JP4462964B2 - 癌特異的抗原を標的とした抗体 - Google Patents
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Description
「モレキュラー・ビジョン(Molecular Vision)」、2002年、第8巻、2−5−220
すなわち、本発明は、
(1) ヒト・オキュロスパニンと特異的に結合し、該蛋白質を発現している細胞に対し細胞障害活性を持つ抗体、
(2) 配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び/又は配列表の配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質と特異的に結合し、該蛋白質を発現している細胞に対し細胞傷害活性を持つ抗体、
(3) 細胞傷害活性が抗体依存性細胞傷害活性であることを特徴とする、(1)又は(2)に記載の抗体、
(4) 細胞傷害活性が補体依存性細胞傷害活性であることを特徴とする、(1)又は(2)に記載の抗体、
(5) 細胞傷害活性が補体依存性細胞性細胞傷害活性であることを特徴とする、(1)又は(2)に記載の抗体、
(6) 細胞傷害活性がアポトーシス誘導であることを特徴とする、(1)又は(2)に記載の抗体、
(7) モノクローナル抗体であることを特徴とする、(1)乃至(6)のいずれか一つに記載の抗体、
(8) マウスハイブリドーマO3B8−2C9−4F3(FERM BP−08627)から産生されることを特徴とする、請求項7に記載の抗体。
(9) ヒト化されていることを特徴とする、(1)乃至(8)のいずれか一つに記載の抗体、
(10) 完全ヒト抗体であることを特徴とする、(1)乃至(7)のいずれか一つに記載の抗体、
(11) IgG抗体であることを特徴とする、(1)乃至(10)のいずれか一つに記載の抗体、
(12)下記の工程1)乃至4)を含む、癌の検出方法:
1)被験者より採取した検体より、全RNA画分を抽出する工程;
2)正常人より採取した検体より、全RNA画分を抽出する工程;
3)上記工程1)由来の全RNA画分と上記工程2)由来の全RNA画分における、下記のa)又はb)のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの発現量を測定する工程;
a)配列表の配列番号1に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
b)上記a)に記載のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
4)上記工程1)由来の全RNA画分と上記工程2)由来の全RNA画分との間における上記工程3)によって測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、上記工程1)に記載の被験者の癌を検出する工程、
(13) 下記の工程1)乃至3)を含む、癌の検出方法:
1)被験者より採取した検体における、配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び/又は配列表の配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質の発現量を測定する工程;
2)正常人から採取した検体における、上記工程1)に記載の蛋白質の少なくともいずれか一つの発現量を測定する工程;
3)上記工程1)で検出された蛋白質の発現量と上記工程2)で測定された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験者の癌を検出する工程、
(14) 癌が皮膚癌であることを特徴とする、(12)又は(13)のいずれか一つに記載の方法、
(15) 癌がメラノーマであることを特徴とする、(12)又は(13)のいずれか一つに記載の方法、
(16) ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が、ノーザンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、RT−PCR、リボヌクレアーゼ保護アッセイ又はランオン・アッセイであることを特徴とする、(12)、(14)及び(15)のいずれか一つに記載の方法、
(17) ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が検体由来の相補的DNA群又は該DNA群の各DNAの部分配列からなるDNAで作製された遺伝子チップ又はアレイを用いることを特徴とする、(12)、(14)及び(15)のいずれか一つに記載の方法、
(18) 蛋白質の発現量の測定方法が、該蛋白質に特異的に結合する抗体又はリガンドを用いることを特徴とする、(13)乃至(15)のいずれか一つに記載の方法、
(19) 蛋白質の発現量の測定方法が、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法又は固相酵素免疫定量法(ELISA法)であることを特徴とする、(13)乃至(15)のいずれか一つに記載の方法、
(20) 下記の1)乃至3)からなる群から選択される少なくとも一つ以上を含む癌の検出用キット:
1)配列表の配列番号1に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に増幅するための15乃至30塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー;
2)配列表の配列番号1に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを検出するための15ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ;
3)配列表の配列番号1に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが固定された固相化試料。
(21) 下記の1)及び2)の少なくとも一つを含む癌の検出用キット:
1)配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び/又は配列表の配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体;
2)上記1)に記載の抗体に結合し得る二次抗体。
(22) 癌が皮膚癌であることを特徴とする、(20)又は(21)に記載のキット、
(23) 癌がメラノーマであることを特徴とする、(20)又は(21)に記載のキット、
(24) (1)乃至(11)に記載の抗体の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、癌の治療用医薬組成物、
(25) 配列表の配列番号1に示されるヌクレオチド配列又は該配列の部分配列に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含む癌の治療用医薬組成物、
(26) 癌が皮膚癌であることを特徴とする、(24)又は(25)のいずれか一つに記載の医薬組成物、
(27) 癌がメラノーマであることを特徴とする、(24)又は(25)のいずれか一つに記載の医薬組成物、
からなる。
(1) ヒト・オキュロスパニン遺伝子の特異的発現の確認
ヒト・オキュロスパニン遺伝子は、ヒト各種細胞株群における遺伝子の発現量の解析の結果、他の組織に比べてメラニン細胞で有意に高い発現量を示し、さらに、正常なメラニン細胞に比べメラノーマにおいて有意に発現量が増加していることが本発明者らによって見出された。例えば、メラニン細胞、リンパ芽球、グリア細胞、上皮細胞の間でヒト・オキュロスパニンの発現量を比較すると、メラニン細胞で有意に発現量が高く、また、正常な皮膚細胞とメラノーマにおけるヒト・オキュロスパニンの発現量を比較すると、メラノーマにおいて顕著に発現量が高いことが、本発明者らによって見出された。したがって、ヒト・オキュロスパニンは細胞の癌化及び/又は癌細胞の増殖に関与していると考えられる。すなわち、ヒト・オキュロスパニンの各細胞、及び/又は各組織における発現量を測定することでヒト・オキュロスパニンの過剰発現に起因して発生する癌化及び/又は癌細胞、の増殖の状態を判定することができる。このような癌としては、例えば、皮膚癌、特にメラノーマを挙げることができるが、ヒト・オキュロスパニンの発現量が他の組織より有意に増殖している癌であれば皮膚癌以外の癌にも適用することができる。
ヒト・オキュロスパニンは癌細胞、特にメラノーマで高い発現が認められるので細胞、特に皮膚細胞の癌化及び/又は癌細胞の増殖に関与していると考えられる。なお、「検体」とは、被験者や臨床検体等から得られた、血液、体液、前立腺、精巣、陰茎、膀胱、腎臓、口腔、咽頭、口唇、舌、歯肉、鼻咽頭、食道、胃、小腸、大腸、結腸、肝臓、胆嚢、膵臓、鼻、肺、骨、軟部組織、皮膚、乳房、子宮、卵巣、脳、甲状腺、リンパ節、筋肉、脂肪組織等の組織又は排泄物等の試料を意味するが、本発明においては皮膚又はリンパ節がより好ましい。
ヒト・オキュロスパニン遺伝子の発現量を利用した癌の検出方法は、具体的には、以下の工程1)乃至4)を含む方法である。
1)被験者より採取した検体より、全RNA画分を抽出する工程;
2)正常人より採取した検体より、全RNA画分を抽出する工程;
3)上記工程1)に記載の全RNA画分と上記工程2)に記載の全RNA画分におけるヒト・オキュロスパニン遺伝子の発現量を測定する工程;
4)上記工程1)由来の全RNA画分と上記工程2)由来の全RNA画分との間における上記工程3)によって測定された遺伝子の発現量の差を解析し、上記工程1)に記載の被験者の癌を検出する工程。
以下、各工程を具体的に説明する。
検体から全RNA画分を抽出するに際しては、適切な実験の倫理基準に適した方法で入手したヒト由来組織をRNA抽出用の溶媒(例えばフェノール等、リボヌクレアーゼを不活性化する作用を有する成分を含むもの)で直接溶解するか又は、該組織の細胞を破壊しないように、スクレーパーで慎重に掻きとるか、もしくはトリプシン等の蛋白質分解酵素を用いて穏やかに組織から細胞を抽出するなどの方法により、細胞を回収した後、速やかにRNA抽出工程に移行する。
