CN104812413A - 物质和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种物质，其包括：(i)T细胞抗原，和(ii)CD22、CD23、CD30、CD74、CD70、CD43、CD44、CD47、CD54、CD58、CD62L、CD95、HLA-DR、CD59、CD55中的任意种的结合配偶体，其中，在物质结合到表达CD22、CD23、CD30、CD74、CD70、CD43、CD44、CD47、CD54、CD58、CD62L、CD95、HLA-DR、CD59、CD55中的任意种的细胞之后，物质被内在化，并且T细胞抗原以可被T细胞识别的方式递呈在细胞表面上。

Description

物质和方法
技术领域
本发明涉及免疫治疗剂。特别地，涉及可以用于预防或治疗病症的物质，所述病症的特征在于存在不需要的细胞，如引起肿瘤或其它疾病的细胞。
背景技术
用于靶向恶性疾病的免疫治疗策略是转译(translational)临床研究的活跃领域，并且已经进行了数十年。目前的模型要求癌症代表可以用宿主的免疫治疗操作治疗的功能性或体质(constitutional)免疫缺陷。这些努力可以宽泛地分为两组。第一组通过如接种疫苗、细胞因子支持(IL-2、IFNγ)或降低免疫抑制环境(伊匹单抗(ipilimumab))这样的方法来增强或支持内源性抗肿瘤免疫力，而第二组设法用功能性免疫应答成分来修复绝对缺陷(使用抗体的被动免疫治疗、TCR转移、干细胞移植和过继性免疫治疗)。通过高效的功能性抗肿瘤免疫应答确实是可能的论点，将这些方法进行了统一。尽管在一些情况中对于有效的抗肿瘤免疫应答存在勿庸置疑的证据，但这个肿瘤免疫学的重要支柱受到目前临床现实压倒性的反对，所述临床现实为尽管进行了很多努力，但对于大部分的癌症病人没有可用的有效的免疫治疗方法。几乎所有的癌症疫苗接种试验都提供了否定结果，而提供肯定数据的那些最常见的是证明了小的作用。现实是，治疗性抗体，除了少数例外，在肿瘤学领域中提供了非常少的临床益处。
如果可以研发出能有效地重新定向内源性抗病毒免疫应答到分子上而不是靶向恶性组织的治疗策略，这将提供一种新的有力且安全的治疗恶性疾病的方法。
大部分细胞毒性治疗抗体依赖于免疫效应物机制，来传送它们的抗癌作用，如补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。重要地，所有细胞(健康的和恶性的)都具有各种机制来限制免疫应答的攻击，以避免自身免疫性。这在自身免疫疾病的环境中是明显的，其中高水平的组织反应性抗体尽管常常引起器官炎症，但很少诱发完全的器官破坏。实际上，已知其中观察到完全的组织破坏的自身免疫疾病，如糖尿病，是依赖于CTL应答，而不是抗体定向的机制。
为了提高治疗抗体差的功效，已经使用了免疫偶联物(放射性核素/毒素)和工程化抗体，其能更好地保证细胞毒性效应物机制(例如，糖基化工程)。然而，这些药剂的临床试验仍然是很令人失望的，并且受到毒性的困扰。一个实例是已经研发来选择性地将抗肿瘤剂靶向肿瘤的抗体-药物偶联物(ADC)(参见US 5,773,001；US 5,767,285；US 5,739,116；US 5,693,762；US 5,585,089；US 2006/0088522；US 2011/0008840；US 7,659,241；Hughes(2010)Nat Drug Discov 9:665,Lash(2010)；In vivo:The Business & Medicine Report 32-38；Mahato等人(2011)Adv Drug Deliv Rev 63:659；Jeffrey等人(2006)BMCL 16:358；Drugs RD 11(1):85-95)。ADC通常含有对抗存在于肿瘤细胞上的目标的单克隆抗体、细胞毒性药物以及将抗体连接至药物的连接物。然而，目前只有少数ADC处于临床研发的后期，而且已经证明了这些的临床成功是难以捉摸的。
因此，仍然存在对具有更高功效和更低毒性的更有效的免疫治疗剂的需求。
发明内容
本发明的物质(agent)是重新定向的(re-directed)免疫治疗的实例。这指的是将通常靶向带有外源抗原的细胞的现有的免疫应答重新定向到靶向病症(如癌症)中不需要的细胞的概念。此概念需要标记物抗原(marker antigen)在不需要的细胞上递呈，使得它们成为免疫细胞的目标。
WO 95/17212描述了由肽T细胞抗原和细胞结合配偶体组成的偶联物(conjugate)及其在重新定向的免疫治疗中的用途。偶联物在结合了结合配偶体到表面受体后内在化至靶细胞中，并且从偶联物加工T细胞抗原，并且以与MHC分子的复合物的形式在细胞表面上表达。经T细胞受体的复合体的识别诱导了对靶细胞的细胞毒性T细胞应答。然而，从WO 95/17212难以预测哪些结合配偶体能够实现内在化并且因此随后递呈T细胞抗原，而哪个不能。仅有的显示有效地递呈肽抗原的受体是B细胞的抗原受体，其正常作用是结合并内在化递呈至辅助性T细胞的抗原。然而，WO 95/17212没有对哪些其它受体(如果有的话)可确保提供相同的结果提供任何指导。
令人惊奇地且预料不到地，本发明人现在已经鉴定了在重新定向的免疫治疗中具有实用性的具体的抗原，即CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95。用病毒衍生肽靶向这些抗原中的每一个都使得体外病毒特异性T细胞的活化增加，这表明，令人惊奇地，各个抗原都能使肽内在化并随后在细胞表面上递呈。
CD70(TNFSF7)是肿瘤坏死因子(TNF)超家族的成员。其是II型膜内在蛋白且是CD27的配体。该蛋白在抗原活化的T和B淋巴细胞中瞬时表达，并且其与CD27的相互作用调节T细胞和B细胞的功能。具体地，该蛋白的作用为控制靶细胞的死亡、存活和共刺激。尽管CD70是由正常淋巴细胞和树突状细胞的限定亚群(limited subsets)表达，其由广泛的恶性血液病和某些实体肿瘤异常地表达。
CD74是II型MHC分子伴侣并且功能为免疫细胞上促炎性细胞因子巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)的膜受体。MIF结合至CD74通过MAPK和Akt途径激活下游信号并促进细胞增殖和存活。除了由免疫细胞表达，还已经在数个非-CNS癌症中观察到CD74的过表达，并且在这些肿瘤中的CD74表达通常与攻击行为和患者预后不良相关。
CD22是属于凝集素的SIGLEC家族的分子，其特异性地用位于其N-末端的免疫球蛋白(Ig)结构域结合唾液酸。其出现在成熟B细胞的表面上且较小程度地出现在一些未成熟的B细胞上。认为CD22是调节分子，其阻止免疫系统的过度活化和自身免疫疾病的发展。其存在于许多B细胞恶性肿瘤(包括慢性淋巴细胞性白血病和非霍奇金氏淋巴瘤)上。
由染色体6上的人类白细胞抗原复合体编码HLA-DRII型MHC细胞表面受体。HLA-DR和其配体的复合体(长度为9个氨基酸或更长的肽)构成了T细胞受体(TCR)的配体。应答信号时HLA-DR分子被上调。HLA-DR出现在各种癌症(包括结直肠癌)中，其中增加的HLA-DR表达涉及更好的预后结果。
CD23是IgE(一种参与过敏和抗寄生虫的抗体同种型)的“低亲和力”受体，并且在IgE水平的调节中很重要。与许多抗体受体不同，CD23是C型凝集素。其出现在成熟的B细胞、活化的巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、滤泡树突状细胞和血小板上。CD23出现在B细胞恶性肿瘤(如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和B细胞慢性淋巴细胞白血病)中的B细胞上。
CD30是肿瘤坏死因子受体家族的细胞膜蛋白并且是肿瘤标记物。此受体由活化的(而不是休眠的)T细胞和B细胞表达。TRAF2和TRAF5可以与此受体相互作用，并介导导致NF-κB活化的信号转导。其是细胞凋亡的正调节子，并且还显示限制自身反应性CD8效应T细胞的增殖潜能并保护身体抵抗自身免疫。CD30出现在T细胞淋巴瘤(包括间变性大细胞淋巴瘤)并且也由B细胞淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤)表达。
CD43是人类T淋巴细胞、单核细胞、粒细胞和一些B淋巴细胞表面上的主要的唾液酸糖蛋白，其似乎对于免疫功能是重要的，并且可以是参与T细胞活化的生理配体-受体复合体的一部分。CD43在超过90％的T细胞淋巴瘤中存在，并也可用作群组(panel)的一部分以证明B细胞淋巴母细胞性淋巴瘤，这是因为在此病症中的恶性细胞通常是CD43阳性的。其还染色粒细胞和它们的前体，因此其可以是骨髓肿瘤的有效的标记物。
CD44是参与细胞-细胞相互作用、细胞粘附和迁移的细胞表面糖蛋白。其是透明质酸的受体，并也可与其它配体如骨桥蛋白、胶原和基质金属蛋白酶(MMP)相互作用。其参与多种细胞功能(包括淋巴细胞活化、再循环和归巢、造血和肿瘤转移)。CD44以各种剪切形式出现，并且报道了CD44中的变动用作一些乳腺癌和前列腺癌干细胞的细胞表面标记物。其还被视为上皮卵巢癌患者的存活时间增加的一个指标。CD44变体亚型还与头颈部鳞状细胞癌的进展相关联。
CD47是膜蛋白，其涉及经由细胞粘附到细胞外基质而发生的细胞内钙浓度的增加。该蛋白还是血小板反应蛋白的C末端细胞结合结构域的受体，并且其可以在膜运输和信号传导中起作用。CD47是出现在许多类型的癌症中的分子，并被膀胱癌细胞使用以躲避巨噬细胞的正常清除。
CD54(也称为细胞间粘附分子1)是细胞表面糖蛋白，其通常表达于内皮细胞和免疫系统的细胞上。其结合CD11a/CD18或CD11b/CD18型的整合素。CD54出现在B细胞淋巴母细胞性淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤以及其它的内皮癌上，且在转移中起作用。
CD55(也称为补体衰变加速因子)是70kDa的膜蛋白，其调节细胞表面上的补体系统。其防止C3bBb复合体(可替代途径的C3-转化酶)的组装或加速预先形成的转化酶的分解，从而阻断膜攻击复合体的形成。这种糖蛋白广泛分布于造血细胞和非造血细胞中。其还出现在许多内皮癌(包括结直肠癌和前列腺癌)中。
CD58是表达在抗原递呈细胞(APC)(尤其是巨噬细胞)上的细胞粘附分子。其结合至T细胞的CD2上，并且在加强T细胞和专职性抗原递呈细胞(professional antigen presentingcell)之间的粘附上是重要的。当T细胞漫游于淋巴结中，寻找APC表面上的肽：MHC复合体时，这种粘附作为T细胞活化前的T细胞和抗原递呈细胞之间的短暂最初的接触中的一部分发生。其表达于很多淋巴瘤(包括B细胞淋巴母细胞性淋巴瘤和黏膜相关淋巴组织淋巴瘤)上。
CD59通过结合C5b678并阻止C9的结合和聚合来抑制补体膜攻击复合体。其存在于“自我”细胞上以防止补体损坏它们。其具有广泛的组织分布并与乳腺癌和前列腺癌相关。
CD62L是出现在淋巴细胞上的细胞粘附分子。其属于识别唾液酸化碳水化合物基团的蛋白中的选择素家族。其被ADAM17裂解。其功能为淋巴细胞的“归巢受体”以经高内皮微静脉(high endothelial venule)进入二级淋巴组织。其出现在B细胞淋巴瘤(包括慢性淋巴细胞性白血病)以及T细胞淋巴瘤(包括成人T细胞淋巴瘤))上。
CD95(也称为Fas配体)是细胞表面上的导致程序性细胞死亡(细胞凋亡)的死亡受体。其出现在许多细胞类型上并与许多类型的癌症(包括卵巢癌和结肠癌)相关。
因此，本发明的第一个方面提供了一种物质，其包括：
(ⅰ)T细胞抗原，和
(ii)CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体，
其中，在物质与表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞结合后，物质被内在化并且T细胞抗原以可以被T细胞识别的形式在细胞表面上递呈。
为了避免疑问，当结合配偶体是CD70的结合配偶体时，物质会与表达CD70的细胞结合，等等。
T细胞抗原
“T细胞抗原”包括可以递呈给T细胞以引发T细胞应答的任何抗原。例如，T细胞抗原可以通过MHC分子或通过表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞的表面上的I组CD1分子递呈给T细胞。一旦在细胞表面上递呈了抗原，则细胞将被识别为外源的，并且变成T细胞的目标，其中一些具有消除被外源生物体(如病毒、真菌、细菌、分枝杆菌或原生动物)感染的或已经变成癌性的(如恶性的)外源细胞的天然功能。因此，应理解，T细胞抗原可以是能够被表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的不需要的细胞上的分子递呈的抗原。
应理解，T细胞抗原是可以引发向其施用本发明物质的受试者的现存T细胞应答的抗原。通常，T细胞抗原不是通过APC中的交叉递呈产生针对抗原的新初级T细胞应答的抗原。换言之，T细胞抗原是受试者内的许多T细胞已经对其敏化的抗原。可以通过将从受试者分离的外周单核血细胞接触抗原并且使用用于细胞增殖的标准试验来测定受试者的细胞是否已经对给定的抗原敏化，如以下和实施例中进一步描述的。
在一个实施方式中，本发明的物质不是产生特异于其中含有的T细胞抗原的新的T细胞应答的物质。因此，本发明包括含有T细胞抗原和CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体的物质，其中，在物质与表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞结合后，物质被内在化并且T细胞抗原以可以被T细胞识别的形式在细胞表面上递呈，并且其中T细胞抗原能引发受试者体内现存的T细胞应答。
“T细胞”包括所有类型T细胞，包括CD4+、CD8+、γδT细胞和NK-T细胞。优选地，T细胞是CD4+T细胞，其中辅助和细胞毒性CD4+T细胞是已知的(Appay V(2004)Clin Exp Immunol 138(1):10-13)。
如本领域已知的，抗原递呈机制将取决于T细胞的类型。可以理解的是，可以使用任何的递呈途径，只要抗原引发T细胞应答。换言之，在本发明的物质内在化后，T细胞抗原必须能在细胞表面上递呈，以使其能引发T细胞应答。优选地，T细胞抗原进入II型MHC加工机制并被递呈在II型MHC分子上，例如以下进一步描述的。
优选地，T细胞抗原是免疫显性抗原(如引发现存的免疫显性应答的抗原)。“免疫显性”指抗原以高量级、灵敏度、组织归巢特征和效率在携带杀灭抗原的(killing antigenbearing)细胞中引发T细胞应答。通常，免疫显性应答包括超过0.1％的受试者的CD8+或CD4+T细胞。例如，可以通过将从受试者分离的外周单核血细胞接触抗原并使用本领域已知的用于细胞增殖的标准试验来进行针对给定抗原的T细胞应答程度的测定。用于测定免疫应答程度的合适试验包括ELISpot、胞内细胞因子染色、HLA-肽四聚体染色、增殖试验、激活试验(如CD69)、CD107动员试验或代谢试验(如MTT)。
合适的T细胞抗原的实例包括肽、多肽、磷酸肽或脂质中的任意种，如磷脂或鞘脂，并且以下提供了这些中每一种的更多的实例。最优选地，T细胞抗原是肽或多肽。
当T细胞抗原是肽或多肽时，其通常是结合II类MHC分子时能够被T细胞受体识别的肽或多肽。T细胞抗原可以是II类MHC限制抗原，其只结合II类MHC分子。将认识到，抗原可以只结合特定的变体II类MHC分子(如特定受试者中发现的天然变体)，或抗原能够结合任何II类MHC分子(即，抗原是无区分的)。
在一个实施方式中，T细胞抗原能够结合II类MHC分子，如HLA-DP、HLA-DQ或HLA-DR中的任意种。通常的II类MHC类型包括DR1、DR3、DR4、DR7、DR52、DQ1、DQ2、DQ4、DQ8和DP1。II类MHC分子在免疫细胞上表达，其中免疫细胞包括抗原递呈细胞如树突细胞、B细胞和巨噬细胞。因此，当T细胞抗原是II类MHC限制时，本发明的物质可以用于治疗如淋巴瘤或自身免疫疾病这样的病症。然而，将理解，II类MHC分子可以在无免疫性的细胞上被上调(如经由IFN-γ刺激)，因此也可以治疗其它病症。
可以使用的无区分的肽的实例是Alexander等人(2000)The Journal of Immunology164:1625-1633中限定的PADRE II类MHC表位；aKXVAAWTLKAAaZC(a＝d-丙氨酸，X＝L-环己基丙氨酸，Z＝氨基己酸))(SEQ ID No:1)。由于这个表位是人造的，因此首先需要在施用本发明的物质前，在患者中引入疫苗，以产生免疫应答。可以使用的另一种无区分的肽是破伤风片段C肽。
便利地，T细胞抗原是由II类MHC分子识别的免疫原性肽。这样的肽通常长9至22个氨基酸。优选地，肽是免疫显性肽。
免疫显性肽的实例包括病毒衍生的引发内源性抗病毒应答的肽。因此，肽可以源自内源性病毒，如水痘-带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒、细胞巨化病毒、爱泼斯坦－巴尔二氏病毒或流感病毒。可以与本文所述的任何结合配偶体(如CD22结合配偶体)组合使用的特别优选的实例包括源自人巨细胞病毒(CMV或人疱疹病毒5/HHV5)或爱泼斯坦－巴尔二氏病毒(EBV或HHV4)；疱疹病毒如HHV1、HHV2和HHV3；甲型流感病毒；乙型流感病毒；鼻病毒；腺病毒；和肝病毒科(Hepadnaviridae)的肽，以下给出它们的具体的实例。
对于人巨细胞病毒(HHV5)，免疫显性抗原得到了充分表征(参见Sylwester AW等人，J Exp Med.2005 Sep 5；202(5):673-85，通过引用并入本文中作为参考)，并且Sylwester等人描述的抗原也可以用于本发明中。特别地，Sylester等人合成了连续的15mer肽，对于213个预测的人CMV蛋白而言，有10个氨基酸重叠。这产生13,687个排列在ORF或亚-ORF特异性混合物中的肽。发现源自ORF UL55(gB)、UL83(pp65)、UL86、UL99(pp28)、UL122(IE2)、UL36、UL48、UL32(pp150)、UL113、IRS-1、UL123(IE1)、UL25、UL141、UL52和UL82(pp71)的肽引发最多的CD4+T细胞应答，并且因此如果肽源自这些ORF中的一个，将特别优选。
特别地，以下列出了可以使用的巨细胞病毒T细胞抗原。
对于巨细胞病毒抗原如pp65的CD4+T细胞表位包括PQYSEHPTFTSQYRIQ(SEQID No:1)、FTSQYRIQGKLEYRHT(SEQ ID No:2)、LLQTGIHVRVSQPSL(SEQ ID No:43)、NPQPFMRPHERNGFT(SEQ ID No:4)、EPDVYYTSAFVFPTK(SEQ ID No:5)、IIKPGKISHIMLDVA(SEQ ID No:6)、AGILARNLVPMVATV(SEQ ID No:7)、KYQEFFWDANDIYRI(SEQ ID No:8)；对于gB，它们包括DYSNTHSTRYV(SEQ ID No:9)、CMLTITTARSKYPYH(SEQ ID No:10)和VFETSGGLVVFWQGI(SEQ ID No:11)；对于IE1，它们包括VRVDMVRHRIKEHMLKKYTQ(SEQ ID No:12)和NYIVPEDKREMWMACIKELH(SEQ ID No:13)；并且对于gH，它们包括HELLVLVKKAQL(SEQ ID No:14)。
对于爱泼斯坦－巴尔二氏病毒(EBV或HHV4)，免疫显性蛋白也得到了充分表征，并且Hislop AD等人，Annu Rev Immunol.2007；25:587-617中有提供(通过引用并入本文中作为参考)。以下提供了改编自Hislop等人的合适的T细胞表位的列表。
表3：EBV裂解的(lytic)和潜伏的(latent)循环蛋白(cycle protein)中鉴定的CD4+T细胞表位(改编自Hislop等人)
将认识到，T细胞抗原(例如，肽)可以是源自活疫苗的抗原，所述活疫苗如麻疹、流行性腮腺炎、风疹(MMR)或HHV3；或者是源自胞内细菌的抗原，所述细菌如分枝杆菌，特别是通过用BCG免疫引起的那些。这样的肽是本领域公知的。相似地，T细胞抗原(例如，肽)可以源自破伤风类毒素，如P2、P4或P30。因此，将理解，T细胞抗原(例如，肽)可以是引发受试者体内现存的免疫应答的抗原，所述现存的免疫应答是通过之前对抗感染剂的疫苗接种产生的。因此，为了增加对T细胞抗原敏化的T细胞数量，用含有T细胞抗原的疫苗接种或加强免疫受试者是合乎需要的。例如，受试者可以接种破伤风毒素，接着施用本发明的包含相关T细胞抗原的物质。
将认识到，由于许多人在儿童时期接种了这些疫苗，他们很可能含有对这些T细胞抗原敏化的T细胞。因此，在一个实施方式中，T细胞抗原是在孩童时期疫苗中发现的抗原。优选通常用于如MMR、麻疹、BCG、黄热病、小儿麻痹症、V2V和流感的抗原。
尽管不是优选地，T细胞抗原(例如，肽)还可以是引发受试者体内现存的免疫应答的抗原，所述现存的免疫应答是通过将该受试者的T细胞在体外暴露于抗原产生的。
可以通过公知的化学方法来产生肽，所述化学方法如溶液或固相合成，或溶液中的半合成，所述半合成通过用本领域已知的常规溶液方法偶联的蛋白片段开始。或者，可以通过用确定的方法(包括重组方法)来合成肽。
尽管优选T细胞抗原是多肽或肽，已知其它抗原也能够引发免疫应答，并且因此在本发明中具有实用性。例如，γδT细胞不识别MHC-相关的肽抗原，并且不是MHC限制的。一些γδT细胞克隆识别小的磷酸化分子、焦磷酸化化合物(例如，HMBPP(E-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基-焦磷酸酯)和IPP(异戊烯基焦磷酸酯))、烷基胺或脂质(例如，磷酸化脂质)，这些物质可以通过称为CD1分子的“非经典”I类MHC-样分子递呈。相似地，NK-T细胞(例如，Vα24Vβ11细胞)识别结合CD1分子的脂质(例如，神经酰胺，如α-gal-神经酰胺)。因此，T细胞抗原可以是已知引发T细胞应答的这些分子的任意种。当然，T细胞抗原必须是在物质内在化进细胞后能递呈在这些分子中的任意种上的抗原。
如下所述，使用物质来治疗自身免疫或过敏性疾病时，将认识到T细胞抗原可以分别是自身抗原或过敏原。这样，有助于失调的免疫应答被重新定向至不需要的细胞，以抵抗失调。
将认识到，T细胞抗原可以是化学修饰的，只要其仍然能够引发T细胞应答。这样的化学修饰可以包括，例如，添加金属，如镍，因为已经显示出在某些过敏患者中，存在识别具有结合的镍原子的肽的T细胞(Romagnoli等人1991，EMBO J 10:1303-1306)。T细胞抗原也可以通过有机分子来修饰，所述有机分子增强了免疫原性(Romero等人，1993，J Immunol 150:3825-3831)。其它修饰包括磷酸化、乙酰化、烷基化、酰化、酰胺化、糖基化、甲基化、瓜氨酸化(citrulination)、硝化、硫酸化和羟基化、与酸或碱形成盐、形成末端羧基的酯或酰胺以及连接氨基酸保护基团，如N-t-丁氧基羰基(N-t-butoxycarbonal)。
当T细胞抗原是肽时，将认识到，其可以包含由DNA编码的天然产生的氨基酸和/或一个或多个非天然氨基酸，包括“D”异构形式的氨基酸或组合使用N-甲基化氨基酸或β氨基酸或类肽，只要其被相应的T细胞识别。因此，肽可以是肽“模拟物”，即肽类似物(peptidomimetic)，其模拟上述任一种肽的结构特征。例如，T细胞抗原是逆反(retro-inverso)肽。
相似地，当T细胞抗原是肽时，其可以是模拟表位(minotope)，即由天然或非天然氨基酸组成的模拟天然表位结构的肽。模拟表位常常更有效地刺激T细胞。
优选地，T细胞抗原在T淋巴细胞不存在的情况中基本上是无毒的。“基本上无毒的”意思是与毒素(如，假单胞菌外毒素)相比，抗原具有相当低或优选不可检测的毒性。
通过使用http://www.immuneepitope.org(Vita R,Zarebski L,Greenbaum JA,Emami H,Hoof I,Salimi N,Damle R,Sette A,Peters B.The immune epitope database2.0，Nucleic AcidsRes.2010Jan；38(数据库发表):D854-62.Epub 2009年11月11日)，本领域技术人员将能够鉴定更多的可以用于本发明中的T细胞抗原。
结合配偶体
“CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体”是指任何的分别结合CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的分子。因此，本发明的物质可以结合到表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞的表面。
“CD70”包括人类CD70，图1A中提供了其氨基酸序列，并且其登录号是P32970。然而，公知的是，某些多肽是多态的，并且将理解，此序列上可能会发生一些自然变异。因此，在一个实施方式中，CD70的结合配偶体不限于具有图1A中所列的序列的人类CD70的结合配偶体，而是还包括其天然存在的变体(其中一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸取代)的结合配偶体。CD70的结合配偶体还包括其它物种中的CD70的结合配偶体，所述其它物种中的CD70具有与图1A中的序列同源的序列，例如源自其它哺乳动物如马、狗、猪、牛、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠或灵长类动物的CD70。
“CD74”包括人类CD74，图1B中提供了其氨基酸序列，并且其登录号是P04233。然而，公知的是，某些多肽是多态的，并且将理解，此序列上可能会发生一些自然变异。因此，在一个实施方式中，CD74的结合配偶体不限于具有图1B中所列的序列的人类CD740的结合配偶体，而是还包括其天然存在的变体(其中一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸取代)的结合配偶体。CD74的结合配偶体还包括其它物种中的CD74的结合配偶体，所述其它物种中的CD74具有与图1B中的序列同源的序列，例如源自其它哺乳动物如马、狗、猪、牛、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠或灵长类动物的CD74。
“CD22”包括人类CD22，图1B中提供了其氨基酸序列，并且其登录号是P20273。然而，公知的是，某些多肽是多态的，并且将理解，此序列上可能会发生一些自然变异。因此，在一个实施方式中，CD22的结合配偶体不限于具有图1C中所列的序列的人类CD22的结合配偶体，而是还包括其天然存在的变体(其中一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸取代)的结合配偶体。CD22的结合配偶体还包括其它物种中的CD22的结合配偶体，所述其它物种中的CD22具有与图1C中的序列同源的序列，例如源自其它哺乳动物如马、狗、猪、牛、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠或灵长类动物的CD22。
“HLA-DR”包括人类HLA-DR，图1D中提供了其氨基酸序列，并且其登录号是P29769。然而，公知的是，某些多肽是多态的，并且将理解，此序列上可能会发生一些自然变异。因此，在一个实施方式中，HLA-DR的结合配偶体不限于具有图1D中所列的序列的人类HLA-DR的结合配偶体，而是还包括其天然存在的变体(其中一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸取代)的结合配偶体。HLA-DR的结合配偶体还包括其它物种中的HLA-DR的结合配偶体，所述其它物种中的HLA-DR具有与图1D中的序列同源的序列，例如源自其它哺乳动物如马、狗、猪、牛、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠或灵长类动物的HLA-DR。
“CD23”包括人类CD23，图1E中提供了其氨基酸序列，并且其登录号是P06734。然而，公知的是，某些多肽是多态的，并且将理解，此序列上可能会发生一些自然变异。因此，在一个实施方式中，CD23的结合配偶体不限于具有图1E中所列的序列的人类CD23的结合配偶体，而是还包括其天然存在的变体(其中一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸取代)的结合配偶体。CD23的结合配偶体还包括其它物种中的CD23的结合配偶体，所述其它物种中的CD23具有与图1E中的序列同源的序列，例如源自其它哺乳动物如马、狗、猪、牛、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠或灵长类动物的CD23。
