ES2963717T3 - Métodos y composiciones para el diagnóstico y tratamiento del cáncer - Google Patents

Métodos y composiciones para el diagnóstico y tratamiento del cáncer Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere a la identificación de secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos que son características de tejidos tumorales tales como tejidos de tumores de ovario y tumores de pulmón y que representan dianas para terapia o diagnóstico de enfermedades tumorales en un sujeto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para el diagnóstico y tratamiento del cáncer
El cáncer es un importante problema de salud en todo el mundo y sigue estando entre las principales causas de muerte.
El cáncer de ovario es un crecimiento canceroso que surge de un ovario. El cáncer de ovario es la quinta causa de muerte por cáncer en las mujeres y la primera causa de muerte por cáncer ginecológico. Una mujer tiene un riesgo de por vida de sufrir cáncer de ovario de alrededor del 1.5 %, lo que lo convierte en la segunda neoplasia maligna ginecológica más común.
El diagnóstico de cáncer de ovario se puede sospechar a partir de un examen físico anormal (incluido un examen pélvico), un análisis de sangre (para CA-125, más específicamente) o de estudios de imágenes médicas. El diagnóstico se puede confirmar con un procedimiento quirúrgico para inspeccionar la cavidad abdominal, tomar biopsias y buscar células cancerosas en el líquido abdominal. El tratamiento suele incluir quimioterapia y cirugía y, a veces, radioterapia.
Existe un mayor riesgo de cáncer de ovario en mujeres mayores y en aquellas que tienen un familiar de primer o segundo grado con la enfermedad. Las formas hereditarias de cáncer de ovario pueden ser causadas por mutaciones en genes específicos (sobre todo BRCA1 y BRCA2). Las mujeres infértiles y las que padecen una afección llamada endometriosis, las que nunca han estado embarazadas y las que usan terapia de reemplazo de estrógenos posmenopáusica tienen un mayor riesgo. El uso de píldoras anticonceptivas orales es un factor protector. El riesgo también es menor en mujeres a las que se les han bloqueado quirúrgicamente las trompas uterinas (ligadura de trompas).
El cáncer de ovario suele tener un mal pronóstico. Es desproporcionadamente mortal porque carece de una detección temprana o prueba de cribado clara, lo que significa que la mayoría de los casos no se diagnostican hasta que alcanzan estadios avanzados. Más del 60 % de los pacientes que presentan este cáncer ya tienen cáncer en estadio III o IV, cuando ya se ha extendido más allá de los ovarios. Los cánceres de ovario arrojan células al líquido natural dentro de la cavidad abdominal. Estas células pueden implantarse en otras estructuras abdominales (peritoneales), incluido el útero, la vejiga urinaria, el intestino y el revestimiento de la pared intestinal (omento). Estas células pueden comenzar a formar nuevos crecimientos tumorales incluso antes de que se sospeche de cáncer.
La tasa de supervivencia a cinco años para todas los estadios del cáncer de ovario es del 45.5 %. En los casos en los que el diagnóstico se realiza en una etapa temprana de la enfermedad, cuando el cáncer todavía está confinado al sitio primario, la tasa de supervivencia a cinco años es del 92.7 %.
Las principales categorías de tumores de ovario son las siguientes: Tumores epiteliales, que representan aproximadamente el 75 % de todos los tumores de ovario y entre el 90 y el 95 % de las neoplasias malignas de ovario; Tumores del estroma del cordón sexual, que representan alrededor del 5-10 % de todas las neoplasias ováricas; Tumores de células germinales, que representan alrededor del 15-20 % de todas las neoplasias ováricas; tumores metastásicos, que representan alrededor del 5 % de las neoplasias malignas de ovario y que suelen surgir de cánceres de mama, colon, endometrio, estómago y cuello uterino. El cáncer de ovario se forma más comúnmente en el revestimiento del ovario (lo que resulta en cáncer de ovario epitelial) o en los óvulos (lo que resulta en un tumor de células germinales).
El tumor epitelial-estroma de superficie, también conocido como carcinoma epitelial de ovario, es el tipo más común de cáncer de ovario. Los tumores epiteliales-estromales de superficie son una clase de neoplasias ováricas que pueden ser benignas o malignas. Se cree que las neoplasias de este grupo se derivan del epitelio de la superficie del ovario (peritoneo modificado) o del tejido endometrial ectópico o de las trompas de Falopio. Los tumores epitelialesestromales de superficie incluyen el tumor seroso, el tumor endometrioide y el cistoadenocarcinoma mucinoso.
El cáncer de pulmón es una enfermedad de crecimiento celular descontrolado en los tejidos del pulmón. Este crecimiento puede provocar metástasis, que es la invasión del tejido adyacente y la infiltración más allá de los pulmones. El cáncer de pulmón, la causa más común de muerte relacionada con el cáncer en hombres y la segunda más común en mujeres (después del cáncer de mama), es responsable de 1.3 millones de muertes anualmente en todo el mundo.
Los tumores de pulmón incluyen cánceres epidermoides y adenocarcinomas. La gran mayoría de los cánceres de pulmón son carcinomas, neoplasias malignas que surgen de las células epiteliales. El cáncer de pulmón puede caracterizarse por cinco criterios histopatológicos. Se distingue entre carcinoma epitelial escamoso, adenocarcinoma, carcinoma de células grandes, carcinoma adenoescamoso y carcinoma de pulmón de células pequeñas (SCLC). Los primeros cuatro se citan como no SCLC (NSCLC) en la literatura.
El carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) a veces se trata con cirugía, mientras que el carcinoma de pulmón de células pequeñas (SCLC) suele responder mejor a la quimioterapia y la radiación.
El cáncer de pulmón se puede observar en una radiografía de tórax y en una tomografía computarizada (TAC). El diagnóstico se confirma con una biopsia. Esto generalmente se realiza mediante broncoscopia o biopsia guiada por TAC. El tratamiento y el pronóstico dependen del tipo histológico de cáncer, el estadio (grado de diseminación) y el estado funcional del paciente. Los posibles tratamientos incluyen cirugía, quimioterapia y radioterapia. Con tratamiento, la tasa de supervivencia a cinco años es del 14 %.
El sistema inmunitario tiene la capacidad de reconocer y destruir células mediante dos modalidades distintas: inmunidad innata y adaptativa. El componente innato consta de macrófagos, células asesinas naturales (NK), monocitos y granulocitos. Estas células identifican patrones moleculares involucrados en la transformación celular y liberan diversas citocinas y mediadores inflamatorios. La respuesta innata carece de capacidad de memoria para antígenos extraños, una característica presente en la respuesta inmunitaria adaptativa. Este último componente del sistema inmunitario también presenta especificidad por antígenos extraños, impartida por la presencia de receptores en los linfocitos. Las células presentadoras de antígenos (APCs) también desempeñan un papel en la respuesta adaptativa: fagocitan antígenos extraños y los presentan a los linfocitos en el contexto del complejo mayor de histocompatibilidad. Las células T CD4+ tienen receptores que reconocen antígenos en el contexto de las moléculas MHC de clase II, lo que luego les permite liberar citocinas y activar aún más los linfocitos CD8+ (CTLs) o las células B. Los CTL son parte de la inmunidad mediada por células y son capaces de eliminar células presentadas en el contexto de moléculas MHC de clase I, mediante apoptosis o lisis celular mediada por perforina. Está ampliamente aceptado que la inmunidad mediada por células T desempeña un papel vital en la respuesta antitumoral.
Las células B están involucradas en la liberación de inmunoglobulinas y, como tales, forman parte del sistema inmunitario humoral.
Si se dirigen y potencian adecuadamente, las funciones inmunitarias pueden explotarse terapéuticamente para controlar e incluso erradicar las lesiones malignas. Los cambios genéticos y epigenéticos involucrados en la carcinogénesis generan antígenos que son reconocidos por el sistema inmunitario de forma análoga a los antígenos microbianos.
Existe una necesidad en la técnica de marcadores genéticos y dianas de tumores tales como tumores de ovario y tumores de pulmón, en particular adenocarcinomas de ovario y adenocarcinomas bronquiolares, y tumores metastásicos derivados de los mismos, que permitan el diseño de enfoques diagnósticos y terapéuticos específicos, fiables y sensibles de estas enfermedades.
La enseñanza se refiere a la terapia y diagnóstico de tumores tales como tumores de ovario y tumores de pulmón, en particular adenocarcinomas de ovario y adenocarcinomas bronquiolares, y tumores metastásicos derivados de los mismos. En particular, la enseñanza se refiere a la identificación de estructuras moleculares que están presentes en tumores tales como tumores de ovario y tumores de pulmón y pueden servir como dianas para enfoques diagnósticos y terapéuticos de estas enfermedades.
El documento de la técnica anterior Osani et al. 2007 describe células de un cáncer de mama caracterizadas por la expresión de claudina-6 e informa que la regulación negativa de claudina-6 podría contribuir a una tumorigenicidad potenciada de las células de cáncer de mama. El documento Hong et al. 2005 describe la regulación positiva de la expresión de CLDN6 en la adipogénesis. El documento EP 2011 886 describe diversos análisisin silicoque sugieren que la expresión genética de CLDN6 está regulada positivamente en diversos tejidos tumorales. Por último Lu et al.
2004 demuestran que la expresión genética de CLDN6 no es detectable en tejidos tumorales de ovario.
Sumario de la invención
La presente invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.
Sumario de la enseñanza
La presente divulgación proporciona enseñanzas que en algunos aspectos van más allá de la divulgación de la invención como tal, que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. Las enseñanzas se proporcionan para ubicar la invención real en un contexto técnico más amplio e ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Tal información técnica adicional que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención. En particular, los términos "realización", "invención" y "aspecto" no deben interpretarse como necesariamente referidos a la invención reivindicada, a menos que el tema en cuestión esté dentro del alcance de las reivindicaciones.
La presente enseñanza se refiere a la identificación de secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos que son características de tejidos tumorales tales como tejidos tumorales de ovario y pulmón, y que representan dianas para terapia o diagnóstico de enfermedades tumorales en un sujeto.
Estas secuencias abarcan proteínas identificadas por estar en la membrana plasmática de las células y accesibles en la región extracelular, de modo que las secuencias pueden ser útiles en la preparación de vacunas tumorales, incluidas vacunas profilácticas y terapéuticas.
Los ácidos nucleicos identificados según la enseñanza para expresarse en células tumorales comprenden la secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 1 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de ácido nucleico. Preferentemente, los ácidos nucleicos identificados según la enseñanza para expresarse en células tumorales codifican un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. Estos ácidos nucleicos también se denominan en este documento "ácidos nucleicos asociados a tumores" o simplemente "ácidos nucleicos tumorales".
En otro aspecto, la enseñanza se refiere a péptidos codificados por los ácidos nucleicos tumorales identificados según la enseñanza, también denominados "antígenos asociados a tumores" o simplemente "antígenos tumorales" en este documento. De acuerdo con lo anterior, los antígenos tumorales identificados según la enseñanza comprenden una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 1 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de ácido nucleico. Preferentemente, los antígenos tumorales identificados según la enseñanza comprenden la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
En un aspecto, la memoria descriptiva menciona péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos derivadas de las secuencias de los antígenos tumorales identificados según la enseñanza, también denominados "péptidos de antígenos tumorales" en este documento. Preferentemente, los péptidos de antígeno tumoral de la enseñanza son capaces de estimular una respuesta celular contra células caracterizadas por la presentación de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza con MHC de clase I y/o de provocar anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno tumoral identificado según la enseñanza cuando se usa por sí mismo o se une a un portador inmunogénico. Los péptidos antigénicos tumorales preferidos pueden presentarse, directamente o después del procesamiento, con moléculas MHC de clase I. Preferentemente, los péptidos antigénicos tumorales según la enseñanza son péptidos presentados por MHC de clase I y/o clase II o pueden procesarse para producir péptidos presentados por m Hc de clase I y/o clase II. Preferentemente, los péptidos de antígeno tumoral según la enseñanza comprenden una secuencia de aminoácidos que corresponde sustancialmente a la secuencia de aminoácidos de un fragmento de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza. Preferentemente, dicho fragmento de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza es un péptido presentado por MHC de clase I y/o clase II o es un inmunógeno que es capaz de provocar anticuerpos que se unen a dicho fragmento. Preferentemente, un péptido de antígeno tumoral según la enseñanza comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde sustancialmente a la secuencia de aminoácidos de tal fragmento y se procesa para producir tal fragmento, es decir, un péptido presentado por MHC de clase I y/o clase II derivado de un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas o un inmunógeno derivado de un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas que es capaz de provocar anticuerpos que se unen a dicho fragmento. De este modo, un péptido de antígeno tumoral según la enseñanza comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde sustancialmente a la secuencia de aminoácidos de un fragmento de un antígeno tumoral que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO. : 1 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de ácidos nucleicos y preferentemente comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde sustancialmente a la secuencia de aminoácidos de un fragmento de un antígeno tumoral que comprende la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. En una realización, un péptido de antígeno tumoral según la enseñanza comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 del listado de secuencias o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos.
La presente memoria descriptiva describe el tratamiento y/o diagnóstico de enfermedades tumorales dirigiéndose a ácidos nucleicos tumorales o antígenos tumorales. Estos métodos proporcionan la detección selectiva de células y/o la erradicación de células que expresan tales ácidos nucleicos tumorales y/o antígenos tumorales, minimizando así los efectos adversos en las células normales que no expresan tales ácidos nucleicos tumorales y/o antígenos tumorales. De este modo, las enfermedades preferidas para una terapia o diagnóstico son aquellas en las que uno o más de los ácidos nucleicos tumorales y/o antígenos tumorales identificados según la enseñanza se expresan tales como enfermedades tumorales, en particular enfermedades cancerosas tales como las descritas en este documento.
Según las enseñanzas, para dirigirse a los antígenos tumorales identificados según las enseñanzas es particularmente adecuada una parte de los antígenos tumorales que corresponde a la porción no transmembrana, en particular la porción extracelular de los antígenos tumorales o está compuesta por la misma. En una realización, dicha parte o porción comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 del listado de secuencias o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos. Por lo tanto, las entidades usadas según la enseñanza que son capaces de unirse a los antígenos tumorales identificados según la presente enseñanza son preferentemente capaces de unirse a una parte de los antígenos tumorales identificados según la enseñanza que corresponde a la porción no transmembrana, en particular la porción extracelular de los antígenos tumorales o está compuesta por los mismos. En una realización, dicha parte o porción comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 del listado de secuencias o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos. De manera similar, los péptidos y ácidos nucleicos usados según la enseñanza para inducir una respuesta inmunitaria con especificidad a los antígenos tumorales identificados según la presente enseñanza inducen preferentemente especificidad por una parte de los antígenos tumorales identificados según la enseñanza que corresponde a la región no transmembrana dicha porción, en particular la porción extracelular de los antígenos tumorales o está compuesta por los mismos. En una realización, dicha parte o porción comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 del listado de secuencias o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos. Preferentemente, dichos péptidos comprenden una secuencia que corresponde sustancialmente a una parte de los antígenos tumorales identificados según la enseñanza que corresponde a la porción no transmembrana, en particular la porción extracelular de los antígenos tumorales o está compuesta por la misma, y dichos ácidos nucleicos codifican tales péptidos. En una realización, dicha parte o porción comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 del listado de secuencias o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos.
Un aspecto de esta enseñanza se refiere a terapias para el tratamiento de enfermedades tumorales, en particular tumores de ovario y tumores de pulmón, que involucran la administración de un inhibidor de la expresión y/o actividad de un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas descritas en la memoria descriptiva.
En este aspecto, la presente enseñanza se refiere a una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de la expresión y/o actividad de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza. En una realización, dicho inhibidor es específico para un ácido nucleico tumoral identificado según la enseñanza. En otra realización, dicho inhibidor es específico para un antígeno tumoral identificado según la enseñanza. Según la enseñanza, la frase "inhibir la expresión y/o actividad" incluye una inhibición completa o esencialmente completa de la expresión y/o actividad y una reducción de la expresión y/o actividad. Preferentemente, dicha inhibición de la expresión de un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas puede tener lugar inhibiendo la producción o reduciendo el nivel de transcripción, es decir, ARNm, que codifica un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas, por ejemplo, inhibiendo la transcripción o induciendo la degradación del transcrito, y/o inhibiendo la producción de antígeno tumoral identificado según las enseñanzas, por ejemplo, inhibiendo la traducción del transcrito que codifica un antígeno tumoral identificado según la enseñanza. Preferentemente, dicha inhibición de la expresión y/o actividad de un antígeno tumoral identificado según la presente enseñanza reduce el crecimiento de las células tumorales y/o induce la muerte de las células tumorales y, de este modo, tiene un efecto inhibidor o destructor de tumores.
En una realización particular, el inhibidor de la expresión de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza es un ácido nucleico inhibidor (por ejemplo, oligonucleótido antisentido, ribozima, ARNi, ARNip o un ADN que codifica los mismos) que se hibrida selectivamente y es específico para un ácido nucleico tumoral identificado según la enseñanza, inhibiendo (por ejemplo, reduciendo) así la transcripción y/o traducción del mismo.
Los ácidos nucleicos inhibidores de esta enseñanza incluyen oligonucleótidos que tienen secuencias en la orientación antisentido con respecto a los ácidos nucleicos diana. Los oligonucleótidos inhibidores apropiados por lo general varían en longitud desde cinco a varios cientos de nucleótidos, más por lo general de aproximadamente 20-70 nucleótidos de longitud o menos, incluso más por lo general de aproximadamente 10-30 nucleótidos de longitud. Estos oligonucleótidos inhibidores pueden administrarse como ácidos nucleicos libres (desnudos) o en formas protegidas, por ejemplo, encapsulados en liposomas. El uso de formas liposomales u otras formas protegidas puede ser ventajoso ya que puede potenciar la estabilidad in vivo y de este modo facilitar la administración a los sitios diana.
Además, el ácido nucleico tumoral diana se puede usar para diseñar ribozimas que se dirijan a la escisión de los ARNm correspondientes en células tumorales. De manera similar, estas ribozimas se pueden administrar en forma libre (desnuda) o mediante el uso de sistemas de administración que potencian la estabilidad y/o la orientación, por ejemplo, liposomas.
Además, el ácido nucleico tumoral diana se puede usar para diseñar ARNip que puedan inhibir (por ejemplo, reducir) la expresión del ácido nucleico tumoral. Los ARNip se pueden administrar en forma libre (desnuda) o mediante el uso de sistemas de administración que potencian la estabilidad y/o la orientación, por ejemplo, liposomas. También pueden administrarse en forma de sus precursores o de ADN codificantes.
El ARNip comprende preferentemente una hebra de ARN sentido y una hebra de ARN antisentido, en el que las hebras de ARN sentido y antisentido forman un dúplex de ARN, y en el que la hebra de ARN sentido comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica a una secuencia diana de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos contiguos en un ácido nucleico tumoral identificado según las enseñanzas, preferentemente ARNm que codifica el antígeno tumoral diana.
En una realización adicional, el inhibidor de la actividad de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza es un anticuerpo que se une específicamente a dicho antígeno tumoral. En una realización, dicho anticuerpo se une específicamente a un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 del listado de secuencias o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos. La unión del anticuerpo al antígeno tumoral puede interferir con la función del antígeno tumoral, por ejemplo, inhibiendo la actividad de unión o la actividad catalítica.
Además, la presente enseñanza describe en la memoria descriptiva terapias para el tratamiento de enfermedades tumorales que involucran la administración de un ligando de una molécula diana, es decir, un ácido nucleico tumoral o un antígeno tumoral identificado según la enseñanza. A este respecto, se puede administrar un ácido nucleico que se hibrida selectivamente con el ácido nucleico diana o se puede administrar un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno diana, unido a unidades estructurales efectoras terapéuticas, por ejemplo, radiomarcadores, citotoxinas, enzimas citotóxicas y similares. para apuntar selectivamente y matar células que expresan estas dianas, por ejemplo, células tumorales. En una realización, dicho anticuerpo se une específicamente a un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 del listado de secuencias o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos.
En este aspecto, la presente enseñanza describe en la memoria descriptiva una composición farmacéutica, que comprende un ligando de un ácido nucleico tumoral o antígeno tumoral identificado según la enseñanza, estando unido dicho ligando a una o más unidades estructurales efectoras terapéuticas. Preferentemente, dicho ligando es específico para dicho ácido nucleico tumoral o antígeno tumoral. En una realización, dicho ligando de un ácido nucleico tumoral o antígeno tumoral reduce el crecimiento de las células tumorales y/o induce la muerte de las células tumorales y, de este modo, tiene un efecto inhibidor de tumores o destructor de tumores.
Según un aspecto adicional de la enseñanza, la identificación de ácidos nucleicos tumorales y de antígenos tumorales permite desarrollar inmunoterapias específicas basadas en atacar células tumorales que portan los antígenos identificados, retrasando o impidiendo así el desarrollo de una enfermedad tumoral o erradicando células tumorales. La inmunoterapia abarca una variedad de intervenciones y técnicas con el objetivo común de provocar respuestas inmunitarias destructivas de las células tumorales. Son posibles una variedad de enfoques clínicos que usan estos ácidos nucleicos y antígenos, como se resume a continuación. Los enfoques de la inmunoterapia contra el cáncer se pueden dividir en categorías activas y pasivas. La inmunoterapia activa puede involucrar la inmunización directa de pacientes con antígenos o ácidos nucleicos que codifican dichos antígenos en un intento de estimular las respuestas inmunitarias contra el tumor. La inmunoterapia pasiva se refiere a la administración de reactivos inmunes con el objetivo de mediar directamente las respuestas antitumorales. La presente enseñanza contempla ambos enfoques.
En este aspecto, la enseñanza se refiere a una composición farmacéutica que comprende uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en (i) un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza o de un péptido de antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral, o un derivado de dicho péptido, (ii) un ácido nucleico que codifica un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas o de un péptido de antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral, o un derivado de dicho ácido nucleico, (iii) una célula hospedadora que codifica un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas o de un péptido de antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral, (iv) un virus que codifica para un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza o de un péptido de antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral, (v) una célula que presenta un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un péptido de antígeno tumoral derivado de un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas, o un derivado de dicho péptido, (vi) un anticuerpo o receptor de células T que se une a un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas o de un péptido de antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral, (vii) una célula inmunorreactiva sensibilizada in vitro para reconocer un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza o de un péptido de antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral, y (viii) una célula efectora (o célula madre) transducida con un ácido nucleico que codifica un receptor de células T que reconoce un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas o de un péptido de antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral.
En una realización, un péptido según (i) es un péptido presentado por MHC de clase I o clase II específico de antígeno tumoral o puede procesarse para producir un péptido presentado por MHC de clase I o clase II específico de antígeno tumoral, preferentemente un péptido presentado por MHC de clase I o clase II específico de antígeno tumoral. Preferentemente, dicho péptido tiene una secuencia que corresponde sustancialmente a un fragmento de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza que se presenta por MHC de clase I o clase II, preferentemente MHC de clase I o puede procesarse para producir un fragmento peptídico que tiene tal secuencia. Preferentemente, dicho péptido es capaz de estimular una respuesta celular contra un tumor caracterizado por la presentación de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza con MHC de clase I y/o es capaz de estimular una respuesta inmunitaria humoral contra un tumor caracterizado por la expresión de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza. En una realización, dicho péptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 del listado de secuencias o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos.
En una realización, un ácido nucleico según (ii) codifica un péptido presentado por MHC de clase I o clase II específico de antígeno tumoral o codifica un péptido que puede procesarse para producir un péptido presentado por MHC de clase I o clase II específico de antígeno tumoral, preferentemente un péptido presentado por MHC de clase I específico de antígeno tumoral. Preferentemente, dicho péptido tiene una secuencia que corresponde sustancialmente a un fragmento de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza que se presenta por MHC de clase I o clase II, preferentemente MHC de clase I o puede procesarse para producir un fragmento peptídico que tiene tal secuencia. Preferentemente, dicho péptido es capaz de estimular una respuesta celular contra un tumor caracterizado por la presentación de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza con MHC de clase I y/o es capaz de estimular una respuesta inmunitaria humoral contra un tumor caracterizado por la expresión de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza. En una realización, dicho péptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 del listado de secuencias o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos. Tal ácido nucleico puede estar presente en un plásmido o un vector de expresión y puede estar unido funcionalmente a un promotor.
En una realización, una célula hospedadora según (iii) codifica un péptido presentado por MHC de clase I o clase II específico de antígeno tumoral o codifica un péptido que puede procesarse para producir un péptido presentado por MHC de clase I o clase II específico de antígeno tumoral, preferentemente un péptido presentado por MHC de clase I específico de antígeno tumoral. Preferentemente, dicho péptido tiene una secuencia que corresponde sustancialmente a un fragmento de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza que se presenta por MHC de clase I o clase II, preferentemente MHC de clase I o puede procesarse para producir un fragmento peptídico que tiene tal secuencia. Preferentemente, dicho péptido es capaz de estimular una respuesta celular contra un tumor caracterizado por la presentación de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza con MHC de clase I y/o es capaz de estimular una respuesta inmunitaria humoral contra un tumor caracterizado por la expresión de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza. En una realización, dicho péptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 del listado de secuencias o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos. La célula hospedadora puede ser una célula recombinante y puede secretar el péptido codificado o un producto de su procesamiento, puede expresarlo en la superficie y preferentemente puede expresar adicionalmente una molécula de MHC que se une a dicho péptido o un producto de su procesamiento y preferentemente presenta dicho péptido o un producto de procesión del mismo sobre la superficie celular. En una realización, la célula hospedadora expresa la molécula MHC de forma endógena. En una realización adicional, la célula hospedadora expresa la molécula MHC y/o el péptido o el producto de su procesamiento de manera recombinante. La célula hospedadora es preferentemente no proliferativa. En una realización preferida, la célula hospedadora es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica, un monocito o un macrófago.
En una realización, un virus según (iv) codifica un péptido presentado por MHC de clase I o clase II específico de antígeno tumoral o codifica un péptido que puede procesarse para producir un péptido presentado por MHC de clase I o clase II específico de antígeno tumoral, preferentemente un péptido presentado por MHC clase I específico de antígeno tumoral. Preferentemente, dicho péptido tiene una secuencia que corresponde sustancialmente a un fragmento de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza que se presenta por MHC de clase I o clase II, preferentemente MHC de clase I o puede procesarse para producir un fragmento peptídico que tiene tal secuencia. Preferentemente, dicho péptido es capaz de estimular una respuesta celular contra un tumor caracterizado por la presentación de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza con MHC de clase I y/o es capaz de estimular una respuesta inmunitaria humoral contra un tumor caracterizado por la expresión de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza. En una realización, dicho péptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 del listado de secuencias o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos.
En una realización, una célula según (v) expresa endógenamente una molécula de MHC. En una realización adicional, la célula expresa de forma recombinante una molécula de MHC y/o un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un péptido de antígeno tumoral derivado de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza. Preferentemente, la célula presenta el péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un péptido de antígeno tumoral derivado de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza, o un derivado de dicho péptido por moléculas de MHC en su superficie. Preferentemente, el péptido presentado es un péptido que tiene una secuencia que corresponde sustancialmente a un fragmento de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza que se presenta por MHC de clase I o clase II, preferentemente MHC de clase I. La célula es preferentemente no proliferativa. En una realización preferida, la célula es una célula presentadora de antígeno tal como una célula dendrítica, un monocito o un macrófago. De este modo, en una realización preferida, la célula según (v) es una célula presentadora de antígeno que comprende un péptido de antígeno tumoral como se describe en este documento presentado con MHC de clase I.
En una realización, un anticuerpo según (vi) es un anticuerpo monoclonal. En realizaciones adicionales, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, humano o humanizado, o es un fragmento de un anticuerpo o un anticuerpo sintético. El anticuerpo puede estar acoplado a una unidad estructural efectora terapéutica o a un marcador detectable. Preferentemente, el anticuerpo o receptor de células T según (vi) se une a una secuencia en el péptido que corresponde sustancialmente a un fragmento de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza. En una realización, dicho anticuerpo o receptor de células T se une a un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 del listado de secuencias o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos.
Preferentemente, una célula según (vii) se une a una secuencia en el péptido que corresponde sustancialmente a un fragmento de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza cuyo fragmento se presenta preferentemente por MHC de clase I o clase II, preferentemente MHC de clase I. En una realización, una célula según (vii) se puede obtener mediante un método que comprende las etapas de (a) proporcionar una muestra que contiene células inmunorreactivas, ya sea obtenida de un paciente o de otro individuo de la misma especie, en particular un individuo sano, o un individuo de una especie diferente, (b) poner en contacto dicha muestra con células que presentan un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde sustancialmente a un fragmento de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza, o un derivado de dicho péptido, en condiciones que favorecen la producción de CTLs contra dicho péptido, y (c) introducir los CTLs en el paciente en una cantidad adecuada para lisar células que expresan el antígeno tumoral y, preferentemente, presentarlo con MHC de clase I, tales como células tumorales.
En una realización, el método incluye clonar el receptor de células T de CTLs obtenidos y transferir el ácido nucleico que codifica el receptor de células T a células efectoras tales como CTLs o CTLs inmaduros, ya sea obtenidas de dicho paciente o de otro individuo de la misma especie, en particular un individuo sano o un individuo de otra especie, cuyas células efectoras reciben de este modo la especificidad deseada y pueden introducirse en el paciente. De esta manera se pueden producir células efectoras según (viii).
La vacunación usando agentes como se describe anteriormente puede proporcionar epítopos presentados por MHC de clase II que son capaces de provocar una respuesta de células T auxiliares CD4+ y/o una respuesta de células T CD8+ contra antígenos tumorales identificados según la enseñanza, en particular si se expresan en células. como las células tumorales. Alternativa o adicionalmente, la vacunación usando agentes como se describió anteriormente puede proporcionar epítopos presentados por MHC de clase I que son capaces de provocar una respuesta de células T CD8+ contra antígenos tumorales identificados según la enseñanza, en particular si se expresan en células tales como células tumorales. Adicionalmente, la vacunación usando agentes como los descritos anteriormente puede provocar anticuerpos específicos para un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas.
En una realización, la composición farmacéutica de la presente enseñanza es una vacuna antitumoral terapéutica o profiláctica que comprende además un agente inmunomodulador, o un ácido nucleico que codifica el mismo. En una realización, el agente inmunomodulador es un agonista de una molécula coestimuladora positiva, por ejemplo, una proteína de fusión de Ig capaz de efectuar la coestimulación de un CTL. En otra realización, el agente coestimulador es un antagonista de una molécula coestimuladora negativa, por ejemplo, un anticuerpo capaz de reducir la inhibición de la coestimulación de CTL. En una realización preferida, el agente inmunomodulador es un anticuerpo anti-CTLA4.
Una composición farmacéutica de la enseñanza puede comprender un portador farmacéuticamente aceptable y opcionalmente puede comprender uno o más adyuvantes, estabilizantes, etc.
Otro aspecto, la enseñanza descrita en la memoria descriptiva implica el uso de los agentes y composiciones de la enseñanza para un tratamiento profiláctico y/o terapéutico de enfermedades tumorales.
En un aspecto, la enseñanza proporciona métodos terapéuticos y profilácticos para tratar a un paciente que tiene una enfermedad tumoral o que está en riesgo de desarrollar una enfermedad tumoral. En un aspecto, la enseñanza proporciona métodos para inhibir el crecimiento tumoral. En un aspecto, la enseñanza proporciona métodos para inducir la muerte de células tumorales.
Preferentemente, la enfermedad tumoral es una enfermedad cancerosa, preferentemente seleccionada del grupo que consiste en cáncer de ovario, en particular adenocarcinoma de ovario y teratocarcinoma de ovario, cáncer de pulmón, incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), en particular carcinoma de células escamosas de pulmón y adenocarcinoma, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer hepático, cáncer de páncreas, cáncer de piel, en particular carcinoma de células basales y carcinoma de células escamosas, melanoma maligno, cáncer de cabeza y cuello, en particular adenoma pleomórfico maligno, sarcoma, en particular sarcoma sinovial y carcinosarcoma, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga urinaria, en particular carcinoma de células transicionales y carcinoma papilar, cáncer de riñón, en particular carcinoma de células renales incluyendo carcinoma de células renales de células claras y carcinoma de células renales papilar, cáncer de colon, cáncer del intestino delgado, incluido cáncer de íleon, en particular adenocarcinoma de intestino delgado y adenocarcinoma de íleon, carcinoma embrionario testicular, coriocarcinoma placentario, cáncer de cuello uterino, cáncer testicular, en particular seminoma testicular, teratoma testicular y cáncer testicular embrionario, y cáncer de útero, y las formas metastásicas de los mismos. En una realización, la enfermedad cancerosa se selecciona del grupo que consiste en cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de ovario metastásico y cáncer de pulmón metastásico. Preferentemente, el cáncer de ovario es un carcinoma o un adenocarcinoma. Preferentemente, el cáncer de pulmón es un carcinoma o un adenocarcinoma, y preferentemente es un cáncer bronquiolar tal como un carcinoma bronquiolar o un adenocarcinoma bronquiolar. En una realización, la célula tumoral es una célula de dicho cáncer.
Preferentemente, los agentes y composiciones descritos en este documento se administran de manera tal que la sustancia terapéuticamente activa no se administra o no se administra sustancialmente a un tejido u órgano en el que las células, cuando el tejido u órgano está libre de tumores, expresan sustancialmente un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas y/o un ácido nucleico tumoral identificado según las enseñanzas tal como tejido de placenta. Para este fin, los agentes y composiciones descritos en este documento se pueden administrar localmente. Preferentemente, los agentes y composiciones se administran en el ovario y/o los pulmones.
Según diversas realizaciones, los métodos de la enseñanza comprenden la administración de un inhibidor de la expresión y/o de la actividad de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza, de un ligando de un ácido nucleico tumoral o de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza y/o de uno o más agentes inmunoterapéuticos como se describe en este documento. En una realización, los métodos involucran administrar una composición farmacéutica como se describe en este documento a un paciente y preferentemente vacunar a un paciente con una vacuna antitumoral descrita en este documento. Según la presente enseñanza se puede usar cualquiera de la amplia variedad de métodos de vacunación conocidos en la técnica. Las vacunas antitumorales de la enseñanza son preferentemente capaces de inducir o promover la actividad de CTL contra un tumor caracterizado por la presentación de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza con MHC de clase I. Estos pueden usarse en combinación con adyuvantes, que facilitan la estimulación del sistema inmunitario al actuar sobre las células T directamente o mediante APCs. Los adyuvantes incluyen sustancias inmunomoduladoras que tienen un efecto inmunomodulador positivo, como se describe en este documento.
En diversas realizaciones, los métodos de la enseñanza involucran la estimulación de una respuesta CTL antitumoral contra células tumorales que expresan un antígeno tumoral identificado según la enseñanza y preferentemente que presentan un antígeno tumoral identificado según la enseñanza con MHC de clase I, la inhibición del crecimiento de células tumorales que expresan un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas y preferentemente que presentan un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas con MHC de clase I, y/o la inducción de la muerte de células que expresan un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas y presentando preferentemente un antígeno tumoral identificado según la enseñanza con MHC de clase I.
En un aspecto, la enseñanza proporciona un inhibidor de la expresión y/o actividad de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza, un ligando de un ácido nucleico tumoral o de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza y/o uno o más agentes inmunoterapéuticos. como se describe en este documento para su uso en los métodos de tratamiento descritos en este documento. En una realización, la enseñanza proporciona una composición farmacéutica como se describe en este documento para su uso en los métodos de tratamiento descritos en este documento.
Los tratamientos basados en atacar ácidos nucleicos tumorales o antígenos tumorales tales como las inmunoterapias descritas en este documento se pueden combinar con resección quirúrgica y/o radiación y/o quimioterapia tradicional.
Otro objeto de la enseñanza es proporcionar métodos para diagnóstico, detección o seguimiento, es decir, determinar la regresión, progresión, curso y/o aparición de una enfermedad tumoral. Preferentemente, dichos métodos involucran el uso de ligandos tales como anticuerpos monoclonales y sondas de ácido nucleico que se unen específicamente a una molécula diana. Las moléculas diana apropiadas son (i) un ácido nucleico tumoral identificado según la enseñanza, (ii) un antígeno tumoral identificado según la enseñanza o un péptido de antígeno tumoral derivado del mismo, (iii) un anticuerpo contra un antígeno tumoral identificado según la enseñanza o un péptido de antígeno tumoral derivado del mismo, (iv) una célula T que reconoce un antígeno tumoral identificado según la enseñanza o un péptido de antígeno tumoral derivado del mismo y/o (v) una célula que presenta un péptido de antígeno tumoral derivado de un antígeno tumoral identificados según la enseñanza con MHC de clase I o clase II, preferentemente MHC de clase I. Tales métodos pueden usarse para detectar si un sujeto tiene o tiene un riesgo (mayor) de desarrollar una enfermedad tumoral o, por ejemplo, si un régimen de tratamiento es eficaz.
De acuerdo con lo anterior, la memoria descriptiva describe métodos para el diagnóstico, detección o seguimiento de una enfermedad tumoral que comprende la detección y/o determinación de la cantidad de uno o más parámetros seleccionados del grupo que consiste en (i) un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de un ácido nucleico tumoral identificado según la enseñanza/un ácido nucleico que codifica un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza, (ii) un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza o de un péptido de antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral, (iii) un anticuerpo que se une a un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza o de un péptido de antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral, (iv) una célula T que reconoce un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza o de un péptido de antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral y/o (v) una célula que presenta un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un péptido de antígeno tumoral derivado de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza con MHC de clase I o clase II, preferentemente MHC de clase I, en una muestra biológica aislada de un paciente, preferentemente de un paciente que tiene una enfermedad tumoral, siendo sospechoso de tener o enfermarse de una enfermedad tumoral o de tener potencial para padecer una enfermedad tumoral.
En una realización, un ácido nucleico según (i) codifica un péptido que se procesa para producir un péptido presentado por MHC de clase I o de clase II específico de antígeno tumoral, preferentemente, un péptido presentado de MHC de clase I específico de antígeno tumoral.
En una realización, un péptido según (ii) es un péptido presentado por MHC de clase I o clase II específico de antígeno tumoral o puede procesarse para producir un péptido presentado por MHC de clase I o clase II específico de antígeno tumoral, preferentemente, un péptido presentado por MHC de clase I específico de antígeno tumoral.
Preferentemente, una célula T según (iv) reconoce una secuencia en el péptido que corresponde sustancialmente a un fragmento de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza que se presenta por MHC de clase I o clase II, preferentemente MHC de clase I.
En una realización, una célula según (v) presenta el péptido por MHC de clase I o clase II, preferentemente MHC de clase I en su superficie. La célula es preferentemente no proliferativa. En una realización preferida, la célula es una célula presentadora de antígeno tal como una célula dendrítica, un monocito o un macrófago. De este modo, en una realización preferida, la célula según (v) es una célula presentadora de antígeno que comprende un péptido de antígeno tumoral como se describe en este documento presentado con MHC de clase I. En otra realización, la célula es una célula tumoral.
En una realización, el ácido nucleico según (i) o el péptido según (ii) se detecta o se determina su cantidad in situ en una célula, preferentemente una célula tumoral. En una realización, el péptido según (ii) se detecta o se determina su cantidad in situ en la superficie de una célula, ya sea incorporado en la membrana plasmática o en un complejo con MHC de clase I o clase Ii, preferentemente MHC de clase I.
Preferentemente, la enfermedad tumoral que se va a diagnosticar, detectar o controlar usando el método de la enseñanza es una enfermedad cancerosa, preferentemente seleccionada del grupo que consiste en cáncer de ovario, en particular adenocarcinoma de ovario y teratocarcinoma de ovario, cáncer de pulmón, incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), en particular carcinoma de pulmón de células escamosas y adenocarcinoma, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer hepático, cáncer de páncreas, cáncer de piel, en particular carcinoma de células basales y carcinoma de células escamosas, melanoma maligno, cáncer de cabeza y cuello, en particular adenoma pleomórfico maligno, sarcoma, en particular sarcoma sinovial y carcinosarcoma, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga urinaria, en particular carcinoma de células transicionales y carcinoma papilar, cáncer de riñón, en particular carcinoma de células renales, incluido carcinoma de células renales de células claras y carcinoma de células renales papilar, cáncer de colon, cáncer de intestino delgado, incluido cáncer de íleon, en particular adenocarcinoma de intestino delgado y adenocarcinoma de íleon, carcinoma embrionario testicular, coriocarcinoma de placenta, cáncer de cuello uterino, cáncer testicular, en particular seminoma testicular, teratoma testicular y cáncer testicular embrionario, y cáncer uterino, y las formas metastásicas de los mismos.
En una realización del método para diagnóstico, detección o seguimiento de una enfermedad tumoral según la enseñanza, una muestra biológica y/o una muestra de control/referencia es de un tejido u órgano correspondiente al tejido u órgano que se va a diagnosticar, detectar o controlar con respecto a la afección por una enfermedad tumoral; por ejemplo, la enfermedad tumoral que se va a diagnosticar, detectar o controlar es cáncer de ovario y la muestra biológica y/o muestra de control/referencia es tejido de ovario. Tales tejidos y órganos se describen en este documento, por ejemplo, en relación con diferentes enfermedades tumorales y cánceres.
En una realización de los métodos para el diagnóstico, detección o seguimiento de una enfermedad tumoral, la muestra biológica es de un tejido u órgano en el que las células, cuando el tejido u órgano está libre de tumores, no expresan sustancialmente un antígeno tumoral identificado según la enseñanza y /o un ácido nucleico tumoral identificado según la enseñanza. Preferentemente dicho tejido es un tejido distinto del tejido placentario. Preferentemente, dicho tejido es tejido de ovario, pulmón, mama, duodeno, piel, colon, hígado, ganglio linfático, estómago, bazo, riñón, esófago, páncreas, endometrio, cerebro, vesícula biliar, vejiga urinaria, íleon, glándula suprarrenal, recto y músculo esquelético, preferentemente tejido de ovario o tejido de pulmón.
Según la enseñanza, un antígeno tumoral y/o un ácido nucleico tumoral no se expresa sustancialmente si el nivel de expresión es menor en comparación con la expresión en células de placenta o tejido de placenta y/o es menor en comparación con la expresión en células tumorales de ovario y/o pulmón. células tumorales o tejido tumoral de ovario y/o tejido tumoral de pulmón. Preferentemente, el nivel de expresión es inferior al 10 %, preferentemente inferior al 5 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0.5 %, 0.1 % o 0.05 % o incluso inferior en comparación con las células o tejidos anteriores. Preferentemente, un antígeno tumoral y/o un ácido nucleico no se expresa sustancialmente si el nivel de expresión está por debajo del límite de detección.
Los métodos para diagnóstico, detección o seguimiento permiten evaluaciones cuantitativas y/o cualitativas, por ejemplo, medidas absolutas y/o relativas de moléculas diana, por ejemplo niveles de expresión de un ácido nucleico tumoral o un antígeno tumoral.
Los medios para lograr dicha detección y/o determinación de la cantidad se describen en este documento y serán evidentes para el experto.
Preferentemente, la detección y/o determinación de la cantidad en los métodos de la enseñanza comprende (i) poner en contacto una muestra biológica con un agente que se une específicamente al ácido nucleico, el péptido, el anticuerpo, la célula T o la célula que se va a detectar y/o cuya cantidad va a determinarse, y (ii) detectar la formación de y/o determinar la cantidad de un complejo entre el agente y el ácido nucleico, el péptido, el anticuerpo, la célula T o la célula que se va a detectar o cuya cantidad se va a determinar.
Por lo general, el nivel de una molécula diana en una muestra biológica se compara con un nivel de referencia, en el que una desviación de dicho nivel de referencia es indicativa de la presencia y/o estadio de una enfermedad tumoral en un sujeto. El nivel de referencia puede ser un nivel determinado en una muestra de control (por ejemplo, de un tejido o sujeto sano) o un nivel medio de sujetos sanos. Una "desviación" de dicho nivel de referencia designa cualquier cambio significativo, tal como un aumento o disminución de al menos un 10 %, un 20 % o un 30 %, preferentemente de al menos un 40 % o un 50 %, o incluso más. Preferentemente, la presencia del ácido nucleico, el péptido, el anticuerpo, la célula T y/o la célula en dicha muestra biológica o una cantidad del ácido nucleico, el péptido, el anticuerpo, la célula T y/o la célula en la muestra biológica que aumenta en comparación con un nivel de referencia indica la presencia de una enfermedad tumoral.
Por lo general, la detección y/o determinación de la cantidad en los métodos de la enseñanza implica el uso de ligandos marcados que se unen específicamente a una molécula diana, por ejemplo, una sonda de ácido nucleico marcada que se hibrida con un ácido nucleico diana y/o un anticuerpo marcado. o fragmento/derivado del mismo que se une específicamente a un péptido diana.
Según las enseñanzas, la detección de un ácido nucleico o la determinación de la cantidad de un ácido nucleico se puede llevar a cabo usando métodos de detección de ácidos nucleicos conocidos, tales como métodos que involucran hibridación o técnicas de amplificación de ácidos nucleicos. En una realización, se detectan transcritos de ARNm o se determina su cantidad usando RT-PCR o análisis de transferencia Northern.
Tales métodos de detección de ácidos nucleicos pueden involucrar el uso de oligonucleótidos que se hibridan con los ácidos nucleicos diana. Los oligonucleótidos apropiados por lo general varían en longitud desde cinco hasta varios cientos de nucleótidos, más por lo general aproximadamente de 20-70 nucleótidos de longitud o menos, incluso más por lo general alrededor de 10-30 nucleótidos de longitud.
Según las enseñanzas, la detección de un péptido o la determinación de la cantidad de un péptido se puede llevar a cabo en un número de maneras, incluyendo, pero no se limitan a, la inmunodetección usando un anticuerpo que se une específicamente a dicho péptido. Preferentemente, el anticuerpo se une a una secuencia que corresponde sustancialmente a un fragmento de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza. En una realización, dicha secuencia comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 del listado de secuencias o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos.
Los métodos para usar anticuerpos para detectar péptidos son bien conocidos e incluyen ELISA, ensayos de unión competitiva y similares. En general, tales ensayos usan un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente al péptido diana unido directa o indirectamente a un marcador que permite la detección, por ejemplo, enzimas indicadoras, radiomarcadores, fluoróforos o partículas paramagnéticas.
Según las enseñanzas, la detección de un anticuerpo o la determinación de la cantidad de un anticuerpo se puede llevar a cabo usando un péptido que se une específicamente a dicho anticuerpo.
Las células T pueden aislarse de sangre periférica del paciente, ganglios linfáticos, muestras de tejido tales como las derivadas de biopsia y resección, u otra fuente. Se pueden realizar ensayos de reactividad en células T primarias u otros derivados apropiados. Por ejemplo, las células T pueden fusionarse para generar hibridomas. En la técnica se conocen ensayos para medir la capacidad de respuesta de las células T e incluyen ensayos de proliferación y ensayos de liberación de citocinas.
En una realización, la célula T que reconoce un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas o de un péptido de antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral es un CTL que responde a antígeno tumoral.