本発明において、正常人とは、癌を有さない人を意味する。正常人であるか否かは、ヒト・オキュロスパニンの濃度を測定し、あらかじめ正常人の値として決められている数値範囲に入るか否かで判定することもできるし、ヒト・オキュロスパニンの発現量と、正常人の癌の形成度の相関をあらかじめ調べておくことによって、被験者から採取した検体におけるヒト・オキュロスパニンの発現量を測定することによって被験者が、正常人であるか否かを判定することもできる。正常人よりの全RNA画分の調製は、上記工程1)と同様に行うことができる。
ここで、ヒト・オキュロスパニン遺伝子の発現量は配列表の配列番号1に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド又は、配列表の配列番号1に示されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの発現量で示される。
(i) 固相化試料
固相化試料としては、例えば以下のものが挙げられる。
データベース上のEST(expressed sequence tag)配列又はmRNA配列をもとに合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドが固相化された遺伝子チップを用いることができる。このような遺伝子チップとしてはアフィメトリックス(Affymetrix)社製の遺伝子チップ(Lipshutz,R.J. et al., Nature Genet. (1999)21,suppliment,20-24)を用いることができるが、これに限定されず、公知の方法に基づき作製してもよい。ヒト細胞由来のmRNAを解析する場合には、ヒト由来のものが好ましく、例えば、アフィメトリックス社製ヒトU95セット又はU133セットを用いることができる。しかしながら、それらに限定されず、例えば近縁種の動物由来のものも使用可能である。
上記cDNA又はRT−PCR産物は、ヒトのESTデータベース等の配列情報を基に作製されたプライマーで逆転写酵素反応やPCRを実施することによりクローン化されたものである。このcDNAやRT−PCR産物は、あらかじめ腫瘍を有するヒトと腫瘍を有さないヒトの間で発現量の異なる全RNAを、サブトラクション法(Diatchenki,L,et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, (1996)93,6025-6030)、ディファレンシャルディスプレイ法(Liang,P.,et alNucleic Acids Res. ,(1992) 23,3685-3690)などを利用して選択されたものであってもよい。また、アレイやフィルターは市販のもの(例えば、インテリジーン:タカラバイオ社製等)を使用してもよいし、上記cDNAやRT−PCR産物を市販のスポッターで(例えば、GMS417アレイヤー:タカラバイオ社製等)を用いて固相化することにより作製してもよい。
標識プローブは、特定のmRNAクローンではなく、発現している全てのmRNAを標識したものを用いる。プローブ作製のための出発材料としては精製していないmRNAを用いてもよいが、前述の方法で精製したポリ(A)+RNAを用いることが望ましい。以下に、各種固相化試料を用いた場合の、標識プローブの調製方法と検出、解析方法について説明する。
アフィメトリクス社製遺伝子チップに添付されたプロトコール(アフィメトリックス社発現解析技術マニュアル)に従ってビオチン標識したcRNAプローブを作製する。次いでアフィメトリックス社製遺伝子チップに添付のプロトコール(発現解析技術マニュアル)に従って、アフィメトリックス社製の解析装置(GeneChip Fluidics Station 400)を用いてハイブリダイゼーション及び解析を行い、アビジンによる発光を検出、解析を行う。
逆転写酵素反応でポリ(A)+RNAからcDNAを作製する際に、cDNAの検出ができるようにcDNAを標識しておくことが必要であり、蛍光色素で標識する場合には、蛍光色素(例えばCy3、Cy5など)で標識されたd−UTPなどを加えておくことによりcDNAを蛍光標識する。このとき、メラノーマ細胞由来のポリ(A)+RNAと対照細胞由来のポリ(A)+RNAをそれぞれ異なる色素で標識しておけば、後のハイブリダイゼーション時には両者を混合して用いることができる。アレイとして例えば、タカラバイオ(株)社の市販アレイを用いる場合、同社のプロトコールに従いハイブリダイゼーション及び洗浄を行って、蛍光シグナル検出機(例えばGMS418アレイスキャナー(タカラバイオ(株)社製)等)で蛍光シグナルを検出後、解析を行う。ただし、使用するアレイとしては市販のものに限定されず、自家製のもの、特別に作製したものでもよい。
逆転写酵素でポリ(A)+RNAからcDNAを作製する際に、放射性同位元素(例えば、d−CTP等を加えることにより標識プローブを調製し、常法によりハイブリダイゼーションを行い、例えば、市販のフィルター製マイクロアレーである、アトラスシステム(クロンテック社製)を用いてハイブリダイゼーション及び洗浄を行った後、解析装置(例えば、アトラスイメージ:クロンテック社製等)を用いて検出、解析を行う。
上記以外の測定方法としてサブトラクションクローニング法(実験医学別冊 新 遺伝子工学ハンドブック、羊土社刊(1996) p.32-35参照)、ディファレンシャルディスプレイ法(基礎生化学実験法4 核酸・遺伝子実験 II.応用編、東京化学同人(2001), p125-128)、レポーター遺伝子を用いた方法(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(例えば、pCAT3−Basicベクター:プロメガ社製を使用。)やβ−ガラクトシダーゼ(例えば、pβgal−Basic:プロメガ社製を使用。)、分泌型アルカリホスファターゼ(例えば、pSEAP2−Basic:クロンテック社製を使用。)、緑色蛍光蛋白質(green−fluorescent protein)(例えば、pEGFP−1:クロンテック社製を使用。))があるがこれらに限定されない。
工程4)上記工程1)由来の全RNA画分と上記工程2)由来の全RNA画分との間における上記工程3)によって測定された遺伝子の発現量の差を解析し、上記工程1)に記載の被験者の癌を検出する工程。 正常人由来の検体と被験者由来の検体との間でヒト・オキュロスパニンの発現量の差を解析し、ヒト・オキュロスパニンの発現量が有意に増加している検体では癌、特に皮膚癌、更にはメラノーマが存在する可能性が高いと判定することができ、癌を検出することができる。発現量が有意に増加しているとは、例えば、アフィメトリックス社の遺伝子チップを用いて、アフィメトリックス社のmicroarray Suite Ver.3.0を用いて解析した場合、メラノーマ細胞由来の遺伝子のAverage difference値が正常メラニン細胞に比べて有意に増加している場合をいう。
ヒト・オキュロスパニンの発現量を利用した癌の検出方法は、具体的には、以下の工程1)乃至3)を含む方法である。
1)被験者より採取した検体における、ヒト・オキュロスパニンの発現量を測定する工程:
2)正常人より採取した検体における、上記1)に記載の蛋白質の発現量を測定する工程:
3)上記工程1)で測定された蛋白質の発現量と上記工程2)で測定された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験者の癌を検出する工程。
以下、各工程を具体的に説明する。
(a) 検体より蛋白質測定用試料の調製
検体は、必要に応じて高速遠心を行うことにより、不溶性の物質を除去した後、以下のようにELISA/RIA用試料やウエスタンブロット用試料として調製する。
上記のようにして得られた試料中の蛋白質を特異的に検出するためには、試料を免疫沈降法、リガンドの結合を利用した方法等によって、沈殿させ、固相化せずに検出することもできるし、そのまま検出する該試料を固相化することもできる。蛋白質を固相化する場合において、ウエスタンブロット法、ドットブロット法又はスロットブロット法に用いられるメンブレンとしては、ニトロセルロースメンブレン(例えば、バイオラッド社製等)、ナイロンメンブレン(例えば、ハイボンド−ECL(アマシャム・ファルマシア社製)等)、コットンメンブレン(例えば、ブロットアブソーベントフィルター(バイオラッド社製)等)又はポリビニリデン・ジフルオリド(PVDF)メンブレン(例えば、バイオラッド社製等)等が挙げられる。
ヒト・オキュロスパニンの発現量は、配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質の発現量で示される。
正常人より採取した検体におけるヒト・オキュロスパニンの発現量の測定は上記工程1)と同様の方法で行うことができる。
ヒト・オキュロスパニン遺伝子及びヒト・オキュロスパニンは、ヒトの正常組織の間ではメラニン細胞で発現量が有意に増加しており、更に、正常なメラニン細胞に比べ、メラノーマで発現量が有意に増加している。
ヒト・オキュロスパニン遺伝子及び/又はヒト・オキュロスパニンは、以下の1)乃至5)からなる群から選択される少なくとも一つ以上を含むキットを用いて検出することができる。
1)配列表の配列番号1に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に増幅するための15乃至30塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー;
2)配列表の配列番号1に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを検出するための15ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ;
3)配列表の配列番号1に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが固定された固相化試料;
4)配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体;
5)上記4)に記載の抗体に結合し得る二次抗体。
(1) 抗原の調製
抗ヒト・オキュロパニン抗体を作製するための抗原としては、ヒト・オキュロパニン又はその少なくとも6個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体を挙げることができる。
(2) 抗ヒト・オキュロスパニンモノクローナル抗体の製造
ヒト・オキュロスパニンと特異的に結合する抗体の例として、ヒト・オキュロスパニンと特異的に結合するモノクローナル抗体を挙げることができるが、その取得方法は、以下に記載する通りである。
(a)抗原として使用する生体高分子の精製、
(b)抗原を動物に注射することにより免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定して脾臓摘出の時期を決定してから、抗体産生細胞を調製する工程、
(c)骨髄腫細胞(以下「ミエローマ」という)の調製、
(d)抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、
(e)目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、
(f)単一細胞クローンへの分割(クローニング)、
(g)場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、又はハイブリドーマを移植した動物の飼育、
(h)このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、及びその結合特異性の検討、あるいは標識試薬としての特性の検定、等である。
抗原としては、前記したような方法で調製したヒト・オキュロスパニン又はその一部を使用することができる。また、ヒト・オキュロスパニン発現組換え体細胞より調製した膜画分、又はヒト・オキュロスパニン発現組換え体細胞自身、さらに、当業者に周知の方法を用いて、化学合成した本発明の蛋白質の部分ペプチドを抗原として使用することもできる。
本発明における抗体価の測定は、例えばELISA法によれば、以下に記載するような手順により行うことができる。まず、精製又は部分精製した抗原をELISA用96穴プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な蛋白質、例えばウシ血清アルブミン(以下「BSA」という)により覆い、該表面を洗浄後、第一抗体として段階希釈した試料(例えばマウス血清)に接触させ、上記抗原に試料中のモノクローナル抗体を結合させる。さらに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する抗体を加えてマウス抗体に結合させ、洗浄後該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、抗体価を算出する。 これらの脾臓細胞又はリンパ球からの抗体産生細胞の分離は、公知の方法(例えば、Kohler et al., Nature, 256, 495, 1975; Kohler et al., Eur.J.Immnol., 6,511, 1977; Milstein et al., Nature, 266, 550, 1977; Walsh, Nature, 266, 495, 1977)に従って行うことができる。例えば、脾臓細胞の場合には、細胞を細切してステンレスメッシュで濾過した後、イーグル最小必須培地(MEM)に浮遊させて抗体産生細胞を分離する一般的方法を採用することができる。
細胞融合に用いるミエローマ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜に選択して用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続が確立しているHGPRT(Hpoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)欠損株を用いるのが好ましい。すなわち、マウス由来のX63-Ag8(X63)、NS1-Ag4/1(NS1)、P3X63-Ag8.Ul(P3Ul)、X63-Ag8.653(X63.653)、SP2/0-Ag14(SP2/0)、MPC11-45.6TG1.7(45.6TG)、FO、S149/5XXO、BU.1等、ラット由来の210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)等、ヒト由来のU266AR(SKO-007)、GM1500・GTG-A12(GM1500)、UC729-6、LICR-LOW-HMy2(HMy2)、8226AR/NIP4-1(NP41)等である。これらのHGPRT欠損株は例えば、American Type Culture Collection (ATCC)等から入手することができる。
(d)細胞融合 抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法(Weir,D.M.,Handbookof Experimental Immunology Vol.I. II. III.,Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987)、Kabat,E.A. and Mayer,M.M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield,Illinois (1964) 等)に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で適宜実施することができる。そのような方法は、例えば、ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法等を用いることができる。このうち、上記化学的方法の具体例を示せば以下のとおりである。すなわち、高濃度ポリマー溶液としてポリエチレングリコールを用いる場合には、分子量1500〜6000、好ましくは2000〜4000のポリエチレングリコール溶液中で、30〜40℃、好ましくは35〜38℃の温度で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを1〜10分間、好ましくは5〜8分間混合する。
上記細胞融合により得られるハイブリドーマの選択方法は特に制限はないが、通常HAT(ヒポキサンチン・アミノブテリン・チミジン)選択法〔Kohler et al., Nature, 256, 495 (1975); Milstein at al., Nature 266, 550 (1977)〕が用いられる。この方法は、アミノブテリンで生存し得ないHGPRT欠損株のミエローマ細胞を用いてハイブリドーマを得る場合に有効である。すなわち、未融合細胞及びハイブリドーマをHAT培地で培養することにより、アミノブテリンに対する耐性を持ち合わせたハイブリドーマのみを選択的に残存させ、かつ増殖させることができる。
ハイブリドーマのクローニング法としては、例えばメチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等の公知の方法を用いることができる〔例えばBarbara, B.M. and Stanley, M.S. :Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Company, San Francisco(1980)参照〕。このクローニング法としては、プレートの1ウェルに1個のハイブリドーマが含まれるように希釈して培養する限界希釈法、軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって1個づつの細胞を取り出し培養する方法、セルソーターによって1個の細胞を分離する「ソータクローン」などが挙げられる。これらの方法のうち、特に限界希釈法が好適である。この方法では、マイクロプレートにラット胎児由来繊維芽細胞株、あるいは正常マウス脾臓細胞、胸腺細胞、腹水細胞などのフィーダー(feeder)を接種しておく。一方、あらかじめハイブリドーマを0.2〜0.5個/0.2mlになるように培地中で希釈し、この希釈したハイブリドーマの浮遊液を各ウェルに0.1mlずつ入れ、一定期間毎(例えば3日毎)に約1/3の培地を新しいものに交換しながら2週間程度培養を続けることによってハイブリドーマのクローンを増殖させることができる。
このようにして選択されたハイブリドーマは、これを培養することにより、モノクローナル抗体を効率よく得ることができるが、培養に先立ち、目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることが望ましい。このスクリーニングにはそれ自体既知の方法が採用できる。
かくして得られるモノクローナル抗体は、ヒト・オキュロスパンに対して高い抗原特異性を有する。
かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は以下のように行うことができる。まず、同定法としてはオクテルロニー(Ouchterlony)法、ELISA法、又はRIA法が挙げられる。オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。一方、ELISA法又はRIA法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに第二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。また、さらに簡便な方法として、市販の同定用のキット(例えば、マウスタイパーキット;バイオラッド社製)等を利用することもできる。
