BR112020004543A2

BR112020004543A2 - proteínas de ligação ativadas condicionalmente restritas

Info

Publication number: BR112020004543A2
Application number: BR112020004543-8A
Authority: BR
Inventors: Chad May; Robert B. Dubridge; Maia Vinogradova; Anand PANCHAL
Original assignee: Maverick Therapeutics, Inc.
Priority date: 2017-09-08
Filing date: 2018-09-06
Publication date: 2020-09-08
Also published as: MX2020002667A; US11744893B2; US20220273795A1; IL302613A; PE20212205A1; MY201723A; TWI812637B; KR20200047687A; IL273119B1; ZA202002325B; JP2023093632A; AU2018328291A1; AU2023200434A1; TWI823811B; TW202426489A; CL2021002241A1; IL273119A; CN111356700A; ECSP20021323A; PH12020500474A1

Abstract

A invenção refere-se a construtos de Ativação Redirecionada Biespecífica Condicional, ou COBRAs, que são administrados em um formato pró-droga ativo. Mediante exposição a proteases tumorais, os construtos são clivados e ativados, de modo que eles podem ligar tanto antígenos alvo de tumor (TTAs), bem como CD3, recrutando assim células T que expressam CD3 para o tumor, resultando em tratamento.

Description

PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO RESTRITAS CONDICIONALMENTE ATIVADAS I. REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica prioridade de acordo com 35 U.S.C. §119(e) ao Pedido de Patente Provisório U.S. 62/555.943 depositado em 8 de setembro de 2017, Pedido de Patente Provisório U.S. 62/586.627 depositado em 15 de novembro de 2017 e Pedido de Patente Provisório U.S. 62/587.318 depositado em 16 de novembro de 2017, todos expressamente incorporados aqui por referência na sua totalidade.

II. REFERÊNCIA A UMA "LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS", A UMA TABELA OU A UM ANEXO DE PROGRAMA DE COMPUTADOR ENVIADO EM UM DISCO COMPACTO.

[0002] A listagem de sequências contida no arquivo chamado “118459- 5005_ST25.txt” e com um tamanho de 984 kilobytes, foi submetida eletronicamente por meio deste via EFS-Web, e o conteúdo do arquivo txt é incorporado por referência na íntegra.

III. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0003] A destruição seletiva de uma célula individual ou de um tipo específico de célula é frequentemente desejável em uma variedade de configurações clínicas. Por exemplo, é um objetivo principal da terapia do câncer destruir especificamente células tumorais, deixando células e tecidos saudáveis tão intactos e sem danos quanto possível. Um desses métodos é induzir uma resposta imune contra o tumor, para fazer células efetoras imunes, como células assassinas naturais (NK) ou linfócitos T citotóxicos (CTLs), atacarem e destruírem células tumorais.

[0004] O uso de anticorpos monoclonais intactos (mAb), que fornecem especificidade e afinidade de ligação superiores a um antígeno associado ao tumor, foi aplicado com sucesso na área de tratamento e diagnóstico do câncer. No entanto, o grande tamanho dos mAbs intactos, sua baixa distribuição biológica, baixa potência e longa persistência no pool de sangue limitaram suas aplicações clínicas. Por exemplo, anticorpos intactos podem exibir acúmulo específico dentro da área do tumor. Nos estudos de biodistribuição, observa-se uma distribuição não homogênea de anticorpos com acúmulo primário nas regiões periféricas ao investigar com precisão o tumor. Devido à necrose do tumor, distribuição não homogênea de antígenos e aumento da pressão do tecido intersticial, não é possível atingir porções centrais do tumor com construtos de anticorpos intactos. Por outro lado, fragmentos menores de anticorpos mostram rápida localização do tumor, penetram mais profundamente no tumor e também são removidos relativamente rapidamente da corrente sanguínea. No entanto, muitos anticorpos, incluindo scFvs e outros construtos, mostram efeitos "no alvo/fora do tumor", em que a molécula é ativa em células não tumorais, causando efeitos colaterais, alguns dos quais podem ser tóxicos. A presente invenção está relacionada a novos construtos que são ativados seletivamente na presença de proteases tumorais.

IV. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0005] A presente invenção fornece várias composições proteicas diferentes para o tratamento de câncer. Por conseguinte, em um aspecto, a invenção fornece proteínas "Formato 2" compreendendo, de N a C-terminal: um primeiro domínio de ligação ao antígeno de domínio único (sdABD) que se liga a um antígeno alvo de tumor humano (TTA) (sdABD-TTA) ; b) um primeiro ligante de domínio; c) um domínio Fv restrito compreendendo: i) um primeiro domínio pesado variável compreendendo um vhCDR1, vhCDR2 e vhCDR3; ii) um ligante não clivável restrito (CNCL); e iii) um primeiro domínio leve variável compreendendo vlCDR1, vlCDR2 e vlCDR3; d) um segundo ligante de domínio; e) um segundo sdABD-TTA; f) um ligante clivável (CL); g) um pseudodomínio Fv restrito compreendendo: i) um primeiro pseudodomínio variável leve; ii) um ligante não clivável (NCL); e iii) um primeiro pseudodomínio variável pesado; h) um terceiro ligante de domínio; e i) um terceiro sdABD que se liga à albumina sérica humana; em que o referido primeiro domínio pesado variável e o referido primeiro domínio leve variável são capazes de se ligar a CD3 humano, mas o referido domínio Fv restrito não se liga a CD3; o referido primeiro domínio pesado variável e o referido primeiro pseudodomínio leve variável associado intramolecularmente para formar um Fv inativo; e o referido primeiro domínio leve variável e o referido primeiro pseudodomínio pesado variável associado intramolecularmente para formar um Fv inativo.

[0006] Em um aspecto adicional, a invenção fornece proteínas "Formato 1" compreendendo, de N a C-terminal: a) um primeiro sdABD-TTA; b) um primeiro ligante de domínio; c) um domínio Fv restrito compreendendo: i) um primeiro domínio pesado variável compreendendo um vhCDR1, vhCDR2 e vhCDR3; ii) um ligante não clivável restrito (CCL); e iii) um primeiro domínio leve variável compreendendo vlCDR1, vlCDR2 e vlCDR3; d) um segundo ligante de domínio; e) um segundo sdABD-TTA; f) um ligante clivável (CL); g) um pseudodomínio Fv restrito compreendendo: i) um primeiro pseudodomínio variável leve; ii) um ligante não clivável (NCL); e iii) um primeiro pseudodomínio variável pesado; h) um terceiro ligante de domínio; e i) um terceiro sdABD que se liga à albumina sérica humana; em que o referido primeiro domínio pesado variável e o referido primeiro domínio leve variável são capazes de se ligar a CD3 humano, mas o referido domínio Fv restrito não se liga a CD3; em que o referido primeiro domínio pesado variável e o referido primeiro pseudodomínio leve variável associado intramolecularmente para formar um Fv inativo; e em que o referido primeiro domínio leve variável e o referido primeiro pseudodomínio pesado variável associado intramolecularmente para formar um Fv inativo.

Em um aspecto adicional, a invenção fornece proteínas "Formato 4" compreendendo, de N a C-terminal: a) um primeiro domínio de ligação ao antígeno de domínio único (sdABD) que se liga a um antígeno alvo de tumor humano (TTA) (sdABD-TTA) ; b) um primeiro ligante de domínio; c) um domínio Fv restrito compreendendo: i) um primeiro domínio pesado variável compreendendo um vhCDR1, vhCDR2 e vhCDR3; ii) um ligante não clivável restrito (CNCL); e iii) um primeiro domínio leve variável compreendendo vlCDR1, vlCDR2 e vlCDR3; d) um ligante clivável (CL); e) um segundo sdABD que se liga à albumina sérica humana; f) um ligante de domínio; g) um pseudodomínio Fv restrito compreendendo: i) um primeiro pseudodomínio variável leve; ii) um ligante não clivável (NCL); e iii) um primeiro pseudodomínio variável pesado; em que o referido primeiro domínio pesado variável e o referido primeiro domínio leve variável são capazes de se ligar a CD3 humano, mas o referido domínio Fv restrito não se liga a CD3; em que o referido primeiro domínio pesado variável e o referido primeiro pseudodomínio leve variável associado intramolecularmente para formar um Fv inativo; e em que o referido primeiro domínio leve variável e o referido primeiro pseudodomínio pesado variável associado intramolecularmente para formar um Fv inativo.

[0007] Em um aspecto adicional das proteínas Formato 1, Formato 2 e Formato 4 listadas acima, o referido primeiro domínio pesado variável é N-terminal ao referido primeiro domínio leve variável e o referido pseudodomínio variável leve é N-terminal ao referido pseudodomínio pesado variável.

[0008] Em um aspecto adicional às proteínas Formato 1, Formato 2 e Formato 4 listadas acima, o referido primeiro domínio pesado variável é N-terminal ao referido primeiro domínio leve variável e o referido pseudodomínio pesado variável é N-terminal ao referido pseudodomínio leve variável.

[0009] Em um aspecto adicional das proteínas Formato 1, Formato 2 e Formato 4 listadas acima, o referido primeiro domínio leve variável é N-terminal ao referido primeiro domínio pesado variável e o referido pseudodomínio variável leve é N-terminal ao referido pseudodomínio pesado variável.

[0010] Em um aspecto adicional às proteínas Formato 1, Formato 2 e Formato 4 listadas acima, o referido primeiro domínio leve variável é N-terminal ao referido primeiro domínio pesado variável e o referido pseudodomínio pesado variável é N-terminal ao referido pseudodomínio leve variável.

[0011] Num aspecto adicional, a invenção fornece proteínas de Formato 1 e 2 em que os referidos primeiro e segundo TTA são os mesmos.

[0012] Num aspecto adicional, a invenção fornece proteínas de Formato 1 e 2 em que o referido primeiro e segundo TTA são diferentes.

[0013] Em um aspecto adicional, a invenção fornece proteínas de Formato 1, 2 e 4, em que o referido primeiro e segundo TTA são selecionados de EGFR, EpCAM, FOLR1 e B7H3. Essas sequências podem ser selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 41.

[0014] Em um aspecto adicional, a invenção fornece proteínas de Formato 1, 2 e 4 em que o referido domínio de extensão de meia-vida tem a SEQ ID NO: 45.

[0015] Em um aspecto adicional, a invenção fornece proteínas de Formato 1, 2 e 4, em que o referido ligante clivável é clivado por uma protease humana selecionada do grupo que consiste em MMP2, MMP9, Meprina A, Meprina B, Catepsina S, Catepsina K, Catespina L, GranzimaB, uPA, Kallekriein7, matriptase e trombina.

[0016] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma proteína selecionada do grupo que consiste em Pro186, Pro225, Pro226, Pro233, Pro311, Pro312, Pro313, Pro495, Pro246, Pro254, Pro255, Pro256, Pro420, Pro421, Pro432, Pro479, Pro480 , Pro187, Pro221, Pro222, Pro223, Pro224, Pro393, Pro394, Pro395, Pro396, Pro429, Pro430 e Pro431.

[0017] Em um aspecto adicional, a invenção fornece ácidos nucleicos que codificam uma proteína de Formato 1, Formato 2 ou Formato 4, como aqui descrito, bem como vetores de expressão e células hospedeiras compreendendo os ácidos nucleicos que codificam a proteína.

[0018] Em um aspecto adicional, a invenção fornece métodos para fabricar as proteínas da invenção e métodos para o tratamento de pacientes em necessidade do mesmo.

[0019] Em um aspecto adicional, a invenção fornece composições compreendendo pares "Formato 3A" de proteínas pró-droga, compreendendo: a) uma primeira proteína compreendendo, do N ao C-terminal: i) um primeiro sdABD- TTA; ii) um primeiro ligante de domínio; iii) um pseudodomínio Fv compreendendo, de N a C-terminal: 1) uma cadeia pesada variável compreendendo um vhCDR1, vhCDR2 e vhCDR3; 2) um ligante clivável; e 3) um primeiro pseudodomínio leve variável compreendendo iVLCDR1, iVLCDR2 e iVLCDR3; iv) um segundo ligante de domínio; v) um sdABD-HSA; a) uma primeira segunda proteína compreendendo, de N a C-terminal: i) um terceira sdABD que se liga a um antígeno alvo do tumor humano; ii) um terceiro ligante de domínio; iii) um pseudodomínio Fv compreendendo, de N a C-terminal: 1) uma cadeia leve variável compreendendo VLCDR1, VLCDR2 e VLCDR3; 2) um ligante clivável; e 3) um primeiro pseudodomínio pesado variável compreendendo iVHCDR1, iVHCDR2 e iVHCDR3; iv) um quarto ligante de domínio; v) um sdABD-HSA; em que o referido primeiro domínio pesado variável e o referido primeiro domínio leve variável são capazes de se ligar ao CD3 humano quando associado; em que o referido primeiro domínio pesado variável e o referido primeiro pseudodomínio leve variável associam-se intermolecularmente para formar um Fv inativo; em que o referido primeiro domínio leve variável e o referido primeiro pseudodomínio pesado variável associam-se intermolecularmente para formar um Fv inativo; e em que o referido primeiro e terceiro sdABD são selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 41.

[0020] Em um aspecto adicional, a invenção fornece composições compreendendo pares "Formato 3B" de proteínas pró-droga, compreendendo a) uma primeira proteína compreendendo, do N ao C-terminal: i) um primeiro sdABD- TTA; ii) um primeiro ligante de domínio; iii) um segundo sdABD-TTA; iv) um segundo ligante de domínio; iii) um pseudodomínio Fv compreendendo, de N a C-

terminal: 1) uma cadeia pesada variável compreendendo um vhCDR1, vhCDR2 e vhCDR3; 2) um ligante clivável; e 3) um primeiro pseudodomínio leve variável compreendendo iVLCDR1, iVLCDR2 e iVLCDR3; iv) um terceiro ligante de domínio; e v) um sdABD-HSA; a) uma primeira segunda proteína compreendendo, de N a C- terminal: i) uma terceira sdABD-TTA; ii) um quarto ligante de domínio; iii) um quarto sdABD-TTA; iv) um quinto ligante de domínio; iii) um pseudodomínio Fv compreendendo, de N a C-terminal: 1) uma cadeia leve variável compreendendo VLCDR1, VLCDR2 e VLCDR3; 2) um ligante clivável; e 3) um primeiro pseudodomínio pesado variável compreendendo iVHCDR1, iVHCDR2 e iVHCDR3; iv) um sexto ligante de domínio; v) um sdABD-HSA; em que o referido primeiro domínio pesado variável e o referido primeiro domínio leve variável são capazes de se ligar ao CD3 humano quando associado; em que o referido primeiro domínio pesado variável e o referido primeiro pseudodomínio leve variável associam-se intermolecularmente para formar um Fv inativo; e em que o referido primeiro domínio leve variável e o referido primeiro pseudodomínio pesado variável se associam intermolecularmente para formar um Fv inativo.

[0021] Em um aspecto adicional, as proteínas Formato 3A e Formato 3B possuem sdABD-HSA que possui a SEQ ID NO: 45.

[0022] Em um aspecto adicional, as proteínas Formato 3A e Formato 3B possuem sdABD-TTA que se liga a um TTA selecionado de EGFR, EpCAM, FOLR1 e B7H3. Os sdABD-TTAs podem ser selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 41.

[0023] Em um aspecto adicional, a invenção fornece composições de ácido nucleico compreendendo os primeiros ácidos nucleicos que codificam os primeiros membros de proteína do par pró-droga e os segundos ácidos nucleicos que codificam os segundos membros de proteína dos pares, e vetores de expressão e células hospedeiras que contêm os ácidos nucleicos.

V. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0024] A Figura 1 representa o tipo "formato 1" de ativação de protease da presente invenção, aqui referido como "construtos restritos, cliváveis" ou "construtos cc". Nesta modalidade, uma construto representativo é Pro140: existem ABDs para dois TTA (como representado em A Figura 1, ambos são os mesmos, embora, conforme descrito aqui, eles possam ser diferentes). Após a clivagem, o construto de pró-droga se divide em três componentes, um contendo um domínio α-TTA ligado por meio de um ligante de domínio a um VH ativo de αCD3, o segundo contendo um domínio α-TTA ligado por meio de um ligante de domínio a um VL ativo de αCD3, e uma peça "restante" compreendendo o domínio de extensão da meia vida ligado ao VH e VL inativos. Os dois domínios variáveis ativos são livres de associação para formar um domínio de ligação anti-CD3 funcional. Deve-se notar que, nas modalidades "formato 1", o componente ativo resultante é trivalente: existe ligação monovalente ao CD3 e ligação bivalente ao TTA, renderizando uma proteína de ligação biespecífica, embora em alguns casos essa trivalência possa ser trispecífica, com ligação monovalente a CD3, ligação monovalente a um primeiro TTA e ligação monovalente a um segundo TTA. A Figura 1 também mostra um domínio de albumina sérica anti-humana (HSA) como um domínio de extensão de meia-vida, em muitas modalidades um sdABD como aqui definido, embora como discutido aqui, isso seja opcional e/ou possa ser substituído por outros domínios de extensão de meia-vida ; além disso, o domínio de extensão de meia-vida também pode ser um terminal N para o construto ou também interno. A Figura 1 também possui o VH e VL do Fv e iVH e iVL do pseudo Fv em uma ordem específica, por exemplo, do N ao C terminal, VH-ligante-VL (e iVL-ligante-iVH), embora como será apreciado por aqueles na técnica, estes podem ser revertidos (VL-ligante-VH e iVH-ligante-iVL). Alternativamente, um desses Fvs pode estar em uma orientação e o outro na outra orientação, embora a expressão de proteína na orientação mostrada aqui seja surpreendentemente mais alta do que as outras orientações.

[0025] A Figura 2 representa o tipo "formato 2" de ativação de protease da presente invenção, referida aqui como "construtos restritos, não cliváveis" ou "construtos CNCL", também algumas vezes mencionado aqui como "construtos de dimerização", conforme discutido aqui. Esses construtos não isomerizam como discutido aqui. Após a clivagem, dois construtos de pró-droga se dividem em quatro componentes, dois domínios de extensão de meia-vida (neste caso, sdABDs para HSA) ligados a dois pseudodomínios (que podem ou não ser capazes de se auto- associar, dependendo do tamanho dos ligantes e mutações de inativação) e duas frações ativas que se automontam em uma fração ativa dimérica que contém quatro domínios anti-TTA (que podem ser iguais ou dois iguais ou iguais e os outros dois diferentes). Deve-se notar que, nas modalidades de "formato 2", o componente ativo resultante é hexavalente: existe ligação bivalente ao CD3 e ligação quadrivalente ao TTA, tornando uma proteína de ligação biespecífica, embora em alguns casos essa hexavalência possa ser triespecífica, com ligação bivalente a CD3, ligação bivalente a um primeiro TTA e ligação bivalente a um segundo TTA. A Figura 2 também mostra um domínio de albumina sérica anti-humana (HSA) como um domínio de extensão de meia-vida, em muitas modalidades um sdABD como aqui definido, embora como discutido aqui, isso seja opcional e/ou possa ser substituído por outros domínios de extensão de meia-vida ; além disso, o domínio de extensão de meia-vida também pode ser um terminal N para o construto ou A Figura 2 também interno. também possui o VH e VL do Fv e iVH e iVL do pseudo Fv em uma ordem específica, por exemplo, do N ao C terminal, VH-ligante-VL (e iVL-ligante-iVH), embora como será apreciado por aqueles na técnica, estes podem ser revertidos (VL-ligante-VH e iVH-ligante-iVL). Alternativamente, um desses Fvs pode estar em uma orientação e o outro na outra orientação, embora a expressão de proteína na orientação mostrada aqui seja surpreendentemente mais alta do que as outras orientações.

[0026] A Figura 3A - A Figura 3B representa o tipo "formato 3", de construtos também conhecido como "hemi-construtos" ou "hemi-COBRA™", conforme descrito aqui, pois essas são duas cadeias polipeptídicas diferentes que juntas formam um terapêutico MCE como está discutido aqui. Nesta modalidade, os construtos são distribuídos em pares, com a automontagem intramolecular de pré- clivagem, resultando em domínios Fv anti-CD3 inativos. Após a clivagem, os domínios variáveis inertes são liberados e os dois domínios variáveis ativos são montados intermolecularmente, para formar um domínio de ligação ao anti-CD3 ativo. Os dois sdABD-TTAs se ligam ao receptor correspondente na superfície da célula tumoral, e a clivagem é realizada por uma protease. Isso permite a montagem intermolecular, uma vez que as moléculas são fisicamente mantidas no lugar, favorecendo a montagem do domínio anti-CD3 ativo. Como acima, para os formatos 1 e 2, nesta modalidade, a ordem N a C terminal dos domínios variáveis pode ser revertida ou também misturada. Além disso, o sdABD (HSA) pode estar no N ou C-terminal de cada hemi-construto. O Pro16 possui o sdABD (HSA) no C- terminal e o Pro17 no N-terminal (ver Pro19, SEQ ID NO: XX, o sdABD (HSA) no C-terminal). A Figura 3A mostra construtos de Formato 3 com um único domínio sdABD-TTA por hemi-construto e A Figura 3B mostra construtos de Formato 3 com dois sdABD-TTAs por hemi-construto, em um formato de "duplo direcionamento" ou "hetero-direcionamento". Observe que a Figura 3B usa FOLR1 e EGFR como os dois TTAs, mas também podem ser usadas outras combinações descritas aqui.