Se puede detectar un CTL y determinar su cantidad de varias maneras, incluidas, pero no se limitan a, las siguientes realizaciones preferidas. En una realización, los CTL se tiñen directamente usando un tetrámero de péptido de antígeno tumoral fluorescente/MHC apropiado. En otra realización, se usa el ensayo "TRAP" ("reconocimiento de células T de APC mediante transferencia de proteínas") (véase, por ejemplo, Beadling et al. Nature Medicine 12:1208 (2006)). En otra realización, la detección de células T en muestras de sangre se realiza usando métodos descritos por Yuan et al. (Cytotherapy 8:498, 2006). Se conocen ensayos e índices para detectar células T reactivas, e incluyen, pero no se limitan a, el uso de tinción con ELISPOT de IFN-gamma y citocinas intracelulares de IFN-gamma.
Se conocen en la técnica otros diversos métodos para determinar si un clon de células T responderá a un péptido antigénico particular. Por lo general, el péptido se añade a una suspensión de células T durante un período de uno a tres días. La respuesta de las células T puede medirse mediante proliferación, por ejemplo, absorción de timidina marcada, o mediante liberación de citocinas, por ejemplo, IL-2. Hay diversos ensayos disponibles para detectar la presencia de citocinas liberadas.
Se pueden usar ensayos citotóxicos de células T para detectar células T citotóxicas que tienen especificidad por antígenos tumorales. En una realización, se prueba la capacidad de las células T citotóxicas para destruir células diana que presentan un péptido de antígeno tumoral con moléculas de MHC de clase I. Las células diana que presentan el péptido del antígeno tumoral pueden marcarse y agregarse a una suspensión de células T de una muestra de un paciente. La citotoxicidad puede medirse cuantificando la liberación de marcador de las células lisadas. En el ensayo se pueden incluir controles para la liberación espontánea y total.
Se puede detectar una célula que presenta un péptido y determinar su cantidad ensayando su capacidad para inducir una respuesta celular, por ejemplo para activar células T, o midiendo la lisis de células mediante CTL que tienen especificidad por tal célula.
La presencia de dicho ácido nucleico, dicho péptido, dicho anticuerpo, dicha célula T y/o dicha célula que se va a detectar y/o cuya cantidad se va a determinar y/o una cantidad de dicho ácido nucleico, dicho péptido, dicho anticuerpo, dicha célula T y/o dicha célula que aumenta en comparación con un nivel de referencia, por ejemplo en comparación con un paciente sin una enfermedad tumoral, puede indicar la presencia o riesgo de (es decir, un potencial para el desarrollo de) una enfermedad tumoral. en dicho paciente. En una realización, la presencia de dicho ácido nucleico, dicho péptido, dicho anticuerpo, dicha célula T y/o dicha célula que se va a detectar y/o cuya cantidad se va a determinar y/o una cantidad de dicho ácido nucleico, dicho péptido, dicho anticuerpo, dicha célula T y/o dicha célula aumenta en comparación con un nivel de referencia, por ejemplo, en comparación con un paciente sin una enfermedad tumoral, puede indicar la presencia o el riesgo de cáncer metastásico, como cáncer de ovario metastásico o cáncer de pulmón metastásico.
En una realización, la muestra biológica es de un tejido u órgano en el que las células, cuando el tejido u órgano está libre de tumores, no expresan sustancialmente un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas y/o un ácido nucleico tumoral identificado según las enseñanzas. La indicación de la presencia o riesgo de una enfermedad tumoral en un paciente mediante los métodos de la enseñanza puede indicar que la enfermedad tumoral está en dicho tejido u órgano o que dicho tejido u órgano está en riesgo de sufrir dicha enfermedad tumoral.
En una realización, la muestra biológica es de un tejido u órgano en el que las células, cuando el tejido u órgano está libre de tumores, no expresan sustancialmente un antígeno tumoral identificado según la enseñanza y/o un ácido nucleico tumoral identificado según la enseñanza y opcionalmente, el tejido u órgano ya ha sido diagnosticado como afectado por una enfermedad tumoral, por ejemplo mediante inspección visual o prueba de cultivo de células de dicho tejido u órgano. En esta realización, la presencia de dicho ácido nucleico, dicho péptido, dicho anticuerpo, dicha célula T y/o dicha célula que se va a detectar y/o cuya cantidad se va a determinar y/o una cantidad de dicho ácido nucleico, dicho péptido, dicho anticuerpo, dicha célula T y/o dicha célula aumenta en comparación con un nivel de referencia, por ejemplo, en comparación con un paciente sin enfermedad tumoral, puede indicar que la enfermedad tumoral es cáncer de ovario metastásico o cáncer de pulmón metastásico. Las muestras biológicas preferidas para tales pruebas pueden comprender tejido que se sabe que es susceptible a tales cánceres metastásicos. Tales tejidos se describen en este documento.
La indicación de la presencia o riesgo de cáncer de ovario metastásico o cáncer de pulmón metastásico en un paciente mediante los métodos de la enseñanza también puede indicar la presencia o riesgo de cáncer de ovario y cáncer de pulmón en dicho paciente.
Los métodos para el diagnóstico, detección o seguimiento de una enfermedad tumoral de la enseñanza también incluyen realizaciones en las que mediante la detección o determinación de la cantidad de dicho ácido nucleico, dicho péptido, dicho anticuerpo, dicha célula T y/o dicha célula es posible evaluar y/o pronosticar el comportamiento metastásico de una enfermedad tumoral, en los que, preferentemente, la presencia de dicho ácido nucleico, dicho péptido, dicho anticuerpo, dicha célula T y/o dicha célula y/o una cantidad de dicho ácido nucleico, dicho péptido, dicho anticuerpo, dicha célula T y/o dicha célula que aumenta en comparación con un nivel de referencia, por ejemplo, un paciente sin dicha enfermedad o sin una metástasis de dicha enfermedad, puede indicar un comportamiento metastásico de una enfermedad tumoral o un riesgo de un comportamiento metastásico de una enfermedad tumoral.
En una realización, la muestra biológica es de un tejido u órgano en el que las células, cuando el tejido u órgano está libre de tumores, no expresan sustancialmente un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas y/o un ácido nucleico tumoral identificado según las enseñanzas. En una realización, la enfermedad tumoral está en dicho tejido u órgano.
Los métodos de seguimiento según la enseñanza comprenden preferentemente una detección y/o determinación de la cantidad de uno o más de los parámetros mencionados anteriormente en una primera muestra en un primer momento y en una muestra adicional en un segundo momento, en los que la regresión, progresión, curso y/o aparición de una enfermedad tumoral se puede determinar comparando las dos muestras.
Una cantidad de dicho ácido nucleico, dicho péptido, dicho anticuerpo, dicha célula T y/o dicha célula que esté disminuida en una muestra biológica en comparación con una muestra biológica tomada anteriormente de un paciente puede indicar una regresión, un curso positivo, por ejemplo, un tratamiento exitoso, o un riesgo reducido de aparición de una enfermedad tumoral en dicho paciente.
En una realización, la muestra biológica es de un tejido u órgano en el que las células, cuando el tejido u órgano está libre de tumores, no expresan sustancialmente un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas y/o un ácido nucleico tumoral identificado según las enseñanzas. En una realización, la enfermedad tumoral está en dicho tejido u órgano.
Una cantidad de dicho ácido nucleico, dicho péptido, dicho anticuerpo, dicha célula T y/o dicha célula que aumenta en una muestra biológica en comparación con una muestra biológica tomada anteriormente de un paciente puede indicar una progresión, un curso negativo, por ejemplo, un tratamiento fallido, recurrencia o comportamiento metastásico, aparición o riesgo de aparición de una enfermedad tumoral en dicho paciente.
En una realización, la muestra biológica es de un tejido u órgano en el que las células, cuando el tejido u órgano está libre de tumores, no expresan sustancialmente un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas y/o un ácido nucleico tumoral identificado según las enseñanzas. En una realización, la enfermedad tumoral está en dicho tejido u órgano.
En un aspecto particular, la enseñanza se refiere a un método para la detección, es decir, determinar la posición o sitio, de una enfermedad tumoral, por ejemplo, un tejido u órgano particular. En una realización, dicho método comprende administrar a un paciente un anticuerpo que se une a un antígeno tumoral identificado según la presente enseñanza y que está acoplado a un marcador detectable. En una realización, dicho anticuerpo se une a un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 del listado de secuencias o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. En realizaciones adicionales, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, humano o humanizado, un fragmento de un anticuerpo o un anticuerpo sintético.
El marcado de un tejido u órgano en dicho paciente puede indicar la presencia o riesgo de una enfermedad tumoral en dicho tejido u órgano.
En una realización, el tejido u órgano es un tejido u órgano en el que las células, cuando el tejido u órgano está libre de tumores, no expresan sustancialmente un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas y/o un ácido nucleico tumoral identificado según las enseñanzas.
En una realización, el tejido u órgano es un tejido u órgano en el que las células, cuando el tejido u órgano está libre de tumores, no expresan sustancialmente un antígeno tumoral identificado según la enseñanza y/o un ácido nucleico tumoral identificado según la enseñanza y ya se ha diagnosticado que el tejido u órgano está afectado por una enfermedad tumoral, por ejemplo mediante inspección visual o pruebas de cultivo de células de dicho tejido u órgano. En esta realización, el marcado del tejido u órgano puede indicar que la enfermedad tumoral es cáncer de ovario metastásico o cáncer de pulmón metastásico.
La indicación de la presencia o riesgo de cáncer de ovario metastásico o cáncer de pulmón metastásico en un tejido u órgano mediante los métodos de la enseñanza también puede indicar la presencia o riesgo de cáncer de ovario y cáncer de pulmón en el paciente.
Preferentemente, la enfermedad tumoral en los métodos para diagnóstico, detección o seguimiento de una enfermedad tumoral de la enseñanza es una enfermedad tumoral de un tejido distinto del tejido de la placenta. Preferentemente, dicho tejido es tejido de ovario, pulmón, mama, duodeno, piel, colon, hígado, ganglio linfático, estómago, bazo, riñón, esófago, páncreas, endometrio, cerebro, vesícula biliar, vejiga urinaria, íleon, glándula suprarrenal, recto y músculo esquelético, preferentemente tejido de ovario o tejido de pulmón. En un aspecto adicional, la enfermedad tumoral se selecciona del grupo que consiste en cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de ovario metastásico y cáncer de pulmón metastásico.
Un diagnóstico positivo de una enfermedad tumoral y/o una enfermedad tumoral metastásica y/o una recurrencia de una enfermedad tumoral como se describió anteriormente usando los métodos de la presente enseñanza puede indicar una enfermedad tumoral y/o una enfermedad tumoral metastásica y/o una recurrencia. de una enfermedad tumoral que es susceptible de los métodos de tratamiento descritos en este documento.
Se han observado células tumorales circulantes (CTC) en la sangre periférica de pacientes con cánceres derivados del epitelio en concentraciones ultrabajas. Se ha demostrado que la cantidad de estas células se correlaciona con el resultado de cohortes de pacientes con cáncer metastásico con enfermedad progresiva en el momento del muestreo. Algunos informes sugieren un papel pronóstico de las células tumorales circulantes en pacientes afectados por cáncer de colon. En consecuencia, un instrumento para medir las células tumorales circulantes podría ser una valiosa herramienta de diagnóstico.
Los ácidos nucleicos tumorales y los antígenos tumorales identificados según la presente enseñanza son útiles en métodos para detectar células tumorales circulantes en un paciente. Los métodos pueden indicar la presencia de cáncer metastásico o un cáncer en estadio temprano. En un aspecto del método, la presencia de células tumorales circulantes en la muestra indica la probabilidad de recurrencia del cáncer en el sujeto mamífero. En un aspecto adicional del método, la presencia de células tumorales circulantes en la muestra indica el estado de remisión del cáncer en el sujeto mamífero.
De acuerdo con lo anterior, la presente enseñanza se refiere a un método para detectar células tumorales circulantes en un paciente que comprende la detección y/o determinación de la cantidad de (i) un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de un ácido nucleico tumoral identificado según la enseñanza/un ácido nucleico que codifica un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza y/o (ii) un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza o de un tumor péptido antigénico derivado de dicho antígeno tumoral en una muestra biológica que contiene o se sospecha que contiene células tumorales diseminadas o circulantes o células tumorales metastásicas aisladas de dicho paciente. Preferentemente, el paciente es un paciente que tiene una enfermedad tumoral, del que se sospecha que tiene o está enfermo con una enfermedad tumoral o que tiene potencial para padecer una enfermedad tumoral.
De este modo, en los métodos para detectar células tumorales circulantes de las enseñanzas, los ácidos nucleicos tumorales identificados según las enseñanzas y/o los antígenos tumorales identificados según las enseñanzas o los péptidos de antígenos tumorales derivados de los mismos se usan como moléculas diana para identificar células que se caracterizan por la presencia de dichas moléculas diana. Es probable que estas células representen células tumorales circulantes.
En una realización, el ácido nucleico o el péptido se detecta o se determina su cantidad in situ en una célula, preferentemente una célula tumoral. En una realización, el péptido se detecta o se determina su cantidad in situ en la superficie de una célula, ya sea incorporado en la membrana plasmática o en un complejo con MHC de clase I o clase II, preferentemente MHC de clase I. Medios para realizar dicha detección y /o la determinación de la cantidad de tales moléculas diana se describen en este documento y serán evidentes para el experto.
Una muestra biológica que contiene o se sospecha que contiene células tumorales diseminadas o circulantes o células tumorales metastásicas incluye, por ejemplo, sangre, suero, líquido abdominal, médula ósea, esputo, aspirado bronquial y/o lavado bronquial.
En un aspecto del método, la presencia de dicho ácido nucleico según (i) y/o dicho péptido según (ii) en dicha muestra biológica o una cantidad de dicho ácido nucleico y/o dicho péptido en dicha muestra biológica que es aumentado en comparación con un nivel de referencia indica la presencia de células tumorales circulantes en dicho paciente.
En un aspecto del método, la presencia de células tumorales circulantes en la muestra puede indicar la presencia o riesgo de una enfermedad tumoral, en particular una enfermedad tumoral metastásica en el paciente. En un aspecto adicional, la presencia de células tumorales circulantes en la muestra puede indicar la presencia o riesgo de una enfermedad tumoral en etapa temprana en el paciente. En un aspecto adicional, la presencia de células tumorales circulantes en dicho paciente puede indicar la presencia o riesgo de una enfermedad tumoral seleccionada del grupo que consiste en cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de ovario metastásico y cáncer de pulmón metastásico.
En realizaciones particulares, los métodos de la enseñanza hacen posible evaluar y/o pronosticar el éxito de una terapia contra el cáncer que se ha administrado o se administrará. En un aspecto del método, la presencia de células tumorales circulantes en la muestra puede indicar la presencia o riesgo de metástasis tumoral o recurrencia tumoral en el paciente. En un aspecto adicional del método, la presencia de células tumorales circulantes en la muestra puede indicar el estado de remisión del tumor en el paciente.
La detección de células tumorales circulantes usando los métodos para detectar células tumorales circulantes de la enseñanza puede indicar una enfermedad tumoral y/o una metástasis de una enfermedad tumoral y/o una recaída de una enfermedad tumoral que es susceptible de los métodos de tratamiento descritos en este documento. .
En un aspecto detallado, la presencia de células tumorales circulantes en la muestra puede indicar la presencia o riesgo de cáncer incluyendo, pero no limitando a, linfoma, mieloma, neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, rabdomiosarcoma, tumores de pulmón de células pequeñas, tumores cerebrales primarios, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga urinaria, cáncer testicular, cáncer de tiroides, neuroblastoma, cáncer de esófago, cáncer del tracto genitourinario, cáncer de cuello uterino, cáncer de endometrio, cáncer cortical suprarrenal o cáncer de próstata.
Preferentemente, tal ensayo para células tumorales circulantes se realiza usando anticuerpos dirigidos contra péptidos diana en los que dichos anticuerpos están marcados de manera detectable. En una realización particular, tal ensayo para células tumorales circulantes se realiza usando ensayos de inmunofluorescencia mediante anticuerpos monoclonales dirigidos contra péptidos diana y se realiza preferentemente en sangre periférica de pacientes. En una realización, dichos anticuerpos se unen a un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 del listado de secuencias o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos.
La presencia de células tumorales circulantes en la sangre puede correlacionarse con una enfermedad tumoral metastásica o con un riesgo de enfermedad tumoral metastásica y con un mal resultado y una menor tasa de supervivencia.
El método más confiable disponible actualmente para la detección de CTC es la microscopía digital automatizada (ADM) que usa análisis de imágenes para el reconocimiento de células tumorales marcadas inmunocitoquímicamente. ADM, sin embargo, tiene la desventaja de sus velocidades de barrido muy lentas de 800 células/s. Kraeft et al, Clin Cancer Res 10: 3020-8, 2004. La velocidad de barrido del ADM está limitada por la latencia asociada con el paso de la muestra muchas veces debido al campo de visión limitado.
Para evitar esta limitación de velocidad, se han desarrollado varias tecnologías de enriquecimiento de CTC para reducir la cantidad total de células que necesitan el barrido. Hasta la fecha, el más exitoso de estos enfoques de enriquecimiento es el enriquecimiento inmunomagnético (IME). Smirnov et al, Cancer Res 65: 4993-7, 2005; Allard et al, Clin Cáncer Res 10: 6897-904, 2004; Cristofanilli et al, N EnglJ Med 351: 781 -91, 2004. En la mayoría de las implementaciones de IME, los anticuerpos monoclonales conjugados con pequeñas perlas magnéticas se dirigen a la molécula de adhesión de células epiteliales, EpCAM. Luego, las perlas se manipulan en campos magnéticos para enriquecerlas.
Un aspecto adicional de la enseñanza se refiere a un método para detectar células de cáncer de ovario metastásico o células de cáncer de pulmón metastásico en un paciente que comprende la detección y/o determinación de la cantidad de (i) un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de un ácido nucleico tumoral identificado según la enseñanza/un ácido nucleico que codifica un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza, y/o (ii) un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza o de un péptido de antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral, en una muestra biológica aislada de un tejido u órgano de dicho paciente que tiene un tumor en el que las células, cuando el tejido u órgano está libre de tumores, no expresan sustancialmente dicho ácido nucleico o péptido.
De este modo, en los métodos de detección de células de cáncer de ovario metastásico o células de cáncer de pulmón metastásico, los ácidos nucleicos tumorales identificados según las enseñanzas y/o los antígenos tumorales identificados según las enseñanzas o los péptidos de antígenos tumorales derivados de los mismos se usan como moléculas diana para identificar células tumorales que se caracterizan por la presencia de dichas moléculas diana. Es probable que estas células representen células de cáncer de ovario metastásico o células de cáncer de pulmón metastásico. En una realización, el ácido nucleico o el péptido se detecta o se determina su cantidad in situ en una célula, preferentemente una célula tumoral.
En una realización, el péptido se detecta o se determina su cantidad in situ en la superficie de una célula, ya sea incorporado en la membrana plasmática o en un complejo con MHC de clase I o clase II, preferentemente MHC de clase I. Medios para realizar dicha detección y /o la determinación de la cantidad de tales moléculas diana se describen en este documento y serán evidentes para el experto.
Según las enseñanzas, un ácido nucleico y/o un péptido no se expresa sustancialmente si el nivel de expresión es menor en comparación con la expresión en células de placenta o tejido de placenta y/o es menor en comparación con la expresión en células tumorales de ovario y/o células tumorales de pulmón o tejido tumoral de ovario y/o tejido tumoral de pulmón. Preferentemente, el nivel de expresión es inferior al 10 %, preferentemente inferior al 5 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0.5 %, 0.1 % o 0.05 % o incluso inferior en comparación con las células o tejidos anteriores. Preferentemente, un ácido nucleico y/o un péptido no se expresa sustancialmente si el nivel de expresión está por debajo del límite de detección.
Preferentemente, el tejido es un tejido distinto del tejido de placenta y preferentemente es un tejido distinto del tejido de ovario o tejido pulmonar. Preferentemente, dicho tejido es tejido de mama, duodeno, piel, colon, hígado, ganglio linfático, estómago, bazo, riñón, esófago, páncreas, endometrio, cerebro, vesícula biliar, vejiga urinaria, íleon, glándula suprarrenal, recto y músculo esquelético. Preferentemente, tal tejido es un tejido que se sabe que es susceptible al cáncer de ovario metastásico y/o al cáncer de pulmón metastásico. Dichos tejidos se describen en este documento.
Preferentemente, ya se ha diagnosticado que el tejido u órgano está afectado por una enfermedad tumoral mediante inspección visual o prueba de cultivo de células de dicho órgano tisular.
En un aspecto del método, la presencia de dicho ácido nucleico según (i) y/o dicho péptido según (ii) en dicha muestra biológica o una cantidad de dicho ácido nucleico y/o péptido en dicha muestra biológica que aumenta comparado con un nivel de referencia indica la presencia o riesgo de células de cáncer de ovario metastásico o células de cáncer de pulmón metastásico en dicho tejido u órgano. La presencia de células de cáncer de ovario metastásico o células de cáncer de pulmón metastásico en dicho tejido u órgano también puede indicar la presencia o riesgo de cáncer de ovario y cáncer de pulmón en dicho paciente.
Un diagnóstico positivo de células de cáncer de ovario metastásico o células de cáncer de pulmón metastásico puede indicar que el tumor del tejido u órgano del cual se ha aislado la muestra biológica es susceptible de los métodos de tratamiento descritos en este documento.
La memoria descriptiva describe además kits de prueba de diagnóstico útiles en los métodos para diagnóstico, detección o seguimiento y en los métodos para detectar células tumorales circulantes y/o en los métodos para detectar células de cáncer de ovario metastásico o células de cáncer de pulmón metastásico de la enseñanza. Estos kits en una realización comprenden un ligando que se une específicamente a una molécula diana como se define anteriormente y, opcionalmente, un marcador detectable, por ejemplo, enzimas indicadoras, radiomarcadores, fluoróforos o partículas paramagnéticas. En una realización particular, el ligando comprende cebadores o sondas de ácido nucleico específicos para ácidos nucleicos diana como se describió anteriormente, o un anticuerpo o un derivado del mismo, específico para un péptido diana como se describió anteriormente. En una realización, dicho anticuerpo es específico para un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 del listado de secuencias o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos. Los kits pueden incluir folletos informativos, por ejemplo, folletos que informan sobre cómo usar reactivos para practicar un método divulgado en este documento.
En un aspecto adicional, la enseñanza se refiere a una molécula de ácido nucleico recombinante, en particular una molécula de ADN o ARN, que comprende un ácido nucleico que codifica un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un antígeno tumoral o de un péptido de antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral.
La enseñanza también se refiere a células hospedadoras que comprenden una molécula de ácido nucleico recombinante de la enseñanza. Preferentemente, tales células hospedadoras expresan el péptido codificado.
La célula hospedadora puede ser una célula recombinante y puede secretar el péptido codificado, puede expresarlo en la superficie y preferentemente puede expresar adicionalmente una molécula de MHC que se une a dicho péptido o a un producto de su procesamiento. En una realización, la célula hospedadora expresa la molécula MHC de forma endógena. En una realización adicional, la célula hospedadora expresa la molécula MHC y/o el péptido o el producto de su procesamiento de manera recombinante. La célula hospedadora es preferentemente no proliferativa. En una realización preferida, la célula hospedadora es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica, un monocito o un macrófago.
En un aspecto adicional, la enseñanza se refiere a un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza o de un péptido de antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral, o un derivado de dicho péptido. En una realización, dicho péptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 del listado de secuencias o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos.
