ES2327408T3

ES2327408T3 - Anticuerpo contra un antigeno especifico de tumor como diana.

Info

Publication number: ES2327408T3
Application number: ES04718767T
Authority: ES
Inventors: Kimihisa Ichikawa; Shu Takahashi; Toshinori Agatsuma; Keisuke Fukuchi; Takehiro Hirai
Original assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Current assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 2003-03-10
Filing date: 2004-03-09
Publication date: 2009-10-29
Anticipated expiration: 2024-03-09
Also published as: RU2005128277A; US20080146785A1; NO20054631L; MXPA05009715A; KR20050116374A; HK1078593A1; DE602004021567D1; ATE434044T1; DK1602669T3; TW200508249A; CA2518787A1; RU2345090C2; EP1602669A4; US7361340B2; WO2004081050A1; JP2004290187A; NO20054631D0; EP1602669A1; AU2004220182A1; EP1602669B1

Abstract

Un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a la proteína oculospanina humana que tiene una secuencia de aminoácidos representada por ID de secuencia nº 2 de la lista de secuencias y/o una secuencia de aminoácidos representada por ID de secuencia nº 4 de la lista de secuencias y tiene actividad citotóxica celular dependiente de anticuerpos contra una célula que expresa esa proteína.

Description

Anticuerpo contra un antígeno específico de tumor como diana.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un anticuerpo útil en el tratamiento del cáncer, a una composición farmacéutica para tratar cáncer caracterizada porque contiene el anticuerpo como principio activo y a usos del anticuerpo como medicamentos y en la preparación de medicamentos para tratar cáncer, por ejemplo, cáncer de piel tal como melanoma.

Técnica anterior

Las células tumorales son conocidas por expresar proteínas antigénicas que son intrínsecas al tipo particular de células tumorales (denominadas en lo sucesivo algunas veces "antígenos asociados a tumores"). Se han intentado desarrollar nuevas terapias para tratar tumores eligiendo como diana antígenos asociados a tumores. Los anticuerpos monoclonales que provocan una respuesta antígeno-anticuerpo específica para tales antígenos asociados a tumores son conocidos por inducir diversos tipos de respuestas inmunitarias in vivo (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), etc.) para atacar células cancerosas, induciendo así muerte celular. Se han desarrollado anticuerpos monoclonales útiles para el tratamiento de tumores.

Sin embargo, la gama de anticuerpos monoclonales útiles para el tratamiento de tumores es limitada. Los anticuerpos monoclonales actualmente disponibles sólo pueden tratar algunos tipos de tumores que incluyen cáncer de mama metastásico, mielosis leucémica aguda, linfoma crónico resistente al tratamiento, linfoma no Hodgkin y mieloma múltiple. Se desea el desarrollo de anticuerpos monoclonales aplicables al tratamiento de otros tumores.

Para obtener un anticuerpo monoclonal útil para el tratamiento de tumores es necesario identificar una proteína específicamente expresada en una célula tumoral y obtener un anticuerpo monoclonal contra este antígeno de
proteína.

La proteína oculospanina humana se obtuvo como un clon de marcas de secuencias expresadas "Expressed Sequence Tag" (EST) derivado de un gen expresado en el epitelio pigmentario retiniano y la membrana coroidea ocular (Wistow y col., Molecular Vision (2002) 8, 25-220). El gen de la oculospanina humana tiene un marco de lectura abierto de 1068 pb. La oculospanina humana está constituida por 355 aminoácidos y se estima que tiene un peso molecular de 36,4 kDa basado en la secuencia de ADN. Wistow y col. (2002) desvelan un anticuerpo policlonal de conejo contra la proteína oculospanina humana. Sin embargo, la relación entre la oculospanina humana y los tumores todavía es desconocida.

Divulgación de la invención

La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a la proteína oculospanina humana que tiene una secuencia de aminoácidos representada por ID de secuencia nº 2 de la lista de secuencias y/o un aminoácido representado por ID de secuencia nº 4 de la lista de secuencias y tiene actividad citotóxica celular dependiente de anticuerpos contra una célula que expresa esa proteína y una composición farmacéutica para tratar cáncer que contiene el anticuerpo como principio activo.

Los presentes inventores han identificado un gen específicamente expresado en tejido de cáncer humano y han encontrado que el nivel de expresión del gen de la oculospanina humana, que es de función desconocida, es significativamente superior en células de melanoma.

Más específicamente, la presente invención proporciona:

(1): Un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a la proteína oculospanina humana que tiene una secuencia de aminoácidos representada por ID de secuencia nº 2 de la lista de secuencias y/o una secuencia de aminoácidos representada por ID de secuencia nº 4 de la lista de secuencias y tiene actividad citotóxica celular dependiente de anticuerpos contra una célula que expresa esa proteína.

(2): Un anticuerpo según la sección 1, caracterizado porque dicho anticuerpo se produce por hibridoma de ratón O3B8-2C9-4F3 (FERM BP-08627).

(3): Un anticuerpo según la sección 1 ó 2, caracterizado porque dicho anticuerpo es humanizado.

(4): Un anticuerpo según la sección 1, caracterizado porque dicho anticuerpo es un anticuerpo humano completo.

(5): Un anticuerpo según una cualquiera de las secciones 1 a 4, caracterizado porque dicho anticuerpo es un anticuerpo de IgG.

(6): Una composición farmacéutica que comprende al menos uno de los anticuerpos según las secciones 1 a 5.

(7): Un anticuerpo según una cualquiera de las secciones 1 a 5 para uso como medicamento.

(8): El uso de un anticuerpo según una cualquiera de las secciones 1 a 5 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer.

(9): El uso de un anticuerpo según una cualquiera de las secciones 1 a 5 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer de piel.

(10): El uso de un anticuerpo según una cualquiera de las secciones 1 a 5 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de melanoma.

(11): Un anticuerpo según una cualquiera de las secciones 1 a 5 para uso en el tratamiento de cáncer.

(12): Un anticuerpo según una cualquiera de las secciones 1 a 5 para uso en el tratamiento de cáncer de piel.

(13): Un anticuerpo según una cualquiera de las secciones 1 a 5 para uso en el tratamiento de melanoma.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1, la figura superior, es una gráfica que muestra el nivel de expresión del gen de la oculospanina humana en diversos tipos de células; y la figura inferior es una gráfica que muestra el nivel de expresión del gen de la oculospanina humana en muestras de piel de una persona sana y en muestras de melanoma;

la Figura 2, la figura superior, es una gráfica que muestra el nivel de expresión del gen de la oculospanina humana en muestras de piel de una persona sana y en muestras de melanoma derivadas de tejido de la piel; y la figura inferior es una gráfica que muestra el nivel de expresión del gen de la oculospanina humana en muestras de piel de una persona sana y en muestras de melanoma derivadas de tejido de ganglio linfático;

la Figura 3 es una gráfica que muestra el nivel de expresión del gen de la oculospanina humana en muestras derivadas del ganglio linfático de una persona sana y en muestras de melanoma derivadas de tejido de ganglio linfático;

la Figura 4 muestra la expresión de productos génicos de la oculospanina humana en células NIH3T3; y

la Figura 5 es una gráfica que muestra la actividad citotóxica dependiente de anticuerpos de un anticuerpo de la oculospanina anti-humana en una célula que expresa oculospanina humana.

Mejor modo para llevar a cabo la invención

En la memoria descriptiva de la presente invención, un anticuerpo monoclonal que tiene un efecto terapéutico contra el cáncer es un anticuerpo monoclonal que tiene actividad para suprimir el crecimiento del cáncer y/o actividad para reducir el cáncer. En la memoria descriptiva de la presente invención, los términos "cáncer" y "tumor" tienen el mismo significado. El término "gen" como se usa en el presente documento incluye no sólo ADN, sino también ARNm del mismo, ADNc y ARNc del mismo. Por consiguiente, el término "gen de la oculospanina humana" como se usa en el presente documento incluye ADN, ARNm, ADNc y ARNc del gen de la oculospanina humana. El término "polinucleótido" como se usa en el presente documento tiene el mismo significado que el de un ácido nucleico y por tanto incluye ADN, ARN, sonda, oligonucleótido y cebador. Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento. El término "fracción de ARN" como se usa en el presente documento se refiere a una fracción que contiene ARN. Además, el término "célula" usado en el presente documento incluye una célula dentro de un cuerpo animal y una célula cultivada. El término "canceración de una célula" usado en el presente documento se refiere a la proliferación anormal de células que se produce por su falta de sensibilidad para inhibir el contacto y su proliferación independiente de andamiaje. Una célula que presenta una proliferación anormal tal se denomina en lo sucesivo una "célula cancerosa". En la memoria descriptiva, una proteína que tiene la misma función que la de la oculospanina humana, tal como actividad de canceración, también se denomina en lo sucesivo una "oculospanina humana". Obsérvese que el término "oncogén" como se usa en la presente invención incluye un gen precanceroso y un protooncogén distinto del oncogén.

El término "citotoxicidad" usado en el presente documento se refiere a un cambio patológico en una célula producido por cualquier razón. Por tanto, la citotoxicidad incluye no sólo la lesión directa externamente ocasionada, sino también diversos cambios estructurales y funcionales que pueden producirse dentro de una célula, que incluyen escisión de ADN, dimerización de bases, escisión cromosómica, mal funcionamiento del aparato mitótico celular y una reducción en las actividades enzimáticas. El término "actividad citotóxica" usado en el presente documento se refiere a cualquier actividad que produzca citotoxicidad, como se menciona anteriormente.

El término "hibrida bajo condiciones restrictivas" se refiere a la hibridación que se realiza a 68ºC en una disolución de hibridación comercialmente disponible, concretamente ExpressHyb (preparada por Clontech) o a la hibridación que se realiza a 68ºC en presencia de NaCl a 0,7 a 1,0 M usando un filtro que tiene ADN inmovilizado sobre el mismo, seguido por lavado a 68ºC con 0,1 a 2x de disolución SSC (1x de disolución SSC contiene NaCl 150 mM y citrato de sodio 15 mM), dando como resultado la hibridación. El término anterior también incluye la hibridación en condiciones equivalentes a las anteriores.

1. Oculospanina humana (1) Confirmación de la expresión específica del gen de la oculospanina humana

Como resultado de analizar los niveles de expresión del gen de la oculospanina humana en diversos tipos de células humanas se encontró que el gen se expresa a un nivel de expresión significativamente mayor en melanocitos en comparación con otros tejidos. Además, los presentes inventores encontraron que el nivel de expresión del gen de la oculospanina humana en melanoma es significativamente superior en melanocitos normales. Para explicarlo más específicamente encontraron lo siguiente: cuando el nivel de expresión de la oculospanina humana se compara en melanocitos, linfoblastos y células de la glía, y en células epiteliales se encuentra que el nivel de expresión en melanocitos es significativamente mayor. Además, cuando el nivel de expresión de la oculospanina humana en células normales de la piel se compara con el de en melanoma, el nivel de expresión es significativamente mayor en el melanoma. De estos hallazgos puede concluirse que la oculospanina humana puede participar en la canceración de células y/o en la proliferación de células cancerosas. Esto sugiere que el estado de canceración y/o el estado de proliferación de células cancerosas producido por la expresión excesiva de oculospanina humana pueden determinarse midiendo el nivel de expresión de la oculospanina humana en células y/o tejidos individuales. Un ejemplo de tal cáncer es cáncer de piel, en particular melanoma. Sin embargo, este hallazgo puede aplicarse a cánceres distintos de cáncer de piel, con la
condición que la oculospanina humana se exprese en el cáncer a un nivel significativamente mayor que en otros tejidos.

La secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto (ORF) del gen de la oculospanina humana está representada por ID de secuencia nº 1 de la lista de secuencias y la secuencia de aminoácidos de la misma está representada por ID de secuencia nº 2. Además, el ADNc del gen de la oculospanina humana se ha registrado en GenBank como ARNm de la oculospanina de Homo sapiens (OCSP) con el número de registro NM_031945. La secuencia de nucleótidos del ADNc registrada en GenBank está representada por ID de secuencia nº 3 de la lista de secuencias. El ORF está representado por los nucleótidos nº 65 a 1129 de ID de secuencia nº 3. Además, la secuencia de aminoácidos de la oculospanina humana registrada en GenBank está representada por ID de secuencia nº 4 de la lista de secuencias.

2. Procedimiento para detectar cáncer

Se cree que la oculospanina humana, debido a que se expresa altamente en células cancerosas, especialmente en melanoma, participa en la canceración de células, particularmente células de la piel, y/o proliferación de células cancerosas. El término "espécimen" se refiere a una muestra tomada de un sujeto de prueba o un espécimen clínico e incluye muestras de tejidos, excremento o similares, tales como muestras de sangre, fluidos corporales, próstata, testículos, pene, vejiga, riñón, cavidad bucal, faringe, labio, lengua, encía, nasofaringe, esófago, estómago, intestino delgado, intestino grueso, colon, hígado, vesícula biliar, páncreas, nariz, pulmón, hueso, tejido blando, piel, mama, útero, ovario, cerebro, tiroides, ganglio linfático, músculo y tejido adiposo. Las muestras de tejido preferidas son piel y ganglio linfático.

(1) Procedimiento para detectar cáncer usando el nivel de expresión del gen de la oculospanina humana

Un procedimiento para detectar cáncer usando el nivel de expresión del gen de la oculospanina humana comprende específicamente las siguientes etapas 1) a 4):

1): una etapa de extraer una fracción de ARN total de un espécimen tomado de un sujeto de prueba;

2): una etapa de extraer una fracción de ARN total de un espécimen tomado de una persona sana;

3): una etapa de medir el nivel de expresión del gen de la oculospanina humana en las fracciones de ARN total según las etapas 1) y 2); y

4): una etapa de analizar la diferencia en el nivel de expresión del gen entre la fracción de ARN total derivada de las etapas 1) y 2), la medida en la etapa 3) y así detectar el cáncer del sujeto de prueba de la etapa 1).

Las etapas individuales se explicarán más específicamente del siguiente modo.

a) Etapa 1)

Extracción de una fracción de ARN total de un espécimen tomado de un sujeto de prueba

En la extracción de la fracción de ARN total de un espécimen, el tejido humano se obtiene mediante un procedimiento apropiado que cumple los principios éticos para experimentación. El tejido obtenido se disuelve directamente en un disolvente de extracción de ARN (que contiene un inhibidor de la ribonucleasa tal como fenol). Alternativamente, las células del tejido obtenido se recogen escoriándolas usando una espátula para no romper las células, o extrayéndolas cuidadosamente del tejido usando una enzima proteolítica tal como tripsina, y luego sometiendo inmediatamente las células a una etapa de extracción de ARN.

Ejemplos de procedimientos de extracción de ARN que pueden usarse incluyen: procedimientos de ultracentrifugación con tiocianato de guanidina/cloruro de cesio, procedimientos con tiocianato de guanidina/fenol caliente, procedimientos con clorhidrato de guanidina y procedimientos con tiocianato de guanidina ácida/fenol/cloroformo (Chomczynski, P. y Sacci, N. Anal. Biochem. (1987), 162, 156-159). De estos son particularmente adecuados los procedimientos con tiocianato de guanidina ácida/fenol/cloroformo. Alternativamente puede usarse un reactivo de extracción de ARN comercialmente disponible tal como ISOGEN (preparado por Nippon Gene Co. Ltd.) o el reactivo TRIZOL (preparado por Gibco BRL) según el protocolo proporcionado con el reactivo.

Si es necesario, de la fracción de ARN total obtenida se prefiere que el ARNm solo se purifique y se use. Puede usarse cualquier procedimiento de purificación adecuado. Por ejemplo, el ARNm puede purificarse adsorbiendo el ARNm sobre una sonda de oligo (dT) biotinilada, uniendo el ARNm a partículas paramagnéticas que tienen estreptavidina inmovilizada sobre las mismas mediante la unión de biotina a estreptavidina, lavando las partículas y eluyendo el ARNm. Alternativamente, el ARNm puede purificarse adsorbiendo el ARNm sobre una columna de oligo (dT)-celulosa y eluyendo el ARNm de la misma. Sin embargo, una etapa de purificación de ARNm no es esencial en los procedimientos descritos en el presente documento. Una fracción de ARN total puede usarse siempre que pueda detectarse la expresión de un polinucleótido deseado, como puede hacerse en las etapas posteriores.

b) Etapa 2)

Extracción de una fracción de ARN total de un espécimen tomado de una persona sana

Una persona sana significa una persona que no tiene cáncer. La determinación de si una persona está sana o no puede hacerse midiendo la concentración de oculospanina humana y determinando si el valor de concentración medido entra dentro o no de un intervalo predeterminado para una persona sana. Alternativamente, la correlación entre el nivel de expresión de la oculospanina humana y el grado de formación de cáncer puede investigarse por adelantado, y entonces la determinación de si un sujeto de prueba es una persona sana o no puede hacerse midiendo el nivel de expresión de la oculospanina humana en un espécimen tomado del sujeto de prueba. La preparación de una fracción de ARN total de una persona sana puede realizarse del mismo modo que se describe en la etapa 1) anterior.

c) Etapa 3)

Medición del nivel de expresión del gen de la oculospanina humana en una fracción de ARN total según las etapas 1) y 2)

El nivel de expresión del gen de la oculospanina humana se representa por el nivel de expresión de un polinucleótido que puede hibridarse con un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos representada por ID de secuencia nº 1 de la lista de secuencias o un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos representada por ID de secuencia nº 1 de la lista de secuencias, bajo condiciones restrictivas.

El nivel de expresión del gen de la oculospanina humana puede determinarse usando un espécimen inmovilizado, éste y otros procedimientos se describen a continuación.

(a) Ensayo usando muestras inmovilizadas (i) Muestras inmovilizadas

Los siguientes son ejemplos de muestras inmovilizadas.

i) Genochips

Puede usarse un genochip sobre el cual se inmoviliza o un oligonucleótido antisentido, que se sintetiza basado en una secuencia de EST (marca de secuencia expresada) a partir de una base de datos, o una secuencia de ARNm. Ejemplos de tales genochips incluyen genochips fabricados por Affymetrix (Lip Shutz, R.J. y col., Nature Genet. (1999), 21, suplemento, 20-24), pero no se limitan a éstos, y pueden prepararse basándose en cualquier procedimiento conocido. Cuando se analiza el ARNm derivado de una célula humana, preferentemente se usa un genochip derivado de secuencias humanas. Por ejemplo, pueden usarse las secuencias humanas U95 set o U133 set fabricadas por Affymetrix. Sin embargo, los genochips adecuados no se limitan a éstos y puede usarse un genochip derivado de, por ejemplo, una especie animal estrechamente relacionada con un ser humano.

ii) Matrices o filtros de membrana sobre los cuales se inmoviliza un ADNc o producto de RT-PCR preparado a partir de ARN humano total o ARN total tomado de un tejido específico de un sujeto humano.

El ADNc o el producto de RT-PCR puede ser un clon obtenido realizando una reacción de transcripción inversa y PCR usando un cebador preparado basándose en una secuencia de una base de datos tal como una base de datos de EST humanas. El ADNc o el producto de RT-PCR puede haberse seleccionado previamente usando un procedimiento de sustracción (Diatchenki, L. y col., Proc. Natl. Acad. Sci, USA (1996) 93, 6025-6030) o un procedimiento de expresión diferencial (Liang, P. y col., Nucleic Acids Res. (1992) 23, 3685-3690) basado en ARN total en el que el nivel de expresión es distinto entre una persona que tiene un tumor y una persona que no tiene un tumor. La matriz o el filtro puede ser uno que está comercialmente disponible, tal como aquellos proporcionados por IntelliGene (fabricados por Takara Bio). Alternativamente, el ADNc o el producto de RT-PCR puede inmovilizarse usando un robot spotter comercialmente disponible, tal como el robot para la fabricación de micromatrices GMS417 (fabricado por Takara Bio) para fabricar una matriz o un filtro.

(ii) Preparación de una sonda y análisis

No un clon de ARNm específico, sino todo el ARNm expresado, está marcado y se usa como la sonda marcada. El ARNm bruto (sin purificar) puede usarse como material de partida para preparar una sonda; sin embargo, preferentemente se usa ARN de poli(A)^{+} que se ha purificado por el procedimiento anteriormente mencionado. Un procedimiento para preparar la sonda marcada y un procedimiento para detectar y analizar la sonda usando diversos tipos de muestra inmovilizada se describen adicionalmente del siguiente modo.

i) Genochip fabricado por Affymetrix

Una sonda de ARNc marcada con biotina se prepara según el protocolo (Affymetrix's Expression Analysis Technical Manual) proporcionado con el GeneChip fabricado por Affymetrix. Posteriormente se realiza la hibridación y el análisis para detectar y analizar la luz emitida del ácido adípico usando un analizador de Affymetrix (GeneChip Fluidics Station 400) según el protocolo (Expresión Analysis Technical Manual) proporcionado con el GeneChip fabricado por Affymetrix.

ii) Matriz

Con el fin de detectar el ADNc, una marca debe unirse al ADNc cuando se prepara a partir de ARN de poli(A)^{+}
usando una reacción de la transcriptasa inversa. Para obtener ADNc fluorescentemente marcado, el d-UTP marcado con un colorante fluorescente tal como Cy3 o Cy5 puede incluirse en la mezcla de reacción. Si el ARN de
poli(A)^{+} derivado de una célula de melanoma y el ARN de poli(A)^{+} derivado de una célula usada como control se marcan con colorantes diferentes, entonces ambos tipos de ARN de poli(A)^{+} pueden usarse simultáneamente en una mezcla. Cuando se usa una matriz comercialmente disponible, por ejemplo una matriz fabricada por Takara Bio Co. Ltd., la hibridación y el lavado se realizan según el protocolo proporcionado y entonces luego se detecta una señal fluorescente usando un detector de señales fluorescentes (por ejemplo, el escáner de matrices GMS418 fabricado por Takara Bio Co. Ltd.) y después de esto se somete a análisis. La elección de la matriz para uso como se describe en el presente documento no se limita a aquellas que están comercialmente disponibles. Puede usarse una matriz hecha en casa y una matriz específicamente preparada en casa.

iii) Filtro de membrana

Cuando se prepara ADNc de ARN de poli(A)^{+} mediante transcripción inversa, una sonda marcada puede prepararse añadiendo un radioisótopo (por ejemplo, d-CTP) a la reacción. La hibridación se realiza según procedimientos tradicionales. Más específicamente, la hibridación puede realizarse usando el sistema Atlas (fabricado por Clontech), que es una micromatriz formada usando un filtro comercialmente disponible, después de la hibridación la micromatriz se lava. Después de esto, la detección y el análisis se realizan usando un analizador (por ejemplo, Atlas Image fabricado por Clontech).

En uno cualquiera de los procedimientos i) a iii), una sonda derivada de tejido humano se hibrida con las muestras inmovilizadas del mismo lote. La sonda que se usa puede estar cargada, pero las condiciones de hibridación usadas se mantienen iguales. Cuando se usan sondas fluorescentemente marcadas, si las sondas se marcan con diferentes colorantes fluorescentes, entonces las sondas de diferentes tipos pueden añadirse simultáneamente en forma de una mezcla e hibridarse con las muestras inmovilizadas. Después de esto, la intensidad fluorescente puede leerse simultáneamente (Brown, P.O. y col., Nature Genet. (1999) 21, suplemento, pág. 33-37).

(b) Otros procedimientos de medición

Además de los procedimientos de medición mencionados anteriormente, hay procedimientos de clonación por sustracción (véase Experimental Medicine, volumen suplementario, New Genetic Engineering Handbook, publicado por Yodosha Co. Ltd. (1996), p32-35); procedimientos de expresión diferencial (Basic Biochemical Experimental Method 4, nucleic acid/gene experiment, II. Applied Series, Tokyo Kagakudojin (2001), pág. 125-128); y procedimientos que usan un gen indicador: cloranfenicol acetiltransferasa (tal como un vector pCAT3-Basic preparado por Promega), \beta-galactosidasa (tal como un vector p\betagal-Basic preparado por Promega), fosfatasa alcalina segregada (tal como pSEAP2-Basic preparada por Clontech); o proteína verde fluorescente (tal como pEGFP-1 preparada por Clontech). Sin embargo, la elección del procedimiento de medición no se limita a estos procedimientos.