[0027] A Figura 4 descreve o tipo "Formato 4" de construtos que são semelhantes aos construtos "formato 2", mas possuem apenas um único sdABD- TTA. A figura mostra o sdABD-TTA para EGFR, mas como será apreciado pelos versados na técnica, outro TTA também pode ser usado. Após a clivagem, o construto pró-droga se divide em dois componentes, um domínio de extensão de meia-vida (neste caso, sdABDs para HSA) ligado a um pseudo Fv e uma fração ativa, que na presença de uma segunda fração ativa de uma molécula clivada diferente , se automonta em uma fração ativa dimérica que contém dois domínios anti-TTA. Deve-se notar que, nas modalidades "formato 4", o componente ativo resultante é quadrivalente: há ligação bivalente ao CD3 e ligação bivalente ao TTA, renderizando uma proteína de ligação biespecífica. A Figura 4 também mostra um domínio de albumina sérica anti-humana (HSA) como um domínio de extensão de meia-vida, em muitas modalidades um sdABD(½) como aqui definido, embora como discutido aqui, isso seja opcional e/ou possa ser substituído por outros domínios de extensão de meia-vida ; além disso, o domínio de extensão de meia- vida também pode ser um terminal N para o construto ou A Figura 4 também interno. também possui o VH e VL do Fv e iVH e iVL do pseudo Fv em uma ordem específica, por exemplo, do N ao C terminal, VH-ligante-VL (e iVL-ligante-iVH), embora como será apreciado por aqueles na técnica, estes podem ser revertidos (VL-ligante-VH e iVH-ligante-iVL). Alternativamente, um desses Fvs pode estar em uma orientação e o outro na outra orientação, embora a expressão de proteína na orientação mostrada aqui seja surpreendentemente mais alta do que as outras orientações.

[0028] Figura 5A - a Figura 5G representa um número de sequências da invenção. Para domínios de ligação ao antígeno, as CDRs estão sublinhadas. Como é descrito mais detalhadamente neste documento, esses domínios podem ser montados em uma ampla variedade de configurações na presente invenção, incluindo orientações "formato 1", "formato 2", "formato 3" e "formato 4". É de notar que a SEQ ID NO: 90 é clivada por MMP9 ligeiramente mais rápida que a SEQ ID NO: s 75 e 76, e a SEQ ID NO: 91 é clivada mais lentamente que a SEQ ID NO:s 75 e 76.

[0029] Figura 6A - A Figura 6B representa um número de sítios de clivagem de protease adequados. Como será apreciado pelos versado na técnica, esses sítios de clivagem podem ser usados como ligantes cliváveis. Em algumas modalidades, por exemplo, quando são necessários ligantes cliváveis mais flexíveis, pode haver aminoácidos adicionais (geralmente glicina e serinas) que são um ou ambos N e C-terminais para esses sítios de clivagem.

[0030] Figura 7A - A Figura 7D representa alguns dados associados às estruturas "Formato 3" ou "hemi-COBRA ™". Isso mostra que os construtos do Formato 3 se ligam cooperativamente ao CD3 após a clivagem por protease (nesse caso, protease EK, embora qualquer um dos sítios de clivagem de protease descritos aqui e representados Figura 5 e Figura 6 possam ser usados) e criam um sítio de ligação a CD3, como mostrado por uma análise FACS sanduíche.

[0031] Figura 8A - A Figura 8D mostra que a clivagem de protease ativa cooperativamente a morte de células T de células alvo de EGFR+ com pares hemi- COBRA ™ complementares. Figura A e Figura B mostram que os construtos isolados, mas clivadas com diferentes concentrações de protease, não afetam a viabilidade da célula alvo. No entanto, Figura C mostra que, em combinação, na presença de protease, a viabilidade das células alvo é significativamente diminuída. Figura D mostra o mecanismo geral.

[0032] A Figura 8 mostra alguns controles não alvo para uso nos ensaios para testar a eficácia dos construtos de Formato 1.

[0033] Figura 9A - A Figura 10F mostra que a geração de um domínio de ligação a CD3 ativo depende da ligação ao alvo de ambos os "braços", por exemplo, os domínios sdABD-TTA, um dos quais está em cada um dos dois construtos. O ensaio TDCC foi realizado como descrito nos Exemplos.

[0034] A Figura 10 mostra o esquema dos pares hemi-COBRA™ adequados. "Mep" representa um sítio de clivagem de protease da meprina, "His-6" é uma etiqueta conforme ainda discutido aqui, ST14 é um sítio de clivagem da protease da matriptase e "Thb" é um sítio de clivagem da protease da trombina.

[0035] Figura 11A - A Figura 12C mostra os dados TDCC associados aos construtos de A Figura 10. Figura 11A mostra que a adição de pares hemi-COBRA pré-clivados resulta em eficácia nas células OvCAR8, Figura 11B mostra que a adição de pares hemi-COBRA pré-clivados resulta em eficácia nas células HCT116 e Figura 11C mostra que a adição de pares hemi-COBRA pré-clivados resulta em eficácia nas células LoVo, todas elas são linhagens celulares de câncer.

[0036] Figura 12A - Figura 13B mostra que o ligante MMP9 é estável in vivo. Aos camundongos NSG foi administrada uma dose única em bolus intravenosa de Pro40 (MMP9 clivável), Pro74 (não clivável) através da veia da cauda a um nível de dose de 0,5 mg/kg. A solução de dose para cada composto foi preparada em um veículo de ácido cítrico 25 mM, L-arginina 75 mM, NaCl 75 mM e sacarose a 4%, pH 7,0. Duas amostras de sangue foram coletadas nos momentos pré- selecionados de cada animal, uma no início do estudo, coletada por sangramento orbital ou sangramento submandibular e outra no momento terminal por punção cardíaca. Os momentos para coleta de sangue foram 0,083, 1, 6, 24, 72 e 168h. O plasma foi preparado a partir de cada amostra de sangue individual usando tubos K2 EDTA. As concentrações foram determinadas usando um ensaio MSD com um MAb específico para o anti-HSA sdABD e detectadas com o domínio extracelular de EGFR.

[0037] A Figura 13 representa os esquemas dos construtos hemi-COBRA™ do Formato 3A usadas nas experiências descritas em A Figura. O Pro51 é o controle positivo, pois está "sempre ligado", pois forma um anti-CD3 Fv ativo. O Pro98 é um controle negativo, uma vez que seu sdABD é direcionado contra a lisozima do ovo de galinha, que não é expressa pelo tumor. Pro77 e Pro53 são o par pró-droga Formato 3A, usando sdABDs contra EGFR e um sítio de clivagem MMP9. Pro74 e Pro72 são um par Formato 3A de controle negativo, uma vez que não possuem sítios de clivagem.

[0038] A Figura 14 mostra que os construtos de Formato 1 trabalham para regredir tumores in vivo, usando duas linhagens de células tumorais diferentes implantadas em camundongos usando os protocolos nos Exemplos. A atividade antitumoral com os construtos hemi-COBRA (Pro77 e Pro53) dependia da inclusão dos sdABDs anti-EGFR e dos ligantes cliváveis MMP9, juntamente com o Fv anti- CD3 ativo.

[0039] A Figura 15 mostra o esquema do formato da próxima geração, um construto de comprimento total que possui dois pseudodomínios Fv com sítios cliváveis entre eles, como é geralmente descrito em US 2018/0134789, aqui incorporado por referência. No entanto, como mostrado nas figuras a seguir, esse construto de primeira geração de comprimento total não mostra muito boa condicionalidade, pois pode isomerizar para formar um construto ativo e inativo.

[0040] A Figura 16 mostra que os pares de construto de Formato 3A realmente mostram melhor condicionalidade do que os construtos de comprimento total de primeira geração do Pro100.

[0041] A Figura 17 mostra construtos adicionais de primeira geração que foram testados em A Figura18.

[0042] A Figura 18 mostra que os construtos de primeira geração mostram alta atividade mesmo no formato não clivado, por exemplo, baixa condicionalidade.

[0043] A Figura 19 mostra que os construtos de comprimento total de primeira geração mostram dois picos de monômero na SEC analítica.

[0044] A Figura 20 mostra o esquema da razão para a atividade não clivada, que é que os construtos de primeira geração completos se isomerizam para formar duas conformações, uma inativa, uma vez que não há Fv anti-CD3 ativo formado (o "scFv bivalente"), e o outro que está ativo na ausência de protease, um tipo de configuração do tipo "diacorpo de cadeia simples". Ver PEDS 23(8):667-677 (2010).

[0045] A Figura 21 mostra os resultados de um ensaio TDCC, executado a 37°C por 2 dias, com os construtos de cadeia única de primeira geração. Os resultados mostram que os construtos não clivados mostram forte extermínio. Esses resultados levaram à geração dos construtos de Formato 1.

[0046] Figura 22A - A Figura 23G mostra os construtos de Formato 1 usados na invenção. Como será apreciado pelos versados na técnica e aqui descritos, estes são representados com uma porção de sdABD-EGFR, embora possam ser utilizados sdABDs para outros TTAs.

[0047] A Figura 23 mostra que os construtos de Formato 1 (Pro140 neste caso) formam um único isômero que é estável a 37C.

[0048] A Figura 24 mostra que os construtos de Formato 1 têm uma ligação muito baixa ao CD3 humano no formato não clivado, conforme medido por um ensaio Octet. A linha superior é Pro120, a linha do meio é Pro51 (o controle positivo) e as linhas inferiores são Pro140 mantidas em 4C ou 37C por 3 dias.

[0049] A Figura 25 mostra de maneira semelhante que os construtos do Formato 1 têm atividade TDCC muito baixa na forma não clivada.

[0050] A Figura 26 representa um construto específico do Formato 1, Pro140, usado em testes in vivo , usando sdABD-EGFR como frações de direcionamento e um sítio de clivagem de MMP9.

[0051] Figura 27A - A Figura 28B mostra a regressão do tumor usando um construto de Formato 1.

[0052] A Figura 28 mostra que, devido ao sítio de clivagem no Fv restrito, vários fragmentos diferentes podem ser gerados: um fragmento parcialmente clivado e o fragmento totalmente clivado. Surpreendentemente, o formato parcialmente clivado é mais ativo que o formato totalmente clivado, levando à geração do Formato 2.

[0053] A Figura 29 mostra vários esquemas de Formato 2, todos os quais usam domínios de direcionamento sdABD-EGFR, embora, conforme descrito aqui e listado nas sequências, sdABDs para outros TTAs possam ser usados. O Pro51 e o Pro201 são controles positivos (em uma configuração “hemi” ativa) e o Pro214 é um controle negativo completo, pois não há sítio de clivagem.

[0054] A Figura 30 mostra a atividade TDCC do construto Pro187 do Formato 2, que usa um sítio de clivagem de meprina. O Pro187 no ensaio TDCC foi 1200 vezes mais ativo quando adicionado pré-clivado do que quando adicionado não clivado. O Pro187 pré-clivado demonstrou atividade que caiu entre os controles positivos Pro51 e Pro201. O Pro187 não clivado demonstrou atividade semelhante ao Pro214, que não contém um ligante clivável por protease.

[0055] A Figura 31 mostra a atividade TDCC do construto do Formato 2 Pro186, que usa um sítio de clivagem n MMP9. O Pro186 no ensaio TDCC foi 18 vezes mais ativo quando adicionado pré-clivado do que quando adicionado não clivado. O Pro186 pré-clivado demonstrou atividade que caiu entre os controles positivos Pro51 e Pro201. O Pro186 não clivado demonstrou mais atividade que o Pro214, que não contém um ligante clivável por protease.

[0056] A Figura 32 mostra que o construto Pro186 se liga a células que possuem níveis diferentes de receptores de EGFR, com células CHO que não expressam EGFR na superfície celular. O Pro186 satura células que expressam níveis diferentes de EGFR em concentrações similares de COBRA.

[0057] A Figura 33 mostra os esquemas dos construtos de Formato 2 usadas nos estudos in vivo de A Figura34, os quais usam domínios de direcionamento sdABD-EGFR.

[0058] A Figura 34 mostra que o construto Pro186 do Formato 2 é altamente eficaz em ambas as concentrações e melhor que o construto Pro140 do Formato 1 na concentração mais baixa.

[0059] A Figura 35 representa um número de construtos de Formato 2 com base em Pro186, mas com diferentes sítios de clivagem de protease. Embora todos esses construtos utilizem sdABD-EGFRs para ambos os domínios de direcionamento, outros sdABDs para diferentes TTAs podem ser usados e podem ser iguais ou diferentes. Ou seja, tanto o homo-direcionamento (ambos sdABDs de direcionamento para o mesmo TTA) quanto o hetero-direcionamento (um sdABD para um primeiro TTA e o outro para um TTA diferente) podem ser realizados.

[0060] A Figura 36 mostra os esquemas para diferentes construtos do Formato 2 que variam o comprimento do ligante entre os domínios Fv. Estes são mostrados usando um sítio de clivagem MMP9, embora outros possam ser usados como descrito aqui. Da mesma forma, todos esses construtos utilizam sdABD- EGFRs para ambos os domínios de direcionamento, outros sdABDs para diferentes TTAs podem ser usados e podem ser iguais ou diferentes.

[0061] A Figura 37 mostra que o comprimento do ligante para o pseudo Fv pode variar, por exemplo, que um construto de Formato 2 com um ligante curto entre o Fv ativo ("ativo curto") com um ligante mais longo entre o pseudo Fv ("inativo longo") exibe atividade semelhante a um “ativo curto” com um “inativo curto”. Assim, a condicionalidade do construto COBRA não depende de que ambos os ligantes scFv ativos e inativos sejam restringidos; desde que um deles esteja restrito, a dobra de diacorpo de cadeia única parece ser preferida à dobra de scFv bivalente.

[0062] A Figura 38 mostra que o comprimento do ligante para o Fv ativo pode ser variado, por exemplo, que os construtos de Formato 2 com "ativo longo" e

"inativo curto" se comportam de maneira semelhante a um construto "ativo curto" e "inativo curto". Assim, a condicionalidade do construto COBRA não depende de que ambos os ligantes scFv ativos e inativos sejam restringidos; desde que um deles esteja restrito, a dobra de diacorpo de cadeia única parece ser preferida à dobra de scFv bivalente.

[0063] Figura 39A - A Figura 40C mostra os esquemas para vários construtos diferentes. O Pro188 é um construto do Formato 1 que é semelhante ao Pro140, exceto com um ligante longo (16mer) no pseudo Fv. O Pro189 e o Pro190 (construtos de Formato 2) são semelhantes ao Pro186 e Pro187, exceto com um ligante longo (16mer) no pseudodomínio Fv. O Pro191 e o Pro192 (também construtos de Formato 2) são semelhantes aos Pro189 e Pro190, exceto que eles têm um sítios de clivagem adicional a montante do sdABD (1/2). O Pro193 (Formato 4) possui um único domínio de direcionamento EGFR, o iVH e o iVL reorganizados para estar em ordem inversa e um sítio de clivagem adicional a montante do sdABD (1/2). O Pro195 é um construto de Formato 2 semelhante ao Pro186, com domínios de direcionamento que se ligam ao mesmo TTA, EGFR, mas a diferentes epítopos. Pro196, Pro197 e Pro198 são construtos de Formato 2 com domínios variáveis reorganizados.

[0064] A Figura 40 mostra o fato de que diferentes clones de sdABD direcionados ao FOLR1 humano mostram extermínio diferencial. Um construto do tipo Pro22 (Pro51 com uma sequência FLAG em vez de um NCL) que se liga ao FOLR1 humano foi comparado a uma construto Pro22-EGFR contra várias famílias de linhagens celulares.

[0065] A Figura 41 mostra os esquemas para quatro construtos de sdABD- FOLR1, incluindo o uso do controle positivo Pro201 usando sdABD-EGFR2 (com duas moléculas associadas intermolecularmente para formar dois Fvs ativos contra CD3) e dois artigos de teste de Formato 2, Pro311, usando h77.2 sdABD e Pro312 usando h59.3 sdABD, bem como dois controles negativos, Pro299, usando h77.2 sdABD e Pro303 usando h59.3 sdABD.

[0066] A Figura 42 representa os esquemas das construtos de Formato 2 para o projeto FOLR/MMP9 in vivo.

[0067] A Figura 43 mostra a eficácia do construto Pro312 in vivo, e demonstra que o ligante clivável de MMP9 é necessário para a atividade antitumoral.

[0068] A Figura 44 mostra os esquemas de alguns formatos usando sdABDs para B7H3 humano (sdABD-B7H3), incluindo Pro244, o controle positivo (usando sdABD-B7H3 (hF7) (com duas moléculas se associando intermolecularmente para formar dois Fvs ativos contra CD3) e dois artigos de teste de Formato 2, Pro225, um construto de Formato 2 e Pro295, o controle negativo sem um sítio de clivagem.

[0069] A Figura 45 mostra que o Pro225 tem uma grande condicionalidade em comparação com o controle Pro295.

[0070] A Figura 46 mostra que um construto de Formato 2 de uso de um ligante de meprina, Pro373, mostra grande condicionalidade em comparação com o Pro295.

[0071] A Figura 47 mostra um número de construtos de sdABD-B7H3 (usando a sequência hF12), mostrando o controle positivo Pro51 usando sdABD- EGFR, o controle positivo Pro244 usando sdABD-hF12 B7H3, o construto de teste Pro226 e o controle negativo Pro296 sem um sítio de clivagem.

[0072] A Figura 48 mostra a boa condicionalidade do construto Pro226 em um ensaio TDCC.

[0073] A Figura 49 mostra a humanização de sdABDs no EpCAM humano.

[0074] A Figura 50 mostra os esquemas de vários formatos: Pro22hVIB13 e Pro205 são controles positivos, Pro199 é um construto do Formato 2 e Pro175 é o controle negativo.

[0075] A Figura 51 mostra a atividade TDCC dos construtos sdABD-EpCAM, mostrando boa condicionalidade.

[0076] Figura 52A - A Figura 53B mostra a atividade TDCC do construto sdABD-EpCAM Pro199, mostrando boa condicionalidade nos modelos de células HT29 e LoVo.

[0077] Figura 53A - A Figura 54B mostra a atividade TDCC do construto sdABD-EpCAM Pro200, mostrando boa condicionalidade nos modelos de células HT29 e LoVo.

[0078] A Figura 54 mostra um esquema de Pro255, que usa dois sdABD- TTA diferentes, um para o EGFR (sdABD-EGFR) e o outro para o EpCAM (sdABD- EpCAM), em comparação com o Pro199, com sdABDs duplos do EpCAM. Às vezes, eles são aqui referidos como construtos de "hetero-direcionamento", neste caso, um construto de Formato 2.

[0079] A Figura 55 mostra que a molécula de direcionamento duplo Pro255 com um sítio de clivagem de MMP9 mostra boa condicionalidade.

[0080] Figura 57A - A Figura 57D mostra os resultados de experiências em três tipos de células diferentes. Primeiro, os transfectantes Raji foram criados com níveis de expressão semelhantes de EpCAM, EGFR e EpCAM + EGFR (dados não mostrados). Em seguida, o Pro255, que direciona EpCAM e EGFR, foi testado em ensaios TDCC usando cada tipo de célula. Figura A mostra a linhagem Raji parental, que não expressa nenhum dos receptores. Figura B mostra condicionalidade na linhagem EpCAM. Figura C mostra condicionalidade na linhagem EGRF. Figura D mostra condicionalidade na linhagem EpCAM/EGFR.

[0081] A Figura 56 mostra os esquemas de um construto de Formato 4, Pro258.

[0082] Figura 57A - A Figura 59B mostra que o Pro258 é condicional no FBS e no soro humano. A condicionalidade do ligante MMP9 é subestimada devido à atividade MMP9 na cultura. Curiosamente, a atividade do Pro51 TDCC é inibida pela ligação do HSA, enquanto a atividade do Pro258 TDCC é semelhante ao Pro51 na presença de HSA. Finalmente, a condicionalidade do Pro258 é um pouco aprimorada na presença de HSA em 6X.

