CN105392798A - 免疫疗法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种药剂，其包含：包含T细胞抗原肽的环肽；其中呈环化形式的所述T细胞抗原肽不能够诱发T细胞反应；并且其中通过选择性裂解所述环肽中的一个或多个裂解位点使得所述T细胞抗原肽能够诱发T细胞反应。所述药剂可用于预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状。

Description

免疫疗法
技术领域
本发明涉及免疫治疗剂。特别地，它涉及可用于预防或治疗以存在不需要的细胞如造成肿瘤或其他疾病的细胞为特征的病状的药剂。
背景技术
本说明书中明显在先公开的文件的列表或讨论不应必然被视为承认该文件是现有技术状态的一部分或是公知常识。
用于靶向恶性疾病的免疫治疗策略是转化临床研究的活跃领域，并且已经持续几十年。目前的模型指示，癌症代表着免疫效应反应的功能错配，由此宿主通常具有针对内源性病毒病原体的强大的和功能性免疫反应，但缺乏针对驻留恶性组织的此类反应。
如果可开发可以有效地分子性利用内源性细胞毒性抗病毒免疫反应以代替靶向恶性组织的治疗策略，则这可提供一种新的有效和安全的方法来治疗恶性疾病。
大多数细胞毒性治疗性抗体依赖于免疫效应机制来递送其抗癌作用，例如补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。重要的是，所有细胞(健康的和恶性的)都具有众多机制来限制免疫反应攻击以避免自身免疫性。这在自身免疫性疾病的情形下是显而易见的，其中高水平的组织反应性抗体虽然经常引起器官炎症，但很少诱发完全器官破坏。实际上，已知观测到完全组织破坏的自身免疫性疾病如糖尿病依赖于CTL反应而非抗体定向机制。
本发明的药剂是重定向免疫疗法的实例。这是指如下概念：重定向通常靶向带有外来抗原的细胞的现有免疫反应，以靶向诸如癌症等病状中不需要的细胞。所述概念需要呈递不需要的细胞上的标记抗原以使得它们变成免疫细胞的靶标。
WO95/17212描述了由肽T细胞抗原和细胞结合搭配物组成的结合物以及其在重定向免疫疗法中的用途。所述结合物包含对靶细胞和T细胞抗原肽具选择性的结合搭配物，并且据称在癌症、自身免疫性疾病、糖尿病或过敏性疾病的治疗中诱导T细胞的特异性细胞毒性。据称，在结合搭配物与表面受体结合后，所述结合物内化至靶细胞中，并且T细胞抗原肽从所述结合物加工并且以与MHC分子的复合物形式表达在细胞表面上。从而诱发T细胞对靶细胞的细胞毒性。
然而，根据WO95/17212，难以预测哪些结合搭配物能够内化并且因此后续呈递T细胞抗原肽，以及哪些不能。此外，WO95/17212中描述的结合物不能有效地靶向MHCI类抗原加工途径。MHCI类途径的优点在于，不同于MHCII类分子，MHCI类分子存在于所有细胞类型上。
Smith等(免疫学杂志(JImmunol)169：99-107，2002)描述了使用蓖麻毒素递送细胞毒性T细胞表位至肿瘤细胞的MHCI类途径中，以使得它们随后被溶解。然而，蓖麻毒素具高毒性并且因此它可以结合至大多数细胞类型，它对肿瘤细胞没有选择性。
本发明的药剂旨在规避所有上述问题的同时提高特异性，并且利用如下事实：T细胞抗原肽可以被呈递而不会首先内化至细胞中并且参加经典的抗原加工途径。除了经由利用蛋白体进行靶向细胞内蛋白水解从细胞内隔室连续地馈送肽的经典MHCI类加工途径之外，肽经由TAP和负载在ER内的MHCI类肽转运，抗原也可以被呈递而不内化。由于一些MHC结合肽对MHC分子的低亲和力，这种较小定向机制依赖于一些MHCI类相关肽的短半衰期。肽解离提供空的MHCI类分子，其能够在膜处结合T细胞抗原(例如肽)。以相同方式，T细胞抗原可以结合至MHCII类分子并且本发明也规避了II类抗原加工途径以在细胞膜处直接负载抗原。此外，I群CD1分子(CD1a、CD1b和CD1c)已显示向细胞毒性αβT细胞以及细胞毒性γδT细胞呈递脂质(Porcelli等，(1989)自然(Nature)，341，447-450)。
本发明人先前已发现，通过在紧邻于T细胞抗原处引入裂解位点，其中所述裂解位点在不需要的细胞附近选择性裂解，所述T细胞抗原可以在不需要的细胞附近从靶向部分释放并且可以变得被例如空MHC分子或I群CD1分子结合，并且诱发T细胞反应(参见WO2012/123755)。以这种方式，药剂内化至细胞中以及抗原定向至经典加工途径不是必要的；相比于如在WO95/17212中仅表达MHCII类的细胞，所述药剂可以靶向表达MHCI类分子的细胞；并且借助于仅在不需要的细胞附近裂解的裂解位点来增加特异性。例如，肿瘤细胞分泌由侵袭局部组织的肿瘤和癌转移所需的蛋白酶，并且因此通过在药剂中包括肿瘤特异性蛋白酶裂解位点，所述药剂对于肿瘤的特异性增加。由此可见，利用裂解位点以避免对于内化和经典加工的需求以使得T细胞抗原有效地呈递至T细胞是一个关键的优点。
然而，仍然需要更有效的免疫治疗剂。例如，将免疫治疗剂定向至癌细胞附近并不总是容易的，并且理想地需要使用具有高肿瘤穿透力的靶向部分。大分子实体如抗体向肿瘤的穿透性已知特别差，并且因此对其进行改进将是有吸引力的。此外，非常希望简化免疫治疗剂的制造方法，以便加速药物开发和降低成本。
本发明人现在已开发了一种新的免疫治疗剂，其寻求解决上述问题。令人惊讶和出乎意料的是，本发明人已发现，通常在环肽内呈递T细胞抗原肽，不再需要靶向部分。这是特别不可预见的，因为靶向部分以前被视为药剂的元件以在所需位置处诱发有效的T细胞反应。这种药剂获益于改进的肿瘤穿透、简化的制造工艺、较低的生产成本和开发时间、改进的稳定性(例如通过外肽酶降解)、降低的免疫原性可能性、更容易的施用、更容易的配制和更长的存放期。
发明内容
因此，本发明的第一方面提供一种药剂，其包含：
包含T细胞抗原肽的环肽；
其中呈环化形式的所述T细胞抗原肽不能够诱发T细胞反应；和
其中通过选择性裂解所述环肽内的一个或多个裂解位点使得所述T细胞抗原肽能够诱发T细胞反应。
如上所述，所述药剂可用于预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状，在这种情况下通过在所述不需要的细胞附近选择性裂解所述环肽内的一个或多个裂解位点使得所述T细胞抗原肽能够诱发T细胞反应。
因此，本发明还提供一种用于预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状的药剂，所述药剂包含含有T细胞抗原肽的环肽，其中呈环化形式的所述T细胞抗原肽不能够诱发T细胞反应，并且其中通过在所述不需要的细胞附近选择性裂解所述环肽内的一个或多个裂解位点使得所述T细胞抗原肽能够诱发T细胞反应。
“环肽”包括如下含义：肽链构成环结构的任何肽。如下所述，优选的是肽链形成共价环结构。然而，应理解，环结构可通过非共价键形成，例如在肽链末端包埋在结构中心并且通过疏水性相互作用达到彼此附近的球状多肽的情况下。
存在多种形成环结构的方式。例如，肽的氨基和羧基端可接合在一起，或者肽的一个末端可连接至肽链中的氨基酸的侧链，或者肽链中的氨基酸的侧链可连接至肽链中的另一个氨基酸的侧链。
应理解，肽的末端，或肽的末端和侧链，或肽中的氨基酸的两个侧链，可直接或间接地(例如借助于一个或多个连接部分)连接在一起。可使用能够共价连接肽链以形成环结构的任何同双官能或异双官能连接子。
直接连接可能是经由标准肽键(例如所谓的“头-尾”连接子)或者通过交联分子的任何常规方式，例如O′Sullivan等，分析生物化学(Anal.Biochem.)(1979)100，100-108中通常所述的那些。例如，一个末端可能富集硫醇基团并且另一个末端与能够和那些硫醇基团反应的双官能剂(例如碘乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHIA)或N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP))或在结合物质之间并有二硫桥的异双官能交联剂反应。例如用间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯实现的酰胺和硫醚键通常在体内比二硫键更稳定。
已知双马来酰亚胺试剂允许硫醇基团(例如抗体的半胱氨酸残基的硫醇基团)以依序或并行方式连接至另一个含硫醇部分(例如T细胞抗原肽或连接子中间体的硫醇基团)。除了马来酰亚胺之外可与硫醇基团反应的其他官能团包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
其他可用的交联剂包括S-乙酰基巯基乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SATA)，它是用于伯胺的硫醇化试剂，其允许巯基在温和条件下脱保护(Julian等，(1983)分析生物化学(Anal.Biochem.)132，68)；二甲基辛二亚氨酸酯二盐酸盐和N，N′-邻苯二马来酰亚胺。
特别优选的交联剂包括4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)、6-(3′-[2-吡啶基二硫基]-丙酰胺基)己酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-LC-SPDP)和N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼三氟乙酸盐(BMPH)。
应理解，大量的同双官能和异双官能交联化学物质将适于接合末端和/或侧链，并且可使用任何这种化学物质。例如，可使用利用Staudinger连接化学(膦-叠氮基化学)的点击化学。
应理解，肽的末端，或肽的末端和侧链，或肽中的氨基酸的两个侧链无需彼此直接连接，但是可经由一个或多个连接子部分连接。例如，当所述末端间接连接在一起时，肽的氨基端可连接至连接部分，所述连接部分又连接至肽的羧基端。可选地，肽的氨基端可连接至第一连接部分，所述第一连接部分又连接至第二连接部分，所述第二连接部分连接至肽的羧基端。可使用类似的连接方法来连接氨基酸侧链与肽链末端或与肽链中的另一个氨基酸侧链。因此，环肽可能含有维持环状结构所必需的一个或多个连接部分。换句话说，环肽可包含T细胞抗原肽和任选地一个或多个其他部分如一个或多个连接部分。
所述一个或多个连接部分可为任何共价实体，但通常是氨基酸或肽。因此，所述一个或多个连接部分可对应于单一氨基酸，或者它们可对应于具有至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸的肽。通常，连接肽将具有2至8个氨基酸。合适的连接肽是采用无规卷曲构象的那些，例如，所述肽可含有甘氨酸或丙氨酸或脯氨酸或者丙氨酸、甘氨酸和脯氨酸残基的混合物。然而，鉴于连接肽的目的是提供间隙，将认识到实际肽序列并不是关键的。合适的连接子序列的特定实例是GGGGS(SEQIDNo：277)。
在一个实施方案中，这些连接子部分含有如本文所述的一个或多个可选择性裂解的裂解位点。因此，所述一个或多个连接部分可为含有一个或多个可选择性裂解的裂解位点(例如酶促裂解位点如蛋白酶裂解位点)的氨基酸或肽。下文给出适当裂解位点的其他细节。
虽然可仅用正常肽键形成环肽的环结构，但也可使用其他键类型。实际上，环肽可根据包含环的键类型分类，并且所有类别都包括在本发明中。例如，均环肽如环孢菌素A是其中环仅由正常肽键(即在一个残基的α羧基与另一个残基的α胺之间)构成的那些。环状异肽含有至少一个非α酰胺键，例如一个残基的侧链与另一个残基的α羧基之间的键，如在微囊藻毒素(microcystin)和杆菌肽中。环状缩酚肽如金担子素A(aureobasidinA)和HUN-7293具有代替一个酰胺的至少一个内酯(酯)键。一些环状缩酚酞在链中的C端羧基与Thr或Ser残基的侧链之间环化，例如kahalalideF、theonellapeptolide和膜海鞘肽B(didemninB)。双环肽如毒伞肽(amatoxin)鹅膏毒肽(amanitin)和鬼笔环肽(phalloidin)含有桥连基团，通常在两个侧链之间。在毒伞肽中，这种桥形成为Trp与Cys残基之间的硫醚。其他双环肽包括棘霉素(echinomycin)、丙霉素A(triostinA)和CelogentinC。也存在多种环肽激素，其经由两个半胱氨酸之间的二硫键环化，如在生长抑素和催产素中。也包括三环肽。其他实例公开于EP2257624和WO2009098450中，包括其中使用三(溴甲基)苯(TBMB)来连接3个半胱氨酸残基以形成双环结构者。
在一个优选的实施方案中，环肽是所谓的“头-尾”环肽，其中肽的末端通过标准肽键连接在一起。
本发明药剂的环肽的长度范围可为从几个氨基酸到数百个氨基酸。通常，环肽具有9至100个氨基酸，例如10至90个氨基酸、20至80个氨基酸、30至70个氨基酸和40至60个氨基酸。更通常地，环肽具有9至30个氨基酸。例如，环肽可具有至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。应理解，肽越大，其形成二级结构的可能性越大，免疫原性变得更大和/或变得更容易蛋白水解降解。因此，在一个实施方案中，优选的是环肽具有不超过100个氨基酸，例如不超过90、80、70、60、50、40或30个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，包含T细胞抗原肽的环肽是由T细胞抗原肽组成的环肽。换句话说，所述环肽是呈环状形式的T细胞抗原肽。在这种情况下，应理解，一个或多个裂解位点(例如蛋白酶裂解位点)可位于T细胞抗原肽本身中。如果T细胞抗原肽用精氨酸残基终止，则例如这可通过胰蛋白酶适当裂解。下文给出适当的裂解位点的其他细节。
在另一个实施方案中，包含T细胞抗原肽的环肽是含有T细胞抗原肽和一个或多个其他连接部分以形成环结构的环化肽。所述一个或多个连接部分可为任何合适的连接部分以完成环结构并且可任选地含有一个或多个裂解位点。通常，所述一个或多个其他连接部分是如上所述的氨基酸或肽。
设计和制造环肽的方法是本领域中公认的并且描述于例如Demmer等，2009(在生物制药应用的肽和蛋白质设计中的环肽设计(DesignofCyclicpeptides，inPeptideandProteinDesignforBiopharmaceuticalApplications)(KJJensen编)，JohnWiley&Sons，Ltd，Chicester，UK，doi：10.1002/9780470749708.ch4)；和Lianshan和Tam，2002(肽科学的肽前沿(PeptidesFrontiersofPeptideScience)，AmericanPeptideSymposia，第5卷，2002，第19-22页，用于合成环肽文库的新颖概念(Novelconceptsforthesynthesisofcyclicpeptidelibraries))中。可由商业生物技术公司(包括JPT(德国))进行环肽的化学合成。
在一个实施方案中，本发明的环肽不包含如US2004/0092434中所述的序列RIKPHQG(Arg-Ile-Lys-Pro-His-Gln-Gly)(SEQIDNo：279)。
本文所述的氨基酸残基通常呈天然“L”异构形式。然而，在某些情况下呈“D”异构形式的残基可以取代L-氨基酸残基，只要本发明的药剂仍保持其预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状的功能即可。除非另外特定说明，否则所述定义还包括化学修饰的氨基酸，包括氨基酸类似物(例如青霉胺、3-巯基-D-缬氨酸)、天然存在的非蛋白原性氨基酸(例如正亮氨酸)、β氨基酸、氮杂肽、N-甲基化氨基酸和具有本领域中已知为氨基酸特征的特性的化学合成化合物。术语“蛋白原性”表示氨基酸可以经由众所周知的代谢途径并入细胞中的蛋白质中。所述定义还包括其中官能侧基已经被化学衍生的氨基酸。这类衍生化分子包括例如其中游离氨基已经被衍生化以形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基的那些分子。游离羧基可被衍生化以形成盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯或酰肼。游离羟基可被衍生化以形成O-酰基或O-烷基衍生物。作为衍生物也包括含有二十种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的那些肽部分。所述定义还包括类肽或聚N-取代甘氨酸，其侧链附接至肽骨架的氮原子，而非连接至α碳(Renya等，1992PNAS89(20)：9367-9371)。因此，应理解，构成环肽的肽可为肽“模拟物”，即模拟包含如本文所述的氨基酸序列或由如本文所述的氨基酸序列组成的肽的结构特征的肽模拟物。
T细胞抗原肽
‘T细胞抗原肽’包括如下含义：可呈递至T细胞以诱发T细胞反应的任何肽。例如，T细胞抗原肽可通过MHC分子呈递至T细胞。一旦抗原肽呈递在细胞表面上，则所述细胞被识别为外来的并且变成T细胞的靶标，其中一些具有消除被外来生物体如病毒、真菌、细菌、分支杆菌或原虫感染或已发生癌变(例如恶性)的外来细胞的天然功能。因此，应理解，T细胞抗原肽可为能够被分子呈递在不需要的细胞上者。然而，有可能T细胞抗原肽可呈递在除了不需要的细胞之外但仍在不需要的细胞附近的细胞上，并且由于后续T细胞激活，例如通过激活T细胞局部产生细胞因子，不需要的细胞被杀死。这种间接杀死可能是可取的，例如以靶向肿瘤血管和/或支持肿瘤生长的基质细胞。
应理解，T细胞抗原肽是可以在施用本发明药剂的受试者中诱发现有T细胞反应者。通常，T细胞抗原肽不是在APC中经由交叉呈递产生对于所述抗原的新的初级T细胞反应者。换句话说，T细胞抗原肽是受试者中的多种T细胞已经对其敏感者。如下文和在实施例中进一步描述，可以通过使来自受试者的分离外周单核血细胞与肽接触并且使用细胞增殖的标准测定法来测定受试者的细胞是否对给定肽敏感。
在一个实施方案中，本发明药剂不是产生对其中所含的T细胞抗原肽具特异性的新的T细胞反应者。因此，本发明包括包含含有T细胞抗原肽的环肽的药剂；其中呈环化形式的所述T细胞抗原肽不能诱发T细胞反应；并且其中通过选择性裂解环肽中的一个或多个裂解位点使得所述T细胞抗原肽能够诱发T细胞反应，并且其中所述T细胞抗原肽能够在受试者中诱发现有T细胞反应。
‘T细胞’包括所有类型的T细胞，包括CD4+、CD8+、γδT细胞和NK-T细胞。优选地，T细胞是细胞毒性T细胞以使得诱发细胞毒性T细胞反应。
如本领域中已知，抗原呈递机制将取决于T细胞类型。通常，CD4+T细胞识别结合至MHCII类分子的肽抗原并且CD8+T细胞识别结合至MHCI类分子的肽抗原。应理解，可使用任何呈递途径，只要所述抗原诱发T细胞反应即可。通常，T细胞抗原肽是能够结合至MHCI类或MHCII类分子者。
优选地，所述T细胞抗原肽是免疫显性抗原肽(例如诱发现有免疫显性反应的肽)。‘免疫显性’包括如下含义：肽抗原诱发T细胞反应，具有高量值、敏感性、组织归巢特性和杀死带抗原细胞的效率。一般来说，免疫显性反应包含大于0.1％的受试者的CD8+或CD4+T细胞。可以例如通过使从受试者分离的外周单核血细胞与肽抗原接触并使用本领域中已知用于细胞增殖的标准测定法来测定对于给定肽抗原的T细胞反应的程度。适于测定免疫反应程度的测定法包括ELISpot、细胞内细胞因子染色、HLA-肽四聚体染色、增殖测定法、活化测定法(例如CD69)、CD107动员测定法或代谢测定法(例如MTT)。
T细胞抗原肽可为仅结合至MHCI类分子的MHCI类限制抗原，或者它可为仅结合至MHCII类分子的MHCII类限制抗原。应理解，肽抗原可能仅结合至特定变体MHCI类和/或MHCII类分子(例如在特定受试者中存在的天然变体)，或者所述抗原能够结合至任何MHCI类和/或MHCII类分子(即所述抗原是混杂的)。
在一个实施方案中，所述T细胞抗原肽能够结合至MHCI类分子，例如HLA-A、HLA-B和HLA-C中的任一种。因为MHCI类分子在所有细胞类型上表达，所以这允许本发明药剂重定向免疫反应至任何不需要的细胞。最优选地，肽能够结合至HLA类型A1、A2.1、A3.2、A11、A24、B7、B8、B35、B44、Cw1、Cw2、Cw3、Cw4和Cw6或其混合物，其被认为涵盖90％以上的白种人和亚洲人群。
在另一个实施方案中，T细胞抗原肽能够结合至MHCII类分子，例如HLA-DP、HLA-DQ或HLA-DR中的任一种。常见的MHCII类类型包括DR1、DR3、DR4、DR7、DR52、DQ1、DQ2、DQ4、DQ8和DPI。MHCII类分子在包括抗原呈递细胞如树突状细胞、B细胞和巨噬细胞的免疫细胞上表达。因此，当T细胞抗原肽被MHCII类限制时，本发明药剂可用于治疗诸如淋巴瘤或自身免疫性疾病等病状。
可使用的混杂肽的一个实例是Alexander等，(2000)免疫学杂志(TheJournalofImmunology)164：1625-1633中定义的PADREMHCII类表位；aKXVAAWTLKAAaZC(a＝d-丙氨酸，X＝L-环己基丙氨酸，Z＝氨基己酸)(SEQIDNo：1)。由于这种表位是人为的，因此首先将需要向患者中引入疫苗以在施用本发明药剂之前产生免疫反应。可使用的另一种混杂肽是破伤风片段C肽。
适宜地，T细胞抗原肽是被MHC分子识别的免疫原性肽。这类肽通常具有9至22个氨基酸(用于在MHCII类复合物中识别)或8至13个氨基酸(用于在MHCI类复合物中识别)的长度。优选地，所述肽是免疫显性肽。
免疫显性肽的实例包括诱发内源性抗病毒反应的病毒衍生肽。因此，所述肽可源自内源性病毒如水痘-带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒或流感。特别优选的实例包括源自如下的肽：人类巨细胞病毒(CMV或人类疱疹病毒5/HHV5)或爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV或HHV4)；疱疹病毒如HHV1、HHV2和HHV3；甲型流感病毒；乙型流感病毒；鼻病毒；腺病毒；和嗜肝DNA病毒。
对于人类巨细胞病毒(HHV5)，免疫显性抗原被充分表征(参见SylwesterAW等，实验医学杂志(JExpMed.)2005年9月5日；202(5)：673-85，以引用的方式并入)，并且Sylwester等中描述的任何这种抗原可用于本发明中。特别地，Sylester等合成了连续15聚体肽，对于213种预测的人类CMV蛋白，重叠10个氨基酸。这产生以ORF或子ORF特异性混合形式布置的13，687种肽。发现源自ORFUL55(gB)、UL83(pp65)、UL86、UL99(pp28)、UL122(IE2)、UL36、UL48、UL32(pp150)、UL113、IRS-1、UL123(IE1)、UL25、UL141、UL52和UL82(pp71)的肽诱发大部分CD4+T细胞反应，并且因此特别优选的是所述肽源自这些ORF之一。可选地，发现源自ORFUL48、UL83(pp66)、UL123(IE1)、UL123(IE2)、US32、UL28、US29、US3、UL32(pp150)、UL55(gB)、UL94、UL69、UL105、UL82(pp71)和UL99(pp28)的肽诱发大部分CD8+T细胞反应，并且因此特别优选的是所述肽源自这些ORF之一。
下文列出特定的巨细胞病毒T细胞抗原肽。
巨细胞病毒抗原如IE1的CD8+T细胞表位包括YILEETSVM(SEQIDNo：2)、YVLEETSVM(SEQIDNo：3)、VLEETSVML(SEQIDNo：4)、VLAELVKQI(SEQIDNo：5)、ATTFLQTMLR(SEQIDNo：6)、EVISVMKRR(SEQIDNo：7)、CRVLCCYVL(SEQIDNo：8)、ELRRKMMYM(SEQIDNo：9)、ELKRKMIYM(SEQIDNo：10)、QIKVRVDMV(SEQIDNo：11)、CVETMCNEY(SEQIDNo：12)、RRKMMYMCY(SEQIDNo：13)、KRKMIYMCY(SEQIDNo：14)、RRIEEICMK(SEQIDNo：15)、DELRRKMMY(SEQIDNo：16)、KEVNSQLSL(SEQIDNo：17)、EEAIVAYTL(SEQIDNo：18)和FPKTTNGCSQA(SEQIDNo：19)；对于pp65，它们包括YSEHPTFTSQY(SEQIDNo：20)、NLVPMVATV(SEQIDNo：21)、MLNIPSINV(SEQIDNo：22)、RIFAELEGV(SEQIDNo：23)、QYDVPAALF(SEQIDNo：24)、FTSQYRIQGKL(SEQIDNo：25)、VYALPLKML(SEQIDNo：26)、QYVKVYLESF(SEQIDNo：27)、FVFPTKDVALR(SEQIDNo：28)、YTPDSTPCHR(SEQIDNo：29)、DTPVLPHETR(SEQIDNo：30)、TPRVTGGGAM(SEQIDNo：31)、RPHERNGFTVL(SEQIDNo：32)、IPSINVHHY(SEQIDNo：33)、FPTKDVAL(SEQIDNo：34)、CPSQEPMSIYVY(SEQIDNo：35)、QPSLILVSQY(SEQIDNo：36)、SEHPTFTSQY(SEQIDNo：37)、EFFDANDIY(SEQIDNo：38)；对于pp150，它们包括TTVYPPSSTAK(SEQIDNo：39)、QTVTSTPVQGR(SEQIDNo：40)、NVRRSWEEL(SEQIDNo：41)、KARDHLAVL(SEQIDNo：42)；对于gB，它们包括RIWCLVVCV(SEQIDNo：43)；和对于pp50，它们包括VTEHDTLLY(SEQIDNo：44)、RGDPFDKNY(SEQIDNo：45)、TVRSHCVSK(SEQIDNo：46)。
巨细胞病毒抗原如pp65的CD4+T细胞表位包括PQYSEHPTFTSQYRIQ(SEQIDNo：47)、FTSQYRIQGKLEYRHT(SEQIDNo：48)、LLQTGIHVRVSQPSL(SEQIDNo：49)、NPQPFMRPHERNGFT(SEQIDNo：50)、EPDVYYTSAFVFPTK(SEQIDNo：51)、IIKPGKISHIMLDVA(SEQIDNo：52)、AGILARNLVPMVATV(SEQIDNo：53)、KYQEFFWDANDIYRI(SEQIDNo：54)；对于gB，它们包括DYSNTHSTRYV(SEQIDNo：55)、CMLTITTARSKYPYH(SEQIDNo：56)和VFETSGGLVVFWQGI(SEQIDNo：57)；对于IE1，它们包括VRVDMVRHRIKEHMLKKYTQ(SEQIDNo：58)和NYIVPEDKREMWMACIKELH(SEQIDNo：59)；和对于gH，它们包括HELLVLVKKAQL(SEQIDNo：60)。
对于爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV或HHV4)，免疫显性蛋白质也被充分表征并且提供于HislopAD等，免疫学年评(AnnuRevImmunol.)2007；25：587-617(以引用的方式并入本文)中。下文提供从Hislop等修改的T细胞表位的列表。
表3：在EBV裂解和潜伏周期蛋白中鉴定的CD8+和CD4+T细 胞表位(改编自Hislop等)
CD8+T细胞表位
CD4+T细胞表位
免疫显性肽的其他实例包括HLA-A*0201限制表位(HCMVpp65495-504-NLVPMVATV(SEQIDNo：21)、HCMVIE1VLEETSVML(SEQIDNo：4)、EBVLMP-2356-364FLYALALLL(SEQIDNo：127)、EBVBMLF-1259-267GLCTLVAML(SEQIDNo：155))；HLA-A*0101限制表位(HCMVpp50245-253-VTEHDTLLY(SEQIDNo：44)；HCMVpp65363-373-YSEHPTFTSQY)(SEQIDNo：20)；HLA-A*0301限制表位(HCMVpp50-TVRSHCVSK(SEQIDNo：46))；HLA-B*0702限制表位(HCMVpp65417-426TPRVTGGGAM(SEQIDNo：31)、pp65265-275RPHERNGFTVL(SEQIDNo：32))；和HLA-B*0801限制表位(HCMVIE188-96-ELKRKMMYM(SEQIDNo：253)、IE188-96QIKVRVDMV(SEQIDNo：11)、EBVBZLF-1190-197RAKFKQLL(SEQIDNo：152))，其中的任一个可用于本发明情形中。
特别优选的MHCI类抗原包括源自CMV的那些，例如CRVCCLYVL(SEQIDNo：274；HLA-Cw07结合肽)、NLVPMVATV(SEQIDNo：21；HLA-A2结合肽)、RPHERNGFTVL(SEQIDNo：32；HLA-B7结合肽)、TPRVTGGGAM(SEQIDNo：31；HLA-B7结合肽)、YSEHPTFTSQY(SEQIDNo；20；HLA-A1结合肽)和VTEHDTLLY(SEQIDNo：44；HLA-A1结合肽)；和源自EBV的那些，包括GLCTLVAML(SEQIDNo：155)和CLGGLLTMV(SEQIDNo：129；HLA-A2结合肽)。
应理解，T细胞抗原肽可为源自活疫苗者如麻疹、腮腺炎、风疹(MMR)或HHV3者；或源自细胞内细菌如结核分枝杆菌者，特别是经由用BCG免疫接种所诱发的那些。这些肽是本领域中众所周知的。类似地，T细胞抗原(例如肽)可源自破伤风类毒素如P2、P4或P30。因此，应理解，T细胞抗原肽可为在已经通过先前针对传染性病原体的疫苗接种所产生的受试者中诱发现有免疫反应者。由此可见，为了增加对T细胞抗原肽敏感的T细胞数目，可能需要用包含T细胞抗原肽的疫苗对受试者进行疫苗接种或加强。例如，在施用包含相关T细胞抗原肽的本发明药剂之前，受试者可用破伤风毒素疫苗接种。
应理解，因为很多人在儿童期用这些疫苗接种，所以他们可能含有对这些T细胞抗原敏感的T细胞。因此，在一个实施方案中，T细胞抗原肽是在儿童期疫苗中存在者。
虽然不是优选的，但T细胞抗原肽也可能是在已经通过使受试者的T细胞暴露于体外抗原而产生的受试者中诱发现有免疫反应者。
肽可通过众所周知的化学程序产生，例如溶液或固相合成，或在溶液中半合成，其开始于通过如本领域中已知的常规溶液方法偶联的蛋白质片段。可选地，可通过公认方法(包括重组方法)合成肽。
当所述药剂是用于治疗自身免疫性或过敏性疾病时，应理解，T细胞抗原肽可能分别是自身抗原或过敏原。以这种方式，将促进病症的免疫反应重定向至不需要的细胞以对抗病症。
应理解，T细胞抗原肽可为化学改性的，只要它仍能够诱发T细胞反应即可。这种化学修饰可包括例如添加金属如镍，因为它已经显示，在某些过敏性患者中，存在识别具有结合镍原子的肽的T细胞(Romagnoli等，1991，EMBOJ10：1303-1306)。也可以通过增强免疫原性的有机分子来修饰T细胞抗原肽(Romero等，1993，免疫学杂志(JImmunol)150：3825-3831)。其他修饰包括磷酸化、乙酰化、烷基化、酰化、瓜氨酸化、硝化、硫酸化和羟基化，与酸或碱形成盐，形成末端羧基的酯或酰胺，和连接氨基酸保护基如N-叔丁氧羰基。
应理解，T细胞抗原肽可包含由DNA编码的天然存在的氨基酸，和/或一个或多个非天然氨基酸，包括呈“D”异构形式的氨基酸，只要它被相应的T细胞识别即可。因此，所述肽可能是肽‘模拟物’，即肽模拟物，其模拟上述任何肽的结构特征。例如，T细胞抗原肽可为反转变型肽。
类似地，T细胞抗原肽可为模拟表位，即由模拟天然表位结构的天然或非天然氨基酸构成的肽。模拟表位通常更有效地刺激T细胞。
优选地，T细胞抗原肽在不存在T淋巴细胞的情况下基本上无毒。“基本上无毒”是指相比于毒素如假单胞菌外毒素，抗原具有相当低的毒性或优选地没有可检测的毒性。
本领域技术人员将能够使用在http：//www.immuneepitope.org可用的数据库鉴定可用于本发明中的其他T细胞抗原肽(VitaR，ZarebskiL，GreenbaumJA，EmamiH，HoofI，SalimiN，DamleR，SetteA，PetersB.Theimmuneepitopedatabase2.0.核酸研究(NucleicAcidsRes.)2010年1月；38(Databaseissue)：D854-62.电子版公布于2009年11月11日)。
在一个实施方案中，环肽包含一种以上T细胞抗原肽，例如2、3、4或5种T细胞抗原。可能需要一种以上T细胞抗原肽以使得本发明药剂与更高比例的患者群体更相关。例如，所述药剂可含有结合至不同类型的MHC分子的多种T细胞抗原肽。HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*0301和HLA-A*1101限制抗原在药剂内的组合例如将有效地涵盖90％的人类群体。所述药剂可含有多种T细胞抗原肽，其中一些结合至MHCI类分子并且其中一些结合至MHCII类分子。I类和II类类型T细胞抗原肽可能是有利的，因为已知II类类型T细胞抗原肽充当I类类型T细胞抗原肽的辅助。在这个实施方案中，它可能适于环肽在每个肽抗原之间含有裂解位点，如下文进一步描述。
不需要的细胞
不需要的细胞可能是在宿主中不希望其存在的任何细胞。因此，所述细胞可能是肿瘤细胞(良性或恶性)、来自肿瘤微环境的细胞如肿瘤成纤维细胞或肿瘤血管、病毒感染细胞、作为基因疗法的一部分而引入的细胞，或出于特定原因希望破坏的正常细胞。例如，可能希望消除免疫细胞亚群，例如自身免疫性疾病中的T淋巴细胞或例如过敏性疾病中的B淋巴细胞。
“以存在不需要的细胞为特征的病状”包括其中通过不需要的细胞的存在介导病理学的至少一部分的任何生物或医学病状或病症。所述病状可由不需要的细胞的存在造成或者不需要的细胞的存在可能是病状的作用。特定病状的实例包括肿瘤(良性或恶性)、自身免疫性病状、心血管疾病、退行性疾病、糖尿病、过敏性疾病(例如哮喘)、神经退行性疾病如阿尔茨海默病、移植患者和感染性疾病。应理解，所述药剂在再生医学(例如实验室生长器官或组织)中也具有效用。特别优选的是，病状是肿瘤(例如恶性疾病)并且不需要的细胞是肿瘤细胞或肿瘤相关组织。
对于自身免疫性疾病，不需要的细胞可能代表着适应性或先天免疫反应的细胞，优选是T细胞，但更优选是B细胞。对于心血管疾病，不需要的细胞可能代表着动脉粥样病变内的细胞，例如巨噬细胞。对于退行性疾病，不需要的细胞可能代表着诱导神经退行性变化的细胞，例如在阿尔茨海默病中它们可能是小胶质细胞或星形胶质细胞。对于其他退行性疾病，促进退化或细胞凋亡的过程的任何细胞可被视为靶标。对于建立有害的组织如老化过程，例如在良性前列腺增生中，非恶性前列腺组织将是优选靶标。对于过敏性疾病，参与过敏反应的细胞如组织肥大细胞可被视为理想的靶标，但也可能是IgE分泌细胞如浆细胞或B细胞。在移植中，同种异体反应性淋巴细胞将代表着优选的靶细胞。在感染性疾病的情形下，任何带有病毒、细菌或真菌病原体的细胞可被视为优选的靶细胞，例如HIV感染细胞。
在一个实施方案中，不需要的细胞不是抗原呈递细胞，例如具有交叉呈递能力的专业抗原呈递细胞。
在另一个实施方案中，不需要的细胞不是癌细胞。
选择性裂解
“呈环化形式的T细胞抗原肽不能够诱发T细胞反应”包括如下含义：当包含在环肽内时，在选择性裂解环肽内的一个或多个裂解位点之前，T细胞抗原肽不能诱发T细胞反应。例如，所述T细胞抗原肽当包含在环肽内时可能无法结合至MHC分子和/或所述T细胞抗原肽可能无法被T细胞受体识别。可以通过使已知对T细胞抗原肽具反应性的分离T细胞(例如从受试者分离的外周单核血细胞)与含有所述T细胞抗原肽的环肽接触并且使用本领域中已知的标准细胞增殖测定法来评估所述T细胞抗原肽是否能够诱发T细胞反应。
“通过选择性裂解环肽中的一个或多个裂解位点使得T细胞抗原肽能够诱发T细胞反应”包括如下含义：在选择性裂解环肽中的一个或多个裂解位点之后，所述T细胞抗原肽现在能够诱发T细胞反应。例如，一个或多个裂解位点的裂解可线性化T细胞抗原肽以使得它现在能够诱发T细胞反应。所述裂解可允许T细胞抗原肽结合至MHC分子和/或被T细胞受体识别，而先前它不能这样。因此，可以通过如上所述在裂解之前和之后评估T细胞反应的存在来确定裂解是否使得T细胞抗原肽能够诱发T细胞反应。
应理解，环肽中的一个或多个裂解位点的裂解可简单地线性化先前环化的T细胞抗原肽，或导致T细胞抗原肽从环肽脱离。例如，一个或多个裂解位点的裂解可从环状结构释放T细胞抗原肽以使得它可自由地诱发T细胞免疫反应。
在一个实施方案中，包含T细胞抗原肽的环肽可为由以环状构型布置的肽T细胞抗原肽组成的环肽。通过以环状构型布置，T细胞抗原肽不能够诱发T细胞反应(例如它可能无法结合于MHC分子和/或无法被T细胞受体识别)。然而，在选择性裂解环肽中的一个或多个裂解位点后，T细胞抗原肽从环状形式转化成线性形式。
在另一个实施方案中，包含T细胞抗原肽的环肽可为含有T细胞抗原肽和一个或多个其他部分(例如连接子部分)以形成环结构的环肽。在这种情况下，选择性裂解环肽中的一个或多个裂解位点可从一个或多个其他部分释放T细胞抗原肽。例如，T细胞抗原肽可能侧接两个裂解位点并且其裂解导致T细胞抗原肽与一个或多个其他部分脱离。可选地，选择性裂解环肽中的一个或多个裂解位点可能打开环结构而T细胞抗原肽不会与一个或多个其他部分脱离。然而，在每种情况下，一个或多个裂解位点的选择性裂解必须能够使得T细胞抗原肽能够诱发T细胞反应。对于较大的连接基团，优选的是，在选择性裂解后，T细胞抗原肽从它们完全脱离。
“选择性裂解”包括如下含义：裂解位点仅可在选择条件下裂解。换句话说，一个或多个裂解位点可在受控条件下以定向方式裂解。例如，一个或多个裂解位点可为被特定酶识别者(例如识别特定肽序列的蛋白酶)并且其裂解是通过选择性酶促裂解。
优选地，选择性裂解使得一个或多个裂解位点仅在不需要的细胞附近被裂解。换句话说，一个或多个裂解位点可在不需要的细胞附近选择性裂解。
“可在不需要的细胞附近选择性裂解的裂解位点”包括如下含义：仅可以被选择性地处于不需要的细胞附近的分子裂解的位点，以使得T细胞抗原肽能够诱发T细胞反应。优选地，裂解裂解位点的分子在相比于不需要的细胞附近外部的分子浓度至少五倍或十倍的浓度下并且更优选地在至少100或500或1000倍的浓度下处于不需要的细胞附近。最优选地，裂解裂解位点的分子仅存在于不需要的细胞附近。例如，当不需要的细胞是特定肿瘤细胞(例如乳房肿瘤细胞)时，裂解位点可能是被选择性处于特定肿瘤(例如乳房肿瘤)中的分子所裂解者，但所述分子不处于特定肿瘤(例如乳房肿瘤)附近的外部。
应理解，如果正常细胞可以在功能上被其他治疗方法代替或者如果它们不是生命所必需的，则可耐受在所述正常细胞附近的一个或多个裂解位点的选择性裂解(并且因此使得T细胞抗原肽能够诱发T细胞反应)。因此，不排除在癌细胞附近以及例如在内分泌组织或器官附近发生的一个或多个裂解位点的选择性裂解。在这种情况下，本发明药剂用于重定向免疫反应至不需要的细胞和可以在功能上被治疗方法代替的其他细胞。在例如拯救生命的情形下，可牺牲组织或器官，只要其功能不是生命所必需的，例如在睾丸、前列腺或胰腺的情况下，或者可被激素替代疗法提供。这些考虑将适用于例如甲状腺、甲状旁腺、肾上腺皮质和卵巢。由此可见，相比于需要的细胞，在不需要的细胞附近的一个或多个裂解位点可能是可选择性裂解的，其中所述不需要的细胞可包括其在宿主中的存在是不合需要的细胞和任选地其在宿主中的存在是需要的但其存在可以在功能上被治疗方法代替的细胞。
“在细胞附近”包括如下含义：在细胞表面处或附近，或两者，或者在直接围绕细胞的环境中例如血液、淋巴和其他体液。在一个特别优选的实施方案中，在不需要的细胞外部、在其表面处或附近的一个或多个裂解位点被选择性裂解，以使得T细胞抗原肽可由不需要的细胞呈递至T细胞而无需被内化。
在不需要的细胞附近的一个或多个裂解位点被选择性裂解，以使得T细胞抗原肽优先被不需要的细胞而非被需要的细胞呈递。因此，优选的是，一个或多个裂解位点是被选择性裂解的位点，以使得T细胞抗原肽能够诱发T细胞反应，在不需要的细胞附近(例如在细胞表面处或附近)的裂解程度是其在需要的细胞附近裂解程度的至少五倍或十倍，并且更优选地至少100或500或1000倍。最优选地，在需要的细胞附近的一个或多个裂解位点不被裂解，并且因此使得T细胞抗原肽不能够在需要的细胞附近诱发T细胞反应。
对于给定的不需要的细胞，使用本领域中的公认方法，本领域技术人员将能够鉴定在不需要的细胞附近可选择性裂解的适当裂解位点。例如，可以通过咨询肽文库并且研究裂解后的片段化分布的MS分析来评估哪种蛋白酶裂解哪种肽。此外，可以如下文进一步描述来检索蛋白酶裂解基序和肽裂解数据的出版文献。还可分析基因表达和蛋白质组学数据以鉴定哪些蛋白酶被特定不需要的细胞表达。
由于在不需要的细胞附近一个或多个裂解位点是可选择性裂解的，因此选择性地使得T细胞抗原肽能够在不需要的细胞附近诱发T细胞反应。本发明人认为，这允许不需要的细胞将T细胞抗原肽呈递至T细胞，从而将现有免疫反应重定向至不需要的细胞。
在一个优选的实施方案中，一个或多个裂解位点是在不需要的细胞附近和在不需要的细胞外部，例如在细胞表面处裂解的位点。以这种方式，使得T细胞抗原肽能够在细胞的外表面附近诱发T细胞反应(例如通过能够结合至MHC分子和/或能够被T细胞受体识别)并且可以直接呈递至T细胞，而无需被内化并参加适当加工途径。因此，本发明包括一种用于预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状的药剂，所述药剂包含含有T细胞抗原肽的环肽，其中呈环化形式的所述T细胞抗原肽不能诱发T细胞反应，并且其中通过在不需要的细胞附近和外部选择性裂解环肽中的一个或多个裂解位点使得所述T细胞能够诱发T细胞反应。优选地，T细胞抗原肽是不产生对于所述抗原的新的初级T细胞反应而是在受试者中诱发现有T细胞反应者。
然而，本发明人也认为，可使得T细胞抗原肽能够在细胞内部诱发T细胞反应，而无需进行经典的抗原加工。因此，应理解，一个或多个裂解位点无需在细胞表面处裂解，但可在细胞内裂解，例如经由受体循环途径或在近膜隔室如囊泡(例如胞饮囊泡)中。
一个或多个裂解位点可能是可被酶如蛋白酶、核酸酶、脂肪酶、裂解酶、磷酸酶或糖酶中的任一种选择性裂解的位点，其可能被膜结合或可能不被膜结合。因此，通过一个或多个酶促裂解位点的选择性酶促裂解可使得T细胞能够诱发T细胞反应。
优选地，所述裂解位点是蛋白酶裂解位点(例如处在环肽内的T细胞抗原肽内或肽连接部分内的裂解位点)。因此，当不需要的细胞是肿瘤细胞时，一个或多个裂解位点可被处在肿瘤细胞附近的蛋白酶选择性裂解。换句话说，一个或多个蛋白酶裂解位点可能是可通过肿瘤相关蛋白酶裂解的位点。众所周知，在肿瘤发展期间，肿瘤异常地表达蛋白酶，这允许它们侵入局部组织并最终发生转移。
蛋白酶可包括半胱氨酸蛋白酶(包括组织蛋白酶家族B、L、S等)、天冬氨酰基蛋白酶(包括组织蛋白酶D和E)和丝氨酸蛋白酶(包括组织蛋白酶A和G、凝血酶、纤溶酶、尿激酶、组织纤溶酶原激活剂)中的任一种。所述蛋白酶可为金属蛋白酶(MMP1-28)，包括膜结合(MMP14-17和MMP24-25)和分泌形式(MMP1-13和MMP18-23和MMP26-28)。所述蛋白酶可能属于蛋白酶的去整合素和金属蛋白酶(ADisintegrinandMetalloproteinase，ADAM)和去整合素或金属蛋白酶与凝血栓蛋白基序(ADisintegrin，orMetalloproteinasewithThrombospondinMotifs，ADAMTS)家族。其他实例包括CD10(CALLA)和前列腺特异性抗原(PSA)。应理解，蛋白酶可能是或可能不是膜结合的。
蛋白酶裂解位点是科学文献中众所周知的，并且包含这些裂解位点的连接子序列可以使用公认基因工程技术或通过本领域中已知的合成性合成技术容易地构建。这些连接子序列可用于将T细胞抗原肽构型成如下文进一步描述的环肽。
蛋白酶裂解位点可能是可通过下表4中列出的任何蛋白酶裂解的位点，其指示所选蛋白酶在各种肿瘤类型中的表达。提供蛋白酶的候选底物。因此，为了治疗特定肿瘤类型，本领域技术人员通常将选择可被已知在所述肿瘤类型中高度表达的蛋白酶选择性裂解的一个或多个蛋白酶裂解位点，如从表格中可见。例如，为了治疗乳腺癌，优选使用可被uPA、tPA、蛋白裂解酶、蛋白裂解酶2、组织蛋白酶K、组织蛋白酶O、MMP1、MMP2、MMP3、MMP11、MMP12、MMP17、ADAM9、ADAM12、ADAM15、ADAM17、ADAM28或ADAMTS15等中的任一种裂解的一个或多个蛋白酶裂解位点。
类似地，表5列出其中已报道ADAM蛋白酶过度表达的肿瘤位点，并且因此在一个实施方案中，一个或多个裂解位点是可被表5中列出的ADAM蛋白酶之一选择性裂解的位点。因此，所述药剂可用于预防或治疗相应的肿瘤类型。
裂解位点可被以下人类蛋白酶(圆括号中提供的MEROPS肽酶数据库编号；RawlingsN.D.，MortonF.R.，Kok，C.Y.，Kong，J.和BarrettA.J.(2008)MEROPS：thepeptidasedatabase.核酸研究(NucleicAcidsRes.)36Databaseissue，D320-325)中的任一种选择性裂解：胃蛋白酶A(MER000885)、胃亚蛋白酶(MER000894)、memapsin-2(MER005870)、血管紧张肽原酶(MER000917)、组织蛋白酶D(MER000911)、组织蛋白酶E(MER000944)、memapsin-1(MER005534)、天冬氨酸肽酶A(MER004981)、Mername-AA034肽酶(MER014038)、胃蛋白酶A4(MER037290)、胃蛋白酶A5(智人)(MER037291)、hCG1733572(智人)型假定肽酶(MER107386)、天冬氨酸肽酶B假基因(MER004982)、CYMPg.P.(智人)(MER002929)、A1A亚家族未指定肽酶(MER181559)、小鼠乳腺肿瘤病毒逆转录胃蛋白酶(MER048030)、兔内源性逆转录病毒内肽酶(MER043650)、S71相关人类内源性逆转录胃蛋白酶(MER001812)、RTVL-H型假定肽酶(MER047117)、RTVL-H型假定肽酶(MER047133)、RTVL-H型假定肽酶(MER047160)、RTVL-H型假定肽酶(MER047206)、RTVL-H型假定肽酶(MER047253)、RTVL-H型假定肽酶(MER047260)、RTVL-H型假定肽酶(MER047291)、RTVL-H型假定肽酶(MER047418)、RTVL-H型假定肽酶(MER047440)、RTVL-H型假定肽酶(MER047479)、RTVL-H型假定肽酶(MER047559)、RTVL-H型假定肽酶(MER047583)、RTVL-H型假定肽酶(MER015446)、人类内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶同源物1(MER015479)、人类内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶同源物2(MER015481)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因1(智人染色体14)(MER029977)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因2(智人染色体8)(MER029665)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因3(智人染色体17)(MER002660)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因3(智人染色体17)(MER030286)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因3(智人染色体17)(MER047144)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因5(智人染色体12)(MER029664)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因6(智人染色体7)(MER002094)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因7(智人染色体6)(MER029776)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因8(智人染色体Y)(MER030291)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因9(智人染色体19)(MER029680)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因10(智人染色体12)(MER002848)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因11(智人染色体17)(MER004378)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因12(智人染色体11)(MER003344)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因13(智人染色体2和类似的)(MER029779)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因14(智人染色体2)(MER029778)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因15(智人染色体4)(MER047158)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因15(智人染色体4)(MER047332)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因15(智人染色体4)(MER003182)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因16(MER047165)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因16(MER047178)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因16(MER047200)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因16(MER047315)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因16(MER047405)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因16(MER030292)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因17(智人染色体8)(MER005305)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因18(智人染色体4)(MER030288)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因19(智人染色体16)(MER001740)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因21(智人)(MER047222)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因21(智人)(MER047454)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因21(智人)(MER047477)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因21(智人)(MER004403)、内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因22(智人染色体X)(MER030287)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047046)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047052)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047076)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047080)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047088)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047089)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047091)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047092)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047093)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047094)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047097)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047099)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047101)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047102)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047107)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047108)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047109)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047110)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047111)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047114)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047118)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047121)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047122)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047126)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047129)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047130)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047134)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047135)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047137)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047140)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047141)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047142)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047148)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047149)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047151)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047154)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047155)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047156)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047157)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047159)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047161)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047163)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047166)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047171)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047173)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047174)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047179)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047183)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047186)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047190)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047191)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047196)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047198)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047199)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047201)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047202)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047203)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047204)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047205)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047207)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047208)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047210)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047211)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047212)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047213)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047215)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047216)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047218)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047219)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047221)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047224)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047225)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047226)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047227)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047230)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047232)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047233)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047234)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047236)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047238)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047239)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047240)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047242)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047243)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047249)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047251)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047252)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047254)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047255)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047263)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047265)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047266)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047267)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047268)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047269)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047272)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047273)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047274)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047275)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047276)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047279)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047280)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047281)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047282)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047284)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047285)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047289)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047290)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047294)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047295)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047298)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047300)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047302)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047304)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047305)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047306)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047307)、A2A亚家族非肽酶同源物(MER047310)、A2A亚家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特别优选的蛋白酶裂解位点包括组织蛋白酶B裂解位点(例如含有缬氨酸-瓜氨酸键或序列如V-R、F-K和V-A的其他类似迭代的那些，例如，如Choe等(生物化学杂志(JBiolChem)5(281)：12824-32)，其以引用的方式并入)中进一步描述)；基质金属蛋白酶2裂解位点(例如AIPVSLR；SEQIDNo：275)和基质金属蛋白酶14(膜类型1)裂解位点(例如PRSAKELR；SEQIDNo：276)。
应理解，对于给定不需要的细胞类型，本领域技术人员可容易地确定适于使用的蛋白酶裂解位点，例如通过咨询科学文献以确定所述细胞类型过度表达哪些蛋白酶。Oncomine(https：//www.oncomine.org)是一个在线癌基因表达数据库，并且因此当本发明药剂是用于治疗癌症时，本领域技术人员可检索Oncomine数据库以鉴定将适于治疗给定癌症类型的特定蛋白酶裂解位点。可选的数据库包括欧洲生物信息研究所(http：//www.ebi.ac.uk)，特别是(http：//www.ebi.ac.uk/gxa)。蛋白酶数据库包括PMAP(http：//www.proteolysis.org)、ExPASyPeptideCutter(http：//ca.expasy.org/tools/peptidecutter)和PMAP.CutDB(http：//cutdb.burnham.org)。
应注意到，可能需要筛选并有多个潜在裂解位点的肽的文库并评估对于给定不需要的细胞(例如肿瘤)的最佳裂解位点。这类肽可用作连接子以接合T细胞抗原肽与如下文所讨论的靶向部分。
表5：其中已报道ADAM过度表达的肿瘤位点
蛋白质肿瘤表达
ADAMS脑、肾、肺、胰腺
ADAM9乳腺、胃、肝、肺、胰腺、前列腺
ADAM10结肠、胃、白血病、前列腺、子宫、卵巢
ADAM12膀胱、脑、乳腺、结肠、胃、肝
ADAM15乳腺、胃、肺、前列腺
ADAM17脑、乳腺、结肠、胃、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、前列腺
ADAM19脑、肾
ADAM28乳腺、肾、肺
已经在癌症中检测到多种蛋白水解ADAM(去整合素和金属蛋白酶)并且已发现mRNA或蛋白质水平相对于正常组织上调(改编自癌症自然评论(NatureReviewsCancer)8，932-941(2008年12月)|doi：10.1038/nrc2459)。
在一个实施方案中，裂解位点是可被酯酶裂解的位点。
其他裂解位点包括在不需要的细胞附近在特定条件(例如肿瘤微环境)下不稳定的键。例如，裂解位点可包含二硫键，其可以在低氧肿瘤微环境中被还原，或者可包含在酸性条件下断裂的pH敏感性部分。然而，应理解，所述裂解位点必须是在不需要的细胞附近可选择性裂解的并且因此这些键必须更不稳定并且优选仅在不需要的细胞附近相比于在需要的细胞附近不稳定。
可选地，但不太优选地，裂解位点可包含在不需要的细胞附近(例如通过核酸酶)可选择性裂解的核酸(例如DNA或RNA)。其他不太优选的裂解位点包括可通过适当酶裂解的含磷酸酯、脂质或二硫化物的部分。
在一个实施方案中，环肽包含一个以上的可选择性裂解的裂解位点(例如一个以上的酶促裂解位点如蛋白酶裂解位点)。因此，环肽可包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个可选择性裂解的裂解位点(例如蛋白酶裂解位点)。
例如，包含T细胞抗原肽和一个或多个连接部分的环肽可含有位于一个或多个连接部分内的两个裂解位点，所述裂解位点在每一侧上侧接T细胞抗原肽。两个裂解位点的裂解将导致T细胞抗原肽与一个或多个连接部分脱离，从而使得T细胞抗原肽能够诱发T细胞反应。
在另一个实例中，环肽可包含多个T细胞抗原肽和一个或多个连接部分，其中多个裂解位点侧接多个T细胞抗原肽的每一侧。多个裂解位点的裂解将导致每个T细胞抗原肽与其他T细胞抗原肽和/或一个或多个连接部分脱离，从而使得每个T细胞抗原肽能够诱发T细胞反应。
当环肽含有多个裂解位点时，应理解，多个裂解位点(例如酶促裂解位点如蛋白酶裂解位点)可能是相同或不同的。所述环肽可含有两个或更多个不同的裂解位点例如两个或更多个不同的蛋白酶裂解位点，或者它可含有两个或更多个相同的裂解位点例如两个或更多个相同的蛋白酶裂解位点。在环肽内具有不同的可选择性裂解的裂解位点可用于在本发明药剂中额外赋予特异性。例如，如果所述药剂是用于治疗特定肿瘤，则所述药剂可被设计成含有两个不同的裂解位点，其已知在所述特定肿瘤附近可选择性裂解(例如两个不同的蛋白酶裂解位点，其被已知在所述肿瘤类型中高度表达的蛋白酶选择性裂解)。
在一个实施方案中，所述环肽包含氨基酸序列FR～GGANLVPMVATVAA(SEQIDNo：278)，其中加有下划线的残基代表T细胞抗原肽，其余残基对应于包含裂解位点的肽连接子，并且‘～’代表易断裂键。
虽然，本发明人已发现，通过在环肽内呈递T细胞抗原肽，靶向部分未必将本发明药剂定向不需要的细胞，然而仍可能需要并入这种部分，例如以进一步改进作用特异性。因此，在一个实施方案中，本发明药剂还包含靶向部分。应理解，这可能在环肽本身的环状结构内(例如环化肽链内的靶向肽)，或者连接至环肽。
靶向部分
‘靶向部分’包括如下含义：能够靶向不需要的细胞的任何部分。优选地，所述靶向部分能够选择性靶向不需要的细胞。例如，优选的是靶向部分靶向不需要的细胞的程度大于其靶向正常细胞的程度，并且最优选地仅靶向不需要的细胞。
应理解，如果它们可在功能上被其他治疗方法代替或者如果它们不是生命所必需的，则可耐受靶向部分与正常细胞的结合。因此，不排除靶向癌细胞以及例如内分泌组织或器官的靶向部分。在这种情况下，所述靶向部分用于将免疫反应重定向至不需要的细胞和可以在功能上被治疗方法代替的其他细胞，如上文先前所述。
此外，应理解，由于药剂中的一个或多个裂解位点在使得T细胞抗原肽能够诱发T细胞反应的地方赋予特异性，因此还可耐受在一个或多个裂解位点不被裂解的地方附近靶向部分结合至正常细胞。
然而，最优选地，相比于任何其他细胞，靶向部分选择性地靶向不需要的细胞。
在一个实施方案中，所述靶向部分是由不需要的细胞表达或与不需要的细胞相关的实体的特异性结合搭配物。通常，所表达的实体在不需要的细胞上选择性地表达。例如，在不需要的细胞上，相比于在有待治疗的身体内的其他细胞上，所表达实体的丰度通常是10或100或500或1000或5000或10000倍。然而，如上所述，所述裂解位点在使得T细胞抗原肽能够诱发T细胞反应的地方上提供额外特异性并且因此结合搭配物可结合在不需要的细胞上相对于身体内的其他细胞类似地或甚至不足表达的实体。
“结合搭配物”包括如下含义：结合至由特定细胞表达的实体的分子。优选地，所述结合搭配物选择性地结合至所述实体。例如，优选的是，所述结合搭配物相比于由另一种细胞(例如正常细胞类型)表达的至少一种其他实体具有低至少五倍或十倍(即更高亲和力)并且优选地低100倍或500倍以上的Kd值(解离常数)。更优选地，所述实体的结合搭配物相比于由另一种细胞(例如正常细胞类型)表达的至少一种其他实体具有低1000或5000倍以上的Kd值。可以容易地使用本领域中众所周知的方法来确定Kd值。然而，如上文所讨论，应理解，所述结合搭配物可选择性结合至由不需要的细胞和由正常细胞表达的实体，只要所述正常细胞可在功能上被代替或者不是生命所必需的。例如，在淋巴瘤中，抗CD20(其靶向所有B细胞)是非常有效的并且杀死所有健康和恶性的B细胞。然而，这是可以耐受的，因为B细胞对健康不是至关重要的。此外，在黑素瘤、淋巴瘤、前列腺癌、甲状腺癌、睾丸或卵巢癌的情况下，靶向健康的对应组织也将是耐受的。
通常，结合搭配物是在不需要的细胞中或其上相比于在宿主的任何正常细胞中以显著更大浓度结合于所存在或可接近结合搭配物的实体者。因此，所述结合搭配物可结合至相比于正常细胞上以显著更高量表达的不需要的细胞上的表面分子或抗原。类似地，所述结合搭配物可相比于正常细胞在更大程度上结合至已经由不需要的细胞分泌至胞外液中的实体。例如，所述结合搭配物可结合至在细胞膜上表达或者已经分泌至肿瘤胞外液中的肿瘤相关抗原。
所述靶向部分可为多肽、肽、小分子或肽模拟物中的任一种。
在一个优选的实施方案中，所述靶向部分是可以并入构成本发明环肽的肽链中的肽。所述肽可以是在不需要的细胞中或其上相比于在宿主的任何正常细胞中以显著更大浓度结合于所存在或可接近于肽的实体者。例如，所述肽可为受体结合肽(例如EGFR结合肽或Her2结合肽)或具有含叶酸残基的肽。
在一个不太优选的实施方案中，所述靶向部分是结合至由不需要的细胞表达的抗原的抗体。合适的抗体靶标(圆括号中是不需要细胞类型的实例)包括：Her2/Neu(上皮恶性疾病)；CD22(B细胞，自身免疫性或恶性)；EpCAM(CD326)(上皮恶性疾病)；EGFR(上皮恶性疾病)；PMSA(前列腺癌)；CD30(B细胞恶性疾病)；CD20(B细胞，自身免疫性、过敏性或恶性)；CD33(骨髓恶性疾病)；膜IgE(过敏性B细胞)；IgE受体(CD23)(过敏性疾病中的肥大细胞或B细胞)、CD80(B细胞，自身免疫性、过敏性或恶性)；CD86(B细胞，自身免疫性、过敏性或恶性)；CD2(T细胞或NK细胞淋巴瘤)；CA125(多种癌症，包括卵巢癌)；碳酸酐酶IX(多种癌症，包括肾细胞癌)；CD70(B细胞，自身免疫性、过敏性或恶性)；CD74(B细胞，自身免疫性、过敏性或恶性)；CD56(T细胞或NK细胞淋巴瘤)；CD40(B细胞，自身免疫性、过敏性或恶性)；CD19(B细胞，自身免疫性、过敏性或恶性)；c-met/HGFR(胃肠道和肝脏恶性疾病)；TRAIL-R1(多种恶性疾病，包括卵巢癌和结肠直肠癌)；DR5(多种恶性疾病，包括卵巢癌和结肠直肠癌)；PD-1(B细胞，自身免疫性、过敏性或恶性)；PD1L(多种恶性疾病，包括上皮腺癌)；IGF-1R(大多数恶性疾病，包括上皮腺癌)；VEGF-R2(与大多数恶性疾病(包括上皮腺癌)相关的脉管系统)；前列腺干细胞抗原(PSCA)(前列腺腺癌)；MUC1(上皮恶性疾病)；CanAg(肿瘤，例如结肠和胰腺癌)；间皮素(许多肿瘤，包括间皮瘤和卵巢和胰腺癌)；P-钙粘蛋白(上皮恶性疾病，包括乳腺癌)；肌肉生长抑制素(GDF8)(许多肿瘤，包括肉瘤和卵巢和胰腺癌)；Cripto(TDGF1)(上皮恶性疾病，包括结肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和胰腺癌)；ACVRL1/ALK1(多种恶性疾病，包括白血病和淋巴瘤)；MUC5AC(上皮恶性疾病，包括乳腺癌)；CEACAM(上皮恶性疾病，包括乳腺癌)；CD137(B细胞或T细胞，自身免疫性、过敏性或恶性)；CXCR4(B细胞或T细胞，自身免疫性、过敏性或恶性)；神经纤毛蛋白1(上皮恶性疾病，包括肺癌)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖(多种癌症，包括肝癌、脑癌和乳腺癌)；HER3/EGFR(上皮恶性疾病)；PDGFRa(上皮恶性疾病)；EphA2(多种癌症，包括神经母细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌和小细胞肺癌)；和CD138(骨髓瘤)。
抗体的实例包括抗表皮生长因子受体抗体如西妥昔单抗(Cetuximab)、抗Her2抗体、抗CD20抗体如利妥昔单抗(Rituximab)、抗CD22抗体如伊珠单抗(Inotuzumab)、抗CD70抗体、抗CD33抗体如hp67.6或吉妥珠单抗(Gemtuzumab)、抗MUC1抗体如GP1.4和SM3、抗CD40抗体、抗CD74抗体、抗P-钙粘蛋白抗体、抗EpCAM抗体、抗CD138抗体、抗E-钙粘蛋白抗体、抗CEA抗体和抗FGFR3抗体。
抗体可通过本领域中已知和本文所述的标准交联程序连接至环肽。
可被靶向部分靶向的肿瘤相关、免疫细胞相关和感染试剂相关抗原的实例给出于表1中。
表1：用于靶向的细胞表面抗原
a)肿瘤相关抗原
1 等，(1986)癌症研究(CancerRes.)46，3917-3923
2Clarke等，(1985)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82，1766-1770
其他抗原包括α甲胎蛋白、Ca-125和前列腺特异性抗原。
b)免疫细胞抗原
c)传染性病原体相关抗原
可选地，所述靶向部分可为在非免疫意义上特异性结合至由不需要的细胞表达的实体或以其他方式变得与不需要的细胞相关的任何化合物或其部分。因此，所述特异性结合搭配物可为激素、生长因子、细胞因子或受体配体(例如激动剂或拮抗剂)中的任一种。
例如，细胞因子先前已用于将毒素靶向侵入细菌。使用基因工程，已产生含有例如IL-2和结合结构域缺失的假单胞菌外毒素蛋白的重组蛋白(Lorderboum-Galski等，1988(62))。这种免疫毒素在实验动物模型中是有效的(Kozak等，1990(63))。此外已经产生与IL-4、IL-6、α-MSH、EGF和TNF-α的融合蛋白(评述于Waldmann1992(35)中)，其全部适合用作本发明中的靶向部分。
特别有用的靶向部分包括细胞因子如IL-2、EGF、VEGF、Flt3L、HGF、IGF、IL-6或IL-4。IL-2和IL-4可以靶向成人T细胞白血病/淋巴瘤细胞，其表达高亲和力IL-2受体，而正常的静息T细胞不会，或者靶向表达IL-4受体的T细胞。先前已表明，结合至人类IL-4受体的单克隆抗体MR6可以抑制IL-4诱导的克隆辅助T细胞增殖和多克隆B细胞的IgE产生(Larche等，1988(36))。这些靶向部分可用于消除自身免疫性疾病或过敏症中的淋巴样细胞亚群。
胰岛素样生长因子(IGF-1和IGF-11)优先被恶性细胞溶解并且因此可用于靶向肿瘤细胞。类似地，EGF可用于靶向上调EGF受体的恶性细胞。此外，肿瘤相关血管过度表达VEGF受体并且因此可被VEGF生长因子家族靶向。
Flt3受体在白血病中过度表达并且可为用于急性和慢性白血病和骨髓增生性病症的治疗靶标。
骨髓瘤细胞表达IL-6受体并且还分泌IL-6，IL-6以自分泌方式作用以刺激细胞增殖。因此，IL-6可用作骨髓瘤的靶向部分。
在另一个实例中，所述靶向部分是黑素瘤刺激素(MSH)，其结合至以高数量在黑素瘤细胞中表达的MSH受体。
应理解，本领域技术人员可以容易地选择适于任何给定的不需要的细胞的结合搭配物，例如通过鉴定对所述不需要的细胞具特异性的表面抗原或分子并找出所述抗原或分子的结合搭配物。如上所述，已经关于肿瘤相关抗原、免疫细胞抗原和传染性病原体的抗体和其片段进行了相当多的研究。因此，适宜地，选择给定细胞类型的适当靶向部分通常涉及检索文献。可选地，从患者获取不需要的细胞(例如通过活检)，并且制备针对所述细胞的抗体。这些“量身定制的”抗体是已知的。已经证实，抗体赋予结合至肿瘤细胞，所述肿瘤细胞不仅来自已获得其的患者，而且来自大量的其他患者。因此，多种这类抗体已变得可购得。鉴定适于给定的不需要细胞的结合搭配物的其他方法包括遗传方法(例如微阵列)、蛋白质组学方法(例如差分质谱法)、免疫学方法(例如免疫化具有肿瘤细胞的动物并鉴定特异性靶向恶性细胞的分泌抗体的克隆)和计算机模拟方法，其中使用系统生物学方法鉴定靶标。
其他选择性靶标和合适的结合搭配物示于表2中。
表2：肿瘤选择性靶标和肿瘤相关抗原的结合搭配物
下文提供可用于预防或治疗各种癌症的其他靶标。
下文提供可用于预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的各种病状的其他选择性靶标。对于下文所有实施例，治疗性抗体已经获得或可由本领域技术人员容易地制备。
如本文所用，术语“抗体”包括(但不限于)多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fab片段、由Fab表达文库和双特异性抗体产生的片段。这些片段包括保留对靶物质的结合活性的完整抗体的片段，Fv、F(ab′)和F(ab′)2片段，以及单链抗体(scFv)，包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白和其他合成蛋白。由于优化从血液的清除率，仅包含抗体一部分的靶向部分可能是有利的，并且由于Fc部分而可能会不太可能经受非特异性结合。此外包括结构域抗体(dAb)、双功能抗体、骆驼抗体和工程改造的骆驼抗体。此外，对于施用至人类，抗体和其片段可为本领域中现在众所周知的人源化抗体(Janeway等，(2001)免疫生物学(Immunobiology.)，第5版，GarlandPublishing)；An等，(2009)治疗性单克隆抗体(TherapeuticMonoclonalAntibodies)：FromBenchtoClinic，ISBN：978-0-470-11791-0)。
此外包括不对称的IgG样抗体(例如三功能单抗/四功能单抗，TrionPharma/FreseniusBiotech；杵臼(knobs-into-holes)，Genentech；交叉MAb，Roche；静电匹配的抗体，AMGEN；LUZ-Y，Genentech；链交换工程改造结构域(SEED)体，EMDSerono；biolonic，Merus；和Fab交换抗体，Genmab)、对称IgG样抗体(例如双靶向(DT)-Ig，GSK/Domantis；二合一抗体，Genentech；交联MAb，karmanos癌症中心；mAb2，F-star；和CovX体，CovX/Pfizer)、IgG融合(例如双可变结构域(DVD)-Ig，Abbott；IgG样双特异性抗体，EliLilly；Ts2Ab，Medimmune/AZ；BsAb，ZymoGenetics；HERCULES，BiogenIdec；TvAb，Roche)、Fc融合(例如ScFv/Fc融合，AcademicInstitution；SCORPION，EmergentBioSolutions/Trubion，ZymoGenetics/BMS；双亲和力重靶向技术(Fc-DART)，MacroGenics；双重(ScFv)2-Fab，美国国家抗体医药研究中心(NationalResearchCenterforAntibodyMedicine))、Fab融合(例如F(ab)2，Medarex/AMGEN；双重作用或双Fab，Genentech；Dock-and-Lock(DNL)，ImmunoMedics；二价双特异性，Biotechnol；和Fab-Fv，UCB-Celltech)、基于ScFv和基于双功能抗体的抗体(例如双特异性T细胞参与者(BiTE)，Micromet；串联双功能抗体(Tandab)，Affimed；DART，MacroGenics；单链双功能抗体，Academic；TCR样抗体，AIT，ReceptorLogics；人类血清白蛋白ScFv融合，Merrimack；和COMBODIES，EpigenBiotech)、IgG/非IgG融合(例如免疫细胞因子，EMDSerono、Philogen、ImmunGene、ImmunoMedics；超抗原融合蛋白，ActiveBiotech；和抗癌的免疫动员mTCR，ImmTAC)和寡克隆抗体(例如Symphogen和Merus)。
所述抗体可具有由以引用的方式并入本文的Carter(2006)“Potentantibodytherapeuticsbydesign”，自然免疫学评论(NatRevImmunol.)6(5)：343-57和Carter(2011)“Introductiontocurrentandfutureproteintherapeutics：aproteinengineeringperspective”，实验细胞研究(ExpCellRes.)317(9)：1261-9所述的任何抗体样骨架，以及本文所述的特异性决定区。因此，术语“抗体”还包括亲和体和基于非免疫球蛋白的框架。实例包括阿德奈汀(adnectin)、安替卡林(anticalin)、阿非林(affilin)、反式体(trans-bodies)、锚蛋白重复蛋白(darpin)、三聚体X、微蛋白、菲诺体(fynomer)、高亲和性多聚体(avimer)、centgrins和kalbitor(艾卡拉肽(ecallantide))。
使用抗体片段而非完整抗体的优点是若干倍。较小尺寸的片段可导致改进的药理学特性，例如实体组织的更好渗透。此外，抗原结合片段如Fab、Fv、ScFv和dAb抗体片段可在大肠杆菌或酵母中表达并从其中分泌，因此允许在实验室中方便的产生和在商业规模上经济的产生。
所述抗体可为IgG、IgE、IgA、IgM和IgD种类中的任一种并且可源自任何物种。如果抗体是IgG，则它可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任一种。然而，优选的是，当药剂用于施用至特定宿主时，抗体或至少其恒定区源自所述宿主。例如，当所述药剂被施用至人类时，抗体优选是人类抗体或人源化抗体等。
本领域技术人员可以使用本领域中长期建立的技术来制造结合至由不需要的细胞表达的特定抗原的合适抗体。制备单克隆抗体和抗体片段的方法是本领域中众所周知的并且包括杂交瘤技术(Kohler和Milstein(1975)“Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity.自然(Nature)256：495-497)；抗体噬菌体展示(Winter等，(1994)“Makingantibodiesbyphagedisplaytechnology.”免疫学年评(Annu.Rev.Immunol.)12：433-455)；核糖体展示(Schaffitzel等，(1999)“Ribosomedisplay：aninvitromethodforselectionandevolutionofantibodiesfromlibraries.”免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)231：119-135)；和迭代菌落过滤筛选(Giovannoni等，(2001)“Isolationofanti-angiogenesisantibodiesfromalargecombinatorialrepertoirebycolonyfilterscreening.”核酸研究(NucleicAcidsRes.)29：E27)。此外，适用于本发明中的抗体和抗体片段描述于例如以下出版物中：“MonoclonalHybridomaAntibodies：TechniquesandApplication”、Hurrell(CRCPress，1982)；“MonoclonalAntibodies：AManualofTechniques”，H.Zola，CRCPress，1987，ISBN：0-84936-476-0；“Antibodies：ALaboratoryManual”第1版，Harlow和Lane编，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork，1988.ISBN0-87969-314-2；“UsingAntibodies：ALaboratoryManual”第2版，Harlow和Lane编，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork，1999.ISBN0-87969-543-9；和“HandbookofTherapeuticAntibodies”StefanDübel编，第1版，-Wiley-VCH，Weinheim，2007.ISBN：3-527-31453-9。
在另一个实施方案中，所述靶向部分可为核酸分子(例如DNA或RNA)。例如，所述靶向部分可为结合至特异性靶标分子的核酸适配体。
作为双特异性结合搭配物的靶向部分的替代，所述靶向部分可能是在施用至受试者后能够积累在不需要的细胞附近的非特异性分子。例如，已知大分子非特异性地积累在肿瘤中。已知非特异性地积累在肿瘤中的大分子包括白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白、脂质体、纳米粒子(例如胶体纳米粒子)和可生物降解的聚合物，包括葡聚糖、聚乙二醇、聚赖氨酸和羟丙基甲基丙烯酰胺。大分子以每克肿瘤至多约2.0％的施用剂量积累在裸小鼠中的人类异种移植肿瘤中。已发现大分子如聚乙二醇和葡聚糖改变其所连接物质的清除率和改变其在肿瘤中的浓度(Melton等，1987；Eno-Ammoquaye等，1996)。在特殊的肿瘤中，非特异性大分子相比于针对所分泌抗原的抗体以更大浓度积累(Searle等，1981)。
这些大分子积累在肿瘤中的发现被称为增强渗透滞留(EnhancedPermeabilityandRetention，EPR)效应，并且已被归因于肿瘤毛细血管泄漏和缺乏淋巴引流(Matsumura和Macda，1986)。
因此，当不需要的细胞是肿瘤细胞时，所述靶向部分可以是积累在肿瘤中的这些大分子中的任一种。优选地，本发明中使用的大分子是亲水性的并且特征在于可溶于体液中和用于肠胃外施用的常规流体中。适宜地，所述大分子是可生物降解的，因此避免了在重复施用期间的全身积累。但是很显然，它必须不被降解过快以致于无法积累在不需要的细胞(例如肿瘤)位点。优选地，包含这种大分子靶向部分的药剂的分子量和规模超过尿排泄的肾阈值(MW60000)，因为这有助于足以提供有效血液：肿瘤浓度梯度的血液浓度。高达至少800000的分子量通常是合适的，例如高达160000。所述大分子优选是不容易被网状内皮系统捕获者。给出的分子量排除任何水合水。
可以子单元获得并且不可生物降解的大分子可通过可生物降解的连接单元连接，以使得不可生物降解的组分过滤通过肾脏并排泄在尿液中。
可选地，优选的是用于制造大分子的聚合物是不可生物降解的，以使得结合物的任何不可生物降解部分的分子量应该小于肾阈值(大约70000)，因此在可生物降解部分降解后，残余的不可生物降解的部分通过肾脏排泄。
适宜地，大分子可为以下中的任一种：葡聚糖；聚氨基酸；纳米粒子(例如胶体纳米粒子)，或非肿瘤特异性蛋白如免疫球蛋白、白蛋白或转铁蛋白。适宜地，它可能是苯乙烯和马来酸酐的共聚物，或者可能是聚天冬氨酸、聚L-赖氨酸、聚乙烯亚胺或聚乙二醇。
应理解，这些大分子被用于如WO1998/024478中所述的黑素细胞定向酶前药疗法(MDEPT)中。
除了靶向部分之外，应理解，其他分子可连接至本发明药剂或并入本发明药剂中。例如，本发明药剂可包含另一种治疗剂，其包括下文进一步描述的那些中的任一种。这种药剂的实例包括抗癌剂、抗发炎肽和蛋白酶抑制剂。所述药剂可包括细胞因子、趋化因子或佐剂。然而，应理解，并入环肽中的其他部分(例如靶向部分、其他治疗剂、细胞因子、趋化因子或佐剂)的尺寸越大，则所述环肽本身变得具免疫原性或者形成可防止酶(例如蛋白酶)接近一个或多个裂解位点的二级结构的可能性越大。因此，优选的是仅并入那些额外部分的活性区域(即负责所需作用的那些区域)。例如，包括细胞因子如IL-2的活性区域或趋化因子如CXCL9、10或11的活性区域可能是有利的，其已显示在抗病毒记忆T细胞迁移中是重要的。
在环肽包含T细胞抗原肽和任选地一个或多个连接部分(其为肽)和任选地肽靶向部分的一个实施方案中，应理解，所述一个或多个组分可为可由核酸分子编码的肽或多肽(例如融合肽或多肽)的一部分。本发明包括这种核酸分子和含有其的宿主细胞。例如，使用本领域中公认的遗传工程技术，可产生肽以含有T细胞抗原肽、任选地一个或多个连接肽(其可含有一个或多个可选择性裂解的裂解位点)和任选地肽靶向部分。适宜地，所述T细胞抗原肽和靶向肽接合以使得两个部分保持其相应活性以使得所述药剂可靶向不需要的细胞并且所述T细胞抗原肽可由不需要的细胞呈递以诱发免疫反应。所述T细胞抗原肽和靶向肽部分通常由连接肽接合，所述连接肽包含在如上所述不需要的细胞附近可选择性裂解的裂解位点。
编码合适的靶向部分的多聚核苷酸是本领域中已知的或者可以容易地从已知序列设计，例如从已知与在不需要的细胞上表达的表面标志物相互作用或包含在核苷酸序列数据库如GenBank、EMBL和dbEST数据库中的蛋白质序列设计。编码合适的T细胞抗原肽的多聚核苷酸是本领域中已知的或者可容易地从已知序列设计并制造。
编码合适的连接肽的多聚核苷酸可以容易地从连接肽序列设计并制造。
因此，编码本发明中使用的药剂的多聚核苷酸可以容易地使用众所周知的基因工程技术构建。
然后核酸在合适的宿主中表达以产生本发明的药剂。因此，编码本发明药剂的核酸可根据已知技术使用，鉴于本文所含的教导适当修改，以构建表达载体，然后将其用于转化适当的宿主细胞以表达和产生本发明的药剂。
应理解，编码本发明药剂的核酸可接合至广泛多种其他核酸序列以引入适当宿主中。如本领域中众所周知的，伴侣核酸将取决于宿主的性质、将核酸引入宿主中的方式，和是否需要游离基因维持或整合。
应理解，本发明药剂的任何肽部分可为肽“模拟物”，即模拟包含如本文所述的氨基酸序列或由如本文所述的氨基酸序列组成的肽的结构特征的肽模拟物。肽模拟物可能在治疗用途、抵抗降解、渗透性或可能的口服施用方面更有利。
如上所述，本发明人已发现，通过在环肽内呈递T细胞抗原肽，有可能省去靶向部分。因此，在本发明的一个实施方案中，所述药剂不包含如本文所述的靶向部分。
优选地，本发明药剂在37℃下具有至少2、3、4、5或6小时并且更优选地至少10、15、20或24小时的血浆半衰期。
可能需要改进本发明药剂以使得它可以更容易地检测，例如通过对其生物素化或通过并入本领域中已知的任何可检测标记如放射性标记、荧光标记或酶标记。
本发明的一个特别优选的实施方案提供一种用于预防或治疗癌症的药剂，所述药剂包含：包含T细胞抗原肽或由T细胞抗原肽组成的环肽；其中呈环化形式的所述T细胞抗原肽不能够诱发T细胞反应；并且其中通过选择性裂解癌症附近的环肽中的一个或多个裂解位点(例如酶促裂解位点如蛋白酶裂解位点)使得所述T细胞抗原肽能够诱发T细胞反应。
本发明的另一个优选的实施方案提供一种用于预防或治疗癌症的药剂，所述药剂包含：包含肽T细胞抗原肽或由肽T细胞抗原肽组成的环肽；其中呈环化形式的所述肽T细胞抗原肽不能诱发T细胞反应；并且其中通过选择性裂解癌症附近的环肽中的一个或多个蛋白酶裂解位点使得所述肽T细胞抗原肽能够诱发T细胞反应。
所述癌症可为任何癌症，例如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、肾癌、黑素瘤、肺癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、脑癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肝癌、白血病、骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、急性骨髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴母细胞性白血病、淋巴增殖性病症、骨髓增生异常病症、骨髓增生性疾病、肉瘤、畸胎瘤、脑膜瘤、胶质母细胞瘤、头颈癌、皮肤癌、肾上腺癌、横纹肌肉瘤、骨肉瘤和癌前病变。
如上所述，本发明人已表明，本发明药剂可用于重定向现有的免疫反应以特异性方式杀死特定不需要的细胞。因为可以这种方式靶向任何不需要的细胞，所以本发明药剂提供显著的治疗潜力。
因此，本发明的第二方面提供一种预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状的方法，所述方法包括向受试者施用根据本发明的第一方面的药剂。
因此，所述方法可涉及鉴定具有以不需要的细胞为特征的病状(例如癌症)或处于患上以不需要的细胞为特征的病状(例如癌症)的风险中的受试者，向所述受试者施用根据本发明的第一方面的药剂，和通过进行测试来测定不需要细胞的数目或通过监测所述受试者的临床症状来监测所述受试者中的不需要细胞的水平。取决于监测步骤的结果，可能需要施用更多药剂。
类似地，本发明包括根据本发明的第一方面的药剂，其用于预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状。
本发明还包括根据本发明的第一方面的药剂用于制造供预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状的药物的用途。
关于病状和不需要的细胞的优选情形如上文关于本发明的第一方面所述。优选地，所述不需要的细胞是肿瘤细胞并且所述病状是肿瘤。
预防或治疗病状包括如下含义：减少或减轻患者中的症状(即缓和用途)，预防症状恶化或进展，治疗病症(例如通过抑制或消除病原体)，或在未患上病状或病症的受试者中预防所述病状或病症。
应理解，本发明药剂本身产生临床上的个性化药物，由此测定有待施用至患者的最适当药剂，并且在临床上选择或制备。例如，在向受试者施用药剂的步骤之前，可测定以下中的任一种：(i)受试者的MHC等位基因，(ii)受试者对T细胞抗原肽的细胞毒性T细胞反应，和(iii)不需要的细胞关于可为靶向部分的靶标的分子和/或能够裂解本发明药剂中的裂解位点的酶的表达谱。可通过血清学测定法在抗原水平下或通过使用DNA测定法在基因水平下评估受试者的MHC等位基因。可以通过使从受试者分离的外周单核血细胞与抗原接触并使用标准细胞增殖测定法来测定给定抗原是否刺激受试者中的特异性细胞毒性T细胞反应。可使用用于测量核酸(例如DNA或RNA转录物)或蛋白质水平的常规测定法在活检样品上评估不需要的细胞的表达谱。例如，可使用转录组学或蛋白质组学技术。以这种方式，有可能鉴定特异性结合至例如由不需要的细胞表达的表面标志物的定制靶向部分。此外有可能鉴定可在不需要的细胞附近选择性裂解的适当的蛋白酶裂解位点。
因此，本发明的第二方面的方法可包括如下步骤：(i)鉴定具有以存在不需要的细胞为特征的病状(例如癌症)或处于患上以存在不需要的细胞为特征的病状(例如癌症)的风险中的受试者，(ii)从所述受试者获取样品，(iii)分析所述样品以鉴定用于预防或治疗所述受试者中的病状的T细胞抗原肽和/或裂解位点和/或靶向部分，(iii)制备本发明的药剂，(iv)向所述受试者施用所述药剂，和(v)通过进行测试以测定不需要细胞的数目或通过监测所述受试者的临床症状来监测所述受试者中的不需要细胞的水平。
应理解，可使用装置来选择和任选地制备用于特定患者的最适当药剂。例如，所述装置可对来自受试者的一个或多个样品进行自动化分析，并且基于这种分析选择和任选地制备用于所述受试者的定制药剂。因此，所述装置可对样品进行血清学测定法以测定受试者的MHC等位基因并且基于此测试各种肽诱发细胞毒性T细胞反应的效率，以鉴定用于所述患者中的最好T细胞抗原肽。类似地，所述装置可对来自受试者(例如来自活检样品)的不需要的细胞进行表达谱分析以测定将在不需要的细胞附近选择性裂解的合适的裂解位点和/或测定将结合至不需要的细胞的合适的靶向部分。
通过在临床中进行这些步骤中的任何一个或多个，可制备针对特定受试者定制的药剂。例如，所述药剂可含有已知结合至患者的MHC分子并诱发强烈T细胞反应的T细胞抗原肽、允许在不需要的细胞附近释放T细胞抗原肽的蛋白酶裂解位点，和/或已知选择性结合至由不需要的细胞表达的表面标志物的靶向部分。
在一个实施方案中，除了根据本发明的第一方面的药剂之外，向受试者施用另一种治疗剂。例如，当施用所述药剂以预防或治疗特定病状时，可施用已知可用于对抗所述病状的另一种治疗剂。作为实例，当所述药剂用于治疗癌症时，除了本发明的药剂之外，可向受试者施用另一种抗癌剂(例如抗肿瘤化学疗法)。类似地，所述另一种治疗剂可为已知在过敏性疾病、发炎性疾病、再生医学和神经再生疾病中具有治疗性应用的治疗剂。
应理解，可与本发明药剂同时(即任选地以共制剂形式同时施用)或在本发明药剂的不同时间(即依序施用)来施用另一种治疗剂。
所述另一种治疗剂可为以下中的任何一种或多种：疫苗；免疫刺激药物；抗癌剂；抑制针对本发明药剂的抗体反应的药剂；蛋白酶抑制剂；和/或能够靶向不需要的细胞并且连接至能够裂解本发明药剂中的一个或多个裂解位点的酶的靶向部分。
例如，为了加强针对所用的特定T细胞抗原肽的效应子免疫反应，可能需要用T细胞抗原肽对受试者进行疫苗接种；和/或施用免疫刺激剂如IL-2、IL-7、IFNa、GM-CSF、二甲双胍、来那度胺；和/或施用抗免疫调节剂如易普利姆玛(Ipilimumab)；其全部可视为其他治疗剂。
此外应理解，如果受试者是已施用免疫抑制剂者，则当被施用本发明药剂时或之前，从受试者提取这些免疫抑制剂(例如通过悬浮处理)。
类似地，可能需要使用旨在规避任何与本发明药剂有关的免疫原性问题的方法，由此在体内诱发不利抗体反应。例如，还可向受试者施用已知抑制B细胞活性的一种或多种药剂，例如利妥昔单抗、环磷酰胺、Syk抑制剂、抗BAFF抗体(例如贝利单抗(Belimumab))、抗CD22抗体、抗CD20抗体和抗CD19抗体中的任一种，其全部可视为其他治疗剂。在这种情况下，特别优选的是在本发明药剂之前向受试者施用B细胞抑制剂，例如作为切除B细胞的预处理。
在另一个实施方案中，施用特定的蛋白酶抑制剂以改进本发明药剂的靶选择性可为适当的。例如，在所述药剂包含靶向部分的实施方案中，如果已知所述靶向部分结合心脏和乳腺组织中的细胞，但仅靶向乳腺中的那些，则可能需要施用选择性抑制蛋白酶的药剂，所述蛋白酶负责使得T细胞抗原肽能够在心脏中而非乳腺中诱发T细胞反应。换句话说，施用药剂以抑制能够选择性裂解环肽中的一个或多个裂解位点的蛋白酶，但所述蛋白酶处在需要的细胞附近(例如其表面处或附近)而非不需要的细胞附近(例如其表面处或附近)。在本发明药剂的蛋白酶裂解位点可被多种蛋白酶裂解的情况下，这也是适用的，所述蛋白酶中的一些处在不需要的细胞附近并且其中一些处在需要的细胞附近。在这种情况下，可通过施用抑制处在需要的细胞附近但能够裂解裂解位点的蛋白酶的蛋白酶抑制剂并且因此使得T细胞抗原肽能够诱发T细胞反应来改进靶向特异性。施用抑制剂的作用将是确保优先使得T细胞抗原肽能够仅在不需要的细胞附近诱发T细胞反应。例如，如果具有癌症的受试者也具有其中MMP2和其他蛋白酶具活性的活动性类风湿性关节炎，并且本发明药剂中的一个或多个裂解位点可由多种蛋白酶(包括MMP2)裂解，则对于抑制MMP2以防止药剂在关节炎关节处裂解但保持在癌症位点被另一种蛋白酶裂解可为有利的。
在另一个实施方案中，可能需要施用能够靶向不需要的细胞的靶向部分，其又连接至能够裂解本发明药剂中的一个或多个裂解位点的酶。以这种方式，通过确保环肽中的一个或多个裂解位点仅可以在所需位置裂解将进一步改进本发明药剂的靶向特异性。例如，可首先向受试者施用连接至特定酶的靶向部分，以确保所述酶以显著量存在于不需要的细胞附近，并且其次施用本发明的药剂，其可被连接至靶向部分的酶选择性裂解。所述靶向部分和酶可为上文关于本发明的第一方面所述的那些中的任一种。优选地，所述酶是蛋白酶。理想地，所述酶(例如蛋白酶)是作用在特异性裂解序列上和/或不被血浆蛋白酶抑制剂如α2巨球蛋白抑制的酶。
因此，本发明包括一种组合物，其包含(i)根据本发明的第一方面的药剂和(ii)另一种治疗剂，其用于预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状。鉴于本发明的药剂和另一种治疗剂可同时或依序施用，应理解，本发明包括根据本发明的第一方面的药剂，其用于在被施用另一种治疗剂的受试者中预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状。此外可见，本发明包括在被施用根据本发明的第一方面的药剂的受试者中用于预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状的治疗剂。
类似地，本发明包括一种包含(i)根据本发明的第一方面的药剂和(ii)另一种治疗剂的组合物的用途，其用于制造供预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状的药物。此外，鉴于本发明的药剂和另一种治疗剂可同时或依序施用，应理解，本发明包括包含根据本发明的第一方面的药剂的组合物用于制造药物的用途，所述药物用于在被施用另一种治疗剂的受试者中预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状。此外可见，本发明包括治疗剂用于制造在被施用根据本发明的第一方面的药剂的受试者中用于预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状的药物的用途。
此外，本发明提供一种组合物，其包含(i)根据本发明的第一方面的药剂和(ii)另一种治疗剂，其适于预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的相同病状。应理解，在前述两个段落中所述的治疗剂可能是适于治疗与可通过本发明药剂治疗相同的以存在不需要的细胞为特征的病状的药剂。
本发明的第三方面提供根据本发明的第一方面的药剂，其用于医学中。
本发明的第四方面提供一种药物组合物，其包含根据本发明的第一方面的药剂，和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
虽然本发明药剂有可能单独施用，但其优选与一种或多种可接受的载体一起以药物制剂形式呈现。所述载体在可与治疗剂相容的意义上必须是“可接受的”并且对其接受者无害。通常，所述载体将是水或盐水，其将是无菌并且无热原质的。
在适当时，所述制剂可方便地以单位剂型呈现并且可通过制药领域中众所周知的方法中的任一种制备。这些方法包括使活性成分(用于治疗或预防以不需要的细胞为特征的病状的药剂)与构成一种或多种辅助成分的载体结合在一起的步骤。一般来说，所述制剂是通过将活性成分与液体载体或细粉状固体载体或两者均匀地和紧密地结合在一起并且然后必要时成形产品来制备。
适于经口施用的根据本发明的制剂可以如下形式呈现：离散单元如胶囊、扁囊剂或片剂，各自含有预定量的活性成分；散剂或颗粒剂；于水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液；或水包油液体乳液或油包水液体乳液。所述活性成分也可以大丸剂、糖剂或糊剂形式呈现。
片剂可通过压缩或模制来制备，任选地具有一种或多种辅助成分。压缩片剂可通过在合适的机器中压缩呈自由流动形式的活性成分来制备，例如散剂或颗粒剂，任选地混合有粘合剂(例如聚维酮、明胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如羟乙酸淀粉钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂。可通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制造模制片剂。所述片剂可任选地被包衣或刻痕并且可使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素配制以提供所需释放曲线来提供其中活性成分的缓慢或控制释放。
适于在口腔中局部施用的制剂包括在调味基质(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)中包含活性成分的糖锭剂；在惰性基质如明胶和甘油或者蔗糖和阿拉伯胶中包含活性成分的软锭剂；和在合适的液体载体中包含活性成分的漱口水。
适于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂和增稠剂。所述制剂可以单位剂量或多剂量容器例如密封安瓿和小瓶呈现，并且可储存在冷冻干燥(冻干)条件中，其仅需要在使用之前不久添加无菌液体载体(例如注射用水)的。临时注射溶液和悬浮液可由先前所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
本发明药剂可以栓剂或阴道栓形式施用，或者它们可以洗剂、溶液、乳膏、软膏或撒布粉形式局部施用。所述药剂还可例如通过使用皮肤贴剂透皮施用。
优选的单位剂量制剂是含有每日剂量或单位、每日亚剂量或其适当部分的活性成分的那些。
应理解，除了上文特别提及的成分之外，本发明的制剂可包括本领域中关于所讨论的制剂类型常用的其他药剂，例如适于经口施用的那些可包括调味剂。
施用至个体的药剂量是可有效对抗特定个体的病状的量。所述量可由医师来决定。
优选地，在本文所述的本发明的任何方面的情形下，待治疗的受试者是人类。可选地，所述受试者可为动物，例如家养动物(例如狗或猫)、实验室动物(例如实验室啮齿动物，例如小鼠、大鼠或兔)或在农业中重要的动物(即牲畜)，例如马、牛、绵羊或山羊。
本发明提供一种用于预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状的多部分试剂盒，所述试剂盒包含：(i)根据本发明的第一方面的试剂，和(ii)能够靶向不需要的细胞并且连接至能够裂解根据本发明的第一方面的药剂中的一个或多个裂解位点的酶的靶向部分。
上文关于本发明的第一方面描述了合适的靶向部分和裂解一个或多个裂解位点的酶。
例如，所述靶向部分可为由不需要的细胞表达的实体的特异性结合搭配物，或在施用至受试者后能够积累在不需要的细胞附近的非特异性分子。特异性结合搭配物的实例包括以下中的任一种：抗体；激素；生长因子；细胞因子；或受体配体，并且非特异性分子的实例包括以下中的任一种：聚乙二醇；葡聚糖；聚氨基酸；非肿瘤特异性蛋白，例如免疫球蛋白；白蛋白；或羟丙基甲基丙烯酰胺。上文关于本发明的第一方面列出合适的靶向部分(例如抗体)的特定实例。
所述靶向部分和酶可通过本领域中已知的标准技术连接。例如，它们可使用如本文所述的常规交联程序共价连接。可选地，它们可通过生物素/抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素或免疫学缔合共价地连接。鉴于血浆含有游离生物素(维生素H)，应理解，将需要离体进行偶联。
应理解，所述试剂盒允许首先向受试者施用连接至酶的靶向部分，并且在施用本发明的第一方面的药剂之前建立靶向部分在受试者中的恰当定位(例如通过被可检测地标记(例如放射性标记)的靶向部分)。然后由于连接至靶向部分的酶裂解本发明药剂中的一个或多个可选择性裂解的裂解位点，使得所述T细胞抗原肽能够在不需要的细胞附近诱发T细胞反应。这允许T细胞抗原肽呈递在不需要的细胞表面上以将现有免疫反应重定向至不需要的细胞。
因此，本发明还提供一种预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状的方法，所述方法包括向受试者施用(i)根据本发明的第一方面的药剂，和(ii)能够靶向不需要的细胞的靶向部分，其连接至能够裂解本发明的第一方面的药剂中的一个或多个裂解位点的酶。优选地，在本发明的第一方面的药剂之前施用连接至酶的靶向部分，例如以允许所述靶向部分恰当定位在有待建立的不需要的细胞处。然而，所述靶向部分可与本发明的第一方面的药剂同时施用。
类似地，本发明提供一种根据本发明的第一方面的药剂，和能够靶向不需要的细胞的靶向部分，所述靶向部分连接至能够裂解根据本发明的第一方面的药剂中的一个或多个裂解位点的酶，其用于预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状。优选地，在本发明的第一方面的药剂之前施用连接至酶的靶向部分，例如以允许所述靶向部分恰当定位在有待建立的不需要的细胞处。然而，所述靶向部分可与根据本发明的第一方面的药剂同时施用。
以存在不需要的细胞为特征的病状可为以下中的任一种：肿瘤(良性或恶性)、自身免疫性病状、心血管疾病、退行性疾病、糖尿病、过敏反应、神经退行性疾病如阿尔茨海默病、移植患者或感染性疾病。
附图说明
现在将借助于以下附图和实施例更详细地描述本发明。
图1：在存在或不存在蛋白酶抑制剂混合液的情况下用环肽脉冲的LCL。
图2：在存在或不存在蛋白酶抑制剂混合液的情况下用环肽脉冲的LCL和健康B细胞。
图3：LCL模型中的环肽的血浆稳定性。
图4：在存在或不存在蛋白酶抑制剂混合液的情况下用环肽脉冲的SW620结肠直肠细胞系。
图5：环肽在结肠直肠癌模型中的血浆稳定性。
图6：环肽和抗体肽表位结合物(APEC)在LCL模型中的血浆稳定性的比较。
图7：本发明环肽的实例的示意图。
具体实施方式
实施例1：在存在或不存在蛋白酶抑制剂混合液的情况下用环肽脉冲 的LCL
将LCL(肿瘤B细胞)在存在或不存在蛋白酶抑制剂混合液的情况下在37℃下温育2小时。向被处理或未被处理的细胞添加10μg环肽或10μg线性肽。所述环肽的氨基酸序列是FRGGANLVPMVATVAA(SEQIDNo：278)。蛋白酶裂解序列“FR”由组织蛋白酶B识别并且T细胞表位NLVPMVATV受限于HLA-A*0201。所述环肽获自JPTPeptideTechnologies。这些细胞用肽特异性T细胞温育过夜并且IFN-y测定所加工肽的T细胞识别。
存在如下可能性：环肽未被100％环化并且因此少量的线性肽将留在小瓶中。作为其对照，T细胞仅用环肽处理。T细胞不应加工环状形式的肽，而是将能够呈现线性形式并且因此在这种对照中产生的IFN-y水平将负责环肽小瓶中存在的线性肽的量。
图1示出结果。
无论它们在蛋白酶抑制剂中培养与否，用线性肽脉冲的靶细胞表现出类似的T细胞识别。这是所预期的，因为不需要蛋白酶作用于线性肽上以允许其结合至靶细胞MHC。
当在不存在蛋白酶抑制剂的情况下培养时，用环肽处理的靶细胞表现出对IFN-y的反应更大。这表明需要蛋白酶作用在环肽上以在其可以结合至靶细胞MHC之前释放病毒表位。当在存在蛋白酶抑制剂的情况下培养细胞时，T细胞识别存在约75％降低。有趣的是，关于蛋白酶抑制剂可见的反应与当仅用环肽培养T细胞时可见的水平非常相似，这表明可见的反应也是由于将不需要任何蛋白酶活性的线性肽。
实施例2：在存在或不存在蛋白酶抑制剂混合液的情况下用环肽脉冲 的LCL和健康B细胞
将LCL(肿瘤B细胞)或健康B细胞在存在或不存在蛋白酶抑制剂混合液的情况下在37℃下温育2小时。向被处理或未被处理的细胞添加10μg环肽或10μg线性肽。所述环肽的氨基酸序列是FRGGANLVPMVATVAA(SEQIDNo：278)。蛋白酶裂解序列“FR”由组织蛋白酶B识别并且T细胞表位NLVPMVATV受限于HLA-A*0201。所述环肽获自JPTPeptideTechnologies。这些细胞用肽特异性T细胞温育过夜并且IFN-y测定所加工肽的T细胞识别。
图2示出结果。
无论它们在蛋白酶抑制剂中培养与否，用线性肽脉冲的健康B细胞表现出类似的T细胞识别。这是所预期的，因为不需要蛋白酶作用于线性肽上以允许其结合至靶细胞MHC。当用PIC处理B细胞时可见的任何小的降低可能是由于向靶细胞添加PIC的稀释作用，因为当用PIC温育时在LCL+肽+T细胞中可见类似的作用。
用环肽处理的健康B细胞相比于用环肽处理的LCL表现出显著降低量的IFN-y并且水平与当仅用环肽培养T细胞时可见的水平相当。这表明，这种IFN-γ产生水平潜在地是由于在管中存在的少量的线性肽以及环化肽。
相比于用环肽标记的未被处理的B细胞，在它们已经用蛋白酶抑制剂混合液处理后，对于用环肽处理的健康B细胞的反应存在很少差异。(可见的反应处于与单独的T细胞+环肽类似的水平并且可能是由于环肽小瓶中存在的较小水平的线性肽。)这表明健康B细胞不能以关于标记的LCL可见相同的方式加工环肽。这被认为是因为健康B细胞不表达与LCL同样多的蛋白酶并且因此不能在与肿瘤细胞相同的水平上加工肽。
LCL结果与实施例1中所示类似。这些结果表明肿瘤细胞相对于健康细胞的差别靶向。
实施例3：环肽在LCL模型中的血浆稳定性
将LCL(肿瘤B细胞)在存在或不存在蛋白酶抑制剂混合液(PIC)的情况下在37℃下温育2小时。向被PIC处理或未被处理的细胞添加已经用人类血浆在37℃下处理4小时的10μg环肽或10μg线性肽。所述环肽与实施例1中所述相同。这些细胞用肽特异性T细胞温育过夜并且IFN-y测定所加工肽的T细胞识别。
图3示出结果。关于LCL(底部3组条柱)的结果与实施例1和2中所示类似。
在将线性肽用血清处理4小时后，与PIC处理无关，不存在针对已经用肽标记的靶细胞的T细胞反应。这表明血浆已经破坏了所预期的肽并且先前数据已显示线性肽具有非常短的血浆半衰期。
环肽的血清处理已经降低反应，但仍明确存在对肽的反应，这表明环肽在血浆中稳定至少4小时。所述环肽仍需要对其裂解以被“激活”，因为当用蛋白酶抑制剂混合液预温育靶细胞时存在降低。
在不存在血清的情况下用环肽标记的T细胞显示对肽的反应非常小，然后在用血清处理肽后反应消失。这表明，可见的较小反应可能是由于环肽小瓶中的少量线性肽，其在用血浆处理后已经被破坏。
实施例4：在存在或不存在蛋白酶抑制剂混合液的情况下用环肽脉冲 的SW620结肠直肠细胞系
将SW620细胞(结肠直肠细胞系)在存在或不存在蛋白酶抑制剂混合液的情况下在37℃下温育2小时。向被处理或未被处理的细胞添加10μg环肽或10μg线性肽。这些细胞用肽特异性T细胞温育过夜并且IFN-y测定所加工肽的T细胞识别。环肽与实施例1中所述相同。
与LCL模型类似，存在如下可能性：环肽未被100％环化并且少量的线性肽将留在小瓶中。作为其对照，T细胞仅用环肽处理。T细胞不应加工环状形式的肽，而是将能够呈现线性形式并且因此在这种对照中产生的IFN-y水平将负责环肽小瓶中存在的线性肽的量。
图4示出结果。
无论它们在蛋白酶抑制剂中培养与否，用线性肽脉冲的靶细胞表现出类似的T细胞识别。这是所预期的，因为不需要蛋白酶作用于线性肽上以允许其结合至靶细胞MHC。
当在不存在蛋白酶抑制剂的情况下培养时，用环肽处理的靶细胞表现出对IFN-y的反应更大。这表明需要蛋白酶作用在环肽上以在其可以结合至靶细胞MHC之前释放病毒表位。当在存在蛋白酶抑制剂的情况下培养细胞时，T细胞识别存在约65％降低。有趣的是，关于蛋白酶抑制剂可见的反应与当仅用环肽培养T细胞时可见的水平非常相似，这表明可见的反应也是由于将不需要任何蛋白酶活性的线性肽。
实施例5：环肽在结肠直肠癌模型中的血浆稳定性
将SW620细胞(结肠直肠细胞系)用已经在37℃下用人类血浆处理2小时的10μg环肽或10μg线性肽温育。这些细胞用肽特异性T细胞温育过夜并且IFN-y测定所加工肽的T细胞识别。所述环肽与实施例1中所述相同。
图5示出结果。
在将线性肽用血清处理2小时后，不存在针对已经用肽标记的靶细胞的T细胞反应。这表明血浆已破坏了所预期的线性肽。
环肽的血清处理已经使反应降低约60％，但明显仍存在对肽的反应，这表明环肽在血浆中稳定至少2小时。
在不存在血清的情况下用环肽标记的T细胞显示对肽的反应非常小，然后在用血清处理肽后反应消失。这表明可见的小反应可能已经是由于环肽小瓶中的少量线性肽，其在用血浆处理后已经被破坏。
单独地T细胞不会自发地产生IFN-y并且它们不识别先前未用任何肽处理的靶细胞。
实施例6：环肽和抗体-肽表位结合物(APEC)在LCL模型中的血浆稳 定性的比较
向靶细胞中添加已经在37℃下用人类血浆处理4小时的10μg环肽或10μgAPEC。这些细胞用肽特异性T细胞温育过夜并且IFN-γ测定所加工肽的T细胞识别。环肽与实施例1中所述相同。
图6示出结果。
环肽的血清处理(白色条柱)相比于未被处理的环肽已经使反应降低约50％，但仍明显存在对环肽的反应，这表明它在血浆中稳定至少4小时。相比于用未被处理的APEC标记的细胞，APEC的血清处理(黑色条柱)已经将对于被标记的靶细胞的T细胞反应降低约90％。这表明APEC相比于环肽在血浆中的稳定性降低。
在不存在血清的情况下用环肽标记的T细胞显示对肽的反应非常小，然后在用血清处理肽后反应消失。这表明可见的小反应可能是由于环肽小瓶中的少量线性肽，其在用血浆处理后已经被破坏。
单独地T细胞不会自发地产生IFN-γ并且它们不识别先前未用任何肽处理的靶细胞。

Claims (45)

1.一种药剂，其包含：
包含T细胞抗原肽的环肽；
其中呈环化形式的所述T细胞抗原肽不能够诱发T细胞反应；并且
其中通过选择性裂解所述环肽中的一个或多个裂解位点使得所述T细胞抗原肽能够诱发T细胞反应。
2.根据权利要求1所述的药剂，其中所述药剂是用于预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状，并且通过在所述不需要的细胞附近选择性裂解所述环肽中的一个或多个裂解位点使得所述T细胞抗原肽能够诱发T细胞反应。
3.根据权利要求1或2所述的药剂，其中所述T细胞抗原肽是能够在受试者中诱发现有T细胞反应者。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的药剂，其中一个或多个裂解位点的选择性裂解使得所述T细胞抗原肽能够在所述不需要的细胞附近和外部诱发T细胞反应。
5.根据权利要求1至4中的任一项所述的药剂，其中一个或多个裂解位点的选择性裂解使得所述T细胞抗原肽能够在所述不需要细胞的细胞表面处或附近诱发T细胞反应。
6.根据权利要求1至5中的任一项所述的药剂，其中所述一个或多个裂解位点可被酶裂解。
7.根据权利要求6所述的药剂，其中所述一个或多个裂解位点可被蛋白酶、核酸酶、脂肪酶、裂解酶、磷酸酶或糖酶中的任一种裂解。
8.根据权利要求7所述的药剂，其中所述一个或多个裂解位点是蛋白酶裂解位点，例如组织蛋白酶B蛋白酶裂解位点、半胱氨酸蛋白酶裂解位点、天冬氨酰基蛋白酶裂解位点、丝氨酸蛋白酶裂解位点、基质金属蛋白酶(例如MMP2或MMP14)裂解位点、前列腺特异性抗原裂解位点或CD10蛋白酶裂解位点。
9.根据权利要求1至8中的任一项所述的药剂，其中所述环肽含有两个或更多个不同的裂解位点，例如两个或更多个不同的蛋白酶裂解位点。
10.根据权利要求1至9中的任一项所述的药剂，其中所述T细胞抗原肽是肽、多肽或磷酸肽中的任一种。
11.根据权利要求10所述的药剂，其中所述T细胞抗原肽是肽，例如长度为9至22个氨基酸的肽。
12.根据权利要求1至11中的任一项所述的药剂，其中所述T细胞抗原肽是病毒源抗原。
13.根据权利要求1至12中的任一项所述的药剂，其中所述T细胞抗原肽是源自水痘带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、腺病毒、鼻病毒、流感病毒中的任一种，或源自疫苗如破伤风类毒素。
14.根据权利要求1至13中的任一项所述的药剂，其中所述T细胞抗原肽是MHCI类限制抗原或MHCII类限制抗原。
15.根据权利要求1至14中的任一项所述的药剂，其中所述T细胞抗原肽是肽CRVCCLYVL、NLVPMVATV、RPHERNGFTVL、TPRVTGGGAM、YSEHPTFTSQY、VTEHDTLLY、GLCTLVAML和CLGGLLTMV中的任一种。
16.根据权利要求1至15中的任一项所述的药剂，其中所述环肽包含T细胞抗原肽和连接所述T细胞抗原肽的C端与所述T细胞抗原肽的N端的连接部分。
17.根据权利要求16所述的药剂，其中所述连接部分含有一个或多个裂解位点。
18.根据权利要求16或17所述的药剂，其中所述连接部分是肽。
19.根据权利要求18所述的药剂，其中所述肽的长度为2-8个氨基酸。
20.根据权利要求1至19中的任一项所述的药剂，其中所述药剂由包含所述T细胞抗原肽的环肽组成。
21.根据权利要求2至20中的任一项所述的药剂，其中所述以存在不需要的细胞为特征的病状是以下中的任一种：肿瘤(良性或恶性)、自身免疫性病状(例如糖尿病)、心血管疾病、退行性疾病、过敏性疾病(例如哮喘)、神经退行性疾病如阿尔茨海默病、移植患者或感染性疾病。
22.根据权利要求2至21中的任一项所述的药剂，其中所述以存在不需要的细胞为特征的病状是肿瘤，所述T细胞抗原肽是肽并且通过选择性裂解所述环肽中的一个或多个蛋白酶裂解位点使得所述T细胞抗原肽能够诱发T细胞反应。
23.根据权利要求1至22中的任一项所述的药剂，其中包含所述T细胞抗原肽的所述环肽是长度为12至30个氨基酸的肽。
24.根据权利要求1至23中的任一项所述的药剂，其中所述药剂包含肽序列FRGGANLVPMVATVAA。
25.根据权利要求1至24中的任一项所述的药剂，其用于医学中。
26.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至24中的任一项所述的药剂，和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
27.一种预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状的方法，所述方法包括向受试者施用根据权利要求1至24中的任一项所述的药剂。
28.根据权利要求27所述的方法，其中在向所述受试者施用所述药剂的步骤之前，测定以下中的任何一种或多种：(i)所述受试者的MHC等位基因，(ii)所述受试者对T细胞抗原肽的细胞毒性T细胞反应，(iii)所述受试者中的所述不需要的细胞的表达谱。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其还包括施用适合预防或治疗所述病状的另一种治疗剂。
30.根据权利要求1至24中的任一项所述的药剂，其用于预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状。
31.一种根据权利要求1至24中的任一项所述的药剂在制造供预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状的药物中的用途。
32.一种组合物，其包含(i)根据权利要求1至24中的任一项所述的药剂和(ii)适合预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状的另一种治疗剂，所述组合物用于预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状。
33.一种包含(i)根据权利要求1至24中的任一项所述的药剂和(ii)适合预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状的另一种治疗剂的组合物在制造供预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状的药物中的用途。
34.一种组合物，其包含(i)根据权利要求1至24中的任一项所述的药剂和(ii)适合预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状的另一种治疗剂。
35.根据权利要求29所述的方法，根据权利要求30所述的药剂，根据权利要求31或33所述的用途，或根据权利要求32或34所述的组合物，其中所述另一种治疗剂是疫苗、免疫刺激药物、抗癌剂、针对根据权利要求1至23中的任一项所述的药剂的抗体反应的抑制剂和蛋白酶抑制剂中的任何一种或多种。
36.一种多部分试剂盒，其用于预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状，所述试剂盒包含：(i)根据权利要求1至24中的任一项所述的药剂，和(ii)能够靶向所述不需要的细胞并且连接至能够裂解根据权利要求1至24中的任一项所述的药剂中的一个或多个裂解位点的酶的靶向部分。
37.一种预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状的方法，所述方法包括向受试者施用(i)根据权利要求1至24中的任一项所述的药剂，和(ii)能够靶向所述不需要的细胞并且连接至能够裂解根据权利要求1至24中的任一项所述的药剂中的一个或多个裂解位点的酶的靶向部分。
38.根据权利要求1至24中的任一项所述的药剂，和能够靶向所述不需要的细胞并且连接至能够裂解根据权利要求1至24中的任一项所述的药剂中的一个或多个裂解位点的酶的靶向部分，其用于预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状。
39.一种根据权利要求1至24中的任一项所述的药剂和能够靶向不需要的细胞并且连接至能够裂解根据权利要求1至24中的任一项所述的药剂中的一个或多个裂解位点的酶的靶向部分在制造供预防或治疗以存在不需要的细胞为特征的病状的药物中的用途。
40.根据权利要求36所述的多部分试剂盒，根据权利要求37所述的方法，根据权利要求38所述的药剂和靶向部分和根据权利要求39所述的用途，其中所述靶向部分是由所述不需要的细胞表达的实体的特异性结合搭配物，或在施用至受试者后能够积累在所述不需要的细胞附近的非特异性分子。
41.根据权利要求40所述的多部分试剂盒、方法、药剂和靶向部分或用途，其中所述特异性结合搭配物是以下中的任一种：抗体；激素；生长因子；细胞因子；或受体配体；或其中所述非特异性分子是以下中的任一种：聚乙二醇；葡聚糖；聚氨基酸；非肿瘤特异性蛋白，例如免疫球蛋白；白蛋白；或羟丙基甲基丙烯酰胺。
42.根据权利要求40所述的多部分试剂盒、方法、药剂和靶向部分或用途，其中所述抗体对以下中的任一种具特异性：Her2/Neu；CD22；EpCAM(CD326)；EGFR；PMSA；CD30；CD20；CD33；膜IgE；IgE受体(CD23)、CD80；CD86；CD2；CA125；碳酸酐酶IX；CD70；CD74；CD56；CD40；CD19；c-met/HGFR；TRAIL-R1；DR5；PD-1；PD1L；IGF-1R；VEGF-R2；前列腺干细胞抗原(PSCA)；MUC1；CanAg；间皮素；P-钙粘蛋白；肌肉生长抑制素(GDF8)；Cripto(TDGF1)；ACVRL1/ALK1；MUC5AC；CEACAM；SLC44A4；CD2/CS1；CD137；CXCR4；神经纤毛蛋白1；磷脂酰肌醇蛋白聚糖；HER3/EGFR；PDGFRa和EphA2。
43.根据权利要求40所述的多部分试剂盒、方法、药剂和靶向部分或用途，其中所述抗体是抗表皮生长因子受体抗体如西妥昔单抗、抗Her2抗体、抗CD20抗体如利妥昔单抗、抗CD22抗体如伊珠单抗、抗CD70抗体、抗CD33抗体如hp67.6或吉妥珠单抗、抗MUC1抗体如GP1.4和SM3、抗CD40抗体、抗CD74抗体、抗P-钙粘蛋白抗体、抗EpCAM抗体、抗CD138抗体、抗E-钙粘蛋白抗体、抗CEA抗体和抗FGFR3抗体。
44.根据权利要求40所述的多部分试剂盒、方法、药剂和靶向部分或用途，其中所述靶向部分是IL-2、EGF、VEGF、Flt3L、HGF、IGF、IL-6、IL-4、Toll样受体或黑素瘤刺激素(MSH)中的任一种。
45.根据权利要求27至29、35、37和40至44中的任一项所述的方法，根据权利要求30或35所述的药剂，根据权利要求31、33、35和39至44中的任一项所述的用途，根据权利要求32、34、35和40至44中的任一项所述的组合物，根据权利要求36和40至44中的任一项所述的多部分试剂盒，和根据权利要求38和40至44中的任一项所述的药剂和靶向部分，其中所述以存在不需要的细胞为特征的病状是以下中的任一种：肿瘤(良性或恶性)、自身免疫性病状、心血管疾病、退行性疾病、糖尿病、过敏反应、神经退行性疾病如阿尔茨海默病、移植患者或感染性疾病。
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