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Etapa 4)

Analizar la diferencia en el nivel de expresión del gen entre la fracción de ARN total derivada de las etapas 1) y 2), la medida en la etapa 3) y detectar cáncer en un sujeto de prueba de etapa 1)

Se analiza la diferencia en el nivel de expresión de oculospanina humana entre un espécimen derivado de una persona sana y un espécimen derivado de un sujeto de prueba. Si un espécimen muestra un nivel de expresión significativamente alto de oculospanina humana, se determina que la posibilidad de que tenga cáncer, particularmente cáncer de piel, y más particularmente melanoma, es alta, es decir, puede detectarse el cáncer. El término "nivel de expresión significativamente alto" se refiere al caso en el que, cuando el análisis se realiza usando GeneChip (fabricado por Affymetrix) y la micromatriz Suite Ver. 3.0 (fabricada por Affymetrix), un valor de diferencia promedio de un gen derivado de una célula de melanoma es significativamente alto en comparación con el de un melanocito
normal.

Alternativamente, el nivel de expresión de oculospanina humana se mide, y luego se evalúa para determinar si el valor de concentración medido entra o no dentro de un intervalo predeterminado para una persona sana. Si el valor supera el intervalo, el sujeto tiene cáncer. El diagnóstico de cáncer puede hacerse de este modo. De otro modo, la correlación entre el nivel de expresión del gen de la oculospanina humana y el grado de formación de cáncer en una persona sana se investiga previamente, y luego se mide el nivel de expresión del gen de la oculospanina humana de un espécimen tomado del sujeto de prueba. Por tanto, de este modo puede determinarse si un sujeto de prueba es una persona sana o no.

(3) Procedimiento para detectar cáncer usando el nivel de expresión de oculospanina humana (nivel de expresión de proteína)

Más específicamente, un procedimiento para detectar cáncer usando el nivel de expresión de la oculospanina humana puede ser un procedimiento que incluye las etapas 1) a 3) a continuación.

1): medir el nivel de expresión de la proteína oculospanina humana en un espécimen tomado de un sujeto;

2): medir el nivel de expresión de la misma proteína que se describe en la etapa 1) en un espécimen tomado de una persona sana; y,

3): analizar la diferencia entre el nivel de expresión de la proteína medida en las etapas 1) y 2) y así detectar que un sujeto tiene cáncer.

Las etapas individuales se describen en más detalle del siguiente modo:

a) Medir el nivel de expresión de la proteína oculospanina humana en un espécimen tomado de un sujeto (i) Preparación de una muestra de un espécimen para la medición de la proteína

El espécimen se somete a centrifugación de alta velocidad según las necesidades para eliminar sustancias insolubles y luego se prepara como una muestra para ELISA/RIA y transferencia de Western.

Para preparar una muestra para ELISA/RIA, la piel o el tejido de ganglio linfático tomado de un sujeto se usa directamente, o se diluye apropiadamente en una disolución tampón antes de uso. Para la transferencia de Western (electroforesis) puede usarse directamente como muestra una disolución extraída de piel o tejido de ganglio linfático, o diluirse apropiadamente con una disolución tampón y mezclarse con una disolución tampón de muestra (preparada por Sigma) que contiene 2-mercaptoetanol para electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Para la transferencia por hoyos o ranuras puede usarse una disolución extraída de piel o tejido de ganglio linfático sin diluir o apropiadamente diluida en una disolución tampón, las muestras se adsorben directamente sobre una membrana usando un dispositivo de transferencia.

(b) Inmovilización de la muestra

Una proteína en la muestra así obtenida puede detectarse específicamente precipitando la proteína usando un procedimiento tal como inmunoprecipitación o unión a ligando, tanto sin inmovilización adicional como después de la inmovilización directa de la misma. Para inmovilizar una proteína, la membrana usada puede ser una tal como la que se usa en transferencia de Western, transferencia por hoyos o transferencia por ranuras. Ejemplos de tales membranas incluyen membranas de nitrocelulosa (por ejemplo, como se fabrican por BioRad), membranas de nailon tales como Hybond-ECL (fabricadas por Amersham Pharmacia), membranas de algodón tales como filtros absorbentes de transferencia (por ejemplo, como se fabrican por BioRad) y membranas de poli(difluoruro de vinilideno) (PVDF) (por ejemplo, fabricadas por BioRad).

Para detectar y cuantificar una proteína usando un procedimiento de ELISA o RIA, una muestra o una disolución de muestra diluida (por ejemplo, diluida con solución salina tamponada con fosfato (denominada en lo sucesivo "PBS") que contiene el 0,05% de azida de sodio) se dispensa a una placa de 96 pocillos, tal como una Immunoplate, Maxisorp, (fabricada por Nunc) y se incuba sin agitación a una temperatura en el intervalo de 4ºC hasta temperatura ambiente durante la noche, o a 37ºC durante 1 a 3 horas, permitiéndose así que la proteína se adsorba a la superficie del fondo de los pocillos para inmovilizar la proteína.

El anticuerpo contra oculospanina humana puede obtenerse usando un procedimiento habitual (véase, por ejemplo, New Biochemical Experimental Course 1, Protein 1, pág. 389-397, 1992) que comprende inmunizar un animal con oculospanina humana o un polipéptido arbitrariamente seleccionado de las secuencias de aminoácidos de oculospanina humana, tomar el anticuerpo producido en el cuerpo y purificarlo. Alternativamente, un anticuerpo monoclonal puede obtenerse según un procedimiento muy conocido en la técnica (por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature 256, 495-497, 1975, Kennet, R. ed. Monoclonal Antibody, pág. 365-367, 1980, Plenum Press, N. Y.) que comprende fusionar una célula productora de anticuerpos que produce un anticuerpo contra oculospanina humana con una célula de mieloma para formar una célula de hibridoma.

La proteína oculospanina humana para uso como antígeno puede obtenerse introduciendo un gen de la oculospanina humana en una célula huésped mediante manipulación genética. Para explicarlo más específicamente, la proteína oculospanina humana puede obtenerse preparando un vector que puede expresar el gen de la oculospanina humana, introduciendo el vector en la célula huésped, expresando el gen y purificando la proteína oculospanina humana expresada.

(c) Medición del nivel de expresión de la oculospanina humana

El nivel de expresión de la oculospanina humana puede representarse por el nivel de expresión de una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por ID de secuencia nº 2 de la lista de secuencias.

El nivel de expresión puede medirse mediante un procedimiento conocido en la técnica, tal como una transferencia de Western o un procedimiento de transferencia por hoyos/ranuras usando anticuerpo de la oculospanina anti-humana.

b) Etapa 2

Medir el nivel de expresión de la misma proteína que se describe en la etapa 1 en un espécimen tomado de una persona sana

La medición del nivel de expresión de la oculospanina humana en un espécimen tomado de una persona sana puede realizarse del mismo modo que se describe en la etapa 1) anterior.

c) Etapa 3

Analizar la diferencia entre el nivel de expresión de la proteína medida en las etapas 1) y 2) y así detectar que un sujeto tiene cáncer

Se analiza la diferencia en el nivel de expresión de la oculospanina humana entre especímenes de una persona sana y un sujeto de prueba. Como resultado, si un espécimen presenta un nivel de expresión significativamente alto de oculospanina humana, puede determinarse que hay una alta probabilidad de un sujeto que tiene cáncer, particularmente cáncer de piel, y más particularmente melanoma. De este modo puede detectarse el cáncer.

Alternativamente, el cáncer puede detectarse midiendo la concentración de oculospanina humana y analizando si el valor de concentración medido entra o no dentro del intervalo predeterminado para una persona sana. En este caso, si el valor de concentración de un sujeto es superior al intervalo para una persona sana, se determina que el sujeto tiene cáncer. Además, investigando la correlación entre el nivel de expresión de la oculospanina humana y el grado de formación de cáncer en una persona sana es posible determinar si el sujeto está sano o no basándose en el nivel de expresión de la oculospanina humana en un espécimen tomado del sujeto.

3. Investigación del gen de la oculospanina humana y la oculospanina humana

El gen de la oculospanina humana y la oculospanina humana se expresan a un nivel significativamente alto en melanocitos en tejidos humanos normales y se expresan a un nivel significativamente mayor en melanoma que en melanocitos normales.

En un procedimiento de examen de la función de la oculospanina humana, el ADNc de longitud completa se toma primero de una biblioteca de ADNc, se deriva de células que expresan la oculospanina humana mediante un procedimiento conocido tal como un procedimiento de hibridación de colonias. Entonces, el ADNc de longitud completa se introduce en una célula de ratón o de ser humano, se expresa altamente en ella y se lleva a cabo la evaluación para investigar si el ADNc afecta o no la célula.

Para expresar ADNc en un animal puede usarse un procedimiento en el que el ADNc de longitud completa obtenido se introduce en un vector de virus y el vector se administra al animal. Ejemplos de transfección de genes usando un vector de virus incluyen procedimientos de introducción de ADNc integrándolo en un virus de ADN o un virus de ARN tales como un retrovirus, adenovirus, virus adenoasociado, virus del herpes, virus de la variolovacuna, virus de la viruela o virus de la poliomielitis. De estos se prefieren los procedimientos que usan retrovirus, adenovirus, virus adenoasociado y virus de la variolovacuna.

Ejemplos de transfección de genes no virales incluyen administrar un plásmido de expresión directamente en el músculo (vacunación con ADN), tratamiento con liposomas, lipofección, microinyección, tratamiento con fosfato de calcio, electroporación y similares. De estos se prefieren la vacunación con ADN y el tratamiento con liposomas.

Además, transfectando el ADNc de longitud completa en células cultivadas, tales como células del músculo, células del hígado o células adiposas derivadas de ser humano, ratón o rata; o en células del músculo, células del hígado, células adiposas o células de la piel primarias, y expresando el ADNc en su interior a un alto nivel es posible examinar las funciones de una célula diana, más específicamente, la producción y la captación de azúcares y lípidos, el control del metabolismo de glucolípidos tal como la acumulación de glucógeno, o ver si hay algún efecto en la morfología de una célula. En cambio, introduciendo en una célula un ácido nucleico antisentido al ARNm de un gen que va a examinarse es posible examinar los efectos producidos en la función y la morfología de la célula diana.

Para introducir un ADNc de longitud completa en un animal o una célula, el ADNc se integra en un vector que contiene secuencias promotoras apropiadas y la transformación se lleva a cabo para transformar la célula huésped con el vector. El vector de expresión para uso con un célula de animal vertebrado puede tener un promotor que normalmente está localizado aguas arriba del gen que va a expresarse, un sitio de corte y empalme de ARN, un sitio de poliadenilación, una secuencia de terminación de la transcripción, etc. Además, si es necesario, puede estar presente un punto de iniciación de la replicación. Ejemplos de un vector de expresión tal incluyen, pero no se limitan a, pSV2dhfr que tiene un promotor temprano de virus de simio 40 (SV40) (Subramani, S. y col., Mol. Cell. Biol. (1981), 1, pág. 854-864), vectores de retrovirus pLNCX, pLNSX, pLXIN, pSIR (preparados por Clontech) y vector de cósmido pAxCw (preparado por Takara Bio). Estos vectores de expresión pueden integrarse en una célula de simio tal como una célula COS (Gluzman, Y. Cell (1981), 23, pág.175-182, ATCC: CRL-1650), una cepa defectuosa de ácido dihidrofólico-reductasa (Urlaub, G. y Chasin, L.A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980), 77, pág. 4126-4220) de una célula de ovario de hámster chino (célula CHO, ATCC: CCL-61), riñón de embrión humano derivado de la célula 293 (ATCC: CRL-1573) y similares, mediante procedimientos que incluyen un procedimiento con dietilaminoetil (DEAE)-dextrano (Luthman, H y Magnusson, G. Nucleic Acid Res. (1983), 11, pág. 1295-1308), un procedimiento de coprecipitación con fosfato de calcio-ADN (Graham, F.L. y van der Eb, A. J. Virology (1973), 52, pág. 456-457) y un procedimiento de electroporación (Neumann, E. y col., EMBO J. (1982), 1, pág. 841-845). Sin embargo, el procedimiento de integración y la célula no se limitan a éstos específicamente descritos. De este modo puede obtenerse un transformante deseado.

Además, usando la manipulación génica en un animal sano puede obtenerse un animal transgénico que expresa altamente el gen deseado. Esto puede usarse para examinar los efectos sobre la morfología celular. Alternativamente, el estado de las células puede examinarse preparando un animal con genes inactivados inactivando el gen diana en un animal que tiene melanoma.

4. Kit de detección del gen de la oculospanina humana y/u oculospanina humana

El gen de la oculospanina humana y/o la oculospanina humana pueden detectarse usando un kit que contiene al menos un componente seleccionado del grupo que está constituido por los siguientes materiales 1) a 5).

1): un cebador de oligonucleótidos que tiene una secuencia continua de 15 a 30 bases de longitud para amplificar específicamente un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos representada por ID de secuencia nº 1 de la lista de secuencias;

2): una sonda de polinucleótidos que tiene una secuencia continua de no menos de 15 nucleótidos que puede hibridarse con un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos representada por ID de secuencia nº 1 de la lista de secuencias bajo condiciones restrictivas, permitiéndose así la detección del polinucleótido;

3): un espécimen inmovilizado al que puede hibridarse un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos representada por ID de secuencia nº 1 de la lista de secuencias

4): un anticuerpo que se une específicamente a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por ID de secuencia nº 2 de la lista de secuencias, permitiéndose así la detección de la proteína; y

5): un anticuerpo secundario que puede unirse a un anticuerpo según la sección 4) anterior.

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El cebador según la sección 1) anterior puede construirse fácilmente basándose en la secuencia de nucleótidos del gen de la oculospanina humana (la secuencia de nucleótidos representada por ID de secuencia nº 1 de la lista de secuencias) mediante un procedimiento habitual, por ejemplo, mediante un procedimiento que usa un software de construcción de cebadores comercialmente disponible (por ejemplo, Wisconsin GCG package versión 10.2) y sometiéndose a amplificación. Como un ejemplo de un cebador tal, más específicamente un cebador para amplificar un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos representada por ID de secuencia nº 1 de la lista de secuencias, puede hacerse uso de la combinación de un oligonucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos representada por ID de secuencia nº 5 de la lista de secuencias y un oligonucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos representada por ID de secuencia nº 6 de la lista de secuencias. La sonda según la sección 2) anterior es un polinucleótido que puede hibridarse específicamente con oculospanina humana y que tiene una longitud de 100 a 1500 bases, preferentemente una longitud de 300 a 600 bases. Estos cebadores y sondas pueden elegirse como diana con una marca apropiada (tal como una marca enzimática, marca radiactiva o marca fluorescente) o pueden tener un ligador añadido a los mismos.

El espécimen inmovilizado según la sección 3) anterior puede prepararse inmovilizando una sonda según la sección 2) sobre una fase sólida tal como una placa de vidrio, una membrana de nailon o similares. Un procedimiento de preparación de un espécimen inmovilizado tal se describe en la sección "2. Procedimiento para detectar cáncer", párrafo ``(1) Procedimiento para detectar cáncer usando el nivel de expresión del gen de la oculospanina humana, subpárrafo "(1) Procedimiento de uso de un espécimen inmovilizado". Ejemplos de especímenes inmovilizados incluyen genochips, matrices de ADNc, oligomatriz y filtros de membrana.

Un kit como se describe en el presente documento puede contener una ADN polimerasa termoestable, dNTP (una mezcla de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) y una disolución tampón. Ejemplos de ADN polimerasas termoestables incluyen ADN polimerasa Taq, ADN polimerasa LA Taq (preparada por Takara Shuzo Co. Ltd.), ADN polimerasa Tth y ADN polimerasa Pfu. El tipo de disolución tampón puede seleccionarse según la ADN polimerasa que va a usarse y puede añadirse Mg^{2+}, si se necesita.

Los anticuerpos según las secciones 4) y 5) anteriores pueden prepararse mediante un procedimiento descrito en la sección "2. Procedimiento para detectar cáncer", párrafo "(3) Procedimiento para detectar cáncer usando el nivel de expresión de la oculospanina humana (nivel de expresión de proteína)" o un procedimiento descrito en la sección "5. Preparación de anticuerpo de la oculospanina anti-humana". El anticuerpo puede elegirse como diana con una marca apropiada (tal como una marca enzimática, marca radiactiva o marca fluorescente).

Un kit como se describe en el presente documento puede usarse para la detección de un gen de la oculospanina humana y/o proteína de la oculospanina humana, determinándose así la presencia o ausencia de cáncer y seleccionándose una sustancia que pueda suprimir el crecimiento del cáncer.

5. Preparación de un anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana (1) Preparación de antígeno

Un antígeno para preparar un anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana puede ser un polipéptido que comprende oculospanina humana, una secuencia parcial de aminoácidos de la misma que tiene una secuencia parcial y continua de aminoácidos que comprenden al menos 6 bases, o derivados de la misma que tienen una secuencia arbitraria de aminoácidos o un vehículo añadido a éstos.

La proteína oculospanina humana puede purificarse directamente a partir de tejidos o células de tumores de seres humanos, sintetizarse in vitro o producirse en células huésped mediante manipulación génica. Más específicamente, en la producción de oculospanina humana mediante manipulación génica, un gen de la oculospanina humana se integra en un vector de expresión y después de esto la oculospanina humana se sintetiza en una disolución que contiene enzimas, sustratos y sustancias energéticas requeridas para su transcripción y traducción. Alternativamente, una célula huésped procariota o eucariota puede transformarse con el vector de expresión y luego puede aislarse la oculospanina humana. La secuencia de nucleótidos del ADNc de la oculospanina humana se describe en: Graeme Wistow, Steven L. Bernstein, M. Keith Wyatt, Robert N. Fariss, Amita Behal, Jeffrey W. Touchman, Gerard Bouffard, Don Smith y Katherine Peterson (2002), Expressed sequence tag analysis of human RPE/choroids for the NEIBank Project: Over 6000 non-redundant transcripts, novel genes and splice variants, Molecular Vision 8:205-220 y está registrada en GenBank bajo el nº de registro NM_031945. El ORF del ADNc se muestra en ID de secuencia nº 1 de la lista de secuencias. El ADNc de la oculospanina humana puede obtenerse a partir de una biblioteca de ADNc que expresa oculospanina humana usando un cebador para amplificar específicamente el ADNc de la oculospanina humana a partir de la biblioteca de ADNc como molde mediante una reacción en cadena de la polimerasa (denominada en lo sucesivo "PCR", (véase Saiki, R. K. y col., (1988), Science 239, 487-49) denominada en el presente documento un "procedimiento de PCR".

La síntesis in vitro de un polipéptido puede realizarse usando, por ejemplo, el sistema de traducción rápida (RTS) fabricado por Roche Diagnostics; sin embargo, los procedimientos de síntesis adecuados no se limitan a este procedimiento particular. En el caso de RTS, el gen deseado se clona en un vector de expresión, bajo el control de un promotor T7, y el vector de expresión se añade a un sistema de reacción in vitro. Por consiguiente, el ARNm se transcribe primero a partir de un ADN molde por la ARN polimerasa de T7 y la traducción se realiza luego mediante ribosomas en una disolución que contiene lisado de Escherichia coli. De este modo, un polipéptido diana puede sintetizarse en la disolución de reacción (Biochemica, 1, 20-23 (2001), Biochemica, 2, 28-29 (2001)).

Ejemplos de huéspedes procariotas adecuados incluyen Escherichia coli y Bacillus subtilis. Para transformar un gen deseado en estas células huésped, las células huésped se transforman con un vector de plásmido derivado de una especie compatible con el huésped, y que contiene un replicón, es decir, un punto de iniciación de la replicación, y una secuencia reguladora. Además, se prefiere que el vector tenga una secuencia que pueda conferir un fenotipo de selección a la célula que va a transformarse.

Como célula huésped puede usarse una cepa de Escherichia coli, por ejemplo, una cepa K12 y las series pBR322 y pUC de plásmidos pueden usarse generalmente como vectores. Sin embargo, la elección de la célula huésped y el vector no se limitan a éstos y puede usarse cualquier cepa y vector conocidos adecuados.

Los promotores adecuados para uso en Escherichia coli incluyen el promotor de triptófano (trp), el promotor de lactosa (lac), el promotor de triptófanolactosa (tac), el promotor de lipoproteína (lpp) y el promotor del factor Tu de extensión de cadenas de polipéptidos (tufB) y similares. Puede usarse uno cualquiera de estos promotores para producir el polipéptido deseado.

Como célula huésped puede usarse una cepa de Bacillus subtilis, por ejemplo, se prefiere la cepa 207-25. Puede usarse el vector pTUB 228 (Ohmura, K. y col., (1984), J. Biochem. 95, 87-93); sin embargo, la elección del huésped y el vector de Bacillus subtilis no se limita a esta combinación particular. Uniendo una secuencia de ADN que codifica una secuencia de péptido señal para \alpha-amilasa de Bacillus subtilis, la proteína de interés puede expresarse y segregarse de la célula.

Ejemplos de células huésped eucariotas incluyen células de animales vertebrados, de insectos y de levadura. Ejemplos de células de animales vertebrados incluyen, pero no se limitan a, una célula de simio, célula COS (Gluzman, Y. (1981), Cell 23, 175-182, (ATCC CRL-1650)), célula de fibroblasto de ratón NIH3T3 (ATCC nº CRL-1658) y una cepa defectuosa de ácido dihidrofólico-reductasa (Urlaub, G. y Chasin, L. A. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci, USA 77, 4126-4220) de célula de ovario de hámster chino (célula CHO, (ATCC CCL-61)).

Un vector de expresión para uso con una célula de animal vertebrado puede ser uno que tiene un promotor localizado aguas arriba del gen que va a expresarse, un sitio de corte y empalme de ARN, un sitio de poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción. Además, puede estar presente un sitio de iniciación de la replicación. Ejemplos de vectores de expresión adecuados incluyen, pero no se limitan a, pCADN3.1 (preparado por Invitrogen) que tiene un promotor temprano de un citomegalovirus y pSV2dhfr (Subramani, S. y col., (1981), Mol. Cell. Biol. 1, 854-864) que tiene un promotor temprano de SV40.

Cuando se usa una célula COS o célula NIH3T3 como célula huésped, los vectores de expresión adecuados tienen un sitio de iniciación de la replicación de SV40 que puede autoproliferar en la célula COS o célula NIH3T3 y adicionalmente puede tener un promotor de la transcripción, señal de terminación de la transcripción y sitio de corte y empalme de ARN. El vector de expresión puede integrarse en la célula COS o célula NIH3T3 mediante tratamiento con DEAE-dextrano (Luthman, H y Magnusson, G. (1983), Nucleic Acid Res. 11, pág.1295-1308), coprecipitación con fosfato de calcio-ADN (Graham, F. L. y van der Eb, A. J. (1973), Virology, 52, pág. 456-457), electroporación (Neumann, E. y col., (1982), EMBO J. 1, pág. 841-845) u otros. De este modo puede obtenerse una célula transformante deseada. Además, cuando una célula CHO se usa como una célula huésped, si un vector que puede expresar un neogén que actúa de marcador con resistencia al antibiótico G418 tal como pRSVneo (Sambrook, J. y col., (1989): Molecular Cloning A Laboratory Manual ``Cold Spring Harbor Laboratory, NY) o pSV2neo (Southern, P. J. y Berg, P. (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341) se cotransfecta con el vector de expresión y luego se selecciona una colonia resistente a G418, puede obtenerse una célula transformada que produce establemente el polipéptido
deseado.

El transformante obtenido en el modo mencionado anteriormente puede cultivarse según un procedimiento habitual para obtener el polipéptido deseado expresado dentro de la célula o segregado fuera de la célula y, por tanto, presente en el medio de cultivo. Como medio de cultivo pueden seleccionarse apropiadamente diversos tipos de medios habitualmente usados dependiendo del tipo de célula huésped empleada. Más específicamente, para células COS puede usarse medio RPMI 1640 o medio de Eagle modificado de Dulbecco (denominado en lo sucesivo "DMEM"). Si es necesario, al medio pueden añadírsele componentes de suero tales como suero bovino fetal.

Una proteína recombinante producida dentro de una célula o segregada fuera de una célula transformante y presente en el medio de cultivo puede separarse y purificarse por diversos procedimientos de separación conocidos basándose en las propiedades físicas y las propiedades químicas de la proteína. Ejemplos de tales procedimientos de separación incluyen tratamiento con un agente de precipitación de proteínas general, ultrafiltración, cromatografía de tamiz molecular (filtración en gel), cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, diversos tipos de procedimientos de cromatografía líquida tales como cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), diálisis y combinaciones de estos procedimientos. Si una marca de hexa-his se fusiona con la proteína de recombinación que se expresa, la proteína recombinante puede purificarse eficazmente por una columna de afinidad de níquel. Si los procedimientos anteriormente mencionados se usan en combinación, puede obtenerse una gran cantidad de un polipéptido deseado con una alta pureza y con un alto rendimiento.