[0083] Figura 58A - A Figura 60C mostra a clivagem do substrato MMP9 por outras MMPs.

[0084] Figura 59A - A Figura 61B mostra alguns dos construtos exemplificativos e seus formatos.

[0085] Figura 60A - A Figura 62U mostra um número de sequências da invenção, embora muitas sequências adicionais também sejam encontradas na listagem de sequências. As CDRs estão sublinhadas e em negrito, os ligantes estão sublinhados duas vezes (com ligantes cliváveis em itálico e duplo sublinhado) e as separações de domínio são indicadas por "/". Todas as etiquetas His6 são opcionais, pois podem ser usadas para reduzir a imunogenicidade em seres humanos, bem como etiquetas de purificação.

VI. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A. Introdução

[0086] A presente invenção é direcionada a métodos para reduzir a toxicidade e efeitos colaterais de anticorpos biespecíficos (incluindo proteínas funcionais semelhantes a anticorpos) que se ligam a importantes alvos fisiológicos, como CD3 e antígenos tumorais. Muitas proteínas de ligação ao antígeno, como anticorpos, podem ter efeitos colaterais fora do alvo significativos e, portanto, é necessário ativar apenas as capacidades de ligação de uma molécula terapêutica na vizinhança do tecido da doença, para evitar interações fora do alvo. Por conseguinte, a presente invenção é direcionada a proteínas multivalentes condicionalmente eficazes ("MCE") que possuem vários domínios funcionais de proteína. Em geral, um desses domínios é um domínio de ligação ao antígeno (ABD) que ligará um antígeno tumoral alvo (TTA) e outro é um ABD que ligará um antígeno de célula T como CD3 sob certas condições. Além disso, as proteínas

MCE também incluem um ou mais sítios de clivagem de protease. Ou seja, as moléculas terapêuticas são produzidas em um formato semelhante a "pró-droga", em que o domínio de ligação à CD3 fica inativo até ser exposto a um ambiente de tumor. O ambiente de tumor contém proteases, de modo que, após a exposição à protease, a pró-droga é clivada e se torna ativa.

[0087] Isso geralmente é realizado aqui usando proteínas que incluem um "pseudo"domínio pesado variável e um "pseudo"domínio leve variável direcionado ao antígeno de células T, como CD3, que restringe os Fvs CD3 do MCE em um formato inativo, como é discutido aqui. Como o TTA direciona MCE na proximidade do tumor, o MCE é assim exposto à protease. Após a clivagem, o domínio pesado ativo variável e o domínio leve ativo agora são capazes de parear para formar um ou mais ABDs ativos em CD3 e, assim, recrutar células T para o tumor, resultando em tratamento.

[0088] Em geral, o domínio de ligação a CD3 ("Fv") está em um formato restrito, em que o ligante entre o domínio pesado da variável ativo e o domínio leve variável ativo que tradicionalmente formam um Fv é muito curto para permitir a ligação dos dois domínios variáveis ativos entre si; isso é chamado de "ligante restrito"; estes podem ser restritos e cliváveis (CCL, como usado no Formato 1) ou restritos e não cliváveis (CNCL, como usado no Formato 2). Pelo contrário, no formato pró-droga (por exemplo, não clivado), o polipeptídeo de pró-droga também compreende um "pseudodomínio Fv". O pseudodomínio Fv compreende um domínio pesado e leve variável, com regiões de estrutura padrão, mas CDRs "inertes" ou "inativos". O pseudodomínio Fv também possui um ligante restrito entre os domínios pesado variável inativo e leve variável inativo. Como nem os domínios Fv nem os pseudo-Fv podem se automontar devido às restrições estéricas, existe um conjunto intramolecular que emparelha a aVL com a iVH e a aVH com a iVL, devido à afinidade das regiões da estrutura de cada uma. No entanto, devido às CDRs "inertes" do pseudo domínio, os ABDs resultantes não se ligam às CD3, evitando assim as toxicidades fora do alvo. No entanto, na presença de proteases que estão dentro ou perto do tumor, o construto de pró-drogas é clivado de tal forma que o domínio pseudo-Fv é liberado da superfície e, assim, permite que os domínios leves variáveis e pesados variáveis "reais" se associem intermolecularmente (por exemplo, dois construtos clivados se juntam), desencadeando assim a ligação ativa de CD3 e a eficácia do tumor resultante. Esses construtos são geralmente referidos aqui como construtos COnditional Bispecific Redirected Activation ou “COBRAs™”. A estabilidade do conjunto intramolecular é mostrada pelas experiências de condicionalidade aqui contidas, nas quais, na ausência de protease, os construtos não clivados não têm atividade (por exemplo, nenhum domínio de ligação à CD3 ativo é formado).

[0089] Curiosamente, para facilitar a descrição, enquanto esses construtos são todos aqui referidos como "restritos", trabalhos adicionais mostram que a montagem intramolecular é favorecida mesmo que um dos domínios Fv não seja restrito, por exemplo, um dos domínios pode ter um ligante flexível mais longo. Isto é, como mostrado em A Figura , A Figura e A Figura, ainda ocorre a montagem intramolecular (por exemplo, os construtos não clivados são inativos na ausência de clivagem de protease) se apenas um dos domínios Fv, ou aquele com um VL e VH ativo, ou o pseudodomínio Fv, está restrito. No entanto, nos sistemas atuais, quando ambos os ligantes estão restritos, a proteína tem melhor expressão. No entanto, como será apreciado pelos versados na técnica, qualquer um dos construtos de Formato 1, Formato 2 ou Formato 4 deste documento pode ter um desses domínios Fv com um ligante "não restrito" ou "flexível". Para facilitar a referência, os construtos são mostrados com os dois domínios Fv em um formato restrito.

[0090] Os construtos e formatos da invenção são variações em relação às invenções descritas em WO2017/156178, aqui expressamente incorporado por referência na sua totalidade. Como mostrado em A Figura, os construtos anteriores têm a capacidade de isomerizar devido à presença de dois conjuntos de domínios VH e VL em um único polipeptídeo, formando um scFv bivalente e um diacorpo de cadeia única. Mesmo após a purificação de cada isoforma, o construto bivalente ainda pode alcançar o equilíbrio com a isoforma do diacorpo. Como o diacorpo de cadeia única tem a capacidade de se ligar à CD3 na ausência de clivagem de protease, a utilidade do construto é diminuída.

[0091] Para resolver esse problema, a presente invenção fornece quatro tipos separados de construtos para realizar essa ativação condicional. A ativação da pró-droga pode ocorrer de uma das quatro maneiras gerais, como geralmente é mostrado nas Figuras. Na Figura 1, um mecanismo de "formato 1" é mostrado. Nesta modalidade, o construto pró-droga tem dois sítios de clivagem: um entre os domínios VH e vl do Fv restrito, liberando assim os dois domínios variáveis para associação e um segundo em um sítio que libera o pseudodomínio Fv do construto de pró-droga, deixando duas moléculas que se associam devido à automontagem inata dos domínios leves variáveis e pesados variáveis, cada um tendo um domínio de ligação ao antígeno a um antígeno tumoral, permitindo assim o recrutamento de células T para o sítio do tumor.

[0092] Em uma modalidade alternativa, o construto de pró-drogas é mostrada em A Figura 2um mecanismo de "formato 2". Nesta modalidade, o ligante de domínio entre as cadeias leves ativas e pesadas variáveis ativas é um ligante restrito, mas não clivável ("CNCL"). No formato pró-droga, os VH e VL inativos do pseudodomínio Fv restrito se associam aos VH e VL do domínio Fv restrito, de modo que não há ligação à CD3. No entanto, uma vez que ocorre a clivagem no ambiente do tumor, duas proteínas ativadas diferentes, cada uma compreendendo um domínio pesado e leve variável ativo, se associam para formar dois domínios de ligação ao anti-CD3.

[0093] Além dos formatos COBRA de "proteína de cadeia única" discutidos acima, onde todos os componentes estão contidos em uma única sequência de aminoácidos, também existem construtos que se baseiam em duas proteínas "hemi-COBRAs", que agem em pares, como mostrado em A Figura 3. Nesta modalidade, cada proteína tem um domínio variável ativo e um inerte, separados por um sítio de clivagem de protease. Cada molécula contém um domínio de ligação ao TTA, de modo que, quando as moléculas são ligadas ao TTA e expostas à protease do tumor, os domínios inertes são clivados e os dois domínios variáveis ativos se automontam para formar um domínio de ligação anti-CD3.

[0094] Além disso, a invenção também fornece construtos de "formato 4", conforme ilustrado em A Figura 4. Estes são semelhantes aos projetos de "formato 2", exceto que um único ABD para um TTA é usado, de modo que, após a clivagem, duas das moléculas pró-droga agora formam um construto tetravalente e biespecífico, contendo dois domínios anti-CD3 ativos, como é descrito mais abaixo.

[0095] Por conseguinte, os formatos e construtos da invenção encontram uso no tratamento de doenças.

B. Definições

[0096] Para que o pedido possa ser mais completamente compreendido, várias definições são apresentadas abaixo. Tais definições visam abranger equivalentes gramaticais.

[0097] Por "aminoácido" e "identidade de aminoácidos", como aqui utilizado, entende-se um dos 20 aminoácidos de ocorrência natural ou quaisquer análogos não naturais que podem estar presentes em uma posição específica definida. Em muitas modalidades, "aminoácido" significa um dos 20 aminoácidos de ocorrência natural. Por "proteína" neste documento entende-se pelo menos dois aminoácidos covalentemente ligados, que incluem proteínas, polipeptídeos, oligopeptídeos e peptídeos.

[0098] Por "modificação de aminoácido", entende-se aqui uma substituição, inserção e/ou exclusão de aminoácidos em uma sequência polipeptídica ou uma alteração em uma fração quimicamente ligada a uma proteína. Por exemplo, uma modificação pode ser um carboidrato alterado ou uma estrutura de PEG ligada a uma proteína. Para maior clareza, salvo indicação em contrário, a modificação de aminoácidos é sempre um aminoácido codificado pelo DNA, por exemplo, os 20 aminoácidos que possuem códons no DNA e no RNA. A modificação de aminoácido preferida aqui é uma substituição.

[0099] Por "substituição de aminoácidos" ou "substituição" neste documento, entende-se a substituição de um aminoácido em uma posição particular em uma sequência polipeptídica parental por um aminoácido diferente. Em particular, em algumas modalidades, a substituição é por um aminoácido de ocorrência não natural na posição específica, ou que de ocorrência não natural dentro do organismo ou em qualquer organismo. Para maior clareza, uma proteína que foi projetada para alterar a sequência de codificação de ácido nucleico, mas não o aminoácido inicial (por exemplo, trocar CGG (codificando arginina) por CGA (ainda codificando arginina) para aumentar os níveis de expressão do organismo hospedeiro) não é "substituição de aminoácidos"; isto é, apesar da criação de um novo gene que codifique a mesma proteína, se a proteína tiver o mesmo aminoácido na posição específica em que começou, não será uma substituição de aminoácidos.

[00100] Por "inserção de aminoácidos" ou "inserção", como utilizado neste documento, entende-se a adição de uma sequência de aminoácidos em uma posição particular em uma sequência polipeptídica parental.

[00101] Por "deleção de aminoácidos" ou "deleção", como utilizado neste documento, entende-se a remoção de uma sequência de aminoácidos em uma posição particular em uma sequência polipeptídica parental.

[00102] Os polipeptídeos da invenção se ligam especificamente à CD3 e a antígenos tumorais alvo (TTAs), tais como receptores de células alvo, conforme descrito aqui. "Ligação específica" ou "liga-se especificamente a" ou é "específico para" um antígeno ou epítopo específico significa ligação que é mensurável diferente de uma interação não específica. A ligação específica pode ser medida, por exemplo, determinando a ligação de uma molécula em comparação com a ligação de uma molécula de controle, que geralmente é uma molécula de estrutura semelhante que não possui atividade de ligação. Por exemplo, a ligação específica pode ser determinada pela competição com uma molécula de controle que é semelhante ao alvo.

[00103] A ligação específica para um antígeno ou epítopo específico pode ser exibida, por exemplo, por um anticorpo com um KD para um antígeno ou epítopo de pelo menos cerca de 10-4 M, pelo menos cerca de 10-5 M, pelo menos cerca de 10-6 M, pelo menos cerca de 10-7 M, pelo menos cerca de 10-8 M, pelo menos cerca de 10-9 M, alternativamente pelo menos cerca de 10-10 M, pelo menos cerca de 10-11 M, pelo menos cerca de 10-12 M, ou maior, onde KD se refere a uma taxa de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno particular. Tipicamente, um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno terá um KD 20-, 50-, 100- , 500-, 1000-, 5,000-, 10.000- ou mais vezes maior para uma molécula de controle em relação ao antígeno ou epítopo.

[00104] Além disso, a ligação específica para um antígeno ou epítopo específico pode ser exibida, por exemplo, por um anticorpo com um KA ou Ka para um antígeno ou epítopo de pelo menos 20, 50, 100, 500, 1000, 5.000 -, 10.000 ou mais vezes maior para o epítopo em relação a um controle, em que KA ou Ka se refere a uma taxa de associação de uma interação anticorpo-antígeno específica. A afinidade de ligação é geralmente medida usando um ensaio Biacore ou Octeto, como é conhecido na técnica.

[00105] Por "polipeptídeo parental" ou "polipeptídeo precursor" (incluindo parentes ou precursores de Fc) como aqui utilizado, entende-se um polipeptídeo que é subsequentemente modificado para gerar uma variante. O referido polipeptídeo parental pode ser um polipeptídeo de ocorrência natural ou uma versão variante ou engenheirada de um polipeptídeo de ocorrência natural. O polipeptídeo parental pode se referir ao próprio polipeptídeo, composições que compreendem o polipeptídeo parental ou a sequência de aminoácidos que o codifica. Por conseguinte, por "polipeptídeo Fc parental" como utilizado neste documento significa um polipeptídeo Fc não modificado que é modificado para gerar uma variante e por "anticorpo parental" como utilizado neste documento significa um anticorpo não modificado que é modificado para gerar um anticorpo variante.

[00106] Por "posição", como utilizado neste documento, entende-se uma localização na sequência de uma proteína. As posições podem ser numeradas sequencialmente ou de acordo com um formato estabelecido, por exemplo, o índice da EU para numeração de anticorpos.

[00107] Por "antígeno alvo", como utilizado neste documento, entende- se a molécula que está ligada especificamente pela região variável de um determinado anticorpo. Um antígeno alvo pode ser uma proteína, carboidrato, lipídeo ou outro composto químico. Uma variedade de antígenos alvo exemplificativos adequados é aqui descrita.

[00108] Por "célula alvo", como utilizado neste documento, entende-se uma célula que expressa um antígeno alvo. Geralmente, para os fins da invenção, as células alvo são células tumorais que expressam TTAs ou células T que expressam o antígeno CD3.

[00109] Por "Fv" ou "domínio Fv" ou "região Fv", como utilizado neste documento, entende-se um polipeptídeo que compreende os domínios VL e VH de um domínio de ligação ao antígeno, geralmente a partir de um anticorpo. Os domínios Fv geralmente formam um "domínio de ligação ao antígeno" ou "ABD", conforme discutido aqui, se eles contêm domínios VH e VL ativos (embora em alguns casos, um Fv contendo um ligante restrito seja usado, de modo que um ABD ativo não seja formado antes da clivagem). Como discutido abaixo, os domínios Fv podem ser organizados de várias maneiras na presente invenção e podem ser "ativos" ou "inativos", como em um formato scFv, um formato Fv restrito, um formato pseudo Fv, etc. Deve ser entendido que na presente invenção, em alguns casos, um domínio Fv é constituído por um domínio VH e VL em uma única cadeia polipeptídica, como mostrado em A Figura 1 e A Figura 2 mas com um ligante restrito, de modo que um ABD intramolecular não possa ser formado. Nestas modalidades, é após a clivagem que dois ABDs ativos são formados. Em alguns casos, um domínio Fv é constituído por um domínio VH e VL, um dos quais é inerte, de modo que somente após a clivagem é formado um ABD intermolecular. Como discutido abaixo, os domínios Fv podem ser organizados de várias maneiras na presente invenção e podem ser "ativos" ou "inativos", como em um formato scFv, um formato Fv restrito, um formato pseudo Fv, etc. Além disso, como discutido aqui, os domínios Fv contendo VH e VL podem ser/formar ABDs, e outros ABDs que não contêm domínios VH e VL podem ser formados usando sdABDs.

[00110] Por "domínio variável" neste documento, entende-se a região de uma imunoglobulina que compreende um ou mais domínios Ig substancialmente codificados por qualquer um dos genes Vκ, Vλ e/ou VH que compõem os loci genéticos das imunoglobulinas kapa, lambda e cadeia pesada, respectivamente. Em alguns casos, um único domínio variável, como um sdFv (também aqui referido como sdABD) pode ser usado.

[00111] Nas modalidades que utilizam os domínios variável pesado (VH) e variável leve (VL), cada VH e VL são compostos por três regiões hipervariáveis ("regiões determinantes complementares", "CDRs") e quatro "regiões estruturais" ou "FRs", dispostas do terminal amino ao terminal carboxi na seguinte ordem: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Assim, o domínio VH tem a estrutura vhFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4 e o domínio VL tem a estrutura vlFR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4. Como é aqui descrito mais detalhadamente, as regiões vhFR e as regiões vlFR se montam para formar domínios Fv. Em geral, nos formatos de pró-droga da invenção, existem "domínios Fv restritos" em que os domínios VH e VL não podem se autoassociar e "pseudodomínios Fv" para os quais as CDRs não formam domínios de ligação ao antígeno quando autoassociados.

[00112] As regiões hipervariáveis conferem especificidade de ligação ao antígeno e geralmente abrangem resíduos de aminoácidos de cerca de resíduos de aminoácidos 24-34 (LCDR1; "L" denota cadeia leve), 50-56 (LCDR2) e 89-97 (LCDR3) na região variável de cadeia leve e ao redor de cerca de 31-35B (HCDR1; "H" denota cadeia pesada), 50-65 (HCDR2) e 95-102 (HCDR3) na região variável de cadeia pesada; Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) e/ou os resíduos que formam uma alça hipervariável (por exemplo, resíduos 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) e 91-96 (LCDR3) na região variável de cadeia leve e 26-32 (HCDR1), 53-55 (HCDR2) e 96-101 (HCDR3) na região variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917. CDRs específicas da invenção são descritas abaixo.

[00113] Como será apreciado pelos versados na técnica, a numeração e colocação exatas das CDRs podem ser diferentes entre os diferentes sistemas de numeração. No entanto, deve ser entendido que a divulgação de uma sequência leve varável e/ou pesada variável inclui a divulgação das CDRs (inerentes) associadas. Por conseguinte, a divulgação de cada região pesada variável é uma divulgação dos vhCDRs (por exemplo, vhCDR1, vhCDR2 e vhCDR3) e a divulgação de cada região leve variável é uma divulgação dos vlCDRs (por exemplo, vlCDR1, vlCDR2 e vlCDR3).

[00114] Uma comparação útil da numeração de CDR é como abaixo, ver Lafranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77 (2003): TABELA 1 Kabat+ IMGT Kabat AbM Chothia Contato Chothia vhCDR1 26-35 27-38 31-35 26-35 26-32 30-35 vhCDR2 50-65 56-65 50-65 50-58 52-56 47-58 vhCDR3 95-102 105-117 95-102 95-102 95-102 93-101 vlCDR1 24-34 27-38 24-34 24-34 24-34 30-36 vlCDR2 50-56 56-65 50-56 50-56 50-56 46-55 vlCDR3 89-97 105-117 89-97 89-97 89-97 89–96

[00115] Em todo o presente relatório descritivo, o sistema de numeração Kabat é geralmente usado quando se refere a um resíduo no domínio variável (aproximadamente, resíduos 1-107 da região variável de cadeia leve e resíduos 1-113 da região variável de cadeia pesada) e o sistema de numeração da EU para regiões Fc (por exemplo, Kabat et al., supra (1991)).

[00116] A presente invenção fornece um grande número de diferentes conjuntos de CDR. Nesse caso, um "conjunto completo de CDR" no contexto do componente anti-CD3 compreende as três CDRs leves variáveis e três pesadas variáveis, por exemplo, um vlCDR1, vlCDR2, vlCDR3, vhCDR1, vhCDR2 e vhCDR3. Como será apreciado pelos versados na técnica, cada conjunto de CDRs, as CDRs VH e VL, podem se ligar a antígenos, tanto individualmente quanto em conjunto. Por exemplo, em domínios Fv restritos, os vhCDRs podem se ligar, por exemplo, ao CD3 e os vlCDRs podem se ligar à CD3, mas no formato restrito eles não podem se ligar à CD3.