“CD30”包括人类CD30，图1F中提供了其氨基酸序列，并且其登录号是P28908。然而，公知的是，某些多肽是多态的，并且将理解，此序列上可能会发生一些自然变异。因此，在一个实施方式中，CD30的结合配偶体不限于具有图1F中所列的序列的人类CD30的结合配偶体，而是还包括其天然存在的变体(其中一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸取代)的结合配偶体。CD30的结合配偶体还包括其它物种中的CD30的结合配偶体，所述其它物种中的CD30具有与图1F中的序列同源的序列，例如源自其它哺乳动物如马、狗、猪、牛、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠或灵长类动物的CD30。
“CD43”包括人类CD43，图1G中提供了其氨基酸序列，并且其登录号是P16150。然而，公知的是，某些多肽是多态的，并且将理解，此序列上可能会发生一些自然变异。因此，在一个实施方式中，CD43的结合配偶体不限于具有图1G中所列的序列的人类CD43的结合配偶体，而是还包括其天然存在的变体(其中一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸取代)的结合配偶体。CD43的结合配偶体还包括其它物种中的CD43的结合配偶体，所述其它物种中的CD43具有与图1G中的序列同源的序列，例如源自其它哺乳动物如马、狗、猪、牛、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠或灵长类动物的CD43。
“CD44”包括人类CD44，图1H中提供了其氨基酸序列，并且其登录号是P16070。然而，公知的是，某些多肽是多态的，并且将理解，此序列上可能会发生一些自然变异。因此，在一个实施方式中，CD44的结合配偶体不限于具有图1H中所列的序列的人类CD44的结合配偶体，而是还包括其天然存在的变体(其中一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸取代)的结合配偶体。CD44的结合配偶体还包括其它物种中的CD44的结合配偶体，所述其它物种中的CD44具有与图1H中的序列同源的序列，例如源自其它哺乳动物如马、狗、猪、牛、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠或灵长类动物的CD44。
“CD47”包括人类CD47，图1I中提供了其氨基酸序列，并且其登录号是P08722。然而，公知的是，某些多肽是多态的，并且将理解，此序列上可能会发生一些自然变异。因此，在一个实施方式中，CD47的结合配偶体不限于具有图1I中所列的序列的人类CD47的结合配偶体，而是还包括其天然存在的变体(其中一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸取代)的结合配偶体。CD47的结合配偶体还包括其它物种中的CD47的结合配偶体，所述其它物种中的CD47具有与图1I中的序列同源的序列，例如源自其它哺乳动物如马、狗、猪、牛、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠或灵长类动物的CD47。
“CD54”包括人类CD54，图1J中提供了其氨基酸序列，并且其登录号是P05362。然而，公知的是，某些多肽是多态的，并且将理解，此序列上可能会发生一些自然变异。因此，在一个实施方式中，CD54的结合配偶体不限于具有图1J中所列的序列的人类CD54的结合配偶体，而是还包括其天然存在的变体(其中一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸取代)的结合配偶体。CD54的结合配偶体还包括其它物种中的CD54的结合配偶体，所述其它物种中的CD54具有与图1J中的序列同源的序列，例如源自其它哺乳动物如马、狗、猪、牛、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠或灵长类动物的CD54。
“CD55”包括人类CD55，图1K中提供了其氨基酸序列，并且其登录号是P08174。然而，公知的是，某些多肽是多态的，并且将理解，此序列上可能会发生一些自然变异。因此，在一个实施方式中，CD55的结合配偶体不限于具有图1K中所列的序列的人类CD55的结合配偶体，而是还包括其天然存在的变体(其中一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸取代)的结合配偶体。CD55的结合配偶体还包括其它物种中的CD55的结合配偶体，所述其它物种中的CD55具有与图1K中的序列同源的序列，例如源自其它哺乳动物如马、狗、猪、牛、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠或灵长类动物的CD55。
“CD58”包括人类CD58，图1L中提供了其氨基酸序列，并且其登录号是P19256。然而，公知的是，某些多肽是多态的，并且将理解，此序列上可能会发生一些自然变异。因此，在一个实施方式中，CD58的结合配偶体不限于具有图1L中所列的序列的人类CD58的结合配偶体，而是还包括其天然存在的变体(其中一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸取代)的结合配偶体。CD58的结合配偶体还包括其它物种中的CD58的结合配偶体，所述其它物种中的CD58具有与图1L中的序列同源的序列，例如源自其它哺乳动物如马、狗、猪、牛、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠或灵长类动物的CD58。
“CD59”包括人类CD59，图1M中提供了其氨基酸序列，并且其登录号是P13987。然而，公知的是，某些多肽是多态的，并且将理解，此序列上可能会发生一些自然变异。因此，在一个实施方式中，CD59的结合配偶体不限于具有图1M中所列的序列的人类CD59的结合配偶体，而是还包括其天然存在的变体(其中一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸取代)的结合配偶体。CD59的结合配偶体还包括其它物种中的CD59的结合配偶体，所述其它物种中的CD59具有与图1M中的序列同源的序列，例如源自其它哺乳动物如马、狗、猪、牛、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠或灵长类动物的CD59。
“CD62L”包括人类CD62L，图1N中提供了其氨基酸序列，并且其登录号是P14151。然而，公知的是，某些多肽是多态的，并且将理解，此序列上可能会发生一些自然变异。因此，在一个实施方式中，CD62L的结合配偶体不限于具有图1N中所列的序列的人类CD62L的结合配偶体，而是还包括其天然存在的变体(其中一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸取代)的结合配偶体。CD62L的结合配偶体还包括其它物种中的CD62L的结合配偶体，所述其它物种中的CD62L具有与图1N中的序列同源的序列，例如源自其它哺乳动物如马、狗、猪、牛、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠或灵长类动物的CD62L。
“CD95”包括人类CD95，图1O中提供了其氨基酸序列，并且其登录号是P25445。然而，公知的是，某些多肽是多态的，并且将理解，此序列上可能会发生一些自然变异。因此，在一个实施方式中，CD95的结合配偶体不限于具有图1O中所列的序列的人类CD95的结合配偶体，而是还包括其天然存在的变体(其中一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸取代)的结合配偶体。CD95的结合配偶体还包括其它物种中的CD95的结合配偶体，所述其它物种中的CD95具有与图1O中的序列同源的序列，例如源自其它哺乳动物如马、狗、猪、牛、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠或灵长类动物的CD95。
如下述进一步描述的，本发明的物质可以施用给受试者以用于医学中。对于被施用物质的受试者而言，优选物质包含结合到该物种的CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体。例如，当受试者是人类时，物质包括人类的CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体，等等。
优选地，结合配偶体选择性结合到CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种。例如，优选的是，如果CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体具有比由此细胞表达的至少一种其它实体低至少5或10倍，并且优选低多于100或500倍的Kd值(解离常数)(即更高的亲和力)。更优选地，CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体具有比由此细胞表达的至少一种其它实体低多于1000或5000倍的Kd值。Kd值可以容易地使用本领域中公知的方法来确定。
结合配偶体可以是任何的多肽、肽、小分子或肽模拟物。
在一个优选的实施方式中，结合配偶体是结合CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95的抗体。
结合配偶体可以是抗-CD70抗体，例如BU69或SGN-70或SGN-75或来自eBioscience的商业抗体(纯化的抗-人CD74，克隆LN2)中的任何一种(Epstein等人,1984,Immunol.133(2):1028；Lamb等人,1991,PNAS 88(14):5998)。
结合配偶体可以是抗-CD74抗体，例如米拉珠单抗(milatuzumab)(Becker-Herman等人,2005,Mol.Biol.Cell.16(11):5061)。
结合配偶体可以是抗-CD22抗体，如依帕珠单抗(Stein R.等人,Cancer ImmunolImmunother 37:293-298)(1993年10月)。
结合配偶体可以是抗-HLA-DR抗体，如来自eBioscience的商业抗体(抗-人HLA-DR，克隆L243)(Brodsky FM.A.Immunogenetics 1984；19(3):179-94；Engleman EG,Warnke R,Fox RI,Dilley J,Benike CJ,Levy R.Proc Natl Acad Sci USA 1981Mar；78(3):1791-5.)。
结合配偶体可以是抗-CD23抗体，例如来自eBioscience的商业抗体(纯化的抗-人CD23，克隆EBVCS2)(Knapp,W.,B.Dorken等人编(1989)Leucocyte Typing IV:White CellDifferentiation Antigens.牛津大学出版社，纽约；McMichael,A.J.,P.C.L.Beverly等人编(1987)Leucocyte Typing III:White Cell Differentiation Antigens.牛津大学出版社，纽约；Bernard,A.等人编(1981)Leukocyte Typing.Springer-Verlag.)。
结合配偶体可以是抗-CD30抗体，例如来自eBioscience的商业抗体(纯化的抗-人CD30，克隆BerH2)(Tamiolakis D等人Int J Biol Sci 2005；1:135-140；Polski JM,Janney CG.Ber-H2 Mod Pathol.1999Sep；12(9):903-6；Horie R,Watanabe,T.J Immunol 1998；10:457-470.)。
结合配偶体可以是抗-CD43抗体，例如来自eBioscience的商业抗体(纯化的抗-人CD43，克隆eBio84-3C1)(Borche L,Lozano F,Vilella R,Vives J.Eur J Immunol.1987Oct；17(10):1523-6；Schlossman,S.,L.Bloumsell等人编1995.Leucocyte Typing V:White CellDifferentiation Antigens.牛津大学出版社，纽约)。
结合配偶体可以是抗-CD44抗体，例如来自eBioscience的商业抗体(纯化的抗-人CD44，克隆IM7)(Trowbridge,I.S.,J.Lesley等人1982.Immunogenetics 15(3):299-312；Lesley,J.和I.S.Trowbridge 1982.Immunogenetics 15(3):313-20；Maiti A,Maki G,Johnson P.Science.1998.Oct 30；282(5390):941-3.)。
结合配偶体可以是抗-CD47抗体，例如来自eBioscience的商业抗体(纯化的抗-人CD47，克隆B6H12)(Grimbert P,Bouguermouh S等人J Immunol.2006 Sep 15；177(6):3534-41；Lagadec P,Dejoux O等人2003Jun 15；101(12):4836-43.)。
结合配偶体可以是抗-CD54抗体，例如来自eBioscience的商业抗体(纯化的抗-人CD54，克隆eBio KAT1)(Lehmann JC等人J Immunol.2003Sep 1；171(5):2588-93；Arai K等人Int J Pancreatol.1999 Aug；26(1):23-31)。
结合配偶体可以是抗-CD55抗体，例如来自eBioscience的商业抗体(纯化的抗-人CD55，克隆143-30)(Knapp,W.,B.Dorken等人编(1989).Leucocyte Typing IV:White CellDifferentiation Antigens.牛津大学出版社，纽约)。
结合配偶体可以是抗-CD58抗体，例如来自eBioscience的商业抗体(纯化的抗-人CD58，克隆TS2/9)(Ariel O等人Cellular Signaling 2009:21:1100-1108；Osborn L等人J.Exp.Med.January 1995；181:429-434.)。