(2) Producción de anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana

Un ejemplo de un anticuerpo que se une específicamente a la oculospanina humana es un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a la proteína oculospanina humana que tiene una secuencia de aminoácidos representada por ID de secuencia nº 2 y/o ID de secuencia nº 4 de la lista de secuencias. Un procedimiento adecuado para obtener tal anticuerpo monoclonal es del siguiente modo:

Para producir el anticuerpo monoclonal, las etapas necesarias requeridas incluyen:

(a): purificar la biomacromolécula que va a usarse como antígeno;

(b): inmunizar un animal inyectando el antígeno en el animal, tomar una muestra de sangre y comprobar el título de anticuerpos para determinar el momento en el que debe extirparse el bazo, y preparar células productoras de anticuerpos;

(c): preparar células de mieloma óseo (denominadas en lo sucesivo "mieloma");

(d): fusionar las células productoras de anticuerpos y el mieloma;

(e): seleccionar hibridomas que producen un anticuerpo deseado;

(f): segregarlos (clonarlos) en clones monocelulares;

(g): opcionalmente, cultivar el hibridoma para producir una gran cantidad de anticuerpo monoclonal o criar un animal que tiene el hibridoma trasplantado en él; y

(h): analizar la actividad fisiológica y la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal así producido, o características del anticuerpo monoclonal como agente de marcado.

El procedimiento de producción de un anticuerpo monoclonal se describe a continuación en más detalle según las etapas mencionadas anteriormente. Sin embargo, los procedimientos de producción de anticuerpo monoclonal no se limitan al procedimiento descrito. Por ejemplo, puede usarse una célula productora de anticuerpos distinta de una célula del bazo y mieloma.

(a) Purificación del antígeno

Como antígeno puede usarse la proteína oculospanina humana preparada según el procedimiento anteriormente mencionado o una parte (fragmento) de la misma. Alternativamente, el antígeno usado puede ser una fracción de membrana preparada a partir de una célula recombinante que expresa oculospanina humana o una célula recombinante que expresa oculospanina humana, o un fragmento de péptido químicamente sintetizado de una proteína oculospanina humana obtenida mediante un procedimiento conocido para aquellos expertos en la materia.

(b) Preparación de una célula productora de anticuerpos

Un antígeno obtenido en la etapa (a) se mezcla con adyuvante completo o incompleto de Freund o un agente auxiliar tal como sulfato de potasio y aluminio. La mezcla se usa como inmunógeno y se inyecta a un animal. Un animal experimental adecuado sería un animal conocido por ser adecuado para uso en un procedimiento de preparación de hibridoma. Los ejemplos específicos de tales animales incluyen ratones, ratas, cabras, ovejas, vacas y caballos. Sin embargo, en vista de la disponibilidad de las células de mieloma que van a fusionarse con las células productoras de anticuerpos tomadas del animal, se prefieren ratones o ratas como los animales que van a inmunizarse. La elección de cepas de ratones o ratas usados en la práctica no está particularmente limitada. Ejemplos de cepas de ratón adecuadas incluyen A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BR, C57L, DBA, FL HTH, HTI, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB y 129. Ejemplos de cepas de rata incluyen Low, Lewis, Spraque, Daweley, ACI, BN y Fischer. Estos ratones y ratas están disponibles de distribuidores de cría de animales experimentales tales como Clea Japan Inc., Charles River Japan Inc., Japan SLC Inc. y The Jackson Laboratories. En vista de la compatibilidad de fusión con células de mieloma como se trata más adelante, "BALB/c" como línea de ratón y "Low" como línea de rata son particularmente preferidas como el animal inmunizado. En consideración de la homología de un antígeno entre un ser humano y un ratón se usa preferentemente un ratón que tiene una función biológica reducida para eliminar el autoanticuerpo, en otras palabras, un ratón que padece una enfermedad autoinmunitaria. Obsérvese que un ratón o una rata que va a inmunizarse tiene preferentemente 5 a 12 semanas de edad, más preferentemente 6 a 8 semanas de edad.

Un animal puede inmunizarse con oculospanina humana o una versión recombinantemente producida de la misma mediante procedimientos conocidos tales como los procedimientos específicamente descritos en, por ejemplo, Weir, D. M. Handbook of Experimental Immunology Vol. 1. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. y Mayer, M. M. Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield Illinois (1964), etc. De estos procedimientos de inmunización, un procedimiento usado preferentemente se realiza, por ejemplo, del siguiente modo. Primero, un antígeno, es decir, una fracción de proteína de membrana o una célula que expresa un antígeno, se inyecta a un animal intradérmica o intraperitonealmente. Para mejorar la eficiencia de la inmunización pueden usarse ambos procedimientos de inyección juntos. Más específicamente, la eficiencia de inmunización puede aumentar particularmente cuando la inyección intradérmica se realiza en la primera mitad de las inyecciones y la inyección intraperitoneal se realiza en la segunda mitad de las inyecciones o sólo en el último momento. La pauta de dosificación del antígeno es distinta dependiendo del tipo y las diferencias individuales, etc., del cuerpo animal que va a inmunizarse. Sin embargo, el antígeno se inyecta preferentemente 3 a 6 veces a intervalos de 2 a 6 semanas, y más preferentemente 3 a 4 a intervalos de 2 a 4 semanas. Se prefiere no aumentar excesivamente el número de dosificaciones porque entonces puede malgastarse el antígeno. Por tanto, se prefiere no prolongar demasiado la duración del intervalo de dosificación porque la actividad de las células disminuye debido al envejecimiento del animal. La dosis del antígeno es distinta dependiendo del tipo y las diferencias individuales, etc., del cuerpo animal; sin embargo, la dosis entra generalmente dentro del intervalo de aproximadamente 0,05 a 5 ml, preferentemente aproximadamente 0,1 a 0,5 ml. La inmunización de refuerzo se realiza 1 a 6 semanas después de administrarse el antígeno, preferentemente después de 2 a 4 semanas, más preferentemente después de 2 a 3 semanas. Si la inmunización de refuerzo se realiza después de más de 6 semanas o dentro de 1 semana, la inmunización de refuerzo será menos eficaz. Obsérvese que la dosis del antígeno que va a inyectarse como un refuerzo es distinta dependiendo del tipo y el tamaño del cuerpo animal; sin embargo, por ejemplo, para ratones, generalmente entra dentro del intervalo de aproximadamente 0,05 a 5 ml, preferentemente aproximadamente 0,1 a 0,5 ml, y más preferentemente aproximadamente 0,1 a 0,2 ml. Se prefiere no administrar una cantidad innecesariamente grande de antígeno porque entonces el efecto de la inmunización disminuye y es desfavorable para el animal que va a inmunizarse.

Uno a 10 días, preferentemente, 2 a 5 días, más preferentemente 2 a 3 días después de la inmunización de refuerzo, las células del bazo o los linfocitos que contienen las células productoras de anticuerpos se extirpan del animal inmunizado en condiciones asépticas. En este momento se determina un título de anticuerpos. Si un animal que tiene un título de anticuerpos suficientemente alto se usa como fuente de suministro para las células productoras de anticuerpos, puede potenciarse la eficiencia de las siguientes operaciones. Como un procedimiento para determinar el título de anticuerpos que va usarse en el presente documento son apropiados diversos tipos de tecnologías tales como procedimientos de RIA, procedimientos de ELISA, procedimientos con anticuerpos fluorescentes y procedimientos de reacción de aglutinación pasiva de células sanguíneas. En vista de la sensibilidad de detección, velocidad, precisión y la posibilidad de operación automática, se prefieren los procedimientos de RIA y los procedimientos de ELISA.

La determinación de un título de anticuerpos puede realizarse mediante un procedimiento de ELISA del siguiente modo. Primero, el antígeno purificado o parcialmente purificado se adsorbe sobre una superficie sólida tal como una placa de 96 pocillos para ELISA. Entonces, la superficie sólida que no tiene antígeno adsorbido sobre ella se cubre con una proteína no relacionada con el antígeno, tal como albúmina de suero bovino (denominada en lo sucesivo "BSA"). Después de lavar la superficie, la superficie se pone en contacto con una muestra de sangre seriadamente diluida (por ejemplo, suero de ratón) que sirve de anticuerpo primario, permitiéndose así que un anticuerpo monoclonal contenido en la muestra se una al antígeno. Además, un anticuerpo secundario, es decir, un anticuerpo marcado con enzima contra un anticuerpo de ratón, se añade para unirse al anticuerpo de ratón. Después de lavar el complejo resultante se añade un sustrato para la enzima y el cambio en la absorbancia, que se produce debido a un cambio de color inducido por la degradación del sustrato, se mide para calcular el título de anticuerpos.

Las células productoras de anticuerpos se separan de las células del bazo o linfocitos según procedimientos conocidos (por ejemplo, descritos en Kohler y col., Nature, 256, 495, 1975; Kohler y col., Eur J. Immunol. 6, 511, 1977; Milstein y col., Nature, 266, 550, 1977; Walsh, Nature, 266, 495, 1977). Más específicamente, en el caso de células del bazo, las células productoras de anticuerpos pueden separarse mediante un procedimiento general que comprende homogeneizar el tejido, filtrar el homogeneizado a través de un tamiz de acero inoxidable y suspender las células obtenidas en medio esencial mínimo de Eagle (MEM).

(c) Preparación de células de mieloma óseo (denominadas en lo sucesivo "mieloma")

La elección de células de mieloma que van a usarse para la fusión de células no está particularmente limitada y las células adecuadas pueden seleccionarse de cepas de células conocidas. Por conveniencia, cuando se seleccionan hibridomas de células fusionadas, se prefiere usar una cepa defectuosa en HGPRT (hipoxantina-guanina-fosforibosiltransferasa) cuyo procedimiento de selección se ha establecido. Más específicamente, ejemplos de cepas defectuosas en HGPRT incluyen X63-Ag8(X63), NSI-Ag4/1(NS1), P3X63-Ag8.U1(P3U1), X63-Ag8.653(X63.653), SP2/0-Ag14(SP2/0), MPC11-45.6TG1.7(45.6TG), F0, S149/5XXO y BU.1 derivadas de ratones, 210.RSY3.Ag.1.2.3 (Y3) derivada de rata; y U266AR(SKO-007), GM1500.GTG-A12(GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2(HMy2) y 8226AR/NIP4-1(NP41) derivadas de seres humanos. Estas cepas defectuosas en HGPRT están disponibles de la Colección americana de cultivos tipo (ATCC), etc.

Estas cepas se subcultivan en un medio apropiado tal como medio de 8-azaguanina [RPMI-1640 complementado con glutamina, 2-mercaptoetanol, gentamicina y suero bovino fetal (denominado en lo sucesivo "SBF") y adicionalmente se añade 8-azaguanina al mismo]; medio de Dulbecco modificado de Iscove (denominado en lo sucesivo "IMDM"), o medio de Eagle modificado de Dulbecco (denominado en lo sucesivo "DMEM"). En este caso, 3 a 4 días antes de realizar la operación de fusión de células, las células se transfieren a un medio regular [por ejemplo, medio ASF104 (preparado por Ajinomoto Co. Inc.) que contiene 10% de SBF] y se subcultivan en él para obtener no menos de 2 x10^{7} células el día de la fusión de células.

(d) Fusión de células

La fusión entre células productoras de anticuerpos y células de mieloma se realiza apropiadamente según procedimientos conocidos (incluyendo: Weir, D. M. Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. y Mayer, M. M. Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Springfield, Illinois (1964)), en condiciones tales que la tasa de supervivencia de las células no se reduzca excesivamente. Ejemplos de tales procedimientos incluyen procedimientos químicos en los que las células productoras de anticuerpos y las células de mieloma se mezclan en una disolución de polímero de alta concentración, por ejemplo, polietilenglicol; y procedimientos físicos que usan estimulación eléctrica. De estos procedimientos, el procedimiento químico se explica más específicamente del siguiente modo. Cuando se usa polietilenglicol como la disolución de polímero de alta concentración, las células productoras de anticuerpos y las células de mieloma se mezclan en una disolución de polietilenglicol que tiene un peso molecular de 1.500 a 6.000, más preferentemente, 2.000 a 4.000, a una temperatura de 30 a 40ºC, preferentemente 35 a 38ºC, durante 1 a 10 minutos, más preferentemente 5 a 8 minutos.

(e) Selección de poblaciones de hibridoma

El procedimiento de selección de hibridomas obtenidos mediante fusión de células no está particularmente limitado. Normalmente se hace uso del procedimiento de selección con HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina) [Kohler y col., Nature, 256, 495 (1975); Milstein y col., Nature 266, 550 (1977)]. Éste es un procedimiento eficaz cuando los hibridomas se obtienen usando células de mieloma de una cepa defectuosa en HGPRT que no puede sobrevivir en presencia de aminopterina. Más específicamente, mediante el cultivo de células sin fusionar e hibridoma en medio HAT sólo se seleccionan hibridomas que tienen resistencia a aminopterina y se deja que permanezcan y
proliferen.

(f) Segregación para dar un clon monocelular (clonación)

Como procedimiento de clonación para hibridomas pueden usarse procedimientos conocidos tales como un procedimiento con metilcelulosa, procedimiento con agarosa blanda o procedimiento de dilución limitante [véase, por ejemplo, Barbara, B.M. y Stanley, M.S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Company, San Francisco (1980)]. Ejemplos de un procedimiento de clonación incluyen un procedimiento de dilución limitante en el que células de hibridoma se diluyen de manera que contengan una única célula de hibridoma por pocillo de una placa y se cultivan; un procedimiento con agarosa blanda en el que las células de hibridoma se cultivan en un medio de agarosa blanda y las colonias se recuperan; un procedimiento de tomar células de hibridoma individuales por medio de un micromanipulador y cultivarlas; y un denominado "procedimiento con clasificador de clones" en el que las células de hibridoma se separan una a una por medio de un clasificador de células. De estos procedimientos se prefiere el procedimiento de dilución limitante. En este procedimiento se siembra una cepa de células de fibroblasto derivada de un feto de rata o células nodrizas tales como células del bazo de ratón sano, células del timo o células de ascitis. Las células de hibridoma se diluyen en medio para proporcionar una relación de dilución de 0,2 a 0,5 células por 0,2 ml. La disolución diluida en suspensión de hibridoma se transfiere a pocillos para proporcionar 0,1 ml por pocillo y se cultiva continuamente durante aproximadamente 2 semanas con cambios de aproximadamente 1/3 del medio con medio nuevo a intervalos de tiempo predeterminados (por ejemplo, cada 3 días). De este modo pueden proliferar los clones de hibridoma.

Las células de hibridoma en el pocillo para el que se ha confirmado el título de anticuerpos se someten a una clonación repetida mediante el procedimiento de dilución limitante, 2 a 4 veces. Las células de hibridoma, con un título de anticuerpos que se confirma que es estable, se seleccionan como cepas de hibridoma productoras de anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana. Una de las cepas de hibridoma clonadas así obtenidas se designa "O3B8-2C9-4F3" y ésta se ha depositado en el International Patent Organism Depositary del National Institute of Advanced Industrial Science and Technologie (ubicado en Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japón) el 17 de febrero de 2004 bajo el nº de depósito FERM BP-08627.

(g) Preparación de anticuerpo monoclonal mediante cultivo de células de hibridoma

Las células de hibridoma así seleccionadas se cultivan para obtener eficazmente el anticuerpo monoclonal. Sin embargo, antes del cultivo se desea cribar una célula de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal deseado. El cribado se realiza mediante un procedimiento conocido.

La determinación del título de anticuerpos puede realizarse mediante, por ejemplo, un procedimiento de ELISA según el siguiente procedimiento. Primero, la oculospanina humana purificada o parcialmente purificada o las células que expresan la oculospanina humana se adsorben sobre una superficie sólida de una placa de 96 pocillos para ELISA. Entonces, la superficie sólida que no tiene antígeno adsorbido sobre ella se cubre con una proteína no relacionada con el antígeno, por ejemplo, albúmina de suero bovino (denominada en lo sucesivo "BSA"). Después de lavar la superficie, la superficie se pone en contacto con una muestra seriadamente diluida (por ejemplo, suero de ratón) como primer anticuerpo, permitiéndose así la unión de un anticuerpo de la oculospanina anti-humana en la muestra al antígeno. Además, un anticuerpo contra el anticuerpo de ratón y marcado con una enzima, que sirve de anticuerpo secundario, se añade para unirse al anticuerpo de ratón. Después de lavar el complejo resultante se añade un sustrato para la enzima y el cambio de absorbancia, que se produce debido al cambio de color inducido por la degradación del sustrato, se determina para calcular el título de anticuerpos. De esta forma se calcula el título de anticuerpos. Obsérvese que una operación de cribado tal puede realizarse después de o antes de clonar la célula de hibridoma como se menciona anteriormente.

Un hibridoma obtenido por el procedimiento anteriormente mencionado puede almacenarse en un estado congelado en nitrógeno líquido a -80ºC o menos o en un frigorífico.

Después de completarse la clonación, los hibridomas se transfieren de medio HAT a un medio general y se cultivan. El cultivo a gran escala se realiza mediante cultivo rotatorio usando una botella cultivo grande o mediante cultivo con agitación centrífuga. El sobrenadante obtenido del cultivo a gran escala se purifica mediante un procedimiento conocido para aquellos expertos en la materia, tal como filtración en gel, para obtener un anticuerpo monoclonal según la presente invención que se une específicamente a la proteína oculospanina humana. El hibridoma puede inyectarse en la cavidad abdominal de un ratón de la misma línea que el hibridoma (por ejemplo, BALB/c) o un ratón Nu/Nu para proliferar el hibridoma. De esta forma puede obtenerse el líquido ascítico que contiene una gran cantidad del anticuerpo monoclonal según la presente invención. Cuando las células de hibridoma se inyectan en la cavidad abdominal, si previamente se ha administrado un aceite mineral tal como 2,6,10,14-tetrametilpentadecano (pristano) (3 a 7 días antes), el líquido ascítico puede obtenerse en una mayor cantidad. Para explicarlo más específicamente, un agente inmunosupresor se inyecta previamente en la cavidad abdominal de un ratón de la misma cepa que el hibridoma. Veinte días después de la inactivación de las células T, 10^{6} a 10^{7} de las células del clon de hibridoma se suspenden en un medio sin suero (0,5 ml) y la suspensión se inyecta en la cavidad abdominal. Cuando el abdomen se expande y se llena del líquido ascítico, el líquido ascítico se coge. Por medio de este procedimiento, el anticuerpo monoclonal puede obtenerse con una concentración 100 veces superior que la del medio de cultivo.

Un anticuerpo monoclonal obtenido en el procedimiento anteriormente mencionado puede purificarse mediante los procedimientos descritos en, por ejemplo, Weir, D. M.: Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978). Para explicarlo más específicamente, ejemplos de tales procedimientos incluyen procedimientos de precipitación con sulfato de amonio, procedimientos de filtración en gel, procedimientos de cromatografía de intercambio iónico y procedimientos de cromatografía de afinidad. De estos, el procedimiento de precipitación con sulfato de amonio, si se repite 3 a 4 veces, preferentemente 3 a 6 veces, purifica satisfactoriamente el anticuerpo monoclonal. Sin embargo, en este procedimiento, el rendimiento del anticuerpo monoclonal purificado es extremadamente bajo. Por tanto, el anticuerpo monoclonal se purifica de forma bruta realizando el procedimiento de precipitación con sulfato de amonio una o dos veces y luego sometiéndolo a al menos un procedimiento, y preferentemente dos procedimientos, seleccionados de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad y similares. De esta forma puede obtenerse anticuerpo monoclonal altamente purificado con un alto rendimiento. El procedimiento de precipitación con sulfato de amonio puede realizarse en la siguiente combinación y en el siguiente orden: a) procedimiento de precipitación con sulfato de amonio -procedimiento de cromatografía de intercambio iónico- procedimiento de filtración en gel; b) procedimiento de precipitación con sulfato de amonio -procedimiento de cromatografía de intercambio iónico- procedimiento de cromatografía de afinidad; y c) procedimiento de precipitación con sulfato de amonio -procedimiento de filtración en gel- procedimiento de cromatografía de afinidad, etc. De estas combinaciones, para obtener el anticuerpo monoclonal con una alta pureza en un alto rendimiento se prefiere particularmente la combinación c).

Como un sencillo procedimiento de purificación puede usarse un kit de purificación de anticuerpos comercialmente disponible (por ejemplo, MAbTrap GII kit preparado por Pharmacia) y similares.

El anticuerpo monoclonal así obtenido tiene una alta especificidad por antígenos para oculospanina humana.

(h) Análisis del anticuerpo monoclonal

El anticuerpo monoclonal así obtenido se comprueba para el isotipo y la subclase del mismo del siguiente modo. Los procedimientos de identificación adecuados incluyen el procedimiento de Ouchterlony, procedimientos de ELISA y procedimientos de RIA. El procedimiento de Ouchterlony es sencillo aunque, si el anticuerpo monoclonal se obtiene a baja concentración, debe concentrarse. Alternativamente, cuando se usa un procedimiento de ELISA o RIA, el sobrenadante de cultivo puede hacerse reaccionar directamente con una fase sólida de adsorción de antígenos. Además, si se usan diversos tipos de anticuerpos correspondientes a isotipos y subclases de inmunoglobulina como anticuerpos secundarios, el isotipo y la subclase del anticuerpo monoclonal puede identificarse. Como otro sencillo procedimiento puede usarse un kit de identificación comercialmente disponible (por ejemplo, el kit Mouse Typer kit preparado por BioRad) y similares.

La cuantificación de una proteína puede realizarse mediante el ensayo de Folin Lowry basado en la adsorción a 280 nm [1,4 (DO280) = inmunoglobulina 1 mg/ml].

(3) Preparación de anticuerpo de la oculospanina anti-humana humanizado

La inmunoglobulina G (denominada en lo sucesivo simplemente "IgG") está constituida por dos cadenas ligeras de polipéptidos (denominadas en lo sucesivo "cadenas ligeras") que tiene cada una un peso molecular de aproximadamente 23.000 y dos cadenas pesadas (denominadas en lo sucesivo "cadenas pesadas") que tiene cada una un peso molecular de aproximadamente 50.000. Cada una de las cadenas pesadas y las cadenas ligeras tiene una estructura de repetición en la que se conserva una secuencia de aminoácidos formada por aproximadamente 110 residuos, esto constituye una unidad básica (denominada en lo sucesivo un "dominio") de la estructura tridimensional de la IgG. La cadena pesada y la cadena ligera constituyen 4 y 2 dominios continuos independientes, respectivamente. En tanto la cadena pesada como en la cadena ligera, la variación en el dominio del extremo amino entre diferentes anticuerpos es mayor que la variación en los otros dominios. Este dominio se llama un dominio variable (denominado en lo sucesivo un "dominio V"). En el extremo amino de la IgG, los dominios V de la cadena pesada y la cadena ligera están complementariamente asociados para formar una región variable. A diferencia, los dominios restantes constituyen un dominio constante. El dominio constante tiene una secuencia intrínseca a cada especie animal. Por ejemplo, la región constante de IgG de ratón es distinta de la de la IgG humana. Por tanto, la IgG de ratón es reconocida como una sustancia extraña por el sistema inmunitario humano. Como resultado, se fomenta una respuesta al anticuerpo anti-ratón humano (denominado en lo sucesivo "HAMA") (véase Schroff y col., Cancer Res. 45, 879-85 (1985)). Debido a esto, el anticuerpo de ratón no puede administrarse repetidamente a un sujeto humano. Para administrar un anticuerpo tal a un ser humano es necesario modificar las moléculas de anticuerpo de manera que no se produzca la respuesta al HAMA mientras que se mantiene la especificidad del anticuerpo.

Según los resultados de la cristalografía de rayos X, un dominio tiene una estructura cilíndrica longitudinal en la que se superponen dos capas de hojas \beta antiparalelas formadas cada una por 3 a 5 cadenas \beta. En la región variable, tres bucles se reúnen para cada uno de los dominios V de la cadena pesada y la cadena ligera para formar un sitio de unión a antígeno. Cada uno de los bucles se denomina en lo sucesivo una región determinante de la complementariedad (denominada en lo sucesivo una "CDR") en la que la variación en la secuencia de aminoácidos es más significativa. Las porciones distintas de las CDR de la región variable desempeñan generalmente una función en el mantenimiento de la estructura de la CDR y, por tanto se llaman "región estructural". Kabat y col. recogieron numerosas secuencias primarias de las regiones variables de cadenas pesadas y cadenas ligeras. Basándose en el grado de conservación de las secuencias, clasificaron las secuencias primarias individuales en la CDR y la región estructural e hicieron una lista de las mismas (véase SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5ª edición, publicación de NIH, nº 91-3242, E.A. Kabat y col.). Además, las regiones estructurales se clasifican en una pluralidad de subgrupos basados en características comunes de las secuencias de aminoácidos. Además, se encontró que hay una región estructural correspondiente entre un ser humano y un ratón.

