JP6345595B2 - 抗原結合タンパク質および癌の治療のためのアドレッシング産物としてのその使用 - Google Patents

抗原結合タンパク質および癌の治療のためのアドレッシング産物としてのその使用 Download PDF

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Description

本発明は、タンパク質Ａｘｌと特異的に結合することができる、新規な抗原結合タンパク質、特に、モノクローナル抗体、ならびに前記タンパク質をコードするアミノ酸配列および核酸配列に関する。一態様から、本発明は、Ａｘｌと特異的に結合することができ、Ａｘｌのインターナリゼーションを誘導することにより細胞にインターナライズされ得る新規な抗原結合タンパク質またはその抗原結合フラグメントに関する。本発明はまた、毒素、放射性元素または薬物などの他の抗癌化合物とのコンジュゲーションにおけるアドレッシング産物（指定部位送達産物：addressing product）としての前記抗原結合タンパク質の使用、およびある種の癌の治療のためのその使用も含んでなる。
「Ａｘｌ」（「Ｕｆｏ」、「Ａｒｋ」または「Ｔｙｒｏ７」とも呼ばれる）は、慢性骨髄性白血病患者から、マウスＮＩＨ３Ｔ３により過剰発現された際に形質転換を誘発する癌遺伝子としてクローニングされた。Ａｘｌは、ＴＡＭ（Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、Ｍｅｒ）ファミリーと呼ばれる受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の一ファミリーに属し、Ｔｙｒｏ３（Ｒｓｅ、Ｓｋｙ、Ｄｔｋ、Ｅｔｋ、Ｂｒｔ、Ｔｉｆ）、Ａｘｌ、およびＭｅｒ（Ｅｙｋ、Ｎｙｋ、Ｔｙｒｏ−１２）を含む[Lemke G. Nat. Rev. Immunol. (2008).8. 327-336]。
ヒトタンパク質Ａｘｌは、アミノ酸８９４個のタンパク質であり、その配列は配列表に配列番号２９として示されている。アミノ酸１〜２５はシグナルペプチドに相当し、このペプチドシグナルを含まないヒトタンパク質Ａｘｌは、配列表に配列番号３０として示されている。
当初は成長停止特異的遺伝子として単離されたＧａｓ６は、ＴＡＭファミリーのメンバーに共通リガンドである[Varnum B.C. et al. Nature (1995).373, 623-626]。Ｇａｓ６は、Ａｘｌに対して最大の親和性を示し、次にＴｙｒｏ３、最後にＭｅｒが続く[Nagata K. et al. J. Biol. Chem. (1996).271, 30022-30027]。Ｇａｓ６は、リン脂質膜との結合を仲介するγ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）リッチドメイン、４つの上皮細胞増殖因子様ドメイン、および２つのラミニンＧ様（ＬＧ）ドメインからなる[Manfioletti G., Brancolini,C., Avanzi,G. & Schneider,C. Mol. Cell Biol. (1993).13, 4976-4985]。多くの他のＲＴＫと同様、リガンドの結合は、受容体の二量体形成、および様々な細胞内シグナル伝達分子のドッキング部位として働くチロシン残基（受容体Ａｘｌに対しては、チロシン残基７７９、８２１および８６６）の自己リン酸化をもたらす[Linger R.M. Adv. Cancer Res. (2008).100, 35-83]。さらに、Ａｘｌ受容体は、リガンド依存性のプロセスを介しても活性化され得る。この活性化は、Ａｘｌ受容体が過剰発現される場合に起こり得る。
Ｇａｓ６／Ａｘｌシグナル伝達は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで多様な細胞において、細胞の増殖、接着、移動および生存を含む様々な細胞プロセスを調節することが示されている[Hafizi S. & Dahlback,B. FEBS J. (2006).273, 5231-5244]。さらに、ＴＡＭ受容体は先天免疫の制御に関与し、樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージにおいて病原体に対する炎症性応答を阻害する。また、ＴＡＭ受容体は、これらの免疫細胞によるアポトーシス細胞の食作用も駆動し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の成熟および殺生活性に必要とされる[Lemke G. Nat. Rev. Immunol. (2008).8, 327-336]。
Ｇａｓ６／Ａｘｌ系は、通常の細胞では発現は弱いが、主として線維芽細胞、骨髄前駆細胞、マクロファージ、神経系組織、心筋および骨格筋に見られ、そこで主要には細胞の生存を助ける。Ｇａｓ６／Ａｘｌ系は、血管平滑筋細胞のホメオスタシスを調節することにより血管生物学に重要な役割を果たしている[Korshunov V.A., Mohan, A.M., Georger, M.A. & Berk, B.C. Circ. Res. (2006).98, 1446-1452; Korshunov V.A., Daul, M., Massett, M.P. & Berk, B.C. Hypertension (2007).50, 1057-1062]。
腫瘍細胞では、Ａｘｌは、細胞の浸潤および移動の調節に重要な役割を果たしている。Ａｘｌの過剰発現は、予後の悪さに関連しているだけでなく、乳癌、結腸癌、食道癌、肝細胞癌、胃癌、神経膠腫、肺癌、黒色腫、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、横紋筋肉腫、腎臓癌、甲状腺癌および子宮内膜癌で報告されているように、様々なヒト癌の浸潤性の増長にも関連している[総説としてLinger R.M. Adv. Cancer Res. (2008).100, 35-83およびVerma A. Mol. Cancer Ther. (2011).10, 1763-1773]。乳癌では、Ａｘｌは、上皮間葉移行（ＥＭＴ）の強力なエフェクターであると思われ；ＥＭＴプログラムは、その生物において癌細胞の移動および転移に積極的に寄与している[Thiery J.P. Curr. Opin. Cell Biol. (2003).15, 740-746]。
また、Ａｘｌは、血管新生を調節することも示されている。実際に、内皮細胞におけるＡｘｌのノックダウンは、管の形成および移動に障害を来すとともに[Holland S.J. et al. Cancer Res. (2005).65, 9294-9303]、特定の血管新生シグナル伝達経路を妨げた[Li Y. et al. Oncogene (2009).28, 3442-3455]。
もっと最近では、ある範囲の細胞モデルに対して、薬剤耐性現象におけるＡｘｌ過剰発現の関与を記載している研究がいくつかある。下表１にこれらの研究をまとめる。
上記表１に挙げた完全な出典：
Macleod, K. et al. Cancer Res. (2005).65, 6789-6800
Mahadevan D. et al. Oncogene (2007).26, 3909-3919
Lay J.D. et al. Cancer Res. (2007).67, 3878-3887
Hong C.C. et al. Cancer Lett. (2008).268, 314-324
Liu L. et al. Cancer Res. (2009).69, 6871-6878
Keating A.K. et al. Mol. Cancer Ther. (2010).9, 1298-1307
Ye X. et al. Oncogene (2010).29, 5254-5264
このような文脈では、Ａｘｌ ＲＴＫは、腫瘍学において興味深い標的と考えられる。いくつかのグループが、すでに、裸のモノクローナル抗体または標的化小分子を用いて、このｇａｓ６／Ａｘｌ軸を標的とする抗腫瘍戦略を開発している[Verma A. Mol. Cancer Ther. (2011).10, 1763-1773]。
第一の実施形態では、本発明は、ｉ）ヒトタンパク質Ａｘｌと特異的に結合し、かつ、ｉｉ）その前記ヒトタンパク質Ａｘｌとの結合の後にインターナライズされる、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントに関する。
より一般的には、本発明は、その前記標的Ａｘｌとの結合の後にインターナライズされ得る抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントの選択のための、タンパク質Ａｘｌの使用に関する。より詳しくは、前記標的は、Ａｘｌの細胞外ドメインである。
従って、この特定の態様では、本発明は、哺乳動物細胞に目的分子を送達またはインターナライズすることができる化合物またはその結合フラグメントをスクリーニングするｉｎ ｖｉｔｒｏの方法を対象とし、前記目的分子は前記化合物に共有結合され、前記方法は、以下の工程：
ａ）Ａｘｌタンパク質、またはその細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、またはそのエピトープと特異的に結合することができる化合物を選択すること；
ｂ）場合により、前記目的分子または対照分子を、工程ａ）で選択された前記化合物と共有結合させて複合体を形成してもよく；
ｃ）工程ａ）で選択された前記化合物、または工程ｂ）で得られた前記複合体を、その表面でＡｘｌタンパク質またはその機能的フラグメントを発現する哺乳動物細胞、好ましくは、生細胞と接触させること；
ｄ）前記化合物または前記目的分子または前記複合体が前記哺乳動物細胞に細胞内送達またはインターナライズされたかどうかを決定する工程；および
ｅ）前記化合物を生哺乳動物細胞に目的分子を送達またはインターナライズすることができる化合物として選択する工程
を含んでなる。
好ましい実施形態では、目的分子を生哺乳動物細胞に送達またはインターナライズすることができる前記化合物は、タンパク質（本明細書ではポリペプチドまたはペプチドとも呼ばれる）またはペプチド構造、特に、少なくとも５、１０、１５またはそれを超えるアミノ酸残基のアミノ酸配列、を含んでなるタンパク質様化合物であり、前記アミノ酸残基はグリコシル化することができる。
目的分子を生哺乳動物細胞に送達またはインターナライズすることができる前記化合物がタンパク質またはタンパク質様化合物である場合、前記化合物は、本明細書では、「抗原結合タンパク質」とも呼ばれ、前記抗原結合タンパク質またはその結合フラグメントは、
ｉ）タンパク質Ａｘｌ、好ましくは、ヒトＡｘｌタンパク質と特異的に結合することができ、かつ、
ｉｉ）前記Ａｘｌタンパク質が前記哺乳動物細胞の表面で発現された際に、その前記タンパク質Ａｘｌとの結合の後に、哺乳動物細胞にインターナライズされ得る。
好ましい実施形態では、前記哺乳動物生細胞は、ヒト細胞、好ましくは、Ａｘｌタンパク質受容体を天然に発現する細胞である。
特定の実施形態では、工程ｃ）の哺乳動物生細胞は、それらの表面で組換えＡｘｌタンパク質を発現する哺乳動物細胞である。
これもまた好ましい実施形態において、前記目的分子は、細胞傷害性分子（本明細書では細胞傷害性薬剤または細胞増殖抑制剤とも呼ばれる）である。
これもまた好ましい実施形態において、前記目的分子は、リンカー、より好ましくは、ペプチドリンカー、より好ましくは、切断可能なペプチドリンカー、より好ましくは、哺乳動物細胞に、特に、前記哺乳動物細胞のサイトゾルに含まれる天然の細胞内化合物により切断され得るリンカーを用いて、Ａｘｌタンパク質と結合することができる前記化合物に共有結合される。
これもまた好ましい実施形態において、Ａｘｌタンパク質と結合することができる前記化合物は抗体、またはその機能的結合フラグメント、Ａｘｌタンパク質に、またはＡｘｌ ＥＤＣドメインに位置するそのエピトープに特異的に向けられている。
ｅ）の選択工程は、細胞内送達またはインターナリゼーションの評価に関して当業者に知られているいずれの方法によっても具現化することができる。Ａｘｌタンパク質と特異的に結合することができる前記化合物の、または前記化合物と前記目的分子によって形成される前記複合体の、または前記化合物と共有結合されている前記目的分子の、存在、不在、または活性を証明または評価することができるアッセイまたは試験は当業者に周知である（以下に開示されるこのような試験またはアッセイのいくつかの例を参照。ただし、これらの試験は以下の試験例に限定されない）。
より詳しくは、これらの試験またはアッセイは、ＦＡＣＳ、免疫蛍光、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、細胞傷害性／細胞増殖抑制性評価などによって具現化することができる。
この態様では、本発明はまた、細胞傷害性化合物を哺乳動物細胞、好ましくは、生細胞に送達することができる細胞傷害性または細胞増殖抑制性複合体を製造するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法も対象とし、前記方法は、
細胞傷害性薬剤を、
ｉ）Ａｘｌタンパク質、好ましくは、ヒトＡｘｌタンパク質と特異的に結合することができ、かつ、
ｉｉ）前記Ａｘｌタンパク質が前記哺乳動物細胞の表面で発現された場合に、その前記タンパク質Ａｘｌとの結合の後に、哺乳動物細胞にインターナライズされる
化合物に共有結合させる工程を含んでなる。
好ましくは、前記化合物は、タンパク質様タンパク質、より好ましくは、Ａｘｌタンパク質に、またはＡｘｌ ＥＤＣドメインに位置するそのエピトープに特異的に向けられた抗体、または前記抗体の機能的結合フラグメントである。
好ましい実施形態では、前記細胞傷害性薬剤は、前記抗Ａｘｌ抗体またはその機能的フラグメントに、リンカー、より好ましくは、ペプチドリンカー、より好ましくは、切断可能なペプチドリンカー、より好ましくは、限定されない例として天然の細胞内化合物により切断され得るリンカーを用いて共有結合される。
発明の具体的な説明
ＴＡＭファミリーの他のメンバーと同様に、Ａｘｌ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は細胞接着分子の細胞外ドメインと近接した構成を有する。Ａｘｌ ＥＣＤは、２つの疫グロブリン様ドメインの次に２つの隣接するフィブロネクチンＩＩＩ型様ドメインがくる組合せを特徴とする[O'Bryan J.P. et al. Mol. Cell Biol. (1991).11, 5016-5031]。この２つのＮ末端免疫グロブリン様ドメインは、Ｇａｓ６リガンド結合に十分なものである[Sasaki T. et al. EMBO J. (2006).25, 80-87]。
ヒトタンパク質ＡｘｌのＥＣＤは、配列番号２９の配列のアミノ酸１〜４５１に相当するアミノ酸４５１個のフラグメントであり、その配列は配列表に配列番号３１として示されている。アミノ酸１〜２５はシグナルペプチドに相当し、このシグナルペプチドを含まないヒトタンパク質ＡｘｌのＥＣＤは、配列番号２９の配列のアミノ酸２６〜４５１に相当し、配列番号３２の配列により示される。
これまでに、種々のインターナリゼーション様式が確認されている。これらのインターナリゼーション様式は、細胞内におけるインターナライズされたタンパク質またはタンパク質複合体の移行を方向付ける(They orientate the becoming the internalized proteins or proteic complex in the cell.)。エンドサイトーシス後、ほとんどの膜タンパク質または脂質は細胞表面に戻るが（リサイクリング）、一部の膜成分は後期エンドソームまたはゴルジに送達される[Maxfield F.R. & McGraw, T.E. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. (2004).5, 121-132]。
好ましい実施形態では、本発明は、ｉ）ヒトタンパク質Ａｘｌと特異的に結合し、かつ、ｉｉ）その前記ヒトタンパク質Ａｘｌとの結合の後に、インターナライズされ、配列番号１〜１４、または配列番号１〜１４と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列からなる群から選択される少なくとも１種類のアミノ酸配列を含んでなる、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントに関する。
最も好ましい実施形態では、本発明は、
ｉ）好ましくは配列番号２９もしくは３０の配列を有するヒトタンパク質Ａｘｌまたはその天然変異体配列と特異的に結合し、かつ、
ｉｉ）その前記ヒトタンパク質Ａｘｌとの結合の後にインターナライズされ、
配列番号１〜１４からなる群から選択される少なくとも１種類のアミノ酸配列を含んでなる抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントに関する。
「結合タンパク質」または「抗原結合タンパク質」とは、別のタンパク質または分子（一般に抗原と呼ばれる）と特異的または全般的な親和性を有するペプチド鎖である。タンパク質を接触させると、結合が可能であれば、複合体を形成する。本発明の抗原結合タンパク質は、限定されるものではないが、好ましくは、抗体、抗体のフラグメントもしくは誘導体、タンパク質またはペプチドであり得る。
本発明によれば、抗原結合タンパク質の「抗原結合フラグメント」とは、抗原結合タンパク質の標的（一般に抗原とも呼ばれる）と特異的に結合する能力を保持し、かつ、抗原結合タンパク質のアミノ酸配列の、少なくとも５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続するアミノ酸残基(amino acid resiudes)、少なくとも７０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基、または少なくとも２５０個の連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含んでなる、任意のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を示すものとする。
抗原結合タンパク質が抗体である好ましい実施形態では、このような「抗原結合フラグメント」は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは一本鎖を表す）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメントもしくはダイアボディー、またはその半減期がポリ（アルキレン）グリコール、例えば、ポリ（エチレン）グリコール（「ペグ化」）（ペグ化フラグメントはＦｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧまたはＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれる）（「ＰＥＧ」はポリ（エチレン）グリコールを表す）などの化学修飾によるか、またはリポソームへの封入によって延長されたと考えられる任意のフラグメントからなる群から選択され、前記フラグメントは、本発明による抗体の特徴的なＣＤＲのうち少なくとも１つを有する。好ましくは、前記「抗原結合フラグメント」は、それらが由来する抗体の可変重鎖または軽鎖の部分配列からなるか、またはそれを含んでなると考えられ、前記部分配列は、それが由来する抗体と同じ結合特異性と、標的に対して十分な親和性、好ましくは、それが由来する抗体の親和性の少なくとも１／１００、より好ましくは、少なくとも１／１０に相当する親和性とを保持するのに十分なものである。このような機能的フラグメントは、それが由来する抗体の配列の、最低５個のアミノ酸、好ましくは、１０、１５、２５、５０および１００個の連続するアミノ酸を含むと考えられる。
用語「エピトープ」は、抗体を含む抗原結合タンパク質により結合される抗原の領域である。エピトープは、構造的または機能的と定義することができる。機能的エピトープは一般に、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を持つ。エピトープはまた、コンフォメーション的でもあり得、すなわち、非直鎖アミノ酸から構成される。特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの化学的に活性な分子の表面群である決定基を含み得、特定の実施形態では、特定の三次元構造の特徴および／または特定の電荷特徴を持ち得る。
本出願では、エピトープは、ヒトタンパク質Ａｘｌの細胞外ドメインに位置する。
本発明の好ましい実施形態によれば、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、ヒトタンパク質Ａｘｌ細胞外ドメインに位置し、好ましくは、配列番号３１もしくは３２の配列またはその天然変異体配列を有するエピトープと特異的に結合する。
