CN104321081A - 免疫治疗分子和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含以下的分子：(i)靶向部分，所述靶向部分能够直接或间接靶向不需要的细胞，以及(ii)另外部分，所述另外部分具有掩蔽的免疫细胞结合区域以阻止所述另外部分结合免疫细胞，其中当所述分子邻近所述不需要的细胞时，所述掩蔽的免疫细胞结合区域能够被选择性地解除掩蔽从而使所述另外部分结合免疫细胞。

Description

免疫治疗分子和用途
本发明涉及免疫治疗分子。特别地，本发明涉及能够用于预防或治疗以存在不需要的细胞(unwanted cells)(如导致肿瘤或其它疾病的细胞)为表征的病症的免疫治疗分子。
针对恶性疾病的免疫治疗策略是转化临床研究的活跃领域，并且已经数十年。目前的模式认为癌症代表功能性或是组成型免疫缺陷，其能够通过对宿主免疫治疗得到治疗。这些尝试可大致分为两类。第一类通过诸如免疫接种、细胞因子支持(IL-2、IFNγ)或降低免疫抑制剂环境(易普单抗)以增强或支持内源性抗肿瘤免疫，而第二类旨在利用功能性免疫应答的组件恢复绝对的缺乏(用抗体被动免疫治疗、TCR转移、干细胞移植和过继免疫治疗)。这些方法通过高度有效的功能性抗肿瘤免疫应答是真正可能的这一观点统一起来。尽管在某些情况下对于有效的抗肿瘤免疫应答存在确凿的证据，肿瘤免疫学的这一核心支柱受到当前临床现实的压倒性反击，所述临床现实显示尽管进行了大量努力但对于大多数癌症患者来说没有可用的有效免疫疗法。几乎所有的癌症免疫接种实验都已经产生了阴性结果，产生阳性数据的那些多数经常显示很小的作用。现实情况是治疗性抗体在肿瘤学领域提供了非常普通的临床好处。因此，仍然需要更有效的免疫治疗剂。
双特异性抗体将具有不同特异性的两个抗原结合位点统一形成一个单独的构建体，从而使所述两个抗原结合位点能够以极度特异性将两个独立抗原集合在一起。第一个双特异性抗体类似于天然免疫球蛋白G(IgG)分子，其中的两个臂配备了不同的结合特异性。最初是由Staerz及其同事在1985年证明了采用这些双特异性抗体卡合细胞毒性T细胞用于癌细胞裂解的概念(Nature 1985,314:628)。自此以后，为了相同的目的，已经制成并开发了不同种类的构建体。最近的重点是通过连接两条单链Fv区(scFv抗体片段)但省略完整免疫球蛋白中存在的Fc部分来形成抗体构建体。在这些构建体(所谓的双特异性T细胞卡合体(engager)或BiTE抗体)中的每个scFv单位由来自每个重(VH)和轻(VL)抗体链的一个可变区通过合成的多肽接头互相连接而成。因此，所得到的双特异性单链抗体是一类在大约55kDa的单个多肽链上含有两个不同特异性的VH/VL对的物质。
采用BiTE抗体已经涌现了有前景的实验结果。Kufer及其同事已经证实，这种设计的CD3/靶抗原-双特异性抗体具有极高的效力，并且能够以非常低的效靶比(effector to target ratio)卡合CD8+和CD4+T细胞用于癌细胞的重定向裂解(Mack,PNAS(1995),92:7021-5)。所述抗体已经在治疗肿瘤(Mack,J Immunol(1997),158:3965-70；Kufer,Canc Immunol Immunother(1997),45:193-7和Loffler,Blood(2000),95:2098-103)以及治疗非肿瘤疾病(Bruhl,J Immunol(2001),166:2420-6)方面显示出潜力。所述抗体依赖于一个能够活化T细胞的scFv单元(通过特异性结合T细胞上的抗原)，以及特异性结合拟破坏的靶细胞上的抗原的其它scFv单元。以这种方式，所述抗体能够活化并重定向用于破坏病理细胞的免疫系统的细胞毒潜能。
当前在临床中测试的有两个BiTE抗体。Blinatumomab(也被称为MT103)对T细胞上的CD3和B细胞上的CD19是双特异性的，并且正被测试用于治疗非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病。MT110对CD3和上皮细胞粘附分子(EpCAM)是双特异性的，并且正被测试用于治疗肺癌和胃肠癌患者。
但是，BiTE抗体和类似的双特异性治疗抗体的局限在于它们在与表达靶向抗原的任何靶标结合时能够活化T细胞。例如，如果BiTE或双特异性抗体被设计用于靶向EGF受体，该受体在许多上皮癌症中高水平表达但也在健康组织中以中等水平表达，则健康组织和癌症组织均被靶向。此外，当结合于任何表面时该试剂变成有活性的，以非抗原结合方式与表面的非特异性结合由此会导致T细胞活化和脱靶作用。由于这些原因，开发中的所有BiTE抗体均以非常低的浓度给予。
因此，尽管双特异性抗体构建体在重定向机体的自身免疫系统以获得不需要的细胞的清除或中和中具有高治疗价值，这种重定向的活化需要其被严格控制以使得该细胞毒潜力被募集并仅应用于所预期的方向。因此，存在对于克服上述局限的其他免疫治疗剂的强烈需求。
本发明人已经设计了募集和活化免疫细胞(如T细胞)从而靶向不需要的细胞的手段(means)，其中所述免疫细胞仅在靶细胞附近时被活化。如通过以下将显而易见的，这种免疫细胞的选择活化是基于留驻在不需要的细胞附近的试剂对不需要的细胞附近的免疫细胞结合区域的选择性解掩蔽。以这种方式，由于仅解除掩蔽在不需要的细胞邻近的免疫细胞结合区域(如在癌症相关蛋白酶的存在下)，该技术对于不需要的细胞是更加特异性的(如对癌症更特异)。这极大地扩展了双特异性抗体的治疗窗口，并因此有助于给予导致较大靶标效果的较大剂量的药物。
因此，本发明的第一方面提供一种分子，所述分子包含：(i)靶向部分(targeting moiety)，所述靶向部分能够直接或间接靶向不需要的细胞(unwantedcells)，以及(ii)另外部分(further moiety)，所述另外部分具有掩蔽的(masked)免疫细胞结合区域以阻止该另外部分结合免疫细胞，其中当所述分子邻近所述不需要的细胞时，所述掩蔽的免疫细胞结合区域能够选择性地被解除掩蔽以使得所述另外部分与免疫细胞结合。靶向部分功能是将所述另外部分带至所述不需要的细胞附近，例如以BiTE抗体的抗原特异性之一的相同方式将构建体靶向至癌细胞。所述不需要的细胞附近的免疫细胞结合区域的选择性解掩蔽确保所述另外部分在所述不需要的细胞附近时仅能够卡合(engage)免疫细胞。
所述分子的单个元件详细描述如下。
靶向部分
‘靶向部分’包括能够靶向至所述不需要的细胞的任何部分的含义。优选地，所述靶向部分能够选择性靶向至所述不需要的细胞。例如，优选所述靶向部分靶向不需要的细胞的程度比其靶向正常细胞高，并且最优选仅靶向不需要的细胞。
可以理解的是，如果正常细胞在功能上能够被其它治疗手段代替或者如果它们不是生命所必需的，则所述靶向部分与正常细胞的结合是可以被容忍的，因此，并不排除靶向癌细胞以及靶向例如内分泌组织或器官的靶向部分。在这种情况下，所述靶向部分作用在于将免疫应答重定向至不需要的细胞和在功能上可被治疗手段取代的其它细胞。例如，在拯救生命的情况下，可以牺牲所述组织或器官，前提是其功能对生命不是必需的，例如在睾丸、前列腺或胰腺的情况下，或是可以通过激素替代疗法补充。这样的考虑适用于，例如甲状腺、甲状旁腺、肾上腺皮质和卵巢。
可以理解，所述靶向部分可以是能够选择性靶向至与需要的细胞相对的不需要的细胞的部分，其中所述不需要的细胞可以包括下述细胞，所述细胞在宿主中的存在是不期望的和任选的所述细胞在宿主中的存在是期望的但其存在可通过治疗手段在功能性被取代。
还可以理解的是，所述免疫细胞结合区域的选择性解掩蔽在所述免疫细胞结合区域被解除掩蔽之处赋予特异性，并因此在所述免疫细胞结合区域未被解除掩蔽的附近，所述靶向部分与正常细胞的结合也可以被容忍。
但是，最优选地，所述靶向部分选择性靶向至不需要的细胞而不是任意其它细胞。
在一个实施方案中，所述靶向部分能够直接靶向至不需要的细胞。然而，如下所述，所述靶向部分也可以是间接靶向不需要的细胞，例如通过靶向至位于所述不需要的细胞附近的另一部分(例如通过结合所述不需要的细胞)。
便利地，所述靶向部分是由不需要的细胞表达或与不需要的细胞结合的实体(entity)的特异性结合配偶体(partner)。通常情况下，所述表达的实体选择性的表达于不需要的细胞上。例如，所表达的实体在不需要的细胞上的丰度比在所治疗的机体内其它细胞上相比通常高10或100或500或1000或5000或10000。但是，如上所述，邻近所述不需要的细胞的所述免疫细胞结合区域的选择性解掩蔽在所述免疫细胞结合区域被解除掩蔽之处提供额外的特异性，并且由此所述结合配偶体可以结合相对于所述机体内其它细胞而言在所述不需要的细胞上类似表达或甚至低表达的实体。
“结合配偶体”包括与特定细胞表达的实体结合的分子的含义。优选地，所述结合配偶体选择性与该实体结合。例如，优选所述结合配偶体的Kd值(解离常数)比对于另一细胞(例如，正常细胞类型)表达的至少一种其它实体的低至少五或十倍(即更高亲和性)，并优选低超过100或500倍。更优选地，该实体的所述结合配偶体的Kd值比对于另一细胞(例如，正常细胞类型)表达的至少一种其它实体的低超过1000或5000倍。Kd值可以采用本领域公知的方法容易的确定。但是，如上所述，可以理解的是，所述结合配偶体可以选择性结合由不需要的细胞和由正常细胞表达的实体，前提是所述正常细胞在功能上可以被取代或是对生命不是必需的。例如，在淋巴细胞中，抗CD20(其靶向所有B细胞)是非常有效的并且杀死所有B细胞(健康的和恶性的)。但是，由于B细胞对于健康不是关键的，因此这可以被容忍。此外，在黑色素瘤、淋巴瘤、前列腺癌、甲状腺癌、睾丸或卵巢癌的情况下，靶向健康的对应组织也是可以被容忍的。
通常情况下，结合配偶体是结合下述实体的配偶体，与宿主的任何正常细胞相比，所述实体以显著更高的浓度在不需要的细胞中或细胞上存在或被结合配偶体利用。因此，所述结合配偶体可以结合在不需要的细胞上的表达量显著高于正常细胞的表面分子或抗原。相似地，所述结合配偶体可以结合由不需要的细胞分泌到胞外液体中的程度比正常细胞更高的实体。例如，所述结合配偶体可以结合表达于细胞膜上的或已经被分泌到肿瘤胞外液体中的肿瘤相关抗原。
所述靶向部分可以是多肽或肽。在一个特别优选的实施方案中，所述靶向部分是结合由不需要的细胞表达的抗原(如肿瘤相关抗原)的抗体。
优选的抗体靶标(括号中为不需要的细胞类型的例子)包括：Her2/Neu(上皮细胞恶性肿瘤)；CD22(B细胞，自身免疫性或恶性)；EpCAM(CD326)(上皮细胞恶性肿瘤)；EGFR(上皮细胞恶性肿瘤)；PMSA(前列腺癌)；CD30(B细胞恶性肿瘤)；CD20(B细胞，自身免疫性、过敏性或恶性)；CD33(骨髓恶性肿瘤)；膜IgE(过敏性B细胞)；IgE受体(CD23)(过敏性疾病中的巨大细胞或B细胞)，CD80(B细胞，自身免疫性、过敏性或恶性)；CD86(B细胞，自身免疫性、过敏性或恶性)；CD2(T细胞或NK细胞淋巴瘤)；CA125(包括卵巢癌的多种癌症)；碳酸酐酶IX(包括肾细胞癌的多种癌症)；CD70(B细胞，自身免疫性、过敏性或恶性)；CD74(B细胞，自身免疫性、过敏性或恶性)；CD56(T细胞或NK细胞淋巴瘤)；CD40(B细胞，自身免疫性、过敏性或恶性)；CD19(B细胞，自身免疫性、过敏性或恶性)；c-met/HGFR(胃肠道和肝脏恶性肿瘤)；TRAIL-R1(包括卵巢癌和大肠癌的多种恶性肿瘤)；DR5(包括卵巢癌和大肠癌的多种恶性肿瘤)；PD-1(B细胞，自身免疫性、过敏性或恶性)；PD1L(包括上皮腺癌的多种恶性肿瘤)；IGF-1R(包括上皮腺癌的大多数恶性肿瘤)；VEGF-R2(与包括上皮腺癌的大多数恶性肿瘤相关的血管系统)；前列腺干细胞抗原(PSCA)(前列腺癌)；MUC1(上皮细胞恶性肿瘤)；CanAg(如结肠癌和胰腺癌的肿瘤)；间皮素(包括间皮瘤和卵巢癌和胰腺癌的许多肿瘤)；P-钙粘蛋白(包括乳腺癌的上皮细胞恶性肿瘤)；肌肉生长抑制素(GDF8)(包括肉瘤和卵巢癌和胰腺癌的许多肿瘤)；Cripto(TDGF1)(包括结肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和胰腺癌的上皮细胞恶性肿瘤)；ACVRL1/ALK1(包括白血病和淋巴瘤的多种恶性肿瘤)；MUC5AC(包括乳腺癌的上皮细胞恶性肿瘤)；CEACAM(包括乳腺癌的上皮细胞恶性肿瘤)；CD137(B细胞或T细胞，自身免疫性、过敏性或恶性)；CXCR4(B细胞或T细胞，自身免疫性、过敏性或恶性)；神经纤毛蛋白1(包括肺癌的上皮细胞恶性肿瘤)；磷脂酰肌醇聚糖(Glypicans)(包括肝、脑和乳腺癌的多种癌症)；HER3/EGFR(上皮细胞恶性肿瘤)；PDGFRa(上皮细胞恶性肿瘤)；EphA2(包括神经母细胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌和小细胞肺癌的多种癌症)和CD138(骨髓瘤)。
特别优选的靶向部分抗体包括抗表皮生长因子受体的抗体如西妥昔单抗(Cetuximab)、抗Her2的抗体、抗CD20的抗体如利妥昔单抗(Rituximab)、抗CD22的抗体如伊珠单抗(Inotuzumab)，抗CD70的抗体、抗CD33的抗体如hp67.6或吉妥单抗(Gemtuzumab)、抗MUC1的抗体如GP1.4和SM3、抗CD40的抗体、抗CD74的抗体、抗P钙粘蛋白的抗体、抗EpCAM的抗体、抗CD138的抗体、抗E钙粘蛋白的抗体、抗CEA的抗体和抗FGFR3的抗体。
有效用于预防或治疗特征为存在不需要的细胞的各种病症的再进一步的选择性靶标提供如下。对于以下所有的例子，治疗性抗体已经是可用的或者可以由本领域技术人员容易地制备。
可以由所述靶向部分靶向的肿瘤相关、免疫细胞相关和感染试剂相关抗原的例子列于表1。
表1：用于靶向的细胞表面抗原
a)肿瘤相关抗原
et al(1986)Cancer Res.46,3917-3923
2Clarke et al(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82,1766-1770
其它抗原包括α-甲胎蛋白、Ca-125和前列腺特异性抗原。
b)免疫细胞抗原
c)感染试剂相关抗原
如本发明所使用的，术语“抗体”包括但不限于多克隆、多克隆、嵌合、单链、Fab片段、由Fab表达文库生产的片段及双特异性抗体。这些片段包括保留对靶标底物的结合活性的全抗体的片段、Fv、F(ab')和F(ab')2片段，以及单链抗体(scFv)、融合蛋白和包括抗体的抗原结合位点的其它合成蛋白。仅包括抗体的一部分的靶向部分由于优化了从血液的清除速率而可能是有利的，并且由于Fc部分而可使进行非特异性结合的可能性较小。还包括结构域抗体(dAbs)、双抗体、骆驼抗体(camelid antibodies)和工程化的骆驼抗体。此外，为了施用于人，所述抗体及其片段可以是人源化的抗体，这现在是本领域公知的(Janeway et al(2001)Immunobiology.,5th ed.,Garland Publishing)；Anet al(2009)Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic,ISBN:978-0-470-11791-0)。
还包括不对称的IgG样抗体(例如triomab/quadroma，TrionPharma/Fresenius Biotech；knobs-into-holes，Genentech；Cross MAbs，Roche；静电匹配的抗体，AMGEN；LUZ-Y，Genentech；链交换工程化的结构域(SEED)抗体，EMD Serono；biolonic，Merus以及Fab-交换抗体，Genmab)，对称的IgG样抗体(例如双靶向(DT)-Ig，GSK/Domantis；两合一抗体，Genentech；交联MAbs，karmanos癌症中心；mAb2，F-star以及Cov X-体，Cov X/Pfizer)，IgG融合体(例如双可变区(DVD)-Ig，Abbott；IgG样双特异性抗体，Eli Lilly；Ts2Ab，Medimmune/AZ；BsAb，ZymoGenetics；HERCULES，Biogen Idec；TvAb，Roche)；Fc融合体(例如ScFv/Fc融合，Academic Institution；SCORPION，Emergent BioSolutions/Trubion，ZymoGenetics/BMS；双亲和力重靶向技术(Fc-DART)，MacroGenics；双(ScFv)2-Fab，National Research Centerfor Antibody Medicine)；Fab融合体(例如F(ab)2，Medarex/AMGEN；双作用或Bis-Fab，Genentech；对接和锁定(DNL)，ImmunoMedics；二价双特异性，Biotechnol以及Fab-Fv，UCB-Celltech)，基于ScFv-和双抗体的抗体(例如双特异性T细胞卡合体(BiTEs)，Micromet；串联式双体(Tandab)，Affimed；DARTs，MacroGenics；单链双抗体，Academic；TCR样抗体，AIT，ReceptorLogics；人血清白蛋白ScFv融合体，Merrimack以及COMBODIES，EpigenBiotech)，IgG/非-IgG融合体(例如免疫细胞因子，EMDSerono，Philogen，ImmunGene，ImmunoMedics；超抗原融合蛋白，Active Biotech；以及抗癌的免疫动员mTCR，ImmTAC)以及寡克隆抗体(例如Symphogen和Merus)。
所述抗体可以具有任何抗体样支架，其描述于Carter(2006)“Potentantibody therapeutics by design”,Nat Rev Immunol.6(5):343-57，和Carter(2011)“Introduction to current and future protein therapeutics:a protein engineeringperspective”,Exp Cell Res.317(9):1261-9，其作为参考引入本发明，连同本发明所述的特异性决定区。因此，术语“抗体”还包括基于亲合体和非免疫球蛋白的框架。
使用抗体片段而不是全抗体的优点有几倍。片段的较小尺寸可带来改善的药理学性质，例如更好的渗透实体组织。此外，诸如Fab、Fv、ScFv和dAb抗体片段的抗原结合片段可以表达于并分泌自大肠杆菌或酵母，因而允许在实验室中便利生产以及以商业规模的经济生产。
所述抗体可以是任何类的IgG、IgE、IgA、IgM和IgD并可以源自任何种类。如果所述抗体是IgG，它可以是任何的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。但是，优选的是当所述试剂用于施用给特定宿主时，所述抗体或至少其恒定区源自该宿主。例如，当所述试剂施用于人时，所述抗体优选人抗体或人源化抗体等。
结合由不需要的细胞表达的特定抗原的合适的抗体可以由本领域技术人员采用本领域长期建立的技术制备。单克隆抗体和抗体片段的制备方法是本领域公知的并包括杂交瘤技术(Kohler&Milstein(1975)“Continuouscultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.Nature 256:495–497)；抗体噬菌体展示(Winter et al(1994)“Making antibodies by phagedisplay technology.”Annu.Rev.Immunol.12:433–455)；核糖体展示(Schaffitzelet al(1999)“Ribosome display:an in vitro method for selection and evolution ofantibodies from libraries.”J.Immunol.Methods 231:119–135)以及迭代菌落过滤筛选(Giovannoni et al(2001)“Isolation of anti-angiogenesis antibodies from alarge combinatorial repertoire by colony filter screening.”Nucleic Acids Res.29:E27)。进一步地，适合用于本发明的抗体和抗体片段描述于，例如，以下出版物：“Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Application”,Hurrell(CRC Press,1982)；“Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques”,H.Zola,CRC Press,1987,ISBN:0-84936-476-0；“Antibodies:A Laboratory Manual”1stEdition,Harlow&Lane,Eds,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,1988.ISBN 0-87969-314-2；“Using Antibodies:A Laboratory Manual”2ndEdition,Harlow&Lane,Eds,ColdSpringHarbor Laboratory Press,New York,1999.ISBN 0-87969-543-9和“Handbook of Therapeutic Antibodies”StefanDübel,Ed.,1st Edition,-Wiley-VCH,Weinheim,2007.ISBN:3-527-31453-9。
尤其优选的是所述靶向部分是单链抗体，例如scFv抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述可变区通过柔性肽接头连接在一起。优选地，所述单链抗体结合由不需要的细胞表达的实体，包括任何上面提到的那些。但是，还可理解的是，所述靶向部分可以仅包含一个抗体可变区，如重链可变区或轻链可变区，并且该可变区可以结合由不需要的细胞表达的实体。
可以理解的是，所述靶向部分还可以是任何化合物或其部分，其以非免疫敏感性特异性结合由不需要的细胞表达的实体或结合所述不需要的细胞。因此，所述特异性结合配偶体可以是任何激素、生长因子、细胞因子或受体配偶体(例如激动剂或拮抗剂)。
例如，细胞因子之前已经用于靶向毒素以侵入细菌。利用基因工程，已经生产了含有例如IL-2和结合结构域删除的绿脓杆菌外毒素蛋白的重组蛋白(Lorderboum-Galski et al,1988(62))。该免疫毒素在实验动物模型中是有效的(Kozak et al,1990(63))。还利用IL-4、IL-6、α-MSH、EGF和TNF-α生产了融合蛋白(综述于Waldmann 1992(35))，所有这些适合用作本发明中的靶向部分。
特别有用的靶向部分包括细胞因子如IL-2、EGF、VEGF、Flt3L、HGF、IGF、IL-6或IL-4。IL-2和IL-4可以靶向至成人T细胞白血病/淋巴瘤细胞，其表达高亲和性IL-2受体而正常静息T细胞则不表达，或靶向至表达IL-4受体的T细胞。之前已经显示了单克隆抗体MR6，其结合人IL-4受体，能够抑制IL-4诱导的克隆的辅助T细胞的增殖以及多克隆B细胞产生IgE(Larche et al,1988(36))。该靶向部分可用于消除自身免疫性疾病或过敏的淋巴细胞亚群。
胰岛素样生长因子(IGF-1和IGF-11)优先被恶性肿瘤细胞摄取因而可以用于靶向肿瘤细胞。相似地，EGF可用于靶向上调EGF受体的恶性肿瘤细胞。此外，肿瘤相关血管过表达VEGF受体因而可以被VEGF生长因子家族靶向。
Flt3受体在白血病中过表达，可以作为急性和慢性白血病和骨髓增生性疾病的治疗靶标。
骨髓瘤细胞表达IL-6受体并且也分泌IL-6，其以自分泌方式作用以刺激细胞增殖。因此，IL-6可被用作针对骨髓瘤的靶向部分。
在另一个例子中，所述靶向部分是黑色素细胞刺激素(MSH)，其与在黑色素瘤细胞中大量表达的MSH受体结合。
可以理解的是，本领域技术人员可以通过例如鉴定特异于不需要的细胞的表面抗原或分子并找到针对该抗原或分子的结合配偶体，从而很容易地选择针对任何给定的不需要的细胞的合适的结合配偶体。如上所述，已经对针对肿瘤相关抗原、免疫细胞抗原和感染试剂的抗体及其片段进行了大量研究。因此，便利地，选择针对给定的细胞类型的合适的靶向部分通常包括检索文献。或者，不需要的细胞取自患者(例如，通过活检)，并且制备针对该细胞的抗体。这种“量身定制”的抗体是已知的。已经证明抗体导致肿瘤细胞结合，所述肿瘤细胞不仅来自由此获得抗体的患者还来自大量其他患者。因此，多种此类抗体已经可市售获得。鉴定针对给定的不需要的细胞的合适结合配偶体的其它方法包括遗传方法(如微阵列)、蛋白质组学方法(如差分质谱)、免疫学方法(如用肿瘤细胞免疫动物并鉴定特异性靶向恶性肿瘤细胞的分泌抗体的克隆)和计算机模拟(in silico)方法(其采用系统生物学方法鉴定靶标)。
进一步的选择性靶标和合适的结合配偶体列于表2。
表2：针对肿瘤选择性靶标和肿瘤相关抗原的结合配偶体
在预防或治疗各种癌症中有用的进一步的靶标提供如下。
作为特异性结合配偶体的候选物的靶向部分，所述靶向部分可以是非特异性的分子，其在施用于受试者后能够在不需要的细胞附近积累。例如，已知大分子在肿瘤中非特异性积累。在肿瘤中非特异性积累的大分子包括白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白、脂质体、纳米颗粒(如胶体纳米颗粒)和生物可降解聚合物包括葡聚糖、聚乙二醇、聚赖氨酸和羟基丙基甲基丙烯酰胺。在裸鼠的异种移植人肿瘤中，大分子的积累以每克肿瘤达大约2.0％的给药剂量。已经发现如聚乙二醇和葡聚糖的大分子改变了它们所结合的物质的清除速率并改变它们在肿瘤中的浓度(Melton et al,1987；Eno-Ammoquaye et al,1996)。在特殊肿瘤中，非特异性大分子可以比针对分泌抗原的抗体更高的浓度积累(Searle et al,1981)。
这种大分子在肿瘤细胞中的积累的发现已经被称为透过增强与滞留(EPR)效应，并已被归因于肿瘤毛细血管泄漏和缺乏淋巴引流(Matsumura &Macda,1986)。
因此，当不需要的细胞是肿瘤细胞时，所述靶向部分可以是在肿瘤中积累的任意这些大分子。优选地，本发明中所采用的大分子是亲水性的并且其特征为可溶于体液以及用于肠胃外给药的常规流体。合适地，所述大分子是可生物降解的，从而避免在反复给药过程中的全身积累。但是很显然它不能被降解得太快以至于无法在不需要的细胞的位点(例如肿瘤)积累。优选地，包括这样的大分子靶向部分的试剂的分子量和大小超过尿排泄的肾阈值(MW 60000)，因为这有助于血液浓度足以提供有效的血液:肿瘤浓度梯度。高达至少800000的分子量，例如高达160000，通常是合适的。大分子优选是不易被网状内皮系统捕获的大分子。给出的分子量排除任何水合的水。
可作为亚单位并不可生物降解的大分子可以连接有可生物降解的连接单元，使得非生物可降解成分通过肾脏过滤并从尿中排出。
或者，优选用于制备大分子的聚合物不是生物可降解的，这样结合物的任何非生物可降解部分的分子量应小于肾阈值(约70000)，从而在生物可降解部分降解后，残留的非生物可降解部分通过肾脏排出。
便利地，所述大分子可以是以下任意：葡聚糖；聚氨基酸；纳米颗粒(如胶体纳米颗粒)，或非肿瘤特异性蛋白如免疫球蛋白、白蛋白或转铁蛋白。合适地，它可以是苯乙烯和马来酸酐的共聚物，或者可以是聚天冬氨酸、聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺或聚乙二醇。
可以理解的是，该大分子用于针对黑色素细胞的酶前药疗法(MDEPT)，如WO 1998/024478中所述。
除了直接靶向不需要的细胞外，靶向部分还可以是，通过能够与能够靶向至不需要的细胞的部分相结合，从而能够间接靶向至不需要的细胞的部分。例如，能够直接靶向不需要的细胞的部分(包括任意上述的那些部分)可以包含第一结合配偶体(partner)。然后，包含能够结合所述第一结合配偶体的第二结合配偶体的靶向部分，由于其能够结合所述第一结合配偶体而具有间接靶向不需要的细胞的能力。在这种情况下，所述靶向部分不直接结合不需要的细胞表达或结合的实体，但是它可以通过结合确实与不需要的细胞表达或结合的实体相结合的部分来间接结合。可以理解的是，本发明的所述分子可以包含以这种方式间接靶向不需要的细胞的靶向部分，以及那些直接靶向不需要的细胞的靶向部分。所述第一和第二结合配偶体的含义包括任何两个互相选择性结合的部分。最优选地，所述第一和第二结合配偶体仅互相结合而不结合任何另外部分。优选如生物素/亲和素或链霉素之间的非共价结合，或免疫学结合。因此，所述第一结合配偶体可以是生物素，所述第二结合配偶体可以是亲和素，反之亦然。或者，所述第一结合配偶体可以是抗原，所述第二结合配偶体可以是针对该抗原的特异性抗体，反之亦然。但是，可以采用任何选择性互相结合的第一和第二结合配偶体配对，并且合适的配对是本领域技术人员已知的。
不需要的细胞
不需要的细胞可以是不期望在宿主中存在的任何细胞。因此，所述细胞可以是肿瘤细胞(良性或恶性)、来自肿瘤微环境的细胞如肿瘤成纤维细胞或肿瘤血管、病毒感染的细胞、作为基因治疗的一部分引入的细胞或者是由于特定原因想要破坏的正常细胞。例如，期望清除自身免疫性疾病中的免疫细胞的亚群如T淋巴细胞或如过敏性疾病中的B淋巴细胞。
优选地，所述不需要的细胞是其存在表征了患者的病症的细胞。不需要的细胞的存在表征的病症包括其中的至少部分病理是由于存在不需要的细胞而介导的任意生物学或医学病症或紊乱(disorder)。所述病症可由不需要的细胞的存在导致或者不需要的细胞的存在是所述病症的结果。特定病症的例子包括肿瘤(良性或恶性)、自身免疫性疾病、心血管疾病、退行性疾病、糖尿病、过敏性疾病(如哮喘)、神经退行性疾病如阿尔茨海默氏症、移植患者和感染性疾病。
对于自身免疫性疾病，不需要的细胞可以代表适应性或先天性免疫应答的细胞，优选T细胞，但更优选B细胞。对于心血管疾病，不需要的细胞可以代表动脉粥样硬化损伤中的细胞如巨噬细胞。对于退行性疾病，不需要的细胞可以代表诱导神经退行性改变的细胞，例如在阿尔茨海默氏症中它们可以是小胶质细胞或星形细胞。对于其它退行性疾病，任何促进退行性或凋亡过程中的细胞均可以被认为是靶标。对于诸如产生有害组织的衰老的过程，例如在良性前列腺增生中，非恶性前列腺组织是优选的靶标。对于过敏性疾病，参与过敏性反应的细胞，如组织肥大细胞，可以被认为是理想的靶标，而且包括诸如浆细胞或B细胞的分泌IgE的细胞。在移植中，同种异体反应性淋巴细胞将代表优选的靶细胞。在感染性疾病的情况下，任何携带病毒、细菌或真菌病原体的细胞都可被认为是优选的靶细胞，例如HIV感染的细胞。
另外部分的免疫细胞结合区域
“免疫细胞结合区域”的含义包括另外部分的能够结合免疫细胞的区域。优选地，所述免疫细胞结合区域能够选择性结合免疫细胞。例如，优选所述免疫细胞结合区域结合免疫细胞的程度大于其结合任何其它类型的细胞，并最优选仅结合免疫细胞。
通常，所述免疫细胞结合区域结合免疫细胞表达的实体，并优选选择性结合该实体。因此，所述另外部分可以是针对免疫细胞上表达的实体的结合配偶体，其中所述免疫细胞结合区域是所述另外部分的负责结合的区域。优选所述免疫细胞结合区域用于结合由给定免疫细胞表达的实体的Kd值比由另一细胞类型表达的至少一个其它实体低至少五或十倍，并优选低多于100或500倍。更优选地，所述免疫细胞结合区域用于结合由给定免疫细胞表达的实体的Kd值比由另一细胞类型表达的至少一个其它实体低1000或5000倍。
‘免疫细胞’的含义包括免疫系统(如人免疫系统)中天然细胞库(repertoire)内的任意免疫细胞，其当被活化时能够给靶细胞的活力带来改变。‘靶细胞的活力’的含义包括靶细胞的存活、增殖和/或与其它细胞相互作用的能力。这种相互作用可以是直接的，例如当靶细胞接触其它细胞时，或是间接的，例如当靶细胞分泌能够影响其它远处细胞的功能的物质时。通常，所述免疫细胞是降低靶细胞的存活、增殖和/或与其它细胞相互作用的能力中的一种或多种的细胞，并优选所述免疫细胞是杀死靶细胞的细胞。因此可以理解，所述免疫细胞优选免疫效应细胞。
在一个实施方案中，所述免疫细胞是是淋巴细胞谱系中的一员，并因此可以是T细胞或自然杀伤(NK)细胞中的任何一个。有利地，这些细胞将对不需要的细胞具有细胞毒或凋亡作用。
在另一个实施方案中，所述免疫细胞是是髓系中的一员，并因此可以是单核吞噬细胞(如单核细胞或巨噬细胞)、中性粒细胞或树突状细胞中的任何一个。有利地，这些细胞将对不需要的细胞具有细胞毒、吞噬或凋亡作用。
特别优选所述免疫细胞是T细胞(如细胞毒T细胞)，并因此所述另外部分的免疫细胞结合区域是T细胞结合区域。因此，本发明提供一种分子，所述分子包含：(i)靶向部分，所述靶向部分能够直接或间接靶向不需要的细胞，以及(ii)另外部分，所述另外部分具有掩蔽的T细胞结合区域以阻止另外部分结合T细胞，其中当所述分子邻近不需要的细胞时，所述掩蔽的免疫细胞结合区域能够选择性被解除掩蔽，使得所述另外部分结合免疫细胞。
‘T细胞’包括所有类型的T细胞，包括CD4+、CD8+、γδT细胞和NK-T细胞。有利地，所述T细胞是细胞毒T细胞，使得细胞毒T细胞应答被募集。以这种方式，细胞毒作用可以作用于不需要的细胞。
T细胞表面上表达的实体包括CD3、T细胞受体(TCR)、CD4、CD8和CD28中的任何一个，并因此当免疫细胞结合区域是与T细胞结合的区域时，所述另外部分能够结合这些抗原中的任何一个。例如，所述另外部分可以是特异性结合CD3、TCR、CD4、CD8和CD28中的任何一个的抗体。
其它免疫细胞的表面上表达的实体是本领域公知的，并且，如与T细胞表面上的那些，可以容易地通过查询科学文献确定。例子包括CD16、CD56、CD8、NK细胞受体(如CD94:NKG2异源二聚体、Ly49同源二聚体、γδT细胞受体、病原体识别受体、应激监控受体、杀伤细胞Ig样受体(KIR)或白细胞抑制受体)、NKG2D、NKp46、CD2、CD28和CD25。
由所述另外部分的免疫细胞结合区域靶向的实体优选是这样的实体：当其结合时，导致相应免疫细胞(如T细胞)的活化。免疫细胞(如T细胞)的活化可以通过将分离的外周血单核血细胞接触包含免疫细胞结合区域的所述另外部分，并采用本领域已知的细胞增殖的标准分析方法来进行确定。确定免疫应答程度的合适的分析方法包括ELISpot、胞内细胞因子染色、HLA-肽四聚体染色、增殖分析、活化分析(如CD69)、CD107动员分析或代谢分析(如MTT)。还适合的是检测活化诱导分泌的细胞因子的分析，例如采用ELISA或多重微珠技术。
例如，在优选的实施方案中当所述另外部分的免疫细胞结合区域是T细胞结合区域时，优选所述T细胞结合区域能够结合已知活化T细胞的T细胞上的CD3抗原和/或TCR。CD3存在于所有T细胞上并由γ、δ、ε、ζ和η亚基组成。在不存在TCR受体复合体的其它成分的情况下，CD3的胞质尾足以转导T细胞活化所必需的信号。通常，T细胞细胞毒作用的活化首先依赖于TCR与主要组织相容性复合体(MHC)蛋白的结合，所述MHC蛋白本身与定位于单独的细胞上的外源抗原结合。只有当该起始TCR-MHC结合已经发生了，才确保造成T细胞克隆扩增的CD3依赖性信号级联以及最终的T细胞细胞毒作用。但是，当本发明的所述分子的另外部分结合CD3和/或TCR时，可以在不存在独立TCR-MHC的情况下发生细胞毒T细胞的活化，原因是CD3和/或TCR分子的交联模仿了免疫突触的形成。这表示T细胞可以以克隆独立的形式被细胞毒活化，即以独立于由T细胞携带的特异性TCR克隆的形式。这允许整个T细胞区室而不是仅仅某种克隆的特异性T细胞的活化。
因此便利地，所述免疫细胞结合区域(如T细胞结合区域)是以模仿天然抗原结合该免疫细胞的方式结合所述免疫细胞，该天然抗原已知活化所述免疫细胞，例如对靶细胞的活力施加其作用，如细胞毒作用。
所述另外部分可以是多肽或肽。优选地，包含所述免疫细胞结合区域的所述另外部分是特异性结合由免疫细胞(如T细胞)表达的实体的抗体。在一个特别优选的实施方案中，所述另外部分包含一个或多个特异性结合免疫细胞抗原的抗体可变区(如VH和VL结构域)。所述另外部分可以包含VH结构域和VL结构域，当配对时，其特异性结合免疫细胞抗原，或者它可以包含能够结合免疫细胞抗原的单个VH结构域或单个VL结构域。因此，所述另外部分可以是单链抗体构建体如scFv抗体。尤其优选所述另外部分是特异性结合T细胞上CD3抗原的抗体(包含至少一个抗体可变区的抗体如scFv抗体)。具体的例子是莫罗单抗(muromonab)，但可以理解的是还可以采用任何抗CD3的抗体。从下文和附图中将会变得更清楚的是，所述另外部分可以包含两个或更多个独立的部分，例如不需要由连续多核苷酸序列编码的多肽结构域。
术语‘掩蔽的(masked)’的含义包括所述另外部分中免疫细胞结合区域的免疫细胞结合功能性被显著降低或优选完全抑制。所述免疫细胞结合区域的掩蔽可以由不需要的细胞附件的选择性解掩蔽来逆转。因此，在掩蔽的状态下，所述免疫细胞结合区域优选不能结合免疫细胞，而在解除掩蔽的状态下，所述免疫细胞结合区域能够结合免疫细胞。
如下文进一步描述和附图中所示例的，在一个特别优选的实施方案中，所述免疫细胞结合区域的掩蔽由所述分子中一个或多个裂解位点的选择性裂解控制。因此，所述分子可以包含一个或多个裂解位点，其在所述分子邻近不需要的细胞时能够选择性裂解。合适的裂解位点和可以裂解它们的试剂在下文中进行更详细地描述。
当所述免疫细胞结合区域被掩蔽时，所述另外部分与免疫细胞结合的亲和力通常比免疫细胞结合区域被解除掩蔽时低至少5倍，并且更通常比免疫细胞结合区域被解除掩蔽时低至少10、50或100倍。最优选地，当所述免疫细胞结合区域被掩蔽时，在所述另外部分和免疫细胞之间没有可检测到的结合。评估部分与细胞的结合的方法是本领域常见的并包括，例如，放射性标记分析、荧光标记技术和流式细胞术。便利地，所述另外部分是标记的并在均有利于在解除掩蔽和掩蔽状态下结合的条件下加至免疫细胞，并且比较所述免疫细胞和另外部分在掩蔽和解除掩蔽状态的结合程度。也可采用如荧光相关光谱法、荧光共振能量转移和分析超速离心的生物物理技术。
优选地，所述免疫细胞结合区域与免疫细胞的结合活化所述免疫细胞。因此，当所述免疫细胞结合区域被掩蔽时，所述另外部分通常活化免疫细胞比所述免疫细胞结合区域是解除掩蔽时低至少5倍，并且更通常比所述免疫细胞结合区域是解除掩蔽时低至少10、50或100倍。最优选地，当所述免疫细胞结合区域被掩蔽时，没有可检测到的免疫细胞的活化。评估免疫细胞活化的方法是本领域标准的并且包括上述细胞增殖和细胞因子分析。
在一个实施方案中，所述免疫细胞结合区域是掩蔽的，原因是所述另外部分被锁定于一个特别构象中，在该构象中所述免疫细胞结合区域不能接近免疫细胞。当邻近不需要的细胞时，通过例如所述分子中的一个或多个裂解位点的选择性裂解(其诱导所述另外部分中的构象变化，该构象变化解除了对所述免疫细胞结合区域的掩蔽)，所述免疫细胞结合区域可以被解除掩蔽。
该实施方案的例子如图1所示，其中每个靶向部分和另外部分分别是表达于单个多肽链上的scFv抗体。在图1中，靶向部分(1)对应于一个scFv单元，该scFv单元包含两个抗体可变区(在图中以椭圆形表示)：第一重链可变区(VH)和第一轻链可变区(VL)，该可变区可以配对在一起以形成特异性针对不需要的细胞上表达的抗原的第一功能表位结合位点。靶向部分结合另外部分(3)，其对应于另一个scFv单元，该scFv单元包含两个抗体可变区(在图中以椭圆形表示)：第二VH结构域和第二VL结构域，该结构域可以配对在一起以形成特异性针对免疫细胞上表达的抗原(如T细胞上的CD3)的第二功能表位结合位点。因此，在图1中，当第二VH结构域与第二VL结构域配对时，所述另外部分的免疫细胞结合区域(4)对应于所形成的第二功能表位结合位点。图1中的所述另外部分(3)的第二VH结构域和第二VL结构域通过多肽接头共价结合，所述多肽接头的长度不足以使两个结构域之间配对，具有将另外部分(3)锁定在特别构象中的作用，在该构象中所述免疫细胞结合区域(4)是掩蔽的。但是，当所述分子邻近不需要的细胞(2)时，连接第二VH结构域和第二VL结构域的多肽接头内的蛋白酶裂解位点(5)的裂解，破坏了第二VH结构域和第二VL结构域之间的共价连接，使得所述结构域可以配对并形成第二功能表位结合位点。换句话说，蛋白酶裂解位点的裂解导致另外部分(3)中的构象改变，其将所述免疫细胞结合区域(4)解除掩蔽。
因此，并且如图1所示，在一个实施方案中，所述另外部分是scFv抗体(3)，其中所述连接VH和VL结构域的接头长度不足以使VH和VL结构域配对，从而使scFv抗体(3)不能结合免疫细胞，并且当邻近不需要的细胞(2)时，在所述接头中的一个或多个裂解位点(5)的选择性裂解诱导VH和VL结构域的配对，使得scFv抗体(3)能够结合免疫细胞。优选地，所述免疫细胞结合区域是T细胞结合区域，如结合T细胞上的CD3抗原的区域。
优选地，在本发明所述的这个和其它实施方案中接头是肽接头。但是，也可以采用其它接头包括聚合物、核苷酸、核酸、多糖链、脂质有机物质(如聚乙二醇)。
重要地，连接所述另外部分的VH和VL结构域的接头长度必须不足以使VH和VL结构域之间配对。
‘在VH和VL结构域之间配对’的含义包括：以与相应的完整IgG亲本抗体或scFv抗体中天然配对状态相同或相似的构象正确并置(juxtapose)匹配的VH和VH结构域，使得配对的结构域以与对相应的完整IgG亲本抗体或scFv抗体相似的亲和力结合抗原。VH和VL结构域的配对可以通过本领域已知的监测抗体/抗原结合的任何结合分析来评估。合适的技术包括ELISA、SPR、流式细胞术、FRET和结构研究。还可以采用竞争性分析，其中过量使用VH或VL结构域的一种或另一种。如果所述过量导致结合提高，这将意味着结构域没有配对。此外，通过研究它们结合以及活化相应免疫细胞的能力，功能性免疫细胞分析可用于评估所述另外部分的VH和VL结构域的配对。例如，如果另外部分的VH和VL结构域对T细胞上的CD3抗原是特异性的，通过进行功能性T细胞分析适用于监测正确配对是恰当的。
通常，连接scFv抗体的VH结构域和VL结构域的肽接头，其为14个氨基酸或更短，长度不足以使VH和VL结构域之间配对。因此，当接头是肽时，肽接头长度通常是14个氨基酸或更短，如13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。
优选地，图1中实施例的靶向部分包括VH结构域和VL结构域，该结构域可以配对在一起以形成特异性针对不需要的细胞上表达的抗原的功能性表位结合位点。在这种情况下，可以理解的是所述靶向部分可被连接至另外部分使得所述分子可以被表达为单个多肽链。
在一个替代的实施方案中，所述免疫细胞结合区域是掩蔽的，因为所述分子包含一个或多个掩蔽部分，其阻止所述免疫细胞结合区域接近所述T细胞。因此，所述分子可以包含至少1或2或3或4或更多个掩蔽部分。
所述一个或多个掩蔽部分可以是包括多肽或肽或抗体或小分子的任何化学部分(moiety)。可以理解的是，任何能够空间位阻阻断所述另外部分的免疫细胞结合区域的部分可以用作掩蔽部分。合适的多肽的例子包括白蛋白和血红蛋白。此类部分可以由本领域技术人员很容易地鉴定。例如，针对已知活化免疫细胞的抗体(如活化T细胞的scFv片段)的抗体可通过噬菌体展示技术或通过用合适的抗体免疫小鼠来选择。相似地，可筛选小分子文库以鉴定免疫细胞的已知活化剂的抑制剂，例如在免疫细胞活化分析中。可以采用的其它技术包括分子计算机建模和核糖体展示方法。
在一个实施方案中，并且如图1、2和4所示，所述一个或多个掩蔽部分是免疫球蛋白结构域。所述免疫球蛋白结构域可以是源自抗体的重链或轻链结构域，并且同样它们可以是源自抗体的可变或恒定区。因此，所述一个或多个掩蔽部分可以是重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、重链恒定区(CH)和轻链恒定区(CL)中的任意一个或多个。例如，所述分子可以包含两个掩蔽部分，其为VL结构域和VH结构域，或者其为CL结构域和CH结构域。当所述一个或多个掩蔽部分是VL结构域和VH结构域时，这两个结构域可以对应于scFv构建体。可以理解的是，当所述一个或多个掩蔽部分是免疫球蛋白结构域时，它们可以具有针对所述靶向部分的免疫细胞结合区域具有特异性的独特型。但是，优选地，用作掩蔽部分的所述免疫球蛋白结构域并不特异性结合体内的任何其它蛋白，并因此是具有低毒性的结构域。
在另一个实施方案中，并如图3所示，所述掩蔽部分是所述另外部分的免疫细胞结合区域能够结合的免疫细胞表面抗原。例如，如果所述另外部分的免疫细胞结合区域结合T细胞上的CD3抗原，所述掩蔽部分可以是CD3抗原(或其亚基之一)。在这种情况下，所述掩蔽部分与T细胞竞争结合所述另外部分的免疫细胞结合区域。可以理解的是，所述掩蔽部分不必是整个免疫细胞表面抗原而是可以包含免疫细胞表面抗原的一部分，前提是该部分能够结合所述免疫细胞结合区域。合适的部分包括能够结合所述免疫细胞结合抗原的所述免疫细胞表面抗原的外部的部分(parts)或其部分(portion)。因此，可以采用CD3抗原的亚基之一(如CD ε)的外部的部分。多方法均可用于确定免疫细胞表面抗原与免疫细胞结合区域之间的结合，包括，例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)、表面等离子共振分析、基于芯片的分析、免疫细胞荧光、酵母双杂交技术和噬菌体展示，这是本领域中常见的做法并且描述于，例如，Plant et al(1995)Analyt Biochem,226(2),342-348和Sambrook et al(2001)Molecular Cloning A Laboratory Manual.Third Edition.ColdSpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York。免疫细胞表面抗原的该部分(portion)包括在免疫细胞表面抗原的定义中。因此，所述掩蔽部分可以包括免疫细胞表面抗原(如CD3抗原)的抗原性部分。通常，这些部分包含一段至少8个氨基酸的氨基酸残基，通常至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸，以及更通常至少25、50、75或100个氨基酸。
通常，所述一个或多个掩蔽部分通过一个或多个接头共价连接至所述分子。如下文进一步描述的，这些接头可以包含一个或多个裂解位点，当所述分子邻近不需要的细胞时该接头是选择性可裂解的。或者，所述一个或多个掩蔽部分可以非共价连接至所述分子。在这种情况下，下文所述一个或多个裂解位点可以定位于所述另外部分的一个或多个位置，这样在裂解时，与掩蔽部分非共价结合的另外部分的部分从所述分子释放，并且含有免疫细胞结合区域的另外部分的部分保留于所述分子中。这样，一个或多个裂解位点的裂解导致免疫细胞结合区域被解除掩蔽。
所述一个或多个掩蔽部分可以通过简单阻断所述免疫细胞结合区域来操作，使得该区域不能接近免疫细胞。在这种情况下，在解除掩蔽时所述另外部分中没有构象改变，并且所述一个或多个掩蔽部分的去除简单暴露了潜在的T细胞结合区域使得它可以结合免疫细胞。可以理解的是，如上所述，所述掩蔽部分可以其空间位阻阻断免疫细胞区域的任何合适的化学部分。该实施方案的例子如图2和3所示，其中所述掩蔽部分分别是免疫球蛋白结构域或者是免疫细胞表面抗原。
和图1中相同，在图2中，所述靶向部分和另外部分的每一个均包含各自的VH和VL结构域配对。虽然图2显示含有两个多肽链的分子，可以理解的是，所述靶向部分和另外部分的每一个也可以各自为表达于单个多肽链上的scFv抗体。在该图中，所述靶向部分(1)包含第一VH结构域和第一VL结构域，所述结构域可以配对在一起以形成特异性针对不需要的细胞上表达的抗原的第一功能表位结合位点。所述靶向部分(1)连接到另外部分(3)，所述另外部分(3)包含第二VH结构域和第二VL结构域，其可以配对在一起以形成特异性针对免疫细胞上表达的抗原(如CD3)的第二功能表位结合位点，即所述免疫细胞结合区域(4)。但是，所述免疫细胞结合区域(4)是掩蔽的，因为所述另外部分的第二VH结构域和第二VL结构域分别连接至包含CH结构域的第一掩蔽部分(6)和包含CL结构域的第二掩蔽部分(6)，其作用是阻断免疫细胞结合区域。当所述分子邻近不需要的细胞时，在连接所述第二VH结构域和第一掩蔽部分的CH结构域以及连接所述第二VL结构域和第二掩蔽部分的CL结构域各自的多肽接头内的蛋白酶裂解位点(5)的裂解，使CH结构域和CL结构域掩蔽部分(6)释放，从而使第二功能表位结合位点变成可以接近免疫细胞。换句话说，蛋白酶裂解位点的裂解解除了所述免疫细胞结合区域的掩蔽。
因此，并如图2所示，在一个实施方案中，本发明的所述分子包含：
另外部分(3)，其包含能够特异性结合免疫细胞的VH结构域和VL结构域，
第一接头，其连接所述另外部分(3)的VH结构域至第一掩蔽部分(6)的CH结构域，以及
第二接头，其连接所述另外部分(3)的VL结构域至第二掩蔽部分(6)的CL结构域，
使得所述第一和第二掩蔽部分(6)的所述CH和CL结构域掩蔽所述VH和VL结构域的结合区域(4)，从而阻止所述另外部分与免疫细胞的结合，并且
其中当邻近不需要的细胞(2)时，在所述接头中的一个或多个裂解位点(5)的选择性裂解从所述另外部分(3)释放所述第一和第二掩蔽部分(6)，从而使所述另外部分(3)结合免疫细胞。优选地，所述免疫细胞结合区域是T细胞结合区域如结合T细胞上的CD3抗原的区域。优选地，所述靶向部分包含VH结构域和VL结构域，其可以配对在一起以形成特异性针对不需要的细胞上表达的抗原的功能表位结合位点。所述靶向部分可以与或可以不与所述另外部分表达为单个多肽。可以理解的是，在该实施方案中，所述第一和第二掩蔽部分可以是任何能够阻止所述免疫细胞结合区域与所述免疫细胞结合的化学部分，例如通过空间位阻阻断。因此，为免生疑问，尽管图2示出了掩蔽部分为CH和CL结构域，可以理解的是，可以采用任何一个或多个合适的掩蔽部分，包括免疫球蛋白结构域的任何组合。
在图3中，所述靶向部分和另外部分的每一个各自为作为单个多肽链表达的scFv抗体。但是，可以理解的是，图3中所示的所述分子的所述靶向部分和另外部分各自的VH和VL结构域可以等同存在于配对在一起的两条多肽链上(例如scFv样分子或双抗体)。在该图中，所述靶向部分(1)对应于一个scFv单元，所述scFv单元包含第一VH结构域和第一VL结构域，所述结构域可以配对在一起以形成特异性针对不需要的细胞上表达的抗原的第一功能表位结合位点。所述靶向部分连接对应于另一个scFv单元的另外部分(3)，所述另一个scFv单元包含第二VH结构域和第二VL结构域，其可以配对在一起以形成特异性针对免疫细胞上表达的抗原(如CD3)的第二功能表位结合位点，即免疫细胞结合区域(4)。但是，所述免疫细胞结合区域是掩蔽的，因为接头将所述另外部分(3)的第二VH结构域或第二VL结构域之一连接至免疫细胞表面抗原，即所述掩蔽部分(6)，使得所述免疫细胞表面抗原结合并阻断所述免疫细胞结合区域(4)。当所述分子邻近不需要的细胞(2)时，接头内的蛋白酶裂解位点(5)的裂解使所述免疫细胞表面抗原(6)离开所述免疫细胞结合区域，从而使第二功能表位结合位点(4)变成可以接近免疫细胞。换句话说，蛋白酶裂解位点(5)的裂解解除所述免疫细胞结合区域(4)的掩蔽。该实施方案涉及所述分子内的免疫细胞和免疫细胞表面抗原(6)竞争结合所述另外部分(3)的免疫细胞结合区域(4)。当没有邻近不需要的细胞(2)时，所述免疫细胞表面抗原(6)通过接头连接所述分子，这增加了免疫细胞表面抗原(6)的局部浓度并因此有利于免疫细胞表面抗原(6)而不是免疫细胞与免疫细胞结合区域(4)的结合。当所述分子邻近不需要的细胞(2)时，连接免疫细胞表面抗原(6)至所述分子的接头被裂解并因此所述免疫细胞表面抗原(6)游离以离开所述免疫细胞结合区域(4)，从而使免疫细胞现在可以与其结合。
因此，本发明的所述分子可以包含：
另外部分(3)，其包含能够特异性结合免疫细胞的VH结构域和VL结构域，以及
接头，其连接所述另外部分(3)至免疫细胞表面抗原(6)，
从而使所述免疫细胞表面抗原(6)结合并掩蔽所述VH和VL结构域的免疫细胞结合区域(4)以阻止另外部分(3)与免疫细胞的结合，
其中当邻近不需要的细胞(2)时，在所述接头中的一个或多个裂解位点(5)的选择性裂解从所述VH和VL结构域的免疫细胞结合区域(4)释放所述免疫细胞表面抗原(6)以允许所述另外部分(3)结合免疫细胞。优选地，所述免疫细胞结合区域(4)是T细胞结合区域如特异性结合T细胞的CD3抗原的区域，并且所述免疫细胞表面抗原是T细胞表面抗原如CD3抗原或其部分。优选地，如图3所示，所述靶向部分包含VH结构域和VL结构域，其可以配对在一起以形成特异性针对不需要的细胞上表达的抗原的功能表位结合位点。以这种方式，所述靶向部分和另外部分可以对应于可以作为单个多肽链表达的两个独立的scFv单元。
在一个可选的实施方案中，所述一个或多个掩蔽部分通过促进所述另外部分的构象来操作，使得所述免疫细胞结合区域不能接近免疫细胞。在这种情况下，解除掩蔽确实涉及所述另外部分的构象改变，使得所述免疫细胞结合区域现在变成可以接近结合免疫细胞。例如，当所述另外部分包含特异性结合免疫细胞上的抗原(如CD3抗原)的VH和VL结构域配对时，可以理解的是，所述一个或多个掩蔽部分可以阻止所述另外部分的VH和VL结构域成分的配对，使得所述VH和VL结构域不在结合所述免疫细胞抗原所期望的三维构象中。可以采用各种方法阻止另外部分的VH和VL结构域的配对。一种这样的方法示例于图4，其采用与所述另外部分的VH和VL结构域配对的虚拟(dummy)可变区，使得所述另外部分的VH和VL结构域不能互相配对。但是，可以采用任何合适的阻止所述另外部分的VH和VL结构域配对的掩蔽部分，例如通过结合至VH-VL界面(interface)蛋白表面。在所有情况下，当所述分子邻近不需要的细胞时，通过在分子内一个或多个裂解位点的裂解来解除对VH和VL结构域配对的阻止。
在图4中，所述靶向部分(1)对应于scFv单元，所述scFv单元包含第一VH结构域和第一VL结构域，所述结构域可以配对在一起以形成特异性针对不需要的细胞上表达的抗原的第一功能表位结合位点。第一接头连接所述靶向部分(1)的第一VL结构域至另外部分(3)的第二VH结构域，第二接头连接所述靶向部分(1)的第一VH结构域至包含VH结构域的第一掩蔽部分(6)，第三接头连接所述另外部分(3)的第二VH结构域至包含VL结构域的第二掩蔽部分(6)，并且第四接头连接第一掩蔽部分的VH结构域至所述另外部分(3)的第二VL结构域；其中当配对时，所述另外部分的所述第二VH和第二VL结构域形成特异性针对免疫细胞上表达的抗原(如T细胞上的CD3抗原)的第二功能表位结合位点，即所述免疫细胞结合区域(4)；并且其中所述第三和第四接头长度足以使所述另外部分(3)的所述第二VH结构域与第二掩蔽部分(6)的VL结构域配对，并且所述另外部分(3)的所述第二VL结构域与第一掩蔽部分(6)的VH结构域配对。因此，图4中的所述第一和第二掩蔽部分阻止所述另外部分的第二VH和第二VL结构域配对并因此掩蔽所述免疫细胞结合区域(4)。以这种方式，所述掩蔽部分的可变区作为与所述另外部分的第二VH和VL结构域配对的‘虚拟’VH和VL结构域。但是，当所述分子邻近不需要的细胞(2)时，存在于所述第三和第四接头中的一个或多个裂解位点(5)的裂解从与之配对的所述第二掩蔽部分(6)的VL结构域和所述第一掩蔽部分(6)的VH结构域分别释放所述第二VH结构域和第二VL结构域，使得所述另外部分的第二VH结构域和第二VL结构域可以配对以形成所述免疫细胞结合区域(4)。换句话说，存在于第三和第四接头中的所述裂解位点(5)的裂解已经使所述分子的构象重排，在该重排的构象中第二VH结构域和第二VL结构域正确配对，从而恢复了所述免疫细胞的结合活性。所述免疫细胞结合区域(4)已被解除掩蔽。
因此，在一个实施方案中，本发明的所述分子包含：
另外部分(3)，所述另外部分(3)独立包含第一VH和第一VL结构域，当配对时其能够特异性结合免疫细胞，
接头，所述接头连接第一VH结构域至第一掩蔽部分(6)的第二VL结构域，以及
接头，所述接头连接第一VL结构域至第二掩蔽部分(6)的第二VH结构域，
从而使所述另外部分的第一VH和第一VL结构域不配对并且所述另外部分不能结合所述免疫细胞，以及
其中当邻近不需要的细胞(2)时，在所述接头中的一个或多个裂解位点(5)的选择性裂解使所述第一VH和第一VL结构域配对，从而使所述另外部分能够结合所述免疫细胞。优选地，所述免疫细胞结合区域(4)是T细胞结合区域，如特异性结合T细胞上的CD3抗原的区域。鉴于所述掩蔽部分掩蔽所述免疫细胞结合区域，当然可以理解的是在该实施例中，所述掩蔽部分的第二VH结构域和第二VL结构域不是能够分别与所述另外部分的第一VL结构域和第一VH结构域配对的，以形成特异性针对免疫细胞上表达的抗原(如T细胞上表达的抗原如CD3抗原)的功能表位结合位点。在任何情况下，还可以理解的是，任何阻止所述另外部分的所述VH和VL结构域配对的合适的掩蔽部分可以取代图4中所示的VH和VL掩蔽部分。优选地，并如图4所示，所述靶向部分包含VH结构域和VL结构域，其可以配对在一起以形成特异性针对不需要的细胞上表达的抗原的功能表位结合位点。在这种情况下，可以理解的是，所述靶向部分可以被连接至所述另外部分和所述一个或多个掩蔽部分使得所述分子能够作为单个多肽链表达。所述靶向部分可以在多肽链的中间，侧接所述另外部分和/或一个或多个掩蔽部分。例如，所述靶向部分可以是scFv单元，它的一个结构域连接至所述另外部分的第一VL结构域，它的其它结构域连接至第一掩蔽部分的第二VL结构域，或者所述靶向部分可以是scFv单元，它的一个结构域连接至所述另外部分的所述第一VH结构域，它的其它结构域连接至所述第二掩蔽部分的第二VH结构域。或者，所述靶向部分可以位于多肽链的任一端。
优选地，如图4所示，连接所述第一VH结构域至第一掩蔽部分的第二VL结构域的所述接头，长度足以使所述第一VH结构域与所述第二VL结构域配对，并且连接所述第一VL结构域至第二掩蔽部分的第二VH结构域的所述接头，长度足以使所述第一VL结构域与第二VH结构域配对。通常，所述接头是肽并因此必须具有足够数量的氨基酸以允许在所述VH和VL结构域之间配对。通常，连接scFv抗体的VH结构域和VL结构域的15个氨基酸或更长的肽接头，长度足以允许在所述VH和VL结构域之间配对。因此，当所述接头是肽时，它们通常长度为15个氨基酸或更长，如至少16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸长。在VH和VL结构域之间的配对可以通过本领域已知的常规方法评估，包括上述的那些。
免疫细胞结合区域的选择性解掩蔽
‘选择性掩蔽’含义包含：所述免疫细胞结合区域通过选择性驻留于不需要的细胞附近的试剂的存在被解除掩蔽，其中该试剂作用是解除掩蔽所述免疫细胞结合区域。优选地，解除掩蔽所述免疫细胞结合区域的所述试剂驻留在不需要的细胞附近的浓度比所述试剂在不需要的细胞附近之外的浓度高至少五倍或十倍、并更优选高至少100或500或1000倍。最优选地，解除掩蔽所述免疫细胞结合区域的所述试剂仅在不需要的细胞附近发现。
在一个优选的实施方案中，当在不需要的细胞附近时，所述免疫细胞结合区域通过所述分子中的一个或多个裂解位点的选择性裂解被解除掩蔽。在这种情况下，所述试剂是裂解所述一个或多个裂解位点的试剂。换句话说，所述免疫细胞结合区域可以通过在邻近不需要的细胞的所述分子内的一个或多个裂解位点的选择性裂解来解除掩蔽。
因此，本发明包括一种分子，所述分子包含(i)靶向部分，其能够直接或间接靶向不需要的细胞，以及(ii)另外部分，其具有掩蔽的免疫细胞结合区域以阻止另外部分结合免疫细胞，其中当邻近所述不需要的细胞时，所述分子中的一个或多个裂解位点的选择性裂解解除了所述免疫细胞结合区域的掩蔽，以允许所述另外部分与免疫细胞结合。优选地，所述免疫细胞结合区域是T细胞结合区域，包括与T细胞上CD3抗原和/或的TCR结合的区域。因此，可以理解的是，本发明提供一种分子，所述分子包含(i)靶向部分，其能够直接或间接靶向不需要的细胞，以及(ii)另外部分，其具有掩蔽的T细胞结合区域以阻止另外部分结合T细胞的，其中当邻近所述不需要的细胞时，所述分子中的一个或多个裂解位点的选择性裂解解除了所述T细胞结合区域的掩蔽，以允许所述另外部分与T细胞结合。
“在邻近不需要的细胞可选择性裂解的裂解位点”包含以下含义：仅能够通过选择性驻留在不需要的细胞附近的试剂裂解的位点，以对所述免疫细胞结合区域解除掩蔽。优选地，裂解所述一个或多个裂解位点的所述试剂驻留在不需要的细胞附近的浓度比所述试剂在不需要的细胞附近之外的浓度高至少五倍或十倍、并更优选至少高100或500或1000倍。最优选地，裂解所述一个或多个裂解位点的所述试剂仅在不需要的细胞附近发现。例如，当不需要的细胞是特定肿瘤细胞(如乳腺肿瘤细胞)时，所述一个或多个裂解位点可以是由选择性驻留在所述特定肿瘤(如乳腺肿瘤)但不驻留在所述特定肿瘤(如乳腺肿瘤)之外的试剂裂解的位点。
‘邻近细胞或在细胞附近’的含义包括：在所述细胞的表面或接近所述细胞的表面，或二者，或在紧密环绕所述细胞的环境中，如血液、淋巴和其它体液。
在邻近不需要的细胞时所述一个或多个裂解位点被选择性裂解使得所述另外部分的免疫细胞结合区域在邻近不需要的细胞时被优先解除掩蔽以募集免疫细胞至优选不需要的细胞而不是需要的细胞。因此，优选一个或多个裂解位点是选择性裂解的位点，使得所述免疫细胞结合区域在邻近不需要的细胞时被解除掩蔽的程度比临近需要的细胞时解除掩蔽的程度高至少五倍或十倍、并且更优选至少100或500或1000倍。最优选地，所述免疫细胞结合区域在邻近需要的细胞时没有被解除掩蔽，并因此免疫细胞没有被募集至需要的细胞。
对于给定不需要的细胞，本领域技术人员能够采用本领域已建立的方法鉴定在邻近不需要的细胞时可被选择性裂解的一个或多个合适的裂解位点。例如，何种蛋白酶裂解何种肽可通过查询肽文库并研究裂解后的片段谱的MS分析来进行评估。并且，如下文进一步所述，可以检索到公开的蛋白酶裂解基序和肽裂解数据的文献。也可以分析基因表达和蛋白质组学数据以鉴定何种蛋白酶由特定不需要的细胞表达。
因为一个或多个裂解位点在邻近不需要的细胞被选择性裂解，所述免疫细胞结合区域在邻近不需要的细胞时被选择性解除掩蔽。
所述一个或多个裂解位点可定位于所述另外部分的独立部分(如独立的免疫球蛋白结构域)，使得在所述裂解位点裂解时诱导构象改变从而使所述另外部分的独立部分重排以解除所述免疫细胞结合区域的掩蔽(参见图1)。所述一个或多个裂解位点可定位于所述一个或多个掩蔽部分和所述另外部分和/或靶向部分之间。因此，所述一个或多个裂解位点可定位于所述一个或多个掩蔽部分和所述另外部分之间(参见图2和3)，或者它们可定位于所述一个或多个掩蔽部分和所述靶向部分之间(参见图4)，或者它们可定位于所述一个或多个掩蔽部分和所述靶向部分和另外部分的每一个之间(参见图4)。当所述另外部分、靶向部分和掩蔽部分的任何一个包含一个或多个免疫球蛋白结构域时，可以理解的是，在所述免疫细胞结合区域解除掩蔽时，所述一个或多个裂解位点应当定位于所述免疫球蛋白结构域之间以允许整个免疫球蛋白结构域的移动而不是仅所述结构域的一部分移动。
所述裂解位点可以是由可被酶裂解的位点，如蛋白酶、核酸酶、脂肪酶、裂解酶、磷酸酶或糖酶的任何一个，其可以是或不是膜结合的。因此，可以理解的是，所述裂解位点可以是由与不需要的细胞的膜结合的酶或由不需要的细胞分泌的酶裂解的位点。
通常，所述裂解位点是蛋白酶裂解位点。因此，当不需要的细胞是肿瘤细胞时，所述一个或多个裂解位点可以由驻留在肿瘤细胞附近的蛋白酶选择性裂解。换句话说，所述蛋白酶裂解位点可以是可被肿瘤相关蛋白酶裂解的位点。公知的是，在肿瘤发展过程中，肿瘤异常表达允许其侵入局部组织并最终发生转移的蛋白酶。
所述蛋白酶可以包括任意的半胱氨酸蛋白酶(包括组织蛋白酶(cathepsin)家族B、L、S等)、天冬氨酰蛋白酶(包括组织蛋白酶D和E)和丝氨酸蛋白酶(包括组织蛋白酶A和G、凝血酶、纤溶酶、尿激酶、组织纤溶酶原活化剂)。所述蛋白酶可以是金属蛋白酶(MMP1-28)，其包括膜结合(MMP14-17和MMP24-25)和分泌形式(MMP1-13和MMP18-23和MMP26-28)。所述蛋白酶可以属于解整合素金属蛋白酶(ADAM)和带有血小板凝血酶敏感蛋白基序的解整合或金属蛋白酶(ADAMTS)蛋白酶家族。其它的例子包括CD10(CALLA)和前列腺特异性抗原(PSA)。可以理解的是，所述蛋白酶可以是或不是膜结合的。
蛋白酶裂解位点是科学文献中公知的，并且包含这些裂解位点的接头序列可以采用所建立的遗传工程学技术或通过本领域已知的合成技术很容易地进行构建。
蛋白酶裂解位点可以是由下表4中所列的任意蛋白酶裂解的位点，该表显示了选定的蛋白酶在各种肿瘤类型中的表达。提供了针对所述蛋白酶的候选底物。因此，为了治疗特定肿瘤类型，本领域技术人员通常选择一个或多个由已知在该肿瘤类型高表达的蛋白酶选择性裂解的蛋白酶裂解位点，如表中所见。例如，为了治疗乳腺癌，优选采用可被任意以下裂解的蛋白酶裂解位点：uPA、tPA、matriptase、matriptase 2、组织蛋白酶K、组织蛋白酶O、MMP1、MMP2、MMP3、MMP11、MMP12、MMP17、ADAM9、ADAM12、ADAM15、ADAM17、ADAM28或ADAMTS15等。可以理解的是，由本领域技术人员选择的所述一个或多个蛋白酶裂解位点包括由不同蛋白酶裂解的位点，其可以帮助进一步提高本发明的所述分子的特异性。
相似地，表5列出了已经报道ADAM蛋白酶在其中过表达的肿瘤位点，并因此在一个实施方案中，所述一个或多个裂解位点由表5所列的ADAM蛋白酶的一个选择性裂解。因此，所述分子可用于预防或治疗相应的肿瘤类型。
所述一个或多个裂解位点可以由以下任意人蛋白酶选择性的裂解(MEROPS peptidase database number provided in parentheses；Rawlings N.D.,Morton F.R.,Kok,C.Y.,Kong,J.&Barrett A.J.(2008)MEROPS:the peptidasedatabase.Nucleic Acids Res.36Database issue,D320-325)：胃蛋白酶A(MER000885),胃亚蛋白酶(MER000894),memapsin-2(MER005870),肾素(MER000917),组织蛋白酶D(MER000911),组织蛋白酶E(MER000944),memapsin-1(MER005534),新天冬氨酸蛋白酶(napsin)A(MER004981),Mername-AA034肽酶(MER014038),胃蛋白酶A4(MER037290),胃蛋白酶A5(Homo sapiens)(MER037291),hCG1733572(Homo sapiens)-型推断的肽酶(MER107386),新天冬氨酸蛋白酶B假基因(MER004982),CYMP g.p.(Homosapiens)(MER002929),亚家族A1A未指定肽酶(MER181559),小鼠乳腺肿瘤病毒逆转录胃蛋白酶(MER048030),兔内源性逆转录病毒内肽酶(MER043650),S71相关人内源性逆转录胃蛋白酶(MER001812),RTVL-H-型推断的肽酶(MER047117),RTVL-H-型推断的肽酶(MER047133),RTVL-H-型推断的肽酶(MER047160),RTVL-H-型推断的肽酶(MER047206),RTVL-H-型推断的肽酶(MER047253),RTVL-H-型推断的肽酶(MER047260),RTVL-H-型推断的肽酶(MER047291),RTVL-H-型推断的肽酶(MER047418),RTVL-H-型推断的肽酶(MER047440),RTVL-H-型推断的肽酶(MER047479),RTVL-H-型推断的肽酶(MER047559),RTVL-H-型推断的肽酶(MER047583),RTVL-H-型推断的肽酶(MER015446),人内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶同源物1(MER015479),人内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶同源物2(MER015481),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因1(Homo sapiens染色体14)(MER029977),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因2(Homo sapiens染色体8)(MER029665),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因3(Homosapiens染色体17)(MER002660),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因3(Homo sapiens染色体17)(MER030286),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因3(Homo sapiens染色体17)(MER047144),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因5(Homo sapiens染色体12)(MER029664),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因6(Homo sapiens染色体7)(MER002094),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因7(Homo sapiens染色体6)(MER029776),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因8(Homo sapiens染色体Y)(MER030291),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因9(Homosapiens染色体19)(MER029680),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因10(Homo sapiens染色体12)(MER002848),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因11(Homo sapiens染色体17)(MER004378),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因12(Homo sapiens染色体11)(MER003344),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因13(Homo sapiens染色体2及类似)(MER029779),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因14(Homosapiens染色体2)(MER029778),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因15(Homo sapiens染色体4)(MER047158),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因15(Homo sapiens染色体4)(MER047332),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因15(Homo sapiens染色体4)(MER003182),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因16(MER047165),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因16(MER047178),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因16(MER047200),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因16(MER047315),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因16(MER047405),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因16(MER030292),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因17(Homo sapiens染色体8)(MER005305),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因18(Homo sapiens染色体4)(MER030288),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因19(Homo sapiens染色体16)(MER001740),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因21(Homo sapiens)(MER047222),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因21(Homo sapiens)(MER047454),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因21(Homo sapiens)(MER047477),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因21(Homo sapiens)(MER004403),内源性逆转录病毒逆转录胃蛋白酶假基因22(Homo sapiens染色体X)(MER030287),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047046),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047052),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047076),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047080),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047088),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047089),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047091),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047092),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047093),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047094),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047097),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047099),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047101),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047102),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047107),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047108),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047109),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047110),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047111),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047114),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047118),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047121),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047122),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047126),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047129),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047130),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047134),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047135),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047137),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047140),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047141),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047142),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047148),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047149),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047151),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047154),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047155),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047156),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047157),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047159),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047161),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047163),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047166),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047171),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047173),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047174),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047179),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047183),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047186),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047190),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047191),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047196),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047198),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047199),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047201),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047202),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047203),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047204),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047205),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047207),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047208),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047210),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047211),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047212),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047213),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047215),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047216),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047218),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047219),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047221),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047224),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047225),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047226),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047227),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047230),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047232),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047233),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047234),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047236),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047238),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047239),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047240),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047242),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047243),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047249),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047251),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047252),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047254),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047255),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047263),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047265),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047266),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047267),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047268),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047269),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047272),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047273),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047274),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047275),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047276),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047279),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047280),亚家族A2A非肽酶同源物(MER047281),亚家族A2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可以理解的是，对于给定的不需要的细胞类型，本领域技术人员可以容易地确定所采用的合适的一个或多个蛋白酶裂解位点，例如通过查询科技文献来确定哪种蛋白酶在该细胞类型是过表达的。Oncomine(https://www.oncomine.org)是一个在线癌基因表达数据库，因此当本发明的所述分子用于治疗癌症时，本领域技术人员可以检索该Oncomine数据库以鉴定可以适合用于治疗给定的癌症类型的特定的一个或多个蛋白酶裂解位点。可替代的数据库包括欧洲生物信息学研究所(European BioinformaticInstitute)(http://www.ebi.ac.uk),尤其是(http://www.ebi.ac.uk/gxa)。蛋白酶数据库包括PMAP(http://www.proteolysis.org)、ExPASy肽Cutter(http://ca.expasy.org/tools/peptide cutter)以及PMAP.CutDB(http://cutdb.burnham.org)。
值得注意的是，可能需要通过筛选肽文库以针对给定的不需要的细胞(例如肿瘤)引入多个潜在裂解位点并评估最佳裂解位点。此类肽可有效用作接头，例如，以连接所述另外部分至一个或多个掩蔽部分，或以促进所述另外部分的特定构象从而掩蔽所述另外部分的T细胞结合区域(参见图1所示的实施方案)。
表5：已报道ADAM在其中过表达的肿瘤位点
已在癌症中检测到大量蛋白水解的ADAM(解整合素金属蛋白酶)并且已经发现mRNA或蛋白水平相对于正常组织上调(改编自Nature ReviewsCancer8,932-941(2008年12月)|doi:10.1038/nrc2459)。
在一个实施方案中，所述蛋白酶可以是酯酶。
其它裂解位点包括在不需要的细胞附件在一定条件下(如肿瘤微环境)不稳定的连接。例如，所述一个或多个裂解位点可以包括在低氧肿瘤微环境下可被还原的二硫键，或者可以包括在酸性条件下断裂的pH敏感部分。但是，可以理解的是，所述一个或多个裂解位点必须在不需要的细胞附近可被选择性裂解并且因此与邻近所需要的细胞相比，所述连接在临近不需要的细胞时必须更不稳定并且优选仅在邻近不需要的细胞时不稳定。
或者，所述一个或多个裂解位点可以包含在邻近不需要的细胞时可被选择性裂解(如通过核酸酶)的核酸(如DNA或RNA)。其它裂解位点包括可由合适的酶裂解的含有磷酸(phosphate)、脂质或二硫键(disulphide)的部分。
本发明分子的合成
便利地，所述靶向部分通过一个或多个接头连接至所述另外部分。因此，‘接头’的含义包括将所述靶向部分连接至所述另外部分的化学部分。优选地，所述接头是肽接头。可以理解的是，此类接头可以含有一个或多个裂解位点，其在邻近不需要的细胞时可被选择性裂解以解除所述另外部分的免疫细胞结合区域的掩蔽。
如上所述，所述另外部分可能具有两个或多个独立的部分(part)。例如，所述另外部分可以包含两个或更多个多肽结构域，所述多肽结构域包含抗体的免疫球蛋白结构域(如scFv抗体)。这些部分(part)可以通过一个或多个接头连接在一起。因此，‘接头’的含义包括将另外部分的所述分离的部分(part)彼此连接的任何化学部分。优选地，所述接头是肽接头。例如，图1所示的分子的另外部分包含通过接头连接的VH结构域和VL结构域。这些接头可以含有一个或多个裂解位点，其在邻近不需要的细胞时可被选择性裂解以解除所述另外部分的T细胞结合区域的掩蔽。
还便利地，当所述分子包含一个或多个掩蔽部分时，其通过一个或多个接头的方式连接至所述靶向部分和/或另外部分。因此，‘接头’的含义包括将所述靶向部分连接至掩蔽部分的化学部分和将所述另外部分连接至掩蔽部分的化学部分。优选地，所述接头是肽接头。例如，图2和3显示了在另外部分和掩蔽部分之间的接头的例子，并且图4显示了另外部分和掩蔽部分之间、以及靶向部分和掩蔽部分之间的接头的例子。这些接头还可以含有一个或多个裂解位点，其在邻近不需要的细胞时可被选择性裂解以解除所述另外部分的T细胞结合区域的掩蔽。
合适的接头的例子包括肽、聚合物、核苷酸、核酸、多糖和脂质有机物质(如聚乙二醇)。但是，最优选地，本发明所述的接头是肽接头。通常，所述肽接头具有2至100个氨基酸残基，如多于或少于10、20、30、40、50、60、70、80和90个氨基酸。下面给出特定接头的优选长度的进一步细节。
可以理解的是，所述靶向部分可以共价结合或者非共价结合所述另外部分。同样，可以理解的是，所述靶向部分和/或另外部分可以共价结合或者非共价结合所述一个或多个掩蔽部分。
通常，所述靶向部分共价结合至所述另外部分，并且当所述分子包含一个或多个掩蔽部分时，所述一个或多个掩蔽部分共价结合至所述另外部分和/或靶向部分。
在一个实施方案中，所述靶向部分和另外部分通过接头(如肽接头)共价连接。当所述分子包含一个或多个掩蔽部分时，所述一个或多个掩蔽部分可以通过一个或多个接头(如肽接头)共价结合至所述另外部分和/或靶向部分。
可以理解的是，所述靶向部分、另外部分(包括其独立的部分(part))和一个或多个掩蔽部分不必互相直接连接，但可以通过一个或多个间隔物(spacer)部分(如肽)连接。例如，所述靶向部分可以连接至化学部分(如肽)，所述化学部分进而连接至所述另外部分。相似地，所述另外部分可以连接至一个或多个化学部分(如肽)，所述活性部分进而连接至一个或多个相应的掩蔽部分。在一个实施方案中，此类间隔物部分可以包含裂解位点，其如上所述在邻近不需要的细胞时可被选择性的裂解。可以理解的是，所述间隔物部分可用于防止空间位阻并促进蛋白酶裂解。
基于上述情况，可以理解的是，本发明提供一种分子，所述分子包含：(i)靶向部分，其能够直接或间接靶向不需要的细胞，(ii)另外部分，其具有掩蔽的免疫细胞结合区域以阻止另外部分结合免疫细胞，(iii)一个或多个掩蔽部分，其连接至所述另外部分和/或靶向部分，其中一个或多个掩蔽部分作用在于掩蔽所述另外部分的免疫细胞结合区域，以及(iv)在所述一个或多个掩蔽部分之间的一个或多个可裂解位点，其中所述一个或多个可裂解位点在邻近不需要的细胞时可被选择性裂解以解除所述免疫细胞结合区域的掩蔽。
在一个优选的实施方案中，其中所述靶向部分、另外部分以及(如果存在)所述一个或多个掩蔽部分共价连接并且其中所有部分均是肽或多肽，可以理解的是，所述分子的所述组件部分可以是一个或多个各自可由一个或多个核酸分子编码的融合多肽的部分(part)。本发明包括此类核酸分子和含有它们的宿主免疫细胞。例如，靶向部分(如抗体)可以采用本领域已经建立的遗传工程化技术进行遗传工程加工以含有所述另外部分以及(如果存在)所述一个或多个掩蔽部分。因此，可以理解的是，所述另外部分(包括其独立的部分(part))以及(如果存在)所述一个或多个掩蔽部分可嵌入所述靶向部分的多肽序列内中，前提是在所述分子邻近不需要的细胞时所述另外部分的免疫细胞结合区域能被解除掩蔽，从而使所述另外部分可以结合至免疫细胞。可以理解的是，所述靶向部分、另外部分以及(如果存在)一个或多个掩蔽部分均不必由连续节段的多核苷酸编码。例如，尽管所述另外部分可以融合至所述靶向部分的末端，并且如果存在的话，所述一个或多个掩蔽部分融合至所述另外部分的末端，也可以涵盖所述分子的各部分可以由非连续的多核苷酸序列编码，并且在这些非连续的多核苷酸序列之间，可以存在编码所述分子的其他部分的多核苷酸序列。例如，从图4可以明显看到所述另外部分的独立部分(part)由多核苷酸序列的非连续节段编码并且在这些节段之间存在编码所述靶向部分的多核苷酸序列。
还可以理解的是，本发明的所述分子可以包含折叠成正确构象的两个或更多个多肽链，其中所述两个或更多个多肽链是混合的。所述两个或更多个多肽链的每一个均可以包含所述靶向部分、另外部分(包括其独立的部分(part))以及(如果存在)所述一个或多个掩蔽部分中的一个或多个。这可以由图2所示的分子示例并且当所述靶向部分、另外部分以及(如果存在)所述一个或多个掩蔽部分均包含一个或多个免疫球蛋白结构域时尤其相关，原因是一个多肽链上的结构域(如VH结构域)可以与另一个多肽链上的结构域(如VL结构域)配对。源自不同多肽链的免疫球蛋白结构域的配对是本领域公知的，并且形成双抗体和三抗体的制备基础。
因此，在具体的实施方案中当所述靶向部分、另外部分以及(如果存在)所述一个或多个掩蔽部分共价连接并且当所有的部分均为肽或多肽时，本发明的所述分子可以被认为是双特异性抗体(如BiTE双特异性抗体)。例如，所述双特异性抗体可以包含(i)第一部分，其能够特异性结合不需要的细胞和(ii)第二部分，其包含掩蔽的免疫细胞结合区域以阻止所述第二部分与免疫细胞的结合，其中所述掩蔽的免疫细胞结合区域能够在所述双特异性抗体邻近不需要的细胞时被选择性解除掩蔽，以允许结合免疫细胞。在这种情况下，所述双特异性抗体的第一部分可以对应于上述靶向部分并且所述双特异性抗体的第二部分可以对应于上述另外部分。优选地，所述抗体是单链抗体构建体；但是，可以理解的是，如上所述，所述抗体可以包含两个或更多个多肽链。
优选地，所述双特异性抗体的免疫细胞结合区域是T细胞结合区域。因此，所述双特异性抗体可以包含(i)第一部分，其能够特异性结合不需要的细胞和(ii)第二部分，其包括掩蔽的T细胞结合区域以阻止所述第二部分与T细胞的结合，其中所述掩蔽的T细胞结合区域能够在所述双特异性抗体邻近不需要的细胞时被选择性解除掩蔽，以允许结合T细胞。通常，所述T细胞结合区域是能够结合T细胞上呈现的CD3抗原和/或TCR的区域。
还优选的是，当邻近不需要的细胞时，所述免疫细胞结合区域被所述分子中一个或多个裂解位点的选择性裂解解除掩蔽。因此，所述双特异性抗体可以包含(i)第一部分，其能够特异性结合不需要的细胞和(ii)第二部分，其包括掩蔽的免疫细胞结合区域以阻止所述第二部分与免疫细胞的结合，其中在邻近不需要的细胞时所述掩蔽的免疫细胞结合区域通过所述分子中一个或多个裂解位点的选择性裂解被解除掩蔽，以允许结合免疫细胞。
因此，本发明提供一种双特异性抗体，其包含(i)第一部分，其能够特异性结合不需要的细胞和(ii)第二部分，其包括掩蔽的T细胞结合区域以阻止所述第二部分与T细胞的结合，其中在邻近不需要的细胞时所述掩蔽的T细胞结合区域通过所述分子中一个或多个裂解位点的选择性裂解被解除掩蔽，以允许结合T细胞。通常，所述T细胞结合区域是能够结合T细胞上呈现的CD3抗原和/或TCR的区域。
合适地，连接所述靶向部分、另外部分以及(如果存在)所述一个或多个掩蔽部分使得所有部分保留它们各自的活性，从而使所述分子可以被靶向至不需要的细胞并且所述免疫细胞结合区域可以在邻近不需要的细胞时被解除掩蔽以结合免疫细胞。
所述靶向部分和另外部分通常由接头肽连接。优选地，连接所述靶向部分和另外部分的所述接头含有2至100个氨基酸残基，如多于或少于10、20、30、40、50、60、70、80和90个氨基酸。更优选地，连接所述靶向部分和另外部分的所述接头含有在2至50个氨基酸并还更加优选4至20个氨基酸。因此，所述接头肽可以包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个氨基酸。
所述一个或多个掩蔽部分通常通过相应的一个或多个接头肽连接至所述另外部分(包括其独立的部分(part))。这些接头肽的长度可以取决于所述一个或多个掩蔽部分如何操作以掩蔽所述T细胞区域。例如，如果所述一个或多个掩蔽部分是旨在与另外部分的可变区配对的免疫球蛋白结构域(如图4)，连接所述掩蔽部分的一个或多个免疫球蛋白结构域与相应的所述另外部分的可变区的所述接头可以长度足以允许在所述一个或多个掩蔽部分的相应的免疫球蛋白结构域和所述另外部分的相应的可变区之间的配对。因此，通常，所述接头至少长15个氨基酸，如至少长16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸。如果所述一个或多个掩蔽部分仅阻断接近所述另外部分的潜在T细胞结合区域(如图2和3)，可以理解的是，连接相应的一个或多个掩蔽部分至所述另外部分的所述一个或多个接头可以更短，或甚至长度为零。通常的氨基酸长度包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个氨基酸。但是，也可以采用较长的接头，尤其是当所述掩蔽部分是免疫细胞表面抗原时(如图3)。因此，所述接头可以至少长16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸。如果所述一个或多个掩蔽部分是旨在防止另外部分的结构域进行配对的免疫球蛋白结构域，但是没有与所述另外部分的可变区进行配对的所述一个或多个掩蔽部分的免疫球蛋白结构域，则连接所述掩蔽部分的一个或多个免疫球蛋白结构域与所述另外部分的相应的可变区的所述接头长度必须足以允许所述一个或多个掩蔽部分的相应免疫球蛋白结构域和所述另外部分的相应可变区之间的配偶体。因此，所述接头通常长14个氨基酸或更少，如13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。
在一些实施方案中，所述一个或多个掩蔽部分可以连接至靶向部分(如图4)。通常，所述一个或多个掩蔽部分通过相应的一个或多个接头肽连接至所述靶向部分。优选地，连接所述靶向部分和另外部分的所述接头含有2至100个氨基酸残基，更优选2至50个并且还更优选在4和20个氨基酸(如至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个氨基酸)。
合适的接头肽是那些通常采取随机卷曲构象的肽，例如多肽可以含有丙氨酸和脯氨酸或丙氨酸加脯氨酸残基的混合物。
编码合适的靶向部分和另外部分的多核苷酸是本领域已知的或者可以根据已知序列很容易地设计出来，如根据已知与不需要的细胞或免疫细胞上表达的表面标志物相互作用的蛋白的序列，或包含于核苷酸序列数据库如GenBank、EMBL、ImMunoGeneTics(IMGT)和dbEST数据库。编码合适的一个或多个掩蔽部分的多核苷酸也是本领域已知的或者可以很容易地由已知序列或上述数据库中的序列设计并制造出来。
编码合适的接头肽的多核苷酸可以根据接头肽序列设计并制造出来。
因此，编码本发明所使用的分子的多核苷酸可以采用公知的遗传工程化技术容易的构建。
然后，所述核酸表达于合适的宿主以生产本发明的分子。因此，可以通过基于本发明含有的教导对已知技术进行适当修饰，利用编码本发明的所述分子的核酸来构建表达载体，然后利用所述表达载体转化合适的宿主细胞以表达和生产本发明的所述分子。
可以理解的是，编码本发明的所述分子的核酸可以连接至多种其它核酸序列以引入合适的宿主。如本领域公知的，伴随的核酸将取决于宿主的性质、将核酸引入宿主的方式以及是否期望维持游离或整合。
在一个替代的实施方案中，所述靶向部分、另外部分(包括其独立的部分(part))以及一个或多个掩蔽部分可以非共价连接。对于非共价结合，优选免疫结合或如分别通过生物素/亲和素或链霉亲和素的结合。例如，所述靶向部分可以是双特异性抗体，其一个特异性是针对不需要的细胞表达的实体的并且其一个特异性是针对所述另外部分或其部分(part)。另外，也可将所述另外部分与另一物质偶联，所述另一物质针对的转而被所述双特异性抗体的特异性所针对。例如，所述另外部分可以含有由所述双特异性抗体识别的另外肽序列。其它可能性涉及将所述靶向部分连接至例如链霉亲和素而将所述另外部分连接至生物素，并且反之亦然。可以形成非共价相互作用的其它方式包括亮氨酸拉链序列或亲和键(affinity bond)。在任何情况下，优选在分子内有一个或多个在所述分子邻近不需要的细胞时可被选择性裂解的裂解位点，使得所述免疫细胞结合区域可以被解除掩蔽。
尽管不太优选，但所述靶向部分、另外部分(包括所述另外部分的独立部分(part))以及一个或多个掩蔽部分可以通过交联分子的任何常规方式互相便利的连接，如O'Sullivan et al Anal.Biochem.(1979)100,100-108所述的方式。例如，所述靶向部分或另外部分(包括其独立的部分(part))或掩蔽部分或间隔物部分中的一个可以巯基富集(be enriched with thiol groups)，并且该部分连接以与能够与所述巯基反应的双功能试剂反应，例如，碘乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-hydroxysuccinimide ester of iodoacetic acid，NHIA)或N-琥珀酰亚胺基-3(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate，SPDP)，在共轭物(conjugatedspecies)之间引入二硫键的异双功能交联试剂。通常，酰胺和硫醚键，例如由间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯得到的酰胺和硫醚键，在体内比二硫键更稳定。
已知双马来酰亚胺试剂可以使巯基(如抗体的半胱氨酸残基的巯基)以顺序(sequential)或者并行(concurrent)的方式连接其它含有巯基的部分(如免疫细胞抗原或接头中间物的巯基)。除马来酰亚胺的其它与巯基反应的官能团包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
其它有用的交联试剂包括S-乙酰巯基肉桂酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(S-acetylthioglycolic acid N-hydroxysuccinimide ester，SATA)，其是可在温和条件下使巯基脱保护的用于伯胺的烃硫化(thiolating)试剂(Julian et al(1983)Anal.Biochem.132,68)，辛二亚氨酸二甲酯.二盐酸盐(dimethylsuberimidatedihydrochloride)和N,N'-邻-苯撑二马来酰亚胺(N,N'-o-phenylenedimaleimide)。
特别优选的交联试剂包括磺基琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯(sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate，Sulfo-SMCC)、磺基琥珀酰亚胺6-(3'-[2-吡啶基二硫]丙酰胺基)己酸酯(sulfosuccinimidyl 6-(3'-[2-pyridyldithio]-propionamido)hexanoate，Sulfo-LC-SPDP)和N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼三氟乙酸盐(N-[β-Maleimidopropionic acid]hydrazide,trifluoroacetic acid salt，BMPH)。
可以理解的是，大量同源双功能和异源双功能交联化学物质可以适用于将所述分子的各个部分连接在一起，并且可以采用任意的这些化学物质。例如，可以采用使用施陶丁连接化学(Staudinger Ligation Chemistry)的点击化学(Click Chemistry)(膦叠氮化学(phosphine-azido chemistry))。
本发明所述的氨基酸残基通常是天然“L”异构体形式，其是优选的。但是“D”异构体形式的残基可以在某些情况下替换L-氨基酸残基，只要本发明的试剂仍然保留其功能，即预防或治疗以存在不需要的细胞表征的病症。除非另外特别指明，否则该定义还包括化学修饰氨基酸，包括氨基酸类似物(如青霉胺，3-巯基-D-缬氨酸)，天然存在的非产生蛋白的(non-proteogenic)氨基酸(如正亮氨酸)，β-氨基酸，氮杂肽(azapeptide)，N-甲基化氨基酸和具有本领域中已知的属性是氨基酸的特性的化学合成的化合物。术语“产生蛋白的(proteogenic)”是指所述氨基酸能够在细胞中通过公知的代谢途径掺入蛋白中。该定义还包括官能侧基被化学衍生化的氨基酸。此类衍生化的分子包括例如下述的那些分子，其中游离氨基已被衍生化以形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基。游离羧基可以被衍生化形成盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯或酰肼(hydrazide)。游离羟基可以被衍生化形成O-酰基或O-烷基衍生物。还可以作为衍生物的包括那些含有二十个标准氨基酸的一个或多个天然存在的氨基酸衍生物的肽部分。
因此，可以理解的是，本发明的所述分子的肽部分可以是肽“模拟物”，即模仿包含本发明所述氨基酸序列或由其组成的肽的结构特征的拟肽(peptidomimetics)。拟肽可以在治疗用途、在对抗降解、在渗透性或在可能的口服给药中更加有利。
在肽模拟物的设计中的主要目标已经是降低模拟物对由肽酶带来的裂解和失活的敏感性。在一个方法中，如Sherman et al(1990)所公开的，一个或多个酰胺键已经由多种化学官能团通过基本上电子等排(isosteric)的方式替换。这种逐步式方法已经在已获得活性类似物的方面获得了一定的成功。在一些情况下，这些类似物已经显示出比天然存在的相应物具有更长生物半衰期。在另一个方法中，各种非编码的或修饰的氨基酸如D-氨基酸和N-甲基氨基酸已经被用于修饰哺乳动物的肽。或者，推测的生物活性构象已经通过诸如环化共价修饰或通过引入γ-内酰胺或其它类型的桥被稳定化(Veber et al,1978和Thorsett et al,1983)。由Rich(1986)公开的另一个方法已通过在酶抑制剂设计中采用过渡态类似物概念来设计肽模拟物。例如，已知statine的仲醇模拟胃蛋白酶底物的无柄酰胺键的四面体过渡态。其它方法包括使用氮杂肽和β-氨基酸。
‘拟肽’的定义还可以包括反转-变型肽(retro-inverso peptide)。反转-变型肽(也称为全-D-反转或反转-对映肽(all-D-retro or retro-enantio peptide))，的定义包括其中所有的L-氨基酸替换为D-氨基酸并且肽键是反转的肽。因此，所述肽是由与亲本L-序列相反顺序装配的D-氨基酸组成的。反转-变型肽可以通过本领域已知的方法合成，例如Meziere et al(1997)J.Immunol.1593230-3237中所述的那些。该方法涉及制造含有涉及骨架的改变的假肽，但是侧链的方向保持与亲本肽非常相似。反转-变型肽对蛋白水解的抗性远大的多。
因此，可以理解的是，当任意本发明所述的靶向部分、另外部分、一个或多个掩蔽部分、裂解位点和间隔物部分是肽或多肽时，这些肽或多肽的任意一个或多个可以由保留亲本肽或多肽的相应活性的拟肽取代。这可有助于赋予本发明的试剂蛋白酶抗性并由此提高其稳定性。因此，例如，当靶向部分通过一个或多个肽间隔物部分连接另外部分时，可能需要一个或多个这些间隔物部分为拟肽，如其中所述间隔物部分的一个或多个天然存在氨基酸被替换或修饰，例如，以提高供稳定性。
另一个提高本发明试剂的肽部分的稳定性的方法是在一个或两个末端具有稳定基团。典型的稳定基团包括酰胺基、乙酰基、苄基、苯基、甲苯磺酰基、烷氧基羰基、烷基羰基、苄氧羰基等末端基团修饰。其它修饰包括在末端采用“D”氨基酸替换“L”氨基酸，采用酰胺基而不是氨基或羧基末端或乙酰基而不是氨基末端，以抑制外肽酶活性。因此，可以理解的是，无论本发明的试剂何时具有暴露的肽末端，该末端可以具有封端部分(cappingmoiety)，优选分子量小于200Da的部分。其它封端部分包括naftyl基团或聚乙二醇基团。可以理解的是，反转-变型肽是已经相对稳定的，因此可以不需要额外的封端部分。
优选地，本发明的所述分子具有在37℃血浆中至少24小时的半衰期。
可能需要修饰本发明的分子使得它能够很容易地被检测，例如通过生物素化或掺入任何本领域已知可检测的标记如放射性标记、荧光标记或酶标记。
如上所讨论的，本发明的所述分子在以特定方式重定向人体的免疫机器以消除或中和特定的不需要的细胞方面具有用途。由于可以以这种方式靶向任何不需要的细胞，本发明的所述分子具有显著的治疗潜力。
因此，本发明的第二方面提供一种预防或治疗特征为存在不需要的细胞的病症的方法，所述方法包括给受试者施用根据本发明的第一方面的分子。
因此，所述方法可以包括鉴定患有以不需要的细胞表征的病症(如癌症)或处于发展该病症的风险中的受试者，给所述受试者施用根据本发明的第一方面的分子，并通过进行试验以确定不需要的细胞数量或者通过监测所述受试者的临床症状，监测受试者中不需要的细胞的水平。基于监测步骤的结果，可能有必要施用更多的所述试剂。
相似地，本发明包括根据本发明第一方面的分子用于预防或治疗特征为存在不需要的细胞的病症。
本发明还包括根据本发明第一方面的分子在制备用于预防或治疗特征为存在不需要的细胞的病症的药物中的用途。
针对所述病症和不需要的细胞的优选项如本发明的第一方面所述。特定病症的例子包括肿瘤(良性或恶性)、自身免疫性疾病、心血管疾病、退行性疾病、糖尿病、过敏性疾病(如哮喘)、神经退行性疾病如阿尔茨海默氏症、移植患者和感染性疾病。优选地，所述不需要的细胞是癌症细胞并且所述病症是癌症。所述癌症可以是任何癌症如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、黑色素瘤、肺癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、脑癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、大肠癌、肝癌、白血病、骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴组织增生性疾病、骨髓发育不良症、骨髓增生性疾病和癌前病变。可以理解的是，本发明的所述分子还可以应用于再生医学(如实验室中培养的器官或组织)。
预防或治疗病症的含义包括：患者症状减轻或缓解(即舒缓使用)、防止症状的恶化或进展、治疗疾病(如通过抑制或消除致病因子)或在未患病受试者中预防所述病症或疾病。
可以理解的是，本发明的所述分子将其应用于临床个性化药物从而确定施用给患者的最合适的分子，并且在临床中选择或者制备该分子。例如，可能需要获得患者中不需要的细胞的表达谱从而能够选择该患者的最佳靶向部分。可以采用测量核酸(如DNA或RNA转录本)或蛋白水平的常规分析方法在活检样本上进行不需要的细胞的表达谱的评估。例如，可以采用转录组学或蛋白组学技术。通过这种方式，可以鉴定特异性结合如不需要的细胞表达的表面标志物的特定的靶向部分。还可以鉴定在邻近不需要的细胞时可被选择性裂解的合适的蛋白酶裂解位点。例如，可以是含有一个或多个MMP2裂解位点的分子没有被给定患者的癌蛋白酶活化，但是含有一个或多个MMP9裂解位点的分子会被活化。
因此，本发明第二方面的所述方法可以包括以下步骤：(i)鉴定受试者，其患有以存在不需要的细胞表征的病症(如癌症)或其处于发展所述病症的风险中，(ii)从所述受试者取得样品，(iii)分析所述样品以鉴定用以预防或治疗该受试者中的所述病症的最佳靶向部分和/或裂解位点，(iii)制备本发明的所述分子，(iv)给所述受试者施用所述分子，以及(v)或者通过进行试验确定不需要的细胞数量或者通过监测所述受试者的临床症状，监测受试者中不需要的细胞的水平。
可以理解的是，一种装置可以用于选择并任选制备用于特定患者的最合适的分子。例如，所述装置可以自动分析来自所述受试者的一个或多个样品，并基于该分析选择并任选制备为该受试者定制的分子。因此，所述装置可以进行来自受试者(例如来自活检样品)的不需要的细胞的表达谱分析以确定结合不需要的细胞的合适的靶向部分和/或确定在邻近不需要的细胞时选择性裂解的合适的裂解位点。
通过在临床上进行这些步骤中的任何一个或多个，可以制备为特定受试者定制的分子。例如，所述分子可以含有已知选择性结合不需要的细胞表达的表面标志物的靶向部分，和/或当所述分子邻近不需要的细胞时使所述免疫细胞结合区域(如T细胞结合区域)解除掩蔽的裂解位点(如蛋白酶裂解位点)。