De los estudios de las características estructurales de IgG se ha concebido un procedimiento para preparar un anticuerpo humanizado como se describe a continuación.

Inicialmente se propuso un anticuerpo quimérico en el que la región variable de un anticuerpo derivado de un ratón está conectada a una región constante derivada de un ser humano (véase Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6855, (1984)). Sin embargo, un anticuerpo quimérico tal todavía contiene muchos residuos de aminoácidos no humanos. Por tanto, cuando el anticuerpo quimérico se administra durante un largo periodo de tiempo, posiblemente puede inducirse una respuesta a HAMA (véase Begent y col., Br. J. Cancer, 62, 487, (1990)).

Como procedimiento para reducir adicionalmente los residuos de aminoácidos derivados de una fuente de mamífero no humano, que posiblemente puede producir una respuesta a HAMA en seres humanos, se propuso un procedimiento para integrar sólo la parte de CDR en un anticuerpo derivado de ser humano (véase Nature, 321, 522-525, (1986)). Sin embargo, para mantener la actividad de la inmunoglobulina contra un antígeno, generalmente era insuficiente el trasplante de la CDR sola.

Chothia y col. encontraron lo siguiente basándose en los datos obtenidos por cristalografía de rayos X en 1987:

(i): en la secuencia de aminoácidos de la CDR hay un sitio se une directamente a un antígeno y un sitio responsable de mantener la estructura de la propia CDR, y las estructuras tridimensionales de la CDR que pueden adoptarse se clasifican en una pluralidad de patrones típicos (estructuras canónicas); y

(ii): las clases de estructuras canónicas se determinan no sólo por la CDR, sino también por el tipo de aminoácido presente en un sitio específico de la porción de la región estructural (véase J. Mol. Biol. 196, 901-917, (1987)).

Basándose en estos hallazgos se sugirió que cuando se empleara el procedimiento de trasplante de CDR, los residuos de aminoácidos de una parte de la región estructural deben trasplantarse a un anticuerpo humano, además de a la secuencia de la CDR (véase la publicación nacional japonesa de solicitud de patente internacional nº 4-502408).

Generalmente, un anticuerpo derivado de mamífero no humano del que va a trasplantarse la CDR se define como un "donante", mientras que el anticuerpo humano al que se trasplanta la CDR se define como un "aceptor". Estas definiciones se usan en el presente documento.

Un punto que debería considerarse para llevar a cabo el trasplante de la CDR es que la actividad de la molécula de inmunoglobulina se mantiene conservando la estructura de CDR en la medida de lo posible. Para lograr esto debe prestarse atención a los dos siguientes puntos:

(i): de qué subgrupo de anticuerpos se selecciona el aceptor; y

(ii): qué residuo de aminoácido se selecciona de la región estructural del donante.

Queen y col. propusieron un procedimiento de diseño para trasplantar un residuo de aminoácido en un aceptor junto con la secuencia de CDR cuando el residuo de aminoácido de la región estructural del donante se corresponde con al menos una de las siguientes referencias (véase la publicación nacional japonesa de solicitud de patente internacional nº 4-502408).

(a): el aminoácido se presenta pocas veces en la posición dentro de la región estructural de un aceptor, mientras que el aminoácido correspondiente de un donante está normalmente presente en la posición equivalente;

(b): el aminoácido está presente cerca de una de las CDR; y

(c): se predice que el aminoácido tiene un átomo de cadena lateral dentro de aproximadamente 3 angstroms desde la CDR en su modelo de inmunoglobulina tridimensional y que el átomo de cadena lateral puede interactuar con un antígeno o la CDR de un anticuerpo humanizado.

El ADN que codifica una cadena pesada o una cadena ligera del anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana de la presente invención puede obtenerse preparando ARNm de una célula de hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana, convirtiendo el ARNm en ADNc usando transcriptasa inversa y aislando cada ADN que codifica la cadena pesada o la cadena ligera del anticuerpo.

En la extracción del ARNm puede emplearse el procedimiento con tiocianato de guanidina-fenol caliente y el procedimiento con tiocianato de guanidina-clorhidrato de guanidina; sin embargo, el procedimiento con tiocianato de guanidina-cloruro de cesio también es adecuado. La preparación de ARNm a partir de una célula se realiza preparando primero el ARN total y purificando el ARNm usando un vehículo de purificación de ARN de poli(a)^{+} tal como perlas de oligo (dT)-celulosa u oligo (dT)-latex o purificando directamente el ARNm a partir de un lisado de células usando el vehículo. Para preparar el ARN total puede hacerse uso del procedimiento de centrifugación en gradiente de densidad con sacarosa alcalina [véase Dougherty, W. G. y Hiebert, E. (1980) Virology 101, 466-474], el procedimiento con tiocianato de guanidina-fenol, el procedimiento con tiocianato de guanidina-trifluoro-cesio y el procedimiento con fenol-SDS y similares; sin embargo, también es adecuado el procedimiento que usa tiocianato de guanidina y cloruro de cesio [véase Chirgwin, J. M. y col., (1979) Biochemistry 18, 5294-5299].

Después de sintetizar un ADNc monocatenario mediante una reacción de la transcriptasa inversa usando el ARN de poli(a)^{+} obtenido como se menciona anteriormente como un molde, el ADNc bicatenario puede sintetizarse a partir del ADNc monocatenario. Este procedimiento puede ser el procedimiento con la nucleasa S1 [véase Efstratiadis, A. y col., (1976) Cell, 7, 279-288], el procedimiento de Gubler/Hoffmann [véase Gubler, U. y Hoffman, B. J. (1983) Gene 25, 263-269], el procedimiento de Okayama/Berg [véase Okayama, H. y Berg, P. (1982) Mol. Cell. Biol. 2, 161-170] u otros; sin embargo, adecuadamente se usa el llamado procedimiento de RT-PCR en el que se realiza una reacción en cadena de la polimerasa (denominada en lo sucesivo una "PCR") [véase Saiki, R K. y col., (1988) Science 239, 487-49] usando un ADNc monocatenario como molde.

El ADNc bicatenario así obtenido se integra en un vector de clonación para obtener un vector recombinante que luego se introduce en un microorganismo, tal como Escherichia coli, para formar un transformante. El transformante puede seleccionarse usando resistencia a tetraciclina o resistencia a ampicilina como marcador. La Escherichia coli puede transformarse por el procedimiento de Hanahan [véase Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol. 166, 557-580], más específicamente, preparando una célula competente en presencia de cloruro de calcio, cloruro de magnesio o cloruro de rubidio y añadiendo el vector de ADN recombinante a la célula competente. Obsérvese que cuando un plásmido se usa como vector, el plásmido debe tener uno cualquiera de los genes de resistencia a fármacos que se mencionan anteriormente. De más está decir que puede usarse un vector de clonación distinto de un plásmido, tal como un fago del grupo lambda.

Como procedimiento de selección de una cepa que tiene un ADNc, que codifica cada una de las subunidades de un anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana deseado a partir de la cepa transformante obtenida anteriormente, puede emplearse cualquiera de los procedimientos descritos más adelante. Cuando un ADNc deseado se amplifica específicamente por el procedimiento de RT-PCR puede saltarse tal operación del procedimiento.

(a) Procedimiento usando una reacción en cadena de la polimerasa

Los cebadores de oligonucleótidos de una cadena de transcripción y una cadena complementaria correspondientes a una parte de la secuencia de aminoácidos se sintetizan cuando la secuencia de aminoácidos de una proteína deseada se ha aclarado en su totalidad o en parte. Entonces, la reacción en cadena de la polimerasa [Saiki, R. K. y col., (1988) Science 239, 487-49] se realiza usando estos cebadores en combinación para amplificar un fragmento de ADN que codifica las subunidades de cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo de la oculospanina anti-humana deseado. Como ADN molde usado en el presente documento puede hacerse uso de ADNc sintetizado a partir de ARNm de un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana mediante una reacción de la transcriptasa inversa.

El fragmento de ADN así preparado puede integrarse directamente en un vector de plásmido usando un kit comercialmente disponible, etc. Alternativamente, el fragmento de ADN puede usarse para seleccionar un clon deseado marcando el fragmento con ^{32}P, ^{35}S o biotina y realizando la hibridación de colonias o la hibridación de placas usándolo como sonda.

Por ejemplo, un procedimiento para examinar una secuencia de aminoácidos parcial de cada subunidad del anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana de la presente invención se realiza preferentemente aislando cada subunidad usando un procedimiento conocido tal como electroforesis o cromatografía en columna y luego analizar la secuencia de aminoácidos del extremo N de cada subunidad usando un secuenciador automático de proteínas (por ejemplo, PPSQ-10, fabricado por Shimadzu Corporation).

Un procedimiento para aislar ADNc que codifica cada subunidad de la proteína del anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana del transformante deseado obtenido como se menciona anteriormente se realiza según un procedimiento conocido [véase Maniatis, T. y col., (1982) en "Molecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY.], y más específicamente puede realizarse separando fracciones correspondientes al ADN del vector de una célula y eliminando una región de ADN que codifica una subunidad deseada del ADN del vector (ADN de plásmido).

(b) Procedimiento de cribado usando una sonda de oligonucleótido sintetizada

Cuando la secuencia de aminoácidos de una proteína deseada se ha aclarado en su totalidad o en parte (se toma cualquier secuencia de cualquier región de la proteína deseada mientras que sea una secuencia específica que tiene una pluralidad de aminoácidos contiguos), se sintetiza un oligonucleótido (en este caso puede hacerse uso de o una secuencia de nucleótidos supuestamente basada en el grado de frecuencia de codones en uso o una pluralidad de secuencias de nucleótidos de secuencias de nucleótidos imaginables en combinación; en este último caso, el número de tipos de secuencias de nucleótidos puede reducirse integrando inosina) de manera que se corresponde con la secuencia de aminoácidos, usada como sonda (marcada con ^{32}P, ^{35}S o biotina); se hibrida con un filtro de nitrocelulosa sobre el que el ADN de una cepa transformante se desnaturaliza y se inmoviliza, y luego se aísla la cepa positiva obtenida.

La secuencia del ADN así obtenido puede determinarse por el procedimiento de modificación química de Maxam - Gilbert [véase Maxam, A. M. y Gilbert, W. (1980) en "Methods in Enzymology" 65, 499-576] y el procedimiento de terminación de cadenas de didesoxinucleótido [Messing, J. y Vieira, J. (1982) Gene 19, 269-276].

Recientemente se ha usado mucho un sistema automático de determinación de secuencias de bases usando un colorante fluorescente (por ejemplo, robots de secuencias "CATALYST 800" y el modelo 373ADNA sequencer, etc., fabricados por PerkinElmer Japan Co. Ltd.)

Usando un sistema tal también es posible determinar eficazmente y con seguridad una secuencia de nucleótidos de ADN. Basándose en los datos así determinados, incluyendo la secuencia de nucleótidos de ADN y las secuencias de aminoácidos del extremo N de la cadena pesada y la cadena ligera, es posible determinar toda la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo monoclonal de la presente invención.

La cadena pesada y la cadena ligera de inmunoglobulina constituyen cada una una región variable y una región constante. La región variable constituye adicionalmente regiones determinantes de la complementariedad (denominadas en lo sucesivo "CDR", hay 3 sitios en cada una de la cadena pesada y la cadena ligera) y regiones estructurales adyacentes a estas CDR (4 sitios en cada una de la cadena pesada y la cadena ligera).

La secuencia de aminoácidos de la región constante es común a anticuerpos que pertenecen a la misma clase de inmunoglobulina independientemente del tipo de antígeno. En la región variable, la secuencia de aminoácidos de una CDR es intrínseca a cada anticuerpo. Sin embargo, según un estudio que compara los datos de secuencias de aminoácidos de numerosos anticuerpos, se sabe que la posición de la CDR y la longitud de una secuencia de la región estructural son similares entre las subunidades de diferentes anticuerpos con tal que pertenezcan al mismo subgrupo [véase Kabat, E. A. y col., (1991) en "Sequence of Proteins of Immunological Interest Vol. II": U.S. Department of Health and Human Services]. Por tanto, es posible determinar la posición de las CDR y las regiones estructurales y adicionalmente la región constante en cada secuencia de aminoácidos comparando las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana de la presente invención con los datos conocidos de la secuencia de aminoácidos. Obsérvese que la longitud de cadena de FRH_{1}, es decir, la región estructural localizada en el lado proximal al extremo N, es algunas veces más corta que la longitud general de 30 aminoácidos. En algunos casos se sabe que la región estructural tiene un mínimo de 18 aminoácidos [véase Kabat y col., citado anteriormente]. A partir de esto, en el anticuerpo monoclonal de la presente invención, la longitud de cadena de la región estructural en el extremo N de la cadena pesada se fija a 18 a 30 aminoácidos, preferentemente 30 aminoácidos, con tal que la función del anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana no se perjudique.

En resumen, sólo mediante la modificación artificial de un péptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que cada una de las CDR de cadenas ligeras o cadenas pesadas o una secuencia contigua parcial de aminoácidos de la mismas, como se determina anteriormente, aproximándose así la estructura a la estructura terciaria de la CDR realmente tomada desde dentro de la molécula de anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana, puede conferirse a la CDR una actividad de unión que puede unirse a la oculospanina humana [véase, por ejemplo, el documento USP nº 5331573].

Puede prepararse una secuencia de aminoácidos modificada eliminando al menos uno o más aminoácidos de su secuencia de aminoácidos original según mutagénesis de casete [véase Toshimitu Kishimoto, "New Biochemical Experimental Lecture 2, Nucleic Acid III, recombinant DNA technique", pág. 242-251].

Tales diversos tipos de secuencias de ADN pueden producirse según un procedimiento habitual para sintetizar químicamente un ácido nucleico, por ejemplo, el procedimiento con triéster de fosfito [véase Hunkapiller M. y col., (1984) Nature 310, 105-111]. Obsérvese que los codones correspondientes a un aminoácido deseado ya son conocidos por sí mismos. Puede seleccionarse cualquier codón. Alternativamente, el codón que se usa puede determinarse según un procedimiento habitual considerando la frecuencia con la que los codones se usan por la célula huésped. La modificación parcial de las secuencias de nucleótidos de codones puede realizarse según un procedimiento habitual, más específicamente según un procedimiento de mutagénesis específico del sitio [véase Mark, D.F. y col., (1984) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81, 5662-5666] usando un cebador de oligonucleótidos sintético que codifica una modificación deseada.

Además, es posible comprobar si un cierto tipo de ADN puede hibridarse con ADN que codifica una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana de la presente invención sometiendo el ADN al siguiente experimento realizado usando un ADN de sonda marcado con [\alpha-^{32}P]dCTP, según el procedimiento de cebadores aleatorios [véase Feinberg, A.P. y Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132, 6-13] o el procedimiento de traducción de muescas [véase Maniatis, T. y col., (1982) en "Molecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY.].

Para explicarlo más específicamente, el ADN que va a comprobarse se adsorbe sobre, por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa o de nailon. Después de desnaturalizarse con álcali, si es necesario, la membrana se calienta o se irradia con UV, inmovilizándose así el ADN sobre la membrana. La membrana se empapa en una disolución de pre-hibridación que contiene 6X SSC (1X SSC contiene cloruro sódico 0,15 M, disolución de citrato de trisodio 0,015) y 5% de disolución de Denhardt, y 0,1% de dodecilsulfato de sodio (SDS), y se mantiene a 55ºC durante 4 horas o más. Posteriormente, la sonda preparada por adelantado se añade a la disolución de pre-hibridación de manera que tenga una actividad específica final de 1 \times 10^{6} cpm/ml y la temperatura se mantenga a 60ºC durante la noche. Después de esto, la membrana se lava varias veces con 6X SSC a temperatura ambiente durante 5 minutos, se lava adicionalmente con 2X SSC durante 20 minutos y se somete a autorradiografía.

Usando los procedimientos anteriormente mencionados, el ADN que se hibrida con el ADN que codifica una cadena pesada o una cadena ligera del anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana humanizado de la presente invención puede aislarse de una biblioteca de ADNc aleatoria o una biblioteca genómica [véase Maniatis, T. y col., (1982) en "Molecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY.].

Cada una de las secuencias de ADN obtenidas en el modo anteriormente mencionado puede integrarse en un vector de expresión, que luego puede introducirse en una célula huésped procariota o eucariota. De esta forma, el gen (que tiene el ADN) puede expresarse en la célula huésped. El procedimiento de expresión es el mismo que el procedimiento descrito en la sección "5. Preparación de anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana", párrafo "(1) Preparación de antígeno" expuesto anteriormente.

Una fracción que contiene una proteína del anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana producida dentro de o fuera de la célula transformante puede tratarse por diversos procedimientos de aislamiento de proteínas conocidos basados en el uso de propiedades físicas y/o químicas para aislar y purificar la proteína. Ejemplos de estos procedimientos incluyen el tratamiento con un agente de precipitación de proteínas generalmente usado, ultrafiltración, cromatografía, tal como cromatografía de tamiz molecular (filtración en gel), cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad, o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), diálisis, y combinaciones de las mismas.

Para humanizar el anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana, la secuencia de aminoácidos de una región variable debe diseñarse de forma que toda la secuencia de CDR y una secuencia parcial de aminoácidos de la secuencia de FR determinada se trasplanten en un anticuerpo humano del siguiente modo:

Convencionalmente, en el diseño de un anticuerpo humanizado, un subgrupo de aceptor se selecciona basándose en las siguientes pautas.

a): la combinación natural de una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo humano conocido que tiene una secuencia de aminoácidos que se produce naturalmente se usa tal como es;

b): aunque la combinación de una cadena pesada y una cadena ligera se mantiene como un subgrupo; la cadena pesada y la cadena ligera pueden derivarse de diferentes anticuerpos humanos. La cadena pesada y la cadena ligera que van a usarse pueden seleccionarse de secuencias de aminoácidos con alta identidad a aquellas de la cadena pesada y la cadena ligera del donante, respectivamente, y las secuencias consenso. En la presente invención pueden emplearse las pautas anteriormente mencionadas. Sin embargo, hay procedimientos alternativos del siguiente modo:

c): independientemente de la consideración de la combinación del subgrupo puede emplearse un procedimiento para seleccionar FR de la cadena pesada y la cadena ligera con alta identidad a aquellas de un donante de la biblioteca de secuencias primarias de un anticuerpo humano. En estos procedimientos de selección, el grado de identidad de los aminoácidos de la región FR entre un donante y un aceptor puede ajustarse al 70% o más. Empleando un procedimiento tal es posible reducir el número de residuos de aminoácidos de un anticuerpo que va a trasplantarse de un donante, induciéndose así menos respuesta a HAMA.

Hay una operación (denominada en lo sucesivo "modelado molecular") para predecir la estructura terciaria de una molécula de anticuerpo a partir de su secuencia primaria; sin embargo, la exactitud de la predicción de esta operación es limitada. Por tanto, la función de un residuo de aminoácido que sólo aparece rara vez en el subgrupo al que pertenece el donante no puede especificarse suficientemente. Generalmente es difícil determinar qué residuo de aminoácido de un donante o un aceptor debe seleccionarse para una posición tal del residuo de aminoácido según el procedimiento descrito anteriormente por Queen y colaboradores. Sin embargo, según el procedimiento de selección (c) es posible reducir la frecuencia con la que tal determinación debe hacerse.

Los presentes inventores han mejorado adicionalmente tales procedimientos de humanización usando un procedimiento novedoso de identificación de un aminoácido derivado de la FR de un donante e importante para mantener la estructura y la función de una CDR del donante.

Después de seleccionar una molécula de aceptor humana para cada una de una cadena ligera y una cadena pesada, el residuo de aminoácido que va a transferirse de la FR de un donante se selecciona mediante el procedimiento mencionado más adelante.

En las secuencias de aminoácidos del donante y el aceptor, cuando los residuos de aminoácidos correspondientes de sus FR son distintos entre sí, debe determinarse qué residuo de aminoácido debe seleccionarse. Cuando se hace una selección tal debe tenerse cuidado para no dañar la estructura terciaria de la CDR derivada del donante.

Queen y col. han propuesto en la publicación nacional japonesa de solicitud de patente internacional nº 4-502408 un procedimiento para trasplantar un residuo de aminoácido en la FR en un aceptor junto con una secuencia de CDR si cumple al menos una de las siguientes condiciones:

1): El aminoácido se presenta pocas veces en la posición dentro de una región de FR humana de un aceptor, mientras que el aminoácido correspondiente de un donante está normalmente presente en la posición equivalente;

2): el aminoácido se localiza extremadamente próximo a una de las CDR;

3): se predice que el aminoácido tiene un átomo de cadena lateral dentro de aproximadamente 3 angstroms de la CDR en su modelo de inmunoglobulina tridimensional y el átomo de cadena lateral puede interactuar con un antígeno o la CDR de un anticuerpo humanizado.

En lo anterior, un residuo que cumple el requisito 2) anterior presenta frecuentemente la propiedad del requisito 3). Por tanto, en la presente invención, el requisito 2) se omite y nuevamente se establecen dos requisitos. Más específicamente, en la presente invención, si el residuo de aminoácido en la FR del donante que va a transferirse junto con la CDR cumple lo siguiente:

a): el aminoácido se presenta pocas veces en la posición dentro de una región de FR de un aceptor, mientras que el aminoácido correspondiente de un donante está normalmente presente en la posición equivalente;

b): en el modelo de estructura terciaria se supone que el aminoácido interactúa con un átomo de aminoácido constituyente de la CDR y un antígeno o el bucle de la CDR que va a trasplantarse;

c): la posición mencionada anteriormente es la de un residuo de determinación de clase canónica; o

d): la posición es aquella que forma una superficie de contacto entre una cadena pesada y una cadena ligera;

entonces el residuo de aminoácido se trasplanta de la FR del donante.

En el requisito a), según la lista de Kabat mencionada anteriormente, un aminoácido hallado a una frecuencia del 90% o más en una posición en la misma subclase de anticuerpo se define como "normalmente presente", mientras que un aminoácido hallado a una frecuencia inferior al 10% se define como "rara vez presente".

En el requisito c), tanto si "la posición mencionada anteriormente es un residuo determinante de clase canónica" como si no, la determinación puede hacerse únicamente según la lista de Chothia como se menciona anteriormente.

En los requisitos b) y d), el modelado molecular de la región variable del anticuerpo debe realizarse por adelantado. Como software para el modelado molecular puede usarse cualquier software comercialmente disponible; sin embargo, preferentemente se usa AbM (fabricado por Oxford Molecular Limited Company).

La exactitud de la predicción mediante el modelado molecular es algo limitada. Por tanto, en la presente invención, considerando datos de cristalografía de rayos X para regiones variables de diversos anticuerpos, la fiabilidad de la estructura predicha mediante modelado molecular puede evaluarse en dos etapas.

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En la estructura terciaria de la región variable construida mediante el software de modelado molecular, tal como AbM, si la distancia entre dos átomos es más corta que el valor de la suma del radio de van der Waals de dos átomos más 0,5 angstroms, se supone que las dos moléculas están en contacto de van der Waals. Por otra parte, si la distancia entre átomos que tienen polaridad, tales como nitrógeno de amida u oxígeno de carbonilo, de las cadenas principales y laterales es más corta que una distancia de una distancia de enlace de hidrógeno promedio, 2,9 angstroms más 0,5 angstroms, se supone que el enlace de hidrógeno puede existir entre los átomos. Además, si la distancia entre los átomos opuestamente cargados es más corta que una distancia de 2,85 angstroms más 0,5 angstroms, se supone que se forma un enlace iónico entre los átomos.

Por otra parte, de los resultados experimentales de cristalografía de rayos X para las regiones variables de diversos anticuerpos, como la posición en la FR en la que el contacto con la CDR puede encontrarse con una alta frecuencia independientemente del subgrupo, pueden especificarse las siguientes posiciones: en la cadena ligera, las posiciones 1, 2, 3, 4, 5, 23, 35, 36, 46, 48, 49, 58, 69, 71 y 88, y en la cadena pesada, las posiciones 2, 4, 27, 28, 29, 30, 36, 38, 46, 47, 48, 49, 66, 67, 69, 71, 73, 78, 92, 93, 94 y 103 (todos los números representan números de aminoácidos definidos en los documentos descritos por Kabat y col. La misma definición también se aplicará más adelante). Cuando se aplica el mismo estándar que el del modelado molecular, los residuos de aminoácidos de estas posiciones se confirman que están en contacto con los residuos de aminoácidos de la CDR en la parte de 2/3 de la región variable de anticuerpos conocida. Basándose en los hallazgos, la frase: "b) en el modelo de estructura terciaria se supone que el aminoácido interactúa con un átomo de aminoácido constituyente de la CDR y un antígeno o el bucle de la CDR que va a trasplantarse" significa lo siguiente.

