BRPI1008564B1 - Método para detecção, diagnóstico ou monitoramento de uma doença tumoral - Google Patents

Método para detecção, diagnóstico ou monitoramento de uma doença tumoral Download PDF

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Abstract

métodos e composições para o diagnóstico e tratamento do câncer. a presente invenção diz respeito à identificação de sequências de ácidos nucléicos e sequências de aminoácidos que são características de tecidos tumorais, como tumor de ovário e tecidos tumorais de pulmão, e que representam alvos para a terapia ou o diagnóstico de doenças tumorais em um sujeito.

Description

[0001] O câncer é um importante problema de saúde em todo o mundo e ainda está entre as principais causas de morte.
[0002] O câncer de ovário é um crescimento canceroso ocorrendo num ovário. Câncer de ovário é a quinta causa de morte por câncer em mulheres e a principal causa de morte por câncer ginecológico. A mulher tem um risco de câncer de ovário em torno de 1,5%, o que o torna o segundo mais comum em termos de malignidade ginecológica.
[0003] O diagnóstico de câncer de ovário pode decorrer de um exame físico anormal (incluindo um exame pélvico), de um exame de sangue (para CA-125, mais especificamente) ou a partir de estudos de imagiologia médica. O diagnóstico pode ser confirmado com um procedimento cirúrgico para inspecionar a cavidade abdominal ou exame do tipo biópsia, onde se procura por células cancerosas no líquido abdominal. O tratamento geralmente envolve quimioterapia e cirurgia, e, às vezes radioterapia.
[0004] Há um risco aumentado de câncer de ovário em mulheres mais velhas e naquelas que têm um parente em primeiro ou segundo grau com a doença. Formas hereditárias de câncer do ovário podem ser causadas por mutações em genes específicos (principalmente BRCAl e BRCA2). Mulheres inférteis e aquelas com uma condição chamada endometriose, aquelas que nunca estiveram grávidas e aquelas que usam a terapia de reposição na pós-menopausa com estrogênio têm maior risco. O uso de pílulas anticoncepcionais orais é um fator de proteção. O risco também é menor nas mulheres que tiveram suas tubas uterinas bloqueadas cirurgicamente (ligadura de trompas).
[0005] O câncer de ovário normalmente tem um prognóstico ruim. É desproporcionalmente mortal porque lhe falta qualquer detecção clara em seu início ou teste de triagem, o que significa que a maioria dos casos não são diagnosticados até que tenham atingido estágios avançados. Mais de 60% das pacientes com este câncer já têm estágio III ou estágio IV de câncer, quando este já se espalhou para além dos ovários. Cânceres de ovário abrigam células no líquido que ocorre naturalmente no interior da cavidade abdominal. Estas células podem se implantar em outras estruturas abdominais (peritoneal), incluído o útero, bexiga, intestino e revestimento da parede do intestino (omento). Estas células podem começar a formar novas formações tumorais antes mesmo que haja suspeita de um câncer.
[0006] A taxa de sobrevivência de cinco anos para todos os estágios do câncer de ovário é de 45,5%. Para casos em que um diagnóstico é feito no início da doença, quando o câncer ainda está confinado somente no sítio principal, a taxa de sobrevivência de cinco anos é de 92,7%.
[0007] As principais categorias de tumores de ovário são as seguintes: - tumores epiteliais, que representam cerca de 75% de todos os tumores de ovário e 90-95% das neoplasias malignas de ovário; - tumores estroma ovariano, que representam cerca de 5 a 10% de todos as neoplasias ovarianas; - tumores de células germinativas, que respondem por cerca de 15 a 20% de todas as neoplasias de ovário; - tumores metastáticos, sendo responsáveis por cerca de 5% das neoplasias malignas de ovário, e, geralmente, decorrentes de câncer de mama, cólon, endométrio, estômago e cervical. O câncer de ovário normalmente se forma no revestimento do ovário (resultando em câncer epitelial de ovário) ou nas células do ovo (resultando em um tumor de células germinativas).
[0008] O tumor de superfície epitelial-estromal, também conhecido como carcinoma epitelial de ovário, é o tipo mais comum de câncer de ovário. Tumores de superfície epitelial de estroma são uma classe de neoplasia de ovário que podem ser benignos ou malignos. Neoplasias, neste grupo, provavelmente derivam do epitélio de superfície do ovário (peritônio modificado) ou a partir das trompas de Falópio ou tecido endometrial ectópico (tubário). Tumores de superfície epitelial de estroma incluem tumor seroso, tumor endometrióide e cistadenocarcinoma mucinoso.
[0009] O câncer de pulmão é uma doença com crescimento celular descontrolado nos tecidos do pulmão. Este crescimento pode levar a metástases, que são uma invasão de tecidos adjacentes e infiltração além dos pulmões. Câncer de pulmão, a causa mais comum de morte relacionada ao câncer em homens e o segundo câncer mais comum em mulheres (depois do câncer de mama), é responsável por 1,3 milhões de mortes em todo o mundo anualmente.
[0010] Os tumores de pulmão incluem cânceres epidermóides e adenocarcinomas. A grande maioria dos cânceres do pulmão são carcinomas - neoplasias que surgem a partir de células epiteliais. O câncer de pulmão pode ser caracterizado por cinco critérios histopatológicos. A distinção entre carcinoma epitelial escamoso, adenocarcinoma, carcinoma de células grandes, carcinoma adenoescamoso e carcinoma de pulmão de células pequenas (CPPC). Os quatro primeiros são citados como não-SCLC (NSCLC) na literatura.
[0011] Carcinoma de pulmão de células não-pequenas (NSCLC) às vezes é tratado com cirurgia, enquanto que o carcinoma do pulmão de células pequenas (CPPC), geralmente responde melhor à quimioterapia e radiação.
[0012] O câncer de pulmão pode ser visto em radiografia de tórax e em tomografia computadorizada (TC). O diagnóstico é confirmado com uma biópsia. Esta geralmente é realizada através de broncoscopia ou biópsia CT-guiada. O tratamento e prognóstico depende do tipo histológico de câncer, do estágio (grau de espalhamento) e do estado de desempenho do paciente. Possíveis tratamentos incluem cirurgia, quimioterapia e radioterapia. Com o tratamento, a taxa de sobrevivência de cinco anos é de 14%.
[0013] O sistema imunológico tem a capacidade de reconhecer e destruir as células através de duas modalidades distintas: a imunidade inata e adaptativa. O componente inato é composto por macrófagos, natural killers (NK), monócitos e granulócitos. Estas células identificam padrões moleculares envolvidos na transformação celular e liberam várias citocinas e mediadores inflamatórios. A resposta inata não tem a capacidade de memória para antígenos estranhos, uma característica presente na resposta imune adaptativa. Este último componente do sistema imunológico também possui especificidade para antígenos estranhos, transmitido pela presença de receptores nos linfócitos. Células apresentadoras de antígenos (APCs) desempenham também um papel na resposta adaptativa - o de englobar antígenos estranhos e apresentá-los aos linfócitos no contexto do complexo principal de histocompatibilidade. Células T CD4 + possuem receptores que reconhecem antígenos no contexto de moléculas de MHC de classe II, que depois lhes permite liberar citocinas e ainda ativar os linfócitos CD8+ (CTLs) ou as células B. CTLs são parte da imunidade mediada por células e são capazes de eliminar as células apresentadas no contexto de moléculas de MHC de classe I, via apoptose ou lise celular mediada por perforina. É amplamente aceito que a imunidade mediada por células T desempenha um papel vital na resposta antitumoral.
[0014] Células B estão envolvidas na liberação de imunoglobulinas e, como tal, fazem parte do sistema imune humoral.
[0015] Se devidamente direcionadas e alcançadas, funções imunológicas podem ser terapeuticamente exploradas para controlar e mesmo erradicar lesões malignas. Alterações genéticas e epigenéticas envolvidas na carcinogênese geram antígenos que são reconhecidos pelo sistema imunológico de forma análoga aos antígenos microbianos.
[0016] Há uma necessidade no estado da técnica por marcadores genéticos e alvos tumorais, como os tumores de ovário e tumores de pulmão, em particular em adenocarcinomas de ovário e adenocarcinomas bronquiolares, tumores metastáticos e derivados, permitindo o projeto de abordagens diagnósticas e terapêuticas específicas, confiáveis e sensíveis destas doenças.
[0017] A presente invenção refere-se a terapia e diagnóstico de tumores, como tumores de ovário e tumores de pulmão, em particular adenocarcinomas de ovário e adenocarcinomas bronquiolares, tumores metastáticos e derivados. Em particular, a invenção diz respeito à identificação de estruturas moleculares que estão presentes em tumores como os tumores de ovário e tumores de pulmão e que podem servir como alvos para abordagens diagnósticas e terapêuticas destas doenças.
RESUMO DA INVENÇÃO
[0018] A presente invenção diz respeito à identificação de ácidos nucléicos e sequências de aminoácidos que são característicos de tecidos tumorais, como os tecidos tumorais dos ovários e de pulmão, e que representam alvos para a terapia ou para o diagnóstico de doenças tumorais em um sujeito.
[0019] Estas sequências envolvem as proteínas identificadas pela a membrana plasmática das células, e acessível sobre a região extra-celular, de forma que as sequências podem ser úteis na preparação de vacinas tumorais, incluindo vacinas profiláticas e terapêuticas.
[0020] Os ácidos nucléicos identificados de acordo com a presente invenção devem ser expressos em células tumorais e são compostos da sequência de ácido nucléico de acordo com a SEQ ID NO: 1 apresentada na listagem de sequências ou com uma variante da referida sequência de ácidos nucléicos. De preferência, os ácidos nucléicos identificados de acordo com a presente invenção devem ser expressos em células tumorais e codificam um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 2, apresentada na listagem de sequências, ou com uma variante da referida sequência de aminoácidos. Estes ácidos nucléicos também são aqui denominados como “ácidos nucléicos associados ao tumor” ou, simplesmente, “ácidos nucléicos tumorais”.
[0021] Em outro aspecto, a invenção se refere a peptídeos codificados pelos ácidos nucléicos tumorais identificados de acordo com a invenção, aqui também denominados “antígenos tumorais associados” ou, simplesmente, “antígenos tumorais”. Assim, os antígenos tumorais identificados de acordo com a invenção compreendem uma sequência de aminoácidos codificada por um ácido nucléico que compreende a sequência de ácidos nucléicos de acordo com a SEQ ID NO: 1, da listagem de sequências, ou uma variante da referida sequência de ácidos nucléicos. De preferência, os antígenos tumorais identificados de acordo com a invenção compreendem a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 2, da listagem de sequências, ou uma variante da referida sequência de aminoácidos.
[0022] Em um aspecto, a invenção proporciona peptídeos compreendendo sequências de aminoácidos derivadas das sequências dos antígenos tumorais identificados de acordo com a invenção, aqui também denominados “peptídeos de antígeno tumoral”. Preferencialmente, os peptídeos de antígeno tumoral da invenção são capazes de estimular uma resposta celular contra as células caracterizada pela apresentação de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção com um MHC de classe I ou pelo desencadeamento de anticorpos que se ligam especificamente a um antígeno tumoral identificado de acordo com a presente invenção, quando utilizado por si ou quando ligado a um transportador imunogênico. Peptídeos de antígeno tumoral preferidos podem ser apresentados diretamente ou após transformação, com moléculas de MHC de classe I.
[0023] De preferência, os peptídeos de antígeno tumoral de acordo com a invenção são peptídeos apresentados de MHC de classe I e/ou de classe II ou podem ser processados para produzir peptídeos apresentados de MHC de classe I e/ou de classe II. De preferência, os peptídeos de antígeno tumoral de acordo com a invenção compreendem uma sequência de aminoácidos substancialmente correspondente à sequência de aminoácidos de um fragmento de um antígeno tumoral identificado de acordo com a presente invenção. Preferencialmente, o referido fragmento de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção é um peptídeo apresentado de MHC de classe I e/ou classe II ou é um imunógeno que é capaz de desencadear a ligação de anticorpos ao referido fragmento. De preferência, um peptídeo de antígeno tumoral de acordo com a invenção compreende uma sequência de aminoácidos substancialmente correspondente à sequência de aminoácidos de um fragmento de tal antígeno e é processado para produzir tal fragmento, ou seja, um peptídeo apresentado de MHC de classe I e/ou classe II derivado de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção, ou um imunógeno derivado de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção que é capaz de desencadear a ligação de anticorpos ao referido fragmento. Assim, um peptídeo de antígeno tumoral de acordo com a presente invenção compreende uma sequência de aminoácidos substancialmente correspondente à sequência de aminoácidos de um fragmento de um antígeno tumoral que compreende uma sequência de aminoácidos codificada por um ácido nucléico que compreende a sequência de ácidos nucléicos de acordo com a SEQ ID NO: 1, da listagem de sequências, ou uma variante da referida sequência de ácidos nucléicos e, de preferência, compreende uma sequência de aminoácidos substancialmente correspondente à sequência de aminoácidos de um fragmento de um antígeno tumoral que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 2, da listagem de sequências, ou uma variante da referida sequência de aminoácidos. Em uma modalidade, um peptídeo de antígeno tumoral de acordo com a presente invenção compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5, da listagem de sequências, ou um fragmento destas, ou uma variante das referidas sequências de aminoácidos ou fragmentos.
[0024] A presente invenção geralmente abrange o tratamento e/ou diagnóstico de doenças tumorais, visando ácidos nucléicos tumorais ou antígenos tumorais. Esses métodos fornecem uma detecção seletiva de células e/ou a erradicação de células que expressam tais ácidos nucléicos tumorais e/ou antígenos tumorais, minimizando assim os efeitos negativos para as células normais que não expressam tais ácidos nucléicos tumorais e/ou antígenos tumorais. Assim, as doenças preferidas para uma terapia ou diagnóstico são aquelas em que um ou mais dos ácidos nucléicos tumorais e/ou antígenos tumorais identificados de acordo com a invenção são expressos, como as doenças tumorais, sendo aqui descritas, em particular, doenças como o câncer.
[0025] De acordo com a invenção, os antígenos tumorais identificados de acordo com a invenção que são particularmente apropriados para alcançar tal objetivo são uma parte dos antígenos tumorais que corresponde à porção não-transmembrânica, em particular a parte extracelular de antígenos tumorais, ou são compostos dos mesmos. Em uma modalidade, a referida parte ou porção compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5, da listagem de sequências, ou um fragmento dela ou uma variante da referida sequência de aminoácidos ou fragmento. Portanto, as entidades utilizadas de acordo com a invenção que são capazes de se ligar aos antígenos tumorais identificados de acordo com a presente invenção, de preferência, são capazes de se ligar a uma parte dos antígenos tumorais identificados de acordo com a invenção, que corresponde à parte não-transmembrânica, em especial a porção extracelular de antígenos tumorais, ou que é composta dos mesmos. Em uma modalidade, a referida parte ou porção compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5, da listagem de sequências, ou um fragmento delas ou uma variante da referida sequência de aminoácidos ou fragmento. Da mesma forma, peptídeos e ácidos nucléicos utilizados de acordo com a invenção para induzir uma resposta imune com especificidade para antígenos tumorais identificados de acordo com a presente invenção, de preferência, induzem a especificidade para uma parte dos antígenos tumorais identificados de acordo com a invenção, que corresponde à porção não-transmembrânica, em especial a porção extracelular de antígenos tumorais, ou é composta da mesma. Em uma modalidade, a referida parte ou porção compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5, da listagem de sequência, ou um fragmento destas ou uma variante da referida sequência de aminoácidos ou fragmento. Preferencialmente, os referidos peptídeos compreendem uma sequência substancialmente correspondente a uma parte dos antígenos tumorais identificados de acordo com a invenção, o que corresponde à porção não-transmembrânica, em especial a porção extracelular de antígenos tumorais, ou é composta das mesmas, e os referidos ácidos nucleicos codificam tais peptídeos. Em uma modalidade, a referida parte ou porção compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5, da listagem de sequências, ou um fragmento destas ou uma variante da referida sequência de aminoácidos ou fragmento.
[0026] Um aspecto da presente invenção se refere a terapias para o tratamento de doenças tumorais, em particular tumores de ovário e tumores de pulmão, envolvendo a administração de um inibidor de expressão e/ou de atividade de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção.
[0027] Neste aspecto, a presente invenção diz respeito a uma composição farmacêutica compreendendo um inibidor de expressão e/ou de atividade de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção. Em uma modalidade, o referido inibidor é específico para um ácido nucléico tumoral identificado de acordo com a invenção. Em outra modalidade, o referido inibidor é específico para um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção. De acordo com a invenção, a expressão “inibir a expressão e/ou atividade” inclui uma inibição completa ou quase completa de expressão e/ou de atividade e uma diminuição na expressão e/ou na atividade. Preferencialmente, a referida inibição da expressão de um antígeno tumoral identificado de acordo a invenção pode se dar inibindo a produção ou reduzindo o nível de transcrição do mRNA, ou seja, que codifica para um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção, por exemplo inibindo a transcrição ou diminuindo a indução de transcrição e/ou inibindo a produção de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção, por exemplo, inibindo a tradução da transcrição de codificação para um antígeno tumoral identificado de acordo com a presente invenção. Preferencialmente, a referida inibição da expressão e/ou da atividade de um antígeno tumoral identificado de acordo com a presente invenção reduz o crescimento de células tumorais e/ou induz a morte das células tumorais e, portanto, tem um efeito inibidor tumoral ou destruidor de tumores.
[0028] Em uma modalidade particular, o inibidor de expressão de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção é um ácido nucléico inibitório (por exemplo, oligonucleotídeo anti-senso, ribozima, RNAi, siRNA ou um DNA que codifica o mesmo) para hibridação seletiva e é específico para um ácido nucléico tumoral identificado de acordo com a invenção; inibindo assim (por exemplo, reduzindo) a transcrição e/ou tradução do mesmo.
[0029] Ácidos nucléicos inibitórios desta invenção incluem oligonucleotídeos tendo sequências na orientação anti-senso com relação aos ácidos nucléicos alvo. Oligonucleotídeos inibitórios adequados normalmente variam em comprimento desde cinco até cerca de várias centenas de nucleotídeos, mais tipicamente de cerca de 20 a 70 nucleotídeos de comprimento ou mais curta, ainda mais tipicamente de cerca de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento. Estes oligonucleotídeos inibitórios podem ser administrados como ácidos nucléicos livres (naked) ou em formas protegidas, por exemplo encapsulados em lipossomas. O uso de lipossomas ou outras formas protegidas pode ser vantajoso, pois pode aumentar a estabilidade in vivo e, assim, facilitar a apresentação nos sítios de destino.
[0030] Além disso, o ácido nucléico tumoral alvo pode ser utilizado para projetar ribozimas que visam a clivagem do mRNA correspondente nas células tumorais. Da mesma forma, estas ribozimas podem ser administradas na forma livre (naked) ou através da utilização de sistemas de apresentação que melhoram a estabilidade e/ou direcionamento, por exemplo, lipossomas.
[0031] Além disso, o ácido nucléico tumoral alvo pode ser utilizado para projetar siRNAs que podem inibir (por exemplo, reduzir) a expressão do ácido nucléico tumoral. Os siRNAs podem ser administrados na forma livre (naked) ou através da utilização de sistemas de apresentação que melhoram a estabilidade e/ou direcionamento, por exemplo, lipossomas. Podem também ser administrados na forma de seus precursores ou DNAs de codificação.
[0032] Um siRNA preferivelmente compreende uma fita de RNA senso e uma fita de RNA anti-senso, em que as fitas senso e anti-senso do RNA formam RNA na forma duplex e em que a fita senso do RNA compreende uma sequência de nucleotídeos substancialmente idêntica a uma sequência alvo de cerca de 19 até cerca de 25 nucleotídeos contíguos em um ácido nucléico tumoral identificado de acordo com a invenção, de preferência um mRNA que codifica para o antígeno tumoral alvo.
[0033] Em uma modalidade adicional, o inibidor da atividade de um antígeno tumoral identificado de acordo com a presente invenção é um anticorpo que se liga especificamente ao referido antígeno tumoral. Em uma modalidade, o referido anticorpo se liga especificamente a um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5, da listagem de sequências, ou um fragmento destas ou uma variante da referida sequência de aminoácidos ou fragmento. A ligação do anticorpo ao antígeno tumoral pode interferir na função do antígeno tumoral, por exemplo, pela inibição da atividade de ligação ou da atividade catalítica.
[0034] Adicionalmente, outro aspecto da presente invenção refere-se a terapias para o tratamento de doenças tumorais envolvendo a administração de um ligante de uma molécula-alvo, ou seja, um ácido nucléico tumoral ou antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção. A este respeito, um ácido nucléico pode ser administrado de modo que este, seletivamente, hibridize com o ácido nucléico alvo ou um anticorpo pode ser administrado de modo que se ligue especificamente e seletivamente a um antígeno alvo, ligado a porções terapêuticas efetoras, por exemplo, radio- marcadores, citotoxinas, enzimas citotóxicas e semelhantes, a fim de se direcionar e matar células que expressem estes alvos, por exemplo, células tumorais. Em uma modalidade, o referido anticorpo se liga especificamente a um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5, da listagem de sequências, ou um fragmento destas ou uma variante da referida sequência de aminoácidos ou fragmento.
[0035] Neste aspecto, a presente invenção diz respeito a uma composição farmacêutica compreendendo um ligante de um ácido nucléico tumoral ou antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção, o referido ligante sendo ligado a uma ou mais porções terapêuticas efetoras. Preferencialmente, o referido ligante é específico para o referido ácido nucléico tumoral ou antígeno tumoral. Em uma modalidade, o referido ligante de ácido nucléico tumoral ou antígeno tumor reduz o crescimento de células tumorais e/ou induz a morte das células tumorais e, portanto, tem um efeito inibidor tumoral ou destruidor de tumores.
[0036] De acordo com um aspecto da invenção, a identificação dos ácidos nucléicos tumorais e antígenos tumorais torna possível o desenvolvimento de imunoterapias específicas com base no ataque de células tumorais tendo os antígenos identificados, atrasando ou impedindo o desenvolvimento de uma doença tumoral ou erradicando células tumorais. A imunoterapia engloba uma variedade de intervenções e técnicas com o objetivo comum de destruir células tumorais provocando respostas imunes. Uma variedade de abordagens clínicas utilizando estes ácidos nucléicos e antígenos são possíveis, como resumido a seguir. Abordagens para imunoterapia de câncer podem ser divididas em duas categorias: ativa e passiva. A imunoterapia ativa pode envolver a imunização direta de pacientes com antígenos ou ácidos nucléicos codificando estes antígenos em uma tentativa de aumentar a resposta imunológica contra o tumor. A imunoterapia passiva se refere à administração de reagentes imunes com o objetivo de mediar diretamente respostas antitumorais. A presente invenção contempla ambas as abordagens.