在一个实施方案中，所述受试者在根据本发明的第一方面的分子之外还施用其它治疗剂。例如，当施用所述分子用以预防或治疗特定病症时，可以施用已知有效抵抗该病症的另外治疗剂。作为一个例子，当所述分子用于治疗癌症时，可以将另外抗癌试剂(例如抗肿瘤化疗)与本发明的所述分子一起施用给所述受试者。相似地，所述另外治疗剂可以是已知在过敏性疾病、炎性疾病、再生医学和神经再生疾病中具有治疗性应用的试剂。
可以理解的是，所述另外治疗剂可以与本发明的分子同时施用(即同时施用，任选以共同配制(co-formulation)的方式)或者与本发明的分子不同时施用(即顺次施用)。
所述另外的治疗剂可以是以下一种或多种：疫苗；免疫刺激药物；抗癌剂；抑制针对本发明的试剂的抗体应答的试剂；和/或蛋白酶抑制剂。
例如，可能需要施用免疫刺激剂如IL-2、IL-7、IFNα、GM-CSF、二甲双胍(metformin)、来那度胺(lenalidomide)和/或施用抗免疫调节试剂如依匹单抗(ipilimumab)；所有这些菌可以被认为是另外的治疗剂。
还可以理解的是，如果所述受试者是施用免疫抑制剂的受试者，这些免疫抑制剂可以在施用本发明的试剂时或之前从受试者撤回(如通过暂停治疗)。对于施用的免疫抑制剂是消除T细胞的受试者，这尤其如此。
相似地，可能需要采用旨在规避与本发明的所述分子相关的引起体内不良抗体反应的免疫原性问题的方法。例如，受试者也可以施用一种或多种已知抑制B细胞活性的试剂，如任意的利妥昔单抗(Rituximab)、环磷酰胺、Syk抑制剂、抗BAFF抗体(如贝利木单抗(Belimumab))、抗CD22的抗体、抗CD20抗体和抗CD19抗体，所有这些都可以被认为是另外的治疗剂。在这种情况下，尤其优选B细胞抑制剂在本发明的分子之前施用给受试者，如作为消除B细胞的预处理。
在另一个实施方案中，其中所述分子包含一个或多个蛋白酶裂解位点，可以理解的是，施用特定蛋白酶抑制剂以改善本发明的分子的靶选择性。例如，靶向部分已知结合心脏和乳腺组织中的细胞，但仅乳腺中的那些是要靶向的，则可能需要施用在心脏而不是乳腺中选择性抑制负责解除免疫细胞结合区域的掩蔽的蛋白酶的试剂。换句话说，施用试剂用以抑制能够解除免疫细胞结合区域的掩蔽的蛋白酶，但所述蛋白酶在需要的细胞附近(如在其上或附近)但不在不需要的细胞附近(如在其上或附近)驻留。这在以下事件中尤其有用：其中本发明的所述分子内的蛋白酶裂解位点可被多种蛋白酶裂解，所述多种蛋白酶中有一些蛋白酶驻留在不需要的细胞附近，有一些蛋白酶驻留在需要的细胞附近。在这种情况下，可以通过施用蛋白酶抑制剂来提高靶向特异性，所述蛋白酶抑制剂抑制驻留在需要的细胞附近但仍然能够裂解所述裂解位点并因此解除所述免疫细胞结合区域的掩蔽。施用所述抑制剂的作用是确保所述免疫细胞结合区域优选在邻近不需要的细胞时被解除掩蔽。例如，如果患有癌症的受试者还患有MMP2和其它蛋白酶具有活性的活动性类风湿关节炎，并且本发明的所述分子中的一个或多个裂解位点可以被包括MMP2的多种蛋白酶裂解，那么抑制MMP2以防止所述分子在关节炎性关节处裂解但保留在癌症处由另一种蛋白酶裂解是有利的。
因此，本发明包括一种组合物，所述组合物包含：(i)根据本发明的第一方面的分子和(ii)另外的治疗剂，用于预防或治疗特征在于存在不需要的细胞的病症。鉴于本发明的所述分子和所述另外的治疗剂可以同时或顺次施用，可以理解的是，本发明包括根据本发明的第一方面的分子，用于在施用另外的治疗剂的受试者中预防或治疗特征在于存在不需要的细胞的病症。因此，本发明包括治疗剂，用于在施用根据本发明的第一方面的分子的受试者中预防或治疗特征在于存在不需要的细胞的病症。
相似地，本发明包括一种组合物，所述组合物包含：(i)根据本发明的第一方面的分子和(ii)另外的治疗剂，在制备预防或治疗特征在于存在不需要的细胞的病症的药物中的用途。此外，鉴于本发明的所述分子和所述另外的治疗剂可以同时或顺次施用，可以理解的是，本发明包括包含根据本发明的第一方面的分子的一种组合物，在制备在施用另外的治疗剂的受试者中预防或治疗特征在于存在不需要的细胞的病症的药物中的用途。因此，本发明还包括治疗剂在制备在施用根据本发明的第一方面的分子的受试者中预防或治疗特征在于存在不需要的细胞的病症的药物中的用途。
本发明还提供一种组合物，所述组合物包含：(i)根据本发明的第一方面的分子和(ii)另外的治疗剂，所述另外的治疗剂适合预防或治疗特征在于存在不需要的细胞的相同病症。可以理解的是，此前两段中提及的治疗剂可以是适合治疗特征在于存在不需要的细胞的与本发明的所述分子可治疗的相同病症的试剂。
本发明的第三方面提供一种根据本发明的第一方面的分子，用在医药中。
本发明的第四方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含根据本发明第一方面的分子和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
虽然本发明的所述分子可以单独施用，优选其作为药物制剂与一种或多种可接受的载体一起存在。所述载体必须是“可接受的”，其是指与治疗剂相容并且对于其接受者是无害的。通常，所述载体可以是无菌并无热原的水或盐水。
在适当情况下，所述制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过任何药学领域中公知的方法来制备。这些方法包括使所述活性成分(治疗或预防特征为不需要的细胞的病症的试剂)与由一种或多种辅助成分构成的载体结合。通常，所述制剂通过以下制备：使所述活性成分与液体载体或精分的固体载体或二者结合，然后，如果有必要的话，将产品成型。
根据本发明的适于口服的制剂可以作为独立的单位存在，如胶囊剂、扁囊剂(cachet)或片剂，其均含有预定量的活性成分；作为粉末或颗粒；作为水性液体或非水性液体中的溶液或悬液；或作为水包油的液体乳液或油包水的液体乳液。所述活性成分还可以作为浓注剂(bolus)、药糖剂(electuary)或糊剂存在。
片剂可以通过压制或模制，可任选用一种或多种辅助成分来制备。压制的片剂可通过在合适的机器中压制自由流动形式的活性成分，如粉末或颗粒，任选地与粘合剂(如聚维酮、明胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(如羟基乙酸淀粉钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂混合而制备。模制的片剂可通过在合适的机器中将用惰性液体稀释剂润湿的粉末化化合物的混合物进行模制而制备。所述片剂可以任选被包衣或刻痕并可以经配制从而提供其中的活性成分的缓慢或可控释放，利用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素配制以提供所期望的释放曲线。
适合在口中局部施用的制剂包括锭剂(lozenges)，其包含在通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶的调味基质中的活性成分；软锭剂(pastilles)，其包含在如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶的惰性基质中的活性成分；和口清洗剂(mouth-washes)，其包含在合适的液体载体中的活性成分。
适合肠胃外施用的制剂包括水性和非水性无菌注射液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌混悬剂，其可以包括悬浮剂和增稠剂。所述制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以存储于冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在使用前立即加入无菌液体载体，如注射用水。临时的注射液和悬浮液可以由先前描述的无菌粉末、颗粒和片剂种类制备。
本发明的所述分子可以栓剂或阴道栓剂的形式施用，或者它们可以洗剂、溶液、霜剂、软膏或撒布粉的形式被局部应用。所述分子还可以例如通过使用皮肤贴剂透皮施用。
优选的单位剂量制剂含有每日剂量或单位、每日亚剂量或其合适的部分的活性成分。
应当理解的是，除了上述特别提到的成分，本发明的所述制剂可以基于制剂的类型包括其它常规试剂，例如那些适合口服施用的试剂可以包括调味剂。
施用给个体的所述分子的量是有效抵抗特定个体的病症的量。所述量可以由医师来决定。
优选地，在本发明的任何方面的情况中，要治疗的所述受试者是人。或者，所述受试者可以是动物，例如家养动物(如狗或猫)、实验动物(如实验啮齿动物，如小鼠、大鼠或兔子)或在农业上重要的动物(即牲畜)，如马、牛、绵羊或山羊。
本发明提供一种预防或治疗特征为存在不需要的细胞的病症的试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)靶向部分，其能够直接靶向不需要的细胞并且结合第一结合配偶体，以及
(ii)另外部分，其具有掩蔽的免疫细胞结合区域以阻止另外部分结合免疫细胞，并且所述另外部分结合能够结合所述第一结合配偶体的第二结合配偶体，
其中当所述另外部分邻近所述不需要的细胞时，所述掩蔽的免疫细胞结合区域能够被选择性地解除掩蔽，以允许所述另外部分与免疫细胞结合。优选地，所述免疫细胞结合区域是T细胞结合区域(如结合T细胞上的CD3抗原和/或TCR的区域)。优选地，当邻近所述不需要的细胞时，所述免疫细胞结合区域通过所述另外部分中一个或多个裂解位点的选择性裂解被解除掩蔽。
不需要的细胞、靶向部分、另外部分和裂解位点的优选项如上所述。特别优选所述试剂盒用于预防或治疗癌症。还可以理解的是，所述试剂盒可以包含掩蔽所述另外部分的免疫细胞结合区域的一个或多个掩蔽部分。所述掩蔽部分的优选项如上所述，并且包括促进所述另外部分的构象的掩蔽部分(其中在该构象中所述免疫细胞结合区域不能接近免疫细胞)，以及掩蔽部分(简单阻断所述另外部分的潜在的免疫细胞结合区域)两者。
所述第一和第二结合配偶体的含义包括彼此选择性结合的任意两部分。最优选地，所述第一和第二结合配偶体仅彼此结合而不与任何其他部分结合。优选如生物素/亲和素或链霉亲和素之间的非共价结合，或免疫结合。因此，所述第一结合配偶体可以是生物素，所述第二结合配偶体可以是亲和素，反之亦然。或者，所述第一结合配偶体可以是抗原，所述第二结合配偶体可以是特异性针对该抗原的抗体，反之亦然。但是，可以采用任意彼此选择性结合的第一和第二结合配偶体的配对，并且本领域技术人员知晓合适的配对。
可以理解的是，所述试剂盒允许个体首先施用直接靶向受试者的不需要的细胞的所述靶向部分，并在施用所述另外部分之前确定所述靶向部分在所述受试者中的正确定位(例如通过带有可检测标记(如放射性标记)的靶向部分)。然后，所述另外部分借助于结合所述第一结合配偶体的所述第二结合配偶体靶向至不需要的细胞。一旦邻近不需要的细胞，所述另外部分的免疫细胞结合区域被解除掩蔽，例如通过所述另外部分内的一个或多个裂解位点的选择性裂解，从而使免疫细胞(如T细胞)被募集至不需要的细胞。应当理解的是，连接第二结合配偶体的所述另外部分可以被认为是靶向部分，其如上述本发明的第一方面提及的能够间接靶向不需要的细胞。
因此，本发明进一步提供一种预防或治疗特征为存在不需要的细胞的病症的方法，所述方法包括施用
(i)靶向部分，其能够直接靶向不需要的细胞并且结合第一结合配偶体，以及
(ii)另外部分，其具有掩蔽的免疫细胞结合区域以阻止另外部分结合免疫细胞，并且所述另外部分结合能够结合所述第一结合配偶体的第二结合配偶体，
其中当所述另外部分邻近所述不需要的细胞，所述掩蔽的免疫细胞结合区域能够被选择性地解除掩蔽，从而使所述另外部分与免疫细胞结合。优选地，所述免疫细胞结合区域是T细胞结合区域(如结合T细胞上的CD3抗原和/或TCR的区域)。还优选当邻近所述不需要的细胞时，所述免疫细胞结合区域通过所述另外部分中一个或多个裂解位点的选择性裂解被解除掩蔽。优选地，所述靶向部分在所述另外部分之前施用，从而例如确定所述靶向部分在不需要的细胞的正确定位。但是，所述靶向部分可以与所述另外部分同时施用。可以理解的是，所述靶向部分和另外部分可以通过所述第一和第二结合配偶体的结合而互相连接。
相似地，本发明提供一种组合物，所述组合物包含：
(i)靶向部分，其能够直接靶向不需要的细胞并且结合第一结合配偶体，以及
(ii)另外部分，其具有掩蔽的免疫细胞结合区域以阻止另外部分结合免疫细胞，并且所述另外部分结合能够结合所述第一结合配偶体的第二结合配偶体，
其中当所述另外部分邻近所述不需要的细胞时，所述掩蔽的免疫细胞结合区域能够被选择性地解除掩蔽，从而使所述另外部分与免疫细胞结合，
用于预防或治疗受试者中特征在于不需要的细胞的病症。优选地，所述免疫细胞结合区域是T细胞结合区域(如结合T细胞上的CD3抗原和/或TCR的区域)。还优选当邻近所述不需要的细胞时，所述免疫细胞结合区域通过所述另外部分中一个或多个裂解位点的选择性裂解被解除掩蔽
相似地，本发明提供一种组合物在制备预防或治疗受试者中特征在于存在不需要的细胞的病症的药物中的用途，所述组合物包含：
(i)靶向部分，其能够直接靶向不需要的细胞并且结合第一结合配偶体，以及
(ii)另外部分，其具有掩蔽的免疫细胞结合区域以阻止另外部分结合免疫细胞，并且所述另外部分结合能够结合所述第一结合配偶体的第二结合配偶体，
其中当所述另外部分邻近所述不需要的细胞时，所述掩蔽的免疫细胞结合区域能够被选择性地解除掩蔽，从而使所述另外部分与免疫细胞结合。
优选地，所述免疫细胞结合区域是T细胞结合区域(如结合T细胞上的CD3抗原和/或TCR的区域)。还优选当邻近所述不需要的细胞时，所述免疫细胞结合区域通过所述另外部分中一个或多个裂解位点的选择性裂解被解除掩蔽。
在本发明的一个实施方案中，所述靶向部分是抗MUC1抗体并且所述另外部分是抗CD3抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述靶向部分是抗CD19抗体并且所述另外部分是抗CD3抗体。
本发明将进一步详细以下附图和实施例的帮助下进行描述。
图1：示例本发明分子的示意图。所述靶向部分(1)包含特异性针对不需要的细胞(2)的VH和VL结构域，并且所述另外部分(3)包含特异性针对CD3抗原的VH和VL结构域。所述另外部分的VH和VL结构域通过接头连接，所述接头长度不足以允许配对并因此使所述另外部分的T细胞结合区域被掩蔽。当所述分子邻近不需要的细胞(2)时，所述接头中裂解位点(5)的裂解使得T细胞结合区域(4)解除掩蔽。
图2：示例本发明分子的示意图。所述靶向部分(1)包含特异性针对不需要的细胞(2)上的抗原的配对的VH和VL结构域。所述另外部分(3)包含特异性针对CD3抗原的VH和VL结构域。但是，所述另外部分的T细胞结合区域被存在的两个掩蔽部分阻断，CH结构域和CL结构域(6)通过各自的接头连接至所述另外部分。当所述分子邻近不需要的细胞(2)时所述接头中裂解位点(5)的裂解使得T细胞结合区域(4)解除掩蔽。
图3：例示本发明分子的示意图。所述靶向部分(1)包含特异性针对不需要的细胞(2)上的抗原的配对的VH和VL结构域。所述另外部分(3)包含特异性针对CD3抗原的VH和VL结构域。但是，所述另外部分的T细胞结合区域被存在的掩蔽部分(6)阻断，所述掩蔽部分是结合所述T细胞结合区域的免疫细胞抗原，并且通过共价接头与所示另外部分牢固地结合。当所述分子邻近不需要的细胞(2)时所述接头中裂解位点(5)的裂解使得所述掩蔽部分离开所述T细胞结合区域并因此使所述T细胞结合区域(4)被解除掩蔽。
图4：示例本发明分子的示意图。所述靶向部分(1)包含特异性针对不需要的细胞(2)上的抗原的配对的VH和VL结构域。所述另外部分(3)包含特异性针对CD3抗原的VH和VL结构域。但是，所述另外部分(3)的VH和VL结构域不能配对，原因是分别包含VL和VH结构域的两个掩蔽部分(6)的存在。所述掩蔽部分的VL和VH结构域充当与所述另外部分的VH和VL结构域配对的虚拟(dummy)结构域并从而阻止所述另外部分的VH和VL结构域的配对。所述T细胞结合区域(4)由此被掩蔽。当所述分子邻近不需要的细胞(2)时将所述另外部分连接至所述一个或多个掩蔽部分的接头中的裂解位点(5)的裂解从与所述掩蔽部分的虚拟VH和VL结构域的配对释放VH和VL结构域，并因此使所述另外部分的VH结构域和VL结构域能够配对。所述T细胞结合区域(4)由此被解除掩蔽。
图5：(A)示例本发明分子的示意图。涵盖所述靶向部分的scFv的VH和VL区域通过单个肽接头连接至所述另外部分的VH区域，其接着通过含有蛋白酶裂解位点的单个肽接头连接至所述掩蔽部分的CH区域。所述另外部分的VL区域通过含有蛋白酶裂解位点的单个肽接头连接至所述掩蔽部分的CL区域。所述另外部分的VH和VL区域和所述掩蔽部分的CH和CL区域在所述蛋白一起孵育时将会配对。因此，所述掩蔽部分的CH和CL区域阻止所述另外部分的VH和VL区域与其天然配体(如CD3)相互作用并阻止活化T细胞。但是，在通过靶向部分结合不需要的细胞后，在不需要的细胞附近将会发生特异性蛋白水解裂解并且所述掩蔽部分会由此释放从而使得T细胞与不需要的细胞相互作用。(B)(A)中所示蛋白链的基因组成的示意图。Rickymab(重链)包含所述另外部分的VH和所述掩蔽部分的CH区域并且这将与所述靶向部分的scFv分子克隆在一起。Rickymab(轻链)包含所述另外部分的VL区域和所述掩蔽部分的CL区域，其会在将所述DNA引入能够产生该实施方案(embodiment)的细胞中后与Rickymab(重链)的VH和CH区域配对。
图6：(A)显示组合在一起形成图4中看到的多肽链的DNA的区域的示意图。进一步指示的箭头分别表示蛋白酶裂解位点和DNA酶裂解位点(BamH、Sac&Xho)，其允许分子中的区域移动以产生图1、2、4和5中看到的分子。(B)显示构成(A)中与荧光染料偶联的所述靶向部分的VH和CH区域的DNA的区域的示意图。其它分子(如图1-5)的VH和CH区域也可以通过DNA的酶消化以及随后连接至荧光染料。一旦带标记的分子用于标记细胞，那些细胞可以采用流式细胞术观察。这可以证实所述靶向部分结合感兴趣的不需要的细胞而不是任何想要的细胞类型。
图7：来自2个供体(具有不同HLA类型)的外周血单核细胞(PBMC)与图3所示的分子(包含连接至抗CD3 scFv(所述另外部分)、还连接至CD3ε结构域(所述掩蔽部分)的抗CD19 scFv(靶向部分)-B.mab)一起孵育并37℃加入蛋白酶过夜孵育以释放所述另外部分的活性位点。第二天，细胞用抗CD3的抗体标记以在与所述分子孵育之后确定T细胞的存在，并用抗CD19以确定B细胞的存在/不存在(参见实施例2)。如所期望的，与所述分子的孵育从PBMC中去除所有B细胞。
图8：靶细胞，B淋巴母样细胞系(B lymphoblastoid cell line，B-LCL)用包含连接至抗CD3 scFv(所述另外部分)、还连接至CD3ε结构域(所述掩蔽部分)的抗CD19 scFv(靶向部分)的分子标记(图3)。去除未结合的实施方案后，所述B-LCL细胞与或者不与T细胞孵育，其中B-LCL产生蛋白酶，所述蛋白酶裂解所述掩蔽部分释放所述另外部分。作为对照方式，T细胞与没有靶细胞的所述分子孵育以确定未结合分子的背景活化。在过夜孵育之后，分析每个培养物中的γ干扰素(IFN-γ)的量以确定T细胞活化的程度。当靶细胞用所述分子标记的时候仅有T细胞的活化(参见实施例1)。
