ES2307502T3 - Composicion y procedimiento para modular la interaccion entre celulas dentrificas y linfocitos t. - Google Patents
Composicion y procedimiento para modular la interaccion entre celulas dentrificas y linfocitos t. Download PDFInfo
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Abstract
Utilización de un anticuerpo que se une al receptor denominado DC-SIGN, en la superficie de una célula dendrítica y que se representa como SEC ID nº 2 o una variante natural o fragmento del mismo, en la preparación de un medicamento destinado a reducir una respuesta inmune en un animal, en la que dicho anticuerpo inhibe la interacción entre una célula dendrítica y un linfocito T.
Description
Composición y procedimiento para modular la
interacción entre células dendríticas y linfocitos T.
La presente invención se refiere a composiciones
y a su utilización para reducir la respuesta inmune en un animal,
tal como el hombre u otro mamífero.
En una forma de realización, la invención se
refiere a composiciones y a su utilización para reducir la adhesión
de las células dendríticas a los linfocitos T.
Más específicamente, esta forma de realización
de la invención se refiere a composiciones y a su utilización para
reducir la adhesión de receptores de lectina tipo C en la superficie
de las células dendríticas a los receptores ICAM en la superficie
de los linfocitos T. Modulando esta adhesión, ambas interacciones
células dendríticas-linfocitos T, tal como la y la
presentación antigénica, así como, por ejemplo, las respuestas
primarias de los linfocitos T dependientes de ellas, pueden verse
influenciadas, dando lugar a una modulación de la respuesta
inmunitaria.
Las composiciones de la invención pueden por
tanto utilizarse para alterar las respuestas inmunes a antígenos
específicos, así como las respuestas inmunes producidas por
trastornos del sistema inmunitario, tal como puede darse en las
enfermedades autoinmunes o en las alergias.
En otra forma de realización, el procedimiento
de la invención puede utilizarse además en el tratamiento de las
infecciones por el VIH y trastornos similares del sistema inmune,
así como para modular la respuesta inmune a injertos o después de
trasplantes.
La invención se basa en el sorprendente
descubrimiento de que la adhesión de las células dendríticas a los
linfocitos T está mediada por un receptor lectina de tipo C en la
superficie de las células dendríticas. Asimismo, se ha encontrado
que esta lectina de tipo C se une a receptores ICAM en la superficie
de los linfocitos T. Con el término "receptor(es) ICAM"
se quieren significar ambos receptores, el ICAM-2 y
el ICAM-3, en particular el receptor
ICAM-3.
La invención se basa además en el hallazgo de
que la inhibición de este receptor de lectina tipo C en las células
dendríticas por anticuerpos específicos dirigidos contra el receptor
de lectina tipo C puede modular, y más específicamente reducir, la
adhesión de los linfocitos T a las células dendríticas, pudiendo por
tanto influenciar la respuesta inmune, en particular sus estados
iniciales.
El documento WO 96/23882 da a conocer un
receptor murino y humano con dominios de lectinas de tipo C que se
expresa abundantemente en la superficie de células dendríticas y
células epiteliales tímicas. El receptor murino -denominado
"DEC-205"- se describe como una proteína de 295
kDa con un punto isoeléctrico de aproximadamente 7,5 que contiene
10 dominios de lectina de tipo C y que es homólogo al receptor
macrofágico de la manosa (MMR).
El documento WO 96/23882 describe además
anticuerpos monoclonales y policlonales contra
DEC-205. Sin embargo, estos anticuerpos no pudieron
bloquear la función de las células dendríticas. En particular, los
anticuerpos monoclonales y policlonales
anti-DEC-205 no pudieron inhibir la
interacción entre las células dendríticas y los linfocitos T
auxiliadores, tanto in vitro (tal como se determinó por la
incapacidad de los anti-DEC-205
para inhibir la proliferación de los linfocitos T alogénicos en una
reacción leucocitaria mezclada de sentido único) como in
vivo (tal como se determinó por la incapacidad de
anti-DEC-205 para inhibir una
respuesta in vivo, es decir, en una reacción injerto local-
con respecto a un huésped (GVH). Estos resultados sugieren que el
receptor DEC-205 no está implicado en la interacción
célula dendrítica-linfocito T (es decir, la
adhesión), y que los anticuerpos
anti-DEC-205 no pueden utilizarse
para modular la respuesta inmune.
Curtis et al, en Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 89 (1992), páginas 8356-8360, así como en el
documento WO 93/01820, describe un receptor gp 120
no-CD4 aislado y clonado a partir del tejido de la
placenta humana. Este receptor gp 120 se expresa en células de
mamíferos que no exhiben altos niveles de CD4, tales como la
placenta, músculo esquelético, cerebro, células neurales y mucosas,
así como otros tejidos y células que incluyen colon, timo, corazón,
linfocitos T, linfocitos B y macrófagos (pero no en el hígado o en
el riñón). La secuencia aminoácida del receptor gp 120 de lectina
de tipo C que se da a conocer en las SEC ID nº 1 y 2 de WO 93/01820
posee un alto grado de homología secuencial (>98%) con las
lectinas de tipo C que se encuentran ahora presentes en las
células
dendríticas.
dendríticas.
Curtis y WO 93/01820 consideran además la
función que este receptor de lectina de tipo C juega en la infección
de las células/tejidos mencionados anteriormente con el VIH, es
decir, mediante la unión de la glicoproteína gp 120 de la envuelta
principal del VIH antes de la internalización del virión en la
célula. Se descubrió que la inhibición del receptor gp 120 de
lectina de tipo C puede reducir o inhibir la infección por el VIH
de estas células o tejidos. Como inhibidores apropiados, WO 93/01820
da a conocer hidratos de carbono de manosa, carbohidratos de
fucosa, lectinas de plantas tales como concanavalina A, antibióticos
específicos tales como pradimicina A, y azúcares tales como
N-acetil-D-glucosamina
y galactosa (que, sin embargo, se describen como menos potentes).
Estos compuestos y las composiciones que los contienen se utilizan
in vitro o in vivo para inhibir la unión del VIH a la
superficie
celular.
celular.
WO 93/01820 da a conocer además que la unión del
VIH a las células COS-7 puede inhibirse mediante la
preincubación de gp 120 con un anticuerpo monoclonal
anti-gp 120 (denominado "anticuerpo 110.1").
Sin embargo, este anticuerpo no se dirige contra las lectinas de
tipo C, sino contra la proteína gp 120.
Sin embargo, ni Curtis ni WO 93/01820 mencionan
o sugieren la presencia de dicha lectina de tipo C en las células
dendríticas, ni estas referencias mencionan o sugieren su función en
la interacción de la célula dendrítica-linfocito T
durante las etapas iniciales de una respuesta inmune.
WO 95/32734 describe composiciones puente (o de
la reticulación) Fc\gammaRII (CD32) y su utilización para modular
la respuesta inmune para antígenos específicos. Esta referencia está
basada en el hallazgo de que la reticulación de las moléculas
Fc\gammaRII (CD32) sobre las células presentadoras de antígenos
(APC) afecta la expresión de las moléculas B7-1/2
coestimulatorias esenciales (es decir, evita su aumento regulado) y
perjudica de ese modo la expresión de (es decir, provoca la
disminución de la modulación de) la molécula de adhesión
ICAM-3, con la consecuencia funcional de una
afectación de la capacidad de los monocitos para coestimular la
activación de los linfocitos T antígeno-específicos
(es decir, dando lugar a la modulación de la insensibilidad de los
linfocitos T antígeno específicos). El agente de reticulación se
selecciona de entre moléculas IgG humanas agregadas o de sus
fragmentos Fc; de anticuerpos monoclonales bi- o multivalentes para
FcyRII o sus fragmentos; o de una fusión de dos o más partes de IgG
Fc humanos.
El documento WO 95/32734 se dirige, por tanto, a
la modulación (por ejemplo, inhibición) de la señal de
coestimulación necesaria para la activación de los linfocitos T
(además de la señal primaria de la interacción TcR/CD3), en
particular para inducir la proliferación y maduración en las células
efectoras. WO 95/32734 no se dirige a modular la adhesión de las
células dendríticas-linfocitos T, ni da a conocer o
sugiere la presencia de lectinas del tipo C en (la superficie de)
las células dendríticas o su interacción con los receptores
ICAM-3 en los linfocitos T.
El documento WO 98/02456 da a conocer un grupo
de lectinas de tipo C II humano, aislado a partir de una biblioteca
de macrófagos humanos estimulados. El documento WO 98/49306 da a
conocer un grupo IV de lectinas de tipo C que se encuentran en
proteínas asociadas a la pancreatitis humana ("PAP"). El
documento WO 98/41633 da a conocer un grupo V de lectinas humanas
de tipo C aisladas de un clon tumoral humano.
Los documentos WO 98/02456, WO 98/49306 y WO
98/41633 dan a conocer además procedimientos para producir
anticuerpos contra estas lectinas de tipo C.
Sin embargo, ninguna de estas referencias se
refiere a lectinas de tipo C en células dendríticas; las lectinas
de tipo C que se dan a conocer en estas referencias, difieren de las
lectinas de tipo C que se describen allí respecto al origen, en su
función biológica, y en su estructura.
Las células dendríticas (DC) son células
profesionales presentadoras de antígenos que capturan a éstos en
los tejidos periféricos y migran mediante la linfa o la sangre al
área de los linfocitos T de los nódulos linfáticos de drenaje y del
bazo. Aquí presentan los antígenos procesados a los linfocitos T
indiferenciados, iniciando respuestas
antígeno-específicas primarias de los linfocitos
T.
Debido a su posición en la superficie del
organismo como células de inmunovigilancia, es probable que las DC
sean las primeras células que se infecten con el
VIH-1 después de la exposición de las mucosas y que
estén implicadas, por tanto, en desempeñar una función importante
en la inmunopatogénesis del VIH. Se cree generalmente ahora que el
VIH transforma el proceso normal de tráfico de DC para poder
penetrar en los nódulos linfáticos y acceder a las células CD4+ T,
tal como se ha demostrado in vivo utilizando, como sistema
modelo, la infección del macaco mediante el virus de la
inmunodeficiencia simia primaria (Spira et al., 1996) (Joag
et al., 1997). Varios investigadores han informado de la
infección productora de DC con VIH-1
(Granelli-Piperno et al., J. Virol
72(4), 2733-7, 1998) (Blauvelt et al,
Nat Med 3(12), 1369-75, 1997), y existe una
evidencia sustancial que indica que las DC (sometidas) a impulsos
con el VIH-1 in vitro, pueden inducir una
intensa infección cuando se cocultivaron con linfocitos T (Cameron
et al., Science 257(5068), 383-7,
1992). Aunque no está todavía claro si una escena similar tiene
lugar en los individuos infectados con el VIH-1, la
transmisión del VIH-1 desde DC a los linfocitos T
podría contribuir al vaciamiento observado de las células CD4+ T
que se observa en el SIDA. El estudio de las interacciones
VIH-DC podría contribuir al conocimiento de los
eventos tempranos de la infección por VIH, y conduciría
esperanzadamente a estrategias dirigidas a bloquear los eventos
tempranos en la transmisión. Para ulteriores consideraciones, se
hace referencia, asimismo, en WO 95/32734 y WO 96/23882.
