014755A1 (en) * 2008-07-29 2010-02-04 The Regents Of The University Of Colorado Methods and compounds for enhancing anti-cancer therapy
US8841424B2 (en) * 2009-05-11 2014-09-23 U3 Pharma Gmbh Humanized AXL antibodies
EP2270053A1 (en) * 2009-05-11 2011-01-05 U3 Pharma GmbH Humanized AXL antibodies
TW201106972A (en) * 2009-07-27 2011-03-01 Genentech Inc Combination treatments
US20120282173A1 (en) 2009-08-17 2012-11-08 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising anti-hb-egf antibody as active ingredient
US8926976B2 (en) * 2009-09-25 2015-01-06 Xoma Technology Ltd. Modulators
EP3241840B1 (en) * 2010-01-22 2022-07-27 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Inhibition of axl signaling in anti-metastatic therapy
US9249228B2 (en) * 2011-06-22 2016-02-02 Oribase Pharma Anti-Axl antibodies and uses thereof
EP2589609A1 (en) * 2011-11-03 2013-05-08 Pierre Fabre Medicament Antigen binding protein and its use as addressing product for the treatment of cancer
US20160106861A1 (en) * 2013-04-26 2016-04-21 Spirogen Sarl Axl antibody-drug conjugate and its use for the treatment of cancer

Also Published As

Publication number Publication date
CA2851941A1 (en) 2013-05-10
WO2013064685A1 (en) 2013-05-10
MX2014005244A (es) 2015-03-23
US9173962B2 (en) 2015-11-03
JP2015504302A (ja) 2015-02-12
CN103998468A (zh) 2014-08-20
CN104039829B (zh) 2021-01-08
IL232342A0 (en) 2014-06-30
HK1199460A1 (en) 2015-07-03
EP2773663A1 (en) 2014-09-10
JP6685270B2 (ja) 2020-04-22
WO2013064684A1 (en) 2013-05-10
BR112014010383B1 (pt) 2022-02-01
US9689862B2 (en) 2017-06-27
KR102089114B1 (ko) 2020-04-14
US20160131639A1 (en) 2016-05-12
KR20140091035A (ko) 2014-07-18
RU2014120629A (ru) 2015-12-10
KR20140094589A (ko) 2014-07-30
MA35659B1 (fr) 2014-11-01
NZ624989A (en) 2016-08-26
RU2650771C1 (ru) 2018-04-17
TN2014000148A1 (en) 2015-09-30
ZA201403141B (en) 2015-04-29
JP2014532687A (ja) 2014-12-08
US20150037340A1 (en) 2015-02-05
AU2012331069A1 (en) 2014-06-05
JP6345595B2 (ja) 2018-06-20
UA119226C2 (uk) 2019-05-27
IL232342B (en) 2021-03-25
AU2012331069B2 (en) 2017-01-05
CN103998468B (zh) 2017-04-19
BR112014010591A2 (pt) 2017-05-02
EP2773666A1 (en) 2014-09-10
AU2012331068A1 (en) 2014-05-22
JP2018052970A (ja) 2018-04-05
US20140141023A1 (en) 2014-05-22
CN104039829A (zh) 2014-09-10
CA2854126A1 (en) 2013-05-10
AU2017219091B2 (en) 2019-05-02
BR112014010383A2 (pt) 2017-04-25
AU2017219091A1 (en) 2017-09-21
EP2589609A1 (en) 2013-05-08
KR102033805B1 (ko) 2019-10-17
CA2851941C (en) 2021-01-12
US10161930B2 (en) 2018-12-25
HK1197073A1 (en) 2015-01-02
RU2659094C2 (ru) 2018-06-28
MY174259A (en) 2020-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6685270B2 (ja) 抗原結合タンパク質および癌の治療のためのアドレッシング産物としてのその使用
EP2914630B1 (en) Novel antigen binding proteins and their use as addressing product for the treatment of cancer
OA16895A (en) Antigen binding protein and its use as addressing product for the treatment of cancer.
NZ624989B2 (en) Antigen binding protein and its use as addressing product for the treatment cancer

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration