CN102325885A - 用于癌症诊断和治疗的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及鉴定肿瘤组织(例如卵巢肿瘤和肺肿瘤组织)之特征性核酸和氨基酸序列，所述序列代表用于治疗或诊断对象中肿瘤疾病的靶标。

Description

用于癌症诊断和治疗的方法和组合物
癌症在全世界范围内都是重大的健康问题，并仍是死亡的首要原因。
卵巢癌是源自卵巢的癌性生长。卵巢癌是女性中第5位的癌症死亡原因以及妇科癌症中的首位死亡原因。女性终生都有患卵巢癌的风险，几率约为1.5％，这使其成为第2大最常见的妇科恶性肿瘤。
怀疑卵巢癌的诊断可通过异常的身体检查(包括骨盆检查)、血液测试(更具体地，针对CA-125)或通过医学影像研究而做出。使用手术方法检查腹腔、活检取样以及在腹腔液(abdominal fluid)中寻找癌细胞可对诊断加以确认。治疗通常包括化学治疗和手术，有时还涉及放射治疗。
在年老女性中以及在有患该病之一级或二级亲属的女性中，卵巢癌的风险增加。卵巢癌的遗传形式可由特定基因(最著名的是BRCA1和BRCA2)的突变导致。不孕的女性和患有被称为子宫内膜异位症的女性、从未怀孕的女性和采用绝经后雌激素替代治疗的女性具有提高的风险。使用口服避孕药是一种保护性措施。在用手术方法阻断输卵管(输卵管结扎)的女性中，风险也较低。
卵巢癌的预后通常较差。因其缺乏明确的早期检查或筛查测试，所以卵巢癌的致死率尤其地高，这意味着大多数病例被诊出时已到晚期。表现出该癌的患者中超过60％已经是III期或IV期癌，此时其已经从卵巢扩散。卵巢癌向腹腔内天然存在的流体中释放细胞。这些细胞可植入其它腹部(腹膜)结构上，包括子宫、膀胱、肠和肠内壁(网膜)。这些细胞甚至在怀疑患有癌症之前就可能开始形成新的肿瘤生长。
所有分期的卵巢癌五年存活率为45.5％。针对在疾病早期即诊出的病例，当癌仍局限于原发部位时，其五年存活率为92.7％。
卵巢肿瘤的主要类别如下：上皮肿瘤，其占全部卵巢肿瘤的约75％，和卵巢恶性肿瘤的90～95％；性索间质肿瘤(Sex cord-stromal tumor)，其占全部卵巢赘生物的约5～10％；生殖细胞肿瘤，其占全部卵巢赘生物的约15～20％；转移性肿瘤，其占卵巢恶性肿瘤的约5％，并通常源自乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃癌和子宫颈癌。卵巢癌最常在卵巢的内壁(导致上皮卵巢癌)或在卵细胞(导致生殖细胞肿瘤)中形成。
表面上皮间质瘤(surface epithelial-stromal tumor)，也称为卵巢上皮癌，是最常见的卵巢癌类型。表面上皮间质瘤是一类可为良性或恶性的卵巢赘生物。这一类赘生物被认为来源自卵巢表面上皮(改性腹膜，modified peritoneum)或来自异位的子宫内膜或输卵管组织。表面上皮间质瘤包括浆液性肿瘤、子宫内膜样肿瘤和粘液性囊腺癌。
肺癌是在肺组织中细胞生长失控的疾病。这种生长可导致转移，所述转移是侵袭邻近组织和浸润到肺之外。肺癌是男性中最常见的和女性中第二常见(排在乳腺癌之后)的癌相关死亡原因，其每年在世界范围内导致130万人死亡。
肺癌包括表皮样癌和腺癌。绝大多数肺癌是源自上皮细胞的癌(恶性肿瘤)。肺癌可通过五种组织病理学标准来表征。鳞状上皮癌、腺癌、大细胞癌、腺鳞状癌和小细胞肺癌(SCLC，small cell lung carcinoma)之间具有差异。上述前四种在文献中统称为非SCLC(NSCLC，non-small celllung carcinoma)。
非小细胞肺癌(NSCLC)有时通过手术进行治疗，而小细胞肺癌(SCLC)通常对化学治疗和放射治疗有更好的响应。
肺癌可通过胸部X射线和计算机断层扫描(CT扫描)发现。利用活检来验证该诊断。这通常通过支气管镜检或CT引导的活检来进行。治疗和诊断取决于癌的组织学类型、分期(扩散程度)和患者的状态。可能的治疗包括手术、化学治疗和放射治疗。经过治疗，五年存活率为14％。
通过两种分别的方式(固有免疫和获得性免疫)，免疫系统具有识别和破坏细胞的能力。固有免疫成员由巨噬细胞、自然杀伤(NK，naturalkiller)细胞、单核细胞和粒细胞组成。这些细胞识别参与细胞转化的分子模式并释放多种细胞因子和炎性介质。固有应答缺乏对外来抗原的记忆能力，而获得性免疫应答具有该特征。免疫系统的该后一构成还具有针对外来抗原之特异性的特征，这是由存在于淋巴细胞上的受体所赋予的。抗原呈递细胞(APC，antigen presenting cell)也在获得性应答中发挥作用，它们吞噬外来抗原并基于主要组织相容性复合物的存在情况将其呈递给淋巴细胞。CD4+T细胞具有在II类MHC分子存在下识别抗原的受体，随后使其释放细胞因子并进一步激活CD8+T淋巴细胞(CTL)或B细胞。CTL是细胞介导免疫的一部分，在I类MHC分子存在下，其能通过凋亡或穿孔素介导的细胞溶解来清除所呈递的细胞。人们广泛地接受，T细胞介导的免疫在抗肿瘤应答中发挥至关重要的作用。
B细胞参与免疫球蛋白的释放，因而是体液免疫系统的一部分。
如果适当地靶向和增强，免疫功能可被开发用于治疗以控制以及根除恶性病变。参与致癌作用的遗传和表观遗传的改变产生抗原，这些抗原可被免疫系统以类似于识别微生物抗原的方式进行识别。
在肿瘤例如卵巢肿瘤和肺肿瘤(尤其是卵巢腺癌支气管腺癌)以及由其衍生的转移性肿瘤的遗传标志物和靶标的领域中，有设计这些疾病的特异性的、可靠的和灵敏的诊断和治疗方法的需求。
本发明涉及肿瘤例如卵巢肿瘤和肺肿瘤(尤其是卵巢腺癌和支气管腺癌)以及由其衍生的转移性肿瘤的治疗和诊断。本发明特别涉及分子结构的鉴定，所述分子结构存在于肿瘤例如卵巢肿瘤和肺肿瘤上并可作为用于这些疾病的诊断和治疗方法的靶标。
发明概述
本发明涉及鉴定肿瘤组织例如卵巢的和肺的肿瘤组织之特征性核酸和氨基酸序列，所述序列代表用于治疗或诊断对象中肿瘤疾病的靶标。
这些序列包括鉴定为在所述细胞之质膜中的、并可在细胞外区域接近的蛋白质，从而所述序列可用于制备肿瘤疫苗(包括预防性和治疗性疫苗)。
根据本发明鉴定的在肿瘤细胞中表达的核酸包含序列表中SEQ IDNO：1的核酸序列或所述核酸序列的变体。优选地，根据本发明鉴定的在肿瘤细胞中表达的核酸编码包含序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体的肽。这些核酸在本文中也称为“肿瘤相关核酸”或简称为“肿瘤核酸”。
另一方面，本发明涉及由根据本发明鉴定的肿瘤核酸编码的肽，在本文中也称为“肿瘤相关抗原”或简称为“肿瘤抗原”。因此，根据本发明鉴定的肿瘤抗原包含由如下核酸编码的氨基酸序列，所述核酸包含序列表中SEQ ID NO：1的核酸序列或所述核酸序列的变体。优选地，根据本发明鉴定的肿瘤抗原包含序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体。
在一方面，本发明提供包含衍生自根据本发明鉴定之肿瘤抗原序列的氨基酸序列的肽，本文中也称为“肿瘤抗原肽”。优选地，本发明的肿瘤抗原肽能够激活针对具有如下特征之细胞的细胞应答，所述细胞以I类MHC呈递根据本发明鉴定的肿瘤抗原，和/或当用利其本身或与免疫原性载体结合时能够诱导出结合根据本发明鉴定之肿瘤抗原的特异性抗体。优选的肿瘤抗原肽可以直接或经过加工后被I类MHC分子呈递。优选地，根据本发明的肿瘤抗原肽是I类和/或II类MHC所呈递的肽，或可被加工产生I类和/或II类MHC所呈递的肽。优选地，根据本发明的肿瘤抗原肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列基本上对应于根据本发明鉴定的肿瘤抗原之片段的氨基酸序列。优选地，根据本发明鉴定的肿瘤抗原的所述片段是I类和/或II类MHC呈递的肽，或是能够诱导出结合所述片段之抗体的免疫原。优选地，根据本发明的肿瘤抗原肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列基本上对应于所述片段的氨基酸序列，并被加工生成所述片段，即I类和/或II类MHC呈递的、衍生自根据本发明鉴定的肿瘤抗原或衍生自根据本发明鉴定之肿瘤抗原的免疫原的肽，所述免疫原能够诱导出结合所述片段的抗体。因此，根据本发明的肿瘤抗原肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列基本上对应于肿瘤抗原之片段的氨基酸序列，其包含由如下核酸编码的氨基酸序列，所述核酸包含序列表中SEQ ID NO：1的核酸序列或所述核酸序列的变体，并且其优选地包含与肿瘤抗原之片段的氨基酸序列基本上对应的氨基酸序列，其包含序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体。在一个实施方案中，根据本发明的肿瘤抗原肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列选自序列表中SEQ ID NO：3、4和5或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。
本发明一般地涉及通过靶向肿瘤核酸或肿瘤抗原来治疗和/或诊断肿瘤疾病。这些方法提供了对表达所述肿瘤核酸和/或肿瘤抗原之细胞的选择性检测和/或根除，从而使对不表达所述肿瘤核酸和/或肿瘤抗原的正常细胞的不良作用最小化。因此，适于治疗或诊断的优选疾病是表达根据本发明鉴定的一种或多种肿瘤核酸和/或肿瘤抗原的疾病，例如肿瘤疾病，尤其是癌症(例如本文所述的那些)。
根据本发明，根据本发明鉴定之肿瘤抗原中尤其适于靶向的是对应于非跨膜区域的肿瘤抗原部分，尤其是肿瘤抗原的细胞外区域或其中所包含的区域。在一个实施方案中，所述部分或区域包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列选自序列表中SEQ ID NO：3、4和5或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。因此，根据本发明使用的、能够结合根据本发明鉴定之肿瘤抗原的实体优选地能够结合对应于根据本发明鉴定之肿瘤抗原的非跨膜区域(尤其是细胞外区域)或其所包含之区域的部分。在一个实施方案中，所述部分或区域包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列选自序列表中SEQ ID NO：3、4和5或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。类似地，根据本发明使用的、用于诱导特异性针对根据本发明鉴定之肿瘤抗原的免疫应答的肽和核酸优选地诱导针对根据本发明鉴定的肿瘤抗原对应于肿瘤抗原之非跨膜区域(尤其是细胞外区域)或其所包含之区域的部分。在一个实施方案中，所述部分或区域包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列选自序列表中SEQ ID NO：3、4和5或其片段，或所述氨基酸序列或片段的变体。优选地，所述肽包含基本上对应于根据本发明鉴定之肿瘤抗原对应于肿瘤抗原之非跨膜区域(尤其是细胞外区域)或其所包含之区域的部分的序列。在一个实施方案中，所述部分或区域包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列选自序列表中SEQ ID NO：3、4和5或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。
本发明的一个方面涉及治疗肿瘤疾病(尤其是卵巢肿瘤和肺肿瘤)的疗法，包括施用根据本发明鉴定之肿瘤抗原的表达和/或活性的抑制剂。
在这一方面，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物包含根据本发明鉴定之肿瘤抗原的表达和/或活性的抑制剂。在一个实施方案中，所述抑制剂特异性针对根据本发明鉴定的肿瘤核酸。在另一实施方案中，所述抑制剂特异性针对根据本发明鉴定的肿瘤抗原。根据本发明，短语“抑制表达和/或活性”包括完全地或基本上完全地抑制表达和/或活性以及降低表达和/或活性。优选地，根据本发明鉴定之肿瘤抗原的表达抑制可通过抑制编码根据本发明鉴定之肿瘤抗原的转录本(即mRNA)的产生或降低其水平来实现(例如通过抑制转录本的转录或诱导其降解来实现)，和/或通过抑制根据本发明鉴定之肿瘤抗原的产生来实现(例如通过抑制编码根据本发明鉴定之肿瘤抗原的转录本的翻译来实现)。优选地，根据本发明鉴定的肿瘤抗原的表达和/活性的抑制减缓肿瘤细胞生长和/或诱导肿瘤细胞死亡，并因此具有肿瘤抑制或肿瘤破坏作用。
在一个具体实施方案中，根据本发明鉴定之肿瘤抗原的表达抑制剂是选择性杂交并特异性地针对根据本发明鉴定之肿瘤核酸、从而抑制(例如，降低)其转录和/或翻译的抑制性核酸(例如，反义寡核苷酸、核酶、iRNA、siRNA或编码其的DNA)。
本发明的抑制性核酸包括具有与靶核酸反义方向之序列的寡核苷酸。合适的抑制性寡核苷酸的长度通常从个5至几百个核苷酸，更通常为约20～70个核苷酸或更短，更加通常为约10～30个核苷酸。这些抑制性寡核苷酸可作为游离(裸)核酸或采用经保护的形式(例如，包封在脂质体中)来施用。使用脂质体或其它保护形式可具有优势，因为其可提高体内稳定性并因而有利于递送至靶部位。
另外，所述靶肿瘤核酸可用于设计靶向切割肿瘤细胞中对应mRNA的核酶。类似地，这些核酶可以以游离(裸)形式施用，或通过使用提高稳定性和/或靶向性的递送系统(例如，脂质体)来施用。
另外，所述靶肿瘤核酸可用于设计能够抑制(例如，降低)所述肿瘤核酸之表达的siRNA。所述siRNA可以以游离(裸)形式施用，或通过使用提高稳定性和/或靶向性的递送系统(例如，脂质体)来施用。它们也可以其前体或编码DNA的形式来施用。
siRNA优选地包含有义RNA链和反义RNA链，其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，且其中所述有义RNA链包含与靶序列基本相同的核苷酸序列，所述靶序列为根据本发明鉴定之肿瘤核酸中约19至约25个连续核苷酸，优选编码所述靶肿瘤抗原的mRNA。
在另一实施方案中，根据本发明鉴定之肿瘤抗原的活性抑制剂是特异性地结合所述肿瘤抗原的抗体。在一个实施方案中，所述抗体特异性地结合包含如下氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列选自序列表中SEQ ID NO：3、4和5或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。所述抗体与肿瘤抗原的结合可干扰所述肿瘤抗原的功能，例如，通过抑制结合活性或催化活性来实现。
另外，本发明另一方面涉及治疗肿瘤疾病的疗法，其包括施用靶分子(即，根据本发明鉴定的肿瘤核酸或肿瘤抗原)的配体。在这一方面，可施用选择性地与靶核酸杂交的核酸或者可施用特异性结合靶抗原的抗体，所述核酸或抗体与治疗效应部分(therapeutic effector moiety)(例如，放射性标记、细胞毒素、细胞毒性酶等)连接，从而选择性地靶向并杀死表达这些靶标的细胞(例如肿瘤细胞)。在一个实施方案中，所述抗体特异性地结合包含如下氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列选自序列表中SEQID NO：3、4和5或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。
在这一方面，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物包含根据本发明鉴定之肿瘤核酸或肿瘤抗原的配体，所述配体与一种或多种治疗效应部分连接。优选地，所述配体特异性地针对所述肿瘤核酸或肿瘤抗原。在一个实施方案中，肿瘤核酸或肿瘤抗原的所述配体减缓肿瘤细胞的生长和/或诱导肿瘤细胞死亡，并因此具有肿瘤抑制或肿瘤破坏作用。
根据本发明的另一方面，对肿瘤核酸和肿瘤抗原的鉴定使得开发特异性免疫疗法成为可能，所述免疫疗法基于攻击具有所鉴定抗原的肿瘤细胞，从而推迟或防止肿瘤疾病的发生或根除肿瘤细胞。免疫治疗包括多种目的在于诱导肿瘤细胞之破坏性免疫应答的干预和技术。应用这些核酸和抗原的多种临床方法是可能的，总结如下。癌症免疫治疗的方法可分为主动和被动两类。主动免疫治疗可涉及使用抗原或编码该抗原的核酸直接免疫患者，以期加强针对肿瘤的免疫应答。被动免疫治疗是指施用免疫试剂，以期直接介导抗肿瘤应答。本发明涵盖这两种方法。
在这一方面，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物包含选自以下的一种或多种药剂：(i)包含根据本发明鉴定之肿瘤抗原的氨基酸序列或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列的肽，或所述肽的衍生物，(ii)编码包含根据本发明鉴定之肿瘤抗原的氨基酸序列或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列的肽的核酸，或所述核酸的衍生物，(iii)编码包含根据本发明鉴定之肿瘤抗原的氨基酸序列或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列的肽的宿主细胞，(iv)编码包含根据本发明鉴定之肿瘤抗原的氨基酸序列或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列的肽的病毒，(v)呈递包含衍生自根据本发明鉴定之肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列的肽或所述肽的衍生物的细胞，(vi)与包含根据本发明鉴定之肿瘤抗原的氨基酸序列或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列的肽结合的抗体或T细胞受体，(vii)经体外敏化识别包含根据本发明鉴定之肿瘤抗原的氨基酸序列或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列的肽的免疫反应性细胞，和(viii)转导了编码T细胞受体之核酸的效应细胞(或干细胞)，所述T细胞受体识别包含根据本发明鉴定之肿瘤抗原的氨基酸序列或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列的肽。
在一个实施方案中，根据(i)的肽是肿瘤抗原特异性的、I类或II类MHC呈递的肽，或者是可被加工生成肿瘤抗原特异性的、I类或II类MHC呈递的肽，优选肿瘤抗原特异性的、I类MHC呈递的肽。优选地，所述肽具有与根据本发明鉴别之肿瘤抗原的片段基本上对应的序列，所述片段由I类或II类MHC(优选I类MHC)呈递或者可被加工生成具有所述序列的肽片段。优选地，所述肽能够激活针对肿瘤(特征在于以I类MHC呈递根据本发明鉴定的肿瘤抗原)的细胞应答和/或能够激活针对肿瘤(特征在于表达根据本发明鉴定的肿瘤抗原)的体液免疫应答。在一个实施方案中，所述肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列选自序列表中SEQ ID NO：3、4和5或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。
在一个实施方案中，根据(ii)的核酸编码肿瘤抗原特异性的、I类或II类MHC呈递的肽，或者编码可被加工生成肿瘤抗原特异性的、I类或II类MHC呈递的肽，优选肿瘤抗原特异性的、I类MHC呈递的肽。优选地，所述肽具有与根据本发明鉴别之肿瘤抗原的片段基本上对应的序列，所述片段由I类或II类MHC(优选I类MHC)呈递或者可被加工生成具有所述序列的肽片段。优选地，所述肽能够激活针对肿瘤(特征在于以I类MHC呈递根据本发明鉴定的肿瘤抗原)的细胞应答和/或能够激活针对肿瘤(特征在于表达根据本发明鉴定的肿瘤抗原)的体液免疫应答。在一个实施方案中，所述肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列选自序列表中SEQ ID NO：3、4和5或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。所述核酸可存在于质粒或表达载体中，并可与启动子功能性连接。
在一个实施方案中，根据(iii)的宿主细胞编码肿瘤抗原特异性的、I类或II类MHC呈递的肽，或者编码可被加工生成肿瘤抗原特异性的、I类或II类MHC呈递的肽，优选肿瘤抗原特异性的、I类MHC呈递的肽。优选地，所述肽具有与根据本发明鉴别之肿瘤抗原的片段基本上对应的序列，所述片段由I类或II类MHC(优选I类MHC)呈递或者可被加工生成具有所述序列的肽片段。优选地，所述肽能够激活针对肿瘤(特征在于以I类MHC呈递根据本发明鉴定的肿瘤抗原)的细胞应答和/或能够激活针对肿瘤(特征在于表达根据本发明鉴定的肿瘤抗原)的体液免疫应答。在一个实施方案中，所述肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列选自序列表中SEQ ID NO：3、4和5或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。所述宿主细胞可为重组细胞并可分泌所述编码的肽或其加工产物，可将其表达在表面上并优选可额外表达MHC分子，所述MHC分子结合所述肽或其加工产物并优选呈递所述肽或其加工产物于细胞表面。在一个实施方案中，所述宿主细胞内源性地表达MHC分子。在另一实施方案中，所述宿主细胞以重组的方式表达MHC分子和/或肽或者其加工产物。所述宿主细胞优选是非增殖性的。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是抗原呈递细胞，尤其是树突状细胞、单核细胞或巨噬细胞。
在一个实施方案中，根据(iv)的病毒编码肿瘤抗原特异性的、I类或II类MHC呈递的肽，或者编码可被加工生成肿瘤抗原特异性的、I类或II类MHC呈递的肽，优选肿瘤抗原特异性的、I类MHC呈递的肽。优选地，所述肽具有与根据本发明鉴别之肿瘤抗原的片段基本上对应的序列，所述片段由I类或II类MHC(优选I类MHC)呈递或者可被加工生成具有所述序列的肽片段。优选地，所述肽能够激活针对肿瘤(特征在于以I类MHC呈递根据本发明鉴定的肿瘤抗原)的细胞应答和/或能够激活针对肿瘤(特征在于表达根据本发明鉴定的肿瘤抗原)的体液免疫应答。在一个实施方案中，所述肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列选自序列表中SEQ ID NO：3、4和5或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。
在一个实施方案中，根据(v)的细胞内源性地表达MHC分子。在另一实施方案中，所述细胞重组表达MHC分子和/或包含衍生自根据本发明鉴定之肿瘤抗原的肿瘤抗原肽的氨基酸序列的肽。优选地，所述细胞通过其表面上的MHC分子呈递包含衍生自根据本发明鉴定之肿瘤抗原的肿瘤抗原肽的氨基酸序列的肽或所述肽的衍生物。优选地，所呈递的肽是这样的肽，其具有与根据本发明鉴定之肿瘤抗原的片段基本上对应的序列，所述片段由I类或II类MHC(优选I类MHC)呈递。所述细胞优选是非增殖性的。在一个优选的实施方案中，所述细胞是抗原呈递细胞，例如树突状细胞、单核细胞或巨噬细胞。因此，在一个优选的实施方案中，根据(v)的细胞是包含本文所述的、I类MHC呈递的肿瘤抗原肽的抗原呈递细胞。
在一个实施方案中，根据(vi)的抗体是单克隆抗体。在另一些实施方案中，所述抗体是嵌合的、人的或人源化的抗体，或者是抗体片段或合成抗体。所述抗体可与治疗效应部分或可检测标签偶联。优选地，根据(vi)的抗体或T细胞受体结合肽中的序列，所述肽基本上对应于根据本发明鉴定之肿瘤抗原的片段。在一个实施方案中，所述抗体或T细胞受体与包含如下氨基酸序列的肽结合，所述氨基酸序列选自序列表中SEQ IDNO：3、4和5或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。
优选地，根据(vii)的细胞结合肽中的序列，所述肽基本上对应于根据本发明鉴定之肿瘤抗原的片段，所述片段优选被I类或II类MHC(优选I类MHC)所呈递。在一个实施方案中，根据(vii)的细胞可通过包括如下步骤的方法获得：(a)提供含有免疫反应性细胞的样品，其获得自患者或者获得自同一物种的另一个体(尤其是健康的个体)或不同物种的个体，(b)在利于产生针对所述肽之CTL的条件下，将所述样品与呈递肽或所述肽之衍生物的细胞接触，所述肽包含与根据本发明鉴定之肿瘤抗原的片段基本上对应的氨基酸序列，和(c)向患者引入合适量的CTL，所述量适于裂解表达所述肿瘤抗原并优选以I类MHC呈递的细胞(例如，肿瘤细胞)。
在一个实施方案中，所述方法包括克隆所得CTL的T细胞受体并将编码该T细胞受体的核酸转移到效应细胞(例如CTL或未成熟的CTL)中，所述效应细胞获得自所述患者或者获得自同一物种的另一个体(尤其是健康的个体)或不同物种的个体，所述效应细胞因而获得期望的特异性并可被引入患者。可用这种方式生成根据(viii)的效应细胞。
使用上述药剂进行免疫接种可提供II类MHC呈递的表位，所述表位能够诱导出针对根据本发明鉴定之肿瘤抗原的CD4+辅助T细胞应答和/或CD8+T细胞应答，特别是当表达于细胞(例如，肿瘤细胞)中时。作为替代或此外，使用上述药剂进行免疫接种可提供I类MHC呈递的表位，所述表位能够诱导出针对根据本发明鉴定之肿瘤抗原的CD8+T细胞应答，特别是当表达于细胞(例如，肿瘤细胞)中时。另外，使用上述药剂进行免疫接种可诱导出特异性针对根据本发明鉴定之肿瘤抗原的抗体。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物是治疗性或预防性的抗肿瘤疫苗，其优选还包含免疫调节剂或编码其的核酸。在一个实施方案中，所述免疫调节剂是正性(positive)共刺激分子的激动剂，例如，能够产生CTL共刺激作用的Ig-融合蛋白。在另一实施方案中，所述共刺激剂是负性(negative)共刺激分子的拮抗剂，例如，能够降低CTL共刺激之抑制作用的抗体。在一个优选的实施方案中，所述免疫调节剂是抗-CTLA4抗体。
本发明的药物组合物可包含药学上可接受的载体，并可任选地包含一种或多种佐剂、稳定剂等。
本发明的另一方面涉及本文所述的药剂和组合物用于预防性和/或治疗性地治疗肿瘤疾病的用途。
在一方面，本发明提供了治疗患有肿瘤疾病或具有发生肿瘤疾病之风险的患者的治疗性和预防性方法。在一方面，本发明提供了抑制肿瘤生长的方法。在一方面，本发明提供了诱导肿瘤细胞死亡的方法。
优选地，所述肿瘤疾病是癌疾病，优选地选自：卵巢癌，尤其是卵巢腺癌和卵巢畸胎癌；肺癌，包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，尤其是鳞状细胞肺癌和腺癌；胃癌；乳腺癌；肝癌；胰腺癌；皮肤癌，尤其是基底细胞癌和鳞状细胞癌；恶性黑色素瘤；头颈癌，尤其是恶性多形性腺瘤；肉瘤，尤其是滑膜肉瘤和癌肉瘤；胆管癌；膀胱癌，尤其是移形细胞癌和乳头状癌；肾癌，尤其是肾细胞癌，包括明细胞肾细胞癌和乳头状肾细胞癌；结肠癌；小肠癌，包括回肠癌，尤其是小肠腺癌和回肠腺癌；睾丸胚胎癌；胎盘绒毛膜癌；子宫颈癌；睾丸癌，尤其是睾丸精原细胞瘤、睾丸畸胎瘤和胚胎睾丸癌；和子宫癌，及其转移形式，优选卵巢癌、肺癌、转移性卵巢癌和转移性肺癌。优选地，所述卵巢癌是恶性肿瘤或是腺癌。优选地，所述肺癌是恶性肿瘤或腺癌，并优选是支气管癌，例如，支气管恶性肿瘤或支气管腺癌。在一个实施方案中，所述肿瘤细胞是上述癌的细胞。
优选地，本文所述的药剂和组合物以如下方式施用，所述方式不将治疗活性物质递送到或主要递运送到下述组织或器官，其中当所述组织或器官不具有肿瘤时，其细胞大量表达根据本发明鉴定的肿瘤抗原和/或根据本发明鉴定的肿瘤核酸，例如胎盘组织。为此目的，本文所述的药剂和组合物可局部施用。优选地，所述药剂和组合物被递送至卵巢和/或肺。
根据多种实施方案，本发明的方法包括施用根据本发明鉴定之肿瘤抗原的表达和/或活性抑制剂，施用根据本发明鉴定之肿瘤核酸或肿瘤抗原的配体，和/或施用本文所述的一种或多种免疫治疗剂。在一个实施方案中，所述方法包括向患者施用本文所述的药物组合物，以及优选地用本文所述的抗肿瘤疫苗接种患者。根据本发明，可以使用本领域已知的多种免疫接种方法中的任何方法。本发明的抗肿瘤疫苗优选能够诱导或促进针对肿瘤的CTL活性，所述肿瘤的特征在于以I类MHC呈递根据本发明鉴定的肿瘤抗原。这些可与佐剂联合使用，通过直接作用于T细胞或通过APC来促进免疫系统的激活。如本文所述，佐剂包括具有正性免疫调节作用的免疫调节物质。
在多个实施方案中，本发明的方法包括激活针对肿瘤细胞的抗肿瘤CTL应答，所述肿瘤细胞表达根据本发明鉴定的肿瘤抗原并优选地以I类MHC呈递根据本发明鉴定的肿瘤抗原；抑制肿瘤细胞的生长，所述肿瘤细胞表达根据本发明鉴定的肿瘤抗原并优选地以I类MHC呈递根据本发明鉴定的肿瘤抗原；和/或诱导细胞死亡，所述细胞表达根据本发明鉴定的肿瘤抗原并优选地以I类MHC呈递根据本发明鉴定的肿瘤抗原。
在一方面，本发明提供了根据本发明鉴定之肿瘤抗原的表达和/或活性抑制剂、根据本发明鉴定之肿瘤核酸或肿瘤抗原的配体和/或本文所述的用于本文所述治疗方法的一种或多种免疫治疗剂。在一个实施方案中，本发明提供了本文所述的用于本文所述治疗方法的药物组合物。
基于靶向肿瘤核酸或肿瘤抗原的治疗(例如本文所述的免疫治疗)可与手术切除和/或放射和/或传统的化学治疗联用。
本发明的另一目的是提供诊断、检测或监测肿瘤疾病的方法，即确定肿瘤疾病的消退、发展、进程和/或发病。优选地，所述方法包括使用特异性结合靶分子的配体(例如，单克隆抗体和核酸探针)。合适的靶分子有：(i)根据本发明鉴定的肿瘤核酸，(ii)根据本发明鉴定的肿瘤抗原或从其衍生的肿瘤抗原肽，(iii)针对根据本发明鉴定之肿瘤抗原或从其衍生之肿瘤抗原肽的抗体，(iv)识别根据本发明鉴定之肿瘤抗原或从其衍生之肿瘤抗原肽的T细胞，和/或(v)以I类或II类MHC(优选I类MHC)呈递衍生自根据本发明鉴定之肿瘤抗原的肿瘤抗原肽的细胞。所述方法可用于检测对象是否患有肿瘤疾病或具有(增加的)发生肿瘤疾病的风险，或者例如治疗方案是否有效。
因此，本发明涉及诊断、检测或监测肿瘤疾病的方法，所述方法包括检测和/或定量选自以下的一个或多个参数：(i)包含根据本发明鉴定之肿瘤核酸的核酸序列的核酸；编码包含根据本发明鉴定之肿瘤抗原的氨基酸序列的肽的核酸，(ii)包含根据本发明鉴定之肿瘤抗原或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列的肽，(iii)与肽结合的抗体，所述肽包含根据本发明鉴定之肿瘤抗原或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列，(iv)识别肽的T细胞，所述肽包含根据本发明鉴定之肿瘤抗原或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列，和/或(v)在分离自患者(优选分离自患有肿瘤疾病、怀疑患有或患上肿瘤疾病或具有患肿瘤疾病可能性的患者)的生物样品中，以I类或II类MHC(优选I类MHC)呈递肽的细胞，所述肽包含衍生自根据本发明鉴定之肿瘤抗原的肿瘤抗原肽的氨基酸序列。
在一个实施方案中，根据(i)的核酸编码这样的肽，所述肽被加工生成肿瘤抗原特异性的、I类或II类MHC呈递的肽，优选肿瘤抗原特异性的、I类MHC呈递的肽。
在一个实施方案中，根据(ii)的肽是肿瘤抗原特异性的、I类或II类MHC呈递的肽，或者是可被加工生成肿瘤抗原特异性的、I类或II类MHC呈递的肽，优选肿瘤抗原特异性的、I类MHC呈递的肽。
优选地，根据(iv)的T细胞识别肽中的序列，所述肽基本上对应于根据本发明鉴定之肿瘤抗原的片段，所述片段由I类或II类MHC(优选I类MHC)呈递。
在一个实施方案中，根据(v)的细胞通过I类或II类MHC(优选I类MHC)将所述肽呈递于其表面上。所述细胞优选是非增殖性的。在一个优选的实施方案中，所述细胞是抗原呈递细胞，例如树突状细胞、单核细胞或巨噬细胞。因此，在一个优选的实施方案中，根据(v)的细胞是这样的抗原呈递细胞，其包含本文所述的以I类MHC呈递的肿瘤抗原肽。在另一实施方案中，所述细胞是肿瘤细胞。
在一个实施方案中，在细胞(优选肿瘤细胞)中原位检测或定量确定根据(i)的核酸或根据(ii)的肽。在一个实施方案中，在细胞表面上原位检测或定量根据(ii)的肽，所述肽掺入质膜中或者在与I类或II类MHC(优选I类MHC)形成的复合物中。
优选地，待使用本发明方法诊断、检测或监测的肿瘤疾病是癌症，其优选地选自：卵巢癌，尤其是卵巢腺癌和卵巢畸胎癌；肺癌，包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，尤其是鳞状细胞肺癌和腺癌；胃癌；乳腺癌；肝癌；胰腺癌；皮肤癌，尤其是基底细胞癌和鳞状细胞癌；恶性黑色素瘤；头颈癌，尤其是恶性多形性腺瘤；肉瘤，尤其是滑膜肉瘤和癌肉瘤；胆管癌；膀胱癌，尤其是移形细胞癌和乳头状癌；肾癌，尤其是肾细胞癌，包括明细胞肾细胞癌和乳头状肾细胞癌；结肠癌；小肠癌，包括回肠癌，尤其是小肠腺癌和回肠腺癌；睾丸胚胎癌；胎盘绒毛膜癌；子宫颈癌；睾丸癌，尤其是睾丸精原细胞瘤、睾丸畸胎瘤和胚胎睾丸癌；和子宫癌，及其转移形式。
在本发明用于诊断、检测或监测肿瘤疾病的方法的一个实施方案中，生物样品和/或对照/参照样品来自这样的组织或器官，所述组织或器官对应于待诊断、检测或监测受肿瘤疾病影响的组织或器官；例如，当待诊断、检测或监测的肿瘤疾病是卵巢癌时，生物样品和/或对照/参照样品是卵巢组织。本文描述了这样的组织和器官，例如，与不同的肿瘤疾病和癌相关的组织和器官。
在诊断、检测或监测肿瘤疾病的方法的一个实施方案中，所述生物样品来自组织或器官，其中，当所述组织或器官不具有肿瘤时，所述细胞基本上不表达根据本发明鉴定的肿瘤抗原和/或根据本发明鉴定的肿瘤核酸。优选地，所述组织是除胎盘组织以外的组织。优选地，所述组织是卵巢、肺、乳房、十二指肠、皮肤、结肠、肝、淋巴结、胃、脾、肾、食管、胰腺、子宫内膜、脑、胆囊、膀胱、回肠、肾上腺、直肠和骨骼肌的组织，优选卵巢组织或肺组织。
根据本发明，如果与在胎盘细胞或胎盘组织中和/或在卵巢肿瘤细胞和/或肺肿瘤细胞或卵巢肿瘤组织和/或肺肿瘤组织中的表达相比表达水平较低，则肿瘤抗原和/或肿瘤核酸基本不表达。优选地，与上述细胞或组织相比，所述表达水平低于10％，优选地低于5％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.05％，或更低。优选地，如果表达水平低于检出限，则肿瘤抗原和/或核酸基本不表达。
所述用于诊断、检测或监测的方法允许定量和/或定性地评估例如靶分子的绝对的和/或相对的量度(例如，肿瘤核酸或肿瘤抗原的表达水平)。
本文中描述了用于实现所述检测和/或定量的方法，这对本领域技术人员来说是显然的。
优选地，本发明方法中的检测和/或定量包括：(i)将生物样品与特异性结合待检测和/或待定量之核酸、肽、抗体、T细胞或细胞的药剂相接触，和(ii)检测所述药剂与所述待检测或待定量之核酸、肽、抗体、T细胞或细胞的复合物的形成和/或对所述复合物进行定量。
通常，将生物样品中靶分子的水平与参照水平进行比较，其中与所述参照水平的偏差反映了对象中肿瘤疾病的存在和/或分期。所述参照水平可为对照样品(例如，来自健康组织或对象的样品)中测定的水平或者来自健康对象的中值水平。与所述参照水平的“偏差”指示任何显著的差异，例如增加或减少至少10％、20％或30％，优选地至少40％或50％，或更高。优选地，所述生物样品中存在所述核酸、肽、抗体、T细胞和/或细胞或者所述生物样品中所述核酸、肽、抗体、T细胞和/或细胞的量与参照水平相比有所增加，则表明存在肿瘤疾病。
通常，本发明方法中的检测和/或定量涉及使用经标记的配体，所述配体特异性地结合靶分子，例如与靶核酸杂交的经标记核酸探针和/或特异性地结合靶肽的经标记抗体或其片段/衍生物。
根据本发明，可使用已知的核酸检测方法(例如涉及杂交或核酸扩增技术的方法)来进行核酸检测或核酸定量。在一个实施方案中，使用RT-PCR或Northern印迹分析来检测mRNA转录本或对其定量。
所述核酸检测方法可包括使用与靶核酸杂交的寡核苷酸。合适的寡核苷酸的长度通常为5至几百个核苷酸，更通常地为约20～70个核苷酸或更短，甚至更通常地为约10～30个核苷酸。
根据本发明，可通过多种方式进行肽检测或肽定量，包括但不限于使用与所述肽特异性结合的抗体进行免疫检测。优选地，所述抗体与基本上对应于根据本发明鉴定之肿瘤抗原的片段的序列结合。在一个实施方案中，所述序列包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列选自序列表中SEQ IDNO：3、4和5或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。
使用抗体检测肽的方法是公知的，包括ELISA、竞争性结合测定等。一般来说，这样的测定使用特异性结合靶肽的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段直接或间接地与用于检测的标记物结合，所述标记物例如指示酶、放射性标记、荧光团或顺磁颗粒。
根据本发明，可使用与所述抗体特异性结合的肽来进行抗体检测或抗体定量。
T细胞可分离自患者的外周血、淋巴结、组织样品(例如，源自活检和切除的样品)或其它来源。可利用原代T细胞或其它合适的衍生物进行反应性测定。例如，T细胞可融合生成杂交瘤。测量T细胞应答性的测定在本领域中是已知的，包括增殖测定和细胞因子释放测定。
在一个实施方案中，识别包含根据本发明鉴定之肿瘤抗原的氨基酸序列或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列的肽的T细胞是肿瘤抗原应答性CTL。
可以多种方式检测及定量CTL，包括但不限于如下优选实施方案。在一个实施方案中，用合适的荧光肿瘤抗原肽/MHC四聚体对CTL直接进行染色。在另一实施方案中，使用了“TRAP”测定(“通过蛋白质转移对APC进行T细胞识别(T-cell recognition of APCs by proteintransfer)”)(例如，见Beadling等，Nature Medicine 12：1208(2006))。在另一实施方案中，使用Yuan等描述的方法(Cytotherapy 8：498，2006)在血液样品中进行T细胞检测。检测反应性T细胞的测定和指标是已知的，包括但不限于使用IFN-γELISPOT和IFN-γ细胞内细胞因子染色。
本领域已知用于测定T细胞克隆是否应答于特定抗原肽的多种其它方法。通常，将肽加至T细胞悬液中1至3天。可通过增殖(例如，对经标记之胸腺嘧啶的摄取)或通过细胞因子(例如，IL-2)的释放来测量T细胞的应答。有多种测定用于检测所释放细胞因子的存在情况。