En el modelado molecular, si una posición en la FR que se espera que esté en contacto con la CDR concuerda con una cualquiera de las posiciones en las que se notifica que frecuentemente se produce el contacto entre la FR y la CDR según la detección experimental por cristalografía de rayos X, se prefiere la selección del residuo de aminoácido del donante. En otros casos, el requisito b) no se tiene en consideración.

La frase: "d) la posición es aquella que forma una superficie de contacto entre una cadena pesada y una cadena ligera" significa el siguiente requisito. De los resultados experimentales de cristalografía de rayos X para las regiones variables de diversos anticuerpos se confirma que el contacto cadena pesada-cadena ligera se observa frecuentemente en los residuos de aminoácidos 36, 38, 43, 44, 46, 49, 87 y 98 en la cadena ligera y en los residuos de aminoácidos 37, 39, 45, 47, 91, 103, y 104 en la cadena pesada. En los casos en los que la posibilidad del contacto cadena pesada-cadena ligera se predice en el modelado molecular y la posición de contacto concuerda con una cualquiera de las posiciones anteriormente mencionadas, el trasplante del residuo de aminoácido del donante se realiza preferentemente. En otros casos, el requisito d) no se tiene en consideración.

El ADN que codifica regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo humanizado monoclonal de la oculospanina anti-humana de la presente invención puede producirse mediante los procedimientos descritos a continuación.

Por ejemplo, una pluralidad de fragmentos de polinucleótido que comprenden una secuencia parcial de nucleótidos del ADN, de 60 a 70 nucleótidos en longitud, se sintetizan químicamente alternativamente a partir de las cadenas de transcripción y complementaria. Después de esto, los fragmentos individuales de polinucleótido se hibridan y se ligan usando ADN ligasa. De esta forma es posible obtener un ADN que tiene ADN que codifica regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana humanizado deseado.

En otro procedimiento, el ADN que codifica la secuencia total de aminoácidos de la región variable de un aceptor se extrae de linfocitos humanos, la sustitución de nucleótidos se realiza en la región que codifica una CDR mediante un procedimiento conocido para aquellos expertos en la materia para introducir una secuencia de escisión de enzima de restricción. Después de escindirse la región con la enzima de restricción correspondiente, la secuencia de nucleótidos que codifica una CDR del donante se sintetiza y se liga usando ADN ligasa. De esta forma es posible obtener el ADN que codifica regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana humanizado deseado.

Además, en la presente invención es posible obtener ADN que comprende ADN que codifica regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana humanizado deseado, preferentemente según el procedimiento de PCR de extensión por solapamiento (Horton y col., Gene, 77, 61-68, (1989)) descrito más adelante.

Para explicarlo más específicamente, dos secuencias de ADN diferentes, que codifican dos secuencias de aminoácidos diferentes, respectivamente, y que se desea que se liguen entre sí, se designan (A) y (B), por comodidad. Se sintetizan químicamente un cebador de transcripción de 20 a 40 nucleótidos (denominado en lo sucesivo un "cebador (C)") que va a hibridarse al extremo 5' de la secuencia de ADN (A) y un cebador complementario de 20 a 40 nucleótidos (denominado en lo sucesivo un "cebador (D)") que va a hibridarse al extremo 3' de la secuencia de ADN (B). Además, se forma un cebador de transcripción de tipo quimérico (denominado en lo sucesivo "cebador (E)) ligando una secuencia de nucleótidos de 20 a 30 nucleótidos al extremo 3' de la secuencia de ADN (A) y una secuencia de nucleótidos de 20 a 30 nucleótidos se liga al extremo 5' de la secuencia de ADN (B). Se sintetiza un cebador antisentido (denominado en lo sucesivo "cebador (F)) complementario al cebador (E). Cuando se realiza una PCR usando ADN de vector apropiado que contiene ADN (A) como sustrato, el cebador sentido (C) y el cebador sentido de tipo quimérico (F), puede obtenerse ADN en el que los nucleótidos 20 a 30 del extremo 5' de ADN (B) están unidos al extremo 3' del ADN (A) (el ADN recientemente formado se designa ADN (G)). Similarmente, cuando se realiza una PCR usando ADN de vector apropiado que contiene ADN (B) como sustrato, el cebador complementario (D) y el cebador sentido de tipo quimérico (E), puede obtenerse ADN en el que los nucleótidos 20 a 30 del extremo 3' de ADN (A) están unidos al extremo 5' del ADN (B) (el ADN recientemente formado se designa ADN (H)). En los ADN (G) y (H), los nucleótidos 40 a 60 en el extremo 3' del ADN (G) forman una secuencia complementaria a la formada por los nucleótidos 40 a 60 en el extremo 5' del ADN (H). El ADN (G) y (H) amplificado se mezclan y se someten a PCR, el ADN (G) y (H) forman una monocadena en una primera reacción de desnaturalización. Aunque la mayoría de las cadenas de ADN vuelven a sus estados originales tras una reacción de hibridación, una parte del ADN forma un ADN heterobicatenario mediante la hibridación de la región de la secuencia de nucleótidos complementaria. Una parte monocatenaria saliente se rellena mediante una reacción de extensión posterior para obtener un ADN de tipo quimérico (denominado en lo sucesivo ADN (I)) formado por ADN (A) y ADN (B) ligados entre sí. El ADN (I) puede amplificarse realizando PCR usando ADN (I) como sustrato, el cebador sentido (C) y el cebador complementario (D). En la presente invención, el ADN que codifica una región CDR de una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo monoclonal de ratón de la oculospanina anti-humana, el ADN que codifica una región FR de inmunoglobulina humana IgG, además del ADN que codifica una señal de secreción de inmunoglobulina IgG humana, pueden usarse como ADN (A) y (B), caso por caso, y someterse a la reacción de ligado mencionada anteriormente.

Obsérvese que los codones correspondientes a un aminoácido deseado son por sí mismos conocidos y pueden elegirse arbitrariamente. Más específicamente, los codones pueden determinarse según un procedimiento habitual considerando la frecuencia con la que el codón es usado por un huésped. Una parte de la secuencia de nucleótidos de los codones puede modificarse según un procedimiento habitual tal como mutagénesis específica del sitio (véase, Mark, D.F. y col., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5662-5666) usando un cebador de oligonucleótido sintético que codifica una modificación deseada. Por tanto, si cada cebador se diseña para introducir una mutación puntual y después de esto se sintetiza químicamente, es posible obtener ADN que codifica regiones variables de una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana deseado.

Integrando cada uno de los ADN así obtenidos en un vector de expresión puede transformarse una célula huésped procariota o eucariota. Además, introduciendo un promotor apropiado y una secuencia relacionada con expresión fenotípica en estos vectores, cada gen puede expresarse en la célula huésped correspondiente.

En virtud del procedimiento mencionado anteriormente, un anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana recombinante puede prepararse fácilmente con alta pureza y con alto rendimiento.

(4) Preparación de anticuerpo monoclonal humano completo de oculospanina anti-humana

El anticuerpo humano completo se refiere a un anticuerpo humano que sólo tiene la secuencia génica de un anticuerpo derivado de un cromosoma humano. El anticuerpo monoclonal humano completo de oculospanina anti-humana puede obtenerse mediante un procedimiento usando un ratón productor de anticuerpo humano que tiene un fragmento de cromosoma humano que contiene los genes de una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo humano [véanse Tomizuka, K. y col., Nature Genetics, 16, pág. 133-143, 1997; Kuroiwa, Y. y col., Nuc. Acids Res. 26, pág. 3447-3448, 1998; Yoshida, H. y col., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, pág. 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. e Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 722-727, 2000, etc.] o se obtiene mediante un procedimiento para obtener un anticuerpo humano derivado de una expresión en fago seleccionada de una biblioteca de anticuerpos humanos [véanse Wormstone, I. M. y col., Investigative Oftalmology & Visual Science. 43(7), pág. 2301-8, 2002; Carmen, S. y col., Briefings in Funcional Genomics and Proteomics, 1 (2), pág. 189-203, 2002; Siriwardena, D. y col., Oftalmology, 109(3), pág. 427-431, 2002, etc.].

Como procedimiento para confirmar si el anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana recombinante así preparado se une o no específicamente a oculospanina humana, adecuadamente se emplea el procedimiento de ELISA usado en la evaluación del título de anticuerpos de un ratón inmunizado.

6. Una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana

A partir de los anticuerpos de la oculospanina anti-humana obtenidos mediante un procedimiento descrito en la sección "5. Preparación de anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana" puede obtenerse el anticuerpo monoclonal que neutraliza la actividad biológica de la oculospanina humana o un anticuerpo monoclonal que daña específicamente una célula cancerosa que expresa oculospanina humana. Estos anticuerpos pueden inhibir la actividad biológica de la oculospanina humana en el cuerpo vivo, en otras palabras, la canceración de una célula. Por tanto, pueden usarse como medicamento, en particular, como un agente terapéutico para el cáncer. La actividad de un anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana en la neutralización de una actividad biológica de la oculospanina humana in vitro puede determinarse mediante la capacidad para inhibir la canceración de una célula en la que la oculospanina humana está sobreexpresada. Para explicarlo más específicamente, la actividad inhibitoria puede determinarse cultivando una cepa de células de fibroblasto de ratón, NIH3T3, que sobreexpresa la oculospanina humana, añadiendo un anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana al sistema de cultivo en diversas concentraciones. De esta forma pueden determinarse las actividades inhibitorias contra la formación de focos, la formación de colonias y el crecimiento de esferoides. La actividad citotóxica de un anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana contra una célula cancerosa in vitro puede determinarse mediante la actividad citotóxica dependiente de anticuerpos, la citotoxicidad dependiente del complemento o la citotoxicidad celular dependiente del complemento presentada por el anticuerpo de la oculospanina anti-humana contra una célula que sobreexpresa oculospanina humana. Para ser más específicos, las células 293T que sobreexpresan la oculospanina humana se cultivan; luego se añade un anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana a diversas concentraciones al sistema de cultivo. Las células del bazo de ratón se añaden adicionalmente al sistema de cultivo y se cultivan durante un tiempo apropiado. Después de esto se determina la relación de inducción de muerte celular de las células que sobreexpresan la oculospanina humana. El efecto de un anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana en el tratamiento contra el cáncer puede determinarse in vivo usando un animal experimental, más específicamente, administrando el anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana a un animal transgénico que sobreexpresa oculospanina humana y determinando un cambio en las células cancerosas.

Un anticuerpo monoclonal así obtenido para neutralizar la actividad biológica de la oculospanina humana o un anticuerpo monoclonal que daña específicamente las células cancerosas que expresan la oculospanina humana es útil como medicamento, especialmente como composición farmacéutica para uso en el tratamiento contra el cáncer o como anticuerpo para uso en el diagnóstico inmunológico de una enfermedad tal. Como tipo de cáncer pueden mencionarse cáncer de piel y melanoma, un tipo de cáncer de piel; pero los cánceres que pueden tratarse o diagnosticarse según la invención no se limitan a estos ejemplos.

La presente invención proporciona una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana en una cantidad útil para el tratamiento, un diluyente farmacéuticamente aceptable, vehículo, solubilizante, emulsionante, conservante y/o un agente auxiliar.

Una sustancia que va a usarse como preparación farmacéuticamente aceptable en una composición farmacéutica según la presente invención es preferentemente no tóxica para un paciente al que se le administra la composición farmacéutica, en vista de la dosis y la concentración.

Una composición farmacéutica según la presente invención puede contener sustancias adecuadas para inclusión en una preparación que pueden cambiar, mantener y estabilizar el pH, la presión osmótica, viscosidad, transparencia, condición isotónica, condición aséptica, estabilidad, solubilidad, velocidad de liberación, velocidad de absorción y permeabilidad. Ejemplos de tales sustancias para inclusión en una preparación incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos tales como glicina, alanina, glutamina, asparagina, arginina y lisina; agentes antioxidantes tales como agentes antibacterianos, ácido ascórbico, sulfato de sodio e hidrogenosulfito de sodio; agentes de tamponamiento tales como tampones de fosfato, citrato, borato, hidrocarbonatos, disolución Tris-HCl; cargas tales como manitol y glicina; agentes quelantes tales como tetraacetato de etilendiamina (EDTA); agentes formadores de complejos tales como cafeína, polivinilpirrolidina, \beta-ciclodextrina e hidroxipropil-p-ciclodextrina; espesantes tales como glucosa, manosa y dextrina; carbohidratos tales como monosacáridos, disacáridos, glucosa, manosa, dextrina; polímeros hidrófilos tales como colorantes, aromas, diluyentes, emulsionantes, polivinilpirrolidina; conservantes tales como polipéptidos de bajo peso molecular, contraiones formadores de base, cloruro de benzalconio, benzoato, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico y peróxido de hidrógeno; disolventes tales como glicerina, propilenglicol y polietilenglicol; alcoholes de azúcar tales como manitol y sorbitol; polisorbatos tales como agentes de suspensión, PEG, éster de sorbitano, polisorbato 20 y polisorbato 80; tensioactivos tales como Triton, trometamina, lecitina, colesterol; agentes promotores de la estabilidad tales como sacarosa y sorbitol; agentes promotores de la elasticidad; agentes de transporte, diluyentes; excipientes; y/o agentes auxiliares farmacéuticos tales como cloruro sódico, cloruro de potasio, manitol/sorbitol. La cantidad de estas sustancias añadidas a una preparación es preferentemente 0,01 a 100 veces, más preferentemente 0,1 a 10 veces el peso del anticuerpo de la oculospanina anti-humana. Aquellos expertos en la materia pueden determinar apropiadamente la formulación adecuada para la preparación de una composición farmacéutica que depende de la enfermedad y la vía de administración.

El excipiente y vehículo añadidos en una composición farmacéutica pueden ser una sustancia líquida o sólida. Ejemplos de un excipiente y vehículo adecuados pueden incluir disoluciones inyectables, solución salina, líquido cefalorraquídeo artificial y otras sustancias normalmente usadas para administración parenteral. Además, como vehículo puede usarse solución salina neutra y solución salina que contiene albumina de suero. Una composición farmacéutica puede contener un tampón Tris de pH 7,0 a 8,5 y un tampón de acetato de pH 4,0 a 5,5, que puede estar complementado con sorbitol y otros compuestos. Una composición farmacéutica según la presente invención que tiene una composición seleccionada se prepara con una pureza requerida en forma de fármaco apropiado, o como producto liofilizado o un producto líquido. Para describir esto más específicamente, una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana puede formarse en un producto liofilizado usando un excipiente apropiado tal como sacarosa.

Una composición farmacéutica según la presente invención puede prepararse para uso parenteral o para uso oral para absorción gastrointestinal. La composición y la concentración de una preparación pueden elegirse dependiendo del procedimiento de administración. Un anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana contenido en una composición farmacéutica según la presente invención presenta alta afinidad por la oculospanina humana. Cuanto mayor sea la afinidad del anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana por la oculospanina humana, como se expresa por la constante de disociación (valor Kd), es decir, menor es valor de Kd, mayor será la eficacia de la composición farmacéutica de la presente invención a una dosis menor. Por tanto, basándose en esto, puede determinarse la cantidad de dosis de la composición farmacéutica de la presente invención a una persona. El anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana humanizado puede administrarse a una persona como una dosis única a un intervalo de 1 a 30 días en una cantidad de aproximadamente 0,1 a 100 mg/kg.

Ejemplos de formas de una composición farmacéutica de la presente invención pueden incluir inyecciones tales como infusiones para goteo, agentes de supositorio, agentes pernasales, agentes sublinguales y agentes de absorción percutánea.

7. Búsqueda de una sustancia que tiene interacción directa

En otro aspecto, en el presente documento se describe una solución de diseño de fármacos para obtener una sustancia que pueda inhibir la actividad de la oculospanina humana basándose en la estructura terciaria de la proteína. Esta solución se conoce como un procedimiento de diseño de fármacos racional y se usa para buscar un compuesto que pueda inhibir o activar eficazmente una función tal como la actividad enzimática o la unión a un ligando, cofactor o ADN. Como ejemplo de un compuesto tal es muy conocido un inhibidor de la proteasa que sirve de agente anti-VIH actualmente comercializado. En el análisis de la estructura tridimensional de la oculospanina humana cabe la posibilidad de poder usar un procedimiento generalmente muy conocido tal como cristalografía de rayos X o resonancia magnética nuclear. Además, en la búsqueda o el diseño de una sustancia para inhibir la función de la oculospanina humana puede usarse un procedimiento de diseño de fármacos asistido por ordenador (CADD). Como ejemplo de este caso se conoce un compuesto de bajo peso molecular (publicación internacional WO 99/58515) que inhibe la acción de la AP-1 que se espera actúe como un fármaco genómico novedoso para tratar artritis reumatoide crónica. En virtud de un procedimiento tal es posible obtener una sustancia que inhibe la función de la oculospanina humana uniéndose directamente a la oculospanina humana o inhibiendo la interacción entre la oculospanina humana y otros factores.

Además, según otro aspecto, en el presente documento se describe un polipéptido asociado a oculospanina humana, en otras palabras, una proteína asociada para controlar la actividad de la oculospanina humana. Más específicamente, en el presente documento se describe un procedimiento de cribado para buscar una proteína asociada tal para controlar la actividad de la oculospanina humana.

Un aspecto de un procedimiento de cribado tal comprende una etapa de poner en contacto una muestra de proteína de prueba con oculospanina humana, seleccionándose así una proteína que se une a la oculospanina humana. Un procedimiento tal incluye la purificación de una proteína haciendo uso de su afinidad por la oculospanina humana purificada. Para describirlo más específicamente, primero, una secuencia formada por 6 histidinas se une a la oculospanina humana como una marca de afinidad. La oculospanina humana resultante se incuba en una disolución de extracto de células (es decir, una fracción pasada a través de una columna cargada con níquel-agarosa) a 4ºC durante 12 horas. Entonces, un vehículo de níquel-agarosa se añade por separado a la mezcla y la mezcla se incuba a 4ºC durante una hora. Después de que el vehículo de níquel-agarosa se haya lavado suficientemente con un tampón de lavado, se añade imidazol 100 mM a la mezcla para eluir una proteína que se une específicamente a oculospanina humana y que está contenida en la disolución de extracto de células. La proteína purificada se analiza para determinar su estructura. Una proteína que puede purificarse como se describe anteriormente incluye una proteína que se une directamente a oculospanina humana y una proteína que forma un complejo como una subunidad con una proteína que se une directamente a oculospanina humana, pero que no tiene actividad de unión por la oculospanina humana, uniéndose así indirectamente a oculospanina humana [véase Experimental Medicine, volumen suplementario, Biomanual series 5, "Transcriptional factor investigation method" pág. 215-219 (publicado por Yodosha Co. Ltd.)].

Como procedimientos alternativos hay un procedimiento de clonación según la transferencia de Far-Western (Experimental Medicine, volumen suplementario, New Genetic Engineering Handbook, pág. 76-81, publicado por Yodosha Co. Ltd.) y un sistema de dos híbridos que usa una levadura o una célula de mamífero (Experimental Medicine, volumen suplementario, New Genetic Engineering Handbook, pág. 66-75, publicado por Yodosha Co. Ltd.) y "Checkmate mammalian two hybrid system" (fabricado por Promega). Sin embargo, no hay limitación en sólo usar estos procedimientos.

Si el ADNc de una proteína asociada que interactúa directa o indirectamente con la oculospanina humana está disponible de este modo, puede usarse en el cribado funcional de una sustancia que inhibe la interacción entre la oculospanina humana y la proteína asociada. Más específicamente, puede prepararse una proteína de fusión de la oculospanina humana con glutatión-S-transferasa. Se permite que la proteína de fusión se una a una microplaca cubierta con anticuerpo de anti-glutatión-S-transferasa y una proteína asociada biotinilada se ponga en contacto con la proteína de fusión. La unión de la proteína asociada con la proteína de fusión puede detectarse usando fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina. Cuando se añade la proteína asociada biotinilada, las sustancias de prueba se añaden al mismo tiempo para seleccionar una sustancia que promueve o inhibe la unión de la proteína de fusión y la proteína asociada. Mediante este procedimiento puede obtenerse un sustrato que actúa directamente sobre la proteína condensada o una sustancia que actúa directamente sobre la proteína asociada.

Cuando la proteína condensada se une indirectamente a la proteína asociada mediante otro factor, el ensayo se realiza en presencia de una disolución de extracto de células que contiene este factor. En este caso puede seleccionarse una sustancia que puede actuar con el factor.

Cuando la proteína asociada obtenida tiene la actividad de suprimir la función de la oculospanina humana, es posible buscar un agente anticancerígeno, por ejemplo, una sustancia candidata útil como agente terapéutico para el cáncer de próstata, según un procedimiento de prueba que usa un vector de expresión que comprende el gen de la oculospanina humana, como se describe anteriormente. Además, cuando la proteína asociada obtenida tiene la actividad de suprimir la función de la oculospanina humana, puede usarse un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un supresor tal en terapia génica para el cáncer.

Un polinucleótido tal puede obtenerse analizando la secuencia de aminoácidos del inhibidor identificado, sintetizando una sonda de oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos y buscando una biblioteca de ADNc o biblioteca genómica. Además, en el caso en el que un péptido que tiene actividad inhibitoria contra una función de la oculospanina humana se derive de una biblioteca de péptidos artificial sintetizada al azar, el ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos del péptido puede sintetizarse químicamente.

En terapia génica, un gen que codifica un inhibidor tal está integrado, por ejemplo, en un vector de virus y un paciente puede infectarse con un virus (atenuado) que comprende el vector de virus recombinante resultante. En el cuerpo del paciente se produce un factor anticancerígeno y funciona para suprimir la proliferación de células cancerosas. De este modo es posible tratar el cáncer.

Como procedimiento de introducción de un agente terapéutico génico en una célula puede usarse tanto una transfección génica usando un vector de virus como una transfección génica no viral [Nikkei Science, 4, (1994), pág. 20-45; Experimental Medicine, número adicional, 12 (15) (1994); Experimental Medicine, volumen suplementario, "Basic Technology of Gene Therapy" Yodosha, Co. Ltd. (1996)].

Ejemplos de transfección génica usando un vector de virus incluyen procedimientos de integrar el ADN que codifica un inhibidor o una versión mutada del ADN en virus de ADN o usando un virus de ARN tal como retrovirus, adenovirus, virus adenoasociado, virus del herpes, virus de la variolovacuna, virus de la viruela, virus de la poliomielitis o virus Sindbis e introducir el vector de virus en un cuerpo. De estos son particularmente preferidos los procedimientos que usan retrovirus, adenovirus, virus adenoasociado y virus de la variolovacuna. Ejemplos de transfección génica no viral incluyen un procedimiento de administración de un plásmido de expresión directamente en el músculo (procedimiento de vacunación con ADN), tratamiento con liposomas, lipofección, microinyección, tratamiento con fosfato de calcio y un procedimiento de electroporación. De estos se prefieren la vacunación con ADN y el tratamiento con liposomas.

Para usar un agente terapéutico génico como medicina en la práctica hay un procedimiento in vivo para introducir el ADN directamente en el cuerpo, y un procedimiento ex vivo que comprende sacar un cierto tipo de células del cuerpo, introducir el ADN en las células y devolver las células al cuerpo [Nikkei Science, 4, (1994), pág. 20-45; The Pharmaceutical Monthly, 36(1), 23-48 (1994); Experimental Medicine, número adicional 12 (15) (1994)].

Cuando el agente terapéutico génico se administra según el procedimiento in vivo, se administra mediante una vía de administración apropiada tal como una vena, arteria, tejido subcutáneo, tejido intradérmico o músculo, que es distinto dependiendo del tipo de enfermedad y síntomas. Cuando el agente se administra según un procedimiento in vivo, el agente terapéutico génico se prepara generalmente en forma de una inyección; sin embargo, si es necesario, puede añadirse un vehículo habitualmente usado. Además, cuando el agente se prepara en forma de un liposoma o liposoma condensado a membrana (virus Sendai-liposoma, etc.), el agente liposómico puede suministrarse como un agente en suspensión, agente liofilizado o concentrado en centrífuga y agente liofilizado.