[0037] Neste sentido, a invenção se refere a uma composição farmacêutica que compreende um ou mais agentes selecionados do grupo consistindo de: (i) um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção ou de um peptídeo de antígeno tumoral derivada do referido antígeno tumoral, ou um derivado do referido peptídeo, (ii) um ácido nucléico que codifica um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um antígeno tumoral identificado de acordo com a presente invenção ou de um peptídeo de antígeno tumoral derivado disse antígeno tumoral, ou um derivado do referido ácido nucléico, (iii) um conjunto de células que codifica um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um antígeno tumoral identificado de acordo com a presente invenção ou de um peptídeo de antígeno tumoral derivado do referido antígeno tumoral, (iv) um vírus que codifica um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um antígeno tumoral identificado de acordo com a presente invenção ou de um peptídeo de antígeno tumoral derivado do referido antígeno tumoral, (v) uma célula apresentando um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um peptídeo de antígeno tumoral derivada de uma antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção, ou um derivado do referido peptídeo, (vi) um anticorpo ou receptor de células T que se liga a um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um antígeno tumoral identificado de acordo com a presente invenção ou de um peptídeo de antígeno tumoral derivado do referido antígeno tumoral, (vii) uma célula imunoreativa sensibilizada in vitro para reconhecer um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um antígeno tumoral identificado de acordo com a presente invenção ou de um peptídeo de antígeno tumoral derivado do referido antígeno tumoral, e (viii) uma célula efetora (ou células-tronco) transduzida com um ácido nucléico codificando um receptor de células T que reconhece um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um antígeno tumoral identificado de acordo com a presente invenção ou de um peptídeo de antígeno tumoral derivado dos referidos antígenos tumorais.
[0038] Em uma modalidade, um peptídeo de acordo com o item (i) é um peptídeo apresentado por antígeno tumoral específico de MHC de classe I ou classe II ou pode ser processado para produzir peptídeo apresentado por antígeno tumoral específico de MHC de classe I ou classe II, de preferência um peptídeo apresentado por antígeno tumoral específico de MHC de classe I. Preferencialmente, o referido peptídeo tem uma sequência substancialmente correspondente a um fragmento de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção que é apresentado por um MHC de classe I ou classe II, o MHC de classe I podendo, de preferência, ser processado para produzir um fragmento de peptídeo tendo tal sequência. Preferencialmente, o referido peptídeo é capaz de estimular uma resposta celular contra um tumor caracterizada pela apresentação de um antígeno tumoral identificado de acordo com a presente invenção com um MHC de classe I e/ou é capaz de estimular uma resposta imune humoral contra um tumor caracterizada pela expressão de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção. Em uma modalidade, o referido peptídeo é composto por uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5, da listagem de sequências, ou um fragmento destas ou uma variante da referida sequência de aminoácidos ou fragmento.
[0039] Em uma modalidade, um ácido nucléico de acordo com o item (ii) codifica para peptídeo apresentado de antígeno tumoral específico de MHC de classe I ou classe II ou codifica para um peptídeo que pode ser processado para produzir um peptídeo apresentado de antígeno tumoral específico de MHC de classe I ou classe II, de preferência um peptídeo apresentado de antígeno tumoral específico de MHC de classe I. Preferencialmente, o referido peptídeo tem uma sequência substancialmente correspondente a um fragmento de um antígeno tumoral identificado de acordo com a presente invenção que é apresentado por um MHC de classe I ou classe II, de preferência um MHC de classe I, ou pode ser processado para produzir um fragmento de peptídeo tendo tal sequência. Preferencialmente, o referido peptídeo é capaz de estimular uma resposta celular contra um tumor caracterizada pela apresentação de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção com um MHC de classe I e/ou é capaz de estimular uma resposta imune humoral contra um tumor caracterizada pela expressão de um antígeno tumoral identificado de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, o referido peptídeo é composto por uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5, da listagem de sequências, ou um fragmento destas ou uma variante da referida sequência de aminoácidos ou fragmento. Os ácidos nucléicos podem estar presentes em um plasmídeo ou em um vetor de expressão e podem ser funcionalmente ligados a um promotor.
[0040] Em uma modalidade, uma célula hospedeira de acordo com o item (iii) codifica para um peptídeo apresentado de antígeno tumoral específico de MHC de classe I ou classe II ou codifica para um peptídeo que pode ser processado para produzir um peptídeo apresentado de antígeno tumoral específico de MHC de classe I ou classe II, de preferência um peptídeo apresentado de antígeno tumoral específico de MHC de classe I. Preferencialmente, o referido peptídeo tem uma sequência substancialmente correspondente a um fragmento de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção que é apresentado por um MHC de classe I ou classe II, de preferência um MHC de classe I, ou pode ser processado para produzir um fragmento de peptídeo tendo tal sequência. Preferencialmente, o referido peptídeo é capaz de estimular uma resposta celular contra um tumor caracterizada pela apresentação de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção com um MHC de classe I e/ou é capaz de estimular uma resposta imune humoral contra um tumor caracterizada pela expressão de um antígeno tumoral identificado de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, o referido peptídeo é composto por uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5, da listagem de sequências, ou um fragmento destas ou uma variante da referida sequência de aminoácidos ou fragmento. A célula hospedeira pode ser uma célula recombinante e pode secretar o peptídeo codificado ou um produto processado, pode expressá-lo na superfície e, de preferência, adicionalmente pode expressar uma molécula que se liga ao referido peptídeo MHC ou a um produto processado do mesmo e, de preferência, apresenta o referido peptídeo ou um produto processado na superfície da célula. Em uma modalidade, a célula hospedeira expressa a molécula de MHC endogenamente. Em uma modalidade adicional, a célula hospedeira expressa a molécula de MHC e/ou o peptídeo ou o produto processado deste de uma forma recombinante. A célula hospedeira é, de preferência, não proliferativa. Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira é uma célula apresentadora de antígeno, em particular uma célula dendrítica, um monócito ou macrófago.
[0041] Em uma modalidade, um vírus de acordo com o item (iv) codifica para um peptídeo apresentado de antígeno tumoral específico de MHC de classe I ou classe II ou codifica para um peptídeo que pode ser processado para produzir um peptídeo apresentado de antígeno tumoral específico de MHC de classe I ou classe II, de preferência um peptídeo apresentado de antígeno tumoral específico de MHC de classe I. Preferencialmente, o referido peptídeo tem uma sequência substancialmente correspondente a um fragmento de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção que é apresentado por um MHC de classe I ou classe II, de preferência um MHC de classe I, ou pode ser processado para produzir um fragmento de peptídeo tendo tal sequência. Preferencialmente, o referido peptídeo é capaz de estimular uma resposta celular contra um tumor caracterizada pela apresentação de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção com um MHC de classe I e/ou é capaz de estimular uma resposta imune humoral contra um tumor caracterizada pela expressão de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção. Em uma modalidade, o referido peptídeo é composto por uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5, da listagem de sequências, ou um fragmento destas ou uma variante da referida sequência de aminoácidos ou fragmento.
[0042] Em uma modalidade, uma célula de acordo com o item (v) expressa endogenamente uma molécula de MHC. Em ainda outra modalidade, a célula expressa recombinantemente uma molécula de MHC e/ou um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um peptídeo de antígeno tumoral derivada de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção. De preferência, a célula apresenta o peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um peptídeo de antígeno tumoral derivada de um antígeno tumoral identificado de acordo com a presente invenção ou um derivado do referido peptídeo por moléculas de MHC em sua superfície.
[0043] De preferência, o peptídeo apresentado é um peptídeo tendo uma sequência substancialmente correspondente a um fragmento de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção que é apresentado por um MHC de classe I ou classe II, de preferência um MHC de classe I. A célula é, de preferência, não proliferativa. Em uma modalidade preferida, a célula é uma célula apresentadora de antígenos como uma célula dendrítica, um monócito ou macrófago. Assim, em uma modalidade preferida, a célula de acordo com o item (v) é uma célula apresentadora de antígenos, que compreende um peptídeo de antígeno tumoral, como aqui descrito, apresentado com um MHC de classe I.
[0044] Em uma modalidade, um anticorpo de acordo com o item (vi) é um anticorpo monoclonal. Em modalidades adicionais, o anticorpo é um anticorpo quimérico humano ou humanizado ou é um fragmento de um anticorpo ou um anticorpo sintético. O anticorpo pode ser acoplado a uma porção terapêutica efetora ou a um marcador detectável. De preferência, o receptor de células T ou os anticorpos de acordo com o item (vi) se ligam a uma sequência de peptídeo substancialmente correspondente a um fragmento de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção. Em uma modalidade, o referido anticorpo ou receptor da célula T se liga a um peptídeo composto por uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5, da listagem de sequências, ou um fragmento destas ou uma variante da referida sequência de aminoácido ou fragmento.
[0045] De preferência, uma célula de acordo com o item (vii) se liga a uma sequência, no peptídeo, substancialmente correspondente a um fragmento de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção em que o fragmento é, de preferência, apresentado por um MHC de classe I ou classe II, de preferência um MHC de classe I. Em uma modalidade, uma célula de acordo com o item (vii) é obtida por um método compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma amostra contendo as células imunorreativas, seja obtida a partir de um paciente ou de outro indivíduo da mesma espécie, em um determinado indivíduo saudável ou em um indivíduo de uma espécie diferente; (b) contactar a referida amostra com células apresentando um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos substancialmente correspondente a um fragmento de um antígeno tumoral identificado de acordo com a presente invenção, ou um derivado do referido peptídeo, em condições que favorecem a produção de CTLs contra o referido peptídeo; e (c) introduzir os CTLs no paciente em uma quantidade adequada para lise de células expressando o antígeno tumoral e, de preferência, apresentá-lo com um MHC de classe I, como as células tumorais.
[0046] Em uma modalidade, o método inclui a clonagem do receptor de células T de CTLs obtidos e a transferência do ácido nucléico que codifica o receptor de células T de células efetoras, tais como CTLs ou CTLs imaturos, sejam obtidas a partir do referido paciente ou de outro indivíduo da mesma espécie, em um determinado indivíduo saudável ou um indivíduo de uma espécie diferente, em que as células efetoras, assim, recebem a especificidade desejada e podem ser introduzidas no paciente. Células efetoras de acordo com o item (viii) podem ser produzidas desta maneira.
[0047] A vacinação por meio de agentes, como descrita acima, pode fornecer epitopos apresentados de um MHC de classe II que são capazes de provocar uma resposta auxiliar das células T CD4+ e/ou resposta das células T CD8+ contra antígenos tumorais identificados de acordo com a presente invenção, em particular se expressos em células tais como as células tumorais. Alternativamente, ou adicionalmente, a vacinação por meio de agentes, como descrita acima, pode fornecer epitopos apresentados de um MHC de classe I que são capazes de provocar uma resposta de células T CD8+ contra antígenos tumorais identificados de acordo com a invenção, em particular se expressos em células como as células tumorais. Além disso, a vacinação por meio de agentes, como descrita acima, pode provocar anticorpos específicos para um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção.
[0048] Em uma modalidade, a composição farmacêutica da presente invenção é uma vacina anti-tumor terapêutica ou profilática, de preferência compreendendo ainda um agente imunomodulador ou uma codificação de ácidos nucléicos do mesmo. Em uma modalidade, o agente imunomodulador é um agonista de uma molécula de co-estimulação positiva, por exemplo, uma proteína de fusão Ig capaz de efetuar a co- estimulação de um CTL. Em outra modalidade, o agente de co- estimulação é um antagonista de uma molécula de co- estimulação negativa, por exemplo um anticorpo capaz de reduzir a inibição da co-estimulação de CTL. Em uma modalidade preferida, o agente imunomodulador é um anticorpo anti-CTLA4.
[0049] Uma composição farmacêutica da presente invenção pode compreender um transportador farmaceuticamente aceitável e pode opcionalmente compreender um ou mais adjuvantes, estabilizantes e semelhantes.
[0050] Outro aspecto da invenção envolve a utilização de agentes e composições aqui descritos para um tratamento profilático e/ou terapêutico de doenças tumorais.
[0051] Em um aspecto, a invenção fornece métodos terapêuticos e profiláticos para tratar um paciente que tem uma doença tumoral ou em risco de desenvolver uma doença tumoral. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para inibir o crescimento tumoral. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para induzir a morte das células tumorais.
[0052] De preferência, a doença tumoral é um câncer, de preferência selecionado do grupo consistindo de: câncer de ovário, em particular adenocarcinoma de ovário e teratocarcinoma de ovário, câncer de pulmão, incluindo câncer de pulmão de células pequenas (CPPC) e câncer de pulmão de células não-pequenas (CPNPC), carcinoma de pulmão de células escamosas e adenocarcinoma, em particular, câncer gástrico, câncer de mama, câncer hepático, câncer pancreático, câncer de pele, carcinoma de células basais e, em particular, carcinoma espinocelular, melanoma maligno, câncer de cabeça e pescoço, em especial adenoma pleomórfico maligno, sarcoma, sarcoma sinovial particular e carcinossarcoma, câncer do duto biliar, câncer de bexiga, em especial o carcinoma de células de transição e carcinoma papilar, câncer de rim, em especial o carcinoma de células renais, incluindo carcinoma de células claras de célula renal e carcinoma de célula renal papilar, câncer de cólon, câncer de intestino delgado, incluindo o câncer do íleo, adenocarcinoma do intestino, em particular delgado e adenocarcinoma do íleo, carcinoma testicular embrionário, coriocarcinoma da placenta, câncer cervical, câncer testicular, seminoma testicular, em especial teratoma testicular e câncer testicular embrionário e câncer uterino, e as formas metastáticas dos mesmos. Em uma modalidade, a doença de câncer é selecionada do grupo consistindo de: câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer ovariano metastático e câncer de pulmão metastático. De preferência, o câncer de ovário é um carcinoma ou um adenocarcinoma. De preferência, o câncer de pulmão é um carcinoma ou um adenocarcinoma e, de preferência, é o câncer bronquiolar, como um carcinoma bronquiolar ou adenocarcinoma bronquiolar. Em uma modalidade, a célula tumoral é uma célula de um destes cânceres.
[0053] De preferência, os agentes e as composições aqui descritos são administrados de tal forma que a substância terapeuticamente ativa não é entregue ou não é substancialmente apresentada a um tecido ou órgão no qual, quando o tecido ou órgão é livre de tumores, as células substancialmente expressam um antígeno tumoral identificado de acordo à invenção e/ou um ácido nucléico tumoral identificado de acordo com a invenção, tais como o tecido da placenta. Para este fim, os agentes e composições descritos neste relatório descritivo podem ser administrados localmente. De preferência, os agentes e as composições são aplicados ao ovário e/ou nos pulmões.
[0054] De acordo com várias modalidades, os métodos da invenção compreendem a administração de um inibidor de expressão e/ou atividade de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção, de um ligante de um ácido nucléico tumoral ou de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção e/ou de um ou mais agentes imunoterápicos como aqui descritos. Em uma modalidade, os métodos envolvem a administração de uma composição farmacêutica como aqui descrita a um paciente e, de preferência, a vacinação de um paciente com uma vacina anti-tumoral aqui descrita. Qualquer método de vacinação, dentre a grande variedade de métodos, conhecido no estado da técnica pode ser utilizado de acordo com a presente invenção. As vacinas anti-tumorais da presente invenção são preferencialmente capazes de induzir ou promover a atividade CTL contra um tumor caracterizada pela apresentação de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção com um MHC de classe I. Estas podem ser utilizadas em combinação com adjuvantes, o que facilita a estimulação do sistema imunológico, agindo sobre as células T diretamente ou através de APCs. Adjuvantes incluem substâncias imunomoduladoras tendo um efeito imunomodulador positivo, como aqui descrito.
[0055] Em várias modalidades, os métodos da presente invenção envolvem a estimulação de uma resposta anti-tumoral CTL contra células tumorais expressando um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção e, de preferência, apresentando um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção com um MHC de classe I, a inibição do crescimento de células tumorais expressando um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção e, de preferência, apresentando um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção com um MHC de classe I e/ou a indução da morte de células que expressam um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção e, de preferência, apresentando um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção com um MHC de classe I.
[0056] Em um aspecto, a presente invenção proporciona um inibidor de expressão e/ou atividade de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção, um ligante de um ácido nucléico tumoral ou de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção e/ou um ou mais agentes imunoterápicos como aqui descritos para o uso nos métodos de tratamento aqui descritos. Em uma modalidade, a invenção fornece uma composição farmacêutica como aqui descrita para o uso nos métodos de tratamento aqui descritos.
[0057] Os tratamentos baseados no direcionamento de tumores de ácidos nucléicos ou antígenos tumorais, como as imunoterapias aqui descritas, podem ser combinados com ressecção cirúrgica e/ou radioterapia e/ou quimioterapia tradicional.
[0058] Outro objeto da presente invenção é o de fornecer métodos para detecção, diagnóstico ou monitoramento, ou seja, para se determinar a regressão, a progressão do curso e/ou o aparecimento de uma doença tumoral. Preferencialmente os referidos métodos envolvem o uso de ligantes, tais como anticorpos monoclonais e sondas de ácidos nucléicos que se ligam especificamente a uma molécula-alvo. Moléculas-alvo adequados são: (i) um ácido nucléico tumoral identificado de acordo com a invenção, (ii) um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção ou um peptídeo derivado de antígeno tumoral, (iii) um anticorpo contra um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção ou um peptídeo derivado de antígeno tumoral, (iv) uma célula T que reconhece um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção ou um peptídeo derivado de antígeno tumoral e/ou (v) uma célula que apresenta um peptídeo derivado de antígeno tumoral de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção com um MHC de classe I ou classe II, de preferência um MHC de classe I. Tais métodos podem ser usados para detectar se um sujeito tem ou possui risco (elevado ) de desenvolver uma doença tumoral, ou, por exemplo, se um regime de tratamento está sendo eficiente.
[0059] Assim, a presente invenção refere-se a métodos para detecção, diagnóstico ou monitoramento de uma doença tumoral que compreende a detecção e/ou a determinação da quantidade de um ou mais parâmetros selecionados do grupo consistindo de: (i) um ácido nucléico que compõe a sequência de ácidos nucléicos de um ácido nucléico tumoral identificado de acordo com a invenção / um ácido nucléico que codifica um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção, (ii) um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção ou de um peptídeo de antígeno tumoral derivado do referido antígeno tumoral, (iii) um anticorpo que se liga a um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção ou de um peptídeo antígeno tumoral derivado do referido antígeno tumoral, (iv) uma célula T que reconhece um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção ou de um peptídeo de antígeno tumoral derivado do referido antígeno tumoral e/ou (v) uma célula que apresenta um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um peptídeo de antígeno tumoral derivado de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção com um MHC de classe I ou classe II, de preferência um MHC de classe I, em uma amostra biológica isolada de um paciente, de preferência de um paciente tendo uma doença tumoral, sendo suspeito de ter ou de adoecer com uma doença tumoral ou de ter um potencial para uma doença tumoral.
[0060] Em uma modalidade, um ácido nucléico de acordo com a presente invenção: (i) codifica um peptídeo que é processado para produzir um peptídeo apresentado por antígeno específico tumoral com um MHC de classe I ou classe II, de preferência, um peptídeo apresentado por um antígeno tumoral específico de um MHC de classe I.
[0061] Em uma modalidade, um peptídeo de acordo com o item (ii) é um peptídeo apresentado por um antígeno tumoral específico de um MHC de classe I ou classe II ou pode ser processado para produzir um peptídeo apresentado por antígeno específico tumoral com um MHC de classe I ou classe II, de preferência, peptídeo apresentado por um antígeno tumoral específico com um MHC de classe I.
[0062] De preferência, uma célula T de acordo com o item (iv) reconhece uma sequência no peptídeo substancialmente correspondente a um fragmento de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção que é apresentado por um MHC de classe I ou classe II, de preferência um MHC de classe I.
[0063] Em uma modalidade, uma célula de acordo com o item (v) apresenta o peptídeo MHC de classe I ou classe II, de preferência MHC de classe I, em sua superfície. A célula é, de preferência, não proliferativa. Em uma modalidade preferida, a célula é uma célula apresentadora de antígeno como uma célula dendrítica, um monócito ou macrófago. Assim, em uma modalidade preferida, a célula de acordo com o item (v) é uma célula apresentadora de antígenos, que compreende um peptídeo antígeno tumoral como aqui descrito, apresentada com um MHC de classe I. Em outra modalidade, a célula é uma célula tumoral.
[0064] Em uma modalidade, o ácido nucléico de acordo com o item (i) ou o peptídeo de acordo com o item (ii) é detectado, ou sua quantidade é determinada, in situ em uma célula, de preferência numa célula tumoral.
[0065] Em uma modalidade, o peptídeo de acordo com o item (ii) é detectado, ou sua quantidade é determinada, in situ na superfície de uma célula, seja incorporada na membrana plasmática ou em um complexo com um MHC de classe I ou classe II, de preferência um MHC de classe I.
[0066] De preferência, a doença tumoral que deve ser diagnosticada, detectada ou monitorada usando o método da invenção é uma doença que é o câncer, de preferência selecionado do grupo consistindo de: câncer de ovário, em particular adenocarcinoma de ovário e teratocarcinoma de ovário, câncer de pulmão, incluindo o câncer de pulmão de células pequenas (SCLC) e câncer de pulmão de células não- pequenas (CPNPC), em particular carcinoma do pulmão de células escamosas e adenocarcinoma, câncer gástrico, câncer de mama, câncer hepático, câncer pancreático, câncer de pele, em particular carcinoma de células basais e carcinoma espinocelular maligno, melanoma, câncer de cabeça e pescoço, em particular sarcoma pleomórfico e adenoma maligno, em particular sarcoma sinovial, carcinossarcoma, câncer do duto biliar, câncer de bexiga, em especial o carcinoma de células de transição e carcinoma papilar câncer de rim, em especial carcinoma de células renais, incluindo carcinoma de célula renal clara e carcinoma de célula renal papilar, câncer de cólon, câncer de intestino delgado, incluindo o câncer do íleo, em particular adenocarcinoma do intestino delgado e adenocarcinoma do íleo, carcinoma testicular embrionário, coriocarcinoma da placenta, câncer cervical, câncer testicular, em particular seminoma testicular, teratoma testicular e câncer testicular embrionário e câncer de útero, e as formas metastático dos mesmos.
[0067] Em uma modalidade do método para detecção, diagnóstico ou monitoramento de uma doença tumoral de acordo com a invenção, uma amostra biológica e/ou uma amostra de controle / referência é uma amostra de um tecido ou órgão correspondente ao tecido ou órgão que deve ser diagnosticado, detectado ou monitorado com relação a ser afetado por uma doença tumoral, por exemplo a doença tumoral que deve ser diagnosticada, detectada ou monitorada é o câncer de ovário e a amostra biológica e/ou controle / referência é uma amostra de tecido ovariano. Tais tecidos e órgãos são descritos aqui, por exemplo, em conexão com diferentes doenças tumorais e câncer.
[0068] Em uma modalidade dos métodos para detecção, diagnóstico ou monitoramento de uma doença tumoral, a amostra biológica é uma amostra de um tecido ou órgão no qual as células, quando o tecido ou órgão é livre de tumores, não substancialmente expressam um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção e/ou um ácido nucléico tumoral identificados de acordo com a invenção. Preferencialmente, o referido tecido é um tecido diferente do tecido da placenta. Preferencialmente, o referido tecido é tecido de ovário, pulmão, mama, duodeno, pele, cólon, fígado, nódulos linfáticos, estômago, baço, rins, esôfago, reto, pâncreas, endométrio, vesícula biliar, cérebro, bexiga, glândula do íleo adrenal e músculo esquelético, de preferência de um tecido do ovário ou do tecido do pulmão.
[0069] De acordo com a presente invenção, um antígeno tumoral e/ou um ácido nucléico tumoral não é substancialmente expresso se o nível de expressão é menor em relação à expressão em células de placenta ou tecido de placenta e/ou é menor em relação à expressão em células de ovário tumorais e/ou células pulmonares tumorais ou tecido do tumor de ovário e/ou tecido do tumor de pulmão. De preferência, o nível de expressão é menor do que 10%, de preferência menor do que 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1% ou 0,05%, ou ainda menor, em comparação com as células ou tecidos acima. De preferência, um antígeno tumoral e/ou um ácido nucléico não é substancialmente expresso se o nível de expressão está abaixo do limite de detecção.
[0070] Os métodos para detecção, diagnóstico ou monitoramento permitem avaliações quantitativas e/ou qualitativa, medidas, por exemplo, absolutas e/ou relativas de moléculas-alvo, por exemplo, níveis de expressão de um ácido nucléico tumoral ou de um antígeno tumoral.
[0071] Meios para atingir a referida detecção e/ou determinação da quantidade são aqui descritos e serão aparentes para um técnico no assunto.
[0072] De preferência, a detecção e/ou a determinação de quantidade nos métodos da presente invenção compreende: (i) contatar uma amostra biológica com um agente que se liga especificamente ao ácido nucléico, peptídeo, anticorpo, célula T ou a uma célula que é para ser detectado e/ou cuja quantidade deve ser determinada, e (ii) detectar a formação e/ou determinar a quantidade de um complexo entre o agente e o ácido nucléico, peptídeo, anticorpo, célula T ou célula que deve ser detectado ou cuja quantidade deve ser determinada.
[0073] Normalmente, o nível de uma molécula-alvo em uma amostra biológica é comparado com um nível de referência, onde um desvio do referido nível de referência é indicativo da presença e/ou do estágio de uma doença tumoral em um sujeito. O nível de referência pode ser um nível determinado em uma amostra de controle (por exemplo, a partir de um tecido ou sujeito saudável) ou um nível médio de indivíduos saudáveis. O termo “desvio” do referido nível de referência designa qualquer mudança significativa, como um aumento ou diminuição de pelo menos 10%, 20%, ou 30%, de preferência pelo menos 40% ou 50%, ou até mais. Preferencialmente, a presença do ácido nucléico, peptídeo, anticorpo, célula T e/ou célula na referida amostra biológica ou uma quantidade de ácido nucléico, peptídeo, anticorpo, célula T e/ou célula da amostra biológica que é aumentada em comparação com um nível de referência, indica a presença de uma doença tumoral.
[0074] Normalmente, a detecção e/ou determinação da quantidade nos métodos da presente invenção envolve o uso de ligantes marcados que se ligam especificamente a uma molécula-alvo, por exemplo, uma sonda de ácido nucléico que hibridiza marcadores em um ácido nucléico alvo e/ou um anticorpo marcado ou fragmento / derivado que se liga especificamente a um peptídeo alvo.
[0075] De acordo com a invenção, a detecção de um ácido nucléico ou a determinação da quantidade de um ácido nucléico podem ser realizadas utilizando-se métodos conhecidos de detecção de ácidos nucléicos, tais como métodos que envolvem técnicas de hibridização ou amplificação de ácido nucléico. Em uma modalidade, transcrições de mRNA são detectadas ou a quantidade das mesmas é determinada utilizando-se RT-PCR ou análise de Northern blot.
[0076] Tais métodos de detecção de ácidos nucléicos podem envolver o uso de oligonucleotídeos para a hibridação de ácidos nucléicos alvo. Oligonucleotídeos adequados normalmente variam em comprimento a partir de cinco até várias centenas de nucleotídeos, mais tipicamente de cerca de 20 a 70 nucleotídeos de comprimento ou mais curtos, ainda mais tipicamente de cerca de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento.
[0077] De acordo com a presente invenção, a detecção de um peptídeo ou a determinação da quantidade de um peptídeo pode ser realizada por diversas maneiras incluindo, mas não limitadas a, imunodetecção utilizando-se uma ligação do anticorpo especificamente ao referido peptídeo. De preferência, o anticorpo se liga a uma sequência substancialmente correspondente a um fragmento de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção. Em uma modalidade, a referida sequência compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5, da listagem de sequências, ou um fragmento destas, ou uma variante da referida sequência de aminoácidos ou fragmento.
[0078] Métodos para utilizar os anticorpos para detectar os peptídeos são bem conhecidos e incluem ELISA, ensaios de ligação competitiva e semelhantes. Em geral, tais ensaios utilizam um fragmento de anticorpo ou anticorpo que se liga especificamente ao peptídeo alvo direta ou indiretamente vinculado a um marcador que permite a detecção, por exemplo, enzimas indicadoras, radio-marcadores, fluoróforos, ou partículas paramagnéticas.
[0079] De acordo com a invenção, a detecção de um anticorpo ou a determinação da quantidade de um anticorpo pode ser realizada através de um peptídeo de ligação especificamente para os referidos anticorpos.
[0080] Células T podem ser isoladas do sangue periférico do paciente; gânglios linfáticos; amostras de tecidos, tais como derivados de biópsia e ressecção; ou de outras fontes. Ensaios de reatividade podem ser realizados em células T primárias ou em outros derivados apropriados. Por exemplo, as células T podem ser fundidas para gerar hibridomas. Os ensaios para medição de resposta das células T são conhecidos no estado da técnica e incluem ensaios de proliferação e testes de liberação de citocinas.
[0081] Em uma modalidade, a célula T que reconhece um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um antígeno tumoral identificado de acordo com a presente invenção ou de um peptídeo de antígeno tumoral derivado do referido antígeno tumoral é um tumor CTL antígeno- responsivo.
[0082] CTLs podem ser detectados e sua quantidade determinada de várias maneiras incluindo as seguintes modalidades preferidas, mas não sendo a estas limitadas. Em uma modalidade, CTLs são diretamente coradas utilizando-se um antígeno tumoral de tetrâmero peptídeo / MHC fluorescente adequado. Em outra modalidade, um “ensaio TRAP” (de reconhecimento de APCs de células T por transferência proteína) é usado (ver, por exemplo, Beadling et al. Nature Medicine 12:1208 (2006)). Em outra modalidade, a detecção de células T em amostras de sangue é realizada utilizando-se métodos descritos por Yuan et al. (Cytotherapy 8:498, 2006). Os ensaios e os índices de detecção de células T reativas são conhecidos e incluem, mas não estão limitados a, o uso de ELISPOT com IFN-gama e coloração de citocinas intracelularescom IFN-gama.
[0083] Vários outros métodos são conhecidos no estado da técnica para determinar se um clone de células T irá responder a um peptídeo antigênico particular. Tipicamente, o peptídeo é adicionado a uma suspensão de células T por um período de 1 a 3 dias. A resposta das células T pode ser medida por proliferação, por exemplo captação de timidina marcada, ou por liberação de citocinas, por exemplo IL-2. Várias análises estão disponíveis para detectar a presença de citocinas liberadas.
[0084] Ensaios com células T citotóxicas podem ser usados para detectar células T citotóxicas tendo especificidade para antígenos tumorais. Em uma modalidade, as células T citotóxicas são testadas para sua capacidade de matar células-alvo apresentando peptídeo de antígeno tumoral com moléculas de MHC de classe I. Células-alvo apresentando peptídeo de antígeno tumoral podem ser marcadas e adicionadas a uma suspensão de células T de uma amostra do paciente. A citotoxicidade pode ser medida pela quantificação do lançamento do marcador a partir de células lisadas. Controles para liberação espontânea e total podem ser incluídos no ensaio.
[0085] Uma célula apresentando um peptídeo pode ser detectada e sua quantidade determinada através de testes para sua capacidade de induzir uma resposta celular, por exemplo para ativar células T, ou pela medida da lise das células por CTLs tendo especificidade para células.
[0086] A presença do referido ácido nucléico, do referido peptídeo, dos referidos anticorpos, das referidas células T e/ou referidas células que deverão ser detectados e/ou a quantidade de que deve ser determinada e/ou uma quantidade dos referidos ácido nucléico, peptídeo, anticorpos, células T e/ou célula que são aumentados em comparação com um nível de referência, por exemplo quando comparado a um paciente sem uma doença tumoral, pode indicar a presença ou risco de (ou seja, um potencial para um desenvolvimento de) uma doença tumoral no referido paciente. Em uma modalidade, a presença dos referidos ácido nucléico, peptídeo, anticorpos, células T e/ou célula que deverão ser detectados e/ou a quantidade de que deve ser determinada e/ou uma quantidade do referido ácido nucléico, peptídeo, anticorpos, células T e/ou célula que é aumentada em comparação com um nível de referência, por exemplo, quando comparado a um paciente sem uma doença tumoral, pode indicar a presença ou risco para o câncer metastático como o câncer ovariano metastático ou câncer de pulmão metastático.
[0087] Em uma modalidade, a amostra biológica é de um tecido ou órgão no qual, quando o tecido ou órgão é livre de tumores, as células substancialmente não expressam um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção e/ou um ácido nucléico tumoral identificado de acordo com a invenção. A indicação, pelos métodos da invenção, da presença ou risco para uma doença tumoral em um paciente pode indicar que a doença tumoral se encontra no referido tecido ou no referido órgão ou que o referido tecido ou órgão apresenta risco de desenvolver a referida doença tumoral.
[0088] Em uma modalidade, a amostra biológica é uma amostra de um tecido ou órgão no qual as células, quando o tecido ou órgão é livre de tumores, substancialmente não expressam um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção e/ou um ácido nucléico tumoral identificado de acordo com a invenção e o tecido ou órgão, opcionalmente, já foi diagnosticado como sendo afetado por uma doença tumoral, por exemplo, por inspeção visual ou teste de cultura de células do mesmo tecido ou órgão. Nesta modalidade, a presença dos referidos ácido nucléico, peptídeo, anticorpos, células T e/ou célula que deverão ser detectados e/ou cuja quantidade deve ser determinada e/ ou uma quantidade dos referidos ácido nucléico, peptídeo, anticorpos, células T e/ou célula que é aumentada em comparação com um nível de referência, por exemplo, quando comparado a um paciente sem uma doença tumoral, pode indicar que a doença tumoral é um câncer ovariano metastático ou câncer de pulmão metastático. Amostras biológicas preferidas para tais testes podem incluir um tecido que é conhecido por ser suscetível a tais tipos de câncer metastático. Tais tecidos são aqui descritos.
[0089] A indicação da presença de ou de risco para câncer ovariano metastático ou câncer de pulmão metastático em um paciente pelos métodos da invenção também pode indicar a presença ou um risco para câncer de ovário e câncer de pulmão em um referido paciente.
[0090] Os métodos para detecção, diagnóstico ou monitoramento de uma doença tumoral de acordo com a presente invenção também incluem modalidades em que pela detecção ou determinação da quantidade dos referidos ácido nucléico, peptídeo, anticorpos, células T e/ou célula é possível avaliar e/ou obter um prognóstico do comportamento metastático de uma doença tumoral onde, de preferência, a presença dos referidos ácido nucléico, peptídeo, anticorpos, células T e/ou célula e/ou uma quantidade dos referidos ácido nucléico, peptídeo, anticorpos, células T e/ou célula que é aumentada em comparação com um nível de referência, por exemplo, um paciente sem a referida doença ou sem metástase da referida doença, pode indicar um comportamento metastático de uma doença tumoral ou um risco para um comportamento metastático de uma doença tumoral.
[0091] Em uma modalidade, a amostra biológica é uma amostra de um tecido ou órgão no qual as células, quando o tecido ou órgão é livre de tumores, substancialmente não expressa um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção e/ou um ácido nucléico tumoral identificado de acordo com a invenção. Em uma modalidade, a doença do tumor se dá nos referido tecido ou órgão.
[0092] Os métodos de monitoramento de acordo com a invenção, de preferência, compreendem a detecção e/ou determinação da quantidade de um ou mais dos parâmetros acima mencionados em uma primeira amostra em um primeiro ponto no tempo e em uma segunda amostra de um segundo ponto no tempo, onde o aparecimento de regressão, de progressão do curso e/ou de uma doença tumoral pode ser determinado pela comparação das duas amostras.
[0093] A quantidade dos referidos ácido nucléico, peptídeo, anticorpos, células T e/ou célula que é diminuída em uma amostra biológica, em comparação com uma amostra biológica tomada anteriormente de um paciente, podem indicar uma regressão; um caminho positivo, por exemplo um tratamento bem sucedido, ou uma redução do risco de aparecimento de uma doença tumoral no referido paciente.
[0094] Em uma modalidade, a amostra biológica é uma amostra de um tecido ou órgão no qual as células, quando o tecido ou órgão é livre de tumores, substancialmente não expressa um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção e/ou um ácido nucléico tumoral identificado de acordo com a invenção. Em uma modalidade, a doença tumoral se dá no referido tecido ou órgão.
[0095] A quantidade dos referidos ácido nucléico, peptídeo, anticorpos, células T e/ou célula que é aumentada em uma amostra biológica, em comparação com uma amostra biológica tomada anteriormente de um paciente, pode indicar uma progressão; um curso negativo, por exemplo, um tratamento sem sucesso; recorrência; ou comportamento metastático ou um início ou um risco de início de uma doença tumoral no referido paciente.
[0096] Em uma modalidade, a amostra biológica é uma amostra de um tecido ou órgão no qual as células, quando o tecido ou órgão é livre de tumores, substancialmente não expressa um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção e /ou um ácido nucléico tumoral identificado de acordo com a invenção. Em uma modalidade, a doença tumoral se dá no referido tecido ou órgão.
[0097] Em um aspecto particular, a invenção se refere a um método de detecção, ou seja, de se determinar a posição ou local de uma doença tumoral, por exemplo, um tecido ou órgão em especial. Em uma modalidade, o referido método compreende administrar um anticorpo que se liga a um antígeno tumoral identificado de acordo com a presente invenção e que é acoplado a um marcador detectável a um paciente. Em uma modalidade, o referido anticorpo liga-se a um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5, da listagem de sequências, ou a um fragmento destas ou e uma variante das referidas sequências de aminoácidos ou fragmento. O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal. Em modalidades adicionais, o anticorpo é um anticorpo quimérico humano ou humanizado, um fragmento de um anticorpo ou um anticorpo sintético.
[0098] A rotulagem de um tecido ou órgão no referido paciente pode indicar a presença ou risco para uma doença tumoral no referido tecido ou órgão.
[0099] Em uma modalidade, o tecido ou órgão é um tecido ou órgão no qual as células, quando o tecido ou órgão é livre de tumores, substancialmente não expressa um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção e/ou um ácido nucléico tumoral identificado de acordo com a invenção.
[0100] Em uma modalidade, o tecido ou órgão é um tecido ou órgão no qual as células, quando o tecido ou órgão é livre de tumores, substancialmente não expressa um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção e/ou um ácido nucléico tumoral identificado de acordo com a invenção e o tecido ou órgão já foi diagnosticado como sendo afetado por uma doença tumoral, por exemplo, por inspeção visual ou teste de cultura de células do mesmo tecido ou órgão. Nesta modalidade, a rotulagem do tecido ou órgão pode indicar que a doença tumoral é câncer ovariano metastático ou câncer de pulmão metastático.
[0101] A indicação da presença de ou de risco para câncer ovariano metastático ou para câncer de pulmão metastático em um tecido ou órgão pelos métodos da invenção também podem indicar a presença ou o risco para câncer de ovário e câncer de pulmão no paciente.
[0102] De preferência, a doença tumoral avaliada pelos métodos para detecção, diagnóstico ou monitoramento de uma doença tumoral da presente invenção é uma doença tumoral de um tecido diferente do tecido da placenta. Preferencialmente, o referido tecido é um tecido de ovário, pulmão, mama, duodeno, pele, cólon, fígado, nódulos linfáticos, estômago, baço, rins, esôfago, reto, pâncreas, endométrio, vesícula biliar, cérebro, bexiga, glândula do íleo adrenal e músculo esquelético, de preferência de tecido do ovário ou de tecido do pulmão. Em outro aspecto, a doença tumoral é selecionada do grupo consistindo de câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer ovariano metastático e câncer de pulmão metastático.
[0103] Um diagnóstico positivo de uma doença tumoral e/ou de uma doença tumoral metastática e/ou a recorrência de uma doença tumoral, como descrita acima, utilizando-se os métodos da presente invenção pode indicar uma doença tumoral e/ou uma doença tumoral metastático e/ou uma recorrência de uma doença tumoral, que poderá usufruir dos métodos de tratamento aqui descritos.
[0104] Células tumorais circulantes (CTCs) têm sido observadas em derivados de sangue periférico de pacientes com câncer epitelial em ultra baixas concentrações. O número dessas células tem se mostrado correlacionado com o resultado de cortes de pacientes com câncer metastático com doença progressiva no momento da amostragem. Alguns relatórios sugerem um papel prognóstico para células tumorais circulantes em pacientes afetados por câncer de cólon. Consequentemente, um instrumento para medir as células tumorais circulantes poderia ser uma valiosa ferramenta de diagnóstico.
[0105] Os ácidos nucléicos tumorais e antígenos tumorais identificados de acordo com a presente invenção são úteis em métodos para a detecção de células tumorais circulantes em um paciente. Os métodos podem indicar a presença de câncer metastático ou de um câncer em estágio inicial. Em um aspecto do método, a presença de células tumorais circulantes na amostra indica uma probabilidade de recorrência de câncer no sujeito que é um mamífero. Em outro aspecto do método, a presença das células tumorais circulantes na amostra indica um estado de remissão de câncer no sujeito que é um mamífero.
[0106] Assim, a presente invenção se refere a um método para a detecção de células tumorais circulantes em um paciente que compreende a detecção e/ou determinação da quantidade de: (i) um ácido nucléico que compreende a sequência de ácidos nucléicos de um ácido nucléico tumoral identificado de acordo com a presente invenção / um ácido nucléico que codifica um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção e/ou (ii) um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção ou de um peptídeo derivado de antígeno tumoral do referido antígeno tumoral em uma amostra biológica contendo ou suspeita de conter disseminação ou células tumorais circulantes ou metastáticas em células tumorais isoladas do referido paciente. De preferência, o paciente é um paciente tendo uma doença tumoral, sendo suspeito de ter ou de adoecer com uma doença tumoral ou que tenha um potencial para uma doença tumoral.
[0107] Assim, nos métodos para a detecção de células tumorais circulantes da invenção, ácidos nucléicos tumorais identificados de acordo com a invenção e/ou antígenos tumorais identificados de acordo com a invenção ou peptídeos derivados de antígeno tumoral são utilizados como moléculas- alvo para identificar as células que são caracterizadas pela presença das referidas moléculas-alvo. Estas células provavelmente representam células tumorais circulantes.
[0108] Em uma modalidade, o ácido nucléico ou peptídeo é detectado ou tem sua quantidade determinada in situ em uma célula, de preferência uma célula de tumor. Em uma modalidade, o peptídeo é detectado ou tem sua quantidade determinada in situ na superfície de uma célula, seja incorporada na membrana plasmática ou em um complexo com um MHC de classe I ou classe II, de preferência um MHC de classe I. Os meios para realizar a referida detecção e/ou determinação da quantidade de tais moléculas-alvo são descritos neste relatório descritivo e serão aparentes para um técnico no assunto.
[0109] A amostra biológica contendo ou suspeita de conter disseminação ou células tumorais circulantes ou células tumorais metastáticas inclui, por exemplo, sangue, soro, líquido abdominal, medula óssea, escarro, aspirado brônquico, e/ou lavado brônquico.
[0110] Em um aspecto do método, a presença do referido ácido nucléico de acordo com o item (i) e/ou do referido peptídeo de acordo com o item (ii) na referida amostra biológica ou uma quantidade do referido ácido nucléico e/ou do referido peptídeo na referida amostra biológica que é aumentada em comparação com um nível de referência indica a presença de células tumorais circulantes no referido paciente.
[0111] Em um aspecto do método, a presença de células tumorais circulantes na amostra pode indicar a presença ou o risco para uma doença tumoral, em particular doença tumoral metastática em um paciente. Em outro aspecto, a presença de células tumorais circulantes na amostra pode indicar a presença ou o risco para uma doença tumoral em estágio inicial no paciente. Em outro aspecto, a presença de células tumorais circulantes no referido paciente pode indicar a presença ou o risco para uma doença tumoral selecionada do grupo consistindo de câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer ovariano metastático e câncer de pulmão metastático.
[0112] Em modalidades particulares, os métodos da invenção possibilitam avaliar e/ou ter um prognóstico do sucesso de uma terapia contra o câncer que tenha sido administrada ou que será administrada. Em um aspecto do método, a presença das células tumorais circulantes na amostra pode indicar a presença ou risco de metástase do tumor ou recidiva do tumor no paciente. Em outro aspecto do método, a presença das células tumorais circulantes na amostra pode indicar o estado de remissão do tumor no paciente.
[0113] A detecção de células tumorais circulantes usando os métodos para a detecção de células tumorais circulantes da invenção pode indicar uma doença tumoral e/ou uma metástase de uma doença tumoral e/ou uma recaída de uma doença tumoral, que poderão ser tratados com os métodos de tratamento aqui descritos.
[0114] Em um aspecto detalhado, a presença das células tumorais circulantes na amostra pode indicar a presença ou risco de câncer, incluindo,mas não limitado a: linfoma, mieloma, neuroblastoma, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pulmão, rabdomiossarcoma, tumores pulmonares de células pequenas, tumores cerebrais primários, câncer de estômago, câncer de cólon, câncer pancreático, câncer de bexiga, câncer testicular, câncer de tireóide, neuroblastoma, câncer de esôfago, câncer do trato geniturinário, câncer cervical, câncer de endométrio, câncer de córtex adrenal ou câncer de próstata.
[0115] De preferência, este ensaio de células tumorais circulantes é realizado utilizando-se anticorpos dirigidos contra peptídeos alvo em que os referidos anticorpos são detectáveis rotulados. Em uma modalidade particular, este ensaio para células tumorais circulantes é realizado utilizando-se marcação com imunofluorescência através de anticorpos monoclonais contra peptídeos alvo e é preferencialmente realizado em sangue periférico de pacientes. Em uma modalidade, os referidos anticorpos se ligam a um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NOS: 3, 4 e 5, da lista de sequências, ou um fragmento destas ou uma variante da referida sequência de aminoácidos ou fragmento.
[0116] A presença de células tumorais circulantes no sangue pode ser correlacionada com uma doença tumoral metastática ou com um risco para uma doença tumoral metastática e com um mau prognóstico e menor taxa de sobrevivência.
[0117] O método mais confiável atualmente disponível para a detecção de CTCs é a microscopia digital automatizada (ADM), que utiliza a análise de imagem para o reconhecimento de células tumorais imunocitoquimicamente rotuladas. A ADM, no entanto, apresenta desvantagens por sua velocidade de varredura ser muito lenta, de 800 células / segundo; Kraeft et al, Clin Cancer Res 10: 3020-8, 2004. A velocidade de varredura em ADM é limitada pela latência associada ao fato de ter-se que varrer a amostra muitas vezes devido ao limitado campo de visão.
[0118] Para contornar esta restrição de velocidade, diversas tecnologias de enriquecimento de CTCs têm sido desenvolvidas, para reduzir o número total de células que necessitam de digitalização. Até o momento, a mais bem sucedida destas abordagens de enriquecimento é a de enriquecimento imunomagnético (IME), Smirnov et al, Cancer Res 65: 4993-7, 2005; Allard et al, Clin Cancer Res 10: 6897-904, 2004; Cristofanilli et al, N Engl J Med 351: 781 -91, de 2004. Na maioria das implementações de IME, os anticorpos monoclonais conjugados com pequenas esferas magnéticas são direcionados a moléculas de adesão das células epiteliais, EpCAM. As contas são depois manipuladas em campos magnéticos para o enriquecimento.
[0119] Um outro aspecto da invenção refere-se a um método de detecção de células câncer metastático de ovário ou de células de câncer metastático de pulmão em um paciente que compreende a detecção e/ou determinação da quantidade de: (i) um ácido nucléico que compreende a sequência de ácidos nucléicos de uma ácido nucléico tumoral identificado de acordo com a invenção / um ácido nucléico que codifica um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção, e/ou (ii) um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção ou de um peptídeo de antígeno tumoral derivado do referido antígeno tumoral, em uma amostra biológica isolada de um tecido ou órgão do referido paciente tendo um tumor no qual as células, quando o tecido ou órgão é livre de tumores, substancialmente não expressa os referidos ácidos nucléicos ou peptídeos.
[0120] Assim, nos métodos de detecção de células de câncer de ovário metastático ou de células de câncer de pulmão metastático, os ácidos nucléicos tumorais identificados de acordo com a invenção e/ou antígenos tumorais identificados de acordo com a invenção ou peptídeos derivados do antígeno tumoral são usados como moléculas-alvo para identificar células tumorais que são caracterizadas pela presença das referidas moléculas-alvo. Estas células são susceptíveis de representar células de câncer de ovário metastático ou de células de câncer metastático de pulmão. Em uma modalidade, o ácido nucléico ou peptídeo é detectado ou tem sua quantidade determinada in situ em uma célula, de preferência uma célula de tumor.
[0121] Em uma modalidade, o peptídeo é detectado ou tem sua quantidade determinada in situ na superfície de uma célula, seja incorporada na membrana plasmática ou em um complexo com MHC de classe I ou classe II, de preferência um MHC de classe I. Tais meios para realizar a referida detecção e/ou determinação da quantidade de moléculas-alvo, são descritos neste relatório descritivo e serão aparentes para um técnico no assunto.
[0122] De acordo com a presente invenção, um ácido nucléico e/ou um peptídeo não é substancialmente expresso se o nível de expressão é menor em relação à expressão em células de placenta ou tecido placentário e/ou é menor em relação à expressão em células de tumor de ovário e/ou células de tumor de pulmão ou tecido tumoral de ovário e/ou tecido tumoral de pulmão. De preferência, o nível de expressão é menor do que 10%, de preferência menor do que 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1% ou 0,05%, ou ainda menor, em comparação com as células ou tecidos acima. Preferencialmente, um ácido nucléico e/ou um peptídeo não é substancialmente expresso se o nível de expressão se encontra abaixo do limite de detecção.
[0123] De preferência, o tecido é um tecido que não é o tecido da placenta e, de preferência, é um tecido diferente do tecido do ovário ou tecido pulmonar. Preferencialmente, o referido tecido é um tecido de câncer de: mama, duodeno, pele, cólon, fígado, nódulos linfáticos, estômago, baço, rins, esôfago, pâncreas, endométrio, vesícula biliar, cérebro, bexiga, glândula de íleo adrenal, reto e músculo esquelético. De preferência, o referido tecido é um tecido que é conhecido por ser suscetível ao câncer de ovário metastático e/ou câncer de pulmão metastático. Tais tecidos são aqui descritos.
[0124] De preferência, o tecido ou órgão já foi diagnosticado como sendo afetado por uma doença tumoral através de inspeção visual ou de teste de cultura de células do referido tecido do órgão.
[0125] Em um aspecto do método, a presença do referido ácido nucléico de acordo com o item (i) e/ou o referido peptídeo de acordo com o item (ii) na referida amostra biológica ou uma quantidade do referido ácido nucléico e/ ou peptídeo na referida amostra biológica que é aumentada, quando comparada com um nível de referência, indica a presença de células ou de risco para câncer de ovário metastático ou câncer metastático de células de pulmão no referido tecido ou órgão. A presença de células de câncer de ovário metastático ou de células de câncer de pulmão metastático no referido tecido ou órgão também podem indicar a presença ou um risco para câncer de ovário e câncer de pulmão no referido paciente.
[0126] Um diagnóstico positivo de células de câncer de ovário metastático ou de células de câncer de pulmão metastático pode indicar que o tumor do tecido ou órgão do qual a amostra biológica foi isolado é adequado para receber os métodos de tratamento aqui descritos.
[0127] Um objeto maior da presente invenção refere- se a kits de teste de diagnóstico úteis em métodos para detecção, diagnóstico ou monitoramento e nos métodos para a detecção de células tumorais circulantes e/ou nos métodos de detecção de células de câncer de ovário metastático ou de células de câncer de pulmão metastático da invenção. Em uma modalidade, estes kits compreendem um ligante que se liga especificamente a uma molécula-alvo tal como definida acima e, opcionalmente, a um marcador detectável, por exemplo: indicador enzimático, rádio-marcador, fluoróforos ou partículas paramagnéticas. Em uma modalidade particular, o ligante é composto por primers de ácidos nucléicos ou de sondas específicas para ácidos nucléicos alvo, como descritos acima, ou um anticorpo ou um seu derivado específico para um peptídeo destino, conforme descrito acima. Em uma modalidade, o referido anticorpo é específico para um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5, da listagem de sequências, ou um fragmento destas ou uma variante da referida sequência de aminoácidos ou fragmento. Kits podem incluir folhetos informativos, por exemplo, folhetos informando uma forma de utilizar os reagentes para a prática dos métodos divulgados na presente invenção.
[0128] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico recombinante, em particular uma molécula de DNA ou RNA, que compreende um ácido nucléico que codifica um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um antígeno tumoral ou de um peptídeo de antígeno tumoral derivado dos referidos antígenos tumorais.
[0129] A invenção também se refere às células hospedeiras que compreendem uma molécula de ácido nucléico recombinante da presente invenção. De preferência, tais células hospedeiras expressam o peptídeo codificado.
[0130] A célula hospedeira pode ser uma célula recombinante e pode secretar o peptídeo codificado, pode expressá-lo na superfície e, de preferência, adicionalmente pode expressar uma molécula que se liga ao referido peptídeo MHC ou a um produto processado do mesmo. Em uma modalidade, a célula hospedeira expressa a molécula de MHC endogenamente. Em uma modalidade adicional, a célula hospedeira expressa a molécula de MHC e/ou o peptídeo ou o produto processamento deste de uma forma recombinante. A célula hospedeira é, de preferência, não proliferativa. Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira é uma célula apresentadora de antígeno, em particular uma célula dendrítica, um monócito ou macrófago.
[0131] Em outro aspecto, a invenção se refere a um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um antígeno tumoral identificado de acordo com a presente invenção ou de um peptídeo derivado de antígeno tumoral do referido antígeno tumoral, ou um derivado do referido peptídeo. Em uma modalidade, o referido peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5, da listagem de sequências, ou um fragmento destas ou uma variante da referida sequência de aminoácidos ou fragmento.
[0132] Em outro aspecto, a invenção se refere a um agente que se liga a um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção ou de um peptídeo de antígeno tumoral derivado do referido antígeno tumoral, ou um derivado do referido peptídeo. Em uma modalidade, o referido peptídeo é composto por uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5, da listagem de sequências, ou um fragmento destas ou uma variante da referida sequência de aminoácidos ou fragmento. Em uma modalidade preferida, o agente é uma proteína ou peptídeo, em particular um anticorpo, um receptor de células T ou uma molécula de MHC. Em modalidades adicionais, o anticorpo é monoclonal, quimérico, humano ou humanizado, um anticorpo produzido por técnicas de combinatórias, um fragmento de um anticorpo ou um anticorpo sintético.
[0133] A invenção ainda se refere a um conjugado entre um agente da presente invenção que se liga a um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção ou de um peptídeo de antígeno tumoral derivado do referido antígeno tumoral, ou um derivado do referido peptídeo e uma porção terapêutica efetora ou um marcador detectável.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0134] Alguns aspectos da presente invenção contemplam a imunoterapia de doenças tumorais, em particular doenças do câncer, utilizando os ácidos nucléicos tumorais e antígenos tumorais identificados de acordo com a invenção por meio de abordagens imunoterapêuticas ativas ou passivas, que podem ser resumidas como se segue: Imunoterapia I. Imunoterapia ativa (“vacinas contra câncer”)
[0135] Imunização com: i) antígeno ou peptídeo (nativo ou modificado) ii) ácido nucléico que codifica o antígeno ou peptídeo, ou iii) células recombinantes que codificam o antígeno ou peptídeo iv) vírus recombinantes que codificam o antígeno ou peptídeo v) antígeno apresentando células pulsadas com antígeno ou peptídeo (nativo ou modificado), ou transfectadas com ácidos nucléicos que codificam o antígeno ou peptídeo II. Imunoterapia passiva (“imunoterapia adotiva”) vi) transferência de anticorpos ou receptores de células T que reconhecem o antígeno vii) transferência de células sensibilizadas in vitro ao antígeno (populações brutas ou clonadas) viii) transferência de células efetoras (ou células- tronco) transduzidas com ácidos nucléicos que codificam receptores de células T que reconhecem o antígeno e, de preferência, são sensíveis a peptídeos apresentados com MHC de classe I tumor-específicos Nos últimos anos muita atenção tem sido dada ao papel das células T CD8 + na imunidade tumoral. CD8+ CTLs tumor-específicos têm demonstrado serem capazes de lisar células tumorais diretamente e erradicar massas tumorais in vivo em modelos animais. Entretanto, também acredita-se que células T CD4 + desempenham um papel crítico e pode ser que vacinas ideais contra o câncer requiram a participação de ambas as células T CD4+ e CD8+.
[0136] A imunização com o antígeno tumoral intacto ou substancialmente intacto tem a vantagem potencial de imunização simultânea contra epítopos de classe I e classe II, mas requer grandes esforços e a purificação de grandes quantidades de antígenos tumorais é demorada. A identificação de peptídeos de MHC de classe I e classe II dentro de um antígeno tumoral torna possível imunizar-se com altos níveis de peptídeo sintético puro. A abordagem peptídica também tem a vantagem de que se pode escolher entre um tipo de resposta de MHC de classe I e de classe II (ou mistura das duas), escolhendo-se quais epítopos usar. A imunização com peptídeo também significa que os epítopos subdominantes e/ou crípticos podem ser escolhidos (como a necessidade de processamento do antígeno pode ser ignorada ou reduzida a um “papel coadjuvante”) a fim de estimular um subconjunto diferente de células T. Além disso, o peptídeo pode ser modificado (por exemplo, em seus sítios de ancoramento HLA de classe I ou II) para aumentar a sua imunogenicidade.
[0137] A invenção refere-se a peptídeos apresentados com MHC classe I tumor-específicos e a métodos de utilização dos mesmos, assim como a linfócitos T citotóxicos (CTLs) responsivos a peptídeos apresentados com MHC classe I tumor- específicos e a métodos de utilização dos mesmos.
[0138] Em um aspecto, a invenção fornece vacinas anti-tumorais capazes de estimular uma resposta celular contra um tumor caracterizada pela apresentação de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção com um MHC de classe I. As vacinas anti-tumorais da invenção, de preferência, compreendem um peptídeo de antígeno tumoral ou um peptídeo de ácido nucléico de antígeno tumoral.
[0139] A invenção também engloba o uso de ácidos nucléicos codificando um ou mais dos antígenos tumorais identificados de acordo com a invenção ou um ou mais peptídeos derivados de antígenos tumorais. Prevê-se que os antígenos ou peptídeos codificados deste modo sejam eficazes como vacinas anti-tumor terapêuticas ou profiláticas. Por exemplo, uma aplicação específica contemplada destes ácidos nucléicos envolve a indução de uma resposta celular, como uma resposta CTL e/ou uma resposta imune humoral contra tais antígenos.
[0140] A imunização com DNA plasmidial pode provocar respostas imunes antígeno-específicas consistindo de células T CD8+, células T CD4+ e anticorpos. O DNA pode ser administrado pelo método de imunização conhecido como gene gun.
[0141] Na imunização com gene gun, o DNA plasmidial pode ser revestido em partículas de ouro seguido pela apresentação das partículas de DNA revestido na pele por uma alta pressão de um gene gun de hélio.
[0142] Avanços na biologia molecular tornaram possível a construção de vírus recombinantes que codificam antígenos tumorais ou peptídeos de antígeno tumoral como aqui descritos. Várias vacinas recombinantes virais têm sido utilizadas até agora.
[0143] Vários vetores virais têm mostrado resultados promissores com relação ao seu potencial para melhorar a imunoterapia de doenças malignas. Tanto replicação competente quanto replicação de vírus incompetente pode ser utilizada, com o último grupo sendo preferido. Exemplos de vírus úteis preferidos, de acordo com a presente invenção, são: vírus da herpes, adenovírus, vaccinia, reovírus, e vírus da doença de New Castle.
[0144] Células apresentadoras de antígenos (APC), tais como células dendríticas (DCs) podem ser carregadas com peptídeos apresentados com MHC de classe I ou com lisado tumoral, ou transduzidas com ácidos nucléicos tais como por transdução com o adenovírus codificando um antígeno tumoral.
[0145] Em uma modalidade preferida, uma vacina anti- tumoral da invenção compreende um APC carregado com peptídeo de antígeno tumoral. A este respeito, os protocolos podem ser baseados em cultura in vitro / diferenciação das DCs manipuladas de tal maneira que artificialmente apresentem peptídeos de antígeno tumoral. A produção de DCs geneticamente modificadas pode envolver a introdução de ácidos nucléicos codificando antígenos tumorais ou peptídeos de antígeno tumoral em DCs. A transfecção de DCs com mRNA é uma técnica promissora de carregamento de antígeno estimulando uma imunidade anti-tumoral forte.
[0146] As células dendríticas (DCs) são populações de leucócitos que apresentam antígenos capturados em tecidos periféricos para as células T através de ambas as vias de apresentação de antígeno de MHC de classe I e II. É bem sabido que DCs são potentes indutores de resposta imune e que a ativação destas células é um passo crítico para a indução de imunidade antitumoral. A maturação de DC é referida como o status da ativação da DC em que tais DCs apresentadoras de antígenos levam a um priming de células T, enquanto que a sua apresentação por DCs imaturas resultada em tolerância. A maturação de DC é principalmente causada por biomoléculas com recursos microbianos detectados por receptores inatos (DNA bacteriano, RNA viral, endotoxinas, etc), citocinas pró-inflamatórias (TNF, IL-I, IFNs), ligantes de CD40 na superfície de DC por CD40L e substâncias liberadas de células em morte celular estressante. As DCs podem ser obtidas por cultura de células da medula óssea in vitro com citocinas, como granulócitos e fator estimulante de colônia de macrófagos (GM-CSF) e fator de necrose tumoral alfa.
[0147] Ainda outra modalidade da invenção compreende a preparação de anticorpos, de preferência anticorpos monoclonais, contra o antígeno-alvo como definido acima. Tais anticorpos monoclonais podem ser produzidos por métodos convencionais e incluem fragmentos ou seus derivados, incluindo, sem limitação, anticorpos monoclonais humanos, anticorpos monoclonais humanizados, anticorpos monoclonais quiméricos, anticorpos de cadeia única, por exemplo, scFv, e fragmentos de anticorpos de ligação antígenos, como fragmentos Fab e Fab'. Métodos para a preparação de anticorpos monoclonais são conhecidos no estado da técnica. Em geral, a preparação de anticorpos monoclonais compreende a imunização de um hospedeiro adequado, com os antígenos do sujeito, o isolamento de células do sistema imunológico do mesmo, o uso de tais células do sistema imunológico para isolar anticorpos monoclonais e a triagem de anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a qualquer desses antígenos. Fragmentos de anticorpos podem ser preparados por métodos conhecidos como, por exemplo, clivagem enzimática de anticorpos monoclonais.
[0148] Estes anticorpos monoclonais e fragmentos são úteis para imunoterapia anti-tumoral passiva ou podem estar associados à porções terapêuticas efetoras, por exemplo, rádio-marcadores, citotoxinas, enzimas terapêuticas, agentes que induzem a apoptose e similares, a fim de prover citotoxicidade direcionada, ou seja, morte de células tumorais. Em uma modalidade da presente invenção, tais anticorpos ou fragmentos são administrados de forma marcada ou não-rotulada, isoladamente ou em conjunto com outras terapêuticas, por exemplo, quimioterápicos como a cisplatina, metotrexato, adriamicina e semelhantes, adequadas para terapia do câncer.
[0149] Se forem utilizados para imunoterapia anti- tumoral passiva, os anticorpos podem ou não ser associados a porções terapêuticas efetoras. De preferência, os anticorpos aqui descritos mediam a morte de células, induzindo citotoxicidade dependente de complemento (CDC) lise mediada, citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) lise mediada, apoptose, adesão homotípica e/ou fagocitose, de preferência através da indução de CDC lise mediada e/ou ADCC lise mediada. Os anticorpos aqui descritos, de preferência, interagem com os componentes do sistema imune, de preferência através de ADCC ou CDC. No entanto, os anticorpos da invenção podem também exercer um efeito simplesmente ligando-se aos antígenos tumorais na superfície da célula, bloqueando assim, por exemplo, a proliferação das células.
[0150] ADCC descreve a capacidade de células efetoras, como aqui descritas, matarem células, particularmente linfócitos, o que, preferencialmente, requer que a célula-alvo seja marcada por um anticorpo.
[0151] De preferência, a ADCC ocorre quando os anticorpos se ligam aos antígenos em células tumorais e os domínios Fc de anticorpos envolvem receptores Fc (FCR) na superfície de células imunes efetoras. Várias famílias de receptores Fc foram identificadas e as populações de células específicas caracteristicamente expressam receptores Fc definidos. A ADCC pode ser vista como um mecanismo para induzir diretamente um grau variável de destruição do tumor imediato, que leva também a apresentação de antígenos e a uma indução de resposta de células T- tumor-dirigidas. De preferência, a indução in vivo de ADCC vai levar a respostas tumor-dirigidas de células T e a respostas de anticorpos derivadas do hospedeiro.
[0152] CDC é outro método de morte celular que pode ser dirigido por anticorpos. IgM é o isotipo mais eficaz para a ativação do complemento. IgGl e IgG3 também são, ambos, muito eficazes no direcionamento de CDC através da via clássica de ativação de complemento. De preferência, a formação de resultados complexos antígeno-anticorpo nesta cascata revela vários sítios CIQ obrigatórios em estreita proximidade dos domínios CH2 de moléculas de anticorpos que participam como moléculas de IgG (CIQ é um dos três subcomponentes do complemento Cl). Preferencialmente, estes sítios revelados CIQ vinculativos convertem a interação CIQ- IgG, anteriormente de baixa afinidade, em uma interação forte, o que desencadeia uma cascata de eventos envolvendo uma série de proteínas de complemento e outras e que leva à liberação proteolítica de quimiotáticos de células efetoras / agentes ativadores C3a e C5a. De preferência, a cascata de complemento termina na formação de um complexo de ataque à membrana, o que cria poros na membrana celular que por sua vez facilitam a livre passagem de água e solutos para dentro e para fora da célula, podendo levar a apoptose.
[0153] Imunoterapia passiva com células do sistema imunológico (opcionalmente geneticamente modificadas) capazes de reconhecer antígenos tumorais é eficaz na mediação da regressão do câncer em pacientes selecionados. Estas técnicas podem ser baseadas em reativação e expansão ex-vivo de culturas clonadas ou policlonais de células T de tumor reativas. Após o cultivo, as células T podem ser reinfundidas para o paciente, juntamente com IL-2. Técnicas in vitro têm sido desenvolvidas, em que os linfócitos humanos são sensibilizados in vitro de peptídeos de antígeno tumoral apresentados em células apresentadoras de antígenos. Por estimulação in vitro repetitiva, células com uma grande capacidade de reconhecer antígenos tumorais humanos podem ser obtidas. A transferência adotiva dessas células pode ser mais eficaz na mediação de regressão do tumor in vivo do que as células convencionais.
[0154] Em uma modalidade, os linfócitos citotóxicos ou linfócitos tumorais autólogos infiltrados podem ser obtidos de um paciente com câncer. Os linfócitos podem ser cultivados em cultura e expandidos em CLTs tumorais antígeno- responsivas através de cultura na presença de peptídeos de antígeno tumoral apresentados com MHC classe I, sozinho ou em combinação com pelo menos um agente imunomodulador e, de preferência, adicionalmente com citocinas. As CTLs tumorais antígeno-responsivas são então reintroduzidas no paciente em uma quantidade eficaz para reduzir ou eliminar os tumores no paciente.
[0155] Pacientes podem ser pré-estimulados com uma vacina anti-tumoral peptídica antes da coleta de linfócitos, se a resposta existente for inadequada. Espera-se que as CTLs adotivamente transferidas tenham melhor sobrevida com uma infusão de IL-2 em doses entre baixas e intermediárias.
[0156] Por “CTL tumoral antígeno-responsiva” se entende uma célula T CD8+ que é sensível a um peptídeo derivado de antígeno tumoral, o referido antígeno tumoral sendo apresentado com um MHC de classe I, por exemplo, na superfície das células tumorais.