结合配偶体可以是抗-CD59抗体，例如来自eBioscience的商业抗体(纯化的抗-人CD59，克隆OV9A2)(Alegretti AP等人Cell Immunol.2010；265(2):127-32；Deckert M等人Eur J Immunol.1992Nov；22(11):2943-7)。
结合配偶体可以是抗-CD62L抗体，例如来自eBioscience的商业抗体(纯化的抗-人CD59，克隆DREG-56)(Jutila MA等人J.Immunol,Aug 15；169(4):1768-73；Schlossman,S.,L.Bloumsell等人编1995.Leucocyte Typing V:White Cell Differentiation Antigens.牛津大学出版社，纽约)。
结合配偶体可以是抗-CD95抗体，例如来自eBioscience的商业抗体(纯化的抗-人CD59，克隆APO-1-1)(Rajasagi,M等人Journal of Leukocyte Biology 2009；85:251-261；Fluhr,H等人Journal of Cell Science 2007；120:4126-4133.)。
或者，结合配偶体可以是以非免疫意义的方式(in non-immune sense)特异性结合到CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的任何分子或其部分。因此，特异性结合配偶体可以是激素、生长因子、细胞因子或受体配体(例如，激动剂或拮抗剂)中的任意种。
已知CD70结合CD27，因此，在一个实施方式中，CD70的结合配偶体是CD27。
已知CD74结合巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)，因此，在一个实施方式中，CD74的结合配偶体是MIF。
已知CD23结合IgE，因此，在一个实施方式中，CD23的结合配偶体是IgE。
已知CD30结合CD30L，因此，在一个实施方式中，CD30的结合配偶体是CD30L。
已知CD43结合唾液酸残基，因此，在一个实施方式中，CD43的结合配偶体是唾液酸。
已知CD44结合透明质酸、胶原蛋白和骨桥蛋白，因此，在一个实施方式中，CD44的结合配偶体是透明质酸、胶原蛋白和骨桥蛋白中的任意种。
已知CD47结合血小板反应蛋白，因此，在一个实施方式中，CD47的结合配偶体是血小板反应蛋白。
已知CD54结合LFA-2，因此，在一个实施方式中，CD54的结合配偶体是LFA-2。
已知CD58结合CD2，因此，在一个实施方式中，CD58的结合配偶体是CD2。
已知CD62L结合外周淋巴结地址素，因此，在一个实施方式中，CD62L的结合配偶体是外周淋巴结地址素。
已知CD95结合FasL(CD95L)，因此，在一个实施方式中，CD95的结合配偶体是FasL(CD95L)。
已知HLA-DR结合CD4，因此，在一个实施方式中，HLA-DR的结合配偶体是CD4。
如本文所用的，术语“抗体”包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fab片段、Fab表达文库产生的片段和双特异性抗体。这样的片段包括完整抗体的保留其对目标物质的结合活性的片段、Fv、F(ab')和F(ab')2片段，以及单链抗体(scFv)、融合蛋白和包含抗体的抗原结合位点的其它合成蛋白。只包含抗体一部分的结合配偶体由于优化了从血液的清除速率，可能是有利的，并且不太可能经历归因于Fc部分的非特异性结合。还包括结构域抗体(dAb)、双特异抗体(diabody)、骆驼抗体和工程化的骆驼抗体。此外，为了施用于人，抗体及其片段可以是人源化抗体，其现在是本领域公知的(Janeway等人(2001)Immunobiology.,5th ed.,Garland Publishing)；An等人(2009)Therapeutic MonoclonalAntibodies:From Bench to Clinic,ISBN:978-0-470-11791-0)。
还包括不对称IgG-样抗体(例如，triomab/quadroma，Trion Pharma/Fresenius Biotech；结嵌入穴(knobs-into-holes)；Genentech；Cross MAb，Roche；静电相配抗体，AMGEN；LUZ-Y，Genentech；链交换工程化结构域(SEDD)体，EMD Serono；biolonic，Merus；和Fab-交换抗体，Genmab)，对称IgG-样抗体(例如，双重靶向(DT)-Ig，GSK/Domantis；二合一(two-in-one)抗体，Genentech；交联MAb，karmanos癌中心；mAb2，F-star；和Cov X-体，Cov X/Pfizer)，IgG融合体(例如，双重可变结构域(DVD)-Ig，Abbott；IgG-样双特异性抗体，Eli Lilly；Ts2Ab，Medimmune/AZ；BsAb，ZymoGenetics；HERCULES，BiogenIdec；TvAb，Roche)Fc融合体(例如，ScFv/Fc融合体，Academic Institution；SCORPION，EmergentBioSolutions/Trubion，ZymoGenetics/BMS；双重亲和性重新靶向技术(Fc-DART)，MacroGenics；双重(ScFv)2-Fab，National Research Center for Antibody Medicine)Fab融合体(例如，F(ab)2，Medarex/AMGEN；双重作用或Bis-Fab，Genentech；对接锁定(Dock-and-Lock，DNL)，ImmunoMedics；二价双特异性，Biotechnol；和Fab-Fv，UCB-Celltech)，基于ScFv-和双特异抗体的抗体(例如，双特异性T细胞啮合物(BiTE)，Micromet；串联双特异抗体(Tandab)，Affimed；DARTs，MacroGenics；单链双特异抗体，Academic；TCR-样抗体，AIT，ReceptorLogics；人血清白蛋白ScFv融合体，Merrimack；和COMBODIES，Epigen Biotech)，IgG/非-IgG融合体(例如，免疫细胞因子，EMDSerono，Philogen，ImmunGene，ImmunoMedics；超抗原融合蛋白，Active Biotech；和对抗癌症的免疫代谢mTCR，ImmTAC)和寡克隆抗体(例如，Symphogen和Merus)。
抗体可以具有如Carter(2006)“Potent antibody therapeutics by design”,Nat RevImmunol.6(5):343-57和Carter(2011)“Introduction to current and future protein therapeutics:a protein engineering perspective”,Exp Cell Res.317(9):1261-9中所述的抗体样支架中的任意种和本文所述的特异性决定区，将上述文献通过引用并入本文作为参考。因此，术语“抗体”还包括亲和体(affibody)和基于非免疫球蛋白的框架。实例包括adnectins、抗钙素(anticalins)、亲和素(affilins)、反体(trans-bodies)、预设计锚蛋白重复蛋白(darpins)、三体X(trimer)、微蛋白、fynomers、高亲和性多聚体(avimers)、centgrins和kalbitor(艾卡拉肽(ecallantide))。
使用抗体片段而不是整个抗体的优点有很多。较小大小的片段可以提高药物性质，如更好的实体组织的渗透。此外，抗原结合片段，如Fab、Fv、ScFv和dAb抗体片段可以在大肠杆菌或酵母中表达并从其分泌出来，因此可以方便地在实验室中生产并以商业规模经济地生产。同时，由于缺少Fc成分，这样的片段增加了毒理学安全性。
抗体可以是IgG、IgE、IgA、IgM和IgD类别中的任意种，并且可以源自任何物种。如果抗体是IgG，可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任意种。然而，优选地，将物质施用于特定宿主时，抗体或至少其恒定区源自该宿主。例如，物质待施用于人时，抗体优选是人抗体或人源化抗体等。
本领域技术人员可以通过使用本领域长期确立的技术来制备结合CD70或CD74的合适抗体。制备单克隆抗体和抗体片段的方法是本领域公知的，并且包括杂交瘤技术(Kohler & Milstein(1975)“Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefinedspecificity.Nature 256:495–497)；抗体噬菌体展示(Winter等人(1994)“Making antibodiesby phage display technology.”Annu.Rev.Immunol.12:433–455)；核糖体展示(Schaffitzel等人(1999)“Ribosome display:an in vitro method for selection and evolution of antibodiesfrom libraries.”J.Immunol.Methods 231:119–135)；和反复菌落过滤筛选(iterative colonyfilter screening)(Giovannoni等人(2001)“Isolation of anti-angiogenesis antibodies from alarge combinatorial repertoire by colony filter screening.”Nucleic Acids Res.29:E27)。此外，描述了适用于本发明的抗体和抗体片段，例如，在以下出版物中：“Monoclonal HybridomaAntibodies:Techniques and Application”,Hurrell(CRC出版社,1982)；“MonoclonalAntibodies:A Manual of Techniques”,H.Zola,CRC出版社,1987,ISBN:0-84936-476-0；“Antibodies:A Laboratory Manual”第1版,Harlow & Lane编，冷泉港实验室出版社，纽约，1988.ISBN 0-87969-314-2；“Using Antibodies:A Laboratory Manual”第2版,Harlow & Lane编，冷泉港实验室出版社，纽约，1999.ISBN 0-87969-543-9；和“Handbook of TherapeuticAntibodies”Stefan Dübel编，第1版，-Wiley-VCH,Weinheim,2007.ISBN:3-527-31453-9。
内在化和细胞表面上的递呈
“物质被内在化并且T细胞抗原以能被T细胞识别的形式在细胞表面上递呈”的意思包括物质被吸收进细胞(例如，通过内吞作用)，随后T细胞抗原以能被T细胞识别的形式在细胞表面上递呈。这样的识别可以容易地通过评估T细胞的活化来确定，例如，将T细胞与递呈了T细胞抗原的细胞接触后并使用本领域已知的用于细胞增殖的标准试验。用于测定免疫应答程度的合适试验包括ELISpot、胞内细胞因子染色、增殖试验、激活试验(例如CD69)、CD107动员试验或代谢试验(例如MTT)。同样合适的是测定激活诱导的分泌的细胞因子的试验，例如使用ELISA或多路复用珠技术(multiplexed beadtechnology)。
可以使用本领域已知的任何合适的试验如基于流式细胞仪的试验来评估内在化。例如，物质可以被耦合到荧光染料如荧光素异硫氰酸酯(FITC)并用物质标记靶细胞。1-24小时后，将弱酸(例如柠檬酸)加入到靶细胞并在洗涤细胞后在流式细胞仪上进行分析。如果荧光染料仍在细胞表面上，则酸会淬灭荧光染料并在流式细胞仪上没有信号，从而表明物质未被内在化。如果物质被内在化，则荧光染料不能接触酸且没有淬灭效应。这意味着在流式细胞仪上存在阳性信号，从而表明物质被内在化。
将理解，可以使用常规方法来确定在T细胞抗原内在化后T细胞抗原是否被递呈到T细胞上，而不是抗原外部装载到细胞表面。例如，可以将细胞在阻止内在化的条件下暴露于本发明的物质中。合适的条件可以是使用物质如低聚甲醛或戊二醛轻微地固定细胞，或在约4℃或更低的温度下进行实验。如果内在化对于被递呈的T细胞抗原是必不可少的，则一旦内在化被抑制应没有T细胞活化。或者，可以使用细胞内加工途径抑制剂以确定T细胞抗原的递呈是否是在内在化之后或是外部装载的结果。例如，可以使用如本领域公知的和以下进一步描述的II类MHC细胞内加工途径的抑制剂。
在一个优选的实施方式中，T细胞抗原是被内在化并进入经典的II类MHC加工途径的抗原。例如，T细胞抗原肽可以通过内吞囊泡中的蛋白质降解从物质中释放，并在运输到细胞表面之前结合到II类MHC分子上。评估T细胞抗原是否是经II类MHC途径加工的是本领域的标准做法，并且可以包括在存在和不存在途径的已知抑制剂如氯醌(chloroquinone)和莫能菌素的情况下对加工过程进行测试。
为了便于在细胞内的T细胞抗原的加工，优选地，T细胞抗原连接到CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体上，使得T细胞抗原可以在表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞内从结合配偶体中释放。以下提供了合适的连接物并且其包括各种异型双功能交联剂，例如可以连接肽到游离的胺基(如在抗体的外表面上)的磺基-SMCC。其它的交联剂可以用于将肽连接到其它的官能团(例如羧基、羟基部分)或碳水化合物基团。通常，连接是共价的，尽管也可以使用强的非共价连接如生物素-亲和素或半抗原-特异性抗体(例如，地高辛)。
在一个实施方式中，T细胞抗原可以通过细胞内蛋白酶从结合配偶体中释放。
不希望受任何理论的束缚，本发明人相信，在包括II类MHC限制的肽的物质内在化进细胞后，物质将以与II类MHC加工途径相同的方式进行加工，其中内吞溶酶体将被酸化。酸化会激活各种基于内体和溶酶体的蛋白酶(如组织蛋白酶)，其将共同分解物质，从而从物质中释放肽。将理解，蛋白质水解不作用于肽自身。然后肽可以被装载到II类MHC分子上并在细胞表面上递呈。
可以使用能识别递呈在细胞表面上的T细胞抗原的T细胞抗原特异性T细胞来测试从结合配偶体中释放T细胞抗原。如果T细胞抗原被释放，T细胞会识别细胞表面上的T细胞抗原，这将通过如前所述的T细胞识别试验中的阳性信号来确定。如果T细胞抗原没有被释放，这将在T细胞识别试验中呈现阴性信号。也可以使用荧光团和技术(如用于评估T细胞抗原分布的直接细胞成像)来标记T细胞抗原。
将理解，以T细胞抗原可以在细胞外从结合配偶体中释放的方式，T细胞抗原并不连接到CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体。当然，T细胞抗原必须被内在化进表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞中并递呈至其表面。因此，优选地，以T细胞抗原可以在细胞外从结合配偶体释放的方式，T细胞抗原并不连接到CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体，例如通过任何一种或多种细胞外蛋白酶、核酸酶、脂肪酶、裂合酶、磷酸酶或糖酶。为了确保这点，优选物质不包括被细胞外分子(如蛋白酶、核酸酶、脂肪酶、裂合酶、磷酸酶、糖酶)裂解的位点，所述细胞外分子可以起作用以从CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体释放T细胞抗原。例如，物质可以不包括由细胞外分子(例如特异性蛋白酶)裂解的位点(例如特异性蛋白酶裂解位点)，所述细胞外分子存在于表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞(如癌细胞)附近。将理解，这将降低本发明的物质的所需大小。例如，当T细胞抗原是肽时，本发明的物质通常包括(i)具有长度短于22个氨基酸(例如，短于21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个氨基酸)的肽，其中肽包含T细胞抗原或由T细胞抗原组成，以及(ii)连接到肽上的结合配偶体(如抗体)。
确定给定序列是否可以被蛋白酶裂解，如果可以裂解，则是何种蛋白酶，这些对于本领域技术人员而言是常规实践。有大量对于蛋白质水解裂解序列的研究，且有很多程序可以用来确定对于给定序列的蛋白质水解活性(例如，Sigma Aldrich程序)。还有包含丰富的蛋白质水解和蛋白酶识别序列的信息的数据库(如MEROPs和PMAP)。还可以使用任何合适的方法。
本发明的物质的合成
便利地，T细胞抗原通过接头结合至CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体上。“接头”的意思包括将结合配偶体连接到T细胞抗原上的化学部分。
在一个实施方式中，接头不包括可被细胞外分子(如细胞外蛋白酶)裂解的位点。因此，在一个实施方式中，任何的连接结合配偶体与T细胞抗原的部分都不包括可被细胞外分子(如细胞外蛋白酶)裂解的位点。
将理解，T细胞抗原可以共价结合或非共价结合至CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体。优选地，T细胞抗原共价连接到CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体上。
在一个实施方式中，T细胞抗原和CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体通过接头共价连接。
因此，T细胞抗原(例如，肽)和CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体可以通过交联分子的任意种常规途径来方便地连接，所述交联分子如在O'Sullivan等人，Anal.Biochem.(1979)100,100-108中所概述的。例如，T细胞抗原(例如，肽)或者CD70或CD74的结合配偶体之一可以富含巯基，并且另一种与能与这些巯基反应的双功能药剂反应，例如，碘乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHIA)或N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)，其是在偶联的物质之间插入二硫桥的异型双功能交联剂。酰胺和硫醚键，例如用m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯获得的，通常在体内比二硫键更稳定。
已知双-马来酰亚胺试剂可以将巯基(例如，抗体的半胱氨酸残基的巯基)以序贯或同时的方式连接至另一个含巯基的部分(例如，T细胞抗原或接头中间体的巯基)。除了马来酰亚胺以外的与巯基反应的其它官能团包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基嘧啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
更多的有用的交联剂包括S-乙酰基硫代乙醇酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(S-acetylthioglycolic acid N-hydroxysuccinimide ester，SATA)(其是用于伯胺的巯化试剂，其允许巯基在温和条件下去保护(Julian等人，(1983)Anal.Biochem.132,68))、二甲基辛二硝酸二盐酸酯(dimethylsuberimidate dihydrochloride)和N,N'-o-亚苯基二马来酰亚胺(N,N'-o-phenylenedimaleimide)。
特别优选的交联剂包括硫代琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯(sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate，硫代-SMCC)、硫代琥珀酰亚胺6-(3'-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸酯(sulfosuccinimidyl6-(3'-[2-pyridyldithio]-propionamido)hexanoate，硫代-LC-SPDP)和N-[β-马来酰亚胺丙酸]酰肼、三氟醋酸盐(BMPH)。
将理解，大量的同型双功能和异型双功能交联化学物质适用于连接CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体和T细胞抗原，并且可以使用任何这样的化学物质。例如，可以使用使用Staudinger连接化学的点击化学(磷化氢-叠氮基化学)。
将认识到，T细胞抗原和CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体不需要彼此直接交联，而是可以通过一个或多个间隔物部分来连接。例如，T细胞抗原可以与化学部分交联，其随后与CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体交联。通常，间隔物部分可以用来防止位阻；然而，由于期望物质在细胞内破裂使得释放T细胞抗原，可以理解的是，不需要一个或多个间隔物部分。
在一个具体的实施方式中，其中T细胞抗原和CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体共价连接，且其中抗原和结合配偶体都是肽或多肽，将理解，两个成分可以是核酸分子编码的融合多肽的一部分。本发明包括这样的核酸分子以及含有所述核酸分子的宿主细胞。例如，使用本领域公知的遗传工程技术，将抗体结合配偶体进行遗传工程化来含有T细胞抗原。因此，将认识到，T细胞抗原可以包埋在CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体的多肽序列内或在其多肽序列的末端，只要其可以释放，以使得能够在内在化后被递呈到表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞的表面上。适当地，T细胞抗原与CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体相连接，使得两个部分保持其各自的活性，以使得可以将物质靶向到表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞，并且通过细胞来递呈T细胞抗原，以引发免疫应答。T细胞抗原和结合配偶体可以通过接头肽连接。合适的接头肽是通常采用随机螺旋构象的那些，例如，多肽可以含有丙氨酸或脯氨酸或丙氨酸加脯氨酸残基的混合物。优选地，接头含有2至100个氨基酸残基，更优选2至50个，再更优选4至20个。然而，如上所讨论，将意识到，对于物质在细胞内破裂使得T细胞抗原被释放而言，接头肽不是必须的。
编码合适的CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体的多核苷酸是本领域已知的或可以从已知序列容易地设计出来，如从已知与CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种相互作用的蛋白的序列或包含在核苷酸序列数据库(如GenBank、EMBL和dbEST数据库)中的序列。编码合适的T细胞抗原的多核苷酸是本领域已知的或可以从已知的序列容易地设计和制备出来。
编码合适的接头肽的多核苷酸可以从接头肽序列容易地设计和制备出来。
因此，使用公知的遗传工程化技术可以容易地构建编码本发明中所用物质的多核苷酸。
然后在合适的宿主中表达核酸，以产生本发明的物质。因此，可以根据已知技术来使用编码本发明物质的核酸，并根据本文中所含的教导进行适当地修改，以构建表达载体，然后将其用于转化合适的宿主细胞来表达和生产本发明的物质。
将认识到，编码本发明物质的核酸可以连接多种用于引入合适宿主中的其它核酸序列。同伴核酸(companion nucleic acid)将取决于宿主的性质、将核酸引入宿主中的方式和是否需要附加型维持或整合，如本领域公知的。
在其他实施方式中，T细胞抗原和CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体是非共价连接的。然而，将理解，非共价连接必须足够稳定，以允许在向受试者施用物质后，试剂被定位至细胞，并允许T细胞抗原在其表面上递呈。通常，非共价连接应具有Kd<10-9的亲和力。对于非共价连接，优选免疫结合或如分别通过生物素/抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素的结合。例如，CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95的结合配偶体可以是双特异性抗体，其中一种特异性是针对由不需要的细胞表达的实体，一种特异性是针对T细胞抗原或其部分。此外，可以将T细胞抗原偶联至另一种物质，双特异性抗体的特异性将反过来针对该物质。例如，T细胞抗原可以进一步包含被双特异性抗体识别的肽序列。另一种可能性涉及将CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体偶联至例如抗生物素蛋白链菌素，同时将T细胞抗原偶联至生物素，反之亦然。通过其可以形成非共价相互作用的其它方式包括亮氨酸拉链序列或亲和性键。在任一种情况中，在T细胞抗原和CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体之间的连接必须使得，在物质内在化进分别表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞后，T细胞抗原可以以可以被T细胞识别的方式递呈在细胞表面上。
本文所述的氨基酸残基通常是天然的“L”异构形式。然而，在某些情况中，“D”异构形式的残基可以取代L-氨基酸残基，只要物质的T细胞抗原仍然可以以可以被T细胞识别的形式被递呈在表达CD70或CD74的细胞的表面上。除非另外特意指出，该定义还包括化学修饰的氨基酸，包括氨基酸类似物(如青霉胺、3-巯基-D-缬氨酸)、天然产生的非成蛋白(proteogenic)氨基酸(如正亮氨酸)、β-氨基酸、氮杂肽、N-甲基化氨基酸和具有本领域已知的氨基酸特征性性质的化学合成化合物。术语“成蛋白”表示可以通过公知的代谢途径整合入细胞中的蛋白中的氨基酸。该定义还包括功能侧链基团已经被化学衍生的氨基酸。这样的衍生分子包括，例如，其中游离氨基已经衍生形成盐酸胺、p-甲苯磺酰基、苄氧羰基、t-丁氧基羰基、氯乙酰基或甲酸基的那些分子。游离羧基可以衍生形成盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯或酰肼。游离羟基可以衍生形成O-酰基或O-烷基衍生物。衍生物还包括含有二十个标准氨基酸的一个或多个天然产生的氨基酸衍生物的那些肽部分。
因此，将认识到，本发明的物质的肽部分可以是肽“模拟物”，即，模拟肽的结构特征的肽模拟物，其包含如本文中所述的氨基酸序列或由本文中所述的氨基酸序列组成。肽模拟物在治疗用途、对抗降解、渗透性或可能的口服给药中甚至更有利。
肽模拟物设计中的主要目标是降低模拟物对肽酶引起的切割和失活的易感性。在一种方法中，如Sherman等人(1990)中公开的以基本上等排的方式，，通过多种化学官能团取代一个或多个酰胺键。这种逐步的方法已经获得了一些成功，因为已经获得了活性类似物。在一些情况中，这些类似物已经显示出具有比其天然产生的对应物更长的生物半衰期。在另一种方法中，多种非编码的或修饰的氨基酸(如D-氨基酸和N-甲基氨基酸)已经用于修饰哺乳动物肽。或者，通过共价修饰，如环化或通过引入γ-内酰胺或其他类型的桥，来稳定假定的生物活性构象(Veber等人，1978)和Thorsett等人，1983)。由Rich(1986)公开的另一种方法通过应用酶抑制剂设计中的过渡态类似物概念来设计肽模拟物。例如，已知statine的仲醇模拟胃蛋白酶底物的固定酰胺键的四面体过渡态。其它方法包括使用氮杂肽和β-氨基酸。
“肽模拟物”的定义中还包括逆反肽。逆反肽(也称为全-D-逆或逆-对映(enantio)肽)的意思包括其中所有L-氨基酸被D-氨基酸取代并且肽键颠倒的肽。因此，肽由以母体L-序列倒序形式装配的D-氨基酸组成。逆反肽可以通过本领域已知的方法合成，例如，如Meziere等人(1997)J.Immunol.1593230-3237中所述的那些。这种方法涉及制备假肽，其含有涉及主链的变化，而没有涉及侧链的方向，其保持与母体肽非常相似。逆反肽对蛋白水解的抵抗性更高。
因此，将认识到，当如本文中所述的CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体、T细胞抗原和间隔物部分中的任意种是肽或多肽时，这些肽或多肽中的任何一种或多种可以被相应的肽模拟物取代，所述肽模拟物保持母体肽或多肽各自的活性。这有助于赋予本发明的物质以蛋白酶抗性并且由此提高其稳定性。因此，例如，当T细胞抗原通过一个或多个肽间隔物部分连接至CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的结合配偶体时，需要那些间隔物部分中的一个或多个是肽模拟物，例如，其中间隔物部分的一个或多个天然产生氨基酸被替代或修饰，例如，以提高稳定性。
另一种提高本发明的物质的肽部分稳定性的方法是在一端或两端具有稳定基团。典型的稳定基团包括酰胺基、乙酰基、苄基、苯基、甲苯磺酰基、烷氧羰基、烷基羰基、苄氧基羰基等末端基团修饰。其它的修饰包括使用“D”型氨基酸替代末端的“L”型氨基酸，以及酰胺而不是氨基或羧基端，或乙酰基而不是氨基端，以抑制外肽酶活性。因此，将认识到，只要本发明的物质具有暴露的肽末端，则末端可以具有加帽部分，优选小于200Da分子量的部分。更多的加帽部分包括萘基(naftyl)或聚乙二醇基。将认识到，逆反肽已经相对稳定，并且因此可能不需要其它的加帽部分。
优选地，本发明的物质在37℃下具有至少24小时的血浆半衰期。
修饰本发明的物质是合乎需要的，以使得其可以更容易检测，例如，通过将其生物素化或通过插入本领域已知的任何可检测标记，如放射性同位素标记、荧光素标记或酶标记。
如上所述，本发明人已经示出，本发明的物质可用于重定向现存的免疫应答，以杀死以特定方式表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的特定细胞。由于表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞常常是(至少部分是)介导生物或医学病症或失调的病理的细胞，本发明的物质提供了显著的治疗潜力。
因此，本发明的第二方面提供了根据本发明的第一方面的物质，其用于医学中。
本发明的第三方面还提供了一种药物组合物，其包括根据本发明的第一方面的物质和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的第四方面提供了一种预防或治疗病症的方法，所述病症的特征在于存在表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞，此方法包括施用根据本发明的第一方面的物质。因此，本发明的物质在内在化后，将结合到表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞上，T细胞抗原将被递呈在细胞表面上，使得它们成为T细胞的目标。为了避免疑义，包括特定目标(例如，CD70)的结合配偶体的物质将被用于预防或治疗以存在表达该特定目标(例如，CD70)的细胞为特征的病症。
因此，该方法可以包含鉴定患有病症(例如，癌症)或处于发展病症风险的受试者，其中所述病症的特征在于CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种，向受试者施用根据本发明的第一方面的物质，并通过进行测试以确定表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞的数量或通过监测受试者的临床症状来监测受试者中表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞的水平。根据监测步骤的结果，可能有必要施用更多的物质。
本发明包括根据本发明的第一方面的物质，其用于预防或治疗病症，所述病症的特征在于存在表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞。
本发明包括根据本发明的第一方面的物质在制备用于预防或治疗病症的药物中的用途，所述病症的特征在于存在表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞。
“特征在于存在表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞的病症”包括任何的生物或医学病症或失调，其中至少部分的病理是由表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞的存在所介导的。病症可以因存在表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞所引起的，或者存在表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞可以是病症的结果。
CD70和CD74通常由B细胞表达，并且因此通常病症是至少部分的病理是由B细胞介导的病症。例如，CD70(CD27L)是在许多血液恶性肿瘤(malignancies)和一些癌(carcinomas)(例如肾细胞癌；Jilaveanu等人，Human Palhol 43(9):1394)上异常表达的肿瘤坏死因子家族中的成员。CD74与II类MHC分子同时表达，并因此表达在专职性抗原递呈细胞上，例如B细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。病症可以是影响这些细胞中的一种或多种的病症。
表达CD70或CD74的细胞常常与淋巴瘤和多种类型的癌相关。因此，特别优选的，病症是肿瘤(例如恶性疾病)并且表达CD70或CD74的细胞是肿瘤细胞或肿瘤相关组织(例如，肿瘤成纤维细胞或肿瘤血管)。病症可以是任何癌症(cancers)，例如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、肾癌、黑素瘤、肺癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、脑癌、食管癌、胃癌、胰腺癌癌、结直肠癌、肝癌、白血病、骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴母细胞白血病、淋巴增殖性障碍、骨髓增生异常疾病、骨髓增殖性疾病和癌变前疾病。
表达CD74的细胞还与过敏性和自身免疫疾病相关，并因此在另一个优选的实施方式中，当结合配偶体是针对CD74时，病症是过敏性或自身免疫疾病。实例包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮和免疫血小板减少性紫癜。
特征在于存在表达本文所公开的其它目标中的任意种的细胞的病症包括在那些目标的上述讨论中所提及的那些病症。
下表提供了各个本文所公开的目标的细胞表达数据以及与各个目标相关的病症。因此，当本发明的物质包括特定目标的结合配偶体，物质可以用于预防或治疗与如列于下表中的目标相关的病症中的一种。
特征在于存在表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞的其它病症可以由本领域技术人员容易地确定。例如，可以使用常规的用于测量核酸(例如，DNA或RNA转录物)或蛋白水平的试验在生检样品(例如，来自癌症患者)上分析细胞上CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的表达谱。可以使用转录组或蛋白质组技术。此外，可以使用免疫组织化学和免疫荧光来定量组织中的抗原表达。
预防或治疗病症的意思包括减轻或缓解患者症状(即，减缓用途)、防止症状恶化或进展、治疗失调(例如，通过抑制或消除病原体)，或预防未患病患者体内的病症或失调。
将认识到，本发明的物质自身导致临床中的个体化医学，借此确定临床中向患者施用以及选择或制备的最合适的物质。例如，在将物质施用给受试者的步骤之前，可以测定以下的任意种情况：(i)受试者的MHC等位基因和/或(ii)受试者对T细胞抗原的T细胞应答(例如，细胞毒T细胞应答)。可以通过抗原水平的血清学试验或在遗传水平使用DNA试验来评价受试者的MHC等位基因。可以通过将从受试者分离的外周单核血细胞接触抗原并使用用于细胞增殖的标准试验来确定给定的抗原是否刺激了受试者体内的特异性T细胞应答(例如，细胞毒T细胞应答)。
因此，本发明的第四方面的方法可以包括以下步骤：(i)鉴定患有病症或处于发展病症风险中的受试者，所述病症(例如，癌症)的特征在于存在表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞，(ii)从受试者获取样品，(iii)分析样品来鉴定用于预防或治疗受试者病症的最佳T细胞抗原，(iii)制备本发明的物质，(iv)向受试者施用物质，和(v)通过进行测试来测定表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞的数量或通过监控受试者的临床症状，来监控受试者体内表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞的水平。
将认识到，可以使用装置来选择和任选地制备用于特定患者的最适物质。例如，装置可以进行来自受试者的一个或多个样品的自动化分析，并且基于这种分析来选择和任选地制备用于该受试者的定制物质。因此，装置可以对样品进行血清学试验，以测定受试者的MHC等位基因，并且基于此测试测定各种肽在引发T细胞应答(例如，细胞毒T细胞应答)中的功效，以鉴定出用于该患者的最佳的T细胞抗原。相似地，装置可以测定来自受试者(例如，来自活检样品)的细胞的表达谱，以确定CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的合适的结合配偶体。
通过在临床中进行这些步骤中的任何一个或多个，可以制备针对特定受试者定制的物质。例如，物质可以含有已知结合患者的MHC分子并且引发强烈的T细胞应答的T细胞抗原。
在一个实施方式中，除了根据本发明的第一方面的物质，向受试者施用另一种治疗剂。例如，当施用物质来预防或治疗特定病症时，可以施用已知对于抵挡该病症有用的另一种治疗剂。例如，当将物质用于治疗癌症时，除了本发明的物质以外，还可以向受试者施用另一种抗癌剂(例如，抗肿瘤化疗)。相似地，另一种治疗剂可以是已知在过敏性疾病、炎性疾病、再生医学和神经再生性疾病中具有治疗应用的物质。
将认识到，可以与本发明的物质同时施用另一种治疗剂(即，任选在共同制剂中同时给药)或在与本发明的物质不同的时间施用(即，序贯给药)。
另一种治疗剂可以是疫苗；免疫刺激药物；抗癌剂；抑制对抗本发明的物质的抗体应答的物质；和/或蛋白酶抑制剂中的任何一种或多种。
例如，为了增强对抗所用的特定T细胞抗原的效应物免疫应答，需要给受试者接种T细胞抗原；和/或施用免疫刺激剂，如IL-2、IL-7、IFNα、GM-CSF、二甲双胍、来那度胺(lenalidomide)；和/或施用抗免疫调节剂，如依匹单抗；其全部都认为是其它的治疗剂。相似地，其它的治疗剂可以是活病毒如CMV，其用于刺激针对T细胞抗原的免疫应答。例如，这可以通过输血来进行。
还认识到，如果受试者施用了免疫抑制剂，则在施用本发明的物质之时或之前，从该受试者撤除这些免疫抑制剂(例如，通过暂停治疗)。
相似地，使用旨在绕开涉及本发明物质的、在体内引发不利抗体应答的任何免疫原性问题的方法是合乎需要的。例如，还可以向受试者施用一种或多种已知抑制B细胞活性的物质，如利妥昔单抗、环磷酰胺、Syk抑制剂、抗-BAFF抗体(例如，贝利木单抗(Belimumab))、抗-CD22抗体、抗-CD20抗体和抗-CD19抗体中的任意种，其全部都认为是其它治疗剂。在这种情况中，如果在本发明的物质之前将B细胞的抑制剂施用给受试者，例如，作为消除B细胞的预处理，则特别优选。
因此，本发明包括一种组合物，其包含(i)根据本发明第一方面的物质和(ii)另一种治疗剂，其用于预防或治疗特征在于存在表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞的病症。鉴于本发明的物质和另一种治疗剂可以同时或序贯给药，将认识到，本发明包括根据本发明第一方面的物质，其用于预防或治疗施用了另一种治疗剂的受试者的体内特征在于存在表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞的病症。因此，本发明还包括治疗剂，其用于预防或治疗施用了根据本发明第一方面的物质的受试者体内特征在于存在表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞的病症。
相似地，本发明包括组合物在制备用于预防或治疗特征在于存在表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞的病症的药物中的用途，所述组合物包含(i)根据本发明第一方面的物质和(ii)另一种物质。再次地，鉴于本发明的物质和另一种物质可以同时或序贯给药，将认识到，本发明包括含有本发明第一方面的物质的组合物在制备用于预防或治疗施用了另一种治疗剂的受试者的体内特征在于存在表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞的病症的药物中的用途。因此，本发明还包括治疗剂在制备用于预防或治疗施用了根据本发明第一方面的物质的受试者的体内特征在于存在表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞的病症的药物中的用途。
本发明还提供了一种组合物，其包含(i)根据本发明第一方面的物质和(ii)适用于预防或治疗特征在于存在表达CD70、CD74、CD22、HLA-DR、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95中的任意种的细胞的相同病症的另一种治疗剂。将认识到，在前两段中提及的治疗剂可以是适用于治疗特征在于存在不需要的细胞的、与利用本发明物质可治疗的病症相同的病症的物质。
同时，本发明的物质单独给药是可能的，优选的是，其作为药物制剂与一种或多种可接受的载体共同存在。载体在与治疗剂相容并且对其接受者无害的意义上必须是“可接受的”。通常，载体将是水或盐水，其将是无菌的并且无热原的。
在合适的情况中，制剂可以方便地以单位剂量形式存在，并且可以通过药学领域中公知的任一种方法来制备。这样的方法包括将活性成分(用于治疗或预防特征在于不需要的细胞的病症的物质)与组成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。通常，通过将活性成分与液体载体或细碎的固体载体或二者均匀且紧密地结合，并且然后，如果需要，将产品成型，从而制备制剂。