免疫グロブリンG(以下、単に「IgG」という。)は、分子量約23000の軽ポリペプチド鎖(以下「軽鎖」という。)、分子量約50000の重ポリペプチド鎖(以下「重鎖」という。)各2本ずつから構成される。重鎖、軽鎖とも約110残基からなる、アミノ酸配列が保存されている領域の繰り返し構造を持ち、これらはIgGの3次元構造の基本単位(以下、「ドメイン」という。)を構成する。重鎖及び軽鎖は、それぞれ連続した4個、及び2個のドメインから構成されている。重鎖、軽鎖いずれにおいても、アミノ末端のドメインは他のドメインに比べ各抗体分子間でのアミノ酸配列の変異が大きく、このドメインは可変ドメイン(variable domain : 以下、「Vドメイン」という。)と呼ばれる。IgGのアミノ末端においては、重鎖、軽鎖のVドメインが相補的に会合し可変領域を形成している。これに対し、残余のドメインは、全体として定常領域を形成する。定常領域は、各動物種に特徴的な配列を有し、例えば、マウスIgGの定常領域はヒトIgGの定常領域とは異なっているので、マウスIgGはヒトの免疫系によって異物として認識され、その結果、ヒト抗マウス抗体(Human Anti Mouse Antibody :以下「HAMA」という。)応答が起こる(シュロッフら、Cancer Res., 45, 879-85 (1985)参照)。従って、マウス抗体はヒトに繰返し投与することはできない。このような抗体をヒトに投与するためには、抗体の特異性を保持したままHAMA応答を起こさないように抗体分子を修飾する必要がある。
(i) CDRのアミノ酸配列中には、抗原に直接結合する部位とCDR自体の構造を維持する部位とが存在し、CDRの取り得る三次元構造は、複数の典型的なパターン(カノニカル構造)に分類されること、
(ii)カノニカル構造のクラスは、CDRのみならずフレームワーク部分の特定の位置のアミノ酸の種類によって決定されること、を見いだした( J. Mol. Biol., 196, 901-917, (1987)参照)。
(i) アクセプターは、いずれのサブグループに属するものを選択すべきか;
(ii)ドナーのフレームワークからいずれのアミノ酸残基を選択すべきか
の2点に留意する必要がある。
(a) アクセプターのフレームワーク領域中のアミノ酸がその位置において稀であり、ドナーの対応するアミノ酸がアクセプターの前記位置において普通である。
(b) 該アミノ酸がCDRのひとつのすぐ近くである。
(c) 該アミノ酸が三次元免疫グロブリンモデルにおいてCDRの約3Å以内に側鎖原子を有し、そして抗原と又はヒト化抗体のCDRと相互作用することができると予想される。
目的蛋白質のアミノ酸配列の全部又は一部が解明されている場合、該アミノ酸配列の一部に対応するセンスストランドとアンチセンスストランドのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、これらを組合せてポリメラーゼ連鎖反応[Saiki, R. K., et al. (1988) Science 239, 487-49 参照]を行ない、目的の抗ヒト・オキュロスパニン抗体重鎖あるいは軽鎖サブユニットをコードするDNA断片を増幅する。ここで用いる鋳型DNAとしては、例えば抗ヒト・オキュロスパニンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのmRNAより逆転写酵素反応にて合成したcDNAを用いることができる。
目的蛋白質のアミノ酸配列の全部又は一部が解明されている場合(該配列は、複数個連続した特異的配列であれば、目的蛋白質のどの領域のものでもよい)、該アミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し(この場合、コドン使用頻度を参考に推測されるヌクレオチド配列、又は考えられるヌクレオチド配列を組合せた複数個のヌクレオチド配列のいずれも採用でき、また後者の場合イノシンを含ませてその種類を減らすこともできる)、これをプローブ(32P、35Sあるいはビオチン等で標識する)として、形質転換株のDNAを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られたポジティブ株を選別する。
b)重鎖、軽鎖が属するサブグループとしての組合せは保存するが、重鎖、軽鎖としては、それぞれ異なるヒト抗体に由来し、ドナーの重鎖、軽鎖のアミノ酸配列と同一性が高いアミノ酸配列、又は、コンセンサス配列を用いる、
のいずれかが選択されている。本発明においても、上記の指針に従うことができるが、これらと異なる方法として、
c)サブグループの組合せを考慮することなく、ドナーのFRと最も同一性の高い重鎖、軽鎖のFRをヒト抗体の一次配列のライブラリーの中から選択する、
という方法を採用することも可能である。これらの選択法により、ドナー及びアクセプター間での、FR部分のアミノ酸の同一性を少なくとも70%以上とすることが可能となる。この方法を採用することにより、ドナーより移植するアミノ酸残基の数をより少なくすることが可能となり、HAMA応答誘導を減少させることができる。
1)アクセプターのヒトFR領域中のアミノ酸がその位置において稀であり、ドナーの対応するアミノ酸がアクセプターの前記位置において普通である;
2)該アミノ酸がCDRのひとつのすぐ近くである;
3)該アミノ酸が三次元免疫グロブリンモデルにおいてCDRの約3Å以内に側鎖原子を有し、そして抗原と又はヒト化抗体のCDRと相互作用することができると予想される。
a)アクセプターのFR中のアミノ酸がその位置において稀でありドナーの対応するアミノ酸が当該位置において普通であるか;
b)該アミノ酸が三次元構造モデルにおいて、CDRの構成アミノ酸原子と抗原又は移植すべきCDRループとの相互作用が予想されるか;
c)当該位置がカノニカルクラス決定残基であるか;
d)当該位置が重鎖と軽鎖の接触面を構成するか、
である場合に、ドナーのFRから当該アミノ酸残基を移植することにする。
それ以外の場合は、この要件b)は考慮しない。
を基質にして、センスプライマー(C)及びキメラ型アンチセンスプライマー(F)を用いたPCRを行うことにより、(A)の3’末端に(B)の5’末端側20乃至30ヌクレオチドが付加したDNAを得ることができる(この新たに得られたDNAを(G)とする)。同様に、(B)を含む適当なベクターDNAを基質にして、アンチセンスプライマー(D)及びキメラ型センスプライマー(E)を用いたPCRを行うことにより、(B)の5’末端に(A)の3’末端側20乃至30ヌクレオチドが付加したDNAを得ることができる(この新たに得られたDNAを(H)とする。)。このようにして得られた(G)と(H)は、(G)の3’側40乃至60ヌクレオチドと(H)の5’側40乃至60ヌクレオチドにおいて相補的なヌクレオチド配列を保持している。増幅された(G)及び(H)を混合してPCRを行った場合、1回目の変性反応で(G)と(H)は1本鎖になり、その後のアニーリング反応で殆どのDNAは元に戻るが、一部のDNAについては相補的ヌクレオチド配列領域でアニーリングするヘテロDNA2本鎖を形成する。その後の伸長反応で、突出した1本鎖部分が修復され、(A)と(B)が連結したキメラ型のDNA(以下、このDNAを(I)とする。)を得ることができる。さらにこの(I)を基質として、センスプライマー(C)とアンチセンスプライマー(D)を用いPCRを行うことにより、(I)を増幅することができる。本発明では、抗ヒトヒト・オキュロスパニンマウスモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖のCDR領域をコードするDNA及びヒト免疫グロブリンIgGのFR領域をコードするDNA、さらには、ヒト免疫グロブリンIgGの分泌シグナルをコードするDNAを、それぞれケース・バイ・ケースにより(A)及び(B)として上記の連結反応を行うことができる。
完全ヒト抗体とは、ヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列のみを有するヒト抗体を意味する。抗ヒト・オキュロスパニン完全ヒト抗体は、ヒト抗体のH鎖とL鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法(Tomizuka, K.et al.,Nature Genetics, 16, p.133-143, 1997.; Kuroiwa, Y.et.al., Nuc. Acids Res., 26, p.3447-3448, 1998.; Yoshida, H.et.al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, p.69-73 (Kitagawa, Y.,Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999.; Tomizuka, K.et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 722-727, 2000.等を参照。)や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法(Wormstone, I. M.et.al, Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43(7), p.2301-8, 2002; Carmen, S. et.al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics,1 (2), p.189-203, 2002; Siriwardena, D. et.al., Opthalmology, 109(3), p.427-431, 2002等参照。)によって取得することができる。