[0157] De acordo com a presente invenção, a resposta CTL pode incluir um fluxo de cálcio sustentado, divisão celular, produção de citocinas como IFN-gama e TNF-alfa, regulação de marcadores de ativação, como CD44 e CD69, e morte citolítica específica do antígeno tumoral expressando as células-alvo. A resposta CTL também pode ser determinada através de um repórter artificial que indica, com precisão, a capacidade de resposta CTL.
[0158] Por “peptídeo de antígeno tumoral” ou “peptídeo de antígeno tumoral derivado de um antígeno tumoral” se entende um oligopeptídeo ou polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos substancialmente correspondente à sequência de aminoácidos de um fragmento de peptídeo ou de um antígeno tumoral identificado de acordo com a presente invenção. De preferência, um peptídeo de antígeno tumoral é capaz de estimular uma resposta celular contra um tumor caracterizada pela apresentação de um antígeno tumoral aqui identificado com um MHC de classe I e, de preferência, uma CLT tumoral antígeno-responsiva e/ou de desencadear anticorpos que se ligam especificamente a um antígeno tumoral identificado de acordo com a presente invenção, quando utilizado em si ou ligado a um transportador imunogênico. Um peptídeo de antígeno tumoral de acordo com a invenção, de preferência, é um peptídeo compreendendo uma sequência substancialmente correspondente à sequência de um fragmento da sequência de amino ácidos de acordo com a SEQ ID NO: 2, da listagem de sequências, ou é um derivado do referido peptídeo. Em uma modalidade, o referido peptídeo composto por uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5, da listagem de sequências, ou um fragmento destas ou uma variante da referida sequência de aminoácidos ou fragmento. Um peptídeo de antígeno tumoral pode ser de qualquer tamanho.
[0159] Se um peptídeo de antígeno tumoral for apresentado diretamente, ou seja, sem processamento e em particular sem clivagem, este deverá ter um comprimento que é adequado para a ligação com uma molécula de MHC, em particular uma molécula de MHC de classe I, e de preferência este terá de 7 a 20 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente de 7 a 12 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente de 8 a 11 aminoácidos de comprimento, em especial 9 ou 10 aminoácidos de comprimento. De preferência, a sequência de um peptídeo de antígeno tumoral que deve ser apresentado diretamente é derivado da sequência de aminoácidos de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção, isto é, sua sequência corresponde substancialmente e é, de preferência, totalmente idêntica a um fragmento de um antígeno tumoral identificado de acordo com a presente invenção. Se um peptídeo de antígeno tumoral for apresentado após transformação, em particular após clivagem, o peptídeo produzido pelo processamento deverá ter um comprimento que é adequado para a ligação com uma molécula de MHC, em particular uma molécula de MHC de classe I, e de preferência é de 7 a 20 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente de 7 a 12 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente de 8 a 11 aminoácidos de comprimento, em especial 9 ou 10 aminoácidos de comprimento. De preferência, a sequência do peptídeo que é para ser apresentado após transformação é derivada da sequência de aminoácidos de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção, isto é, sua sequência corresponde substancialmente e é, de preferência, totalmente idêntica a um fragmento de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção. Assim, um peptídeo de antígeno tumoral de acordo com a presente invenção, em uma modalidade, compreende uma sequência de 7 a 20 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente de 7 a 12 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente de 8 a 11 aminoácidos de comprimento, em especial 9 ou 10 aminoácidos de comprimento, que corresponde substancialmente e é, de preferência, totalmente idêntica a um fragmento de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção e, após processamento, o peptídeo de antígeno tumoral torna-se o peptídeo apresentado. No entanto, o peptídeo de antígeno tumoral pode também incluir uma sequência que corresponde substancialmente e, de preferência, é totalmente idêntica a um fragmento de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção que é ainda maior do que a sequência acima indicada. Em uma modalidade, um peptídeo antígeno tumoral pode incluir toda a sequência de um antígeno tumoral identificado de acordo com a presente invenção.
[0160] De preferência, um peptídeo de antígeno tumoral pode ser apresentado diretamente ou após transformação, com moléculas de MHC de classe I e, quando assim apresentado, é capaz de estimular uma CTL antígeno- tumoral responsiva. Peptídeos tendo sequências de aminoácidos substancialmente correspondentes a uma sequência de um peptídeo que é apresentado com MHC de classe I podem ser diferentes em um ou mais resíduos que não são essenciais para reconhecimento TCR do peptídeo apresentado pelo MHC de classe I, ou para a ligação de peptídeos a MHC. Tais peptídeos substancialmente correspondentes também são capazes de estimular uma CTL antígeno-tumoral responsiva. Peptídeos tendo sequências de aminoácidos diferentes de um peptídeo apresentado em resíduos que não afetam o reconhecimento TCR, mas que melhoram a estabilidade de ligação ao MHC podem melhorar a imunogenicidade do peptídeo de antígeno tumoral e poderão ser, aqui, referidos como “peptídeos otimizados”. Utilizando-se o conhecimento existente sobre quais destes resíduos podem ser mais susceptíveis de afetar a ligação quer com o MHC ou com o TCR, uma abordagem racional para a concepção de peptídeos substancialmente correspondentes pode ser empregada. Os peptídeos resultantes, que são funcionais, são contemplados como peptídeos de antígeno tumoral.
[0161] Por “imunoreativos” deve-se entender uma célula que pode amadurecer em uma célula imunológica (como uma célula B, uma célula T ajudante ou uma CTL) com a estimulação adequada. Assim células imunorreativas incluem células-tronco hematopoiéticas CD34+, células T imaturas e células B imaturas. Quando se deseja produzir CTLs que reconhecem um antígeno tumoral, as células imunorreativas são colocadas em contato com uma célula que apresenta o antígeno tumoral ou um peptídeo de antígeno tumoral derivado do referido antígeno tumoral em condições favoráveis de produção, diferenciação e/ou seleção de CTLs.
[0162] Por “célula caracterizada pela apresentação de um antígeno tumoral com MHC de classe I” ou “célula apresentando um antígeno tumoral com MHC de classe I”, ou expressões semelhantes, deve-se entender uma célula como uma célula de tumor ou uma célula apresentadora de antígenos apresentando o antígeno tumoral expresso ou um fragmento derivado do referido antígeno tumoral, por exemplo, através do processamento do antígeno tumoral, no contexto de moléculas de MHC de classe I. Da mesma forma, o termo “tumor caracterizado pela apresentação de um antígeno tumoral com MHC de classe I” denota uma célula tumoral caracterizada pelo fato de compreender a apresentação de um antígeno tumoral com um MHC de classe I.
[0163] Por "fragmento de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção que apresenta", ou expressões semelhantes, deve-se entender que o fragmento pode ser apresentado por um MHC de classe I ou classe II, de preferência MHC de classe I, por exemplo quando adicionado diretamente às células apresentadoras de antígenos. Em uma modalidade, o fragmento é um fragmento que é naturalmente apresentado por células que expressam um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção, por exemplo, células tumorais.
[0164] Por “célula que reconhece um antígeno tumoral ou um peptídeo de antígeno tumoral derivado do referido antígeno tumoral” ou “célula imunoreativa que reconhece um antígeno tumoral ou um peptídeo de antígeno tumoral derivado do referido antígeno tumoral", ou expressões semelhantes, deve-se entender uma célula que é capaz de reconhecer o referido antígeno tumoral ou um peptídeo de antígeno tumoral derivado do referido antígeno tumoral com algum grau de especificidade, em particular se apresentado no contexto de moléculas de MHC, como na superfície das células apresentadoras de antígenos ou células tumorais. De preferência, o referido reconhecimento permite que a célula que reconhece um antígeno tumoral ou um peptídeo de antígeno tumoral derivado do referido antígeno tumoral seja responsiva. Se a célula é uma células T ajudante (células T CD4+), receptores de rolamento que reconhecem um antígeno tumoral ou um peptídeo de antígeno tumoral derivado do referido antígeno tumoral, no contexto de uma molécula de MHC de classe II, tal resposta pode envolver a liberação de citocinas e/ou a ativação de linfócitos CD8+ (CTLs) e/ou células B. Se a célula é uma CTL responsiva, estas podem envolver a eliminação de células apresentadas no contexto de moléculas de MHC de classe I, ou seja, caracterizadas pela apresentação de um antígeno tumoral com um MHC de classe I, por exemplo através de apoptose ou lise celular mediada por perforina. Tais CTL que reconhecem um antígeno tumoral ou um peptídeo de antígeno tumoral derivado do referido antígeno tumoral e são sensíveis também são denominadas “CTL antígeno- tumoral responsivas” no presente relatório descritivo. Se a célula é uma célula B de resposta imunológica, estas podem envolver a liberação de imunoglobulinas.
[0165] Por “receptor celular T que reconhece um antígeno tumoral ou um peptídeo de antígeno tumor derivado do referido antígeno tumoral” deve-se entender um receptor de células T que é capaz de reconhecer o referido antígeno tumoral ou um peptídeo de antígeno tumoral derivado do referido antígeno tumoral com algum grau de especificidade, em particular se apresentado no contexto de moléculas de MHC. Preferencialmente, o referido reconhecimento permite que a célula carregando o receptor de células T que reconhece um antígeno tumoral ou um peptídeo de antígeno tumoral derivado do referido antígeno tumoral seja sensível, conforme descrito acima.
[0166] A “resposta celular contra um antígeno tumoral” deve ser entendida como incluindo uma resposta celular dirigida às células caracterizada pela apresentação de um antígeno tumoral com um MHC de classe I ou classe II. A resposta celular refere-se a células chamadas células T ou linfócitos T que atuam como ou "ajudantes" ou "assassinos". As células T ajudantes (também denominadas células T CD4+) têm um papel central através da regulação da resposta imune e as células killer (também chamadas de células T citotóxicas, células T citolíticas, células T CD8+ ou CTLs) matam as células tumorais, evitando a produção de mais células do tumor. Embora ambos os braços da resposta imune sejam entendidos como sendo necessários, a resposta CTL pode ser mais importante para controlar o câncer.
[0167] De acordo com a presente invenção o termo “de referência” deve ser entendido como uma amostra de referência ou organismo de referência e pode ser usado para correlacionar e comparar os resultados obtidos nos métodos da invenção de uma amostra de teste ou de um organismo de teste, ou seja, um paciente. Normalmente, o organismo de referência é um organismo saudável em um organismo especial que não sofre de uma doença tumoral.
[0168] O termo “valor de referência” ou “nível de referência” pode ser determinado a partir de uma referência, empiricamente medindo-se um número suficientemente grande de referências. De preferência, o valor de referência é determinado medindo-se pelo menos 2, de preferência pelo menos 3, preferivelmente pelo menos 5, de preferência pelo menos, 8, de preferência pelo menos 12, de preferência pelo menos 20, de preferência pelo menos 30, de preferência pelo menos 50, ou de preferência em pelo menos 100 referências.
[0169] De acordo com a presente invenção, o termo “ligação”, de preferência, diz respeito a uma ligação específica. O termo “ligação específica” significa que um agente, como um anticorpo, se liga a um alvo mais forte, como um epitopo, para o qual ele é específico em comparação com uma ligação com outro alvo. Um agente se liga mais forte a um primeiro alvo em comparação com um segundo alvo quando se liga ao primeiro alvo com uma constante de dissociação (KD), que é inferior à constante de dissociação para o segundo alvo. De preferência, a constante de dissociação (KD) para o destino ao qual o agente se liga especificamente é mais do que 102 vezes, 103 vezes, 104 vezes, 105 vezes, 106 vezes, 107 vezes, 108 vezes, 109 vezes ou 1010 vezes menor do que a constante de dissociação (KD) para o destino ao qual o agente não se liga especificamente.
[0170] De acordo com a presente invenção, um ácido nucléico é, de preferência, um ácido desoxirribonucléico (DNA) ou ácido ribonucléico (RNA). Ácidos nucléicos compõem, de acordo com o DNA genômico invenção, mRNA, cDNA, recombinantemente produzidos e moléculas obtidas por síntese química. De acordo com a invenção, um ácido nucléico pode estar presente como uma molécula de fita simples ou de dupla fita e ser linear ou circular covalentemente fechada.
[0171] Os termos “ácidos nucléicos tumorais identificados de acordo com a invenção” e “ácidos nucléicos codificando um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção” têm significados semelhantes.
[0172] Como aqui utilizado, o termo “RNA” significa uma molécula compreendendo pelo menos um resíduo de ribonucleotídeo. Por “ribonucleotídeo” deve-se entender um nucleotídeo com um grupo hidroxila na posição 2'- de uma molécula de beta-D-ribo-furanose. O termo inclui RNA de dupla fita, RNA de fita simples, RNA isolados, como RNA parcialmente purificado, RNA essencialmente puro, RNA sintético, RNA produzido recombinantemente, bem como RNA alterado que difere do RNA que ocorre naturalmente pela adição, supressão, substituição e/ou alteração de um ou mais nucleotídeos. Tais alterações podem incluir adição de material não-nucleotídico nas extremidades de um RNA ou internamente, por exemplo, em um ou mais nucleotídeos do RNA. Nucleotídeos nas moléculas de RNA também podem incluir nucleotídeos não-padrão, como nucleotídeos sem ocorrência natural ou nucleotídeos oriundos de síntese química ou desoxinucleotídeos. Estes RNAs alterados podem ser referidos como análogos ou como análogos de RNA que ocorre naturalmente.
[0173] Quando é feita, aqui, referência a uma detecção ou a uma determinação da quantidade de um ácido nucléico, o ácido nucléico que na verdade é para ser detectado ou a quantidade de que é na verdade para ser determinada é, de preferência, um mRNA. No entanto, deve-se entender que este aspecto também pode incluir modalidades em que um mRNA é detectado indiretamente ou onde a quantidade de mRNA é determinada de forma indireta. Por exemplo, um mRNA pode ser transformado em cDNA e os cDNA serem detectados ou sua quantidade determinada. Um mRNA é dado, aqui, como o equivalente cDNA. Um técnico no assunto entenderá que a sequência de cDNA é equivalente à sequência de mRNA, e pode ser usada aqui para o mesmo propósito, por exemplo, a geração de sondas de hibridização para o ácido nucléico a ser detectado. Assim, se faz referência, aqui, às sequências mostradas na listagem de sequências e esta também deve incluir os equivalentes de RNA das referidas sequências.
[0174] Os ácidos nucléicos descritos de acordo com a presente invenção são, de preferência, isolados. O termo “ácido nucléico isolado” significa, de acordo com a invenção, que o ácido nucléico foi: (i) amplificado in vitro, por exemplo pela reação em cadeia de polimerase (PCR); (ii) recombinantemente produzido por clonagem; (iii) purificado, por exemplo por clivagem e eletroforese em gel com fracionamento; ou (iv) sintetizado, por exemplo, por síntese química. Um ácido nucléico isolado é um ácido nucléico que está disponível para manipulação por técnicas de DNA recombinante.
[0175] O termo “variante” com respeito a, por exemplo, ácidos nucléicos e sequências de aminoácidos, de acordo com a invenção, inclui as variantes, mutantes em particular, variantes de emendas, conformações, isoformas, variantes alélicas, espécies variantes e espécies homólogas, em particular aquelas entidades que são naturalmente presentes. Uma variante alélica relacionada a uma alteração na sequência normal de um gene, tem um significado do que é muitas vezes pouco claro. O sequenciamento completo dos genes muitas vezes identifica inúmeras variantes alélicas de um determinado gene. A espécie homóloga é um ácido nucléico ou sequência de aminoácidos com diferentes espécies de origem a partir de um ácido nucléico ou de uma dada sequência de aminoácidos.
[0176] No que diz respeito a moléculas de ácido nucléico, o termo “variante” inclui sequências de ácidos nucléicos degeneradas, em que um degenerado de ácido nucléico de acordo com a invenção é um ácido nucléico que difere de um ácido nucléico de referência em sua sequência de códon devido à degeneração do código genético.
[0177] Além disso, uma “variante” de uma sequência de ácido nucléico específico, de acordo com a invenção, inclui sequências de ácidos nucléicos que compreendem um ou vários, como: pelo menos 2, pelo menos 4 ou pelo menos 6 e, de preferência, até 3, até 4, até a 5, até 6, até 10, até 15 ou até 20 substituições, deleções e / ou alterações de nucleotídeos.
[0178] De preferência, o grau de identidade entre uma sequência de ácido nucléico e uma dada sequência de ácido nucléico que é uma variante do mesmo, numa dada sequência de ácido nucléico, será pelo menos 70%, de preferência pelo menos 75%, de preferência pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, ainda mais de preferência pelo menos 90% ou mais preferencialmente pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. O grau de identidade é dado, de preferência, para uma região de pelo menos cerca de 30, pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 70, pelo menos cerca de 90, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 150, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 250, pelo menos cerca de 300, ou pelo menos cerca de 400 nucleotídeos. Em modalidades preferidas, o grau de identidade é dado para todo o comprimento da sequência de ácidos nucléicos de referência.
[0179] O termo “similaridade de sequência” indica a percentagem de aminoácidos que, ou são idênticos ou conservadores e que representam substituições de aminoácidos. O termo “identidade de sequência” entre duas sequências de ácidos nucléicos ou polipeptídeos indica a porcentagem de aminoácidos ou nucleotídeos que são idênticos entre as sequências.
[0180] O termo “identidade percentual” destina-se a indicar um percentual de nucleotídeos ou de resíduos de aminoácidos que são idênticos entre as duas sequências sendo comparadas, obtido após o melhor alinhamento, sendo esta percentagem puramente estatística e as diferenças entre as duas sequências sendo distribuídas aleatoriamente e toda a sua extensão comparada. Alinhamentos de sequência entre duas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos são convencionalmente realizados mediante a comparação destas sequências, depois de terem sido alinhadas da melhor maneira, a referida comparação sendo realizada por segmento ou por “janela de comparação”, a fim de identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. O alinhamento das sequências ideal para a comparação pode ser produzido, além de manualmente, por meio do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, por meio do algoritmo de homologia local de Neddleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, por meio do método de pesquisa de similaridade de Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, ou por meio de programas de computador que utilizam estes algoritmos (GAP, BestFit, FASTA, BLAST P, BLAST N e TFASTA do pacote Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis).
[0181] A porcentagem de identidade é calculada através da determinação do número de posições idênticas entre as duas sequências que estão sendo comparadas, dividindo este número pelo número de posições em relação e multiplicando o resultado obtido por 100 a fim de obter a identidade percentual entre essas duas sequências.
[0182] Um ácido nucléico é “capaz de hibridação” ou “hibridiza” para outro ácido nucléico se as duas sequências são complementares entre si. Um ácido nucléico é complementar “a outro ácido nucléico” se as duas sequências são capazes de formar um duplex estável uma com a outra. De acordo com a presente invenção, a hibridação é preferencialmente realizada em condições que permitem a hibridização específica entre polinucleotídeos (condições severas). Condições rigorosas são descritas, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ou em Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York e se referem, por exemplo, a hibridação a 65°C em tampão de hibridação (3,5 x SSC, Ficoll 0,02%, polivinilpirrolidona 0,02%, 0,02% albumina de soro bovino, 2,5 mM NaH2PO4 (pH 7), 0,5% SDS, 2 mM EDTA). O SSC é uma solução 0,15 M de cloreto de sódio / 0,15 M de citrato de sódio, pH 7. Após a hibridização, a membrana em que o DNA foi transferido é lavada, por exemplo, em 2 x SSC à temperatura ambiente e, em seguida, de 0,1 a 0,5 x SSC / 0,1 x SDS a temperaturas de até 68°C.
[0183] A porcentagem de complementaridade indica a percentagem de resíduos contíguos em uma molécula de ácido nucléico que podem formar pontes de hidrogênio (por exemplo, emparelhamento de bases de Watson-Crick) com uma segunda sequência de ácido nucléico (por exemplo: 5, 6, 7, 8, 9, 10 dos 10 para 50%, 60%, 70%, 80%, 90% e 100% complementares), em que “perfeitamente complementares” ou “totalmente complementares” significa que todos os resíduos contíguos de uma sequência de ácido nucléico fazem ligação de hidrogênio com o mesmo número de resíduos contíguos em uma segunda sequência de ácido nucléico. De preferência, o grau de complementaridade de acordo com a presente invenção é de pelo menos 70%, de preferência pelo menos 75%, de preferência pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90% ou mais, de preferência pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. Mais preferencialmente, o grau de complementaridade de acordo com a presente invenção é de 100%.
[0184] O termo “derivado de” compreende qualquer derivatização química de um ácido nucléico em uma base de nucleotídeos, tanto na porção de açúcar quanto na de fosfato. O termo “derivado” também inclui os ácidos nucléicos que contêm análogos de nucleotídeos e nucleotídeos que não ocorrem naturalmente. De preferência, uma derivação de um ácido nucléico aumenta a sua estabilidade.
[0185] Ácidos nucléicos que codifiquem antígenos tumorais ou peptídeos do antígeno tumoral podem, de acordo com a presente invenção, estar presentes isoladamente ou em combinação com outros ácidos nucléicos, em particular ácidos nucléicos heterólogos. Preferencialmente, um ácido nucléico que codifica um antígeno tumoral ou peptídeo de antígeno tumoral expressa o referido antígeno tumoral ou peptídeo de antígeno tumoral. Em modalidades preferidas, um ácido nucléico é funcionalmente ligado a sequências de expressão de controle ou sequências regulatórias, que podem ser homólogas ou heterólogas com relação a este ácido nucléico. Uma sequência de codificação e uma sequência de regulamentação são “funcionalmente” ligadas umas às outras se elas estão covalentemente ligadas umas às outras de tal maneira que a expressão ou transcrição da referida sequência de codificação está sob o controle ou sob a influência da referida sequência de regulamentação. Se a sequência de codificação deve ser traduzida em uma proteína funcional, então, quando uma sequência reguladora se encontra funcionalmente ligada à referida sequência de codificação, a indução da referida sequência reguladora resulta na transcrição da referida sequência de codificação sem causar uma mudança de quadro na sequência de codificação, ou a referida sequência de codificação não será capaz de ser traduzida para a proteína ou peptídeo desejados.
[0186] O termo “sequência de controle de expressão” ou “sequência reguladora” compreende, de acordo com a presente invenção, promotores, melhoradores e outros elementos de controle que regulam a expressão de um gene. Em modalidades particulares da invenção, as sequências de controle de expressão podem ser regulamentadas. A estrutura exata de sequências reguladoras pode variar em função do tipo de espécies ou de célula, mas geralmente compreende sequências 5'- não-transcritas e 5'- não-traduzidas que estão envolvidas na iniciação da transcrição e da tradução, respectivamente, como a caixa TATA, sequência de nivelamento, sequência CAAT e semelhantes. Mais especificamente, sequências regulatórias 5'- não-transcritas compreendem uma região promotora, que inclui uma sequência promotora, para o controle transcricional do gene, funcionalmente ligada. Sequências reguladoras podem também incluir melhoradores de sequências ou ativadores de sequências a montante.