Las DC son únicas en su capacidad para
interaccionar con y activar los linfocitos T en reposo. Sin embargo,
anteriormente a la presente invención, fue ampliamente desconocido
cómo el contacto células DC-T es iniciado y
regulado. En la presente memoria, se investiga la función de
ICAM-3 en las interacciones celulares
DC-T. Se ha demostrado que, aunque las DC se
adhieren intensamente a ICAM-3, esta adhesión no es
mediada por LFA-1, \alphaD o cualquier otra
integrina. En la búsqueda de este nuevo receptor
ICAM-3 en DC, se clonó un receptor de lectina de
tipo C, denominado DC-SIGN, que se expresa
preferentemente por DC. Además de su función prominente en el
agrupamiento de las células DC-T y del inicio de las
respuestas de los linfocitos T, descubrimos que
DC-SIGN constituye un receptor importante de
VIH-1 implicado en la infección de DC y
subsiguientemente en la transmisión del VIH-1 a los
linfocitos T. De este modo, el VIH-1 y los
linfocitos T en reposo explotan un receptor similar que se expresa
intensamente para interaccionar con DC.
En un primer aspecto, la invención se refiere a
la utilización de un anticuerpo que se une al receptor denominado
DC-SIGN en la superficie de una célula dendrítica, y
que se representa como SEC ID nº 2 o una variante natural o un
fragmento suyo, en la preparación de un medicamento para reducir una
respuesta inmune en un animal, en el que dicho anticuerpo inhibe la
interacción entre una célula dendrítica y un linfocito T.
En particular, el anticuerpo puede reducir la
adhesión entre una célula dendrítica y un linfocito T.
Especialmente, el anticuerpo puede reducir la
adhesión entre DC-SIGN en la superficie de una
célula dendrítica y un receptor ICAM en la superficie de un
linfocito T.
La secuencia aminoácida de una lectina de tipo C
denominada DC-SIGN que se encontró que estaba
implicada en la unión de las células dendríticas a los linfocitos
T, se muestra en SEC ID nº 1 y en la figura 9. Este receptor de
lectina de tipo C es esencialmente similar al receptor gp 120 de la
lectina de tipo C, descrito por Curtis et al en Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 89 (1992), páginas 8356-8360 y en el
documento WO 93/01820. En particular, presenta un alto grado de
homología (< 98%) con la secuencia aminoácida que se aprecia en
SEC ID nº 1 de WO 93/01820. Es un grupo II de lectina de tipo C de
404 aminoácidos, con un Mr aparente de aproximadamente 44 kDa; y
con un primer dominio (Met 1 a Ala 76) que comprende un extremo
amino citoplásmico, un segundo dominio (Ile 77 a Val 249) que
comprende repeticiones en tándem, y un tercer dominio (Cys 253 a Ala
404) con un alto grado de homología para otras lectinas conocidas
de tipo C que constituyen proteínas de membrana de tipo II. A
continuación, se proporciona una caracterización posterior.
En la invención, se encontró que la lectina de
tipo C en las células dendríticas se unía a los receptores ICAM en
la superficie de los linfocitos T.
De acuerdo con esto, las composiciones de la
invención pueden utilizarse para modular (es decir, alterar y/o
modificar) y, más específicamente, inhibir (es decir, reducir y/o
afinar)las interacciones entre las células dendríticas y los
linfocitos T.
Dichas interacciones incluyen la adhesión de los
linfocitos T a las células dendríticas, por ejemplo, en la
agrupación de células dendríticas-linfocitos T, la
activación de los linfocitos T y además, incluyen todas las
interacciones que se basan en el contacto entre las células
dendríticas y los linfocitos T, lo que pretende hacer referencia al
contacto directo célula a célula, o la proximidad de las células
dendríticas y los linfocitos T.
Dichas otras interacciones incluyen, pero no se
limitan a procedimientos implicados en generar una respuesta
inmune, en particular durante las etapas iniciales de dicha
respuesta, tal como la sensibilización/activación primaria de los
linfocitos T (es decir, la presentación del antígeno y/o de los
péptidos unidos a MHC a los linfocitos T) y la coestimulación de
los linfocitos T; así como procesos tales como señalización química,
endocitosis y transporte trans-epitelial. Para un
debate en general de las interacciones células
dendríticas-linfocitos T, todas las cuales pueden
estar influenciadas por las composiciones de la invención, a
continuación se hace referencia al debate, así como a los
documentos WO 95/32734 y WO 96/23882.
Las composiciones de la invención pueden, por
tanto, utilizarse para influenciar la capacidad inmunomoduladora de
las células dendríticas; para modular, y en particular reducir, las
respuestas de los linfocitos T (primarias) mediadas por las células
dendríticas, y/o generalmente para influenciar, y en particular
inhibir, el sistema inmune.
Algunas aplicaciones específicas incluyen la
prevención o la inhibición de las respuestas inmunes a antígenos
específicos; inducción de la tolerancia; inmunoterapia;
inmunosupresión, por ejemplo para prevenir el rechazo al
trasplante; el tratamiento de enfermedades autoinmunes tales como
tiroiditis, artritis reumatoidea, lupus eritematoso sistémico
(SLE); esclerosis múltiple y diabetes autoinmune; y la prevención o
el tratamiento de las alergias.
Las composiciones de la invención pueden también
modular la activación de otros receptores en los linfocitos T, que
dependen de la adhesión o de la proximidad de las células
dendríticas a los linfocitos T. Además, el hallazgo de la invención
de que una lectina de tipo C en las células dendríticas se une a los
receptores ICAM en los linfocitos T, puede hacer accesibles nuevas
estrategias o posibilidades para influenciar la interacción entre
las células dendríticas y los linfocitos T, y de ese modo modular el
sistema inmune en general.
Además, las composiciones de la invención pueden
utilizarse para prevenir o reducir la transferencia de sustancias
desde las células dendríticas a los linfocitos T, tales como
sustancias químicas, factores de señalización tales como
quimiocinas y/o interleucinas, etc., y en particular de partículas
víricas tales como el VIH. De esta forma, utilizando las
composiciones de la invención, no sólo puede inhibirse la adhesión
inicial de NV a las células dendríticas, sino también la
propagación de la infección por el VIH desde las células dendríticas
a los linfocitos T.
Este hallazgo es de particular importancia, pues
se cree que las células dendríticas pueden servir como una
"reserva" del VIH, en particular durante las etapas iniciales
de la infección MV. Las composiciones de la invención pueden, por
tanto, no sólo utilizarse para prevenir la infección por VIH de las
células dendríticas, sino también para reducir la propagación de la
infección por el VIH a los linfocitos T después de que las células
dendríticas hayan sido infectadas, retardando, por lo tanto, el
proceso de la enfermedad.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Asimismo, se sabe que la activación de los
linfocitos T -a saber, en las glándulas linfáticas-, desempeña un
papel importante en el desarrollo del SIDA en un paciente infectado
con el VIH. Se cree que las composiciones de la invención pueden
utilizarse para prevenir, inhibir o por lo menos, retrasar, dicha
activación de los linfocitos T y, por tanto, ralentizar el comienzo
y/ el progreso de la enfermedad.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
refiere además a la utilización de un anticuerpo que se une al
receptor denominado DC-SIGN, en la superficie de una
célula dendrítica y que está representado como SEC ID nº 2 o una
variante natural o fragmento suyo, en la preparación de un
medicamento para inhibir la adhesión de la proteína superficial del
VIH (es decir, gp 120) a la superficie de una célula dendrítica y
por tanto, la entrada del VIH en dicha célula dendrítica.
Los compuestos que pueden utilizarse como
inhibidores para las lectinas del tipo C, son conocidos per
se, incluyendo los que se describen en el documento WO
93/01820, como se ha mencionado anteriormente.
En general, estos son compuestos que pueden
unirse o adherirse a (por ejemplo, de forma reversible) o que
pueden servir como un ligando para las lectinas de tipo C, en
particular la lectina de tipo C de SEC ID nº 1/figura 9, o
variantes naturales o equivalentes suyos. Ejemplos son carbohidratos
de manosa, tales como el manano y la D-manosa, los
carbohidratos de fucosa tales como la L-fucosa; las
lectinas vegetales tales como la concanavalina A; antibióticos
tales como la pradimicina A; azúcares como la
N-acetil-D-glucosamina
y la galactosa (que sin embargo son descritos como menos potentes);
así como compuestos peptidomiméticos apropiados y pequeñas
moléculas medicamentosas, que pueden identificarse, por ejemplo,
utilizando técnicas de visualización fágica. Además, pueden
utilizarse proteínas tales como gp 120 y análogos o fragmentos
suyos, o proteínas similares con capacidad de unión a lectinas de
tipo C en células dendríticas, así como
receptores-ICAM aislados y análogos suyos,
incluyendo parte o sus fragmentos. Dichas partes o fragmentos
deberán entonces ser todavía tales que puedan unirse a las lectinas
de tipo C en la superficie de las células dendríticas.
Sin embargo, la utilización de carbohidratos se
desea menos habitualmente desde un punto de vista terapéutico, pues
pueden ser metabolizados rápidamente in vivo. Asimismo, la
utilización de lectinas vegetales tal como la concanavalina A y el
antibiótico pradimicina pueden presentar desventajas en una posición
terapéutica, en particular cuando se tratan pacientes con
trastornos autoinmunes y/o infecciones HN.
Pueden utilizarse uno o más compuestos
fisiológicos tolerables y/o farmacéuticamente aceptables, tales como
se definen en el documento WO 93/01820. Por ejemplo, la utilización
de gp 120 o sus derivados puede provocar efectos secundarios
indeseables, en particular sobre el sistema nervioso (véase el
documento WO 93/01820).
Al contrario, según la invención, se utiliza un
anticuerpo dirigido contra DC-SIGN como
presente/expresado en la superficie de una célula dendrítica, o una
parte, segmento o epítopo suyo. Tal como se utiliza en la presente
memoria, el término anticuerpo incluye entre otros, anticuerpos
policlonales, monoclonales, quiméricos y de cadena única, así como
fragmentos (Fab, Fv, Fa) y una biblioteca de expresión Fab.
Además, pueden utilizarse anticuerpos "humanizados", por
ejemplo tal como se describe en el documento WO 98/49306.
Dichos anticuerpos contra
DC-SIGN de la invención, pueden obtenerse tal como
se describe a continuación en la presente memoria o en cualquier
otra de las maneras conocidas per se, tal como las que se
describen en los documentos WO 95/32734, WO 96/23882, WO 98/02456,
WO 98/41633 y/o WO 98/49306.
Por ejemplo, los anticuerpos policlonales pueden
obtenerse inmunizando un huésped apropiado tal como una cabra, un
conejo, una oveja, una rata, un cerdo o un ratón con
DC-SIGN o una porción inmunogénica, fragmento o
fusión suyos, utilizando, opcionalmente, un portador inmunogénico
(tal como la albúmina sérica bovina o la hemocianina de lapa) y/o
un adyuvante tal como el de Freund, saponina, ISCOM, hidróxido de
aluminio o un gel mineral similar, o la hemocianina de lapa, o una
sustancia activa superficial similar. Después de que se produjera
una respuesta inmunológica contra DC-SIGN (entre 1
y 7 días habitualmente), pueden aislarse los anticuerpos a partir de
la sangre o del suero extraídos del animal inmunizado de una forma
conocida per se, que puede implicar opcionalmente una etapa
de rastreo del anticuerpo con las propiedades deseadas (es decir,
especificidad), utilizando técnicas conocidas de inmunoensayo, para
las cuales se hace otra vez referencia a, por ejemplo, el documento
WO 96/23882.
Los anticuerpos monoclonales pueden producirse
utilizando progenies celulares continuas en cultivo, que incluyen
hibridomas y técnicas similares, otra vez esencialmente tal como se
describe en las referencias citadas anteriormente.
Fragmentos Fab tales como
F(ab)_{2,} Fab' y Fab pueden obtenerse mediante la
digestión de un anticuerpo con papaína u otra proteasa, la
reducción de enlaces disulfuro y el tratamiento con papaína y un
agente reductor, respectivamente. Las bibliotecas de expresión Fab
pueden obtenerse, por ejemplo, mediante el procedimiento de Huse
et al, 1989, Science, 245: 1275-1281.
Preferentemente, se utiliza un anticuerpo
monoclonal contra DC-SIGN en las células
dendríticas, más específicamente contra el péptido con la secuencia
aminoácida que se muestra en/y codificada por SEC ID nº 1 y 2 y
figura 9 o una parte (antigénica) suya; constituyendo dichos
anticuerpos monoclonales otro aspecto de la invención. En la
memoria a continuación la invención se ilustrará mediante dos de
dichos monoclonales, a los que se hará referencia como
AZN-1 y AZN-2, aunque pueden
utilizarse también monoclonales similares con una especificidad
comparable para DC-SIGN.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la invención proporciona una
progenie celular tal como un hibridoma que produce anticuerpos,
preferentemente anticuerpos monoclonales, contra
DC-SIGN en las células dendríticas, más
específicamente contra el péptido con la secuencia aminoácida que
se muestra en/codificada por SEC ID nº 1 y 2 y en la figura 9 o una
parte (antigénica) suya. Los hibridomas que producen los anticuerpos
monoclonales AZN-1 y AZN-2 de la
invención, se depositaron el 8 de abril de 1999, con la European
Collection of Cell Cultures, con los números de registro EGACC
(provisionales) de registro 990400818 y 99040819,
respectivamente.
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento para producir un anticuerpo, preferentemente un
anticuerpo monoclonal, contra DC-SIGN en las
células dendríticas, más específicamente contra el péptido con la
secuencia aminoácida que se muestra en (o codificada) por SEC ID nº
1 y 2 y en la figura 9 o una parte (antigénica) suya, comprendiendo
dicho procedimiento el cultivo de una célula o de una progenie
celular que produce dicho anticuerpo y recuperar/aislar el
anticuerpo a partir del cultivo celular.
Ni los anticuerpos (monoclonales) contra
DC-SIGN en las células dendríticas, ni las células o
las progenies celulares que producen dichos anticuerpos, se han
descrito en la técnica hasta la fecha, y se prevé que los nuevos
anticuerpos de la invención tendrán una amplia aplicabilidad (es
decir, además de la utilización farmacéutica/terapéutica dada a
conocer en la presente memoria). Algunas de estas aplicaciones -que
forman todavía otro aspecto de la invención- resultarán evidentes
para el experto en la materia, a partir de la exposición de la
presente memoria.
Por ejemplo, los anticuerpos de la invención
pueden utilizarse para detectar la presencia de (y por tanto,
determinar la expresión de) DC-SIGN en o sobre los
tejidos de la totalidad de las células, así como detectar la
presencia de DC-SIGN en otras muestras biológicas
tales como fragmentos celulares o en preparaciones celulares. La
información así obtenida puede entonces (también) utilizarse para
determinar si el procedimiento o las composiciones de la invención
pueden aplicarse a dichos tejidos o células. Los anticuerpos de la
invención podrían utilizarse asimismo para detectar
(cualitativamente y/o cuantitativamente), aislar, purificar y/o
producir células dendríticas, por ejemplo en/o a partir de muestras
biológicas, incluyendo líquidos biológicos tales como sangre,
plasma o líquido linfático; muestras de tejidos o muestras celulares
tales como médula ósea, tejido dérmico, tejidos tumorales, etc; o
cultivos celulares o medios de cultivo.
Por ejemplo, los escasos procedimientos que
están disponibles actualmente para el aislamiento/producción de
células dendríticas a partir de muestras biológicas -tales como el
procedimiento que se describe en el documento
US-A-5.643.786, que comprende
leucocitaféresis seguido por clasificación celular activada por
fluorescencia-, es muy pesado, con muchas etapas, que proporciona
sólo bajos rendimientos y muestras heterogéneas. Como resultado, la
disponibilidad limitada de las células dendríticas ha dificultado
severamente la investigación en este importante tipo de
células.
Utilizando los anticuerpos monoclonales de la
invención, se pudieron aislar y producir con un rendimiento mayor
las células dendríticas y con una alta especificidad. En dicho
procedimiento, los anticuerpos monoclonales podrían utilizarse de
una forma conocida per se para la recolección, aislamiento
y/o purificación de las células a partir de los líquidos biológicos
utilizando anticuerpos.
Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales
podrían unirse a una columna o matriz, a perlas
(para)magnéticas, o a un soporte sólido similar, que podría
entonces ponerse en contacto con una muestra biológica o medio de
cultivo que contuviera las células dendríticas. Las células que no
se unieran ellas mismas al portador, se separarían entonces o se
eliminarían - por ejemplo, mediante lavado, después del cual las
células dendríticas se separarían del portador y se aislarían de
una forma conocida per se.
Asimismo, los anticuerpos monoclonales de la
invención podrían utilizarse para detectar/determinar la presencia
de células dendríticas y/o DC-SIGN y/o la expresión
de genes codificantes, por lo tanto, en muestras biológicas, en las
que los anticuerpos podrían utilizarse otra vez de una forma
conocida per se para el análisis de los anticuerpos, tal
como ensayos de inhibición competitiva o inmunoensayos de tipo
ELISA. Por ejemplo, los anticuerpos podrían utilizarse en
combinación con técnicas de microscopía, técnicas de clasificación
celular incluyendo la citometría de flujo y FACS, técnicas basadas
en soportes sólidos y/o marcas detectables o marcadores (que
podrían unirse a los anticuerpos), técnicas basadas en perlas
(para)magnéticas o cualquier otra técnica de detección o
ensayo conocido per se, en el cual pudieran utilizarse los
anticuerpos. Dichos ensayos y equipos para ello -los cuales
equipos, además de los anticuerpos de la invención, pueden contener
per se todos los demás componentes conocidos para los
ensayos basados en los anticuerpos, así como manuales, etc,- forman
otro aspecto de la invención.
De este modo, los anticuerpos monoclonales de la
invención constituyen una herramienta muy útil de investigación y
diagnóstico, para utilizar tanto in vitro como in
vivo. Campos posibles no limitantes de aplicación incluyen el
estudio de las células dendríticas y sus funciones e interacciones;
el estudio del sistema inmune; la detección de las células
dendríticas y/o de DC-SIGN en las células, tejidos o
líquidos biológicos tales como el tejido sinovial y el tejido
dérmico/células dérmicas (células dendríticas dérmicas); así como el
estudio del papel que las células dendríticas juegan en los
procesos biológicos o en los mecanismos patológicos, tal como el
cáncer (pues las células dendríticas son explotadas in vivo
en ensayos clínicos para erradicar la formación y el desarrollo del
tumor) y las enfermedades autoinmunes (incluyendo por ejemplo la
artritis reumatoide).
\newpage
Para una descripción posterior de los
procedimientos y técnicas conocidos per se, en los que los
anticuerpos de la invención pueden utilizarse, se hace referencia a
los libros de texto generales, tales como D.P. Sites, A.I. Terr,
T.G. Parslow, "Basic and clinical immunology", 8ª edición,
Prentice-Hall (1994); I. Roitt, J. Brostof, D.
Male: "Immunology", 2ª edición., Churchill Livingstone (1994),
incorporándose en su totalidad a la presente memoria como
referencia. Se hace una referencia particular a la utilización
general de anticuerpos y técnicas implicadas en la presente
memoria, tal como se menciona en las secciones 2.7 a 2.17 del
trabajo de referencia general realizado por
Janeway-Travers "Immunobiology, the immune system
in health and disease", tercera edición.
Una composición de la invención puede contener
dos o más de los compuestos activos mencionados anteriormente o
dichos compuestos pueden utilizarse en combinación. Por ejemplo, un
anti-anticuerpo DC-SIGN puede
formularse con carbohidratos de manosa o fucosa, lectinas
y/antibióticos tales como la primamicina A, mediante el cual puede
obtenerse un efecto sinérgico.
Las composiciones de la invención pueden
contener asimismo o utilizarse en combinación con compuestos
coinhibitorios conocidos, tales como anti-LF3A; así
como otros principios activos conocidos per se, dependiendo
de la situación que vaya a ser tratada. Por ejemplo, las
composiciones de la invención pueden formularse o utilizarse en
combinación con inmunosupresores (es decir, para prevenir el rechazo
del trasplante), inmunomoduladores, antibióticos, autoantígenos o
alérgenos (por ejemplo, tal como se describen en los documentos WO
95/3234 o WO 96/23882), el factor de necrosis tumoral (TNF), y
agentes antivirales tales como agentes anti-VIH e
inhibidores de CD4, incluyendo anticuerpos dirigidos contra CD4
tales como Leu-3A, por medio de los cuales pueden
obtenerse otra vez un efecto sinérgico.
Las composiciones de la invención pueden además
formularse utilizando portadores conocidos y/o adyuvantes para
proporcionar una forma farmacéutica conocida per se, tal como
un comprimido, cápsula, polvo, preparación liofilizada, solución
para inyecciones, etc, preferentemente en una forma unitaria de
dosificación. Dichas formas farmacéuticas, su utilización y
administración (en forma de dosis única o multi), así como
transportadores, excipientes, adyuvantes y/o formulantes para su
utilización, se conocen generalmente en la técnica y se describen,
por ejemplo, en los documentos WO 93/01820, WO 95/32734, WO
96/23882, WO 98/02456, WO 98/41633 y/o WO 98/49306, incorporándose
en su totalidad a la presente memoria como referencia. Además, la
formulación puede ser en forma de liposoma, tal como se describe en
el documento WO 93/01820.
Las formulaciones farmacéuticas de anticuerpos,
su administración y/o utilización, se describen generalmente en los
documentos WO 95/3274, WO 96/23882, WO 98/02456, WO 98/41633 y/o WO
98/49306.
Las composiciones de la invención pueden
ulteriormente ser acondicionadas, por ejemplo, en viales,
recipientes, saquitos, blísters, etc; opcionalmente, con folletos
de información destacada de los pacientes y/o instrucciones de
uso.
Las composiciones de la invención pueden
utilizarse para la modulación de la respuesta inmune en un animal,
en particular en el hombre o otro mamífero, administrando a dicho
animal un anticuerpo que se une o puede unirse a un
DC-SIGN en la superficie de una célula dendrítica,
preferentemente en forma de una composición tal como la descrita
anteriormente, en una cantidad suficiente para alterar o modificar
una respuesta inmune.
El anticuerpo o composición se administra en
particular en tal cantidad que las interacciones entre las células
dendríticas y los linfocitos T están alteradas o modificadas, más en
particular en tal cantidad que la adhesión de las células
dendríticas a los linfocitos T se reduce.
Este procedimiento puede utilizarse para
prevenir y/o tratar trastornos del sistema inmune, así como para
prevenir el rechazo del trasplante, tal como se describe
anteriormente.
La composición de la invención puede utilizarse
para la prevención o tratamiento de las infecciones por VIH,
administrando a un paciente infectado con el VIH, o a una persona
con riesgo de infectarse por el VIH, un anticuerpo que pueda unirse
o se una a DC-SIGN en la superficie de la célula
dendrítica, en tal cantidad que la adhesión del VIH a las células
dendríticas, y en particular de la proteína gp 120 de la envuelta de
VIH para DC-SIGN en la superficie de las células
dendríticas, es inhibida.
En todos los procedimientos anteriores y formas
de realización, los compuestos/composiciones que se utilizan, se
administrarán en una cantidad terapéuticamente efectiva, para el
cual, el termino de referencia se toma generalmente en los
documentos WO 93/01820, WO 95/32734 y/o WO 96/23882. La
administración puede ser una única dosis, pero es parte
preferentemente de un régimen multidosis de administración que se
decanta sobre uno o más días, semanas o meses.