「特異的に結合すること」および「特異的に結合する」などは、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントが、抗原と生理学的条件下で比較的安定な複合体を形成することを意図する。特異的結合は、少なくとも約１×１０−６Ｍ以下の平衡解離定数を特徴とし得る。２つの分子が特異的に結合するかどうかを決定するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などが含まれる。疑念を避けるため、この用語は、前記抗原結合フラグメントが別の抗原と低レベルで、結合または干渉できないことを意味するものではない。しかしながらやはり、好ましい実施形態として、前記抗原結合フラグメントは前記抗原とのみ結合する。
この意味で、「ＥＣ５０」は、５０％効果濃度を意味する。より厳密には、この５０％効果濃度（ＥＣ５０）という用語は、ある特定の暴露時間の後にベースラインと最大値の半分の反応を誘導する薬物、抗体または毒物の濃度に相当する。これは薬物の効力の尺度として慣用されている。従って、計量的（graded）用量反応曲線のＥＣ５０は、その最大効果の５０％が見られる化合物の濃度を表す。素量的（quantal）用量反応曲線のＥＣ５０は、特定の暴露期間の後に、その集団の５０％が反応を示す化合物の濃度を表す。濃度の尺度は一般に、比較的小さい濃度変化で急速に増加するＳ字曲線をたどる。これはベストフィット曲線の微分によって数学的に求めることができる。
好ましい実施形態として、本発明で決定されたＥＣ５０は、ヒト腫瘍細胞上に露出しているＡｘｌ ＥＣＤに対する抗体結合の抗力を特徴付けた。ＥＣ５０パラメーターは、ＦＡＣＳ分析を用いて決定される。ＥＣ５０パラメーターは、ヒト腫瘍細胞上で発現されたヒトＡｘｌに対して最大結合の５０％が見られる抗体濃度を表す。各ＥＣ５０値は、４パラメーター回帰曲線フィッティングプログラム（Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて用量反応曲線の中点として計算した。このパラメーターは、生理的状態／病的状態の代表例として選択されたものである。
本発明の一実施形態では、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、そのエピトープと、少なくとも１０−９Ｍ、優先的には１０−９〜１０−１２Ｍの間のＥＣ５０で結合する。
本発明の別の実施形態は、哺乳動物細胞、好ましくは、ヒト細胞、好ましくは、生細胞に、細胞内にインターナライズされ得る抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントを選択するためのプロセスまたは方法であり、
ｉ）Ａｘｌ、好ましくは、そのＥＤＣドメインまたはそのエピトープと、特異的に結合する抗原結合タンパク質を選択する工程、および
ｉｉ）哺乳動物細胞の表面で発現されたＡｘｌタンパク質とのそれらの結合の後に、前記哺乳動物細胞にインターナライズされる、前記工程ｉ）から得られた前記抗原結合タンパク質を選択する工程
を含んでなる。
特定の実施形態では、前記哺乳動物細胞は、それらの表面でＡｘｌタンパク質受容体を天然に発現するか、またはそれらの表面で組換えＡｘｌタンパク質を発現する哺乳動物細胞、好ましくは、ヒト細胞である。
このような方法またはプロセスは、ｉ）Ａｘｌと少なくとも１０−９ＭのＥＣ５０で特異的に結合する抗原結合タンパク質を選択する工程、およびｉｉ）それらのＡｘｌとの結合の後にインターナライズされる、前記工程から得られた抗原結合タンパク質を選択する工程を含んでなり得る。ｉｉ）の選択工程は、インターナリゼーションの評価に関して当業者に知られているいずれの方法によっても具現化することができる。より詳しくは、試験は、ＦＡＣＳ、免疫蛍光、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、細胞傷害性評価などによって具現化することができる。
本発明による抗原結合タンパク質のもう一つの特徴は、腫瘍細胞の増殖に対していずれの顕著な活性も持たないということである。より詳しくは、以下の例で示されるように、本発明による抗原結合タンパク質は、増殖ＳＮ１２Ｃモデルに対していずれの顕著なｉｎ ｖｉｔｒｏ活性も持たない。
腫瘍学において、ｍＡｂが治療効力を発揮し得る機構は複数存在するが、それらの活性は持続的利益をもたらすには十分でない。従って、特に化学療法薬としての薬物とそれらを組み合わせることでそれらの活性を増強するためにいくつかの戦略が採られてきた。組合せプロトコールに対する有効な代替法として、免疫毒素が癌を治療するための新規な治療選択肢となる[Beck A. et al. Discov. Med. (2010).10, 329-339; Alley S.C. et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. (2009).330, 932-938]。抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）は、ｍＡｂの特異性を利用し、かつ、細胞傷害性薬剤の送達を腫瘍に標的化する能力がｍＡｂ活性と薬物活性の両方を著しく増強し得る一つのアプローチである。ｍＡｂは抗原と特異的に結合し、腫瘍細胞では実質的発現を伴うが、正常な細胞では発現が限定されることが理想的である。
本発明は、特異的抗Ａｘｌ結合タンパク質、より詳しくは、Ａｘｌ結合の後にインターナライズされる高い能力を示す特異的抗Ａｘｌ抗体を対象とする。このような抗原結合タンパク質は、免疫−薬物複合体成分の一つとして注目され、従って、それは連結された細胞傷害薬を標的癌細胞に届ける。一度インターナライズされると、細胞傷害薬は癌細胞の死を誘発する。
免疫複合体療法で成功するための重要な鍵は、標的抗原特異性と、抗原結合タンパク質複合体の癌細胞へのインターナリゼーションであると思われる。明らかに、非インターナライズ性の抗原は、インターナライズ性の抗原よりも細胞傷害性薬剤を送達する効果が低い。インターナリゼーションプロセスは抗原間で異なり、結合タンパク質により影響を受け得る複数のパラメーターに依存する。細胞表面ＲＴＫは、このようなアプローチを検討するために注目される抗原ファミリーを構成する。
生体分子では、細胞傷害薬は細胞傷害活性をもたらし、使用する抗原結合タンパク質は癌細胞に対するその特異性をもたらすとともに、細胞傷害薬を適切に届けるために細胞内に入れるためのベクターとなる。
よって、免疫複合体分子を改良するためには、担体結合タンパク質は、標的癌細胞への高いインターナライズ能を示さなければならない。結合タンパク質がインターナリゼーションを媒介した効率は、標的エピトープによって有意に異なる。強力なインターナライズ性抗Ａｘｌ結合タンパク質の選択には、Ａｘｌのダウンレギュレーションを研究するだけでなく、細胞内に入る抗Ａｘｌ結合タンパク質を追跡する様々な実験データが必要である。
好ましい実施形態では、本発明による抗原結合タンパク質のインターナリゼーションが、好ましくは、免疫蛍光（本出願の下記に例示される）または当業者インターナリゼーション機構を専門とする当業者に知られているいずれかの方法またはプロセスによって評価することができる。
別の好ましい実施形態では、本発明によるＡｘｌ−抗原結合タンパク質複合体は、本発明の結合タンパク質が前記ＡｘｌのＥＣＤに結合した後にインターナライズされるので、細胞表面のＡｘｌ量の減少が引き起こされる。この減少は、当業者に知られているいずれの方法（ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ、免疫蛍光など）によっても定量することができる。
本発明の実施形態では、この減少（従ってインターナリゼーションを反映する）は、好ましくはＦＡＣＳにより測定し、非処理細胞で測定された平均蛍光強度（ＭＦＩ）と、本発明による抗原結合タンパク質で処理した細胞で測定されたＭＦＩとの間の差すなわちΔ（デルタ）として表すことができる。
本発明の非限定例として、このΔは、ｉ）本発明の抗原結合タンパク質との２４時間のインキュベーション期間の後のヒト腎腫瘍ＳＮ１２Ｃ細胞、およびｉｉ）Ａｌｅｘａ４８８で標識された二次抗体を用い、非処理細胞および実施例９に記載の本発明の抗原結合タンパク質で処理した細胞で得られたＭＦＩに基づいて決定される。このパラメーターは、下式で計算されるように定義される。
ＭＦＩは細胞表面で発現されたＡｘｌに比例するので、このＭＦＩ間の差はＡｘｌのダウンレギュレーションを反映する。
より好ましく、有利な態様では、本発明の抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも２００、好ましくは、少なくとも３００のΔ（ＭＦＩ２４ｈ非処理細胞−ＭＦＩ２４ｈ処理細胞）を誘発するモノクローナル抗体、好ましくは、単離されたＭａｂからなる。
本発明による抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも２００のＭＦＩ減少を誘導する。
より詳しくは、上述のΔは、以下のプロセス（例示的、非限定的例とみなされなければならない）に従って測定することができる：
ａ）目的の腫瘍細胞を本発明の抗原結合タンパク質で処理およびインキュベートし、
ｂ）工程ａ）の処理細胞と、並行して非処理細胞を、本発明の抗原結合タンパク質で処理し、
ｃ）処理および非処理細胞に関して、抗原結合タンパク質と結合することができる二次標識抗体を用いてＭＦＩ（表面に存在するＡｘｌの量を代表するもの）を測定し、
ｄ）Δを、非処理細胞で得られたＭＦＩから処理細胞で得られたＭＦＩを差し引いた差として計算する。
用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、互換的に、広義に使用され、モノクローナル抗体、好ましくは、単離されたＭａｂ（例えば、全長または完全モノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多価抗体または多重特異性抗体（例えば、それらが所望の生物活性を示す限り、二重特異性抗体）を含む。
より詳しくは、このような分子は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖を含んでなる糖タンパク質からなる。各重鎖は、重鎖可変領域（またはドメイン）（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）と重鎖定常領域を含んでなる。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含んでなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）と軽鎖定常領域を含んでなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬを含んでなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存性の高い領域に散在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超過変性領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端方向に以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、宿主組織、または免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む因子への免疫グロブリンの結合を仲介することができる。
本発明の意味における抗体はまた、ある特定のその抗体フラグメントも含む。前記抗体フラグメントは、供給源または免疫グロブリンのタイプ（すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡなど）にかかわらず、所望の結合特異性および親和性を示し、すなわち、抗体フラグメントは、本発明の全長抗体に匹敵する親和性でＡｘｌタンパク質と特異的に結合することができる。
一般に、モノクローナル抗体またはそれらの機能的フラグメント、特にマウス起源のものの調製には、特に手引き書“Antibodies” (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988)に記載されている技術またはKohler and Milstein (Nature, 256:495-497, 1975)により記載されているハイブリドーマからの作製技術を参照することができる。
本明細書において用語「モノクローナル抗体」または「Ｍａｂ」とは、特定の抗原に向けられ、かつ、Ｂ細胞の単一クローンまたはハイブリドーマによって生産され得る抗体分子を意味する。モノクローナル抗体はまた組換え型であってもよく、すなわち、タンパク質工学によって作製されてもよい。さらに、一般に様々な決定基またはエピトープに対する様々な抗体を含むポリクローナル抗体の作製とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原の単一のエピトープに対するものである。本発明は、単離された、または天然源から精製により得られた、または遺伝子組換えもしくは化学合成により得られた抗体に関する。
本発明の好ましい実施形態は、配列番号１、２および３の配列、または配列番号１、２および３と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと；配列番号４、５および６の配列、または配列番号４、５および６と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体を含んでなる、または該抗体からなる、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントである。
本発明のより好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１、２および３の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと；配列番号４、５および６の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体からなる。
好ましい態様では、ＣＤＲ領域またはＣＤＲとは、ＩＭＧＴによって定義される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を示すものとする。相反する記述がなければ、ＣＤＲは、本明細書においては、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って定義される。
ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、抗原受容体、鎖のタイプ、または種が何であれ可変ドメインを比較するために定義されたものである[Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]。ＩＭＧＴ独自ナンバリングでは、保存されているアミノ酸は常に同じ位置を有し、例えば、システイン２３（１ｓｔ−ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ−ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ−ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）がそうである。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、フレームワーク領域の標準画定（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：１〜２６番、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５番、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４番およびＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８番）および相補性決定領域の標準画定：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８番、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５番およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７番を提供する。ギャップは非占有の位置を表し、ＣＤＲ−ＩＭＧＴ長（括弧の間にドットで区切って示される、例えば、［８．８．１３］）は、重要な情報となる。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、ＩＭＧＴ Ｃｏｌｌｉｅｒｓ ｄｅ Ｐｅｒｌｅｓと呼ばれる２次元グラフ[Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)]、およびＩＭＧＴ／３次元構造−ＤＢの３次元構造[Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]で示される。
本明細書において相反する記述がなければ、相補性決定領域またはＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って定義される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を意味するものと理解しなければならない。
しかしながら、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステム(Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991および後続版)に従って定義することもできる。３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲが存在する。ここで、用語「ＣＤＲ」は、それが認識する抗原またはエピトープに対する抗体の結合親和性を担うアミノ酸残基の大部分を含有する領域の、場合に応じて１以上の、またはさらには全部を示して用いられる。
Ｋａｂａｔナンバリングシステムによれば、本発明は、配列番号９、１０および１１の配列、または配列番号９、１０および１１と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って定義される３つの軽鎖ＣＤＲと；配列番号１２、１３および１４の配列、または配列番号１２、１３および１４と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って定義される３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体からなる抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントに関する。
本発明の意味において、２つの核酸またはアミノ酸配列間の「同一性パーセンテージ」は、最適なアラインメントの後に得られる、比較する２つの配列間で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは、このパーセンテージは単に統計的なものであり、２つの配列間の違いはそれらの全長にわたってランダムに分布している。２つの核酸またはアミノ酸配列の比較は、それらを最適にアラインした後にこれらの配列を比較することにより慣行するが、この比較はセグメントによるか、または「アライメントウインドウ」を用いて行うことができる。比較のための配列の最適アライメントは、手作業による比較の他、Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482]のローカルホモロジーアルゴリズムの手段によるか、Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48: 443]のローカルホモロジーアルゴリズムの手段によるか、Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]の類似性検索法の手段によるか、またはこれらのアルゴリズムを用いるコンピューターソフトウエア（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、またはＢＬＡＳＴ ＮＲもしくはＢＬＡＳＴ Ｐ比較ソフトウエア）の手段によって行うことができる。
２つの核酸またはアミノ酸配列間の同一性パーセンテージは、最適にアラインしたこれら２つの配列を比較することにより決定され、比較される核酸またはアミノ酸配列は、これらの２配列間の最適なアライメントのために、参照配列に対して付加または欠失を含み得る。同一性パーセンテージは、２配列間で、好ましくは２つの完全な配列間で、アミノ酸残基またはヌクレオチド(the amino acid nucleotide or residue)が同一である位置の数を求め、この同一の位置の数をアライメントウインドウの位置の総数で割り、その商に１００を掛け、これらの２配列間の同一性パーセンテージを得ることにより算出される。