Una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos representada por ID de secuencia nº 1 o una secuencia complementaria a una secuencia parcial de esta secuencia de nucleótidos puede usarse como la denominada terapia antisentido. Como molécula antisentido puede hacerse uso de ADN parcialmente complementario a la secuencia de nucleótidos representada por ID de secuencia nº 1 de la lista de secuencias y formada generalmente por 15 a 30 meros. Por tanto, también puede hacerse uso de un derivado de ADN estable tal como un derivado de fosforotioato, derivado de metifosfonato o derivado de morfolino del ADN, o un derivado de ARN estable tal como ARN de 2'-O-alquilo. Una molécula antisentido tal puede introducirse en una célula mediante un procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, inyectando una cantidad extremadamente pequeña de la molécula antisentido, formando una cápsula de liposoma o expresándola mediante el uso de un vector que tiene una secuencia antisentido. Una terapia antisentido tal es útil para tratar una enfermedad producida por una actividad excesiva de una proteína codificada por la secuencia de nucleótidos representada por ID de secuencia nº 1 de la lista de secuencias.

Una composición que contiene el oligonucleótido antisentido útil como medicina puede prepararse mediante un procedimiento conocido que incluye mezclar un vehículo farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de un vehículo tal y el procedimiento de preparación se describen en Applied Antisense Oligonucleotide Technology (1998 Wiley-Liss, Inc.). Una preparación que contiene un oligonucleótido antisentido puede administrarse por vía oral mezclando con un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable apropiado, en forma de comprimidos, cápsulas, gránulos, polvo o jarabe, o se administra parenteralmente en forma de una inyección, supositorio, parche o preparación externa. Estas preparaciones pueden prepararse mediante un procedimiento conocido usando aditivos:

excipientes que incluyen excipientes orgánicos tales como derivados de azúcar (por ejemplo, lactosa, azúcar blanca (sacarosa), glucosa, manitol y sorbitol); derivados de almidón (por ejemplo, almidón de maíz, almidón de patata, \alpha-almidón y dextrina); derivados de celulosa (por ejemplo, celulosa cristalina); goma arábiga; dextrano; y pululano; y excipientes inorgánicos tales como derivados de silicato (por ejemplo, ácido silícico anhidro blando, silicato de aluminio sintetizado, silicato de calcio y aluminato y metasilicato de magnesio); fosfatos (por ejemplo, hidrogenofosfato de calcio); carbonatos (por ejemplo, carbonato cálcico) y sulfatos (por ejemplo, sulfato de calcio); agentes lubricantes que incluyen estearatos metálicos (por ejemplo, ácido esteárico, estearato de calcio y estearato de magnesio); talco; sílice coloidal; ceras (por ejemplo, cera de abeja y cera espermaceti), ácido bórico; ácido adípico; sulfatos (por ejemplo, sulfato de sodio), glicol; ácido fumárico; benzoato de sodio; DL-leucina; laurilsulfatos (por ejemplo, laurilsulfato de sodio y laurilsulfato de magnesio); silicatos (por ejemplo, silicato anhidro, silicato hidrato); y derivados de almidón mencionados anteriormente; aglutinantes que incluyen hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, polivinilpirrolidona, macrogol y los mismos compuestos que se mencionan como excipientes; agentes de disgregación que incluyen derivados de celulosa (por ejemplo, hidroxipropilcelulosa de bajo grado de sustitución, carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa calcio, carboximetilcelulosa sodio reticulada internamente; y celulosas de almidón químicamente modificadas (por ejemplo, carboximetilalmidón, carboximetilalmidón sodio y polivinilpirrolidona reticulada); agentes emulsionantes que incluyen sílice coloidal (bentonita y goma de abeja), hidróxidos metálicos (por ejemplo, hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio), tensioactivos aniónicos (por ejemplo, laurilsulfato de sodio y estearato de calcio); tensioactivos catiónicos (por ejemplo, cloruro de benzalconio) y tensioactivos no iónicos (por ejemplo, éter alquílico de polioxietileno, éter de ácido graso de polioxietilensorbitano y éster de ácido graso de sacarosa); agentes estabilizantes que incluyen paraoxibenzoatos (por ejemplo, metilparabeno, propilparabeno); alcoholes (por ejemplo, clorobutanol, alcohol bencílico y alcohol feniletílico); cloruro de benzalconio; fenoles (por ejemplo, fenol y cresol); timerosal; deshidroacetato; y ácido sórbico; aromatizantes que incluyen edulcorantes, aromas ácidos y aromas generalmente usados; y diluyentes.

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Para introducir un anticuerpo monoclonal de la presente invención en un paciente puede usarse un sistema de dispersión coloidal, además de los procedimientos anteriormente mencionados. Se espera que el sistema de dispersión coloidal contribuya a aumentar la estabilidad del anticuerpo monoclonal en el cuerpo y lo transporte eficazmente a un órgano, tejido o célula específico. La elección del sistema de dispersión coloidal no se limita particularmente con tal que se use generalmente y pueda usarse, por ejemplo, un sistema de dispersión basado en lípidos que incluye complejos poliméricos, nanocápsulas, microesferas, perlas o emulsionantes de aceite en agua, micelas, mezclas de micelas o liposomas. Un sistema de dispersión coloidal preferible está constituido por múltiples liposomas o vesículas de una membrana artificial que es eficaz en transferir eficazmente un anticuerpo monoclonal a un órgano, tejido o célula específico (Mannino y col., Biotechniques, 1988, 6, 682; Blume y Cevc, Biochem. et Biophys. Acta, 1990, 1029, 91; Lappalainen y col., Antiviral Res. 1994, 23, 119; Chonn y Cullis, Current Op. Biotech. 1995, 6, 698).

Un liposoma unilaminar que oscila de 0,2 a 0,4 \mum de tamaño puede encapsular una gran proporción de macromoléculas contenidas en un tampón acuoso. Un anticuerpo monoclonal de la invención puede encapsularse en una membrana interna acuosa tal y transportarse a las células del cerebro en forma activa biológica (Fraley y col., Trends Biochem. Sci. 1981, 6, 77). El liposoma está generalmente compuesto por una mezcla de un lípido, particularmente un fosfolípido, más particularmente un fosfolípido que tiene una alta temperatura de transición de fase, con uno o más tipos de esteroide, en particular, colesterol. Ejemplos de un lípido útil para producir un liposoma incluyen compuestos de fosfatidilo tales como fosfatidilglicerina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, esfingolípido, fosfatidiletanolamina, cerebrósido y gangliósido. De estos es particularmente útil la diacilfosfatidilglicerina en la que un resto de lípido tiene 14 a 18 átomos de carbono, en particular 16 a 18 átomos de carbono y está saturado (es decir, no están presentes dobles enlaces dentro de la cadena de átomos de carbono C14-C18). Los fosfolípidos típicos incluyen fosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina y diestearoilfosfatidilcolina.

El sistema de dispersión coloidal que contiene liposomas puede usarse para la elección como diana pasiva o activa. La elección como diana pasiva puede conseguirse usando una tendencia inherente a los liposomas que tienden a distribuirse en el sistema reticuloendotelial de un órgano que contiene sinusoides. Alternativamente, la elección como diana activa puede conseguirse modificando un liposoma, por ejemplo, uniendo un ligando específico al mismo, tal como envuelta de la proteína viral (Morishita y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 1993, 90, 8474), un anticuerpo monoclonal (o su parte de unión apropiada), azúcar, glicolípido o proteína (o su fragmento de oligopéptido apropiado); o alternativamente, modificando la composición del liposoma con el fin de distribuirlo en órganos o tipos de células distintos de aquellos en los que naturalmente se localizan los liposomas. La superficie del sistema de dispersión coloidal puede modificarse en diversos procedimientos para la elección como diana. En un sistema de liberación que usa un liposoma como un medio de elección como diana, para mantener un ligando para uso en la elección como diana manteniendo una estrecha asociación con una bicapa lipídica, un grupo de lípidos se integra en la bicapa lipídica del liposoma. Para unir una cadena peptídica al ligando que se elige como diana pueden usarse diversos grupos de enlace. Pueden formarse dos o más bioactivadores en un complejo dentro de un único liposoma y administrarse. Un agente médico para mejorar la estabilidad intracelular y/o seleccionar como diana la capacidad del contenido puede añadirse al sistema de dispersión coloidal.

Ahora, la presente invención se describirá más específicamente en detalle mediante ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes de la presente invención. Obsérvese que las operaciones individuales referentes a la manipulación génica en los siguientes ejemplos se realizan según los procedimientos descritos en "Molecular Cloning" (por Sambrook, J. Fritsch, E.F. y Maniatis, T., publicado por Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989) o se realizan usando reactivos o kits comercialmente disponibles según los protocolos de los mismos.

Ejemplo 1 Cribado de un gen específicamente expresado en una célula cancerosa

El análisis del perfil de expresión se realizó usando una sonda de EST (Affymetrix GeneChip HG-133 probe 223795_at: preparada por Affymetrix) que tenía una secuencia de nucleótidos que se solapaba parcialmente con la secuencia representada por ID de secuencia nº 1 de la lista de secuencias usando la base de datos (sistema de software GeneExpress versión 1.4.2) proporcionada por Genelogic company.

La expresión del gen de la oculospanina humana en diversas células se comparó cuantitativamente considerando su transcripción. Como resultado se encontró que los niveles de expresión en 8 muestras de melanocitos eran significativamente altos, en comparación con los niveles en otras muestras de células, incluyendo 12 muestras de células sanguíneas, 6 muestras de células de la glía, 62 muestras de células epiteliales (los valores de p de las mismas fueron < 0,0001, = 0,0007 y < 0,0001 secuencialmente en orden, Figura 1, panel superior).

A continuación se compararon los niveles de expresión del gen de la oculospanina humana en muestras derivadas de tejido. Más específicamente, la cantidad de transcripción se comparó con respecto a 66 muestras de piel de individuos sanos y 33 muestras de melanoma. Como resultado se encontró que la cantidad de transcripción en las muestras de melanoma era significativamente alto (valor de p = 0,0001, Figura 1, panel inferior). Además, cuando se compararon las muestras de piel de 66 individuos sanos con 12 muestras de melanoma derivadas del tejido de la piel con melanoma se encontró que la cantidad de transcripción en las muestras de melanoma era significativamente mayor (valor de p = 0,007, Figura 2, panel superior).

Cuando se compararon 66 muestras de piel de personas sanas con 12 muestras de melanoma derivadas de tejido de ganglio linfático se encontró que la cantidad de transcripción en las muestras de melanoma era significativamente mayor (valor de p = 0,0003, Figura 2, panel inferior).

Además, cuando se compararon 13 muestras de personas sanas derivadas de ganglio linfático con 12 muestras de melanoma derivadas de tejido de ganglio linfático se encontró que la cantidad de transcripción en las muestras de melanoma era significativamente mayor (valor de p = 0,0011, el panel de la Figura 3).

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Ejemplo 2 Adquisición del gen de la oculospanina humana y construcción del plásmido de expresión a) Reacción de PCR

Como cebador para amplificar el ADNc de la oculospanina humana por PCR se sintetizaron oligonucleótidos que tienen las siguientes secuencias según un procedimiento habitual.

5'-CACCATGGAGGAGGGGGAGAGGAGCCC-3' (cebador 1, ID de secuencia nº 5 de la lista de secuencias)

5'-GCCCCGGGCGGGTTTGGCAGCGG-3' (cebador 2, ID de secuencia nº 6 de la lista de secuencias)

Obsérvese que cebador 1 es un oligonucleótido construido añadiendo 4 bases, CACC, como una secuencia KOZAK, aguas arriba del codón de iniciación del gen de la oculospanina humana, en otras palabras, un oligonucleótido construido añadiendo las 4 bases, la secuencia CACC, al extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que está constituida por los nucleótidos nº 1 a 23 de ID de secuencia nº 1 de la lista de secuencias. La secuencia CACC, debido a que forma una cadena complementaria al extremo 3' del vector cuando se integra en el vector de clonación pENTR/D-TOPO, hace posible integrar el gen en el vector mientras que se mantiene la orientación del gen. El cebador 2 es un oligonucleótido compuesto por una cadena complementaria a una secuencia de nucleótidos que está constituida por los nucleótidos nº 1043 a 1065 de ID de secuencia nº 1 de la lista de secuencias.

La reacción de PCR se realizó usando la ADN polimerasa PLATINUM Pfx (preparada por Invitrogen) según el protocolo proporcionado. Más específicamente, a 0,1 \mul del primer ADNc de cadena obtenido se añadieron 1,5 \mul de cada uno de 10 pmol/\mul de cebador 1 sintético y cebador 2 sintético, 5 \mul de 10x tampón de amplificación Pfx, 1,5 \mul de mezcla de dNTP 10 mM, 1 \mul de MgSO_{4} 50 mM, 0,5 \mug de ADN polimerasa PLATINUM Pfx, 10 \mul de 10x disolución potenciadora de PCRx y 28,9 \mul de agua esterilizada para preparar 50 \mul de una disolución de reacción de PCR. La reacción de PCR se realizó usando un ciclador térmico TPC-200 DNA Engine (fabricado por MJ Research), primero mediante calentamiento de la disolución de PCR a 94ºC durante 2 minutos, repitiendo 5 veces un ciclo térmico que está constituido por reacciones a 94ºC durante 30 segundos y 65ºC durante 2 minutos; 5 veces un ciclo térmico que está constituido por reacciones a 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 40 segundos y 68ºC durante un minuto y 20 segundos; 5 veces un ciclo térmico que está constituido por reacciones a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 40 segundos y 68ºC durante un minuto y 20 segundos; 35 veces un ciclo térmico que está constituido por reacciones a 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 40 segundos y 68ºC durante un minuto y 20 segundos y finalmente manteniendo la disolución de PCR a 68ºC durante 10 minutos, y luego almacenando la disolución a 4ºC. Se obtuvo un ADNc deseado sometiendo el producto de reacción a electroforesis en gel de agarosa al 1,5%, confirmando la amplificación del ADNc NM_031945 (1069 pb) y purificando el ADN del gel de agarosa usando el kit de purificación S.N.A.P. UV-Free Gel Purification kit (preparado por Invitrogen) según el protocolo proporcionado. La concentración de ADNc así purificado se determinó usando el software de análisis de imágenes en 1D versión 3.5 (Kodak Digital Science EDAS290: fabricado por Kodak) con referencia a una escalera de ADN de 1 kb que se usó como referencia de concentración.

b) Clonación del ADNc de la oculospanina humana en el vector pENTR/D-TOPO

El ADNc de NM_031945 obtenido en el ejemplo 2a) se clonó en el vector pENTR/D-TOPO usando el kit de clonación pENTR Directional TOPO Cloning Kit (preparado por Invitrogen) según el protocolo proporcionado. Más específicamente, el ADNc de NM_031945 se mezcló con el vector pENTR/D-TOPO que tenía topoisomerasa unida al mismo en el tampón de reacción suministrado con el kit y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La E. coli químicamente competente OneShot TOP10 (preparada por Invitrogen) se transformó usando el producto de reacción obtenido y se cultivó en un medio agar LB que contenía 50 \mug/ml de kanamicina. Las colonias de E. coli resultantes, que presentaron resistencia a kanamicina, se seleccionaron y se cultivaron en un medio TB líquido que contenía 1 ml de 50 \mug/ml de kanamicina, a 37ºC durante la noche. El ADN de plásmido se aisló y se purificó usando un kit Montage Plasmide Miniprep_{96} Kit (preparado por Millipore). Entonces, el ADN de plásmido así obtenido se sometió a una reacción usando el kit de reacción BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit según el protocolo proporcionado, la secuencia de nucleótidos se analizó usando un analizador de ADN ABI PRISM 3100 (preparado por Applied Biosystems). Como resultado se confirmó que el ADNc (ID de secuencia nº 1 de la lista de secuencias) que tenía un marco de lectura abierto del nucleótido representado por el nº de registro de GenBank NM_031945 se integró en el vector pENTR/D-TOPO.

A continuación, el gen se transfirió a un vector de expresión, pcDNA3.1/DEST40 (preparado por Invitrogen) usando el sistema GATEWAY^{TM}. Para explicarlo más específicamente, 4 \mul de mezcla de enzimas GATEWAY^{TM}-LR Clonase^{TM} (preparada por Invitrogen), 4 \mul de tampón de reacción de LR, 0,3 \mug de pENTR/D-TOPO-NM_031945 y 0,3 \mug de pcDNA3.1/DEST40 se mezclaron y se enrasaron hasta una disolución de reacción de 20 \mul en tampón TE. La disolución de reacción se dejó reaccionar a 25ºC durante una hora. Después de la reacción se añadieron 2 \mul de proteinasa K y se realizó una reacción a 37ºC durante 10 minutos. Usando el producto de reacción resultante, la E. coli químicamente competente OneShot TOP10 (preparada por Invitrogen) se transformó y se cultivó en un medio de agar LB que contenía 50 \mug/ml de ampicilina. Las colonias de E. coli resultantes que presentaron resistencia a ampicilina se seleccionaron y se cultivaron en 100 ml de medio líquido LB que contenía 50 \mug/ml de ampicilina a 37ºC durante la noche, y el ADN de plásmido (pcDNA3.1/DEST40-NM_031945) se aisló y se purificó usando el kit Plasmid MAXI Kit (preparado por QIAGEN).

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Ejemplo 3 Introducción del gen de la oculospanina humana en células, confirmación de que se expresa el producto génico de la oculospanina humana y preparación de una fracción de membrana a partir de células que expresan la oculospanina humana para uso como un inmunógeno a) Transfección de células NIH3T3 con el plásmido pcDNA3.1/DEST40-NM_031945

Las células NIH3T3 se transfectaron con plásmido pcDNA3.1/DEST40-NM_031945 obtenido en el ejemplo 2 del siguiente modo. La transfección de las células NIH3T3 se realizó mediante lipofección usando el reactivo Lipofectamine^{TM} 2000 preparado por Invitrogen. Para explicarlo más específicamente, primero, células NIH3T3 se cultivaron en una placa de 6 pocillos hasta un estado semiconfluente. A continuación, las células se lavaron una vez con DMEM sin antibiótico que contenía 10% de suero bovino fetal, luego se añadieron 200 \mul de DMEM sin antibiótico que contenía 10% de suero bovino fetal a las células. Entonces, a un tubo Eppendorf de 1,5 ml se añadieron 100 \mul de medio sin suero (DMEM) y 2 \mug de ADN de plásmido (pcDNA3.1/DEST40-NM_031945) recuperado del modo anteriormente mencionado y se mezclaron. A otro tubo Eppendorf de 1,5 ml se añadieron 96 \mul de medio sin suero (DMEM) y 4 \mul de reactivo Lipofectamine^{TM} 2000 y se mezclaron. La disolución de ADN y la disolución de Lipofectamine se mezclaron y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después de esto, la mezcla de las disoluciones de ADN-Lipofectamine se añadió a las células y se cultivó a 37ºC en 5% de CO_{2}. Después de 4 horas, 1 ml de DMEM que contenía el 10% suero bovino fetal se añadió a las células que se cultivaron a 37ºC durante la noche en 5% de CO_{2}.

b) Confirmación de la expresión del plásmido pcDNA3.1/DEST40-NM_031945 en células NIH3T3

El producto de cultivo celular así obtenido se recuperó. El control negativo que no contenía ADNc o células NIH3T3 transfectadas con el pcDNA3.1/DEST40-NM-031945 obtenido se lavó con una disolución tampón PBS (-) (preparada por Invitrogen). Las células se dispersaron en una disolución tampón de muestra (preparada por BioRad) que contenía 2-mercaptoetanol para uso en electroforesis en SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). La SDS-PAGE se realizó usando 12,5% de gel de poliacrilamida (e PAGEL E-T12.5L; preparado por ATTO corporation) en condiciones reductoras.

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Después de la electroforesis, las bandas se transfirieron del gel de poliacrilamida a una membrana de poli(difluoruro de vinilideno) (PVDF) (fabricada por Millipore) usando un aparato de transferencia de gel-membrana (NP7513 fabricado por Marysol) en un disolución de tampón de transferencia (glicina 192 mM, 20% de metanol, Tris 25 mM) bajo las siguiente condiciones: 4ºC, 120 minutos y 200 mA.

Después de la transferencia, la membrana de PVDF se sometió a análisis de transferencia de Western usando un anticuerpo anti-V5-marca (preparado por Invitrogen). Para explicarlo más específicamente, primero, la membrana de PVDF se bloqueó usando blockace (fabricado por Yukijirushi Co.) una vez a temperatura ambiente durante 30 minutos y se puso en una bolsa de plástico (nombre comercial: Hibribag fabricada por Cosmo Bio). A la marca se añadieron el anticuerpo anti-V5-marca (dilución de 1000 veces) y 5 ml de blockace y la bolsa se agitó a temperatura ambiente durante una hora. Después de una hora, la membrana se eliminó y se lavó con PBS que contenía 0,05% de Tween 20 (denominado en lo sucesivo ``0,05% de Tween 20-PBS) una vez a temperatura ambiente durante 15 minutos y dos veces durante 5 minutos. Después de esto, la membrana se transfirió a una nueva bolsa de plástico. A la bolsa se añadieron 30 ml de una disolución que contenía un anticuerpo de IgG anti-conejo marcado con peroxidasa de rábano picante (preparado por Amersham Pharmacia) diluido 5000 veces con 0,05% de Tween 20-PBS y se agitó a temperatura ambiente durante una hora. Después de una hora, la membrana se sacó y se lavó con 0,05% de Tween 20-PBS una vez durante 15 minutos y cuatro veces durante 5 minutos. Después del lavado, la membrana se colocó sobre una película de envoltura y se detectó una banda que tenía el anticuerpo anti-V5-marca unido a ella usando disolución de detección de transferencia de Western por ECL (preparada por Amersham Pharmacia). La membrana se colocó sobre la película de envoltura y se empapó en la disolución de detección de transferencia de Western por ECL durante un minuto y luego se expuso a una película de rayos X (un minuto). Como resultado se detectó una banda específica para las células NIH3T3 que tenían ADN de plásmido pcDNA3.1/DEST40-NM_031945 introducido en su interior debido a la presencia del anticuerpo anti-V5-marca (Figura 4).

c) Transfección de células BALB-3T3 con el plásmido pcDNA3.1/DEST40-NM_031945

Las células BALB-3T3 (Colección americana de cultivos tipo nº CCL-163) se cultivaron en tres bandejas de células (área de cultivo: 500 cm^{2} fabricadas por Sumitomo Bakelite Co. Ltd.) para cultivo celular en medio de Eagle modificado de Dulbecco (denominado en lo sucesivo "DMEM") preparado por Nissui Pharmaceutical Co. Ltd. que contenía 10% de suero bovino (denominado en lo sucesivo "BS") preparado por Gibco, a 37ºC en 5% de gas CO_{2} hasta un estado semiconfluente. Después de esto, las células BALB-3T3 se transfectaron con el plásmido pcDNA3.1/DEST40-NM_031945. La transfección de las células BALB-3T3 se realizó mediante lipofección usando el reactivo de transfección Geneporter^{TM} 2 (preparado por Gene Therapy Systems). Para explicarlo más específicamente, las células se lavaron una vez usando un medio sin suero, DMEM. A las células se añadieron 500 ml del medio sin suero (DMEM). Entonces, a un tubo de Falcon de 50 ml se añadieron 6 ml de New DNA diluent y 240 \mug de ADN de plásmido (pcDNA3.1/DEST40-NM_031945) recuperado mediante el procedimiento anteriormente mencionado y se mezclaron. A otro tubo de Falcon de 50 ml se añadieron 4,8 ml de medio sin suero (DMEM) y 1200 \mul del reactivo Geneporter^{TM} 2 y se mezclaron. La disolución de ADN y la disolución de Geneporter^{TM} 2 se mezclaron y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después de esto, la mezcla de las disoluciones de ADN-Geneporter^{TM} 2 se añadió a las células (4 ml/bandeja) y se cultivó a 37ºC en presencia de 5% de CO_{2}. Después de 4 horas, el DMEM que contenía 20% de suero bovino se añadió en una cantidad de 50 ml/bandeja y se cultivó a 37ºC en 5% de CO_{2} durante la noche

d) Preparación de la fracción de membrana celular

Las células cultivadas por el procedimiento anteriormente mencionado se lavaron con disolución tampón PBS (-) (preparado por Invitrogen). Las células se recogieron usando una rasqueta de células (fabricada por Sumitomo bakelite Co. Ltd.) y se suspendieron en 7 ml de tampón Tris 5 mM a pH 8,0. La disolución de células resultante se dejó reposar a 4ºC durante 30 minutos. Las células se trituraron usando un homogeneizador Dounce tipo B (30 emboladas) y se centrifugaron a 1000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se recuperó y se centrifugó a 78.000 g durante 100 minutos usando un aparato de ultracentrifugación (fabricado por Hitachi) y el precipitado se recuperó. El precipitado se sometió a un gradiente de densidad de azúcar para concentrar los fragmentos de membrana. Más específicamente, el precipitado se disolvió en 3 ml de una disolución de 57% de azúcar y tampón Tris 0,25 M, pH 8,0. La disolución resultante se transfirió a un tubo de ultracentrífuga. Una alícuota de 3 ml de una disolución de 57% de azúcar y tampón Tris 0,25 M, pH 8,0, y 1,5 ml de una disolución de 37,5% de azúcar y tampón Tris 0,25 M, pH 8,0, se estratificaron secuencialmente sobre la disolución de precipitado celular. Entonces, la centrifugación se realizó usando un aparato de ultracentrifugación a 75.500 g durante 16 horas. Se tomó una alícuota de 1 ml de la parte superior de cada tubo. A cada alícuota (fracción) se añadieron 10 ml de tampón Tris 5 mM, pH 8,0, y ésta se sometió a ultracentrifugación a 78.000 g durante una hora para recuperar el precipitado. Al precipitado se añadieron 500 \mul de tampón Tris 5 mM, pH 8,0, y la disolución de células se homogeneizó usando un homogeneizador Dounce tipo B (10 emboladas). La fracción de membrana celular se identificó mediante el procedimiento de transferencia de Western descrito en la sección "Confirmación de la expresión" y se usó como un inmunógeno.