En un aspecto adicional, la enseñanza se refiere a un agente que se une a un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza o de un péptido de antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral, o un derivado de dicho péptido. En una realización, dicho péptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 del listado de secuencias o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos. En una realización preferida, el agente es una proteína o un péptido, en particular un anticuerpo, un receptor de células T o una molécula de MHC. En realizaciones adicionales, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, quimérico, humano o humanizado, un anticuerpo producido mediante técnicas combinatorias, un fragmento de un anticuerpo o un anticuerpo sintético.
La enseñanza se refiere adicionalmente a un conjugado entre un agente de la enseñanza que se une a un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza o de un péptido de antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral, o un derivado de dicho péptido y una unidad estructural efectora terapéutica o un marcador detectable.
Descripción detallada
Algunos aspectos de la presente enseñanza prevén la inmunoterapia de enfermedades tumorales, en particular enfermedades cancerosas, usando los ácidos nucleicos tumorales y los antígenos tumorales identificados según la enseñanza mediante enfoques inmunoterapéuticos activos o pasivos que se pueden resumir de la siguiente manera:
Inmunoterapia
I. Inmunoterapia activa ("Vacunas contra el cáncer")
Inmunización con:
i) antígeno o péptido (nativo o modificado)
ii) ácido nucleico que codifica el antígeno o péptido
iii) células recombinantes que codifican el antígeno o péptido
iv) virus recombinantes que codifican el antígeno o péptido
v) células presentadoras de antígeno pulsadas con antígeno o péptido (nativo o modificado) o transfectadas con ácidos nucleicos que codifican el antígeno o péptido
II. Inmunoterapia pasiva ("Inmunoterapia adoptiva")
vi) Transferencia de anticuerpos o receptores de células T que reconocen el antígeno
vii) Transferencia de células sensibilizadas in vitro al antígeno (poblaciones masivas o clonadas)
viii) Transferencia de células efectoras (o células madre) transducidas con ácidos nucleicos que codifican receptores de células T que reconocen antígenos y preferentemente responden a péptidos presentados por MHC de clase I específicos de tumores.
En los últimos años se ha prestado mucha atención al papel de las células T CD8+ en la inmunidad tumoral. Se ha demostrado que los CTL<c>D8+ específicos de tumores son capaces de lisar células tumorales directamente y erradicar masas tumorales in vivo en modelos animales.
Sin embargo, también se cree que las células T CD4+ desempeñan un papel fundamental y es posible que las vacunas óptimas contra el cáncer requieran la participación de células T CD4+ y CD8+.
La inmunización con antígeno tumoral intacto o sustancialmente intacto tiene la ventaja potencial de inmunizar simultáneamente contra epítopos tanto de clase I como de clase II, pero requiere esfuerzos extensos y que requieren mucho tiempo para purificar grandes cantidades de antígeno tumoral. La identificación de péptidos MHC de clase I y clase II dentro de un antígeno tumoral permite inmunizar con altos niveles de péptido sintético puro. El enfoque peptídico también tiene la ventaja de que se puede elegir entre una respuesta (o mezcla) de tipo MHC de clase I y de clase II eligiendo qué epítopos para usar. La inmunización con péptido también significa que se pueden elegir epítopos subdominantes y/o crípticos (ya que la necesidad de procesamiento del antígeno puede evitarse o reducirse a una función de "recorte") para estimular un subconjunto diferente de células T Además, el péptido puede modificarse (por ejemplo, en sus sitios de anclaje HLA de clase I o II) para aumentar su inmunogenicidad.
La enseñanza se refiere a péptidos presentados por MHC de clase I específicos de tumores y métodos para usar los mismos, así como a linfocitos T citotóxicos (CTL) que responden a péptidos presentados por MHC de clase I específicos de tumores y métodos para usar los mismos.
En un aspecto, la memoria descriptiva describe vacunas antitumorales capaces de estimular una respuesta celular contra un tumor caracterizado por la presentación de un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas con MHC de clase I. Las vacunas antitumorales comprenden preferentemente un péptido de antígeno tumoral o un ácido nucleico peptídico antigénico tumoral.
La enseñanza también abarca el uso de ácidos nucleicos que codifican uno o más de los antígenos tumorales identificados según la enseñanza o uno o más péptidos de antígeno tumoral derivados de los mismos. Se prevé que los antígenos o péptidos así codificados sean eficaces como vacunas antitumorales terapéuticas o profilácticas. Por ejemplo, una aplicación particular contemplada de estos ácidos nucleicos implica la inducción de una respuesta celular tal como una respuesta CTL y/o una respuesta inmunitaria humoral contra tales antígenos.
La inmunización con ADN plasmídico puede provocar respuestas inmunitarias específicas de antígeno que consisten en células T CD8+, células T CD4+ y anticuerpos. El ADN se puede administrar mediante el método de inmunización con pistola genética. En la inmunización con pistola genética, se puede recubrir ADN plasmídico sobre partículas de oro, seguido de la administración de las partículas recubiertas de ADN en la piel mediante una pistola genética impulsada por helio de alta presión.
Los avances en biología molecular han hecho posible construir virus recombinantes que codifican antígenos tumorales o péptidos de antígenos tumorales como se describe en este documento. Hasta ahora se han utilizado varias vacunas virales recombinantes.
Varios vectores virales han mostrado resultados prometedores con respecto a su potencial para potenciar la inmunoterapia de enfermedades malignas. Se pueden usar virus competentes en replicación y virus incompetentes en replicación, prefiriéndose el último grupo. Los virus del herpes, adenovirus, vaccinia, reovirus y enfermedad de New Castle son ejemplos de virus preferidos útiles según la presente enseñanza.
Las células presentadoras de antígenos (APC), como las células dendríticas (DC), pueden cargarse con péptidos presentados por MHC de clase I o lisado tumoral, o transducirse con ácido nucleico, por ejemplo mediante transducción usando adenovirus que codifican un antígeno tumoral.
En una realización preferida, una vacuna antitumoral de la enseñanza comprende una APC cargada con un péptido antígeno tumoral. En este sentido, los protocolos pueden basarse en cultivoin vitro/diferenciación de DC manipuladas de tal manera que presenten artificialmente el péptido antígeno tumoral. La producción de DCs genéticamente modificadas puede involucrar la introducción de ácidos nucleicos que codifican antígenos tumorales o péptidos de antígenos tumorales en las DC. La transfección de DC con ARNm es una técnica prometedora de carga de antígeno para estimular una fuerte inmunidad antitumoral.
Las células dendríticas (DC) son poblaciones de leucocitos que presentan antígenos capturados en tejidos periféricos a las células T a través de vías de presentación de antígenos del MHC de clase II y I. Es bien sabido que las DC son potentes inductores de respuestas inmunes y la activación de estas células es una etapa crítica para la inducción de inmunidad antitumoral. La maduración de las DC se conoce como el estado de activación de las DC en el que tales DC presentadoras de antígenos conducen al cebado de las células T, mientras que su presentación por las DC inmaduras produce tolerancia. La maduración de las DC está causada principalmente por biomoléculas con características microbianas detectadas por receptores innatos (ADN bacteriano, ARN viral, endotoxinas, etc.), citocinas proinflamatorias (TNF, IL-1, IFN), ligadura de CD40 en la superficie de las DC por CD40L, y sustancias liberadas por células que sufren muerte celular estresante. Las DC pueden derivarse cultivando células de la médula ósea in vitro con citocinas, tal como el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y el factor de necrosis tumoral alfa.
La memoria descriptiva describe además la preparación de anticuerpos, preferentemente anticuerpos monoclonales contra un antígeno diana como se define anteriormente. Tales anticuerpos monoclonales pueden producirse mediante métodos convencionales e incluyen fragmentos o derivados de los mismos, incluyendo, sin limitación, anticuerpos monoclonales humanos, anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos monoclonales quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, por ejemplo, scFv's y fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno tales como fragmentos Fab y Fab'. Se conocen en la técnica métodos para la preparación de anticuerpos monoclonales. En general, la preparación de anticuerpos monoclonales comprende la inmunización de un hospedadora apropiado con los antígenos en cuestión, el aislamiento de células inmunitarias del mismo, el uso de dichas células inmunitarias para aislar anticuerpos monoclonales y la detección de anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a cualquiera de dichos antígenos. Los fragmentos de anticuerpos se pueden preparar mediante métodos conocidos, por ejemplo, escisión enzimática de anticuerpos monoclonales.
Estos anticuerpos monoclonales y fragmentos son útiles para inmunoterapia antitumoral pasiva, o pueden unirse a unidades estructurales efectoras terapéuticas, por ejemplo, radiomarcadores, citotoxinas, enzimas terapéuticas, agentes que inducen apoptosis y similares para proporcionar citotoxicidad dirigida, es decir, destrucción de células tumorales. En una realización de la presente enseñanza, tales anticuerpos o fragmentos se administran en forma marcada o no marcada, solos o junto con otros agentes terapéuticos, por ejemplo, quimioterapéuticos tales como cisplatino, metotrexato, adriamicina y similares apropiados para la terapia del cáncer.
Si se usan para inmunoterapia antitumoral pasiva, los anticuerpos pueden unirse o no a unidades estructurales efectoras terapéuticas. Preferentemente, los anticuerpos descritos en este documento median la destrucción de células induciendo lisis mediada por citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), lisis mediada por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), apoptosis, adhesión homotípica y/o fagocitosis, preferentemente induciendo lisis mediada por CDC y/o ADCC. lisis mediada. Los anticuerpos descritos en este documento interactúan preferentemente con componentes del sistema inmunitario, preferentemente a través de ADCC o CDC. Sin embargo, los anticuerpos de la enseñanza también pueden ejercer un efecto simplemente uniéndose a antígenos tumorales en la superficie celular, de este modo, por ejemplo, bloqueando la proliferación de las células.
ADCC describe la capacidad de destrucción celular de las células efectoras como se describe en este documento, en particular los linfocitos, que preferentemente requiere que la célula diana esté marcada por un anticuerpo.
La ADCC ocurre preferentemente cuando los anticuerpos se unen a antígenos en las células tumorales y los dominios Fc del anticuerpo se acoplan a los receptores Fc (FcR) en la superficie de las células efectoras inmunitarias. Se han identificado varias familias de receptores Fc y poblaciones celulares específicas expresan característicamente receptores Fc definidos. ADCC puede verse como un mecanismo para inducir directamente un grado variable de destrucción tumoral inmediata que también conduce a la presentación de antígenos y a la inducción de respuestas de células T dirigidas al tumor. Preferentemente,in vivoLa inducción de ADCC conducirá a respuestas de células T dirigidas al tumor y respuestas de anticuerpos derivadas de la hospedadora.
CDC es otro método de destrucción de células que puede ser dirigido por anticuerpos. La IgM es el isotipo más eficaz para la activación del complemento. IgG1 e IgG3 también son muy eficaces para dirigir las CDC a través de la vía clásica de activación del complemento. Preferentemente, en esta cascada, la formación de complejos antígenoanticuerpo da como resultado el descubrimiento de múltiples sitios de unión a C1q muy próximos en los dominios Ch2 de moléculas de anticuerpos participantes, tales como las moléculas de IgG (C1q es uno de los tres subcomponentes del complemento C1). Preferentemente, estos sitios de unión de C1q no encubiertos convierten la interacción C1q-IgG que anteriormente tenía baja afinidad en una de alta avidez, lo que desencadena una cascada de eventos que involucran una serie de otras proteínas del complemento y conduce a la liberación proteolítica de los agentes quimiotácticos/activadores de las células efectoras C3a y C5a. Preferentemente, la cascada del complemento termina en la formación de un complejo de ataque a la membrana, que crea poros en la membrana celular que facilitan el paso libre de agua y solutos dentro y fuera de la célula y puede conducir a la apoptosis.
La inmunoterapia pasiva con células inmunitarias (opcionalmente modificadas genéticamente) capaces de reconocer antígenos tumorales es eficaz para mediar en la regresión del cáncer en pacientes seleccionados. Estas técnicas pueden basarse enex vivoreactivación y expansión de cultivos clonados o policlonales de células T reactivas a tumores. Después del cultivo, se pueden reinfundir células T al paciente junto con IL-2. Se han desarrollado técnicas in vitro en las que los linfocitos humanos se sensibilizan in vitro a péptidos de antígenos tumorales presentados en células presentadoras de antígenos. Mediante estimulación repetitiva in vitro se pueden derivar células con una gran capacidad para reconocer antígenos tumorales humanos. La transferencia adoptiva de estas células puede ser más eficaz para mediar la regresión tumoral in vivo que las células cultivadas convencionalmente.
En una realización, se pueden obtener linfocitos citotóxicos autólogos o linfocitos infiltrantes de tumores de un paciente con cáncer. Los linfocitos se pueden cultivar en cultivo y los CTL que responden a antígenos tumorales se pueden expandir cultivando en presencia de un péptido de antígeno tumoral presentado con MHC de clase I, solo o en combinación con al menos un agente inmunomodulador, preferentemente además con citocinas. Los CTL que responden al antígeno tumoral se infunden luego nuevamente en el paciente en una cantidad eficaz para reducir o eliminar los tumores en el paciente.
Los pacientes podrían ser estimulados previamente con una vacuna peptídica antitumoral antes de la recolección de linfocitos si la respuesta existente fuera inadecuada. Se espera que los CTL transferidos adoptivamente sobrevivan mejor con la infusión de IL-2 en dosis bajas a intermedias.
Por "CTL que responde a antígeno tumoral" se entiende una célula T CD8+ que responde a un péptido de antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral, que se presenta con MHC de clase I, por ejemplo, en la superficie de células tumorales.
Según las enseñanzas, la capacidad de respuesta de los CTL puede incluir un flujo sostenido de calcio, división celular, producción de citocinas tal como IFN-gamma y TNF-alfa, regulación positiva de marcadores de activación tal como CD44 y CD69 y destrucción citolítica específica de células diana que expresan antígenos tumorales. La capacidad de respuesta de CTL también se puede determinar usando un indicador artificial que indique con precisión la capacidad de respuesta de CTL.
Por "péptido de antígeno tumoral" o "péptido de antígeno tumoral derivado de un antígeno tumoral" se entiende un oligopéptido o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde sustancialmente a la secuencia de aminoácidos de un fragmento o péptido de un antígeno tumoral identificado según la presente enseñanza. Preferentemente, un péptido de antígeno tumoral es capaz de estimular una respuesta celular contra un tumor caracterizado por la presentación de un antígeno tumoral identificado en este documento con MHC de clase I y preferentemente un CTL que responde a antígeno tumoral y/o de provocar anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno tumoral. identificado de acuerdo con la presente enseñanza cuando se usa por sí mismo o se une a un portador inmunogénico. Un péptido de antígeno tumoral según la enseñanza es preferentemente un péptido que comprende una secuencia que corresponde sustancialmente a la secuencia de un fragmento de la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2 del listado de secuencias o es un derivado de dicho péptido. En una realización, dicho péptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 del listado de secuencias o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos. Un péptido de antígeno tumoral puede tener cualquier longitud.
Si un péptido de antígeno tumoral debe presentarse directamente, es decir, sin procesamiento, en particular sin escisión, éste tiene una longitud que es apropiada para unirse a una molécula de MHC, en particular a una molécula de MHC de clase I, y preferentemente tiene de 7-20 aminoácidos de longitud, más preferentemente de 7-12 aminoácidos de longitud, más preferentemente de 8-11 aminoácidos de longitud, en particular de 9 o 10 aminoácidos de longitud. Preferentemente, la secuencia de un péptido de antígeno tumoral que se va a presentar directamente se deriva de la secuencia de aminoácidos de un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas, es decir, su secuencia corresponde sustancialmente y es preferentemente completamente idéntica a un fragmento de un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas. Si se debe presentar un péptido de antígeno tumoral después del procesamiento, en particular después de la escisión, el péptido producido mediante el procesamiento tiene una longitud que es apropiada para unirse a una molécula de MHC, en particular una molécula de MHC de clase I, y preferentemente tiene 7-20 aminoácidos de longitud, más preferentemente 7-12 aminoácidos de longitud, más preferentemente 8-11 aminoácidos de longitud, en particular 9 o 10 aminoácidos de longitud. Preferentemente, la secuencia del péptido que se va a presentar después del procesamiento se deriva de la secuencia de aminoácidos de un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas, es decir, su secuencia corresponde sustancial y preferentemente es completamente idéntica a un fragmento de un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas. De este modo, un péptido de antígeno tumoral según la enseñanza en una realización comprende una secuencia de 7-20 aminoácidos de longitud, más preferentemente 7-12 aminoácidos de longitud, más preferentemente 8-11 aminoácidos de longitud, en particular 9 o 10 aminoácidos de longitud que corresponden sustancialmente y preferentemente son completamente idénticos a un fragmento de un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas y después del procesamiento del péptido del antígeno tumoral constituyen el péptido presentado. Sin embargo, el péptido del antígeno tumoral también puede comprender una secuencia que corresponde sustancial y preferentemente es completamente idéntica a un fragmento de un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas que es incluso más larga que la secuencia indicada anteriormente. En una realización, un péptido de antígeno tumoral puede comprender la secuencia completa de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza.
Preferentemente, se puede presentar un péptido de antígeno tumoral, directamente o después del procesamiento, con moléculas MHC de clase I, y cuando se presenta así es capaz de estimular un CTL que responde a un antígeno tumoral. Los péptidos que tienen secuencias de aminoácidos que corresponden sustancialmente a una secuencia de un péptido presentado por el MHC de clase I pueden diferir en uno o más residuos que no son esenciales para el reconocimiento por parte del TCR del péptido presentado por el MHC de clase I, o para la unión del péptido al MHC. Tales péptidos sustancialmente correspondientes también son capaces de estimular un CTL que responde a un antígeno tumoral. Los péptidos que tienen secuencias de aminoácidos que difieren de un péptido presentado en residuos que no afectan el reconocimiento de TCR pero mejoran la estabilidad de la unión al MHC pueden mejorar la inmunogenicidad del péptido antígeno tumoral y pueden denominarse en este documento "péptidos optimizados". Utilizando el conocimiento existente sobre cuál de estos residuos puede tener más probabilidades de afectar la unión al MHC o al TCR, se puede emplear un enfoque racional para el diseño de péptidos sustancialmente correspondientes. Los péptidos resultantes que son funcionales se contemplan como péptidos antigénicos tumorales.
Por "célula inmunorreactiva" se entiende una célula que puede madurar hasta convertirse en una célula inmunitaria (tal como una célula B, una célula T auxiliar o un CTL) tras una estimulación adecuada. De este modo, las células inmunorreactivas incluyen células madre hematopoyéticas CD34+, células T inmaduras y células B inmaduras. Cuando se desea producir CTL que reconozcan un antígeno tumoral, la célula inmunorreactiva se pone en contacto con una célula que presenta el antígeno tumoral o un péptido del antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral en condiciones que favorecen la producción, diferenciación y/o selección de CTL.
Por "célula caracterizada por la presentación de un antígeno tumoral con MHC de clase I" o "célula que presenta un antígeno tumoral con MHC de clase I" o expresiones similares se entiende una célula tal como una célula tumoral o una célula presentadora de antígeno que presenta el antígeno tumoral que expresa. o un fragmento derivado de dicho antígeno tumoral, por ejemplo mediante procesamiento del antígeno tumoral, en el contexto de moléculas MHC de Clase I. De manera similar, el término "tumor caracterizado por la presentación de un antígeno tumoral con MHC de clase I" denota un tumor que comprende células caracterizadas por la presentación de un antígeno tumoral con MHC de clase I.
Por "fragmento de un antígeno tumoral identificado según la enseñanza que se presenta" o expresiones similares se entiende que el fragmento puede presentarse mediante MHC de clase I o clase II, preferentemente MHC de clase I, por ejemplo, cuando se añade directamente a células presentadoras de antígeno. En una realización, el fragmento es un fragmento que se presenta de forma natural en células que expresan un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas, por ejemplo, células tumorales.
Por "célula que reconoce un antígeno tumoral o un péptido de antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral" o "célula inmunorreactiva que reconoce un antígeno tumoral o un péptido de antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral" o expresiones similares se entiende una célula que es capaz de reconocer dicho antígeno tumoral o un péptido de antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral con cierto grado de especificidad, en particular si se presenta en el contexto de moléculas MHC tales como en la superficie de células presentadoras de antígeno o células tumorales. Preferentemente, dicho reconocimiento permite que la célula que reconoce un antígeno tumoral o un péptido de antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral responda. Si la célula es una célula T auxiliar (célula T CD4+) que porta receptores que reconocen un antígeno tumoral o un péptido de antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral en el contexto de moléculas MHC de clase II, tal capacidad de respuesta puede involucrar la liberación de citocinas y/o la activación de linfocitos CD8+ (CTL) y/o células B. Si la célula es un<c>T<l>, tal capacidad de respuesta puede involucrar la eliminación de células presentadas en el contexto de moléculas de MHC de clase I, es decir, células caracterizadas por la presentación de un antígeno tumoral con MHC de clase I, por ejemplo mediante apoptosis o lisis celular mediada por perforina. Tales CTL que reconocen un antígeno tumoral o un péptido de antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral y responden también se denominan en este documento "CTL que responden a antígeno tumoral". Si la célula es una célula B, tal capacidad de respuesta inmunitaria puede involucrar la liberación de inmunoglobulinas.
Por "receptor de células T que reconoce un antígeno tumoral o un péptido de antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral" se entiende un receptor de células T que es capaz de reconocer dicho antígeno tumoral o un péptido de antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral con cierto grado de especificidad, en particular si se presenta en el contexto de moléculas MHC. Preferentemente, dicho reconocimiento permite que la célula que porta el receptor de células T que reconoce un antígeno tumoral o un péptido de antígeno tumoral derivado de dicho antígeno tumoral responda como se describió anteriormente.
Se pretende que una "respuesta celular contra un antígeno tumoral" incluya una respuesta celular dirigida a células caracterizadas por la presentación de un antígeno tumoral con MHC de clase I o clase II. La respuesta celular se relaciona con células llamadas células T o linfocitos T que actúan como "ayudantes" o "asesinas". Las células T colaboradoras (también denominadas células T CD4+) desempeñan un papel central al regular la respuesta inmunitaria y las células asesinas (también denominadas células T citotóxicas, células T citolíticas, células T CD8+ o CTL) destruyen las células tumorales, impidiendo la producción de más células tumorales. Aunque se cree que ambos brazos de la respuesta inmunitaria son necesarios, la respuesta CTL puede ser más importante para controlar el cáncer.
Según la enseñanza, se puede usar una "referencia", tal como una muestra de referencia u organismo de referencia, para correlacionar y comparar los resultados obtenidos en los métodos de la enseñanza a partir de una muestra de prueba u organismo de prueba, es decir, un paciente. Por lo general, el organismo de referencia es un organismo sano, en particular un organismo que no padece una enfermedad tumoral.
A partir de una referencia se puede determinar empíricamente un "valor de referencia" o un "nivel de referencia" midiendo un número suficientemente grande de referencias. Preferentemente el valor de referencia se determina midiendo al menos 2, preferentemente al menos 3, preferentemente al menos 5, preferentemente al menos 8, preferentemente al menos 12, preferentemente al menos 20, preferentemente al menos 30, preferentemente al menos 50, o preferentemente al menos 100 referencias.