[00117] No contexto de um único domínio ABD ("sdABD"), como geralmente é usado aqui para se ligar aos antígenos tumorais alvo (TTA), um conjunto de CDR é de apenas três CDRs; estes são também algumas vezes referidos na técnica como domínios "VHH".

[00118] Esses CDRs podem fazer parte de um domínio leve variável ou pesado variável maior, respeitosamente. Além disso, como mais detalhadamente descrito neste documento, os domínios pesados variáveis e leves variáveis podem estar em cadeias polipeptídicas separadas ou em uma única cadeia polipeptídica no caso de sequências scFv, dependendo do formato e configuração das frações aqui descritas.

[00119] As CDRs contribuem para a formação dos sítios de ligação ao antígeno, ou mais especificamente, ao epítopo. "Epítopo" refere-se a um determinante que interage com um sítios de ligação ao antígeno específico nas regiões variáveis conhecidas como paratopo. Epítopos são agrupamentos de moléculas como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e geralmente têm características estruturais específicas, bem como características de carga específicas. Um único antígeno pode ter mais de um epítopo.

[00120] O epítopo pode compreender resíduos de aminoácidos diretamente envolvidos na ligação (também chamados de componente imunodominante do epítopo) e outros resíduos de aminoácidos, que não estão diretamente envolvidos na ligação, como resíduos de aminoácidos que são efetivamente bloqueados pelo peptídeo de ligação ao antígeno específico; por outras palavras, o resíduo de aminoácido está dentro da pegada do peptídeo de ligação ao antígeno específico.

[00121] Os epítopos podem ser conformacionais ou lineares. Um epítopo conformacional é produzido por aminoácidos espacialmente justapostos de diferentes segmentos da cadeia polipeptídica linear. Um epítopo linear é aquele produzido por resíduos de aminoácidos adjacentes em uma cadeia polipeptídica. Epítopos conformacionais e não conformacionais podem ser distinguidos pelo fato de a ligação ao primeiro, mas não o último, ser perdida na presença de solventes desnaturantes.

[00122] Um epítopo tipicamente inclui pelo menos 3, e mais geralmente, pelo menos 5 ou 8 a 10 aminoácidos em uma conformação espacial única. Anticorpos que reconhecem o mesmo epítopo podem ser verificados em um imunoensaio simples, mostrando a capacidade de um anticorpo para bloquear a ligação de outro anticorpo a um antígeno alvo, por exemplo "armazenamento". Como descrito abaixo, a invenção não inclui apenas os domínios e anticorpos de ligação ao antígeno aqui enumerados, mas também aqueles que competem pela ligação com os epítopos ligados pelos domínios de ligação ao antígeno enumerados.

[00123] Os domínios pesados variáveis e leves variáveis da invenção podem ser "ativos" ou "inativos".

[00124] Conforme usado aqui, "VH inativo" ("iVH") e "VL inativo" ("iVL") referem-se a componentes de um pseudodomínio Fv que, quando emparelhados com seus parceiros VL ou VH, respectivamente, formam um par de VH/VL resultante que não se liga especificamente ao antígeno ao qual o VH "ativo" ou VL "ativo" se ligaria se estivesse ligado a um VL ou VH análogo, que não era "inativo".

Os domínios "VH inativo" e "VL inativo" exemplificativos são formados por mutação de uma sequência VH ou VL do tipo selvagem, conforme descrito mais detalhadamente abaixo. Mutações exemplificativas estão dentro de CDR1, CDR2 ou CDR3 de VH ou VL. Uma mutação exemplificativa inclui colocar um ligante de domínio dentro da CDR2, formando assim um domínio "VH inativo" ou "VL inativo". Em contraste, um "VH ativo" ou "VL ativo" é aquele que, ao parear com seu parceiro cognato "ativo", isto é, VL ou VH, respectivamente, é capaz de se ligar especificamente ao seu antígeno alvo. Assim, deve ser entendido que um pseudo Fv pode ser um par VH/iVL, um par iVH/VL ou um par iVH/iVL.

[00125] Em contraste, como utilizado neste documento, o termo "ativo" refere-se a um domínio de ligação à CD-3 que é capaz de se ligar especificamente à CD-3. Este termo é usado em dois contextos: (a) quando se refere a um único membro de um par de ligação a Fv (isto é, VH ou VL), que é uma sequência capaz de emparelhar com seu parceiro cognato e se ligar especificamente à CD-3; e (b) o par de cognatos (isto é, VH e VL) de uma sequência capaz de se ligar especificamente à CD-3. Um par VH, VL ou VH/VL "ativo" exemplificativo é uma sequência de tipo selvagem ou parental.

[00126] "CD-x" refere-se a um agrupamento de proteína de diferenciação (CD). Em modalidades exemplificativas, CD-x é selecionado dentre as proteínas CD que têm um papel no recrutamento ou ativação de células T em um indivíduo ao qual foi administrada um construto polipeptídico da invenção. Em uma modalidade exemplificativa, CD-x é CD3, cuja sequência é mostrada em Figura 5.

[00127] O termo “domínio de ligação” caracteriza em conjunto com a presente invenção um domínio que (especificamente) se liga a/interage com/ reconhece um dado sítio de epítopo ou um dado lado alvo nas moléculas-alvo (antígenos), por exemplo: EGFR e CD-3, respectivamente. A estrutura e a função do domínio de ligação ao antígeno alvo (reconhecendo EGFR) e, de preferência também a estrutura e/ou a função do domínio de ligação ao CD-3 (reconhecendo CD3), é/são baseadas na estrutura e/ou função de um anticorpo, por exemplo, de uma molécula de imunoglobulina completa ou de comprimento total, incluindo sdABDs. De acordo com a invenção, o domínio de ligação ao antígeno alvo é geralmente caracterizado pela presença de três CDRs que se ligam ao antígeno tumoral alvo (geralmente referido na técnica como domínios pesados variáveis, embora não estejam presentes CDRs de cadeia leve correspondentes). Alternativamente, ABDs para TTAs podem incluir três CDRs de cadeia leve (ou seja, CDR1, CDR2 e CDR3 da região VL) e/ou três CDRs de cadeia pesada (ou seja, CDR1, CDR2 e CDR3 da região VH). O domínio de ligação à CD-3, de preferência, também compreende pelo menos os requisitos estruturais mínimos de um anticorpo que permitem a ligação-alvo. Com mais preferência, o domínio de ligação à CD-3 compreende pelo menos três CDRs de cadeia leve (isto é, CDR1, CDR2 e CDR3 da região VL) e/ou três CDRs de cadeia pesada (isto é, CDR1, CDR2 e CDR3 da região VH). Prevê-se que, em modalidades exemplificativas, o domínio de ligação ao antígeno alvo e/ou CD-3 seja produzido por ou obtenível por métodos de exibição de fagos ou de triagem de biblioteca.

[00128] Por "domínio", como aqui utilizado, entende-se uma sequência de proteínas com uma função, conforme descrito aqui. Os domínios da invenção incluem domínios de ligação ao antígeno alvo de tumor (domínios TTA), domínios pesados variáveis, domínios leves variáveis, domínios ligantes e domínios de extensão de meia-vida.

[00129] Por "ligante de domínio" neste documento entende-se uma sequência de aminoácidos que une dois domínios, conforme descrito aqui. Os ligantes de domínio podem ser ligantes cliváveis, ligantes cliváveis restritos, ligantes não cliváveis, ligantes não cliváveis restritos, ligantes scFv etc.

[00130] Por "ligante clivável" ("CL") neste documento entende-se uma sequência de aminoácidos que pode ser clivada por uma protease, preferencialmente uma protease humana em um tecido de doença, conforme descrito aqui. Os ligantes cliváveis geralmente têm pelo menos 3 aminoácidos de comprimento, com 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais aminoácidos que encontram uso na invenção, dependendo da flexibilidade necessária. Um número de sequências de ligantes cliváveis são encontradas em Figura 6 e Figura 5.

[00131] Por "ligante não clivável" ("NCL"), neste documento, entende- se uma sequência de aminoácidos que não pode ser clivada por uma protease humana sob condições fisiológicas normais.

[00132] Por "ligante clivável restrito" ("CCL") neste documento entende-se um polipeptídeo curto que contém um sítio de clivagem de protease (conforme definido aqui) que une dois domínios conforme descrito neste documento de tal maneira que os dois domínios não possam interagir significativamente um com o outro até depois de residirem em diferentes cadeias polipeptídicas, por exemplo, após a clivagem. Quando o CCL une um domínio VH e VL conforme definido aqui, o VH e o VL não podem se automontar para formar um Fv funcional antes da clivagem devido a construtos estéricos de maneira intramolecular (embora possam se reunir em psedodomínios Fv de maneira intermolecular). Após a clivagem pela protease relevante, o VH e o VL podem se reunir para formar um domínio de ligação ao antígeno ativo de maneira intermolecular. Em geral, os CCLs têm menos de 10 aminoácidos de comprimento, com 9, 8, 7, 6, 5 e 4 aminoácidos sendo utilizados na invenção. Em geral, os sítios de clivagem de protease geralmente têm pelo menos 4+ aminoácidos de comprimento para conferir especificidade suficiente, como é mostrado em Figura 6

[00133] Por "ligante não clivável restrito" ("CNCL") aqui se entende um polipeptídeo curto que une dois domínios, conforme descrito aqui, de maneira que os dois domínios não possam interagir significativamente um com o outro e que não é significativamente clivado por proteases humanas em condições fisiológicas.

[00134] Por "domínio Fv restrito" neste documento, entende-se um domínio Fv que compreende um domínio pesado variável ativo e um domínio leve variável ativo, ligado covalentemente a um ligante restrito, conforme descrito aqui, de tal maneira que os domínios variáveis pesados e leves ativos não possam interagir intramolecularmente para formar um Fv ativo que ligará um antígeno como o CD3. Assim, um domínio Fv restrito é semelhante a um scFv, mas não é capaz de se ligar a um antígeno devido à presença de um ligante restrito (embora eles possam montar intermolecularmente com domínios variáveis inertes para formar pseudodomínios Fv).

[00135] Por "pseudodomínio Fv", aqui se entende um domínio que compreende um pseudodomínio ou domínio inativo pesado variável ou um pseudodomínio ou domínio inativo leve variável, ou ambos, ligados usando um ligante de domínio (que pode ser clivável, restrito, não clivável, não restrito, etc.). Os domínios iVH e iVL de um pseudo domínio Fv não se ligam a um antígeno humano quando associados um ao outro (iVH/iVL) ou quando associados a um VH ou VL ativo; assim, os domínios iVH/iVL, iVH/VL e iVL/VH Fv não se ligam apreciavelmente a uma proteína humana, de modo que esses domínios são inertes no corpo humano.

[00136] Por "Fv de cadeia única" ou "scFv", aqui se entende um domínio pesado variável (VH) covalentemente ligado a um domínio leve variável (VL), geralmente usando um ligante de domínio como discutido aqui, para formar um domínio scFv ou scFv. Um domínio scFv pode estar na orientação do N a C- terminal (VH-ligante-VL ou VL-ligante-VH).

[00137] Por "Fv de domínio único", "sdFv" ou "sdABD" aqui se entende um domínio de ligação ao antígeno que possui apenas três CDRs, geralmente com base na tecnologia de anticorpos camelídeos. Ver: Protein Engineering 9(7):1129- 35 (1994); Rev Mol Biotech 74:277-302 (2001); Ann Rev Biochem 82:775-97 (2013). Conforme descrito neste documento, existem dois tipos gerais de sdABDs usados aqui: sdABDs que se ligam a TTAs e são anotados como tal (sdABD-TTA para o termo genérico, ou sdABD-EGFR para aquele que se liga ao EGFR, sdABD- FOLR1 para um que se liga ao FOLR1, etc.) e sdABDs que se ligam ao HSA ("sdABD-HSA" ou "sdABD (½)".

[00138] Por "sítio de clivagem de protease" refere-se à sequência de aminoácidos reconhecida e clivada por uma protease. Sítios de clivagem de protease adequados são descritos abaixo e mostrados em Figura 5 e. Figura 6

[00139] Como utilizado neste documento, "domínio de clivagem de protease" refere-se à sequência peptídica que incorpora o "sítio de clivagem de protease" e quaisquer ligantes entre os sítios de clivagem de protease individuais e entre os sítios de clivagem de protease e os outros componentes funcionais dos construtos da invenção (por exemplo, VH, VL, iVH, iVL, domínio(s) de ligação ao antígeno alvo, domínio de extensão de meia-vida, etc.). Como descrito aqui, um domínio de clivagem de protease também pode incluir aminoácidos adicionais, se necessário, por exemplo, para conferir flexibilidade.

[00140] O termo "COBRA ™" e "ativação redirecionada biespecífica condicional" refere-se a uma proteína condicionalmente eficaz biespecífica que possui vários domínios funcionais de proteína. Em algumas modalidades, um dos domínios funcionais é um domínio de ligação ao antígeno (ABD) que liga um antígeno tumoral alvo (TTA). Em certas modalidades, outro domínio é um ABD que se liga a um antígeno de célula T sob certas condições. O antígeno de células T inclui, mas não está limitado à CD3. O termo "hemi-COBRA ™" refere-se a uma proteína condicionalmente eficaz que pode se ligar a um antígeno de célula T quando uma cadeia pesada variável de um hemi-COBRA pode se associar a uma cadeia leve variável de outro hemi-COBRA™ (um hemi-COBRA complementar™) devido à automontagem inata quando concentrada na superfície de uma célula que expressa o alvo.

VII. Proteínas de Fusão da Invenção

[00141] As proteínas de fusão da invenção têm vários componentes diferentes, geralmente referidos aqui como domínios, que estão ligados de várias maneiras. Alguns dos domínios são domínios de ligação, cada um deles ligado a um antígeno alvo (por exemplo, um TTA ou CD3, por exemplo). Como eles se ligam a mais de um antígeno, são aqui referidos como "multiespecíficos"; por exemplo, um construto de pró-droga da invenção pode se ligar a um TTA e CD3 e, portanto, é "biespecífico". Uma proteína também pode ter especificidades mais altas; por exemplo, se o primeiro αTTA se ligar ao EGFR, o segundo ao EpCAM e houver um domínio de ligação ao anti-CD3, isso seria uma molécula "triespecífica".

Da mesma forma, a adição de um domínio de ligação anti-HSA a esse construto seria "tetrasspecífico", como mostrado em A Figura 3B.

[00142] Como será apreciado pelos versados na técnica, as proteínas da invenção podem ter diferentes valências, além de serem multiespecíficas. Ou seja, as proteínas da invenção podem se ligar a um alvo com mais de um sítio de ligação; por exemplo, Pro140 é bivalente para EGFR.

[00143] As proteínas da invenção podem incluir domínios de ligação ao antígeno CD3 dispostos de várias maneiras, conforme descrito aqui, domínios de ligação ao antígeno alvo do tumor, domínios de extensão de meia-vida, ligantes, etc.

A. Domínios de Ligação ao Antígeno CD3

[00144] A especificidade da resposta das células T é mediada pelo reconhecimento do antígeno (exibido no contexto de um grande complexo de histocompatibilidade, MHC) pelo complexo receptor de células T. Como parte do complexo receptor de células T, o CD3 é um complexo proteico que inclui uma cadeia CD3γ (gama), uma cadeia CD3δ (delta), duas cadeias CD3e (epsilon) e duas cadeias CD3ζ (zeta), presentes na célula superfície. As moléculas de CD3 se associam às cadeias α (alfa) e β (beta) do receptor de células T (TCR) para compreender o complexo TCR. O agrupamento de CD3 em células T, como por domínios Fv que se ligam a CD3, leva à ativação de células T semelhante ao envolvimento do receptor de células T, mas independente de sua especificidade clonal-típica.

[00145] No entanto, como é conhecido na técnica, a ativação de CD3 pode causar vários efeitos colaterais tóxicos e, portanto, a presente invenção é direcionada a fornecer ligação ativa à CD3 dos polipeptídeos da invenção apenas na presença de células tumorais, onde proteases específicas são encontradas, que então cliva os polipeptídeos pró-drogas da invenção para fornecer um domínio de ligação à CD3 ativo. Assim, na presente invenção, a ligação de um domínio Fv anti-CD-3 a CD-3 é regulada por um domínio de clivagem de protease que restringe a ligação do domínio Fv CD-3 à CD-3 apenas no microambiente de uma célula doente ou tecido com níveis elevados de proteases, por exemplo, em um microambiente tumoral, como aqui descrito.

[00146] Por conseguinte, a presente invenção fornece dois conjuntos de domínios VH e VL, um conjunto ativo (VH e VL) e um conjunto inativo (iVH e iVL) com todos os quatro presentes no construto pró-droga. O construto é formatado de modo que o conjunto VH e VL não possa se autoassociar, mas se associe a um parceiro inativo, por exemplo, iVH e VL e iVL e VH, como é mostrado aqui.

1. Domínios leves variáveis e pesados variáveis anti-CD3 ativos

[00147] Há um número de conjuntos de CDR ativos adequados, e/ou domínios VH e VL, que são conhecidos na técnica que encontram uso na presente invenção. Por exemplo, os domínios CDRs e/ou VH e VL são derivados de anticorpos anti-CD-3 conhecidos, como, por exemplo, muromonabe-CD-3 (OKT3), otelixizumabe (TRX4), teplizumabe (MGA031), visilizumabe (Nuvion), SP34 ou I2C, TR-66 ou X35-3, VIT3, BMA030 (BW264/56), CLB-T3/3, CRIS7, YTH12.5, F111- 409, CLB-T3.4.2, TR-66, WT32, SPv-T3b, 11D8, XIII-141, XIII-46, XIII-87, 12F6, T3/RW2-8C8, T3/RW2-4B6, OKT3D, M-T301, SMC2, F101.01, UCHT-1 e WT-31.

[00148] Em uma modalidade, as sequências VH e VL que formam um domínio Fv ativo que se liga ao CD3 humano são mostradas em Figura 5. Como é mostrado neste documento, esses domínios ativos VH ("aVH") e ativos VL ("aVL") podem ser usados em diferentes configurações e Formatos 1, 2, 3 e 4.

2. Domínios leves variáveis e pesados variáveis anti-CD3 inativos

[00149] Os domínios iVH e iVL inativos contêm regiões de estrutura "regulares" (FRs) que permitem associação, de modo que um domínio variável inativo se associe a um domínio variável ativo, renderizando o par inativo, por exemplo, incapaz de ligar o CD3.

[00150] Como será apreciado pelos versados na técnica, há vários domínios variáveis "inativos" que encontram uso na invenção. Basicamente, qualquer domínio variável com regiões estruturais humanas que permita a automontagem com outro domínio variável, não importa quais aminoácidos estejam no local CDR na região variável, pode ser usado. Para maior clareza, diz-se que os domínios inativos incluem CDRs, embora tecnicamente os domínios variáveis inativos não confiram capacidades de ligação.

[00151] Como será apreciado na técnica, é geralmente simples gerar domínios VH ou VL inativos e pode ser feito de várias maneiras. Em algumas modalidades, a geração de domínios variáveis inativos é geralmente feita alterando uma ou mais das CDRs de um Fv ativo, inclusive fazendo alterações em uma ou mais das três CDRs de um domínio variável ativo. Isso pode ser feito fazendo uma ou mais substituições de aminoácidos em resíduos funcionalmente importantes em uma ou mais CDRs, substituindo alguns ou todos os resíduos de CDR por sequências aleatórias, substituindo um ou mais CDRs por sequências de etiqueta ou sinalização e/ou trocando CDRs e/ou regiões variáveis por aquelas de um anticorpo irrelevante (um direcionado para a proteína de um organismo diferente, por exemplo.

[00152] Em alguns casos, apenas uma das CDRs em uma região variável pode ser alterada para torná-la inativa, embora outras modalidades incluam alterações em uma, duas, três, quatro, cinco, cinco ou seis CDRs.

[00153] Em alguns casos, os domínios inativos podem ser projetados para promover a ligação seletiva no formato pró-droga, para incentivar a formação de domínios intramoleculares iVH-VL e VH-iVL antes da clivagem (sobre, por exemplo, formação de pares intermoleculares). Ver, por exemplo, Igawa et al., Protein Eng. Des. A Seleção 23(8):667-677 (2010), aqui expressamente incorporada por referência na sua totalidade e especificamente para as substituições de aminoácidos de resíduos de interface.

[00154] Em certas modalidades, o domínio de ligação à CD-3 dos construtos polipeptídicos aqui descritos exibem não apenas afinidades de ligação à CD-3 potentes com CD-3 humano, mas também mostram excelente reatividade cruzada com as respectivas proteínas CD-3 de macaco cynomolgus. Em alguns casos, o domínio de ligação à CD-3 dos construtos polipeptídicos é reativo cruzado com CD-3 de macaco cynomolgus. Em certos casos, as razões KD humano:cynomolgous para CD-3 estão entre 5 e 0,2.

[00155] Em algumas modalidades, o domínio de ligação à CD-3 da proteína de ligação ao antígeno pode ser qualquer domínio que se ligue à CD-3, incluindo, mas não limitado a, domínios de um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado. Em alguns casos, é benéfico que o domínio de ligação à CD-3 seja derivado da mesma espécie em que a proteína de ligação ao antígeno será finalmente utilizada. Por exemplo, para uso em seres humanos, pode ser benéfico para o domínio de ligação à CD-3 da proteína de ligação ao antígeno compreender resíduos humanos ou humanizados do domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

[00156] Assim, em um aspecto, o domínio de ligação ao antígeno compreende um domínio de ligação humanizado ou humano. Em uma modalidade, o domínio de ligação humanizado ou humano ao anti-CD-3 compreende uma ou mais (por exemplo, todas as três) região determinante complementar 1 de cadeia leve (LC CDR1), região determinante complementar 2 de cadeia leve (LC CDR2) e região determinante complementar 3 de cadeia leve (LC CDR3) de um domínio de ligação humanizado ou anti-CD-3 humano aqui descrito e/ou uma ou mais (por exemplo, todas as três) regiões determinantes complementares 1 de cadeia pesada (HC CDR1), região determinante complementar 2 de cadeia pesada (HC CDR2) e região determinante complementar 3 de cadeia pesada (HC CDR3) de um domínio de ligação humanizado ou humano anti-CD-3 aqui descrito, por exemplo, um domínio de ligação humanizado ou humano anti-CD-3 compreendendo um ou mais, por exemplo, todas as três LC CDRs e um ou mais, por exemplo, todos os três HC CDRs.

[00157] Em algumas modalidades, o domínio de ligação humanizado ou humano ao anti-CD-3 compreende uma região variável de cadeia leve humanizada ou humana específica para CD-3, onde a região variável de cadeia leve específica para CD-3 compreende CDRs de cadeia leve humana ou não humana em uma região de estrutura de cadeia leve humana. Em certos casos, a região de estrutura de cadeia leve é uma estrutura de cadeia leve λ (lambda). Em outros casos, a região de estrutura de cadeia leve é uma estrutura de cadeia leve k (kappa).

[00158] Em algumas modalidades, um ou mais domínios de ligação à CD-3 são humanizados ou totalmente humanos. Em algumas modalidades, um ou mais domínios de ligação à CD-3 ativados têm uma ligação KD de 1000 nM ou menos à CD-3 em células que expressam CD-3. Em algumas modalidades, um ou mais domínios de ligação à CD-3 ativados têm uma ligação KD de 100 nM ou menos à CD-3 em células que expressam CD-3. Em algumas modalidades, um ou mais domínios de ligação à CD-3 ativados têm uma ligação KD de 10 nM ou menos à CD-3 em células que expressam CD-3. Em algumas modalidades, um ou mais domínios de ligação à CD-3 têm reatividade cruzada com o CD-3 de cynomolgus. Em algumas modalidades, um ou mais domínios de ligação à CD-3 compreendem uma sequência de aminoácidos aqui fornecida.

[00159] Em algumas modalidades, o domínio de ligação humanizado ou humano ao anti-CD-3 compreende uma região variável de cadeia pesada humanizada ou humana específica para CD-3, onde a região variável de cadeia pesada específica para CD-3 compreende CDRs de cadeia pesada humana ou não humana em uma região de estrutura de cadeia pesada humana.

[00160] Numa modalidade, o domínio de ligação ao anti-CD-3 é um Fv compreendendo uma cadeia leve e uma cadeia pesada de uma sequência de aminoácidos aqui fornecida. Em uma modalidade, o domínio de ligação ao anti-CD- 3 compreende: uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos uma, duas ou três modificações (por exemplo, substituições) mas não mais que 30, 20 ou 10 modificações (por exemplo,

substituições) de uma sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve aqui fornecida, ou uma sequência com 95-99% de identidade com uma sequência de aminoácidos aqui fornecida; e/ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos uma, duas ou três modificações (por exemplo, substituições), mas não mais que 30, 20 ou 10 modificações (por exemplo, substituições) de uma sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia pesada aqui fornecida, ou uma sequência com 95-99% de identidade com uma sequência de aminoácidos aqui fornecida. Em uma modalidade, o domínio de ligação humanizado ou humano ao anti-CD-3 é um scFv e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos aqui descrita, é fixada a uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos aqui descrita, através de um ligante scFv. A região variável de cadeia leve e a região variável de cadeia pesada de um scFv podem estar, por exemplo, em qualquer uma das seguintes orientações: região variável de cadeia leve - região variável de cadeia leve do ligante scFv ou região variável de cadeia pesada ou região variável de cadeia pesada - região variável de cadeia leve do ligante scFv .

[00161] Em algumas modalidades, o domínio de ligação à CD-3 de uma proteína de ligação ao antígeno tem uma afinidade com CD-3 em células que expressam CD-3 com um KD de 1000 nM ou menos, 100 nM ou menos, 50 nM ou menos, 20 nM ou menos, 10 nM ou menos, 5 nM ou menos, 1 nM ou menos ou 0,5 nM ou menos. Em algumas modalidades, o domínio de ligação à CD-3 de uma proteína de ligação ao antígeno tem uma afinidade com CD-3ε com um KD de 1000 nM ou menos, 100 nM ou menos, 50 nM ou menos, 20 nM ou menos, 10 nM ou menos, 5 nM ou menos, 1 nM ou menos ou 0,5 nM ou menos. Em outras modalidades, o domínio de ligação à CD-3 de uma proteína de ligação ao antígeno tem baixa afinidade para CD-3, isto é, cerca de 100 nM ou superior.

[00162] A afinidade para se ligar à CD-3 pode ser determinada, por exemplo, pela capacidade da própria proteína de ligação ao antígeno ou de seu domínio de ligação à CD-3 se ligar à CD-3 revestido em uma placa de ensaio; exibido em uma superfície celular microbiana; em solução; etc., como é conhecido na técnica, geralmente usando ensaios Biacore ou Octet. A atividade de ligação da própria proteína de ligação ao antígeno ou de seu domínio de ligação à CD-3 da presente divulgação à CD-3 pode ser avaliada imobilizando o ligando (por exemplo, CD-3) ou a própria proteína de ligação ao antígeno ou sua ligação a domínio CD- 3, a uma esfera, substrato, célula etc. Os agentes podem ser adicionados em um tampão apropriado e os parceiros de ligação incubados por um período de tempo a uma determinada temperatura. Após lavagens para remover o material não ligado, a proteína ligada pode ser liberada com, por exemplo, SDS, tampões com pH alto e semelhantes e analisada, por exemplo, por Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR).

[00163] Em muitas modalidades, os domínios de ligação ativos e inertes preferidos são aqueles mostrados em Figura 5.

B. Domínios de ligação ao antígeno aos antígenos alvo de tumor

[00164] Além dos domínios de extensão de CD3 e de meia-vida descritos, os construtos polipeptídicos aqui descritos também compreendem domínios-alvo que se ligam a um ou mais antígenos-alvo ou a uma ou mais regiões em um único antígeno alvo. É contemplado aqui que um construto polipeptídico da invenção é clivado, por exemplo, em um microambiente específico da doença ou no sangue de um sujeito no domínio de clivagem da protease e que cada domínio de ligação ao antígeno alvo se ligue a um antígeno alvo em um célula alvo, ativando assim o domínio de ligação à CD3 para ligar uma célula T. Em geral, os domínios de ligação ao TTA podem se ligar aos seus alvos antes da clivagem da protease, para que possam "esperar" na célula-alvo a ser ativada como ativador de células T. Pelo menos um antígeno alvo está envolvido e/ou associado a uma doença, distúrbio ou condição. Exemplos de antígenos alvo incluem aqueles associados a uma doença proliferativa, uma doença tumoral, uma doença inflamatória, um distúrbio imunológico, uma doença autoimune, uma doença infecciosa, uma doença viral, uma reação alérgica, uma reação parasitária, uma doença enxerto versus hospedeiro ou uma doença hospedeiro versus enxerto. Em algumas modalidades, um antígeno alvo é um antígeno tumoral expresso em uma célula tumoral.

Alternativamente, em algumas modalidades, um antígeno alvo está associado a um patógeno, como um vírus ou bactéria. Pelo menos um antígeno alvo também pode ser dirigido contra tecido saudável.

[00165] Em algumas modalidades, um antígeno alvo é uma molécula de superfície celular, como uma proteína, lipídeo ou polissacarídeo. Em algumas modalidades, um antígeno alvo é uma célula tumoral, célula infectada por vírus, célula infectada por bactérias, glóbulo vermelho danificado, célula de placa arterial ou célula de tecido fibrótico.

[00166] As modalidades preferidas da invenção utilizam sdABDs como domínios de direcionamento. Estes são preferidos aos scFv ABDs, uma vez que a adição de outros domínios VH e VL em um construto da invenção pode complicar a formação de pseudodomínios Fv.

[00167] Em algumas modalidades, os construtos pró-droga da invenção utilizam um único domínio de ligação ao TTA, como geralmente representado em A Figura 3A, como pares de sdABD-TTAs e, A Figura 4como uma configuração de "formato 4". A Figura 4 mostra o uso de um único anti-EGFR ABD, embora outros domínios de ligação ao TTA possam ser usados.

[00168] Em algumas modalidades, particularmente nos construtos de Formato 1 e Formato 2, os construtos pró-droga da invenção utilizam dois TTA ABDs, novamente preferencialmente no formato sdABD-TTA. Quando domínios de segmentação dupla são usados, eles podem se ligar ao mesmo epítopo do mesmo TTA. Por exemplo, como discutido aqui, muitos dos construtos aqui utilizados utilizam dois domínios de direcionamento idênticos. Em algumas modalidades, dois domínios de direcionamento podem ser usados que se ligam a diferentes epítopos do mesmo TTA, por exemplo, como mostrado em Figura 5, os dois EGFR sdABDs se ligam a diferentes epítopos no EGFR humano. Em algumas modalidades, os dois domínios de direcionamento se ligam aos TTAs diferentes, ver, por exemplo A Figura .

[00169] Os construtos polipeptídicos aqui contemplados incluem pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, em que o domínio de ligação ao antígeno se liga a pelo menos um antígeno alvo. Em algumas modalidades, os domínios de ligação ao antígeno alvo se ligam especificamente a uma molécula da superfície celular. Em algumas modalidades, os domínios de ligação ao antígeno alvo se ligam especificamente a um antígeno tumoral. Em algumas modalidades, os domínios de ligação ao antígeno alvo se ligam específica e independentemente a um antígeno alvo do tumor ("TTA") selecionado de pelo menos um de EpCAM, EGFR, HER-2, HER-3, cMet, LyPD3, B7H3, CEA e FOLR1.

[00170] De uso particular na presente invenção são os sdABDs para EGFR humano, como mostrado em Figura 5.

[00171] Modalidades adicionais de uso na invenção são sdABDs para o FOLR1 humano, como mostrado em Figura 5.

[00172] Outras modalidades de uso na invenção são sdABDs para B7H3 humano, como mostrado em Figura 5.

[00173] Modalidades adicionais de uso na invenção são sdABDs para EpCAM humano, como mostrado em Figura 5.

[00174] Em algumas modalidades, a proteína antes da clivagem do domínio de clivagem da protease é inferior a cerca de 100 kDa. Em algumas modalidades, a proteína após a clivagem do domínio de clivagem da protease é de cerca de 25 a cerca de 75 kDa. Em algumas modalidades, a proteína antes da clivagem da protease tem um tamanho que está acima do limiar renal para a depuração da primeira passagem. Em algumas modalidades, a proteína antes da clivagem de protease tem um tempo de eliminação de pelo menos cerca de 50 horas. Em algumas modalidades, a proteína antes da clivagem da protease tem um tempo de eliminação de pelo menos cerca de 100 horas. Em algumas modalidades, a proteína aumentou a penetração de tecido em comparação com uma IgG para o mesmo antígeno alvo. Em algumas modalidades, a proteína aumentou a distribuição do tecido em comparação com uma IgG para o mesmo antígeno alvo.

C. Domínios de extensão de meia-vida

[00175] As proteínas MCE da invenção (novamente, também aqui referidas como proteínas ou construtos "COBRA ™") incluem opcionalmente domínios de extensão de meia-vida. Tais domínios são contemplados para incluir, mas não estão limitados a, domínios de ligação a HSA, domínios Fc, moléculas pequenas e outros domínios de extensão de meia-vida conhecidos na técnica.

[00176] A albumina sérica humana (HSA) (massa molecular ~ 67 kDa) é a proteína mais abundante no plasma, presente em cerca de 50 mg/ml (600 uM) e tem meia-vida de cerca de 20 dias em humanos. A HSA serve para manter o pH plasmático, contribui para a pressão sanguínea coloidal, funciona como transportadora de muitos metabólitos e ácidos graxos e serve como a principal proteína transportadora de drogas no plasma.

[00177] A associação não covalente com a albumina estende a eliminação no meio tempo de proteínas de vida curta. Por exemplo, uma fusão recombinante de um domínio de ligação da albumina a um fragmento Fab resultou em uma depuração in vivo reduzida de 25 e 58 vezes e em uma extensão de meia- vida de 26 e 37 vezes quando administrada por via intravenosa em camundongos e coelhos, respectivamente em comparação com a administração do fragmento Fab sozinho. Em um outro exemplo, quando a insulina é acilada com ácidos graxos para promover a associação com a albumina, foi observado um efeito prolongado quando injetado por via subcutânea em coelhos ou porcos. Juntos, esses estudos demonstram uma ligação entre a ligação à albumina e ação prolongada.

[00178] Em um aspecto, as proteínas de ligação ao antígeno aqui descritas compreendem um domínio de extensão de meia-vida, por exemplo, um domínio que se liga especificamente ao HSA. Em outras modalidades, o domínio de ligação à HSA é um peptídeo. Em outras modalidades, o domínio de ligação ao HSA é uma molécula pequena. É contemplado que o domínio de ligação à HSA de uma proteína de ligação ao antígeno seja razoavelmente pequeno e não superior a 25 kD, não superior a 20 kD, não superior a 15 kD ou superior a 10 kD em algumas modalidades. Em certos casos, o domínio de ligação à HSA é de 5 kD ou menos se for um peptídeo ou molécula pequena.

[00179] Em muitas modalidades, o domínio de extensão de meia-vida é um domínio de ligação ao antígeno de domínio único a partir de um anticorpo de domínio único que se liga à HSA. Este domínio é geralmente referido aqui como "sdABD" para HSA humano (sdABD-HSA) ou, alternativamente, "sdABD (½)", para distinguir esses domínios de ligação dos sdABDs para TTAs. Um sdABD particularmente útil (½) é mostrado em Figura 5.

[00180] O domínio de extensão de meia-vida de uma proteína de ligação ao antígeno fornece farmacodinâmica e farmacocinética alteradas da própria proteína de ligação ao antígeno. Como acima, o domínio de extensão de meia-vida prolonga a eliminação no meio-tempo. O domínio de extensão de meia- vida também altera as propriedades farmacodinâmicas, incluindo alteração da distribuição do tecido, penetração e difusão da proteína de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o domínio de extensão de meia-vida fornece melhor direcionamento do tecido (incluindo tumor), penetração do tecido, distribuição do tecido, difusão no tecido e eficácia aprimorada em comparação com uma proteína sem um domínio de ligação de extensão de meia-vida. Em uma modalidade, os métodos terapêuticos utilizam eficaz e eficientemente uma quantidade reduzida da proteína de ligação ao antígeno, resultando em efeitos colaterais reduzidos, tais como citotoxicidade reduzida de células não tumorais.

[00181] Além disso, as características do domínio de extensão de meia-vida, por exemplo, um domínio de ligação à HSA, incluem a afinidade de ligação do domínio de ligação à HSA para HSA. A afinidade do referido domínio de ligação à HSA pode ser selecionada de modo a direcionar uma meia-vida de eliminação específica em um construto polipeptídico particular. Assim, em algumas modalidades, o domínio de ligação à HSA tem uma alta afinidade de ligação. Em outras modalidades, o domínio de ligação à HSA tem uma afinidade de ligação média. Em ainda outras modalidades, o domínio de ligação à HSA tem uma afinidade de ligação baixa ou marginal. Afinidades de ligação exemplificativas incluem concentrações de KD a 10 nM ou menos (alta), entre 10 nM e 100 nM (média) e maiores que 100 nM (baixa). Como acima, as afinidades de ligação à HSA são determinadas por métodos conhecidos, como a Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR).

D. Sítios de clivagem de protease

[00182] As composições proteicas da invenção, e particularmente os construtos de pró-droga, incluem um ou mais sítios de clivagem de protease, geralmente residentes em ligantes cliváveis, conforme descrito aqui.

[00183] Como aqui descrito, os construtos de pró-droga da invenção incluem pelo menos um sítio de clivagem de protease compreendendo uma sequência de aminoácidos que é clivada por pelo menos uma protease. Em alguns casos, as proteínas MCE descritas aqui compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais sítios de clivagem de protease que são clivados por pelo menos uma protease. Como é discutido aqui mais detalhadamente, quando mais de um sítio de clivagem de protease é usado em um construtos de pró-droga, eles podem ser os mesmos (por exemplo, vários sítios clivados por uma única protease) ou diferentes (dois ou mais sítios de clivagem são clivados em pelo menos duas proteases diferentes). Como será apreciado pelos versados na técnica, construtos contendo três ou mais sítios de clivagem de protease podem utilizar um, dois, três, etc .; por exemplo, alguns construtos podem utilizar três sítios para duas proteases diferentes, etc.

[00184] A sequência de aminoácidos do sítio de clivagem da protease dependerá da protease que é direcionada. Como é conhecido na técnica, existem várias proteases humanas que são encontradas no corpo e podem estar associadas a estados de doença.

[00185] Sabe-se que as proteases são secretadas por algumas células e tecidos doentes, por exemplo, células tumorais ou cancerígenas, criando um microambiente rico em proteases ou um microambiente rico em protease. Em alguns casos, o sangue de um sujeito é rico em proteases. Em alguns casos, as células ao redor do tumor secretam proteases no microambiente do tumor. As células que circundam as proteases secretoras de tumor incluem, entre outras, células estromais tumorais, miofibroblastos, células sanguíneas, mastócitos, células B, células NK, células T regulatórias, macrófagos, linfócitos T citotóxicos, células dendríticas, células-tronco mesenquimais, células polimorfonucleares e outras células. Em alguns casos, proteases estão presentes no sangue de um sujeito por exemplo, proteases que direcionam sequências de aminoácidos encontradas em peptídeos microbianos. Esta característica permite que a terapêutica direcionada, como proteínas de ligação ao antígeno, tenha especificidade adicional, porque as células T não serão ligadas pela proteína de ligação ao antígeno, exceto no microambiente rico em protease das células ou tecido direcionados.

[00186] As proteases são proteínas que clivam proteínas, em alguns casos, de uma maneira específica da sequência. As proteases incluem, entre outras, serina proteases, cisteína proteases, aspartato proteases, treonina proteases, ácido glutâmico, proteases, metaloproteases, asparagina peptase liases, proteases séricas, Catepsinas (por exemplo, Catepsina B, Catepsina C, Catepsina D, Catepsina E, Catepsina K, Catepsina L, CatepsinaS), Calicreína, hK1, hK10, hK15, KLK7, GranzimaB, plasmina, colagenase, colagenase Tipo IV, estromelisina, fator XA, protease do tipo quimotripsina, protease do tipo tripsina, protease do tipo da elastase, protease do tipo subtilisina, actinidaína, bromelaína, calpaína, Caspases (por exemplo, Caspase-3), Mir1-CP, papaína, protease HIV-1, protease HSV, protease CMV, quimiosina, renina, pepsina, matriptase, legumaina, plasmepsina, nepentesina, metaloexopeptidases, metaloendopeptidases, metaloproteases de matriz (MMP), MMP1, MMP2, MMP3, MMP8, MMP9, MMP13, MMP11, MMP14, meprina, ativador de plasminogênio da uroquinase (uPA), enteroquinase, antígeno específico da próstata (PSA, hK3), enzima de conversão da interleucina-1β, trombina, FAP (FAP-α), dipeptidil-peptidase, e dipeptidil- peptidase IV (DPPIV/CD26).