Todos los términos que se utilizan en la
presente memoria tienen el significado normal en la técnica, para
los cuales puede hacerse referencia entre otros a las definiciones
que se dan en los documentos WO 93/01820, WO 95/32734, WO 96/23882,
WO 98/02456, WO 98/41633 y/o WO 98/49306, aplicados
análogamente.
Además, aunque la invención se describe con
respecto al receptor específico de 44 kDa de la lectina de tipo C,
denominado DC-SIGN y que se da a conocer en la
presente memoria, no se excluye que otras lectinas, generalmente
similares al tipo C, incluyendo las variantes naturales de la
secuencia de SEC ID nº 1 y la figura 9, puedan estar también
presentes en las células dendríticas y/o puedan estar implicadas en
la interacción célula dendrítica-linfocito T.
Dichas variantes tendrán habitualmente un alto grado de homología
aminoácida (más del 80% a más del 90%), y/o serán funcionalmente
equivalentes a la lectina específica de tipo C que se da a conocer
en la presente memoria. Asimismo, cualquier receptor de este tipo
mostrará generalmente propiedades similares a las descritas en la
presente memoria; en particular, que la inhibición de este receptor,
mediante inhibidores carbohidratos o anticuerpos específicos,
conducirá a una alteración de la interacción células
dendríticas/linfocitos T. Cualesquiera de dichos receptores
variantes se distinguirán, sin embargo, del receptor lectina de tipo
C que se describe en el documento WO 96/23882, cuya inhibición no
conduce a la inhibición de la interacción de las células
dendríticas y los linfocitos T.
La invención se ilustrará además a continuación
mediante la Parte Experimental que se proporciona a continuación en
la presente memoria, así como las figuras, en las que:
- Las figuras 1A-1C son gráficos
que muestran: adhesión espontánea de leucocitos a
ICAM-1 e ICAM-3 (Fig. 1A); adhesión
de leucocitos a ICAM-3 después de activación de
integrinas \beta2 (fig. 1B); adhesión de DC a
ICAM-3 en presencia de anticuerpos bloqueantes (20
\mug/ml) contra integrinas \beta2 (NKI-L19),
integrinas \beta1 (AIIB2), ICAM-3
(CBR-IC3/1), CBR-IC3/2) o en
presencia de EDTA (5 mM) o EGTA (5 mM) (fig 1C).
- Las figuras 2A-2C son gráficos
que muestran que los anticuerpos AZN-D1 y
AZN-D2 inhiben la adhesión de DC a
ICAM-3 y reconocen un antígeno que se expresa
específicamente por DC.
- Las figuras 3A y 3B muestran que
DC-SIGN es idéntico a la lectina de tipo C de la
placenta humana que se une a gp 120 del VIH, tal como puede
apreciarse a partir de SDS-PAGE (fig 3A) y mediante
presentación esquemática de DC-SIGN aislado del DC
humano (3B).
- Las figuras 4A y 4B muestran que
DC-SIGN, que se sobreexpresa en las células COS7, es
reconocido por el anticuerpo anti DC-SIGN
AZN-D1 y se une a ICAM-3.
- La figura 5 muestra la distribución tisular de
DC-SIGN, determinada mediante análisis
inmunohistoquímico de la expresión de DC-SIGN en
las amígdalas (A y B) y en los cortes de nódulos linfáticos (C y D)
(OMx 100).
- Las figuras 6A-6D muestran que
la adhesión mediada por DC-SIGN de DC a
ICAM-3 está implicada en la interacción
DC-linfocitos T, como se demuestra por la adhesión
mediada por DC-SIGN de DC a ICAM-3
(fig 6A); grupos heterotípicos celulares de DC con células
K562-ICAM-3 (fig 6B); grupos
celulares dinámicos de DC con PBL en reposo (fig 6C); y el papel
que la interacción
DC-SIGN-ICAM-3 juega
en la proliferación de linfocitos T inducida por DC (fig 6D).
- La figura 7 muestra que DC SIGN es un receptor
para VIH-1 en DC.
- La figura 8 muestra que DC SIGN se une a tanto
ICAM-3 como a las células K562 que expresan
ICAM-3.
- La figura 9 muestra la secuencia de
DC-SIGN.
Las células dendríticas (DC) capturan antígenos
y migran a tejidos linfoides secundarios donde presentan antígenos
a los linfocitos T inocentes. El VIH-1 mina esta
única capacidad para acceder a las células CD4+. En la invención,
se clonó una lectina de tipo C específica de DC, denominada
DC-SIGN, que no sólo se une a ICAM-2
y/o ICAM-3 con alta afinidad, sino que puede
también unirse al VIH-1. Asimismo, se desarrollaron
anticuerpos anti-DC-SIGN que no
sólo inhibieron las interacciones transitorias
DC-linfocitos T e indujeron la proliferación de los
linfocitos T inducidos por DC, sino que también inhibieron de modo
efectivo la infección por VIH-1 de DC. Estos
hallazgos no sólo tienen importantes consecuencias para el
entendimiento de la entrada del VIH independiente de CD4 en DC,
sino que también arrojaron más luz sobre el papel de
DC-SIGN para iniciar las respuestas inmunes
primarias.
Se investigó el papel de la adhesión mediada por
el ICAM-3 en el primer contacto de las células
DC-T. Explotando un nuevo ensayo de adhesión por
citometría de flujo, que implicó perlas fluorescentes revestidas con
quimeras ICAM-3-Fc (Geijtenbeek
et al), se ensayó la capacidad de DC, de los linfocitos
sanguíneos periféricos en reposo (PBL) y de los monocitos, para
unirse a este ligando de integrina. DC inmaduras, obtenidas después
de cultivar monocitos durante 7 días en presencia de
IL-4 y GM-CSF, se unieron
intensamente a ICAM-3 sin activación previa de las
integrinas \beta2 (72%, figura 1A). La figura 1 demuestra que la
adhesión de DC a ICAM-3 es dependiente de Ca^{2+}
e independiente de la integrina: en las figuras 1A, B y C se muestra
un experimento representativo de por lo menos 3 (SD<5%).
- -
- 1A: Adhesión espontánea de leucocitos a ICAM-1 e ICAM-3. PBL recién aislados, monocitos y DC, se incubaron durante 30 minutos a 37ºC con perlas fluorescentes ICAM-1 Fc o ICAM-3 Fc. Después de lavar, se determinó mediante citometría de flujo el porcentaje de células que se unieron a las perlas.
- -
- 1B: Adhesión de los leucocitos a ICAM-3 después de activación de las \beta2 integrinas. La unión de perlas fluorescentes ICAM-3Fc se midió después de 30 minutos a 37ºC en presencia de PMA 980 nM, o activando el anticuerpo 185 anti-\beta2 integrina (10 \mug/ml). La inhibición de la adhesión específica de LFA-1 después de la activación de PMA, se determinó en presencia del anticuerpo NKI-L15 anti-LFA-1 bloqueante (20 \mug/ml).
- -
- 1C: Adhesión de DC a ICAM-3 en presencia de los anticuerpos bloqueantes (20 \mug/ml) contra las integrinas \beta2 (NKI-L19), integrina \beta1 (AllB2), ICAM-3 (CBR-IC3/1, IC3/2), o en presencia de EDTA (5 mM), o EGTA (5 mM). La adhesión se determinó tal como se describe en la fig. 1A.
Esta unión espontánea de DC a
ICAM-3 es más intensa que la de los monocitos,
mientras que los PBL en reposo apenas se unen a
ICAM-3 (figura 1A). La adhesión de DC a
ICAM-3 podría no bloquearse con cualquier anticuerpo
anti-\alphaL o anti-integrina
\beta2 (figura 1A). Al contrario, la adhesión de monocitos a
ICAM-3 depende de LFA-1, ya que la
adhesión se bloquea por anticuerpos anti-\alphaL
(figura 1A). Ya que ni los anticuerpos dirigidos contra los otros
miembros de las integrinas \beta2 (\alphaD\beta2,
\alphaM\beta2, \alphaX\beta2, datos que no se muestran), ni
los anticuerpos dirigidos contra otras integrinas (integrinas
\beta1, \beta7, figura 1B) bloquearon la adhesión de DC a
ICAM-3, se concluyó que la unión de DC a
ICAM-3 no depende de las integrinas.
La interacción de DC con las perlas
ICAM-3-Fc es específica para
ICAM-3, ya que los anticuerpos
anti-ICAM-3 CBR3/1 y CBR3/2 de la
invención, y una combinación de ambos anticuerpos, es capaz de
inhibir la adhesión en gran medida (figura 1B). De forma
interesante, la adhesión de DC a ICAM-3 podría
bloquearse completamente por EDTA y EGTA (figura 1B). Estos
hallazgos sugieren de forma importante que las DC se unen a
ICAM-3 mediante un receptor superficial dependiente
de Ca^{2+} que no pertenece a la familia de las integrinas
\beta1 o \beta2. Esta molécula se denominó
No-integrina de agarre ICAM-3
específica de DC (DC-SIGN).
Para investigar DC-SIGN con
mayor detalle, se produjeron anticuerpos contra el receptor de unión
ICAM-3. Bazos de ratones inmunizados con DC se
fusionaron con células SP2/0 de mieloma, y los sobrenadantes de los
hibridomas resultantes se rastrearon para revelar la presencia de
anticuerpos capaces de inhibir la adhesión específica de DC a
ICAM-3. Se seleccionaron dos hibridomas, se clonaron
y los anticuerpos resultantes se denominaron AZN-D1
y AZN-D2. Ambos anticuerpos purificados inhibieron
intensamente la adhesión de DC a ICAM-3, pero no
afectaron la adhesión mediada por LFA-1 de los
monocitos a ICAM-3 (figura 2A). La figura 2
demuestra que los anticuerpos AZN-D1 y
AZN-D2 inhiben la adhesión de DC a
ICAM-3 y reconocen un antígeno que se expresa
específicamente por DC:
- -
- 2A: Los anticuerpos monoclonales AZN-D1 y AZN-D2 (20 \mug/ml) bloquean la adhesión de DC, pero no la de monocitos aislados recién preparados a las perlas fluorescentes ICAM-3 Fc. Se muestra un experimento representativo de por lo menos 3 experimentos (SD<5%).
- -
- 2B: La expresión de DC-SIGN aumentó durante el desarrollo de DC. Las DC se cultivaron a partir de monocitos en presencia de GM-CSF e IL-4. A distintos tiempos, se analizaron las DC en desarrollo con respecto a la expresión de los marcadores monocíticos CD14, integrina \beta2, LFA-1 y DC-SIGN. Las células se dirigieron a un dispersor en el lado delantero y la fluorescencia promedio se muestra en el ángulo superior derecho de los histogramas. Se muestra un experimento representativo además del 3.
- -
- 2C: El desarrollo de las células DC a partir de los monocitos, en presencia de GM-CSF e IL-4, se une de forma creciente a ICAM-3 de una forma dependiente de DC-SIGN. A distintos tiempos durante el cultivo, las células se recuperaron e incubaron con perlas fluorescentes ICAM-3Fc en presencia del anticuerpo bloqueante anti-integrina \beta2 AZN-L19 o del anticuerpo AZN-D1 (20 \mug/ml). La adhesión se determinó tal como se describe en la fig. 1A. AZN-D2 inhibió la adhesión a ICAM-3 de forma similar a AZN-1 (resultados que no se muestran). Se muestra un experimento representativo además de 3 (SD <5%).