Según la enseñanza, el término "unión" se refiere preferentemente a una unión específica. "Unión específica" significa que un agente tal como un anticuerpo se une más fuerte a una diana tal como un epítopo para el cual es específico en comparación con la unión a otra diana. Un agente se une más fuerte a una primera diana en comparación con una segunda diana si se une a la primera diana con una constante de disociación (Kd) que es menor que la constante de disociación para la segunda diana. Preferentemente la constante de disociación (K<d>) para la diana a la que se une específicamente el agente es más de 102-veces, 103-veces, 104-veces, 105-veces, 106-veces, 107-veces, 108-veces, 109-veces, o 1010-veces por debajo de la constante de disociación (Kd) para la diana a la que el agente no se une específicamente.
Según la enseñanza, un ácido nucleico es preferentemente ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN). Los ácidos nucleicos comprenden según las enseñanzas ADN genómico, ADNc, ARNm, moléculas producidas de forma recombinante y sintetizadas químicamente. Según la enseñanza, un ácido nucleico puede estar presente como una molécula monocatenaria o bicatenaria y cerrada lineal o covalentemente circularmente.
Los términos "ácido nucleico tumoral identificado según las enseñanzas" y "ácido nucleico que codifica un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas" tienen significados similares.
Como se usa en este documento, el término "ARN" significa una molécula que comprende al menos un residuo de ribonucleótido. Por "ribonucleótido" se entiende un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de una unidad estructural beta-D-ribofuranosa. El término incluye ARN bicatenario, ARN monocatenario, ARN aislado tal como ARN parcialmente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético, ARN producido de forma recombinante, así como ARN alterado que difiere del ARN natural por la adición, deleción, sustitución y/o o alteración de uno o más nucleótidos. Tales alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como en el(los) extremo(s) de un ARN o internamente, por ejemplo en uno o más nucleótidos del ARN. Los nucleótidos en moléculas de ARN también pueden comprender nucleótidos no estándar, tales como nucleótidos no naturales o nucleótidos o desoxinucleótidos sintetizados químicamente. Estos ARN alterados pueden denominarse análogos o análogos del ARN natural.
Si en este documento se hace referencia a la detección o determinación de la cantidad de un ácido nucleico, el ácido nucleico que realmente debe detectarse o cuya cantidad realmente debe determinarse es preferentemente ARNm. Sin embargo, debe entenderse que esto también puede incluir realizaciones en las que se detecta ARNm o la cantidad de ARNm se determina indirectamente. Por ejemplo, el ARNm puede transformarse en ADNc y detectarse el ADNc o determinarse su cantidad. El ARNm se proporciona en este documento como equivalente de ADNc. Un experto en la técnica entendería que la secuencia de ADNc es equivalente a la secuencia de ARNm y puede usarse para el mismo propósito en este documento, por ejemplo, la generación de sondas que se hibridan con el ácido nucleico que se va a detectar. De este modo, si en este documento se hace referencia a las secuencias mostradas en el listado de secuencias, esto también incluirá los equivalentes de ARN de dichas secuencias.
Preferentemente se han aislado los ácidos nucleicos descritos según la enseñanza. El término "ácido nucleico aislado" significa según la enseñanza que el ácido nucleico fue (i) amplificadoin vitro,por ejemplo mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), (ii) producido de forma recombinante mediante clonación, (iii) purificado, por ejemplo mediante escisión y fraccionamiento electroforético en gel, o (iv) sintetizado, por ejemplo mediante síntesis química. Un ácido nucleico aislado es un ácido nucleico que está disponible para manipulación mediante técnicas de<a>D<n>recombinante.
El término "variante" con respecto a, por ejemplo, secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos, según la enseñanza incluye cualquier variante, en particular mutantes, variantes de empalme, conformaciones, isoformas, variantes alélicas, variantes de especies y homólogos de especies, en particular aquellas que están naturalmente presentes. Una variante alélica se relaciona con una alteración en la secuencia normal de un gen, cuyo significado a menudo no está claro. La secuenciación completa de genes a menudo identifica numerosas variantes alélicas de un gen determinado. Un homólogo de especie es un ácido nucleico o secuencia de aminoácidos con una especie de origen diferente al de un ácido nucleico o secuencia de aminoácidos determinado.
Con respecto a las moléculas de ácido nucleico, el término "variante" incluye secuencias de ácido nucleico degeneradas, en las que un ácido nucleico degenerado según la enseñanza es un ácido nucleico que difiere de un ácido nucleico de referencia en la secuencia de codones debido a la degeneración del código genético.
Adicionalmente, una "variante" de una secuencia de ácido nucleico específica según la enseñanza incluye secuencias de ácido nucleico que comprenden una o múltiples tales como al menos 2, al menos 4 o al menos 6 y preferentemente hasta 3, hasta 4, hasta 5, hasta 6, hasta 10, hasta 15 o hasta 20 sustituciones, eliminaciones y/o adiciones de nucleótidos.
Preferentemente, el grado de identidad entre una secuencia de ácido nucleico dada y una secuencia de ácido nucleico que es una variante de dicha secuencia de ácido nucleico dada será al menos 70 %, preferentemente al menos 75 %, preferentemente al menos 80 %, más preferentemente al menos 85 %, incluso más preferentemente al menos el 90 % o lo más preferentemente al menos el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %. El grado de identidad se da preferentemente para una región de al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 90, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 150, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 250, al menos aproximadamente 300, o al menos aproximadamente 400 nucleótidos. En realizaciones preferidas, el grado de identidad se proporciona para toda la longitud de la secuencia de ácido nucleico de referencia.
"Similitud de secuencia" indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos o que representan sustituciones de aminoácidos conservadoras. La "identidad de secuencia" entre dos secuencias de polipéptidos o ácidos nucleicos indica el porcentaje de aminoácidos o nucleótidos que son idénticos entre las secuencias.
El término "porcentaje de identidad" pretende designar un porcentaje de nucleótidos o de residuos de aminoácidos idénticos entre las dos secuencias a comparar, obtenido después del mejor alineamiento, siendo este porcentaje puramente estadístico y distribuyéndose aleatoriamente las diferencias entre las dos secuencias y en toda su longitud. Las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos se llevan a cabo convencionalmente comparando estas secuencias después de haberlas alineado de manera óptima, llevándose a cabo dicha comparación por segmento o por "ventana de comparación" con el fin de identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. El alineamiento óptimo de las secuencias a comparar puede producirse, además de manualmente, mediante el algoritmo de homología local de Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, mediante el algoritmo de homología local de Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, mediante el método de búsqueda por similitud de Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, o mediante programas informáticos que usan estos algoritmos (<g>A<p>, BESTFIT, FAS-TA, BLAST P, BLAST N and TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).
El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones idénticas entre las dos secuencias que se comparan, dividiendo este número por el número de posiciones comparadas y multiplicando el resultado obtenido por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.
Un ácido nucleico es "capaz de hibridarse" o "hibridarse" con otro ácido nucleico si las dos secuencias son complementarias entre sí. Un ácido nucleico es "complementario" de otro ácido nucleico si las dos secuencias son capaces de formar un dúplex estable entre sí. Según la enseñanza, la hibridación se lleva a cabo preferentemente en condiciones que permitan una hibridación específica entre polinucleótidos (condiciones rigurosas). Las condiciones rigurosas se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 o Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York y se refieren, por ejemplo, a la hibridación a 65 °C en solución reguladora de hibridación (3.5 x SSC, Ficoll al 0.02 %, polivinilpirrolidona al 0.02 %, albúmina de suero bovino al 0.02 %, NaH<2>PO<4 2 . 5>mM) (pH 7), SDS al 0.5 %, EDTA 2 mM). S<s>C es cloruro de sodio 0.15 M/citrato de sodio 0.15 M, pH 7. Después de la hibridación, la membrana a la que se ha transferido el ADN se lava, por ejemplo, en 2 x SSC a temperatura ambiente y luego en 0.1-0.5 x SSC/0.1 x SDS a temperaturas de hasta 68 °C.
Un porcentaje de complementariedad indica el porcentaje de residuos contiguos en una molécula de ácido nucleico que pueden formar enlaces de hidrógeno (por ejemplo, emparejamiento de bases de Watson-Crick) con una segunda secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10 de 10 siendo 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % y 100 % complementarios). "Perfectamente complementario" o "completamente complementario" significa que todos los residuos contiguos de una secuencia de ácido nucleico formarán enlaces de hidrógeno con el mismo número de residuos contiguos en una segunda secuencia de ácido nucleico. Preferentemente, el grado de complementariedad según la enseñanza es al menos 70 %, preferentemente al menos 75 %, preferentemente al menos 80 %, más preferentemente al menos 85 %, incluso más preferentemente al menos 90 % o lo más preferentemente al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %. Lo más preferentemente, el grado de complementariedad según la enseñanza es del 100 %.
El término "derivado" comprende cualquier derivación química de un ácido nucleico sobre una base nucleotídica, sobre el azúcar o sobre el fosfato. El término "derivado" también comprende ácidos nucleicos que contienen nucleótidos y análogos de nucleótidos que no se encuentran en la naturaleza. Preferentemente, una derivación de un ácido nucleico aumenta su estabilidad.
Los ácidos nucleicos que codifican antígenos tumorales o péptidos de antígenos tumorales pueden estar presentes, según la enseñanza, solos o en combinación con otros ácidos nucleicos, en particular ácidos nucleicos heterólogos. Preferentemente, un ácido nucleico que codifica un antígeno tumoral o péptido de antígeno tumoral expresa dicho antígeno tumoral o péptido de antígeno tumoral. En realizaciones preferidas, un ácido nucleico está funcionalmente unido a secuencias de control de la expresión o secuencias reguladoras que pueden ser homólogas o heterólogas con respecto a dicho ácido nucleico. Una secuencia codificante y una secuencia reguladora están unidas "funcionalmente" entre sí, si están unidas covalentemente entre sí de tal manera que la expresión o transcripción de dicha secuencia codificante está bajo el control o bajo la influencia de dicha secuencia reguladora. Si la secuencia codificante se va a traducir en una proteína funcional, entonces, con una secuencia reguladora unida funcionalmente a dicha secuencia codificante, la inducción de dicha secuencia reguladora da como resultado la transcripción de dicha secuencia codificante, sin provocar un cambio de marco en la secuencia codificante o dicha secuencia codificante no es capaz de traducirse en la proteína o péptido deseado.
El término "secuencia de control de la expresión" o "secuencia reguladora" comprende según la enseñanza promotores, potenciadores y otros elementos de control que regulan la expresión de un gen. En realizaciones particulares de la enseñanza, las secuencias de control de la expresión pueden regularse. La estructura exacta de las secuencias reguladoras puede variar en función de la especie o tipo de célula, pero generalmente comprende secuencias 5' no transcritas y 5' no traducidas que participan en el inicio de la transcripción y la traducción, respectivamente, tal como la caja TATA, la secuencia de protección, secuencia CAAt y similares. Más específicamente, las secuencias reguladoras no transcritas en 5' comprenden una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del gen funcionalmente unido. Las secuencias reguladoras también pueden comprender secuencias potenciadoras o secuencias activadoras aguas arriba.
Según la enseñanza, un ácido nucleico puede estar presente además en combinación con otro ácido nucleico que codifica un péptido que controla la secreción de la proteína o péptido codificado por dicho ácido nucleico de una célula hospedadora. Según la enseñanza, un ácido nucleico también puede estar presente en combinación con otro ácido nucleico que codifica un péptido que hace que la proteína o el péptido codificado se anclen en la membrana celular de la célula hospedadora o se compartimenten en orgánulos particulares de dicha célula. De manera similar, es posible una combinación con un ácido nucleico que represente un gen indicador o cualquier "etiqueta".
En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico recombinante es, según las enseñanzas, un vector, eventualmente con un promotor, que controla la expresión de un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas. El término "vector" se usa aquí en su significado más general y comprende cualquier vehículo intermediario de un ácido nucleico que permite, por ejemplo, introducir dicho ácido nucleico en células procarióticas y/o eucariotas y, en su caso, integrarse en un genoma. Preferentemente, tales vectores se replican y/o expresan en las células. Un vehículo intermediario puede adaptarse, por ejemplo, al uso en electroporación, en bombardeo con microproyectiles, en administración liposomal, en transferencia con ayuda de agrobacterias o en inserción mediante virus de ADN o ARN. Los vectores comprenden plásmidos, fagémidos, bacteriófagos o genomas virales.
Los ácidos nucleicos que codifican un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas pueden usarse para la transfección de células hospedadoras. Los ácidos nucleicos aquí significan tanto ADN como A<r>N recombinantes. El ARN recombinante puede prepararse mediante transcripción in vitro de una plantilla de ADN. Además, puede modificarse mediante secuencias estabilizantes, protección y poliadenilación antes de la aplicación.
Según la enseñanza, el término "célula hospedadora" se refiere a cualquier célula que pueda transformarse o transfectarse con un ácido nucleico exógeno. El término "células hospedadoras" comprende según la enseñanza procariotas (por ejemplo,E. coli)o células eucariotas (por ejemplo, células dendríticas, células B, células CHO, células COS, células K562, células de levadura y células de insecto). Se prefieren especialmente células de mamíferos, tales como por ejemplo, células de seres humanos, ratones, hámsteres, cerdos, cabras y primates. Las células pueden derivar de una multiplicidad de tipos de tejido y comprender células primarias y líneas celulares. Ejemplos específicos comprenden queratinocitos, leucocitos de sangre periférica, células madre de la médula ósea y células madre embrionarias. En realizaciones adicionales, la célula hospedadora es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica, monocito o macrófago. Un ácido nucleico puede estar presente en la célula hospedadora en forma de una única copia o de dos o más copias y, en una realización, se expresa en la célula hospedadora.
Según la enseñanza, el término "expresión" se usa en su significado más general y comprende la producción de ARN o de ARN y proteína. También comprende la expresión parcial de ácidos nucleicos. Adicionalmente, la expresión puede llevarse a cabo de forma transitoria o estable. Los sistemas de expresión preferidos en células de mamíferos comprenden pcDNA3.1, pcDNA3.3 y pRc/CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA), que contienen un marcador seleccionable tal como un gen que imparte resistencia a G418 (y permitiendo de este modo seleccionar líneas celulares transfectadas de forma estable) y las secuencias potenciadoras-promotoras del citomegalovirus (CMV).
En aquellos casos de la enseñanza en los que una molécula de MHC presenta un antígeno tumoral o un péptido de antígeno tumoral, un vector de expresión también puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha molécula de MHC. La secuencia de ácido nucleico que codifica la molécula MHC puede estar presente en el mismo vector de expresión que el ácido nucleico que codifica el antígeno tumoral o el péptido del antígeno tumoral, o ambos ácidos nucleicos pueden estar presentes en diferentes vectores de expresión. En el último caso, los dos vectores de expresión pueden cotransfectarse en una célula. Si una célula hospedadora no expresa ni el antígeno tumoral ni el péptido del antígeno tumoral ni la molécula MHC, ambos ácidos nucleicos que los codifican pueden transfectarse en la célula ya sea en el mismo vector de expresión o en diferentes vectores de expresión. Si la célula ya expresa la molécula m Hc , únicamente se puede transfectar en la célula la secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno tumoral o el péptido del antígeno tumoral.
Se pueden usar "moléculas antisentido" o "ácidos nucleicos antisentido" para regular, en particular reducir, la expresión de un ácido nucleico. El término "molécula antisentido" o "ácido nucleico antisentido" se refiere según la enseñanza a un oligonucleótido que es un oligorribonucleótido, oligodesoxirribonucleótido, oligorribonucleótido modificado u oligodesoxirribonucleótido modificado y que se hibrida en condiciones fisiológicas con el ADN que comprende un gen particular o con el ARNm de dicho gen, inhibiendo así la transcripción de dicho gen y/o la traducción de dicho ARNm. Según la enseñanza, una "molécula antisentido" también comprende una construcción que contiene un ácido nucleico o una parte del mismo en orientación inversa con respecto a su promotor natural. Un transcrito antisentido de un ácido nucleico o de una parte del mismo puede formar un dúplex con el ARNm de origen natural y así evitar la acumulación o traducción del ARNm. Otra posibilidad es el uso de ribozimas para inactivar un ácido nucleico.
En realizaciones preferidas, el oligonucleótido antisentido se hibrida con un sitio N-terminal o 5' aguas arriba tal como un sitio de inicio de la traducción, un sitio de inicio de la transcripción o un sitio promotor. En realizaciones adicionales, el oligonucleótido antisentido se hibrida con una región 3' no traducida o un sitio de corte y empalme de ARNm.
En una realización, un oligonucleótido de la enseñanza consiste en ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos o una combinación de los mismos, estando unidos el extremo 5' de un nucleótido y el extremo 3' de otro nucleótido entre sí mediante un enlace fosfodiéster. Estos oligonucleótidos pueden sintetizarse de manera convencional o producirse de forma recombinante.
En realizaciones preferidas, un oligonucleótido de la enseñanza es un oligonucleótido "modificado". En este caso, el oligonucleótido puede modificarse de maneras muy diferentes, sin perjudicar su capacidad de unirse a su diana, para aumentar, por ejemplo, su estabilidad o su eficacia terapéutica. Según la enseñanza, el término "oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido en el que (i) al menos dos de sus nucleótidos están unidos entre sí mediante un enlace internucleósido sintético (es decir, un enlace internucleósido que no es un enlace fosfodiéster) y/o (ii) un grupo químico que normalmente no se encuentra en los ácidos nucleicos está unido covalentemente al oligonucleótido. Los enlaces internucleósidos sintéticos preferidos son fosforotioatos, alquilfosfonatos, fosforoditioatos, ésteres de fosfato, alquilfosfonotioatos, fosforamidatos, carbamatos, carbonatos, triésteres de fosfato, acetamidatos, ésteres de carboximetilo y péptidos.
El término "oligonucleótido modificado" también comprende oligonucleótidos que tienen una base y/o azúcar modificados covalentemente. Los "oligonucleótidos modificados" comprenden, por ejemplo, oligonucleótidos con residuos de azúcar que están unidos covalentemente a grupos orgánicos de bajo peso molecular distintos de un grupo hidroxilo en la posición 3' y un grupo fosfato en la posición 5'. Los oligonucleótidos modificados pueden comprender, por ejemplo, un residuo de ribosa 2'-O-alquilado u otro azúcar en lugar de ribosa, tal como arabinosa.
Debe entenderse que todas las realizaciones descritas anteriormente con respecto a oligonucleótidos también pueden aplicarse a polinucleótidos.
Por "ARN de interferencia pequeño" o "ARNip", como se usa en este documento, se entiende una molécula de ARN aislada, preferentemente de más de 10 nucleótidos de longitud, más preferentemente de más de 15 nucleótidos de longitud, y lo más preferentemente de 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud que se usa para identificar un gen diana o ARNm que se va a degradar. Un intervalo de 19 a 25 nucleótidos es el tamaño más preferido para los ARNip.
El ARNip según la enseñanza puede comprender ARN parcialmente purificado, ARN sustancialmente puro, ARN sintético o ARN producido de forma recombinante, así como ARN alterado que se diferencia del ARN natural por la adición, eliminación, sustitución y/o alteración de uno o más. nucleótidos. Tales alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como al extremo(s) del ARNip o a uno o más nucleótidos internos del ARNip; modificaciones que hacen que el ARNip sea resistente a la digestión con nucleasa (por ejemplo, el uso de ribonucleótidos sustituidos en 2' o modificaciones en la estructura principal de azúcar-fosfato); o la sustitución de uno o más nucleótidos en el ARNip por desoxirribonucleótidos. Adicionalmente, el ARNip puede modificarse para aumentar su estabilidad como se describió anteriormente para los oligonucleótidos modificados, en particular introduciendo uno o más enlaces fosforotioato.
Una o ambas cadenas del ARNip también pueden comprender un saliente 3'. Como se usa en este documento, un "saliente 3'" se refiere a al menos un nucleótido desapareado que se extiende desde el extremo 3' de una cadena de ARN. De este modo, en una realización, el ARNip comprende al menos un saliente 3' desde 1 a aproximadamente 6 nucleótidos (que incluye ribonucleótidos o desoxinucleótidos) de longitud, preferentemente desde 1 a aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, más preferentemente desde 1 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud, y particularmente preferentemente desde aproximadamente 2 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud. En la realización en la que ambas hebras de la molécula de ARNip comprenden un saliente 3', la longitud de los salientes puede ser igual o diferente para cada hebra. En una realización más preferida, el saliente 3' está presente en ambas hebras del ARNip y tiene una longitud de 2 nucleótidos. Por ejemplo, cada hebra del ARNip de la enseñanza puede comprender proyecciones 3' de ácido didesoxitimidílico ("TT") o ácido diuridílico ("uu").
Para potenciar la estabilidad del ARNip, los salientes 3' también pueden estabilizarse contra la degradación. En una realización, los salientes se estabilizan incluyendo nucleótidos de purina, tales como nucleótidos de adenosina o guanosina. Alternativamente, la sustitución de nucleótidos de pirimidina por análogos modificados, por ejemplo, la sustitución de nucleótidos de uridina en los salientes 3' por 2'-desoxitimidina, se tolera y no afecta la eficacia de la degradación del ARNi. En particular, la ausencia de un 2'-hidroxilo en la 2'-desoxitimidina potencia significativamente la resistencia a la nucleasa del saliente 3' en el medio de cultivo de tejidos.
Las hebras sentido y antisentido del ARNip pueden comprender dos moléculas de ARN monocatenario complementarias o pueden comprender una única molécula en la que dos porciones complementarias tienen pares de bases y están unidas covalentemente mediante un área de "horquilla" monocatenaria. Es decir, la región sentido y la región antisentido pueden conectarse covalentemente mediante una molécula conectora. La molécula conectora puede ser un conector polinucleotídico o no nucleotídico. Sin desear quedar ligado a ninguna teoría, se cree que el área en horquilla del último tipo de molécula de ARNip se escinde intracelularmente por la proteína "Dicer" (o su equivalente) para formar un ARNip de dos moléculas de ARN con pares de bases individuales.
Como se usa en este documento, "ARNm diana" se refiere a una molécula de ARN que es un diana para la regulación negativa.
El ARNip se puede expresar a partir de vectores de expresión de pol III sin un cambio en el sitio de direccionamiento, ya que se cree que la expresión de ARN de promotores de pol III únicamente es eficaz cuando el primer nucleótido transcrito es una purina.
El ARNip según la enseñanza puede dirigirse a cualquier tramo de aproximadamente 19-25 nucleótidos contiguos en cualquiera de las secuencias de ARNm diana (la "secuencia diana"). Las técnicas para seleccionar secuencias diana para ARNip se dan, por ejemplo, en Tuschl T et al., "The siRNA User Guide", revisada el 11 de octubre de 2002. "The siRNA User Guide" está disponible en Internet en un sitio web mantenido por Dr. Thomas Tuschl, Lab- oratory of RNA Molecular Biology, Rockefeller University, Nueva York, EE. UU., y se puede encontrar accediendo al sitio web de la Universidad Rockefeller y buscando con la palabra clave "ARNip". De este modo, la hebra sentido del presente ARNip comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica a cualquier tramo contiguo de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos en el ARNm diana.
Generalmente, se puede seleccionar una secuencia diana en el ARNm diana a partir de una secuencia de ADNc dada correspondiente al ARNm diana, preferentemente comenzando de 50 a 100 nt aguas abajo (es decir, en la dirección 3') desde el codón de inicio. Sin embargo, la secuencia diana puede localizarse en las regiones no traducidas 5' o 3', o en la región cercana al codón de inicio.
El ARNip se puede obtener usando varias técnicas conocidas para los expertos en la técnica. Por ejemplo, el ARNip puede sintetizarse químicamente o producirse de forma recombinante usando métodos conocidos en la técnica, tales como el sistema in vitro de Drosophila descrito en La solicitud publicada en EE.UU. 2002/0086356 de Tuschl et al.