例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlのサイトで利用可能なＢＬＡＳＴプログラム「ＢＬＡＳＴ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」(Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174:247-250)を、デフォルトパラメーター（特に、パラメーター「オープンギャップペナルティー」：５、「エクステンションギャップペナルティー」：２；選択されるマトリックスは、例えば、このプログラムにより提案されているマトリックス「ＢＬＯＳＵＭ ６２」である）とともに使用することができ、比較する２配列間の同一性パーセンテージはこのプログラムにより直接算出される。
参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示すアミノ酸配列の好ましい例としては、参照配列、ある種の改変、特に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加もしくは置換、末端切断または延長を含むものが挙げられる。１以上の連続的または非連続的アミノ酸の置換の場合、被置換アミノ酸が「等価な」アミノ酸に置き換えられる置換が好ましい。ここで「等価なアミノ酸」という表現は、対応する抗体の生物活性を改変せずに構造アミノ酸の１つで置換され得る任意のアミノ酸を示すものとし、これらの具体例は以下に定義される。
等価なアミノ酸は、それらに代わって置換されるアミノ酸との構造的相同性か、または生成可能な種々の抗原結合タンパク質間の生物活性の比較試験の結果のいずれかに対して決定することができる。
限定されない例として、下表２に、対応する改変抗原結合タンパク質の生物活性の著しい改変を生じさせることなく実施可能な置換の可能性をまとめる。当然のことながら、同じ条件で逆の置換も可能である。
本発明の実施形態は、配列番号７の配列、または配列番号７と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと；配列番号４、５および６の配列、または配列番号４、５および６と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントに関する。
本発明の好ましい実施形態によれば、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７の配列、または配列番号７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと；配列番号４、５および６の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる。
本発明の別の好ましい実施形態によれば、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７の配列、または配列番号７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなる。
本発明の別の実施形態は、配列番号１、２および３の配列、または配列番号１、２および３と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと；配列番号８の配列、または配列番号８と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントに関する。
本発明の好ましい実施形態によれば、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１、２および３の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと；配列番号８の配列、または配列番号８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる。
本発明の別の好ましい実施形態によれば、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号８の配列、または配列番号８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインを含んでなる。
本発明の別の実施形態は、配列番号７配列、または配列番号７と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと；配列番号８の配列、または配列番号８と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントに関する。
本発明の好ましい実施形態によれば、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７の配列、または配列番号７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号８の配列、または配列番号８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる。
より明確にするため、下表３ａに、本発明の抗原結合タンパク質に相当する種々のアミノ酸配列をまとめる（Ｍｕ＝マウス）。
本発明の特定の態様は、マウス抗体、またはその誘導化合物もしくは抗原結合フラグメントに関し、前記抗体はまた、マウスとは異種の、特にヒトの抗体に由来する軽鎖および重鎖定常領域も含んでなることを特徴とする。
本発明の別の特定の態様は、キメラ抗体、またはその誘導化合物もしくは抗原結合フラグメントに関し、前記抗体はまた、マウスとは異種の、特にヒトの抗体に由来する軽鎖および重鎖定常領域も含んでなることを特徴とする。
本発明のさらに別の特定の態様は、ヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは抗原結合フラグメントに関し、ヒト抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域がそれぞれ、λまたはκ領域、およびγ−１、γ−２またはγ−４領域であることを特徴とする。
本発明の別の態様は、２０１１年７月２８日にＣＮＣＭ（パスツール研究所、フランス）に寄託されたハイブリドーマＩ−４５０５に由来するモノクローナル抗体１６１３Ｆ１２からなる抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントである。
別の態様によれば、本発明は、本発明による抗原結合タンパク質を選択することができるマウスハイブリドーマ、特に、２０１１年７月２８日にＦｒｅｎｃｈ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＮＣＭ、パスツール研究所、パリ、フランス）にＩ−４５０５の番号で提出されたマウス起源のハイブリドーマに関する。前記ハイブリドーマは、Ｂａｌｂ／Ｃ免疫マウス脾細胞／リンパ球と骨髄腫Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ １４細胞株の細胞との融合により得られたものである。
別の態様によれば、本発明は、配列番号１、２および３の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと；配列番号４、５および６の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体を選択することができるマウスハイブリドーマに関し、前記ハイブリドーマは、ＣＮＣＭ、パスツール研究所、パリ、フランス、２０１１年７月２８日に、Ｉ−４５０５の番号で提出されている。前記ハイブリドーマは、Ｂａｌｂ／Ｃ免疫マウス脾細胞／リンパ球と骨髄腫Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ １４細胞株の細胞との融合により得られたものである。
本発明の対象は、２０１１年７月２８日にＣＮＣＭ（パスツール研究所、フランス）に寄託されたマウスハイブリドーマＩ−４５０５である。
本発明の抗原結合タンパク質はまた、キメラまたはヒト化抗体を含んでなる。
キメラ抗体は、所与の種の抗体に由来する本来の可変領域（軽鎖および重鎖）を、その所与の種とは異種の抗体の軽鎖および重鎖の定常領域と組み合わせて含有するものである。
抗体、またはそのキメラフラグメントを、組換え遺伝学の技術を用いることにより作製することもできる。例えば、キメラ抗体は、プロモーターと、本発明の非ヒト、特にマウス、モノクローナル抗体の可変領域をコードする配列と、ヒト抗体定常領域をコードする配列とを含有する組換えＤＮＡをクローニングすることによって作製することができる。このような１つの組換え遺伝子によりコードされている本発明によるキメラ抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラであり得、この抗体の特異性は、マウスＤＮＡに由来する可変領域によって決定され、そのアイソタイプは、ヒトＤＮＡに由来する定常領域によって決定される。キメラ抗体を作製するための方法については、Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988)を参照。
別の態様では、本発明は、キメラ抗体からなる結合タンパク質を記載する。
特定の好ましい実施形態では、本発明のキメラ抗体、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン配列を含んでなり、かつ、配列番号８のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン配列を含んでなる。
別の態様では、本発明は、ヒト化抗体からなる結合タンパク質を記載する。
「ヒト化抗体」とは、非ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲ領域を含有し、その抗体分子の他の部分は１つ（または数個の）ヒト抗体に由来する抗体を意味する。さらに、骨格セグメント残基（ＦＲと呼ばれる）のいくつかは結合親和性を保存するために改変することができる(Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988)。
本発明のヒト化抗体またはそのフラグメントは、当業者に知られている技術（例えば、文献Singer et al., J. Immun., 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992; and Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992に記載されているもなど）によって作製することができる。このようなヒト化抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断またはｉｎ ｖｉｖｏにおける予防的処置および／もしくは治療的処置などの方法におけるそれらの使用のために好ましい。例えば、ＰＤＬによりＥＰ０ ４５１ ２６１、ＥＰ０ ６８２ ０４０、ＥＰ０ ９３９ １２７、ＥＰ０ ５６６ ６４７またはＵＳ５，５３０，１０１、ＵＳ６，１８０，３７０、ＵＳ５，５８５，０８９およびＵＳ５，６９３，７６１に記載されている「ＣＤＲグラフト」技術など、他のヒト化技術も当業者に知られている。米国特許ＵＳ５，６３９，６４１またはＵＳ６，０５４，２９７、ＵＳ５，８８６，１５２およびＵＳ５，８７７，２９３も引用することができる。
さらに、本発明はまた、上記のマウス抗体から生じるヒト化抗体に関する。
好ましい様式では、ヒト抗体由来の軽鎖および重鎖の定常領域はそれぞれ、ラムダ（λ）またはカッパ（κ）、およびガンマ（γ）−１、γ−２またはγ−４領域である。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号３６の配列、または配列番号３６と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる軽鎖可変ドメインと；配列番号４、５および６の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなるヒト化抗体からなる抗原結合タンパク質、または抗原結合フラグメントに関する。
本発明の別の実施形態は、配列番号３７〜４７からなる群から選択される配列、または配列番号３７〜４７と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと；配列番号４、５および６の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントに関する。
「配列番号３６または３７〜４７と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列」とは、配列番号１、２および３の３つの軽鎖ＣＤＲを示し、かつさらに、前記ＣＤＲに相当する配列（すなわち、配列番号１、２および３）の外側で、配列番号３６または３７〜４７の全長配列と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す配列を呼称することを意図する。
より明確にするため、下表３ｂに、本発明のヒト化抗原結合タンパク質軽鎖（ＶＬ）に相当する種々のアミノ酸配列をまとめる（Ｈｚ．＝ヒト化）。
本発明の一実施形態では、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、
ｉ）配列番号７の配列、または配列番号７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメイン；
ｉｉ）配列番号３６の配列、または配列番号３６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメイン；および
ｉｉｉ）配列番号３７〜４７の配列、または配列番号３７〜４７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメイン
からなる群から選択される軽鎖可変ドメインを含んでなる。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号４８の配列、または配列番号４８と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる重鎖可変ドメインと；配列番号１、２および３の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなるヒト化抗体からなる抗原結合タンパク質、または抗原結合フラグメントに関する。
本発明の別の実施形態は、配列番号４９〜６８からなる群から選択される配列、または配列番号４９〜６８と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと；配列番号１、２および３の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントに関する。
「配列番号４８および４９〜６８と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列」とは、配列番号４、５および６の３つの重鎖ＣＤＲを示し、かつさらに、前記ＣＤＲに相当する配列（すなわち、配列番号４、５および６）の外側で、配列番号４８および４９〜６８の完全配列と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す配列を呼称することを意図する。
より明確にするため、下表３ｃに、本発明のヒト化抗原結合タンパク質重鎖（ＶＨ）に相当する種々のアミノ酸配列をまとめる（Ｈｚ．＝ヒト化）。
本発明の一実施形態では、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、
ｉ）配列番号８の配列、または配列番号８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメイン；
ｉｉ）配列番号４８の配列、または配列番号４８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメイン；および
ｉｉｉ）配列番号４９〜６８の配列、または配列番号４９〜６８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメイン
からなる群から選択される重鎖可変ドメインを含んでなる。
本発明の一実施形態では、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３６の配列、または配列番号３６と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと；配列番号４８の配列、または配列番号４８と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる。
本発明の別の実施形態では、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３７〜４７からなる群から選択される配列、または配列番号３７〜４７と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと；配列番号４９〜６８からなる群から選択される配列、または配列番号４９〜６８と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる。
本発明の一実施形態では、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントは、
ｉ）配列番号７、３６もしくは３７〜４７の配列、または配列番号７、３６もしくは３７〜４７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと；
ｉｉ）配列番号８、４８もしくは４９〜６８の配列、または配列番号８、４８もしくは４９〜６８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメイン
とを含んでなる。
本発明の新規な態様は、以下の核酸（任意の縮重遺伝コードを含む）：
ａ）本発明による抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸；
ｂ）
・配列番号１５〜２８および６９〜９９からなる群から選択される核酸配列、または
・配列番号１５〜２０の６つの核酸配列を含んでなる核酸配列、または
・配列番号２１、２２の２つの核酸配列、またはある部分は配列番号６９〜７９から選択され、他の部分は配列番号８０〜９９から選択される２つの核酸配列を含んでなる核酸配列
を含んでなる核酸；
ｃ）ａ）またはｂ）に定義された核酸と相補的な核酸；および
ｄ）パートａ）もしくはｂ）に定義された核酸配列と、またはパートａ）もしくはｂ）に定義された核酸配列との最適なアラインメントの後に少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列と、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができる、好ましくは少なくとも１８ヌクレオチドを有する、核酸
の中から選択されることを特徴とする単離された核酸に関する。
下表４ａに、本発明の結合タンパク質に関する種々のヌクレオチド配列をまとめる（Ｍｕ．＝マウス）。
より明確にするため、下表４ｂに、本発明のヒト化抗原結合タンパク質軽鎖（ＶＬ）に相当する種々のヌクレオチド配列をまとめる（Ｈｚ．＝ヒト化）。
より明確にするため、表４ｃに、本発明のヒト化抗原結合タンパク質重鎖（ＶＨ）に相当する種々のヌクレオチド配列をまとめる（Ｈｚ．＝ヒト化）。
用語「核酸」、「核配列(nucleic sequence)」、「核酸配列(nucleic acid sequence)」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」は、本明細書において互換的に用いられ、改変または非改変型の、核酸のフラグメントまたは領域を定義し、非天然ヌクレオチドを含有するまたは含有しない、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたはこれらのＤＮＡの転写産物のいずれかである、ヌクレオチドの正確な配列を意味する。
本発明の配列は単離および／または精製されたものであり、すなわち、それらは、少なくとも部分的に改変されたそれらの環境から、例えばコピーによって直接的または間接的にサンプリングされたものである。ここでまた、例えば宿主細胞の手段による組換えによって得られた、または化学合成によって得られた単離された核酸も記載しておくべきであろう。
