KR20170116039A - 표적 세포에 대항하여 t 세포 세포독성을 특이적으로 유도하기 위한 면역컨주게이트 - Google Patents

표적 세포에 대항하여 t 세포 세포독성을 특이적으로 유도하기 위한 면역컨주게이트 Download PDF

Info

Publication number
KR20170116039A
KR20170116039A KR1020177022471A KR20177022471A KR20170116039A KR 20170116039 A KR20170116039 A KR 20170116039A KR 1020177022471 A KR1020177022471 A KR 1020177022471A KR 20177022471 A KR20177022471 A KR 20177022471A KR 20170116039 A KR20170116039 A KR 20170116039A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
peptide
cell
immunoconjugate
target cell
cell response
Prior art date
Application number
KR1020177022471A
Other languages
English (en)
Inventor
세바스티안 지아데크
알렉산더 리프케
발레리아 리프케
라르스 힐링하우스
Original Assignee
에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에프. 호프만-라 로슈 아게 filed Critical 에프. 호프만-라 로슈 아게
Publication of KR20170116039A publication Critical patent/KR20170116039A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation

Abstract

본 발명은 절단가능한 결합을 통해 표적 세포 결합 모이어티(moiety)에 커플링되고 MHC 클래스(class) I을 경유하여 제시될 수 있는 적어도 하나의 T 세포 반응 유발 펩타이드를 포함하는, 표적 세포에 대항하여 T 세포 세포독성을 특이적으로 유도하기 위한 면역컨주게이트, 이의 제조 방법, 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