- -
- 2D: La contribución relativa de las integrinas \beta2 y de DC-SIGN mediaron la adhesión a ICAM-3 desarrollando DC. La contribución relativa se calculó a partir de la inhibición de la adhesión en presencia de AZN-D1 o AZN-L19, tal como se describe en la fig. 2C.
Utilizando los anticuerpos
AZN-D1 en los análisis de citometría de flujo, se
demostró que DC-SIGN no se expresa por los
monocitos (figura 2B). Las células que expresan
DC-SIGN pueden ya detectarse después de 1 día de
cultivo. El nivel que se expresa de DC-SIGN aumenta
durante el cultivo (figura 2B). La expresión del marcador monocítico
CD14 disminuye gradualmente durante el cultivo y en el día 7, sólo
una escasa expresión de CD14 se observa (figura 2B). Otros análisis
de citometría de flujo demostraron que en el día 7 las células
también expresan altos niveles de los tipos I y II de MHC, de la
integrina \beta2 p150.95 y de CD86 (datos que no se representan),
que están de acuerdo con la diferenciación de los monocitos a las DC
inmaduras. Estos resultados demuestran que DC-SIGN
se expresa abundantemente por las DC en el día 7, siendo el nivel de
expresión varias veces más alto que el de
LFA-1.
Simultáneamente, se investigó la implicación de
DC-SIGN en la unión a ICAM-3 durante
la diferenciación de los monocitos en células DC inmaduras (figura
2C). Al principio del cultivo (día 0), la unión a
ICAM-3 por los monocitos depende completamente de
la integrina \beta2 (LFA-1), tal como se demostró
por la inhibición de la adhesión con el anticuerpo bloqueante
anti-integrina \beta2 L9 (figura 2C). En el día 1,
cuando se expresan bajos niveles de DC-SIGN (figura
2B), la adhesión específica de ICAM-3 depende tanto
de la integrina \beta2 (LFA-1) como de
DC-SIGN (figura 2C). Desde el día 2 al 7, la
adhesión específica a ICAM-3 aumenta, se convierte
en independiente de la integrina \beta2 (figura 2C) y a partir del
día 2 es mediada solamente por DC-SIGN, ya que
anti-DC-SIGN bloque completamente la
adhesión. La adhesión máxima mediante DC-SIGN se
alcanza en el día 7 (figura 2C).
Estos resultados demuestran conjuntamente que el
aumento en la expresión de DC-SIGN coincide con el
aumento que se observó en la unión a ICAM-3 (figura
2A y B). A partir de estos hallazgos puede concluirse que
DC-SIGN, reconocido por los anticuerpos
AZN-D1, y AZN-D2, es el nuevo
receptor expresado por DC, que se une a ICAM-3.
Para obtener información con respecto al pero
molecular de DC-SIGN, se inmunoprecipitó
DC-SIGN partir de un lisado de DC marcado
superficialmente con I^{125}. El análisis mediante
SDS-PAGE bajo condiciones reductoras, reveló una
proteína única de 44 kDa (figura 3A, carriles 1-2).
La figura 3 demuestra que DC-SIGN es idéntico a la
lectina de tipo C de la placenta humana que se une al gp 120 del
VIH:
- -
- 3A: DC-SIGN es una proteína de 44 kDa. Se marcó con I^{125} las superficies de DC, se lisaron y DC-SIGN se inmunoprecipitó con los anticuerpos anti-DC-SIGN AZN-D1 (carril 1), AZN-D2 (carril 2) y AZN-L 19 (anti-integrina-J32, carril 3). Los inmunoprecipitados se analizaron mediante SDS-PAGE (gel 5-15%), seguido por autoradiografía. La migración de los marcadores del peso molecular se indica a la izquierda. Las flechas indican las cadenas \alpha de LFA-1 (\alphaL, 180 kDa)., MAC-1 (\alphaM, 165 kDa) y p150,95 (\alphaX, 150 kDa), la cadena de la integrina \beta2 (95 kDa) y DC-SIGN (44 kDa). Resultados similares se obtuvieron en otros 3 experimentos.
- -
- 3B: presentación esquemática de DC-SIGN aislado de las DC humanas. Los dos péptidos encuadrados (posiciones aminoácidas 296-306 y 187-197 de la lectina de tipo C placentaria humana que se une a gp 120, se identificaron mediante secuenciación interna de los péptidos del DC-SIGN inmunoprecipitado, utilizando la degradación de Edman. El ADNc que codifica DC-SIGN se aisló a partir de DC. La secuencia aminoácida deducida es un 100% idéntica a la de la lectina de tipo C de la placenta humana que se une al gp 120 del VIH. Se indican la región transmembranosa, el dominio de la lectina y las repeticiones (siete completas y una octava parcial) (R1-R8).
El análisis del inmunoprecipitado en un gel
SDS-PAGE no reductor muestra que
DC-SIGN existe como un monómero (resultados no
representados). Además, utilizando perlas revestidas con
ICAM-3-Fc, también pudo extraerse
una proteína de 44 kDa a partir del lisado DC, mientras que en
presencia de anticuerpos bloqueantes
anti-DC-SIGN, esta proteína no pudo
precipitarse con perlas revestidas con
ICAM-3-Fc (resultados que no se
muestran). Estos hallazgos demuestran que DC-SIGN
se expresa mediante DC como una proteína de 44 kDa bajo condiciones
reductoras. La observación de que las perlas acopladas con
ICAM-3-Fc extrajeron sólo una
proteína de 44 kDa fuera del lisado de DC, indica que
DC-SIGN posee una alta afinidad por
ICAM-3, mucho mayor que LFA-1 o
\alphaD\beta2, que se expresan también mediante las DC (figura
3A) y de las que se ha informado que se unen a
ICAM-3 (Vandervieren et al., Immunity, 3,
683-690, 1995). Ya que cantidades muy pequeñas de
LFA-1 se inmunoprecipitan, en comparación con
DC-SIGN (figura 3A, carril 1 y 3), esto confirma que
DC-SIGN se expresa más abundantemente mediante las
DC que LFA-1. Juntos, estos datos demuestran que
DC-SIGN es un polipéptido sencillo de 44 kDa y
constituye el receptor primario para ICAM-3 en las
células DC.
Para identificar DC-SIGN, se
llevó a cabo una inmunoprecipitación preparativa a partir de un
lisado de células DC con el anticuerpo
anti-DC-SIGN AZN-D1,
extrayéndose la proteína de 44 kDa a partir del
SDS-PAGE. Después de digestión tríptica, los
péptidos resultantes se extrajeron a partir del gel, y se purificó
utilizando HPLC preparativa. A continuación, las secuencias
aminoácidas de 2 péptidos (0,5-1 pmol) se
determinaron utilizando el procedimiento de degradación de Edman.
Ambos péptidos consistieron en 11 residuos aminoácidos (figura 3B)
utilizándose las secuencias péptidos para rastrear la base de datos
EMBL con respecto a la homología con proteínas conocidas. Ambos
péptidos mostraron una identidad del 100% con la secuencia
aminoácida deducida de la lectina de tipo C humana que se une al gp
120 del VIH (Curtis et al., 1992). Esta proteína se había
identificado previamente de modo exclusivo en la placenta como un
receptor independiente de CD4 para la glicoproteína gp 120 de la
envuelta del virus humano de la inmunodeficiencia (VIH).
El análisis RT-PCR con cebadores
basados en la secuencia de la lectina de tipo C que se une a la gp
120, sobre el ARN aislado a partir de las células DC, dio lugar a
un producto PCR con la longitud esperada de 1237 nt. El producto
PCR específico de DC, se clonó y la secuenciación confirmó una
identidad del 100% con la lectina humana que se une al gp 120
(figura 3B). El análisis de la citometría de flujo de las células
COS7, transfectadas con el ADNc que codifica la lectina de tipo C
humana que se une a gp 120, prueba inequívocamente que la secuencia
de la lectina de tipo C que se une a la gp 120, es verdaderamente
idéntica a DC-SIGN (figura 4A). La figura 4
demuestra que DC-SIGN, que se sobreexpresa en las
células COS7, es reconocido por el anticuerpo
anti-DC-SIGN AZN-D1
y se une a ICAM-3:
- -
- 4A: AZN-D1 reconoce a las células COS7 transfectadas con el ADNc que codifica DC-SIGN (rellenas) y no a las células COS7 transfectadas simuladas (no rellenas). AZN-D2 produjo una tinción similar (resultados que no se muestran).
- -
- 4B: Adhesión de COS7-DC-SIGN a ICAM-3. Las células COS7 fueron transfectadas y se determinó la adhesión tal como se describe en la fig. 1A, respectivamente. La adhesión de las células COS7-DC-SIGN a ICAM-3 se midió en presencia de EGTA (5 mM) y los anticuerpos bloqueantes contra DC-SIGN (AZN-D1), ICAM-3 (CBR-IC3/1, CBR-IC3/2) e integrinas \beta2 (AZN-L19). Se muestra un experimento representativo además de 3 (SD<5%).
Aproximadamente 30% de las células COS7
transfectadas se tiñeron con anticuerpo
anti-DC-SIGN y por tanto,
expresaron DC-SIGN. Además, las células
COS7-DC-SIGN pueden unirse a
ICAM-3, mientras que las células COS7 transfectadas
simuladas son incapaces de unirse a ICAM-3 (figura
4B). La unión de DC-SIGN expresado por COS7 podría
ser completamente inhibida por anticuerpos contra
ICAM-3 y DC-SIGN, y fue dependiente
del Ca^{2+}, ya que EGTA bloquea completamente la adhesión
(figura 4B).
Se concluye que el receptor que se une a
ICAM-3, expresado por DC (DC-SIGN),
es idéntico a la lectina de tipo C placentaria que se une al gp 120
del VIH (Curtis et al, 1992), una proteína transmembranosa de
tipo II que comprende 404 aa (aminoácidos) con tres dominios
distintos. El dominio citoplásmico N-terminal de 40
residuos está separado por un segmento hidrofóbico de 15 aa de una
región que está formada por repeticiones en tándem, siete completas
y una incompleta de secuencias casi idénticas. La restante región
C-terminal (Cys253-Ala404) muestra
homología para las lectinas (de tipo C) dependientes del Ca^{+2}
(figura 3B).
El análisis mediante citometría de flujo de un
extenso conjunto de células hematopoyéticas con los anticuerpos
AZN-D1/D2 demuestra que el antígeno se expresa
preferentemente por DC (Tabla 1). Todas las células hematopoyéticas
que se ensayaron, fueron negativas con respecto a la expresión de
DC-SIGN, excepto para DC. Además, un análisis
RT-PCR confirma que el ARNm que codifica
DC-SIGN se transcribe específicamente en DC, lo que
está de acuerdo con el patrón de expresión de la proteína
DC-SIGN (Tabla 1).
Para investigar posteriormente la expresión de
DC-SIGN in vivo, se llevó a cabo un análisis
inmunohistoquímico de los tejidos linfoides secundarios con los
anticuerpos anti DC-SIGN. Estos tejidos son
conocidos porque contienen células dendríticas. Cortes de amígdalas
y nódulos linfáticos contenían células que expresaban
DC-SIGN, que se observaron predominantemente en el
área de los linfocitos T de ambas amígdalas y en los nódulos
linfáticos (figura 5). La figura 5 muestra la distribución del
tejido de DC-SIGN: análisis inmunohistoquímico de la
expresión de DC-SIGN en las amígdalas y en los
cortes de nódulos linfáticos (OM x100). Se fijaron los cortes con
acetona y se realizó la tinción nuclear con hemateína. La tinción
de DC-SIGN se llevó a cabo con
AZN-D1. Se muestran el centro germinal (GC), y las
áreas celulares T-(T) y (B).