「最適なアライメントの後に好ましい配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性パーセンテージを示す核酸配列」とは、参照核酸配列に対して、特に、欠失、末端切断、延長、キメラ融合および／または置換、特に厳密なものなどの特定の改変を示す核酸配列を意味する。好ましくは、これらは参照配列と同じアミノ酸配列をコードする配列（これは遺伝コードの縮重に関連する）、または好ましくは高ストリンジェント条件下、特に以下に定義される条件下で、参照配列と特異的にハイブリダイズし得る相補的配列である。
高ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションとは、温度およびイオン強度に関する条件が、２つの相補的ＤＮＡフラグメント間でハイブリダイゼーションを維持させるように選択されることを意味する。単に例であるが、上記のポリヌクレオチドフラグメントを定義するためのハイブリダイゼーション工程の高ストリンジェント条件は有利には以下の通りである。
ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションは、（１）５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム溶液に相当する）、５０％ホルムアミド、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０×デンハート液、５％デキストラン硫酸および１％サケ精子ＤＮＡを含有するリン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）中、４２℃で３時間のプレハイブリダイゼーション；（２）プローブ長に応じた温度（すなわち、プローブ＞１００ヌクレオチド長の場合は４２℃）で２０時間の主要ハイブリダイゼーションの後、２×ＳＳＣ＋２％ＳＤＳ中、２０℃、２０分の洗浄２回、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中、２０℃、２０分の洗浄１回、という二段階で行う。最後の洗浄は、プローブ＞１００ヌクレオチド長の場合は６０℃で３０分間、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中で行う。定義されたサイズのポリヌクレオチドに関する上記の高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、当業者ならば、Sambrook et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 3rd edition, 2001)に記載の手順に従って、より長いまたは短いオリゴヌクレオチドに適合させることができる。
本発明はまた、本発明に記載される核酸を含んでなるベクターに関する。
本発明は、特に、このようなヌクレオチド配列を含むクローニングおよび／または発現ベクターを対象とする。
本発明のベクターは好ましくは、所与の宿主細胞でのヌクレオチド配列の発現および／または分泌を可能とするエレメントを含む。従って、ベクターはプロモーター、翻訳開始および終結シグナル、ならびに好適な転写調節領域を含まなければならい。ベクターは宿主細胞で安定に維持できなければならず、所望により、翻訳されたタンパク質の分泌を指定する特定のシグナルを有することができる。これらの種々のエレメントは、当業者により、用いる宿主細胞に従って選択および最適化される。この目的で、これらのヌクレオチド配列は選択された宿主内の自己複製ベクターに挿入することができ、または選択された宿主の組込型ベクターであり得る。
このようなベクターは当業者により一般に用いられる方法によって作製され、得られたクローンは、リポフェクション、エレクトロポレーション、熱ショックまたは化学的方法などの標準的な方法によって好適な宿主に導入することができる。
これらのベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルス起源のベクターである。それらは、本発明のヌクレオチド配列のクローニングまたは発現のために宿主細胞を形質転換するのに用いられる。
本発明はまた、本発明に記載されるベクターにより形質転換された、または本発明に記載されるベクターを含んでなる宿主細胞を含んでなる。
宿主細胞は原核生物系または真核生物系、例えば、細菌細胞、例えばまた、酵母細胞もしくは動物細胞、特に、哺乳動物細胞（ヒトを除く）、の中から選択することができる。また、昆虫細胞または植物細胞を用いることもできる。
本発明はまた、本発明に従って形質転換された細胞を含む、ヒト以外の動物に関する。
本発明の別の態様は、本発明による抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントの生産方法に関し、前記方法が以下の工程：
ａ）本発明による宿主細胞を培地中、好適な培養条件で培養する工程；および
ｂ）このようにして生産された抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントの１つを培養培地または前記培養細胞から回収する工程
を含んでなることを特徴とする。
本発明に従って形質転換された細胞は、本発明による組換え抗原結合タンパク質の製造方法で用いられる。本発明によるベクター、および／またはベクターによって形質転換された細胞を用いることを特徴とする、本発明による抗原結合タンパク質の組換え型での製造方法も本発明に含まれる。好ましくは、本発明によるベクターによって形質転換された細胞は、前記抗原結合タンパク質の発現および前記組換えタンパク質の回収を可能とする条件下で培養される。
すでに述べたように、宿主細胞は原核生物系または真核生物系から選択することができる。特に、このような原核生物系または真核生物系で分泌を促進する本発明のヌクレオチド配列を同定することができる。従って、このような配列を有する本発明によるベクターは、分泌させる組換えタンパク質の生産のために有利に使用することができる。実際、目的のこれらの組換えタンパク質の精製は、それらが宿主細胞の内部よりもむしろ細胞培養の上清中に存在するという事実により容易となる。
また、本発明の抗原結合タンパク質は化学合成によって製造することもできる。このような製造方法の１つもまた本発明の課題である。当業者ならば、固相技術（特にSteward et al, 1984, Solid phase peptide synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd ed., pp 71-95参照）、または部分的固相技術、または溶液中でのフラグメントの縮合もしくは慣例の合成によるなどの、化学合成法を知っている。化学合成によって得られ、対応する非天然アミノ酸を含み得るポリペプチドもまた本発明に含まれる。
本発明の方法によって得ることができる抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントもまた本発明に含まれる。
特定の態様によれば、本発明は、細胞傷害性薬剤を宿主標的部位に送達するためのアドレッシング産物として使用するための、上記の抗原結合タンパク質、またはその抗原結合フラグメントに関し、前記宿主標的部位は、タンパク質Ａｘｌ細胞外ドメイン、好ましくは、ヒトタンパク質Ａｘｌ細胞外ドメイン、より好ましくは、配列番号３１もしくは３２の配列、またはその天然変異体配列を有するヒトタンパク質Ａｘｌ細胞外ドメインに位置するエピトープからなる。
好ましい実施形態では、前記宿主標的部位は、哺乳動物細胞、より好ましくは、ヒト細胞、より好ましくは、天然にまたは遺伝子組換えの手段によりＡｘｌタンパク質を発現する細胞の標的部位である。
本発明は、細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされた本明細書に記載の抗原結合タンパク質を含んでなる免疫複合体に関する。
本発明の意味において、「免疫複合体」とは、一般に、１種類以上の治療薬と物理的に連結された少なくとも１種類のアドレッシング産物を含んでなる化合物を意味し、従って、標的性の高い化合物を作り出す。
好ましい実施形態では、このような治療薬は細胞傷害性薬剤からなる。
「細胞傷害性薬剤」または「細胞傷害薬」とは、対象に投与した際に、細胞機能を阻害または妨害すること、および／または細胞死を引き起こすことにより、対象の身体で細胞増殖の進展、好ましくは、癌の発生を治療または予防する薬剤を意図する。
多くの細胞傷害性薬剤が単離または合成されており、細胞増殖を阻害すること、または、限定的でなくとも、少なくとも有意に腫瘍細胞を破壊するまたは減少させることを可能とする。しかしながら、これらの薬剤の傷害活性は腫瘍細胞に限定されず、非腫瘍細胞も影響を受け、破壊され得る。より詳しくは、造血細胞または上皮細胞、特に粘膜の上皮細胞などの急速に更新する細胞に副作用が見られる。例として、消化管の細胞はこのような細胞傷害性薬剤によって大きく影響を受ける。
本発明の目的の１つはまた、腫瘍細胞に対する高い細胞傷害性を保持すると同時に正常細胞に対する副作用を制限することを可能とする細胞傷害性薬剤を提供できることである。
より詳しくは、細胞傷害性薬剤は、好ましくは、限定されるものではないが、薬物（すなわち、「抗体−薬物複合体」）、毒素（すなわち、「免疫毒素」または「抗体−毒素複合体」）、放射性同位元素（すなわち、「放射性免疫複合体」または「抗体−放射性同位元素複合体」）などからなり得る。
本発明の第１の好ましい実施形態では、免疫複合体は、少なくとも１種類の薬物または薬剤に連結された結合タンパク質からなる。このような免疫複合体は、結合タンパク質が抗体、またはその抗原結合フラグメントである場合には、抗体−薬物複合体（または「ＡＤＣ」）と呼ばれる。
第１の実施形態では、このような薬物は、それらの作用様式に関して記載することができる。非限定例として、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素、オキサゾホリン(oxazophorins)、アジリジンまたはイミン−エチレン）、抗代謝産物、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、クロマチン機能阻害剤、抗血管新生薬、抗エストロゲン作用薬、抗アンドロゲン作用薬、キレート剤、鉄吸収促進剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、ＤＮＡ阻害剤、ＤＮＡ合成阻害剤、アポトーシス促進剤、チミジル酸阻害剤、Ｔ細胞阻害剤、インターフェロン作動薬、リボヌクレオシド三リン酸レダクターゼ阻害剤、アロマターゼ阻害剤、エストロゲン受容体拮抗薬、チロシンキナーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、タキサン、チューブリン阻害剤、血管新生阻害剤、マクロファージ刺激剤、ニューロキニン受容体拮抗薬、カンナビノイド受容体作動薬、ドーパミン受容体作動薬、顆粒球刺激因子作動薬、エリスロポエチン受容体作動薬、ソマトスタチン受容体作動薬、ＬＨＲＨ作動薬、カルシウム増感剤、ＶＥＧＦ受容体拮抗薬、インターロイキン受容体拮抗薬、破骨細胞阻害剤、ラジカル形成促進剤、エンドセリン受容体拮抗薬、ビンカアルカロイド、抗ホルモンもしくは免疫調節剤、または細胞傷害薬または毒素の活性基準を満たす任意の他の新規な薬物が挙げられる。
このような薬物は、例えば、ＶＩＤＡＬ ２０１０の、癌腫学および血液学の段「細胞傷害薬」に付属する化合物にさかれた頁に引用されており、この文献に参照として引用されているこれらの細胞傷害性化合物が、本明細書で好ましい細胞傷害性薬剤として引用される。
より詳しくは、限定されるものではないが、本発明によれば以下の薬物が好ましい：メクロレタミン、クロラムブコル(chlorambucol)、メルファレン(melphalen)、クロリドレート(chlorydrate)、ピポブロメン(pipobromen)、プレドニムスチン、リン酸二ナトリウム(disodic phosphates)、エストラムスチン、シクロホスファミド、アルトレタミン、トロフォスファミド、スルホフォスファミド、イフォスファミド、チオテパ、トリエチルエナミン、アルテトラミン(altetramine)、カルムスチン、ストレプトゾシン、フォテムスチン、ロムスチン、ブスルファン、トレオスルファン、インプロスルファン、ダカルバジン、シスプラチナム、オキサリプラチン、ロバプラチン、ヘプタプラチン(heptaplatin)、ミリプラチン水和物、カルボプラチン、メトトレキサート、ペメトレキセド、５−フルオルウラシル、フロクスウリジン、５−フルオロデオキシウリジン、カペシタビン、シタラビン、フルダラビン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、ネララビン、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、クロロデスオキシアデノシン(chlorodesoxyadenosine)、５−アザシチジン、ゲムシタビン、クラドリビン、デオキシコホルマイシン、テガフール、ペントスタチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ミトキサントロン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、プリカマイシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、バルルビシン、塩酸アムルビシン、ピラルビシン、酢酸エリプチニウム、ゾルビシン、エピルビシン、イダルビシンおよびテニポシド、ラゾキシン、マリマスタット、バチマスタット、プリノマスタット、タノマスタット、イロマスタット、ＣＧＳ−２７０２３Ａ、ハロフジノン(halofuginon)、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、サリドマイド、ＣＤＣ ５０１、ＤＭＸＡＡ、Ｌ−６５１５８２、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、インターフェロン−α、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンギオスタチン、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、フルタミド、ニルタミド、スプリロノラクトン(sprironolactone)、酢酸シプロテロン、フィナステリド、シミチジン(cimetidine)、ボルテゾミド(bortezomid)、ベルケード、ビカルタミド、シプロテロン、フルタミド、フルベストラン(fulvestran)、エキセメスタン、ダサチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、レチノイド、レキシノイド、メトキサレン(methoxsalene)、レブリン酸メチルアミノ、アルデスロイキン(aldesleukine)、ＯＣＴ−４３、デニロイキンジフリトクス(denileukin diflitox)、インターロイキン−２、タソネルミン(tasonermine)、レンチナン、シゾフィラン、ロキニメックス、ピドチモド、ペガデマーゼ、チモペンチン(thymopentine)、ポリＩ：Ｃ、プロコダゾール(procodazol)、Ｔｉｃ ＢＣＧ、コリネバクテリウム・パルブム（corynebacterium parvum）、ＮＯＶ−００２、ウクライン、レバミゾール、１３１１−ｃｈＴＮＴ、Ｈ−１０１、セルモロイキン、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、インターフェロンγ１ａ、インターロイキン−２、モベナキン、レキシン−Ｇ、テセロイキン、アクラルビシン、アクチノマイシン、アルグラビン、アスパラギナーゼ、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダウノマイシン、ロイコボリン、マソプロコール、ネオカルジノスタチン、ペプロマイシン、サルコマイシン、ソラマージン、トラベクテジン、ストレプトゾシン、テストステロン、クネカテキン、シネカテキン、アリトレチノイン、塩酸ベロテカン、カルステロン、ドロモスタノロン、酢酸エリプチニウム、エチニルエストラジオール、エトポシド、フルオキシメステロン、フォルメスタン、ホスフェトロール(fosfetrol)、酢酸ゴセレリン、アミノレブリン酸ヘキシル、ヒストレリン、ヒドロキシプロゲステロン、イキサベピロン、ロイプロリド、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲステロール、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、ミルテホシン、ミトブロニトール、フェニルプロピオン酸ナドロロン、酢酸ノレシンドロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、テムシロリムス(temsirrolimus)、テストラクトン、トリアムコノロン(triamcinolone)、トリプトレリン、酢酸バプレオチド、ジノスタチンスチマラマー、アムサクリン、三酸化ヒ素、塩酸ビサントレン、クロラムブシル、クロルトリアニセン(chlortrianisene)、シス−ジアミンジクロロプラチニウム(cis-diamminedichloroplatinium)、シクロホスファミド、ジエチルスチルベストロール、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシ尿素、レナリドマイド、ロニダミン、メクロレタナミン(mechlorethanamine)、ミトタン、ネダプラチン、塩酸ニムスチン、パミドロン酸、ピポブロマン、ポルフィマーナトリウム、ラニムスチン、ラゾキサン、セムスチン、ソブゾキサン、メシル酸塩、トリエチレンメラミン、ゾレンドロン酸、メシル酸カモスタット、ファドロゾールＨＣｌ、ナフォキシジン、アミノグルテチミド、カルモフール、クロファラビン、シトシンアラビノシド、デシタビン、ドキシフルリジン、エノシタビン、リン酸フルダラビン(fludarabne)、フルオロウラシル、フトラフール、ウラシルマスタード、アバレリクス、ベキサロテン、ラルチテルキセド(raltiterxed)、タミバロテン、テモゾロミド、ボリノスタット、メガストロール(megastrol)、クロドロネート二ナトリウム、レバミゾール、フェルモキシトール、鉄イソマルトシド、セレコキシブ、イブジラスト、ベンダムスチン、アルトレタミン、ミトラクトール、テムシロリムス、プララトレキサート、ＴＳ−１、デシタビン、ビカルタミド、フルタミド、レトロゾール、クロドロネート二ナトリウム、デガレリクス、クエン酸トレミフェン、二塩酸ヒスタミン、ＤＷ−１６６ＨＣ、ニトラクリン、デシタビン、塩酸イリノテカン(irinoteacn)、アムサクリン、ロミデプシン、トレチノイン、カバジタキセル、バンデタニブ、レナリドマイド、イバンドロン酸、ミルテホシン、ビテスペン、ミファムルチド、ナドロパリン、グラニセトロン、オンダンセトロン、トロピセトロン、アリザプリド、ラモセトロン、メシル酸ドラセトロン、ホスアプレピタントジメグルミン、ナビロン、アプレピタント、ドロナビノール、ＴＹ−１０７２１、リスリド水素マレアート、エピセラム、デフィブロチド、ダビガトランエテキシレート、フィルグラスチム、ペグフィルグラスチム、レディタクス、エポエチン、モルグラモスチム、オプレルベキン、シプロイセル−Ｔ、Ｍ−Ｖａｘ、アセチルＬ−カルニチン、塩酸ドネペジル、５−アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、酢酸セトロレリクス、イコデキストリン、ロイプロレリン、メトビルフェニデート(metbylphenidate)、オクトレオチド、アンレキサノクス、プレリキサフォル、メナテトレノン、アネトールジチオールチオン、ドキセルカルシフェロール、塩酸シナカルセト、アレファセプト、ロミプロスチム、サイモグロブリン、チマルファシン、ウベニメクス、イミキモド、エベロリムス、シロリムス、Ｈ−１０１、ラソフォキシフェン、トリロスタン、インカドロン酸塩、ガングリオシド、ペガプタニブ八ナトリウム、ベルトポルフィン(vertoporfin)、ミノドロン酸、ゾレンドロン酸、硝酸ガリウム、アレンドロン酸ナトリウム、エチドロン酸二ナトリウム、パミドロン酸二ナトリウム、デュタステライド、スチボグルコン酸ナトリウム、アルモダフィニル、デクスラゾキサン、アミフォスチン、ＷＦ−１０、テモポルフィン、ダルベポエチンアルファ、アンセスチム、サルグラモスチム、パリフェルミン、Ｒ−７４４、ネピデルミン、オプレルベキン、デニロイキンディフチトクス、クリサンタスパーゼ、ブセレリン、デスロレリン、ランレオチド、オクトレオチド、ピロカルピン、ボセンタン、カリケアマイシン、メイタンシノイドおよびシクロニカート。
より詳しくは、当業者は、“Association Francaise des Enseignants de Chimie Therapeutique”により編集された表題“traite de chimie therapeutique, vol. 6, Medicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers, edition TEC & DOC, 2003”の手引き書を参照することができる。