上述の「5.抗ヒト・オキュロパニン抗体の製造」の項に記載された方法で得られる抗ヒト・オキュロスパニン抗体の中から、ヒト・オキュロスパニンの生物活性を中和する抗体又はヒト・オキュロスパニンを発現する癌細胞を特異的に傷害する抗体を得ることができる。これらの抗体は、生体内でのヒト・オキュロスパニンの生物活性、即ち、細胞の癌化を阻害することから、医薬として、特に癌に対する治療剤として用いることができる。in vitroでの抗ヒト・オキュロスパニン抗体によるヒト・オキュロスパニンの生物活性の中和活性は例えば、ヒト・オキュロスパニンを過剰発現している細胞における細胞の癌化の抑制活性で測定することができる。例えば、ヒト・オキュロスパニンを過剰発現しているマウス繊維芽細胞株NIH3T3を培養し、培養系に種々の濃度で抗ヒト・オキュロスパニン抗体を添加し、フォーカス形成、コロニー形成及びスフェロイド増殖に対する抑制活性を測定することができる。in vitroでの抗ヒト・オキュロスパニン抗体による癌細胞の傷害活性は例えば、ヒト・オキュロスパニンを過剰発現している細胞に対して抗ヒト・オキュロスパニン抗体の示す抗体依存性細胞障害活性、補体依存性細胞障害活性又は補体依存性細胞性細胞障害活性で測定することができる。例えば、ヒト・オキュロスパニンを過剰発現している293T細胞を培養し、培養系に種々の濃度で抗ヒト・オキュロスパニン抗体を添加し、さらにマウス脾臓細胞を添加して適当時間培養後の、ヒト・オキュロスパニン過剰発現細胞に対する細胞死誘導率を測定することができる。in vivoでの実験動物を利用した抗ヒト・オキュロスパニン抗体の癌に対する治療効果は、例えば、ヒト・オキュロスパニンを過剰に発現しているトランスジェニック動物に同ヒト・オキュロスパニン抗体を投与し、癌細胞の変化を測定することができる。 このようにして得られたヒト・オキュロスパニンの生物活性を中和する抗体又はヒト・オキュロスパニンを発現する癌細胞を特異的に傷害する抗体は、医薬として特に癌の治療を目的とした医薬組成物として、あるいはこのような疾患の免疫学的診断のための抗体として有用である。癌の種類としては、皮膚癌や皮膚癌の一種であるメラノーマを好適に挙げることができるがこれらに限定されない。
本発明の他の一つの態様としては、ヒト・オキュロスパニンの活動を抑制するような物質を得ることを目的とした、該蛋白質の立体構造をベースとしたドラッグデザインの手法を含む。このような手法は、ラショナルドラッグデザイン法として知られており、酵素活性などの機能や、リガンド、コファクター、又はDNAへの結合などを効率よく阻害もしくは活性化させるような化合物の探索に利用されている。この例として、すでに上市されている抗HIV剤であるプロテアーゼの阻害剤がよく知られている。本発明のヒト・オキュロスパニンの三次元構造解析においても、X―線結晶解析や核磁気共鳴法といった一般的によく知られている手法が利用できると考えられる。さらに、ヒト・オキュロスパニンの機能を抑制する物質の探索には、コンピュータードラッグデザイン(CADD)を活用した設計も可能である。この例としては、慢性関節リウマチ治療の新たなゲノム新薬として期待されているAP−1の働きを阻害する低分子化合物(国際特許出願公開WO99/58515号)などが知られている。このような方法により、ヒト・オキュロスパニンに直接結合するか、あるいはヒト・オキュロスパニンと他の因子との相互作用を阻害することにより、ヒト・オキュロスパニンの機能を抑制するような物質を得ることができる。
配列表の配列番号1と部分的に重複するヌクレオチド配列を有するESTプローブ(Affimetrix Genechip HG-133 probe 223795_at:アフィメトリクス社製)について、GeneLogic社製のデータベース(GeneExpress Software System Release 1.4.2)を用いて発現プロファイル解析を行った。
次に組織由来サンプルでのヒト・オキュロスパニン遺伝子の発現量を比較した。健常人皮膚サンプル66例、及びメラノーマサンプル33例について転写量を比較したところ、メラノーマサンプルにおいて有意に高く転写されていた(P値<0.0001:図1下パネル)。また、健常人皮膚サンプル66例と、メラノーマサンプルのうち、皮膚組織由来サンプル12例を比較したところ、メラノーマサンプルにおいて有意に高く転写されていた(P値=0.0007:図2上パネル)。
さらに、健常人リンパ節由来サンプル13例と、メラノーマサンプルのうち、リンパ節組織由来サンプル12例を比較したところ、メラノーマサンプルにおいて有意に高く転写されていた(P値=0.0011:図3パネル)。
a)PCR反応
ヒト・オキュロスパニンcDNAをPCRで増幅するためのプライマーとして
5’-CACCATGGAGGAGGGGGAGAGGAGCCC−3’(プライマー1:配列表の配列番号5)
及び、
5’-GCCCCGGGCGGGTTTGGCAGCGG-3’(プライマー2:配列表の配列番号6)
の配列を有するオリゴヌクレオチドを常法に従って合成した。なお、プライマー1はヒト・オキュロスパニン遺伝子の開始コドン上流にKozak配列として4塩基、CACCを付加したオリゴヌクレオチドであり、配列表の配列番号1のヌクレオチド番号1乃至23からなるヌクレオチド配列の5’側に4塩基配列(CACC)付加した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。このCACC配列は、クローニングベクターpENTR/D−TOPOへの組み込みの際にベクター3’末端と相補鎖を形成するため、遺伝子の方向性を保持したベクターへの組み込みを可能としている。プライマー2は配列表の配列番号1のヌクレオチド番号1043乃至1065からなるヌクレオチド配列の相補鎖からなるオリゴヌクレオチドである。
PCR反応はPLATINUM Pfx DNA Polymerase(インビトロジェン社製)を添付プロトコールに従って用いて行った。具体的には、得られたファーストストランドcDNA 0.1μlに10pmol/μlの濃度の合成プライマー1と合成プライマー2をそれぞれ1.5μl、10X Pfx Amplifaction Buffer 5μl、10mM dNTP Mixを1.5μl、、50mM MgSO4を1μl、PLATINUM Pfx DNA Polymerase 0.5μl、10X PCRx Enhancer Solution 10μl、滅菌精製水28.9μlを添加し、50μlのPCR反応溶液を作製した。PCR反応は、Peltier Thermal Cycler TPC−200 DNA Engine(エムジェーリサーチ(MJ Research)社製)により行った。まず94℃で2分加熱した後、引き続き94℃で30秒、65℃で2分の温度サイクルを5回、続いて94℃で30秒、60℃で40秒、68℃で1分20秒の温度サイクルを5回、続いて94℃で30秒、55℃で40秒、68℃で1分20秒の温度サイクルを5回、続いて94℃で30秒、50℃で40秒、68℃で1分20秒の温度サイクルを35回繰り返し、最後に68℃で10分間保温してから、4℃に保存した。目的cDNAは、反応物を1.5%のアガロースゲルで電気泳動し、NM_031945 cDNA(1069bp)の増幅を確認後、S.N.A.P. UV−Free Gel Purification Kit(インビトロジェン社製)をその添付プロトコールに従って用いることによりアガロースゲルよりDNAを精製した。精製されたcDNAの濃度は、1D Image Analysis Software Version 3.5(Kodak Digital Science EDAS290:コダック社製)を用い、1kb DNA Ladder(インビトロジェン社製)を濃度標準物にして測定した。
pENTR Directional TOPO Cloning Kits (インビトロジェン社製)を添付プロトコールに従って用い、実施例2a)によって得られたNM_031945 cDNAをpENTR/D−TOPOベクターにクローニングした。NM_031945 cDNAを、キット付属の反応バッファー中でTopoisomeraseを結合させてあるpENTR/D−TOPOベクターと混合し室温で30分間インキュベートした。得られた反応物を用いて大腸菌OneShot TOP10 Chemically Competent E.coli(インビトロジェン社製)を形質転換し、50μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地上で培養した。その結果カナマイシン耐性を示して生育してきた大腸菌コロニーを選択して、1mlの50μg/mlのカナマイシンを含む液体TB培地中で37℃で一晩培養し、Montage Plasmid Miniprep96 Kit(ミリポア社製)を利用することによりプラスミドDNAを単離精製した。得られたプラスミドDNAについて、BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction Kitをその添付プロトコールに従って用いることにより反応を行った後、ABI PRISM 3100 DNA Analyzer(アプライド・バイオシステムズ社製)によりヌクレオチド配列解析を行い、GenBank アクセッション番号(ACCESSION NO.NM_031945 に示されるヌクレオチド配列のOpen ReadingFrameを有するcDNA(配列表の配列番号1)が、pENTR/D−TOPOベクターに組み込まれていることを確認した。
実施例3 ヒト・オキュロスパニン遺伝子の細胞への導入と発現されたヒト・オキュロスパニン遺伝子産物の確認、及び免疫原としてのヒト・オキュロスパニン発現細胞の膜画分の調製
a)プラスミドpcDNA3.1-DEST40-NM_031945のNIH3T3細胞へのトランスフェクション
実施例2によって得られたプラスミドpcDNA3.1-DEST40-NM_031945をNIH3T3細胞に以下のようにトランスフェクションした。NIH3T3細胞へのトランスフェクションは(株)Invitrogen製のLipofectamineTM 2000 Reagentを用いてリポフェクションにより行った。すなわち、まずNIH3T3細胞を6穴プレートにてセミコンフルエントになるまで増殖させた。細胞を抗生物質の入っていない、10% ウシ胎児血清を含むDMEMで一度洗浄したのち、200μlの抗生物質の入っていない、10% ウシ胎児血清を含むDMEMを加えた。次に1.5mlエッペンドルフチューブ中に無血清培地(DMEM)100μlと、上記方法にて回収したプラスミドDNA(pcDNA3.1-DEST40-NM_031945)2μgを加え、混合した。別の1.5mlエッペンドルフチューブ中に無血清培地(DMEM)96μlと、LipofectamineTM 2000 Reagent 4μlを加え、混合した。DNA溶液とLipofectamine溶液を混合し、室温にて20分間放置した。その後、DNA−Lipofectamine混合液を細胞に加え、37℃、5% CO2下で培養した。4時間後 10% ウシ胎児血清を含むDMEM 1mlを細胞に加え、37℃、5% CO2下で一晩培養した。
