CN107249641A - 用于特异性诱导针对靶细胞的t细胞细胞毒性的免疫缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于特异性诱导针对靶细胞的T细胞细胞毒性的免疫缀合物,其包含至少一个经可切割键与靶细胞结合模块偶联的经MHC I类可呈递的T细胞应答引发肽,及其生成和使用方法。

Description

用于特异性诱导针对靶细胞的T细胞细胞毒性的免疫缀合物
发明领域
本发明涉及用于特异性诱导针对靶细胞的T细胞细胞毒性的免疫缀合物,其包含至少一个与靶细胞结合模块偶联的经MHC I类可呈递的T细胞应答引发肽,及其生成和使用方法。
发明背景
与B细胞形成对比,T细胞识别经主要组织相容性复合物(MHC)的自体细胞表面分子在细胞表面上呈递的自已加工抗原衍生的肽。
经MHC II类(MHC II)的抗原呈递的当前想法是外源蛋白经由吞噬和胞吞接近MHCII,而内源蛋白经由自噬接近MHC II。抗原加工成适宜长度(～10-16个氨基酸)的肽抗原(肽表位),结合吞噬体,内体或自噬体中的MHC II分子。未加载的MHC IIαβ链二聚体在内质网(ER)中作为与不变链(Ii)的九聚复合物装配,不变链(Ii)针对前溶酶体隔室中的过早肽或蛋白质相互作用提供保护。这种复合物运输至溶酶体MHC II隔室,在那里不变链进行顺序蛋白水解。最终的切割产物,一种称作II类相关Ii肽(CLIP)的肽,占据肽结合沟且必须在给MHC II分子加载高亲和力肽(MHC II限制肽)之前释放(Wearsch P and Creswell P,Nat.Rev.Immunol.:Antigen processing and presentation,Poster available online,http://www.nature.com/nri/posters/antigenprocessing)。
通过引发幼稚CD4T细胞极化成效应T细胞(Th1,Th2,Th17)或记忆T细胞,幼稚CD4T细胞对细胞表面上加载了肽的MHC II的结合介导针对抗原的免疫接种。或者,取决于APC的微环境中的局部环境(例如细胞因子平衡)，通过引发幼稚CD4T细胞极化成调节T细胞(Treg)，幼稚CD4T细胞对加载了肽的MHC II的结合可介导针对抗原的免疫耐受。
虽然MHC II分子在正常情况下只发生在抗原呈递细胞上,但是与巨噬细胞,B细胞和树突细胞一样,MHC I类(MHC I)发生在所有有核细胞上。
经MHC I类(MHC I)的抗原呈递的当前假设机制是内源抗原,诸如在细胞内部生成的病毒蛋白或自体蛋白,在胞质溶胶内部由蛋白酶体和胞质溶胶蛋白酶加工成肽。然后这些肽经由称作抗原加工相关转运蛋白(TAP)复合物的特异性泵转运入ER,在那里它们由ER氨肽酶(ERAP)进一步修整以生成8-12个氨基酸的肽。
已经证明内在化入细胞,优选专门抗原呈递细胞(APC),像树突细胞或巨噬细胞的外源蛋白的肽表位也能由MHC I呈递。这归于外源蛋白中包含的支持所述蛋白自吞噬体或内体逆转运并由此将该蛋白引导入细胞的胞质的转运域的存在(Donnelly JJ et al.ProcNatl Acad Sci U S A.1993Apr 15；90(8):3530-4；Wearsch P and Creswell P,Nat.Rev.Immunol.:Antigen processing and presentation，Poster available online,http://www.nature.com/nri/posters/antigenprocessing)。
MHC I重链-β2-微球蛋白异二聚体与短肽的装配由肽加载复合物协调,肽加载复合物由tapasin和ERp57的二硫化物连接的二聚体,钙网蛋白(CRT)和TAP分子构成。Tapasin也支持肽编辑以选择稳定的肽-MHC I复合物在细胞表面上的呈递(Wearsch P andCreswell P,Nat.Rev.Immunol.:Antigen processing and presentation,Posteravailable online,http://www.nature.com/nri/posters/antigenprocessing)。一旦肽加载到MHC I分子上,肽加载复合物分解且加载了肽的MHC I经由分泌途径离开ER以到达细胞表面。在ER的内腔中未能结合MHC I分子的肽经sec61通道自ER去除而进入胞质溶胶,在那里它们可能进行尺寸上的进一步修整,而且可能由TAP转运回入ER,结合MHC I分子(Koopmann JO,Albring J,Hüter E,et al.(July 2000)Immunity,13(1):117-27.；Albring J,Koopmann JO,GJ,Momburg F(January 2004),Mol.Immunol.40(10):733-41)。
细胞表面上的MHC I分子将它们加载的肽呈递给细胞毒性CD8 T淋巴细胞(CD8 T细胞,也称作CTL)。CTL触发经MHC I呈递肽表位的细胞通过凋亡进行编程性细胞死亡。由此,MHC I介导细胞介导的免疫,它是免疫系统解决细胞内病原体，也是解决表达突变型或异常蛋白的自身细胞的主要手段。
过去几年里研究的一个焦点是利用诱导细胞介导的免疫的机制来诱导对多种不受细胞内病原体影响的患病细胞(例如肿瘤细胞)的杀伤。由于所有有核细胞均表达MHC I,因此诱导经MHC I呈递细胞内病原体的抗原是一种有希望的对患病细胞群体,例如肿瘤细胞诱导经CTL的编程性细胞死亡的办法。
在这点上，已经开发了多种办法,通过由结合靶细胞的结合配偶和细胞内病原体的肽部分构成的免疫缀合物将自细胞内病原体,例如病毒衍生的抗原投递至某种患病细胞群体以诱导所投递肽的已加工片段经MHC I在患病细胞的表面上的呈递。然后患病细胞会被CTL清除。
一种办法披露于EP 0659439A1。EP 0659439A1披露了一种免疫缀合物,其中病毒衍生肽(已修饰流感基质肽57-68)或细菌衍生肽(伯格氏疟原虫(Plasmodium bergei)肽249-260)与靶细胞结合抗体偶联。通过添加N端半胱氨酸残基及随后经SPDP接头交联至抗体,各肽与抗体偶联以生成免疫缀合物。一旦内在化,包括所添加的N端半胱氨酸残基的各肽自缀合物分离,在细胞内进一步加工并由MHC I呈递。然而,该免疫缀合物的IC50值很高(0.5μmol/l)。
如依照EP 0659439A1的办法中描述的,一项主要挑战是刺激针对外源抗原的MHCI限制性CTL应答。在外源提供抗原的大多数情况中,它没有传送至胞质,从那里它能转运至MHC I途径。
EP 0659439 A1提出了一种方法学来改善包括一旦加工能经MHC I呈递的肽的免疫缀合物的IC50值。在这里,推荐在免疫缀合物中包括转运域从而经逆转运将免疫缀合物传送至胞质。然而,EP 0659439 A1没有显示关于这种方法学的结果。
因此,仍然需要改良的办法,通过诱导细胞介导的免疫来诱导对靶细胞的杀伤。
发明概述
本发明涉及一种免疫缀合物,其包含至少一个经可切割键与靶细胞结合模块偶联的经MHC I类可呈递的T细胞应答引发肽。在免疫缀合物内,可切割键安排成使得一旦切割,经MHC I类分子直接可呈递的所述T细胞应答引发肽自免疫缀合物释放。
本发明的一个实施方案涉及一种免疫缀合物,其中T细胞应答引发肽是天然发生T细胞应答引发肽。
本发明的一个实施方案涉及一种免疫缀合物,其中T细胞应答引发肽是包含至少一个半胱氨酸残基的天然发生T细胞应答引发肽。
本发明的一个实施方案涉及一种免疫缀合物,其中可切割键是在靶细胞的内体隔室内可切割的。
本发明的一个实施方案涉及一种免疫缀合物,其中免疫缀合物不包含转运域。
本发明的一个实施方案涉及一种免疫缀合物,其中在免疫缀合物内在化入靶细胞后少于12小时内,T细胞应答引发肽经MHC I类分子在靶细胞的表面上呈递。
本发明的另一个方面是一种药物组合物,其包含与药学可接受载剂组合的依照本发明的免疫缀合物。
本发明的另一个方面是依照本发明的免疫缀合物用于特异性诱导针对靶细胞的T细胞细胞毒性的用途。
本发明的另一个方面是一种用于生成依照本发明的免疫缀合物的方法,其包含下述步骤:
a)提供重组靶细胞结合模块,
b)提供T细胞应答引发肽,并
c)经可切割键偶联至少一个所述T细胞应答引发肽与所述靶细胞结合模块。
本发明的一个实施方案涉及一种用于生成免疫缀合物的方法,其中未修饰的T细胞应答引发肽与靶细胞结合模块偶联。
本发明的另一个方面是依照本发明的免疫缀合物,其用作药物。
本发明的另一个方面是包含癌细胞结合模块的依照本发明的免疫缀合物,其用于治疗癌症。
本发明的另一个方面是依照本发明的免疫缀合物,其用于治疗传染病,自身免疫病,糖尿病或变态反应。
本发明的另一个方面是一种治疗罹患疾病的患者的方法,其通过对需要此类治疗的患者施用依照本发明的免疫缀合物来进行。
依照本发明,自免疫缀合物切割的T细胞应答引发肽能在没有进一步加工或在靶细胞内修整的情况下经MHC I类分子直接呈递。一旦免疫缀合物内在化，T细胞应答引发肽在靶细胞的内体隔室内自免疫缀合物切割,而且肽在内体隔室中直接(即在没有进一步加工或修整的情况下)加载到MHC I类分子并转运至靶细胞表面用于经MHC I类呈递。令人惊讶地,达到了与本领域已知办法相比可观更低的IC50值。
附图简述
图1:已修饰CMV肽中降低的T细胞激活,如使用不同肿瘤细胞系和细胞培养培养基通过IFNγ-ELISPOT测量的。A)MDA-MB231细胞在RPMI+中,B)MDA-MB231细胞在AIM-V中,C)HCT-116细胞在RPMI+中,D)HCT-116细胞在AIM-V中，E)T2细胞在RPMI+中。如标示的,使用肽浓度13,245μM或1,3245μM实施分析。
图2:依照本发明的免疫缀合物的提议作用模式。A:免疫缀合物结合靶细胞。B:免疫缀合物内在化入内体隔室。C:在内体隔室中T细胞应答引发肽自免疫缀合物释放。D:在内体隔室中给MHC I分子加载所释放的肽。E:加载了肽的MHC I分子传送至靶细胞表面。F:肽特异性CD8 T细胞识别靶细胞表面上加载了肽的MHC I分子,在靶细胞中诱导细胞死亡。
图3:包含与EBV和/或FLU肽偶联的抗CDCP1抗体的免疫缀合物对表达CDCP1的MDA-MB 231细胞的结合。
图4:包含与EBV和/或FLU肽偶联的抗CD19抗体的免疫缀合物对表达CD19的RL细胞的结合。
图5:使用依照本发明的免疫缀合物关于肽特异性T细胞激活的IFN-γELISPOT的结果。标示的浓度指肽浓度。A)用包含单克隆抗CDCP-1抗体和HLA-A2限制性EBV肽的免疫缀合物处理表达CDCP-1的HCT-116细胞。B)用包含单克隆抗CD19抗体和HLA-A2限制性EBV肽的免疫缀合物处理表达CD19的HLA-A2阳性RL和HLA-A2阴性Ramos细胞。C)用包含单克隆抗CDCP-1抗体和HLA-A2限制性EBV肽的免疫缀合物处理不同的表达CDCP-1的肿瘤细胞。
图6:通过xCELLigence和LDH释放测定法评估的对标示肿瘤细胞的肿瘤细胞杀伤。(A)由包含与HLA-A2限制性EBV肽偶联的抗CDCP1抗体的免疫缀合物介导的对HLA-A2阳性MDA-MB231细胞的肿瘤细胞杀伤。(B)由包含与具有非末端半胱氨酸残基的HLA-A2限制性EBV肽偶联的抗CDCP1抗体的免疫缀合物介导的对A-375细胞的特异性杀伤。(C)由包含与具有非末端半胱氨酸残基的HLA-A2限制性EBV肽偶联的抗CDCP1抗体的免疫缀合物介导的对HLA-A2阳性MDA-MB231细胞的特异性杀伤。标示的浓度指肽浓度。