本発明の第２の好ましい実施形態では、免疫複合体は、少なくとも１種類の放射性同位元素と連結された結合タンパク質からなる。このような免疫複合体は、結合タンパク質が抗体、またはその抗原結合フラグメントである場合には、抗体−放射性同位元素複合体（または「ＡＲＣ」）と呼ばれる。
腫瘍の選択的破壊のためには、抗体は、放射性の高い原子を含んでなってもよい。ＡＲＣの作製には様々な放射性同位元素が利用可能であり、例えば、限定されるものではないが、Ａｔ２１１、Ｃ１３、Ｎ１５、Ｏ１７、Ｆｌ１９、Ｉ１２３、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｉｎ１１１、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、ｔｃ９９ｍ、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、Ｌｕ、ガドリニウム、マンガンまたは鉄の放射性同位元素がある。
このような放射性同位元素をＡＲＣに組み込むためには、当業者に知られているいずれの方法またはプロセスも使用することができる（例えば、“Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy”, Chatal, CRC Press 1989参照）。非限定例として、ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８およびＩｎ１１１はシステイン残基を介して結合させることができる。Ｙ９０はリシン残基を介して結合させることができる。Ｉ１２３はヨードゲン法(Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57)を用いて結合させることができる。
ＡＲＣ分野の当業者の知識を示すために、チオ尿素リンカー−キレーターにより結合された抗ＣＤ２０モノクローナル抗体とＩｎ１１１またはＹ９０放射性同位元素から構成されるＡＲＣであるゼヴァリン(商標）(Wiseman et at (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et at (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)、またはカリケアマイシンと連結された抗ＣＤ３３抗体から構成されるマイロターグ（商標）（ＵＳ４，９７０，１９８；５，０７９，２３３；５，５８５，０８９；５，６０６，０４０；５，６９３，７６２；５，７３９，１１６；５，７６７，２８５；５，７７３，００１）など、いくつかの例を挙げることができる。もっと最近では、ホジキンリンパ腫の治療において最近ＦＤＡにより承認されたアドセトリスと呼ばれるＡＤＣ（ブレンツキシマブベドチンに相当する）を挙げることもできる(Nature, vol. 476, pp380-381, 25 August 2011)。
本発明の第３の好ましい実施形態では、免疫複合体は、少なくとも１種類の毒素と連結された結合タンパク質からなる。このような免疫複合体は、結合タンパク質が抗体、またはその抗原結合フラグメントである場合には、抗体−毒素複合体（または「ＡＴＣ」）と呼ばれる。
毒素は、生きている生物によって産生される有効かつ特異的な有毒物質である。毒素は通常、数百（ペプチド）から１０万（タンパク質）の間で分子量が異なり得るアミノ酸鎖からなる。毒素はまた、低分子有機化合物であってもよい。毒素は多くの生物、例えば、細菌、真菌、藻類および植物により産生される。それらの多くは極めて有毒であり、神経薬よりも数桁高い毒性を持つ。
ＡＴＣに使用される毒素としては、限定されるものではないが、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、またはトポイソメラーゼ阻害を含む機構によってそれらの細胞傷害作用を発揮し得る、あらゆる種類の毒素を含み得る。
使用可能な酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ(Phytolaca Americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ(momordica charantia)阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ(sapaonaria officinalis)阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセン(tricothecenes)が含まれる。
ドラスタチン、オーリスタチン、トリコテセン、およびＣＣ１０６５などの小分子毒素、ならびに毒素活性のあるこれらの毒素の誘導体も、本明細書において企図される。ドラスタチンおよびオーリスタチンは、微小管ダイナミクス、ＧＴＰ加水分解、並びに核および細胞分裂を妨げ、抗癌活性および抗真菌活性を有することが示されている。
「リンカー」、「リンカー単位」、または「連結」とは、共有結合、または結合タンパク質を少なくとも１つの細胞傷害性薬剤に共有結合させる原子の鎖を含んでなる化学部分を意味する。
リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、２，６−ジイソシアン酸トルエン）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製することができる。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、本アドレッシング系に細胞傷害性薬剤をコンジュゲートさせるためのキレート剤の一例である。他の架橋試薬としては、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、およびスルホ−ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）が挙げられ、これらは市販されている（例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Ill., U.S.Aから）。
リンカーは、「非切断性」であっても「切断可能」であってもよい。
好ましい実施形態では、それは細胞において細胞傷害性薬剤の放出を促進する「切断可能な」リンカーである。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカーが使用可能である。リンカーは、好ましい実施形態では、細胞内条件下で切断可能であり、その結果、リンカーの切断は細胞内環境で結合タンパク質から細胞傷害性薬剤を放出する。
例えば、いくつかの実施形態では、リンカーは、細胞内環境中（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ内）に存在する切断剤によって切断可能である。リンカーは、例えば、限定されるものではないが、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼを含む細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカーであり得る。一般に、ペプチジルリンカーは、少なくとも２アミノ酸長または少なくとも３アミノ酸長である。切断剤としては、カテプシンＢおよびＤならびにプラスミンを挙げることができ、これらは総て、ジペプチド薬物誘導体を加水分解して標的細胞内で活性薬の放出をもたらすことが知られている。例えば、癌性組織で発現の高いチオール依存性プロテアーゼであるカテプシン−Ｂにより切断可能であるペプチジルリンカーを使用することができる（例えば、Ｐｈｅ−ＬｅｕまたはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙリンカー）。特定の実施形態では、細胞内プロテアーゼにより切断可能であるペプチジルリンカーは、Ｖａｌ−ＣｉｔリンカーまたはＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである。細胞傷害性薬剤の細胞内タンパク質分解性放出を使用する１つの利点は、薬剤は一般に結合させると減弱され、複合体の血清安定性が一般に高いということである。
他の実施形態では、切断可能なリンカーは、ｐＨ感受性であり、すなわち、あるｐＨ値で加水分解を受けやすい。一般に、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解され得る。例えば、リソソーム中で加水分解され得る酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス−アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）が使用可能である。このようなリンカーは、血液の場合のように、中性ｐＨ条件下で比較的安定であるが、リソソームのおよそのｐＨであるｐＨ５．５または５．０より低いと不安定である。特定の実施形態では、加水分解可能なリンカーは、チオエーテルリンカー（例えば、アシルヒドラゾン結合を介して治療薬と結合しているチオエーテル）である。
さらに他の実施形態では、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。様々なジスルフィドリンカーが当技術分野で公知であり、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）およびＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）−、ＳＰＤＢおよびＳＭＰＴを用いて形成され得るものが含まれる。
非切断性または「非還元性」リンカーの非限定例としては、トラスツズマブと、連結された化学療法薬マイタンシンとを組み合わせた免疫複合体トラスツズマブ−ＤＭ１（ＴＤＭ１）が挙げられる(Cancer Research 2008; 68: (22). November 15, 2008)。
好ましい実施形態では、本発明の免疫複合体は、限定されるものではないが、ｉ）抗原結合タンパク質の求核基と二価リンカー試薬の反応と、その後の細胞傷害性薬剤との反応、またはｉｉ）細胞傷害性薬剤の求核基と二価リンカー試薬の反応と、その後の抗原結合タンパク質の求核基との反応など、当業者に公知のいずれの方法によって作製してもよい。
抗原結合タンパク質上の求核基は、限定されるものではないが、Ｎ末端アミン基、側鎖アミン基、例えば、リシン、側鎖チオール基、および抗原結合タンパク質がグリコシル化されている場合には糖ヒドロキシルまたはアミノ基が含まれる。アミン、チオール、およびヒドロキシル基は求核性であり、かつ、限定されるものではないが、活性エステル、例えば、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸エステルおよび酸ハロゲン化物；ハロゲン化アルキルおよびベンジル、例えば、ハロアセトアミド；アルデヒド、ケトン、カルボキシル、およびマレイミド基などのリンカー部分およびリンカー試薬上の求電子基と反応して共有結合を形成することができる。抗原結合タンパク質は、還元可能な鎖内ジスルフィド、すなわち、システイン架橋を有してもよい。抗原結合タンパク質は、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）などの還元剤で処理することにより、リンカー試薬との結合に対して反応性とすることができる。従って、各システイン架橋は、理論的には、２つの反応性チオール求核基を形成する。当業者に公知の任意の反応により、さらなる求核基を抗原結合タンパク質に導入することもできる。非限定例として、反応性チオール基は、１以上のシステイン残基を導入することにより、抗原結合タンパク質に導入することができる。
免疫複合体は、リンカー試薬または細胞傷害性薬剤上の求核置換基と反応することができる求電子部分を導入するための抗原結合タンパク質の改変によって作出してもよい。グリコシル化された抗原結合タンパク質の糖を酸化して、リンカー試薬または細胞傷害性薬剤のアミン基と反応し得るアルデヒドまたはケトン基を形成することができる。生じたイミンシッフ塩基基は安定な結合を形成し得るか、または還元されて安定なアミン結合を形成し得る。一実施形態では、グリコシル化された抗原結合タンパク質の糖鎖部分とガラクトースオキシダーゼかまたはメタ過ヨウ素酸ナトリウムのいずれかとの反応により、タンパク質内に、薬物上の適当な基と反応することができるカルボニル（アルデヒドおよびケトン）基を得ることができる。別の実施形態では、Ｎ末端セリンまたはトレオニン残基を含有するタンパク質をメタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応させて、最初のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成することができる。
特定の好ましい実施形態では、リンカー単位は以下の一般式を有し得る：
−−Ｔａ−−Ｗｗ−−Ｙｙ−−
式中、
−Ｔ−は、ストレッチャー単位であり；
ａは、０または１であり；
−Ｗ−は、アミノ酸単位であり；
ｗは独立に、１〜１２の範囲の整数であり；
−Ｙ−は、スペーサー単位であり；
ｙは、０、１または２である。
存在する場合、ストレッチャー単位（−Ｔ−）は、抗原結合タンパク質とアミノ酸単位（−Ｗ−）を連結する。自然状態でまたは化学操作を介して抗原結合タンパク質上に存在し得る有用な官能基としては、スルフヒドリル、アミノ、ヒドロキシル、糖鎖のアノマーヒドロキシル基、およびカルボキシルが含まれる。好適な官能基は、スルフヒドリルおよびアミノである。スルフヒドリル基は、存在する場合、抗原結合タンパク質の分子内ジスルフィド結合の還元によって作出することができる。あるいは、スルフヒドリル基は、抗原結合タンパク質のリシン部分のアミノ基と２−イミノチオランまたは他のスルフヒドリル生成試薬を反応させることによって作出することができる。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は組換え抗体であり、かつ、１個以上のリシンを保持するように操作されている。より好ましくは、抗原結合タンパク質は、１個以上のシステインを保持するように操作することができる（ｃｆ．ＴｈｉｏＭａｂｓ）。
ある特定の実施形態では、ストレッチャー単位は、抗原結合タンパク質の硫黄原子と結合を形成する。この硫黄原子は、還元された抗原結合タンパク質のスルフヒドリル（−−ＳＨ）基に由来するものであり得る。
他のある特定の実施形態では、ストレッチャー単位は、抗原結合タンパク質の硫黄原子とストレッチャー単位の硫黄原子の間のジスルフィド結合を介して抗原結合タンパク質と連結される。
他の特定の実施形態では、ストレッチャーの反応性基は、抗原結合タンパク質のアミノ基に対して反応性であり得る反応性部位を含む。アミノ基は、アルギニンまたはリシンのものであり得る。好適なアミン反応性部位としては、限定されるものではないが、活性化エステル、例えば、スクシンイミドエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、無水物、酸塩化物、塩化スルホニル、イソシアネートおよびイソチオシアネートが含まれる。
さらに別の態様では、ストレッチャーの反応性官能基は、抗原結合タンパク質上に存在し得る修飾された糖鎖基に対して反応性である反応性部位を含む。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は酵素的にグリコシル化されて糖鎖部分を提供する（抗原結合タンパク質が抗体である場合には、前記抗体は一般に自然状態でグリコシル化されていることに留意されたい）。糖鎖は過ヨウ素酸ナトリウムなどの試薬で軽度に酸化され得、酸化された糖鎖の、結果として生じたカルボニル単位は、ヒドラジド、オキシム、反応性アミン、ヒドラジン、チオセミカルバジド、カルボン酸ヒドラジン、またはアリールヒドラジドなどの官能基を含有するストレッチャーと縮合することができる。
アミノ酸単位（−Ｗ−）は、スペーサー単位が存在する場合には、ストレッチャー単位（−Ｔ−）をスペーサー単位（−Ｙ−）と連結し、スペーサー単位が存在しない場合には、ストレッチャー単位を細胞傷害性薬剤と連結する。
上述のように、−Ｗｗ−は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチドまたはドデカペプチド単位であり得る。
いくつかの実施形態では、アミノ酸単位は、限定されるものではないが、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、アセチルまたはホルミルで保護されたリシン、アルギニン、トシルまたはニトロ基で保護されたアルギニン、ヒスチジン、オルニチン、アセチルまたはホルミルで保護されたオルニチンおよびシトルリンなどのアミノ酸残基を含んでなり得る。例示的アミノ酸リンカー成分としては、好ましくは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドまたはペンタペプチドが含まれる。
例示的ジペプチドとしては、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇが含まれる。
例示的トリペプチドとしては、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓが含まれる。
例示的テトラペプチドとしては、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号３３）、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号３４）が含まれる。
例示的ペンタペプチドとしては、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ （配列番号３５）が含まれる。
アミノ酸リンカー成分を含んでなるアミノ酸残基としては、天然アミノ酸、ならびに微量アミノ酸、およびシトルリンなどの非天然アミノ酸類似体が含まれる。アミノ酸リンカー成分は、特定の酵素、例えば、腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、ＣおよびＤ、またはプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断に対するそれらの選択性において設計および最適化することができる。
リンカーのアミノ酸単位は、限定されるものではないが、腫瘍関連プロテアーゼを含む酵素によって酵素的に切断されて細胞傷害性薬剤を遊離することができる。
アミノ酸単位は、腫瘍関連腫瘍関連プロテアーゼによる酵素的切断に対するその選択性において設計および最適化することができる。好適な単位は、その切断がプロテアーゼ、カテプシンＢ、ＣおよびＤ、およびプラスミンにより触媒されるものである。
スペーサー単位（−Ｙ−）は、存在する場合、アミノ酸単位を細胞傷害性薬剤に連結する。スペーサー単位は、自壊的と非自壊的の２つの一般的なタイプのものである。非自壊的スペーサー単位は、免疫複合体からのアミノ酸単位の酵素的切断後も、スペーサー単位の一部または全部が細胞傷害性薬剤に結合したままとなるものである。非自壊的スペーサー単位の例としては、限定されるものではないが、（グリシン−グリシン）スペーサー単位およびグリシンスペーサー単位が含まれる。細胞傷害性薬剤を遊離させるためには、標的細胞内でグリシン−薬物単位結合を切断するための非依存的加水分解反応が起こらなければならない。
別の実施形態では、非自壊的スペーサー単位（−Ｙ−）は、−Ｇｌｙ−である。
一実施形態では、免疫複合体にスペーサー単位はない（ｙ＝０）。あるいは、自壊的スペーサー単位を含有する免疫複合体は、別途の加水分解工程の必要なく、細胞傷害性薬剤を放出することができる。これらの実施形態では、−Ｙ−は、ＰＡＢ基の窒素原子を介して−Ｗｗ−に連結され、かつ、炭酸基、カルバミン酸基またはエーテル基を介して−Ｄに直接接続されているｐ−アミノベンジルアルコール（ＰＡＢ）単位である。
自壊的スペーサーの他の例としては、限定されるものではないが、２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体およびオルトまたはパラ−アミノベンジルアセタールなどのＰＡＢ基と電気的に等価な芳香族化合物が含まれる。置換および非置換４−アミノ酪酸アミド、適切に置換された置換ビシクロ［２．２．１］およびビシクロ［２．２．２］環系および２−アミノフェニルプロピオン酸アミドなど、アミド結合の加水分解時に容易に環化を受けるスペーサーを使用することができる。
別の実施形態では、スペーサー単位は、分岐型のビス（ヒドロキシメチル）スチレン（ＢＨＭＳ）単位であり、これは細胞傷害性薬剤を追加導入するために使用することができる。
最後に、本発明は、癌の治療において使用するための、上記免疫複合体に関する。
癌は好ましくは、それらの表面でタンパク質Ａｘｌの全部または一部を発現または過剰発現する腫瘍細胞を含む、Ａｘｌ関連癌から選択することができる。