[00187] Algumas proteases e sequências de clivagem de proteases são mostradas em Figura 5 e. Figura 6 E. Ligantes

[00188] Como é discutido aqui, os diferentes domínios da invenção são geralmente ligados entre si usando ligantes de aminoácidos, que também podem conferir funcionalidade, incluindo flexibilidade ou inflexibilidade (por exemplo, restrição estérica), bem como a capacidade de ser clivada usando uma protease in situ . Esses ligantes podem ser classificados de várias maneiras.

[00189] A invenção fornece "ligantes de domínio", que são usados para unir dois ou mais domínios (por exemplo, um VH e um VL, um domínio de ligação ao antígeno tumoral alvo (TTABD, às vezes também aqui referido como "αTTA" (para "anti-TTA" ) a um VH ou VL, um domínio de extensão de meia-vida para outro componente etc. Os ligantes de domínio podem ser não cliváveis (NCL), cliváveis (“CL”), restritos e cliváveis (CCL) e restritos e não cliváveis (CNCL), por exemplo.

1. Ligantes não cliváveis

[00190] Em algumas modalidades, o ligante de domínio é não clivável. Geralmente, esses podem ser de dois tipos: não cliváveis e flexíveis, permitindo que os componentes “a montante” e “a jusante” do ligante nos construtos se automontem intramolecularmente de determinadas maneiras; ou não clivável e restrito, onde os dois componentes separados pelo ligante não são capazes de se automontar intramolecularmente. Deve-se notar, no entanto, que no último caso, enquanto os dois domínios componentes que são separados pelo ligante restrito não clivável não se automontam intramolecularmente, outros componentes intramoleculares se automontam para formar os pseudodomínios Fv.

(i) Ligantes não cliváveis, mas flexíveis

[00191] Nesta modalidade, o ligante é usado para unir domínios para preservar a funcionalidade dos domínios, geralmente através de domínios mais longos e flexíveis que não são clivados por proteases in situ em um paciente.

Exemplos de ligantes internos não cliváveis adequados para ligar os domínios nos polipeptídeos da invenção incluem, mas não estão limitados a, (GS)n, (GGS)n, (GGGS)n, (GGSG)n, (GGSGG)n, ou (GGGGS)n, em que n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10. Em algumas modalidades, o comprimento do ligante pode ser de cerca de 15 aminoácidos.

(ii) Ligantes não cliváveis e restritos

[00192] Em alguns casos, os ligantes não contêm um sítio de clivagem e também são muito curtos para permitir que os domínios de proteína separados pelo ligante se automontem intramolecularmente e são "ligantes não cliváveis restritos" ou "CNCLs". Por exemplo, no Pro186, um VH ativo e um VL ativo são separados por 8 aminoácidos (um "8mer") que não permitem que o VH e o VL se automontem em um domínio de ligação ao antígeno ativo. Em algumas modalidades, o ligante ainda é flexível; por exemplo, (GGGS) n em que n = 2. Em outras modalidades, embora geralmente menos preferidos, podem ser usados ligantes mais rígidos, como aqueles que incluem prolina ou aminoácidos volumosos.

2. Ligantes cliváveis

[00193] Todos os construtos de pró-drogas aqui incluídos incluem pelo menos um ligante clivável. Assim, em uma modalidade, o ligante de domínio é clivável (CL), às vezes referido aqui como um "domínio de clivagem de protease" ("PCD"). Nesta modalidade, o CL contém um sítio de clivagem de protease, conforme descrito aqui e como descrito em Figura 5 e. Figura 6 Em alguns casos, o CL contém apenas o sítio de clivagem da protease. Opcionalmente, dependendo do comprimento do local de reconhecimento da clivagem, pode haver alguns aminoácidos de ligação extras em um ou em ambas as extremidades N ou C- terminais do CL; por exemplo, pode haver de 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos em um ou em ambos os N e C-terminais do sítio de clivagem. Assim, ligantes cliváveis também podem ser restritos (por exemplo, 8mers) ou flexíveis.

[00194] De particular interesse na presente invenção são os ligantes cliváveis MMP9 e ligantes cliváveis Meprina, particularmente ligantes cliváveis restritos a MMP9 e ligantes cliváveis restritos a Meprina.

VIII. Domínios da invenção

[00195] A presente invenção fornece vários formatos diferentes para os polipeptídeos pró-drogas da invenção. A presente invenção fornece domínios Fv restritos e pseudodomínios Fv restritos. Além disso, a presente invenção fornece proteínas multivalentes condicionalmente eficazes ("MCE") que contêm dois domínios Fv, mas são construtos não isomerizantes. Como delineado aqui, estes podem ser formatos cliváveis não isomerizantes ou formatos não cliváveis não isomerizantes, embora cada construto contenha pelo menos um domínio de clivagem de protease.

[00196] É importante ressaltar que, embora esses dois domínios (domínios Fv e pseudodomínios Fv) sejam referidos aqui como "restritos", o que significa que, conforme discutido acima e mostrado em A Figura , A Figura e A Figura, apenas um deles precisa ser restrito, embora geralmente quando ambos os ligantes são restritos, a proteína tem melhor expressão.

[00197] Os versados na técnica compreenderão que, para os Formatos 1, 2 e 4, há quatro possibilidades para a ordem N-C-terminal dos domínios restritos e pseudo-Fv da invenção (não mostrando os ligantes): aVH-aVL and iVL-iVH, aVH- aVL and iVH-iVL, aVL-aVH and iVL-iVH, aVL-aVH e iVH-iVL. Todos os quatro foram testados e todos os quatro têm atividade, embora a primeira ordem, aVH- aVL e iVL-iVH, mostre melhor expressão do que os outros três. Assim, embora a descrição aqui contida seja geralmente mostrada neste formato aVH-aVL e iVL- iVH, toda a divulgação aqui contida inclui outras ordens para esses domínios.

[00198] Observe que, geralmente, a ordem do N ao C-terminal para os construtos de comprimento total da invenção é baseada na orientação aVH-aVL e iVL-iVH.

[00199] Além disso, é conhecido na técnica que pode haver imunogenicidade em humanos originários das sequências C-terminais de certos ABDs. Por conseguinte, em geral, particularmente quando o C-terminal dos construtos termina em um sdABD (por exemplo, os domínios sdABD-HSA de muitos dos construtos, uma etiqueta de histidina (His6 ou His10) podem ser usados. Muitas ou a maioria das sequências aqui contidas foram geradas usando etiquetas terminais His6 C por razões de purificação, mas essas sequências também podem ser usadas para reduzir a imunogenicidade em seres humanos, como é mostrado por Holland et al., DOI 10.1007/s10875-013-9915-0 e WO2013/024059.

A. Domínios Fv restritos

[00200] A presente invenção fornece domínios Fv restritos, que compreendem um domínio VH ativo e um VL ativo que são conectados covalentemente usando um ligante restrito (que, conforme descrito aqui, pode ser clivável (Formatos 1 e 3) ou não clivável (Formatos 2 e 4)). O ligante restrito evita a associação intramolecular entre aVH e aVL na ausência de clivagem. Assim, um domínio Fv geral restrito compreende um conjunto de seis CDRs contidos em domínios variáveis, em que os vhCDR1, vhCDR2 e vhCDR3 do VH ligam a CD-3 humana e os vlCDR1, vCDR2 e vlCDR3 do VL ligam a CD-3 humana, mas no formato pró-droga (por exemplo, não clivado), o VH e o VL são incapazes de associar-se estericamente para formar um domínio de ligação ativo, preferindo, em vez de emparelhar intramolecularmente com o pseudo Fv.

[00201] Os domínios Fv restritos podem compreender VH ativo e VL ativo (aVH e aVL) ou VH e VL inativo (iVH e iVL, caso em que é um pseudodomínio Fv restrito) ou combinações dos mesmos, como aqui descrito.

[00202] Como será apreciado pelos versados na técnica, a ordem do VH e VL em um domínio Fv restrito pode ser VH-ligante-VL (N a C-terminal) ou VL- ligante-VH.

[00203] Como descrito aqui, para construtos no Formato 1, os domínios Fv restritos podem compreender um VH e um VL ligados usando um ligante clivável,

em casos como os mostrados em Figura 5 e. Figura 6 Nesta modalidade, o domínio Fv restrito possui a estrutura (N a C-terminal) vhFR1- vhCDR1-vhFR2- vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4-CCL-vlFR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3- vlCDR3-vlFR4. Em geral, o domínio Fv restrito contém domínios VH e VL ativos (por exemplo, capazes de se ligar à CD3 quando associado) e, portanto, possui a estrutura (N a C-terminal) vhFR1-avhCDR1-vhFR2-avhCDR2-vhFR3-avhCDR3- vhFR4-CCL-vlFR1-avlCDR1-vlFR2-avlCDR2-vlFR3-avlCDR3-vlFR4.

[00204] Como descrito aqui, para construtos no Formato 2, os domínios Fv restritos podem compreender um VH e um VL ligados usando um ligante não clivável. Nesta modalidade, o domínio Fv restrito possui a estrutura (N a C-terminal) vhFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4-CNCL-vlFR1-vlCDR1- vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4. Em geral, o domínio Fv restrito contém domínios VH e VL ativos (por exemplo, capazes de se ligar à CD3 quando associado) e, portanto, possui a estrutura (N a C-terminal) vhFR1-avhCDR1- vhFR2-avhCDR2-vhFR3-avhCDR3-vhFR4-CNCL-vlFR1-avlCDR1-vlFR2- avlCDR2-vlFR3-avlCDR3-vlFR4.

[00205] De uso particular na presente invenção são domínios Fv não cliváveis limitados com um aVH com SEQ ID NO: 61, um aVL com SEQ ID NO: 49 e um ligante de domínio com SEQ ID NO: 74.

B. Pseudodomínios Fv restritos

[00206] A presente invenção fornece pseudodomínios Fv, compreendendo domínios inativos ou pseudo-iVH e iVL que são covalentemente ligados usando um ligante restrito (que, como descrito aqui, pode ser clivável ou não clivável). O ligante restrito evita a associação intramolecular entre iVH e iVL na ausência de clivagem. Assim, um pseudo domínio Fv geral restrito compreende um iVH e um iVL com regiões estruturais que permitem a associação (quando em um formato não restrito) do iVH e iVL, embora o pseudodomínio Fv resultante não se ligue a uma proteína humana. Os domínios iVH podem ser montados com domínios aVL e os domínios iVL podem ser montados com domínios aVH, embora as estruturas resultantes não se liguem à CD3.

[00207] Os pseudodomínios Fv restritos compreendem VH e VL inativos (iVH e iVL).

[00208] Como será apreciado pelos versados na técnica, a ordem do VH e VL em um pseudodomínio Fv restrito pode ser VH-ligante-VL (N a C-terminal) ou VL-ligante-VH.

[00209] Como descrito aqui, os pseudodomínios Fv restritos podem compreender um iVH e um iVL ligados usando um ligante não clivável, como mostrado nos Formatos 1, 2 e 4, ou com ligantes cliváveis, como mostrado no Formato 3.

[00210] Em geral, o domínio Fv restrito contém domínios VH e VL inertes (por exemplo, capazes de se ligar à CD3 quando associado) e, portanto, possui a estrutura (N a C-terminal) vhFR1-ivlCDR1-vhFR2-ivlCDR2-vhFR3- ivlCDR3-vhFR4-CNCL-vlFR1-ivhCDR1-vlFR2-ivhCDR2-vlFR3-ivhCDR3-vlFR4.

[00211] De uso particular na presente invenção são os pseudodomínios Fv não cliváveis restritos com um iVH com SEQ ID NO: 65 ou SEQ ID NO: 69, um iVL com SEQ ID NO: 53 ou SEQ ID NO: 57 e um ligante de domínio tendo a SEQ ID NO: 74.

IX. Formatos da Invenção Como discutido aqui, os construtos pró-droga da invenção podem assumir vários formatos diferentes, incluindo formatos cliváveis com domínios de ligação ao TTA duplos, formatos não cliváveis com domínios de ligação ao TTA duplos (um dos quais pode ter os mesmos domínios de ligação ao TTA ou domínios de ligação diferentes) e formatos não cliváveis com um único domínio de direcionamento.

A. Formatos cliváveis com direcionamento duplo

[00212] A invenção fornece formatos cliváveis não isomerizantes do tipo "formato 1" em A Figura 1. Nesta modalidade, o domínio Fv restrito compreende domínios VH e VL que são ligados usando ligantes cliváveis restritos e o pseudodomínio Fv restrito usa ligantes não cliváveis restritos. Para facilitar a discussão, ambos são aqui referidos como "restritos", mas como discutido acima e mostrado em A Figura , A Figura e A Figura, apenas um deles precisa ser restrito, embora geralmente, quando ambos os ligantes são restritos, a proteína tem melhor expressão.

[00213] Todas os construtos no Formato 1 (assim como os outros formatos) também têm um ligante clivável (CL) que é clivado por uma protease de tumor humano.

[00214] A invenção fornece proteínas pró-drogas, compreendendo, de N a C-terminal, (sdABD-TTA1)-ligante de domínio-domínio Fv restrito-ligante de domínio-(sdABD-TTA2)-CL-pseudodomínio Fv restrito-ligante de domínio-sdABD- HSA.

[00215] Como será apreciado pelos versados na técnica, a ordem do VH e VL em um domínio Fv restrito ou um pseudodomínio Fv restrito pode ser VH- ligante-VL (N a C-terminal) ou VL-ligante-VH.

[00216] Assim, em uma modalidade, a proteína pró-droga compreende, de N a C-terminal: (sdABD-TTA1)-ligante de domínio-aVH-CCL-aVL- ligante de domínio-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ligante de domínio-sdABD- HSA.

[00217] Assim, em uma modalidade, a proteína pró-droga compreende, de N a C-terminal: (sdABD-TTA1)-ligante de domínio-aVH-CCL-aVL- ligante de domínio-(sdABD-TTA2)-CL-iVH-CCL-iVL-ligante de domínio-sdABD- HSA.

[00218] Assim, em uma modalidade, a proteína pró-droga compreende, de N a C-terminal: (sdABD-TTA1)-ligante de domínio-aVL-CCL-aVH- ligante de domínio-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CCL-iVH-ligante de domínio-sdABD- HSA.

[00219] Assim, em uma modalidade, a proteína pró-droga compreende, de N a C-terminal: (sdABD-TTA1)-ligante de domínio-aVL-CCL-aVH- ligante de domínio-(sdABD-TTA2)-CL-iVH-CCL-iVL-ligante de domínio-sdABD- HSA.

[00220] Em algumas modalidades, o construto de pró-droga compreende sdABD(TTA1)-ligante de domínio-aVH-CCL-aVL-ligante de domínio- sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-NCL-sdABD(½). Nesta modalidade, aVH, aVL, iVH e iVL têm as sequências mostradas em Figura 5.

[00221] Em algumas modalidades, o construto de pró-droga compreende sdABD(TTA1)-ligante de domínio-aVH-CCL-aVL-ligante de domínio- sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ligante de domínio-sdABD(½). Nesta modalidade, aVH, aVL, iVH, iVL têm as sequências mostradas em Figura 5. Nesta modalidade, os dois domínios de direcionamento se ligam ao mesmo TTA, que pode ser EGFR, EpCAM, FOLR1 ou B7H3, cujas sequências estão representadas Figura 5.

[00222] Em algumas modalidades, o construto de pró-droga compreende sdABD(TTA1)-ligante de domínio-aVH-CCL-aVL-ligante de domínio- sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ligante de domínio-sdABD(½). Nesta modalidade, aVH, aVL, iVH, iVL têm as sequências mostradas em Figura 5. Nesta modalidade, os dois domínios de direcionamento se ligam a diferentes TTAs.

[00223] Em algumas modalidades, o construto de pró-droga compreende sdABD(TTA1)-ligante de domínio-aVH-CCL-aVL-ligante de domínio- sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ligante de domínio-sdABD(½). Nesta modalidade, aVH, aVL, iVH, iVL têm as sequências mostradas em Figura 5. Nesta modalidade, os dois domínios de direcionamento se ligam ao EGFR e EpCAM, e os sdABD-TTAs têm as sequências na Figura 5.

[00224] Em algumas modalidades, o construto de pró-droga compreende sdABD(TTA1)-ligante de domínio-aVH-CCL-aVL-ligante de domínio- sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ligante de domínio-sdABD(½). Nesta modalidade, aVH, aVL, iVH, iVL têm as sequências mostradas em Figura 5. Nesta modalidade, os dois domínios de direcionamento se ligam ao EGFR e FOLR1, e os sdABD-TTAs têm as sequências na Figura 5.

[00225] Em algumas modalidades, o construto de pró-droga compreende sdABD(TTA1)-ligante de domínio-aVH-CCL-aVL-ligante de domínio- sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ligante de domínio-sdABD(½). Nesta modalidade, aVH, aVL, iVH, iVL têm as sequências mostradas em Figura 5. Nesta modalidade, os dois domínios de direcionamento se ligam ao EGFR e B7H3, e os sdABD-TTAs têm as sequências na Figura 5.

[00226] Em algumas modalidades, o construto de pró-droga compreende sdABD(TTA1)-ligante de domínio-aVH-CCL-aVL-ligante de domínio- sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ligante de domínio-sdABD(½). Nesta modalidade, aVH, aVL, iVH, iVL têm as sequências mostradas em Figura 5. Nesta modalidade, os dois domínios de direcionamento se ligam ao EpCAM e FOLR1, e os sdABD-TTAs têm as sequências na Figura 5.

[00227] Em algumas modalidades, o construto de pró-droga compreende sdABD(TTA1)-ligante de domínio-aVH-CCL-aVL-ligante de domínio- sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ligante de domínio-sdABD(½). Nesta modalidade, aVH, aVL, iVH, iVL têm as sequências mostradas em Figura 5. Nesta modalidade, os dois domínios de direcionamento se ligam ao EpCAM e B7H3, e os sdABD-TTAs têm as sequências na Figura 5.

[00228] Em algumas modalidades, o construto de pró-droga compreende sdABD(TTA1)-ligante de domínio-aVH-CCL-aVL-ligante de domínio- sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ligante de domínio-sdABD(½). Nesta modalidade, aVH, aVL, iVH, iVL têm as sequências mostradas em Figura 5. Nesta modalidade, os dois domínios de direcionamento se ligam ao B7H3 e FOLR1, e os sdABD-TTAs têm as sequências na Figura 5.

[00229] Em algumas modalidades, o construto de pró-droga compreende sdABD(TTA1)-ligante de domínio-aVH-CCL-aVL-ligante de domínio-

sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ligante de domínio-sdABD(½). Nesta modalidade, aVH, aVL, iVH, iVL têm as sequências mostradas em Figura 5. Nesta modalidade, os dois domínios de direcionamento se ligam ao mesmo TTA, que pode ser EGFR, FOLR1, B7H3 ou EpCAM, cujas sequências são representadas em Figura 5, e o CCL e o CL são selecionados de um ligante que é clivado por MMP9 ou meprina e o sdABD(½) possui a SEQ ID NO: 45.

[00230] No formato 1, um ligante de domínio preferido é a SEQ ID NO: 74 (que também serve como um ligante não clivável restrito preferido).

[00231] No formato 1, os construtos preferidos são Pro140 e Pro140b.

B. Formatos não cliváveis

[00232] Como mostrado em A Figura 2, a invenção fornece formatos não isomerizantes e não cliváveis. Nesta modalidade, entende-se que o "não clivável" se aplica apenas à ligação do domínio Fv restrito, pois existe o sítio de clivagem de ativação no construto pró-droga. Nesta modalidade, o domínio Fv restrito compreende domínios VH e VL que são ligados usando ligantes não cliváveis restritos e o pseudodomínio Fv restrito usa ligantes não cliváveis restritos.

[00233] Como será apreciado pelos versados na técnica, a ordem do VH e VL em um domínio Fv restrito ou um pseudodomínio Fv restrito pode ser VH- ligante-VL (N a C-terminal) ou VL-ligante-VH.

[00234] A invenção fornece proteínas pró-drogas, compreendendo, de N a C-terminal, sdABD(TTA1)-ligante de domínio-domínio Fv restrito-ligante de domínio-sdABD-(TTA2)-ligante clivável-pseudodomínio Fv restrito-ligante de domínio-sdABD-HSA.