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Ejemplo 4 Inmunización de ratones y fusión de células (4-1) Inmunización

1 ml (cantidad total de proteína: 100 \mug) de la disolución de fracción de membrana de las células que expresan la oculospanina humana obtenidas en el ejemplo 3 se inyectó intraperitonealmente a ratones BALB/c que tenían 4 a 10 semanas de edad (comprados de Japan SLC Inc.). Después de dos semanas, la misma disolución de fracción de membrana (20 \mug de proteína/ratón) se inyectó en la cavidad abdominal como una inmunización de refuerzo.

(4-2) Fusión de células

Se extirpó el bazo de un ratón tres días después de la inmunización de refuerzo y se añadió a 10 ml de un medio RPMI 1640 sin suero (10,4 g/l, RPMI 1640 "Nissui"(1): preparado por Nissui Pharmaceutical Co. Ltd., denominado en lo sucesivo "medio RPMI sin suero") que contenía tampón HEPES 20 mM (pH 7,3), 350 mg/ml de hidrogenocarbonato de sodio, \beta-mercaptoetanol 0,05 mM, 50 unidades/ml de penicilina, 50 \mug/ml de estreptomicina y 300 \mug/ml de ácido L-glutámico, y el bazo se trituró sobre la malla de un filtro de células (filtro de células; fabricado por Falcon) usando una espátula. La disolución en suspensión de células pasada a través de la malla se centrifugó para recoger las células del bazo. Las células del bazo se lavaron dos veces con medio RPMI sin suero, se suspendieron en medio RPMI sin suero y se contó el número de células.

La células de mieloma NSI (Colección americana de cultivos tipo TIB-18) se cultivaron en medio ASF 104 (preparado por Ajinomoto; denominado en lo sucesivo "medio ASF que contiene suero") que contenía 10% de SBF (preparado por Gibco BRL) a 37ºC en 5% de gas CO_{2} de forma que la densidad celular no superara 1 \times 10^{8} células/ml. Las células de mieloma así preparadas se lavaron con medio RPMI sin suero del mismo modo que antes y se suspendieron en medio RPMI sin suero y se contó el número de células.

La disolución en suspensión de células NSI que contenía aproximadamente 3 \times 10^{7} células y la disolución en suspensión de células del bazo que contenía aproximadamente 3 \times 10^{8} células se mezclaron y se sometieron a centrifugación, y después de esto el sobrenadante se eliminó completamente. La operación de fusión de células de más adelante se realizó mientras se mantenía el tubo de centrífuga de plástico que contenía el sedimento en un vaso de precipitados que contenía agua caliente a 37ºC. Al sedimento se añadió lentamente 1 ml de 50% (peso/volumen) de polietilenglicol 1500 (preparado por Boehringer Mannheim) mediante una pipeta mientras el sedimento se agitaba usando la punta. Después de esto, 1 ml de medio RPMI sin suero, previamente calentado hasta 37ºC, se añadió cuidadosamente en dos veces y se añadieron adicionalmente 7 ml de medio RPMI sin suero. Después de la centrifugación, el sobrenadante se eliminó y se añadieron 10 ml de medio de hipoxantina-aminopterina-timidina (denominado en lo sucesivo "medio HAT"; preparado por Boehringer Mannheim) que contenía 10% de SBF mediante una pipeta mientras se agitaba cuidadosamente usando la punta. Después de añadirse 20 ml de medio HAT que contenía 10% de SBF, la disolución resultante se dispensó a un microplaca de cultivo celular de 96 pocillos a una cantidad de 100 \mul/pocillos y se cultivó a 37ºC en 5% de gas CO_{2}. Siete a ocho días después, a los pocillos que contenían medio con un matiz amarillo se les añadió medio nuevo HAT en una cantidad de 100 \mul/pocillo. Las células fusionadas así obtenidas se sometieron a barrido mediante análisis de dilución limitante como se menciona más adelante.

(4-3) Dilución limitante

El timo se extirpó de ratones BALB/c hembra que tenían 4 a 10 semanas de edad (comprados de Japan SLC Inc.) y se trituraron sobre la malla de un filtro de células (filtro de células, fabricado por Falcon) usando una espátula. Las células pasadas a través de la malla se lavaron dos veces con medio hipoxantina-timidina (denominado en lo sucesivo "medio HT", preparado por Boehringer Mannheim) que contenía 10% de SBF. Las células del timo del ratón se suspendieron en 30 ml de medio HT que contenía 10% de SBF. La disolución en suspensión así obtenida se usó como una disolución de células nodrizas. La disolución de cultivo que contenía las células fusionadas obtenidas en la sección (4-2) se diluyó 10 a 100 veces con la disolución de células nodrizas dependiendo de la densidad celular y adicionalmente se diluyeron seriadamente con la disolución de células nodrizas hasta que la densidad de las células fusionadas era 5 células/ml, 1 célula/ml y 0,5 células/ml. Cada una de las muestras así preparada se dispensó a una microplaca de cultivo celular de 96 pocillos en una cantidad de 100 \mul por pocillo y se cultivó a 37ºC en 5% de gas CO_{2} durante 5 días.

(4-4) Cribado (4-4-1) ELISA celular

Las células que expresan la oculospanina humana se mantuvieron cultivándolas en medio RPMI 1640 (preparado por Invitrogen) complementado con 10% de suero bovino fetal (preparado por Moregate Biotech), HEPES 20 mM (preparado por Sigma) y 2-mercaptoetanol 55 \muM (preparado por Invitrogen) a 37ºC en 5% de gas CO_{2}. Las células que expresan la oculospanina humana en la fase de crecimiento logarítmico se sembraron en un matraz de cultivo celular a una densidad de 2 \times 10^{4} células/cm^{2} y se cultivaron durante 3 días. Las células que expresan la oculospanina humana así preparadas se transfirieron a un tubo de 50 ml y se centrifugaron usando un HITACHI himac CF8DL a 1.000 rpm durante 5 minutos (condición de centrifugación 1). El sobrenadante se eliminó y las células que expresan la oculospanina humana se suspendieron en un medio. Después de esto, el número de células vivas se contó usando 0,4% de disolución de azul de tripano (preparada por Sigma). La densidad de las células vivas que expresan la oculospanina humana se ajustó usando el medio para que tuviera 10^{7} células por ml y el medio resultante se dispensó a un placa con fondo en U de 96 pocillos en una cantidad de 100 \mul/pocillo. La placa con fondo en U de 96 pocillos se centrifugó usando un HITACHI himac CF8DL a 15.000 rpm durante un minuto (condición de centrifugación 2). El sobrenadante se eliminó usando una punta de 200 \mul. A la placa con fondo en U de 96 pocillos se le dio un golpe en la superficie lateral para suspender las células que expresan la oculospanina humana. A la suspensión se añadieron disoluciones de sobrenadante de cultivo de hibridoma cuyas concentraciones se ajustaron a 10 \mug/ml, 5 \mug/ml, 2,5 \mug/ml con un medio enfriado sobre hielo en una cantidad de 100 \mul/pocillo. Mientras que la placa con fondo en U de 96 pocillos se agitó usando un mezclador de placas (fabricado por Fujirebio Inc.) a intervalos de 15 minutos, una reacción se realizó a 4ºC durante 1,5 horas. Después de completarse la reacción, la placa con fondo en U de 96 pocillos se centrifugó bajo la condición de centrifugación 2 y el sobrenadante se eliminó usando una punta de 200 \mul. Una disolución (PBS-5% de SBF) preparada añadiendo 5% de suero bovino fetal a PBS(-) (preparado por Nissui Pharmaceutical Co. Ltd.) se añadió a los pocillos en una cantidad de 200 \mul por pocillo. Después de la agitación usando un mezclador de placas, la centrifugación se realizó bajo la condición de centrifugación 2 y el sobrenadante se eliminó usando una punta de 200 \mul. Después de esto, la operación anteriormente mencionada se repitió dos veces. A la placa con fondo en U de 96 pocillos se le dio un golpe en la superficie lateral para suspender las células que expresan la oculospanina humana. A la suspensión se añadieron anticuerpo IgG anti-humano marcado con peroxidasa (preparado por Kirkegaad & Perry Laboratories) diluido 500 veces con PBS-5% de SBF enfriado sobre hielo en una cantidad de 100 \mul/pocillo. Mientras que la placa con fondo en U de 96 pocillos se agitó usando un mezclador de placas a intervalos de 15 minutos, se realizó una reacción a 4ºC durante 1,5 horas. Después de completarse la reacción, la placa con fondo en U de 96 pocillos se centrifugó bajo la condición de centrifugación 2 y el sobrenadante se eliminó usando una punta de 200 \mul. Entonces se añadió PBS-5% de SBF en una cantidad de 200 \mul/pocillo y se agitó usando un mezclador de placas, se centrifugó bajo la condición de centrifugación 2 y luego el sobrenadante se eliminó usando una punta de 200 \mul. Después de esto, la operación anteriormente mencionada se repitió dos veces. A la placa con fondo en U de 96 pocillos se le dio un golpe en la superficie lateral para suspender las células que expresan la oculospanina humana. A la suspensión se añadió un sustrato de revelado de color para peroxidasa (preparado por Nacalai Tesque Inc.) ajustado hasta temperatura ambiente en una cantidad de 100 \mul/pocillo y se agitó usando un mezclador de placas durante 10 minutos. Después de realizarse la centrifugación bajo la condición de centrifugación 2, el sobrenadante se transfirió a una placa de fondo plano de 96 pocillos en una cantidad de 50 \mul/pocillo y se midió la absorbancia a 405 nm usando un lector de placas (contador de múltiples marcas 1420 ARVO, fabricado por PerkinElmer Inc.)

(4-4-2) Citometría de flujo

Las células que expresan la oculospanina humana obtenidas en el ejemplo 3 se cultivaron y se hicieron crecer en medio RPMI 1640 que contenía 10% de SBF a 37ºC en 5% de gas CO_{2}. Una disolución en suspensión de células, preparada de manera que contuviera 1 \times 10^{7} células/ml, se dispensó a una microplaca con fondo en U de 96 pocillos (fabricada por Nunk) en una cantidad de 50 \mul/pocillo y se centrifugó (a 90 \times g, 4ºC durante 10 minutos). El sobrenadante se eliminó y el sobrenadante de las células fusionadas cultivado en la sección (4-3) anterior se añadió en una cantidad de 50 \mul/pocillo y se agitó. La placa se dejó reposar durante una hora sobre hielo, se sometió a centrifugación (a 90 \times g, 4ºC durante 10 minutos) y el sobrenadante se eliminó. El sedimento se lavó dos veces con una disolución de tampón citométrico de flujo (PBS que contenía 5% de SBF y 0,04% (peso/volumen) de azida de sodio) en una cantidad de 100 \mul/pocillo y 50 \mul de fracción de IgG de anticuerpo IgG anti-ratón de cabra diluida 500 veces (preparado por Organon Technica) marcado con 5-isotiocianato de fluoresceína (denominado en lo sucesivo "FITC") se añadieron como anticuerpo secundario y se dejaron reposar sobre hielo durante una hora. Después de la centrifugación (a 90 \times g, 4ºC durante 10 minutos), el sobrenadante se eliminó. El sedimento se lavó dos veces con 100 \mul de disolución de tampón citométrico de flujo por pocillo y después de esto se añadieron 50 \mul de una disolución de formalina al 3,7% y la mezcla de disolución resultante se dejó reposar durante 10 minutos sobre hielo. De este modo, las células se inmovilizaron. Después de la centrifugación (a 90 \times g, 4ºC durante 10 minutos), el sobrenadante se eliminó. El sedimento se lavó de nuevo con 100 \mul de disolución de tampón citométrico de flujo por pocillo y se suspendió en 100 \mul de tampón citométrico de flujo. Éste se usó como una muestra para citometría de flujo. La intensidad de la fluorescencia FITC emitida de las células en cada muestra se midió usando un citómetro de flujo (Epics Elite fabricado por Coulter) a una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de detección de 530 nm. Cuando la intensidad de fluorescencia FITC de las células que expresan la oculospanina humana expuestas al sobrenadante del cultivo de células de fusión fue mucho mayor (aproximadamente 100 a 1.000) que la (aproximadamente 0,3) de las células que expresan la oculospanina humana sin exponer al sobrenadante del cultivo de células de fusión, se seleccionaron las células de fusión correspondientes.

(4-5) Clonación

Las células seleccionadas en la sección (4-4) anterior se sometieron a una serie de etapas (4-3) a (4-4) cinco veces. De esta forma se obtuvieron varios clones de hibridoma que pudieron producir un único anticuerpo que podía unirse a células que expresan la oculospanina humana, pero que no puede unirse a las células parentales no transfectadas.

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Ejemplo 5 Purificación de anticuerpo monoclonal de la oculospanina humana

Las células de hibridoma de ratón-ratón construidas en el ejemplo 4 se cultivaron en 1 litro de medio ASF que contenía 10% de SBF a 37ºC en 5% de gas CO_{2} hasta que la densidad celular alcanzó 1 \times 10^{6} células/ml. La disolución de cultivo se centrifugó (a 1.000 rpm durante 2 minutos), el sobrenadante se desechó y las células recogidas se lavaron una vez usando medio ASF sin suero. Después de esto, las células se volvieron a suspender en 1 litro de medio ASF sin suero y se cultivaron a 37ºC en 5% de gas CO_{2} durante 48 horas. La disolución de cultivo se centrifugó (a 1.000 rpm durante 2 minutos) y el sobrenadante se recuperó y se transfirió a un tubo de diálisis (peso molecular de límite de exclusión: 12.000 a 14.000, preparado por Gibco BRL). La diálisis se realizó contra una cantidad 10 veces de disolución tampón de fosfato de sodio 10 mM (pH 8,0). La IgG contenida en la disolución dentro del tubo de diálisis se purificó de forma bruta usando un aparato de cromatografía líquida de alta resolución (sistema HPLC, fabricado por Pharmacia) en las condiciones descritas a continuación:

: Columna: columna DEAE Sepharose CL-6B (tamaño de columna 10 ml, fabricada por Pharmacia)

: Disolvente: disolución tampón de fosfato de sodio 10 mM (pH 8,0)

: Velocidad de flujo: 1 ml/minuto

: Elución: gradiente de concentración lineal de cloruro sódico 1 M (0-50%, 180 minutos)

El eluato se fraccionó en muestras de 5 ml. El título de anticuerpos del anticuerpo de la oculospanina anti-humana en cada fracción se comprobó mediante el procedimiento de ELISA usando proteína oculospanina humana. Primero, una disolución de fracción de membrana preparada a partir de células que expresan la oculospanina humana preparadas en el ejemplo 3 se añadió a una microplaca de 96 pocillos para ELISA en una cantidad de 100 \mul/pocillo y se mantuvo caliente a 37ºC durante una hora. Entonces, la disolución de fracción de membrana se desechó y cada pocillo se lavó tres veces con 100 \mul de PBS-Tween por pocillo. Entonces se añadieron 100 \mul de PBS que contenía 2% de albúmina de suero bovino por pocillo y se mantuvo caliente a 37ºC durante una hora. Después de lavar tres veces con 100 \mul de PBS-Tween por pocillo se añadieron 100 \mul de la fracción de elución y se mantuvo caliente a 37ºC durante una hora. Además, después de lavarse los pocillos tres veces con 100 \mul de PBS-Tween por pocillo, se añadió anticuerpo inmunoglobulina anti-ratón marcado con peroxidasa de rábano picante (preparado por Amersham) diluido 2000 veces en PBS-Tween en una cantidad de 100 \mul/pocillo y se dejó reaccionar a 37ºC durante una hora, y luego se lavó tres veces con 100 \mul de PBS-Tween por pocillo. Posteriormente se añadió un sustrato para la peroxidasa de rábano picante (preparada por BioRad) en una cantidad de 100 \mul/pocillo y se dejó reposar durante 5 minutos, y después de esto se midió la absorbancia de cada pocillo a 415 nm usando un lector de microplacas.

Por consiguiente, las fracciones que presentan alta absorbancia se recogieron y se cargaron en dos columnas de purificación por afinidad de anticuerpos (columna Hitrap Protein G, volumen de columna: 5 ml, fabricada por Pharmacia). Después de lavar el interior de las columnas con 25 ml de tampón de equilibrio (20 mM, tampón de fosfato sodio (pH 7,0) por columna, el anticuerpo monoclonal se eluyó usando 15 ml de un tampón de elución (clorhidrato de glicina 0,1 M (pH 2,7)) por columna. Cada eluato se recogió en un tubo de ensayo que contenía 1,125 ml de Tris-clorhidrato 1 M (pH 9,0). Inmediatamente después de completarse la elución, el eluato se cargó sobre la parte superior de un ultrafiltro de centrifugación - forma de tubo (Centriprep 10 fabricado por Grace Japan) y se centrifugó a 3000 \times g a 4ºC durante 2 horas. Después de eliminarse el filtrado recogido en la parte inferior del filtro se añadieron 15 ml de PBS a la parte superior y se centrifugó de nuevo a 3000 \times g y 4ºC durante 2 horas. En total, esta operación se repitió cinco veces. A la 5ª vez de operación, la operación de centrifugación se realizó hasta que la cantidad líquida en la parte superior del filtro alcanzó 0,5 ml. El líquido restante en la parte superior del filtro se usó como muestra del anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana.

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Ejemplo 6 Actividad citotóxica

La actividad citotóxica dependiente de anticuerpos se midió como un índice de bioactividad.

El número de células que expresan la oculospanina humana (ejemplo 3) se contó por el procedimiento de tinción con azul de tripano, la concentración de las células se ajustó a 1 \times 10^{6} células/ml con medio RPMI 1640 (preparado por Invitrogen, denominado en lo sucesivo "medio RPMI") que contenía 10% de suero bovino fetal (preparado por Moregate). A las células se añadieron 2,5 \mul de ácido bis(acetoximetil)2,2':6'2''-terpiridin-6,6''-dicarboxílico (agente de marcado BATDA, preparado por PerkinElmer), se agitó bien y se incubó a 37ºC en 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos mientras se mezclaba a intervalos de 15 minutos invirtiendo el cultivo. Al medio de cultivo se añadieron 10 ml de medio RPMI, se agitó y se centrifugó a 1.500 rpm durante 5 minutos. Esta operación de lavado se repitió otras dos veces. Las células que expresan la oculospanina humana marcada con BATDA así obtenidas se volvieron a suspender en 10 ml de medio RPMI 1640. Una alícuota de 50 \mul (5 \times 10^{3} células) de la disolución en suspensión se sembró en cada pocillo de una microplaca de fondo redondo de 96 pocillos, que previamente se preparó añadiendo un anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana de ratón purificado previamente ajustado con medio RPMI 1640 a una concentración de 1 \mug/ml, o el sobrenadante del medio de cultivo de hibridoma, y dejándolo reposar a 4ºC durante 30 minutos. La microplaca se dejó reposar a 4ºC durante 30 minutos adicionales. A este pocillo de control negativo se añadió o el anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana de ratón purificado o medio RPMI 1640 en lugar del sobrenadante de hibridoma.

Las células efectoras se prepararon del siguiente modo. Las células J774A.1 (disponibles de Dainippon Pharmaceutical Co. Ltd.) se cultivaron en presencia de 100 ng/ml de factor estimulante de colonias de macrófagos (preparado por Sigma) durante 3 días. El número de células J774A.1 se contó por el procedimiento de tinción con azul de tripano y luego se ajustó con medio RPMI a una concentración de 1 \times 10^{6} células/ml. En cada pocillo de la microplaca de fondo redondo de 96 pocillos mencionada anteriormente se sembró una alícuota de 100 \mul (1 \times 10^{5} células) de las células. La microplaca se centrifugó a 1.500 rpm durante 5 minutos y se incubó a 37ºC en 5% de gas CO_{2} durante 4 horas. A un pocillo de control positivo se añadió 1% de Triton-X-100 en lugar de las células efectoras con el fin de destruir completamente las células que expresan la oculospanina humana marcada con BATDA. Después de 4 horas de incubación se tomaron 20 \mul del sobrenadante de cultivo de cada pocillo y se transfirieron a una placa blanca de 96 pocillos. A la placa se añadieron 200 \mul de una disolución de europio (preparada por PerkinElmer). La placa se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos y se midió la descomposición de la fluorescencia con tiempo.

La velocidad de inducción de muerte celular en cada pocillo se calculó basándose en la siguiente ecuación:

Velocidad de inducción de muerte celular (%) = (recuento fluorescente para cada pocillo de prueba - recuento del fondo para el pocillo de control negativo)/(el recuento fluorescente para cada pocillo de control positivo - recuento del fondo para el pocillo de control negativo) x100.

En comparación con un control que sólo contenía medio RPMI 1640 se confirmó que la muerte celular de las células que expresan la oculospanina humana se indujo por la adición del anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana de ratón purificado o el sobrenadante de hibridoma.

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Ejemplo 7

Preparación de células que expresan la oculospanina humana y su fracción de membrana como inmunógeno y antígeno para detectar anticuerpo a) Construcción del plásmido pEF/DEST51-NM_031945

El ADNc de NM_031945 obtenido en el ejemplo 2a) se clonó en el vector pENTR/D-TOPO usando el kit de clonación pENTR Directional TOPO Cloning Kit (preparado por Invitrogen) según el protocolo proporcionado. El ADNc de NM_031945 se mezcló con el vector pENTR/D-TOPO que tenía topoisomerasa unida al mismo en un tampón de reacción proporcionado con el kit y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Usando el producto de reacción obtenido, la E. coli químicamente competente OneShot TOP10 (preparada por Invitrogen) se transformó y se cultivó en medio agar LB que contenía 50 \mug/ml de kanamicina. Las colonias de E. coli resultantes resistentes a kanamicina se seleccionaron y se cultivaron en 1 ml de medio TB líquido que contenía 50 \mug/ml de kanamicina a 37ºC durante la noche. El ADN de plásmido se aisló y se purificó usando un kit Montage Plasmide Miniprep_{96} Kit (preparado por Millipore). A continuación, el ADN de plásmido así obtenido se sometió a una reacción de secuenciación realizada usando un kit de reacción BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit según el protocolo proporcionado, la secuencia de nucleótidos se analizó usando un analizador de ADN ABI PRISM 3100 (fabricado por Applied Biosystem). Como resultado se confirmó que el ADNc (ID de secuencia nº 1 de la lista de secuencias) que tenía un marco de lectura abierto de la secuencia de nucleótidos representada por el nº de registro NM_031945 se integró en el vector pENTR/D-TOPO.