图7:由包含HLA-A1限制性FLU肽的免疫缀合物介导的对HLA-A1阳性肿瘤细胞的肿瘤细胞杀伤。A-C)6,10和18小时后通过xCELLigence测定法测量的结果。D-F)通过LDH释放测定法测量的结果。A和D)A-375细胞，效应细胞对靶细胞比(E:T)为1∶1和1∶2,B和E)HCT-116细胞,C和F)PC3细胞。
图8:包含单克隆抗CDCP1抗体的依照本发明的免疫缀合物在静脉内转移huPBMC的MDA-MB231皮下模型中的抗肿瘤活性。测试方案(图8A)和结果(图8B)。
图9:包含单克隆抗CDCP1抗体的依照本发明的免疫缀合物与抗PD1治疗组合在静脉内转移huPBMC的已建立MDA-MB231皮下模型中的抗肿瘤活性。测试方案(图9A)和肿瘤生长抑制(图9B)和T细胞增多(图9C)的结果。
发明详述
1.定义
如本文中使用的,术语“免疫缀合物”指与异源功能性分子偶联的靶细胞结合模块(例如特异性结合靶细胞的抗体或结合它在靶细胞上的受体的配体)。依照本发明的免疫缀合物中本质上存在的功能性分子是T细胞应答引发肽。另外,可以采用别的功能性分子,像细胞毒剂。
如本文中使用的,“靶细胞结合模块”指特异性结合靶细胞的模块。该术语包括能够特异性结合靶细胞的抗体以及其它天然(例如受体,配体)或合成(例如DARPin)分子。如本文中使用的,“特异性结合靶细胞”表示所述模块优先结合复杂混合物内的靶细胞。
靶细胞结合模块对靶细胞的结合的亲和力通过术语ka(蛋白质自蛋白质/靶细胞复合物解离的速率常数),kD(解离常数),和KD(kD/ka)来定义。在一个实施方案中,其中靶细胞结合模块是抗体,特异性结合靶细胞表示10-8mol/l或更少,在一个实施方案中,10-8M至10-13mol/l的结合亲和力(KD)。
术语“抗体”在本文中以最广义使用且涵盖各种抗体结构,包括但不限于单克隆抗体,多克隆抗体,多特异性抗体(例如双特异性抗体),和抗体片段,只要它们展现期望的抗原结合活性。
术语“配体”在本文中用于与靶细胞上的生物分子形成复合物以满足生物学目的的分子,优选蛋白质。在一个实施方案中,配体是具有结合限定类型的受体的倾向的选择性配体。
如本文中使用的,“肽”是通过肽键连接的氨基酸单体的短链。结合MHC I类的肽典型地长度为8至12个氨基酸。如本文中使用的,术语“经MHC I类可呈递的T细胞应答引发肽”指经MHC I类分子可呈递的但并非经MHC II可呈递的且触发CD 8 T细胞应答的肽。为了简化,该术语在本文中也可以仅仅称作“T细胞应答引发肽”。
在本发明的范围内使用的T细胞应答引发肽典型地衍生自非自身(即非人)病原体来源。在这种语境中的术语“衍生自”表示T细胞应答引发肽与非自身病原体来源的天然发生T细胞表位同一(即分享相同的氨基酸序列)。换言之,T细胞应答引发肽的氨基酸序列与非自身病原体来源的蛋白质抗原的氨基酸序列的部分序列同一。虽然T细胞应答引发肽的病原体来源可以是病毒或细菌起源的,但是MHC I可呈递的T细胞应答引发肽典型地衍生自细胞内或细胞外病原体。细胞内病原体包括病毒,细胞内细菌或寄生物。细胞外病原体包括寄生物和细菌。虽然用于本发明的T细胞应答引发肽与对应的天然发生T细胞表位分享相同氨基酸序列,但是依照本发明的免疫缀合物的T细胞应答引发肽典型地是合成起源的。
在本领域中,用于诱导针对靶细胞的T细胞细胞毒性的自细胞内病原体衍生的肽偶尔通过氨基酸替代或添加而修饰以改善它们的生理学特性,例如它们的溶解性。然而,对于本发明,只使用天然发生T细胞应答引发肽(即不包括进一步氨基酸序列修饰的分享野生型病原体肽的氨基酸序列的肽)。
如本文中使用的,“天然发生”表示与靶细胞结合模块偶联的经MHC I类可呈递的T细胞应答引发肽分享(即由其组成)对应的经MHC I类可呈递的非自身病原体T细胞表位的氨基酸序列。换言之,T细胞应答引发肽由与通过在靶细胞内切割对应的天然发生非自身病原体可生成的氨基酸序列同一的氨基酸序列组成。因而,在本发明的术语内,“天然发生T细胞应答引发肽”或“经MHC I类可呈递的天然发生T细胞应答引发肽”可以是合成起源的,然而它的氨基酸序列与通过切割对应的天然发生非自身病原体可生成的肽相比不包含任何氨基酸修饰,特别是没有氨基酸添加,删除或替代。再一次换言之,与靶细胞结合模块偶联的天然发生T细胞应答引发肽的氨基酸序列与非自身病原体的蛋白质抗原的氨基酸序列的部分序列(在一个优选实施方案中,长8至12个氨基酸)同一。
陈述T细胞应答引发肽“天然包含”独特氨基酸残基表示在对应的天然发生T细胞应答引发肽内的相同位置处存在独特氨基酸残基。因而,天然包含半胱氨酸残基的T细胞应答引发肽表示自非自身病原体衍生的肽,其中非自身病原体的蛋白质抗原的氨基酸序列中与所述T细胞应答引发肽的氨基酸序列对应的部分序列包含相同位置处的半胱氨酸残基。
当指出提供就野生型病原体T细胞表位而言“没有氨基酸序列修饰的”T细胞应答引发肽时,表示肽的氨基酸序列与对应的非自身病原体的天然可衍生T细胞表位(即通过切割对应的天然发生非自身病原体可生成的T细胞表位)的氨基酸序列是同一的。特别地,肽的氨基酸序列与天然发生肽相比不包括氨基酸残基的添加,删除或替代。
如本文中使用的,术语“氨基酸”表示拥有位于羧基基团的α位置的氨基模块的有机分子。氨基酸的例子包括:精氨酸,甘氨酸,鸟氨酸,赖氨酸,组氨酸,谷氨酸,天冬氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,丙氨酸,苯丙氨酸,酪氨酸,色氨酸,甲硫氨酸,丝氨酸,脯氨酸。所采用的氨基酸在每一种情况中任选是L型。氨基酸可以依照共同侧链特性来分组:
(1)疏水性:正亮氨酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile；
(2)中性亲水性:Cys,Ser,Thr,Asn,Gln；
(3)酸性:Asp,Glu；
(4)碱性:His,Lys,Arg；
(5)影响链取向的残基:Gly,Pro；
(6)芳香族的:Trp,Tyr,Phe。
表–具有特定特性的氨基酸
“表位”是蛋白质抗原中受到免疫系统,例如受到抗体,B细胞或T细胞识别的部分。“T细胞表位”在细胞的表面上呈递,在那里它结合至MHC分子。通过MHC I可呈递的T细胞表位能受到细胞毒性CD8 T淋巴细胞(CD8 T细胞或CTL)的T细胞受体结合。通过MHC I可呈递的T细胞表位典型地是长度为8至12个氨基酸的肽。因而,如本文中提到的,“经MHC I类可呈递的T细胞应答引发肽”表示不需要在靶细胞中加工(例如通过切割一个或多个氨基酸残基)就能够结合MHC I复合物(但不结合MHC II)的病原体衍生肽(在一个实施方案中,由8至12个氨基酸残基组成的肽)。
在本发明的术语内,“可切割键”涉及免疫缀合物内安排在靶细胞结合模块和T细胞应答引发肽之间,容许T细胞应答引发肽分离以由MHC I类分子直接呈递的键。可切割键的定位与T细胞应答引发肽直接联接。自免疫缀合物切割T细胞应答引发肽导致释放具有它的原始氨基酸序列且没有任何另外的氨基酸残基的T细胞应答引发肽。
取决于可切割键的类型,一旦“无痕迹”或“非无痕迹”切割,T细胞应答引发肽自免疫缀合物释放。如本文中使用的,“非无痕迹”释放表示所释放的T细胞应答引发肽包括接头的痕迹(即处于除氨基酸之外的化学模块的形式的痕迹),前提是所述痕迹不干扰MHC I类结合。明确提到，在本发明的术语内，如本文中提到的,“非无痕迹释放”不包括释放包括另外的氨基酸残基的T细胞应答引发肽。如本文中使用的,“无痕迹”释放表示所释放的T细胞应答引发肽不包括接头的任何痕迹。
“pH依赖性切割”表示切割可切割键是由pH的变化而触发的。在本发明的一个实施方案中,pH依赖性切割是在靶细胞的内体隔室内存在的pH触发的。在本发明的一个实施方案中,pH依赖性切割是在pH 5.5-6.5触发的。
如本文中使用的,“酶促切割”表示蛋白水解切割免疫缀合物,其一般通过水解肽键而发生。酶促切割是由蛋白酶,例如弗林蛋白酶来实现的。在免疫缀合物内创建通过酶促切割而可切割的可切割键可以例如通过经肽接头将T细胞应答引发肽结合至靶细胞结合模块来实现。
T细胞应答引发肽与靶细胞结合模块的结合可以通过二硫键,酯键，化学接头，肽接头或通过非共价结合(例如通过生物素/链霉亲合素，生物素/茶碱)来实现。
T细胞应答引发肽与靶细胞结合模块的“共价偶联”或“共价结合”表示通过化学键的偶联，其牵涉在T细胞应答引发肽的一个原子和靶细胞结合模块的一个原子之间分享电子对。
T细胞应答引发肽与靶细胞结合模块的“非共价偶联”或“非共价结合”表示不牵涉分享电子的偶联。非共价偶联的例子包括免疫学结合或经生物素/亲合素，生物素/链霉亲合素等等的结合。在一个实施方案中,免疫学结合是经免疫缀合物中包括的抗体实现的偶联,其中抗体特异性结合结合至T细胞应答引发肽的有机分子。为了在内在化之后释放T细胞应答引发肽,在这个实施方案中,经可切割键将T细胞应答引发肽与所述有机分子偶联。有机分子优选是分子量高至900Da的小分子。此类有机分子的例子包括生物素和茶碱。
如本文中使用的,“肽接头”或“接头肽”指具有优选合成起源的氨基酸序列的肽。或是本文中使用的肽接头包含包括切割位点(在一个实施方案中,蛋白酶切割位点)的功能性域,或是肽接头在融合至T细胞应答引发肽时创建切割位点(在一个实施方案中,蛋白酶切割位点)。本文中使用的肽接头的氨基酸序列典型地具有8至50个氨基酸残基的长度。在一个实施方案中,本文中使用的肽接头包含弗林蛋白酶切割位点且肽接头的氨基酸序列包含:
-R-X-R-R,其中X是任何氨基酸残基,或
-R-X-K-R,其中X是任何氨基酸残基。
在本发明的术语内,“转运域”是负责使得能够到达胞质溶胶的膜转运的结构蛋白域或所述蛋白域的功能性部分。转运域的一个例子是来自绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)外毒素A的域II。
术语“药物组合物”指其形式使得允许其中含有的活性组分的生物学活性为有效,且不含对会接受组合物施用的受试者有不可接受的毒性的另外的成分的制备物。本发明的药物组合物可以通过本领域已知的多种方法来施用。正如技术人员会领会的，施用的路径和/或模式会随期望的结果而变化。为了通过某些施用路径来施用依照本发明的免疫缀合物,可能必须用防止它失活的材料给免疫缀合物包衣或与防止它失活的材料共施用免疫缀合物。例如,可以在适宜的载剂,例如脂质体，或稀释剂中将免疫缀合物施用于受试者。药学可接受稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。
“药学可接受载剂”指药物配制剂中除活性组分之外的对受试者无毒的组分。药学可接受载剂包括生理学相容的任何和所有溶剂,分散介质,涂层,抗细菌和抗真菌剂,等张和吸收延迟剂,等等。优选地,载剂适合于静脉内,肌肉内,皮下,胃肠外,脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。
依照本发明的药物组合物还可以含有佐剂,诸如防腐剂,润湿剂,乳化剂和分散剂。防止存在微生物可以通过灭菌规程,见上文及通过包括各种抗细菌和抗真菌剂,例如对羟基苯甲酸酯,氯丁醇,苯酚,山梨酸,等等二者来确保。可能还想要在组合物中包括等张剂,诸如糖,氯化钠,等等。另外,可注射药物形式延长的吸收可以通过包括延迟吸收的药剂,诸如单硬脂酸铝和明胶来实现。
如本文中使用的,短语“胃肠外施用”表示除肠和表面施用之外的施用模式，通常通过注射，而且包括但不限于静脉内，肌肉内，动脉内，鞘内，囊内，眶内，心内，真皮内，腹膜内，经气管，皮下，表皮下，关节内，囊下,蛛网膜下,脊柱内,硬膜外和胸骨内注射和输注。