より詳しくは、前記癌は、乳癌、結腸、食道癌、肝細胞癌、胃癌、神経膠腫、肺癌、黒色腫、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、横紋筋肉腫、腎臓癌、甲状腺癌、子宮内膜癌および任意の薬剤耐性現象である。本発明の別の目的は、本明細書に記載の免疫複合体を含んでなる医薬組成物である。
より詳しくは、本発明は、本発明の免疫複合体を少なくとも１種類の賦形剤および／または薬学的に許容可能なビヒクルとともに含んでなる医薬組成物に関する。
本明細書において、「薬学的に許容可能なビヒクル」または「賦形剤」という表現は、二次反応を引き起こすことなく、かつ、例えば、有効化合物の投与の補助、体内におけるその寿命の延長および／またはその有効性の増強、溶液中でのその溶解度の増大、あるいはまたその保存性の改善を可能とする、医薬組成物中に含まれる化合物または化合物の組合せを示すものとする。これらの薬学的に許容可能なビヒクルおよび賦形剤は周知であり、当業者ならば、選択される有効化合物の性質および投与様式に対して適合させることができる。
好ましくは、これらの免疫複合体は、全身経路、特に、静脈内経路によるか、筋肉内、皮内、腹腔内もしくは皮下経路によるか、または経口経路によって投与される。より好ましい様式では、本発明による免疫複合体を含んでなる組成物は、一連の様式で数回投与される。
それらの投与様式、用量および最適な剤形は、例えば、患者の年齢または体重、患者の健康状態の重篤度、治療に対する耐用性、および報告されている副作用などの、患者に適合した治療の確立を一般に考慮した基準に従って決定することができる。
本発明の他の特徴および利点は、実施例および図面を含む本明細書の続きで明らかとなる。図面の範例を以下に示す。
ＳＮ１２Ｃ細胞でのＭａｂ−ｚａｐ結合二次抗体を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイ。 ＥＬＩＳＡによる、固定化したｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質（図２Ａ）、ｒｈＤｔｋ−Ｆｃ（図２Ｂ）またはｒｈＭｅｒ−Ｆｃ（図２Ｃ）タンパク質に対する１６１３Ｆ１２の結合特異性。 ヒト腫瘍細胞に対する１６１３Ｆ１２結合のＦＡＣＳ分析。 固定化ｒｍＡｘｌ−Ｆｃタンパク質 （「ｒｍ」はマウス組換えを表す）に対するＥＬＩＳＡ。 フローサイトメトリー法を用いて間接的標識プロトコールで決定されたＣＯＳ７細胞に対する１６１３Ｆ１２結合。 １６１３Ｆ１２を用いたＧａｓ６結合の競合ＥＬＩＳＡ。 ＳＮ１２Ｃ細胞溶解液を用いたウエスタンブロットによるエピトープ結合分析。ＮＨ（非加熱）；ＮＲ（非還元）；Ｈ（加熱）；Ｒ（還元）。ＧＡＰＤＨの検出は、ゲルに適切にサンプルがロードされたことの証拠となる。 ウエスタンブロットによる、ＳＮ１２Ｃ細胞に１６１３Ｆ１２が結合した後のＡｘｌダウンレギュレーションの研究。図８Ａは、実施した３回の独立した実験に代表的なウエスタンブロット画像（ウエスタンブロット解析は、ＳＮ１２Ｃ細胞上で１６１３Ｆ１２を４時間および２４時間インキュベートした後に行った）であり；図８Ｂは、「ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ」ソフトウエアを用いて表示したフィルムの光学密度の定量結果である。 １６１３Ｆ１２とのインキュベーション後のＳＮ１２Ｃ細胞の免疫蛍光顕微鏡像。図９Ａは、膜染色および細胞内染色の両場合のｍＩｇＧ１アイソタイプ対照条件の写真である。図９Ｂは、膜染色の場合である。図９Ｃは、１６１３Ｆ１２を用いた場合のＡｘｌ受容体および初期エンドソームマーカーＥＥＡ１の細胞内染色である。画像を重ね合わせたものを下に示し、可視化した同時局在を矢印で示す。 ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体の効果と比較した場合のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＳＮ１２Ｃ細胞増殖に対する１６１３Ｆ１２の効果。 種々のヒト腫瘍細胞株を用いた１６１３Ｆ１２−サポリン免疫複合体の直接的細胞傷害性アッセイ。Ａ− ＳＮ１２Ｃ、Ｂ− Ｃａｌｕ−１、Ｃ− Ａ１７２、Ｄ− Ａ４３１、Ｅ− ＤＵ１４５、Ｆ− ＭＤＡ−ＭＢ４３５Ｓ、Ｇ− ＭＤＡ−ＭＢ２３１、Ｈ− ＰＣ３、Ｉ− ＮＣＩ−Ｈ２２６、Ｊ− ＮＣＩ−Ｈ１２５、Ｋ− Ｐａｎｃ１。 ｍ１６１３Ｆ１２およびｈｚ１６１３Ｆ１２の両抗体のｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質に対する結合を調べるＥＬＩＳＡ実験。 ＳＮ１２Ｃ細胞に対するマウス、キメラおよびヒト化１６１３Ｆ１２抗体の結合比較。 ＳＮ１２Ｃヒト腎臓腫瘍細胞株を用いたマウスおよびヒト化両方の１６１３Ｆ１２−サポリン免疫複合体、ならびにアイソタイプ対照の存在下での直接的細胞傷害性アッセイ。 Ｃａｌｕ−１ヒト肺癌細胞株を用いたマウスおよびヒト化両方の１６１３Ｆ１２−サポリン免疫複合体、ならびにアイソタイプ対照の存在下での直接的細胞傷害性アッセイ。
以下の実施例では、１６１３Ｆ１２抗体またはｍ１６１３Ｆ１２抗体とは、マウス型の１６１３Ｆ１２抗体を意味する。ヒト化型の１６１３Ｆ１２抗体は、ｈｚ１６１３Ｆ１２と呼称される。
同様に、使用したアイソタイプ対照抗体は、９Ｇ４と呼ばれるマウスＩｇＧ１からなる。これは、以下の実施例では、ｍＩｇＧ１対照と９Ｇ４は同様であることを意味する。
実施例１：Ａｘｌ受容体のインターナリゼーション
免疫複合体アプローチは、標的抗原がインターナライズ性のタンパク質である場合により有効となるので、ヒト腫瘍細胞株に対するＭａｂ−Ｚａｐ細胞傷害性アッセイを用いたＡｘｌ受容体インターナリゼーションを試験した。より厳密には、Ｍａｂ−Ｚａｐ試薬は、アフィニティー精製したヤギ抗マウスＩｇＧとリボソーム不活化タンパク質サポリンを含む、化学複合体である。免疫複合体のインターナリゼーションが起これば、サポリンは破断して標的化薬剤から離れ、リボソームを不活化し、タンパク質合性の阻害、そして最終的には細胞死をもたらす。Ａｘｌ陽性細胞において１６１３Ｆ１２またはｍＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体とともに７２時間インキュベートした後に細胞の生存率を決定すれば、１６１３Ｆ１２により誘導されたＡｘｌ受容体インターナリゼーションに関する結論を下すことができる。
この実施例では、Ｑｉｆｉｋｉｔ試薬（Ｄａｋｏ）を用いて決定されたＡｘｌ陽性の高い細胞を使用した。データを下表５に示す。
以下の実施例では、ＳＮ１２Ｃ細胞を非限定例として用いた。その細胞表面で適当なレベルのＡｘｌ受容体を発現する他のいずれの細胞株も使用可能である。
一定の濃度範囲の１６１３Ｆ１２またはｍＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体を、細胞培養培地中、室温で３０分間、１００ｎｇのＭａｂ−Ｚａｐ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ）二次抗体とともにプレインキュベートした。これらの混合物を、白色の９６ウェルマイクロプレートに平板培養したサブコンフルエント状態のＳＮ１２Ｃ細胞に添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２の存在下で７２時間インキュベートした。細胞の生存率は、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ細胞増殖法を製造者（Ｐｒｏｍｅｇａ）の説明書に従って用いて測定した。いくつかの対照実験を行う：ｉ）二次免疫複合体を含まない場合、およびｉｉ）一次抗体を含まない場合。並行して、ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照でもアッセイを行った。
得られた結果を図１に示す。
１６１３Ｆ１２は、ＳＮ１２Ｃ細胞に対して約３６％の最大細胞傷害作用を示す。この実験では、ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照と考えられる９Ｇ４抗体の存在下で細胞傷害作用は見られなかった。一次抗体のみを含有するウェルでも細胞傷害性は見られなかった（データは示されていない）。従って、Ａｘｌ−１６１３Ｆ１２−ＭａｂＺａｐを含んでなる免疫複合体は標的細胞の効果的な細胞傷害性を誘発することから、Ａｘｌ受容体は、免疫複合体アプローチで標的とするのに都合のよい抗原であると思われる。
実施例２：ｒｈＡｘｌ ＥＣＤに対する抗体の作製
Ａｘｌ受容体のヒト細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対するマウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を作製するために、５個体のＢＡＬＢ／ｃマウスを、１５〜２０．１０６のＣＨＯ−Ａｘｌ細胞で５回（ｓ．ｃ．）および２０μｇのｒｈ Ａｘｌ ＥＣＤで２回免疫した。初回免疫誘導はフロイントの完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＤ、ＵＳＡ）の存在下で行った。その後の免疫誘導にはフロイントの不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ）を加えた。
融合３日前に、免疫マウスに、ＩＦＡを用い、２０×１０６のＣＨＯ−Ａｘｌ細胞および２０μｇのｒｈＡｘｌ ＥＣＤの両方で追加免疫を行った。
ハイブリドーマを作出するために、免疫マウス５個体のうち１個体（血清滴定後に選択）から採取した脾細胞およびリンパ球をそれぞれ脾臓の潅流および近位リンパ節の細断によって調製し、ＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ロックヴィル、ＭＤ、ＵＳＡ）と融合した。この融合プロトコールは、Kohler and Milstein (Nature, 256:495-497, 1975)に記載されている。次に、融合した細胞に対してＨＡＴ選択を行った。一般に、モノクローナル抗体またはそれらの機能的フラグメントの調製では、特にマウス起源の場合には、手引き書“Antibodies” (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988)に特に記載されている技術を参照することができる。
融合からおよそ１０日後に、ハイブリッド細胞のコロニーをスクリーニングした。一次スクリーニングのために、ＥＬＩＳＡを用い、ハイブリドーマの上清を、Ａｘｌ ＥＣＤタンパク質に対して生成したＭａｂの分泌に関して評価した。並行して、野生型ＣＨＯおよびＡｘｌ発現ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ）の両方を用い、細胞表面に存在する細胞型のＡｘｌに結合することができるＭａｂを選択するためにＦＡＣＳ分析を行った。
できるだけ速やかに、選択されたハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングし、その後、Ａｘｌ ＥＣＤタンパク質に対するそれらの反応性に関してスクリーニングした。次に、クローニングしたＭａｂのアイソタイプ分析を、Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇキット（カタログ番号５３００．０５、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、バーミンガム、ＡＬ、ＵＳＡ）を用いて行った。各ハイブリドーマから得られた１つのクローンを選択し、拡大培養した。
ＥＬＩＳＡアッセイを、純粋なハイブリドーマ上清を用いて以下のように行うか、または上清中のＩｇＧ含量が決定された場合には、５μｇ／ｍｌから始めて滴定を実施した。その後、以下の１１行で１／２連続希釈を行った。簡単に述べると、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３６９０、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）をＰＢＳ中２μｇ／ｍｌのｒｈ Ａｘｌ−Ｆｃタンパク質（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５４−ＡＬ）またはｒｈＡｘｌ ＥＣＤ ５０μｌ／ウェルで、４℃にて一晩コーティングした。次に、これらのプレートを０．５％ゼラチン（＃２２１５１、Ｓｅｒｖａ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイツ）を含有するＰＢＳで３７℃にて２時間ブロッキングした。プレートを軽くたたいて飽和バッファーを排出したところで、５０μｌの純粋なハイブリドーマ細胞上清または５０μｌの５μｇ／ｍｌ溶液をＥＬＩＳＡプレートに加え、３７℃で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、５０μｌのセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ（＃１１５−０３５−１６４、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ウエストグローブ、ＰＡ、ＵＳＡ）を、０．１％ゼラチンおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（ｗ：ｗ）を含有するＰＢＳ中、１／５０００希釈で、３７℃にて１時間加えた。次に、ＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、ＴＭＢ（＃ＵＰ６６４７８２、Ｕｐｔｉｍａ、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、フランス）基質を加えた。室温で１０分のインキュベーション時間の後、１Ｍ硫酸を用いて反応を停止させ、４５０ｎｍで光学密度を測定した。
フローサイトメトリーによる選択のため、１０５細胞（野生型ＣＨＯまたはＣＨＯ−Ａｘｌ）を９６ウェルプレートの各ウェルの、１％ＢＳＡおよび０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）中に、４℃で平板培養した。２０００ｒｐｍで２分の遠心分離の後、バッファーを除去し、供試するハイブリドーマ上清または精製したＭａｂ（１μｇ／ｍｌ）を加えた。４℃で２０分のインキュベーション後、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中に１／５００°希釈されたＡｌｅｘａ ４８８結合ヤギ抗マウス抗体（＃Ａ１１０１７、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｓ Ｉｎｃ．、ユージーン、ＵＳＡ）を加え、４℃で２０分間インキュベートした。ＦＡＣＳバッファーでの最終洗浄の後、ヨウ化プロピジウムを各試験管に終濃度４０μｇ／ｍｌで加えた後に細胞をＦＡＣＳ（Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析した。細胞のみを含有するウェルおよびＡｌｅｘａ ４８８結合二次抗体とともにインキュベートした細胞を含有するウェルを陰性対照として含めた。アイソタイプ対照を核実験に用いた（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆ Ｍ９０３５１ＭＧ）。少なくとも５０００細胞を評価して蛍光強度（ＭＦＩ）の平均値を計算した。
より厳密には、融合は、採取した３００×１０６の脾細胞と３００×１０６の骨髄腫細胞（１：１比）で行った。得られた細胞懸濁液の２００細胞を３０枚の９６ウェルプレートに２×１０６細胞／ｍｌで平板培養した。
ｒｈＡｘｌ ＥＣＤタンパク質に対するＥＬＩＳＡおよび野生型ＣＨＯおよびＡｘｌ発現ＣＨＯ細胞の両方を用いたＦＡＣＳ分析の双方による最初のスクリーニング（融合後１４日前後）で、ｒｈ ＡｘｌＥＣＤコーティング上で約１の光学密度（ＯＤ）および野生型ＣＨＯ細胞で５０未満、ＣＨＯ−Ａｘｌ細胞で約２００のＭＦＩを示す１０個のハイブリドーマを選択することができた。
これら１０個のハイブリドーマを拡大培養し、限界希釈法によりクローニングした。各コードにつき、１枚の９６ウェルプレートを準備した。平板培養９日後に、クローニングプレートからの上清を、まず、ＡｘｌＥＣＤタンパク質の細胞外ドメインに対するそれらの結合特異性に関してＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。各コードの３つのクローンを拡大培養し、アイソタイプ分析を行った。ひと度産生されれば、抗Ａｘｌ抗体を細胞表面にＡｘｌが結合した後にインターナライズされる能力に関してさらに検討した。
実施例３：Ａｘｌの結合特異性
この実施例では、まず、ｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質に対する１６１３Ｆ１２の結合を検討した。次に、ＴＡＭファミリーの他の２つのメンバーｒｈＤｔｋ−ＦｃおよびｒｈＭｅｒ−Ｆｃに対するその結合を検討した。
簡単に述べると、組換えヒトＡｘｌ−Ｆｃ（Ｒ ａｎｄ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５４ＡＬ／ＣＦ）、ｒｈＤｔｋ（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８５９−ＤＫ）またはｒｈＭｅｒ−Ｆｃ（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８９１−ＭＲ）タンパク質をＩｍｍｕｌｏｎ ＩＩ９６ウェルプレートに４℃で一晩コーティングし、０．５％ゼラチン溶液で１時間のブロッキング工程の後、１６１３Ｆ１２精製抗体を開始濃度５μｇ／ｍｌ（３．３３ １０−８Ｍ）で、３７℃にてさらに１時間加えた。次に、１／２連速希釈を１２列にわたって行った。プレートを洗浄し、ヤギ抗マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ）特異的ＩｇＧ−ＨＲＰを３７℃で１時間加えた。反応の開始はＴＭＢ基質溶液を用いて行った。アイソタイプ対照抗体ｍＩｇＧ１および市販の抗Ａｘｌ Ｍａｂ １５４抗体も並行して用いた。コーティング対照は、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃポリクローナル血清（Ｊａｃｋｓｏｎ、ｒｅｆ １０９−０３５−０９８）の存在下および／またはＨＲＰ結合抗ヒスチジン抗体（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｒｅｆ：ＭＡＢ０５０Ｈ）の存在下で実施した。結果はそれぞれ図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃに示す。
この実施例は、１６１３Ｆ１２抗体がｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質とのみ結合し、ＴＡＭファミリーの他の２つのメンバーｒｈＤｔｋまたはｒｈＭｅｒには結合しないことを示す。ＴＡＭメンバー間で１６１３Ｆ１２抗体の結合の交差特異性は見られなかった。一次抗体の不在下（希釈剤(diluant)）で非特異的結合は見られなかった。アイソタイプ対照抗体の存在下で結合は見られなかった。
実施例４：１６１３Ｆ１２は腫瘍細胞で発現された細胞型のＡｘｌを認識した
Ａｘｌ発現レベルの定量を可能とするために、まず、較正ビーズと並行して市販のＡｘｌ抗体（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｒｅｆ：ＭＡＢ１５４）を用い、ヒト腫瘍細胞上の細胞表面Ａｘｌ発現レベルを確立した。次に、１６１３Ｆ１２を用いて、細胞表面Ａｘｌの結合を検討した。
細胞表面結合の検討のため、１０μｇ／ｍｌ（６．６６ １０−８Ｍ）一次抗体溶液（１６１３Ｆ１２、ＭＡＢ１５４抗体またはｍＩｇＧ１アイソタイプ対照９Ｇ４ Ｍａｂ）の２倍連続希釈液を作製し、４℃で２０分間、２×１０５細胞に適用する。１％ＢＳＡおよび０．０１％ＮａＮ３を添加したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で３回洗浄した後、細胞を二次抗体ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ ４８８（１／５００°希釈）とともに４℃で２０分間インキュベートした。１％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を添加したＰＢＳ中でさらに３回洗浄した後、細胞をＦＡＣＳ（Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析した。少なくとも５０００細胞を評価して蛍光強度の平均値を計算した。