표적 세포에 대항하여 T 세포 세포독성을 특이적으로 유도하기 위한 면역컨주게이트
본 발명은 표적 세포 결합 모이어티(moiety)에 커플링되고 MHC 클래스(class) I을 경유하여 제시될 수 있는 적어도 하나의 T 세포 반응 유발 펩타이드를 포함하는, 표적 세포에 대항하여 T 세포 세포독성을 특이적으로 유도하기 위한 면역컨주게이트, 이의 제조 방법, 및 이의 용도에 관한 것이다.
T 세포는, B 세포와 대조적으로, 가공된 항원으로부터 유래된 펩타이드를 인식하고, 이는 주요 조직적합성 복합체(MHC: major histocompatibility complex)의 자가유래의 세포 표면 분자를 경유하여 세포 표면 상에 제시된다.
MHC 클래스 II(MHC II)를 경유한 항원 제시에 대하여, 외인성 단백질이 식세포작용 및 세포내섭취(endocytosis)를 통해 MHC II에 접근하고 내생성 단백질이 자가소화작용을 통해 MHC II에 접근한다고 현재 생각되고 있다. 항원은 포식소체(phagosome), 엔도솜(endosome) 또는 자가포식소체에서 MHC II 분자에 결합하기 위해 적절한 길이(대략 10 내지 16개 아미노산)의 펩타이드 항원(펩타이드 에피토프)으로 가공된다. 적재되지 않은 MHC II αβ-쇄 이량체는 소포체(ER: endoplasmic reticulum)에서 불변성 쇄(Ii)와 함께 9량체 복합체로서 조립되고, 이는 프리-리소좀(pre-lysosomal) 구획에서 미성숙 펩타이드 또는 단백질 상호작용에 대항하여 보호한다. 이러한 복합체는 리소좀성 MHC II 구획으로 운송되고, 여기서 불변성 쇄는 순차적으로 단백질 가수분해된다. 최종 절단 생성물인, 클래스 II-회합된 Ii 펩타이드(CLIP)로서 공지된 펩타이드는 펩타이드-결합 홈(groove)을 점유하고, 이는 MHC II 분자가 고-친화도 펩타이드(MHC II 제한된 펩타이드)로 적재되기 이전에 방출되어야 한다[웨어쉬(Wearsch P) 및 크레스웰(Creswell P)의 문헌 "Nat. Rev. Immunol.: 항원 가공 및 제시(Antigen processing and presentation)", 온라인에서 이용가능한 포스터(Poster available online), http ://www.nature.com/nri/posters/antigenprocessing].
세포 표면 상의 펩타이드-적재된 MHC II로의 나이브(naive) CD4 T 세포의 결합은 나이브 CD4 T 세포를 프라이밍(priming)시켜 효과기 T 세포(Th1, Th2, Th17) 또는 기억 T 세포로 분극화시킴으로써 항원에 대한 면역화를 중재한다. 다르게는 APC의 미세환경에서 국소적 환경(예를 들어 사이토킨 균형)에 의존하여, 나이브 CD4 T 세포의 펩타이드-적재된 MHC II로의 결합은 나이브 CD4 T 세포를 프라이밍시켜 조절성 T 세포(T조절)로 분극화시킴으로써 항원에 대한 면역 내인성을 중재할 수 있다.
MHC II 분자는 정상적으로 단지 항원 제시 세포 상에서만 발생하지만, 대식세포, B 세포 및 수지상 세포와 마찬가지로, MHC 클래스 I(MHC I)은 모든 유핵 세포 상에서 발생한다.
MHC 클래스 I(MHC I)을 경유하는 항원 제시에 대한 현재 상정되는 기작은, 세포 내부에서 생산되는 내생성 항원, 예컨대 바이러스성 단백질 또는 자가유래의 단백질이 프로테아좀(proteasome) 및 시토졸의 프로테아제에 의해 시토졸 내부에서 펩타이드로 가공된다는 것이다. 이어서 이들 펩타이드는 항원 가공과 연관된 수송자(TAP: transporter associated with antigen process) 복합체로 지칭되는 특정한 펌프를 통해 ER로 수송되고, 여기서 이들은 ER 아미노펩티다아제(ERAP: ER aminopeptidases)에 의해 추가로 정돈되어 8 내지 12개의 아미노산의 펩타이드를 생산한다.
세포, 우선적으로 전문적 항원 제시 세포(APC: antigen presenting cell), 예컨대 수지상 세포 또는 대식세포 내로 내재화되는 외인성 단백질의 펩타이드 에피토프가 또한 MHC I에 의해 제시될 수 있는 것으로 입증되었다. 이는 포식소체 또는 엔도솜으로부터의 상기 단백질의 역전좌(retrotranslocation)를 뒷받침하는 외인성 단백질에 포함된 전좌 도메인의 존재에 기인하고, 이로써 세포의 세포질내로 단백질을 이끈다[도넬리(Donnelly JJ) 등의 문헌 "Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Apr 15;90(8):3530-4"; 웨어쉬(Wearsch P) 및 크레스웰(Creswell P)의 문헌 "Nat. Rev. Immunol.: 항원 가공 및 제시(Antigen processing and presentation)", 온라인에서 이용가능한 포스터, http://www.nature.com/nri/posters/antigenprocessing].
MHC I 중쇄-β2-마이크로글로불린 이종이량체와 짧은 펩타이드의 조립은 펩타이드-적재 복합체에 의해 조정되는데, 이는 타파신(tapasin) 및 ERp57의 디설파이드-연결된 이량체, 칼레티큘린(calreticulin)(CRT) 및 TAP 분자로 구성된다. 타파신은 또한 세포 표면 상에서 안정한 펩타이드-MHC I 복합체를 제시하기 위해 펩타이드 편집이 선택되도록 뒷받침한다[웨어쉬(Wearsch P) 및 크레스웰(Creswell P)의 문헌 "Nat. Rev. Immunol.: 항원 가공 및 제시(Antigen processing and presentation)", 온라인에서 이용가능한 포스터, http://www.nature.com/nri/posters/antigenprocessing]. 일단 펩타이드가 MHC I 분자 상으로 적재되면, 펩타이드-적재 복합체는 해리되고 펩타이드-적재된 MHC I은 분비 경로를 통해 ER을 떠나 세포 표면에 도달한다. ER의 내강에서 MHC I 분자에 결합하지 못한 펩타이드는 ER로부터 제거되어 sec61 채널(channel)을 경유하여 시토졸내로 이동되고, 여기서 이들은 추가로 크기가 정돈될 수 있고, MHC I 분자로의 결합을 위해 TAP에 의해 ER로 다시 전좌될 수 있다[쿠프만(Koopmann JO), 알브링(Albring J), 휘터(Huter E) 등의 문헌 "(July 2000) Immunity, 13 (1): 117-27."; 알브링(Albring J), 쿠프만(Koopmann JO), 해머링(Hammerling GJ), 몸부르그(Momburg F)의 문헌 "(January 2004), Mol. Immunol. 40 (10): 733-41"].
세포 표면 상의 MHC I 분자는 이들의 적재된 펩타이드를 세포독성 CD8 T 림프구(CD8 T 세포, 또한 CTL로 지칭됨)에 제공한다. CTL은 세포를 촉발시키고, 이는 펩타이드 에피토프를 MHC I을 경유하여 제시시켜, 세포자멸(apoptosis)에 의한 계획된 세포 사멸을 겪는다. 이와 같이, MHC I은 세포-중재된 면역력을 중재하고, 이는 세포내 병원체, 뿐만 아니라 돌연변이되거나 비정상적인 단백질을 발현하는 자가 세포를 설명하기 위한 면역 시스템의 우선적 의미이다.
지난 몇년 동안 연구는 세포내 병원체에 의해 영향받지 않는 다양한 병에 걸린 세포(예를 들어 종양 세포)의 사멸을 유도하기 위해 세포-중재된 면역력을 유도하는 기작을 탐구하는데 초점이 맞춰져 왔다. 모든 유핵 세포가 MHC I을 발현하므로, MHC I을 경유하여 세포내 병원체의 항원 제시를 유도하는 것은 다양한 병에 걸린 세포 집단, 예를 들어 종양 세포 상에서 CTL을 경유하여 계획된 세포 사멸을 유도하는 유망한 접근법이다.
이와 관련하여, 표적 세포에 결합하는 결합 파트너 및 특정의 병에 걸린 세포 집단에 대한 세포내 병원체의 펩타이드 부분으로 구성되어 MHC I를 통해 병에 걸린 세포의 표면 상에서 전달 펩타이드의 가공된 단편의 제시를 유도하는 면역컨주게이트에 의해 세포내 병원체, 예를 들어 바이러스로부터 유래된 항원을 전달시키는 접근법들이 개발되어 왔다. 이어서 병에 걸린 세포는 CTL에 의해 제거될 것이다.
하나의 접근법이 EP 제0659439 A1호에 개시되어 있다. EP 제0659439 A1호는 바이러스 유래된 펩타이드(변형된 인플루엔자 매트릭스 펩타이드 57-68) 또는 박테리아 유래된 펩타이드[플라스모디움 베르게이(Plasmodium bergei) 펩타이드 249-260]가 표적 세포 결합 항체에 커플링된 면역컨주게이트를 개시한다. 개개의 펩타이드는 N-말단 시스테인 잔기의 첨가 및 SPDP-연결기를 경유한 항체로의 후속적인 가교결합에 의해 항체에 커플링되어 면역컨주게이트를 생산한다. 내재화시, 첨가된 N-말단 시스테인 잔기를 포함하는 개개의 펩타이드는 컨주게이트로부터 나눠지고, 세포 내에서 추가로 가공되고 MHC I에 의해 제시된다. 그러나, 면역컨주게이트의 IC50 값은 매우 높았다(0.5 μ몰/ℓ).
EP 제0659439 A1호에 따른 접근법에서 기재된 바와 같이, 주된 도전은 외인성 항원에 대항하여 MHC I 제한된 CTL 반응을 자극하는 것이다. 대부분의 경우, 항원이 외인성으로 제공되는 경우, 이는 세포질(이로부터 항원은 MHC I 경로로 수송될 수 있음)로 이동되지 않는다.
가공시 MHC I을 경유하여 제시될 수 있는 펩타이드를 포함하는 면역컨주게이트에 대한 IC50 값을 개선시키기 위한 하나의 방법론이 EP 0659439 A1호에 제안되어 있다. 여기서, 역전좌를 통해 세포질로 면역컨주게이트를 이동시키기 위해 면역컨주게이트에 전좌 도메인을 포함시키는 것이 권고된다. 그러나, EP 제0659439 A1호는 이러한 방법론에 관한 결과를 입증하지 않는다.
따라서, 세포-중재된 면역력을 유도함으로써 표적 세포의 사멸을 유도하기 위한 개선된 접근법에 대한 필요성이 여전히 남아있다.
본 발명은 절단가능한 결합을 통해 표적 세포 결합 모이어티에 커플링되고 MHC 클래스 I을 경유하여 제시될 수 있는 적어도 하나의 T 세포 반응 유발 펩타이드를 포함하는 면역컨주게이트에 관한 것이다. 면역컨주게이트 내에서, 절단가능한 결합은, 절단시 MHC 클래스 I 분자를 경유하여 직접적으로 제시될 수 있는 상기 T 세포 반응 유발 펩타이드가 면역컨주게이트로부터 방출되도록 배열된다.
본 발명의 하나의 실시태양은 T 세포 반응 유발 펩타이드가 자연적으로 발생하는 T 세포 반응 유발 펩타이드인 면역컨주게이트에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 실시태양은 T 세포 반응 유발 펩타이드가 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 자연적으로 발생하는 T 세포 반응 유발 펩타이드인 면역컨주게이트에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 실시태양은 절단가능한 결합이 표적 세포의 엔도솜 구획 내에서 절단될 수 있는 면역컨주게이트에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 실시태양은 면역컨주게이트가 전좌 도메인을 포함하지 않는 면역컨주게이트에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 실시태양은 면역컨주게이트가 표적 세포 내로 내재화된 후 12 시간 이내에 T 세포 반응 유발 펩타이드가 MHC 클래스 I 분자를 경유하여 표적 세포의 표면 상에 제시되는 면역컨주게이트에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 면역컨주게이트를 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 약학 조성물이다.
본 발명의 또 다른 양태는 표적 세포에 대항하여 T 세포 세포독성을 특이적으로 유도하기 위한 본 발명에 따른 면역컨주게이트의 용도이다.
본 발명의 또 다른 양태는
a) 재조합 표적 세포 결합 모이어티를 제공하는 단계,
b) T 세포 반응 유발 펩타이드를 제공하는 단계, 및
c) 적어도 하나의 상기 T 세포 반응 유발 펩타이드를 상기 표적 세포 결합 모이어티에 절단가능한 결합을 통해 커플링시키는 단계
를 포함하는, 본 발명에 따른 면역컨주게이트의 제조 방법이다.
본 발명의 하나의 실시태양은 변형되지 않은 T 세포 반응 유발 펩타이드를 표적 세포 결합 모이어티에 커플링시키는 면역컨주게이트의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 면역컨주게이트이다.
본 발명의 또 다른 양태는 암을 치료하기 위한, 암 세포 결합 모이어티를 포함하는 본 발명에 따른 면역컨주게이트이다.
본 발명의 또 다른 양태는 감염성 질환, 자가면역 질환, 당뇨병 또는 알러지의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 면역컨주게이트이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 면역컨주게이트를 질환의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 앓는 환자를 치료하는 방법이다.
본 발명에 따라서 면역컨주게이트로부터 절단된 T 세포 반응 유발 펩타이드는 표적 세포 내에서 추가의 가공 또는 정돈없이 MHC 클래스 I 분자를 경유하여 직접적으로 제시될 수 있다. T 세포 반응 유발 펩타이드는 면역컨주게이트의 내재화시 표적 세포의 엔도솜 구획 내에서 면역컨주게이트로부터 절단되고, 펩타이드는 엔도솜 구획에서 MHC 클래스 I 분자 상으로 직접적으로(즉, 추가의 가공이나 정돈없이) 적재되고, MHC 클래스 I을 경유하여 제시를 위한 표적 세포 표면으로 수송된다. 놀랍게도, 당분야에 공지된 접근법과 비교할 경우 상당히 더 낮은 IC50 값이 도달된다.
도 1은 상이한 종양 세포주 및 세포 배양 배지를 사용하여 IFNγ-ELISPOT에 의해 측정될 경우 변형된 CMV 펩타이드에서의 감소된 T 세포 활성화를 도시한다. a) RPMI+에서의 MDA-MB231 세포, b) AIM-V에서의 MDA-MB231 세포, c) RPMI+에서의 HCT-116 세포, d) AIM-V에서의 HCT-116 세포, e) RPMI+에서의 T2 세포. 분석은 지시된 바와 같이 13,245 μΜ 또는 1,3245 μΜ의 펩타이드 농도를 사용하여 수행되었다.
도 2는 본 발명에 따른 면역컨주게이트의 작용에 대한 제안된 방식을 도시한다. A: 면역컨주게이트의 표적 세포로의 결합. B: 면역컨주게이트의 엔도솜 구획 내로의 내재화. C: 엔도솜 구획에서 면역컨주게이트로부터의 T 세포 반응 유발 펩타이드의 방출. D: 엔도솜 구획에서 방출된 펩타이드에 의한 MHC I 분자의 적재. E: 펩타이드-적재된 MHC I 분자의 표적 세포 표면로의 이동. F: 표적 세포에서 세포 사멸을 유도하는 펩타이드 특이적 CD8 T 세포에 의한 표적 세포 표면 상에서의 펩타이드-적재된 MHC I 분자의 인식.
도 3은 EBV 및/또는 FLU 펩타이드에 커플링된 항-CDCP1 항체를 포함하는 면역컨주게이트의 CDCP1 발현 MDA-MB231 세포로의 결합을 도시한다.
도 4는 EBV 및/또는 FLU 펩타이드에 커플링된 항-CDCP1 항체를 포함하는 면역컨주게이트의 CD19 발현 RL 세포로의 결합을 도시한다.
도 5는 펩타이드-특이적 T 세포 활성화를 위하여 본 발명에 따른 면역컨주게이트를 사용한 IFN-γ ELISPOT의 결과를 도시한다. 지시된 농도는 펩타이드 농도를 지칭한다. a) 단일클론성 항-CDCP-1 항체 및 HLA-A2 제한된 EBV 펩타이드를 포함하는 면역컨주게이트에 의해 치료된 CDCP-1-발현 HCT-116 세포. b) 단일클론성 항-CD19 항체 및 HLA-A2 제한된 EBV 펩타이드를 포함하는 면역컨주게이트에 의해 치료된 CD19-발현 HLA-A2-양성 RL 및 HLA-A2-음성 라모스(Ramos) 세포. c) 단일클론성 항-CDCP-1 항체 및 HLA-A2 제한된 EBV 펩타이드를 포함하는 면역컨주게이트에 의해 치료된 상이한 CDCP-1-발현 종양 세포.
도 6은 엑스셀리겐스(xCELLigence) 및 LDH 방출 검정에 의해 평가된 지시된 종양 세포의 종양 세포 사멸을 도시한다. (a) HLA-A2 제한된 EBV-펩타이드에 커플링된 항-CDCP1 항체를 포함하는 면역컨주게이트에 의해 중재된 HLA-A2-양성 MDA-MB231 세포의 종양 세포 사멸. (b) 비-말단 시스테인 잔기를 갖는 HLA-A2 제한된 EBV-펩타이드에 커플링된 항-CDCP1 항체를 포함하는 면역컨주게이트에 의해 중재된 A-375 세포의 특이적 사멸. (c) 비-말단 시스테인 잔기를 갖는 HLA-A2 제한된 EBV-펩타이드에 커플링된 항-CDCP1 항체를 포함하는 면역컨주게이트에 의해 중재된 HLA-A2-양성 MDA-MB231 세포의 특이적 사멸. 지시된 농도는 펩타이드 농도를 지칭한다.
도 7은 HLA-A1 제한된 FLU-펩타이드를 포함하는 면역컨주게이트에 의해 중재된 HLA-A1-양성 종양 세포의 종양 세포 사멸을 도시한다. a 내지 c) 6, 10 및 18 시간 후 엑스셀리겐스 검정에 의해 측정된 결과. d 내지 f) LDH 방출 검정에 의해 측정된 결과. a 및 d) 1:1 및 1:2의 효과기 세포 대 표적 세포중의 A-375 세포 비(E:T), b 및 e) HCT-116 세포, c 및 f) PC3 세포.
도 8은 huPBMC가 정맥내 전달된 MDA-MB231 s.c. 모델에서 단일클론성 항-CDCP1 항체를 포함하는 본 발명에 따른 면역컨주게이트의 항-종양 활성을 도시한다. 시험 체계(도 8a) 및 결과(도 8b).
도 9는 huPBMC가 정맥내 전달된 확립된 MDA-MB231 s.c. 모델에서, 항-PD1 치료와 조합된, 단일클론성 항-CDCP1 항체를 포함하는 본 발명에 따른 면역컨주게이트의 항-종양 활성을 도시한다. 시험 체계(도 9a), 종양 성장 저해의 결과(도 9b) 및 T 세포 증가(도 9c).
1. 정의
용어 "면역컨주게이트"는 본원에 사용될 경우 이종성 기능성 분자에 커플링된 표적 세포 결합 모이어티(예를 들어 표적 세포에 특이적으로 결합하는 항체 또는 표적 세포 상의 그의 수용체에 결합하는 리간드)를 지칭한다. 본 발명에 따른 면역컨주게이트에 본질적으로 존재하는 기능성 분자는 T 세포 반응 유발 펩타이드이다. 추가적으로, 추가의 기능성 분자, 예컨대 세포독성제가 사용될 수 있다.
"표적 세포 결합 모이어티"는 본원에 사용될 경우 표적 세포에 특이적으로 결합하는 모이어티를 지칭한다. 이 용어는 항체 뿐만 아니라 표적 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 다른 천연(예를 들어 수용체, 리간드) 또는 합성(예를 들어 DARPins) 분자를 포함한다. "표적 세포에 특이적으로 결합하는"은, 본원에 사용될 경우, 상기 모이어티가 복합 혼합물 내에서 표적 세포에 우선적으로 결합함을 의미한다.
표적 세포 결합 모이어티의 표적 세포로의 결합의 친화도는 용어 ka(단백질/표적 세포 복합체로부터의 단백질의 회합에 대한 반응 속도 상수), kD(해리 상수), 및 KD(kD/ka)에 의해 정의된다. 표적 세포 결합 모이어티가 항체인 하나의 실시태양에서, 표적 세포로의 특이적인 결합은 10-8 몰/ℓ 이하의 결합 친화도(KD)를 의미하고, 하나의 실시태양에서, 10-8 M 내지 10-13 몰/ℓ이다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고 다양한 항체 구조물, 예컨대 제한되지 않지만 단일클론성 항체, 다중클론성 항체, 다중특이성 항체(예를 들어 이중특이성 항체), 및 항체 단편을, 이들이 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 내포한다.
용어 "리간드"는 본원에서 생물학적 목적을 제공하기 위해 표적 세포 상에서 생물분자와 함께 복합체를 형성하는 분자, 바람직하게는 단백질에 대해 사용된다. 하나의 실시태양에서, 리간드는 제한된 유형의 수용체에 결합하는 경향을 갖는 선택적 리간드이다.
"펩타이드"는 본원에 사용될 경우 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산 단량체의 짧은 쇄이다. MHC 클래스 I에 결합하는 펩타이드는 전형적으로 8 내지 12개 아미노산의 길이이다. 용어 "MHC 클래스 I을 경유하여 제시될 수 있는 T 세포 반응 유발 펩타이드"는 본원에 사용될 경우 MHC 클래스 I 분자를 경유하여 제시될 수 있지만 MHC 클래스 II를 경유하여 제시가능하지 않고 CD8 T 세포 반응을 촉발시키는 펩타이드를 지칭한다. 간소화를 위해, 이 용어는 본원에서 또한 단지 "T 세포 반응 유발 펩타이드"로서 지칭될 수 있다.
본 발명의 범주 내에서 사용되는 T 세포 반응 유발 펩타이드는 전형적으로 비-자가(즉 비-인간) 병원성 근원으로부터 유래된다. 이와 관련하여 용어 "..로부터 유래된"은 T 세포 반응 유발 펩타이드가 비-자가 병원성 근원의 자연적으로 발생하는 T 세포 에피토프와 동일함(즉 동일한 아미노산 서열을 공유함)을 의미한다. 달리 말하면, T 세포 반응 유발 펩타이드의 아미노산 서열은 비-자가 병원성 근원의 단백질 항원의 아미노산 서열의 일부 서열과 동일하다. T 세포 반응 유발 펩타이드의 병원성 근원이 바이러스 또는 박테리아 기원일 수 있지만, 전형적으로, MHC I 제시가능한 T 세포 반응 유발 펩타이드는 세포내 또는 세포외 병원체로부터 유래된다. 세포내 병원체로는 바이러스, 세포내 박테리아 또는 기생충이 포함된다. 세포외 병원체로는 기생충 및 박테리아가 포함된다. 비록 본 발명에 사용되는 T 세포 반응 유발 펩타이드가 상응하는 자연적으로 발생하는 T 세포 에피토프와 동일한 아미노산 서열을 공유하지만, 본 발명에 따른 면역컨주게이트의 T 세포 반응 유발 펩타이드는 전형적으로 합성 기원이다.
당분야에서, 표적 세포에 대항하여 T 세포 세포독성을 유도하기 위해 사용되는 세포내 병원체로부터 유래된 펩타이드는, 이들의 생리학적 특성, 예를 들어 이들의 용해도를 개선시키기 위해 아미노산 치환 또는 부가에 의해 때때로 변형된다. 그러나 본 발명의 경우 단지 자연적으로 발생하는 T 세포 반응 유발 펩타이드(즉 추가의 아미노산 서열 변형을 포함하지 않고 야생형 병원성 펩타이드의 아미노산 서열을 공유하는 펩타이드)만이 사용된다.
"자연적으로 발생하는"은 본원에 사용될 경우 표적 세포 결합 모이어티에 커플링되고 MHC 클래스 I을 경유하여 제시될 수 있는 T 세포 반응 유발 펩타이드가 MHC 클래스 I을 경유하여 제시될 수 있는 상응하는 비-자가 병원성 T 세포 에피토프의 아미노산 서열을 공유함(즉 이로 구성됨)을 의미한다. 달리 말하면, T 세포 반응 유발 펩타이드는 표적 세포 내에서 상응하는 자연적으로 발생하는 비-자가 병원체의 절단에 의해 생산가능한 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열로 구성된다. 이에 따라, 본 발명의 용어 내에서 "자연적으로 발생하는 T 세포 반응 유발 펩타이드" 또는 "MHC 클래스 I을 경유하여 제시될 수 있는 자연적으로 발생하는 T 세포 반응 유발 펩타이드"는 합성 기원일 수 있지만, 그의 아미노산 서열은, 상응하는 자연적으로 발생하는 비-자가 병원체의 절단에 의해 생산가능한 펩타이드와 비교하여, 아미노산 변형, 특별히 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 전혀 포함하지 않는다. 다시 한번 달리 말하자면, 표적 세포 결합 모이어티에 커플링된 자연적으로 발생하는 T 세포 반응 유발 펩타이드의 아미노산 서열은 비-자가 병원체의 단백질 항원의 아미노산 서열의 일부 서열(하나의 바람직한 실시태양에서 8 내지 12개의 아미노산 길이)과 동일하다.
T 세포 반응 유발 펩타이드가 별개의 아미노산 잔기를 "자연적으로 포함하는"이라고 언급하는 것은 상응하는 이러한 별개의 아미노산 잔기가 자연적으로 발생하는 T 세포 반응 유발 펩타이드 내에서 동일한 위치에 존재함을 의미한다. 이에 따라, 시스테인 잔기를 자연적으로 포함하는 T 세포 반응 유발 펩타이드는, 상기 T 세포 반응 유발 펩타이드의 아미노산 서열에 상응하는 비-자가 병원체의 단백질 항원의 아미노산 서열의 일부 서열이 동일한 위치에서 시스테인 잔기를 포함하는 비-자가 병원체로부터 유래된 펩타이드를 의미한다.
T 세포 반응 유발 펩타이드가 야생형 병원성 T 세포 에피토프와 관련하여 "아미노산 서열 변형이 없이" 제공되는 것으로 표시되는 경우, 펩타이드의 아미노산 서열이 비-자가 병원체의 상응하는 자연적으로 유래가능한 T 세포 에피토프(즉 상응하는 자연적으로 발생하는 비-자가 병원체의 절단에 의해 생산가능한 T 세포 에피토프)의 아미노산 서열과 동일함을 의미한다. 특별히, 펩타이드의 아미노산 서열은 자연적으로 발생하는 펩타이드와 비교할 경우 아미노산 잔기의 부가, 결실 또는 치환을 포함하지 않는다.
용어 "아미노산"은 본원에 사용될 경우 카복실기에 대해 α-위치에 위치된 아미노 모이어티를 소유하는 유기 분자를 표시한다. 아미노산의 예로는 아르기닌, 글리신, 오르니틴, 라이신, 히스티딘, 글루탐산, 아스파라긴산, 이소류신, 류신, 알라닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 메티오닌, 세린, 프롤린이 포함된다. 사용된 아미노산은 각각의 경우 선택적으로 L-형태이다. 아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
특이적 성질을 갖는 아미노산
Figure pct00001
"에피토프"는, 면역 시스템에 의해, 예를 들어, 항체, B 세포 또는 T 세포에 의해 인식되는 단백질 항원의 부분이다. "T 세포 에피토프"는 세포의 표면 상에 제시되고, 여기서 이는 MHC 분자에 결합된다. MHC I에 의해 제시될 수 있는 T 세포 에피토프는 세포독성 CD8 T 림프구(CD8 T 세포 또는 CTL)의 T 세포 수용체에 의해 결합될 수 있다. MHC I에 의해 제시될 수 있는 T 세포 에피토프는 전형적으로 8 내지 12개의 아미노산 길이의 펩타이드이다. 이에 따라, 본원에서 지칭될 경우 "MHC 클래스 I을 경유하여 제시될 수 있는 T 세포 반응 유발 펩타이드"는, 표적 세포에서 가공(예를 들어 하나 이상의 아미노산 잔기의 절단에 의해 가공)될 필요없이, MHC I 복합체에 결합할 수 있는(MHC II에는 결합할 수 없는) 병원체-유래된 펩타이드(하나의 실시태양에서, 8 내지 12개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드)를 의미한다.