图9：条件活化双特异性构建体。采用流式细胞术对过夜培养后的来自健康供体的外周血单核细胞进行评估。细胞采用抗CD3(Y轴)和抗CD19(x-轴)的抗体染色以呈现T细胞和B细胞的数量。scFv1-scFv2-CD3e构建体在CD3e帽和scFv1-scFv2活化区域之间含有蛋白酶可裂解节段，其可以采用因子Xa蛋白酶裂解。scFv1是抗CD19的实体，scFv2具有针对CD3e的亲和力。(A)仅在培养基中过夜培养的PBMCs；(B)PBMCs+scFv1-scFv2-CD3e构建体；(C)PBMCs+scFv1-scFv2-CD3e构建体+因子Xa蛋白酶(0.01ug/ml)；(D)PBMCs+scFv1-scFv2-CD3e构建体+因子Xa蛋白酶(0.1ug/ml)；(E)PBMCs+scFv1-scFv2-CD3e构建体+因子Xa蛋白酶(0.5ug/ml)；(F)PBMCs+scFv1-scFv2-CD3e构建体+因子Xa蛋白酶(1ug/ml)。由图可以看到，仅当加入蛋白酶时帽才被裂解掉，从而去除B细胞。所述构建体包含连接至抗CD3 scFv(所述另外部分)、还连接至CD3ε结构域(所述掩蔽部分)的抗CD19scFv(靶向部分)。
图10：通过去除掩蔽结构域的条件活化双特异性构建体。(A)设计2个构建体Ricky2A(SEQ ID No:30)和Ricky2B(SEQ ID No:31)，当在哺乳动物表达系统(293T)中共表达时产生scFv1-scFv2-Cap，其中抗CD3结合区域(scFv2)由免疫球蛋白恒定区(CH、CL)掩蔽。通过在所述掩蔽和结合结构域之间包含的MMP2识别位点IPVSLR(SEQ ID No:32)，所述恒定区通过肿瘤相关蛋白酶(MMP2)裂解。在这种情况下，抗MUC1(scFv1)和抗CD3(scFv2)结构域用于构建体；(B)采用CD3-PE(x-轴)和抗CD138-APC(y-轴)染色的、采用流式细胞术评估的用于实验的T细胞；(C)采用CD3-PE(x-轴)和抗CD138-APC(y-轴)染色的、采用流式细胞术评估的用于实验的表达Muc1的U266细胞；(D)U266细胞与T细胞的共培养；(E)U266细胞与T细胞的共培养+Ricky2A/2B可活化的掩蔽的双特异性显示12％降低的U266群体。
具体实施方式
实施例1：本发明分子的用途
用包含连接至抗CD3 scFv(所述另外部分)、还连接至CD3ε结构域(所述掩蔽部分)的抗CD19 scFv(靶向部分)的分子(如图3中的分子)靶向模拟B细胞恶性的靶细胞(B淋巴母样细胞系(B-LCL))。一旦被靶向，从靶细胞洗去过量分子并且靶细胞与T细胞(CD4+和CD8+)在37℃过夜培养。孵育后，分析来自培养物的上清的IFNγ释放，其证明T细胞在识别靶B-LCL表面上的分子中的活化。仅在所述另外部分和CD3ε掩蔽部分之间的接头蛋白水解裂解已经发生并因此解除了抗CD3结合区域的结合区域的掩蔽时，才看到T细胞的活化。在单独与靶细胞或者单独与T细胞孵育所述分子之后，来自培养物的上清证实没有产生IFN-γ。但是，在所靶向的B-LCL与T细胞孵育之后，大量产生的IFN-γ证实了在不需要的细胞(B-LCL)存在的情况下所述掩蔽部分的释放以及T细胞对不需要的细胞的识别。
实施例2：本发明分子的用途
用包含连接至抗CD3 scFv(所述另外部分)、还连接至CD3ε结构域(所述掩蔽部分)的抗CD19 scFv(靶向部分)的分子，靶向在人外周血单核细胞的混合细胞群(含有B细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞和NK细胞)中的B细胞。一旦所述分子加至混合细胞群中(由此标记B细胞)，将外源性蛋白酶(如胰酶)加入细胞以释放掩蔽试剂，然后在37℃过夜培养。培养后，所述细胞用荧光标记的抗CD3和抗CD19抗体标记并采用流式细胞术分析。结果证实在没有所述分子过夜培养后，细胞中存在B细胞(～10％)，但在存在所述分子过夜培养后细胞中B细胞完全消除。这个结果证实了在外周血单核细胞的混合细胞群中不需要的B细胞的靶向细胞毒作用。
实施例3：本发明分子的合成
图中所示的分子的制备包括产生所述靶向部分(VH和VL结构域)的蛋白序列和所述另外部分(VH和VL结构域)的蛋白序列以及采用标准蛋白质组学连接(Gly-Gly-Gly-Ser重复：SEQ ID No:33)连接这些结构域。然后scFv结构域可以采用相似的技术连接至一个或多个掩蔽部分。如果需要的话，一个或多个蛋白酶裂解序列可以插入至接头多肽序列中。一旦已经确定一个或多个多肽链的蛋白序列，合成DNA并插入至适合原核或者真核表达系统的载体中。在原核系统中，用编码一个或多个多肽链的合成的基因转化大肠杆菌并过夜培养后，收集上清并通过标准技术(如His标签纯化)纯化多肽链。纯化后，所述一个或多个多肽链重新折叠然后可以用于标记靶细胞。在真核表达系统中，将编码一个或多个多肽链的合成的基因转染至适合慢病毒表达系统的细胞系。48小时孵育后，含有正确重折叠的和构象正确的分子的上清可以采用标准技术纯化(如His标签纯化)。
图3所示的分子的例子含有以下单个多肽链上的氨基酸序列：
抗CD19VL
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID No:20)
接头
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID No:21)
抗CD19VH
QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID No:22)
接头
GGGGSSD(SEQ ID No:23)
抗CD3VH
IKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID No:24)
接头
VEGGSGGSGGSGGSGGVDD(SEQ ID No:25)
抗CD3VL
IQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK(SEQ ID No:26)
长接头
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID No:21)
裂解位点
TIPVSLR(SEQ ID No:27)
长接头
SGGGGSGGGGSGGGGSDI(SEQ ID No:28)
CD3ε
QTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCEGS(SEQ ID No:29)
该分子是本发明的一个实施方案的示例，其中所述分子包含一个或多个掩蔽部分，其为免疫细胞表面抗原，在这情况下为CD3ε。
图5中所述的分子的例子如图10所示。该分子是本发明的一个实施方案的示例，其中所述分子包括一个或多个掩蔽部分，其为免疫球蛋白结构域，并且更具体地为恒定区。该实施方案还如图2所示，但在图2中，所述靶向部分的VH和VL部分是位于独立的多肽链上，在图5中，所述靶向部分的VH和VL部分是位于相同的多肽链上。

Claims (46)

1.一种分子，所述分子包含：
(i)靶向部分，所述靶向部分能够直接或间接靶向不需要的细胞，以及
(ii)另外部分，所述另外部分具有掩蔽的免疫细胞结合区域以阻止所述另外部分结合免疫细胞，
其中，当所述分子邻近所述不需要的细胞时，所述掩蔽的免疫细胞结合区域能够被选择性地解除掩蔽，从而使所述另外部分与免疫细胞结合。
2.根据权利要求1的分子，其中，在邻近不需要的细胞时，所述免疫细胞结合区域通过所述分子中一个或多个裂解位点的选择性裂解被解除掩蔽。
3.根据权利要求1或2的分子，其中，所述免疫细胞结合区域是T细胞结合区域。
4.根据权利要求1-3任一项的分子，其中，所述另外部分是抗体。
5.根据权利要求4的分子，其中，所述另外部分是单链抗体构建体，如scFv抗体。
6.根据权利要求4或5的分子，其中，所述抗体特异性针对免疫细胞表面上表达的抗原，如任意以下：CD3、T细胞受体(TCR)、CD4、CD8、CD28、CD16、CD56、NK细胞受体(如CD94:NKG2异源二聚体、Ly49同源二聚体、杀伤细胞的Ig样受体(KIR)、白细胞抑制受体)、NKG2D、NKp46、CD2、CD28和CD25。
7.根据权利要求4-6任一项的分子，其中，所述抗体是莫罗单抗-CD3(OKT3)。
8.根据权利要求1-7任一项的分子，其中，邻近不需要的细胞的所述试剂诱导所述另外部分的构象变化，所述构象变化解除了所述免疫细胞结合区域的掩蔽。
9.根据权利要求8的分子，其中，所述另外部分是scFv抗体，在所述scFv抗体中连接重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的接头长度不足以使所述VH和VL结构域配对，从而使所述scFv抗体不能结合所述免疫细胞，并且其中，当邻近不需要的细胞时，邻近所述不需要的细胞的所述试剂诱导所述VH和VL结构域的配对，从而使所述scFv抗体能够结合所述免疫细胞。
10.根据权利要求9的分子，其中，邻近所述不需要的细胞的所述试剂通过选择性裂解在所述接头中的一个或多个裂解位点而诱导所述VH和VL结构域的配对。
11.根据权利要求9或10的分子，其中，所述scFv抗体的所述VH结构域和VL结构域通过14个或更少氨基酸的肽接头连接。
12.根据权利要求1-7任一项的分子，其中，所述分子包含掩蔽所述免疫细胞结合区域的一个或多个掩蔽部分。
13.根据权利要求12的分子，其中，所述一个或多个掩蔽部分通过含有所述一个或多个裂解位点的一个或多个接头而与所述分子共价连接。
14.根据权利要求12或13的分子，其中，所述一个或多个掩蔽部分的存在促进了所述另外部分的构象，使得所述免疫细胞结合区域未被暴露。
15.根据权利要求12-14任一项的分子，其中，所述掩蔽部分是免疫细胞表面抗原。
16.根据权利要求15的分子，所述分子包含：
另外部分，所述另外部分包含能够特异性结合免疫细胞的VH结构域和VL结构域，以及
接头，所述接头连接所述另外部分至免疫细胞表面抗原，
从而使所述免疫细胞表面抗原结合至并掩蔽所述VH和VL结构域的所述结合区域以阻止所述另外部分与免疫细胞的结合，
其中，当邻近所述不需要的细胞时，在所述接头中的一个或多个裂解位点的选择性裂解从所述VH和LV结构域释放所述免疫细胞表面抗原，从而使所述另外部分结合免疫细胞。
17.根据权利要求12-14任一项的分子，其中，所述掩蔽部分是免疫球蛋白结构域。
18.根据权利要求17的分子，所述分子包含：
另外部分，所述另外部分包含能够特异性结合免疫细胞的VH结构域和VL结构域，
接头，所述接头连接所述另外部分的所述VH结构域至第一掩蔽部分的CH结构域，以及
接头，所述接头连接所述另外部分的所述VL结构域至第二掩蔽部分的CL结构域，
从而使所述第一和第二掩蔽部分的所述CH和CL结构域掩蔽所述VH和VL结构域的所述结合区域，以阻止所述另外部分与免疫细胞的结合，并且
其中，当邻近所述不需要的细胞时，在所述接头中的一个或多个裂解位点的选择性裂解从所述另外部分释放所述第一和第二掩蔽部分，从而使所述另外部分结合免疫细胞。
19.根据权利要求17的分子，所述分子包含：
另外部分，所述另外部分独立包含第一VH和第一VL结构域，所述第一VH和第一VL结构域在配对时能够特异性结合免疫细胞，
接头，所述接头连接所述第一VH结构域至第一掩蔽部分的第二VL结构域，以及
接头，所述接头连接所述第一VL结构域至第二掩蔽部分的第二VH结构域，
从而使所述另外部分的所述第一VH和第一VL结构域不配对，并且所述另外部分不能结合所述免疫细胞，以及
其中，当邻近所述不需要的细胞时，在所述接头中的一个或多个裂解位点的选择性裂解使所述第一VH和第一VL结构域配对，从而使所述另外部分能够结合所述免疫细胞。
20.根据权利要求19的分子，其中，连接所述第一VH结构域至所述第二VL结构域的所述接头的长度，足以使所述第一VH结构域与所述第二VL结构域配对，并且其中，连接所述第一VL结构域至所述第二VH结构域的所述接头的长度，足以使所述第一VL结构域与所述第二VH结构域配对。
21.根据权利要求1-20任一项的分子，其中，所述靶向部分能够直接靶向不需要的细胞。
22.根据权利要求21的分子，其中，所述靶向部分是由所述不需要的细胞表达的实体的特异性结合配偶体，或非特异性的分子，所述非特异性的分子在施用给受试者后能够在所述不需要的细胞附近积累。
23.根据权利要求22的分子，其中，所述特异性结合配偶体是任意以下：抗体、激素、生长因子、细胞因子或受体配偶体，或者其中，所述非特异性的分子是任意以下：聚乙二醇；葡聚糖；多氨基酸；非肿瘤特异性蛋白，如免疫球蛋白；白蛋白；或羟基丙基甲基丙烯酰胺。
24.根据权利要求23的分子，其中，所述抗体特异性针对任意以下：Her2/Neu；CD22；EpCAM(CD326)；EGFR；PMSA；CD30；CD20；CD33；膜IgE；IgE受体(CD23)，CD80；CD86；CD2；CA125；碳酸酐酶IX；CD70；CD74；CD56；CD40；CD19；c-met/HGFR；TRAIL-R1；DR5；PD-1；PD1L；IGF-1R；VEGF-R2；前列腺干细胞抗原(PSCA)；MUC1；CanAg；间皮素；P-钙粘蛋白；肌肉生长抑制素(GDF8)；Cripto(TDGF1)；ACVRL1/ALK1；MUC5AC；CEACAM；SLC44A4；CD2/CS1；CD137；CXCR4；神经纤毛蛋白1；磷脂酰肌醇聚糖；HER3/EGFR；PDGFRa和EphA2。
25.根据权利要求23或24的分子，其中，所述抗体是抗表皮生长因子受体的抗体如西妥昔单抗、抗Her2的抗体、抗CD20的抗体如利妥昔单抗、抗CD22的抗体如伊珠单抗，抗CD70的抗体、抗CD33的抗体如hp67.6或吉妥单抗、抗MUC1的抗体如GP1.4和SM3、抗CD40的抗体、抗CD74的抗体、抗P钙粘蛋白的抗体、抗EpCAM的抗体、抗CD138的抗体、抗E-钙粘蛋白的抗体、抗CEA的抗体和抗FGFR3的抗体。
26.根据权利要求22或23的分子，其中，所述另外部分任意以下：IL-2、EGF、VEGF、Flt3L、HGF、IGF、IL-6、IL-4、Toll样受体或黑色素细胞刺激素(MSH)。
27.根据权利要求1-20任一项的分子，其中，通过能够结合至能够靶向不需要的细胞的部分，所述靶向部分能够间接靶向不需要的细胞。
28.根据权利要求27的分子，其中，所述靶向部分是抗体，如scFv抗体。
29.根据权利要求1-28任一项的分子，其中，所述另外部分、靶向部分，以及如果存在的所述一个或多个掩蔽部分中的每一个均是单个多肽链的部分。
30.根据权利要求1-29任一项的分子，用于医药中。
31.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-29任一项的分子，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
32.预防或治疗特征为存在不需要的细胞的病症的方法，所述方法包括将根据权利要求1-29任一项的分子施用给受试者。
33.根据权利要求32的方法，进一步包括施用适合预防或治疗所述病症的另外的治疗剂。
34.根据权利要求1-29任一项的分子，用于预防或治疗特征为受试者中存在不需要的细胞的病症，任选的，其中向所述受试者施用适合预防或治疗所述病症的另外的治疗剂。
35.根据权利要求1-29任一项的分子在制备预防或治疗特征为受试者中存在不需要的细胞的病症的药物中的用途，任选的，其中向所述受试者施用适合预防或治疗所述病症的另外的治疗剂。
36.一种组合物，所述组合物包含(i)根据权利要求1-29任一项的分子和(ii)另外的治疗剂，所述另外的治疗剂适合预防或治疗特征为存在不需要的细胞的病症。
37.一种组合物，用于预防或治疗特征为存在不需要的细胞的病症，所述组合物包含(i)根据权利要求1-29任一项的分子和(ii)另外的治疗剂，所述另外的治疗剂适合预防或治疗特征为存在不需要的细胞的病症的其它治疗剂。
38.一种组合物在制备预防或治疗特征为存在不需要的细胞的病症的药物中的用途，所述组合物包含(i)根据权利要求1-29任一项的分子和(ii)另外的治疗剂，所述另外的治疗剂适合预防或治疗特征为存在不需要的细胞的病症。
39.根据权利要求33的方法，根据权利要求34的分子，根据权利要求35或38的用途以及根据权利要求36或37的组合物，其中，所述另外的治疗剂是以下任意一个或多个：免疫刺激药物、抗癌剂和针对本发明的试剂的抗体应答的抑制剂。
40.一种预防或治疗特征为存在不需要的细胞的病症的试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)靶向部分，所述靶向部分能够直接靶向不需要的细胞并且其结合第一结合配偶体，以及
(ii)另外部分，所述另外部分具有掩蔽的免疫细胞结合区域以阻止所述另外部分结合免疫细胞，并且所述另外部分结合能够结合所述第一结合配偶体的第二结合配偶体，
其中，当所述另外部分邻近所述不需要的细胞时，所述掩蔽的免疫细胞结合区域能够被选择性地解除掩蔽，从而使所述另外部分与免疫细胞结合。
41.一种预防或治疗特征为存在不需要的细胞的病症的方法，所述方法包括施用：
(i)靶向部分，所述靶向部分能够直接靶向不需要的细胞并且其结合第一结合配偶体，以及
(ii)另外部分，所述另外部分具有掩蔽的免疫细胞结合区域以阻止所述另外部分结合免疫细胞，并且所述另外部分结合能够结合所述第一结合配偶体的第二结合配偶体，
其中，当所述另外部分邻近所述不需要的细胞时，所述掩蔽的免疫细胞结合区域能够被选择性地解除掩蔽，从而使所述另外部分与免疫细胞结合。
42.一种组合物，用于预防或治疗受试者中特征在于不需要的细胞的病症，所述组合物包含：
(i)靶向部分，所述靶向部分能够直接靶向不需要的细胞并且其结合第一结合配偶体，以及
(ii)另外部分，所述另外部分具有掩蔽的免疫细胞结合区域以阻止所述另外部分结合免疫细胞，并且所述另外部分结合能够结合所述第一结合配偶体的第二结合配偶体，
其中，当所述另外部分邻近所述不需要的细胞时，所述掩蔽的免疫细胞结合区域能够被选择性地解除掩蔽，从而使所述另外部分与免疫细胞结合。
43.一种组合物在制备预防或治疗特征在于存在不需要的细胞的病症的药物中的用途，所述组合物包含：
(i)靶向部分，所述靶向部分能够直接靶向所述不需要的细胞并且其结合第一结合配偶体，以及
(ii)另外部分，所述另外部分具有掩蔽的免疫细胞结合区域以阻止所述另外部分结合免疫细胞，并且所述另外部分结合能够结合所述第一结合配偶体的第二结合配偶体，
其中，当所述另外部分邻近所述不需要的细胞时，所述掩蔽的免疫细胞结合区域能够被选择性地解除掩蔽，从而使所述另外部分与免疫细胞结合。
44.根据权利要求40的试剂盒，根据权利要求41的方法，根据权利要求42的组合物或根据权利要求43的用途，其中，当邻近所述不需要的细胞时，所述免疫细胞结合区域通过所述另外部分中的一个或多个裂解位点的选择性裂解被解除掩蔽。
45.根据权利要求40或44的试剂盒，根据权利要求41或44的方法，根据权利要求42或44的组合物或根据权利要求43或44的用途，其中，所述免疫细胞结合区域是T细胞结合区域。
46.根据权利要求32、33、39、41、44和45任一项的方法，根据权利要求34或39的分子，根据权利要求35、38、39和43-45任一项的用途，根据权利要求36、37、39、42、44和45任一项的组合物和根据权利要求40、44和45任一项的试剂盒，其中，所述特征为存在不需要的细胞的病症是任意以下：肿瘤(良性或恶性)、自身免疫性疾病、心血管疾病、退行性疾病、糖尿病、过敏性疾病、神经退行性疾病如阿尔茨海默氏症、移植患者或感染性疾病。
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