不管所选择的施用路径,通过本领域技术人员知道的常规方法将可以以合适的水合形式使用的本发明的免疫缀合物和/或本发明的药物组合物配制成药学可接受的剂量形式。
本发明的药物组合物中活性组分的实际剂量水平可以变化,从而获得在对患者无毒的情况下对特定患者,组合物,和施用模式有效实现期望的治疗性响应的量的活性组分。所选择的剂量水平会取决于多个药动学因素,包括所采用的本发明的特定组合物的活性,施用的路径,施用的时间,所采用的特定化合物的排泄速率,治疗的持续时间,与所采用的特定组合物组合使用的其它药物,化合物和/或材料,所治疗的患者年龄,性别,重量,状况,一般健康和之前的医学史,及医学领域公知的类似因素。
组合物必须是无菌的且流动性达到通过注射器可投递组合物的程度。在水以外,载剂优选是等张缓冲盐水溶液。
适当的流动性可以例如通过使用涂层诸如卵磷脂,在分散的情况中通过维持所需粒度及通过使用表面活性剂来维持。在许多情况中,优选在组合物中包括等张剂,例如糖,多元醇诸如甘露醇或山梨醇,和氯化钠。
如本文中使用的,术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于放射性同位素(例如At211,I131,I125,Y90,Re186,Re188,Sm153,Bi212,P32,Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或化疗药物(例如甲氨蝶呤,阿霉素,长春花生物碱(长春新碱,长春碱,依托泊苷),多柔比星,美法仑,丝裂霉素C,苯丁酸氮芥,柔红霉素或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段,诸如溶核酶；抗生素；毒素诸如小分子毒素或细菌,真菌,植物或动物起源的酶活性毒素,包括其片段和/或变体；和下文公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
如本文中使用的,术语“癌”或“癌症”指增殖性疾病,诸如淋巴瘤,淋巴细胞性白血病,肺癌,非小细胞肺(NSCL)癌,支气管肺泡细胞肺癌,骨癌,胰腺癌,皮肤癌,头或颈癌,皮肤或眼内黑素瘤,子宫癌,卵巢癌,直肠癌,肛门区癌,胃癌,胃的癌,结肠癌,乳腺癌,子宫癌,输卵管癌,子宫内膜癌,宫颈癌,阴道癌,外阴癌,霍奇金氏病,食管癌,小肠癌,内分泌系统癌,甲状腺癌,甲状旁腺癌,肾上腺癌,软组织肉瘤,尿道癌,阴茎癌,前列腺癌,膀胱癌,肾或输尿管癌,肾细胞癌,肾盂癌,间皮瘤,肝细胞癌,胆癌,中枢神经系统(CNS)赘生物,脊柱轴肿瘤,脑干胶质瘤,多形性成胶质细胞瘤,星形细胞瘤,施万细胞瘤,室管膜瘤,髓母细胞瘤,脑膜瘤,鳞状细胞癌,垂体腺瘤和尤因氏肉瘤,包括任何上述癌症的顽固性型式,或一种或多种上述癌症的组合。
术语“半最大抑制性浓度”(“IC50”)表示特定化合物或分子在体外获得50％抑制生物学过程所需浓度。IC50值可以对数换算成pIC50值(-log IC50),其中较高的值指示指数上较大的效力。IC50值不是绝对值,而是依赖于实验条件,例如所采用的浓度。IC50值可以使用Cheng-Prusoff方程(Biochem.Pharmacol.(1973)22:3099)换算成绝对抑制常数(Ki)。
“重组蛋白”是由重组改造的宿主细胞生成的蛋白质。它任选是分离的或纯化的。
在靶细胞结合模块是蛋白质的情况中,靶细胞结合蛋白优选是通过重组手段生成的。用于重组生成蛋白质的方法是现有技术广泛知道的,而且包括在原核和真核细胞中表达蛋白质,随后分离蛋白质,且通常纯化至药学可接受纯度。为了在宿主细胞中表达蛋白质,通过标准方法将编码蛋白质或其部分的核酸插入表达载体。在适宜的原核或真核宿主细胞,像CHO细胞，NS0细胞，SP2/0细胞,HEK293细胞,COS细胞,PER.C6细胞,酵母,或大肠杆菌细胞中实施表达,并自细胞(上清液或裂解后的细胞)回收蛋白质。用于重组生成抗体的一般方法是现有技术公知的,而且记载于例如综述性论文Makrides,S.C.,ProteinExpr.Purif.17(1999)183-202；Geisse,S.,et al.,Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner,R.G.,Drug Res.48(1998)870-880。
2.本发明的实施方案的详细描述
自EP 0 659 437 A1知道包含T细胞特异性病原体肽和特异性结合靶细胞上的表面受体的蛋白的缀合物。然而,细胞表面上MHC I类肽呈递和T细胞活化的效率在EP 0 659437 A1披露的办法中较低。本发明的发明人观察到,不受这种理论束缚,这种作用因EP 0659 437 A1披露的含肽缀合物需要在靶细胞内进一步加工这一事实而发生。这受到在大多数情况中外源提供的抗原没有传送至胞质(它在那里受到蛋白酶体加工并进一步转运至MHC I类途径及在细胞表面上呈递)的问题限制。另一个推测另外发生的作用会是抗原加工机构和呈递过程(尤其是在肿瘤细胞内)是有缺陷的(Ferrone S.,Advances in CancerResearch,93(2005)189-234)。
本发明提供一种办法来改善T细胞特异性病原体肽的MHC I类呈递。依照本发明,在免疫缀合物内在化后在内体隔室中自免疫缀合物释放的T细胞应答引发肽直接适合于经结合至MHC I类复合物而呈递(不需要在靶细胞内进一步加工或修整)。T细胞应答引发肽在内体隔室中结合至MHC I类分子,在MHC I类的背景中通过内体再循环途径行进至靶细胞的表面(Donaldson J.G.,Nat Rev Mol Cell Biol.Sep 2009；10(9):597-608)且不需要转运至胞质溶胶中的抗原加工机构和细胞内的进一步加工。由此,T细胞应答引发肽和靶细胞结合模块经可切割键彼此偶联从而释放(在切割之后)由它的原始氨基酸序列组成的T细胞应答引发肽。换言之,当T细胞应答引发肽自免疫缀合物切割时,它与天然发生T细胞应答引发肽的氨基酸序列相比不包含另外的任何氨基酸残基或缺少任何氨基酸残基(即所释放的T细胞应答引发肽与对应的天然发生T细胞应答引发肽长度相同)。因此,依照本发明的免疫缀合物是更好的适合的候选来介导CD8 T细胞活化及诱导靶细胞中的细胞死亡。凭借依照本发明的免疫缀合物,(a)以可观降低的所需量的免疫缀合物且(b)更快地诱导靶细胞裂解,具体是与所分离的肽需要在靶细胞内进一步加工的构建物相比。
本发明涉及一种免疫缀合物,其包含至少一个经可切割键与靶细胞结合模块偶联的经MHC I类可呈递的T细胞应答引发肽,其中可切割键安排成使得一旦切割,经MHC I类分子(直接)可呈递的所述T细胞应答引发肽自免疫缀合物释放。在本发明的一个实施方案中,T细胞应答引发肽在靶细胞的内体隔室中释放。在本发明的另一个实施方案中,所释放的T细胞应答引发肽是在没有在靶细胞内进一步加工的情况下经MHC I类可呈递的。
本发明还涉及一种免疫缀合物,其中所释放的T细胞应答引发肽的氨基酸序列与天然发生T细胞应答引发肽的氨基酸序列同一。
在本发明的一个实施方案中,所释放的T细胞应答引发肽的氨基酸序列与同靶细胞结合模块偶联的T细胞应答引发肽的氨基酸序列同一。
本发明还涉及一种免疫缀合物,其包含至少一个经可切割键与靶细胞结合模块偶联的经MHC I类可呈递的T细胞应答引发肽,其中可切割键安排成使得一旦切割,所述T细胞应答引发肽自免疫缀合物释放,其中所释放的T细胞应答引发肽由与同靶细胞结合蛋白偶联的T细胞应答引发肽同一数目的氨基酸组成且其中所释放的T细胞应答引发肽适合于经MHC I类复合物呈递。
本发明还涉及一种免疫缀合物，其包含至少一个经可切割键与靶细胞结合模块偶联的经MHC I类可呈递的由8-12个氨基酸残基组成的T细胞应答引发肽,其中可切割键安排成使得一旦切割,所述T细胞应答引发肽自免疫缀合物释放,其中所释放的T细胞应答引发肽由与结合至靶细胞结合模块的T细胞应答引发肽同一数目的氨基酸组成。
在本发明的一个实施方案中,T细胞应答引发肽由8至12个氨基酸组成。
在本发明的一个实施方案中,T细胞应答引发肽是天然发生T细胞应答引发肽。
在本发明的一个实施方案中,T细胞应答引发肽包含至少一个半胱氨酸残基。在本发明的一个实施方案中,T细胞应答引发肽是包含至少一个半胱氨酸残基的天然发生T细胞应答引发肽。在本发明的一个实施方案中,T细胞应答引发肽包含N或C端半胱氨酸残基。在本发明的一个实施方案中，T细胞应答引发肽是包含N或C端半胱氨酸残基的天然发生T细胞应答引发肽。
在本发明的一个实施方案中，T细胞应答引发肽包含它的氨基酸序列的N端位置(自N端至C端方向的位置1)处的半胱氨酸残基。在本发明的一个实施方案中，T细胞应答引发肽天然包含它的氨基酸序列的N端位置(自N端至C端方向的位置1)处的半胱氨酸残基。
在本发明的一个实施方案中，T细胞应答引发肽包含它的氨基酸序列自N端至C端方向的位置2处的亮氨酸残基。在本发明的一个实施方案中,T细胞应答引发肽天然包含它的氨基酸序列自N端至C端方向的位置2处的亮氨酸残基。在本发明的一个实施方案中,T细胞应答引发肽由8-12个氨基酸残基组成且天然包含它的氨基酸序列自N端至C端方向的位置2处的亮氨酸残基。
在本发明的一个实施方案中,免疫缀合物包括多至五个T细胞应答引发肽。在本发明的一个实施方案中,免疫缀合物包括多至十个T细胞应答引发肽。
在本发明的一个实施方案中,T细胞应答引发肽衍生自受到靶细胞的宿主生物体的免疫细胞识别的非自身病原体。在本发明的一个实施方案中，T细胞应答引发肽衍生自细胞内或细胞外病原体。在本发明的一个实施方案中，T细胞应答引发肽衍生自细胞内病原体。在本发明的一个实施方案中,T细胞应答引发肽衍生自病毒细胞内病原体。
在一个实施方案中,T细胞应答引发肽选自SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:5。
在一个实施方案中,T细胞应答引发肽衍生自埃巴二氏病毒。在一个实施方案中,T细胞应答引发肽衍生自埃巴二氏病毒且选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4。
在一个实施方案中,T细胞应答引发肽衍生自人疱疹病毒5。在一个实施方案中,T细胞应答引发肽衍生自人疱疹病毒5且是SEQ ID NO:5的。
在一个实施方案中,T细胞应答引发肽衍生自甲型流感。在一个实施方案中，T细胞应答引发肽衍生自甲型流感且是SEQ ID NO:3的。
在一个实施方案中,与靶细胞结合模块偶联的T细胞应答引发肽氨基酸序列与非自身病原体(在一个实施方案中,细胞内病原体)的蛋白质抗原的氨基酸序列的部分序列同一,优选长8至12个氨基酸。
T细胞应答引发肽经可切割键结合至靶细胞结合模块。在本发明的一个实施方案中，可切割键是通过化学，pH依赖性或酶促切割可切割的。
在本发明的一个实施方案中,可切割键是在免疫缀合物内在化入靶细胞之后可切割的。
在本发明的一个实施方案中,可切割键是在靶细胞的内体隔室内可切割的。在本发明的一个实施方案中,可切割键是在免疫缀合物内在化入靶细胞之后在靶细胞的内体隔室内可切割的。
在本发明的一个实施方案中,可切割键容许T细胞应答引发肽自免疫缀合物无痕迹释放。
在本发明的一个实施方案中,T细胞应答引发肽与靶细胞结合模块共价偶联。在本发明的一个实施方案中,T细胞应答引发肽与靶细胞结合模块经二硫键,酯键,肽键或经接头模块共价偶联。