본 발명의 용어 내에서 "절단가능한 결합"은 MHC 클래스 I 분자에 의해 직접 제시되기 위해 T 세포 반응 유발 펩타이드가 쪼개지는 것을 허용하는 T 세포 반응 유발 펩타이드 및 표적 세포 결합 모이어티 사이에 배열된 면역컨주게이트 내의 결합에 관련한 것이다. 절단가능한 결합은 T 세포 반응 유발 펩타이드와 직접 연결되어 위치된다. 면역컨주게이트로부터 T 세포 반응 유발 펩타이드의 절단은 임의의 추가적인 아미노산 잔기 없이 그의 기원 아미노산 서열의 T 세포 반응 유발 펩타이드의 방출을 일으킨다.
절단가능한 결합의 유형에 따라서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 절단시 "흔적없이(traceless)" 또는 "흔적을 남기고(non-traceless)" 면역컨주게이트로부터 방출된다. "흔적을 남긴" 방출은, 본원에 사용될 경우 방출된 T 세포 반응 유발 펩타이드가 연결기의 흔적(즉 아미노산(들) 이외의 화학적 모이어티 형태의 흔적)을 포함함을 의미하지만, 단 상기 흔적은 MHC 클래스 I 결합에 간섭하지 않아야 한다. 본 발명의 용어 내에서 "흔적을 남긴 방출"은 본원에서 지칭될 경우 추가적인 아미노산 잔기(들)를 포함하는 T 세포 반응 유발 펩타이드의 방출을 포함하지 않음을 명백히 언급한다. "흔적없는" 방출은 본원에 사용될 경우 방출된 T 세포 반응 유발 펩타이드가 연결기의 어떠한 흔적도 포함하지 않음을 의미한다.
"pH 의존적 절단"은 절단가능한 결합의 절단이 pH의 변화에 의해 촉발됨을 의미한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, pH 의존적 절단은 표적 세포의 엔도솜 구획 내에 존재하는 pH에서 촉발된다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, pH 의존적 절단은 pH 5.5 내지 6.5에서 촉발된다.
"효소적 절단"은 본원에 사용될 경우 일반적으로 펩타이드 결합의 가수분해에 의해 발생되는 면역컨주게이트의 단백질분해적 절단을 의미한다. 효소적 절단은 프로테아제, 예를 들어 푸린(furin)에 의해 일어난다. 효소적 절단에 의해 절단될 수 있는 면역컨주게이트 내에서 절단가능한 결합의 발생은, 예를 들면 펩타이드 연결기를 통해 표적 세포 결합 모이어티에 T 세포 반응 유발 펩타이드를 결합시킴으로써 달성될 수 있다.
T 세포 반응 유발 펩타이드의 표적 세포 결합 모이어티로의 결합은 디설파이드 결합, 에스테르 결합, 화학적 연결기, 펩타이드 연결기에 의해 또는 비-공유 결합에 의해[예를 들어 비오틴(biotin)/스트렙타비딘(streptavidin), 비오틴/테오필린(theophylline)에 의해] 초래된다.
T 세포 반응 유발 펩타이드의 표적 세포 결합 모이어티로의 "공유적 커플링" 또는 "공유 결합"은 T 세포 반응 유발 펩타이드의 원자 및 표적 세포 결합 모이어티의 원자 사이의 전자 쌍의 공유를 비롯한 화학적 결합에 의한 커플링을 의미한다.
T 세포 반응 유발 펩타이드의 표적 세포 결합 모이어티로의 "비-공유적 커플링" 또는 "비-공유 결합"은 전자의 공유를 포함하지 않는 커플링을 의미한다. 비-공유적 커플링의 예로는 면역학적 결합 또는 비오틴/아비딘(avidin), 비오틴/스트렙타비딘 등을 경유하는 결합이 포함된다. 면역학적 결합의 하나의 실시태양에서, 커플링은 면역컨주게이트에 포함된 항체를 경유하여 일어나고, 여기서 항체는 T 세포 반응 유발 펩타이드에 결합되는 유기 분자에 특이적으로 결합한다. 내재화 이후 T 세포 반응 유발 펩타이드를 방출하기 위해, 이러한 실시태양에서 T 세포 반응 유발 펩타이드는 절단가능한 결합을 통해 상기 유기 분자에 커플링된다. 이러한 유기 분자는 바람직하게는 900 Da 이하의 분자량을 갖는 작은 분자이다. 이러한 유기 분자의 예로는 비오틴 및 테오필린이 포함된다.
"펩타이드 연결기" 또는 "연결기 펩타이드"는 본원에 사용될 경우 바람직하게는 합성 기원인 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 지칭한다. 본원에서 사용된 펩타이드 연결기는 절단 자리, 하나의 실시태양에서 프로테아제 절단 자리를 포함하는 기능성 도메인을 포함하거나, 또는 T 세포 반응 유발 펩타이드에 융합될 경우, 펩타이드 연결기는 절단 자리, 하나의 실시태양에서 프로테아제 절단 자리를 생성한다. 본원에서 사용된 펩타이드 연결기의 아미노산 서열은 전형적으로 8 내지 50개 아미노산 잔기의 길이를 갖는다. 하나의 실시태양에서 본원에서 사용된 펩타이드 연결기는 푸린 절단 자리를 포함하고 펩타이드 연결기의 아미노산 서열은 다음을 포함한다:
R-X-R-R(X는 임의의 아미노산 잔기임), 또는
R-X-K-R(X는 임의의 아미노산 잔기임).
본 발명의 용어 내에서 "전좌 도메인"은 시토졸로의 접근을 가능하게 하는 막 전좌에 책임이 있는 구조적 단백질 도메인, 또는 상기 단백질 도메인의 기능성 부분이다. 전좌 도메인에 대한 일예는 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A로부터의 도메인 II이다.
용어 "약학 조성물"은 이에 함유된 활성 구성성분의 생리학적 활성이 효과적이도록 허용하는 형태로 존재하고, 조성물이 투여되는 피험체에 허용가능하지 않도록 독성인 추가적인 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 본 발명의 약학 조성물은 당분야에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 숙련가에 의해 인식될 수 있듯이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 의존하여 달라질 것이다. 투여의 특정 경로에 의해 본 발명에 따른 면역컨주게이트를 투여하기 위해, 면역컨주게이트를 그의 불활성화를 방지하는 물질로 코팅하거나 이와 면역컨주게이트를 공동-투여할 필요가 있을 수 있다. 예를 들면, 면역컨주게이트는 적절한 담체, 예를 들면, 리포솜 또는 희석제 내에서 피험체에게 투여될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 희석제로는 염수 및 수성 완충 용액이 포함된다.
"약학적으로 허용가능한 담체"는 피험체에 무독성인 활성 구성성분 이외의 약학 제형중의 구성성분을 지칭한다. 약학적으로 허용가능함 담체로는 생리학적으로 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항곰팡이제, 등장성 제제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구적, 척추 및 상피 투여에 적합하다(예를 들어 주사 또는 주입에 의함).
본 발명에 따른 약학 조성물은 또한 보조제, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물 존재의 예방은 상기 멸균 절차, 및 다양한 항박테리아제 및 항곰팡이제, 예를 들면, 파라벤(paraben), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등의 포함 둘 다에 의해 확보될 수 있다. 또한 등장성 제제, 예컨대 당분, 염화 나트륨 등을 조성물내로 포함시키는 것이 요망될 수 있다. 또한, 주사가능한 약학 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 포함에 의해 야기될 수 있다.
"비경구적 투여" 및 "비경구적으로 투여되는"이라는 어구는 본원에 사용될 경우 장내 투여 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 대체적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하고, 제한되지 않지만, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 낭내(intracapsular), 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관경유(transtracheal), 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입이 포함된다.
선택된 투여 경로와 무관하게, 적합한 수화된 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 면역컨주게이트, 및/또는 본 발명의 약학 조성물은 당분야의 숙련가에게 공지된 통상적인 방법에 의해 약학적으로 허용가능한 투여형으로 제형화된다.
본 발명의 약학 조성물중의 활성 구성성분의 실제 투여량 수준은, 환자에 대한 독성 없이, 특별한 환자, 조성물 및 투여 방식에 대하여 원하는 치료 반응을 달성하기 위해 효과적인 활성 구성성분의 양을 수득할 수 있도록 다양할 것이다. 선택된 투여량 수준은 이용되는 본 발명의 특별한 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 이용되는 특별한 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 이용되는 특별한 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 증상, 일반적 건강 및 이전의 의학적 병력, 및 의학 분야에 잘 공지된 유사한 인자를 비롯한 다양한 약물동력학적 인자에 의존할 것이다.
조성물은 멸균되고 조성물이 주사기에 의해 전달가능할 정도로 유동성이어야 한다. 물에 더하여, 담체는 바람직하게는 등장성 완충 염 용액이다.
적절한 유동성은, 예를 들면, 코팅제, 예컨대 레시틴(lecithin)의 사용에 의해, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우, 등장성 제제, 예를 들면, 당분, 다가알코올, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨, 및 염화 나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
용어 "세포독성제"는 본원에 사용될 경우 세포 기능을 저해 또는 방지하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 일으키는 물질을 지칭한다. 세포독성제로는, 제한되지 않지만, 방사성 동위원소(예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학치료제 또는 약물(예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입 제제); 성장 억제제; 효소 및 이의 단편, 예컨대 핵용해(nucleolytic) 효소; 항생제; 독소, 예컨대 소분자 독소, 또는 박테리아, 균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소(이의 단편 및/또한 변형물 포함); 및 이후 개시되는 다양한 항종양제 또는 항암제가 포함된다.
용어 "암"은 본원에 사용될 경우 하기 암 중 임의의 것의 불응성 형태 또는 하기 암 중 하나 이상의 조합을 비롯하여, 림프종, 림프성 백혈병, 폐암, 비-소세포 폐암(NSCL), 기관지 폐포 세포 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부암 또는 안구 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부의 암, 위암, 위장관암, 결장암, 유방암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 음문암, 호지킨병(Hodgkin's Disease), 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연부 조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장암 또는 수뇨관 암, 신세포암, 신우암, 중피종, 간암, 담관암, 중추신경계(CNS)의 종양, 척추 종양, 뇌간 교세포종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 신경초종, 상의세포종, 수모세포종, 뇌수막종, 편평세포암종, 뇌하수체 선종 및 에윙스(Ewings) 육종과 같은 증식성 질환을 지칭한다.
용어 "반수 최대 저해 농도"("IC50": half maximal inhibitory concentration)는 시험관 내에서 생물학적 과정의 50% 저해를 수득하기 위해 필요한 특별한 화합물 또는 분자의 농도를 표시한다. IC50 값은 pIC50 값(-log IC50)으로 대수적으로 전환될 수 있고, 여기서 더 높은 값은 기하급수적으로 더 큰 효능을 지시한다. IC50 값은 절대 값이 아니지만 실험적 농도, 예를 들어 이용된 농도에 의존한다. IC50 값은 쳉-프루소프(Cheng-Prusoff) 식을 사용하여 절대 저해 상수(Ki)로 전환될 수 있다(Biochem. Pharmacol. (1973) 22:3099).
"재조합 단백질"은 재조합적으로 조작된 숙주 세포에 의해 생산된 단백질이다. 이는 임의적으로 단리되거나 정제된다.
표적 세포 결합 모이어티가 단백질인 경우, 표적 세포 결합 단백질은 바람직하게는 재조합 수단에 의해 생산된다. 단백질의 재조합 생산을 위한 방법은 당분야에서 널리 공지되어 있고, 원핵 및 진핵 세포에서의 단백질 발현을 포함하고, 단백질의 단리 및 대체적으로 약학적으로 허용가능한 순도로의 정제가 후속된다. 숙주 세포에서 단백질을 발현하기 위해, 단백질 또는 이의 부분을 암호화하는 핵산이 표준 방법에 의해 발현 벡터내로 삽입된다. 발현은 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, PER.C6 세포, 효모, 또는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포와 같은 적절한 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 수행되고, 단백질은 세포(용해 후의 상청액 또는 세포)로부터 회수된다. 항체의 재조합 생산을 위한 일반적 방법은 당분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들면 마크리데스(Makrides, S.C.)의 문헌[Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202]; 가이세(Geisse, S.) 등의 문헌[Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282]; 카우프만(Kaufman, R.J.)의 문헌[Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161]; 웨르너(Werner, R.G.)의 문헌[Drug Res. 48 (1998) 870-880]에 기재되어 있다.
2. 본 발명의 실시태양에 대한 상세한 설명
표적 세포 상에서 표면 수용체에 특이적으로 결합하는 T 세포 특이적 병원성 펩타이드 및 단백질을 포함하는 컨주게이트는 EP 제0 659 437 A1호로부터 공지되어 있다. 그러나, 세포 표면 상에서의 MHC 클래스 I 펩타이드 제시 및 T 세포 활성화의 효능은 EP 제0 659 437 A1호에 개시된 접근법에서 낮았다. 본 발명의 발명자들은, 이러한 이론에 얽매이지 않고, EP 제0 659 437 A1호에 개시된 펩타이드 함유 컨주게이트가 표적 세포 내에서 추가로 가공될 필요가 있다는 사실에 기인하여 이러한 효과가 발생한다는 것을 관찰하였다. 이는 대부분의 경우에 외인성으로 제공된 항원이, 프로테오좀에 의해 가공되고 추가로 MHC 클래스 I 경로로 수송되고 세포 표면 상에서 제시될 수 있는 세포질로 이동되지 않는다는 문제점에 의해 제한된다. 또 다른, 아마도 추가적으로 발생하는 영향은, 특별히 종양 세포 내에서 항원 가공 장치 및 제시 과정에 결함이 있다는 것일 수 있다[페론(Ferrone S.)의 문헌 "Advances in Cancer Research, 93 (2005) 189-234"].
본 발명은 T 세포 특이적 병원성 펩타이드의 MHC 클래스 I 제시를 개선시키는 접근법을 제공한다. 본 발명에 따라서, 면역컨주게이트의 내재화 이후 엔도솜 구획에서 면역컨주게이트로부터 방출된 T 세포 반응 유발 펩타이드는 MHC 클래스 I 복합체로의 결합을 통해 제시에 직접적으로 적합하다(표적 세포 내에서 추가의 가공 또는 정돈을 필요로 하지 않음). T 세포 반응 유발 펩타이드는 엔도솜 구획에서 MHC 클래스 I 분자에 결합되고, 엔도솜 재순환 경로에 의해 MHC 클래스 I과 연관된 표적 세포의 표면으로 향하고[도날드선(Donaldson J.G.)의 문헌 "Nat Rev Mol Cell Biol. Sep 2009; 10(9): 597-608"], 시토졸중의 항원 가공 장치로의 수송 및 세포 내에서의 추가의 가공을 필요로 하지 않는다. 이에 따라, T 세포 반응 유발 펩타이드 및 표적 세포 결합 모이어티는, (절단 후) 그의 기원 아미노산 서열로 구성된 T 세포 반응 유발 펩타이드를 방출하도록, 서로 절단가능한 결합을 통해 커플링된다. 달리 말하면, T 세포 반응 유발 펩타이드가 면역컨주게이트로부터 절단될 경우, 이는 자연적으로 발생하는 T 세포 반응 유발 펩타이드의 아미노산 서열과 비교하여 어떠한 추가적인 아미노산 잔기도 포함하지 않거나, 어떠한 아미노산 잔기도 결핍되지 않는다(즉 방출된 T 세포 반응 유발 펩타이드는 상응하는 자연적으로 발생하는 T 세포 반응 유발 펩타이드와 동일한 길이이다). 이에 기인하여, 본 발명에 따른 면역컨주게이트는 CD8 T 세포 활성화를 중재하고 표적 세포에서 세포 사멸을 유도하는 더욱 적합한 후보이다. 본 발명에 따른 면역컨주게이트에 의해, 표적 세포 용해는, (a) 필요한 면역컨주게이트의 상당히 감소된 양에 의해서 유도되고, (b) 구체적으로, 표적 세포 내에서 추가의 가공을 필요로 하는, 펩타이드가 나눠지는 구조물과 비교될 경우 더욱 신속하다.
본 발명은 절단가능한 결합을 통해 표적 세포 결합 모이어티에 커플링되고 MHC 클래스 I을 경유하여 제시될 수 있는 적어도 하나의 T 세포 반응 유발 펩타이드를 포함하는 면역컨주게이트에 관한 것으로, 여기서 절단가능한 결합은 절단시 MHC 클래스 I 분자를 경유하여 (직접적으로) 제시될 수 있는 상기 T 세포 반응 유발 펩타이드가 면역컨주게이트로부터 방출되도록 배열된다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 표적 세포의 엔도솜 구획에서 방출된다. 본 발명의 또 다른 실시태양에서, 방출된 T 세포 반응 유발 펩타이드는 표적 세포 내에서 추가의 가공없이 MHC 클래스 I을 경유하여 제시될 수 있다.
본 발명은 또한 방출된 T 세포 반응 유발 펩타이드의 아미노산 서열이 자연적으로 발생하는 T 세포 반응 유발 펩타이드의 아미노산 서열과 동일한 면역컨주게이트에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 방출된 T 세포 반응 유발 펩타이드의 아미노산 서열이 표적 세포 결합 모이어티에 커플링된 T 세포 반응 유발 펩타이드의 아미노산 서열과 동일하다.
본 발명은 또한 절단가능한 결합을 통해 표적 세포 결합 모이어티에 커플링되고 MHC 클래스 I을 경유하여 제시될 수 있는 적어도 하나의 T 세포 반응 유발 펩타이드를 포함하는 면역컨주게이트에 관한 것으로, 여기서 절단가능한 결합은 절단시 상기 T 세포 반응 유발 펩타이드가 면역컨주게이트로부터 방출되도록 배열되고, 방출된 T 세포 반응 유발 펩타이드는 표적 세포 결합 단백질에 커플링된 T 세포 반응 유발 펩타이드와 동일한 수의 아미노산으로 구성되며, 방출된 T 세포 반응 유발 펩타이드는 MHC 클래스 I 복합체를 경유한 제시에 적합하다.
본 발명은 또한 절단가능한 결합을 통해 표적 세포 결합 모이어티에 커플링되고 MHC 클래스 I을 경유하여 제시될 수 있는 8 내지 12개의 아미노산 잔기로 구성된 적어도 하나의 T 세포 반응 유발 펩타이드를 포함하는 면역컨주게이트에 관한 것으로, 여기서 절단가능한 결합은 절단시 상기 T 세포 반응 유발 펩타이드가 면역컨주게이트로부터 방출되도록 배열되고, 방출된 T 세포 반응 유발 펩타이드는 표적 세포 결합 모이어티에 결합된 T 세포 반응 유발 펩타이드와 동일한 수의 아미노산으로 구성된다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 8 내지 12개의 아미노산으로 구성된다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 자연적으로 발생하는 T 세포 반응 유발 펩타이드이다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 자연적으로 발생하는 T 세포 반응 유발 펩타이드이다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 N- 또는 C-말단 시스테인 잔기를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 N- 또는 C-말단 시스테인 잔기를 포함하는 자연적으로 발생하는 T 세포 반응 유발 펩타이드이다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 시스테인 잔기를 그의 아미노산 서열의 N-말단 위치(N-말단으로부터 C-말단 방향으로의 위치 1)에 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 자연적으로 시스테인 잔기를 그의 아미노산 서열의 N-말단 위치(N-말단으로부터 C-말단 방향으로의 위치 1)에 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 류신 잔기를 그의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 C-말단 방향으로의 위치 2에 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 류신 잔기를 그의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 C-말단 방향으로의 위치 2에 자연적으로 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 8 내지 12개의 아미노산 잔기로 구성되고, 류신 잔기를 그의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 C-말단 방향으로의 위치 2에 자연적으로 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 면역컨주게이트는 5개 이하의 T 세포 반응 유발 펩타이드를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 면역컨주게이트는 10개 이하의 T 세포 반응 유발 펩타이드를 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 비-자가 병원체로부터 유래되고, 이는 표적 세포의 숙주 유기체의 면역 세포에 의해 인식된다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 세포내 또는 세포외 병원체로부터 유래된다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 세포내 병원체로부터 유래된다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 바이러스성 세포내 병원체로부터 유래된다.
하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 서열 번호 2 내지 서열 번호 5로부터 선택된다.
하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스로부터 유래된다. 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 엡스타인-바르 바이러스로부터 유래되고 서열 번호 2 및 서열 번호 4로부터 선택된다.
하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 인간 헤르페스바이러스(Human herpesvirus) 5로부터 유래된다. 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 인간 헤르페스바이러스 5로부터 유래되고 서열 번호 5를 갖는다.
하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 인플루엔자(Influenza) A로부터 유래된다. 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 인플루엔자 A로부터 유래되고 서열 번호 3을 갖는다.
하나의 실시태양에서, 표적 세포 결합 모이어티에 커플링된 T 세포 반응 유발 펩타이드의 아미노산 서열은 비-자가 병원체(하나의 실시태양에서, 세포내 병원체)의 단백질 항원의 아미노산 서열의 일부 서열, 바람직하게는 8 내지 12개 아미노산 길이의 일부 서열과 동일하다.