[0187] De acordo com a presente invenção, um ácido nucléico pode ainda estar presente em combinação com outro ácido nucléico que codifica uma secreção de peptídeo controle da proteína ou peptídeo codificado pelo referido ácido nucléico de uma célula hospedeira. De acordo com a presente invenção, um ácido nucléico pode também estar presente em combinação com outro ácido nucléico que codifica um peptídeo fazendo com que a proteína codificada, ou peptídeo, seja ancorada na membrana celular da célula hospedeira ou compartimentada em organelas particulares das referidas células. Da mesma forma, uma combinação com um ácido nucléico é possível e representa um gene repórter ou qualquer outro “marcador”.
[0188] Em uma modalidade preferida, uma molécula de ácido nucléico recombinante de acordo com a invenção é um vetor, e se for o caso em conjunto com um promotor, que controla a expressão de um ácido nucléico, por exemplo, um ácido nucléico que codifica para um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção. O termo “vetor” é aqui utilizado em seu significado mais geral e abrange qualquer veículo intermediário de um ácido nucléico que permite que o referido ácido nucléico, por exemplo, seja introduzido em células procariotas e/ou eucarióticas e, quando apropriado, seja integrado em um genoma. Vetores deste tipo são, de preferência, replicados e/ou expressos nas células. Um veículo intermediário pode ser adaptado, por exemplo, para o uso em eletroporação, em bombardeamento com microprojéteis, na administração lipossomal, na transferência com o auxílio de Agrobacterium ou em inserção por meio de vírus de DNA ou RNA. Vetores compreendem plasmídeos, fagemídeos, bacteriófagos ou genomas virais.
[0189] Os ácidos nucléicos que codificam um antígeno tumoral identificados de acordo com a invenção podem ser utilizados para a transfecção de células hospedeiras. Ácidos nucléicos, aqui, significam tanto um DNA recombinante quanto um RNA. Um RNA recombinante pode ser preparado in vitro pela transcrição de um modelo de DNA. Além disso, pode ser modificado através da estabilização, nivelamento e poliadenilação de sequências antes da aplicação.
[0190] De acordo com a presente invenção, o termo “célula hospedeira” refere-se a qualquer célula que pode ser transformada ou transfectada com um ácido nucléico exógeno. O termo “células hospedeiras” compreende, de acordo com a presente invenção, células procarióticas (por exemplo, E. coli) ou células eucarióticas (por exemplo, células dendríticas, células B, células CHO, células COS, células K562, células de levedura e células de inseto). Preferência particular é dada às células de mamíferos, como as células dos seres humanos, ratos, hamsters, porcos, cabras e primatas. As células podem ser derivadas de uma multiplicidade de tipos de tecidos e compreendem células primárias e linhagens celulares. Exemplos específicos compreendem queratinócitos, leucócitos do sangue periférico, células-tronco da medula óssea e células-tronco embrionárias. Em modalidades adicionais, a célula hospedeira é uma célula apresentadora de antígenos, em particular células dendríticas, monócitos ou macrófagos. Um ácido nucléico pode estar presente na célula hospedeira na forma de uma única cópia ou de duas ou mais cópias e, em uma modalidade, é expresso na célula hospedeira.
[0191] De acordo com a invenção, o termo “expressão” é utilizado em seu sentido mais geral e compreende a produção de RNA ou de RNA e proteínas. Inclui também expressão parcial de ácidos nucléicos. Além disso, a expressão pode ser realizada de forma transitória ou estável. Sistemas de expressão preferidos em células de mamíferos compreendem pcDNA3.1, pcDNA3.3 e pRc/CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA), que contêm um marcador selecionável tal como uma resistência a transmissão de genes para G418 (e, portanto, permitindo que linhagens de células transfectadas sejam selecionadas estavelmente) e sequências melhoradoras-promotoras de citomegalovírus (CMV).
[0192] Nos casos da presente invenção nos quais uma molécula de MHC apresenta um antígeno tumoral ou um peptídeo de antígeno tumoral, um vetor de expressão pode também incluir uma sequência de ácidos nucléicos de codificação para a referida molécula de MHC. A sequência de ácido nucléico que codifica a molécula de MHC pode estar presente no vetor de expressão mesmo que o ácido nucléico que codifica o antígeno tumoral ou o peptídeo de antígeno tumoral, ou ambos os ácidos nucléicos possam estar presentes em vetores de expressão diferentes. Neste último caso, os dois vetores de expressão podem ser co-transfectados em uma célula. Se uma célula hospedeira não expressa nem o antígeno tumoral nem o peptídeo de antígeno tumoral nem a molécula de MHC, tanto ácidos nucléicos codificando os mesmos podem ser transfectados para dentro da célula ou no mesmo vetor de expressão ou em vetores de expressão diferentes. Se a célula já expressa a molécula de MHC, somente a sequência de ácido nucléico que codifica o antígeno tumoral ou o peptídeo de antígeno tumoral pode ser transfectada para dentro da célula.
[0193] As “moléculas anti-senso” ou “ácidos nucléicos anti-senso” podem ser utilizados para a regulação, em particular, reduzindo a expressão de um ácido nucléico. O termo “molécula anti-senso” ou “ácido nucléico anti-senso” refere-se, de acordo com a presente invenção, a um oligonucleotídeo que é um oligoribonucleotídeo, oligodesoxiribonucleotídeo, oligoribonucleotídeo modificado ou oligodesoxiribonucleotídeo modificado e que hibridiza sob condições fisiológicas para um DNA compreendendo um gene particular ou o referido gene de transcrição de mRNA, inibindo assim a tradução dos referidos gene e/ou mRNA. De acordo com a invenção, uma “molécula anti-senso” compreende também uma construção que contém um ácido nucléico ou uma parte dele na orientação inversa em relação ao seu promotor natural. Uma transcrição anti-senso de um ácido nucléico ou de uma parte dele pode formar um duplex com o mRNA de ocorrência natural e, assim, evitar o acúmulo de mRNA ou sua tradução. Outra possibilidade é o uso de ribozimas para inativação de um ácido nucléico.
[0194] Em modalidades preferidas, os oligonucleotídeos anti-senso hibridizam com um N-terminal ou sítio 5’- a montante tal como um sítio de iniciação de tradução, sítio de iniciação de transcrição ou sítio promotor. Em modalidades adicionais, o oligonucleotídeo anti-senso hibridiza com uma região não traduzida 3'- ou região de junção de mRNA.
[0195] Em uma modalidade, um oligonucleotídeo da invenção consiste em ribonucleotídeos, desoxirribonucleotídeos ou uma combinação destes, com a extremidade 5'- de um nucleotídeo e a extremidade 3'- do outro sendo nucleotídeos ligados uns aos outros por uma ligação fosfodiéster. Estes oligonucleotídeos podem ser sintetizados na forma convencional ou produzidos recombinantemente.
[0196] Em modalidades preferidas, um oligonucleotídeo da presente invenção é um “oligonucleotídeo modificado”. Aqui, o oligonucleotídeo pode ser modificado de maneiras muito diferentes, sem prejudicar a sua capacidade de vincular o seu alvo, a fim de aumentar, por exemplo, a sua estabilidade ou eficácia terapêutica. De acordo com a invenção, o termo, “oligonucleotídeo modificado” significa um oligonucleotídeo em que:
[0197] (i) pelo menos dois de seus nucleotídeos são ligados uns aos outros por uma ligação internucleosídica sintética (ou seja, uma ligação internucleosídica que não é uma ligação fosfodiéster) e/ou
[0198] (ii) um grupo químico que normalmente não é encontrado em ácidos nucléicos é covalentemente ligado ao oligonucleotídeo. Exemplos preferidos de internucleosídeos sintéticos são fosforotioatos, fosfonatos de alquila, fosforoditioatos, ésteres de fosfato, fosfonotioatos de alquila, fosforamidatos, carbamatos, carbonatos, triésteres de fosfato, acetamidatos, ésteres carboximetílicos e peptídeos.
[0199] O termo “oligonucleotídeos modificados” também compreende oligonucleotídeos tendo uma base e/ou açúcar covalentemente modificados. “Oligonucleotídeos modificados” compreendem, por exemplo, oligonucleotídeos com resíduos de açúcar que estão covalentemente ligados a grupos de baixo peso molecular orgânicos que não sejam um grupo hidroxila na posição 3’- e um grupo fosfato no terminal 5'. Oligonucleotídeos modificados podem incluir, por exemplo, um resíduo ribose 2'-O-alquilado ou outro açúcar em vez de ribose, como arabinose.
[0200] É preciso entender que todas as modalidades descritas acima, com relação a oligonucleotídeos, podem também se aplicar aos polinucleotídeos.
[0201] O termo “pequeno RNA de interferência” ou “siRNA”, como aqui utilizado, significa uma molécula de RNA isolada, de preferência superior a 10 nucleotídeos de comprimento, mais de preferência superior a 15 nucleotídeos de comprimento, e mais preferivelmente 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos de comprimento, que é usado para identificar um gene-alvo ou para degradar um mRNA. A faixa de 19 a 25 nucleotídeos constitui o tamanho preferido para siRNAs.
[0202] siRNAs de acordo com a invenção podem compreender RNA5 parcialmente purificado, RNA substancialmente puro, RNA sintético ou RNA recombinantemente produzido, bem como RNA alterado que difere do RNA que ocorre naturalmente pela adição, supressão, substituição e/ou alteração de um ou mais nucleotídeos. Tais alterações podem incluir: a adição de material não- nucleotídico nas extremidades do siRNA ou a um ou mais nucleotídeos internos do siRNA; modificações que tornam o siRNA resistente à digestão por nuclease (por exemplo, o uso de ribonucleotídeos 2' -substituídos ou modificações no esqueleto fosfato do açúcar) ou a substituição de um ou mais nucleotídeos no siRNA com desoxirribonucleotídeos. Além disso, o siRNA pode ser modificado para aumentar a estabilidade do mesmo, conforme descrito acima para oligonucleotídeos modificados, em particular através da introdução de uma ou mais ligações fosforotioato.
[0203] Uma ou ambas as fitas do siRNA também podem incluir uma saliência 3'. Como aqui utilizado, o termo “saliência 3’” refere-se a pelo menos um nucleotídeo desemparelhado que se estende desde a extremidade 3' de uma fita de RNA. Assim, em uma modalidade, o siRNA compreende pelo menos uma saliência 3' de 1 a cerca de 6 nucleotídeos (que inclui ribonucleotídeos ou desoxinucleotídeos) de comprimento, de preferência de 1 a cerca de 5 nucleotídeos de comprimento, mais preferivelmente de 1 a cerca de 4 nucleotídeos de comprimento e particularmente de preferência de cerca de 2 a cerca de 4 nucleotídeos de comprimento. Na modalidade em que ambas as fitas da molécula de siRNA compõem a saliência 3’, os comprimentos das saliências podem ser iguais ou diferentes para cada fita. Em uma modalidade preferida, a saliência 3’ está presente em ambas as fitas do siRNA e é de 2 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, cada fita do siRNA da invenção pode compreender saliências 3' de ácido didesoxitimidílico (“TT”) ou ácido diuridílico (“uu”).
[0204] A fim de reforçar a estabilidade do siRNA, as saliências 3' também podem ser estabilizadas contra degradação. Em uma modalidade, as saliências são estabilizadas através da inclusão de nucleotídeos de purina, tais como nucleotídeos adenosina ou guanosina. Alternativamente, a substituição de nucleotídeos de pirimidina por análogos modificados, por exemplo, a substituição de nucleotídeos uridina na saliência 3’ com 3'- 2'-desoxitimidina é tolerada e não afeta a eficiência de degradação de RNAi. Em particular, a ausência de um grupo 2'-hidroxila na 2'-desoxitimidina aumenta significativamente a resistência à nuclease das saliências 3' em meio de cultura de tecidos.
[0205] As fitas senso e anti-senso do siRNA podem incluir dois complementares, as moléculas de fita única de RNA, ou podem incluir uma única molécula em que duas partes complementares são pares de bases e são covalentemente ligados por uma área “hairpin” de fita simples. Isto é, a região senso e a região anti-senso podem ser covalentemente ligadas através de uma molécula de ligante. A molécula ligante pode ser um ligante polinucleotídeo ou não- nucleotídico. Sem querer se comprometer com qualquer teoria, acredita-se que a área hairpin deste último tipo de molécula de siRNA é clivada intracelularmente pela “proteína dicer” (ou seu equivalente) para formar um siRNA de duas moléculas individuais de RNA base-emparelhadas.
[0206] Como aqui utilizado, o termo “mRNA alvo” refere-se a uma molécula de RNA que é alvo de regulação baixa.
[0207] O siRNA pode ser expresso de vetores de expressão pol III sem uma mudança nos sítios alvo, considerando que se acredita que a expressão de RNAs de promotores pol III só é eficiente quando o primeiro nucleotídeo transcrito é uma purina.
[0208] Um siRNA de acordo com a invenção podem ser direcionado para qualquer trecho de cerca de 19 a 25 nucleotídeos contíguos em qualquer uma das sequências de mRNA alvo ( a chamada “sequência alvo”). Técnicas para a seleção de sequências alvo de siRNA são reveladas, por exemplo, por Tuschl T. et al., “The siRNA User Guide”, revista 11 de outubro de 2002, cuja divulgação, em sua totalidade, é aqui incorporada por referência. O “The siRNA User Guide” está disponível em rede por meio de uma página eletrônica mantida pelo Dr. Thomas Tuschl, Laboratory of RNA Molecular Biology, Rockefeller University, New York, EUA, e pode ser encontrada acessando-se a página eletrônica da Universidade Rockefeller com busca com a palavra-chave, “siRNA”. Assim, a fita senso do siRNA em questão é composta por uma sequência de nucleotídeos substancialmente idêntica a qualquer trecho contínuo de cerca de 19 a cerca de 25 nucleotídeos no mRNA alvo.
[0209] Geralmente, uma sequência alvo no mRNA alvo pode ser selecionada a partir de uma dada sequência de cDNA correspondente ao mRNA-alvo, de preferência começando de 50 a 100 nt a jusante (ou seja, na direção 3'-) a partir do códon de iniciação. A sequência alvo pode, no entanto, ser localizada nas regiões 5'- ou 3' não-traduzidas ou na região próxima do códon de início.
[0210] Um siRNA pode ser obtido usando-se uma série de técnicas conhecidas dos técnicos no assunto. Por exemplo, um siRNA pode ser quimicamente sintetizado ou produzido recombinantemente usando-se métodos conhecidos no estado da técnica, como o sistema de Drosophila in vitro descrito no pedido de patente norte-americano US2002/0086356 de Tuschl et al., cuja divulgação, em sua totalidade, é aqui incorporada por referência.
[0211] De preferência, o siRNA é quimicamente sintetizado usando fosforamiditos de ribonucleosídeo devidamente protegidos e um sintetizador de DNA/RNA convencional. Um siRNA pode ser sintetizado como duas partes separadas, moléculas de RNA complementares, ou como uma única molécula de RNA com duas regiões complementares.
[0212] Alternativamente, um siRNA também pode ser expresso de plasmídeos de DNA recombinante circular ou linear utilizando-se qualquer promotor adequado. Modalidades de acordo com a presente invenção incluem, quando é feita referência neste documento, a administração de siRNA ou a incorporação de siRNA em composições farmacêuticas. Promotores adequados para expressar um siRNA da presente invenção em um plasmídeo incluem, por exemplo, sequências promotoras U6 ou Hl de RNA pol III e o promotor citomegalovírus.
[0213] A seleção de outros promotores adequados se encontra dentro da habilidade de um técnico no assunto. Os plasmídeos recombinantes da invenção também podem incluir promotores induzíveis ou reguláveis para a expressão do siRNA em um tecido especial ou em um determinado ambiente intracelular.
[0214] O siRNA expresso de plasmídeos recombinantes pode ser isolado de sistemas de expressão de cultura de células por técnicas padrão, ou pode ser expresso intracelularmente. O uso de plasmídeos recombinantes para apresentar siRNAs para as células in vivo é discutido em maiores detalhes abaixo. Um siRNA pode ser expresso a partir de um plasmídeo recombinante ou como duas moléculas de RNA complementares separadas, ou como uma única molécula de RNA com duas regiões complementares.
[0215] A seleção de plasmídeos adequados para expressar siRNAs, os métodos para a inserção de sequências de ácidos nucléicos para expressar o siRNA no plasmídeo e métodos para apresentar o plasmídeo recombinante para as células de interesse estão dentro da habilidade de um técnico no assunto.
[0216] O siRNA também pode ser expresso de vetores virais recombinantes intracelularmente in vivo. Os vetores virais recombinantes compreendem as sequências de codificação do siRNA e qualquer promotor adequado para expressar as sequências de siRNA. Os vetores virais recombinantes também podem incluir promotores induzíveis ou reguláveis para a expressão do siRNA em um tecido especial ou em um determinado ambiente intracelular. Um siRNA pode ser expresso a partir de um vetor viral recombinante ou como duas moléculas de RNA complementares separadas ou como uma única molécula de RNA com duas regiões complementares.
[0217] O termo “peptídeo” compreende oligo- e polipeptídeos e se refere a substâncias que compreendem dois ou mais, de preferência 3 ou mais, de preferência 4 ou mais, de preferência 6 ou mais, de preferência 8 ou mais, de preferência 10 ou mais, de preferência 13 ou mais, de preferência 16 ou mais, de preferência 21 ou mais e, de preferência, até 8, 10, 20, 30, 40 ou 50, em particular 100, aminoácidos unidos covalentemente por ligações peptídicas. O termo “proteína” refere-se a peptídeos grandes, de preferência a peptídeos com mais de 100 resíduos de aminoácidos, mas em geral os termos “peptídeos” e “proteínas” são sinônimos e são usados indistintamente neste documento.
[0218] De preferência, as proteínas e peptídeos descritos de acordo com a invenção são entidades isoladas. Os termos “proteína isolada” ou “peptídeo isolado” significam que a proteína ou peptídeo foi separado de seu ambiente natural. Uma proteína ou peptídeo isolado pode estar em um estado essencialmente purificado. O termo “essencialmente purificado” significa que a proteína ou o peptídeo é essencialmente livre de outras substâncias com as quais ele está associado na natureza ou in vivo.
[0219] Tais proteínas e peptídeos podem ser usados, por exemplo, na produção de anticorpos e em um ensaio imunológico ou de diagnóstico ou como terapêutica. Proteínas e peptídeos descritos de acordo com a presente invenção podem ser isolados de amostras biológicas como homogeneizados de tecido ou de células e também podem ser expressos recombinantemente em uma multiplicidade de sistemas de expressão pró- ou eucarióticos.
[0220] Para efeitos da presente invenção, “variantes” de uma proteína ou peptídeo, ou de uma sequência de aminoácidos compreendem variantes de aminoácidos com inserção, exclusão e/ou substituição de aminoácidos.
[0221] Variantes de inserção de aminoácidos compõem fusões amino- e/ou carbóxi-terminal e também inserções de aminoácidos simples ou de dois ou mais aminoácidos em uma sequência de aminoácidos em particular. No caso de variantes de sequência de aminoácidos tendo uma inserção, um ou mais resíduos de aminoácidos são inseridos em um determinado local em uma sequência de aminoácidos, embora uma inserção aleatória com triagem adequada do produto resultante também seja possível.
[0222] Variantes de exclusão aminoácidos são caracterizadas pela remoção de um ou mais aminoácidos da sequência.
[0223] Variantes de substituição de aminoácidos são caracterizadas por, pelo menos, ter um resíduo na sequência que está sendo removido e um outro resíduo que está sendo inserido em seu lugar. A preferência é dada às modificações que se dão em posições na sequência de aminoácidos que não são conservadas entre proteínas homólogas ou peptídeos e/ou substituição de aminoácidos com os outros aminoácidos com propriedades semelhantes.
[0224] De preferência, alterações de aminoácidos nas proteínas variantes são mudanças conservadoras de aminoácidos, ou seja, as substituições com aminoácidos carregados ou descarregados de forma semelhante. Uma mudança conservadora de aminoácidos envolve a substituição de uma de uma família de aminoácidos que são relacionados em suas cadeias laterais. Aminoácidos naturais são geralmente divididos em quatro famílias: aminoácidos ácidos (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), não- polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano) e sem carga polar (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). Fenilalanina, triptofano e tirosina são, às vezes, classificados em conjunto como aminoácidos aromáticos.
[0225] De preferência, o grau de similaridade de identidade, de preferência entre uma sequência determinada de aminoácidos e uma sequência de aminoácidos que é uma variante da mesma dada sequência de aminoácidos será de pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, de preferência pelo menos 85%. Ainda mais preferencialmente pelo menos 90% ou mais preferencialmente pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. O grau de semelhança ou identidade é dado, de preferência, para uma região de pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 60, pelo menos cerca de 80, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 120, pelo menos cerca de 140, pelo menos cerca de 160, pelo menos cerca de 200 ou 250 aminoácidos. Em modalidades preferidas, o grau de semelhança ou identidade é dado para todo o comprimento da sequência de aminoácidos de referência.
[0226] Os peptídeos e aminoácidos variantes descritos na presente invenção podem ser facilmente preparados com o auxílio de técnicas de síntese de peptídeos conhecidas como, por exemplo, por síntese em fase sólida (Merrifield, 1964) e métodos semelhantes ou por manipulação de DNA recombinante. A manipulação de sequências de DNA para preparar proteínas e peptídeos com substituições, inserções ou exclusões, é descrita em detalhes por Sambrook et al. (1989), por exemplo.
[0227] De acordo com a invenção “derivados” de proteínas e peptídeos são formas modificadas de proteínas e peptídeos. Tais modificações incluem qualquer modificação química e incluem uma ou várias substituições, exclusões e/ou inserções de quaisquer moléculas associadas com a proteína ou peptídeo, como carboidratos , lipídios e/ou proteínas ou peptídeos. O termo “derivado” também se estende a todos os equivalentes químicos funcionais dos referidos proteínas e peptídeos. De preferência, um peptídeo modificado aumenta a estabilidade e/ou tem imunogenicidade aumentada.