在本发明的一个实施方案中,可切割键选自二硫键和酯键。在本发明的一个实施方案中,可切割键是二硫键。在本发明的一个实施方案中,T细胞应答引发肽包含至少一个半胱氨酸残基且可切割键是二硫键。在本发明的一个优选实施方案中,靶细胞结合模块是蛋白质且在T细胞应答引发肽的半胱氨酸残基和靶细胞结合蛋白的半胱氨酸残基之间形成二硫键。在另一个优选实施方案中,在靶细胞结合模块和T细胞应答引发肽之间存在肽接头。在这种情况中,在T细胞应答引发肽的半胱氨酸残基和肽接头的半胱氨酸残基之间形成二硫键。
在本发明的一个实施方案中,T细胞应答引发肽和靶细胞结合模块经可切割接头模块偶联。
在本发明的一个实施方案中,T细胞应答引发肽和靶细胞结合模块经肽接头或经化学接头偶联。
在本发明的一个实施方案中,T细胞应答引发肽和靶细胞结合模块经肽接头偶联。在本发明的一个实施方案中,T细胞应答引发肽和靶细胞结合模块经氨基酸序列长度为8至50个氨基酸残基的肽接头偶联。
在本发明的一个实施方案中,可切割接头模块包含蛋白酶切割位点。在本发明的一个实施方案中,可切割接头模块包含在靶细胞的内体或溶酶体隔室中可切割的蛋白酶切割位点。在本发明的一个优选实施方案中,可切割接头模块包含弗林蛋白酶切割位点。
在本发明的一个实施方案中,包含蛋白酶切割位点的可切割接头模块是肽接头。在本发明的一个实施方案中,包含蛋白酶切割位点的可切割接头模块是包含所述蛋白酶切割位点的肽接头。在本发明的一个实施方案中,包含蛋白酶切割位点的可切割接头模块是包含所述弗林蛋白酶切割位点的肽接头。
在本发明的一个实施方案中,可切割接头模块包含pH依赖性切割位点。在本发明的一个实施方案中,可切割接头模块包含在靶细胞的内体隔室中可切割的pH依赖性切割位点。在本发明的一个实施方案中,可切割接头模块包含在pH 5.5-6.5可切割的pH依赖性切割位点。
在本发明的一个实施方案中,包含pH依赖性切割位点的可切割接头模块是化学接头。在一个实施方案中,包含pH依赖性切割位点的可切割接头模块选自腙,肟,马来酸酰胺和缩酮,如下所示:
在本发明的一个实施方案中,T细胞应答引发肽与靶细胞结合模块非共价偶联。在本发明的一个实施方案中,非共价偶联是通过免疫学结合而实现的。
在一个优选实施方案中,免疫学结合是通过特异性结合免疫缀合物内包含的有机分子的抗体而实现的。然后对T细胞应答引发肽的结合是在抗体和与T细胞应答引发肽偶联的所述有机分子之间实现的。为了实现T细胞应答引发肽的无痕迹释放,T细胞应答引发肽经可切割键与所述有机分子偶联。如此,在本发明的一个实施方案中,免疫缀合物包含
-靶细胞结合模块,其处于包含靶细胞结合模块和特异性结合有机分子,优选生物素或茶碱的第二模块(在一个实施方案中,抗体)的多特异性,优选双特异性实体(在一个实施方案中,重组融合蛋白)的形式,和
-T细胞应答引发肽,其经可切割键与能受到第二蛋白特异性结合的有机分子偶联。
在一个实施方案中,有机分子是分子量高至900Da的小分子。在一个优选实施方案中,有机分子是生物素或茶碱。在另一个优选实施方案中,有机分子是茶碱。
在另一个实施方案中,非共价偶联是通过高亲和力结合,在一个实施方案中,通过生物素-亲合素结合而实现的。在另一个实施方案中,非共价偶联是通过受到靶细胞结合模块中存在的第二结合模块(例如Fab片段)识别的肽标签之间的高亲和力结合而实现的,其中在T细胞应答引发肽和肽标签之间存在可切割键。如此,在本发明的一个实施方案中,免疫缀合物包含
-靶细胞结合模块,其处于包含靶细胞结合模块和特异性结合肽标签,优选FLAG或V5的第二模块(在一个实施方案中,抗体)的多特异性,优选双特异性实体(在一个实施方案中,重组融合蛋白)的形式,和
-T细胞应答引发肽,其经可切割键与能受到第二蛋白特异性结合的肽标签偶联。
依照本发明的免疫缀合物包含靶细胞结合模块以将T细胞应答引发肽传送至靶细胞。
在本发明的一个实施方案中,靶细胞结合模块能够内在化入靶细胞。
在本发明的一个实施方案中,靶细胞结合模块结合靶细胞的细胞表面抗原。
在本发明的一个实施方案中,靶细胞是肿瘤细胞。在本发明的另一个实施方案中,其中靶细胞是肿瘤细胞,靶细胞结合模块能够特异性结合表面表达的肿瘤特异性抗原(TSA,其只存在于肿瘤细胞上且不存在于其它细胞上)或表面表达的肿瘤相关抗原(TAA,其存在于肿瘤细胞上且以较少的程度存在于一些其它细胞上)。
在本发明的一个实施方案中,靶细胞是与传染病,自身免疫病,糖尿病或变态反应中的疾病严重程度有关的细胞。
在本发明的一个实施方案中,靶细胞结合模块是蛋白质。在本发明的一个实施方案中,靶细胞结合蛋白是重组蛋白。在本发明的一个实施方案中,靶细胞结合蛋白是特异性结合靶细胞的抗体或结合它在靶细胞上的受体的配体。在本发明的另一个实施方案中,靶细胞结合蛋白选自抗体,细胞因子和生长因子。在本发明的一个优选实施方案中,靶细胞结合模块是抗体。
在一个实施方案中,靶细胞结合模块特异性结合CD19或CDCP-1。在一个实施方案中,靶细胞结合模块特异性结合CD19。在一个实施方案中,靶细胞结合模块特异性结合CDCP-1。
在本发明的一个优选实施方案中,靶细胞结合模块是特异性结合CD19或CDCP-1的抗体。在本发明的一个优选实施方案中,靶细胞结合模块是特异性结合CD19的抗体。在本发明的一个优选实施方案中,靶细胞结合模块是特异性结合CDCP-1的抗体。
在本发明的一个实施方案中，免疫缀合物能够内在化入靶细胞。
依照本发明,T细胞应答引发肽是通过MHC I类直接可呈递的且不需要在靶细胞内进一步加工。因此,在本发明的一个实施方案中,免疫缀合物不包含转运域。
凭借本发明,提供了一种免疫缀合物,其容许释放经MHC I类直接可呈递的T细胞应答引发肽。因为所释放的T细胞应答引发肽不需要投递至胞质溶胶中的抗原加工机构，所以T细胞应答引发肽在短时间内呈递在靶细胞的表面上。因而，在本发明的一个实施方案中，在免疫缀合物内在化入靶细胞之后少于12小时内,T细胞应答引发肽经MHC I类分子呈递在靶细胞的表面上。在本发明的另一个实施方案中,在免疫缀合物内在化入靶细胞之后少于6小时内,T细胞应答引发肽经MHC I类分子呈递在靶细胞的表面上。在本发明的另一个实施方案中,免疫缀合物能够在免疫缀合物内在化入靶细胞之后少于6小时内介导针对靶细胞的T细胞细胞毒性。
本发明进一步涉及一种药物组合物,其包含依照本发明的免疫缀合物。本发明的一个实施方案是一种药物组合物,其包含与药学可接受载剂组合的依照本发明的免疫缀合物。
本发明的另一个方面是上文进一步描述和限定的经MHC I类可呈递的T细胞应答引发肽用于生成依照本发明的免疫缀合物的用途。
本发明的另一个方面是依照本发明的免疫缀合物用于特异性诱导针对靶细胞的T细胞细胞毒性的用途。在本发明的一个实施方案中,免疫缀合物用于特异性诱导针对靶细胞的经CD8 T细胞的细胞介导的免疫。在本发明的一个实施方案中,免疫缀合物内在化入靶细胞且T细胞应答引发肽在靶细胞的内体隔室内自免疫缀合物释放。在本发明的一个实施方案中,在免疫缀合物内在化入靶细胞之后少于12小时内,T细胞应答引发肽经MHC I类分子呈递在靶细胞的表面上。在本发明的另一个实施方案中,在免疫缀合物内在化入靶细胞之后少于6小时内,T细胞应答引发肽经MHC I类分子呈递在靶细胞的表面上。
在本发明的另一个实施方案中,免疫缀合物用于在免疫缀合物内在化入靶细胞之后少于6小时内介导针对靶细胞的T细胞细胞毒性。
本发明的另一个方面是一种用于生成依照本发明的免疫缀合物的方法，其包含下述步骤:
a)提供重组靶细胞结合模块,
b)提供T细胞应答引发肽,和
c)经可切割键偶联至少一个所述T细胞应答引发肽与所述靶细胞结合模块。
本发明的一个实施方案涉及一种用于生成免疫缀合物的方法,其中偶联未修饰的T细胞应答引发肽与靶细胞结合模块。换言之,本发明的一个实施方案涉及一种用于生成免疫缀合物的方法,其中提供没有氨基酸序列修饰的T细胞应答引发肽并与靶细胞结合模块偶联。
本发明的另一个方面是一种用于生成依照本发明的用于特异性诱导针对靶细胞的经CD8 T细胞的细胞介导免疫的免疫缀合物的方法,其包含下述步骤:
a)提供重组靶细胞结合模块，
b)提供T细胞应答引发肽，和
c)经可切割键偶联至少一个所述T细胞应答引发肽与所述靶细胞结合模块。在一个实施方案中,偶联未修饰的T细胞应答引发肽与靶细胞结合模块。
本发明的另一个目标是依照本发明的免疫缀合物用于制造药物组合物的用途。本发明的另一个目标是一种用于制造包含依照本发明的免疫缀合物的药物组合物的方法,其包括配制与至少一种药学可接受载剂组合的依照本发明的免疫缀合物。
本发明的另一个方面是依照本发明的免疫缀合物,其用作药物。本发明的另一个方面是包含癌细胞结合模块的依照本发明的免疫缀合物,其用于治疗癌症。
本发明的另一个方面是依照本发明的免疫缀合物,其用于治疗传染病,自身免疫病,糖尿病或变态反应。
本发明的另一个方面是依照本发明的免疫缀合物,其用于特异性诱导针对靶细胞的经CD8 T细胞的细胞介导免疫。
本发明的另一个方面是依照本发明的药物组合物，其用作药物。本发明的另一个方面是依照本发明的药物组合物,其中药物组合物中包含的免疫缀合物包含癌细胞结合模块,其用于治疗癌症。本发明的另一个方面是依照本发明的药物组合物,其用于治疗传染病,自身免疫病,糖尿病或变态反应。本发明的另一个方面是依照本发明的药物组合物，其用于特异性诱导针对靶细胞的经CD8 T细胞的细胞介导的免疫。
本发明的另一个目标是依照本发明的免疫缀合物用于制造药物的用途。本发明的另一个目标是依照本发明的免疫缀合物用于制造用于治疗癌症的药物的用途。
本发明的另一个目标是依照本发明的免疫缀合物用于制造用于治疗传染病,自身免疫病,糖尿病或变态反应的药物的用途。本发明的另一个目标是依照本发明的免疫缀合物用于制造用于特异性诱导针对靶细胞的经CD8 T细胞的细胞介导的免疫的药物的用途。
本发明的另一个方面是一种治疗罹患疾病的患者的方法,其通过对需要此类治疗的患者施用依照本发明的免疫缀合物来进行。本发明的另一个方面是一种治疗罹患癌症患者的方法,其通过对需要此类治疗的患者施用包含癌细胞结合模块的依照本发明的免疫缀合物来进行。本发明的另一个方面是一种治疗罹患传染病,自身免疫病,糖尿病或变态反应的患者的方法,其通过对需要此类治疗的患者施用依照本发明的免疫缀合物来进行。
本发明的另一个方面是一种治疗罹患疾病的患者的方法,其通过对需要此类治疗的患者施用依照本发明的药物组合物来进行。本发明的另一个方面是一种治疗罹患癌症的患者的方法,其通过对需要此类治疗的患者施用依照本发明的药物组合物来进行。本发明的另一个方面是一种治疗罹患传染病,自身免疫病,糖尿病或变态反应的患者的方法,其通过对需要此类治疗的患者施用依照本发明的药物组合物来进行。
3.本发明的具体实施方案
下面列出本发明的具体实施方案。
1.一种免疫缀合物,其包含至少一个经可切割键与靶细胞结合模块偶联的经MHCI类可呈递的T细胞应答引发肽,其中该可切割键安排成使得一旦切割,经MHC I类分子直接可呈递的所述T细胞应答引发肽自该免疫缀合物释放。
2.依照实施方案1的免疫缀合物,其中所释放的T细胞应答引发肽的氨基酸序列与天然发生T细胞应答引发肽的氨基酸序列同一。
3.依照实施方案2的免疫缀合物,其中所释放的T细胞应答引发肽与天然发生T细胞应答引发肽长度相同。
4.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该T细胞应答引发肽是天然发生T细胞应答引发肽。
5.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该T细胞应答引发肽包含至少一个半胱氨酸残基。