Preferentemente, el ARNip se sintetiza químicamente usando fosforamiditas de ribonucleósidos apropiadamente protegidas y un sintetizador de ADN/ARN convencional. El ARNip se puede sintetizar como dos moléculas de ARN complementarias separadas o como una única molécula de ARN con dos regiones complementarias.
Alternativamente, el ARNip también se puede expresar a partir de plásmidos de ADN circular o lineal recombinante usando cualquier promotor apropiado. Tales realizaciones se incluyen según la presente enseñanza cuando en este documento se hace referencia a la administración de ARNip o la incorporación de ARNip en composiciones farmacéuticas. Los promotores apropiados para expresar ARNip de la enseñanza a partir de un plásmido incluyen, por ejemplo, las secuencias del promotor U6 o H1 RNA pol III y el promotor de citomegalovirus.
La selección de otros promotores apropiados está dentro de los conocimientos de la técnica. Los plásmidos recombinantes de la enseñanza también pueden comprender promotores inducibles o regulables para la expresión del ARNip en un tejido particular o en un entorno intracelular particular.
El ARNip expresado a partir de plásmidos recombinantes puede aislarse de sistemas de expresión de células cultivadas mediante técnicas estándar o puede expresarse intracelularmente. El uso de plásmidos recombinantes para administrar ARNip a células in vivo se analiza con más detalle a continuación. El ARNip se puede expresar a partir de un plásmido recombinante como dos moléculas de ARN complementarias separadas o como una única molécula de ARN con dos regiones complementarias.
La selección de plásmidos apropiados para expresar ARNip, métodos para insertar secuencias de ácido nucleico para expresar el ARNip en el plásmido y métodos para administrar el plásmido recombinante a las células de interés están dentro de los conocimientos de la técnica.
El ARNip también se puede expresar a partir de vectores virales recombinantes intracelularmente in vivo. Los vectores virales recombinantes comprenden secuencias que codifican el ARNip y cualquier promotor apropiado para expresar las secuencias de ARNip. Los vectores virales recombinantes también pueden comprender promotores inducibles o regulables para la expresión del ARNip en un tejido particular o en un entorno intracelular particular. El ARNip se puede expresar a partir de un vector viral recombinante como dos moléculas de ARN complementarias separadas o como una única molécula de ARN con dos regiones complementarias.
El término "péptido" comprende oligopéptidos y polipéptidos y se refiere a sustancias que comprenden dos o más, preferentemente 3 o más, preferentemente 4 o más, preferentemente 6 o más, preferentemente 8 o más, preferentemente 10 o más, preferentemente 13 o más, preferentemente 16 más, preferentemente 21 o más y hasta preferentemente 8, 10, 20, 30, 40 o 50, en particular 100 aminoácidos unidos covalentemente mediante enlaces peptídicos. El término "proteína" se refiere a péptidos grandes, preferentemente a péptidos con más de 100 residuos de aminoácidos, pero en general los términos "péptidos" y "proteínas" son sinónimos y se usan indistintamente en este documento.
Preferentemente, se han aislado las proteínas y péptidos descritos según la enseñanza. Los términos "proteína aislada" o "péptido aislado" significan que la proteína o péptido ha sido separado de su entorno natural. Una proteína o péptido aislado puede estar en un estado esencialmente purificado. El término "esencialmente purificado" significa que la proteína o péptido está esencialmente libre de otras sustancias con las que está asociado en la naturaleza oin vivo.
Tales proteínas y péptidos se pueden usar, por ejemplo, en la producción de anticuerpos y en un ensayo inmunitario o de diagnóstico o como agentes terapéuticos. Las proteínas y péptidos descritos según las enseñanzas pueden aislarse de muestras biológicas tales como homogeneizados de tejidos o células y también pueden expresarse de forma recombinante en una multiplicidad de sistemas de expresión pro o eucarióticos.
Para los fines de la presente enseñanza, las "variantes" de una proteína o péptido o de una secuencia de aminoácidos comprenden variantes de inserción de aminoácidos, variantes de deleción de aminoácidos y/o variantes de sustitución de aminoácidos.
Las variantes de inserción de aminoácidos comprenden fusiones amino y/o carboxi terminales y también inserciones de uno o dos o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos particular. En el caso de variantes de secuencia de aminoácidos que tienen una inserción, se insertan uno o más residuos de aminoácidos en un sitio particular en una secuencia de aminoácidos, aunque también es posible una inserción aleatoria con un cribado apropiado del producto resultante.
Las variantes de deleción de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia.
Las variantes de sustitución de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de al menos un residuo de la secuencia y la inserción de otro residuo en su lugar. Se prefieren las modificaciones en posiciones de la secuencia de aminoácidos que no están conservadas entre proteínas o péptidos homólogos y/o la sustitución de aminoácidos por otros que tengan propiedades similares.
Preferentemente, los cambios de aminoácidos en variantes de proteínas son cambios de aminoácidos conservadores, es decir, sustituciones de aminoácidos cargados o no cargados de manera similar. Un cambio de aminoácido conservador implica la sustitución de uno de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos naturales generalmente se dividen en cuatro familias: ácidos (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), no polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) y aminoácidos no cargados, polares (glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina). La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos.
Preferentemente, el grado de similitud, preferentemente identidad, entre una secuencia de aminoácidos dada y una secuencia de aminoácidos que es una variante de dicha secuencia de aminoácidos dada será de al menos el 70 %, preferentemente al menos el 80 %, preferentemente al menos el 85 %, incluso más preferentemente al menos el 90 % o lo más preferentemente al menos el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %. El grado de similitud o identidad se da preferentemente para una región de al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 120, al menos aproximadamente 140, al menos aproximadamente 160, al menos aproximadamente 200 o 250 aminoácidos. En realizaciones preferidas, el grado de similitud o identidad se proporciona para toda la longitud de la secuencia de aminoácidos de referencia.
Los péptidos y variantes de aminoácidos descritos en este documento se pueden preparar fácilmente con la ayuda de técnicas de síntesis de péptidos conocidas tales como, por ejemplo, mediante síntesis en fase sólida (Merrifield, 1964) y métodos similares o mediante manipulación de ADN recombinante. La manipulación de secuencias de ADN para preparar proteínas y péptidos que tienen sustituciones, inserciones o deleciones se describe en detalle en Sambrook et al. (1989), por ejemplo.
Según la enseñanza, los "derivados" de proteínas y péptidos son formas modificadas de proteínas y péptidos. Tales modificaciones incluyen cualquier modificación química y comprenden sustituciones, eliminaciones y/o adiciones únicas o múltiples de cualquier molécula asociada con la proteína o péptido, tales como carbohidratos, lípidos y/o proteínas o péptidos. El término "derivado" también se extiende a todos los equivalentes químicos funcionales de dichas proteínas y péptidos. Preferentemente, un péptido modificado tiene una mayor estabilidad y/o una mayor inmunogenicidad.
Según la enseñanza, una variante de un ácido nucleico o secuencia de aminoácidos, una secuencia de aminoácidos sustancialmente correspondiente o un fragmento o derivado de un péptido tiene preferentemente una propiedad funcional del ácido nucleico o secuencia de aminoácidos, la secuencia de aminoácidos o el péptido, respectivamente, del que se deriva. Tales propiedades funcionales comprenden la interacción con anticuerpos, la interacción con otros péptidos o proteínas, la unión selectiva de ácidos nucleicos y una actividad enzimática. En una realización, una variante de un ácido nucleico o secuencia de aminoácidos, una secuencia de aminoácidos sustancialmente correspondiente o un fragmento o derivado de un péptido es inmunológicamente equivalente al ácido nucleico o secuencia de aminoácidos, la secuencia de aminoácidos o el péptido, respectivamente, del cual se ha derivado. En una realización, la propiedad funcional es una propiedad inmunológica. Una propiedad particular es la capacidad de formar un complejo con moléculas de MHC y, donde corresponda, generar una respuesta inmunitaria, preferentemente mediante estimulación de células citotóxicas o T colaboradoras. Un fragmento de un antígeno tumoral comprende preferentemente una secuencia de al menos 6, en particular al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 15, al menos 20, al menos 30 o al menos 50, aminoácidos consecutivos del antígeno tumoral. Un fragmento de un antígeno tumoral comprende preferentemente una secuencia de hasta 8, en particular hasta 10, hasta 12, hasta 15, hasta 20, hasta 30 o hasta 55 aminoácidos consecutivos del antígeno tumoral. Un fragmento de un antígeno tumoral es preferentemente una parte del antígeno tumoral que puede presentarse con moléculas de MHC y cuando así se presenta es capaz de estimular una respuesta celular.
Los fragmentos preferidos de un antígeno tumoral son apropiados para la estimulación de linfocitos T citotóxicos in vivo pero también para la producción de linfocitos T expandidos y estimulados para la transferencia adoptiva terapéutica ex vivo.
Los antisueros que contienen anticuerpos específicos que se unen específicamente a la proteína diana pueden prepararse mediante diversos procedimientos estándar; véase, por ejemplo, "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" de Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9; "Antibodies: A Laboratory Manual" de Ed Harlow, David Lane, ISBN: 0879693142 y "Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" de Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN 0879695447. En este sentido, también es posible generar anticuerpos afines y específicos que reconocen proteínas de membrana complejas en su forma nativa (Azorsa et al., J. Immunol. Methods 229: 35-48, 1999; Anderson et al., J. Immunol. 143: 1899-1904,1989; Gardsvoll, J. Immunol. Methods 234: 107-116, 2000). Esto es especialmente relevante para la preparación de anticuerpos que deben usarse terapéuticamente, pero también para muchas aplicaciones de diagnóstico. De este modo es posible inmunizar con la proteína completa, con secuencias parciales extracelulares así como con células que expresan la molécula diana en forma fisiológicamente plegada.
Los anticuerpos monoclonales se preparan tradicionalmente mediante la tecnología de hibridoma. (para detalles técnicos véase: "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" de Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19 963722-9; "Antibodies: A Laboratory Manual" de Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142; "Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" de Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447).
Se sabe que únicamente una pequeña parte de una molécula de anticuerpo, el parátopo, participa en la unión del anticuerpo a su epítopo (cf. Clark, W.R. (1986), The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991), Essential Immunology, 7th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford). Las regiones pFc' y Fc son, por ejemplo, efectoras de la cascada del complemento pero no participan en la unión al antígeno. Un anticuerpo del que se ha eliminado enzimáticamente la región pFc' o que se ha producido sin la región pFc', denominado fragmento F(ab')<2>, porta ambos sitios de unión al antígeno de un anticuerpo completo. De manera similar, un anticuerpo del que se ha eliminado enzimáticamente la región Fc o que se ha producido sin dicha región Fc, denominado fragmento Fab, porta un sitio de unión a antígeno de una molécula de anticuerpo intacta. Adicionalmente, los fragmentos Fab constan de una cadena ligera unida covalentemente de un anticuerpo y parte de la cadena pesada de dicho anticuerpo, denominada Fd. Los fragmentos Fd son los principales determinantes de la especificidad del anticuerpo (un único fragmento Fd puede asociarse con hasta diez cadenas ligeras diferentes, sin alterar la especificidad del anticuerpo) y los fragmentos Fd, cuando se aíslan, conservan la capacidad de unirse a un epítopo.
Dentro de la parte de unión al antígeno de un anticuerpo se encuentran regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que interactúan directamente con el epítopo del antígeno y regiones estructurales (FRs) que mantienen la estructura terciaria del parátopo. Tanto el fragmento Fd de la cadena pesada como también la cadena ligera de las inmunoglobulinas IgG contienen cuatro regiones estructurales (FR1 a FR4), que están separadas en cada caso por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3). Las CDR y, en particular, las regiones CDR3 y, aún más particularmente, la región CDR3 de la cadena pesada son responsables en gran medida de la especificidad de los anticuerpos.
Se sabe que las regiones no CDR de un anticuerpo de mamífero pueden ser reemplazadas por regiones similares de anticuerpos con la misma o diferente especificidad, conservando la especificidad por el epítopo del anticuerpo original. Esto hizo posible el desarrollo de anticuerpos "humanizados" en los que las CDR no humanas están unidas covalentemente a regiones FR y/o Fc/pFc' humanas para producir un anticuerpo funcional.
Como otro ejemplo, el documento WO 92/04381 describe la producción y uso de anticuerpos RSV murinos humanizados en los que al menos parte de las regiones FR murinas han sido reemplazadas con regiones FR de origen humano. Los anticuerpos de este tipo, incluidos fragmentos de anticuerpos intactos con capacidad de unión a antígenos, se denominan a menudo anticuerpos "quiméricos".
Según la enseñanza, el término "anticuerpo" también incluye fragmentos F(ab')<2>, Fab, Fv y Fd de anticuerpos, anticuerpos quiméricos, en los que las regiones Fc y/o FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera se han reemplazado con secuencias homólogas humanas o no humanas, anticuerpos quiméricos del fragmento F(ab')<2>en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera se han reemplazado con secuencias homólogas humanas o no humanas, anticuerpos de fragmento Fab quiméricos en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera se han reemplazado con secuencias homólogas humanas o no humanas, y anticuerpos de fragmento Fd quiméricos en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 se han reemplazado con secuencias homólogas humanas o no humanas. El término "anticuerpo" también comprende anticuerpos "de cadena única".
Las proteínas y péptidos que no son anticuerpos que se unen específicamente a antígenos tumorales pueden reemplazar a los anticuerpos cuando se usan según las enseñanzas. Las sustancias de unión de este tipo pueden obtenerse, por ejemplo, mediante bibliotecas de péptidos degenerados, que pueden prepararse simplemente en solución en forma inmovilizada o como bibliotecas de presentación en fagos. También es posible preparar bibliotecas combinatorias de péptidos con uno o más aminoácidos. También se pueden preparar bibliotecas de peptoides y residuos sintéticos no peptídicos.
Los anticuerpos también pueden acoplarse a un marcador terapéutico para mostrar células y tejidos que expresan antígenos tumorales. También pueden estar acoplados a unidades estructurales efectoras terapéuticas.
En una realización, los anticuerpos descritos en este documento se unen específicamente a una porción de los antígenos tumorales identificados según la enseñanza que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 del listado de secuencias o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos. En una realización, los anticuerpos descritos en este documento se unen específicamente a un péptido de antígeno tumoral descrito en este documento que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 del listado de secuencias o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia o fragmento de aminoácidos. Tales anticuerpos se pueden obtener usando un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 del listado de secuencias o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia de aminoácidos o fragmento para inmunización.
Los marcadores detectables incluyen cualquier marcador que funcione para: (i) proporcionar una señal detectable; (ii) interactuar con una segunda marcador para modificar la señal detectable proporcionada por el primer o segundo marcador, por ejemplo, FRET (Transferencia de Energía por Resonancia de Fluorescencia); (iii) afectar la movilidad, por ejemplo, movilidad electroforética, por carga, hidrofobicidad, forma u otros parámetros físicos, o (iv) proporcionar una unidad estructural de captura, por ejemplo, afinidad, anticuerpo/antígeno o formación de complejos iónica. Como marcadores son apropiadas estructuras tales como marcadores fluorescentes, marcadores luminiscentes, marcadores cromóforos, marcadores radioisotópicos, marcadores isotópicos, preferentemente marcadores isotópicos estables, marcadores isobáricos, marcadores enzimáticos, marcadores de partículas, en particular marcadores de partículas metálicas, marcadores de partículas magnéticas, marcadores de partículas poliméricas, pequeñas moléculas orgánicas tales como biotina, ligandos de receptores o moléculas de unión tales como proteínas de adhesión celular o lectinas, secuencias de marcadores que comprenden ácidos nucleicos y/o residuos de aminoácidos que pueden detectarse mediante el uso de agentes de unión, etc. Los marcadores detectables comprenden de forma no limitativa, sulfato de bario, ácido iocetámico, ácido iopanoico, ipodato cálcico, diatrizoato sódico, diatrizoato de meglumina, metrizamida, tiropanoato sódico y radiodiagnósticos, incluyendo emisores de positrones como el flúor-18 y el carbono-11, emisores gamma como el yodo- 123, tecnecio-99m, yodo-131 e indio-111, nucleidos para resonancia magnética nuclear, como flúor y gadolinio.
Según la enseñanza, el término "molécula efectora terapéutica" significa cualquier molécula que pueda ejercer un efecto terapéutico. Según la enseñanza, una molécula efectora terapéutica preferentemente se guía selectivamente a una célula que expresa uno o más antígenos tumorales e incluye agentes anticancerígenos, compuestos marcados con yodo radiactivo, toxinas, fármacos citostáticos o citolíticos, etc. Los agentes anticancerígenos comprenden, por ejemplo, aminoglutetimida, azatioprina, sulfato de bleomicina, busulfán, carmustina, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida, ciclosporina, citarabidina, dacarbazina, dactinomicina, daunorrubina, doxorrubicina, taxol, etopósido, fluorouracilo, interferón-a, lomustina, mercaptopurina, metotrexato, mitotano, procarbazina HCl, tioguanina, sulfato de vinblastina y sulfato de vincristina. Otros agentes anticancerígenos se describen, por ejemplo, clorhidrato de en Goodman and Gilman, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", 8a Edición, 1990, McGraw-Hill, Inc., en particular capítulo 52 (Antineoplastic Agents (Paul Calabresi and Bruce A. Chabner). Las toxinas pueden ser proteínas tales como la proteína antiviral de la hierba carmín, la toxina del cólera, la toxina de la tos ferina, la ricina, la gelonina, la abrina, la exotoxina de la difteria oPseudomonasexotoxina. Los residuos de toxinas también pueden ser radionucleidos que emiten alta energía, tal como el cobalto-60.
El término "complejo mayor de histocompatibilidad" o "MHC" incluye MHC de clase I y clase II y se refiere a un complejo de genes presentes en todos los vertebrados. Las proteínas o moléculas del MHC participan en la señalización entre los linfocitos y las células presentadoras de antígenos en reacciones inmunitarias normales uniendo péptidos y presentándolos para su reconocimiento por los receptores de células T (TCR). Las moléculas de MHC se unen a péptidos dentro de un compartimento de procesamiento intracelular y presentan estos péptidos en la superficie de las células presentadoras de antígenos para su reconocimiento por las células T La región MHC humana, también denominada HLA, se encuentra en el cromosoma 6 e incluye las regiones de clase I y clase II. En una realización preferida de todos los aspectos de la enseñanza, una molécula de MHC es una molécula de HLA.
"Reducir" o "inhibir" como se usa en este documento significa la capacidad de provocar una disminución global, preferentemente del 20 % o más, más preferentemente del 50 % o más, y lo más preferentemente del 75 % o más, en el nivel, por ejemplo en el nivel de proteína o ARNm en comparación con una muestra de referencia (por ejemplo, una muestra no tratada con ARNip). Esta reducción o inhibición de la expresión de ARN o proteínas puede ocurrir mediante escisión o degradación dirigida del ARNm. Los ensayos para la expresión de proteínas o de ácidos nucleicos se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, ELISA, análisis de transferencia Western para la expresión de proteínas y ensayos de transferencia Northern o de protección de RNasa para ARN.
El término "paciente" significa según la enseñanza un ser humano, un primate no humano u otro animal, en particular un mamífero tal como una vaca, caballo, cerdo, oveja, cabra, perro, gato o un roedor tal como un ratón y una rata. En una realización especialmente preferida, el paciente es un ser humano.
Según la enseñanza, el término "aumentado" o "cantidad aumentada" se refiere preferentemente a un aumento de al menos un 10 %, en particular de al menos un 20 %, al menos un 50 % o al menos un 100 %. La cantidad de una sustancia también aumenta en una muestra de prueba, tal como una muestra biológica, en comparación con una muestra de referencia si es detectable en la muestra de prueba pero ausente o no detectable en la muestra de referencia.
Según la enseñanza, el término "tumor" o "enfermedad tumoral" se refiere a una hinchazón o lesión formada por un crecimiento anormal de células (llamadas células neoplásicas o células tumorales). Por "célula tumoral" se entiende una célula anormal que crece mediante una proliferación celular rápida e incontrolada y continúa creciendo después de que cesan los estímulos que iniciaron el nuevo crecimiento. Los tumores muestran una falta parcial o total de organización estructural y coordinación funcional con el tejido normal y, suele, forman una masa distinta de tejido, que puede ser benigna, premaligna o maligna.
Preferentemente, una enfermedad tumoral según la enseñanza es una enfermedad cancerosa, es decir, una enfermedad maligna y una célula tumoral es una célula cancerosa. Preferentemente, una enfermedad tumoral se caracteriza por células en las que un ácido nucleico tumoral y/o antígeno tumoral identificado según la enseñanza se expresa o se expresa anormalmente y una célula tumoral o una célula tumoral circulante o metastásica se caracteriza por la expresión o expresión anormal de un ácido nucleico tumoral y/o antígeno tumoral identificado según la enseñanza. Preferentemente, una enfermedad tumoral, una célula tumoral o una célula tumoral circulante o metastásica se caracteriza por la presentación de un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas con MHC de clase I.
"Expresión anormal" significa según la enseñanza que la expresión está alterada, preferentemente aumentada, en comparación con el estado en un individuo sano. Un aumento de expresión se refiere a un aumento de al menos un 10 %, en particular de al menos un 20 %, al menos un 50 %, al menos un 100 %, al menos un 200 %, al menos un 500 %, al menos un 1000 %, al menos un 10000 % o incluso más. En una realización, la expresión únicamente se encuentra en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido sano está reprimida.
Según la enseñanza, las células de un tejido u órgano no expresan sustancialmente un antígeno tumoral identificado según la enseñanza y/o un ácido nucleico tumoral identificado según la enseñanza si el nivel de expresión es menor en comparación con la expresión en células de placenta o tejido de placenta y/o es menor en comparación con la expresión en células tumorales de ovario y/o células tumorales de pulmón o tejido tumoral de ovario y/o tejido tumoral de pulmón. Preferentemente, el nivel de expresión es inferior al 10 %, preferentemente inferior al 5 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0.5 %, 0.1 % o 0.05 % o incluso inferior en comparación con las células o tejidos anteriores. Preferentemente, un antígeno tumoral y/o un ácido nucleico no se expresa sustancialmente si el nivel de expresión está por debajo del límite de detección. Preferentemente, un tejido que no expresa sustancialmente un antígeno tumoral identificado según las enseñanzas y/o un ácido nucleico tumoral identificado según las enseñanzas cuando el tejido está libre de tumores, es decir, no tiene una enfermedad tumoral, es un tejido de ovario, pulmón, mama, duodeno, piel, colon, hígado, ganglio linfático, estómago, bazo, riñón, esófago, páncreas, endometrio, cerebro, vesícula biliar, vejiga urinaria, íleon, glándula suprarrenal, recto y músculo esquelético, preferentemente tejido de ovario o tejido del pulmón. Preferentemente tal tejido es un tejido distinto del tejido de placenta.
Preferentemente, una enfermedad tumoral según la enseñanza es cáncer, en el que el término "cáncer" según la enseñanza comprende leucemias, seminomas, melanomas, teratomas, linfomas, neuroblastomas, gliomas, cáncer de recto, cáncer de endometrio, cáncer de riñón, cáncer suprarrenal, cáncer de tiroides, cáncer de sangre, cáncer de piel, cáncer de cerebro, cáncer de cuello uterino, cáncer intestinal, cáncer de hígado, cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de intestino, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gastrointestinal, cáncer de ganglios linfáticos, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de oído, nariz y garganta (ENT), cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer de ovario y cáncer de pulmón y las metástasis de los mismos. Ejemplos de los mismos son carcinomas de pulmón, carcinomas de mama, carcinomas de próstata, carcinomas de colon, carcinomas de células renales, carcinomas de cuello uterino o metástasis de los tipos de cáncer o tumores descritos anteriormente. El término cáncer según la enseñanza también comprende metástasis de cáncer.