可使用T细胞细胞毒测定来检测对肿瘤抗原具有特异性的细胞毒T细胞。在一个实施方案中，测试了细胞毒T细胞杀死以I类MHC分子呈递肿瘤抗原肽之靶细胞的能力。呈递肿瘤抗原肽的靶细胞可被标记并加至来自患者样品的T细胞悬液中。可通过定量从裂解细胞释放的标记物来测量细胞毒性。测定中可包括自发释放和总释放的对照。
呈递肽的细胞可通过测试其诱导细胞应答(例如，激活T细胞)的能力或通过测量CTL对细胞的裂解来检测或定量，所述CTL对所述细胞具有特异性。
待检测和/或定量的所述核酸、所述肽、所述抗体、所述T细胞和/或所述细胞的存在，和/或与参照水平相比(例如，与未患肿瘤疾病的患者相比)所述核酸、所述肽、所述抗体、所述T细胞和/或所述细胞的量的增加，可指示在所述患者中存在肿瘤疾病或具有发生肿瘤疾病的风险(即，发生肿瘤疾病的可能性)。在一个实施方案中，待检测和/或定量的所述核酸、所述肽、所述抗体、所述T细胞和/或所述细胞的存在，和/或与参照水平相比(例如，与未患肿瘤疾病的患者相比)待检测和/或定量的所述核酸、所述肽、所述抗体、所述T细胞和/或所述细胞的量的增加，可指示存在转移性癌(例如转移性卵巢癌或转移性肺癌)或者具有发生上述癌的风险。
在一个实施方案中，所述生物样品来自组织或器官，其中当所述组织或器官不具有肿瘤时，所述细胞基本上不表达根据本发明鉴定的肿瘤抗原和/或根据本发明鉴定的肿瘤核酸。通过本发明的方法指示患者中存在肿瘤疾病或具有其风险可表明在所述组织或器官中存在所述肿瘤疾病，或者所述组织或器官具有发生所述肿瘤疾病的风险。
在一个实施方案中，所述生物样品来自组织或器官，其中当所述组织或器官不具有肿瘤时，所述细胞基本上不表达根据本发明鉴定的肿瘤抗原和/或根据本发明鉴定的肿瘤核酸，并且任选地所述组织或器官已被诊断为受到肿瘤疾病的影响(例如，通过视觉检查或培养测试所述组织或器官的细胞来实现)。在这一实施方案中，待检测和/或定量的所述核酸、所述肽、所述抗体、所述T细胞和/或所述细胞的存在，和/或与参照水平相比(例如，与未患肿瘤疾病的患者相比)所述核酸、所述肽、所述抗体、所述T细胞和/或所述细胞的量的增加，可指示所述肿瘤疾病是转移性卵巢癌或转移性肺癌。用于该测试的优选生物样品可包括已知对所述转移性癌症易感的组织。本文中描述了这样的组织。
通过本发明的方法指示患者中存在转移性卵巢癌或转移性肺癌或具有其风险，也可表明所述患者中存在卵巢癌和肺癌或具有其风险。
本发明的用于诊断、检测或监测肿瘤疾病的所述方法还包括这样的一些实施方案，其中可通过检测或测定所述核酸、所述肽、所述抗体、所述T细胞和/或所述细胞的量，对肿瘤疾病的转移行为进行评价和/或预测，其中，优选地，所述核酸、所述肽、所述抗体、所述T细胞和/或所述细胞的存在，和/或与参照水平相比(例如，与未患肿瘤疾病或无所述疾病转移的患者相比)所述核酸、所述肽、所述抗体、所述T细胞和/或所述细胞的量增加，可表明肿瘤疾病发生转移或有发生肿瘤疾病转移的风险。
在一个实施方案中，所述肿瘤样品来自组织或器官，其中当所述组织或器官不具有肿瘤时，所述细胞基本上不表达根据本发明鉴定的肿瘤抗原和/或根据本发明鉴定的肿瘤核酸。在一个实施方案中，所述肿瘤疾病存在于所述组织或器官中。
根据本发明的监测方法优选地包括：在第一时间点、在第一样品中和在第二时间点、在另一样品中检测和/或定量一个或多个上述参数，其中可通过比较这两个样品来确定肿瘤疾病的消退、发展、进程和/或发病。
与较早前从患者中获取的生物样品相比，生物样品中所述核酸、所述肽、所述抗体、所述T细胞和/或所述细胞的量的降低，可表明所述患者中肿瘤疾病的消退、积极的进展(例如，成功的治疗)或发病风险降低。
在一个实施方案中，所述生物样品来自组织或器官，其中当所述组织或器官不具有肿瘤时，所述细胞基本上不表达根据本发明鉴定的肿瘤抗原和/或根据本发明鉴定的肿瘤核酸。在一个实施方案中，所述肿瘤疾病存在于所述组织或器官中。
与较早前从患者中获取的生物样品相比，生物样品中所述核酸、所述肽、所述抗体、所述T细胞和/或所述细胞的量的增加，可表明所述患者中肿瘤疾病的进展、不乐观的进展(例如，失败的治疗)、复发或发生转移、发病或有发病风险。
在一个实施方案中，所述肿瘤样品来自组织或器官，其中当所述组织或器官不具有肿瘤时，所述细胞基本上不表达根据本发明鉴定的肿瘤抗原和/或根据本发明鉴定的肿瘤核酸。在一个实施方案中，所述肿瘤疾病存在于所述组织或器官中。
在一个特别的方面中，本发明涉及检测肿瘤疾病(即，确定肿瘤疾病的位置或部位，例如特定的组织或器官)的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患者施用与根据本发明鉴定的肿瘤抗原结合并与检测标记物偶联的抗体。在一个实施方案中，所述抗体结合包含这样氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列选自序列表中SEQ ID NO：3、4和5或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。所述抗体可为单克隆抗体。在另一些实施方案中，所述抗体为嵌合的、人的或人源化的抗体、抗体片段或合成抗体。
所述患者中组织或器官被标记可表明在所述组织或器官中肿瘤疾病的存在或风险。
在一个实施方案中，所述组织或器官是这样的组织或器官，其中当所述组织或器官不具有肿瘤时，所述细胞基本上不表达根据本发明鉴定的肿瘤抗原和/或根据本发明鉴定的肿瘤核酸。
在一个实施方案中，所述组织或器官是这样的组织或器官，其中当所述组织或器官不具有肿瘤时，所述细胞基本上不表达根据本发明鉴定的肿瘤抗原和/或根据本发明鉴定的肿瘤核酸，并且所述组织或器官已被诊断为受肿瘤疾病的影响(例如通过视觉检查或培养测试所述组织或器官的细胞来实现)。在这一实施方案中，所述组织或器官的标记可表明所述肿瘤疾病是转移性卵巢癌或转移性肺癌。
通过本发明的方法指示组织或器官中存在转移性卵巢癌或转移性肺癌或具有其风险，也可表明所述患者中存在卵巢癌和肺癌或具有其风险。
优选地，在本发明用于诊断、检测或监测肿瘤疾病的方法中的肿瘤疾病是除结胎盘组织以外的组织的肿瘤疾病。优选地，所述组织是卵巢、肺、乳房、十二指肠、皮肤、结肠、肝、淋巴结、胃、脾、肾、食管、胰腺、子宫内膜、脑、胆囊、膀胱、回肠、肾上腺、直肠和骨骼肌的组织，优选卵巢组织或肺组织。在另一方面，所述肿瘤疾病选自卵巢癌、肺癌、转移性卵巢癌和转移性肺癌。
使用本发明方法得出的上述肿瘤疾病和/或转移性肿瘤疾病和/或肿瘤疾病复发的阳性诊断可指示肿瘤疾病和/或转移性肿瘤疾病和/或肿瘤疾病复发适于接受本文所述的治疗方法。
已在患有上皮来源之癌的患者的外周血中观察到了超低浓度的循环肿瘤细胞(CTC，circulating tumor cell)。已显示，这些细胞的数目与取样时患有进行性疾病的转移性癌患者人群的预后相关。一些报道揭示了循环肿瘤细胞在受结肠癌影响的患者中的预后作用。因此，测量循环肿瘤细胞的仪器可以是有价值的诊断工具。
根据本发明鉴定的肿瘤核酸或肿瘤抗原可用于检测患者中循环肿瘤细胞的方法中。所述方法可指示转移性癌或早期癌的存在。在所述方法的一方面中，在样本中存在循环肿瘤细胞表明哺乳动物对象中癌复发的可能性。在所述方法的另一方面中，样本中存在循环肿瘤细胞表明在哺乳动物对象中癌的减退状态。
因此，本发明涉及检测患者中循环肿瘤细胞的方法，所述方法包括在从所述患者分离的含有或怀疑含有散布的或循环的肿瘤细胞或转移性肿瘤细胞的生物样品中检测和/或定量(i)包含根据本发明鉴定之肿瘤核酸的核酸序列的核酸；编码包含根据本发明鉴定之肿瘤抗原的氨基酸序列的肽的核酸，和/或(ii)包含根据本发明鉴定之肿瘤抗原的氨基酸序列或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列的肽。优选地，所述患者是患有、怀疑患有或患上肿瘤疾病或者具有患肿瘤疾病可能性的患者。
因此，在本发明用于检测循环肿瘤细胞的方法中，根据本发明鉴定的肿瘤核酸和/或根据本发明鉴定的肿瘤抗原或从其衍生的肿瘤抗原肽被用作靶分子，用于鉴定特征在于存在所述靶分子的细胞。这些细胞可能代表循环的肿瘤细胞。
在一个实施方案中，在细胞(优选肿瘤细胞)中原位检测或定量所述核酸或所述肽。在一个实施方案中，在细胞表面上原位检测或定量所述肽，所述肽掺入质膜中或者在与I类或II类MHC(优选I类MHC)形成的复合物中。本文描述了用于实现所述检测和/或定量所述靶分子的手段，所述手段对于本领域技术人员来说是显见的。
含有或怀疑含有散布的或循环的肿瘤细胞或转移性肿瘤细胞的生物样品包括例如：血液、血清、腹液(abdominal fluid)、骨髓、痰、支气管吸出物和/或支气管灌洗液。
在本方法的一方面中，在所述生物样品中存在根据(i)的所述核酸和/或根据(ii)的所述肽，或者与参照水平相比所述生物样品中所述核酸和/或所述肽的量增加，表明在所述患者中存在循环的肿瘤细胞。
在本方法的一方面中，在样品中存在循环肿瘤细胞可表明患者中存在肿瘤疾病(尤其是转移性肿瘤疾病)或具有其风险。在另一方面，在样品中存在循环肿瘤细胞可表明患者中存在早期肿瘤疾病或具有其风险。在另一方面，所述患者中存在循环肿瘤细胞可表明存在下述肿瘤疾病或具有其风险，所述肿瘤疾病选自：卵巢癌、肺癌、转移性卵巢癌和转移性肺癌。
在一些具体的实施方案中，本发明的方法使得评价和/或预测已施用或待施用之癌症治疗是否成功成为可能。在本方法的一方面中，在样品中存在循环肿瘤细胞可表明在患者中存在肿瘤转移或肿瘤复发或具有其风险。在本方法的另一方面中，样品中存在循环肿瘤细胞可表明患者中肿瘤的减退状态。
使用本发明用于检测循环肿瘤细胞的方法检测循环肿瘤细胞可表明肿瘤疾病和/或肿瘤疾病的转移和/或肿瘤疾病的再度恶化适于接受本文所述的治疗方法。
在一个详细的方面，样品中存在循环肿瘤细胞可表明癌的存在或风险，所述癌包括但不限于淋巴瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、小细胞肺肿瘤、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、胰腺癌、膀胱癌、睾丸癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌或前列腺癌。
优选地，使用针对靶肽的抗体进行针对循环肿瘤细胞的所述测定，其中对所述抗体进行可检测地标记。在一个具体的实施方案中，使用免疫荧光测定、利用针对靶肽的单克隆抗体来进行循环肿瘤细胞的所述测定，并优选利用患者的外周血进行。在一个实施方案中，所述抗体结合包含如下氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列选自序列表中SEQ ID NO：3、4和5或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。
血液中循环肿瘤细胞的存在可与转移性肿瘤疾病或转移性肿瘤疾病的风险相关联，并可与差的预后和较低的存活率相关联。
当前可用的最可靠的CTC检测法是使用影像分析来识别经免疫细胞化学标记的肿瘤细胞的自动数码显微镜检测法(ADM，automated digitalmicroscopy)。然而，ADM的劣势是其扫描速度非常慢(800个细胞/秒)。Kraeft等，Clin Cancer Res 10：3020-8，2004。所述ADM扫描速度受限于由于视野有限所致的多次分步检测样品相关的时间延迟。
为克服该速度限制，已开发了几种CTC富集技术，以减少需要扫描的细胞总数。这些富集方法中迄今最成功的是免疫磁性富集法(IME，immunomagnetic enrichment)。Smirnov等，Cancer Res 65：4993-7，2005；Allard等，Clin Cancer Res 10：6897-904，2004；Cristofanilli等，N EnglJMed 351：781-91，2004。在大多数IME的应用中，与小磁珠缀合的单克隆抗体靶向内皮细胞粘附分子——EpCAM(epithelial cell adhesionmolecule)。随后，在磁场中富集所述磁珠。
本发明的另一方面涉及检测患者中转移性卵巢癌细胞或转移性肺癌细胞的方法，所述方法包括在从所述患有肿瘤之患者的组织或器官分离的生物样品中检测和/或定量(i)包含根据本发明鉴定之肿瘤核酸的核酸序列的核酸；编码包含根据本发明鉴定之肿瘤抗原的氨基酸序列的肽的核酸，和/或(ii)包含根据本发明鉴定之肿瘤抗原的氨基酸序列或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列的肽，其中当组织或器官不具有肿瘤时，所述细胞基本上不表达所述核酸或肽。
因此，在检测转移性卵巢癌细胞或转移性肺癌细胞的方法中，根据本发明鉴定的肿瘤核酸和/或根据本发明鉴定的肿瘤抗原或从其衍生的肿瘤抗原肽被用作靶分子，用来鉴定特征在于存在所述靶分子的肿瘤细胞。这些细胞很可能代表转移性卵巢癌细胞或转移性肺癌细胞。在一个实施方案中，在细胞(优选肿瘤细胞)中原位检测或定量所述核酸或所述肽。
在一个实施方案中，在细胞表面上原位检测或定量所述肽，所述肽掺入质膜中或者在与I类或II类MHC(优选I类MHC)形成的复合物中。本文描述了用于实现所述检测和/或定量所述靶分子的方法，所述方法对于本领域技术人员来说是显见的。
根据本发明，如果与在胎盘细胞或胎盘组织中和/或在卵巢肿瘤细胞和/或肺肿瘤细胞或卵巢肿瘤组织和/或肺肿瘤组织中的表达相比表达水平较低，则核酸和/或肽基本上不表达。优选地，与上述细胞或组织相比，所述表达水平低于10％，优选地低于5％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.05％，或更低。优选地，如果表达水平低于检出限，则核酸和/或肽基本上不表达。
优选地，所述组织是除胎盘组织以外的组织，优选地是除卵巢组织或肺组织以外的组织。优选地，所述组织是乳房、十二指肠、皮肤、结肠、肝、淋巴结、胃、脾、肾、食管、胰腺、子宫内膜、脑、胆囊、膀胱、回肠、肾上腺、直肠和骨骼肌的组织。优选地，所述组织是已知对转移性卵巢癌和/或转移性肺癌易感的组织。本文中描述了这样的组织。
优选地，所述组织或器官已通过视觉检查或培养测试所述组织器官的细胞而被诊断为受肿瘤疾病的影响。
在本方法的一方面中，在所述生物样品中存在根据(i)的所述核酸和/或根据(ii)的所述肽，或者与参照水平相比所述生物样品中所述核酸和/或所述肽的量增加，表明所述组织或器官中存在转移性卵巢癌细胞或转移性肺癌细胞或具有其风险。所述组织或器官中存在转移性卵巢癌细胞或转移性肺癌细胞在也可表明所述患者中存在卵巢癌和肺癌或具有其风险。
转移性卵巢癌细胞或转移性肺癌细胞的阳性诊断可表明，从中分离出所述生物样品的组织或器官的肿瘤适于接受本文所述的治疗方法。
本发明的另一目的涉及诊断测试试剂盒，其可用于诊断、检测或监测方法，并且可用于检测循环肿瘤细胞的方法，和/或可用于本发明的检测转移性卵巢癌细胞或转移性肺癌细胞的方法。在一个实施方案中，这些试剂盒包含如上定义的特异性结合靶分子的配体以及任选地可检测标记物(例如指示酶、放射性标记、荧光团或顺磁颗粒)。在一个具体的实施方案中，所述配体包含特异性针对上述靶核酸的核酸引物或探针，或特异性针对上述靶肽的抗体或其衍生物。在一个实施方案中，所述抗体特异性针对包含如下氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列选自序列表中SEQ ID NO：3、4和5或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。试剂盒可包含说明性的小手册，例如告知如何使用试剂来实施本文公开之方法的小手册。
在另一方面，本发明涉及重组核酸分子(尤其是DNA或RNA分子)，其包含编码如下肽的核酸，所述肽含有肿瘤抗原或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列。
本发明还涉及包含本发明重组核酸分子的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞表达所述编码肽。
宿主细胞可为重组细胞，并可分泌所述编码肽，可将其表达在表面上，并优选地可额外表达结合所述肽或其加工产物的MHC分子。在一个实施方案中，所述宿主细胞内源性地表达MHC分子。在另一实施方案中，所述宿主细胞以重组的方式表达所述MHC分子和/或所述肽或其加工产物。所述宿主细胞优选是非增殖性的。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是抗原呈递细胞，尤其是树突状细胞、单核细胞或巨噬细胞。
在另一方面，本发明涉及包含根据本发明鉴定之肿瘤抗原或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列的肽，或所述肽的衍生物。在一个实施方案中，所述肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列选自序列表中SEQ ID NO：3、4和5或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。
在另一方面，本发明涉及与如下肽结合的药剂，所述肽包含根据本发明鉴定之肿瘤抗原或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列，或所述肽的衍生物。在一个实施方案中，所述肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列选自序列表的SEQ ID NO：3、4和5的氨基酸序列，或其片段，或所述氨基酸序列或片段的变体。在一个优选的实施方案中，所述药剂是蛋白质或肽，尤其是抗体、T细胞受体或MHC分子。在另一些实施方案中，所述抗体是单克隆的、嵌合的、人的或人源化的抗体、通过重组技术产生的抗体、抗体片段或合成抗体。
本发明还涉及由本发明中结合肽或所述肽之衍生物的药剂与治疗效应部分或检测标记物形成的缀合物，所述肽包含根据本发明鉴定之肿瘤抗原或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列。
发明详述
本发明的一些方面通过主动或被动免疫治疗方法、应用根据本发明鉴定的肿瘤核酸和肿瘤抗原涉及肿瘤疾病(尤其是癌疾病)的免疫治疗，所述免疫治疗方法总结如下：
免疫治疗
I.主动免疫治疗(“癌疫苗”)
用如下各项来免疫：
i)抗原或肽(天然的或修饰的)
ii)编码所述抗原或肽的核酸
iii)编码所述抗原或肽的重组细胞
iv)编码所述抗原或肽的重组病毒
v)用抗原或肽(天然的或修饰的)进行脉冲处理的抗原呈递细胞或用编码所述抗原或肽的核酸转染的抗原呈递细胞
II.被动免疫治疗(“获得性免疫治疗”)
vi)转移识别抗原的抗体或T细胞受体
vii)转移在体外用抗原致敏的细胞(大量或克隆的群体)
viii)转移用编码T细胞受体的核酸转导的效应细胞(或干细胞)，所述T细胞受体识别抗原并优选地对肿瘤特异性的、I类MHC呈递的肽有响应。
在过去的几年中，非常关注CD8+T细胞在肿瘤免疫中的作用。肿瘤特异性CD8+CTL已表明能够直接裂解肿瘤细胞并在动物模型体内根除瘤块。然而，CD4+T细胞也被认为发挥关键作用，而最佳的癌疫苗也许需要CD4+和CD8+T细胞共同参与。
用完整的或基本完整的肿瘤抗原进行免疫具有同时针对I类和II类表位进行免疫的潜在优势，但需要大量和耗时的努力来纯化大量肿瘤抗原。在肿瘤抗原中鉴定I类和II类MHC肽使得用高水平的纯的合成肽进行免疫成为可能。该肽法还具有这样的优势：人们可以通过选用表位而在I类和II类MHC型应答之间(或混合)进行选择。用肽免疫还意味着可以选择次优势和/或隐蔽表位(因为抗原加工的需要可被绕过或降至“修剪(trimming)”作用)，以激活不同的T细胞亚群。另外，可修饰所述肽(例如，在其I或II类HLA锚定位点)以提高其免疫原性。
本发明涉及肿瘤特异性的、I类MHC呈递的肽和使用所述肽的方法，以及对肿瘤特异性的、I类MHC呈递的肽有响应的细胞毒T淋巴细胞(CTL)和使用该细胞的方法。
在一个方面，本发明提供能够激活针对肿瘤之细胞应答的抗肿瘤疫苗，所述肿瘤的特征在于以I类MHC呈递根据本发明鉴定的肿瘤抗原。本发明的抗肿瘤疫苗优选包含肿瘤抗原肽或肿瘤抗原肽核酸。
本发明还涉及编码一种或多种根据本发明鉴定的肿瘤抗原或者一种或多种从其衍生的肿瘤抗原肽的核酸的用途。据预测，如此编码的抗原或肽有效地用作治疗性或预防性的抗肿瘤疫苗。例如，这些核酸的一个具体涉及的应用涉及诱导针对所述抗原的细胞应答(例如CTL应答)和/或体液免疫应答。
用质粒DNA免疫可诱导出抗原特异性的由CD8+T细胞、CD4+T细胞和抗体构成的免疫应答。可通过免疫基因枪法施用DNA。在基因枪免疫中，可将质粒DNA包被到金颗粒上，然后通过高压、氦驱动基因枪将所述经DNA包被的颗粒递送进皮肤中。
分子生物学的进步已使得构建本文所述的编码肿瘤抗原或肿瘤抗原肽的重组病毒成为可能。迄今，已使用几种重组病毒疫苗。
在改善恶性疾病之免疫治疗的潜力方面，几种病毒载体已显示出乐观的前景。可使用有复制能力和无复制能力的病毒(优选后一组)。根据本发明优选使用的病毒的实例有疱疹病毒、腺病毒、牛痘、呼肠孤病毒和新城疫病毒。
抗原呈递细胞(APC)(例如，树突状细胞(DC))可用I类MHC呈递的肽或肿瘤裂解物加载，或用核酸转导(例如用编码肿瘤抗原的腺病毒来转导)。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗肿瘤疫苗包含载有肿瘤抗原肽的APC。在这一方面，实验方案可依赖于DC的体外培养/分化，以使其人工地呈递肿瘤抗原肽的方式操作。产生遗传改造的DC可包括将编码肿瘤抗原或肿瘤抗原肽的核酸引入DC。用mRNA转染DC是激活强抗肿瘤免疫的有前景的抗原加载技术。
树突状细胞(DC)是通过II和I类MHC抗原呈递途径将外周组织中捕获的抗原呈递给T细胞的白细胞群。众所周知，DC是免疫应答的强诱导剂，而这些细胞的活化是诱导抗肿瘤免疫的关键步骤。DC的成熟是指DC活化的状态，在该状态下，所述抗原呈递DC导致T细胞的活化，而其通过未成熟DC的呈递则导致耐受。DC成熟主要由通过固有受体检测到的具有微生物特征的生物分子(细菌DNA、病毒RNA、内毒素等)、促炎细胞因子(TNF、IL-I、IFN)、CD40L与DC表面上CD40的连接以及从发生应激性细胞死亡的细胞中释放的物质所引起。可通过用细胞因子(例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子α)体外培养骨髓细胞来获得DC。
本发明的另一实施方案包括抗体的制备，所述抗体优选为针对上述靶抗原的单克隆抗体。所述单克隆抗体可通过常规方法生产，且包括其片段或衍生物，包括但不限于：人单克隆抗体、人源化单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、单链抗体(例如，scFv)和结合抗原的抗体片段(例如Fab和Fab’片段)。制备单克隆抗体的方法在本领域中是已知的。一般来说，单克隆抗体的制备包括用目的抗原免疫合适的宿主，从中分离免疫细胞，使用这样的免疫细胞来分离单克隆抗体，并筛选特异性结合任一所述抗原的单克隆抗体。可用已知的方法制备抗体片段，例如单克隆抗体的酶裂解法。
这些单克隆抗体和片段可用于被动抗肿瘤免疫治疗，或者可与治疗效应部分(放射性标记、细胞毒素、治疗性酶、诱导凋亡的制剂等)连接，从而提供靶向的细胞毒性(即杀死肿瘤细胞)。在本发明的一个实施方案中，采用标记的或未标记的形式、单独地或与其它疗法(例如适于治疗癌的化学治疗(例如，顺铂、甲氨蝶呤、阿霉素等))一起施用所述抗体或片段。
如果用于被动抗肿瘤免疫治疗，则抗体可以与或不与治疗效应部分连接。优选地，本文所述的抗体通过诱导补体依赖性细胞毒作用(CDC，complement dependent cytotoxicity)介导的裂解、抗体依赖的细胞毒作用(ADCC，antibody dependent cellular cytotoxicity)介导的裂解、凋亡、同质性粘附和/或噬菌作用(优选地通过诱导CDC介导的裂解和/或ADCC介导的裂解)来介导杀死细胞。本文所述的抗体优选地与免疫系统的组分相互作用(优选地通过ADCC或CDC来实现)。然而，本发明的抗体还可以简单地通过与细胞表面上的肿瘤抗原结合而发挥作用，从而例如阻断所述细胞的增殖。
ADCC描述了本文所述效应细胞(尤其是淋巴细胞)的细胞杀死能力，其优选地需要用抗体标记靶细胞。
当抗体与肿瘤细胞上的抗原结合并且抗体Fc结构域与免疫效应细胞表面上的Fc受体(FcR)连结时，ADCC优选地发生。已鉴定出几个Fc受体家族，特定细胞群特征性地表达所定义的Fc受体。可将ADCC看作是直接诱导不同程度的立即肿瘤破坏的机制，其也导致抗原呈递和诱导针对肿瘤的T细胞应答。优选地，ADCC的体内诱导会导致针对肿瘤的T细胞应答和源自宿主的抗体应答。
CDC是另一种杀死细胞的方法，其可由抗体指导。IgM是最有效地激活补体的同种型。IgG1和IgG3对于通过经典的补体激活途径指导CDC也都很有效。优选地，在该级联中，抗原-抗体复合物的形成导致参与抗体分子(例如IgG分子)的CH2结构域上紧邻的多个C1q结合位点暴露(C1q是补体C1的三个亚组分之一)。优选地，这些暴露的C1q结合位点将先前低亲和力的C1q-IgG相互作用转化为高亲和力的相互作用，这触发了涉及其它补体蛋白复合物的级联事件，并导致效应细胞趋化/激活物质C3a和C5a的蛋白水解释放。优选地，在形成膜攻击复合物之后，补体级联终止，所述膜攻击复合物在细胞膜中形成孔道从而促进水和溶质自由进出细胞，并可导致凋亡。
用能够识别肿瘤抗原的免疫细胞(任选地，经遗传修饰的免疫细胞)进行被动免疫治疗有效地介导选定患者中癌的消退。这些技术可基于肿瘤反应性T细胞的克隆或多克隆培养物的离体再活化和扩增。培养之后，可将T细胞与IL-2再次输注进患者中。已开发了体外技术，其中在体外用抗原呈递细胞上呈递的肿瘤抗原肽使人淋巴细胞致敏。通过反复的体外刺激，细胞可获得强的识别人肿瘤抗原的能力。与常规培养的细胞相比，这些细胞的获得性转移可以更有效地介导体内肿瘤的消退。
在一个实施方案中，可从癌症患者中获得自体细胞毒淋巴细胞或肿瘤浸润性淋巴细胞。所述淋巴细胞可在培养物中培养，且肿瘤抗原应答性CTL在I类MHC呈递的肿瘤抗原肽存在下、单独地或与至少一种免疫调节剂(优选额外地与细胞因子)联合培养而进行扩增。随后，将所述肿瘤抗原应答性CTL以有效降低或清除所述患者中肿瘤的量输注回患者中。
如果已有的应答不够，则可在收获淋巴细胞之前用抗肿瘤肽疫苗预刺激患者。预计利用低至中等剂量的IL-2输注可使获得性转移的CTL存活得最好。
“肿瘤抗原应答性CTL”意为对衍生自所述肿瘤抗原的肿瘤抗原肽有响应的CD8+T细胞，所述肿瘤抗原肽由I类MHC呈递于例如肿瘤细胞表面上。
根据本发明，CTL的应答性可包括持续的钙流、细胞分裂、产生细胞因子(例如，IFN-γ和TNF-α)、上调活化标志物(例如，CD44和CD69)以及特异性地细胞裂解性杀死表达肿瘤抗原的靶细胞。还可使用精确指示CTL应答性的人工报告子来测定CTL的应答性。
“肿瘤抗原肽”或“衍生自肿瘤抗原的肿瘤抗原肽”意为包含基本上对应于根据本发明鉴定之肿瘤抗原的片段或肽的氨基酸序列的氨基酸序列的寡肽或多肽。优选地，肿瘤抗原肽当使用其本身或与免疫原性载体连接时能够激活针对特征在于以I类MHC呈递本文所鉴定肿瘤抗原的肿瘤的细胞应答，优选地能够激活肿瘤抗原应答性CTL和/或能够诱导特异性结合根据本发明鉴定之肿瘤抗原的抗体。根据本发明的肿瘤抗原肽优选为包含基本上对应于序列表中SEQ ID NO：2之氨基酸序列的片段的序列，或是所述肽的衍生物。在一个实施方案中，所述肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列选自序列表中SEQ ID NO：3、4和5或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。肿瘤抗原肽可为任意长度。
如果要直接呈递肿瘤抗原肽(即不经加工，尤其是不经切割)，则其具有适于结合MHC分子(尤其是I类MHC分子)的长度，优选长度为7～20个氨基酸，更优选长度为7～12个氨基酸，更优选长度为8～11个氨基酸，尤其是长度为9或10个氨基酸。优选地，要直接呈递的肿瘤抗原肽的序列衍生自根据本发明鉴定之肿瘤抗原的氨基酸序列，即其序列基本上对应于根据本发明鉴定之肿瘤抗原的片段，并优选与其完全相同。如果肿瘤抗原肽在加工之后(尤其是切割之后)被呈递，则经加工产生的肽具有适于结合MHC分子(尤其是I类MHC分子)的长度，优选长度为7～20个氨基酸，更优选长度为7～12个氨基酸，更优选长度为8～11个氨基酸，尤其是长度为9或10个氨基酸。优选地，要在加工之后呈递的肽的序列衍生自根据本发明鉴定之肿瘤抗原的氨基酸序列，即其序列基本上对应于根据本发明鉴定之肿瘤抗原的片段，并优选与其完全相同。因此，在一个实施方案中，根据本发明的肿瘤抗原肽包含长度为7～20个氨基酸(更优选长度为7～12个氨基酸，更优选长度为8～11个氨基酸，尤其是长度为9或10个氨基酸)的序列，所述序列基本上对应于根据本发明鉴定之肿瘤抗原的片段，并优选与其完全相同，并且在肿瘤抗原肽加工之后形成了所呈递的肽。然而，所述肿瘤抗原肽还可包含这样的序列，所述序列基本上对应于根据本发明鉴定之肿瘤抗原的片段，并优选与其完全相同，所述序列比上面提及的序列更长。在一个实施方案中，肿瘤抗原肽可包含根据本发明鉴定之肿瘤抗原的整个序列。
优选地，肿瘤抗原肽可以直接地或在加工之后以I类MHC分子进行呈递，当如此呈递时能够激活肿瘤抗原应答性CTL。具有与I类MHC所呈递肽基本上对应于之序列的氨基酸序列的肽可在一个或多个残基处有差异，所述残基对于TCR识别所述I类MHC所呈递之肽或对于肽和MHC的结合不是必需的。所述基本上对应的肽也能够激活肿瘤抗原应答性CTL。具有如下氨基酸序列的肽可改善肿瘤抗原肽的免疫原性并在本文中可称为“优化肽”，所述氨基酸序列与所呈递的肽在不影响TCR识别而是提高MHC结合稳定性的残基处有差异。使用关于哪些残基更可能影响与MHC或TCR结合的已有知识，可采用理性方法来设计基本上对应的肽。所得到的有功能的肽均归为“肿瘤抗原肽”。
“免疫反应性细胞”意指在适当刺激后可成熟为免疫细胞(例如，B细胞、辅助T细胞或CTL)的细胞。因此，免疫反应性细胞包括CD34+造血干细胞、未成熟T细胞和未成熟B细胞。当期望产生识别肿瘤抗原的CTL时，在利于CTL产生、分化和/或选择的条件下使免疫反应性细胞与呈递肿瘤抗原或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的细胞相接触。
“特征在于以I类MHC呈递肿瘤抗原的细胞”或“以I类MHC呈递肿瘤抗原的细胞”或类似的表述意指：在I类MHC分子存在下，呈递其表达之肿瘤抗原或衍生自所述肿瘤抗原之片段(例如，通过加工所述肿瘤抗原来实现)的细胞(例如，肿瘤细胞或抗原呈递细胞)。类似地，术语“特征在于以I类MHC呈递肿瘤抗原的肿瘤”表示这样的肿瘤，其包含特征在于以I类MHC呈递肿瘤抗原的细胞。
“所呈递的根据本发明鉴定之肿瘤抗原的片段”或类似表述意指，当直接加至抗原呈递细胞时，所述片段可被I类或II类MHC(优选I类MHC)呈递。在一个实施方案中，所述片段是由表达根据本发明鉴定之肿瘤抗原的细胞(例如，肿瘤细胞)天然呈递的片段。
“识别肿瘤抗原或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的细胞”或“识别肿瘤抗原或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的免疫反应性细胞”或类似表述意指：能够以一定程度的特异性识别所述肿瘤抗原或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的细胞，尤其是在MHC分子存在下呈递到例如抗原呈递细胞或肿瘤细胞的表面上。优选地，所述识别使得识别肿瘤抗原或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的细胞有响应。如果所述细胞是具有在II类MHC分子存在下识别肿瘤抗原或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的受体的辅助T细胞(CD4+T细胞)，则所述应答性可涉及释放细胞因子和/或激活CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B细胞。如果所述细胞是CTL，则所述应答性可涉及清除I类MHC分子存在下呈递的细胞，即以I类MHC呈递肿瘤抗原为特征的细胞，例如通过凋亡或穿孔素介导的细胞裂解来实现。识别肿瘤抗原或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽并且有应答性的所述CTL在本文中也称为“肿瘤抗原应答性CTL”。如果所述细胞是B细胞，则所述免疫应答性可涉及免疫球蛋白的释放。
“识别肿瘤抗原或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的T细胞受体”意指：能够以一定程度的特异性识别所述肿瘤抗原或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的T细胞受体，尤其是在MHC分子存在下呈递时。优选地，所述识别使得携带识别肿瘤抗原或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的T细胞受体的细胞具有上述应答性。
“针对肿瘤抗原的细胞应答”意在包括针对特征在于以I类或II类MHC呈递肿瘤抗原之细胞的细胞应答。所述细胞应答涉及称为T细胞或T淋巴细胞的细胞，其作为“辅助者”或“杀伤者”发挥作用。所述辅助T细胞(也称为CD4+T细胞)通过调节免疫应答而发挥重要作用，所述杀伤细胞(也称为细胞毒T细胞、细胞裂解T细胞、CD8+T细胞或CTL)杀死肿瘤细胞，防止更多肿瘤细胞的产生。尽管免疫应答的这两个分支都被认为是必要的，但所述CTL应答对于控制肿瘤来说可能更为重要。
根据本发明，“参照”(例如参照样品或参照生物体)可用于与通过本发明方法获得的来自测试样品或测试生物体(即，患者)的结果进行关联和比较。所述参照生物体一般是健康生物体，尤其是未患有肿瘤疾病的生物体。
“参照值”或“参照水平”可通过测量足够大数目的参照物而根据参照物来经验性地确定。优选地，通过测量至少2个、优选至少3个、优选至少5个、优选至少8个、优选至少12个、优选至少20个、优选至少30个、优选至少50个或优选至少100个参照物来确定参照值。
根据本发明，术语“结合”优选地涉及特异性结合。“特异性结合”意为药剂(例如，抗体)较强地与靶标(例如，表位)结合，与结合其它靶标相比该结合是特异性的。如果结合第一靶标的解离常数(KD)低于结合第二靶标的解离常数，则药剂与所述第一靶标的结合强于与所述第二靶标的结合。优选地，与不特异性结合药剂的靶标之解离常数(KD)相比，特异性结合药剂的靶标之解离常数(KD)低出超过102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍或1010倍。
根据本发明，核酸优选为脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。根据本发明的核酸包括基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生的和化学合成的分子。根据本发明，核酸可为单链或双链、线性或共价环状闭合的分子。
术语“根据本发明鉴定的肿瘤核酸”和“编码根据本发明鉴定之肿瘤抗原的核酸”具有相似的含义。
本文中使用的术语“RNA”意为包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”意为β-D-核呋喃糖部分的2’位为羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA(例如，部分纯化的RNA)、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA以及通过添加、缺失、替换和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然RNA的经改变RNA。所述改变可包括添加非核苷酸物质，例如，添加到RNA的末端或内部，例如，在RNA的一个或多个核苷酸处。RNA分子中的核苷酸也可包括非标准核苷酸，例如非天然核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些经改变RNA可称为类似物或天然RNA之类似物。
当本文中涉及对核酸的检测或定量时，实际上待检测或待定量的核酸优选为mRNA。然而，应当理解，其也可包括这样的一些实施方案，其中mRNA被间接地检测或定量。例如，mRNA可被转化成cDNA，继而检测或定量cDNA。本文中将mRNA视为cDNA的等同概念。本领域专业人员会理解，所述cDNA序列等同于mRNA序列，并可用于本文中的相同目的，例如，生成与待检测核酸杂交的探针。因此，当本文中涉及序列表中所示序列时，其也包括所述序列的RNA等同物。
根据本发明所述的核酸优选地已被分离。根据本发明的术语“分离的核酸”意为：所述核酸是(i)体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)来实现，(ii)通过克隆重组地产生的，(iii)纯化的，例如通过切割和凝胶电泳分级分离来实现，或(iv)合成的，例如通过化学合成来实现。分离的核酸是可用于重组DNA技术操作的核酸。
当例如涉及核酸和氨基酸序列时，根据本发明的术语“变体”包括任何变体，尤其是突变体、剪接变体、构象变体(conformation)、同工型、等位基因变体、种间变体(species variant)和物种同源物，尤其是那些天然存在的变体。等位基因变体涉及基因正常序列中的改变，其意义常常是不清楚的。全基因测序常鉴定出给定基因中的多个等位基因变体。物种同源物是与给定核酸或氨基酸序列具有不同物种来源的核酸或氨基酸序列。
对于核酸分子，术语“变体”包括简并核酸序列，其中根据本发明的简并核酸是由于遗传密码的简并性在密码子序列上不同于参照核酸的核酸。
另外，根据本发明的特定核酸序列的“变体”包括这样的核酸序列：其包含一个或多个(例如至少2个、至少4个或至少6个，优选多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达10个、多达15个或多达20个)核苷酸替换、缺失和/或添加。
优选地，给定核酸序列与所述给定核酸序列之变体的核酸序列之间的同一性程度为至少70％，优选至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％或最优选至少95％、96％、97％、98％或99％。同一性程度优选在至少约30个、至少约50个、至少约70个、至少约90个、至少约100个、至少约150个、至少约200个、至少约250个、至少约300个或至少约400个核苷酸的区域上给出。在一些优选实施方案中，同一性程度在参考核酸序列的整个长度上给出。
“序列相似性”表示相同氨基酸或作为保守氨基酸替换之氨基酸的百分比。两个多肽或核酸序列的“序列相似性”表示所述序列之间相同氨基酸或核苷酸的百分比。
术语“同一性百分比”旨在表示待比较的两个序列之间相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比，其在最优比对后获得，该百分比是纯粹统计学意义上的，两个序列之间的差异在其整个长度上随机分布。两个核苷酸序列或氨基酸序列之间的序列比较在最优比对之后、通过比较这些序列来常规地进行，所述比较通过分段(segment)或通过“比较窗口”来进行，以鉴定和比较局部区域的序列相似性。为比较而进行的序列最优比对可通过手动方式或如下方法得到：Smith和Waterman，1981，Ads App.Math.2，482的局部同源性算法；Neddleman和Wunsch，1970，J.MoI.Biol.48，443的局部同源性算法；Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl Acad.Sci.USA 85，2444的相似性检索法；或使用这些算法的计算机程序(Wisconsin GeneticsSoftware软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wis.)。
如下计算同一性百分比：确定要比较的两个序列之间相同位置的数目，将该数目除以所比较的位置数，并将所得结果乘以100，从而获得这两个序列之间的同一性百分比。
如果两个序列彼此互补，则核酸“能够杂交”或“杂交”到另一核酸。如果两个序列能够彼此形成稳定的双链体，则核酸与另一核酸“互补”。根据本发明，杂交优选在允许多核苷酸之间特异性杂交的条件下进行(严格条件)。严格条件描述于例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook等编辑，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory press，ColdSpring Harbor，New York，1989或Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等编辑，John Wiley & Sons，Inc.，New York，并指例如于65℃在杂交缓冲液(3.5×SSC，0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白，2.5mM NaH2PO4(pH 7)，0.5％SDS，2mM EDTA)中杂交。SSC是0.15M氯化钠/0.15M柠檬酸钠(pH7)。杂交后，清洗已转移有DNA的膜(例如于室温下在2×SSC中，随后在高达68℃的温度下在0.1～0.5×SSC/0.1×SDS中)。
互补百分比表示核酸分子中可与另一核酸序列形成氢键(例如，Watson-Crick碱基配对)的连续残基的百分比(例如，10个中有5、6、7、8、9、10个互补，则为50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。“完美互补”或“完全互补”意指核酸序列的所有连续残基与另一核酸序列中相同数目的连续残基形成氢键。优选地，根据本发明的互补程度为至少70％，优选至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，或最优选至少95％、96％、97％、98％或99％。根据本发明，最优选地，所述互补程度为100％。
术语“衍生物”包括核酸在核苷酸碱基、糖或磷酸上的任何化学衍生化。术语“衍生物”也包括含有核苷酸和非天然核苷酸类似物的核酸。优选地，核酸的衍生化提高其稳定性。
根据本发明，编码肿瘤抗原或肿瘤抗原肽的核酸可单独或与其它核酸(尤其是异源性核酸)联合存在。优选地，编码肿瘤抗原或肿瘤抗原肽的核酸表达所述肿瘤抗原或肿瘤抗原肽。在一些优选的实施方案中，核酸与表达调控序列或调节序列功能性连接，所述表达调控序列或调节序列可与所述核酸是同源的或异源的。如果编码序列和调节序列以如下方式彼此共价连接，则它们彼此“功能性地”连接：所述编码序列的表达或转录置于所述调节序列的控制或影响之下。如果要将编码序列翻译成功能蛋白质，则借助与所述编码序列功能性连接的调节序列，诱导所述调节序列会导致所述编码序列的翻译，而不引起编码序列移框或者所述编码序列不能翻译成期望蛋白质或肽。
根据本发明的术语“表达调控序列”或“调节序列”包括启动子、增强子和其它调节基因表达的调控元件。在一些具体的实施方案中，表达调控序列可被调节。调节序列的确切结构根据物种或细胞类型而变化，但一般包含5’非转录和5’非翻译序列，其分别参与转录和翻译的起始，例如，TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。更具体地，5’非转录调节序列包含启动子区，所述启动子区包含用于转录调控功能性连接之基因的启动子序列。调节序列还可包括增强子序列或上游激活子序列。
根据本发明，核酸还可与其它核酸联合存在，所述其它核酸编码控制由所述核酸编码的蛋白质或肽从宿主细胞中分泌的肽。根据本发明，核酸也可与另一核酸联合存在，所述另一核酸编码这样的肽，所述肽使所编码的蛋白质或肽锚定于宿主细胞的细胞膜上或者分隔于所述细胞的特定细胞器中。类似地，可以与代表报告基因或任何“标签”的核酸组合。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的重组核酸分子是载体，其适当地具有启动子，所述启动子控制核酸(例如，编码根据本发明鉴定之肿瘤抗原的核酸)的表达。本文以其最一般的含义使用术语“载体”，所述载体包括针对核酸的任何中介运载体(intermediary vehicle)，所述运载体使得所述核酸例如被导入原核和/或真核细胞中，并在适当时整合进基因组。此类载体优选地在细胞中复制和/或表达。可对中介运载体进行改造，例如为了用于电穿孔、微粒轰击、脂质体施用、借助农杆菌的转移或者通过DNA或RNA病毒的插入。载体包括质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒基因组。
编码根据本发明鉴定之肿瘤抗原的核酸可用于转染宿主细胞。本文中，核酸意在包括重组DNA和RNA。重组RNA可通过DNA模板的体外转录来制备。另外，在应用之前，可通过稳定序列、加帽和多聚腺苷酸化来对其进行修饰。
根据本发明的术语“宿主细胞”涉及可用外源性核酸转化或转染的任何细胞。根据本发明的术语“宿主细胞”包括原核细胞(例如，大肠杆菌)或真核细胞(例如，树突状细胞、B细胞、CHO细胞、COS细胞、K562细胞、酵母细胞和昆虫细胞)。特别优选的是哺乳动物细胞，例如来自人、小鼠、仓鼠、猪、山羊、灵长类的细胞。所述细胞可源自多种组织类型，并包括原代细胞和细胞系。特别的实例包括角质形成细胞、外周血白细胞、骨髓和胚胎干细胞。在另一些实施方案中，宿主细胞是抗原呈递细胞，尤其是树突状细胞、单核细胞或巨噬细胞。在一个实施方案中，核酸可以以单拷贝或两拷贝或多拷贝的形式存在于宿主细胞中，并在宿主细胞中表达。
根据本发明，以其最一般的含义使用术语“表达”，其包括RNA的产生或者RNA和蛋白质的产生。其还包括核酸的部分表达。另外，表达可瞬时地或稳定地进行。哺乳动物细胞中优选的表达系统包括pcDNA3.1、pcDNA3.3和pRc/CMV(Invitrogen，Carlsbad，CA)，其包含选择标记(例如，赋予G418抗性的基因(并因此使稳定转染的细胞系能够被选出)和巨细胞病毒(CMV，cytomegalovirus)的增强子-启动子序列。
本发明中MHC分子呈递肿瘤抗原或肿瘤抗原肽的情形中，表达载体还可包含编码所述MHC分子的核酸序列。编码MHC分子的核酸序列可与编码所述肿瘤抗原或肿瘤抗原肽的核酸存在于同一表达载体上，或者这两种核酸可存在于不同表达载体上。在后一种情形中，可将所述两种表达载体共转染进细胞中。如果宿主细胞既不表达所述肿瘤抗原或肿瘤抗原肽，也不表达MHC分子，则可将编码它们的两种核酸(在同一表达载体上或在不同表达载体上)转染进细胞中。如果细胞已表达MHC分子，则可仅转染编码所述肿瘤抗原或肿瘤抗原肽的核酸序列。
“反义分子”或“反义核酸”可用于调节(尤其是降低)核酸的表达。根据本发明的术语“反义分子”或“反义核酸”是指这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸是寡核糖核苷酸、寡脱氧核糖核苷酸、经修饰的寡核糖核苷酸或经修饰的寡脱氧核糖核苷酸，并且所述寡核苷酸在生理条件下与包含特定基因的DNA或与所述基因的mRNA杂交，因而抑制所述基因的转录和/或所述mRNA的翻译。根据本发明的“反义分子”还包括含有与其天然启动子方向相反的核酸或其一部分的构建体。核酸或其一部分的反义转录本可与天然mRNA形成双链体，并因此阻止mRNA的累积或翻译。另一种可能性是使用核酶使核酸失活。
在一些优选的实施方案中，反义寡核苷酸与N-端或5’上游位点(例如，翻译起始位点、转录起始位点或启动子位点)杂交。在另一些实施方案中，反义寡核苷酸与3’非翻译区或mRNA剪接位点杂交。
在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸由核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其组合组成，其中一个核苷酸的5’端与另一核苷酸的3’端通过磷酸二酯键彼此相连。可用常规的方式合成这些寡核苷酸，或重组生产。
在一些优选的实施方案中，本发明的寡核苷酸是“经修饰的”寡核苷酸。本文中，所述寡核苷酸可以用不同的方式进行修饰，而不削弱其结合靶标的能力，从而提高例如其稳定性或疗效。根据本发明的术语“经修饰的寡核苷酸”意指这样的寡核苷酸，其中(i)其至少两个核苷酸通过合成的核苷间键(即，非磷酸二酯键的核苷间键)彼此连接，和/或(ii)在核酸中不常见的化学基团共价连接到寡核苷酸。优选的合成的核苷间键是硫代磷酸酯键、烷基磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、磷酸酯键、烷基硫代磷酸酯键、氨基磷酸酯键、氨基甲酸酯键、碳酸酯键、磷酸三酯键、乙酰亚胺酯键、羧甲基酯键和肽键。
术语“经修饰的寡核苷酸”还包括具有共价修饰的碱基和/或糖的寡核苷酸。“经修饰的寡核苷酸”包括例如糖残基与低分子量有机基团共价连接的寡核苷酸，而非3’位为羟基及5’位为磷酸基。经修饰的寡核苷酸可包含例如2′-O-烷基化的核糖残基或非核糖的其它糖(例如阿拉伯糖)。
应理解，所有上述关于寡核苷酸的实施方案均可适用于多核苷酸。
本文使用的“小干扰RNA”或“siRNA”是指分离的RNA分子，优选长度大于10个核苷酸，更优选长度大于15个核苷酸，最优选长度为18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸，所述RNA分子用于识别待降解的靶基因或mRNA。19～25个核苷酸的范围是siRNA最优选的大小。
根据本发明，siRNA可包括部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA或重组产生的RNA以及通过添加、缺失、替换和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然RNA的经改变RNA。所述改变可包括添加非核苷酸物质，例如添加到siRNA的末端或siRNA的一个或多个内部核苷酸；使siRNA抵抗核酸酶消化的修饰(例如，使用2’-取代的核糖核苷酸或者对糖-磷酸骨架进行修饰)；或用脱氧核糖核苷酸替换siRNA中的一个或多个核苷酸。另外，如上文中针对经修饰的寡核苷酸所述地，可修饰siRNA以提高其稳定性，尤其是通过引入一个或多个硫代磷酸酯连接来实现。
siRNA的一条或两条链也可包含3’-突出。本文使用的“3’-突出端”是指从RNA链的3’-端伸出的至少一个未配对核苷酸。因此，在一个实施方案中，所述siRNA包含长度为1至约6个核苷酸(包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的至少一个3’-突出端，优选长度为1至约5个核苷酸，更优选长度为1至约4个核苷酸，尤其优选长度为约2至约4个核苷酸。在siRNA分子的两条链都包含3’-突出端的实施方案中，每条链的突出端的长度可以相同或不同。在一个最优选的实施方案中，所述3’-突出端存在于siRNA的两条链上，长度为2个核苷酸。例如，本发明的siRNA的每条链可包含二脱氧胸腺嘧啶核苷酸(“TT”)或二尿嘧啶核苷酸(“uu”)的3’-突出端。
为了提高siRNA的稳定性，3’-突出端也可对降解稳定。在一个实施方案中，通过包含嘌呤核苷酸(例如，腺嘌呤或鸟嘌呤核苷酸)来稳定突出端。或者，用修饰的类似物替换嘧啶核苷酸(例如，用2’-脱氧胸腺嘧啶替换3’-突出端中的尿嘧啶核苷酸)是耐受的，且不影响RNAi降解的效率。特别地，在2’-脱氧胸腺嘧啶中没有2’-羟基可显著增强组织培养基中3’-突出端对核酸酶的抗性。
siRNA的有义链和反义链可包括两条互补的单链RNA分子，或者可包括单个分子(其中两个互补区域碱基配对并通过单链“发卡”区域共价连接)。也就是说，有义区和反义区可通过连接分子共价相连。所述连接分子可为多聚核苷酸或非核苷酸连接物。不希望被任何理论所约束，据信，后一类型的siRNA分子的发卡区域在细胞内被“Dicer”蛋白(或其等同物)切割形成具有两个分别碱基配对RNA分子的siRNA。
本文使用的“靶mRNA”是指用于下调的靶标的RNA分子。
siRNA可从pol III表达载体中表达，无需改变靶位点，这是因为只有当第一转录核苷酸是嘌呤时才认为从pol III启动子表达RNA是有效的。
根据本发明的siRNA可被靶向至任何靶mRNA序列(“靶序列”)中约19～25个连续核苷酸的任何区段。选择siRNA靶序列的技术在例如Tuschl T.等，“The siRNA User Guide”(2002年10月11日修订)中给出，其全部公开内容通过引用并入本文中。“The siRNA User Guide”可通过互联从Dr.Thomas Tuschl，Laboratory of RNA Molecular Biology，Rockefeller University，New York，USA维护的网站获得，并可通过登录Rockefeller University的网站并以“siRNA”为关键词进行搜索而找到。因此，本文中siRNA的有义链包含的核苷酸序列与靶mRNA中约19至约25个核苷酸的任何连续区段基本上相同。
一般来说，靶mRNA上的靶序列可选自对应于所述靶mRNA的给定cDNA序列，优选地始于起始密码子下游50至100nt(即，以3’方向)。然而，所述靶序列可位于5’-或3’-非翻译区，或位于临近起始密码子的区域。
可使用多种本领域已知的技术来获得siRNA。例如，可使用本领域已知的方法化学合成或重组生产siRNA，例如，在美国公布的Tuschl等的申请2002/0086356中所述的果蝇体外系统，其全部公开内容通过引用并入本文中。
优选地，使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规的DNA/RNA合成仪来化学合成siRNA。siRNA可作为两个单独的、互补的RNA分子来合成，或者作为具有两个互补区的单个RNA分子来合成。
或者，也可使用任何合适的启动子从重组的环状或线性DNA质粒中表达siRNA。根据本发明，当本文涉及施用siRNA或将siRNA掺入药物组合物中时包括这样的一些实施方案。用于从质粒中表达本发明siRNA的合适启动子包括例如：U6或H1 RNA pol III启动子序列和巨细胞病毒启动子。
其它合适的启动子的选择在本领域的技术范围之内。本发明的重组质粒还可包含用于在特定组织或在特定细胞内环境中表达siRNA的可诱导的或可调节的启动子。
从重组质粒中表达的siRNA可从培养的细胞表达系统中通过标准技术进行分离，或者可在细胞内表达。用重组质粒向体内细胞递送siRNA将在下文中更详细地讨论。siRNA可从重组质粒中作为两个分别的、互补的RNA分子或者作为具有两个互补区的单一RNA分子而表达。
适用于表达siRNA的质粒的选择、将表达siRNA的核酸序列插入质粒的方法以及向目的细胞递送重组质粒的方法都在本领域的技术范围之内。
siRNA也可在体内细胞中通过重组病毒载体表达。所述重组病毒载体包含编码siRNA和用于表达该siRNA序列的任何合适启动子的序列。所述重组病毒载体还可包含用于在特定组织中或在特定细胞内环境中表达siRNA的可诱导的或可调节的启动子。siRNA可从重组病毒载体中作为两个分开的、互补的RNA分子或者作为具有两个互补区的单个RNA分子而表达。
术语“肽”包括寡肽和多肽，是指包含通过肽键共价连接的两个或更多个、优选3个或更多个、优选4个或更多个、优选6个或更多个、优选8个或更多个、优选10个或更多个、优选13个或更多个、优选16个或更多个、优选21个或更多个以及高达优选8、10、20、30、40或50个(尤其是100个)氨基酸的物质。术语“蛋白质”是指大的肽，优选指超过100个氨基酸残基的肽，但一般来说，术语“肽”和“蛋白质”是同义词，并可在本文中互换使用。
优选地，根据本发明所述的蛋白质和肽已被分离。术语“分离的蛋白质”或“分离的肽”意指所述蛋白质或肽已从其天然环境中被分离出来。分离的蛋白质或肽可处于基本上纯化的状态。术语“基本上纯化的”意指所述蛋白质或肽基本上不含与其在自然界中或在体内相附着的其它物质。
所述蛋白质和肽可用于例如生产抗体以及用于免疫学测定或诊断测定或作为治疗剂。根据本发明所述的蛋白质和肽可从生物样品(例如，组织或细胞匀浆物)中分离出来，并且还可在多种原核或真核表达系统中重组表达。
针对本发明的目的，蛋白质或肽的或者氨基酸序列的“变体”包括氨基酸插入变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸替换变体。
氨基酸插入变体包括氨基端和/或羧基端融合，以及在特定氨基酸序列中插入单个或两个或更多个氨基酸。在具有插入的氨基酸序列变体的情形中，将一个或多个氨基酸残基插入氨基酸序列的特定位点，但是也可以随机插入并适当地筛选所得产物。
氨基酸缺失变体的特征在于从序列中除去一个或多个氨基酸。
氨基酸替换变体的特征在于从序列中除去至少一个残基并在该位置插入另一残基。优选地，在同源蛋白质或肽之间非保守的氨基酸序列的位置处进行修饰，和/或用具有类似特性的其它氨基酸来替代氨基酸。
优选地，蛋白质变体中的氨基酸改变是保守的氨基酸改变，即，类似荷电或不荷电氨基酸的替换。保守的氨基酸改变包括一个家族之氨基酸的替换，所述氨基酸的侧链是相关的。天然氨基酸一般分为四个家族：酸性(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不荷电极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时一起划分为芳香氨基酸。
优选地，相似性(优选地，给定氨基酸序列与所述给定氨基酸序列之变体的氨基酸序列的同一性)程度至少为70％，优选至少为80％，优选至少为85％，甚至更优选至少为90％，或最优选为至少95％、96％、97％、98％或99％。相似性或同一性程度优选地在至少约20个、至少约40个、至少约60个、至少约80个、至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约200或250个氨基酸的区域上给出。在一些优选的实施方案中，相似性或同一性程度在参照氨基酸序列的整个长度上给出。
本文所述的肽和氨基酸变体可借助已知的肽合成技术(例如，通过固相合成(Merrifield，1964))和类似的方法或者通过重组DNA操作容易地进行制备。例如，Sambrook等(1989)中详细地描述了用于制备具有替换、插入或缺失的蛋白质和肽的DNA序列的操作。
根据本发明，蛋白质和肽的“衍生物”是蛋白质和肽的经修饰形式。所述修饰包括任何化学修饰，并包括单个或多个替换、缺失和/或添加与所述蛋白质或肽相关的任何分子(例如糖、脂质和/或蛋白质或肽)。术语“衍生物”还延伸到所述蛋白质和肽的所有功能性化学等同物。优选地，经修饰肽具有提高的稳定性和/或提高的免疫原性。
根据本发明，核酸或氨基酸序列的变体、基本上对应的氨基酸序列或者肽的片段或衍生物优选地分别具有其所来源之核酸或氨基酸序列、氨基酸序列或肽的功能特性。所述功能特性包括与抗体的相互作用，与其它肽或蛋白质的相互作用，与核酸的选择性结合以及酶活性。在一个实施方案中，核酸或氨基酸序列的变体、基本上对应的氨基酸序列或者肽的片段或衍生物在免疫原性上分别等同于其所来源的核酸或氨基酸序列、氨基酸序列或肽。在一个实施方案中，所述功能特性是免疫原性。一个具体的特性是与MHC分子形成复合物的能力以及需要时产生免疫应答的能力(优选地通过激活细胞毒T细胞或T辅助细胞来实现)。肿瘤抗原的片段优选地包含肿瘤抗原之至少6个、尤其是至少8个、至少10个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个或至少50个连续氨基酸的序列。肿瘤抗原的片段优选包含肿瘤抗原之多达8个、尤其是多达10个、多达12个、多达15个、多达20个、多达30个或多达55个连续氨基酸的序列。肿瘤抗原的片段优选为肿瘤抗原的一部分，所述部分可被MHC分子呈递，且当被这样呈递时能够激活细胞应答。
优选的肿瘤抗原片段适于体内激活细胞毒T淋巴细胞，也适于产生用于治疗性离体获得性转移的扩增的和激活的T淋巴细胞。
包含特异性结合靶蛋白之特异性抗体的抗血清可通过多种标准方法来制备，例如参见“Monoclonal Antibodies：A Practical Approach”，PhilipShepherd，Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9；“Antibodies：ALaboratory Manual”，Ed Harlow，David Lane，ISBN：0879693142以及“Using Antibodies：A Laboratory Manual：Portable Protocol NO”，Edward Harlow，David Lane，Ed Harlow ISBN 0879695447。因此，也可产生识别天然形式之复合膜蛋白的亲和性的和特异性的抗体(Azorsa等，J.Immunol.Methods 229：35-48，1999；Anderson等，J.Immunol.143：1899-1904，1989；Gardsvoll，J.Immunol.Methods 234：107-116，2000)。这尤其与制备治疗用抗体相关，但也与多种诊断性应用相关。在该方面，可用完整蛋白质、用细胞外部分序列以及用表达生理折叠形式之靶分子的细胞来进行免疫。
使用杂交瘤技术常规地制备单克隆抗体。(技术细节参见“MonoclonalAntibodies：A Practical Approach”，Philip Shepherd，Christopher DeanISBN 0-19-963722-9；“Antibodies：A Laboratory Manual”Ed Harlow，David Lane ISBN：0879693142；“Using Antibodies：A Laboratory Manual：Portable Protocol NO”Edward Harlow，David Lane，Ed Harlow ISBN：0879695447)。
已知仅抗体分子的一小部分(互补位(paratope))参与抗体与其表位的结合(参见Clark，W.R.(1986)，The Experimental Foundations ofModern Immunology，Wiley & Sons，Inc.，New York；Roitt，I.(1991)，Essential Immunology，第7版，Blackwell Scientific Publications，Oxford)。例如，pFc’和Fc区是补体级联的效应物，但不参与抗原结合。其pFc’区已被酶切除的抗体或其生产时即不含pFc’区的抗体表示为F(ab′)2片段，其携带了完全抗体的两个抗原结合位点。类似地，Fc区已被酶切除的抗体或其生产时即不含Fc区的抗体表示为Fab片段，其携带了完整抗体分子的一个抗原结合位点。另外，Fab片段由共价结合的抗体轻链和所述抗体的部分重链(称为Fd)组成。所述Fd片段是抗体特异性的主要决定簇(一个Fd片段可与多达10个不同的轻链相连，而不改变抗体的特异性)，当被分离时，Fd片段保持结合表位的能力。
互补决定区(CDR，complementary-determining region)位于抗体的抗原结合部分中，其与抗原表位和框架区(FR，framework region)直接相互作用，所述框架区维持互补位的三级结构。IgG免疫球蛋白的重链之Fd片段和轻链包含4个框架区(FR1至FR4)，在每种情形中，它们被三个互补决定区(CDR1至CDR3)所分隔开。所述CDR(尤其是CDR3区，更尤其是重链的CDR3区)很大程度上决定了抗体特异性。
已知哺乳动物抗体的非CDR区能被具有相同或不同特异性的类似抗体区域所替代，保留了针对原抗体之表位的特异性。这使得开发“人源化”抗体成为可能，其中非人CDR与人FR和/或Fc/pFc′区共价连接，以产生功能性抗体。
另一个实例(WO 92/04381)描述了人源化鼠RSV抗体的产生和应用，其中鼠FR区的至少一部分被人来源的FR区所替代。这类抗体(包括具有抗原结合能力的完整抗体之片段)常称为“嵌合”抗体。
根据本发明的术语“抗体”还包括抗体的F(ab′)2、Fab、Fv和Fd片段；嵌合抗体，其中Fc和/或FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链-CDR3区已被同源的人或非人序列替代；嵌合的F(ab′)2-片段抗体，其中FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链-CDR3区已被同源的人或非人序列替代；嵌合的Fab-片段抗体，其中FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链-CDR3区已被同源的人或非人序列替代；以及嵌合的Fd-片段抗体，其中FR和/或CDR1和/或CDR2区已被同源的人或非人序列替代。术语“抗体”还包括“单链”抗体。
当根据本发明使用时，特异性结合肿瘤抗原的非抗体之蛋白质和肽可替代抗体。这类结合物质可例如由简并肽文库提供，所述肽文库可简单地在溶液中以固定形式或作为噬菌体展示文库而制备。同样地，可制备具有一个或多个氨基酸的肽组合文库。也可制备类胨(peptoid)和非肽合成残基文库。
抗体也可与治疗性标记物偶联，所述标记物用于展示表达肿瘤抗原的细胞和组织。它们还可与治疗效应部分偶联。
在一个实施方案中，本文所述的抗体与根据本发明鉴定之肿瘤抗原的一部分特异性结合，所述肿瘤抗原包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列选自序列表中SEQ ID NO：3、4和5或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，本文所述的抗体特异性结合本文所述的肿瘤抗原肽，所述肿瘤抗原肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列选自序列表红SEQ ID NO：3、4和5或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。所述抗体可通过使用用于免疫的肽而获得，所述肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列选自序列表中SEQ ID NO：3、4和5或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。
可检测标记物包括任何发挥如下功能的标记物：(i)提供可检测的信号；(ii)与第二标记物相互作用以改变由第一或第二标记物提供的可检测信号(例如，FRET(荧光共振能量转移，Fluorescence Resonance EnergyTransfer))；(iii)通过电荷、疏水性、形状或其它物理参数影响运动力(例如，电泳迁移)，或(iv)提供捕获部分(例如，亲和力、抗体/抗原、或离子络合物)。适于作为标记物的是这样的结构，例如荧光标记物、发光标记物、荧光团标记物、放射性同位素标记物、同位素标记物(优选稳定的同位素标记物)、同质异位标记物(isobaric label)、酶标记物、颗粒标记物(尤其是金属颗粒标记物、磁性颗粒标记物、聚合物颗粒标记物)、小有机分子(例如，生物素、受体之配体或结合分子，例如细胞粘附蛋白或凝集素)、标记物序列(包含可通过使用结合剂而检测的核酸和/或氨基酸残基)等。可检测标记物非限制性地包括硫酸钡、碘酸胺酸、碘番酸、碘泊酸钙、泛影钠、泛影葡胺(meglumine diatrizoate)、甲泛葡胺、酪泮酸钠和放射性诊断剂(包括正电子发射体(例如，氟-18和碳-11)、γ发射体(例如，碘-123、锝-99m、碘-131和铟-111)、核磁共振核素(例如，氟和钆))。
根据本发明的术语“治疗效应分子”意为可发挥治疗效用的任何分子。根据本发明，治疗效应分子优选地被选择性引导至表达一种或多种肿瘤抗原的细胞，其包括抗癌剂、放射性碘标记化合物、毒素、抑制细胞生长或裂解细胞的药物等。抗癌剂包括例如：氨鲁米特、硫唑嘌呤、硫酸博莱霉素、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、环孢霉素、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、紫杉醇、依托泊苷、氟尿嘧啶、干扰素-α、洛莫司汀、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托坦、盐酸丙卡巴肼、硫鸟嘌呤、硫酸长春碱和硫酸长春新碱。其它抗癌药描述于例如Goodman和Gilman，“The Pharmacological Basis of Therapeutics”，第8版，1990，McGraw-Hill，Inc.，尤其是其中第52章，Antineoplastic Agents(Paul Calabresi和Bruce A.Chabner)。毒素可为蛋白质，例如商陆抗病毒蛋白、霍乱毒素、百日咳毒素、蓖麻毒素、白树毒素、相思豆毒素、白喉外毒素或绿脓杆菌(Pseudomonas)外毒素。毒素残基也可为发射高能量的放射性核素(例如钴-60)。
术语“主要组织相容性复合物”或“MHC”包括I类和II类MHC，是指存在于所有脊椎动物中的基因复合物。在正常的免疫反应中，MHC蛋白质或分子通过与肽结合并将其呈递用于T细胞受体(TCR，T cellreceptor)识别来参与淋巴细胞与抗原呈递细胞之间的信号传导。MHC分子在细胞内加工分隔区内与肽结合，并将这些肽呈递到抗原呈递细胞的表面上用于T细胞的识别。人MHC区也称为HLA，位于6号染色体，包括I类和II类区。在本发明所有方面的一个优选实施方案中，MHC分子是HLA分子。
本文中使用的“降低”或“抑制”意为：与参照样品(例如，未用siRNA处理的样品)相比，能够引起水平(例如，蛋白质或mRNA水平)整体降低，优选20％或更多，更优选50％或更多，并最优选75％或更多。RNA或蛋白质表达的降低或抑制可通过靶向mRNA切割或降解而发生。用于蛋白质表达或核酸表达的测定是本领域已知的，包括例如针对蛋白质表达的ELISA、western印迹分析以及针对RNA的northern印迹或RNA酶保护测定。
根据本发明的术语“患者”意为人类、非人灵长类或其它动物，尤其是哺乳动物，例如牛、马、猪、绵羊、山羊、犬、猫或啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在一个特别优选的实施方案中，所述患者为人类。
根据本发明的术语“增加”或“增加量”优选地指增加至少10％，尤其是至少20％、至少50％或至少100％。如果在测试样品中可检测到，但在参照样品中没有或未检测到，则与参照样品相比，测试样品(例如，生物样品)中物质的量也增加了。
根据本发明的术语“肿瘤”或“肿瘤疾病”是指细胞(称为“赘生细胞”或“肿瘤细胞”)的异常生长形成的肿块或病变。“肿瘤细胞”意指这样的异常细胞，其生长迅速、细胞增殖失控并且在引发新生长的刺激停止之后仍继续生长。肿瘤表现出部分或完全地缺乏组织结构性以及与正常组织的功能协调性，并通常形成单独的组织块，该组织块可以是良性、前恶性或恶性的。
优选地，根据本发明的肿瘤疾病是癌症(即恶性疾病)，肿瘤细胞是癌细胞。优选地，肿瘤疾病的特征在于细胞表达或异常表达根据本发明鉴定的肿瘤核酸和/或肿瘤抗原，肿瘤细胞或者循环或转移性肿瘤细胞的特征在于表达或异常表达根据本发明鉴定的肿瘤核酸和/或肿瘤抗原。优选地，肿瘤疾病、肿瘤细胞或者循环或转移性肿瘤细胞的特征在于：以I类MHC呈递根据本发明鉴定的肿瘤抗原。
根据本发明，“异常表达”意指与健康个体的情况相比，表达发生改变(优选地增加)。表达增加是指增加至少10％，尤其是至少20％、至少50％、至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少10000％或更多。在一个实施方案中，表达仅发现于疾病组织中，而在健康组织中的表达被抑制。
根据本发明，如果与在胎盘细胞或胎盘组织中和/或在卵巢肿瘤细胞和/或肺肿瘤细胞或卵巢肿瘤组织和/或肺肿瘤组织中的表达相比表达水平较低，则组织或器官的细胞基本上不表达根据本发明鉴定的肿瘤抗原和/或根据本发明鉴定的肿瘤核酸。优选地，与上述细胞或组织相比，所述表达水平低于10％，优选低于5％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.05％，或者更低。优选地，如果表达水平低于检出限，则肿瘤抗原和/或核酸基本上不表达。优选地，当组织不具有肿瘤(即，不具有肿瘤疾病)时，基本上不表达根据本发明鉴定之肿瘤抗原和/或根据本发明鉴定之肿瘤核酸的组织是卵巢、肺、乳房、十二指肠、皮肤、结肠、肝、淋巴结、胃、脾、肾、食管、胰腺、子宫内膜、脑、胆囊、膀胱、回肠、肾上腺、直肠和骨骼肌的组织，优选卵巢组织或肺组织。优选地，所述组织是除胎盘组织以外的组织。
优选地，根据本发明的肿瘤疾病是癌，其中，根据本发明的术语“癌”包括白血病、精原细胞瘤、黑色素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肾上腺癌、甲状腺癌、血癌、皮肤癌、脑癌、子宫颈癌、肠癌、肝癌、结肠癌、胃癌、肠癌、头颈癌、胃肠癌、淋巴结癌、食管癌、结肠直肠癌、胰腺癌、耳鼻喉(ENT，ear，noseand throat)癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌，及其转移。其实例有肺癌、乳癌(mamma carcinomas)、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、子宫颈癌或上述各类癌或肿瘤的转移。根据本发明的术语“癌”还包括癌转移。
根据本发明优选的肿瘤疾病或癌选自：卵巢癌，尤其是卵巢腺癌和卵巢畸胎癌；肺癌，包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，尤其是鳞状细胞肺癌和腺癌；胃癌；乳腺癌；肝癌；胰腺癌；皮肤癌，尤其是基底细胞癌和鳞状细胞癌；恶性黑色素瘤；头颈癌，尤其是恶性多形性腺瘤；肉瘤，尤其是滑膜肉瘤和癌肉瘤；胆管癌；膀胱癌，尤其是移形细胞癌和乳头状癌；肾癌，尤其是肾细胞癌，包括明细胞肾细胞癌和乳头状肾细胞癌；结肠癌；小肠癌，包括回肠癌，尤其是小肠腺癌和回肠腺癌；睾丸胚胎癌；胎盘绒毛膜癌；子宫颈癌；睾丸癌，尤其是睾丸精原细胞瘤、睾丸畸胎瘤和胚胎睾丸癌；和子宫癌，及其转移形式。
根据本发明特别优选的肿瘤疾病或癌选自：卵巢癌、肺癌、转移性卵巢癌和转移性肺癌。优选地，所述卵巢癌是卵巢恶性肿瘤或卵巢腺癌。优选地，所述肺癌是恶性肿瘤或腺癌，优选支气管癌，例如支气管恶性肿瘤或支气管腺癌。在一个实施方案中，肿瘤细胞是所述癌的细胞。转移性卵巢癌包括转移性卵巢恶性肿瘤和转移性卵巢腺癌，转移性肺癌包括转移性肺恶性肿瘤、转移性肺腺癌、转移性支气管恶性肿瘤和转移性支气管腺癌。
肺癌的主要类型有小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。非小细胞肺癌有三种主要的亚型：鳞状细胞肺癌、腺癌和大细胞肺癌。腺癌占肺癌的约10％。与倾向于位于中心位置的小细胞肺癌和鳞状细胞肺癌相反，腺癌常见于肺的外周。
皮肤癌是皮肤上的恶性生长。最常见的皮肤癌是基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑色素瘤。恶性黑色素瘤是皮肤癌的严重类型。它是由色素细胞(称为黑色素细胞)的失控生长所造成的。
根据本发明，“恶性肿瘤”是始于器官内壁层(上皮细胞)的癌。
“支气管恶性肿瘤”是肺的恶性肿瘤，被认为源自终末细支气管的上皮，其中赘生组织沿肺泡壁延伸，并在肺泡中长成小团块。在一些所述细胞中和在肺泡中的物质中(也包括裸露的细胞(denuded cell))，可出现粘蛋白(mucin)。
“腺癌”是源自腺组织的癌。该组织也是称为上皮组织的更大组织分类中的一部分。上皮组织包括皮肤、腺体以及身体的腔和器官的内壁的多种其它组织。上皮从胚胎学上源自外胚层、内胚层和中胚层。分类为腺癌的细胞不一定是腺体的一部分，只要它们具有分泌特性即可。这种类型的恶性肿瘤可在一些高等哺乳动物(包括人)中发生。分化良好的腺癌倾向于与它们来源的腺组织类似，而分化差的则不。通过对来自活检的细胞染色，病理学医师可确定肿瘤是否为腺癌或其它种类的癌。由于体内腺体广泛分布的特性，因此腺癌可在身体的多种组织中发生。尽管每种腺体可分泌不同的物质，但只要其细胞具有外分泌功能，就可以认为是腺性的，同时其恶性形式被称为“腺癌”。恶性腺癌侵袭其它组织，并且在时间充足的情况下常常发生转移。卵巢腺癌是最常见的卵巢癌类型。它包括浆液性和粘液性腺癌、明细胞腺癌和子宫内膜样腺癌。
“囊腺癌”是表面上皮间质肿瘤的恶性形式(卵巢癌的一种)。
表面上皮间质肿瘤是一类卵巢赘生物，其被认为源自卵巢表面上皮(改性腹膜)或来自异位的子宫内膜或输卵管组织。这类肿瘤占全部卵巢肿瘤的大部分。
畸胎癌是指生殖细胞肿瘤，是畸胎瘤与胚胎癌或与绒毛膜癌或与这两者的混合物。绒毛膜癌通常是胎盘的恶性的、滋养层的和侵袭性的癌。其特征是早期血行扩散至肺。