T 세포 반응 유발 펩타이드는 절단가능한 결합을 통해 표적 세포 결합 모이어티에 결합된다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 절단가능한 결합은 화학적, pH 의존적 또는 효소적 절단에 의해 절단될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 절단가능한 결합은 면역컨주게이트가 표적 세포 내로 내재화된 후 절단될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 절단가능한 결합은 표적 세포의 엔도솜 구획 내에서 절단될 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 절단가능한 결합은 면역컨주게이트가 표적 세포 내로 내재화된 후 표적 세포의 엔도솜 구획 내에서 절단될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 절단가능한 결합은 면역컨주게이트로부터 T 세포 반응 유발 펩타이드의 흔적없는 방출을 허용한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 표적 세포 결합 모이어티에 공유적으로 커플링된다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 표적 세포 결합 모이어티에 디설파이드 결합, 에스테르 결합, 펩타이드 결합 또는 연결기 모이어티를 통해 공유적으로 커플링된다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 절단가능한 결합은 디설파이드 결합 및 에스테르 결합으로부터 선택된다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 절단가능한 결합은 디설파이드 결합이다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하고, 절단가능한 결합은 디설파이드 결합이다. 본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 표적 세포 결합 모이어티는 단백질이고 디설파이드 결합은 T 세포 반응 유발 펩타이드의 시스테인 잔기 및 표적 세포 결합 단백질의 시스테인 잔기 사이에 형성된다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 펩타이드 연결기는 표적 세포 결합 모이어티 및 T 세포 반응 유발 펩타이드 사이에 존재한다. 이러한 경우, 디설파이드 결합은 T 세포 반응 유발 펩타이드의 시스테인 잔기 및 펩타이드 연결기의 시스테인 잔기 사이에 형성된다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드 및 표적 세포 결합 모이어티는 절단가능한 연결기 모이어티를 통해 커플링된다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드 및 표적 세포 결합 모이어티는 펩타이드 연결기 또는 화학적 연결기를 통해 커플링된다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드 및 표적 세포 결합 모이어티는 펩타이드 연결기를 통해 커플링된다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드 및 표적 세포 결합 모이어티는 8 내지 50개 아미노산 잔기의 아미노산 서열 길이를 갖는 펩타이드 연결기를 통해 커플링된다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 절단가능한 연결기 모이어티는 프로테아제 절단 자리를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 절단가능한 연결기 모이어티는 표적 세포의 엔도솜 또는 리소좀 구획에서 절단가능한 프로테아제 절단 자리를 포함한다. 본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 절단가능한 연결기 모이어티는 푸린 절단 자리를 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 프로테아제 절단 자리를 포함하는 절단가능한 연결기 모이어티는 펩타이드 연결기이다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 프로테아제 절단 자리를 포함하는 절단가능한 연결기 모이어티는 상기 프로테아제 절단 자리를 포함하는 펩타이드 연결기이다. 본 발명의 하나의 실시태양에서 프로테아제 절단 자리를 포함하는 절단가능한 연결기 모이어티는 상기 푸린 절단 자리를 포함하는 펩타이드 연결기이다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 절단가능한 연결기 모이어티는 pH 의존적 절단 자리를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 절단가능한 연결기 모이어티는 표적 세포의 엔도솜 구획에서 절단될 수 있는 pH 의존적 절단 자리를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 절단가능한 연결기 모이어티는 pH 5.5 내지 6.5에서 절단가능한 pH 의존적 절단 자리를 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, pH 의존적 절단 자리를 포함하는 절단가능한 연결기 모이어티는 화학적 연결기이다. 하나의 실시태양에서, pH 의존적 절단 자리를 포함하는 절단가능한 연결기 모이어티는 아래에 지시되는 바와 같이 하이드라존, 옥심, 말레산 아미드 및 케탈로부터 선택된다:
Figure pct00002
본 발명의 하나의 실시태양에서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 표적 세포 결합 모이어티에 비-공유적으로 커플링된다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 비-공유적 커플링은 면역학적 결합에 의해 초래된다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 면역학적 결합은 면역컨주게이트 내에 포함되는 유기 분자에 특이적으로 결합하는 항체에 의해 초래된다. 이어서 T 세포 반응 유발 펩타이드로의 결합은 T 세포 반응 유발 펩타이드에 커플링되는 상기 유기 분자 및 항체 사이에서 일어난다. T 세포 반응 유발 펩타이드의 흔적없는 방출을 달성하기 위해, T 세포 반응 유발 펩타이드는 상기 유기 분자에 절단가능한 결합을 통해 커플링된다. 이와 같이, 본 발명의 하나의 실시태양에서, 면역컨주게이트는 하기를 포함한다:
- 표적 세포 결합 모이어티, 및 유기 분자, 바람직하게는 비오틴 또는 테오필린에 특이적으로 결합하는 제2의 모이어티(하나의 실시태양에서 항체)를 포함하는 다중특이적, 바람직하게는 이중특이적 실체(하나의 실시태양에서 재조합 융합 단백질)의 형태의 표적 세포 결합 모이어티, 및
- 제2 단백질에 의해 절단가능한 결합을 통해 특이적으로 결합될 수 있는, 유기 분자에 커플링된 T 세포 반응 유발 펩타이드.
하나의 실시태양에서, 유기 분자는 900 Da 이하의 분자량을 갖는 소분자이다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 유기 분자는 비오틴 또는 테오필린이다. 또 다른 바람직한 실시태양에서 유기 분자는 테오필린이다.
또 다른 실시태양에서, 비-공유적 커플링은 높은 친화도 결합에 의해, 하나의 실시태양에서, 비오틴-아비딘-결합에 의해 초래된다. 또 다른 실시태양에서, 비-공유적 커플링은 표적 세포 결합 모이어티에 존재하는 제2 결합 모이어티(예를 들어 Fab 단편)에 의해 인식되는 펩타이드 태그(tag) 사이의 높은 친화도 결합에 의해 초래되고, 여기서 절단가능한 결합은 T 세포 반응 유발 펩타이드 및 펩타이드 태그 사이에 존재한다. 이와 같이, 본 발명의 하나의 실시태양에서, 면역컨주게이트는 하기를 포함한다:
- 표적 세포 결합 모이어티, 및 펩타이드 태그, 바람직하게는 FLAG 또는 V5에 특이적으로 결합하는 제2의 모이어티(하나의 실시태양에서 항체)를 포함하는 다중특이적, 바람직하게는 이중특이적 실체(하나의 실시태양에서 재조합 융합 단백질)의 형태의 표적 세포 결합 모이어티, 및
- 제2 단백질에 의해 절단가능한 결합을 통해 특이적으로 결합될 수 있는, 펩타이드 태그에 커플링된 T 세포 반응 유발 펩타이드.
본 발명에 따른 면역컨주게이트는 표적 세포에 T 세포 반응 유발 펩타이드를 이동시키기 위해 표적 세포 결합 모이어티를 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 표적 세포 결합 모이어티는 표적 세포 내로 내재화될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 표적 세포 결합 모이어티는 표적 세포의 세포 표면 항원에 결합한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 표적 세포는 종양 세포이다. 표적 세포가 종양 세포인 본 발명의 또 다른 실시태양에서, 표적 세포 결합 모이어티는 표면-발현된 종양 특이적 항원(TSA, 이는 종양 세포 상에서만 제시되고 다른 세포 상에서는 제시되지 않음) 또는 표면-발현된 종양 회합된 항원(TAA, 이는 종양 세포 상에서 제시되고 몇몇 다른 세포 상에서 더 적은 정도로 제시됨)에 특이적으로 결합될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 표적 세포는 감염성 질환, 자가면역 질환, 당뇨병 또는 알러지에서 질환 위중성과 연관된 세포이다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 표적 세포 결합 모이어티는 단백질이다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 표적 세포 결합 단백질은 재조합 단백질이다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 표적 세포 결합 단백질은 표적 세포에 특이적으로 결합하는 항체 또는 표적 세포 상의 그의 수용체에 결합된 리간드이다. 본 발명의 또 다른 실시태양에서, 표적 세포 결합 단백질은 항체, 사이토킨 및 성장 인자로부터 선택된다. 본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 표적 세포 결합 모이어티는 항체이다.
하나의 실시태양에서, 표적 세포 결합 모이어티는 특이적으로 CD19 또는 CDCP-1에 결합한다. 하나의 실시태양에서, 표적 세포 결합 모이어티는 특이적으로 CD19에 결합한다. 하나의 실시태양에서, 표적 세포 결합 모이어티는 특이적으로 CDCP-1에 결합한다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 표적 세포 결합 모이어티는 CD19 또는 CDCP-1에 특이적으로 결합하는 항체이다. 본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 표적 세포 결합 모이어티는 CD19에 특이적으로 결합하는 항체이다. 본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 표적 세포 결합 모이어티는 CDCP-1에 특이적으로 결합하는 항체이다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 면역컨주게이트는 표적 세포 내로 내재화될 수 있다.
본 발명에 따라서, T 세포 반응 유발 펩타이드는 MHC 클래스 I에 의해 직접적으로 제시될 수 있고, 표적 세포 내에서 추가의 가공을 필요로 하지 않는다. 따라서, 본 발명의 하나의 실시태양에서, 면역컨주게이트는 전좌 도메인을 포함하지 않는다.
본 발명에 의해, MHC 클래스 I을 경유하여 직접적으로 제시될 수 있는 T 세포 반응 유발 펩타이드의 방출을 허용하는 면역컨주게이트가 제공된다. 방출된 T 세포 반응 유발 펩타이드가 시토졸에서 항원 가공 장치로 전달될 필요가 없으므로, T 세포 반응 유발 펩타이드는 짧은 시간내에 표적 세포의 표면 상에 제시된다. 이에 따라, 본 발명의 하나의 실시태양에서, 면역컨주게이트가 표적 세포 내로 내재화된 후 12 시간 이내에 T 세포 반응 유발 펩타이드는 MHC 클래스 I 분자를 경유하여 표적 세포의 표면 상에 제시된다. 본 발명의 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트가 표적 세포 내로 내재화된 후 6 시간 이내에 T 세포 반응 유발 펩타이드는 MHC 클래스 I 분자를 경유하여 표적 세포의 표면 상에 제시된다. 본 발명의 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트가 표적 세포 내로 내재화된 후 6 시간 이내에 면역컨주게이트는 표적 세포에 대항하여 T 세포 세포독성을 중재할 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 면역컨주게이트를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 하나의 실시태양은 본 발명에 따른 면역컨주게이트를 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 면역컨주게이트를 생성하기 위한, 추가로 기재되고 상기 정의된 MHC 클래스 I을 경유하여 제시될 수 있는 T 세포 반응 유발 펩타이드의 용도이다.
본 발명의 또 다른 양태는 표적 세포에 대항하여 T 세포 세포독성을 특이적으로 유도하기 위한, 본 발명에 따른 면역컨주게이트의 용도이다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 면역컨주게이트는 표적 세포에 대항하여 CD8 T 세포를 경유하여 세포-중재된 면역력을 특이적으로 유도하기 위해 사용된다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 면역컨주게이트는 표적 세포 내로 내재화되고, T 세포 반응 유발 펩타이드는 표적 세포의 엔도솜 구획 내에서 면역컨주게이트로부터 방출된다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 면역컨주게이트가 표적 세포 내로 내재화된 후 12 시간 이내에 T 세포 반응 유발 펩타이드는 MHC 클래스 I 분자를 경유하여 표적 세포의 표면 상에 제시된다. 본 발명의 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트가 표적 세포 내로 내재화된 후 6 시간 이내에 T 세포 반응 유발 펩타이드는 MHC 클래스 I 분자를 경유하여 표적 세포의 표면 상에 제시된다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트가 표적 세포 내로 내재화된 후 6 시간 이내에 면역컨주게이트는 표적 세포에 대항하여 T 세포 세포독성을 중재하기 위해 사용된다.
본 발명의 또 다른 양태는
a) 재조합 표적 세포 결합 모이어티를 제공하는 단계,
b) T 세포 반응 유발 펩타이드를 제공하는 단계, 및
c) 적어도 하나의 상기 T 세포 반응 유발 펩타이드를 상기 표적 세포 결합 모이어티에 절단가능한 결합을 통해 커플링시키는 단계
를 포함하는, 본 발명에 따른 면역컨주게이트를 제조하는 방법이다.
본 발명의 하나의 실시태양은 변형되지 않은 T 세포 반응 유발 펩타이드를 표적 세포 결합 모이어티에 커플링시키는 면역컨주게이트의 제조 방법에 관한 것이다. 달리 말하면, 본 발명의 하나의 실시태양은 T 세포 반응 유발 펩타이드를 아미노산 서열 변형 없이 제공하고 표적 세포 결합 모이어티에 커플링시키는 면역컨주게이트의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는
a) 재조합 표적 세포 결합 모이어티를 제공하는 단계,
b) T 세포 반응 유발 펩타이드를 제공하는 단계, 및
c) 적어도 하나의 상기 T 세포 반응 유발 펩타이드를 상기 표적 세포 결합 모이어티에 절단가능한 결합을 통해 커플링시키는 단계
를 포함하는, 표적 세포에 대항하여 CD8 T 세포를 경유하여 세포-중재된 면역력을 특이적으로 유도하기 위한 본 발명에 따른 면역컨주게이트를 제조하는 방법이다. 하나의 실시태양에서, 변형되지 않은 T 세포 반응 유발 펩타이드는 표적 세포 결합 모이어티에 커플링된다.
본 발명의 또 다른 목적은 약학 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 면역컨주게이트의 용도이다. 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 면역컨주게이트를 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 면역컨주게이트를 포함하는 약학 조성물을 제조하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 면역컨주게이트이다. 본 발명의 또 다른 양태는 암의 치료를 위한, 암 세포 결합 모이어티를 포함하는 본 발명에 따른 면역컨주게이트이다.
본 발명의 또 다른 양태는 감염성 질환, 자가면역 질환, 당뇨병 또는 알러지의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 면역컨주게이트이다.
본 발명의 또 다른 양태는 표적 세포에 대항하여 CD8 T 세포를 경유하여 세포-중재된 면역력을 특이적으로 유도하는데 사용하기 위한 본 발명에 따른 면역컨주게이트이다.
본 발명의 또 다른 양태는 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 약학 조성물이다. 본 발명의 또 다른 양태는 약학 조성물에 포함된 면역컨주게이트가 암의 치료를 위한, 암 세포 결합 모이어티를 포함하는 본 발명에 따른 약학 조성물이다. 본 발명의 또 다른 양태는 감염성 질환, 자가면역 질환, 당뇨병 또는 알러지의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 약학 조성물이다. 본 발명의 또 다른 양태는 표적 세포에 대항하여 CD8 T 세포를 경유하여 세포-중재된 면역력을 특이적으로 유도하는데 사용하기 위한 본 발명에 따른 약학 조성물이다.
본 발명의 또 다른 목적은 약제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 면역컨주게이트의 용도이다. 본 발명의 또 다른 목적은 암의 치료용 약제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 면역컨주게이트의 용도이다.
본 발명의 또 다른 목적은 감염성 질환, 자가면역 질환, 당뇨병 또는 알러지의 치료용 약제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 면역컨주게이트의 용도이다. 본 발명의 또 다른 목적은 표적 세포에 대항하여 CD8 T 세포를 경유하여 세포-중재된 면역력을 특이적으로 유도하는 약제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 면역컨주게이트의 용도이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 면역컨주게이트를 질환의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 앓는 환자를 치료하는 방법이다. 본 발명의 또 다른 양태는 암 세포 결합 모이어티를 포함하는 본 발명에 따른 면역컨주게이트를 암의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 환자를 치료하는 방법이다. 본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 면역컨주게이트를 감염성 질환, 자가면역 질환, 당뇨병 또는 알러지의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 감염성 질환, 자가면역 질환, 당뇨병 또는 알러지를 앓는 환자를 치료하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 약학 조성물을 질환의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 앓는 환자를 치료하는 방법이다. 본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 약학 조성물을 암의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 환자를 치료하는 방법이다. 본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 약학 조성물을 감염성 질환, 자가면역 질환, 당뇨병 또는 알러지의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 감염성 질환, 자가면역 질환, 당뇨병 또는 알러지를 앓는 환자를 치료하는 방법이다.
3. 본 발명의 구체적인 실시태양
아래에 본 발명의 구체적인 실시태양이 열거된다.
1. 절단가능한 결합을 통해 표적 세포 결합 모이어티에 커플링되고 MHC 클래스 I을 경유하여 제시될 수 있는 적어도 하나의 T 세포 반응 유발 펩타이드를 포함하고, 여기서 절단가능한 결합은 절단시 MHC 클래스 I 분자를 경유하여 직접적으로 제시될 수 있는 상기 T 세포 반응 유발 펩타이드가 면역컨주게이트로부터 방출되도록 배열되는 면역컨주게이트.
2. 방출된 T 세포 반응 유발 펩타이드의 아미노산 서열이 자연적으로 발생하는 T 세포 반응 유발 펩타이드의 아미노산 서열과 동일한, 실시태양 1에 따른 면역컨주게이트.
3. 방출된 T 세포 반응 유발 펩타이드가 자연적으로 발생하는 T 세포 반응 유발 펩타이드와 동일한 길이를 갖는, 실시태양 2에 따른 면역컨주게이트.
4. T 세포 반응 유발 펩타이드가 자연적으로 발생하는 T 세포 반응 유발 펩타이드인, 실시태양 1 내지 실시태양 3중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
5. T 세포 반응 유발 펩타이드가 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는, 실시태양 1 내지 실시태양 4중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
6. T 세포 반응 유발 펩타이드가 N- 또는 C-말단 시스테인 잔기를 포함하는, 실시태양 1 내지 실시태양 5중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
7. T 세포 반응 유발 펩타이드가 류신 잔기를 위치 2(N-말단으로부터 C-말단 방향으로 계산됨)에 포함하는, 실시태양 1 내지 실시태양 6중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
8. 5개 이하의 T 세포 반응 유발 펩타이드를 포함하는, 실시태양 1 내지 실시태양 7중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
9. T 세포 반응 유발 펩타이드가 8 내지 12개의 아미노산으로 구성되는, 실시태양 1 내지 실시태양 8중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
10. T 세포 반응 유발 펩타이드가 엡스타인-바르 바이러스, 인간 헤르페스바이러스 5 또는 인플루엔자 A로부터 유래되는, 실시태양 1 내지 실시태양 9중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
11. T 세포 반응 유발 펩타이드가 엡스타인-바르 바이러스로부터 유래되는, 실시태양 1 내지 실시태양 10중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
12. T 세포 반응 유발 펩타이드가 인간 헤르페스바이러스 5로부터 유래되는, 실시태양 1 내지 실시태양 11중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
13. T 세포 반응 유발 펩타이드가 인플루엔자 A로부터 유래되는, 실시태양 1 내지 실시태양 12중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
14. T 세포 반응 유발 펩타이드가 서열 번호 2 내지 서열 번호 5로부터 선택되는, 실시태양 1 내지 실시태양 13중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
15. 절단가능한 결합이 화학적, pH 의존적 또는 효소적 절단에 의해 절단될 수 있는, 실시태양 1 내지 실시태양 14중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
16. 면역컨주게이트가 표적 세포 내로 내재화된 이후 절단가능한 결합이 절단될 수 있는, 실시태양 1 내지 실시태양 15중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
17. 절단가능한 결합이 표적 세포의 엔도솜 구획 내에서 절단될 수 있는, 실시태양 1 내지 실시태양 16중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
18. T 세포 반응 유발 펩타이드가 표적 세포 결합 모이어티에 공유적으로 커플링되는, 실시태양 1 내지 실시태양 17중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
19. 절단가능한 결합이 디설파이드 결합 및 에스테르 결합으로부터 선택되는, 실시태양 1 내지 실시태양 18중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
20. 절단가능한 결합이 디설파이드 결합인, 실시태양 1 내지 실시태양 19중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
21. T 세포 반응 유발 펩타이드가 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하고 절단가능한 결합이 디설파이드 결합인, 실시태양 1 내지 실시태양 20중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
22. T 세포 반응 유발 펩타이드 및 표적 세포 결합 모이어티가 절단가능한 연결기 모이어티를 통해 커플링되는, 실시태양 1 내지 실시태양 18중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
23. 절단가능한 연결기 모이어티가 프로테아제 절단 자리를 포함하는, 실시태양 22에 따른 면역컨주게이트.
24. 절단가능한 연결기 모이어티가 푸린 절단 자리를 포함하는, 실시태양 23에 따른 면역컨주게이트.
25. 절단가능한 연결기 모이어티가 pH 의존적 절단 자리를 포함하는, 실시태양 22에 따른 면역컨주게이트.
26. pH 의존적 절단 자리가 pH 5.5 내지 6.5에서 절단될 수 있는, 실시태양 25에 따른 면역컨주게이트.
27. 절단가능한 연결기 모이어티가 화학적 연결기인, 실시태양 22 내지 실시태양 26중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
28. 표적 세포 결합 모이어티가 표적 세포 내로 내재화될 수 있는, 실시태양 1 내지 실시태양 27중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
29. 표적 세포 결합 모이어티가 표적 세포의 세포 표면 항원에 결합하는, 실시태양 1 내지 실시태양 28중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
30. 표적 세포가 종양 세포인, 실시태양 1 내지 실시태양 29중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
31. 표적 세포 결합 모이어티가 단백질인, 실시태양 1 내지 실시태양 30중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