このようにして得られた細胞培養物を回収した。cDNAを含まないネガティブコントロール又はpcDNA3.1-DEST40-NM_031945でトランスフェクトして得たNIH3T3細胞をPBS(−)緩衝液((株)Invitrogen製)で洗浄した。細胞をSDS−ポリアクリルアミド電気泳動(SDS−PAGE)用の2−メルカプトエタノールを含むサンプル緩衝液(バイオラッド社製)に溶解し、12.5% ポリアクリルアミドゲル(e パジェル E−T12.5L アトー(株)社製)を用いて、還元条件下でSDS−PAGEを行った。
BALB−3T3細胞(American Type Culture Collection No. CCL-163 )を、10% ウシ血清(ギブコ社製)(以下「CS」という)を含むダルベッコ変法イーグル培地(以下「DMEM」という:日水製薬(株)社製)を入れた細胞培養用フラトレイ(培養面積500cm2;住友ベークライト(株)社製)3枚中でセミコンフルエントになるまで37℃、5% 炭酸ガス下で培養した後、pcDNA3.1-DEST40-NM_031945をBALB−3T3細胞にトランスフェクションした。BALB−3T3細胞へのトランスフェクションは(株)Gene Therapy Systems製のGeneporterTM 2 Transfection Reagentを用いてリポフェクションにより行った。すなわち、細胞を無血清培地(DMEM)で一度洗浄したのち、500mlの無血清培地(DMEM)を加えた。次に50mlファルコンチューブ中にNew DNA Diluent 6mlと、上記方法にて回収したプラスミドDNA(pcDNA3.1-DEST40-NM_031945)240μgを加え、混合した。別の50mlファルコンチューブ中に無血清培地(DMEM)4.8mlと、GeneporterTM 2 Reagent 1200μlを加え、混合した。DNA溶液とGeneporterTM 2溶液を混合し、室温にて20分間放置した。その後、DNA−GeneporterTM 2混合液を細胞に加え(4ml/トレイ)、37℃、5% CO2下で培養した。4時間後 20% ウシ血清を含むDMEM 50ml/トレイを細胞に加え、37℃、5% CO2下で一晩培養した。
上記の方法にて培養した細胞をPBS(−)緩衝液((株)Invitrogen製)で洗浄する。セルスクレーパー(住友ベークライト(株)社製)を用いて細胞を回収し、5mM Trisバッファー pH8.0 7mlに懸濁する。4℃にて30分間細胞溶液を放置する。Dounce Type B ホモジェナイザー(30ストローク)にて細胞を破砕する。1000Gで10分間遠心し、上清を回収する。上清を78000G 100分間、超遠心分離機(日立(株)製)にて遠心し、沈殿を回収する。ショ糖密度勾配により、膜画分を濃縮する。すなわち、沈殿を57%ショ糖 0.25M TrisバッファーpH8.0 3mLに溶解する。超遠心用チューブに移しかえ、その細胞溶液の上へ37.2%57%ショ糖 0.25M TrisバッファーpH8.0 3mL、0.25M57%ショ糖 0.25M TrisバッファーpH8.0 1.5mLを重層する。超遠心分離機にて、75500G 16時間遠心する。チューブ中の溶液を上方より1mLずつ回収する。各フラクションに10mLの5mM Trisバッファー pH8.0を加え、78000G 1時間超遠心し、沈殿を回収する。沈殿に5mM Trisバッファー pH8.0 500μlを加え、Dounce Type B ホモジェナイザー(10ストローク)にて細胞溶液を均一化する。発現確認の項で述べたウエスタンブロッティング法により、細胞膜画分を同定し、免疫原とする。
(4−1) 免疫
実施例3で得られたヒト・オキュロスパニン発現細胞の膜画分溶液 1ml(全蛋白質量; 100μg)を4〜10週令のBALB/cマウス雌(日本エスエルシー社より購入)腹腔内に投与した。2週間後、同様の膜画分溶液(20μg蛋白質/マウス)を腹腔内に投与し追加免疫する。
追加免疫3日後のマウスより脾臓を摘出し、これを20mM HEPES緩衝液(pH7.3)、350mg/ml 炭酸水素ナトリウム、0.05mM β−メルカプトエタノール、50単位/ml ペニシリン、50μg/ml ストレプトマイシン、300μg/ml L−グルタミン酸を含む無血清RPMI1640培地(10.4g/リットル RPMI1640「ニッスイ」(1):日水製薬(株)社製)(以下「無血清RPMI培地」という)10ml中に入れ、メッシュ(セルストレイナー:ファルコン社製)上でスパーテルを用いてつぶす。メッシュを通過した細胞懸濁液を遠心して脾臓細胞を沈澱させた後、この脾臓細胞を無血清RPMI培地で2回洗浄してから、無血清RPMI培地に懸濁して細胞数を測定する。
4〜10週令のBALB/cマウス雌(日本エスエルシー社より購入)より胸腺を摘出後、メッシュ(セルストレイナー;ファルコン社製)上でスパーテルを用いてつぶし、メッシュを通過した細胞を10% FCSを含むヒポキサンチン・チミジン培地(以下「HT培地」という;ベーリンガー・マンハイム社製)で2回洗浄する。マウス1匹分の胸腺細胞を10% FCSを含むHT培地 30mlに懸濁したものをフィーダー細胞液とした。上記(4−2)で得られた融合細胞を含む培養液を、細胞密度に応じてフィーダー細胞液で10乃至100倍に希釈し、さらに融合細胞の密度が5細胞/ml、1細胞/ml、0.5細胞/mlとなるように、フィーダー細胞液で段階希釈する。このようにして調製した各試料を、細胞培養用96穴マイクロプレートに100μl/ウェルずつ分注し、37℃、5%炭酸ガス下で5日間培養する。
(4−4−1)細胞ELISA
ヒト・オキュロスパニン発現細胞の維持培養は、RPMI1640(インビトロジェン社製)に10%牛胎児血清(Moregate Biotech社製)、20mM HEPES(シグマ社製)、55μM 2ーメルカプトエタノール(インビトロジェン社製)を添加した培地(培地)にて、37℃、5%CO2下で行う。対数増殖期にあるヒト・オキュロスパニン発現細胞を2×104cells/cm2で細胞培養用フラスコへまきこみ、3日間培養する。このように調製したヒト・オキュロスパニン発現細胞を全て50mlチューブへ移し、HITACHI himac CF8DLで1000rpm、5分間遠心分離する(遠心分離条件1)。上清を除き、培地でヒト・オキュロスパニン発現細胞を懸濁後、0.4%トリパンブルー溶液(シグマ社製)を使用し、生細胞数を計測する。培地でヒト・オキュロスパニン発現細胞を生細胞107cells/mlに調製し、96穴U底プレートに100μl/wellずつ分注する。96穴U底プレートをHITACHI himac CF8DLで15000rpm、1分間遠心分離し(遠心分離条件2)、上清を200μlチップで抜き取った。96穴U底プレートの側面をたたいてヒト・オキュロスパニン発現細胞を懸濁後、氷中で冷やした培地で10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/mlの濃度に調製したハイブリドーマ培養上清を100μl/wellずつ添加する。15分毎に96穴U底プレートをプレートミキサー(フジレビオ社製)で攪拌しながら、4℃で1.5時間反応させる。反応終了後、96穴U底プレートを遠心分離条件2で遠心分離し、上清を200μlチップで抜き取る。PBS(-)(日水製薬社製)に5%牛胎児血清を添加した溶液(PBS-5%FBS)を200μl/wellずつ添加し、プレートミキサーで攪拌後、遠心分離条件2で遠心分離し、上清を200μlチップで抜き取る。以上の操作をこのあと2回行う。96穴U底プレートの側面をたたいてヒト・オキュロスパニン発現細胞を懸濁後、氷中で冷やしたPBS-5%FBSで500倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG抗体(Kirkegaard & Perry Laboratories社製)を100μl/wellずつ添加し、15分毎に96穴U底プレートをプレートミキサーで攪拌しながら、4℃で1.5時間反応させる。反応終了後、96穴U底プレートを遠心分離条件2で遠心分離し、上清を200μlチップで抜き取った。PBS-5%FBSを200μl/wellずつ添加し、プレートミキサーで攪拌後、遠心分離条件2で遠心分離し、上清を200μlチップで抜き取る。以上の操作をこのあと2回行る。96穴U底プレートの側面をたたいてヒト・オキュロスパニン発現細胞を懸濁後、室温にしたペルオキシダーゼ用発色基質(ナカライテスク社製)を100μl/wellずつ添加し、プレートミキサーで10分間攪拌する。遠心分離条件2で遠心分離後、上清50μl/wellを96穴平底プレートへ移し、プレートリーダー(1420 ARVO マルチラベルカウンター、パーキンエルマー社製)で405nmの吸収を測定する。
実施例3で取得したヒト・オキュロスパニン発現細胞を、10% FCSを含むRPMI1640培地中で、37℃、5%炭酸ガス下で培養し増殖させてから、1×107細胞/mlに調製した細胞懸濁液を、U字底96穴マイクロプレート(ヌンク社製)に50μl/ウェルずつ分注し、遠心分離(90×g、4℃、10分)する。上清を除去し、上記(4−3)で培養する融合細胞の培養上清を50μl/ウェル加えて撹拌した後、氷上で1時間静置してから、遠心分離(90×g、4℃、10分)して上清を除去する。ペレットを100μl/ウェルのフローサイトメトリー用緩衝液(5% FCS、0.04%(w/v) アジ化ナトリウムを含むPBS)で2回洗浄した後、500倍希釈したフルオレッセイン−5−イソチオシアネート(Fluorescein-5-isothiocyanate;以下「FITC」という)標識ヤギ抗マウスIgG抗体IgG画分(オルガノン・テクニカ社製)50μlを二次抗体として加え、氷上で1時間静置する。遠心分離(90×g、4℃、10分)して上清を除去してから、ペレットをフローサイトメトリー用緩衝液100μl/ウェルで2回洗浄後、3.7% ホルマリン溶液 50μlを添加し、氷上で10分静置することにより細胞を固定する。遠心分離(90×g、4℃、10分)して上清を除去してから、再度フローサイトメトリー用緩衝液100μl/ウェルで洗浄し、ペレットをフローサイトメトリー用緩衝液100μl/ウェルに懸濁したものをフローサイトメトリー用試料とする。各試料中の細胞のFITC蛍光強度をフローサイトメーター(エピックス・エリート;コールター社製)で測定する(励起波長:488nm、検出波長:530nm)。その結果、融合細胞培養上清を添加しなかったヒト・オキュロスパニン発現細胞(FITC蛍光強度約0.3)よりも明らかに高値(約100−1000)のFITC蛍光強度を示した試料に対応する融合細胞を選別する。