ＭＡＢ１５４抗体を用いた定量的ＡＢＣ測定のために、ＱＩＦＩＫＩＴ（登録商標）較正ビーズを用いる。次に、細胞を、ＱＩＦＩＫＩＴ（登録商標）ビーズと並行し、飽和濃度のポリクローナルヤギ抗マウス免疫グロブリン／ＦＩＴＣ、ヤギＦ（ａｂ’）２とともにインキュベートする。その後、検体細胞上の抗原部位の数を、検量線（ビーズ上のＭａｂ分子の数に対する個々のビーズ集団の蛍光強度）の補間によって求める。
４．１．細胞表面Ａｘｌ発現レベルの定量
ヒト腫瘍細胞表面のＡｘｌ発現レベルを、細胞表面抗原を評価するための定量的フローサイトメトリーキットである間接的免疫蛍光アッセイ（ＱＩＦＩＫＩＴ（登録商標）法（Ｄａｋｏ、デンマーク）を用い、フローサイトメトリーにより決定した。較正グラフによってビーズの既知の抗原レベルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を比較すると、細胞株の抗体結合能（ＡＢＣ）が決定できる。
表６は、市販の抗体ＭＡＢ１５４（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＱＩＦＩＫＩＴ（登録商標）を用いて決定した場合の、種々のヒト腫瘍細胞株（ＳＮ１２Ｃ、Ｃａｌｕ−１、Ａ１７２、Ａ４３１、ＤＵ１４５、ＭＤＡ−ＭＢ４３５Ｓ、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＰＣ３、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ１２５、ＭＣＦ７、Ｐａｎｃ１）（ＡＴＣＣ、ＮＣＩ）の表面で検出されたＡｘｌ発現レベルを示す。値を抗原結合複合体（ＡＢＣ）として示す。
市販のＡｘｌモノクローナル抗体（ＭＡＢ１５４）で得られた結果は、Ａｘｌ受容体は、検討するヒト腫瘍細胞に応じて様々なレベルで発現されることを示した。
４．２．ヒト腫瘍細胞での１６１３Ｆ１２によるＡｘｌの検出
より具体的には、１６１３Ｆ１２を用いて、Ａｘｌの結合を調べた。
１６１３Ｆ１２用量反応曲線を作成した。次に、種々のヒト腫瘍細胞を用いて得られたＭＦＩをＰｒｉｓｍソフトウエアで分析した。データを図３に示す。
データは、飽和曲線プロフィールにより示されるように、１６１３Ｆ１２は膜Ａｘｌ受容体と特異的に結合することを示唆する。しかしながら、標識強度の違いが見られ、ヒト腫瘍細胞上の細胞表面Ａｘｌ受容体が様々なレベルであることが明らかとなった。ＭＣＦ７ヒト乳房腫瘍細胞株を用いた場合には、Ａｘｌ受容体の結合は見られなかった。
実施例５：１６１３Ｆ１２種間交差特異性
１６１３Ｆ１２の種交差特異性に取り組むため、マウスとサルの２つの種を検討した。まず、組換えマウス（ｒｍ）Ａｘｌ受容体に対する結合をＥＬＩＳＡにより調べる（図４）。次に、サルＣＯＳ７細胞がそれらの表面にＡｘｌ受容体を発現することから、これらの細胞を用いてフローサイトメトリー実験を行った（図５）。ＣＯＳ７細胞株は、アフリカミドリザルの腎臓細胞に由来するＣＶ−１細胞株を、ラージＴ抗原を産生するがゲノム複製に欠陥を持つＳＶ４０ゲノムの一形態で不死化することにより得られたものである。
ｒｍＡｘｌ−Ｆｃ ＥＬＩＳＡ
簡単に述べると、組換えマウスＡｘｌ−Ｆｃ（Ｒ ａｎｄ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８５４−ＡＸ／ＣＦ）タンパク質をＩｍｍｕｌｏｎ ＩＩ ９６ウェルプレートに４℃で一晩コーティングし、０．５％ゼラチン溶液で１時間のブロッキング工程の後、１６１３Ｆ１２精製抗体を開始濃度５μｇ／ｍｌ（３．３３ １０−８Ｍ）で３７℃にてさらに１時間加えた。次に、１／２連速希釈を１２列にわたって行った。プレートを洗浄し、ヤギ抗マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ）特異的ＩｇＧ ＨＲＰを３７℃で１時間加えた。反応の開始はＴＭＢ基質溶液を用いて行った。ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体および市販の抗体Ａｘｌ Ｍａｂ １５４も並行して用いた。コーティング対照は、ＨＲＰと結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃポリクローナル血清（Ｊａｃｋｓｏｎ、ｒｅｆ １０９−０３５−０９８）の存在下および／またはＨＲＰ結合抗ヒスチジン抗体（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｒｅｆ：ＭＡＢ０５０Ｈ）の存在下で実施した。
結果は図４に示す。この図は、１６１３Ｆ１２がマウスＡｘｌ ＥＣＤ ドメインに結合しないことを示す。一次抗体の不在下（希釈剤(diluant)）では、非特異的結合は見られなかった。
ＦＡＣＳ ＣＯＳ７
ＣＯＳ７細胞を用いた１６１３Ｆ１２細胞結合試験については、２×１０５細胞を、１６１３Ｆ１２またはｍＩｇＧ１アイソタイプ対照Ｍａｂの１０μｇ／ｍｌ（６，６６ １０−８Ｍ）抗体溶液の１／２連続希釈（１２点）によって作製した抗体濃度範囲で、４℃にて２０分間インキュベートした。１％ＢＳＡおよび０．０１％ＮａＮ３を添加したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で３回洗浄した後、細胞を二次抗体ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ ４８８（１／５００希釈）とともに４℃で２０分間インキュベートした。１％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を添加したＰＢＳ中でさらに３回洗浄した後、細胞をＦＡＣＳ（Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析した。少なくとも５０００細胞を評価し、蛍光強度の平均値を計算した。データはＰｒｉｓｍソフトウエアを用いて分析する。
結果を図５に示す。１６１３Ｆ１２を用いてＣＯＳ７細胞で確立した滴定曲線により、１６１３Ｆ１２がＣＯＳ７細胞の表面で発現されたサル細胞型のＡｘｌ受容体を認識できることが確認される。０．６２５μｇ／ｍｌ（４．２ １０−１０Ｍ）を超える１６１３Ｆ１２濃度でプラトーに達する。ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照の存在下では、結合は見られない。
本実施例は、１６１３Ｆ１２はマウスＡｘｌ受容体と交差反応しないことを示す。対照的に、１６１３Ｆ１２は、ＣＯＳ７細胞の表面で発現されたサルＡｘｌ受容体と強く結合する。
実施例６：１６１３Ｆ１２の存在下で行ったＧａｓ６競合実験
１６１３Ｆ１２をさらに特徴付けるために、Ｇａｓ６競合アッセイを行った。このアッセイでは、遊離ｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質および１６１３Ｆ１２をインキュベートして抗原−抗体複合体を形成させ、次いで、これらの複合体をアッセイプレートのＧａｓ６コーティング表面に添加する。結合していない抗体−抗原複合体を洗い流した後、ｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質のヒトＦｃ部分に対する、酵素結合二次抗体を加える。次に、基質を加え、酵素−基質反応により誘発されたシグナル強度によって抗原濃度を決定することができる。
簡単に述べると、供試抗Ａｘｌ Ｍａｂの存在下または不在下で、ｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質を含んでなる反応混合物を、個別の飽和（１倍ＰＢＳ中０．５％ゼラチン）プレートで調製する。系統１：マウス抗Ａｘｌ抗体の２倍希釈（８０μｇ／ｍｌから始めて１２列）を行う。次に、ＥＬＩＳＡ希釈液(diluent)（１倍ＰＢＳ中、０．１％ゼラチン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）のみを含有する陰性対照系を除いて、０．５μｇ／ｍｌのｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｒｅｆ．１５４ＡＬ／ＣＦ）を加える。ホモジナイゼーションの後、ＰＢＳ中、６μｇ／ｍｌのｒｈＧａｓ６溶液（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ カタログ番号８８５−ＧＳ−ＣＳ／ＣＦ）の入ったＧａｓ６コーティングプレートに競合サンプルを添加する。インキュベーションおよび数回の洗浄の後、結合したｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ、ｒｅｆ．１０９−０３５−０９８）を用いて検出する。結合したところで、これらのプレートにＴＭＢ基質を加える。１Ｍ Ｈ２ＳＯ４酸溶液を加えることによって反応を停止させ、得られた光学密度を、マイクロプレートリーダー装置を用いて４５０ｎｍで読み取る。
この実験（図６）は、１６１３Ｆ１２がその固定化リガンド上でｒｈＡｘｌ−Ｆｃ結合と競合し得ることを示す。Ｇａｓ６結合との競合は、２．５μｇ／ｍｌ（１．６７ １０−８Ｍ）を超える濃度の１６１３Ｆ１２抗体の存在下で起こる。１０μｇ／ｍｌ（６．６７ １０−８Ｍ）を超える濃度の１６１３Ｆ１２の存在下では、固定化Ｇａｓ６に対するｒｈＡｘｌ−Ｆｃの結合はもはや見られない。１６１３Ｆ１２は、ｒｈＡｘｌ−Ｆｃに対するＧａｓ６結合を遮断する。
実施例７：ウエスタンブロットによるエピトープ認識
１６１３Ｆ１２が直鎖またはコンフォメーションエピトープを認識するかどうかを決定するため、ＳＮ１２Ｃ細胞溶解液を用いてウエスタンブロット解析を行った。還元条件または非還元条件となるようにサンプルに異なる処理を施した。還元型のサンプルでバンドが見られれば、その処理抗体はＥＣＤドメインの直鎖エピトープを標的とし、そうでなれば、その抗体はＡｘｌ ＥＣＤのコンフォメーションエピトープに対して生じたものである。
ＳＮ１２Ｃ細胞を、Ｔ１６２ｃｍ２フラスコにて、ＲＰＭＩ＋１０％熱失活ＦＢＳ＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン中、５×１０４細胞／ｃｍ２で播種し、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で７２時間培養した。次に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１．５ｍｌの氷冷溶解バッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０；０．５％デオキシコール酸塩；および全プロテアーゼ阻害剤カクテル１錠と１％抗ホスファターゼ］で溶解させた。細胞溶解液を４℃で９０分間振盪し、１５０００ｒｐｍで１０分間、清澄化した。ＢＣＡを用いてタンパク質濃度を定量した。種々のサンプルを添加した。まず、１０μｇの全細胞溶解液（２０μｌ中、１０μｇ）を還元条件（１倍サンプバッファー（ＢＩＯＲＡＤ）＋１倍還元剤（ＢＩＯＲＡＤ））で調製し、９６℃で２分のインキュベーション後にＳＤＳ−ＰＡＧＥに添加した。次に、１０μｇの全細胞溶解液を別に２サンプル、非還元条件（１倍サンプルバッファー（ＢＩＯＲＡＤ）単独中）で調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに添加する前に、これら２つの前記サンプルのうち一方を９６℃で２分のインキュベーションで加熱し、もう一方を氷上で維持する。泳動後、タンパク質をニトロセルロース膜に転写する。膜を室温にて１時間、ＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ ２０ ０．１％（ＴＢＳＴ）、５％脱脂乳で飽和させ、４℃にて一晩、１０μｇ／ｍｌの１６１３Ｆ１２でプロービングした。抗体を、５％脱脂乾燥乳を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水−０．１％ｔｗｅｅｎ ２０（ｖ／ｖ）（ＴＢＳＴ）中に希釈した。次いで、膜をＴＢＳＴで洗浄し、ペルオキシダーゼ結合二次抗体（１／１０００希釈）とともに室温で１時間インキュベートした。免疫反応性タンパク質をＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ ＃３２２０９）で可視化した。Ａｘｌを可視化した後、膜をＴＢＳＴで１回洗浄し、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（１／２０００００希釈）とともに室温で１時間インキュベートした。次いで、膜をＴＢＳＴで洗浄し、ペルオキシダーゼ結合二次抗体とともに、室温で１時間インキュベートした。膜を洗浄し、ＥＣＬを用いてＧＡＰＤＨを可視化した。
結果を図７に示す。
特異的バンドは基本的に非還元条件で見られるので、１６１３Ｆ１２は主としてコンフォメーションエピトープを認識する。しかしながら、ＳＮ１２Ｃ細胞溶解液の変性移動条件でも弱いシグナルが検出され、このことは、１６１３Ｆ１２が直鎖エピトープにも弱く結合し得ることを示している。
実施例８：１６１３Ｆ１２により誘発されたＡｘｌダウンレギュレーションの、ウエスタンブロットによる測定
以下の実施例では、Ａｘｌ受容体発現に対するＡｘｌ抗体の活性に取り組むため、ヒト腎細胞癌細胞株ＳＮ１２Ｃ（ＡＴＣＣ）を選択した。ＳＮ１２Ｃ細胞株はＡｘｌ受容体を過剰発現する。図８Ａ〜８Ｂの全細胞抽出液に対するウエスタンブロットにより、Ａｘｌダウンレギュレーションを検討した。
ＳＮ１２Ｃ細胞を、６ウェルプレートにて、ＲＰＭＩ＋１０％熱失活ＦＢＳ＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン中、６×１０４細胞／ｃｍ２で播種し、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で４８時間培養した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、細胞を、８００ｎｇ／ｍｌの組換えマウスｇａｓ６リガンド（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｒｅｆ：９８６−ＧＳ／ＣＦ）または１０μｇ／ｍｌのｍＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（９Ｇ４）または１０μｇ／ｍｌの本発明のＡｘｌ抗体のいずれかを含有する培地中で血清飢餓状態とし、さらに４時間または２４時間インキュベートした。次に、培地を静かに除去し、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を２００μｌの氷冷溶解バッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０；０．５％デオキシコール酸塩；および完全プロテアーゼ阻害剤カクテル１錠と１％抗ホスファターゼ］で溶解させた。細胞溶解液を４℃で９０分間振盪し、１５０００ｒｐｍで１０分間、清澄化した。ＢＣＡを用いてタンパク質濃度を定量した。全細胞溶解液（２０μｌ中、１０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜に転写した。膜を室温にて１時間、ＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ ２０ ０．１％（ＴＢＳＴ）、５％脱脂乳で飽和させ、４℃にて一晩、市販のＭ０２ Ａｘｌ抗体０．５μｇ／ｍｌ（ＡｂＮｏｖａ Ｈ０００００５５８−Ｍ０２）でプロービングした。抗体を、５％脱脂乾燥乳を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水−０．１％ｔｗｅｅｎ ２０（ｖ／ｖ）（ＴＢＳＴ）中に希釈した。次いで、膜をＴＢＳＴで洗浄し、ペルオキシダーゼ結合二次抗体（１／１０００希釈）とともに室温で１時間インキュベートした。免疫反応性タンパク質をＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ ＃３２２０９）で可視化した。Ａｘｌを可視化した後、膜をＴＢＳＴで１回洗浄し、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（１／２０００００希釈）とともに室温で１時間インキュベートした。次いで、膜をＴＢＳＴで洗浄し、ペルオキシダーゼ結合二次抗体とともに、室温で１時間インキュベートした。膜を洗浄し、ＥＣＬを用いてＧＡＰＤＨを可視化した。バンド強度を濃度計により定量した。
図Ａおよび８Ｂに示す結果は３回の独立した実験の代表例であり、１６１３Ｆ１２が、Ａｘｌを過剰発現するヒト腫瘍細胞株でＡｘｌをダウンレギュレートし得ることを示す。４時間の時点で、１６１３Ｆ１２は６６％の、そして、１６１３Ｆ１２とともに２４時間インキュベートした後には最大８７％の、Ａｘｌのダウンレギュレーションを誘発する。
実施例９：細胞表面Ａｘｌ発現に対する１６１３Ｆ１２の効果のフローサイトメトリー試験
フローサイトメトリー技術は、細胞表面のＡｘｌ受容体の標識を可能とする。この技術の使用は、膜Ａｘｌ発現に対する抗体の効果を強調することができる。本実施例では、高レベルのＡｘｌを発現するヒト腎腫瘍ＳＮ１２Ｃ細胞を用いた。
ＳＮ１２Ｃ腫瘍細胞株を、１％Ｌ−グルタミンおよび１０％ＦＣＳを含むＲＭＰＩ１６４０中で、実験前に３日間培養した。次に、トリプシンを用いて細胞を解離させ、６マルチウェルプレートの、１％Ｌ−グルタミンおよび５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中で平板培養した。翌日、目的抗体を１０μｇ／ｍｌで加えた。非処理ウェルも含めた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、解離させ、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０１％アジ化ナトリウム）中で、同じ目的抗体とともにインキュベートした。処理細胞および非処理細胞に対して同じＭａｂで得られたシグナル強度を比較するために、非処理ウェルも同じ抗体で染色した。細胞を４℃で２０分間インキュベートし、ＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した。Ａｌｅｘａ ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を２０分間インキュベートし、細胞を３回洗浄した後、ヨウ化プロピジウム陰性細胞集団に対してＦＡＣＳ分析を行った。
（ｉ）Ｔ２４時間にＡｂ処理細胞に比べた場合の、処理（Ａｂ無し）細胞の表面で検出された蛍光シグナルの違い、および（ｉｉ）細胞表面に残留するＡｘｌのパーセンテージ、の２つのパラメーターを決定する。残留Ａｘｌのパーセンテージは次のように計算する。
％残留Ａｘｌ＝（ＭＦＩＡｂ２４ｈ／ＭＦＩＡｂなし２４ｈ）×１００
１つの代表的な実験からのデータを表７に示す。これらの結果は、３回の独立した実験で再現された。
非処理細胞と同じ抗体で処理された条件におけるＭａｂ染色間のＭＦＩの違いは、検討下のＭａｂの結合による細胞表面でのＡｘｌタンパク質のダウンレギュレーションを反映する。抗体を含まない条件は、アイソタイプ対照抗体（ｍ９Ｇ４）の存在下の条件と同様の結果をもたらした。
これらのデータは、１６１３Ｆ１２で２４時間処理した細胞の表面に検出された平均蛍光強度が１６１．３Ｆ１２で標識した非処理細胞で得られたＭＦＩに比べて減少する（−５１４）ことを示す。１６１３Ｆ１２抗体とともに２４時間インキュベートした後、４５．２％の細胞表面Ａｘｌ受容体がＳＮ１２Ｃ細胞表面に残留する。
実施例１０：蛍光免疫細胞化学標識を用いた１６１３Ｆ１２のインターナリゼーション試験
補足的インターナリゼーション結果を、直接的蛍光標識法を用いた共焦点顕微鏡観察により得る。
簡単に述べると、ＳＮ１２Ｃ腫瘍細胞株を、１％Ｌ−グルタミンおよび１０％ＦＣＳを含むＲＭＰＩ１６４０中で、実験前に３日間培養した。次に、トリプシンを用いて細胞を解離させ、カバーガラスを含む６マルチウェルプレートの、１％Ｌ−グルタミンおよび５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中で平板培養した。翌日、１６１３Ｆ１２を１０μｇ／ｍｌで加えた。無関連の抗体で処理した細胞も含めた。その後、これらの細胞を３７℃、５％ＣＯ２で１時間および２時間インキュベートした。Ｔ０時間では、細胞表面への抗体の結合を判定するために、細胞を４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、パラホルムアルデヒドで１５分間固定した。細胞をすすぎ、ヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ ４８８抗体とともに４℃で６０分間インキュベートして、細胞表面に残留する抗体を確認した。抗体の細胞への浸透を追跡するため、細胞を固定し、サポニンで透過処理を施した。ヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて膜抗体および細胞内抗体の両方を染色した。初期エンドソームを、ＥＥＡ１に対するウサギポリクローナル抗体を用いて同定し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ ５５５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で可視化した。細胞を３回洗浄し、Ｄｒａｑ５を用いて核を染色した。染色後、細胞をＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ封入剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に封入し、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０共焦顕微鏡を用いて分析した。