32. 표적 세포 결합 모이어티가 표적 세포에 특이적으로 결합하는 항체 또는 표적 세포 상의 그의 수용체에 결합된 리간드인, 실시태양 1 내지 실시태양 31중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
33. 표적 세포 결합 모이어티가 CD19 또는 CDCP-1에 특이적으로 결합하는, 실시태양 1 내지 실시태양 32중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
34. 표적 세포 결합 모이어티가 CD19에 특이적으로 결합하는, 실시태양 1 내지 실시태양 33중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
35. 표적 세포 결합 모이어티가 CDCP-1에 특이적으로 결합하는, 실시태양 1 내지 실시태양 34중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
36. 표적 세포 결합 모이어티가 CD19 또는 CDCP-1에 특이적으로 결합하는 항체인, 실시태양 1 내지 실시태양 35중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
37. 표적 세포 결합 모이어티가 CD19에 특이적으로 결합하는 항체인, 실시태양 1 내지 실시태양 36중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
38. 표적 세포 결합 모이어티가 CDCP-1에 특이적으로 결합하는 항체인, 실시태양 1 내지 실시태양 37중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
39. 표적 세포 내로 내재화될 수 있는, 실시태양 1 내지 실시태양 38중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
40. 면역컨주게이트가 전좌 도메인을 포함하지 않는, 실시태양 1 내지 실시태양 39중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
41. 면역컨주게이트가 표적 세포 내로 내재화된 후 12 시간 이내에 T 세포 반응 유발 펩타이드가 MHC 클래스 I 분자를 경유하여 표적 세포의 표면 상에 제시되는, 실시태양 1 내지 실시태양 40중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
42. 실시태양 1 내지 실시태양 41중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트를 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 약학 조성물.
43. 실시태양 1 내지 실시태양 41중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트를 생성하기 위한, MHC 클래스 I을 경유하여 제시될 수 있는 T 세포 반응 유발 펩타이드의 용도.
44. 표적 세포에 대항하여 T 세포 세포독성을 특이적으로 유도하기 위한, 실시태양 1 내지 실시태양 41중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트의 용도.
45. 면역컨주게이트가 표적 세포 내로 내재화되고 T 세포 반응 유발 펩타이드가 표적 세포의 엔도솜 구획 내에서 면역컨주게이트로부터 방출되는, 실시태양 44에 따른 용도.
46. 면역컨주게이트가 표적 세포 내로 내재화된 후 12 시간 이내에 T 세포 반응 유발 펩타이드가 MHC 클래스 I 분자를 경유하여 표적 세포의 표면 상에 제시되는, 실시태양 44 또는 실시태양 45에 따른 용도.
47. (a) 재조합 표적 세포 결합 모이어티를 제공하는 단계,
(b) T 세포 반응 유발 펩타이드를 제공하는 단계, 및
(c) 적어도 하나의 상기 T 세포 반응 유발 펩타이드를 상기 표적 세포 결합 모이어티에 절단가능한 결합을 통해 커플링시키는 단계
를 포함하는, 실시태양 1 내지 실시태양 41중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트의 제조 방법.
48. 변형되지 않은 T 세포 반응 유발 펩타이드를 표적 세포 결합 모이어티에 커플링시키는, 실시태양 47에 따른 방법.
49. 약제로서 사용하기 위한 실시태양 1 내지 실시태양 41중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
50. 암을 치료하기 위한, 암 세포 결합 모이어티를 포함하는 실시태양 1 내지 실시태양 41중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
51. 감염성 질환, 자가면역 질환, 당뇨병 또는 알러지를 치료하기 위한, 실시태양 1 내지 실시태양 41중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트.
52. 실시태양 1 내지 실시태양 41중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트를 질환의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 앓는 환자를 치료하는 방법.
53. 실시태양 1 내지 실시태양 41중 어느 한 실시태양에 따른 면역컨주게이트를 암의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 환자를 치료하는 방법.
아미노산 서열에 대한 설명
Figure pct00003
실시예
하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기위해 제공되고, 이의 진정한 범주는 특허청구범위에 제시된다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않고 절차에 변경이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다.
실시예 1
MHC 클래스 I(HLA-A2)으로의 결합 및 CMV-특이적 T 세포 활성화에 미치는 CMV-펩타이드의 C- 또는 N-말단 변형의 영향
자연적으로 발생하는 T 세포 반응 유발 펩타이드에 포함된 C- 또는 N-말단 아미노산 변형의 영향을 평가하기 위해, 아미노산 서열 NLVPMVATV(서열 번호 1)의 자연적으로 가공된 CMV 펩타이드를 다음과 같이 변형시켰다:
Figure pct00004
표준 Fmoc-화학법을 사용하여 펩타이드를 합성하였다. 사용된 아미노산은 모두 L-이성체였다.
실시예 1A
건강한 공여자의 말초 혈액으로부터의 CMV 펩타이드 특이적 T 세포의 생성
건강한 공여자로부터 신선하게 단리된 PBMC중의 또는 T 세포 배양액중의 CMV 펩타이드 CD8 T 세포의 빈도를 5량체 염색을 통해 FACS에서 검사하였다.
간단히, 분취량의 3 내지 5 x 1OE05의 T 세포 배양액 또는 HLA-A2-부합된 건강한 공여자로부터의 신선하게 단리된 PBMC를 BD FACS 완충액으로 세척하고, 5 ㎕의 인간 트루스테인(TruStain) FcX[바이오레전드(BioLegend), 422302]가 포함된 100 ㎕의 BD FACS 완충액과 함께 15 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후 10 ㎕의 비오틴 컨주게이션된 CMV-펜타머(Pentamer)[프로이뮨(ProImmune), F008-4, 1:10]가 포함된 90 ㎕의 BD FACS 완충액을 첨가하고 1 시간 동안 4℃에서 항온처리하였다.
BD FACS 완충액으로 세척할 때, 세포를 100 ㎕의 BD FACS 완충액에서 FITC-표지화된 항-CD8a mAb(클론 LT8, 프로이뮨) 뿐만 아니라 스트렙타비딘-APC 컨주게이트에 의해 4℃에서 20 분 동안 염색시켰다. BD FACS 완충액으로 3회 세척하고 원심분리한 후, 세포를 1 ㎍/㎖의 DAPI가 함유된 200 ㎕의 BD FACS 완충액에 재현탁시키고, 염색된 세포의 MFI 신호를 BD 바이오사이언시즈(Biosciences) FACSCanto II 유세포 분석기에 의해 분석하였다. HLA-A1 공여자로부터의 세포를 4량체의 비특이적 결합의 평가를 위해 사용하였다.
다음과 같이 CMV 유래된 펩타이드 NLVPMVATV(서열 번호 1)에 의한 단리 일에 자극을 위해 신선하게 단리된 PBMC를 사용하였다:
1 μM 펩타이드가 함유된 200 ㎕의 RPMI+ 배지에서 96-웰 당 2 x 10E5의 세포를 3 일 동안 96 웰 플레이트에서 항온처리하였다. 3 일째, 플레이트를 300 g에서 2 분 동안 원심분리하고, 160 ㎕의 상청액을 웰로부터 제거하고, 1 μM 펩타이드 및 1OO U/㎖의 IL-2가 함유된 신선한 RPMI+ 배지로 대체시켰다. 8 일 및 10 일째, 배지를 다시 3 일째 기재된 바와 같이 대체시켰다. 배양된 세포를 14 일째 펩타이드의 자극없이 나누었다. 16 일째, 세포 배양액을 자가유래의 PBMC로 재자극시키고[11 그레이(Gray)로 조사됨], 다음과 같이 CMV 펩타이드로 맥동시켰다: 6개의 웰 플레이트중 1 μM 펩타이드가 함유된 2000 ㎕의 RPMI+ 배지에서 웰 당 12 x 1OE6의 T-세포 + 웰 당 8.7 x 1OE6의 조사된 PBMC. 19 일, 21 일 및 25 일째, 배양액을 다시 나누고, 상기 기재된 바와 같이 30 일째 자극시켰다. 35 일, 37 일, 41 일째, 배양액을 나누고, 44 일째 프로토콜에 따라 재자극시켰다. 배양액을 CMV 펩타이드 특이적 세포의 빈도에 대해 시험하였고, 51 일째 LDH 세포독성 검정에서 사용하였고, 54 일째 지시된 CMV 펩타이드로 적재된 세포에 대항하는 특이성에 대한 ELISPOT 검정에서 사용하였다.
실시예 1B
자유 CMV 펩타이드에 의한 종양 세포의 치료 이후 CMV 펩타이드 특이적 T 세포 활성화에 대한 IFNγ-ELISPOT에 의한 평가
관련된 MHC I 분자를 상이한 수준으로 표면 상에 발현하는 상이한 종양 세포주에 대하여 HLA-A2 제한된 CMV 펩타이드 특이적 T 세포 활성화를 IFNγ-ELISPOT에 의해 평가하였다:
- MDA-MB231 : HLA-A2 높음
- HCT-116: HLA-A2 낮음
- T2: TAP 결핍 세포주, 이는 세포 표면 상에 비적재 MHC 클래스 I 분자를 발현하지 않는다.
간단히, 10,000개의 종양 세포를, 각각 실시예 1A에서 수득된 500개의 CMV-특이적 CD8 T 세포의 존재하에 상이한 농도의 변형된 자유 CMV 펩타이드(cCMV, CMVc, rcCMV, CMVrc, CMVpen) 또는 자연적으로 발생하는, 변형되지 않은 CMV 펩타이드(13,245 μΜ 또는 1,3245 μΜ의 농도)에 의해 처리하였다. 대조군으로서, 종양 세포 및 T 세포를 자유 펩타이드의 부재하에 항온처리하였고, 추가의 대조군으로서, T 세포를 단독으로 동일한 조건하에 항온처리하였다.
혈청-함유 RPMI+ 배지 또는 무혈청 AIM-V 배지를 사용하여 실험을 수행하였다.
IFNγ-ELISPOT를 다음과 같이 수행하였다:
1 일째, 플레이트를 멸균 PBS로 세척하였다. 후속적으로, 웰 당 50 ㎕의 RPMI+ 배지를 첨가하고, 플레이트를 20 내지 30 분 동안 항온처리하였다. 후속적으로, 펩타이드에 50㎕의 RPMI+를 각각의 웰에 대해 첨가하였다. 개개의 종양 세포를 아쿠타아제(Accutase)에 의해 수확하였다. 개개의 웰에서 웰 당 10,000개의 종양 세포를 100 ㎕의 RPMI+에 첨가하였다. 20 분 동안 항온처리한 후, 플레이트를 암실에서 약 6 시간 동안 항온처리하였다. T 세포를 40 ㎛ 메쉬를 통해 여과하고 RPMI+에서 1회 세척하였다(300 g에서 원심분리, 2 분). 500개의 펩타이드-특이적 CD8 T 세포가 함유된 50 ㎕의 RPMI+ 배지를 첨가하였다. 플레이트를 하룻밤 항온처리하였다.
2 일째, 플레이트를 비우고 PBS로 세척하였다. 항-인간 IFN-γ 단일클론성 항체[맵테크(Mabtech) 7-B6-ALP]를 여과된 PBS/0.5% FCS에 1:200으로 희석시켰다. 웰 당 100 ㎕의 희석된 항체를 첨가하고 2 시간 동안 항온처리하였다. 후속적으로, 플레이트를 PBS로 세척하였다. 기질 용액(BCIP/NBT-플러스)을 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 웰 당 100 ㎕의 기질 용액을 첨가하고 개별적인 점들이 출현할 때까지 진행시켰다. 수돗물에서 세척함으로써 진행을 중단시킨 후, 플레이트를 암실에서 건조시켰다.
"이뮤노스팟(ImmunoSpot) 5.0 프로페셔널(professional) DC" 소프트웨어를 사용하여 ELISPOT 판독기[셀룰라 테크놀로지 리미티드(Cellular Technology Ltd.)]에서 플레이트를 분석하였다.
RPMI+ 배지의 조성은 다음과 같았다:
500 ㎖의 RPMI 배지 1640[라이프 테크놀로지스(Life Technologies)]
8% 인간 혈청(열-불활성화되고 여과됨)
1% L-글루타민
1% NEAA
1% 피루브산 나트륨
0.2% 펜스트렙(PenStrep)
0.1% β-머캅토에탄올
결과는 도 1에 지시되어 있다.
CMV-펩타이드의 N-말단 변형이 T 세포 활성화의 손실을 유도하는 것으로 관찰되었다. C-말단 변형은 T 세포의 활성화를 감소시켰다. 또한, CMV 펩타이드의 아미노산 서열 내에 자연적으로 존재하는 아미노산의 측쇄의 변형은 T 세포 활성화의 손실을 이끌었다. 이에 따라, 자연적으로 발생하는 T 세포 반응 유발 펩타이드 내에서의 변형은 MHC 클래스 I 분자 상의 적재, 및 따라서 T 세포 활성화에 영향을 줄 수(즉 감소시킬 수) 있는 것으로 결론지을 수 있다.
그러나, 자연적으로 발생하는 T 세포 반응 유발 펩타이드를 사용하는 경우에, 최적의 MHC 클래스 I 결합 및 적재가 보장될 수 있다.
실시예 2
본 발명에 따른 면역컨주게이트 작용의 제안된 방식
도 2는 본 발명에 따른 면역컨주게이트의 작용에 대한 제안된 방식을 보여준다. 예시적으로, 항체가 표적 세포 결합 모이어티로서 제시되지만, 다른 모이어티가 동등하게 적합하다.
정상 상태에서, 표적 세포 표면(예를 들어 종양 세포의 표면)에 표적 항원이 부착되어 있고, 여기에 표적 세포 결합 모이어티가 특이적으로 결합한다. 또한, 자가 펩타이드를 제시하는 MHC 클래스 I 분자는 세포 표면 상에서 발현된다.
이론에 얽매려는 것은 아니지만, 면역컨주게이트의 표적 항원으로의 결합(A)은 표적 항원-면역컨주게이트 복합체의 내재화(B) 및 초기 엔도솜 구획에서 면역컨주게이트로부터의 T 세포 반응 유발 펩타이드의 후속적인 방출(C)을 이끈다. 중요하게는, 방출된 펩타이드는 그의 상응하는 자연적으로 발생하는 펩타이드와 동일한 아미노산 서열로 구성되고, 아미노산 변형, 구체적으로 C- 또는 N- 말단 아미노산 변형을 전혀 포함하지 않는다.
MHC 클래스 I 분자 상에 제시되는 자가 펩타이드는 엔도솜 구획 내에서 비-자가 펩타이드(즉 면역컨주게이트로부터 절단되는 T 세포 반응 유발 펩타이드)와 수동적으로 교환된다(D). 펩타이드-적재된 MHC 클래스 I 분자는 엔도솜 운송을 통해 세포 표면으로 이동되어(E), MHC 클래스 I과 관련된 표적 세포 표면 상에 T 세포 반응 유발 펩타이드의 제시를 이끈다.
펩타이드-특이적 CD8 T 세포는 표적 세포 상에서 펩타이드-적재된 MHC 클래스 I 분자를 인식하고 이에 결합하여(F), 표적 세포에 대항하여 T 세포 세포독성의 특이적 유도를 이끈다.
실시예 3
MHC 클래스 I을 경유하여 제시될 수 있는 적어도 하나의 T 세포 반응 유발 펩타이드와 단일클론성 항-CDCP1 항체와의 컨주게이션
본 발명에 따른 면역컨주게이트를 생성하기 위해, CUB 도메인-함유 단백질 1(CDCP1, 또한 CD318로서 지정됨, EP 제1 396 501 A1호에 개시됨)에 특이적으로 결합하는 단일클론성 항체(mAb)를 다음의 병원체 유래된 펩타이드중 하나에 커플링시켰다:
- 엡스타인-바르 바이러스(EBV) 펩타이드 426-434(서열 번호 2, CLGGLLTMV), 또는
- 인플루엔자 A NP(FLU) 펩타이드 44-52(서열 번호 3, CTELKLSDY).
표준 Fmoc-화학법을 사용하여 펩타이드를 합성하였다. 사용된 아미노산은 모두 L-이성체였다.
실시예 3A
단일클론성 항-CDCP1 항체 및 EBV 및/또는 FLU 펩타이드를 포함하는 면역컨주게이트의 생산(여기서 펩타이드는 절단가능한 S-S 결합을 통해 항체에 커플링됨)
면역컨주게이트가 표적 세포 내로 내재화될 경우 펩타이드를 방출하기 위해 디설파이드 결합을 포함하는 본 발명에 따른 면역컨주게이트의 예를 생산하기 위해, 펩타이드를 다음과 같이 항체에 컨주게이션시킨다:
αCDCP1-mAb를 10 당량의 N-석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)-프로피오네이트[SPDP, 피어스(Pierce)]의 존재하에 0.1 M 인산 칼륨 완충액 중에서 pH 7.2에서 먼저 유도체화시켰다. 2 시간의 반응 시간 후, 유도체화된 항체를 겔 여과에 의해 10 mM EDTA가 함유된 0.1 M 인산 칼륨 완충액으로 pH 7.0에서 정제하였다.
EBV 또는 FLU 펩타이드를 포함하는 면역컨주게이트를 생산하기 위해서, 10 당량의 개개의 펩타이드를 유도체화된 항체에 첨가하고 하룻밤 반응시켰다. 본 발명에 따른 면역컨주게이트를 겔 여과에 의해 정제하였다.
EBV 또는 FLU 펩타이드를 포함하는 면역컨주게이트를 생산하기 위해서, 유도체화된 항체를 5 당량의 각각의 EBV 및 FLU 펩타이드와 함께 하룻밤 반응시켰다. 본 발명에 따른 면역컨주게이트를 겔 여과에 의해 정제하였다.
생산된 본 발명에 따른 면역컨주게이트를 본원에서 다음과 같이 지칭한다:
- <CDCP1-SS-pEBV> 디설파이드 결합에 의해 EBV 펩타이드 426-434에 커플링된 항-CDCP1 MAb를 포함하는 면역컨주게이트
- <CDCP1-SS-pFLU> 디설파이드 결합에 의해 FLU 펩타이드 44-52에 커플링된 항-CDCP1 MAb를 포함하는 면역컨주게이트
- <CDCP1-SS-pEBV/FLU> 개개의 디설파이드 결합에 의해 EBV 펩타이드 426-434 및 FLU 펩타이드 44-52에 커플링된 항-CDCP1 MAb를 포함하는 면역컨주게이트
실시예 3B(비교)
단일클론성 항-CDCP1 항체 및 EBV 또는 FLU 펩타이드를 포함하는 면역컨주게이트의 생산(여기서 펩타이드는 비-절단가능한 티오에테르 결합을 통해 항체에 커플링됨)
비교 분석을 위해, 펩타이드를 티오에테르 결합을 통해 항체에 비-절단가능한 방식으로 컨주게이션시켰다:
αCDCP1-mAb를 10 당량의 N-엡실론-말레미도카프로일-옥시석신이미드 에스테르(EMCS, 피어스)의 존재하에 0.1 M 인산 칼륨 완충액 중에서 pH 7.2에서 먼저 유도체화시켰다. 2 시간의 반응 시간 후, 유도체화된 항체를 겔 여과에 의해 10 mM EDTA가 함유된 0.1 M 인산 칼륨 완충액으로 pH 7.0에서 정제하였다.
이후 10 당량의 개개의 펩타이드를 유도체화된 항체에 첨가하고 하룻밤 반응시켰다. 면역컨주게이트를 겔 여과에 의해 정제하였다.
비교를 위해 사용된 생산된 면역컨주게이트를 본원에서 다음과 같이 지칭한다:
- <CDCP1-S-pEBV> 티오에테르 결합에 의해 EBV 펩타이드 425-433에 커플링된 항-CDCP1 MAb를 포함하는 면역컨주게이트
- <CDCP1-S-pFLU> 티오에테르 결합에 의해 FLU 펩타이드 44-52에 커플링된 항-CDCP1 MAb를 포함하는 면역컨주게이트
실시예 3C
EBV 및/또는 FLU 펩타이드에 커플링된 단일클론성 항-CDCP1 항체를 포함하는 면역컨주게이트에 대한 MS 분석 및 안정성 평가
실시예 3A 및 3B에서 형성된 면역컨주게이트의 표지화 비율을 LC-ESI 질량 분석법에 의해 분석하였다.
샘플 제조: 측정 전에 IgG 또는 표지화된-IgG를 N-글리코시다아제(glycosidase) F로 탈당화시켰다. 다르게는 경쇄 및 중쇄를 별도로 측정하기 위해 탈당화 이후 IgG 또는 표지화된-IgG를 TCEP로 환원시켰다.
분석을, 물:아세토니트릴 구배를 갖는 역상 칼럼이 구비된 LC-ESI-MS[워터스(Waters)] HPLC 시스템 및 ESI-TOF-MS 측정 및 검출에 의해 수행하였다. MS 데이터 분석을 매스라인스 소프트웨어(MassLynx Software)(워터스)에 의해 수행하였다.
분석 결과, 평균 0.8개의 펩타이드가 각각의 항체 분자에 커플링되었다(데이터는 제시되지 않음).
면역컨주게이트의 안정성을 검토하기 위해, 저장 용액(stock solution) 및 세포 배양 배지에서의 안정성을 평가하였다. 면역컨주게이트의 저장 용액을 스핀(spin) 칼럼[MW 컷오프(cutoff) 50 kDa]에 의해 여과하고 LC-MS에 의해 분석하였다. 자유 펩타이드가 검출되지 않았다. 면역컨주게이트가 첨가된 세포 배양 배지를 LC-MS에 의해 분석하였다. 자유 펩타이드가 검출되지 않았다. 양성 대조군으로서, 세포 배양 배지에 자유 펩타이드를 첨가하였다.
실시예 3D
EBV 및/또는 FLU 펩타이드에 커플링된 단일클론성 항-CDCP1 항체를 포함하는 면역컨주게이트의 CDCP1 발현 MDA-MB231 세포로의 세포 결합 연구
면역컨주게이트의 이들 개개의 항원으로의 결합을 평가하기 위해, 실시예 3A 및 3B의 면역컨주게이트의 CDCP1 발현 MDA-MB231 세포로의 결합을 FACS 기반의 결합 검정에서 평가하였다.
간단히, MDA-MB231 세포를 아쿠타아제에 의한 처리를 통해 검출하고, 원심분리에 의해 분리 배지로부터 분리하고, MDA-MB231 세포 배지에 4 x 10E06 세포/㎖의 농도로 현탁시켰다. 50 ㎕의 세포 분취량을 면역컨주게이트 또는 컨주게이션되지 않은 항-CDCP1 항체(모 항-CDCP1 항체)의 멸균 희석액(BD FACS 완충액중 20 ㎍/㎖ 내지 0.02 ㎍/㎖의 면역컨주게이트)과 함께 30 분 동안 4℃에서 항온처리하였다. BD FACS 완충액으로 세척한 후, 세포를 FITC 표지화된 항-인간 IgG H+L[인비트로겐(Invitrogen) A11013; BD FACS 완충액중 10 ㎍/㎖]에 의해 30 분 동안 4℃에서 염색시켰다. 세척 및 원심분리 후, 염색된 세포의 MFI 신호를 BD 바이오사이언시즈 FACSCanto 유세포 분석기에 의해 분석하였다(도 3).
도 3에 제시된 FACS 기반의 세포 결합 연구로부터의 결과는, 모든 면역컨주게이트가 CDCP1 발현 MDA-MB231 종양 세포에 필적할만한 방식으로 결합함을 입증한다.
실시예 3E
EBV 및/또는 FLU 펩타이드에 커플링된 단일클론성 항-CDCP1 항체를 포함하는 면역컨주게이트의 CDCP1의 세포외 도메인(ECD)으로의 결합에 대한 표면 플라스몬(plasmon) 공명에 의한 연구
실시예 3A 및 3B의 면역컨주게이트의 인간 CDCP1-ECD로의 생화학적 결합을, 비아코어(Biacore) T100 기기[지이 헬쓰케어(GE Healthcare)]를 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 검사하였다.
대략 2000 공명 단위(RU)의 포획 시스템[10 ㎍/㎖의 염소 항 인간 IgG Fc 프레그먼트 사이언티픽(Fragment specific); 잭슨 이뮤노 리서치(Jackson Immuno Research)]을, CM4 칩(chip)(지이 헬쓰케어, BR-1005-34) 상에 pH 5.0에서 지이 헬쓰케어에 의해 공급된 아민 커플링 키트를 사용하여 커플링시켰다. 고정화를 위한 이동 완충액은 HBS-N pH 7.4(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4, 지이 헬쓰케어, BR-1006-70)였다. 수반되는 동력학적 검정을 위해, 이동 및 희석 완충액은 HBS-P pH 7.4(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,05% 계면활성제 P20, pH 7.4, 지이 헬쓰케어, BR-1006-71)였다.
유동 세포를 25℃로 설정하고 - 샘플 블럭(block)을 12℃로 설정하고 - 이동 완충액으로 2회 프라이밍하였다. 1 ㎍/㎖의 용액을 60 초 동안 10 ㎕/분의 유속으로 주입함으로써 면역컨주게이트 및 비교를 위해 모 항-CDCP1 mAb 항체(R05464169-000-0004)를 포획하였다.
용액중 다양한 농도로 180 초 동안 30 ㎕/분의 유속에서 1350 nM로 출발하여 인간 CDCP1-ECD를 주사하여 회합을 측정하였고, 1 회의 1:1.5의 희석, 및 추가의 1:3의 희석을 수반하였다. 해리 상을 300 초 이하 동안 모니터링하고 샘플 용액에서 이동 완충액으로의 전환에 의해 촉발시켰다. 60 초 동안 10 ㎕/분의 유속으로 글리신 pH 1.7 용액의 2회 연속 주사에 의해 세척함으로써 표면을 재생시켰다. 수득된 반응을 염소 항 인간 IgG Fc 표면으로부터 차감함으로써 벌크(bulk) 굴절 지수를 보정하였다. 블랭크(blank) 주사를 또한 차감한다(= 2중 참조). KD 및 다른 동력학적 매개변수의 계산을 위해, 랑뮤(Langmuir) 1:1 모델을 사용하였다.
결과는 표 1에 제시된다.
Figure pct00005
표 1에 제시된 비아코어 연구로부터의 결과는 모든 면역컨주게이트가 모 항-CDCP1 기준 항체와 비교하여 필적할만한 방식으로 CDCP1-ECD에 결합함을 입증한다.
실시예 3F
EBV 및/또는 FLU 펩타이드에 커플링된 단일클론성 항-CDCP1 항체를 포함하는 면역컨주게이트의 CDCP1 발현 인간 종양 세포(MDA-MB231) 내로의 내재화 연구
모 항-CDCP1 mAb와 비교하여 생성된 면역컨주게이트의 내재화 능력을 평가하기 위해, CDCP1 발현 인간 종양 세포주 MDA-MB231에 의한 FACS 기반의 내재화 검정을 수행하였다.
간단히, MDA-MB231 세포를 아쿠타아제에 의한 처리를 통해 탈착시키고, 원심분리에 의해 분리 배지로부터 분리하고, MDA-MB231 세포 배양 배지(RPMI/2 mM 글루타민/10% FCS)에 3 x 10E06 세포/㎖의 농도로 현탁시켰다. 50 ㎕의 세포 분취량을 면역컨주게이트 또는 모 항체(MDA-MB231 세포 배양 배지중 5 ㎍/㎖)와 함께 30 분 동안 4℃에서 항온처리하였다. 차가운 MDA-MB231 세포 배양 배지(RPMI/2 mM 글루타민/10% FCS)에 의해 2회 세척한 후, 세포를 100 ㎕의 배지에서 4℃ 또는 37℃하에 30, 60, 120, 240 분 및 하룻밤[23 시간] 동안 항온처리하였다.