Las enfermedades tumorales o cánceres preferidos según la enseñanza se seleccionan del grupo que consiste en cáncer de ovario, en particular adenocarcinoma de ovario y teratocarcinoma de ovario, cáncer de pulmón, incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), en particular carcinoma de células escamosas de pulmón y adenocarcinoma, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer hepático, cáncer de páncreas, cáncer de piel, en particular carcinoma de células basales y carcinoma de células escamosas, melanoma maligno, cáncer de cabeza y cuello, en particular adenoma pleomórfico maligno, sarcoma, en particular sarcoma sinovial y carcinosarcoma, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga urinaria, en particular carcinoma de células transicionales y carcinoma papilar, cáncer de riñón, en particular carcinoma de células renales incluyendo carcinoma de células renales de células claras y carcinoma de células renales papilar, cáncer de colon, cáncer de intestino delgado, incluyendo cáncer de íleon, en particular adenocarcinoma de intestino delgado y adenocarcinoma de íleon, carcinoma embrionario testicular, coriocarcinoma placentario, cáncer de cuello uterino, cáncer testicular, en particular seminoma testicular, teratoma testicular y cáncer testicular embrionario, y cáncer de útero, y las formas metastásicas de los mismos.
Las enfermedades tumorales o cánceres particularmente preferidos según la enseñanza se seleccionan del grupo que consiste en cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de ovario metastásico y cáncer de pulmón metastásico. Preferentemente, el cáncer de ovario es un carcinoma de ovario o un adenocarcinoma de ovario. Preferentemente, el cáncer de pulmón es un carcinoma o un adenocarcinoma, y preferentemente es un cáncer bronquiolar tal como un carcinoma bronquiolar o un adenocarcinoma bronquiolar. En una realización, la célula tumoral es una célula de dicho cáncer. Los cánceres de ovario metastásicos incluyen carcinomas de ovario metastásicos y adenocarcinomas de ovario metastásicos, y los cánceres de pulmón metastásicos incluyen carcinomas de pulmón metastásicos, adenocarcinomas de pulmón metastásicos, carcinomas bronquiolares metastásicos y adenocarcinomas bronquiolares metastásicos.
Los principales tipos de cáncer de pulmón son el carcinoma de pulmón de células pequeñas (SCLC) y el carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Hay tres subtipos principales de carcinomas de pulmón de células no pequeñas: carcinoma de pulmón de células escamosas, adenocarcinoma y carcinoma de pulmón de células grandes. Los adenocarcinomas representan aproximadamente el 10 % de los cánceres de pulmón. Este cáncer suele observarse periféricamente en los pulmones, a diferencia del cáncer de pulmón de células pequeñas y el cáncer de pulmón de células escamosas, que tienden a tener una ubicación más central.
El cáncer de piel es un crecimiento maligno en la piel. Los cánceres de piel más comunes son el cáncer de células basales, el cáncer de células escamosas y el melanoma. El melanoma maligno es un tipo grave de cáncer de piel. Se debe al crecimiento descontrolado de células pigmentarias, llamadas melanocitos.
Según la enseñanza, un "carcinoma" es un cáncer que comienza en la capa de revestimiento (células epiteliales) de los órganos.
El "carcinoma bronquiolar" es un carcinoma de pulmón, que se cree que deriva del epitelio de los bronquiolos terminales, en el que el tejido neoplásico se extiende a lo largo de las paredes alveolares y crece en pequeñas masas dentro de los alvéolos. Se puede demostrar mucina en algunas de las células y en el material de los alvéolos, que también incluye células desnudas.
El "adenocarcinoma" es un cáncer que se origina en el tejido glandular. Este tejido también forma parte de una categoría de tejido más amplia conocida como tejido epitelial. El tejido epitelial incluye piel, glándulas y una variedad de otros tejidos que recubren las cavidades y órganos del cuerpo. El epitelio se deriva embriológicamente del ectodermo, endodermo y mesodermo. Para ser clasificado como adenocarcinoma, las células no necesariamente tienen que ser parte de una glándula, siempre y cuando tengan propiedades secretoras. Esta forma de carcinoma puede ocurrir en algunos mamíferos superiores, incluidos los humanos. Los adenocarcinomas bien diferenciados tienden a parecerse al tejido glandular del que derivan, mientras que los mal diferenciados pueden no serlo. Al teñir las células de una biopsia, un patólogo determinará si el tumor es un adenocarcinoma o algún otro tipo de cáncer. Los adenocarcinomas pueden surgir en muchos tejidos del cuerpo debido a la naturaleza ubicua de las glándulas dentro del cuerpo. Si bien es posible que cada glándula no secrete la misma sustancia, siempre que la célula tenga una función exocrina, se considera glandular y, por lo tanto, su forma maligna se denomina adenocarcinoma. Los adenocarcinomas malignos invaden otros tejidos y, a menudo, metastatizan si se les da tiempo suficiente para hacerlo. El adenocarcinoma de ovario es el tipo más común de carcinoma de ovario. Incluye los adenocarcinomas serosos y mucinosos, el adenocarcinoma de células claras y el adenocarcinoma endometrioide.
El "cistoadenocarcinoma" es una forma maligna de un tumor epitelial-estroma superficial, un tipo de cáncer de ovario.
Los tumores epiteliales-estromales de superficie son una clase de neoplasias ováricas que se cree que se derivan del epitelio de la superficie ovárica (peritoneo modificado) o del tejido endometrial ectópico o de las trompas (tubárica) de Falopio. Este grupo de tumores representa la mayoría de todos los tumores de ovario.
El teratocarcinoma se refiere a un tumor de células germinales que es una mezcla de teratoma con carcinoma embrionario, coriocarcinoma o ambos. El coriocarcinoma es un cáncer maligno, trofoblástico y agresivo, generalmente de placenta. Se caracteriza por una diseminación hematógena temprana a los pulmones.
Un sarcoma es un cáncer del tejido conectivo (hueso, cartílago, grasa) que provoca la proliferación del mesodermo. Esto contrasta con los carcinomas, que son de origen epitelial. Un sarcoma sinovial es una forma rara de cáncer que generalmente ocurre cerca de las articulaciones del brazo o la pierna. Es uno de los sarcomas de tejidos blandos.
El carcinoma de células renales, también conocido como cáncer de células renales o adenocarcinoma de células renales, es un cáncer de riñón que se origina en el revestimiento del túbulo contorneado proximal, los tubos muy pequeños del riñón que filtran la sangre y eliminan los productos de desecho. El carcinoma de células renales es, con diferencia, el tipo más común de cáncer de riñón en adultos y el más letal de todos los tumores genitorurinarios. Los distintos subtipos de carcinoma de células renales son el carcinoma de células renales de células claras y el carcinoma de células renales papilar. El carcinoma de células renales de células claras es la forma más común de carcinoma de células renales. Cuando se observan bajo un microscopio, las células que forman el carcinoma de células renales de células claras aparecen muy pálidas o claras. El carcinoma papilar de células renales es el segundo subtipo más común. Estos cánceres forman proyecciones en forma de dedo meñique (llamadas papilas) en algunos, si no en la mayoría, de los tumores.
Por "metástasis" se entiende la diseminación de células cancerosas desde su sitio original a otra parte del cuerpo. La formación de metástasis es un procedimiento muy complejo y depende del desprendimiento de células malignas del tumor primario, la invasión de la matriz extracelular, la penetración de las membranas basales endoteliales para ingresar a la cavidad corporal y los vasos, y luego, después de ser transportada por la sangre, infiltración de órganos diana. Finalmente, el crecimiento de un nuevo tumor, es decir, un tumor secundario o un tumor metastásico, en el sitio diana depende de la angiogénesis. La metástasis tumoral a menudo ocurre incluso después de la extirpación del tumor primario porque las células o componentes tumorales pueden permanecer y desarrollar potencial metastásico. En una realización, el término "metástasis" según la enseñanza se refiere a "metástasis a distancia" que se refiere a una metástasis que está alejada del tumor primario y del sistema de ganglios linfáticos regionales.
Las células de un tumor secundario o metastásico son como las del tumor original. Esto significa, por ejemplo, que, si el cáncer de ovario hace metástasis en el hígado, el tumor secundario está formado por células ováricas anormales, no por células hepáticas anormales. El tumor en el hígado se denomina entonces cáncer de ovario metastásico, no cáncer hepático.
En el cáncer de ovario, la metástasis puede ocurrir de las siguientes maneras: por contacto directo o extensión, puede invadir tejidos u órganos cercanos ubicados cerca o alrededor del ovario, como las trompas de Falopio, útero, vejiga, recto, etc.; mediante siembra o eliminación en la cavidad abdominal, que es la forma más común de propagación del cáncer de ovario. Las células cancerosas se desprenden de la superficie de la masa ovárica y "caen" a otras estructuras del abdomen tales como el hígado, el estómago, el colon o el diafragma; desprendiéndose de la masa ovárica, invadiendo los vasos linfáticos y luego viajando a otras zonas del cuerpo u órganos distantes tales como el pulmón o el hígado; al desprenderse de la masa ovárica, invadiendo el sistema sanguíneo y viajando a otras áreas del cuerpo u órganos distantes.
Según la enseñanza, el cáncer de ovario metastásico incluye cáncer en las trompas de Falopio, cáncer en órganos del abdomen tales como cáncer en el intestino, cáncer en el útero, cáncer en la vejiga, cáncer en el recto, cáncer en el hígado, cáncer en el estómago, el cáncer de colon, el cáncer de diafragma, el cáncer de pulmón, el cáncer del revestimiento del abdomen o la pelvis (peritoneo) y el cáncer de cerebro. De manera similar, el cáncer de pulmón metastásico se refiere al cáncer que se ha diseminado desde los pulmones a lugares distantes o a varios lugares del cuerpo e incluye cáncer hepático, cáncer de glándulas suprarrenales, cáncer de huesos y cáncer de cerebro.
Una recaída o recurrencia ocurre cuando una persona vuelve a verse afectada por una condición que la afectó en el pasado. Por ejemplo, si un paciente ha padecido una enfermedad tumoral, ha recibido un tratamiento exitoso de dicha enfermedad y vuelve a desarrollar dicha enfermedad, dicha enfermedad recientemente desarrollada puede considerarse como una recaída o recurrencia. Sin embargo, según las enseñanzas, una recaída o recurrencia de una enfermedad tumoral puede ocurrir, pero no necesariamente, en el sitio de la enfermedad tumoral original. De este modo, por ejemplo, si una paciente ha sufrido un tumor de ovario y ha recibido un tratamiento exitoso, una recaída o recurrencia puede ser la aparición de un tumor de ovario o la aparición de un tumor en un sitio diferente al ovario. Una recaída o recurrencia de un tumor también incluye situaciones en las que un tumor se produce en un sitio diferente al sitio del tumor original así como en el sitio del tumor original. Preferentemente, el tumor original para el cual el paciente ha recibido tratamiento es un tumor primario y el tumor en un sitio diferente al sitio del tumor original es un tumor secundario o metastásico.
Según la enseñanza, una muestra biológica puede ser una muestra de tejido, incluyendo fluidos corporales, y/o una muestra celular y puede obtenerse de la manera convencional tal como mediante biopsia de tejido, incluyendo biopsia por punción, y tomando sangre, aspirado bronquial, esputo, orina, heces u otros fluidos corporales. Según la enseñanza, el término "muestra biológica" también incluye muestras biológicas procesadas tales como fracciones o aislados de muestras biológicas, por ejemplo, aislados de ácidos nucleicos y péptidos/proteínas.
Según la enseñanza, el término "célula inmunorreactiva" significa una célula que puede madurar hasta convertirse en una célula inmunitaria (tal como una célula B, una célula T colaboradora o una célula T citolítica) con una estimulación apropiada. Las células inmunorreactivas comprenden células madre hematopoyéticas CD34+, células T inmaduras y maduras y células B inmaduras y maduras. Si se desea la producción de células T citolíticas o colaboradoras que reconozcan un antígeno tumoral, la célula inmunorreactiva se pone en contacto con una célula que expresa un antígeno tumoral en condiciones que favorecen la producción, diferenciación y/o selección de células T citolíticas y de células T colaboradoras. La diferenciación de los precursores de células T en células T citolíticas, cuando se exponen a un antígeno, es similar a la selección clonal del sistema inmunitario.
Los términos "célula T" y "linfocito T" se usan indistintamente en este documento e incluyen células T colaboradoras (células T CD4+) y células T citotóxicas (CTL, células T CD8+) que comprenden células T citolíticas.
Algunos métodos terapéuticos se basan en una reacción del sistema inmunitario de un paciente, que da como resultado la lisis de células enfermas, tales como las células cancerosas, que presentan un antígeno tumoral con MHC de clase I. En este sentido, por ejemplo, se pueden administrar linfocitos T citotóxicos autólogos específicos para un complejo de un péptido antígeno tumoral y una molécula de MHC a un paciente que tiene una enfermedad tumoral. La producción de tales linfocitos T citotóxicosin vitroes conocida. Un ejemplo de un método para diferenciar células T se puede encontrar en el documento WO-A-9633265. Generalmente, se toma del paciente una muestra que contiene células tales como células sanguíneas y las células se ponen en contacto con una célula que presenta el complejo y que puede provocar la propagación de linfocitos T citotóxicos (por ejemplo, células dendríticas). La célula diana puede ser una célula transfectada tal como una célula COS. Estas células transfectadas presentan el complejo deseado en su superficie y, en contacto con linfocitos T citotóxicos, estimulan la propagación de estos últimos. A continuación se administran al paciente los linfocitos T citotóxicos autólogos expandidos clonalmente.
En otro método de selección de linfocitos T citotóxicos, se usan tetrámeros fluorogénicos de complejos molécula/péptido MHC de clase I para obtener clones específicos de linfocitos T citotóxicos (Altman et al., Science 274:94-96, 1996; Dunbar et al., Curr. Biol. 8:413-416, 1998).
Adicionalmente, las células que presentan el complejo deseado (por ejemplo, células dendríticas) pueden combinarse con linfocitos T citotóxicos de individuos sanos u otras especies (por ejemplo, ratón), lo que puede dar como resultado la propagación de linfocitos T citotóxicos específicos con alta afinidad. El receptor de células T de alta afinidad de estos linfocitos T específicos propagados se puede clonar y opcionalmente humanizar en un grado diferente, y los receptores de células T así obtenidos se pueden transducir luego mediante transferencia genética, por ejemplo usando vectores retrovirales, en células T de pacientes. La transferencia adoptiva puede llevarse a cabo usando estos linfocitos T genéticamente alterados (Stanislawski et al., Nat Immunol. 2:962-70, 2001; Kessels et al., Nat Immunol.
2:957-61,2001).
También se pueden generar linfocitos T citotóxicos.in vivode una manera conocida per se. Un método usa células no proliferativas que expresan un complejo MHC de clase I/péptido. Las células usadas aquí serán aquellas que suelen expresar el complejo, tales como células tumorales irradiadas o células transfectadas con uno o ambos genes necesarios para la presentación del complejo (es decir, el péptido antigénico y la molécula MHC presentadora). Otra forma preferida es la introducción del antígeno tumoral en forma de ARN recombinante que puede introducirse en las células mediante transferencia liposomal o mediante electroporación, por ejemplo. Las células resultantes presentan el complejo de interés y son reconocidas por linfocitos T citotóxicos autólogos que luego se propagan.
Se puede lograr un efecto similar combinando un antígeno tumoral o un péptido de antígeno tumoral con un adyuvante para realizar la incorporación en células presentadoras de antígenoin vivoposible. El antígeno tumoral o el péptido del antígeno tumoral puede representarse como proteína, como ADN (por ejemplo, dentro de un vector) o como ARN. El antígeno tumoral se puede procesar para producir un péptido asociado a la molécula MHC, mientras que se puede presentar un fragmento del mismo sin necesidad de procesamiento adicional. Esto último es especialmente cierto si estos pueden unirse a moléculas MHC. Se dan preferencia a formas de administración en las que se procesa el antígeno completo.in vivopor una célula dendrítica, ya que esto también puede producir respuestas de células T colaboradoras que son necesarias para una respuesta inmunitaria efectiva (Ossendorp et al., Immunol Lett. 74:75-9, 2000; Ossendorp et al., J. Exp. Med. 187:693-702, 1998). En general, es posible administrar una cantidad eficaz del antígeno tumoral a un paciente mediante inyección intradérmica, por ejemplo. Sin embargo, la inyección también se puede llevar a cabo por vía intranodal en un ganglio linfático (Maloy et al., Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-303, 2001).
Las composiciones farmacéuticas y los métodos de tratamiento descritos según la enseñanza también se pueden usar para inmunización o vacunación para tratar o prevenir terapéuticamente una enfermedad descrita en este documento. Según la enseñanza, los términos "inmunización" o "vacunación" se refieren preferentemente a un aumento o activación de una respuesta inmunitaria a un antígeno. Es posible usar modelos animales para probar un efecto inmunizante contra el cáncer. Por ejemplo, se pueden introducir células cancerosas humanas en un ratón para generar un tumor. El efecto sobre las células cancerosas (por ejemplo, reducción del tamaño del tumor) se puede medir como medida de la eficacia de una inmunización mediante un agente administrado al animal.
Como parte de la composición para una inmunización o vacunación, preferentemente uno o más agentes como se describe en este documento se administran junto con uno o más adyuvantes para inducir una respuesta inmunitaria o para aumentar una respuesta inmunitaria. Un adyuvante es una sustancia que potencia una respuesta inmunitaria. Los adyuvantes pueden potenciar la respuesta inmunitaria proporcionando un recipiente de antígeno (extracelularmente o en macrófagos), activando macrófagos y/o estimulando linfocitos particulares. Los adyuvantes son conocidos y comprenden de forma no limitativa monofosforil lípido A (MPL, SmithKIine Beecham), saponinas tales como QS21 (SmithKIine Beecham), DQS21 (SmithKIine Beecham); Documento WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 y QS-L1 (So et al., Mol. Cells 7:178-186, 1997), adyuvante incompleto de Freund, adyuvante completo de Freund, vitamina E, montanida, alumbre, oligonucleótidos CpG (cf. Kreig et al., Nature 374:546-9, 1995) y diversas emulsiones de agua en aceite preparadas a partir de aceites biológicamente degradables tal como escualeno y/o tocoferol. Preferentemente, según la enseñanza, los péptidos se administran en una mezcla con DQS21/MPL. La proporción de DQS21 a MPL es por lo general de aproximadamente 1:10 a 10:1, preferentemente de aproximadamente 1:5 a 5:1 y en particular de aproximadamente 1:1. Para la administración a seres humanos, una formulación de vacuna contiene por lo general DQS21 y MPL en un intervalo de aproximadamente 1 |jg a aproximadamente 100 |jg.
También se pueden administrar otras sustancias que estimulan una respuesta inmunitaria del paciente. Es posible, por ejemplo, usar citocinas en una vacunación debido a sus propiedades reguladoras de los linfocitos. Tales citocinas comprenden, por ejemplo, la interleucina-12 (IL-12), que se ha demostrado que aumenta las acciones protectoras de las vacunas (cf. Science 268:1432-1434, 1995), GM-CSF e IL-18.
Hay un número de compuestos que potencian la respuesta inmunitaria y que, por lo tanto, pueden usarse en una vacunación. Dichos compuestos comprenden moléculas coestimulantes proporcionadas en forma de proteínas o ácidos nucleicos tales como B7-1 y B7-2 (CD80 y CD86, respectivamente).
Los péptidos se pueden administrar de una manera conocida per se. En una realización, los ácidos nucleicos se administran mediante métodosex-vivo,es decir, eliminando células de un paciente, modificación genética de dichas células para incorporar un ácido nucleico y reintroducción de las células alteradas en el paciente. Esto generalmente comprende introducir una copia funcional de un gen en las células de un pacientein vitroy reintroducir las células genéticamente alteradas en el paciente. La copia funcional del gen está bajo el control funcional de elementos reguladores que permiten que el gen se exprese en las células genéticamente alteradas. Los métodos de transfección y transducción son conocidos para el experto.
La enseñanza prevé también la administración de ácidos nucleicos.in vivousando, por ejemplo, vectores tales como virus y liposomas controlados por dianas.
En una realización preferida, un virus o vector viral para administrar un ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en adenovirus, virus adenoasociados, virus de la viruela, incluyendo virus vaccinia y virus de la viruela atenuados, virus del bosque de Semliki, retrovirus, virus de Sindbis y partículas parecidas a virus Ty. Se prefieren especialmente adenovirus y retrovirus. Los retrovirus por lo general tienen una replicación deficiente (es decir, son incapaces de generar partículas infecciosas).
Métodos para introducir ácidos nucleicos en las célulasin vitrooin vivocomprenden transfección de precipitados de fosfato cálcico de ácido nucleico, transfección de ácidos nucleicos asociados con DEAE, transfección o infección con los virus anteriores que portan los ácidos nucleicos de interés, transfección mediada por liposomas y similares. En realizaciones particulares, se da preferencia a dirigir el ácido nucleico a células particulares. En tales realizaciones, un vehículo usado para administrar un ácido nucleico a una célula (por ejemplo, un retrovirus o un liposoma) puede tener una molécula de control diana unida. Por ejemplo, una molécula tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie en la célula diana o un ligando para un receptor en la célula diana puede incorporarse o unirse al portador de ácido nucleico. Los anticuerpos preferidos comprenden anticuerpos que se unen selectivamente a un antígeno tumoral. Si se desea la administración de un ácido nucleico a través de liposomas, se pueden incorporar a la formulación de liposomas proteínas que se unen a una proteína de membrana superficial asociada con la endocitosis para hacer posible el control y/o la absorción del diana. Tales proteínas comprenden proteínas de la cápsida o fragmentos de las mismas que son específicas para un tipo de célula particular, anticuerpos contra proteínas que se internalizan, proteínas que se dirigen a un sitio intracelular y similares.
Los compuestos terapéuticamente activos de la enseñanza pueden administrarse mediante cualquier vía convencional, incluso mediante inyección o infusión. La administración puede llevarse a cabo, por ejemplo, por vía oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea o transdérmica. Preferentemente, los anticuerpos se administran terapéuticamente mediante un aerosol pulmonar. Los ácidos nucleicos antisentido se administran preferentemente mediante administración intravenosa lenta.
Las composiciones de la enseñanza se administran en cantidades eficaces. Una "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad que logra una reacción deseada o un efecto deseado sola o junto con dosis adicionales. En el caso del tratamiento de una enfermedad particular o de una condición particular, la reacción deseada se refiere preferentemente a la inhibición del curso de la enfermedad. Esto comprende frenar el progreso de la enfermedad y, en particular, interrumpir o invertir el progreso de la enfermedad. La reacción deseada en un tratamiento de una enfermedad o de una afección también puede ser un retraso de la aparición o una prevención de la aparición de dicha enfermedad o dicha afección. Según la enseñanza, un diagnóstico o tratamiento de cáncer también puede incluir el diagnóstico o tratamiento de metástasis de cáncer que ya se han formado o se formarán. Según la enseñanza, el término "tratamiento" comprende tratamiento terapéutico y profiláctico, es decir, prevención.
Una cantidad eficaz de una composición de la enseñanza dependerá de la afección que se va a tratar, la gravedad de la enfermedad, los parámetros individuales del paciente, incluyendo la edad, la condición fisiológica, el tamaño y el peso, la duración del tratamiento, el tipo de terapia adjunta (si está presente), la vía de administración específica y factores similares. De acuerdo con lo anterior, las dosis de las composiciones de la enseñanza administradas pueden depender de diversos de tales parámetros. En el caso de que una reacción en un paciente sea insuficiente con una dosis inicial, se pueden usar dosis más altas (o dosis efectivamente más altas logradas mediante una vía de administración diferente y más localizada).