肉瘤是结缔组织(骨、软骨、脂肪)的癌，导致中胚层增殖。它是与上皮来源的恶性肿瘤相对而言的。滑膜肉瘤是一种罕见的癌症类型，其通常发生在手臂或腿的关节处附近。它是一种软组织肉瘤。
肾细胞恶性肿瘤也称为肾细胞癌或肾细胞腺癌，是一种源自近曲小管内壁的肾癌，所述近曲小管是肾中过滤血液并除去废物的非常小的管。迄今，肾细胞癌已成为成年人中最常见的肾癌类型和所有泌尿生殖系统肿瘤中致死率最高的。肾细胞癌的独有亚型是明细胞肾细胞癌和乳头状肾细胞癌。明细胞肾细胞癌是最常见的肾细胞癌类型。当在显微镜下观察时，组成明细胞肾细胞癌的细胞显得很苍白或透明。乳头状肾细胞癌是第二常见的亚型。在一些(如果不是大多数的话)肿瘤中，这些癌形成小的手指样突起物(称为乳头)。
“转移”意指癌细胞从其原发位置扩散到身体的另一部分。转移的形成是非常复杂的过程，其有赖于恶性细胞从原发肿瘤脱离、细胞外基质的侵袭、穿透内皮基底膜进入体腔和血管、以及之后地经血液转运后浸润靶器官。最后，新肿瘤(即，继发性肿瘤或转移性肿瘤)在靶部位的生长有赖于血管生成。即使切除原发肿瘤之后，肿瘤转移也常会发生，这是因为肿瘤细胞或组分可保留并发展出转移性潜力。在一个实施方案中，根据本发明的术语“转移”是指“远处转移”，其是指远离原发肿瘤和局部淋巴结系统的的转移。
继发性或转移性肿瘤的细胞与原发肿瘤中的一样。这意味着，例如，如果卵巢癌转移到肝，则继发性肿瘤由异常的卵巢细胞(而非异常的肝细胞)组成。此时，肝中的肿瘤被称为转移性卵巢癌，而非肝癌。
在卵巢癌中，转移可以以如下方式发生：通过直接接触或延展，其可侵入位于卵巢附近或周围的邻近组织或器官，例如输卵管、子宫、膀胱、直肠等；通过播种(seeding)或脱落进入腹腔，这是卵巢癌扩散的最常见方式。癌细胞脱离卵巢肿块的表面并“落入”腹部的其它结构(例如，肝、胃、结肠或膈膜)中；通过从卵巢肿块中松动，侵入淋巴管，并随后运送到身体的其它区域或远处器官(例如肺或肝)；通过从卵巢肿块中松动，侵入血液系统，并运送到身体的其它区域或远处器官。
根据本发明，转移性卵巢癌包括输卵管中的癌、腹部器官的癌(例如，肠中的癌、子宫中的癌、膀胱中的癌、直肠中的癌、肝中的癌、胃中的癌、结肠中的癌、膈膜中的癌、肺中的癌、腹或骨盆内壁(腹膜)中的癌)以及脑中的癌。类似地，转移性肺癌是指从肺扩散到远处部位和/或身体若干部位的癌，包括肝中的癌、肾上腺中的癌、骨中的癌和脑中的癌。
当某人再次被先前所患病症所影响时，则发生“再度恶化”或“复发”。例如，如果患者患有肿瘤疾病，并已接受所述疾病的成功治疗，而再次发生所述疾病，则所述新发疾病可被认为是再度恶化或复发。然而，根据本发明，肿瘤疾病的再度恶化或复发可以(但不是必须地)发生在原发肿瘤疾病的部位。因此，例如，如果患者已患有卵巢肿瘤，并已接受成功的治疗，则再度恶化或复发可以是发生卵巢肿瘤或发生非卵巢部位的肿瘤。肿瘤的再度恶化或复发还包括肿瘤发生在不同于原来肿瘤的部位以及发生在原来肿瘤的部位的情况。优选地，原来的肿瘤(患者已针对其接受了治疗)是原发肿瘤，而不同于原来肿瘤部位的肿瘤是继发性或转移性肿瘤。
根据本发明，生物样品可以是组织样品(包括体液)和/或细胞样品，并可以以常规方式获取(例如通过组织活检(包括钻取活检)，和通过取血、支气管吸出物、痰、尿、粪便或其它体液而获得)。根据本发明，术语“生物样品”也包括经处理的生物样品，例如生物样品的级分或分离物，例如核酸和肽/蛋白质分离物。
根据本发明的术语“免疫反应性细胞”意为在适宜的刺激下可成熟化为免疫细胞(例如，B细胞、T辅助细胞或细胞裂解性T细胞)的细胞。免疫反应性细胞包括CD34+造血干细胞、未成熟和成熟的T细胞以及未成熟和成熟的B细胞。如果需要产生识别肿瘤抗原的细胞裂解性或T辅助细胞，则在利于细胞裂解性T细胞和T辅助细胞的产生、分化和/或选择的条件下，将免疫反应性细胞与表达肿瘤抗原的细胞相接触。当暴露于抗原时，T细胞前体分化成为细胞裂解性T细胞，这与免疫系统的克隆选择类似。
在本文中，术语“T细胞”和“T淋巴细胞”可互换使用，包括辅助T辅助细胞(CD4+T细胞)以及细胞毒T细胞(CTL，CD8+T细胞)(包括细胞裂解性T细胞)。
某些治疗方法基于患者免疫系统的反应，其导致疾病细胞(例如癌细胞)的裂解，所述癌细胞以I类MHC呈递肿瘤抗原。在这一方面，例如，可向患有肿瘤疾病的患者施用特异性针对肿瘤抗原肽与MHC分子复合物的自体细胞毒T淋巴细胞。体外产生这种细胞毒T淋巴细胞是已知的。分化T细胞的方法的实例可在WO-A-9633265中找到。一般来说，从患者采集包含细胞(例如，血细胞)的样品，将所述细胞与呈递所述复合物并且可引起细胞毒T淋巴细胞(例如，树突状细胞)增殖的细胞相接触。所述靶细胞可为转染的细胞(例如COS细胞)。这些转染的细胞呈递所需复合物到其表面上，当与细胞毒T淋巴细胞相接触时，刺激后者的增殖。随后，将该克隆扩充的自体细胞毒T淋巴细胞施用给患者。
在另一选择细胞毒T淋巴细胞的方法中，使用I类MHC分子/肽复合物的荧光四聚体来获取细胞毒T淋巴细胞的特异性克隆(Altman等，Science 274：94-96，1996；Dunbar等，Curr.Biol.8：413-416，1998)。
另外，呈递所需复合物的细胞(例如，树突状细胞)可与健康个体或其它物种(例如，小鼠)的细胞毒T淋巴细胞联用，所述联用可导致具有高亲和力的特异性细胞毒T淋巴细胞的增殖。这些增殖的特异性T淋巴细胞的高亲和力T细胞受体可被克隆并任选地进行不同程度地人源化，而如此获得的T细胞受体随后通过基因转移而转导(例如，使用逆转录病毒载体)进入患者的T细胞中。随后可使用这些经遗传改造的T淋巴细胞来进行获得性转移(Stanislawski等，Nat Immunol.2：962-70，2001；Kessels等，Nat Immunol.2：957-61，2001)。
细胞毒T淋巴细胞也可以其本身已知的方式在体内产生。一种方法使用表达I类MHC/肽复合物的非增殖性细胞。本文使用的细胞是通常表达所述复合物的细胞，例如，经辐照的肿瘤细胞或者用一种或两种呈递所述复合物必需之基因(即，抗原肽和呈递MHC分子)转染的细胞。另一优选的形式是以重组RNA的形式引入肿瘤抗原，其可例如通过脂质体转移或通过电穿孔引入细胞。所得到的细胞呈递目的复合物，并被自体细胞毒T淋巴细胞所识别，所述细胞毒T淋巴细胞随后增殖。
类似的作用可通过将肿瘤抗原或肿瘤抗原肽与佐剂联用而实现，从而使体内整合进入抗原呈递细胞成为可能。所述肿瘤抗原或肿瘤抗原肽也可作为蛋白、作为DNA(例如，在载体中)或作为RNA而存在。所述肿瘤抗原可被加工而产生MHC分子的肽伴侣(peptide partner)，而其片段可无需进一步加工而被呈递。如果这些能够结合MHC分子，则尤其适用后一情形。优选施用完全抗原在体内被树突状细胞加工的形式，因为这也可产生有效免疫应答中所需要的T辅助细胞应答(Ossendorp等，ImmunolLett.74：75-9，2000；Ossendorp等，J Exp.Med.187：693-702，1998)。一般来说，例如，可以皮内注射的方式向患者施用有效量的肿瘤抗原。然而，也可进行淋巴结内注射(Maloy等，Proc Natl Acad Sci USA 98：3299-303，2001)。
根据本发明描述的药物组合物和治疗方法也可用于免疫或接种，以治疗性地治疗或预防本文中所述的疾病。根据本发明的术语“免疫”或“接种”优选是指提高或激活针对抗原的免疫应答。可使用动物模型来测试对肿瘤的免疫作用。例如，可将人癌细胞引入小鼠以产生肿瘤。对癌细胞的作用(例如，降低肿瘤大小)可通过向动物施用药剂测量免疫的有效性来测量。
作为用于免疫或接种的组合物的一部分，优选将本文所述的一种或多种药剂与一种或多种佐剂一起使用，用于诱导免疫应答或用于提高免疫应答。佐剂是增强免疫应答的物质。佐剂可通过提供抗原储库(antigenreservoir)(细胞外或在巨噬细胞中)、活化巨噬细胞和/或激活特定淋巴细胞来提供免疫应答。佐剂是已知的，并以非限制性的方式包括单磷酰脂质A(MPL，SmithKline Beecham)、皂苷(例如，QS21(SmithKlineBeecham)、DQS21(SmithKline Beecham；WO 96/33739)、QS7、QS17、QS18和QS-L1(So等，Mol.Cells 7：178-186，1997))、不完全弗氏佐剂(Freund′s adjuvant)、完全弗氏佐剂、维生素E、montanide、明矾、CpG寡核苷酸(参见Kreig等，Nature 374：546-9，1995)和多种用生物可降解的油(例如，角鲨烯和/或生育酚)制备的油包水型乳剂。根据本发明，优选与DQS21/MPL混合来施用肽。DQS21与MPL的比例一般为约1∶10至10∶1，优选约为1∶5至5∶1，尤其是约1∶1。用于人类施用的疫苗制剂一般包括约1μg至约100μg的DQS21和MPL。
也可施用激活患者免疫应答的其它物质。例如，因为其对淋巴细胞的调节特性，可在接种中使用细胞因子。这样的细胞因子包括例如白介素-12(IL-12，其显示提高疫苗的保护性作用)(参见Science 268：1432-1434，1995)、GM-CSF和IL-18。
有很多增强免疫应答的化合物，因此其可用于免疫接种。所述化合物包括以蛋白质或核酸形式提供的共刺激分子，例如B7-1和B7-2(分别为CD80和CD86)。
可以通过已知的方式施用肽。在一个实施方案中，通过离体方法施用核酸，即，通过从患者中取出细胞、遗传修饰所述细胞以整合核酸并再次将改变的细胞引入所述患者。这一般包括将基因的功能性拷贝体外引入患者中，并再次将经遗传改变的细胞引入所述患者。所述基因的功能性拷贝在调节元件的功能性控制之下，所述调节元件允许所述基因在经遗传改变的细胞中表达。转染和转导的方法是本领域技术人员已知的。
本发明还提供了通过使用例如载体(例如，病毒和靶标控制脂质体)体内施用核酸。
在一个优选的实施方案中，用于施用核酸的病毒或病毒载体选自：腺病毒、腺相关病毒、痘病毒(包括牛痘病毒和减毒痘病毒)、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)、逆转录病毒、辛德比斯病毒(Sindbis virus)和Ty病毒样颗粒。特别优选腺病毒和逆转录病毒。所述逆转录病毒一般是复制缺陷的(即，它们不能产生感染性颗粒)。
将核酸体外或体内引入细胞的方法包括核酸磷酸钙沉淀转染、DEAE相关的核酸转染或用携带目的核酸的上述病毒感染或转染、脂质体介导的转染等。在一些具体的实施方案中，优选将核酸引入特定细胞。在这样的一些实施方案中，用于施用核酸进入细胞的载剂(carrier)(例如，逆转录病毒或脂质体)可具有结合的靶标控制分子。例如，可将分子(如，特异性针对靶细胞上表面膜蛋白的抗体，或靶细胞上受体的配体)整合进或连接至核酸载剂。优选的抗体包括选择性结合肿瘤抗原的抗体。如果需要通过脂质体来施用核酸，则将与胞吞作用相关表面膜蛋白结合的蛋白质整合进脂质体制剂，从而使靶标控制和/或摄取成为可能。这样的蛋白质包括衣壳蛋白或其片段(其为特定细胞类型特异的)、针对内化蛋白质的抗体、寻址细胞内位点的蛋白质等。
本发明的治疗活性化合物可通过常规的途径施用，包括通过注射或输注施用。所述施用可例如通过口服、静脉内、腹膜内、肌内、皮下或透皮来进行。优选地，通过肺气雾剂的方式治疗性施用抗体。反义核酸优选通过慢静脉内施用方式来施用。
以有效量施用本发明的组合物。“有效量”是指单独地或与其它给药一起地实现期望反应或期望作用的量。在治疗特定疾病或特定病症时，期望的反应优选涉及疾病进程的抑制。这包括减缓疾病进展，尤其是阻止或逆转疾病进程。在疾病或病症的治疗中，期望的反应也可以是推迟或防止所述疾病或所述病症的发病。根据本发明，癌的诊断或治疗也可包括已形成或将形成的癌转移的诊断和治疗。根据本发明，术语“治疗”包括治疗性和预防性治疗(即，预防)。
本发明组合物的有效量将取决于所要治疗的病症、疾病的严重程度、患者的个体参数(包括年龄、生理状况、体型和体重、治疗时程、伴随治疗的类型(如果有的话)、施用的特定途径以及类似因素。因此，所施用的本发明组合物的剂量可取决于多种这样的参数。当初始剂量引起的患者反应不够时，可使用更高剂量(或通过不同的、更局部的施用途径实现足够高的剂量)。
本发明的药物组合物优选是无菌的并包含有效量的治疗活性物质，以产生期望的反应或期望的作用。
一般来说，配制并施用1ng至1mg、优选10ng至100μg剂量的肽。如果需要施用核酸(DNA和RNA)，可配制和施用1ng至0.1mg的剂量。
本发明的药物组合物一般以药学相容性的量和药学相容性的制剂来施用。术语“药学相容性”是指无毒材料，其不与药物组合物的活性组分的作用发生相互作用。这类制剂通常可含盐、缓冲物质、防腐剂、载剂、补充的免疫增强物质(例如佐剂(如CpG寡核苷酸、细胞因子、趋化因子、皂苷、GM-CSF和/或RNA))以及适当时地其它治疗活性化合物。当用于药物时，所述盐应为药学相容性盐。然而，药学不相容的盐也可用于制备药学相容性盐，并且包括在本发明中。此类药理学和药学相容性盐非限制性地包含由以下的酸所制备的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、醋酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。药学相容性盐也可制备成碱金属盐或碱土金属盐，例如钠盐、钾盐或钙盐。
本发明的药物组合物可包含药学相容性载剂。术语“载剂”是指天然或合成的、有机或无机组分，其与活性组分联用从而有利于应用。根据本发明，术语“药学相容性载剂”包括一种或多种相容性固态或液态填充剂、稀释剂或包封物质，所述载剂适于施用给患者。本发明药物组合物的组分一般不会发生显著影响期望药物疗效的相互作用。
本发明的药物组合物可包含合适的缓冲物质，例如醋酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐和磷酸盐。
所述药物组合物还可酌情包含合适的防腐剂，例如苯扎氯铵、氯丁醇、尼泊金(paraben)和硫柳汞。
通常以均一剂型提供所述药物组合物，并可通过已知的方式制备。本发明的药物组合物可采用例如胶囊、片剂、锭剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂、酏剂的形式，或是乳剂的形式。
适于肠胃外施用的组合物通常包括活性化合物的无菌的、水性或非水性的制剂，所述制剂优选与接受者的血液等渗。相容性载剂和溶剂的实例有林格氏液(Ringer solution)和等渗氯化钠溶液。此外，通常无菌的不挥发油被用作溶液或混悬液介质。
应强调的是，本说明书中使用的术语“包含/含有”用于具体说明所指出的特征、整数、步骤或组分的存在，但不排除一种或多种其它特征、整数、步骤、组分或其组的存在或增加。仅仅因为某些手段在不同的从属权利要求中记载或在不同的实施方案中描述，不表明这些手段的组合不能有利地使用。然而，术语“包含/含有”也包括由所指出的特征、整数、步骤或组分组成的实施方案。
通过如下的附图和实施例对本发明进行详细地描述，所述附图和实施例仅用作举例说明，而不旨在限制。基于以下描述和实施例，本领域技术人员可获得同样包括于本发明中的其它实施方案。
附图说明
图1.通过实时RT-PCR在正常和癌变组织中定量CLDN6的表达。除了胎盘以外，在正常组织中只能检测到痕量的CLDN6转录本。在卵巢癌(腺癌)和肺癌(腺癌)样品中发现高表达的CLDN6。
图2：使用实时RT-PCR在正常组织中定量CLDN6的表达。针对每种正常组织类型，测试来自三个个体的组织。40个循环的RT-PCR之后，在正常组织中只能检测到痕量的CLDN6转录本。唯一略微超出表达取舍点(cutoff)(虚线，所有正常组织的平均表达+3个STD(99％百分位))的正常组织是胎盘。误差棒，STD。
图3a-h：使用实时RT-PCR在癌变组织和细胞系中定量CLDN6的表达。与正常组织相比，我们发现CLDN6在来自卵巢癌(腺癌)、肺癌(NSCLC，在腺癌中具有最高的频率和表达水平)、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌(基底细胞癌和鳞状细胞癌)恶性黑色素瘤、头颈癌(恶性多形性腺瘤)、肉瘤(滑膜肉瘤和癌肉瘤)、胆管癌、肾细胞癌(明细胞癌和乳头状癌)、子宫癌、膀胱癌(乳头状癌)的样品中以及在癌细胞系A2780(卵巢癌)、NIH-OVCAR3(卵巢癌)、HCT-116(结肠癌)、EFO-27(卵巢癌)、CPC-N(SCLC)、NCI-H552(NSCLC)、SNU-1(胃癌)、KATOIII(胃癌)、YAPC(胰腺癌)、AGS(胃癌)、FU97(胃癌)、MKN7(胃癌)中高表达。为了不过高估计CLDN6在癌变组织和细胞系中的表达频率，只有转录本水平为正常组织表达取舍点10倍以上时才被归为阳性(虚线)。
图4：正常组织中CLDN6表达的Western印迹分析。针对每种正常组织类型，测试来自多达5个个体的组织裂解物。在所分析的任一正常组织中，均未检测到CLDN6蛋白表达。NIH-OVCAR3，阳性对照。
图5：癌变组织中CLDN6表达的Western印迹分析。与正常组织相比，在来自卵巢癌和肺癌的样品中检测到高表达的CLDN6蛋白。NIH-OVCAR3，阳性对照。
图6：癌细胞系中CLDN6表达的Western印迹分析。在如下细胞系中检测CLDN6的表达：用CLDN6表达质粒转染的HEK293细胞(阳性对照)、NIH-OVCAR3(卵巢癌)、MKN7(胃癌)、AGS(胃癌)、CPC-N(SCLC)、HCT-116(结肠癌)、FU97(胃癌)、NEC8(睾丸胚胎癌)、JAR(胎盘绒毛膜癌)、JEG3(胎盘绒毛膜癌)、BEWO(胎盘绒毛膜癌)和PA-1(卵巢畸胎癌)。
图7：正常组织中CLDN6表达的免疫组织化学(IHC，Immunohistochemical)分析。在所分析的任一组织中均没有可检出的CLDN6蛋白表达。在胰腺、十二指肠和肾中可见深色标记，其代表与细胞结构无关的染料沉淀。
图8a-h：癌变组织中CLDN6表达的免疫组织化学(IHC)分析。与正常组织相比，在如下来源的组织切片上观察到强的或至少是显著的染色：(a)卵巢癌，(b)肺癌，(c)皮肤癌，(d)胰腺癌、胃癌，(e)乳腺癌、膀胱癌(移形细胞癌)，(f)子宫颈癌、睾丸癌(精原细胞瘤)，(g)子宫癌、小肠癌以及(h)睾丸癌(胚胎癌和畸胎瘤)。染色在恶性上皮细胞群的质膜处清晰显著，而邻近的间质和非恶性上皮细胞则为阴性。这些结果表明，CLDN6蛋白位于恶性细胞的质膜处。
图9：癌细胞中CLDN6表达的流式细胞术分析。使用商品化的靶向CLDN6细胞外结构域(αCLDN6)的单克隆抗体对本源细胞(native cell)进行染色。使用以CLDN6表达质粒转染的HEK293细胞和未转染的HEK293细胞作为对照。未观察到对未转染对照细胞的标记，而在转染有CLDN6的对照细胞中以及在内源性表达CLDN6的AGS(胃癌)、NIH-OVCAR3(卵巢癌)、HCT-116(结肠癌)和CPC-N(SCLC)癌细胞中观察到了强的标记。这些结果清楚地表明，CLDN6位于癌细胞的质膜处，并且可以被针对细胞外蛋白结构域的单克隆抗体所靶向。
实施例：
本文中使用的技术和方法在文中描述或以已知的方式来实施，并描述在例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.中。除非特别地指明，所有方法(包括试剂盒和试剂的使用)根据制造商提供的信息来进行。
实施例1：CLDN6是卵巢肿瘤和肺肿瘤特异性的标志物