언급된 시점 이후, 세포를 세척하고, 원심분리하고 알렉사(Alexa)488 표지화된 항-인간 IgG H+L(인비트로겐 A11013; BD FACS 완충액중 10 ㎍/㎖)에 의해 30 분 동안 4℃에서 염색시켰다. 2회 세척하고 원심분리한 후, 세포를 100 ㎕의 BD 셀-픽스(Cell-Fix) 완충액에 유지시키고, 염색된 세포의 MFI 신호를 BD 바이오사이언시즈 FACSCanto 유세포 분석기에 의해 분석하였다.
4℃에서 항온처리시 내재화는 검출되지 않았다. 37℃에서의 내재화 연구의 결과는 표 2에 제시된다.
Figure pct00006
FACS 기반의 내재화 연구로부터의 결과는 모든 시험된 면역컨주게이트가 모 항-CDCP1 기준 항체(R05464169-000-0004)에 필적할만하게 CDCP1 발현 MDA-MB231 종양 세포 내로 내재화됨을 보여준다.
실시예 4
MHC 클래스 I을 경유하여 제시될 수 있는 적어도 하나의 T 세포 반응 유발 펩타이드와 단일클론성 항-CD19 항체의 컨주게이션
실시예 4A
단일클론성 항-CD19 항체 및 EBV 및/또는 FLU 펩타이드를 포함하는 면역컨주게이트의 생산(여기서 펩타이드는 절단가능한 S-S 결합을 통해 항체에 커플링됨)
CD19에 특이적으로 결합하는 mAb(하이브리도마 상청액으로부터 정제된 내부 제조물)을 실시예 3A에서 사용된 펩타이드중 하나에 커플링시켰다.
면역컨주게이트의 표적 세포 내로의 내재화시 펩타이드를 방출하기 위해 디설파이드 결합을 포함하는 본 발명에 따른 면역컨주게이트의 예를 생산하기 위해, 실시예 3A에 기재된 바와 같이 디설파이드 결합을 통해 펩타이드를 항체에 컨주게이션시켰다.
생산된 본 발명에 따른 면역컨주게이트를 본원에서 다음과 같이 지칭한다:
- <CD19-SS-pEBV> 디설파이드 결합에 의해 EBV 펩타이드 426-434에 커플링된 항-CD19 MAb를 포함하는 면역컨주게이트
- <CD19-SS-pFLU> 디설파이드 결합에 의해 FLU 펩타이드 44-52에 커플링된 항-CD19 MAb를 포함하는 면역컨주게이트
- <CD19-SS-pEBV/FLU> 디설파이드 결합에 의해 EBV 펩타이드 426-434 및 FLU 펩타이드 44-52에 커플링된 항-CD19 MAb를 포함하는 면역컨주게이트
실시예 4B
EBV 및/또는 FLU 펩타이드에 커플링된 단일클론성 항-CD19 항체를 포함하는 면역컨주게이트의 CD19 발현 RL 비-호지킨의 림프종 세포로의 세포 결합 연구
면역컨주게이트의 이들 개개의 항원으로의 결합을 평가하기 위해, 실시예 4A의 면역컨주게이트의 CD19 발현 RL 세포로의 결합을 FACS 기반의 결합 검정에서 평가하였다.
간단히, RL 세포를 시험관 내에서 RPMI/2 mM 글루타민/10% FCS(낮은 IgG) 배지에서 배양하였다. 50 ㎕ 분취량의 RL 세포 현탁액(4 x 10E06 세포/㎖)을 면역컨주게이트(BD FACS 완충액중 2 ㎍/㎖)와 함께 30 분 동안 4℃에서 항온처리하였다. BD FACS 완충액으로 세척한 후, 세포를 알렉사488 표지화된 항-마우스 IgG H+L(인비트로겐 65E1-1; BD FACS 완충액중 10 ㎍/㎖)에 의해 30 분 동안 4℃에서 염색시켰다. 세척하고 원심분리한 후, 염색된 세포의 MFI 신호를 BD 바이오사이언시즈 FACSCanto 유세포 분석기에 의해 분석하였다. 결과는 도 4에 제시된다.
도 4에 제시된 FACS 기반의 세포 결합 연구로부터의 결과는 모든 면역컨주게이트가 필적할만한 방식으로 CD19 발현 RL 세포에 결합함을 입증한다.
실시예 4C
EBV 및/또는 FLU 펩타이드에 커플링된 단일클론성 항-CD19 항체를 포함하는 면역컨주게이트의 CD19 발현 인간 비-호지킨의 림프종 세포(RL 세포) 및 인간 부르키트(Burkitt)의 림프종 세포주[라모스(Ramos) 세포] 내로의 내재화에 대한 연구
모 항-CD19 mAb와 비교하여 생성된 면역컨주게이트의 내재화 능력을 평가하기 위해, CD19 발현 세포주 RL 및 라모스에 의한 FACS 기반의 내재화 검정을 수행하였다.
간단히, RL 및 라모스 세포를 시험관 내에서 RPMI/2 mM 글루타민/10% FCS(낮은 IgG) 배지에서 배양하였다. 50 ㎕ 분취량의 RL 및 라모스 세포 현탁액(4 x 10E06 세포/㎖)을 면역컨주게이트 또는 모 항-CD19 mAb(RL 세포 배양 배지중 5 ㎍/㎖)와 함께 30 분 동안 4℃에서 항온처리하였다. 차가운 RL 세포 배지에 의해 2회 세척한 후, 세포를 100 ㎕의 배지에서 4℃ 또는 37℃하에 30, 60, 120, 240 분 및 하룻밤[23 시간] 동안 항온처리하였다.
언급된 시점 이후, 세포를 세척하고, 원심분리하고 알렉사488 표지화된 항-인간 IgG H+L(잭슨 이뮤노 715-116-150 Lot 90812; BD FACS 완충액중 2.5 ㎍/㎖))에 의해 30 분 동안 4℃에서 염색시켰다. 2회 세척하고 원심분리한 후, 세포를 100 ㎕의 BD 셀-픽스 완충액에 유지시키고, 염색된 세포의 MFI 신호를 BD 바이오사이언시즈 FACSCanto 유세포 분석기에 의해 분석하였다.
4℃에서 항온처리시 내재화는 검출되지 않았다. 37℃에서의 내재화 연구의 결과는 표 3에 제시된다.
Figure pct00007
FACS 기반의 내재화 연구로부터의 결과는 시험된 면역컨주게이트가 모 항-CD19 기준 항체에 필적할만하게 CD19 발현 RL 세포 내로 내재화됨을 보여준다.
실시예 5
단일클론성 항-CDCP1 항체 및 EBV 펩타이드를 포함하는 면역컨주게이트, 및 단일클론성 항-CD19 항체 및 EBV 펩타이드를 포함하는 면역컨주게이트에 의해 종양 세포를 치료한 이후의 CD8 T 세포의 활성화
실시예 5A
건강한 공여자의 말초 혈액으로부터의 EBV 펩타이드 특이적 T 세포의 생성
건강한 공여자로부터 신선하게 단리된 PBMC중의 또는 T 세포 배양액중의 EBV 펩타이드 특이적 CD8 T 세포의 빈도를 5량체 염색을 통해 FACS에서 검사하였다.
간단히, 분취량의 4 내지 5 x 1OE05의 T 세포 배양액 또는 HLA-A2-부합된 건강한 공여자로부터의 신선하게 단리된 PBMC를 BD FACS 완충액으로 세척하고, 5 ㎕의 인간 트루스테인 FcX(바이오레전드, 422302)가 포함된 100 ㎕의 BD FACS 완충액과 함께 15 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후 10 ㎕의 비오틴 컨주게이션된 EBV-펜타머(프로이뮨, F042-84A-E)가 포함된 90 ㎕의 BD FACS 완충액을 첨가하고 1 시간 동안 4℃에서 항온처리하였다.
BD FACS 완충액으로 세척할 때, 세포를 100 ㎕의 BD FACS 완충액에서 FITC-표지화된 항-CD8a mAb(클론 LT8, 프로이뮨) 뿐만 아니라 스트렙타비딘-APC 컨주게이트에 의해 4℃에서 20 분 동안 염색시켰다. BD FACS 완충액으로 3회 세척하고 원심분리한 후, 세포를 200 ㎕의 BD FACS 완충액에 재현탁시키고, 염색된 세포의 MFI 신호를 BD 바이오사이언시즈 FACSCanto II 유세포 분석기에 의해 분석하였다. HLA-A1 공여자로부터의 세포를 4량체의 비특이적 결합의 평가를 위해 사용하였다.
본 실험에서 자극을 위해 서열 번호 2에 따른 EBV 펩타이드를 사용함을 제외하고, CMV 유래된 펩타이드에 대해 실시예 1에 기재된 프로토콜에 따라 EBV-펩타이드 특이적 T 세포를 생성하였다.
실시예 5B
단일클론성 항-CDCP1 항체 및 EBV 펩타이드를 포함하는 면역컨주게이트, 및 단일클론성 항-CD19 항체 및 EBV 펩타이드를 포함하는 면역컨주게이트에 의해 HCT-116 종양 세포를 치료한 이후의 EBV 펩타이드 특이적 T 세포의 활성화에 대한 IFNγ-ELISPOT에 의한 평가
실시예 5A에서 수득된 CD8 T 세포의 존재하에 실시예 3A, 3B(IC는 항-CDCP1 및 EBV 펩타이드를 포함함) 및 4A(IC는 항-CD19 및 EBV 펩타이드를 포함함)로부터의 면역컨주게이트(IC)에 의해 치료된 HCT-116 종양 세포를 사용하여 EBV 펩타이드 특이적 T 세포 활성화를 IFNγ-ELISPOT에 의해 평가하였다. 비교 분석을 위해, 자유 펩타이드(pEBV, 양성 대조군) 및 실시예 3A에 기재된 바와 같은 EBV 펩타이드에 커플링된 항-Dig 항체로 구성된 대조군 면역컨주게이트(<DIG-SS-pEBV>로서 지칭됨, 음성 대조군)에 의해 실험을 동시에 수행하였다.
실시예 1B에 기재된 일반적 프로토콜에 따라서 IFNγ-ELISPOT를 수행하였다.
결과는 도 5a에 제시된다.
IFNγ-ELISPOT로부터의 결과는, 시험된 면역컨주게이트들중 절단가능한 결합을 통해 커플링된 EBV 펩타이드 및 단일클론성 항-CDCP1 항체를 포함하는 면역컨주게이트(<CDCP1-SS-EBV>)만이 종양 세포에서 내재화될 경우 CD8 T 세포를 충분히 활성화시키는 반면, 비-절단가능한 결합을 통해 커플링된 EBV 펩타이드 및 단일클론성 항-CDCP1 항체를 포함하는 면역컨주게이트(<CDCP1-S-EBV>)는 펩타이드-특이적 CD8 T 세포를 활성화시킬 수 없었음을 입증한다. 표적 세포에 결합하지 않는 항체를 포함하는 면역컨주게이트(<DIG-SS-EBV> 및 <CD19-SS-EBV>)는 T-세포를 활성화시키지 않는다. 추가로, 본 발명에 따른 면역컨주게이트는 1 nmol/ℓ 미만의 낮은 양에서 조차도 CD8 T 세포를 활성화시킬 수 있다.
실시예 5C
단일클론성 항-CD19 항체 및 EBV 펩타이드를 포함하는 면역컨주게이트에 의해 RL 및 라모스 세포를 치료한 이후의 EBV 펩타이드 특이적 T 세포 활성화에 대한 IFNγ-ELISPOT에 의한 평가
종양 세포 사멸이 개개의 T 세포 반응 유발 펩타이드를 제시할 수 있는 HLA-아형을 발현하는 표적 세포에 제한됨을 입증하기 위해, 실시예 5A에서 수득된 CD8 T 세포의 존재하에 실시예 4A(IC는 항-CD19 및 HLA-A2 제한된 EBV 펩타이드를 포함함)로부터의 면역컨주게이트(IC)에 의해 치료된, HLA-A2를 발현하는 RL 세포, 및 HLA-A2를 발현하지 않는 라모스 세포를 사용하여 EBV 펩타이드 특이적 T 세포 활성화를 IFNγ-ELISPOT에 의해 평가하였다. 비교 분석을 위해, 자유 펩타이드(pEBV, 양성 대조군)에 의해 동시에 실험을 실행하였다.
실시예 1B에 기재된 일반적 프로토콜에 따라서 IFNγ-ELISPOT를 수행하였다.
결과는 도 5b에 제시되고, 이는 종양 세포 사멸이 RL 세포에서만 관찰되고 라모스 세포에서는 관찰되지 않음을 보여준다.
실시예 6
절단가능한 디설파이드 결합을 통해 EBV-펩타이드에 커플링된 단일클론성 항-CDCP1 항체를 포함하는 면역컨주게이트(여기서, EBV-펩타이드는 자연적으로 비-말단 시스테인 잔기를 포함함)의 제공 및 IFNγ-ELISPOT에 의한 CD8 T 세포 활성화에 대한 평가
T 세포 반응 유발 펩타이드가 개개의 항체의 말단에 연결되어 면역컨주게이트를 형성하는 면역컨주게이트가 실시예 3 및 4에서 제공되었지만, 본 실시예에서는, 절단가능한 디설파이드 결합을 펩타이드 및 항체의 비-말단 시스테인 잔기 사이에 형성하였다. 이를 위해, 아미노산 서열 GLCTLVAML(서열 번호 4)의 EBV-펩타이드를 제공하고 실시예 3A에 기재된 바와 같이 항-CDCP1 항체에 커플링시켰다.
상이한 수준으로 MHC I을 발현하는 상이한 종양 세포주 상에서의 펩타이드 특이적 T 세포 활성화를 IFNγ-ELISPOT에 의해 평가하였다:
- MDA-MB231, HLA-A2 높음, 및
- A375, HLA-A2 낮음.
간단히, EBV-펩타이드 GLCTLVAML을 대신 사용함을 제외하고 실시예 5B에 기재된 바와 같이 수득된 500개의 펩타이드-특이적 CD8 T 세포의 존재하에 상이한 농도의 면역컨주게이트에 의해 10,000개의 종양 세포를 개별적으로 치료하였다. 대조군으로서, 종양 세포 및 T 세포를 면역컨주게이트의 부재하에 항온처리하고, 추가의 대조군으로서, T 세포를 동일한 조건하에 단독으로 항온처리하였다.
생산된 본 발명에 따른 면역컨주게이트를 본원에서 다음과 같이 지칭하였다:
- <CDCP1-SS-pEBV(GLC)> 디설파이드 결합에 의해 EBV 펩타이드 GLCTLVAML에 커플링된 항-CDCP1 MAb를 포함하는 면역컨주게이트
IFNγ-ELISPOT의 결과는 도 5c에 제시된다. 본 발명에 따른 면역컨주게이트에 대한 시험된 종양 세포주 둘 다에 대하여 펩타이드 특이적 T 세포 활성화를 용량 의존적 방식으로 관찰하였다.
실시예 7
단일클론성 항-CDCP1 항체 및 EBV 펩타이드를 포함하는 본 발명에 따른 면역컨주게이트에 의해 치료된 MDA-MB231 종양 세포에서 CD8 T 세포 유도된 세포 사멸에 관하여 LDH 방출 검정 및 엑스셀리겐스에 의해 평가된 중재
3:1의 효과기 세포 대 표적 세포 비에서 실시예 5A에서 수득된 CD8 T 세포의 존재하에 실시예 3A, 3B(IC는 항-CDCP1 및 EBV 펩타이드를 포함함)로부터의 상이한 농도의 면역컨주게이트(IC)에 의해 치료된 MDA-MB231 종양 세포를 사용하여 EBV 펩타이드 특이적 T 세포 활성화 및 종양 세포 사멸을 LDH 방출 검정 및 엑스셀리겐스 검정에 의해 평가하였다. 비교 분석을 위해, 자유 펩타이드(pEBV, 양성 대조군)에 의해 동시에 실험을 실행하였다.
다음의 일반적 방법을 사용하여 엑스셀리겐스 시스템에서 세포 증식 및 생존력에 대한 동적 모니터링을 통해 면역컨주게이트에 의한 치료의 결과로서 바이러스성 펩타이드가 적재된 종양 세포의 사멸에 대한 평가를 수행하였다: 웰 당 50 ㎕의 종양 세포 배지를 첨가하고 RTCA 기기[로슈 어플라이드 사이언시즈(Roche Applied Sciences)]에서 초기 배경 측정(단계 1)을 수행하였다. 50 ㎕의 종양 세포 배지에 현탁된 기질을 E-플레이트에 첨가하였다. 종양 세포를 아쿠타아제에 의해 수확하고, 개개의 세포 수를 50 ㎕의 종양 세포 배지에 현탁시키고 배지를 E-플레이트에 첨가하였다.
상이한 종양 세포주에 대해 다음의 세포 수를 사용하였다: A-375: 10,000개 세포; HCT-116: 20,000개 세포; PC-3: 10,000개 세포; MDA-MB231: 10,000개 세포.
실온에서 10 분 이후, 플레이트를 RTCA 기기에 위치시키고 단계 2를 수행하였다(10 분 간격, 200 간격). 후속적으로, 플레이트를 약 24 시간 동안 항온처리하였다.
다음 날, T 세포를 AIM-V 배지에서 세척하고 AIM-V 배지에 현탁시켰다. T 세포를 200 ㎕의 총 부피로 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 RTCA 기기내에 위치시켜 단계 3을 수행하였다(5 분 간격, 300 간격). 플레이트를 하룻밤 항온처리하였다.
후속적인 LDH 방출 분석을 위해 상기 샘플을 사용하였다.
LDH 방출 평가를 위해, 1% 트리톤 X-100을 첨가함으로써 세포를 용해시켰다. 상청액을 V형 바닥의 96-웰 플레이트로 옮기고 세포 찌꺼기를 원심분리에 의해 제거하고, 세포 찌꺼기가 없는 상청액을 편평한 바닥의 96-웰 플레이트로 또 다시 옮겼다. 제조업체의 지시에 따라 LDH 세포독성 검정(로슈, #11644793001)을 사용하여 LDH 방출을 분석하였다. 간단히, 촉매 및 염료 용액을 혼합하고 100 ㎕의 생성된 반응 혼합물을 각각의 웰에 첨가하고, 실온하에 암실에서 항온처리하였다. 테칸(Tecan) ELISA 판독기를 t = 15 내지 45 분(대체적으로 30 분)에서 사용하여 492nm(기준: 620nm)에서의 흡광도를 측정하였다.
결과는 도 6a에 제시되고, 이는 본 발명에 따른 면역컨주게이트를 사용하여 강력한 종양 세포 사멸이 피코몰 농도에서 관찰될 수 있음을 보여준다.
실시예 8
단일클론성 항-CDCP1 항체 및 EBV 펩타이드(이는 자연적으로 비-말단 시스테인 잔기를 포함함)를 포함하는 본 발명에 따른 면역컨주게이트에 의해 치료된 MDA -MB231 및 A-375 종양 세포에서의 CD8 T 세포 유도된 세포 사멸에 관하여 LDH 방출 검정 및 엑스셀리겐스에 의해 평가된 중재
3:1의 효과기 세포 대 표적 세포 비에서, 자극을 위해 EBV-펩타이드 GLCTLVAML을 대신 사용함을 제외하고 실시예 5A에 따라 수득된 펩타이드 특이적 CD8 T 세포의 존재하에 상이한 농도의 실시예 6의 면역컨주게이트(IC)(IC는 자연적으로 비-말단 시스테인 잔기를 포함하는 EBV 펩타이드 및 항-CDCP1을 포함함)에 의해 치료된 MDA-MB231 및 A-375 종양 세포를 사용하여 EBV 펩타이드 특이적 T 세포 활성화 및 종양 세포 사멸을 LDH 방출 검정에 의해 및 엑스셀리겐스 검정 및 LDH 방출 평가에 의해 평가하였다. 비교 분석을 위해, 자유 펩타이드(pEBV)에 의해 2가지 상이한 펩타이드 농도로 동시에 실험을 실행하였다.
엑스셀리겐스 검정 및 LDH 방출 평가를 실시예 7에 기재된 바와 같이 수행하였다.
결과는 도 6b(A-375 세포에 대하여) 및 6c(MDA-MB231 세포에 대하여)에 제시되고, 엑스셀리겐스 검정의 데이터는 13.5 시간 이후 측정되었다.
결과는 단지 본 발명에 따른 면역컨주게이트만이 펩타이드 특이적 T 세포를 경유하여 시험된 종양 세포의 특이적 사멸을 중재할 수 있었음을 보여준다. 대조적으로, 동몰 농도의 자유 EBV 펩타이드를 사용하여서는 특이적 종양 세포 사멸이 관찰되지 않았다.
실시예 9
단일클론성 항-CDCP1 항체 및 FLU 펩타이드를 포함하는 본 발명에 따른 면역컨주게이트에 의해 치료된 종양 세포에서의 CD8 T 세포 유도된 세포 사멸에 관하여 LDH 방출 검정 및 엑스셀리겐스에 의해 평가된 중재
FLU-특이적 CD8 T 세포의 존재하에 상이한 종양 세포주(A-375, PC-3, HCT-116)의 치료를 위하여 HLA-A1 제한된 FLU-펩타이드 포함 면역컨주게이트(CDCP1-SS-pFLU, 실시예 3A에서 수득됨)를 사용하여 본 발명에 따른 면역컨주게이트의 종양 세포 사멸을 평가하였다. 펩타이드 특이적 T 세포 활성화 및 종양 세포 사멸을 실시예 7에 기재된 바와 같이 LDH 방출 검정 및 엑스셀리겐스 검정에 의해 평가하였다.
시험된 세포주는 표적(CDCP-1)의 HLA-아형 및 발현에 관한 다음의 특징을 제공한다:
Figure pct00008
엑스셀리겐스 분석으로부터의 결과는 도 7a 내지 7c에 제시된다. LDH 방출 검정으로부터의 결과는 도 7d 내지 7f에 제시된다.
면역컨주게이트에 의한 종양 세포의 치료시 효과적인 종양 세포 사멸은 모든 시험된 종양 세포주에 대해 관찰되었다. 자유 펩타이드의 사용과 비교할 경우, 면역컨주게이트는 100 배 더 높은 농도의 자유 펩타이드에 비해 더 효과적으로 T 세포 활성화를 중재한다.
면역컨주게이트에 의해 중재된 종양 세포 사멸은 면역컨주게이트에 의해 치료한지 6 시간 후에 이미 관찰될 수 있었고, 이는 펩타이드가 MHC 클래스 I을 경유하여 제시되기 위해 시토졸에서 항원 가공 장치로 수송될 필요가 없음을 나타낸다. 또한, 시간이 경과함에 따라 종양 세포 사멸이 증가된 것으로 관찰된 반면, -대조적으로- 자유 펩타이드에 의해 중재된 종양 세포 사멸은 항온처리 시간이 길어질 수록 대체적으로 감소하였다. 유사한 효과가 상이한 종양 세포주에서 관찰되었고, 이는 이러한 효과가 표적 세포에서의 MHC 클래스 I 발현 수준과 무관함을 나타낸다. 엑스셀리겐스 분석 결과는 LDH 방출 검정의 결과에 의해 확인되었다.
실시예 10: 개념 I의 생체내 증명
huPBMC(EBV-특이적 CD8 T 세포를 포함함)가 정맥내로 전달된 MDA-MB231 s.c. 모델에서의 단일클론성 항-CDCP1 항체 및 EBV 펩타이드를 포함하는 본 발명에 따른 면역컨주게이트의 항-종양 활성
NOG 마우스에 인간 종양 세포[5 x 106 미오(Mio) MDA-MB231]를 피하 주사를 통해 0 일째 이종이식시켰다. 인간 PBMC 자극(∼10% CLG-펩타이드 EBV-특이적 CD8 T 세포)을 0 일 및 20 일째 정맥내 전달 1O x 106을 통해 2회 적용하였다(도 8A에서의 세부사항 참조). 항체/면역컨주게이트의 치료 계획은 다음과 같았다:
<CDCP1>-IgG4-SS-CLG 펩타이드(실시예 3에 기재된 바와 같이 생성, IgG4 불변성 쇄를 가짐):
5 mg/kg(날짜: 0, 3, 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27, 30 일)
대조군 AB: <CDCP1>-IgG4(IgG4 불변성 쇄):
5 mg/kg(날짜: 0, 3, 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27, 30 일)
시험 체계 및 결과는 도 8a 및 8b에 제시된다. 이 결과는 CLG-특이적 huPBMC가 양자 면역 전달(adoptive transfer)된 MDA-MB231 s.c. 이종이식 모델에서 단일클론성 항-CDCP1 항체를 포함하는 본 발명에 따른 면역컨주게이트의 생체내 효능을 입증한다.
실시예 11: 개념 II의 생체내 증명
huPBMC(EBV-특이적 CD8 T 세포를 포함함)가 정맥내로 전달된 확립된 MDA-MB231 s.c. 모델에서 항-PD1 치료와 조합된 단일클론성 항-CDCP1 항체 및 EBV 펩타이드를 포함하는 본 발명에 따른 면역컨주게이트의 항-종양 활성
NOG 마우스에 인간 종양 세포(5 x 106 미오 MDA-MB231)를 피하 주사를 통해 0 일째 이종이식시켰다. 인간 PBMC 자극(∼10% CLG-펩타이드 EBV-특이적 CD8 T 세포)을 20 일 및 32 일째 정맥내 전달 1O x 106을 통해 2회 적용하였다(도 8A에서의 세부사항 참조). 시험 컨주게이트 <CDCP1>-IgGl-PGLala-SS-CLG 펩타이드{실시예 3에 기재된 바와 같이 생성됨, Fc 부분에서 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G[카밧(Kabat) EU 지수]를 갖는 IgG1 불변성 쇄를 가짐}에 의한 시험군 및 대조군 항체 <CDCP1>-IgGl PGLALA에 의한 대조군(양쪽 군에 대해 항-PDl 항체의 첨가가 플러스됨)의 시험 계획은 다음과 같았다:
Figure pct00009
시험 체계 및 결과는 도 9a 및 9b에 제시된다. 이 결과는 EBV CLG-특이적 huPBMC가 양자 면역 전달된 MDA-MB231 이종이식 모델에서의 단일클론성 항-CDCP1 항체를 포함하는 본 발명에 따른 면역컨주게이트 + 항-PD-1 치료법의 조합 효과를 입증한다. 항 PD-1 항체와 조합하여 ATPP로 치료한 후 종양에서 CLG-특이적 T-세포의 강한 증가가 보여졌다.
<110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> IMMUNOCONJUGATES FOR SPECIFIC INDUCTION OF T CELL CYTOTOXICITY AGAINST A TARGET CELL <130> P32622-WO <140> PCT/EP2016/053332 <141> 2016-02-17 <150> EP 15155598.4 <151> 2015-02-18 <150> EP 15199306.0 <151> 2015-12-10 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Human herpesvirus 5 <220> <221> misc_feature <223> Human herpesvirus 5 (CMV) peptide pp65 495-503 <400> 1 Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <220> <221> misc_feature <223> Epstein-Barr virus (EBV) peptide LMP-2 426-434 <400> 2 Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> misc_feature <223> Influenza A (FLU) peptide NP 44-52 <400> 3 Cys Thr Glu Leu Lys Leu Ser Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <220> <221> misc_feature <223> Epstein-Barr virus (EBV) peptide BLMF-1 280-288 <400> 4 Gly Leu Cys Thr Leu Val Ala Met Leu 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Human herpesvirus 5 <220> <221> misc_feature <223> Human herpesvirus 5 (CMV) peptide 309-317 <400> 5 Cys Arg Val Leu Cys Cys Tyr Val Leu 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified Human herpesvirus 5 (CMV) peptide pp65 495-503 (cCMV peptide) <400> 6 Cys Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified Human herpesvirus 5 (CMV) peptide pp65 495-503 (CMVc peptide) <400> 7 Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val Cys 1 5 10 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified Human herpesvirus 5 (CMV) peptide pp65 495-503 (rcCMV peptide) <400> 8 Cys Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified Human herpesvirus 5 (CMV) peptide pp65 495-503 (CMVrc peptide) <400> 9 Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Cys 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified Human herpesvirus 5 (CMV) peptide pp65 495-503 (CMVpen peptide) <220> <221> misc_feature <223> Xaa is penicillamine <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 10 Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Xaa 1 5