6.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该T细胞应答引发肽包含N或C端半胱氨酸残基。
7.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物，其中该T细胞应答引发肽包含位置2(自N端至C端方向计数)处的亮氨酸残基。
8.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其包含多至五个T细胞应答引发肽。
9.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该T细胞应答引发肽由8至12个氨基酸组成。
10.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该T细胞应答引发肽衍生自埃巴二氏病毒,人疱疹病毒5或甲型流感。
11.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该T细胞应答引发肽衍生自埃巴二氏病毒。
12.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该T细胞应答引发肽衍生自人疱疹病毒5。
13.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该T细胞应答引发肽衍生自甲型流感。
14.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该T细胞应答引发肽选自SEQ IDNO:2至SEQ ID NO:5。
15.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该可切割键是通过化学,pH依赖性或酶促切割可切割的。
16.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该可切割键是在该免疫缀合物内在化入该靶细胞之后可切割的。
17.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该可切割键是在该靶细胞的内体隔室内可切割的。
18.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该T细胞应答引发肽与该靶细胞结合模块共价偶联。
19.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该可切割键选自二硫键和酯键。
20.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该可切割键是二硫键。
21.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该T细胞应答引发肽包含至少一个半胱氨酸残基且该可切割键是二硫键。
22.依照实施方案1至18任一项的免疫缀合物,其中该T细胞应答引发肽和该靶细胞结合模块经可切割接头模块偶联。
23.依照实施方案22的免疫缀合物,其中该可切割接头模块包含蛋白酶切割位点。
24.依照实施方案23的免疫缀合物,其中该可切割接头模块包含弗林蛋白酶切割位点。
25.依照实施方案22的免疫缀合物,其中该可切割接头模块包含pH依赖性切割位点。
26.依照实施方案25的免疫缀合物,其中该pH依赖性切割位点是在pH 5.5-6.5可切割的。
27.依照实施方案22至26任一项的免疫缀合物,其中该可切割接头模块是化学接头。
28.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该靶细胞结合模块能够内在化入该靶细胞。
29.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该靶细胞结合模块结合该靶细胞的细胞表面抗原。
30.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该靶细胞是肿瘤细胞。
31.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该靶细胞结合模块是蛋白质。
32.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该靶细胞结合模块是特异性结合该靶细胞的抗体或结合它在该靶细胞上的受体的配体。
33.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该靶细胞结合模块特异性结合CD19或CDCP-1。
34.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该靶细胞结合模块特异性结合CD19。
35.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该靶细胞结合模块特异性结合CDCP-1。
36.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该靶细胞结合模块是特异性结合CD19或CDCP-1的抗体。
37.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该靶细胞结合模块是特异性结合CD19的抗体。
38.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该靶细胞结合模块是特异性结合CDCP-1的抗体。
39.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其能够内在化入该靶细胞。
40.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中该免疫缀合物不包含转运域。
41.依照前述实施方案任一项的免疫缀合物,其中在该免疫缀合物内在化入该靶细胞后少于12小时内,该T细胞应答引发肽经MHC I类分子在该靶细胞的表面上呈递。
42.一种药物组合物,其包含与药学可接受载剂组合的依照前述实施方案任一项的免疫缀合物。
43.经MHC I类可呈递的T细胞应答引发肽用于生成依照实施方案1至41任一项的免疫缀合物的用途。
44.依照实施方案1至41任一项的免疫缀合物用于特异性诱导针对靶细胞的T细胞细胞毒性的用途。
45.依照实施方案44的用途,其中该免疫缀合物内在化入该靶细胞且该T细胞应答引发肽在该靶细胞的内体隔室内自该免疫缀合物释放。
46.依照实施方案44或45的用途,其中在该免疫缀合物内在化入该靶细胞后少于12小时内,该T细胞应答引发肽经MHC I类分子在该靶细胞的表面上呈递。
47.一种用于生成依照实施方案1至41任一项的免疫缀合物的方法，其包含下述步骤:
a)提供重组靶细胞结合模块,
b)提供T细胞应答引发肽,
c)经可切割键偶联至少一个所述T细胞应答引发肽与所述靶细胞结合模块。
48.依照实施方案47的方法,其中偶联未修饰的T细胞应答引发肽与该靶细胞结合模块。
49.依照实施方案1至41任一项的免疫缀合物，其用作药物。
50.包含癌细胞结合模块的依照实施方案1至41任一项的免疫缀合物，其用于治疗癌症。
51.依照实施方案1至41任一项的免疫缀合物，其用于治疗传染病，自身免疫病，糖尿病或变态反应。
52.一种治疗罹患疾病的患者的方法,其通过对需要此类治疗的患者施用依照实施方案1至41任一项的免疫缀合物来进行。
53.一种治疗罹患癌症的患者的方法,其通过对需要此类治疗的患者施用包含癌细胞结合模块的依照实施方案1至41任一项的免疫缀合物来进行。
氨基酸序列的描述
实施例
提供下述实施例来帮助理解本发明,其真正范围在所附权利要求中列出。理解的是,可以在不背离本发明的精神的情况下在所列规程中进行修改。
实施例1:
CMV肽的C或N端修饰对MHC I类(HLA-A2)结合和CMV特异性T细胞激活的影响
为了评估天然发生T细胞应答引发肽中包括的C或N端氨基酸修饰的影响,对天然加工的氨基酸序列NLVPMVATV(SEQ ID NO.1)的CMV肽进行下述修饰:
使用标准Fmoc化学合成肽。所使用的氨基酸均为L-异构体。
实施例1A
自健康供体的外周血生成CMV肽特异性T细胞
经五聚物染色在FACS中调查自健康供体新鲜分离的PBMC中或T细胞培养物中CMV肽特异性CD8 T细胞的频率。
简言之,用BD FACS缓冲液清洗3-5x10E05个T细胞培养物或自HLA-A2匹配的健康供体新鲜分离的PBMC的小样并与包含5μL人TruStain FcX(BioLegend,422302)的100μL BDFACS缓冲液一起于室温温育15分钟。之后添加包含10μL生物素缀合的CMV五聚物(ProImmune,F008-4,1∶10)的90μL BD FACS缓冲液并于4℃温育1小时。
用BD FACS缓冲液清洗后将细胞在100μl含FITC标记的抗CD8a单抗(克隆LT8,ProImmune)以及链霉亲合素-APC缀合物的BD FACS缓冲液中于4℃染色20分钟。3次用BDFACS缓冲液清洗及离心后在200μl含有1μg/ml DAPI的BD FACS缓冲液中重悬浮细胞并通过BD Biosciences FACSCanto II流式细胞仪分析染色细胞的MFI信号。使用来自HLA-A1供体的细胞来评估四聚物的非特异性结合。
在分离那天如下用CMV衍生肽NLVPMVATV(SEQ ID NO:1)使用新鲜分离的PBMC进行刺激:
将2x10E5个细胞每96孔在200μL含有1μM肽的RPMI+培养基中在96孔板中温育3天。在第3天将板以300g离心2分钟,自孔取出160μl上清液,并用含有1μM肽和100U/mL IL-2的新鲜RPMI+培养基替换。在第8和10天再次如第3天所述替换培养基。在第14天在没有用肽刺激的情况下分拆培养细胞。在第16天如下对细胞培养物用自体PBMC(以11戈瑞照射)再刺激并用CMV肽脉冲:12x10E6个T细胞每孔,在含有1μM肽加8.7x10E6个经照射PBMC每孔的2000μL RPMI+培养基中,在6孔板中。在第19,21和25天再次分拆培养物并在第30天如上所述刺激。在第35,37,41天分拆培养物并在第44天依照方案再刺激。对培养物测试CMV肽特异性细胞的频率,在第51天用于LDH细胞毒性测定法并在第54天用于ELISPOT测定法(针对加载了标示CMV肽的细胞的特异性)。
实施例1B
用游离CMV肽处理肿瘤细胞后CMV肽特异性T细胞激活通过IFNγ-ELISPOT的评估
在表面上表达不同水平的有关MHC I分子的不同肿瘤细胞系上通过IFNγ-ELISPOT评估HLA-A2限制性CMV肽特异性T细胞激活:
-MDA-MB 231:HLA-A2高
-HCT-116:HLA-A2低
-T2:一种在细胞的表面上不表达未加载MHC I类分子的TAP缺陷细胞系
简言之，分别在500个实施例1A中获得的CMV特异性CD8 T细胞存在下用不同浓度的游离已修饰CMV肽(cCMV，CMVc，rcCMV，CMVrc，CMVpen)或天然发生，未修饰CMV肽(浓度为13.245μM或1.3245μM)处理10,000个肿瘤细胞。在相同条件下,作为对照,在游离肽缺失下温育肿瘤细胞和T细胞,并且作为又一个对照,单独温育T细胞。
使用含有血清的RPMI+培养基或无血清AIM-V培养基任一进行实验。
如下实施IFNγ-ELISPOT:
在第1天,用无菌PBS清洗板。随后，每孔添加50μL RPMI+培养基并将板温育20-30分钟。随后,在50μL RPMI+中将肽添加至各自孔。使用Accutase收获各自肿瘤细胞。在各自孔中在100μL RPMI+中添加10,000个肿瘤细胞每孔。温育20分钟后将板在黑暗中温育约6小时。将T细胞过滤穿过40μm网并在RPMI+中清洗一次(以300g离心2分钟)。添加含有500个肽特异性CD8 T细胞的50μL RPMI+培养基。将板温育过夜。
在第2天,倒空板并用PBS清洗。在经过滤的PBS/0.5％FCS中1∶200稀释抗人IFN-γ单克隆抗体(Mabtech 7-B6-ALP)。每孔添加100μL pf稀释的抗体并温育2小时。随后,用PBS清洗板。将底物溶液(BCIP/NBT-plus)过滤穿过0.45μm滤器。每孔添加100μL底物溶液并显色直至出现明晰的点。通过在自来水中清洗来停止显色后,在黑暗中使板干燥。
在ELISPOT读数仪(Cellular Technology Ltd.)中使用“ImmunoSpot5.0professional DC”软件分析板。
RPMI+培养基的组成如下:
结果标示于图1。
观察到CMV肽的N端修饰引起T细胞激活丧失。C端修饰降低T细胞激活。另外,CMV肽的氨基酸序列内天然存在的氨基酸的侧链的修饰引起T细胞激活丧失。因而,能得出结论,天然发生T细胞应答引发肽内的修饰可能影响(即降低)MHC I类分子上的加载及因而T细胞激活。
然而,当使用天然发生T细胞应答引发肽时,能确保最佳的MHC I类结合和加载。
实施例2:
依照本发明的免疫缀合物的提议作用模式
图2展示依照本发明的免疫缀合物的一种提议作用模式。例示地,显示一种抗体作为靶细胞结合模块,然而其它模块同等合适。
在稳态中,靶细胞表面(例如肿瘤细胞的表面)装饰有靶细胞结合模块特异性结合的靶抗原。另外,呈递自身肽的MHC I类分子在细胞表面上表达。
不受这种理论束缚,免疫缀合物结合靶抗原(A)引起靶抗原-免疫缀合物复合物内在化(B)及随后在早期内体隔室中T细胞应答引发肽自免疫缀合物释放(C)。重要的是,所释放的肽由与其对应的天然发生肽同一的氨基酸序列组成且不包含任何氨基酸修饰,具体是没有C或N端氨基酸修饰。
在内体隔室内MHC I类分子上存在的自身肽与非自身肽(即自免疫缀合物切下的T细胞应答引发肽)被动交换(D)。加载了肽的MHC I类分子经内体运输传送至细胞表面(E),引起T细胞应答引发肽在MHC I类的背景中呈递在靶细胞表面上。
肽特异性CD8 T细胞识别并结合靶细胞上加载了肽的MHC I类分子(F),引起针对靶细胞的T细胞细胞毒性的特异性诱导。
实施例3:
单克隆抗CDCP1抗体与至少一个经MHC I类可呈递的T细胞应答引发肽的缀合
为了生成依照本发明的免疫缀合物,将特异性结合含CUB域蛋白1(CDCP1,也称作CD318,披露于EP 1 396 501A1)的单克隆抗体(单抗)与下述病原体衍生肽任一偶联:
-埃巴二氏病毒(EBV)肽426-434(SEQ ID NO:2,CLGGLLTMV),或
-甲型流感NP(FLU)肽44-52(SEQ ID NO:3,CTELKLSDY)。
使用标准Fmoc化学合成肽。所使用的氨基酸均为L-异构体。
实施例3A:
包含单克隆抗CDCP1抗体和EBV和/或FLU肽的免疫缀合物的生成,其中肽经可切割S-S键与抗体偶联
为了生成依照本发明的免疫缀合物的例子,其中免疫缀合物包含二硫键以在内在化入靶细胞后释放肽,如下将肽缀合至抗体:
首先在10个当量的3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸N-琥珀酰亚胺基酯(SPDP,Pierce)存在下在pH 7.2的0.1M磷酸钾缓冲液中使抗CDCP1单抗衍生化。2小时反应时间后通过凝胶过滤将已衍生化抗体纯化入pH 7.0的含有10mM EDTA的0.1M磷酸钾缓冲液。
为了生成包含EBV或FLU肽任一的免疫缀合物,将10个当量的各自肽添加至已衍生化抗体并反应过夜。通过凝胶过滤来纯化依照本发明的免疫缀合物。
为了生成包含EBV和FLU肽的免疫缀合物,使已衍生化抗体与5个当量的每种EBV和FLU肽反应过夜。通过凝胶过滤来纯化依照本发明的免疫缀合物。
所生成的依照本发明的免疫缀合物在本文中如下提及:
-<CDCP1-SS-pEBV>包含通过二硫键与EBV肽426-434偶联的抗CDCP1单抗的免疫缀合物
-<CDCP1-SS-pFLU>包含通过二硫键与FLU肽44-52偶联的抗CDCP1单抗的免疫缀合物
-<CDCP1-SS-pEBV/FLU>包含通过各自二硫键与EBV肽426-434和FLU肽44-52偶联的抗CDCP1单抗的免疫缀合物
实施例3B(比较):
包含单克隆抗CDCP1抗体和EBV或FLU肽的免疫缀合物的生成,其中肽经非可切割硫醚键与抗体偶联
为了比较性分析,以非可切割方式经硫醚键将肽缀合至抗体:
首先在10个当量的N-ε-马来酰亚胺基己酰基-氧基琥珀酰亚胺酯(EMCS,Pierce)存在下在pH 7.2的0.1M磷酸钾缓冲液中使抗CDCP1单抗衍生化。2小时反应时间后通过凝胶过滤将已衍生化抗体纯化入pH 7.0的含有10mM EDTA的0.1M磷酸钾缓冲液。
之后将10个当量的各自肽添加至已衍生化抗体并反应过夜。通过凝胶过滤来纯化免疫缀合物。
用于比较的所生成的免疫缀合物在本文中如下提及:
-<CDCP1-S-pEBV>包含通过硫醚键与EBV肽425-433偶联的抗CDCP1单抗的免疫缀合物
-<CDCP1-S-pFLU>包含通过硫醚键与FLU肽44-52偶联的抗CDCP1单抗的免疫缀合物
实施例3C:
包含与EBV和/或FLU肽偶联的单克隆抗CDCP1抗体的免疫缀合物的MS分析学和稳定性评估
通过LC-ESI质谱术分析实施例3A和3B中形成的免疫缀合物的标记率。
样品制备:在测量之前用N-糖苷酶F将IgG或经标记IgG脱糖基化。或者在脱糖基化后用TCEP还原IgG或经标记IgG以分开测量轻链和重链。
使用带有反相柱及水:乙腈梯度和ESI-TOF-MS测量和检测的LC-ESI-MS(Waters)HPLC系统实施分析学。使用MassLynx软件(Waters)实施MS数据分析。
分析显示平均而言0.8个肽偶联至每个抗体分子(数据未显示)。
为了检查免疫缀合物的稳定性,评估储备溶液内的和细胞培养培养基内的稳定性。通过旋转柱(分子量截留50kDa)过滤免疫缀合物的储备溶液并通过LC-MS分析。没有检测到游离肽。通过LC-MS分析掺有免疫缀合物的细胞培养培养基。没有检测到游离肽。作为阳性对照,细胞培养培养基掺有游离肽。
实施例3D:
包含与EBV和/或FLU肽偶联的单克隆抗CDCP1抗体的免疫缀合物对表达CDCP1的MDA-MB 231细胞的细胞结合研究
为了评估免疫缀合物对它们各自抗原的结合,在基于FACS的结合测定法中评估实施例3A和3B的免疫缀合物对表达CDCP1的MDA-MB 231细胞的结合。
简言之,MDA-MB 231细胞经Accutase处理而解离,通过离心与解离培养基分开,并以4x 10E06个细胞/ml的浓度在MDA-MB 231细胞培养基中悬浮。将50μl细胞小样与免疫缀合物或未缀合抗CDCP1抗体(亲本抗CDCP1抗体)的连续稀释液(20μg/ml–0.02μg/ml免疫缀合物，在BD FACS缓冲液中)一起于4℃温育30分钟。用BD FACS缓冲液清洗后将细胞用FITC标记的抗人IgG H+L(Invitrogen A11013；10μg/ml,在BD FACS缓冲液中)于4℃染色30分钟。清洗和离心后通过BD Biosciences FACSCanto流式细胞仪分析染色细胞的MFI信号(图3)。
图3中所示来自基于FACS的细胞结合研究的结果证明所有免疫缀合物均以相当的方式结合表达CDCP1的MDA-MB 231肿瘤细胞。
实施例3E:
通过表面等离振子共振包含与EBV和/或FLU肽偶联的单克隆抗CDCP1抗体的免疫缀合物对CDCP1的胞外域(ECD)的结合研究
使用BIACORE T100仪器(GE Healthcare)通过表面等离振子共振调查实施例3A和3B的免疫缀合物对人CDCP1-ECD的生物化学结合。
使用由GE Healthcare供应的胺偶联试剂盒于pH 5.0在CM4芯片(GE Healthcare,BR-1005-34)上偶联2000个响应单位(RU)左右的捕捉系统(10μg/ml山羊抗人IgG Fc片段特异性；Jackson Immuno Research)。用于固定化的运行缓冲液是HBS-N pH 7.4(10mMHEPES,150mM NaCl,pH 7.4,GE Healthcare,BR-1006-70)。对于下面的动力学测定法,运行和稀释缓冲液是HBS-P pH 7.4(10mM HEPES,150mM NaCl,0.05％表面活性剂P20,pH 7.4,GE Healthcare,BR-1006-71)。
流动室设为25℃-且样品块设为12℃-并用运行缓冲液试行两次。通过以10μl/min流注射1μg/ml溶液60秒来捕捉免疫缀合物和用于比较的亲本抗CDCP1单抗抗体(RO5464169-000-0004)。
通过以30μl/min流注射多种浓度的人CDCP1-ECD溶液180秒来测量结合,始于1350nM,接着是一次1:1.5稀释和进一步的多次1:3稀释。监测解离期高至300秒并通过将样品溶液转换至运行缓冲液来触发。通过用以10μl/min流速两次连续注射甘氨酸pH 1.7溶液60秒清洗来再生表面。通过减去自山羊抗人IgG Fc表面获得的响应来修正整体折射率(bulk refractive index)差异。还减去空白注射(＝双重参照)。为了计算KD和其它动力学参数,使用Langmuir 1∶1模型。
结果显示于表1:
表1:通过评估的免疫缀合物对CDCP1的结合
免疫缀合物 kD[s-1]
亲本抗CDCP1单抗 5.6E-03
<CDCP1-SS-pEBV> 4.6E-03
<CDCP1-SS-pFLU> 5.5E-03
<CDCP1-SS-pEBV/FLU> 5.2E-03
<CDCP1-S-pEBV> 5.0E-03
<CDCP1-S-pFLU> 5.1E-03
表1中所示来自Biacore研究的的结果证明所有免疫缀合物均以与亲本抗CDCP1参照抗体相当的方式结合CDCP1-ECD。
实施例3F:
包含与EBV和/或FLU肽偶联的单克隆抗CDCP1抗体的免疫缀合物内在化入表达CDCP1的人肿瘤细胞(MDA-MB 231)的研究
为了与亲本抗CDCP1单抗比较来评估所生成的免疫缀合物的内在化能力,用表达CDCP1的人肿瘤细胞系MDA-MB 231实施基于FACS的内在化测定法。
简言之,MDA-MB 231细胞经Accutase处理而解离，通过离心与解离培养基分开，并以3x 10E06个细胞/ml的浓度在MDA-MB 231细胞培养培养基(RPMI/2mM谷氨酰胺/10％FCS)中悬浮。将50μl细胞小样与免疫缀合物或亲本抗体(5μg/ml,在MDA-MB 231细胞培养培养基中)一起于4℃温育30分钟。2次用冷的MDA-MB 231细胞培养培养基(RPMI/2mM谷氨酰胺/10％FCS)清洗后将细胞在100μl培养基中于4℃或37℃温育30,60,120，240分钟和过夜[23小时]。
所述时间点后清洗细胞，离心并用Alexa488标记的抗人IgG H+L(InvitrogenA11013；10μg/ml,在BD FACS缓冲液中)于4℃染色30分钟。2次清洗和离心后在100μl BD细胞固定缓冲液中保持细胞并通过BD Biosciences FACSCanto流式细胞仪分析染色细胞的MFI信号。