使用实时RT-PCR，在正常组织和来自卵巢癌和肺癌(腺癌)的样品中定量CLDN6(根据SEQ ID NO：1的核酸序列、根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列)的表达。
如先前的描述(Koslowski等，2006；Koslowski等，2007)进行RNA提取、第一链cDNA合成和实时逆转录PCR(RT-PCR)。在40个循环的RT-PCR中，一式三份地进行实时定量表达分析。针对HPRT(有义5′-TGACAC TGG CAA AAC AAT GCA-3′；反义5′-GGT CCT TTT CAC CAGCAA GCT-3′，62℃退火)进行归一化之后，使用ΔΔCT计算对CLDN6的表达进行定量(有义5′-CTT ATC TCC TTC GCA GTG CAG-3′；反义5′-AAG GAG GGC GAT GAC ACA GAG-3′，60℃退火)。针对每种正常组织类型，测试来自多达3个个体的组织。
除了胎盘以外，在正常组织中只能检测到痕量的CLDN6转录本。相反，我们发现在来自卵巢癌(腺癌)和肺癌(腺癌)的样品中CLDN6高表达；见图1。
实施例2：使用实时RT-PCR，在正常组织、癌变组织和细胞系中定量CLDN6的表达。
使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)从冷冻的组织样本和癌细胞系中提取总细胞RNA，根据制造商的说明书，以dT18寡核苷酸为引物，用Superscript II(GIBCO/Lifetech)进行逆转录。在30个循环的RCR(有义，5′-CGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCG-3′；反义，5′-CCTAACCAGCTGCCCAACTGTAG-3′；退火温度67℃)中通过扩增p53转录本来测试所得cDNA的完整性。针对HPRT(有义5′-TGA CAC TGGCAA AAC AAT GCA-3′；反义5′-GGT CCT TTT CAC CAG CAAGCT-3′，62℃退火)进行归一化之后，使用ΔΔCT计算来定量CLDN6的表达(有义5′-CTT ATC TCC TTC GCA GTG CAG-3′；反义5′-AAGGAG GGC GAT GAC ACA GAG-3′，60℃退火)。
针对每种正常组织类型，测试来自三个个体的组织。在40个循环的RT-PCR之后，在正常组织中只能检测到痕量的CLDN6转录本；见图2。唯一略微超出表达取舍点(虚线，所有正常组织的平均表达+3个STD(99％百分位))的正常组织是胎盘。误差棒，STD。
与正常组织相比，我们发现CLDN6在来自卵巢癌(腺癌)、肺癌(NSCLC，在腺癌中具有最高的频率和表达水平)、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌(基底细胞癌和鳞状细胞癌)、恶性黑色素瘤、头颈癌(恶性多形性腺瘤)、肉瘤(滑膜肉瘤及癌肉瘤)、胆管癌、肾细胞癌(明细胞癌和乳头状癌)、子宫癌、膀胱癌(乳头状癌)的样品中以及在癌细胞系A2780(卵巢癌)、NIH-OVCAR3(卵巢癌)、HCT-116(结肠癌)、EFO-27(卵巢癌)、CPC-N(SCLC)、NCI-H552(NSCLC)、SNU-1(胃癌)、KATOIII(胃癌)、YAPC(胰腺癌)、AGS(胃癌)、FU97(胃癌)、MKN7(胃癌)中高表达；见图3a-g。为了不过高估计CLDN6在癌变组织和细胞系中的表达频率，仅转录本水平为正常组织表达取舍点至少10倍以上时才被归为阳性(虚线)。
实施例3：使用Western印迹分析在正常组织、癌变组织和细胞系中定量CLDN6的表达。
针对Western印迹分析，使用从以Laemmli裂解缓冲液裂解的从细胞中提取的20μg总蛋白。用还原样品缓冲液(Roth)稀释提取物，进行SDS-PAGE，并随后电转到PVDF膜(Pall)上。用对CLDN6(ARP)和β-肌动蛋白(Abcam)有反应性的多克隆抗体进行免疫染色，继之用辣根过氧化酶缀合的山羊抗小鼠和山羊抗兔的第二抗体(secondaryantibody)(Dako)来检测第一抗体(primary antibody)。
针对每种正常组织类型，测试来自多达5个个体的组织裂解物。在所分析的任一正常组织中均没有检测到CLDN6蛋白的表达；见图4。NIH-OVCAR3，阳性对照。
与正常组织相比，在来自卵巢癌和肺癌的样品中检测到了高表达的CLDN6蛋白；见图5。NIH-OVCAR3，阳性对照。
在如下细胞中检测到CLDN6的表达：用CLDN6表达质粒转染的HEK293细胞(阳性对照)、NIH-OVCAR3(卵巢癌)、MKN7(胃癌)、AGS(胃癌)、CPC-N(SCLC)、HCT-116(结肠癌)、FU97(胃癌)、NEC8(睾丸胚胎癌)、JAR(胎盘绒毛膜癌)、JEG3(胎盘绒毛膜癌)、BEWO(胎盘绒毛膜癌)和PA-1(卵巢畸胎癌)；见图6。
实施例4：正常组织和癌变组织中CLDN6表达的免疫组织化学(IHC)分析
在加热板上(HI 1220，Leica)，于58℃孵育石蜡包埋的组织切片(4μm)1小时。室温(RT)下，通过在Roticlear(Roth)中孵育所述载玻片2×10分钟，从所述切片中除去石蜡。随后，在梯度乙醇(99％、2×96％、80％和70％，每步5分钟)中再水化所述切片。通过在120℃(15psi)下、在10mM柠檬酸缓冲液(pH 6.0)+0.05％吐温-20中煮沸载玻片15分钟来进行抗原修复。煮沸载玻片之后马上在PBS中孵育5分钟。室温下，用0.3％的MeOH中过氧化氢阻断内源性过氧化物酶的活性15分钟。为了避免非特异性结合，室温下，用10％的PBS中山羊血清阻断所述载玻片30分钟。随后，在4℃下，用CLDN6特异性多克隆抗体(1μg/ml)(ARP)过夜孵育所述载玻片。第二天，室温下，用PBS清洗所述载玻片(3×5分钟)，并用100μl第二抗体(PowerVision多克隆HRP-抗-兔IgG即用抗体(ImmunoLogic))在室温下孵育1小时。此后，室温下，用PBS清洗载玻片(3×5分钟)。通过使用Vector Laboratories(Burlingame)的VECTOR NovaRED Substrate Kit SK-4800试剂盒来进行最终染色。室温下，用苏木素复染切片90秒。用梯度乙醇(70％、80％、2×96％和99％，每步5分钟)脱水以及在二甲苯中孵育10分钟之后，用X-tra Kit试剂盒(Medite Histotechnic)封片。
在所分析的任一组织中均没有可检出的CLDN6蛋白表达；见图7。在胰腺、十二指肠和肾中可见深色标记，其代表与细胞结构无关的染料沉淀。
与正常组织相比，在如下来源的组织切片上观察到强的或至少是显著的染色：(a)卵巢癌，(b)肺癌，(c)皮肤癌，(d)胰腺癌、胃癌，(e)乳腺癌、膀胱癌(移形细胞癌)，(f)子宫颈癌、睾丸癌(精原细胞瘤)，(g)子宫癌、小肠癌以及(h)睾丸癌(胚胎癌和畸胎瘤)；见图8a-h。染色在恶性上皮细胞群的质膜处清晰显著，而附近的间质和非恶性上皮细胞为阴性。这些结果表明，CLDN6蛋白位于恶性细胞的质膜处。
实施例5：癌细胞中CLDN6表达的流式细胞术分析
用5mM EDTA/PBS收获细胞，并重悬于PBS/2％FCS/0.1％NaAcid中。4℃下，用靶向CLDN6细胞外结构域的小鼠单克隆抗体(R&D)孵育2×105个细胞30分钟。清洗后，4℃下，用APC标记的山羊抗小鼠第二抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories)孵育细胞30分钟。清洗后，用碘化丙啶(PI，propidium iodide)对细胞进行染色。对活细胞(PI阴性细胞)设门(gating)之后，使用BD FACSArrayBioanalyzer System进行分析。
使用商品化的靶向CLDN6细胞外结构域(αCLDNβ)的单克隆抗体对本源细胞进行染色。使用以CLDN6表达质粒转染的HEK293细胞和未转染的HEK293细胞作为对照。未观察到对未转染对照细胞的标记，而在转染有CLDN6的对照细胞中以及在内源性表达CLDN6的AGS(胃癌)、NIH-OVCAR3(卵巢癌)、HCT-116(结肠癌)和CPC-N(SCLC)癌细胞中观察到强的标记；见图9。这些结果清楚地表明，CLDN6位于癌细胞的质膜处，并且可被针对其细胞外蛋白结构域的单克隆抗体靶向。
Figure IPA00001423590100011
Figure IPA00001423590100021
Figure IPA00001423590100031
Figure IPA00001423590100041

Claims (23)

1.药物组合物，其包含肿瘤抗原的表达和/或活性的抑制剂，其中所述肿瘤抗原包含由如下核酸编码的氨基酸序列，所述核酸包含根据序列表中SEQ ID NO：1的核酸序列或所述核酸序列的变体。
2.权利要求1的药物组合物，其中(i)所述肿瘤抗原的表达抑制剂是与如下核酸选择性杂交的抑制性核酸，所述核酸包含根据序列表中SEQ ID NO：1的核酸序列或所述核酸序列的变体，所述抑制性核酸优选地选自：反义寡核苷酸、核酶、iRNA、siRNA或编码它们的DNA，或(ii)所述肿瘤抗原的活性抑制剂是特异性结合所述肿瘤抗原的抗体。
3.药物组合物，其包含肿瘤抗原的配体或编码肿瘤抗原之核酸的配体，其中所述肿瘤抗原包含由如下核酸编码的氨基酸序列，所述核酸包含根据序列表中SEQ ID NO：1的核酸序列或所述核酸序列的变体，并且其中所述的肿瘤抗原配体或编码肿瘤抗原之核酸的配体与一个或多个治疗效应部分结合，所述治疗效应分子优选地为放射性标记、细胞毒素或细胞毒性酶。
4.权利要求3的药物组合物，其中所述的肿瘤抗原配体包括特异性结合所述肿瘤抗原的抗体，或者所述编码肿瘤抗原之核酸的配体是选择性地与所述核酸杂交的核酸。
5.药物组合物，其包含选自以下的一种或多种药剂：
(i)包含肿瘤抗原的氨基酸序列或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列的肽，或所述肽的衍生物，
(ii)编码如下肽的核酸，所述肽包含肿瘤抗原的氨基酸序列或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列，或所述核酸的衍生物，
(iii)编码如下肽的宿主细胞，所述肽包含肿瘤抗原的氨基酸序列或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列，
(iv)编码如下肽的病毒，所述肽包含肿瘤抗原的氨基酸序列或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列，
(v)呈递如下肽或所述肽之衍生物的细胞，所述肽包含衍生自肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列，
(vi)与如下肽结合的抗体或T细胞受体，所述肽包含肿瘤抗原的氨基酸序列或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列，
(vii)体外致敏以识别如下肽的免疫反应性细胞，所述肽包含肿瘤抗原的氨基酸序列或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列，和
(viii)用编码识别如下肽之T细胞受体的核酸转导的效应细胞或干细胞，所述肽包含肿瘤抗原的氨基酸序列或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列，
其中，所述肿瘤抗原包含由如下核酸编码的氨基酸序列，所述核酸包含根据序列表中SEQ ID NO：1的核酸序列或所述核酸序列的变体，并且所述肿瘤抗原肽包含与所述肿瘤抗原之片段的氨基酸序列基本上对应的氨基酸序列。
6.权利要求5的药物组合物，其中所述肽是I类或II类MHC呈递的肽，或者可被加工产生I类或II类MHC呈递的肽。
7.权利要求5的药物组合物，其中所述宿主细胞表达与所述经编码肽或其加工产物结合的MHC分子。
8.权利要求5的药物组合物，其中所述抗体是单克隆的、嵌合的、人的或人源化的抗体，或是抗体片段或合成抗体。
9.权利要求5至8中任一项的药物组合物，其采用治疗性或预防性肿瘤疫苗的形式。
10.权利要求5至9中任一项的药物组合物，其用于治疗或预防肿瘤疾病。
11.治疗患有肿瘤疾病或具有发生肿瘤疾病之风险的患者的方法，其包括向所述患者施用权利要求1至10中任一项的药物组合物，所述施用优选地诱导或促进针对如下肿瘤的CTL活性，所述肿瘤的特征在于以I类MHC呈递包含由下述核酸编码之氨基酸序列的肿瘤抗原，所述核酸包含根据序列表中SEQ ID NO：1的核酸序列或所述核酸序列的变体。
12.用于诊断、检测或监测肿瘤疾病的方法，其包括在从患者分离的生物样品中检测和/或定量选自以下的一种或多种参数：
(i)编码如下肽的核酸，所述肽包含肿瘤抗原的氨基酸序列，
(ii)包含肿瘤抗原的氨基酸序列或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列的肽，
(iii)与如下肽结合的抗体，所述肽包含肿瘤抗原的氨基酸序列或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列，
(iv)识别如下肽的T细胞，所述肽包含肿瘤抗原的氨基酸序列或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列，和/或
(v)呈递如下肽的细胞，所述肽包含衍生自肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列，
其中，所述肿瘤抗原包含由如下核酸编码的氨基酸序列，所述核酸包含根据序列表中SEQ ID NO：1的核酸序列或所述核酸序列的变体，并且所述肿瘤抗原肽包含与所述肿瘤抗原之片段的氨基酸序列基本上对应的氨基酸序列。
13.用于检测患者中的循环肿瘤细胞的方法，其包括在从所述患者分离的、含有或怀疑含有散布的或循环的肿瘤细胞或转移性肿瘤细胞的生物样品中检测和/或定量：(i)编码如下肽的核酸，所述肽包含肿瘤抗原的氨基酸序列，和/或(ii)包含肿瘤抗原的氨基酸序列或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列的肽，
其中，所述肿瘤抗原包含由如下核酸编码的氨基酸序列，所述核酸包含根据序列表中SEQ ID NO：1的核酸序列或所述核酸序列的变体，并且所述肿瘤抗原肽包含与所述肿瘤抗原之片段的氨基酸序列基本上对应的氨基酸序列。
14.检测患者中转移性卵巢癌细胞或转移性肺癌细胞的方法，其包括在从患有肿瘤的所述患者的组织或器官分离的生物样品中检测和/或定量：(i)编码如下肽的核酸，所述肽包含肿瘤抗原的氨基酸序列，和/或(ii)包含肿瘤抗原的氨基酸序列或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列的肽，其中，当所述组织或器官不具有肿瘤时，所述细胞基本上不表达所述核酸或肽，
其中，所述肿瘤抗原包含由如下核酸编码的氨基酸序列，所述核酸包含根据序列表中SEQ ID NO：1的核酸序列或所述核酸序列的变体，并且所述肿瘤抗原肽包含与所述肿瘤抗原之片段的氨基酸序列基本上对应的氨基酸序列。
15.权利要求12至14中任一项的方法，其中所述生物样品来自组织或器官，其中，当所述组织或器官不具有肿瘤时，所述细胞基本上不表达所述肿瘤抗原和/或编码所述肿瘤抗原的核酸。
16.权利要求12至15中任一项的方法，其中所述检测和/或定量包括：
(i)使所述生物样品与如下药剂相接触，所述药剂特异性地结合待检测/或待定量的所述核酸、所述肽、所述抗体、所述T细胞或所述细胞，和
(ii)检测由所述药剂与待检测或待定量之所述核酸、所述肽、所述抗体、所述T细胞或所述细胞之间复合物的形成和/或对其进行定量。
17.权利要求16的方法，其中(i)特异性结合所述核酸的所述药剂包含特异性地与所述核酸杂交的寡核苷酸，(ii)特异性结合所述肽的所述药剂包含特异性结合所述肽的抗体，(iii)特异性结合所述抗体的所述药剂包含特异性结合所述抗体的肽，或(iv)特异性结合所述T细胞的所述药剂包含呈递MHC分子和如下肽之间复合物的细胞，所述肽包含衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列。
18.权利要求16或17的方法，其中所述药剂还包含可检测标记。
19.诊断测试试剂盒，其包含与如下项特异性结合的药剂：
(i)编码如下肽的核酸，所述肽包含肿瘤抗原的氨基酸序列，
(ii)包含肿瘤抗原的氨基酸序列或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列的肽，
(iii)结合如下肽的抗体，所述肽包含肿瘤抗原的氨基酸序列或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列，
(iv)识别如下肽的T细胞，所述肽包含肿瘤抗原的氨基酸序列或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列，和/或
(v)呈递如下肽的细胞，所述肽包含衍生自肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列，
其中，所述肿瘤抗原包含由如下核酸编码的氨基酸序列，所述核酸包含根据序列表中SEQ ID NO：1的核酸序列或所述核酸序列的变体，并且所述肿瘤抗原肽包含与所述肿瘤抗原之片段的氨基酸序列基本上对应的氨基酸序列，其中所述药剂优选地还包含可检测标记。
20.结合如下肽的药剂，所述肽包含肿瘤抗原的氨基酸序列或衍生自所述肿瘤抗原之肿瘤抗原肽的氨基酸序列，其中所述肿瘤抗原包含由如下核酸编码的氨基酸序列，所述核酸包含根据序列表中SEQ ID NO：1的核酸序列或所述核酸序列的变体，并且所述肿瘤抗原肽包含与所述肿瘤抗原之片段的氨基酸序列基本上对应的氨基酸序列，其中所述药剂优选地为抗体，更优选地为单克隆的、嵌合的、人的或人源化的抗体、抗体片段或合成抗体。
21.权利要求20的药剂与治疗效应部分或可检测标记之间的缀合物。
22.权利要求1至10中任一项的药物组合物、权利要求11至18中任一项的方法、权利要求19的诊断测试试剂盒、权利要求20的药剂或权利要求21的缀合物，其中所述肿瘤抗原包含根据序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体。
23.权利要求10或22的药物组合物或权利要求11至12、14至18和22中任一项的方法，其中所述肿瘤疾病选自：卵巢癌，尤其是卵巢腺癌和卵巢畸胎癌；肺癌，包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，尤其是鳞状细胞肺癌和腺癌；胃癌；乳腺癌；肝癌；胰腺癌；皮肤癌，尤其是基底细胞癌和鳞状细胞癌；恶性黑色素瘤；头颈癌，尤其是恶性多形性腺瘤；肉瘤，尤其是滑膜肉瘤和癌肉瘤；胆管癌；膀胱癌，尤其是移形细胞癌和乳头状癌；肾癌，尤其是肾细胞癌，包括明细胞肾细胞癌和乳头状肾细胞癌；结肠癌；小肠癌，包括回肠癌，尤其是小肠腺癌和回肠腺癌；睾丸胚胎癌；胎盘绒毛膜癌；子宫颈癌；睾丸癌，尤其是睾丸精原细胞瘤、睾丸畸胎瘤和胚胎睾丸癌；和子宫癌，及其转移形式，优选卵巢癌、肺癌、转移性卵巢癌和转移性肺癌。
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