Entonces, el gen se transfirió al vector de expresión pcDNA3.1/DEST40 (preparado por Invitrogen) usando el sistema GATEWAY^{TM}. Más específicamente, 4 \mul de mezcla de enzimas GATEWAY^{TM}-LR Clonase^{TM} (preparada por Invitrogen), 4 \mul de tampón de reacción de LR, 0,3 \mug de pENTR/D-TOPO-NM_031945 y 0,3 \mug de pcDNA3.1/DEST40 se mezclaron con tampón TE para preparar una disolución de 20 \mul que se dejó reaccionar a 25ºC durante una hora. Después de completarse la reacción se añadieron 2 \mul de proteinasa K y se realizó una reacción a 37ºC durante 10 minutos. La E. coli químicamente competente OneShot TOP10 (preparada por Invitrogen) se transfectó con el producto de reacción y se cultivó sobre medio agar LB que contenía 50 \mug/ml de ampicilina. Las colonias de E. coli resultantes resistentes a ampicilina se seleccionaron y se cultivaron en 100 ml de medio LB líquido que contenía 50 \mug/ml de ampicilina a 37ºC durante la noche. Como resultado, el ADN de plásmido (pcDNA3.1/DEST40-NM_031945) se aisló y se purificó usando el kit Plasmid MAXI Kit (preparado por Qiagen).

Similarmente, el gen se transfirió al vector de expresión pEF/DEST51 (preparado por Invitrogen) usando el sistema GATEWAY^{TM}. Para explicarlo más específicamente, 4 \mul de mezcla de enzimas GATEWAY^{TM}-LR Clonase^{TM} (preparada por Invitrogen), 4 \mul de tampón de reacción de LR, 0,3 \mug de pENTR/D-TOPO-NM_031945 y 0,3 \mug de pEF/DEST51 se mezclaron con tampón TE para preparar una disolución de 20 \mul y se dejó reaccionar a 25ºC durante una hora. Después de la reacción se añadieron 2 \mul de proteinasa K y se dejó reaccionar a 37ºC durante 10 minutos. La E. coli químicamente competente OneShot TOP10 (preparada por Invitrogen) se transformó con el producto de reacción obtenido y se cultivó sobre medio agar LB que contenía 50 \mug/ml ampicilina. Las colonias de E. coli resultantes resistentes a ampicilina se seleccionaron y se cultivaron en 100 ml de medio TB líquido que contenía 50 \mug/ml de ampicilina a 37ºC durante la noche. Como resultado, el ADN de plásmido (pEF-DEST51-NM 031945) se aisló y se purificó usando el kit Plasmid MAXI Kit (preparado por Qiagen).

b) Transfección de células BALB-3T3 y células 293T con el plásmido pEF-DEST51-NM_031945

Las células BALB-3T3 (disponibles de RIKEN, clon A31) se cultivaron en placas de cultivo de células de 330 150 mm (área de cultivo: 148 cm^{2}, fabricadas por IWAKI) que contenían medio de Eagle modificado de Dulbecco (denominado en lo sucesivo "DMEM", preparado por SIGMA) complementado con 10% de suero bovino (preparado por GIBCO; denominado en lo sucesivo "BS") a 37ºC en 5% de gas CO_{2} hasta un estado semiconfluente. Después de esto, las células BALB-3T3 se transfectaron con plásmido pEF-DEST51-NM_031945. La transfección de células BALB-3T3 se realizó mediante lipofección usando el reactivo de transfección Geneporter^{TM} 2 preparado por Gene Therapy Systems. Más específicamente, las células se lavaron una vez con medio sin suero (DMEM) y se añadieron 20 ml del medio sin suero (DMEM). Entonces, a un tubo de Falcon de 50 ml se añadieron 6 ml de New DNA diluent y 24 \mug de ADN de plásmido (pEF-DEST51-NM_031945) recuperado mediante el procedimiento anteriormente mencionado y se mezclaron. A otro tubo de Falcon de 50 ml se añadieron 0,35 ml de un medio sin suero (Opti-MEM I, preparado por GIBCO) y 84 \mul del reactivo Geneporter^{TM} 2 y se mezclaron. La disolución de ADN y la disolución de Geneporter^{TM} 2 se mezclaron y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después de esto, la mezcla de las disoluciones con ADN-Geneporter^{TM} 2 se añadió a las células (1 ml/placa) y se cultivó a 37ºC en 5% de CO_{2}. Después de 3 horas, el medio se sustituyó por 20 ml de DMEM que contenía 10% de suero bovino por placa y se cultivó a 37ºC durante la noche en 5% de CO_{2}.

Además, el plásmido pEF-DEST51-NM_031945 se introdujo en células 293T del siguiente modo. La introducción en las células 293T se realizó usando el reactivo LIPOFECTAMINE 2000 (preparado por Invitrogen). Las células 293T se sembraron a una densidad de 2,5 \times 10^{5} células/9,2 cm^{2} y se cultivaron a 37ºC durante la noche en 5% de CO_{2}. En un tubo de polipropileno de 5 ml se mezclaron 10 \mul de reactivo LIPOFECTAMINE 2000 y 250 \mul de medio reducido en suero OPTI-MEM I (preparado por Invitrogen) y se dejaron reaccionar entre sí a temperatura ambiente durante 5 minutos. En otro tubo de polietileno de 5 ml se mezclaron 4 \mug de plásmido (pEF-DEST51-NM_031945) y 250 \mul de medio reducido en suero OPTI-MEM I. La disolución de LIPOFECTAMINE y la disolución de ADN se mezclaron y se dejaron reaccionar entre sí a temperatura ambiente durante 20 minutos. El sobrenadante se eliminó de las células 293T cultivadas durante la noche y se añadió un medio de Eagle modificado de Dulbecco sin antibiótico (preparado por Gibco) que contenía 10% de suero bovino fetal (preparado por Moregate) a las células en una cantidad de 2 ml/9,2 cm^{2}. La mezcla de las disoluciones de LIPOFECTAMINE-ADN se añadió a las células 293T y se incubó a 37ºC en 5% de gas CO_{2} durante 2 días.

c) Preparación de la fracción de membrana celular (10 litros)

Las células cultivadas por el procedimiento anteriormente mencionado se lavaron con una disolución tampón de PBS (-) (preparada por Dainippon Pharmaceutical Co. Ltd). Las células se recogieron usando una rasqueta de células (fabricada por IWAKI) y se suspendieron en 230 ml de una disolución de tampón Tris 5 mM, pH 7,4. La disolución de células resultante se dejó reposar a 4ºC durante 30 minutos. Las células se trituraron usando un homogeneizador Dounce tipo B (50 emboladas) y se centrifugaron a 1000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se recuperó y se centrifugó a 1.000 g durante 10 minutos usando un aparato de ultracentrifugación (fabricado por KUBOTA) y el sobrenadante se recuperó.

El sobrenadante se centrifugó a 78.000 g durante 100 minutos usando un aparato de ultracentrifugación (fabricado por BECKMAN) y el precipitado se recuperó. Al precipitado se añadieron 14 ml de 57% de sacarosa en tampón Tris y se sometió a gradiente de densidad de azúcar a 78.000 g durante 16 horas a 4ºC. Como resultado, el fragmento de membranas de la fase superior se recuperó. A la fracción de membrana se añadieron 55 ml de tampón Tris 5 mM, pH 7,4, y se centrifugó a 78.000 g durante 60 minutos a 4ºC. El precipitado se recuperó. Al precipitado se añadieron 1500 \mul de tampón Tris 5 mM, pH 7,4, y entonces la disolución de células se homogeneizó por el homogeneizador Dounce tipo B (10 emboladas). La fracción de membrana se identificó usando un procedimiento de transferencia de Western descrito en la sección "Confirmación de la expresión".

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Ejemplo 8 Inmunización de ratón y fusión de células a) Inmunización

1\times10^{7} células de las células que expresan el gen de la oculospanina humana obtenidas en el ejemplo 7 se inyectaron intraperitonealmente a ratones BALB/c hembra que tenían 5 semanas de edad (comprados de Japan SLC Inc.) Después de 2, 4, 6 y 8 semanas, las células que expresan el gen de la oculospanina humana (1\times10^{7} células/ratón) se inyectaron intraperitonealmente como un refuerzo del mismo modo.

b) Fusión de células

Se extirpó el bazo de un ratón el cuarto día después de la inmunización de refuerzo y se añadió a 10 ml de un medio MEM sin suero (9,4 g/l, medio MEM de Eagle "Nissui"(1): preparado por Nissui Pharmaceutical Co. Ltd. denominado en lo sucesivo "medio MEM sin suero") que contenía tampón HEPES 10 mM (pH 7,4), 0,02 mg/l de hidrogenocarbonato de sodio y 300 \mug/ml de ácido L-glutámico, y entonces las células del bazo se extrajeron usando un aguja de 21G' y pinzas. La disolución en suspensión de células se centrifugó para precipitar las células del bazo. Las células del bazo se lavaron dos veces con el medio MEM sin suero y se suspendieron en medio MEM sin suero y se contó el número de células.

Las células de mieloma SP2/0 se cultivaron en medio de crecimiento de mieloma (denominado en lo sucesivo "medio ME") que contenía 15% de SBF (preparado por GIBCO), 306 \mug/ml de ácido glutámico y \beta-mercaptoetanol 0,05 mM a 37ºC en presencia de 7% de gas dióxido de carbono de forma que la densidad celular no superara 1 \times 10^{6} células/ml. Las células de mieloma SP2/0 así cultivadas se lavaron con el medio MEM sin suero y se suspendieron en medio MEM sin suero y se contó el número de células.

Se mezclaron las células que contenían la disolución en suspensión de células SP2/0, cuyo número se correspondía con aproximadamente 1/5 de las células del bazo, y la disolución en suspensión de todas las células del bazo. Después de la centrifugación, el sobrenadante se eliminó completamente. La operación de fusión de células de más adelante se realizó manteniendo un tubo de centrífuga que contenía el sedimento a temperatura ambiente. Al sedimento se añadieron lentamente 1 ml de 40% (peso/volumen) de polietilenglicol 4000 (preparado por Merck) mientras se agitaba el tubo de centrífuga. Después de esto se añadieron cuidadosamente 9 ml de medio MEM sin suero previamente calentado a 37ºC en tres veces. Después de la centrifugación, el sobrenadante se eliminó y se añadió medio de hipoxantina-aminopterina-timidina (denominado en lo sucesivo "medio HAT"; preparado por SIGMA) que contenía 20% de SBF usando una pipeta mientras se agitaba cuidadosamente con la punta de la pipeta de forma que la densidad celular fuera 2,5 \times 10^{6} células/ml. El medio HAT se dispensó a microplacas de cultivo de células de 96 pocillos en una cantidad de 100 \mul/pocillo y se cultivó a 37ºC en presencia de 7% de gas dióxido de carbono. Después de un día se añadió medio HAT nuevo a todos los pocillos en una cantidad de 100 \mul/pocillo y después de esto el medio se sustituyó por medio fresco a intervalos de 2 a 3 días. Las células fusionadas así obtenidas se sometieron a cribado mediante análisis de dilución limitante como se menciona a continuación.

c) Dilución limitante

La disolución de cultivo que contenía las células fusionadas obtenidas en la sección (b) anterior se diluyó seriadamente de forma que la densidad de células fusionadas en el medio HAT (medio HT en el caso de la 2ª clonación o posterior) fuera 1 célula/pocillo (10 células/ml) y 5 células/pocillo (50 células/ml). Cada una de las muestras así preparadas se dispensó en una cantidad de 100 \mul por pocillo a una microplaca de 96 pocillos que ya contenía 100 \mul de medio HT, y las microplacas se cultivaron a 37ºC en presencia de 7% de gas dióxido de carbono durante 10 días.

d) Cribado d-1) ELISA

La fracción de membrana celular obtenida en el ejemplo 7 se preparó en una disolución de 1 \mug/ml dispensado a una placa EIA de 96 pocillos (fabricada por COSTAR) en una cantidad de 50 \mul/pocillo. Después de dejar reposar la placa a 4ºC durante un día, la disolución de antígeno dentro de la placa se desechó agitando bien y se añadió por pocillo 80 \mul de una disolución que contenía 1% de BSA en PBS(-). La placa se cerró herméticamente y se almacenó a 4ºC hasta uso. Cuando se usó, la placa se volvió a llevar a temperatura ambiente y se lavó tres veces usando un Serawasher (fabricado por Bio-Tec) a través del cual se suministró PBS (PBS-T) que contenía 0,1% de Tween 20. Como anticuerpo primario se añadieron a cada pocillo 50 \mul de sobrenadante de cultivo celular obtenido después de 10 a 12 días de la fusión de células y se dejó reposar a temperatura ambiente durante una hora. Después de completarse la reacción con el anticuerpo primario, la placa se lavó tres veces con PBS-T y anticuerpo IgG anti-ratón marcado con fosfatasa alcalina (preparado por BIO SOURCE), se diluyó 5000 veces con una disolución (disolución de dilución de antígeno) que contenía 0,5% de BSA añadido a PBS-T, se añadió a los pocillos en una cantidad de 50 \mul/pocillo y se dejó reposar a temperatura ambiente durante una hora. Después de completarse la reacción con el anticuerpo secundario se añadió un sustrato emisor de color para fosfatasa alcalina, el fosfato de p-nitrofenilo, 2Na6H_{2}O (pNPP, preparado por Wako Pure Chemical Industries Ltd.) devuelto hasta temperatura ambiente se disolvió a una concentración de 1 mg/ml en tampón pNPP (97 ml/l de dietanolamina, 0,1 g/l de MgCl_{2} 6H_{2}O, pH 9,8) y se añadió a los pocillos en una cantidad de 100 \mul/pocillo. La absorbancia se midió a 405 nm y 630 nm usando un lector de placas (fabricado por Nalgene Nunc International).

d-2) Citometría de flujo

Las células de cultivo HEK293 obtenidas en el ejemplo 7 se cultivaron en medio DMEM que contenía 10% de SBF a 37ºC en 5% de gas CO_{2}. Después de la transfección, las células se cultivaron durante 24 horas y se preparó una disolución de suspensión celular de manera que contuviera 2 \times 10^{7} células/ml. La disolución en suspensión de células se dispensó a microplacas con fondo en forma de V de 96 pocillos (fabricadas por Coming) en una cantidad de 50 \mul/pocillo y se sometieron a centrifugación (1000 \times g, 20ºC durante 5 minutos). El sobrenadante se eliminó y el sobrenadante de las células fusionadas cultivadas en la etapa (c) anterior se añadió a una cantidad de 50 \mul/pocillo, se agitó, se dejó reposar sobre hielo durante 0,75 horas, se centrifugó (1000 \times g, 20ºC durante 5 minutos) y luego se eliminó el sobrenadante. El sedimento se lavó dos veces con una disolución de tampón de citometría de flujo (MEM que contenía 5% de SBF) en una cantidad de 150 \mul/pocillo. Después de esto, al sedimento se añadieron 100 \mul de anticuerpo IgG de anti-ratón de conejo diluido 33 veces (preparado por Wako Pure Chemical Industries Ltd.) marcado con 5-isotiocianato de fluoresceína (denominado en lo sucesivo "FITC") como un anticuerpo secundario, se dejó reposar sobre hielo durante 0,75 horas y se sometió a centrifugación (1000 \times g, 20ºC durante 5 minutos). El sobrenadante se eliminó, el sedimento se lavó dos veces con tampón de citometría de flujo usando 150 \mul/pocillo y se suspendió en el tampón de citometría de flujo en una cantidad de 500 \mul/pocillo. Éste se usó como una muestra para citometría de flujo. En cada muestra, la intensidad de la fluorescencia FITC emitida de las células se midió por citometría de flujo (FC500, fabricado por BECKMAN) a una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de detección de 530 nm. Como resultado, las células fusionadas se seleccionaron de la muestra que presentaba mayor intensidad fluorescente FITC que aquellas de células HEK293 de expresión transitoria a las que no se añadió el sobrenadante del cultivo de células de fusión.

e) Clonación

Las células seleccionadas en la etapa (d) anterior se sometieron dos veces a las operaciones de una serie de etapas c) a d). Como resultado se obtuvieron varios clones de hibridoma que produjeron un anticuerpo monoclonal que se une a células HEK293 de expresión transitoria, pero que no se une a células en las que no se ha introducido el plásmido de expresión de la oculospanina anti-humana. Una de las cepas de hibridoma así clonada se designó O3B8-2C9-4F3 y se depositó en el International Patent Organism Depositary del National Institute of Advanced Industrial Science Technology el 17 de febrero de 2004 bajo el número de depósito FERM BP-08627.

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Ejemplo 9 Purificación de anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana

El hibridoma de ratón-ratón preparado en el ejemplo 8 se suspendió en medio HY a una concentración de 1 \times 10^{6} células/ml y se dejó reposar a 37ºC en presencia de 7% de dióxido de carbono durante 3 días. La disolución de cultivo así obtenida se centrifugó a 1.600 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se recuperó y la IgG se purificó de forma bruta del siguiente modo:

: Tampón de unión: pH 7,0 (Na_{2}HPO_{4}\cdot12H_{2}O 20 mM, Na_{2}HPO_{4}\cdot2H_{2}O 20 mM)

: Tampón de elución: pH 3,0, glicina-HCl 100 mM

: Tampón de neutralización: pH 9,0, Tris-HCl 1 M

Se tomó una alícuota requerida de vehículo de proteína G (preparado por Amersham Biosciences). Después de eliminarse el etanol, la alícuota del vehículo de proteína G se lavó dos veces con agua ultrapura y se lavó una vez con el tampón de unión. El tampón de unión se añadió al vehículo de la alícuota de proteína G para preparar una suspensión en gel del 50%. La suspensión en gel de proteína G se añadió al sobrenadante del hibridoma. La mezcla resultante se centrifugó a 4ºC durante 24 horas y se lavó tres veces con el tampón de unión. Después del lavado, el tampón de elución se añadió para permitir que el anticuerpo se eluyera. El eluato se recogió en un tubo que contenía tampón de neutralización en una cantidad de 1/10 del tampón de elución. El eluato se cargó sobre la parte superior de un ultrafiltro de un tubo de muestra (Amicon Ultrafree-MC: fabricado por Millipore) y se centrifugó a 5000 x g, 4ºC durante 20 minutos. Mientras se eliminaba el filtrado recogido en la parte inferior del filtro, el eluato se añadió de forma que la cantidad de líquido en la parte superior del filtro fuera al menos 50 \mul. Después de añadirse la cantidad total de eluato, el PBS (-) se añadió al volumen 3 veces mayor que el eluato. De este modo se realizó el intercambio de tampón. El líquido restante en la parte superior del filtro se trató como la muestra de anticuerpo de la oculospanina anti-humana.

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Ejemplo 10 Actividad citotóxica

La actividad citotóxica dependiente de anticuerpos se midió como un índice de la actividad biológica. El número de células que expresan la oculospanina humana preparadas en el ejemplo 7 se contó mediante el procedimiento de tinción con azul de tripano y después de esto la concentración de las células se ajustó con medio RPMI 1640 (preparado por Invitrogen, denominado en lo sucesivo "medio RPMI") que contenía 10% de suero bovino fetal (preparado por Moregate) a 8 \times 10^{5} células/0,4 ml. Entonces se añadieron 40 \mul de cromo 51 (cromato de sodio preparado por Amersham Bioscience) a las células, las células se incubaron a 37ºC en 5% de CO_{2} durante 2 horas. A las células se añadieron 8 ml de medio RPMI, se agitaron y luego se centrifugaron a 1.500 rpm durante 5 minutos. Esta operación de lavado se repitió otras dos veces. Las células que expresan la oculospanina humana marcada con cromo 51 así obtenidas se volvieron a suspender en 4 ml de medio RPMI y se sembraron en una placa de fondo redondo de 96 pocillos en la que ya estaban presentes 50 \mul de 5 \mug/ml de anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana de ratón purificado ajustado con medio RPMI en una cantidad de 50 \mul (1 \times 10^{4} células) por pocillo y se dejaron reposar a 4ºC durante 30 minutos. En un pocillo de control negativo o pocillo de medición del fondo, el medio RPMI se añadió en lugar del anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana de ratón purificado.

Las células efectoras se prepararon como se menciona a continuación. Se tomaron células del bazo de ratón BALB/c-nu/nu (hembra, 7 semanas de edad) según el procedimiento habitual. Entonces se contó el número de células mediante el procedimiento de tinción con azul de tripano, la concentración de las células se ajustó con medio RPMI a 1,5 \times 10^{7} células/ml. Las células se sembraron en microplacas de fondo redondo de 96 pocillos en una cantidad de 100 \mul (1,5 \times 10^{6} células) por pocillo, se centrifugaron a 1.500 rpm durante 5 minutos y se incubaron a 37ºC en 5% de CO_{2} durante 4 horas. Al pocillo de control positivo se añadió 2% de Triton-X-100 en lugar de las células efectoras con el fin de destruir completamente las células que expresan la oculospanina humana marcadas con cromo 51. Al pocillo de medición del fondo se añadió el medio RPMI en lugar de las células efectoras. A continuación, la incubación se realizó durante 4 horas, se tomaron 50 \mul del sobrenadante de cultivo de cada uno de los pocillos y se transfirieron a una placa Luma de 96 pocillos (fabricada por PerkinElmer). La placa se deshidrató a 50ºC durante la noche, se midió la cantidad de cromo 51 en cada pocillo mediante un contador de centelleo para microplacas (TopCourt NTX, fabricado por PerkinElmer).

La velocidad a la que se indujo la muerte celular en cada pocillo se calculó según la siguiente fórmula:

Velocidad de inducción de muerte celular (%) = (recuento de radiactividad para cada pocillo de prueba - recuento del fondo para el pocillo de control negativo)/(el recuento de radiactividad para el pocillo de control positivo - recuento del fondo para el pocillo de control negativo) \times 100.

En comparación con el control negativo se confirmó que la adición del anticuerpo monoclonal de la oculospanina anti-humana de ratón purificado (Figura 5) indujo muerte celular en las células que expresan la oculospanina humana.

Aplicabilidad industrial

Se encontró que el nivel de expresión de la oculospanina humana en melanoma es significativamente alto. Según la presente invención se proporciona un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a la proteína oculospanina humana que tiene una secuencia de aminoácidos representada por ID de secuencia nº 2 de la lista de secuencias y/o una secuencia de aminoácidos representada por ID de secuencia nº 4 de la lista de secuencias y que tiene actividad citotóxica celular dependiente de anticuerpos contra células que expresan esa proteína, una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo de la invención; un anticuerpo según la invención para uso como medicamento; el uso de un anticuerpo según la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, por ejemplo, cáncer de piel, tal como melanoma y un anticuerpo según la invención para uso en el tratamiento de cáncer; por ejemplo cáncer de piel, tal como melanoma.

Texto sin lista de secuencias

ID de secuencia nº 5: cebador sentido de PCR para la amplificación de oculospanina humana.

<110> SANKYO COMPANY, LIMITED

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<120> Anticuerpos para el antígeno específico del cáncer

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<130> FP0408

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<140>

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<141>

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<150> JP2003-063648

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<151> 03-10-2003

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<160> 6

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 1065

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1065)

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<223> Inventor: Ichikawa, Kimihisa; Takahashi, shu; Agatsuma Toshinori; Fukuchi, Keisuke; Hirai Takehiro

\newpage

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<400> 1

1

2

3

4

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<210> 2

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<211> 355

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

5

6

7

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<210> 3

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<211> 1601

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (65)..(1129)

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<400> 3

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\hskip1cm

8

9

10

11

12

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<210> 4

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<211> 355

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 4

13

14

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<210> 5

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador sentido de PCR para OCSP

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<400> 5

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\hskip1cm

100

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<210> 6

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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\hskip1cm

101

Claims

1. Un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a la proteína oculospanina humana que tiene una secuencia de aminoácidos representada por ID de secuencia nº 2 de la lista de secuencias y/o una secuencia de aminoácidos representada por ID de secuencia nº 4 de la lista de secuencias y tiene actividad citotóxica celular dependiente de anticuerpos contra una célula que expresa esa proteína.

2. Un anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho anticuerpo se produce por hibridoma de ratón designado O3B8-2C9-4F3 y depositado en el International Patent Organism Depositary del National Institute of Advanced Industrial Science Technology bajo el número de depósito FERM BP 08627.

3. Un anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicho anticuerpo es humanizado.

4. Un anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho anticuerpo es un anticuerpo humano completo.

5. Un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicho anticuerpo es un anticuerpo IgG.

6. Una composición farmacéutica que comprende al menos uno de los anticuerpos según las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para uso como medicamento.

8. El uso de un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer.

9. El uso de un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer de piel.

10. El uso de un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de melanoma.

11. Un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para uso en el tratamiento de cáncer.

12. Un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para uso en el tratamiento de cáncer de piel.

13. Un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para uso en el tratamiento de melanoma.