De acuerdo con la distribución y morfología de
las células dendríticas, las células que expresan
DC-SIGN no se detectan en los centros germinales y
en la zona del manto de los tejidos linfoides (figura 5). La tinción
de cortes en serie con respecto a CD3 y CD14 confirmó que las
células que expresaban DC-SIGN son distintas de los
linfocitos T y de los monocitos (datos que no se muestran), como
también se demostró mediante ambos análisis mediante citometría de
flujo y RT-PCR de estas células (Tabla 1).
Para demostrar que las CD se unen a los
transfectantes que expresan ICAM-3 de una forma
dependiente de DC-SIGN, se investigó la capacidad
de la progenie celular leucémica K562 transfectada con el ADNc que
codifica ICAM-3
(K562-ICAM-3), para unirse a DC. Tal
como se muestra en la figura 6A, el conjunto de células DC se
conjuntaron con K562-ICAM-3 de una
forma dependiente de DC-SIGN, ya que la interacción
puede bloquearse mediante anticuerpos
anti-DC-SIGN. No se observó la entre
DC y K562, demostrando que ICAM-3 es el ligando para
DC-SIGN. La figura 6 muestra que la adhesión
mediada por DC-SIGN, de DC a ICAM-3,
está implicada en la interacción
DC-linfocitos T.
DC-linfocitos T.
- -
- 6A: La adhesión mediada por DC-SIGN de DC a ICAM-3, depende de un citoesqueleto intacto. La adhesión de DC a las perlas ICAM-3, se determinó con (cuadro abierto) o sin (cuadro lleno) el anticuerpo de bloqueo DC-SIGN AZN-D1 en presencia de citocalasina D, que se tituló en varias concentraciones. Se muestra un experimento representativo de 2 experimentos (SD<5%).
- -
- 6B: de células heterotípicas de DC con células K562-ICAM-3. Las células estables K562 y K562 que se transfectaron con el ADNc que codifica ICAM-3 (K562-ICAM-3) se marcaron con el colorante rojo HE (hidroetidina). Las DC se marcaron con el colorante verde SFDA. K562 y K562-ICAM-3 se incubaron con DC (5 x 10^{3} células/tipo celular) con o sin anticuerpos bloqueantes anti-DC-SIGN (AZN-D1:10 min preincubación) a 37ºC. A distintos tiempos, las células se fijaron con paraformaldehído (0,5%), y la de células heterotípicas se midió mediante citometría de flujo. Se proporciona un experimento representativo de 2 experimentos.
- -
- 6C: La formación de conjuntos celulares dinámicos de las DC con los Pbl en reposo es mediada por DC-SIGN. Las DC (50 x 10^{3} células) se preincubaron con/o sin los anticuerpos anti-DC-SIGN AZN-D1 y AZN-D2 (10 \mug/ml) durante 10 minutos a TA. Se añadieron PBL alogénicos (1 x 10^{6} células), marcados con el colorante fluorescente Calceína-A (25 \mug/10^{7} células/ml durante 30 minutos a 37ºC) y la mezcla celular se incubó a 37ºC. La formación de conjuntos se midió mediante citometría de flujo. Se muestra un experimento representativo además de 2.
- -
- 6D: La interacción DC-SIGN-ICAM-3 es importante en la proliferación de los linfocitos T inducida por DC. Los T-linfocitos alogénicos receptivos (100x10^{3})se añadieron a las DC estimuladoras (1,5x10^{3}) en presencia de anticuerpos bloqueantes (20 \mug/ml) contra LFA-3 (TS2/9) y DC-SIGN (AZN-D1, AZN-D2). Las células se cultivaron durante 4 días. En el día 4 a las células se aplicaron impulsos durante 16 horas con [^{3}H]metil-timidina, determinándose la captación. Los resultados se expresan como el porcentaje promedio de CPM, por triplicado, a partir de los pocillos.
La formación de conjuntos dependiente de
DC-SIGN es transitoria, con un máximo a los 60
minutos, que indica que las interacciones
DC-SIGN-ICAM-3
pueden estar activamente reguladas por las DC. Además, este fenómeno
permite a las DC interaccionar transitoriamente con múltiples
linfocitos T, hasta que la interacción se intensifica después del
compromiso de TCR.
Para probar esto, se investigó si la agrupación
de DC con los linfocitos T es mediada por DC-SIGN y
si esta interacción es también transitoria. Las DC se incubaron con
los linfocitos T alogénicos en reposo (DC:linfocitos T, 1:20) y se
determinó la agrupación celular DC-T. Tal como se
aprecia en la fig. 6B, la de DC con los linfocitos T es transitoria
y alcanza un máximo después de 20 minutos (32%). Además, la
interacción celular DC-T puede inhibirse
(aproximadamente el 50%) mediante anticuerpos anti
DC-SIGN, lo que sugiere que la agrupación celular
DC-T está también mediada por otros receptores
superficiales. De este modo, la agrupación de células
DC-T es verdaderamente transitoria y está mediada
parcialmente por las interacciones
DC-SIGN-ICAM-3. De
forma similar, la figura 8 muestra que DC-SIGN se
une no sólo con las células K562 que expresan el ADNc que codifica
ICAM-3, sino también con las células K562 que
expresan el ADNc que codifica ICAM-3, y que dicha
unión puede inhibirse mediante anticuerpos, tanto de manano, como
anti-DC-SIGN.
Como la unión de DC-SIGN a
ICAM-3 es importante para la de las células DC con
las T, también se investigó la función de DC-SIGN
en la proliferación de los linfocitos T inducida por DC. Los
linfocitos T en reposo se estimularon con DC alogénicas en
presencia o ausencia de los anticuerpos bloqueantes
anti-DC-SIGN. Tal como se aprecia
en la figura 6C, los anticuerpos
anti-DC-SIGN AZN-D1
y AZN-D2 inhibieron ambos la proliferación de los
linfocitos T en más de un 75%. De modo similar, los anticuerpos
contra la molécula estimuladora LFA-3, que se une a
CD2 en los linfocitos T y que también es conocida por mediar la
proliferación de los linfocitos T, inhiben la proliferación de las
células T. Una combinación de los anticuerpos
anti-LFA-3 y
anti-DC-SIGN inhibe completamente
la proliferación de los linfocitos T. (figura 6C).
Como se demostró anteriormente en la presente
memoria que DC-SIGN es idéntico a la lectina
placentaria que se une a gp 120 del VIH, y que se expresa
abundantemente por DC, DC-SIGN podría facilitar la
entrada del VIH-1 en las células DC. Para
investigar esto, se emitieron impulsos con VIH-1 a
las células DC, y se midió la infección productiva en cocultivos de
células DC-T. Las células DC que recuperaron 7 días
después del cultivo en presencia de IL-4 y
GM-CSF, expresaron niveles bajos de CD4 (Blauvelt
et al., 1997; Granelli-Piperno et al.,
J. Exp. Med 184(6), 2433-8, 1996) y niveles
altos de DC-SIGN (figura 7). Tal como se muestra en
la figura 7, se produce una intensa infección productiva cuando se
emitieron impulsos con VIH-1 a las células DC
durante 2 horas, lavándose y cultivándose en presencia de células
PBMC activadas. En el día 3 del cocultivo de las células
DC-T, la proteína p24 Gag, una medida de la
replicación del VIH-1, empieza a acumularse en el
medio (figura 7), demostrando que el VIH-1 se
replica eficientemente en el cocultivo, de forma similar a lo
mostrado por otros investigadores (Baluvelt et al.,1997;
Granelli-Piperno et al,. 1998;
Granelli-Piperno et al, Curr Biol 9 (1),
21-29, 1999). Sin embargo, cuando las células DC
antes de la emisión de los impulsos del VIH-1, se
preincubaron con anticuerpos
anti-DC-SIGN, y se incubaron con
PBMC activados, se inhibió la replicación del VIH-1
en más del 75%, tal como se muestra en el día 3 del cocultivo de las
células DC-T (figura 7). Cuando las DC se incubaron
con anticuerpos anti-DC-SIGN después
de la emisión de impulsos con el VIH-1, se observó
todavía una eficiente replicación del VIH-1 en el
cocultivo de células DC-T (figura 7). Estos
hallazgos demuestran que los anticuerpos anti
DC-SIGN bloquean la infección por el
VIH-1 mediante la inhibición de la unión del
VIH-1 a las células DC y (entonces) no tiene lugar
la transmisión del VIH-1 desde las células DC a los
linfocitos T, indicando que DC-SIGN actúa como un
receptor importante para el VIH-1 en las células DC.
Así, DC-SIGN es altamente expresado en las células
DC y funciona como un receptor específico de las células DC para
tanto el ICAM-3 como el VIH-1.
A partir de los resultados experimentales
anteriores, puede concluirse entre otros, que la interacción inicial
de DC con los linfocitos T es independiente del antígeno y
transitoria. Esta naturaleza transitoria proporciona que DC posea
la capacidad de interaccionar con una multitud de linfocitos T hasta
que tenga lugar un productivo compromiso de TCR. Hasta ahora no
está claro el mecanismo por el cual se inicia este proceso
transitorio. En la presente memoria, se demuestra que la
interacción de un nuevo receptor específico de las células DC,
DC-SIGN, media, con el ICAM-3, esta
interacción transitoria de las células DC-T.
DC-SIGN es expresado abundantemente por DC, y se ha
mostrado que DC-SIGN sirve como un receptor
importante del VIH-1 en las células DC.
Una importante función para las DC durante el
curso de la infección por VIH-1 es la capacidad para
extender el VIH-1 a los linfocitos T, promoviendo
la replicación extensa que conduce a la muerte de las células CD4+T
(Cameron et al., 1992, Cameron: AIDS Res Hum Retroviruses 10
(1), 61-71, 1994). Se demostró claramente una
infección de DC productora de VIH-1, que depende del
estado de desarrollo de DC (Granelli-Piperno et
al., 1998). Células DC inmaduras, cultivadas a partir de
monocitos en presencia de IL-4 y
GM-CSF, son infectadas productivamente por cepas
M-trópicas de VIH-1
(Granelli-Piperno et al., 1996,
Granelli-Piperno et al., 1998) (Blauvelt
et al., 1997), mientras que la penetración de ambos
VIH-1 M- y T-trópicos en las DC
maduras no conduce a una infección productiva (Granelli 1998). Sin
embargo, la penetración de VIH-1 en ambos tipos de
DC conduce a una replicación explosiva después del cocultivo con
linfocitos T en reposo o activadas (Granelli 1998, 1999), Los
eventos iniciales en la infección por VIH-1 de las
células diana incluyen la unión del receptor y la fusión de la
membrana. Este proceso se inicia por la unión de alta afinidad de la
glicoproteína gp 120 de la envuelta a CD4. Sin embargo, la CD4 sola
no basta para iniciar la fusión, y son necesarios receptores
quimiocina tales como CCR5 y CXCR4 como coreceptores para que tenga
lugar el evento de la fusión final (revisado por Littman et
al, 1998) (Dragic et al., Nature 381 (6584),
667-73, 1996: Feng et al., Science 272
(5263), 872-7, 1996), Las células DC expresan
pequeñas cantidades de CD4, mientras que altos niveles de
DC-SIGN se expresan en la superficie celular. Se ha
sugerido que la infección productiva de DC y su capacidad para
capturar y subsiguientemente, transmitir el VIH-1,
son mediadas a través de vías separadas. La infección productiva de
DC es medida mediante una vía dependiente de CD4, mientras que el
VIH-1 puede ser capturado mediante DC a través de
una vía independiente de CD4 que todavía permite que DC transmita el
VIH-1 a los linfocitos T (Blauvelt et al
(1997). En la presente memoria, se mostró que
DC-SIGN media específicamente la penetración del
VIH-1 en las células DC, tal como se midió por la
falta de infección productiva en el cocultivo de las células
DC-T después de la preincubación de DC con
anticuerpos anti-DC-SIGN antes de la
emisión de impulsos de VIH-1. Los anticuerpos
anti-DC-SIGN no inhiben
completamente la penetración de VIH-1 en DC. Esta
vía independiente de DC-SIGN es mediada
probablemente por CD4(), que se expresa a niveles bajos en DC. Estos
resultados confirman la presencia de una vía tanto dependiente como
independiente de CD4 para la penetración viral en DC. Se ha
mostrado que varias moléculas adhesivas pueden inhibir la
transmisión de VIH-1 desde DC a los linfocitos T,
mediante la interferencia del contacto DC-linfocitos
T (Tsunetsugu-Yokota et al., 1997).