于4℃温育后没有检测到内在化。于37℃的内在化研究的结果显示于表2。
表2:于37℃包含与EBV和/或FLU肽偶联的单克隆抗CDCP1抗体的免疫缀合物进入表达CDCP1的人肿瘤细胞(MDA-MB 231)的内在化
来自基于FACS的内在化研究的结果显示所测试的所有免疫缀合物均与亲本抗CDCP1参照抗体(RO5464169-000-0004)相当地内在化入表达CDCP1的MDA-MB 231肿瘤细胞。
实施例4:
单克隆抗CD19抗体与至少一个经MHC I类可呈递的T细胞应答引发肽的缀合
实施例4A:
包含单克隆抗CD19抗体和EBV和/或FLU肽的免疫缀合物的生成,其中肽与抗体经可切割S-S键偶联
将一种特异性结合CD19的单抗(自杂交瘤上清液纯化的内部制备物)与实施例3A中使用的肽任一偶联。
为了生成依照本发明的免疫缀合物的例子,其中免疫缀合物包含二硫键以在内在化入靶细胞后释放肽,如实施例3A中所述经二硫键将肽缀合至抗体。
所生成的依照本发明的免疫缀合物在本文中如下提及:
-<CD19-SS-pEBV>包含通过二硫键与EBV肽426-434偶联的抗CD19单抗的免疫缀合物
-<CD19-SS-pFLU>包含通过二硫键与FLU肽44-52偶联的抗CD19单抗的免疫缀合物
-<CD19-SS-pEBV/FLU>包含通过二硫键与EBV肽426-434和FLU肽44-52偶联的抗CD19单抗的免疫缀合物
实施例4B:
包含与EBV和/或FLU肽偶联的单克隆抗CD19抗体的免疫缀合物对表达CD19的RL非霍奇金氏淋巴瘤细胞的细胞结合研究
为了评估免疫缀合物对它们各自抗原的结合，在基于FACS的结合测定法中评估实施例4A的免疫缀合物对表达CD19的RL细胞的结合。
简言之,在体外在RPMI/2mM谷氨酰胺/10％FCS(低IgG)培养基中培养RL细胞。将RL细胞悬浮液(4x 10E06个细胞/ml)的50μl小样与免疫缀合物(2μg/ml,在BD FACS缓冲液中)一起于4℃温育30分钟。用BD FACS缓冲液清洗后将细胞用Alexa488标记的抗小鼠IgG H+L(Invitrogen 65E1-1；10μg/ml,在BD FACS缓冲液中)于4℃染色30分钟。清洗和离心后通过BD Biosciences FACSCanto流式细胞仪分析染色细胞的MFI信号。结果显示于图4。
图4中所示来自基于FACS的细胞结合研究的结果证明所有免疫缀合物均以相当的方式结合表达CD19的RL细胞。
实施例4C:
包含与EBV和/或FLU肽偶联的单克隆抗CD19抗体的免疫缀合物内在化入表达CD19的人非霍奇金氏淋巴瘤细胞(RL细胞)和人伯基特氏淋巴瘤细胞系(Ramos细胞)的研究
为了与亲本抗CD19单抗比较来评估所生成的免疫缀合物的内在化能力,用表达CD19的细胞系RL和Ramos实施基于FACS的内在化测定法。
简言之,在体外在RPMI/2mM谷氨酰胺/10％FCS(低IgG)培养基中培养RL和Ramos细胞。将RL和Ramos细胞悬浮液(4x 10E06个细胞/ml)的50μl小样与免疫缀合物或亲本抗CD19单抗(5μg/ml,在RL细胞培养培养基中)一起于4℃温育30分钟。2次用冷的RL细胞培养培养基清洗后将细胞在100μl培养基中于4℃或37℃温育30,60,120，240和360分钟和过夜[23小时]。
所述时间点后清洗细胞,离心并用Alexa488标记的抗人IgG H+L(JacksonImmuno715-116-150Lot 90812；2,5μg/ml,在BD FACS缓冲液中)于4℃染色30分钟。2次清洗和离心后在100μl BD细胞固定缓冲液中保持细胞并通过BD Biosciences FACSCanto流式细胞仪分析染色细胞的MFI信号。
于4℃温育后没有检测到内在化。于37℃的内在化研究的结果显示于表3。
表3:于37℃包含与EBV和/或FLU肽偶联的单克隆抗CD19抗体的免疫缀合物进入表达CD19的人肿瘤细胞(RL)的内在化
来自基于FACS的内在化研究的结果显示所测试的免疫缀合物均与亲本抗CD19参照抗体相当地内在化入表达CD19的RL细胞。
实施例5:
用包含单克隆抗CDCP1抗体和EBV肽的免疫缀合物和包含单克隆抗CD19抗体和EBV肽的免疫缀合物处理肿瘤细胞后CD8 T细胞的激活
实施例5A:
自健康供体的外周血生成EBV肽特异性T细胞
经五聚物染色在FACS中调查自健康供体新鲜分离的PBMC中或T细胞培养物中EBV肽特异性CD8 T细胞的频率。
简言之,用BD FACS缓冲液清洗4-5x10E05个T细胞培养物或自HLA-A2匹配的健康供体新鲜分离的PBMC的小样并与包含5μL人TruStain FcX(BioLegend,422302)的100μL BDFACS缓冲液一起于室温温育15分钟。之后添加包含10μL生物素缀合的EBV五聚物(ProImmune,F042-84A-E)的90μL BD FACS缓冲液并于4℃温育1小时。
用BD FACS缓冲液清洗后将细胞在100μl含FITC标记的抗CD8a单抗(克隆LT8,ProImmune)以及链霉亲合素-APC缀合物的BD FACS缓冲液中于4℃染色20分钟。3次用BDFACS缓冲液清洗及离心后在200μl BD FACS缓冲液中重悬浮细胞并通过BD BiosciencesFACSCanto II流式细胞仪分析染色细胞的MFI信号。使用来自HLA-A1供体的细胞来评估四聚物的非特异性结合。
依照实施例1关于CMV衍生肽描述的方案生成EBV肽特异性T细胞,区别在于在这个实验中使用依照SEQ ID NO:2的EBV肽进行刺激。
实施例5B:
用包含单克隆抗CDCP1抗体和EBV肽的免疫缀合物和包含单克隆抗CD19抗体和EBV肽的免疫缀合物处理HCT-116肿瘤细胞后EBV肽特异性T细胞激活通过IFNγ-ELISPOT的评估
使用在实施例5A中获得的CD8 T细胞存在下用来自实施例3A，3B(包含抗-CDCP1和EBV肽的免疫缀合物)和4A(包含抗CD19和EBV肽的免疫缀合物)的免疫缀合物(IC)处理的HCT-116肿瘤细胞通过IFNγ-ELISPOT评估EBV肽特异性T细胞激活。为了比较性分析,用游离肽(pEBV,阳性对照)及用由与实施例3A中所述EBV肽偶联的抗Dig抗体构成的对照免疫缀合物(称作<DIG-SS-pEBV>,阴性对照)同时进行实验。
依照实施例1B中描述的通用方案实施IFNγ-ELISPOT。
结果显示于图5A。
来自IFNγ-ELISPOT的结果证明在所测试免疫缀合物中只有包含经可切割键偶联的单克隆抗CDCP1抗体和EBV肽的免疫缀合物(<CDCP1-SS-EBV>)在内在化入肿瘤细胞后充分激活CD8 T细胞,而包含经非可切割键偶联的单克隆抗CDCP1抗体和EBV肽的免疫缀合物(<CDCP1-S-EBV>)不能激活肽特异性CD8 T细胞。包含不结合靶细胞的抗体的免疫缀合物(<DIG-SS-EBV>和<CD19-SS-EBV>)不激活T细胞。而且,依照本发明的免疫缀合物能够以甚至少于1nmol/l的低量激活CD8 T细胞。
实施例5C:
用包含单克隆抗CD19抗体和EBV肽的免疫缀合物处理RL和Ramos细胞后EBV肽特异性T细胞激活通过IFNγ-ELISPOT的评估
为了证明肿瘤细胞杀伤限于表达能够呈递各自T细胞应答引发肽的HLA亚型的靶细胞,使用在实施例5A中获得的CD8 T细胞存在下用来自实施例4A(包含抗CD19和HLA-A2限制性EBV肽的免疫缀合物)的免疫缀合物(IC)处理的表达HLA-A2的RL细胞和不表达HLA-A2的Ramos细胞通过IFNγ-ELISPOT评估EBV肽特异性T细胞激活。为了比较性分析,用游离肽(pEBV,阳性对照)同时进行实验。
依照实施例1B中描述的通用方案实施IFNγ-ELISPOT。
结果显示于图5B,指示仅仅在RL细胞中而非Ramos细胞中观察到肿瘤细胞杀伤。
实施例6:
提供包含经可切割二硫键与EBV肽偶联的单克隆抗CDCP1抗体的免疫缀合物，其中EBV肽天然包含非末端半胱氨酸残基及通过IFNγ-ELISPOT评估CD8 T细胞激活
虽然在实施例3和4中提供了免疫缀合物，其中T细胞应答引发肽在末端连接各自抗体以形成免疫缀合物,但是在这个实施例中,在肽的非末端半胱氨酸残基和抗体之间形成可切割二硫键。为此,提供氨基酸序列GLCTLVAML(SEQ ID NO:4)的EBV肽并如实施例3A中所述与抗CDCP1抗体偶联。
在表达不同水平的MHC I的不同肿瘤细胞系上通过IFNγ-ELISPOT评估肽特异性T细胞激活:
-MDA-MB 231,HLA-A2高,和
-A375,HLA-A2低。
简言之，在500个如实施例5B中所述获得的肽特异性CD8 T细胞存在下分别用不同浓度的免疫缀合物处理10,000个肿瘤细胞,然而使用EBV肽GLCTLVAML代替。在相同条件下,作为对照,在免疫缀合物缺失下温育肿瘤细胞和T细胞,并且作为又一个对照,单独温育T细胞。
所生成的依照本发明的免疫缀合物在本文中如下提及:
-<CDCP1-SS-pEBV(GLC)>包含通过二硫键与EBV肽GLCTLVAML偶联的抗CDCP1单抗的免疫缀合物
IFNγ-ELISPOT的结果显示于图5C。对于依照本发明的免疫缀合物对所测试的两种肿瘤细胞系均观察到剂量依赖性方式的肽特异性T细胞激活。
实施例7:
通过LDH释放测定法和xCELLigence评估的用包含单克隆抗CDCP1抗体和EBV肽的依照本发明的免疫缀合物处理的MDA-MB231肿瘤细胞中CD8 T细胞诱导的细胞死亡的介导
以效应细胞对靶细胞比3∶1在实施例5A中获得的CD8 T细胞存在下使用用不同浓度的来自实施例3A，3B(包含抗CDCP1和EBV肽的免疫缀合物)的免疫缀合物(IC)处理的MDA-MB231肿瘤细胞通过LDH释放测定法及通过xCELLigence测定法评估EBV肽特异性T细胞激活和肿瘤细胞杀伤。为了比较性分析,用游离肽(pEBV,阳性对照)同时进行实验。
使用下述通用方法在xCELLigence系统中经由动态监测细胞增殖和存活力来实施对加载有病毒肽的肿瘤细胞因免疫缀合物处理所致杀伤的评估:每个孔添加50μL肿瘤细胞培养基并在RTCA仪器(Roche Applied Sciences)中实施初始背景测量(步骤1)。将在50μl肿瘤细胞培养基中悬浮的物质添加入E板。使用Accutase收获肿瘤细胞,在50μL肿瘤细胞培养基中悬浮各自细胞数,并将培养基添加入E板。
将下述细胞数用于不同肿瘤细胞系:A-375∶10,000个细胞；HCT-116:20,000个细胞；PC-3:10,000个细胞；MDA-MB231:10,000个细胞。
于室温10分钟后将板置于RTCA仪器中并实施步骤2(间隔10分钟,200个间隔)。随后,将板温育约24小时。
次日,在AIM-V培养基中清洗T细胞并在AIM-V培养基中悬浮。将T细胞添加至板至终体积200μl。将板置于RTCA仪器中以实施步骤3(间隔5分钟,300个间隔)。将板温育过夜。
将样品用于后续LDH释放分析。
为了LDH释放评估,通过添加1％Triton X-100来裂解细胞。将上清液转移至V底96孔板,并通过离心和再次将无细胞残骸的上清液转移至平底96孔板来去除细胞残骸。使用LDH细胞毒性测定法(Roche,#11644793001)依照制造商的说明书分析LDH释放。简言之,混合催化剂和染料溶液,将100μl所得反应混合物添加入每个孔,并在黑暗中于室温温育。以t＝15-45分钟(通常30分钟)使用Tecan ELISA读数仪测量492nm(参照:620nm)处的吸光度。