根据本发明的适用于口服给药的制剂可以以分开的单位形式存在，如胶囊、扁囊剂或片剂，其各自包含预定量的活性成分；作为粉末或颗粒存在；作为含水液体或非水液体中的溶液或悬浮液存在；或作为水包油型液体乳液或油包水型液体乳液存在。活性成分还可以丸剂、药糖剂或糊剂存在。
可以通过压制或模制来制备片剂，任选使用一种或多种辅助成分。可以通过在合适的机器中压制自由流动形式(例如，粉末或颗粒)的活性成分来制备压缩片剂，任选与粘合剂(例如，聚维酮、明胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，羟基乙酸淀粉钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂混合。可以通过在合适的机器中模压用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制造模压片剂。片剂可以任选地有包衣或有压痕，并且可以进行配制，以提供其中的活性成分的缓慢或受控释放，通过使用，例如，不同(varying)比例的羟丙基甲基纤维素来提供所需的释放特征。
适用于口腔局部给药的制剂包括含有在调味基料中的活性成分的锭剂，所述调味基料通常是蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶；含有在惰性基料(如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯树胶)中的活性成分的软锭剂；和含有在合适的液体载体中的活性成分的漱口水。
适用于胃肠道外给药的制剂包括含水和非水无菌注射液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，所述溶质使得制剂与预计的接受者的血液等渗；以及含水和非水无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如，密封的安瓿和小瓶，并且可以存储于冷冻干燥(冻干)条件下，其仅需要在使用前即刻添加无菌液体载体，例如，注射用水。即时的注射液和悬浮液可以从之前所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
可以以栓剂或阴道药栓的形式来施用本发明的物质，或可以以洗液、溶液、霜剂、膏剂或爽身粉的形式来局部使用。物质也可以经皮给药，例如，通过使用皮肤贴剂。
优选的单位剂型是含有日剂量或单位、日亚剂量(sub-dose)或其合适部分的活性成分的那些。
将理解，除了以上特别提及的成分以外，考虑到所讨论制剂的类型，本发明的制剂可以包括本领域中常规的其它物质，例如，适用于口服给药的那些可以包括调味剂。
向个体施用的物质的量是有效抵抗特定个体病症的量。量可以由医生来确定。
优选地，在本文中所述的本发明的任一方面的内容中，待治疗的受试者是人。或者，受试者可以是动物，例如，家养动物(例如，狗或猫)、实验室动物(例如，实验室啮齿动物，如小鼠、大鼠或兔子)或农业中重要的动物(即，家畜)，例如马、牛、绵羊或山羊。
在本发明的一个优选实施方式中，物质中的T细胞抗原是肽，并且物质用于预防或治疗癌症。
在一个实施方式中，CD70的结合配偶体是抗-CD70抗体，如BU69抗体(抗-CD70，伯明翰大学)(Leucocyte Typing V(1995):由SF Schlossman编，OUP，牛津)，且T细胞抗原包括DYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：9)或PDDYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：108)。
在一个实施方式中，CD74的结合配偶体是抗-CD74抗体，如抗-CD74(eBiosciences)纯化的抗-人CD74，克隆：LN2)，且T细胞抗原包含DYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：9)或PDDYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：108)。
在一个实施方式中，CD70的结合配偶体是抗-CD70抗体，如BU69抗体(抗-CD70，伯明翰大学)(Leucocyte Typing V(1995):由SF Schlossman编，OUP，牛津)，且T细胞抗原包括PRSPTVFYNIPPMPLPPSQL(SEQ ID NO：49)。
在一个实施方式中，CD22的结合配偶体是抗-CD22抗体，如抗-CD22(BD Bioscience)纯化的抗-人CD22，克隆：HIB22)，且T细胞抗原包含DYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：9)或PDDYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：108)。
在一个实施方式中，CD23的结合配偶体是抗-CD23抗体，如抗-CD23(BD Bioscience)纯化的抗-人CD23，克隆：M-L233)，且T细胞抗原包含DYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：9)或PDDYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：108)。
在一个实施方式中，CD30的结合配偶体是抗-CD30抗体，如抗-CD30(BD Bioscience)纯化的抗-人CD30，克隆：BerH8)，且T细胞抗原包含DYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：9)或PDDYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：108)。
在一个实施方式中，CD43的结合配偶体是抗-CD43抗体，如抗-CD43(BD Bioscience)纯化的抗-人CD43，克隆：1G10)，且T细胞抗原包含DYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：9)或PDDYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：108)。
在一个实施方式中，CD44的结合配偶体是抗-CD44抗体，如抗-CD44(BD Bioscience)纯化的抗-人CD44，克隆：515)，且T细胞抗原包含DYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：9)或PDDYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：108)。
在一个实施方式中，CD47的结合配偶体是抗-CD47抗体，如抗-CD47(BD Bioscience)纯化的抗-人CD47，克隆：B6H12)，且T细胞抗原包含DYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：9)或PDDYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：108)。
在一个实施方式中，CD54的结合配偶体是抗-CD54抗体，如抗-CD54(BD Bioscience)纯化的抗-人CD54，克隆：28/CD54)，且T细胞抗原包含DYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：9)或PDDYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：108)。
在一个实施方式中，CD55的结合配偶体是抗-CD55抗体，如抗-CD55(BD Bioscience)纯化的抗-人CD55，克隆：IA10)，且T细胞抗原包含DYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：9)或PDDYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：108)。
在一个实施方式中，CD58的结合配偶体是抗-CD58抗体，如抗CD58(BD Bioscience)纯化的抗-人CD58，克隆：1C3(AICD58.6))，且T细胞抗原包含DYSNTHSTRYV(SEQ IDNO：9)或PDDYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：108)。
在一个实施方式中，CD59的结合配偶体是抗-CD59抗体，如抗-CD59(BD Bioscience)纯化的抗-人CD59，克隆：p282(H19))，且T细胞抗原包含DYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：9)或PDDYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：108)。
在一个实施方式中，CD62L的结合配偶体是抗-CD62L抗体，如抗-CD62L(BDBioscience)纯化的抗-人CD62L，克隆：SK11)，且T细胞抗原包含DYSNTHSTRYV(SEQID NO：9)或PDDYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：108)。
在一个实施方式中，CD95的结合配偶体是抗-CD95抗体，如抗-CD95(BD Bioscience)纯化的抗-人CD95，克隆：EOS9.1)，且T细胞抗原包含DYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：9)或PDDYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：108)。
在一个实施方式中，HLA-DR的结合配偶体是抗-HLA-DR抗体，如抗-HLA-DR(BDBioscience)纯化的抗-人HLA-DR，克隆：G46-6)，且T细胞抗原包括DYSNTHSTRYV(SEQID NO：9)或PDDYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：108)。
将借助以下附图和实施例来进一步详细描述本发明。
附图说明
图1：人类CD70、CD74、HLA-DR、CD22、CD23、CD30、CD43、CD44、CD47、CD54、CD55、CD58、CD59、CD62L或CD95的氨基酸序列(SEQ ID NO：93-107)。
图2：数据证明了在抗体肽-表位偶联物内在化后，重定向的病毒-特异性T细胞的体外活性
(A)通过将PDDYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：108)肽与BU69抗体(抗-CD70，伯明翰大学)偶联，CD4+巨细胞病毒-特异性T细胞识别类淋巴母细胞细胞系。仅当抗体与特定肽偶联时，才存在靶细胞的识别。对照证明了在仅存在外源肽的情况下T细胞对靶细胞的特异性。
(B)标记有用病毒肽DYSNTHSTRYV偶联的BU69的靶细胞的细胞毒性(以5个T细胞对1个靶细胞的比例)。与用病毒肽外源脉冲的靶细胞的55％的细胞毒性相比，偶联肽的BU69抗体介导了40％的细胞毒性。可以看出，当BU69抗体与无关的病毒肽偶联时，仅存在非常小的毒性。
(C)通过将PDDYSNTHSTRYV肽与抗-CD74抗体(eBiosciences)偶联，CD4+巨细胞病毒-特异性T细胞识别类淋巴母细胞细胞系。仅当抗体与特定肽偶联时，才存在靶细胞的识别。对照证明了在仅存在外源肽的情况下T细胞对靶细胞的特异性。
(D)通过在存在或不存在异型双功能交联剂磺基-SMCC的情况下将PDDYSNTHSTRYV肽与BU69抗体偶联，CD4+巨细胞病毒-特异性T细胞识别类淋巴母细胞细胞系。仅在存在交联剂的情况下抗体被偶联时，才存在靶细胞的识别，相比之下，当不存在交联剂时，应答不存在。对照证明了在仅存在外源肽的情况下T细胞对靶细胞的特异性。
(E)通过在存在或不存在I类或II类MHC抗原加工途径的抑制剂的情况下将PDDYSNTHSTRYV肽与BU69抗体偶联，CD4+巨细胞病毒-特异性T细胞识别类淋巴母细胞细胞系。与未处理的对照(PDDYSNTHSTRYV)相比，仅在存在II类MHC加工途径的抑制剂(氯喹和莫能菌素)的情况下培养细胞时，靶细胞的识别才会被降低。对于在存在I类MHC加工途径的抑制剂的情况下所培养的细胞，T细胞应答没有差别。
(F)通过将同源抗原PRSPTVFYNIPPMPLPPSQL肽与BU69抗体(抗-CD70，伯明翰大学)偶联，CD4+爱泼斯坦－巴尔二氏病毒-特异性T细胞识别类淋巴母细胞细胞系。仅当抗体与特定肽偶联时，才存在靶细胞的识别。对照证明了在仅存在外源肽的情况下T细胞对靶细胞的特异性。
(G-S)通过偶联到二抗的肽抗原PDDYSNTHSTRYV的识别，CD4+巨细胞病毒-特异性T细胞识别类淋巴母细胞细胞系。首先将靶细胞标记能结合在靶细胞表面表达的蛋白质(例如，CD22、CD23、HLA-DR等)的一抗。然后使用与肽PDDYSNTHSTRYV偶联的二抗(抗-小鼠IgG)标记结合到靶细胞的抗体。如通过IFN-γ的产生所确定的，肽-特异性T细胞识别了标记有APEC复合体的靶细胞。对照证明了在仅存在外源肽的情况下T细胞对靶细胞的特异性。
具体实施方式
实施例1：抗体肽表位偶联物(APEC)对T细胞的刺激
本发明人已经示出了，通过将T细胞抗原靶向特定的细胞表面靶，T细胞抗原可以被内在化并递呈在细胞的表面上，使得T细胞应答被启动。
图2A证明了标记有物质的靶细胞的T细胞识别。将抗-CD70抗体与肽(PDDYSNTHSTRYV)或不与肽(DMSO)偶联并用于标记靶细胞。用没有肽的抗体标记的细胞不能被T细胞识别，这由在靶细胞和T细胞过夜培养后的培养物上清液中不存在IFN-γ得以证明。用偶联有免疫原性肽的抗体标记的细胞被T细胞强烈地识别，这归因于在培养物上清液中存在IFN-γ。这些结果表明，肽已从抗体中释放，并以与II类MHC分子复合的形式在细胞表面递呈。
对照细胞证明，仅有靶细胞或响应免疫原性肽孵育时，没有IFN-γ释放。此外，不存在免疫原性肽时，T细胞没有IFN-γ释放，但是，一旦靶细胞被外源免疫原性肽标记，则有强烈的T细胞识别，这证明了T细胞是肽特异性的且不识别由靶细胞天然表达的任何其它肽。最后，在整个培养时间内没有T细胞的IFN-γ自发释放。