Anticuerpos anti-DC-SIGN no
pudieron prevenir la transmisión de VIH-1 a los
linfocitos T cuando anticuerpos
anti-DC-SIGN se añadieron después
del envío de impulsos VIH-1 para inhibir la
interacción DC-linfocitos T. Estos datos indican que
DC-SIGN sirve como un receptor importante para la
penetración del VIH-1 en las células DC. El hecho de
que DC exprese niveles altos de DC-SIGN y niveles
bajos de CD4 (figura 7) demuestra además que la penetración de
VIH-1 en DC está mediada predominantemente por
DC-SIGN. El descubrimiento de
DC-SIGN como un receptor de VIH-1
podría ser importante para una mejor comprensión de la penetración
de VIH-1 en DC. Además, la inhibición de la
infección por VIH-1 observada en presencia de los
anticuerpos anti-DC-SIGN, permitirá
el desarrollo de anticuerpos
anti-DC-SIGN en estrategias
terapéuticas, contra la infección vírica y la propagación regional
del VIH-1.
Las células DC constituyen una población
heteróloga de células que se encuentran a niveles indiciarios en
varios tejidos. Para definir mejor las distintas poblaciones, se ha
hecho un gran esfuerzo para generar anticuerpos que se dirijan
contra moléculas superficiales celulares específicas de progenies de
DC. Hasta ahora, sólo se han generado algunos anticuerpos que
reconocen antígenos específicos de DC humanas (Hock et al.,
Immunol, 83, 573-581, 1994), (de Saint Vis et
al, Immunity 9(3), 325-36, 1998) (Hart
et al., 1997). DC-SIGN puede ahora añadirse
a esta lista de antígenos específicos DC humanos, ya que se ha
demostrado en la presente memoria que a nivel proteico, así como a
nivel del ARNm, de todas las células hematopoyéticas ensayadas, sólo
las DC expresan DC-SIGN (Tabla 1). In situ,
DC-SIGN se expresa exclusivamente mediante
subconjuntos de DC que se encuentran en el área de los linfocitos T
de las amígdalas y de los nódulos linfáticos. Estas DC maduras son
muy potentes en la activación de los linfocitos T indiferenciados.
Por tanto, la expresión de DC-SIGN in situ,
se correlaciona con su función como un mediador importante de la
formación de conjuntos DC-T y la subsiguiente
activación de los linfocitos T.
La activación de los linfocitos T en reposo
mediante las células presentadoras de antígenos, constituye una
etapa críticamente importante en la respuesta inmune adquirida.
Localizadas en muchos tejidos, las DC capturan y procesan
antígenos, y migran a los tejidos linfoides, donde interaccionan con
y activan linfocitos T indiferenciados
específico-antigénicos. Los linfocitos T son
dirigidos por las quimiocinas a estos sitios de presentación
antigénica. Recientemente, se identificó una quimiocina
DC-CK1 específica de DC, que atrae específicamente
a los linfocitos T indiferenciados en sitios de iniciación inmune
(Adema et al., Nature, 387, 713-717, 1997).
Después de la llegada a los tejidos linfoides secundarios, los
linfocitos T interaccionan con DC, teniendo lugar la activación
después del reconocimiento por TCR de los péptidos unidos a las
moléculas MHC. Sin embargo, ya que la afinidad de TCR por el
antígeno presentado por las moléculas MHC es muy baja, y el número
de complejos específicos MHC-péptido sobre APC es
limitado, la interacción de TCR con el antígeno es habitualmente
insuficiente para gobernar la formación de un contacto íntimo de la
membrana entre DC y el linfocito T, necesario para la plena
activación.
Hasta ahora, la LFA-1 constituyó
el receptor más importante para ICAM-3 en las DC.
Sin embargo, su función en la unión a ICAM-3 se ha
convertido ahora en discutible, debido al descubrimiento en la
presente memoria de DC-SIGN. Se demostró que la
adhesión de DC a ICAM-3 está completamente mediada
por DC-SIGN. DC-SIGN se expresa más
abundantemente por DC que por LFA-1 (figura 2B).
Además, LFA-1 es inactiva sobre DC (figura 2C) y su
afinidad por ICAM-3 es mucho menor que la de
DC-SIGN por ICAM-3. Estos datos
demuestran claramente que DC-SIGN constituye el
receptor primario para ICAM-3 en las células DC. La
función para DC-SIGN en DC se aclaró ulteriormente
por el hallazgo de que anticuerpos
anti-DC-SIGN inhibieron
parcialmente la formación de conjuntos transitorios
DC-linfocitos T. Por tanto, DC-SIGN
está implicado en la interacción inicial
DC-linfocitos T en la respuesta inmune. Una función
que se atribuyó previamente a LFA-1. La naturaleza
transitoria de la interacción DC-linfocitos T
mediada por DC-SIGN permite a DC interaccionar con
un gran número de linfocitos T en reposo, hasta que se consigue una
interacción productiva mediada por TCR, después de la cual la
interacción se estabiliza. La importancia de la interacción
DC-SIGN-ICAM-3 es
subrayada además por el hallazgo de que los anticuerpos contra
DC-SIGN pueden inhibir la proliferación alogénica de
linfocitos T inducida por DC. Además, la combinación de anticuerpos
contra DC-SIGN y LFA-3, una molécula
coestimuladora conocida(), inhibe casi completamente la
proliferación de los linfocitos T. Por tanto, la adhesión
transitoria de alta afinidad de DC-SIGN a
ICAM-3, desempeña un importante papel en la
interacción inicial antígeno-independiente entre DC
y los linfocitos T indiferenciados. Presumiblemente, esta
interacción inicial de alta afinidad permite el compromiso de TCR
mediante la unión antigénica a MHC, que inicia a continuación varias
otras interacciones de adhesión entre DC y los linfocitos T, tales
como la interacción LFA-1. ICAM-1.
Ya que LFA-1 es inactiva sobre los linfocitos T, la
activación del complejo TCR/CD3 después de la presentación
antigénica por DC(), dará lugar a la activación de
LFA-1 y la intensa unión subsiguiente de
LFA-1 a ICAM-1, expresada en DC. La
intensificación de la interacción entre DC y los linfocitos T
mediante múltiples contactos, conducirá entonces a la activación
completa de los linfocitos T mediante las células DC
estimuladoras().
estimuladoras().
En conclusión, se ha identificado un nuevo
receptor ICAM-3 en las células DC, denominado
DC-SIGN, el cual se expresa específicamente por las
células DC humanas y está implicado en la interacción inicial
transitoria DC-linfocitos T, necesaria para iniciar
una respuesta inmune. De forma interesante, DC-SIGN
es también capaz de unirse a la proteína gp 120 de la envuelta del
VIH-1 y facilitar la penetración del virus en las
células DC. Al experto en la materia, y basándose en los hallazgos
que se han expuesto en la presente memoria, le serán sugeridas
varias técnicas y distintas posibilidades profilácticas y
terapéuticas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ej.
9A
Se utilizaron los siguientes anticuerpos: KLM
185 (anti-integrina \beta2, (Andrew et al.,
Eur. J. Immunol 23, 2217-2222, 1993),
AZN-L19 (anti-integrina \beta2),
NKI-L15 (anti-\alphaL, (Keizer
et al., Eur. J. Immunol 15, 1142-1147,
1985)), AIIB2 (anti-integrina \beta1, (Da Silva
et al., J. Immunol, 143, 617-622, 1989)),
CBR-IC3/1 y CBR-IC3/2
(anti-ICAM-3 (de Fougerolles et
al., J. Exp. Med, 177, 1187-1192, 1993)), CD14
(WT14()), CD4 (wt4()). Los anticuerpos
anyi-DC-SIGN AZN-D1
y AZN-D2 se obtuvieron inmunizando ratones BALB/c
con DC y rastreando a continuación los sobrenadantes de hibridoma,
en cuanto a su capacidad para bloquear la adhesión de DC a
ICAM-3, tal como se midió mediante el ensayo de
adhesión de perlas fluorescentes.
Ej.
9B
Se cultivaron células DC a partir de monocitos,
tal como se describe (Sallusto y Lanzavecchia, J. Exp. Med. 179,
1109-1118, 1994; Romani et al., J. Exp. Med.
180; 83-93, 1994). Brevemente, se aislaron monocitos
a partir de PBMC recién preparados mediante una etapa de
adherencia. Se cultivaron los monocitos en presencia de
IL-4 (Schering-Plough, Bruselas,
Bélgica; 500 U/ml) y GM-CSF
(Schering-Plough, Bruselas, Bélgica, 1000 U/ml)
durante 7 días. En el día 4, se añadieron citoquinas recién
preparadas. En el día 7 el fenotipo de las células DC cultivadas se
confirmó mediante análisis de citometría de flujo de la expresión de
los tipos I y II de MHC, de CD1a, de p150,95 y de CD80. Se
generaron transfectables estables K562 que expresaban
ICAM-3 (K562-ICAM 3) mediante la
transfección de K562 con 10 \mug del plásmido PCRII
ICAM-3 R1 (donación del Dr. D. Simmons) y 2 \mug
del vector PGK-hyg (Riele et al, 1990)
mediante electroporación, tal como se describe en (Lub et
al, Mol. Biol. Cell 8, 719-728, 1997). Los
linfocitos T en reposo (CD3 positivas > 90%) se obtuvieron
mediante elutriación centrífuga de PBMC a partir de la médula ósea
de donantes sanos, tal como se describe (Figdor et al.,
Immunol Methods 68, 73-87, 1984).
Ej.
9C
Se marcaron células superficialmente con
Na^{125}I (Amersham Buckinghamshire, Reino Unido) mediante el
procedimiento de la lactoperoxidasa (Pink y Ziegler, 1979, en:
Research Methods in Immunology, editores L. Lefkovits y B.Pernis,
(New York Academic Press), págs 169-180). Las
células DC se lisaron durante una hora a 4ºC en tampón de lisis
(NP-40 al 1%, 50 mM trietanolamina (pH 7,8), 150 mM
NaCl, 1 mM CaCl_{2,} 1 mM MgCl_{2}, 1 mM PMSF, 0,02 mg/ml
leupeptina). Se eliminaron los restos nucleares del lisado mediante
centrifugación a 13.000 g durante 15 minutos a 4ºC. Antes de
desalojar los lisados, se incubaron durante 3 horas con un mAb
específico unido covalentemente a perlas
4B-Proteína A-sefarosa CL (Pharmacia
Fine Chemicals, Piscataway, NJ). Los inmunoprecipitados se lavaron
extensamente con tampón de lisis y se analizaron mediante
SDS-PAGE según una modificación del procedimiento
Laemmli (Laemmli, Nature 227, 680-685, 1970). La
digestión tríptica de la proteína extirpada, la purificación de los
péptidos resultantes y el análisis secuencial, se llevaron a cabo
mediante Eurosequence BV (Groningen,
Holanda).
Holanda).
Ej.