[00235] Como será apreciado pelos versados na técnica, a ordem do VH e VL em um domínio Fv restrito ou um pseudodomínio Fv restrito pode ser VH- ligante-VL (N a C-terminal) ou VL-ligante-VH.

[00236] Assim, em uma modalidade, a proteína pró-droga compreende, de N a C-terminal: (sdABD-TTA1)-ligante de domínio-aVH-CNCL- aVL-ligante de domínio-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ligante de domínio- sdABD-HSA.

[00237] Assim, em uma modalidade, a proteína pró-droga compreende, de N a C-terminal: (sdABD-TTA1)-ligante de domínio-aVH-CNCL- aVL-ligante de domínio-(sdABD-TTA2)-CL-iVH-CNCL-iVL-ligante de domínio- sdABD-HSA.

[00238] Assim, em uma modalidade, a proteína pró-droga compreende, de N a C-terminal: (sdABD-TTA1)-ligante de domínio-aVL-CNCL- aVH-ligante de domínio-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CCL-iVH-ligante de domínio- sdABD-HSA.

[00239] Assim, em uma modalidade, a proteína pró-droga compreende, de N a C-terminal: (sdABD-TTA1)-ligante de domínio-aVL-CNCL- aVH-ligante de domínio-(sdABD-TTA2)-CL-iVH-CNCL-iVL-ligante de domínio- sdABD-HSA.

[00240] Em algumas modalidades, a proteína pró-droga compreende, de N a C-terminal: (sdABD-TTA1)-ligante de domínio-aVH-CNCL-aVL-ligante de domínio-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ligante de domínio-sdABD-HSA. Nesta modalidade, aVH, aVL, iVH, iVL têm as sequências mostradas em Figura 5. Nesta modalidade, os dois domínios de direcionamento se ligam ao mesmo TTA, que pode ser EGFR, EpCAM, FOLR1 ou B7H3, cujas sequências estão representadas Figura 5.

[00241] Em algumas modalidades, a proteína pró-droga compreende, de N a C-terminal: (sdABD-TTA1)-ligante de domínio-aVH-CNCL-aVL-ligante de domínio-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ligante de domínio-sdABD-HSA. Nesta modalidade, aVH, aVL, iVH, iVL têm as sequências mostradas em Figura 5. Nesta modalidade, os dois domínios de direcionamento se ligam a diferentes TTAs.

[00242] Em algumas modalidades, a proteína pró-droga compreende, de N a C-terminal: (sdABD-TTA1)-ligante de domínio-aVH-CNCL-aVL-ligante de domínio-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ligante de domínio-sdABD-HSA. Nesta modalidade, aVH, aVL, iVH, iVL têm as sequências mostradas em Figura 5. Nesta modalidade, os dois domínios de direcionamento se ligam ao EGFR e EpCAM, e os sdABD-TTAs têm as sequências na Figura 5.

[00243] Em algumas modalidades, a proteína pró-droga compreende, de N a C-terminal: (sdABD-TTA1)-ligante de domínio-aVH-CNCL-aVL-ligante de domínio-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ligante de domínio-sdABD-HSA. Nesta modalidade, aVH, aVL, iVH, iVL têm as sequências mostradas em Figura 5. Nesta modalidade, os dois domínios de direcionamento se ligam ao EGFR e FOLR1, e os sdABD-TTAs têm as sequências na Figura 5.

[00244] Em algumas modalidades, a proteína pró-droga compreende, de N a C-terminal: (sdABD-TTA1)-ligante de domínio-aVH-CNCL-aVL-ligante de domínio-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ligante de domínio-sdABD-HSA. Nesta modalidade, aVH, aVL, iVH, iVL têm as sequências mostradas em Figura 5. Nesta modalidade, os dois domínios de direcionamento se ligam ao EGFR e B7H3, e os sdABD-TTAs têm as sequências na Figura 5.

[00245] Em algumas modalidades, a proteína pró-droga compreende, de N a C-terminal: (sdABD-TTA1)-ligante de domínio-aVH-CNCL-aVL-ligante de domínio-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ligante de domínio-sdABD-HSA. Nesta modalidade, aVH, aVL, iVH, iVL têm as sequências mostradas em Figura 5. Nesta modalidade, os dois domínios de direcionamento se ligam ao EpCAM e FOLR1, e os sdABD-TTAs têm as sequências na Figura 5.

[00246] Em algumas modalidades, a proteína pró-droga compreende, de N a C-terminal: (sdABD-TTA1)-ligante de domínio-aVH-CNCL-aVL-ligante de domínio-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ligante de domínio-sdABD-HSA. Nesta modalidade, aVH, aVL, iVH, iVL têm as sequências mostradas em Figura 5. Nesta modalidade, os dois domínios de direcionamento se ligam ao EpCAM e B7H3, e os sdABD-TTAs têm as sequências na Figura 5.

[00247] Em algumas modalidades, a proteína pró-droga compreende, de N a C-terminal: (sdABD-TTA1)-ligante de domínio-aVH-CNCL-aVL-ligante de domínio-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ligante de domínio-sdABD-HSA. Nesta modalidade, aVH, aVL, iVH, iVL têm as sequências mostradas em Figura 5. Nesta modalidade, os dois domínios de direcionamento se ligam ao FOLR1 e B7H3, e os sdABD-TTAs têm as sequências na Figura 5.

[00248] Em algumas modalidades, a proteína pró-droga compreende, de N a C-terminal: (sdABD-TTA1)-ligante de domínio-aVH-CNCL-aVL-ligante de domínio-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-ligante de domínio-sdABD-HSA. Nesta modalidade, aVH, aVL, iVH, iVL têm as sequências mostradas em Figura 5. Nesta modalidade, os dois domínios de direcionamento se ligam ao mesmo TTA, que pode ser EGFR, FOLR1, B7H3 ou EpCAM, cujas sequências são representadas em Figura 5, e o CCL e o CL são selecionados de um ligante que é clivado por MMP9 ou meprina e o sdABD(½) possui a SEQ ID NO: 45.

[00249] No formato 2, um ligante de domínio preferido é a SEQ ID NO: 74 (que também serve como um ligante não clivável restrito preferido).

[00250] No Formato 2, modalidades de uso particular incluem, mas não estão limitadas a, Pro186, Pro225, Pro226, Pro233, Pro311, Pro312, Pro313, Pro495, Pro246, Pro254, Pro255, Pro256, Pro420, Pro421, Pro432, Pro479, Pro480, Pro187, Pro221, Pro222, Pro223, Pro224, Pro393, Pro394, Pro395, Pro396, Pro429, Pro430 e Pro431.

C. Construtos TTA únicos

[00251] Como é mostrado em A Figura 4, os construtos de "formato 4" também estão incluídos nas composições da invenção, que são semelhantes aos construtos de Formato 2, mas sem um segundo TTA ABD. Nesta modalidade, entende-se que o "não clivável" se aplica apenas à ligação do domínio Fv restrito, pois existe o sítio de clivagem de ativação no construto pró-droga. Nesta modalidade, o domínio Fv restrito compreende domínios VH e VL que são ligados usando ligantes não cliváveis restritos e o pseudodomínio Fv restrito usa ligantes não cliváveis restritos.

[00252] Como será apreciado pelos versados na técnica, a ordem do VH e VL em um domínio Fv restrito ou um pseudodomínio Fv restrito pode ser VH- ligante-VL (N a C-terminal) ou VL-ligante-VH.

[00253] A invenção fornece proteínas pró-drogas, compreendendo, de N a C-terminal, do sdABD(TTA)-ligante de domínio-domínio Fv restrito-ligante clivável- sdABD-HSA-pseudodomínio Fc restrito. (Observe que, para todas os construtos desse formato, o sdABD-HSA geralmente não possui uma etiqueta His6, embora possa ser incluída).

[00254] Como será apreciado pelos versados na técnica, a ordem do VH e VL em um domínio Fv restrito ou um pseudodomínio Fv restrito pode ser VH- ligante-VL (N a C-terminal) ou VL-ligante-VH.

[00255] Assim, em uma modalidade, a proteína pró-droga compreende, de N a C-terminal: (sdABD-TTA)-ligante de domínio-aVH-CNCL-aVL- CL-(sdABD-HSA)-ligante de domínio-iVL-CNCL-iVH.

[00256] Assim, em uma modalidade, a proteína pró-droga compreende, de N a C-terminal: (sdABD-TTA)-ligante de domínio-aVH-CNCL-aVL- CL-(sdABD-HSA)-ligante de domínio-iVH-CNCL-iVL.

[00257] Assim, em uma modalidade, a proteína pró-droga compreende, de N a C-terminal: (sdABD-TTA)-ligante de domínio-aVL-CNCL-aVH- CL-(sdABD-HSA)-ligante de domínio-iVH-CNCL-iVL.

[00258] Assim, em uma modalidade, a proteína pró-droga compreende, de N a C-terminal: (sdABD-TTA)-ligante de domínio-aVL-CNCL-aVH- CL-(sdABD-HSA)-ligante de domínio-iVL-CNCL-iVH.

[00259] Assim, em uma modalidade, a proteína pró-droga compreende, de N a C-terminal: (sdABD-TTA)-ligante de domínio-aVH-CNCL-aVL-

CL-(sdABD-HSA)-ligante de domínio-iVL-CNCL-iVH. Nesta modalidade, aVH, aVL, iVH, iVL têm as sequências mostradas em Figura 5. Nesta modalidade, o domínio de direcionamento se liga a um TTA, que pode ser EGFR, EpCAM, FOLR1 ou B7H3, cujas sequências estão representadas Figura 5.

[00260] No Formato 4, um ligante de domínio preferido é a SEQ ID NO: 74 (que também serve como um ligante não clivável restrito preferido).

[00261] No Formato 4, um sdABD-HSA preferido é o da SEQ ID NO:

45.

D. Duas composições de proteínas

[00262] Em algumas modalidades, as composições da invenção compreendem duas moléculas diferentes, às vezes chamadas de "hemi-COBRAs ™", ou "hemi-construtos", que na ausência de clivagem, se associam intramolecularmente para formar pseudo-Fvs. Na presença da protease, os sítios de clivagem são clivados, liberando os domínios variáveis inertes, e o par de proteínas forma um domínio de ligação ao antígeno ativo para CD3, como geralmente descrito em A Figura 3.

[00263] O que é importante no projeto dos hemi-construtos é que o domínio variável ativo e o sdABD-TTA permaneçam juntos após a clivagem, de modo que as duas porções clivadas sejam mantidas juntas pelo receptor de antígeno do tumor na superfície do tumor e, então, possam formar um domínio de ligação anti-CD3 ativo.

[00264] Existem dois construtos gerais de Formato 3 diferentes, aqueles em que cada membro do par possui um único sdABD-TTA (A Figura 3A) e aqueles com dois sdABD-TTAs diferentes, cada um com um TTA diferente (A Figura 3B).

1. Construtos Hemi-COBRA™ com domínios de ligação TTA únicos (formato 3A)

[00265] Em algumas modalidades, o primeiro hemi-COBRA™ possui, de N a C-terminal, sdABD(TTA1)-ligante de domínio-aVH-CL-iVL-ligante de domínio- sdABD(½) e o segundo tem sdABD(½)-ligante de domínio-iVH-CL-aVL- ligante de domínio-sdABD(TTA2). Nesta modalidade, o aVH, aVL, iVH, iVL e sdABD (½) têm as sequências mostradas em Figura 5, e o sdABD-TTAa se liga ao EGFR humano, EpCAM, FOLR1 e/ou B7H3, e tem uma sequência representada em Figura 5.

2. Construtos Hemi-COBRA™ com TTA ABDs duplos

[00266] Em algumas modalidades, os construtos pró-droga emparelhados podem ter dois domínios de ligação sdABD-TTA por construção, como é mostrado em A Figura 3B. Nestas modalidades, o primeiro membro do par compreende, de N a C-terminal, sdABD-TTA1-ligante de domínio-sdABD-TTA2- ligante de domínio-aVH-CL-iVL-ligante de domínio-sdABD(HAS),e o segundo membro compreende, de N a C-terminal, sdABD-TTA1-ligante de domínio-sdABD- TTA2-aVL-CL-iVH-ligante de domínio-sdABD-HSA.

[00267] Os dois sdABD-TTAs em cada membro do par são diferentes, mas geralmente os dois membros (hemi-COBRAs™) têm os mesmos dois sdABD- TTAs, por exemplo, ambos têm EGFR e FOLR1 ou EGFR e B7H3, etc.

[00268] Os dois sdABD-TTAs estão em algumas modalidades selecionadas das mostradas em Figura 5.

X. Métodos para fazer as composições da invenção

[00269] As composições pró-droga da invenção são feitas como geralmente serão apreciadas pelos versados na técnica e descritas abaixo.

[00270] A invenção fornece composições de ácido nucleico que codificam as composições pró-droga da invenção. Como será apreciado pelos versados na matéria, as composições de ácido nucleico dependerão do formato do(s) polipeptídeo(s) pró-droga. Assim, por exemplo, quando o formato requer duas sequências de aminoácidos, como os construtos de "formato 3", duas sequências de ácidos nucleicos podem ser incorporadas em um ou mais vetores de expressão para expressão. Da mesma forma, os construtos de pró-drogas que são um único polipeptídeo (formatos 1, 2 e 4), precisam de um único ácido nucleico em um único vetor de expressão para produção.

[00271] Como é conhecido na técnica, os ácidos nucleicos que codificam os componentes da invenção podem ser incorporados nos vetores de expressão como é conhecido na técnica e dependendo das células hospedeiras utilizadas para produzir as composições pró-drogas da invenção. Geralmente, os ácidos nucleicos estão operacionalmente ligados a qualquer número de elementos reguladores (promotores, origem da replicação, marcadores selecionáveis, sítios de ligação ribossômica, indutores, etc.). Os vetores de expressão podem ser vetores extra-cromossômicos ou de integração.

[00272] Os ácidos nucleicos e/ou vetores de expressão da invenção são então transformados em qualquer número de diferentes tipos de células hospedeiras, como é bem conhecido na técnica, incluindo células de mamíferos, bactérias, leveduras, insetos e/ou fungos, com células de mamíferos (por exemplo, células CHO, 293 células), encontrando uso em muitas modalidades.

[00273] As composições pró-drogas da invenção são feitas através da cultura de células hospedeiras compreendendo o (s) vetor (es) de expressão, como é bem conhecido na técnica. Uma vez produzidos, as etapas tradicionais de purificação de anticorpos são realizadas, incluindo uma etapa de cromatografia de afinidade com proteína A e/ou uma etapa de cromatografia de troca iônica.

XI. Formulação e administração das composições pró-droga da invenção

[00274] As formulações das composições pró-droga usadas de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenamento misturando as pró- drogas (proteínas únicas no caso dos formatos 1, 2 e 4 e duas proteínas no caso do formato 3) com o desejado grau de pureza com veículos, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais (como geralmente descrito na Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas.

[00275] As composições pró-droga da invenção são administradas a um sujeito, de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa em bolus ou por infusão contínua durante um período de tempo.

[00276] As composições pró-droga da invenção são úteis no tratamento de câncer.

XII. Exemplos A. Exemplo 1: Construção e purificação Pro Construto

[00277] Transfecções

[00278] Cada proteína (por exemplo, proteínas únicas para os Formatos 1, 2 e 4) ou pares de construtos (Formato 3) foram expressos a partir de um vetor de expressão separado (derivado pcdna3.4). Quantidades iguais de DNA de plasmídeo que codificaram o par de construtos de hemi-cobra ou de cadeia única foram misturadas e transfectadas para células Expi293 seguindo o protocolo de transfecção do fabricante. O meio condicionado foi colhido 5 dias após a transfecção por centrifugação (6000rpm x 25') e filtração (filtro 0,2 uM). A expressão proteica foi confirmada por SDS-PAGE. Os construtos foram purificados e a composição do tampão final foi: Citrato 25 mM, Arginina 75 mM, NaCl 75 mM, Sacarose a 4%, pH 7. As preparações finais foram armazenadas a -80°C.

[00279] Ativação de MMP9

[00280] A MMP9 humana recombinante (rh) foi ativada de acordo com o seguinte protocolo. MMP-9 humana recombinante (R&D # 911-MP-010) está a 0,44 mg/ml (4,7 uM). Acetato p-aminofenilmercúrico (APMA) (Sigma) é preparado na concentração de estoque de 100 mM em DMSO. O tampão de ensaio é Tris 50 mM, pH 7,5, CaCl2 10 mM, NaCl 150 mM, Brij-35 a 0,05%.

[00281] - Diluir rhMMP9 com tampão de ensaio para ~ 100 ug/ml (25 ul hMMP9 + 75 uL de tampão de ensaio)

[00282] - Adicionar acetato de p-aminofenilmercúrico (APMA) de estoque de 100 mM em DMSO a uma concentração final de 1 mM (1 µL a 100 µL)

[00283] - Incubar a 37°C por 24 horas

[00284] - Diluir MMP9 a 10 ng/ul (adicionar 900 ul de tampão de ensaio a 100 ul de solução ativada)

[00285] A concentração do rhMMP9 ativado é de ~ 100 nM.

[00286] Clivagem de Construtos para Ensaios TDCC

[00287] Para clivar os construtos, 100 ul da amostra de proteína na concentração de 1 mg/ml (10,5 uM) no tampão de formulação (ácido cítrico 25 mM, L-arginina 75 mM, NaCl 75 mM, sacarose a 4%) foram fornecidos com CaCl 2 até a 10 mM. O rhMMP9 ativado foi adicionado à concentração 20-35 nM. A amostra foi incubada à temperatura ambiente durante a noite (16-20 horas). A completude da clivagem foi verificada usando SDS PAGE (10-20% de TG, tampão de execução de TG, 200v, 1 h). As amostras foram tipicamente 98% clivadas.

B. Exemplo 2: Ensaios de citotoxicidade celular dependente de células T (TDCC)

[00288] As células HT-29 transduzidas pela Luciferase Firefly foram cultivadas até aproximadamente 80% de confluência e destacadas com Versene (EDTA 0,48 mM em PBS - Ca - Mg). As células foram centrifugadas e ressuspensas em meio TDCC (FBS inativado por calor a 5% em RPMI 1640 com HEPES, GlutaMax, piruvato de sódio, aminoácidos não essenciais e β-mercaptoetanol). As células Pan-T humanas purificadas foram descongeladas, centrifugadas e ressuspensas em meio TDCC.

[00289] Uma cocultura de células HT-29_Luc e células T foi adicionada às placas de cultura de células de 384 poços. COBRAs diluídos em série foram então adicionados à cocultura e incubados a 37°C por 48 horas. Finalmente, um volume igual de reagente de ensaio da luciferase SteadyGlo foi adicionado às placas e incubado por 20 minutos. As placas foram lidas no Perkin Elmer Envision com um tempo de exposição de 0,1s/poço. Luminescência total foi registrada e os dados analisados em GraphPad Prism7.

C. Exemplo 3: Projeto geral de protocolo do modelo de eficácia de transferência de células T adotiva In Vivo

[00290] Esses protocolos foram usados em muitas das experiências das figuras. As células tumorais foram implantadas subcutaneamente (SC) no flanco direito de camundongos NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) (The Jackson Laboratory, Cat. 005557) e deixadas crescer até atingir um tumor estabelecido com um volume médio de cerca de 200 mm3 . Paralelamente, células T humanas foram cultivadas em meio de célula T (X-VIVO 15 [Lonza, Cat.No. 04- 418Q], soro humano a 5%, penicilina a 1%/estreptomicina, 2-mercaptoetanol 0,01 mM) em um frasco permeável ao gás G-Rex100M (Wilson Wolf Cat. No. 81100S) com MACSiBeads do Kit de Ativação/Expansão de Células T (Miltenyi Cat. 130- 091-441) por cerca de 10 dias e suplementado com proteína IL-2 humana recombinante. O crescimento do tumor em camundongos e a ativação/expansão de células T humanas foram coordenadas de modo que, no dia 0 do estudo, os camundongos foram randomizados em grupos (N = 6) com base no tamanho do tumor; cada um foi então injetado por via intravenosa (IV) com 2,5 x 10 6 células T humanas cultivadas e administrados com a primeira dose das moléculas de COBRA ou controle. Os camundongos foram dosados a cada 3 dias por 7 doses (dias 0, 3, 6, 9, 12, 15 e 18) e seguidos por mais 2-3 semanas até os tumores atingirem > 2000mm3 de volume ou o estudo terminar. Os volumes tumorais foram medidos a cada 3 dias.