Las composiciones farmacéuticas de la enseñanza son preferentemente estériles y contienen una cantidad eficaz de la sustancia terapéuticamente activa para generar la reacción deseada o el efecto deseado.
Generalmente, se formulan y administran dosis de un péptido de 1 ng a 1 mg, preferentemente de 10 ng a 100 |jg. Si se desea la administración de ácidos nucleicos (ADN y ARN), se pueden formular y administrar dosis de 1 ng a 0.1 mg.
Las composiciones farmacéuticas de la enseñanza generalmente se administran en cantidades farmacéuticamente compatibles y en preparaciones farmacéuticamente compatibles. El término "farmacéuticamente compatible" se refiere a un material no tóxico que no interactúa con la acción del componente activo de la composición farmacéutica. Los preparados de este tipo pueden contener normalmente sales, sustancias reguladoras, conservantes, portadores y sustancias complementarias que mejoran la inmunidad, como por ejemplo adyuvantes, por ejemplo, Oligonucleótidos CpG, citocinas, quimiocinas, saponina, GM-CSF y/o ARN y, en su caso, otros compuestos terapéuticamente activos. Cuando se usan en medicina, las sales deben ser farmacéuticamente compatibles. Sin embargo, se pueden usar sales que no son farmacéuticamente compatibles para preparar sales farmacéuticamente compatibles y están incluidas en la enseñanza. Las sales farmacológica y farmacéuticamente compatibles de este tipo comprenden de forma no limitativa aquellas preparadas a partir de los siguientes ácidos: ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malónico, succínico y similares. También se pueden preparar sales farmacéuticamente compatibles como sales de metales alcalinos o sales de metales alcalinotérreos, tales como sales de sodio, sales de potasio o sales de calcio.
Una composición farmacéutica como se describe en la memoria descriptiva puede comprender un portador farmacéuticamente compatible. El término "portador" se refiere a un componente orgánico o inorgánico, de naturaleza natural o sintética, en el que el componente activo se combina para facilitar la aplicación. Según la enseñanza, el término "portador farmacéuticamente compatible" incluye uno o más rellenos, diluyentes o sustancias encapsulantes sólidos o líquidos compatibles, que son apropiados para la administración a un paciente. Los componentes de la composición farmacéutica de la enseñanza suelen ser tales que no se produce ninguna interacción que perjudique sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada.
Las composiciones farmacéuticas de la enseñanza pueden contener sustancias reguladoras apropiadas tales como ácido acético en una sal, ácido cítrico en una sal, ácido bórico en una sal y ácido fosfórico en una sal.
Las composiciones farmacéuticas pueden contener también, dado el caso, conservantes apropiados tales como cloruro de benzalconio, clorobutanol, parabeno y timerosal.
Las composiciones farmacéuticas suelen proporcionarse en una forma de dosificación uniforme y pueden prepararse de una manera conocida per se. Las composiciones farmacéuticas de la enseñanza pueden estar en forma de cápsulas, comprimidos, comprimidos para deshacer en la boca, soluciones, suspensiones, jarabes, elixires o en forma de una emulsión, por ejemplo.
Las composiciones apropiadas para administración parenteral suelen comprender una preparación acuosa o no acuosa estéril del compuesto activo, que es preferentemente isotónica para la sangre del receptor. Ejemplos de portadores y disolventes compatibles son la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro de sodio. Además, como medio de solución o suspensión se usan aceites fijos, normalmente estériles.
Se debe enfatizar que el término "comprende/que comprende" cuando se usa en esta memoria descriptiva se toma para especificar la presencia de características, números enteros, etapas o componentes indicados pero no excluye la presencia o adición de una o más características, números enteros, etapas, componentes o grupos de los mismos. El simple hecho de que ciertas medidas se mencionen en reivindicaciones dependientes mutuamente diferentes o se describan en diferentes realizaciones no indica que una combinación de estas medidas no pueda usarse de manera ventajosa. Sin embargo, el término "comprende/que comprende" también incluye realizaciones que consisten en características, números enteros, etapas o componentes establecidos.
La presente enseñanza se describe en detalle mediante las figuras y ejemplos siguientes, que se usan únicamente con fines ilustrativos y no pretenden ser limitativos. Gracias a la descripción y a los ejemplos, el experto puede acceder a realizaciones adicionales que también están incluidas en la enseñanza.
Figuras:
Figura 1. Cuantificación de la expresión de CLDN6 en tejidos normales y cancerosos mediante RT-PCR en tiempo real. Con la excepción de la placenta, únicamente se pudieron detectar trazas de transcritos de CLDN6 en tejidos normales. Se encuentra una alta expresión de CLDN6 en muestras de cáncer de ovario (adenocarcinomas) y cáncer de pulmón (adenocarcinomas).
Figura 2: Cuantificación de la expresión de CLDN6 en tejidos normales mediante RT-PCR en tiempo real. Se analizaron tejidos de tres individuos para cada tipo de tejido normal. Únicamente se pudieron detectar trazas de transcritos de CLDN6 en tejidos normales después de 40 ciclos de RT-PCR. El único tejido normal que superó ligeramente el límite de expresión (línea discontinua, expresión media de todos los tejidos normales 3 STD (percentil del 99 %)) fue la placenta. Barras de error, STD.
Figura 3a-h: Cuantificación de la expresión de CLDN6 en tejidos y líneas celulares cancerosas mediante RT-PCR en tiempo real. A diferencia de los tejidos normales, se encontró una alta expresión de CLDN6 en muestras de cáncer de ovario (adenocarcinomas), cáncer de pulmón (NSCLC, con mayor frecuencia y niveles de expresión en adenocarcinomas), cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer hepático, cáncer de páncreas y cáncer de piel. (carcinoma de células basales y carcinoma de células escamosas), melanoma maligno, cáncer de cabeza y cuello (adenoma pleomórfico maligno), sarcoma (sarcoma sinovial y carcinosarcoma), cáncer de vías biliares, cáncer de células renales (carcinoma de células claras y carcinoma papilar), cáncer de útero, cáncer de vejiga urinaria (carcinoma papilar) y líneas celulares cancerosas A2780 (cáncer de ovario), NIH-OVCAR3 (cáncer de ovario), HCT-116 (cáncer de colon), EFO-27 (cáncer de ovario), CPC-N (SCLC), NCI- H552 (NSCLC), Sn U-1 (cáncer gástrico), KATOIII (cáncer gástrico), YAPC (cáncer de páncreas), AGS (cáncer gástrico), FU97 (cáncer gástrico), MKN7 (cáncer gástrico). Para no sobreestimar la frecuencia de expresión de CLDN6 en tejidos y líneas celulares cancerosas, únicamente los niveles de transcripción al menos 10 veces por encima del límite de expresión del tejido normal se clasificaron como positivos (línea discontinua).
Figura 4: Análisis de transferencia Western de la expresión de CLDN6 en tejidos normales. Se analizaron lisados de tejido de hasta cinco individuos para cada tipo de tejido normal. No se detectó expresión de la proteína CLDN6 en ninguno de los tejidos normales analizados. NIH-OVCAR3, control positivo.
Figura 5: Análisis de transferencia Western de la expresión de CLDN6 en tejidos cancerosos. A diferencia de los tejidos normales, se detectó una alta expresión de la proteína CLDN6 en muestras de cáncer de ovario y cáncer de pulmón. NIH-OVCAR3, control positivo.
Figura 6: Análisis de transferencia Western de la expresión de CLDN6 en líneas celulares cancerosas. La expresión de CLDN6 se detectó en células HEK293 transfectadas con plásmido de expresión CLDN6 (control positivo), NIH-OVCAR3 (cáncer de ovario), MKN7 (cáncer gástrico), AGS (cáncer gástrico), CPC-N (SCLC), HCT-116 (cáncer de colon), FU97 (cáncer gástrico), NEC8 (carcinoma embrionario testicular), JAR (coriocarcinoma placentario), JEG3 (coriocarcinoma placentario), BEWO (coriocarcinoma placentario) y PA-1 (teratocarcinoma de ovario).
Figura 7: Análisis inmunohistoquímico (IHC) de la expresión de CLDN6 en tejidos normales. No se detectó expresión de la proteína CLDN6 en ninguno de los tejidos analizados. Las marcas oscuras visibles en el páncreas, el duodeno y el riñón representan precipitados de tinte no asociados con estructuras celulares.
Figura 8a-h: Análisis inmunohistoquímico (IHC) de la expresión de CLDN6 en tejidos cancerosos. A diferencia de los tejidos normales, se observó una tinción fuerte o al menos significativa en secciones de tejido de (a) cáncer de ovario, (b) cáncer de pulmón, (c) cáncer de piel, (d) cáncer de páncreas, cáncer gástrico, (e) cáncer de mama, cáncer de vejiga urinaria (carcinoma de células de transición), (f) cáncer de cuello uterino, cáncer testicular (seminoma), (g) cáncer de útero, cáncer de intestino delgado y (h) cáncer testicular (embrionario y teratoma). La tinción se acentuó claramente en la membrana plasmática de las poblaciones de células epiteliales malignas, mientras que las células epiteliales estromales y no malignas adyacentes fueron negativas. Estos resultados indican que la proteína CLDN6 se localiza en la membrana plasmática de las células malignas.
Figura 9: Análisis de citometría de flujo de la expresión de CLDN6 en células cancerosas. Las células nativas se tiñeron usando un anticuerpo monoclonal comercial dirigido a un dominio extracelular de CLDN6 (aCLDN6). Como control se usaron células HEK293 transfectadas con un plásmido de expresión CLDN6 y células HEK293 no transfectadas. No se observó marcado de células de control no transfectadas; sin embargo, se observó un marcado fuerte en células de control transfectadas con CLDN6 y en CLDN6 endógeno que expresa AGS (cáncer gástrico), NIH-OVCAR3 (cáncer de ovario), HCT-116 (cáncer de colon) y CPC- N (SCLC) células cancerosas. Estos resultados muestran claramente que CLDN6 está localizado en la membrana plasmática de las células cancerosas y puede ser diana de los anticuerpos monoclonales dirigidos contra un dominio proteico extracelular.
Ejemplos:
Las técnicas y métodos usados en este documento se describen en este documento o se llevan a cabo de una manera conocida per se y como se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y Todos los métodos, incluido el uso de kits y reactivos, se llevan a cabo según la información del fabricante, a menos que se indique específicamente.
Ejemplo 1: CLDN6 es un marcador específico de tumores de ovario y tumores de pulmón
CLDN6 (secuencia de ácidos nucleicos según SEQ ID NO: 1, secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2) la expresión se cuantificó en tejidos normales y muestras de cáncer de ovario y cáncer de pulmón (adenocarcinomas) mediante RT-PCR en tiempo real.
Para la extracción de ARN, se realizó la síntesis de ADNc de primera cadena y la transcripción inversa-PCR en tiempo real (RT-PCR) como se describió anteriormente (Koslowski et al, 2006; Koslowski et al, 2007). El análisis de expresión cuantitativa en tiempo real se realizó por triplicado en una RT-PCR de 40 ciclos. Después de la normalización a HPRT (sentido 5'-TGA CAC TGG CAA AAC AAT GCA-3'; antisentido 5'-GGT CCT TTT CAC CAG CAA GCT-3', hibridación a 62 °C) expresión de CLDN6 (sentido 5'-CTT ATC TCC TTC GCA GTG CAG-3'; antisentido 5'-AAG GAG GGC GAT GAC ACA GAG-3', hibridación a 60 °C) se cuantificó usando el cálculo de AACT. Se analizaron tejidos de hasta tres individuos para cada tipo de tejido normal.
Con la excepción de la placenta, únicamente se pudieron detectar trazas de transcritos de CLDN6 en tejidos normales. Por el contrario, se encontró una alta expresión de CLDN6 en muestras de cáncer de ovario (adenocarcinomas) y cáncer de pulmón (adenocarcinomas); véase la figura 1.
Ejemplo 2: Cuantificación de la expresión de CLDN6 en tejidos normales, tejidos cancerosos y líneas celulares mediante RT-PCR en tiempo real
El ARN celular total se extrajo de muestras de tejido congeladas y líneas celulares cancerosas usando RNeasy Mini Kit (Qiagen), se preparó con un oligonucleótido dTis y se transcribió de manera inversa con Superscript II (GIBCO/Lifetech) según las instrucciones del fabricante. La integridad del ADNc obtenido se probó mediante amplificación de transcritos de p53 en una PCR de 30 ciclos (sentido, 5'-CGTGAGCGCT- TCG<a>G<a>TGTTCCG-3'; antisentido, 5'-CCTAACCAGCT-GCCCAACTGTAG-3'; temperatura de hibridación 67 °C). Después de la normalización a HPRT (sentido 5'-TGA CAC TGG CAA AAC<a>A<t>GCA-3'; antisentido 5'-GGT CCT TTT<c>A<c>CAG CAA GCT-3', hibridación a 62 °C) expresión de CLDN6 (sentido 5'-CTT ATC TCC TTC GCA GTG CAG-3'; antisentido 5'-AAG GAG GGC GAT GAC A<c>A GAG-3', hibridación a 60 °C) se cuantificó usando el cálculo de AACT.
Se analizaron tejidos de tres individuos para cada tipo de tejido normal. Únicamente se pudieron detectar trazas de transcritos de CLDN6 en tejidos normales después de 40 ciclos de RT-PCR; véase la figura 2. El único tejido normal que superó ligeramente el límite de expresión (línea discontinua, expresión media de todos los tejidos normales 3 STD (percentil del 99 %)) fue la placenta. Barras de error, STD.
A diferencia de los tejidos normales, se encontró una alta expresión de CLDN6 en muestras de cáncer de ovario (adenocarcinomas), cáncer de pulmón (NSCLC, con mayor frecuencia y niveles de expresión en adenocarcinomas), cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer hepático, cáncer de páncreas y cáncer de piel (carcinoma de células basales y carcinoma de células escamosas), melanoma maligno, cáncer de cabeza y cuello (adenoma pleomórfico maligno), sarcoma (sarcoma sinovial y carcinosarcoma), cáncer de vías biliares, cáncer de células renales (carcinoma de células claras y carcinoma papilar), cáncer de útero, cáncer de vejiga urinaria (carcinoma papilar) y líneas celulares cancerosas A2780 (cáncer de ovario), NIH-OVCAR3 (cáncer de ovario), HCT-116 (cáncer de colon), EFO-27 (cáncer de ovario), CPC-N (SCLC), NCI- H552 (NSCLC), SNU-1 (cáncer gástrico), KATOIII (cáncer gástrico), YAPC (cáncer de páncreas), AGS (cáncer gástrico), FU97 (cáncer gástrico), MKN7 (cáncer gástrico); véanse las figuras 3a-g. Para no sobreestimar la frecuencia de expresión de CLDN6 en tejidos y líneas celulares cancerosas, únicamente los niveles de transcripción al menos 10 veces por encima del límite de expresión del tejido normal se clasificaron como positivos (línea discontinua).
Ejemplo 3: Cuantificación de la expresión de CLDN6 en tejidos normales, tejidos cancerosos y líneas celulares mediante análisis de transferencia Western
Para el análisis de transferencia Western se usaron 20 |jg de proteína total extraída de células lisadas con solución reguladora de lisis de Laemmli. Los extractos se diluyeron en solución reguladora de muestra reductor (Roth), se sometieron a SDS-PAGE y posteriormente se electrotransfirieron a una membrana de PVDF (Pall). La inmunotinción se realizó con anticuerpos policlonales reactivos a CLDN6 (ARP) y beta-actina (Abcam) seguido de la detección de anticuerpos primarios con anticuerpos secundarios de cabra anti-ratón y de cabra anti-conejo conjugados con peroxidasa de rábano picante (Dako).
Se analizaron lisados de tejido de hasta cinco individuos para cada tipo de tejido normal. No se detectó expresión de la proteína CLDN6 en ninguno de los tejidos normales analizados; véase la figura 4. NIH-OVCAR3, control positivo.
A diferencia de los tejidos normales, se detectó una alta expresión de la proteína CLDN6 en muestras de cáncer de ovario y cáncer de pulmón; véase la figura 5. NIH-OVCAR3, control positivo.
La expresión de CLDN6 se detectó en células HEK293 transfectadas con plásmido de expresión CLDN6 (control positivo), NIH-OVCAR3 (cáncer de ovario), MKN7 (cáncer gástrico), AGS (cáncer gástrico), CPC-N (SCLC), HCT-116 (cáncer de colon), FU97 (cáncer gástrico), NEC8 (carcinoma embrionario testicular), JAR (coriocarcinoma placentario), JEG3 (coriocarcinoma placentario), BEWO (coriocarcinoma placentario) y PA-1 (teratocarcinoma de ovario); véase la figura 6.
Ejemplo 4: Análisis inmunohistoquímico (IHC) de la expresión de CLDN6 en tejidos normales y cancerosos.
Se incubaron secciones de tejido incluidas en parafina (4 |jm) durante 1 hora a 58 °C en una placa calefactora (HI 1220, Leica). Se eliminó la parafina de las secciones incubando los portaobjetos en Roticlear (Roth) durante 2 x 10 min a RT Posteriormente las secciones se rehidrataron en alcohol graduado (99 %, 2 * 96 %, 80 % y 70 %, 5 min cada uno). La recuperación del antígeno se realizó hirviendo portaobjetos a 120 °C (15 psi) durante 15 minutos en solución reguladora citrato 10 mM (pH 6.0) Tween-20 al 0.05 %. Directamente después de hervir, los portaobjetos se incubaron en PBS durante 5 minutos. La actividad de la peroxidasa endógena se bloqueó con peróxido de hidrógeno al 0.3 % en MeOH durante 15 minutos a RT. Para evitar la unión inespecífica, los portaobjetos se bloquearon con suero de cabra al 10 % en PBS durante 30 minutos a RT A continuación, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo policlonal específico de CLDN6 1 jg/m l) (ARP) durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, los portaobjetos se lavaron con PBS a RT (3 x 5 min) y se incubaron con 100 j l de los anticuerpos secundarios (PowerVision poli HRP-Anti-Rabbit IgG listo para usar (ImmunoLogic)) durante una hora a RT Posteriormente, los portaobjetos se lavaron con PBS a RT (3 x 5 min). La tinción final se realizó usando el kit de sustrato VECTOR NovaRED SK-4800 de Vector Laboratories (Burlingame). Las secciones se contratiñeron con hematoxilina durante 90 segundos a RT. Después de la deshidratación con alcohol graduado (70 %, 80 %, 2x 96 % y 99 %, 5 min cada uno) y 10 min de incubación en xilol, los portaobjetos se montaron con el kit X-tra (Medite Histotechnic). ;;No se detectó expresión de la proteína CLDN6 en ninguno de los tejidos analizados; véase la figura 7. Las marcas oscuras visibles en el páncreas, el duodeno y el riñón representan precipitados de tinte no asociados con estructuras celulares. ;;A diferencia de los tejidos normales, se observó una tinción fuerte o al menos significativa en secciones de tejido de (a) cáncer de ovario, (b) cáncer de pulmón, (c) cáncer de piel, (d) cáncer de páncreas, cáncer gástrico, (e) cáncer de mama, cáncer de vejiga urinaria (carcinoma de células de transición), (f) cáncer de cuello uterino, cáncer testicular (seminoma), (g) cáncer de útero, cáncer de intestino delgado y (h) cáncer testicular (embrionario y teratoma); véanse las figuras 8a-h. La tinción se acentuó claramente en la membrana plasmática de las poblaciones de células epiteliales malignas, mientras que las células epiteliales estromales y no malignas adyacentes fueron negativas. Estos resultados indican que la proteína CLDN6 se localiza en la membrana plasmática de las células malignas. ;;Ejemplo 5: Análisis de citometría de flujo de la expresión de CLDN6 en células cancerosas. ;;Las células se recogieron con EDTA/PBS 5 mM y se volvieron a suspender en PBS/FCS al 2 %/ácido Na al 0.1 %. ;2*105 células se incubaron con un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido a un dominio extracelular de CLDN6 (R&D) a 4 ° C durante 30 minutos. Después del lavado, las células se incubaron con un anticuerpo secundario de cabra anti ratón marcado con APC (Jackson ImmunoResearch Laboratories) a 4 °C durante 30 minutos. Después del lavado, las células se tiñeron con yoduro de propidio (PI). El análisis se realizó después de seleccionar células vivas (células PI negativas) usando el sistema BD FACSArray Bioanalyzer.
Las células nativas se tiñeron usando un anticuerpo monoclonal comercial dirigido a un dominio extracelular de CLDN6 (aCLDN6). Como control se usaron células HEK293 transfectadas con un plásmido de expresión CLDN6 y células HEK293 no transfectadas. No se observó marcado de células de control no transfectadas; sin embargo, se observó un marcado fuerte en células de control transfectadas con CLDN6 y en CLDN6 endógeno que expresa AGS (cáncer gástrico), NIH-OVCAR3 (cáncer de ovario), HCT-116 (cáncer de colon) y CPC-N (SCLC) células cancerosas; véase la figura 9. Estos resultados muestran claramente que CLDN6 está localizado en la membrana plasmática de las células cancerosas y puede ser atacado por anticuerpos monoclonales dirigidos contra un dominio proteico extracelular.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un método para el diagnóstico, detección o seguimiento de una enfermedad tumoral caracterizado por la expresión aumentada del antígeno tumoral claudina-6 (CLDN6), comprendiendo dicho método la detección y/o determinación de la cantidad de uno o más parámetros seleccionados del grupo que consiste en:
(i) un ácido nucleico que codifica un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos del antígeno tumoral, y (ii) un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos del antígeno tumoral,
en una muestra biológica aislada de un paciente,
en el que dicho antígeno tumoral comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 1 del listado de secuencias,
en el que dicha enfermedad tumoral es una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en cáncer gástrico, cáncer hepático, cáncer de páncreas, cáncer de cabeza/cuello, cáncer de las vías biliares, y cáncer de la vejiga urinaria.
2. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica es de un tejido u órgano en el que las células cuando el tejido u órgano está libre de tumores no expresan dicho antígeno tumoral y/o un ácido nucleico que codifica dicho antígeno tumoral.
3. El método según la reivindicación 1 o 2, en el que la detección y/o determinación de la cantidad comprende: (i) poner en contacto la muestra biológica con un agente que se une específicamente al ácido nucleico o al péptido que se va a detectar y/o cuya cantidad se va a determinar, y
(ii) detectar la formación de y/o determinar la cantidad de un complejo entre el agente y el ácido nucleico o el péptido que se va a detectar o cuya cantidad se va a determinar.
4. El método según la reivindicación 3, en el que (i) el agente que se une específicamente al ácido nucleico comprende un oligonucleótido, que se hibrida específicamente con dicho ácido nucleico, y (ii) el agente que se une específicamente al péptido comprende un anticuerpo que se une específicamente a dicho péptido.
5. El método según la reivindicación 4, en el que el agente comprende además un marcador detectable.
6. Uso de un kit de prueba de diagnóstico en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, cuyo kit comprende un agente que se une específicamente a
(i) un ácido nucleico que codifica un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos del antígeno tumoral, y/o (ii) un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un antígeno tumoral,
en el que dicho antígeno tumoral comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 1 de la lista de secuencias, en el que el agente comprende además preferentemente un marcador detectable, en el que dicha enfermedad tumoral es una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en cáncer gástrico, cáncer hepático, cáncer de páncreas, cáncer de cabeza/cuello, cáncer del conducto biliar, y cáncer de la vejiga urinaria.
7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o uso según la reivindicación 6, en el que el antígeno tumoral comprende la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2 del listado de secuencias.
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