9D
Se aisló el ARN total mediante un procedimiento
ácido guanidinio isotiocianato-fenolclorofórmico
(Chomczynski y Sacchi, Anal Biochem 162 (1), 156-9,
1987). El ADNc que codifica la lectina placentaria de tipo C que se
une a gp 120 se amplificó mediante RT-PCR sobre el
ARN total de las células DC. Los cebadores PCR se basaron en la
secuencia nucleótida de la lectina placentaria de tipo C que se une
a gp 120 (nº de registro M98457, (Curtis et al., 1992) y las
secuencias nucleótidas (5' a 3') son las siguientes: XF29,
AGAGTGGGGTGACATGAGTG; XR1265, GAAGTTCTGCTACGCA GGAG. El fragmento
PCR se clonó en el vector pGEM-T (Promega, Madison
Wl) y se secuenció. La secuencia nucleótida del ADNc clonado era
idéntica a la de la lectina placentaria de tipo C que se una a
pg120 (Curtis et al, 1992). El ADNc se clonó a continuación
en el vector eucariótico de expresión (pRc/CMV
(pRc/CMV-DC-SIGN), y las células
COS7 fueron transfectadas de forma transitoria con
pRc/CMV-DC-SIGN, utilizando el
procedimiento de DEAE dextrano (Seed y Aruffo, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84, 3365-3369,
1987).
1987).
Ej.
9E
Trans-Flúor Esferas modificadas
por carboxilato (488/645 nm, 1,0 \mum; Molecular Probes.
Eugene.OR) se revistieron con ICAM-1 Fc e
ICAM-3 Fc, tal como se ha descrito previamente
(Geijtenbeek et al., presentado en 1999). Brevemente, se
añadieron 20 \mul de estreptavidina (5 mg/ml en 50 mM de tampón
MES) a 50 \mul de Esferas Trans-Flúor. Se
añadieron 30 \mul de EDAC (1,33 mg/ml) y la mezcla se incubó a TA
durante 2 horas. La reacción se detuvo añadiendo glicina a una
concentración final de 100 mM. Las perlas revestidas con
estreptavidina se lavaron tres veces con PBS (50 mM fosfato, NaCl
al 0,9%, pH 7,4) y se volvieron a suspender en 150 \mul de PBS,
BSA al 0,5% (peso/vol). Las perlas revestidas con estreptavidina (15
\mul) se incubaron con fragmentos de cabra biotinilados
antihumanos anti-Fc-Fab2 (6
\mug/ml) en 0,5 ml de PBA durante 2 horas a 37ºC. Las perlas se
lavaron una vez con PBS, BSA al 0,5% y se incubaron con ligandos
humanos fusionados IgG1 Fc (ICAM-1 Fc,
VCAM-1 Fc; 250 ng/ml) en 0,5 ml, por la noche, a
4ºC. Las perlas revestidas con los ligandos se lavaron, se
volvieron a suspender en 100 \mul de PBS, BSA al 0,5%, y se
guardaron a 4ºC. ICAM-1 Fc e ICAM-3
Fc consisten en la parte extracelular de la proteína fusionada a un
fragmento IgG1 Fc humano (proporcionado por el Dr. D. Simmons). El
ensayo de adhesión de las perlas fluorescentes se llevó a cabo tal
como se ha descrito por Geijtenbeek et al (presentado).
Brevemente, las células se volvieron a suspender en tampón
Tris-Sodio-BSA (20 mM
Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl_{2}, 2 mM
MgCl_{2}, BSA al 0,5%; 5 x 10^{6} células/ml). Se preincubaron
50.000 células con o sin bloqueo mAb (20 \mug/ml) durante 10
minutos a TA en una placa con fondo en forma de V, de 96 pocillos.
Se añadieron perlas fluorescentes revestidas con ligandos (20
perlas/célula) y distintos estimulantes/inhibidores, incubándose la
suspensión durante 30 minutos a 37ºC. Se lavaron las células y se
volvieron a suspender en 100 \mul de TSA. La adhesión se determinó
midiendo, mediante citometría de flujo, el porcentaje de células
que se habían unido a las perlas fluorescentes, utilizando el
FACScan (Becton y Dickinson & Co.,
Oxnard, CA).
Oxnard, CA).
\newpage
Ej.
9F
La agrupación entre las células DC y las que
expresan ICAM-3 se evaluó mediante citometría de
flujo. Las células DC y las células que expresan
ICAM-3 (2 x 10^{6} células/ml) se marcaron
respectivamente con sulfofluoresceína (Molecular Probes, Eugene,
OR; 50 \mug/ml) e hidroetidina (Molecular Probes, Eugene, OR; 40
\mug/ml) durante 1 hora a 37ºC. Después de lavado, las células DC
y las que expresan ICAM-3 se mezclaron (50 x
10^{3} células cada una de ellas) y se incubaron a 37ºC. A
distintos tiempos, las células se fijaron con paraformaldehído
(0,5%) y se midió la agrupación de células heterotípicas mediante
citometría de flujo, utilizando el FACScan (Becton and Dickinson
& Co,
Oxnard, CA).
Oxnard, CA).
La agrupación entre las células DC y los
linfocitos T que permanecen se evaluó mediante un procedimiento
diferente. Las DC (50x10^{3} células) se preincubaron con/sin los
anticuerpos anti-DC-SIGN
AZN-D1 y AZN-D2 (10 g/ml) durante
10 minutos a TA. Se añadieron PBC alogénicos (1x10^{6} células),
marcados con el colorante fluorescente calceína-A
(Molecular Probes, Eugene, OR; 25 \mug/10^{7} células/ml durante
30 minutos a 37ºC) y la mezcla celular se incubó a 37ºC. La
agrupación se determinó midiendo el porcentaje de DC que se ha unido
a los linfocitos T fluorescentes por citometría de flujo utilizando
el FACScan (Becton and Dickinson & Co., Oxnard, CA).
Ej.
9G
Linfocitos T alogénicos sensibles (100x10^{3})
se añadieron a las células DC estimuladoras (1,5x10^{3}) en
presencia de anticuerpos bloqueantes (20 g/ml). Las células se
cultivaron durante 4 días. En el día 4, se emitieron impulsos de
[^{3}H] metil-timidina a las células durante 16
horas (1,52 TBq/mmol, 0,5 \muCi/pocillo; Amersham,
Buckingamshire, Reino Unido), y se cuantificó la absorción.
Ej.
9H
Se desarrolló el
VIH-1_{Ba-L} a un título más alto
en macrófagos derivados de monocitos (MDM). Siete días después de
la titulación de la reserva vírica en los MDM, se determinó
TCID_{50} mediante un ensayo ELISA para el antígeno p24
(Diagnostics Pasteur, Marnes la Coquette, Francia), y se estimó en
10^{4}/ml. Células DC (50 x 10^{3}) que se preincubaron con
anticuerpos (50 \mug/ml) durante 20 minutos, a TA, se sometieron
a la emisión de impulsos con el
VIH-1_{Ba-L} de tipo salvaje,
durante 2 horas (con una infección múltiple de 10^{3} unidades
infecciosas por 10^{5} células), se lavaron y cocultivaron con
PBMC activados con PHA/II-2 (50 x 10^{3}). Se
recuperaron los sobrenadantes 3 y 5 días después del cocultivo de
las células DC con los linfocitos T, midiéndose los niveles del
antígeno p24 mediante un ensayo ELISA del antígeno p24 (Diagnostics
Pasteur Marnes la Coquette, Francia). Los PBMC se activaron
cultivándolos en presencia de IL-2 (10 U/ml) y PGA
(10 \mug/ml).
Ej.
9I
Criocortes (8 \mum) de amígdalas y nódulos
linfáticos se fijaron en acetona al 100% (10 minutos), se lavaron
con PBS y se incubaron con el primer anticuerpo (10 \mug/ml)
durante 60 minutos a TA. Después del lavado, se llevó a cabo la
tinción final con el equipo ABC-AP Vectastain
(Vector Laboratories, Burlingame, CA), según el protocolo del
fabricante. La tinción nuclear se realizó con hemateína().
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Koninklijke Universiteit Nijmegen, Afdeling tumorimmunologie
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DIRECCIÓN: Philips van Leydenlaan 25
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Nijmegen
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Netherlands
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 6525 EX
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: + 31 243 617 600
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: + 31 243 540 339
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0. Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Composición y procedimiento para modular la interacción entre células dendríticas y linfocitos T.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1215 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 415 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
Claims (16)
1. Utilización de un anticuerpo que se une al
receptor denominado DC-SIGN, en la superficie de una
célula dendrítica y que se representa como SEC ID nº 2 o una
variante natural o fragmento del mismo, en la preparación de un
medicamento destinado a reducir una respuesta inmune en un animal,
en la que dicho anticuerpo inhibe la interacción entre una célula
dendrítica y un linfocito T.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la
preparación de una composición para reducir una o más interacciones
entre una célula dendrítica y un linfocito T.
3. Utilización según la reivindicación 1 y/o 2,
en la preparación de una composición para reducir la adhesión entre
un DC-SIGN en la superficie de una célula dendrítica
y un receptor ICAM en la superficie de un linfocito T.
4. Utilización según la reivindicación 3, en la
que el receptor ICAM es el receptor ICAM-3 en la
superficie de un linfocito T.
5. Utilización de un anticuerpo que se une al
receptor denominado DC-SIGN en la superficie de una
célula dendrítica y que se representa como SEC ID nº 2 o una
variante natural o fragmento del mismo, en la preparación de un
medicamento destinado a inhibir la adhesión de la proteína
superficial del VIH a la superficie de una célula dendrítica.
6. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el anticuerpo es un
anticuerpo monoclonal.
7. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el animal es humano.
8. Anticuerpo dirigido contra el receptor
denominado DC-SIGN en la superficie de una célula
dendrítica y que se representa como SEC ID nº 2 o una variante
natural o fragmento del mismo, en el que dicho anticuerpo inhibe la
interacción entre una célula dendrítica y un linfocito T.
9. Anticuerpo según la reivindicación 8, que es
un anticuerpo monoclonal.
10. Anticuerpo según la reivindicación 9, que es
AZN-D1 y que se identifica como el número de
registro de ECACC 99040818, o AZN-D2 que se
identifica en la presente memoria como número de registro de ECACC
99040819.
11. Composición farmacéutica, que contiene por
lo menos un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 8 a
10, y por lo menos otro portador, excipiente, adyuvantes y/o
formulantes conocidos per se.
12. Utilización de un anticuerpo según las
reivindicaciones 8 a 10, en la detección de células dendríticas en
una muestra biológica.
13. Utilización de un anticuerpo según las
reivindicaciones 8 a 10, en el aislamiento, preparación y/o
purificación de células dendríticas a partir de una muestra
biológica o de un medio de cultivo.
14. Procedimiento para producir, aislar y/o
purificar células dendríticas a partir de una muestra biológica o
de un medio de cultivo, que comprende las etapas que consisten en:
a) poner en contacto una muestra biológica o un medio de cultivo
que contiene células dendríticas con un anticuerpo según cualquiera
de las reivindicaciones 8 a 10; b) separar las células que se unen
a dicho anticuerpo de las células que no se unen a dicho anticuerpo,
y opcionalmente de cualquier otro constituyente de la muestra o del
medio; y que comprende además opcionalmente la etapa que consiste
en: c) separar las células que se unen al anticuerpo a partir de
dicho anticuerpo.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en
el que el anticuerpo se une a una columna o matriz, a perlas
(para)magnéticas o a un soporte sólido similar.
16. Procedimiento según la reivindicación 14 ó
15, en el que la muestra biológica es un líquido biológico, tal
como sangre, plasma o líquido linfático.
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