[0228] De acordo com a invenção, uma variante de uma sequência de ácidos nucléicos ou de aminoácidos, uma sequência de aminoácidos substancialmente correspondente ou um fragmento ou derivado de um peptídeo, de preferência, tem uma propriedade funcional da sequência de ácidos nucléicos ou de aminoácidos, da sequência de aminoácidos ou peptídeo, respectivamente, a partir da qual foi derivada. Tais propriedades funcionais compreendem a interação com anticorpos, interação com outros peptídeos ou proteínas, ligação seletiva de ácidos nucléicos e uma atividade enzimática. Em uma modalidade, uma variante de uma sequência de ácidos nucléicos ou de aminoácidos, uma sequência de aminoácidos substancialmente correspondente ou um fragmento ou derivado de um peptídeo é imunologicamente equivalente à sequência de ácidos nucléicos ou de aminoácidos, sequência de aminoácidos ou peptídeos, respectivamente, da qual foi derivada. Em uma modalidade, a propriedade funcional é uma propriedade imunológica. A propriedade particular é a capacidade de formar um complexo com as moléculas de MHC e, eventualmente, gerar uma resposta imune, de preferência, estimulando as células T ajudantes ou citotóxicas. Um fragmento de um antígeno tumoral, de preferência, compreende uma sequência de pelo menos 6, em particular, pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 30 ou pelo menos 50, aminoácidos consecutivos de antígenos tumorais. Um fragmento de um antígeno tumoral, de preferência, compreende uma sequência de até 8, em particular até 10, até 12, até 15, até 20, até 30 ou até 55 aminoácidos consecutivos de antígeno tumoral. Um fragmento de um antígeno tumoral é, de preferência, uma parte do antígeno tumoral que pode ser apresentada com as moléculas de MHC e, quando assim apresentado, é capaz de estimular uma resposta celular.
[0229] Fragmentos preferidos de um antígeno tumoral são adequados para a estimulação de linfócitos T citotóxicos in vivo, mas também para a produção de linfócitos T expandidos e estimulados para a transferência terapêutica adotiva ex vivo.
[0230] Anti-soros que contêm anticorpos específicos especificamente para ligação com a proteína-alvo podem ser preparados por vários processos padrão; ver, por exemplo “Antibodies: A Laboratory Manual" por Ed Harlow, David Lane, ISBN: 0879693142 e “Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO” por Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN 0879695447.
[0231] Assim, também é possível gerar anticorpos específicos e afins, que reconheçam proteínas complexa da membrana em sua forma nativa (Azorsa et al., J. Immunol. Methods 229: 35-48, 1999; Anderson et al., J. Immunol. 143: 1899-1904, 1989; Gardsvoll, J. Immunol. Methods 234: 107116, 2000). Isto é particularmente relevante para a preparação de anticorpos que são para serem usados terapeuticamente, mas também para muitas aplicações de diagnóstico. A este respeito, é possível se imunizar com a proteína inteira, com sequências extracelulares parciais, bem como com as células que expressam a molécula-alvo em sua forma fisiologicamente enovelada.
[0232] Os anticorpos monoclonais são tradicionalmente preparados utilizando-se a tecnologia de hibridoma, (para detalhes técnicos ver: "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" por Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9; "Antibodies: A Laboratory Manual" por Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142; "Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" por Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447).
[0233] Sabe-se que apenas uma pequena parte de uma molécula de anticorpo, o paratopo, está envolvida na ligação do anticorpo ao seu epítopo (cf. Clark, WR (1986), The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991), Essential Immunology, 7a Edição, Blackwell Scientific Publications, Oxford). As regiões pFc’ e Fc são, por exemplo, efetores da cascata do complemento, mas não estão envolvidas na ligação do antígeno. Um anticorpo de que o córtex pré-frontal "da região foi enzimaticamente removido ou que tenha sido produzido sem região pFc’, conhecido como fragmento F(ab')2, carrega ambos os sítios de ligação do antígeno de um anticorpo completo. Da mesma forma, um anticorpo a partir do qual a região Fc foi enzimaticamente removida ou que tenha sido produzido sem a referida região Fc, conhecido como fragmento Fab, carrega um sítio de ligação do antígeno de uma molécula de anticorpo intacta. Além disso, fragmentos Fab consistem de uma cadeia leve de ligação covalente de um anticorpo e de parte da cadeia pesada do referido anticorpo, referida como Fd. Os fragmentos Fd são os principais determinantes da especificidade do anticorpo (um fragmento Fd único pode ser associado com até dez cadeias leves diferentes, sem alterar a especificidade do anticorpo) e fragmentos Fd, quando isolados, mantêm a capacidade de se ligar a um epitopo.
[0234] Localizadas na parte de ligação ao antígeno de um anticorpo, se encontram as regiões complementares determinantes (CDRs), que interagem diretamente com o epítopo do antígeno e com as regiões framework (FRS) que mantêm a estrutura terciária do paratopo.
[0235] Tanto o fragmento Fd da cadeia pesada quanto a cadeia leve de imunoglobulinas IgG contêm quatro regiões framework (FRL a FR4) que são separadas, em cada caso, por três regiões complementares determinantes (CDRl a CDR3). Os CDRs e, em particular, a região CDR3 e, ainda mais particularmente a região CDR3 da cadeia pesada, são responsáveis em grande medida pela especificidade do anticorpo.
[0236] Regiões não-CDR de um anticorpo de mamíferos são conhecidas por serem capazes de ser substituídas por regiões similares de anticorpos com a mesma especificidade ou com uma especificidade diferente, com a especificidade para o epítopo do anticorpo original sendo mantida. Isso tornou possível o desenvolvimento de anticorpos “humanizados” em que CDRs não-humanos são covalentemente ligados a regiões FR e/ou Fc / pFc’ humanas para a produção de um anticorpo funcional.
[0237] Como outro exemplo, o documento WO 92/04381 descreve a produção e utilização de anticorpos humanizados RSV murinos em que pelo menos parte das regiões murinas FR foram substituídas por regiões FR de origem humana. Anticorpos deste tipo, incluindo fragmentos de anticorpos intactos com capacidade de ligação a antígeno, são muitas vezes referidos como “anticorpos quiméricos”.
[0238] De acordo com a invenção, o termo “anticorpo” também inclui fragmentos F(ab')2, Fab, Fv e Fd de anticorpos, anticorpos quiméricos, nos quais as régioes Fc e/ou FR e/ou CDRl e/ou CDR2 e/ou CDR3 de cadeia leve foram substituídas por sequências homólogas humanas ou não humanas, fragmentos quiméricos de anticorpos F(ab')2 em que as regiões FR e/ou CDRl e/ou CDR2 e/ou CDR3 de cadeia leve foram substituídas com sequências homólogas humanas ou não humanas, fragmento quimérico de anticorpos FAB em que as regiões FR e/ou CDRl e/ou CDR2 e/ou CDR3 de cadeia leve foram substituídas por sequências homólogas humanas ou não humanas, e fragmento quimérico de anticorpos Fd em que as regiões FR e/ou CDRl e/ou CDR2 foram substituídas por sequências homólogas humanas ou não humanas. O termo “anticorpos” também compreende anticorpos de “cadeia simples”.
[0239] Proteínas e peptídeos que não são anticorpos e que se ligam especificamente a antígenos tumorais podem substituir anticorpos, quando utilizados de acordo com a presente invenção. Aglutinantes deste tipo podem ser fornecidos, por exemplo, por bibliotecas de peptídeo degenerado que podem ser preparadas simplesmente em solução em uma forma imobilizada ou como bilbiotecas phage display. É igualmente possível preparar bibliotecas combinatórias de peptídeos com um ou mais aminoácidos. Bibliotecas de peptóides e resíduos não-peptídicos sintéticos também podem ser preparadas.
[0240] Os anticorpos também podem ser acoplados a um marcador terapêutico para a apresentação de células e tecidos expressando antígenos tumorais. Eles também podem ser acoplados a porções terapêuticas efetoras.
[0241] Em uma modalidade, os anticorpos aqui descritos se ligam especificamente a uma parte dos antígenos tumorais identificados de acordo com a presente invenção que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5, da listagem de sequências, ou um fragmento das mesmas ou uma variante da referida sequência de aminoácidos ou seu fragmento. Em uma modalidade, os anticorpos aqui descritos se ligam especificamente a um peptídeo de antígeno tumoral aqui descrito compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5, da listagem de sequências, ou um fragmento destas ou uma variante da referida sequência de aminoácidos ou um seu fragmento. Tais anticorpos podem ser obtidos usando-se um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5, da listagem de sequências, ou um fragmento destas ou uma variante da referida sequência de aminoácidos ou um seu fragmento para a imunização.
[0242] Marcadores detectáveis incluem qualquer marcador que tenha as funções de: (i) fornecer um sinal detectável; (ii) interagir com um segundo marcador para modificar o sinal detectável fornecido pelo primeiro ou segundo marcador, por exemplo, FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer); (iii) afetar a mobilidade, por exemplo, mobilidade eletroforética, por carga, forma, hidrofobicidade ou outros parâmetros físicos; ou (iv) fornecer uma porção de captura, por exemplo, afinidade, anticorpo / antígeno ou complexação iônica. Marcadores adequados são estruturas tais como: marcadores fluorescentes, marcadores luminescentes, marcadores cromóforos, marcadores radioisotópicos, marcadores isotópicos, de preferência marcadores isotópicos estáveis, marcadores isobáricos, marcadores enzimáticos, marcadores de partículas, em especial marcadores de partículas de metal, marcadores de partículas magnéticas, marcadores de partículas de polímero, pequenas moléculas orgânicas, como biotina, ligantes de receptores ou moléculas de ligação, tais como proteínas de adesão celular ou lectinas; o marcador compreendendo sequências de ácidos nucléicos e/ou resíduos de aminoácidos que podem ser detectados através da utilização de agentes de ligação e semelhantes. Marcadores detectáveis compreendem, de uma forma não-limitante: sulfato de bário, ácido iocetâmico, ácido iopanóico, ipodato de cálcio, diatrizoato de sódio, diatrizoato de meglumina, metrizamida, tiropanoato de sódio e diagnóstico de rádio, incluindo emissores de pósitrons como o flúor-18 e carbono-11, emissores gama, como o iodo- 123, tecnécio-99m, iodo-131 e índio-1ll e nuclídeos de ressonância magnética nuclear, como o flúor e gadolínio.
[0243] De acordo com a invenção, o termo “molécula efetora terapêutica” significa qualquer molécula que pode exercer um efeito terapêutico. De acordo com a invenção, uma molécula terapêutica efetora é, de preferência, seletivamente guiada a uma célula que expressa um ou mais antígenos tumorais e inclui agentes anticâncer, compostos radioativos marcados com iodo, toxinas, drogas citostáticas ou citolíticas e semelhantes. Antineoplásicos incluem, por exemplo: aminoglutetimida, azatioprina, sulfato de bleomicina, busulfan, carmustina, clorambucila, cisplatina, ciclofosfamida, ciclosporina, citarabidina, dacarbazina, dactinomicina, daunorrubina, doxorrubicina, taxol, etoposídeo, fluorouracila, sulfato de vimblastina, interferon-α, lomustina, mercaptopurina, metotrexato, mitotano, cloridrato de procarbazina, tioguanina e sulfato de vincristina. Outros agentes anticancerígenos são descritos, por exemplo, por Goodman e Gilman em “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, 8 a edição, 1990, McGraw-Hill, Inc., em particular no capítulo 52 (Antineoplásicos (Paul Calabresi e Bruce A. Chabner)). Toxinas podem ser proteínas como a proteína antiviral pokeweed, toxina da cólera, a toxina pertussis, ricina, resíduos de Toxina gelonina, ABRIN, exotoxina diftérica ou exotoxina de Pseudomonas. Também podem ser radionuclídeos emissores de alta energia, como cobalto-60.
[0244] O termo “complexo principal de histocompatibilidade” ou “MHC” inclui um MHC de classe I e classe II e se relaciona com um complexo de genes presentes em todos os vertebrados. Proteínas ou moléculas MHC estão envolvidas na sinalização entre linfócitos e células apresentadoras de antígenos em reações imunológicas normais por peptídeos de ligação e os apresentam para o reconhecimento por receptores de células T (TCR). Moléculas MHC ligam peptídeos dentro de um compartimento de processamento intracelular e apresentam esses peptídeos na superfície das células apresentadoras de antígenos para o reconhecimento pelas células T. A região MHC humana, também denominada HLA, está localizada no cromossomo 6 e inclui as regiões de classe I e classe II. Em uma modalidade preferida de todos os aspectos da invenção, uma molécula de MHC é uma molécula HLA.
[0245] O termo “reduzir” ou “inibir”, como aqui utilizado significa a capacidade de causar uma diminuição global, de preferência de 20% ou mais, de preferência mais de 50% ou mais e, mais preferivelmente de 75% ou superior, em níveis, por exemplo, no nível de proteína ou mRNA, em comparação com uma amostra de referência (por exemplo, uma amostra não tratada com siRNA). Esta redução ou inibição de expressão de RNA ou proteína pode ocorrer através de clivagem ou degradação do mRNA alvo. Ensaios para a expressão da proteína ou expressão de ácido nucléico são conhecidos no estado da técnica e incluem, por exemplo, ELISA e western blot para expressão de proteínas, e nothern blotting ou ensaios de proteção de RNase para RNA.
[0246] O termo “paciente”, de acordo com a presente invenção, é um ser humano, um primata não-humano ou outro animal, em particular um mamífero, como vaca, cavalo, porco, carneiro, cabra, cão, gato ou um roedor como um camundongo e rato. Em uma modalidade particularmente preferida, o paciente é um ser humano.
[0247] De acordo com a presente invenção, o termo “aumento” ou “aumento da quantidade” de preferência refere- se a um aumento de pelo menos 10%, em particular pelo menos 20%, pelo menos 50% ou pelo menos 100%. A quantidade de uma substância é também aumentada em uma amostra de teste, como uma amostra biológica, em comparação com uma amostra de referência, se for detectada na amostra de teste mas ausente ou não detectável na amostra de referência.
[0248] De acordo com a invenção, o termo “tumor” ou “a doença tumoral” se refere a uma lesão ou edema formado por um crescimento anormal de células (chamadas de células neoplásicas ou células tumorais). Por “células tumorais” deve-se entender uma célula anormal que se desenvolve por uma rápida proliferação descontrolada celular e continua a crescer após estímulos que iniciam o cessar de crescimento normal. Tumores mostram a falta parcial ou completa da organização estrutural e coordenação funcional do tecido normal e, normalmente, formam uma massa distinta de tecido que pode ser benigna, pré-maligna ou maligna.
[0249] De preferência, uma doença tumoral de acordo com a invenção é uma doença do câncer, ou seja, uma doença maligna e uma célula de tumor é uma célula cancerosa. De preferência, uma doença tumoral é caracterizada por células em que um ácido nucléico tumoral e/ou antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção é expresso ou anormalmente expresso e uma célula de tumor circulante ou uma célula de tumor metastática é caracterizada por expressão ou a expressão anormal de uma ácido nucléico tumoral e/ou antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção. De preferência, uma doença tumoral, uma célula de tumor ou uma célula de tumor circulante ou célula de tumor metastático é caracterizada pela apresentação de um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção com um MHC de classe I.
[0250] O termo “expressão anormal” significa, de acordo com a invenção, que a expressão é alterada, de preferência maior, em comparação com o estado em um indivíduo saudável. Um aumento na expressão refere-se a um aumento de pelo menos 10%, em particular pelo menos 20%, pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 500%, pelo menos 1000%, pelo menos 10.000% ou até mais. Em uma modalidade, a expressão só é encontrada em um tecido doente, enquanto a expressão em um tecido saudável é reprimida.
[0251] De acordo com a invenção, as células de um tecido ou órgão substancialmente não expressam um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção e/ou um ácido nucleico tumoral identificados de acordo com a invenção se o nível de expressão for menor em relação à expressão em células de placenta ou tecidos de placenta e/ou for menor em relação à expressão em células tumorais de ovário e/ou células tumorais do pulmão ou tecido ovariano tumoral e/ou tecido tumoral de pulmão. De preferência, o nível de expressão é menor do que 10%, de preferência menor que 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1% ou 0,05% ou ainda menor em comparação com as células ou tecidos acima. De preferência, um antígeno tumoral e/ou um ácido nucléico não é substancialmente expresso se o nível de expressão está abaixo do limite de detecção. De preferência, um tecido que substancialmente não expressa um antígeno tumoral identificado de acordo com a invenção e/ou um ácido nucléico tumoral identificado de acordo com a invenção quando o tecido é livre de tumores, ou seja, não tem uma doença tumoral, é um tecido de: ovário, pulmão, mama, duodeno, pele, cólon, fígado, nódulos linfáticos, estômago, baço, rins, esôfago, pâncreas, músculo do endométrio, cérebro, vesícula biliar, bexiga, glândula, íleo adrenal, reto e músculo do esqueleto, de preferência tecido de ovário ou tecido de pulmão. De preferência, tal tecido é um tecido diferente do tecido da placenta.
[0252] De preferência, uma doença tumoral de acordo com a invenção é o câncer, onde o termo “câncer”, segundo a invenção, compreende: leucemias, seminomas, melanomas, teratomas, linfomas, neuroblastomas, gliomas, câncer do reto, câncer endometrial, câncer renal, câncer de adrenal, câncer de tireóide, câncer no sangue, câncer de pele, câncer do cérebro, câncer cervical, câncer intestinal, câncer do fígado, câncer de cólon, câncer de estômago, câncer de intestino, câncer de cabeça e pescoço, câncer gastrointestinal, câncer de linfonodos, câncer de esôfago, câncer colorretal, câncer de pâncreas, câncer de ouvido, nariz e garganta (ONG ), câncer de mama, câncer de próstata, câncer de ovário, câncer de útero e câncer de pulmão e as metástases dos mesmos. Exemplos destes são: carcinomas de pulmão, carcinomas de mama, carcinoma da próstata, carcinomas de cólon, carcinomas de células de insuficiência renal, carcinoma cervical ou metástases dos tipos de câncer ou tumores descritos acima. O termo “câncer” de acordo com a invenção também compreende metástases do câncer.
[0253] Doenças tumorais ou cânceres preferenciais de acordo com a invenção são selecionados do grupo consistindo de: câncer de ovário, em particular adenocarcinoma de ovário e teratocarcinoma de ovário; câncer de pulmão, incluindo câncer de pulmão de células pequenas (CPCP) e câncer de pulmão de células não-pequenas (CPNPC), em especial carcinoma escamoso de pulmão e adenocarcinoma de células; câncer gástrico; câncer de mama; câncer hepático; câncer pancreático; câncer de pele, em especial carcinoma de células basais e em particular carcinoma espinocelular e melanoma maligno; câncer de cabeça e pescoço, em particular sarcoma pleomórfico; adenoma maligno, em particular sarcoma sinovial e carcinossarcoma; câncer do duto biliar; câncer de bexiga, em especial o carcinoma de células de transição e carcinoma papilar; câncer de rim, em especial o carcinoma de células renais, incluindo carcinoma de células claras de célula renal e carcinoma de célula renal papilar; câncer de cólon; câncer de intestino delgado, incluindo câncer do íleo, em particular adenocarcinoma do intestino delgado e adenocarcinoma do íleo; carcinoma testicular embrionário; coriocarcinoma de placenta; câncer cervical; câncer testicular, em especial seminoma testicular, teratoma testicular e câncer testicular embrionário e câncer de útero; e as suas formas metastáticas.
[0254] Doenças tumorais ou cânceres particularmente preferidos de acordo com a invenção são selecionados do grupo consistindo de: câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer ovariano metastático e câncer de pulmão metastático. De preferência, o câncer de ovário é um carcinoma do ovário ou um adenocarcinoma de ovário. De preferência, o câncer de pulmão é um carcinoma ou um adenocarcinoma e, de preferência, é o câncer bronquiolar, como um carcinoma bronquiolar ou adenocarcinoma bronquiolar. Em uma modalidade, a célula tumoral é uma célula de tal câncer. Cânceres ovarianos metastáticos incluem os carcinomas de ovário metastático e adenocarcinomas de ovário metastático; cânceres de pulmão metastáticos incluem os carcinomas de pulmão metastáticos, adenocarcinomas de pulmão metastáticos, carcinomas metastáticos bronquiolares e adenocarcinomas metastáticos bronquiolares.
[0255] Os principais tipos de câncer de pulmão são o carcinoma do pulmão de células pequenas (CPCP) e carcinoma de pulmão de células não-pequenas (NSCLC). Existem três principais sub-tipos de carcinomas de pulmão de células não- pequenas: carcinoma de pulmão de células escamosas, adenocarcinoma e carcinoma de pulmão de células grandes. Adenocarcinomas representam aproximadamente 10% dos cânceres do pulmão. Esse tipo de câncer geralmente é visto perifericamente nos pulmões, em oposição ao câncer de pulmão de células pequenas e do câncer de pulmão de células escamosas, em que ambos tendem a ocorrer mais centralmente.
[0256] Câncer de pele é um crescimento maligno na pele. Os cânceres de pele mais comuns são carcinoma basocelular, carcinoma espinocelular e melanoma. Melanoma maligno é um tipo grave de câncer de pele. Ocorre devido ao crescimento descontrolado de células de pigmento, chamadas melanócitos.
[0257] De acordo com a invenção, um "carcinoma" é um câncer que começa na camada de revestimento (células epiteliais) de órgãos.
[0258] Um "carcinoma bronquiolar" é um carcinoma do pulmão, que se acredita ser derivado do epitélio dos bronquíolos terminais, em que o tecido neoplásico se estende ao longo das paredes alveolares e cresce em pequenas massas dentro do alvéolo. Mucina pode ser demonstrada em algumas das células e no material dos alvéolos, que também inclui as células nuas.
[0259] Um "adenocarcinoma" é um câncer que se origina em tecido glandular. Este tecido também faz parte de uma categoria maior de tecidos conhecida como tecido epitelial. O tecido epitelial inclui pele, glândulas e uma variedade de outros tecidos que revestem as cavidades e órgãos do corpo. O epitélio é derivado embriologicamente do ectoderma, endoderme e mesoderme. Para ser classificado como adenocarcinoma, as células não precisam necessariamente ser parte de uma glândula, contanto que elas tenham propriedades secretoras. Esta forma de carcinoma pode ocorrer em alguns mamíferos superiores, incluindo os seres humanos. Adenocarcinomas bem diferenciados tendem a se assemelhar a um tecido glandular do qual eles são derivados, ao mesmo tempo podendo ser pouco diferenciado. Através da coloração das células em uma biópsia, o patologista irá determinar se o tumor é um adenocarcinoma ou algum outro tipo de câncer. Adenocarcinomas podem surgir em muitos tecidos do corpo devido à natureza ubíqua das glândulas dentro do corpo. Embora cada glândula não possa secretar a mesma substância, enquanto há uma função exócrina para a célula, este é considerado glandular e sua forma maligna é, portanto, chamada de adenocarcinoma. Adenocarcinomas malignos invadem outros tecidos e muitas vezes suas metástases propiciam tempo suficiente para tal invasão. O adenocarcinoma de ovário é o tipo mais comum de carcinoma ovariano. Ele inclui os adenocarcinomas seroso e mucinoso, o adenocarcinoma de células claras e o adenocarcinoma endometrióide.
[0260] Um "cistadenocarcinoma" é uma forma maligna de um tumor de superfície epitelial-estromal, um tipo de câncer de ovário.
[0261] Tumores de estroma de superfície epitelial são uma classe de neoplasias de ovário, que se acredita serem derivados do epitélio da superfície do ovário (peritônio modificado) ou a partir da trompa de Falópio ou tecido endometrial ectópico (tubário). Este grupo de tumores representa a maioria de todos os tumores de ovário.