Claims (16)

  1. 절단가능한 결합을 통해 표적 세포 결합 모이어티(moiety)에 커플링되고 MHC 클래스(class) I을 경유하여 제시될 수 있는 하나 이상의 T 세포 반응 유발 펩타이드를 포함하는 면역컨주게이트로서,
    상기 절단가능한 결합은 절단시 MHC 클래스 I 분자를 경유하여 직접적으로 제시될 수 있는 상기 T 세포 반응 유발 펩타이드가 상기 면역컨주게이트로부터 방출되도록 배열되는, 면역컨주게이트.
  2. 제1항에 있어서,
    T 세포 반응 유발 펩타이드가 자연적으로 발생하는 T 세포 반응 유발 펩타이드인 면역컨주게이트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    T 세포 반응 유발 펩타이드가 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 면역컨주게이트.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서,
    절단가능한 결합이 화학적, pH 의존적 또는 효소적 절단에 의해 절단될 수 있는 면역컨주게이트.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서,
    절단가능한 결합이 표적 세포의 엔도솜 구획 내에서 절단될 수 있는 면역컨주게이트.
  6. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서,
    표적 세포가 종양 세포인 면역컨주게이트.
  7. 제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서,
    표적 세포 내로 내재화(internalized)될 수 있는 면역컨주게이트.
  8. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서,
    면역컨주게이트가 전좌(translocation) 도메인을 포함하지 않는 면역컨주게이트.
  9. 제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서,
    면역컨주게이트가 표적 세포 내로 내재화된 후 12 시간 이내에 T 세포 반응 유발 펩타이드가 MHC 클래스 I 분자를 경유하여 표적 세포의 표면 상에 제시되는 면역컨주게이트.
  10. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 따른 면역컨주게이트를 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 약학 조성물.
  11. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 따른 면역컨주게이트를 생성하기 위한, MHC 클래스 I을 경유하여 제시될 수 있는 T 세포 반응 유발 펩타이드의 용도.
  12. 표적 세포에 대항하여 T 세포 세포독성을 특이적으로 유도하기 위한, 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 따른 면역컨주게이트의 용도.
  13. a) 재조합 표적 세포 결합 모이어티를 제공하는 단계,
    b) T 세포 반응 유발 펩타이드를 제공하는 단계, 및
    c) 하나 이상의 상기 T 세포 반응 유발 펩타이드를 상기 표적 세포 결합 모이어티에 절단가능한 결합을 통해 커플링시키는 단계
    를 포함하는, 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 따른 면역컨주게이트의 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    변형되지 않은 T 세포 반응 유발 펩타이드를 표적 세포 결합 모이어티에 커플링시키는 방법.
  15. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서,
    약제로서 사용하기 위한 면역컨주게이트.
  16. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 따른 면역컨주게이트를 질환의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 앓는 환자의 치료 방법.
KR1020177022471A 2015-02-18 2016-02-17 표적 세포에 대항하여 t 세포 세포독성을 특이적으로 유도하기 위한 면역컨주게이트 KR20170116039A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15155598 2015-02-18
EP15155598.4 2015-02-18
EP15199306 2015-12-10
EP15199306.0 2015-12-10
PCT/EP2016/053332 WO2016131856A1 (en) 2015-02-18 2016-02-17 Immunoconjugates for specific induction of t cell cytotoxicity against a target cell