结果显示于图6A并指示使用依照本发明的免疫缀合物能在皮摩尔浓度观察到有力的肿瘤细胞杀伤。
实施例8:
通过LDH释放测定法和xCELLigence评估的用包含单克隆抗CDCP1抗体和天然包含非末端半胱氨酸残基的EBV肽的依照本发明的免疫缀合物处理的MDA-MB231和A-375肿瘤细胞中CD8 T细胞诱导的细胞死亡的介导
以效应细胞对靶细胞比3:1在依照实施例5A获得的肽特异性CD8 T细胞存在下使用用不同浓度的实施例6(包含抗CDCP1和天然包含非末端半胱氨酸残基的EBV肽的免疫缀合物)的免疫缀合物(IC)处理的MDA-MB231和A-375肿瘤细胞通过LDH释放测定法及通过xCELLigence测定法和LDH释放评估来评估EBV肽特异性T细胞激活和肿瘤细胞杀伤,然而使用EBV肽GLCTLVAML代替刺激。为了比较性分析,以两种不同肽浓度用游离肽(pEBV)同时进行实验。
如实施例7中所述实施xCELLigence测定法和LDH释放评估。
结果显示于图6B(对于A-375细胞)和6C(对于MDA-MB231细胞),xCELLigence测定法的数据是在13.5小时后测量的。
结果指示只有依照本发明的免疫缀合物能够介导所测试的肿瘤细胞经肽特异性T细胞的特异性杀伤。与之对比,使用等摩尔浓度的游离EBV肽没有观察到特异性肿瘤细胞杀伤。
实施例9:
通过LDH释放测定法和xCELLigence评估的用包含单克隆抗CDCP1抗体和FLU肽的依照本发明的免疫缀合物处理的肿瘤细胞中CD8 T细胞诱导的细胞死亡的介导
在FLU特异性CD8 T细胞存在下使用含有HLA-A1限制性FLU肽的免疫缀合物(CDCP1-SS-pFLU,如实施例3A中获得的)处理不同肿瘤细胞系(A-375,PC-3,HCT-116)来评估依照本发明的免疫缀合物的肿瘤细胞杀伤。如实施例7中所述通过LDH释放测定法及通过xCELLigence测定法评估肽特异性T细胞激活和肿瘤细胞杀伤。
所测试的细胞系就HLA亚型和表达及靶物(CDCP-1)表达而言提供下述特征:
细胞系 肿瘤类型 HLA-A亚型 CDCP-1(MFI) HLA-A1,A11,A26/A1,A36(MFI)
PC-3 前列腺 HLA-A1 43488 24452/1336
HCT-116 肠 HLA-A1,A2 47678 24679/1747
A-375 皮肤 HLA-A1,A2 1736 21758/710
来自xCELLigence分析的结果显示于图7A-C。来自LDH释放测定法的结果显示于图7D-F。
用免疫缀合物处理肿瘤细胞后对所测试的所有肿瘤细胞系均观察到有效的肿瘤细胞杀伤。与使用游离肽相比,免疫缀合物比浓度高100倍的游离肽更加有效地介导T细胞激活。
用免疫缀合物处理后6小时就已经能观察到由免疫缀合物介导的肿瘤细胞杀伤,指示肽不需要转运至胞质溶胶中的抗原加工机构来经MHC I类呈递。另外,观察到肿瘤细胞杀伤随时间过程的升高,与之对比,由游离肽介导的肿瘤细胞杀伤通常在更高的温育时间中降低。在不同肿瘤细胞系中观察到相似的作用,指示作用不依赖于靶细胞中MHC I类表达的水平。xCELLigence分析的结果得到LDH释放测定法的结果确认。
实施例10:概念I的体内证据
包含单克隆抗CDCP1抗体和EBV肽的依照本发明的免疫缀合物在静脉内转移huPBMC(包含EBV特异性CD8 T细胞)的MDA-MB231皮下模型中的抗肿瘤活性
在第0天经皮下注射给NOG小鼠异种移植人肿瘤细胞(5x106个MDA-MB231)。经静脉内转移10x106在第0天和第20天应用两次人PBMC刺激(～10％CLG肽EBV特异性CD8 T细胞)(见图8A中的详情)。抗体/免疫缀合物的处理日程表如下:
<CDCP1>-IgG4-SS-CLG肽(如实施例3中所述生成,具有IgG4恒定链):
5mg/kg(在第0,3,6,9,13,16,20,23,27,30天)
对照抗体:<CDCP1>-IgG4(IgG4恒定链):
5mg/kg(在第0,3,6,9,13,16,20,23,27,30天)
测试方案和结果显示于图8A和B。结果证明包含单克隆抗CDCP1抗体的依照本发明的免疫缀合物在具有过继转移CLG特异性huPBMC的MDA-MB231皮下异种移植物模型中的体内功效。
实施例11:概念II的体内证据
包含单克隆抗CDCP1抗体和EBV肽的依照本发明的免疫缀合物与抗PD-1处理组合在静脉内转移huPBMC(包含EBV特异性CD8 T细胞)的已建立MDA-MB231皮下模型中的抗肿瘤活性
在第0天经皮下注射给NOG小鼠异种移植人肿瘤细胞(5x106Mio个MDA-MB231)。经静脉内转移10x106在第20天和第32天应用两次人PBMC刺激(～10％CLG肽EBV特异性CD8 T细胞)(见图8A中的详情)。测试缀合物<CDCP1>-IgG1-PGLala-SS-CLG肽(如实施例3中所述生成,具有带Fc部分中的突变L234A,L235A和P329G(Kabat EU索引)的IgG1恒定链)的测试组和对照抗体<CDCP1>-IgG1PGLALA的对照组的处理日程表如下(两组均添加抗PD1抗体):
测试方案和结果显示于图9A和B。结果证明包含单克隆抗CDCP1抗体的依照本发明的免疫缀合物加抗PD-1疗法在具有过继转移EBV CLG特异性huPBMC的MDA-MB231异种移植物模型中的组合效果。显示了用ATPP与抗PD-1抗体组合处理后肿瘤中CLG特异性T细胞的强烈增多。
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann-La Roche AG）
<120> 用于特异性诱导针对靶细胞的T细胞细胞毒性的免疫缀合物
<130> P32622-WO
<150> EP15155598
<151> 2015-02-18
<150> EP15199306
<151> 2015-12-10
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人疱疹病毒5
<220>
<221> 混杂特征
<223> 人疱疹病毒5 (CMV)肽pp65 495-503
<400> 1
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 埃巴二氏病毒
<220>
<221> 混杂特征
<223> 埃巴二氏病毒(EBV)肽LMP-2 426-434
<400> 2
Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<220>
<221> 混杂特征
<223> 甲型流感病毒(FLU)肽NP 44-52
<400> 3
Cys Thr Glu Leu Lys Leu Ser Asp Tyr
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 埃巴二氏病毒
<220>
<221> 混杂特征
<223> 埃巴二氏病毒(EBV)肽BLMF-1 280-288
<400> 4
Gly Leu Cys Thr Leu Val Ala Met Leu
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人疱疹病毒5
<220>
<221> 混杂特征
<223> 人疱疹病毒5 (CMV)肽309-317
<400> 5
Cys Arg Val Leu Cys Cys Tyr Val Leu
1 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰人疱疹病毒5 (CMV)肽pp65 495-503 (cCMV肽)
<400> 6
Cys Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5 10
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰人疱疹病毒5 (CMV)肽pp65 495-503 (CMVc肽)
<400> 7
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val Cys
1 5 10
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰人疱疹病毒5 (CMV)肽pp65 495-503 (rcCMV肽)
<400> 8
Cys Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰人疱疹病毒5 (CMV)肽pp65 495-503 (CMVrc肽)
<400> 9
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Cys
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰人疱疹病毒5 (CMV)肽pp65 495-503 (CMVpen肽)
<220>
<221> 混杂特征
<223> Xaa是青霉胺
<220>
<221> 混杂特征
<222> (9)..(9)
<223> Xaa可以是任何天然发生氨基酸
<400> 10
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Xaa
1 5

Claims (16)

1.一种免疫缀合物,其包含至少一个经可切割键与靶细胞结合模块偶联的经MHC I类可呈递的T细胞应答引发肽,其中该可切割键安排成使得一旦切割,经MHC I类分子直接可呈递的所述T细胞应答引发肽自该免疫缀合物释放。
2.依照前述权利要求任一项的免疫缀合物,其中该T细胞应答引发肽是天然发生T细胞应答引发肽。
3.依照前述权利要求任一项的免疫缀合物,其中该T细胞应答引发肽包含至少一个半胱氨酸残基。
4.依照前述权利要求任一项的免疫缀合物,其中该可切割键是通过化学,pH依赖性或酶促切割可切割的。
5.依照前述权利要求任一项的免疫缀合物,其中该可切割键是在该靶细胞的内体隔室内可切割的。
6.依照前述权利要求任一项的免疫缀合物,其中该靶细胞是肿瘤细胞。
7.依照前述权利要求任一项的免疫缀合物,其能够内在化入该靶细胞。
8.依照前述权利要求任一项的免疫缀合物,其中该免疫缀合物不包含转运域。
9.依照前述权利要求任一项的免疫缀合物,其中在该免疫缀合物内在化入该靶细胞后少于12小时内,该T细胞应答引发肽经MHC I类分子在该靶细胞的表面上呈递。
10.一种药物组合物,其包含与药学可接受载剂组合的依照前述权利要求任一项的免疫缀合物。
11.经MHC I类可呈递的T细胞应答引发肽用于生成依照权利要求1至9任一项的免疫缀合物的用途。
12.依照权利要求1至9任一项的免疫缀合物用于特异性诱导针对靶细胞的T细胞细胞毒性的用途。
13.一种用于生成依照权利要求1至9任一项的免疫缀合物的方法,其包含下述步骤:
a)提供重组靶细胞结合模块,
b)提供T细胞应答引发肽,
c)经可切割键偶联至少一个所述T细胞应答引发肽与所述靶细胞结合模块。
14.依照权利要求13的方法,其中偶联未修饰的T细胞应答引发肽与该靶细胞结合模块。
15.依照权利要求1至9任一项的免疫缀合物,其用作药物。
16.一种治疗罹患疾病的患者的方法,其通过对需要此类治疗的患者施用依照权利要求1至9任一项的免疫缀合物来进行。
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