D. Exemplo 4: Atividade In Vivo com EGFR/MMP9 Hemi-COBRA Par Pro77 e Pro53.

[00291] 5 x 106 células LoVo células ou 5 x 106 células HT29 foram implantadas subcutaneamente no flanco direito de camundongos NSG (NOD.Cg- Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) (The Jackson Laboratory, Cat. 005557) e deixadas crescer até que os tumores fossem estabelecidos. Paralelamente, células T humanas foram cultivadas em meio de célula T (X-VIVO 15 [Lonza, Cat. No. 04- 418Q], soro humano a 5%, penicilina a 1%/estreptomicina, 2-mercaptoetanol 0,01 mM) em um frasco permeável ao gás G-Rex100M (Wilson Wolf Cat. No. 81100S) com MACSiBeads do Kit de Ativação/Expansão de Células T (Miltenyi Cat. 130- 091-441) por cerca de 10 dias e suplementadas com proteína IL-2 humana recombinante. O crescimento do tumor em camundongos e a ativação/expansão de células T humanas foram coordenadas de modo que, no dia 0 do estudo, os camundongos foram randomizados em grupos (N = 6) com base no tamanho do tumor; cada um foi então injetado por via intravenosa (IV) com 2,5 x 106 células T humanas cultivadas e administrados com a primeira dose das moléculas de COBRA ou controle. Os camundongos foram dosados a cada 3 dias por 7 doses (dias 0, 3, 6, 9, 12, 15 e 18) e seguidos até os tumores atingirem >2000mm 3 de volume ou o estudo terminar. Os grupos receberam 0,2 mg/kg (mpk) do anticorpo biespecífico Pro51 anti-EGFR x CD3 de controle positivo (bsAb), 0,5 mpk da lisozima do ovo anti-galinha de controle negativo (HEL) x CD3 bsAb Pro98, 0,5 mpk de cada um dos ligantes cliváveis MMP9 contendo o par anti-EGFR hemi-COBRA Pro77 e Pro53, ou 0,5 mpk cada um dos ligantes não cliváveis (NCL) contendo o par anti-EGFR hemi-COBRA Pro74 e Pro72. Os volumes tumorais foram medidos a cada 3 dias.

E. Exemplo 5: Atividade In Vivo com EGFR/MMP9 COBRA Pro140.

[00292] 5 x 106 células LoVo células ou 5 x 106 células HT29 foram implantadas subcutaneamente no flanco direito de camundongos NSG (NOD.Cg- Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) (The Jackson Laboratory, Cat. 005557) e deixadas crescer até que os tumores fossem estabelecidos. Paralelamente, células T humanas são cultivadas em meio de célula T (X-VIVO 15 [Lonza, Cat.No. 04-418Q], soro humano a 5%, penicilina a 1%/estreptomicina, 2-mercaptoetanol 0,01 mM) em um frasco permeável ao gás G-Rex100M (Wilson Wolf Cat. No. 81100S) com MACSiBeads do Kit de Ativação/Expansão de Células T (Miltenyi Cat. 130-091- 441) por cerca de 10 dias e suplementadas com proteína IL-2 humana recombinante. O crescimento do tumor em camundongos e a ativação/expansão de células T humanas foram coordenadas de modo que, no dia 0 do estudo, os camundongos foram randomizados em grupos (N = 6) com base no tamanho do tumor; cada um foi então injetado por via intravenosa (IV) com 2,5 x 10 6 células T humanas cultivadas e administrados com a primeira dose das moléculas de COBRA ou controle. Os camundongos foram dosados a cada 3 dias por 7 doses (dias 0, 3, 6, 9, 12, 15 e 18) e seguidos até os tumores atingirem >2000mm 3 de volume ou o estudo terminar. Os grupos receberam 0,2 mpk do anticorpo biespecífico Pro51 anti-EGFR x CD3 de controle positivo (bsAb), 0,5 mpk do lisozima do ovo anti-galinha de controle negativo (HEL) x CD3 bsAb Pro98 ou 0,5 mpk do ligante clivável MMP9 contendo anti-EGFR COBRA Pro140. Os volumes tumorais foram medidos a cada 3 dias.

F. Exemplo 6: Atividade In Vivo com EGFR/MMP9 COBRA Pro186.

[00293] 5 x 106 células HT29 foram implantadas subcutaneamente no flanco direito de camundongos NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) (The Jackson Laboratory, Cat. 005557) e deixadas crescer até que os tumores fossem estabelecidos. Paralelamente, células T humanas são cultivadas em meio de célula T (X-VIVO 15 [Lonza, Cat.No. 04-418Q], soro humano a 5%, penicilina a 1%/estreptomicina, 2-mercaptoetanol 0,01 mM) em um frasco permeável ao gás G- Rex100M (Wilson Wolf Cat. No. 81100S) com MACSiBeads do Kit de Ativação/Expansão de Células T (Miltenyi Cat. 130-091-441) por cerca de 10 dias e suplementadas com proteína IL-2 humana recombinante. O crescimento do tumor em camundongos e a ativação/expansão de células T humanas foram coordenadas de modo que, no dia 0 do estudo, os camundongos foram randomizados em grupos

(N = 6) com base no tamanho do tumor; cada um foi então injetado por via intravenosa (IV) com 2,5 x 106 células T humanas cultivadas e administrados com a primeira dose das moléculas de COBRA ou controle. Os camundongos foram dosados a cada 3 dias por 7 doses (dias 0, 3, 6, 9, 12, 15 e 18) e seguidos até os tumores atingirem >2000mm3 de volume ou o estudo terminar. Os grupos receberam 0,1 mg/kg (mpk) do anticorpo biespecífico Pro51 de controle positivo anti-EGFR x CD3 (bsAb), 0,3 mpk do ligante de controle não clivável (NCL) contendo anti-EGFR COBRA Pro214, 0,1 ou 0,3 mpk do ligante clivável MMP9 contendo anti-EGFR COBRA Pro140, ou 0,1 ou 0,3 mpk do ligante clivável MMP9 contendo anti-EGFR COBRA Pro186. Os volumes tumorais foram medidos a cada 3 dias.

G. Exemplo: Humanização bem-sucedida de sequências anti-EGFR

[00294] Os resultados são mostrados abaixo.

Molécula KD (M) Kon (1/Ms) Kdis(1/s) Pro22 (EGFR 2,58E-09M/2,6 nM 2,05E+05 5,27E-04 parental) Pro90 (hEGFR1) 2,00E-09M/2,0 nM 2,21E+05 4,40E-04 Pro48 (EGFR2) 2,89E-09M/2,9 nM 6,09E +05 1,76E-03 Pro137 (hEGFR2) 4,36E-09M/4,4. nM 5,85E+05 2,55E-03 Pro51 (hEGFR2) 3,27E-09M/3,2 nM 6,45E+05 2,11E-03 Pro201 (hEGFR2 com 2,25E-12M/2,3 pM 1,55E+06 3,48E-06 2 sítios de ligação)

[00295] Estes resultados mostram que a humanização dos domínios de ligação ao EGFR foi bem sucedida e que existe uma forte avidez ao EGFR alvo quando dois sítios de ligação estão na molécula.

[00296] Exemplo: Humanização bem-sucedida dos sdABDs do EpCAM

[00297] Os resultados são mostrados abaixo.

Clone Afinidade de Afinidade de ligação Cyno/reatividade ligação humana Cyno (nM) cruzada humana (nM) VIB-13 2,3 11,6 5 hVIB-13 2,8 12,7 4,5 VIB-23 4,2 46,7 11,1 hVIB-23 4,1 58,8 12,6

[00298] Esses resultados mostram que a humanização dos domínios de ligação ao EpCAM foi bem-sucedida.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Proteína, caracterizada pelo fato de que compreende, de N a C-terminal: a) um primeiro domínio de ligação a antígeno de domínio único (sdABD) que liga a um antígeno alvo de tumor (TTA) humano (sdABD-TTA); b) um primeiro ligante de domínio; c) um domínio Fv restrito compreendendo: i) um primeiro domínio pesado variável compreendendo um vhCDR1, vhCDR2 e vhCDR3; ii) um ligante não clivável restrito (CNCL); e iii) um primeiro domínio leve variável compreendendo vlCDR1, vlCDR2 e vlCDR3; d) um segundo ligante de domínio; e) um segundo sdABD-TTA; f) um ligante clivável (CL); g) um pseudodomínio Fv restrito compreendendo: i) um primeiro pseudodomínio variável leve; ii) um ligante não clivável (NCL); e iii) um primeiro pseudodomínio variável pesado; h) um terceiro ligante de domínio; e i) um terceiro sdABD que liga à albumina sérica humana; em que o referido primeiro domínio pesado variável e o referido primeiro domínio leve variável são capazes de se ligar a CD3 humano, mas o referido domínio Fv restrito não se liga a CD3; em que o referido primeiro domínio pesado variável e o referido primeiro pseudodomínio leve variável se associam intramolecularmente para formar um Fv inativo; e em que o referido primeiro domínio leve variável e o referido primeiro pseudodomínio pesado variável se associam intramolecularmente para formar um Fv inativo.

2. Proteína, caracterizada pelo fato de que compreende, de N a C-terminal: a) um primeiro sdABD-TTA; b) um primeiro ligante de domínio; c) um domínio Fv restrito compreendendo: i) um primeiro domínio pesado variável compreendendo um vhCDR1, vhCDR2 e vhCDR3; ii) um ligante clivável restrito (CCL); e iii) um primeiro domínio leve variável compreendendo vlCDR1, vlCDR2 e vlCDR3; d) um segundo ligante de domínio; e) um segundo sdABD-TTA; f) um ligante clivável (CL); g) um pseudodomínio Fv restrito compreendendo: i) um primeiro pseudodomínio variável pesado; ii) um ligante não clivável (NCL); e iii) um primeiro pseudodomínio variável leve; h) um terceiro ligante de domínio; e i) um terceiro sdABD que liga à albumina sérica humana; em que o referido primeiro domínio pesado variável e o referido primeiro domínio leve variável são capazes de se ligar a CD3 humano, mas o referido domínio Fv restrito não se liga a CD3; em que o referido primeiro domínio pesado variável e o referido primeiro pseudodomínio leve variável se associam intramolecularmente para formar um Fv inativo; e em que o referido primeiro domínio leve variável e o referido primeiro pseudodomínio pesado variável se associam intramolecularmente para formar um Fv inativo.

3. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo fato de que o referido primeiro domínio pesado variável é N-terminal ao referido primeiro domínio leve variável e o referido pseudodomínio variável é N-terminal ao referido pseudodomínio pesado variável.

4. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo fato de que o referido primeiro domínio pesado variável é N-terminal ao referido primeiro domínio leve variável e o referido pseudodomínio variável é N-terminal ao referido pseudodomínio leve variável.

5. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo fato de que o referido primeiro domínio leve variável é N-terminal ao referido primeiro domínio pesado variável e o referido pseudodomínio variável é N-terminal ao referido pseudodomínio pesado variável.

6. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo fato de que o referido primeiro domínio leve variável é N-terminal ao referido primeiro domínio pesado variável e o referido pseudodomínio variável pesado é N-terminal ao referido pseudodomínio leve variável.

7. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o primeiro e o segundo TTA são os mesmos.

8. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o primeiro e o segundo TTA são diferentes.

9. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o primeiro e o segundo TTA são selecionados de EGFR, EpCAM, FOLR1 e B7H3.

10. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que os referidos primeiro e segundo sdABD-TTAs são selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13 , SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 41.

11. Proteína, de acordo com as reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o referido domínio de extensão de meia-vida tem a SEQ ID NO: 45.

12. Proteína de acordo com as reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que o referido ligante clivável é clivado por uma protease humana selecionada do grupo que consiste em MMP2, MMP9, Meprina A, Meprina B, Catepsina S, Catepsina K, Catespina L, GranzimaB, uPA, Calicreína7, matriptase e trombina.

13. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína selecionada do grupo que consiste em Pro186, Pro225, Pro226, Pro233, Pro311, Pro312, Pro313, Pro495, Pro246, Pro254, Pro255, Pro256, Pro420, Pro421, Pro432, Pro479, Pro480 , Pro187, Pro221, Pro222, Pro223, Pro224, Pro393, Pro394, Pro395, Pro396, Pro429, Pro430 e Pro431.

14. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que codifica uma proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.

15. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 14.

16. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor de expressão como definido na reivindicação 15.

17. Método para fabricar uma proteína, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 16 sob condições em que a referida proteína é expressa e recuperar a referida proteína.

18. Método para tratamento de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 a um paciente.

19. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende: a) uma primeira proteína compreendendo, de N a C-terminal: i) um primeiro sdABD-TTA; ii) um primeiro ligante de domínio; iii) um pseudodomínio Fv compreendendo, de N a C-terminal: 1) uma cadeia pesada variável compreendendo um vhCDR1, vhCDR2 e vhCDR3;

2) um ligante clivável; e

3) um primeiro pseudodomínio leve variável compreendendo iVLCDR1, iVLCDR2 e iVLCDR3;

iv) um segundo ligante de domínio;

v) um primeiro sdABD que liga à albumina sérica humana;

a) uma segunda proteína compreendendo, de N a C-terminal:

i) um terceiro sdABD que liga a um antígeno alvo do tumor humano;

ii) um terceiro ligante de domínio;

iii) um pseudodomínio Fv compreendendo, de N a C-terminal:

1) uma cadeia leve variável compreendendo um VLCDR1, VLCDR2 e VLCDR3;

2) um ligante clivável; e

3) um primeiro pseudodomínio pesado variável compreendendo iVHCDR1, iVHCDR2 e iVHCDR3;

iv) um quarto ligante de domínio;

v) um quarto sdABD que liga à albumina sérica humana;

em que o referido primeiro domínio pesado variável e o referido primeiro domínio leve variável são capazes de se ligar à CD3 humana quando associado;

o referido primeiro domínio pesado variável e o referido primeiro pseudodomínio leve variável associam-se intermolecularmente para formar um Fv inativo;

o referido primeiro domínio leve variável e o referido primeiro pseudodomínio pesado variável associam-se intermolecularmente para formar um Fv inativo;

em que o referido primeiro e terceiro sdABD são selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID

NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO:

41.

20. Proteína, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o primeiro e o segundo TTA são os mesmos.

21. Proteína, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o referido primeiro e segundo TTA são diferentes.

22. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizada pelo fato de que os referidos terceiro e quarto sdABDs têm SEQ ID NO: 45.

23. Composição de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende: a) um primeiro ácido nucleico que codifica uma primeira proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 19 a 22; e b) um segundo ácido nucleico que codifica uma segunda proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 19 a 22.

24. Composição de vetor de expressão, caracterizada pelo fato de que compreende: a) um primeiro vetor de expressão compreendendo o primeiro ácido nucleico da reivindicação 23; e b) um segundo vetor de expressão compreendendo o segundo ácido nucleico da reivindicação 23.

25. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende a composição de vetor de expressão como definida na reivindicação 24.

26. Método para fazer uma composição, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 25 sob condições em que as referidas proteínas são expressas e recuperar as referidas proteínas.

27. Método para tratamento de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 19 a 22 a um paciente.

28. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende:

a) uma primeira proteína compreendendo, de N a C-terminal:

i) um primeiro sdABD-TTA;

ii) um primeiro ligante de domínio;

iii) um segundo sdABD-TTA;

iv) um segundo ligante de domínio;

iii) um pseudodomínio Fv compreendendo, de N a C-terminal:

1) uma cadeia pesada variável compreendendo um vhCDR1, vhCDR2 e vhCDR3;

2) um ligante clivável; e

3) um primeiro pseudodomínio leve variável compreendendo iVLCDR1, iVLCDR2 e iVLCDR3;

iv) um terceiro ligante de domínio; e v) um sdABD-HSA;

a) uma segunda proteína compreendendo, de N a C-terminal:

i) um terceiro sdABD-TTA;

ii) um quarto ligante de domínio;

iii) um quarto sdABD-TTA;

iv) um quinto ligante de domínio;

iii) um pseudodomínio Fv compreendendo, de N a C-terminal:

1) uma cadeia leve variável compreendendo um VLCDR1, VLCDR2 e VLCDR3;

2) um ligante clivável; e

3) um primeiro pseudodomínio pesado variável compreendendo iVHCDR1, iVHCDR2 e iVHCDR3;

iv) um sexto ligante de domínio;

v) um sdABD-HSA; em que o referido primeiro domínio pesado variável e o referido primeiro domínio leve variável são capazes de se ligar à CD3 humana quando associado; o referido primeiro domínio pesado variável e o referido primeiro pseudodomínio leve variável associam-se intermolecularmente para formar um Fv inativo; o referido primeiro domínio leve variável e o referido primeiro pseudodomínio pesado variável associam-se intermolecularmente para formar um Fv inativo.

29. Composição, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que os referidos sdABD-HSAs têm SEQ ID NO: 45.

30. Composição de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende: a) um primeiro ácido nucleico que codifica uma primeira proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 28 a 29; e b) um segundo ácido nucleico que codifica uma segunda proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 28 a 29, respectivamente.

31. Composição de vetor de expressão, caracterizada pelo fato de que compreende: a) um primeiro vetor de expressão compreendendo o primeiro ácido nucleico da reivindicação 30; e b) um segundo vetor de expressão compreendendo o segundo ácido nucleico da reivindicação 30.

32. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende a composição de vetor de expressão como definida na reivindicação 31.

33. Método para fazer uma composição, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 32 sob condições em que as referidas proteínas são expressas e recuperar as referidas proteínas.

34. Método para tratamento de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 28 a 29 a um paciente.

35. Proteína, caracterizada pelo fato de que compreende, de N a C-terminal: a) um domínio de ligação a antígeno de domínio único (sdABD) que liga a um antígeno alvo de tumor (TTA) humano (sdABD-TTA); b) um primeiro ligante de domínio; c) um domínio Fv restrito compreendendo: i) um primeiro domínio pesado variável compreendendo um vhCDR1, vhCDR2 e vhCDR3; ii) um ligante não clivável restrito (CNCL); e iii) um primeiro domínio leve variável compreendendo vlCDR1, vlCDR2 e vlCDR3; d) um ligante clivável (CL); e) um segundo sdABD que liga à albumina sérica humana; f) um ligante de domínio; g) um pseudodomínio Fv restrito compreendendo: i) um primeiro pseudodomínio variável leve; ii) um ligante não clivável (NCL); e iii) um primeiro pseudodomínio variável pesado; em que o referido primeiro domínio pesado variável e o referido primeiro domínio leve variável são capazes de se ligar à CD3 humana, mas o referido domínio Fv restrito não se liga à CD3; o referido primeiro domínio pesado variável e o referido primeiro pseudodomínio leve variável associam-se intramolecularmente para formar um Fv inativo; e o referido primeiro domínio leve variável e o referido primeiro pseudodomínio pesado variável associam-se intramolecularmente para formar um Fv inativo.

36. Proteína, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que o referido primeiro domínio pesado variável é N-terminal ao referido primeiro domínio leve variável e o referido pseudodomínio variável é N-terminal ao referido pseudodomínio pesado variável.

37. Proteína, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que o referido primeiro domínio pesado variável é N-terminal ao referido primeiro domínio leve variável e o referido pseudodomínio variável é N-terminal ao referido pseudodomínio leve variável.

38. Proteína, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que o referido primeiro domínio leve variável é N-terminal ao referido primeiro domínio pesado variável e o referido pseudodomínio variável é N-terminal ao referido pseudodomínio pesado variável.

39. Proteína, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que o referido primeiro domínio leve variável é N-terminal ao referido primeiro domínio pesado variável e o referido pseudodomínio variável pesado é N-terminal ao referido pseudodomínio leve variável.

40. Proteína, de acordo com as reivindicações 35 a 39, caracterizada pelo fato de que o referido TTA é selecionado de EGFR, EpCAM, FOLR1 e B7H3.

41. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 40, caracterizada pelo fato de que o referido sdABD-TTA é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 41.

42. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 41, caracterizada pelo fato de que o referido domínio de extensão de meia-vida tem a SEQ ID NO: 45.

43. Proteína de acordo com as reivindicações 35 a 42, caracterizada pelo fato de que o referido ligante clivável é clivado por uma protease humana selecionada do grupo que consiste em MMP2, MMP9, Meprina A, Meprina B, Catepsina S, Catepsina K, Catespina L, GranzimaB, uPA, Calicreína7, matriptase e trombina.

44. Proteína, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que compreende Pro258, Pro356, Pro359, Pro388 e Pro364.

45. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que codifica uma proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 35 a 44.

46. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 45.

47. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor de expressão como definido na reivindicação 46.

48. Método para fabricar uma proteína, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 47 sob condições em que a referida proteína é expressa e recuperar a referida proteína.

49. Método para tratamento de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 35 a 44 a um paciente.