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20170116039A true KR20170116039A (ko) 2017-10-18

Family

ID=55398291

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177022471A KR20170116039A (ko) 2015-02-18 2016-02-17 표적 세포에 대항하여 t 세포 세포독성을 특이적으로 유도하기 위한 면역컨주게이트

Country Status (18)

Country Link
US (1) US20180078655A1 (ko)
EP (1) EP3258969B1 (ko)
JP (1) JP6791865B2 (ko)
KR (1) KR20170116039A (ko)
CN (1) CN107249641B (ko)
AU (2) AU2016221777A1 (ko)
BR (1) BR112017016379A2 (ko)
CA (1) CA2975439A1 (ko)
ES (1) ES2727552T3 (ko)
HK (1) HK1245103A1 (ko)
IL (1) IL253693B (ko)
MX (1) MX361695B (ko)
MY (1) MY187178A (ko)
PL (1) PL3258969T3 (ko)
RU (1) RU2746021C2 (ko)
SG (1) SG11201706667XA (ko)
WO (1) WO2016131856A1 (ko)
ZA (1) ZA201705223B (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103561771B (zh) * 2011-03-17 2019-01-04 伯明翰大学 重新定向的免疫治疗
US11583593B2 (en) 2016-01-14 2023-02-21 Synthis Therapeutics, Inc. Antibody-ALK5 inhibitor conjugates and their uses
MY202196A (en) 2017-06-23 2024-04-16 Verimmune Inc Chimeric virus-like particles and uses thereof as antigen-specific redirectors of immune responses
WO2020139978A1 (en) 2018-12-27 2020-07-02 Verimmune Llc Conjugated virus-like particles and uses thereof as anti-tumor immune redirectors
WO2020256721A1 (en) * 2019-06-19 2020-12-24 Synthis, Llc Antib0dy-alk5 inhibitor conjugates and their uses
AU2021364548A1 (en) 2020-10-19 2023-06-08 Verimmune Inc. Virus-inspired compositions and methods of redirecting preexisting immune responses using the same for treatment of cancer

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5494801A (en) 1993-12-03 1996-02-27 Biostar, Inc. Microorganism antigen extraction methods
EP0659438A1 (en) * 1993-12-23 1995-06-28 Boehringer Mannheim Gmbh Conjugates consisting of peptidic T cell antigens and cell binding groups, and their use for therapy
ES2166368T3 (es) * 1993-12-24 2002-04-16 Merck Patent Gmbh Inmunoconjugados.
WO1999045954A1 (en) * 1998-03-13 1999-09-16 Epimmune, Inc. Hla-binding peptides and their uses
ATE370234T1 (de) * 1998-09-01 2007-09-15 Us Gov Health & Human Serv Page-4, ein gage-ähnliches gen auf dem x- chromosom das von neoplastischer prostata, testis und uterus exprimiert wird, und dessen anwendungen
CN1649902B (zh) * 2002-03-01 2011-04-13 免疫医疗公司 内在化抗-cd74抗体和使用方法
AU2002950183A0 (en) * 2002-07-12 2002-09-12 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research Expression of hydrophobic proteins
EP1569514A4 (en) * 2002-08-16 2007-10-31 SPECIFIC ANTIGEN OF TUMORS, PEPTIDES ASSOCIATED THERETO AND USE THEREOF AS IMMUNOMINAL VACCINES
DE10242146A1 (de) 2002-09-04 2004-03-18 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum Antikörper zur Identifizierung und/oder Isolierung von hämatopoetischen Stammzellen
BRPI0418273A (pt) * 2003-12-31 2007-05-02 Sanofi Pasteur Inc imunógenos alvejados
GB0720118D0 (en) * 2007-10-15 2007-11-28 Achour Adnane Modified mhc class 1 binding peptides
ES2700984T3 (es) * 2012-12-21 2019-02-20 Hoffmann La Roche Proteínas multifuncionales que comprenden MHC de clase I multivalente unida por disulfuro

Also Published As

Publication number Publication date
MX361695B (es) 2018-12-13
RU2746021C2 (ru) 2021-04-06
CN107249641B (zh) 2021-07-09
BR112017016379A2 (pt) 2018-03-27
ES2727552T3 (es) 2019-10-17
RU2017132324A (ru) 2019-03-18
ZA201705223B (en) 2022-03-30
SG11201706667XA (en) 2017-09-28
EP3258969B1 (en) 2019-03-20
MX2017010335A (es) 2017-12-20
JP2018511571A (ja) 2018-04-26
CN107249641A (zh) 2017-10-13
PL3258969T3 (pl) 2019-08-30
WO2016131856A1 (en) 2016-08-25
JP6791865B2 (ja) 2020-11-25
CA2975439A1 (en) 2016-08-25
AU2021266316A1 (en) 2021-12-09
IL253693A (en) 2019-08-29
RU2017132324A3 (ko) 2019-09-09
AU2016221777A1 (en) 2017-08-31
MY187178A (en) 2021-09-08
HK1245103A1 (zh) 2018-08-24
EP3258969A1 (en) 2017-12-27
IL253693B (en) 2021-09-30
US20180078655A1 (en) 2018-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20170116039A (ko) 표적 세포에 대항하여 t 세포 세포독성을 특이적으로 유도하기 위한 면역컨주게이트
US20190322731A1 (en) Molecular Complex for Targeting Antigens Towards Cells Comprising Antigens and Uses Thereof for Vaccination
US10849965B2 (en) H3.3 CTL peptides and uses thereof
US11642409B2 (en) Immunomodulatory fusion protein-metal hydroxide complexes and methods thereof
US20230167185A1 (en) Cd40 binding protein
US20220118069A1 (en) H3.3 ctl peptides and uses thereof
JP6218175B2 (ja) ヘルパーｔ細胞誘導性ポリペプチドの改変
US20220000998A1 (en) Bi-specific conjugates
US20230257429A1 (en) Peptide adjuvant for its therapeutic applications in viral and tumour vaccine development and cancer immunotherapy and autoimmune disease diagnosis and treatments
JP2023538002A (ja) 制御性ｔ細胞エピトープ
JPWO2021195492A5 (ko)

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application