上記(4−4)で選別される細胞群について、上記(4−3)から(4−4)の一連の工程を5回繰り返すことにより、ヒト・オキュロスパニン発現細胞と結合するが導入前の細胞と結合しない単一な抗体を産生するハイブリドーマを数クローン得る。
実施例4で作出されるマウス−マウスハイブリドーマを、10% FCSを含むASF培地 1リットル中で、37℃、5% 炭酸ガス下で培養し、1×106細胞/mlとなるまで増殖させる。培養液を遠心分離(1000rpm、2分間)し、上清を捨て、沈澱した細胞を無血清ASF培地で1回洗浄後、無血清ASF培地1リットルに再懸濁し、37℃、5% 炭酸ガス下で48時間培養する。この培養液を遠心分離(1000rpm、2分間)し、上清を回収して透析チューブ(排除限界分子量12000−14000;ギブコ・ビーアールエル社製)に入れ、10倍量の10mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)に対して透析する。この透析チューブ内液からのIgGの粗精製を、高速液体クロマトグラフィー装置(FPLCシステム;ファルマシア社製)を用いて以下に記載する条件で行う:
カラム: DEAE−セファロース CL−6Bカラム(カラムサイズ10ml;ファルマシア製);
溶媒: 10mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)
流速: 1ml/分;
溶出: 1M 塩化ナトリウムの直線濃度勾配(0−50%、180分)。
溶出液を5mlずつ分画し、各分画中の抗ヒト・オキュロスパニン抗体価を、ヒト・オキュロスパニン蛋白質を用いたELISA法により検定する。まず、実施例3で調製するヒト・オキュロスパニン発現細胞より調製した膜画分溶液をELISA用96穴マイクロプレート中に100μl/ウェル入れ、37℃で1時間保温した後、この溶液を捨て、各ウェルをPBS−Tween 100μl/ウェルで3回洗浄する。次に2% ウシ血清アルブミンを含むPBS 100μl/ウェルを入れて37℃で1時間保温する。PBS−Tween 100μl/ウェルで3回洗浄した後に、各溶出分画 100μlを入れて37℃で1時間保温する。さらに、PBS−Tween 100μl/ウェルで3回洗浄した後に、PBS−Tweenで2000倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体(アマシャム社製)100μl/ウェルを添加して37℃で1時間反応させ、PBS−Tween 100μl/ウェルで3回洗浄する。次に西洋ワサビペルオキシダーゼ基質(バイオラッド社製)100μl/ウェルを入れて5分間静置した後、マイクロプレートリーダーで各ウェルの415nmの吸光度を測定する。
生物活性の指標として、抗体依存性細胞傷害活性を測定する。
各ウェルの細胞死誘導率は以下の計算式より算出する。細胞死誘導率(%)=(各テストウェルのカウント−陰性コントロールウェルのカウント)/(陽性コントロールウェルのカウント−陰性コントロールウェルのカウント)x100
RPMI1640培地のみのコントロールと比較し、精製マウス抗ヒト・オキュロスパニン抗体若しくはハイブリドーマ上清の添加により、ヒト・オキュロスパニン発現細胞への細胞死の誘導が認められる。
a)プラスミドpEF-DEST51- NM_031945の構築
pENTR Directional TOPO Cloning Kits (インビトロジェン社製)を添付プロトコールに従って用い、実施例2a)によって得られたNM_031945 cDNAをpENTR/D−TOPOベクターにクローニングした。NM_031945 cDNAを、キット付属の反応バッファー中でTopoisomeraseを結合させてあるpENTR/D−TOPOベクターと混合し室温で30分間インキュベートした。得られた反応物を用いて大腸菌OneShot TOP10 Chemically Competent E.coli(インビトロジェン社製)を形質転換し、50μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地上で培養した。その結果カナマイシン耐性を示して生育してきた大腸菌コロニーを選択して、1mlの50μg/mlのカナマイシンを含む液体TB培地中で37℃で一晩培養し、Montage Plasmid Miniprep96 Kit(ミリポア社製)を利用することによりプラスミドDNAを単離精製した。得られたプラスミドDNAについて、BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction Kitをその添付プロトコールに従って用いることにより反応を行った後、ABI PRISM 3100 DNA Analyzer(アプライド・バイオシステムズ社製)によりヌクレオチド配列解析を行い、GenBank アクセッション番号(ACCESSION NO.NM_031945 に示されるヌクレオチド配列のOpen ReadingFrameを有するcDNA(配列表の配列番号1)が、pENTR/D−TOPOベクターに組み込まれていることを確認した。
BALB−3T3細胞(理研clone A31)を、10% ウシ血清(GIBCO製)(以下「BS」という)を含むダルベッコ変法イーグル培地(以下「DMEM」という:SIGMA社製)を入れた細胞培養用150mmDish(培養面積148cm2;IWAKI社製)330枚中でセミコンフルエントになるまで37℃、5% 炭酸ガス下で培養した後、pEF-DEST51- NM_031945をBALB−3T3細胞にトランスフェクションした。BALB−3T3細胞へのトランスフェクションは(株)Gene Therapy Systems製のGeneporterTM 2 Transfection Reagentを用いてリポフェクションにより行った。すなわち、細胞を無血清培地(DMEM)で一度洗浄したのち、20mlの無血清培地(DMEM)を加えた。次に50mlファルコンチューブ中にNew DNA Diluentを0.6mlと、上記方法にて回収したプラスミドDNA(pEF-DEST51- NM_031945)24μgを加え、混合した。別の50mlファルコンチューブ中に無血清培地(Opti-MEM I;GIBCO社製)0.35 mlと、GeneporterTM 2 Reagent 84μlを加え、混合した。DNA溶液とGeneporterTM 2溶液を混合し、室温にて20分間放置した。その後、DNA−GeneporterTM 2混合液を細胞に加え(1ml/dish)、37℃、5% CO2下で培養した。3時間後 10% ウシ血清を含むDMEM 20ml/dishに培地交換して、37℃、5% CO2下で一晩培養した。
上記の方法にて培養した細胞をPBS(−)緩衝液(大日本製薬(株)製)で洗浄した。セルスクレーパー(IWAKI社製)を用いて細胞を回収し、5mM Trisバッファー pH7.4 230mlに懸濁した。4℃にて30分間細胞溶液を放置した。Dounce Type B ホモジェナイザー(50ストローク)にて細胞を破砕した。1000Gで10分間、遠心分離機(KUBOTA製)にて遠心し、上清を回収した。
a) 免疫
実施例7で得られたヒト・オキュロスパニン遺伝子発現細胞1×107cellを5週令のBALB/cマウス雌(日本エスエルシーより購入)腹腔内に投与した。2,4,6,8週間後、同様のヒト・オキュロスパニン遺伝子発現細胞(1×107cell/マウス)を腹腔内に投与し追加免疫した。
追加免疫4日後のマウスより脾臓を摘出し、これを10mM HEPES緩衝液(pH7.4)、0.02mg/ml 炭酸水素ナトリウム、300μg/ml L-グルタミン酸を含む無血清MEM培地(イーグルMEM培地「ニッスイ」(1):日水製薬(株)社製9.4g/L)(以下「無血清MEM培地」という)10ml中に入れ、21G’の注射針とピンセットを使い脾臓細胞を扱き出した。この細胞懸濁液を遠心して脾臓細胞を沈澱させた後、この脾臓細胞を無血清MEM培地で2回洗浄してから、無血清MEM培地に懸濁して細胞数を測定した。
上記b)で得られた融合細胞を含む培養液を、HT培地(2nd cloning以降はHY培地)で細胞の密度が1cell/well(10cells/ml)、5 cells/well(50cells/ml)となるように段階希釈した。こうして調整した各試料をあらかじめ100μlのHY培地を各wellに分注しておいた96wellプレートに、100μl/wellずつ分注し、37℃、7%炭酸ガス下で10日間培養した。
d−1)ELISA
実施例7で取得した細胞膜画分を1μg/mlで50μl/wellずつ96穴EIAプレート(COSTAR社製)へ分注した。1日間4度で放置後、プレート内の抗原液をよく振り捨て、PBS(-)に1%BSAを添加した溶液を80μl/well添加し、プレートシールをし、使用時まで4℃で保存した。使用時に室温に戻し、0.1% Tween20入りPBS(PBS-T)を通したSerawasher(Bio-Tec社製)でプレートを3回洗浄した。一次抗体として細胞融合後10-12日経過した細胞培養上清50μlを加え、室温で一時間静置した。一次抗体反応終了後、PBS-Tで3回洗浄し、PBS-Tに0.5%BSAを添加した溶液(抗体希釈液)で5000倍に希釈したアルカリホスファターゼ標識抗マウスIgG抗体(BIO SOURCE社製)を50μl/wellずつ添加し、室温で一時間静置した。二次抗体反応終了後、室温に戻したアルカリホスファターゼ用発色基質p-ニトロフェニルリン酸2Na6H2O(pNPP、和光純薬工業社製)を1mg/ml濃度でpNPPBuffer(97ml/lジエタノールアミン、0.1g/l MgCl2・6H2O PH9.8)に溶解し、100μl/well加えた。プレートリーダー(ナルジェンクインターナショナル社製)で405nm、630nmの吸光度を測定した。