写真を図９Ａ〜９Ｃに示す。
画像を共焦点顕微鏡によって得た。ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照（９Ｇ４）の存在下では、膜染色も細胞内標識も見られない（図９Ａ）。ＳＮ１２Ｃ細胞を１６１３Ｆ１２とともに１時間インキュベートした後すぐに膜抗Ａｘｌ標識の段階的損失が見られる（図９Ｂ）。１時間および２時間の時点で１６１３Ｆ１２抗体の細胞内蓄積が明らかに見られる（図９Ｃ）。細胞内抗体は初期エンドソームマーカーであるＥＥＡ１と同時局在する。これらの写真から、ＳＮ１２Ｃ細胞への１６１３Ｆ１２のインターナリゼーションが確認される。
実施例１１：ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗Ａｘｌ媒介抗腫瘍活性
ＳＮ１２Ｃ増殖アッセイ
ウェル当たり１０００個のＳＮ１２Ｃ細胞を９６ウェルプレートのＦＣＳ不含培地に播種し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で一晩培養した。翌日、細胞を１０μｇ／ｍｌの各抗体とともに３７℃で１時間プレインキュベートした。ウェルに直接リガンドを加えることにより、細胞をｒｍＧａｓ６（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号９８６−ＧＳ／ＣＦ）で処理し、または処理せず、その後、７２時間放置して増殖させた。増殖は３Ｈチミジン組み込みに従って測定した。
データを図１０に示す。１６１３Ｆ１２で効果は見られず、これをＳＮ１２Ｃ細胞に加えてもサイレントである。
実施例１２：種々のヒト腫瘍細胞株における１６１３Ｆ１２−サポリン免疫複合体の細胞傷害効力
本実施例では、サポリン結合１６１３Ｆ１２の細胞傷害効力を記載する。この目的で、ヒト腫瘍細胞株の大パネルを用いて、直接的ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイを行った（図１１Ａ〜１１Ｋ）。この腫瘍細胞株パネルは、種々の細胞表面Ａｘｌ発現を与える。
簡単に述べると、５０００個の細胞を９６ウェル培養プレートの１００μｌの５％ＦＢＳ適切培養培地中に播種した（Ｄ０）。５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で２４時間インキュベートした後、一定の濃度範囲の免疫複合体（１６１３Ｆ１２−サポリンまたは９Ｇ４−サポリンまたは裸の１６１３Ｆ１２または９Ｇ４）を細胞に適用する。次に、培養プレートを３７℃、加湿５％ＣＯ２インキュベーター内で７２時間インキュベートする。
４日目に、細胞生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、マディソン、ウィスコンシン州）（このキットは、代謝的に活性な細胞の指標としての、存在するＡＴＰの定量に基づいて培養物中の生細胞の数を決定することができる）を用いて評価する。発光を照度計により記録する。
発光出力から下式を用いて細胞傷害性のパーセンテージが計算される。
細胞傷害性％＝１００−［（ＲＬＵＡｂ−ｓａｐ×１００）／ＲＬＵＡｂなし］
図１１Ａ〜１１Ｋには、一定範囲の１６１３Ｆ１２−サポリン免疫複合体濃度で処理した（Ａ）ＳＮ１２Ｃ、（Ｂ）Ｃａｌｕ−１、（Ｃ）Ａ１７２、（Ｄ）Ａ４３１、（Ｅ）ＤＵ１４５、（Ｆ）ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、（Ｇ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、（Ｈ）ＰＣ３、（Ｉ）ＮＣＩ−Ｈ２２６、（Ｊ）ＮＣＩ−Ｈ１２５または（Ｋ）Ｐａｎｃ１腫瘍細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイにおいて明瞭に得られた免疫複合体濃度に応じた細胞傷害性パーセンテージを示すグラフがまとめられている。
図１１Ａ〜１１Ｋは、１６１３Ｆ１２−サポリン免疫複合体がこれらの種々のヒト腫瘍細胞株において細胞傷害性を誘発したことを示す。結果として得られた細胞傷害作用の効力はヒト腫瘍細胞株によって異なる。
実施例１３：１６１３Ｆ１２抗体可変ドメインのヒト化
ヒトにおける治療適用のためのマウス抗体（Ｍａｂ）の使用は、一般に、大きな有害作用をもたらし、患者はヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応を生じ、それにより、治療の有効性を低下させ、継続的な投与を妨げる。この問題を克服するための１つのアプローチは、抗原結合活性を改変することなく、マウス配列をそれらのヒト対応物で置換することによりマウスＭａｂをヒト化することである。これは２つの主な方法、すなわち、（ｉ）マウス可変領域がヒト定常領域と連結されているマウス／ヒトキメラ抗体の構築(Boulianne et al., 1984)および（ｉｉ）マウス可変領域由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）を注意深く選択されたヒト可変領域にグラフトし、次いで、これらの「再成形されたヒト」可変領域をヒト定常領域と連結すること(Riechmann et al., 1988)によって達成することができる。
１３．１．１６１３Ｆ１２抗体のヒト化型の設計
１３．１．１ 軽鎖可変ドメインＶＬのヒト化
予備工程として、１６１３Ｆ１２ ＶＬのヌクレオチド配列を、ＩＭＧＴデータベース(http://www.imgt.org)のマウス生殖細胞系遺伝子の部分と比較した。マウスＩＧＫＶ１６−１０４＊０１およびＩＧＫＪ５＊０１生殖細胞系遺伝子を同定した。ＣＤＲグラフトに最良のヒト候補を同定するために、１６１３Ｆ１２ ＶＬマウス配列と最良の同一性を示すヒト生殖細胞系遺伝子を検索した。ＩＭＧＴデータベース分析ツールの助けで、マウス１６１３Ｆ１２ ＶＬ ＣＤＲに対する、可能性のあるアクセプターヒトＶ領域：ＩＧＫＶ１−２７＊０１およびＩＧＫＪ４＊０２を同定した。軽鎖可変ドメインにヒト化を行うために、ヒト配列とマウス配列の間で異なる各残基に優先ランク順位を与えた。これらの優先順位（１〜４）を用いて、最大１４の復帰突然変異を有する軽鎖可変領域の、異なる１１のヒト化変異体を作出した。
１３．１．２ 重鎖可変ドメインＶＨのヒト化
ＣＤＲグラフトの最良のヒト候補を同定するために、１６１３Ｆ１２ ＶＨと最良の同一性を示すマウスおよびヒト生殖細胞系遺伝子を検索した。１６１３Ｆ１２ ＶＨのヌクレオチド配列を、ＩＭＧＴデータベースの一部である配列アラインメントソフトウエア「ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ」を使用することにより、マウスおよびヒトの両方の生殖細胞系遺伝子配列とアラインした。ベクターＮＴＩパッケージの「Ａｌｉｇｎ Ｘ」ソフトウエアを用いてヌクレオチド配列アラインメントの結果を確認するために、アミノ酸配列のアラインメントも行った。マウス生殖細胞系遺伝子とのアラインメントは、マウス生殖細胞系Ｖ遺伝子ＩＧＨＶ１４−３＊０２およびＪ遺伝子ＩＧＨＪ２＊０１が最も相同なマウス生殖細胞系遺伝子であることを示した。ＩＭＧＴデータベースを使用し、マウスＤ遺伝子生殖細胞系ＩＧＨＤ１−１＊０１を相同配列として同定した。ＣＤＲグラフトのために適当なヒト生殖細胞系を選択するために、１６１３Ｆ１２ ＶＨマウス配列と最高の相同性を有するヒト生殖細胞系遺伝子を同定した。ＩＭＧＴデータベースおよびツールの助けで、ヒトＩＧＨＶ１−２＊０２生殖細胞系遺伝子およびヒトＩＧＨＪ５＊０１ Ｊ生殖細胞系遺伝子を、マウス１６１３Ｆ１２ ＶＨ ＣＤＲに対するヒトアクセプター配列として選択した。重鎖可変ドメインにヒト化を行うために、ヒト配列とマウス配列の間で異なる各残基に優先ランク順位（１〜４）を与えた。これらの優先順位を用いて、最大１８の復帰突然変異を有する重鎖可変領域の、異なる２０のヒト化変異体を作出した。
３．２．ｍ１６１３Ｆ１２に対するｈｚ１６１３Ｆ１２のバリデーション
ヒト化１６１３Ｆ１２がそのマウス１６１３Ｆ１２型に匹敵するかどうかを確認するために、ｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質アッセイを使用するＥＬＩＳＡ、およびＳＮ１２Ｃ細胞を使用するＦＡＣＳの両方により、結合実験を行った。補足として、ＳＮ１２Ｃヒト腎臓腫瘍細胞およびＣａｌｕ−１ヒト肺癌細胞株を用いて直接的ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイを行った。
まず、ＥＬＩＳＡ実験を実施した。このアッセイでは、９６ウェルプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ＩＩ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を４℃にて一晩、１倍ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌの１６１３Ｆ１２溶液でコーティングした。飽和工程の後、これらのコーティングプレート上で、一定範囲のｒｈ Ａｘｌ−Ｆｃタンパク質（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｒｅｆ：１５４−ＡＬ）濃度（５μｇ／ｍｌ〜０．０２μｇ／ｍｌ）を３７℃で１時間インキュベートした。この暴露工程の後、ビオチン化−Ａｘｌ抗体（自家生成物）を０．８５μｇ／ｍｌで３７℃にて１時間加えた。このＡｘｌ抗体は、明らかに異なるエピトープ群に属す。次に、希釈バッファー中、１／２０００°のアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ溶液をこれらのウェルに加えた。次いで、ＴＭＢ基質溶液を５分間加えた。ペルオキシダーゼ停止溶液を加えた後、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍで吸光度を測定した。
図１２は、マウスおよびヒト化１６１３Ｆ１２抗体は両方とも同等にｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質と結合することを示す。
ＦＡＣＳ分析のために、ＳＮ１２Ｃ細胞をＲＰＭＩ １６４０＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン＋１０％血清中で培養した。トリプシンを用いて細胞を解離させ、細胞濃度をＦＡＣＳバッファーで１×１０６細胞／ｍｌに調整した。容量１００μＬの細胞懸濁液を漸増濃度のアイソタイプ対照または抗Ａｘｌ抗体のいずれかとともに４℃で２０分間インキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳバッファーで３回洗浄し、抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ４８８二次抗体または抗ヒトＩｇＧ Ａｌｅｘａ４８８二次抗体のいずれかを用い、４℃、暗所でさらに２０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳバッファーで３回洗浄し、１００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁させた後、ヨウ化プロピジウムを加えた。
細胞を漸増濃度のアイソタイプ対照または抗Ａｘｌ抗体のいずれかとともにインキュベートした。ｍ１６１３Ｆ１２はマウス１６１３Ｆ１２に相当し、ｃ１６１３Ｆ１２はキメラ１６１３Ｆ１２に相当し、ｈｚ１６１３Ｆ１２はヒト化抗体に相当する。ＥＣ５０は、Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いて決定した。
図１３に示すように、ヒト化型の１６１３Ｆ１２は、キメラ型およびマウス型の１６１３Ｆ１２と同等のＥＣ５０でＳＮ１２Ｃ細胞に結合する。これらの結果は、ｈｚ１６１３Ｆ１２が、マウス１６１３Ｆ１２と同様の結合特性でＡｘｌ抗原を認識することを示した。
直接的ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイの試験手順は、従前に実施例１２で記載した。本実施例では、４つのサポリン−免疫複合体：ｍ９Ｇ４−サポリン、ｃｈ９Ｇ４−サポリン、１６１３Ｆ１２−サポリンおよびｈｚ１６１３Ｆ１２−サポリンを作製し、２つのモデル（ヒトＳＮ１２Ｃ腎臓腫瘍細胞およびヒトＣａｌｕ−１肺癌細胞）で試験した。
図１４は、ｍ９Ｇ４−サポリンおよびｃｈ９Ｇ４−サポリンアイソタイプ対照は両方ともサイレントであったこと、およびヒト化Ａｘｌ １６１３Ｆ１２−サポリン抗体は、ＳＮ１２Ｃ細胞に対して、マウス１６１３Ｆ１２−サポリン免疫複合体と同等の細胞傷害作用を誘発することを示す。
図１５は、ヒト化１６１３Ｆ１２−サポリン免疫複合体が、Ｃａｌｕ−１細胞に対して、マウス１６１３Ｆ１２−サポリン免疫複合体と同等の細胞傷害作用を誘発することを示す。これに対して、ｍ９Ｇ４−サポリンおよびｃｈ９Ｇ４−サポリンアイソタイプ対照は両方とも、１０−９Ｍを超える抗体濃度で、弱い活性（最大細胞傷害性約１０％）を示した。
実施例１４：ヒトＡｘｌ ＥＣＤに対する１６１３Ｆ１２の結合動態
次に、１６１３Ｆ１２の親和性の測定を、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて行った。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘを用いて、ヒトＡｘｌ ＥＣＤに対する１６１３Ｆ１２の結合動態を測定した。
Ｂｉａｃｏｒｅシステムにより使用されている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象に基づく機器は、標識を用いずに、リアルタイムでタンパク質−タンパク質相互作用の検出および測定を可能とする。
簡単に述べると、バイオセンサーとしてセンサーチップＣＭ５を用いて実験を実施した。抗体を捕捉するためのアミンカップリング化学を用い、ウサギＩｇＧを、ＣＭ５センサーチップのフローセル１および２（ＦＣ１およびＦＣ２）に９３００〜１００００応答単位（ＲＵ）のレベルで固定化した。
複数回のサイクルを用いて結合を評価する。各サイクルの測定は、ＨＢＳ−ＥＰバッファー中、流速３０μｌ／分を用いて実施する。その後、供試Ａｘｌ抗体をＦＣ２のチップ上に１分間捕捉し、１６１３Ｆ１２の場合には平均捕捉値が３１１．８ＲＵ（ＳＤ＝５．１ＲＵ）となるまでとする。分析物（Ａｘｌ ＥＣＤ抗原）を、２００ｎＭから始め２倍連続希釈を用いて注入し、およそのｋａおよびｋｄをリアルタイムで測定する。
各サイクルの終了時には、１０ｍＭ塩酸グリシンｐＨ１．５溶液を注入して抗体−抗原複合体と捕捉抗体をともに除去することにより、表面を再生した。考慮するシグナルは、ＦＣ１とＦＣ２の間に見られるシグナルの差（ＦＣ２−ＦＣ１）に相当する。会合速度（ｋａ）および解離速度（ｋｄ）は、１対１ラングミュア結合モデルを用いて計算した。平衡解離定数（ＫＤ）はｋａ／ｋｄ比として求める。これらの実験値をＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアバージョン３．０で分析した。データの精度を評価するためにはχ２分析を行う。
データを下表８にまとめる。
Ａｘｌのヒト細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を作製するために、まず、ヒト可溶性ＡＸＬ受容体をコードするヒトｃＤＮＡをＰＣＲによりｐＣＥＰ４発現ベクターにクローニングした。次に、精製した産物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、同じ酵素で予め切断したｐＣＥＰ４発現ベクターに連結した。最後に、同定された組換えプラスミドｐＣＥＰ［ＡＸＬ］Ｈｉｓ６をＤＮＡシーケンシングによりさらに確認した。
次いで、懸濁適合細胞ＨＥＫ２９３Ｅを、４ｍＭグルタミンを含むＥｘ−ｃｅｌｌ ２９３（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）培地で培養した。トランスフェクションは総て、直鎖２５ｋＤａポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて行った。トランスフェクト細胞を５％ＣＯ２のインキュベートシェーカーにて、３７℃、１２０ｒｐｍで振盪しながら６日間維持した。細胞を遠心分離により回収し、組換えＨｉｓタグを有するタンパク質を含有する上清を、精製のため、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラムで処理した。

Claims (13)

  1. ｉ）好ましくは配列番号２９または３０の配列を有するヒトタンパク質Ａｘｌと特異的に結合し、かつ、
    ｉｉ）その前記ヒトタンパク質Ａｘｌとの結合の後にインターナライズされ、
    配列番号１、２および３の配列をそれぞれ有するＣＤＲ−Ｌ１〜ＣＤＲ−Ｌ３の３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号４、５および６の配列をそれぞれ有するＣＤＲ−Ｈ１〜ＣＤＲ−Ｈ３の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる、抗体またはその抗原結合フラグメント。
  2. 好ましくは配列番号３１または３２の配列を有するヒトタンパク質Ａｘｌ細胞外ドメインに局在するエピトープと特異的に結合する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  3. 少なくとも２００のＦＡＣＳによる平均蛍光強度（ＭＦＩ）の減少を誘導する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  4. モノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  5. ｉ）配列番号７の配列の軽鎖可変ドメイン、
    ｉｉ）配列番号３６の配列の軽鎖可変ドメイン；および
    ｉｉｉ）配列番号３７〜４７の配列の軽鎖可変ドメイン
    からなる群から選択される軽鎖可変ドメインを含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  6. ｉ）配列番号８の配列の重鎖可変ドメイン；
    ｉｉ）配列番号４８の配列の重鎖可変ドメイン；および
    ｉｉｉ）配列番号４９〜６８の配列の重鎖可変ドメイン
    からなる群から選択される重鎖可変ドメインを含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  7. ｉ）配列番号７、３６または３７〜４７の配列の軽鎖可変ドメイン；および
    ｉｉ）配列番号８、４８または４９〜６８の配列の重鎖可変ドメイン
    を含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  8. ２０１１年７月２８日にＣＮＣＭ（パスツール研究所、フランス）に寄託されたハイブリドーマＩ−４５０５により産生されるモノクローナル抗体１６１３Ｆ１２からなる、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  9. タンパク質Ａｘｌ細胞外ドメイン、好ましくは、ヒトタンパク質Ａｘｌ細胞外ドメイン、より好ましくは、配列番号３１または３２の配列を有するヒトタンパク質Ａｘｌ細胞外ドメイン、に局在するエピトープからなる宿主標的部位に、細胞傷害性薬剤を送達するためのアドレッシング産物として使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  10. 細胞傷害性薬剤とコンジュゲートされた請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなる、免疫複合体。
  11. 癌の治療において使用するための、請求項１０に記載の免疫複合体。
  12. 請求項１１に記載の免疫複合体ならびに少なくとも１種類の賦形剤および／または薬学的に許容可能なビヒクルを含んでなる、医薬組成物。
  13. ２０１１年７月２８日にＣＮＣＭ（パスツール研究所、フランス）に寄託されたマウスハイブリドーマＩ−４５０５。
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