图2B中，靶细胞用含有对照肽(生物素-RPHERNFGTVL)或测试肽(PDDYSNTHSTRYV)的抗-CD70APEC标记。将标记的靶细胞与肽-特异性T细胞孵育6小时，并用抗-CD20抗体染色，用于流式细胞分析。标记有CD70-PDDYSNTHSTRYVAPEC的靶细胞被T细胞识别，并且与标记有生物素-RPHERNFGTVL的靶细胞相比，6小时后留在孔中的靶细胞的数目是减少的。此结果证明了针对标记有APEC的靶细胞的T细胞细胞毒性的间接方法。
对照细胞是肽脉冲的或未处理的并与T细胞培养6小时。流式细胞仪上的分析证明了装载有外源肽的靶细胞被T细胞靶向，而未处理的靶细胞则被T细胞忽略。
图2C中，靶细胞用不含有肽(DMSO)、含有对照肽(生物素-RPHERNFGTVL)或含有测试肽(PDDYSNTHSTRYV)的抗-CD74APEC标记。与肽-特异性T细胞培养后，标记有含有测试肽的APEC的靶细胞被识别，这由IFN-γ的释放得以证实，而标记有不含肽或含有对照肽的APEC的靶细胞不能被识别。
图2D中，使用作为无肽对照的DMSO以及添加或不添加磺基-SMCC的测试肽PDDYSNTHSTRYV，生成抗-CD70APEC。这用以证明，肽与抗体的偶联依赖于异型双功能交联剂且不通过任何其它的化学相互作用。将靶细胞用APEC标记并与T细胞培养16小时。分析细胞培养物的上清液中IFN-γ的存在。当在不存在磺基-SMCC的情况下完成偶联时，不能识别标记有对照或测试APEC的靶细胞，这表明没有肽递呈在细胞表面上。当在存在磺基-SMCC的情况下完成偶联时，标记有测试APEC(PDDYSNTHSTRYV)的靶细胞有T细胞应答，而标记有对照APEC(DMSO)的靶细胞没有T细胞应答。此结果证明在肽与抗体偶联以产生APEC的过程中需要SMCC。
图2E中，在存在I类和II类HLA加工途径的抑制剂的情况下将靶细胞用抗-CD70-PDDYSNTHSTRYV APEC标记。将T细胞添加至标记的靶细胞之后再培养6小时，分析上清液中IFN-γ的存在。与在不存在抑制剂(PDDYSNTHSTRYV)的情况下培养的细胞相比，添加乳胞素、胃蛋白酶抑制剂或3-甲基腺嘌呤(I类加工途径的抑制剂)证实了相似的T细胞识别的水平。添加莫能菌素、氯喹和亮抑蛋白酶肽(II类加工途径的各个方面的抑制剂)证实了产生的IFN-γ量的减少，表明APEC是经II类HLA加工途径进行加工的。
图2F中，使用来源于EBV的肽PRSPTVFYNIPPMPLPPSQL生成抗-CD70APEC并用APEC标记靶细胞。将肽特异性T细胞添加到靶细胞中，并一起培养16小时，并分析上清液中IFN-γ的存在。标记有测试APEC(PRSPTVFYNIPPMPLPPSQL)的靶细胞被T细胞识别，而标记有对照APEC(DMSO或生物素-RPHERNFGTVL)的靶细胞不被T细胞识别。
用外源肽脉冲的对照细胞强烈地被T细胞识别，而未处理的靶细胞不能被T细胞识别。当将它们单独培养时，T细胞没有IFN-γ的自发释放。
图2G-S中，抗-小鼠IgG二抗与CMV来源的肽PDDYSNTHSTRYV偶联。首先用靶向各种细胞表面分子的一抗标记靶细胞，并然后使用偶联肽的二抗进行二次标记。将肽特异性T细胞添加到靶细胞中，并一起培养16小时，并分析上清液中IFN-γ的存在。标记有测试APEC的靶细胞在用不同的一抗染色后，被T细胞识别。
用外源肽脉冲的对照细胞强烈地被T细胞识别，而未处理的靶细胞不被T细胞识别。当将它们单独培养时，T细胞没有IFN-γ的自发释放。
实施例2：半胱氨酸化肽与抗体的化学偶联的标准操作规程
1.将半胱氨酸化肽溶解于DMSO中，至10mg/ml的终浓度。
2.称量1mg磺基琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)，并溶解于200μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
a.可以使用其它异型双功能交联剂代替磺基-SMCC，例如磺基琥珀酰亚胺-6-(3'-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸酯(磺基-LC-SPDP)和N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼、三氟乙酸盐(BMPH)及其它。
3.将50μl抗体(10mg/ml，500μg抗体)添加到溶解的磺基-SMCC中，并在室温下孵育30分钟。
4.首先将柱子在1,500g下离心1分钟以去除乙醇(储存缓冲液)，从而洗涤ZebaSpin脱盐柱(7kDa分子量)(Thermo Fisher)。
5.添加300μl的PBS中，并1,500g离心1分钟。去除洗脱液，再重复2次。
6.添加125μl的抗体-SMCC到柱中，充分混合并孵育2分钟。
7.为了洗脱结合的抗体，1500g离心2分钟并收集洗脱液。
8.添加5μl预先溶解于DMSO中的肽到SMCC活化的抗体中并在室温下孵育30分钟。
9.首先通过13,000rpm离心柱30秒以去除乙醇(储存缓冲液)，从而洗涤Protein G柱(GE Healthcare)。
10.添加500μl的PBS并充分混合Protein G珠之后，13,000rpm离心30秒。去除洗脱液并重复洗涤2次。
11.添加抗体-SMCC到Protein G柱，充分混合并孵育5分钟。13,000rpm离心30秒并去除洗脱液。
12.通过添加500μl的PBS并充分混合珠，之后再13,000rpm离心30秒并去除洗脱液，从而洗涤抗体。重复此步骤2次。
13.为了洗脱结合的抗体，将125μl的0.1M柠檬酸添加到珠中，并在室温下孵育2分钟。将柱置于1.5ml的eppendorf中并13,000rpm离心30秒并收集洗脱液。
14.重复洗脱1次，共250ul的洗脱体积。
15.添加750μl的0.2M Na2HCO3使pH升高至～7。置于室温10分钟。抗体-肽偶联物即可用来染色细胞。
16.于4℃储存抗体。

Claims (31)

1.一种物质，其包括：
(i)T细胞抗原，和
(ii)CD22、CD23、CD30、CD74、CD70、CD43、CD44、CD47、CD54、CD58、CD62L、CD95、HLA-DR、CD59、CD55中的任意种的结合配偶体，
其中，在物质结合到表达CD22、CD23、CD30、CD74、CD70、CD43、CD44、CD47、CD54、CD58、CD62L、CD95、HLA-DR、CD59、CD55中的任意种的细胞之后，物质被内在化，并且T细胞抗原以可被T细胞识别的方式递呈在细胞表面上。
2.如权利要求1所述的物质，其中T细胞抗原连接到CD22、CD23、CD30、CD74、CD70、CD43、CD44、CD47、CD54、CD58、CD62L、CD95、HLA-DR、CD59、CD55中的任意种的结合配偶体上，使得T细胞抗原可以在表达CD22、CD23、CD30、CD74、CD70、CD43、CD44、CD47、CD54、CD58、CD62L、CD95、HLA-DR、CD59、CD55中的任意种的细胞中从结合配偶体释放。
3.如权利要求2所述的物质，其中T细胞抗原可以利用细胞内蛋白酶从结合配偶体释放。
4.如权利要求2所述的物质，其中，在物质与表达CD22、CD23、CD30、CD74、CD70、CD43、CD44、CD47、CD54、CD58、CD62L、CD95、HLA-DR、CD59、CD55中的任意种的细胞结合之后，物质被内在化，并且T细胞抗原通过结合到MHC分子或I组CD1分子而递呈在细胞表面上。
5.如权利要求1-4任一项所述的物质，其中CD22、CD23、CD30、CD74、CD70、CD43、CD44、CD47、CD54、CD58、CD62L、CD95、HLA-DR、CD59、CD55中的任意种的结合配偶体是抗体、激素、生长因子、细胞因子或受体配体中的任意种。
6.如权利要求5所述的物质，其中结合配偶体是抗体。
7.如权利要求6所述的物质，其中抗体是抗-CD70抗体，如BU69或SGN-70或SGN-75。
8.如权利要求6所述的物质，其中抗体是抗-CD74抗体，如米拉珠单抗。
9.如权利要求1-8任一项所述的物质，其中T细胞抗原是能引发受试者体内现存的T细胞应答的抗原。
10.如权利要求1-9任一项所述的物质，其中T细胞抗原是肽、多肽、磷酸肽或脂质如磷脂或鞘脂中的任意种。
11.如权利要求9或10所述的物质，其中抗原是病毒来源的抗原。
12.如权利要求1-11任一项所述的物质，其中抗原源自爱泼斯坦－巴尔二氏病毒(例如，HHV4)、巨细胞病毒(例如，人巨细胞病毒)、水痘带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒、鼻病毒、流感病毒中的任意种，或源自疫苗如破伤风类毒素。
13.如权利要求1-12任一项所述的物质，其中T细胞抗原是II类MHC限制的抗原，或能够结合I组CD1分子的抗原。
14.如权利要求1-13任一项所述的物质，其用于医学中。
15.一种药物组合物，其包括权利要求1-13任一项所述的物质和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
16.一种预防或治疗病症的方法，所述病症的特征在于存在表达CD22、CD23、CD30、CD74、CD70、CD43、CD44、CD47、CD54、CD58、CD62L、CD95、HLA-DR、CD59、CD55中的任意种的细胞，所述方法包括施用权利要求1-13任一项所述的物质。
17.如权利要求1-13任一项所述的物质，其用于预防或治疗特征在于存在表达CD22、CD23、CD30、CD74、CD70、CD43、CD44、CD47、CD54、CD58、CD62L、CD95、HLA-DR、CD59、CD55中的任意种的细胞的病症。
18.权利要求1-13任一项所述的物质在制备用于预防或治疗特征在于存在表达CD22、CD23、CD30、CD74、CD70、CD43、CD44、CD47、CD54、CD58、CD62L、CD95、HLA-DR、CD59、CD55中的任意种的细胞的病症的药物中的用途。
19.如权利要求16所述的方法，其中在向受试者施用物质的步骤之前，确定(i)受试者的MHC等位基因，和(ii)受试者对T细胞抗原的细胞毒性T细胞应答中的一种或两种。
20.如权利要求16或19所述的方法，进一步包括向受试者施用其它的治疗剂。
21.一种组合物或试剂盒，其包括(i)权利要求1-13任一项所述的物质和(ii)其它治疗剂。
22.如权利要求1-13任一项所述的物质和其它治疗剂，其用于预防或治疗特征在于存在表达CD22、CD23、CD30、CD74、CD70、CD43、CD44、CD47、CD54、CD58、CD62L、CD95、HLA-DR、CD59、CD55中的任意种的细胞的病症。
23.如权利要求1-13任一项所述的物质，其用于预防或治疗特征在于存在表达CD22、CD23、CD30、CD74、CD70、CD43、CD44、CD47、CD54、CD58、CD62L、CD95、HLA-DR、CD59、CD55中的任意种的细胞的病症，其中还向受试者施用其它的治疗剂。
24.一种治疗剂，其用于预防或治疗特征在于存在表达CD22、CD23、CD30、CD74、CD70、CD43、CD44、CD47、CD54、CD58、CD62L、CD95、HLA-DR、CD59、CD55中的任意种的细胞的病症，其中还向受试者施用权利要求1-13任一项所述的物质。
25.权利要求1-13任一项所述的物质和其它的治疗剂在制备用于预防或治疗特征在于存在表达CD22、CD23、CD30、CD74、CD70、CD43、CD44、CD47、CD54、CD58、CD62L、CD95、HLA-DR、CD59、CD55中的任意种的细胞的病症的药物中的用途。
26.权利要求1-13任一项所述的物质在制备用于预防或治疗特征在于存在表达CD22、CD23、CD30、CD74、CD70、CD43、CD44、CD47、CD54、CD58、CD62L、CD95、HLA-DR、CD59、CD55中的任意种的细胞的病症的药物中的用途，其中还向受试者施用其它的治疗剂。
27.治疗剂在制备用于预防或治疗特征在于存在表达CD22、CD23、CD30、CD74、CD70、CD43、CD44、CD47、CD54、CD58、CD62L、CD95、HLA-DR、CD59、CD55中的任意种的细胞的病症的药物中的用途，其中还向受试者施用权利要求1-13任一项所述的物质。
28.如权利要求1-14、17和22-24任一项所述的物质、如权利要求16、19和20任一项所述的方法、如权利要求15或21所述的组合物或试剂盒，或如权利要求18和25-27任一项所述的用途，其中特征在于存在表达CD22、CD23、CD30、CD74、CD70、CD43、CD44、CD47、CD54、CD58、CD62L、CD95、HLA-DR、CD59、CD55中的任意种的细胞的病症是肿瘤(良性的或恶性的)或自身免疫病症中的任意种。
29.如权利要求1-14、17、22-24和28任一项所述的物质、如权利要求16、19、20和28任一项所述的方法、如权利要求15、21和28任一项所述的组合物或试剂盒，或如权利要求18和25-28任一项所述的用途，其中特征在于存在表达CD22、CD23、CD30、CD74、CD70、CD43、CD44、CD47、CD54、CD58、CD62L、CD95、HLA-DR、CD59、CD55中的任意种的细胞的病症是肿瘤，并且物质中的T细胞抗原是肽。
30.如权利要求20、28和29所述的方法、如权利要求21、28和29任一项所述的组合物或试剂盒、如权利要求22-24、28和29任一项所述的物质，或如权利要求25-29任一项所述的用途，其中治疗剂是适用于预防或治疗特征在于表达CD22、CD23、CD30、CD74、CD70、CD43、CD44、CD47、CD54、CD58、CD62L、CD95、HLA-DR、CD59、CD55中的任意种的细胞的病症的治疗剂。
31.如权利要求20和28-30任一项所述的方法、如权利要求21和28-30任一项所述的组合物或试剂盒、如权利要求22-24和28-30任一项所述的物质，或如权利要求25-30任一项所述的用途，其中其它的治疗剂是疫苗、免疫刺激药物、活病毒、抗癌剂、抗本发明的物质的抗体应答的抑制剂和蛋白酶抑制剂中的任何一种或多种。
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