実施例7で取得したHEK293培養細胞を、10% FBSを含むDMEM培地中で、37℃、5%炭酸ガス下で培養し増殖させ、トランスフェクション後24時間培養してから、2×107 細胞/mlに調製した細胞懸濁液を、V字底96穴マイクロプレート(Corning社製)に50μl/ウェルずつ分注し、遠心分離(1000 ×g、20℃、5分)した。上清を除去し、上記c)で培養する融合細胞の培養上清を50μl/ウェル加えて撹拌した後、氷上で0.75時間静置してから、遠心分離(1000×g、20℃、5分)して上清を除去した。ペレットを150μl/ウェルのフローサイトメトリー用緩衝液(5% FBSを含むMEM)で2回洗浄した後、33倍希釈したフルオレッセイン−5−イソチオシアネート(Fluorescein-5-isothiocyanate;以下「FITC」という)標識ウサギ抗マウスIgG抗体IgG画分(和光純薬工業社製)100μlを二次抗体として加え、氷上で0.75時間静置した。遠心分離(1000×g、20℃、5分)して上清を除去してから、ペレットをフローサイトメトリー用緩衝液150μl/ウェルで2回洗浄し、ペレットをフローサイトメトリー用緩衝液500μl/ウェルに懸濁したものをフローサイトメトリー用試料とした。各試料中の細胞のFITC蛍光強度をフローサイトメーター(FC500;BECKMAN社製)で測定した(励起波長:488nm、検出波長:530nm)。その結果、融合細胞培養上清を添加しなかったHEK293 transient発現細胞よりも高値のFITC蛍光強度を示した試料に対応する融合細胞を選別した。
上記d)で選別される細胞群について、上記c)からd)の一連の工程を2回繰り返すことにより、HEK293 transient発現細胞と結合するが抗ヒト・オキュロスパニン発現プラスミド導入前の細胞と結合しない単一な抗体を産生するハイブリドーマを数クローン得た。このようにしてクローニングされたハイブリドーマ株のひとつは、O3B8−2C9−4F3と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに2004年2月17日付けで、寄託番号FERM BP−08627として寄託されている。
実施例8で作製されたマウス−マウスハイブリドーマを、1×106cells/mlとなるようHY培地に懸濁し、37℃、7% CO2下で3日間静置した。こうして得られた培養液を遠心分離(1600rpm、5min)し、上清を回収してIgGの粗精製を以下の条件で行った。
結合バッファー:pH7.0 (20mM Na2HPO4・12H2O, 20mM Na2HPO4・2H2O)
溶出バッファー:pH3.0 100mM グリシン-HCl
中和バッファー:pH9.0 1M Tris-HCl
ProteinG担体(Amersiam Biosciences社製を必要量分取し、エタノール除去後、超純水で2回wash、結合バッファーで1回wash後、結合バッファーを加えて、50%ゲルスラリーとした。ハイブリドーマ上清にProteinGゲルスラリーを加え、一昼夜4℃でrotate後、結合バッファーで3回洗浄した。洗浄後、溶出バッファーを加え、抗体を溶出させた。溶出液は溶出バッファーの1/10量の中和バッファーを入れたチューブ内に受けた。溶出液はサンプルチューブ型限外濾過器(amicon Ultrafree-MC:Millipore社製の上部に入れて、5000×g、4℃、20分間で遠心し、濾過器下部に回収されたろ液を除去しつつ、濾過器上部の液量が50μlを下回らないよう溶出液を添加した。溶出液を全て添加した後、PBS(-)を溶出液の3倍分のvolumeを加え、Buffer交換し、この濾過器上部に残った液を抗抗ヒト・オキュロスパニン抗体試料とした。
生物活性の指標として、抗体依存性細胞傷害活性を測定した。実施例7で作製されたヒト・オキュロスパニン発現細胞をトリパンブルー染色法で計数後、10%ウシ胎児血清(Moregate社製)を含むRPMI1640培地(インビトロジェン社製、以下RPMI培地)で8×105 cells/0.4mlに調製した。Chromium−51(クロム酸ナトリウム、アマシャムバイオサイエンス社製)40μlを添加後、37℃、5%二酸化炭素存在下、2時間インキュベートした。RPMI培地8mlを添加して攪拌後1500rpmで5分間遠心分離し、この洗浄操作をさらに2回繰り返した。このようにして得られたChromium−51標識ヒト・オキュロスパニン発現細胞をRPMI培地4mlに再懸濁し、あらかじめRPMI培地で5μg/mlに調製した精製マウス抗ヒト・オキュロスパニン抗体50μlを添加した96穴丸底マイクロプレートに50μl(1×104 cells)ずつ播種して4℃で30分間静置した。陰性コントロールウェル もしくは バックグラウンド測定用ウェルには精製マウス抗ヒト・オキュロスパニン抗体の代りにRPMI培地を添加した。
陰性コントロールと比較し、精製マウス抗ヒト・オキュロスパニン抗体の添加により、ヒト・オキュロスパニン発現細胞への細胞死の誘導が認められた(図5)。
Claims (17)
- ヒト・オキュロスパニンと特異的に結合し、該蛋白質を発現している細胞に対し抗体依存性細胞傷害活性を持つモノクローナル抗体。
- 配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び/又は配列表の配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質と特異的に結合し、該蛋白質を発現している細胞に対し抗体依存性細胞傷害活性を持つモノクローナル抗体。
- マウスハイブリドーマO3B8−2C9−4F3(FERM BP−08627)から産生されることを特徴とする、請求項1又は2に記載の抗体。
- ヒト化されていることを特徴とする、請求項1乃至3のいずれか一つに記載の抗体。
- 完全ヒト抗体であることを特徴とする、請求項1乃至2のいずれか一つに記載の抗体。
- IgG抗体であることを特徴とする、請求項1乃至5のいずれか一つに記載の抗体。
- 下記の工程1)乃至4)を含む、癌の検出方法:
1)被験者より採取した検体より、全RNA画分を抽出する工程;
2)正常人より採取した検体より、全RNA画分を抽出する工程;
3)上記工程1)由来の全RNA画分と上記工程2)由来の全RNA画分における、下記のa)又はb)のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの発現量を測定する工程;
a)配列表の配列番号1に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
b)上記a)に記載のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
4)上記工程1)由来の全RNA画分と上記工程2)由来の全RNA画分との間における上記工程3)によって測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、上記工程1)に記載の被験者の癌を検出する工程。 - 下記の工程1)乃至3)を含む、癌の検出方法:
1)被験者より採取した検体における、配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び/又は配列番号4に示されるアミノ酸配列から成る蛋白質の発現量を測定する工程;
2)正常人から採取した検体における、上記工程1)に記載の蛋白質の少なくともいずれか一つの発現量を測定する工程;
3)上記工程1)で検出された蛋白質の発現量と上記工程2)で測定された該蛋白質の発現量の差を解析し、被験者の癌を検出する工程。 - 癌が皮膚癌であることを特徴とする、請求項7又は8に記載の方法。
- 癌がメラノーマであることを特徴とする、請求項7又は8に記載の方法。
- ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が、ノーザンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、RT−PCR、リボヌクレアーゼ保護アッセイ又はランオン・アッセイであることを特徴とする、請求項7、9又は10のいずれか一つに記載の方法。
- ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が検体由来の相補的DNA群又は該DNA群の各DNAの部分配列からなるDNAで作製された遺伝子チップ又はアレイを用いることを特徴とする、請求項7、9又は10のいずれか一つに記載の方法。
- 蛋白質の発現量の測定方法が、該蛋白質に特異的に結合する抗体又はリガンドを用いることを特徴とする、請求項8乃至10のいずれか一つに記載の方法。
- 蛋白質の発現量の測定方法が、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法又は固相酵素免疫定量法(ELISA法)であることを特徴とする、請求項8乃至10のいずれか一つに記載の方法。
- 下記の1)及び2)の少なくとも一つを含む癌の検出用キット:
1)配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び/又は配列表の配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体;
2)上記1)に記載の抗体に結合し得る二次抗体。 - 癌が皮膚癌であることを特徴とする、請求項15に記載のキット。
- 癌がメラノーマであることを特徴とする、請求項15に記載のキット。
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