[0262] Um teratocarcinoma se refere a um tumor de células germinativas, que é uma mistura de teratoma com carcinoma embrionário ou com coriocarcinoma, ou com ambos. Coriocarcinoma é um câncer maligno trofoblástico e agressivo, geralmente da placenta. É caracterizado por disseminação hematogênica precoce para os pulmões.
[0263] Um sarcoma é um câncer do tecido conjuntivo (osso, cartilagem, gordura), resultando em proliferação mesoderma. Isto se dá em contraste com carcinomas, que são de origem epitelial. Um sarcoma sinovial é uma forma rara de câncer que geralmente ocorre perto das articulações do braço ou da perna. É um dos sarcomas de tecidos moles.
[0264] Carcinoma de células renais também é conhecido como câncer de células renais ou adenocarcinoma de células renais é um câncer renal que se origina no revestimento do túbulo convoluto proximal, os tubos muito pequenos no rim que filtram o sangue e removem resíduos. Carcinoma de células renais é, de longe, o tipo mais comum de câncer renal em adultos e mais letal de todos os tumores genitorurinários. Subtipos distintos de carcinoma de células renais são carcinoma de células renais claras e carcinoma de célula renal papilar. O carcinoma de células renais claras é a forma mais comum de carcinoma de células renais. Quando visto sob um microscópio, as células que formam o carcinoma de células renais claras parecem muito pálidas ou claras. O carcinoma papilar renal é o segundo subtipo mais comum. Estes cânceres formam poucas projeções digitiformes (chamadas papilas) em alguns, se não a maioria, dos tumores.
[0265] Por “metástase” se entende a disseminação de células cancerosas do seu local original para outra parte do corpo. A formação de metástase é um processo muito complexo e depende de desprendimento de células malignas do tumor primário, invasão da matriz extracelular, penetração da membrana basal endotelial para entrar na cavidade do corpo e vasos, e, então, depois de ser transportado pelo sangue, infiltração de órgãos-alvo. Finalmente, o crescimento de um novo tumor, ou seja, um tumor secundário ou tumor metastático, no local de destino depende de angiogênese. Uma metástase do tumor muitas vezes ocorre mesmo após a remoção do tumor primário porque as células do tumor, ou seus componentes, podem permanecer e desenvolver um potencial metastático. Em uma modalidade, o termo “metástase”, segundo a presente invenção, refere-se a “metástases à distância”, que se refere a uma metástase que é remota a partir do tumor primário e do sistema de linfonodos regionais.
[0266] As células de um tumor secundário ou metastático são como os do tumor original. Isso significa, por exemplo, que se o câncer de ovário metastasiza para o fígado o tumor secundário é composto de células ovarianas anormais, não de células do fígado anormais. O tumor no fígado é então chamado de câncer ovariano metastático, e não de câncer do fígado.
[0267] No câncer de ovário, a metástase pode ocorrer das seguintes formas: por contato direto ou extensão, que pode invadir os tecidos vizinhos ou órgãos localizados perto ou ao redor do ovário, como as trompas de falópio, útero, bexiga, reto, etc, ou por semeadura ou derramamento na cavidade abdominal, que é a forma mais comum de câncer de ovário que se espalha.
[0268] Células de câncer quebram a superfície da massa ovariana e se "soltam" em outras estruturas no abdômen, como o fígado, estômago, cólon ou diafragma, abandonando a massa ovariana, invadindo os vasos linfáticos e depois viajando para outras áreas distantes dos órgãos do corpo como o pulmão ou fígado; se soltando da massa ovariana, invadindo o sistema sanguíneo e viajando para outras áreas do corpo ou para órgãos distantes.
[0269] De acordo com a invenção, o câncer ovariano metastático inclui: câncer nas trompas de falópio; câncer nos órgãos do abdômen, como câncer no intestino; câncer no útero; câncer na bexiga; câncer no reto; câncer no fígado; câncer no estômago; câncer no cólon; câncer no diafragma; câncer nos pulmões; câncer no revestimento do abdômen ou pelve (peritônio) e câncer no cérebro. Da mesma forma, o câncer de pulmão metastático refere-se ao câncer que se espalhou dos pulmões para locais distantes e/ou para várias partes no corpo e inclui câncer no fígado, câncer nas glândulas supra-renais, câncer nos ossos e câncer no cérebro.
[0270] Uma recaída ou recorrência ocorre quando uma pessoa é afetada novamente por uma condição que a afetou no passado. Por exemplo, se um paciente sofre de uma doença tumoral, recebeu um tratamento bem sucedido da doença e mais uma vez desenvolve a referida doença, a referida doença recém-desenvolvida pode ser considerada como recaída ou recorrência. No entanto, de acordo com a invenção, uma recaída ou recorrência de uma doença tumoral pode, mas não necessariamente vai, ocorrer no local da doença do tumor original. Assim, por exemplo, se um paciente sofre de tumor de ovário e recebeu um tratamento bem sucedido uma recaída ou recorrência pode ser a ocorrência de um tumor de ovário ou a ocorrência de um tumor em um local diferente do ovário. Uma recaída ou recorrência de um tumor também inclui situações em que um tumor ocorre em um local diferente do local do tumor original, bem como no local do tumor original. De preferência, o tumor original para o qual o paciente recebeu um tratamento é um tumor primário e o tumor em um local diferente do local do tumor original é um tumor secundário ou metastático.
[0271] De acordo com a invenção, uma amostra biológica pode ser uma amostra de tecido, incluindo fluidos corporais, e/ou uma amostra celular e pode ser obtida de maneira convencional, como por biópsia de tecido, incluindo biópsia, e tomada de aspirado de sangue, brônquico, urina escarro, fezes ou outros fluidos corporais. De acordo com a invenção, o termo “amostra biológica” também inclui amostras biológicas processadas, tais como frações ou isolados de amostras biológicas, por exemplo, ácidos nucléicos e peptídeos/proteínas isolados.
[0272] De acordo com a invenção, o termo “imunoreativos” significa uma célula que pode amadurecer em uma célula imunológica (como células B, células T ajudantes ou células T citolíticas) com a estimulação adequada. Células imunorreativas compreendem células-tronco CD34+ hematopoiéticas imaturas e as células T maduras e células B imaturas e maduras. Se a produção de células T ajudantes ou citolíticas reconhecendo um antígeno tumoral é desejada, o imunoreativo é contactado com uma célula que expressa um antígeno tumoral em condições que favorecem a diferenciação da produção e/ou a seleção de células T citolíticas e de células T ajudantes. A diferenciação de precursores das células T em uma célula T citolítica, quando expostos a um antígeno, é semelhante à seleção clonal do sistema imunológico.
[0273] Os termos, “células T” e “linfócitos T” são utilizados alternadamente aqui e incluem células T auxiliares (células T CD4+) e células T citotóxicas (CTLs, células T CD8+) que compreendem células T citolíticas.
[0274] Alguns métodos terapêuticos são baseados em uma reação do sistema imunológico de um paciente, o que resulta em uma lise de tais células doentes, como as células cancerosas que apresentam um antígeno tumoral com um MHC de classe I. Neste contexto, por exemplo, linfócitos T citotóxicos específicos autólogos para um complexo de um peptídeo de antígeno tumoral e uma molécula de MHC podem ser administrados a um paciente tendo uma doença tumoral. A produção de tais linfócitos T citotóxicos in vitro é conhecida. Um exemplo de um método de diferenciação das células T pode ser encontrado no documento WO-A-9633265. Geralmente, uma amostra contendo as células, como células do sangue, é retirada do paciente e as células são contactadas com uma célula que apresenta o complexo e que pode causar a propagação de linfócitos T citotóxicos (células dendríticas, por exemplo). A célula-alvo pode ser uma célula transfectada como uma célula COS. Estas células transfectadas apresentam o complexo desejado em sua superfície e, quando em contato com os linfócitos T citotóxicos, estimulam a propagação deste último. A expansão clonal dos linfócitos T citotóxicos autólogos é então administrada ao paciente.
[0275] Em outro método de seleção de linfócitos T citotóxicos, complexos tetrâmeros fluorogênicos molécula/peptídeo de MHC de classe I são usados para a obtenção de clones específicos de linfócitos T citotóxicos (Altman et al, Science 274:94-96, 1996;. Dunbar et al, Curr. Biol. 8:413-416, 1998).
[0276] Além disso, as células que apresentam o complexo desejado (por exemplo, células dendríticas) podem ser combinadas com linfócitos T citotóxicos de pessoas saudáveis ou de outra espécie (camundongo, por exemplo) que pode resultar na propagação de linfócitos T citotóxicos específicos com alta afinidade. O receptor de células T dos linfócitos T específicos de alta afinidade propagados podem ser clonados e, opcionalmente, humanizados de forma diferente, e os receptores de células T assim obtidos, em seguida, transduzidos via transferência de genes, por exemplo usando vetores retrovirais, em células T de pacientes. Uma transferência adotiva pode ser realizada com estes linfócitos T geneticamente modificados (Stanislawski et al, Nat Immunol 2:962-70, 2001; Kessels et al, Nat Immunol 2:957-61, 2001).
[0277] Linfócitos T citotóxicos também podem ser gerados in vivo de uma maneira conhecida per se. Um método utiliza células não proliferativa expressando complexos peptídeo/MHC de classe I. As células utilizadas aqui serão aquelas que normalmente expressam as complexas, como as células tumorais irradiadas ou células transfectadas com um ou ambos os genes necessários para a apresentação do complexo (ou seja, o peptídeo antigênico e a molécula MHC de apresentadação). Outra forma preferida é a introdução do antígeno tumoral na forma de RNA recombinante, que podem ser introduzidos nas células através de transferência lipossomal ou por eletroporação, por exemplo. As células resultantes apresentam o complexo de interesse e são reconhecidas por linfócitos T citotóxicos autólogos, que então se propagam.
[0278] Um efeito similar pode ser atingido através da combinação de um antígeno tumoral ou um peptídeo de antígeno tumoral com um adjuvante, a fim de tornar a incorporação células apresentadoras de antígenos in vivo possível. O antígeno tumoral ou peptídeo de antígeno tumoral pode ser representado como proteína, como DNA (por exemplo, dentro de um vetor) ou como RNA. O antígeno tumoral pode ser processado para produzir um peptídeo parceiro para a molécula de MHC, enquanto um fragmento do mesmo pode ser apresentado sem a necessidade de processamento posterior. O último é o caso em particular, se estas podem se ligar a moléculas de MHC. É dada preferência a formas de administração em que o antígeno completo é processado in vivo por uma célula dendrítica, uma vez que este também pode produzir respostas de células T ajudantes que são necessárias para uma resposta imune eficaz (Ossendorp et al, Immunol Lett 74:75, de 2000; Ossendorp et al, Exp Med J. 187:693-702, 1998). Em geral, é possível administrar-se uma quantidade eficaz do antígeno tumoral em um paciente por injeção intradérmica, por exemplo. No entanto, a injeção pode também ser realizada intranodalmente em um nó linfático (Maloy et al., Proc Natl Acad Sci EUA 98:3299-303, 2001).
[0279] As composições farmacêuticas e métodos de tratamento descritos de acordo com a presente invenção podem também ser usadas para imunização ou vacinação para terapeuticamente tratar ou prevenir uma doença descrita. De acordo com a invenção, os termos “imunização” ou “vacinação”, de preferência, dizem respeito a um aumento ou a uma ativação de uma resposta imune a um antígeno. É possível a utilização de modelos animais para se testar um efeito imunizante no câncer. Por exemplo, as células de câncer humano podem ser introduzidas em um camundongo para gerar um tumor. O efeito sobre as células cancerosas (por exemplo, redução no tamanho do tumor) pode ser medido como uma medida para a eficácia de uma imunização por um agente administrado ao animal.
[0280] Como parte da composição de uma imunização ou de vacinação, de preferência, um ou mais agentes como descritos neste relatório descritivo são administrados em conjunto com um ou mais adjuvantes para induzir uma resposta imune ou para aumentar uma resposta imune. Um adjuvante é uma substância que aumenta a resposta imune. Adjuvantes podem aumentar a resposta imune através de um reservatório de antígeno (ou extracelularmente em macrófagos), ativando macrófagos e/ou estimular os linfócitos em particular. Adjuvantes são conhecidos e incluem, de modo não-limitante, um lipídio monofosforil A (MPL, SmithKline Beecham), saponinas, como QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 e QS-Ll (So et al. Mol. Cells 7:178-186, 1997), um adjuvante de Freund incompleto, adjuvante de Freund completo, vitamina E, montanídeo, alume, oligonucleotídeos CpG (cf. Kreig et al. 374:546-9 Nature, 1995) e várias emulsões de água em óleo preparadas a partir de óleos biodegradáveis, tais como esqualeno e/ou tocoferol. De preferência, de acordo com a invenção, peptídeos são administrados em mistura com DQS21/MPL. A proporção de DQS21 a MPL é tipicamente de cerca de 1:10 a 10:1, de preferência de cerca de 1: 5 a 5:1 e em particular em cerca de 1:1. Para administração em seres humanos, a formulação da vacina contém normalmente DQS21 e MPL em um intervalo de cerca de 1 mg a cerca de 100 mg.
[0281] Outras substâncias que estimulam uma resposta imune do paciente também podem ser administradas. É possível, por exemplo, se usar citocinas em uma vacina, devido às suas propriedades reguladoras sobre os linfócitos. Citocinas podem incluir, por exemplo, a interleucina-12 (IL-12), que se mostrou aumentando as ações de proteção das vacinas (cf. Science 268:1432-1434, 1995), GM-CSF e IL-18.
[0282] Há uma série de compostos que aumentam a resposta imunológica e que, portanto, podem ser usados em uma vacina. Estes referidos compostos compreendem moléculas co-estimulantes fornecidas na forma de proteínas ou ácidos nucléicos tais como B7-1 e B7-2 (CD80 e CD86, respectivamente).
[0283] Peptídeos podem ser administrados em uma maneira conhecida per se. Em uma modalidade, os ácidos nucléicos são administradas por métodos ex vivo, ou seja, através da remoção de células de um paciente, da modificação genética das referidas células a fim de incorporar um ácido nucléico e da reintrodução das células alteradas no paciente. Isso geralmente compreende a introdução de uma cópia funcional de um gene nas células de um paciente in vitro e reintroduzir as células geneticamente alteradas no paciente. A cópia funcional do gene está sob o controle funcional de elementos regulatórios que permitem que o gene venha a ser expresso nas células geneticamente alteradas. Métodos de transfecção e transdução são conhecidos de um técnico no assunto.
[0284] A invenção também fornece ácidos nucléicos para a administração in vivo, utilizando, por exemplo, vetores, como vírus e lipossomas alvo-controlados.
[0285] Em uma modalidade preferida, um vírus ou um vetor viral para a administração de um ácido nucléico é selecionado do grupo consistindo de: adenovírus, vírus adeno-associados, vírus pox, incluindo vírus vaccinia e vírus pox atenuado, vírus Semliki Forest, retrovírus, vírus Sindbis e partículas Ty semelhantes a vírus. Preferência particular é dada a adenovírus e retrovírus. Os retrovírus são tipicamente deficientes em replicação (ou seja, são incapazes de gerar partículas infecciosas).
[0286] Métodos de introdução de ácidos nucleicos em células in vitro ou in vivo compreendem transfecção de fosfato de cálcio precipitado de ácido nucléico, transfecção de ácidos nucleicos associadas à DEAE, transfecção ou infecção com o vírus acima transportando os ácidos nucleicos de interesse, transfecção mediada por lipossomas e semelhantes. Em modalidades particulares, preferência é dada para se dirigir o ácido nucléico para células particulares. Em tais modalidades, um suporte é utilizado para a administração de um ácido nucléico a uma célula (por exemplo, um retrovírus ou um lipossoma) que pode ter uma molécula- alvo de controle acoplada. Por exemplo, uma molécula, como um anticorpo específico para uma proteína de membrana de superfície da célula-alvo ou um ligante para um receptor na célula-alvo, pode ser incorporada ou anexada ao transportador de ácidos nucléicos. Anticorpos preferidos compreendem anticorpos que se ligam seletivamente a um antígeno tumoral. Se a administração de um ácido nucléico via lipossomas é desejada, proteínas de ligação a uma proteína de membrana de superfície associadas com endocitose podem ser incorporadas na formulação de lipossomas, a fim de tornar o controle do alvo e/ou a absorção possível. Tais proteínas compõem as proteínas do capsídeo ou mesmo fragmentos que são específicos para um tipo de célula particular, anticorpos para proteínas que são internalizados, proteínas de abordagem de um sítio intracelular e assim por diante.
[0287] Os compostos terapeuticamente ativos da presente invenção podem ser administrados através de qualquer rota convencional, incluindo injeção ou infusão. A administração pode ser realizada, por exemplo, por via oral, por via intravenosa, por via intraperitoneal, intramuscular, subcutânea ou transdérmica. De preferência, os anticorpos são terapeuticamente administrados por meio de um aerossol de pulmão. Ácidos nucléicos anti-senso são preferivelmente administrados por administração intravenosa lenta.
[0288] As composições da invenção são administradas em quantidades eficazes. Uma quantidade “eficaz” se refere a uma quantidade que alcança uma reação desejada ou o efeito desejado por si só ou em conjunto com doses adicionais. No caso do tratamento de uma doença em particular ou de uma condição particular, a reação desejada, de preferência, refere-se à inibição do curso da doença. Também pode compreender retardar o progresso da doença e, em particular, interromper ou reverter a progressão da doença. A reação desejada em um tratamento de uma doença ou de uma condição também pode ser o atraso do início ou prevenção do aparecimento da referida doença ou da referida condição. De acordo com a presente invenção, um diagnóstico ou tratamento de câncer pode também incluir o diagnóstico ou tratamento de metástases do câncer que já se formaram ou irão se formar. De acordo com a invenção, o termo, “tratamento” compreende o tratamento terapêutico e profilático, ou seja, a prevenção.
[0289] Uma quantidade eficaz de uma composição da invenção dependerá da condição a ser tratada, da gravidade da doença, dos parâmetros individuais do paciente, incluindo idade, estado fisiológico, tamanho e peso, da duração do tratamento, do tipo de um terapia de acompanhamento (se houver), da rota específica de administração e de fatores semelhantes. Assim, as doses das composições da invenção administradas podem depender de vários desses parâmetros. No caso de uma reação em um paciente não ser suficiente com uma dose inicial, doses mais elevadas (ou doses efetivamente maiores alcançadas por uma rota diferente, mais localizada de administração) podem ser utilizadas.
[0290] As composições farmacêuticas da presente invenção são preferivelmente estéreis e contêm uma quantidade eficaz de a substância terapeuticamente ativa para gerar a reação desejada ou o efeito desejado.
[0291] Geralmente, doses de um peptídeo a partir de 1 ng até 1 mg, de preferência de 10 ng a 100 μg, são formuladas e administradas. Se a administração de ácidos nucléicos (DNA e RNA) é desejada, doses a partir de 1 ng até 0,1 mg podem ser formuladas e administradas.
[0292] As composições farmacêuticas da invenção são geralmente administradas em quantidades farmaceuticamente compatíveis e em preparações farmaceuticamente compatíveis. O termo “farmaceuticamente compatíveis” refere-se a um material não tóxico, que não interage com a ação do componente ativo da composição farmacêutica. Preparativos deste tipo podem geralmente conter sais, substâncias tampão, conservantes, transportadores, substâncias que completam a imunidade de reforço como adjuvantes, por exemplo, oligonucleotídeos CpG, citocinas, quimiocinas, saponinas, GM-CSF e/ou RNA e, eventualmente, outros compostos terapeuticamente ativos. Quando utilizados em medicina, os sais devem ser farmaceuticamente compatíveis. No entanto, os sais que não são farmaceuticamente compatíveis podem usados para preparar sais farmaceuticamente compatíveis e sais farmacologicamente e farmaceuticamente compatíveis desta espécie estão incluídos na invenção e consistem, em uma forma não-limitante, naqueles preparados a partir dos seguintes ácidos: clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maléico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malônico, succínico, e semelhantes. Sais farmaceuticamente compatíveis também podem ser preparados como sais de metais alcalinos ou sais de metais alcalino-terrosos, tais como sais de sódio, sais de potássio ou sais de cálcio.
[0293] Uma composição farmacêutica da invenção pode compreender um transportador farmaceuticamente compatível. O termo “transportador” refere-se a um componente orgânico ou inorgânico, de origem natural ou sintética, em que o componente ativo é combinado a fim de facilitar a aplicação. De acordo com a invenção, o “transportador farmaceuticamente compatível” inclui um ou mais enchimentos sólidos ou líquidos compatíveis, solventes ou substâncias encapsulantes que são adequados para administração a um paciente. Os componentes da composição farmacêutica da invenção geralmente são de tal forma que nenhuma interação que prejudica substancialmente a eficácia desejada farmacêutica ocorre.
[0294] As composições farmacêuticas da invenção podem conter substâncias tampão adequadas, como um sal de ácido acético, um sal de ácido cítrico, um sal de ácido bórico, e um sal de ácido fosfórico.
[0295] As composições farmacêuticas podem, eventualmente, também conter conservantes adequados, tais como cloreto de benzalcônio, clorobutanol, parabeno e timerosal.
[0296] As composições farmacêuticas são normalmente fornecidas em uma forma de dosagem uniforme e podem ser preparadas em uma maneira conhecida per se. Composições farmacêuticas da invenção podem ser encontradas na forma de cápsulas, comprimidos, pastilhas, soluções, suspensões, xaropes, elixires ou na forma de uma emulsão, por exemplo.
[0297] Composições adequadas para administração parenteral, normalmente são uma preparação aquosa estéril ou não aquosa do composto ativo, que é de preferência isotônica com o sangue do receptor. Exemplos de portadores compatíveis e solventes são solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotônica. Além disso, óleos fixos, normalmente estéreis, são usados como solução ou meio de suspensão.
[0298] Deve-se ressaltar que o termo “compreende/compreendendo”, quando utilizado neste relatório descritivo, deve especificar a presença de características indicadas, inteiras, em etapas ou seus componentes, mas não exclui a presença ou adição de uma ou mais outras características, números de etapas inteira, componentes ou os seus agrupamentos. O simples fato de que certas medidas são recitadas mutuamente diferentes reivindicações dependentes ou descritas em modalidades diferentes não indica que uma combinação dessas medidas não pode ser usada com vantagem. No entanto, o termo “compreende/compreendendo” também inclui modalidades consistindo de características indicadas, inteiras, em etapas ou de seus componentes.
[0299] A presente invenção é descrita em detalhes pelas figuras e exemplos a seguir, que são utilizados apenas para fins ilustrativos e não pretendem ser um fator limitante. Devido ao relatório descritivo e aos exemplos, outras modalidades, que estão igualmente incluídas na presente invenção, são acessíveis a um técnico no assunto.
[0300] Desenhos:
[0301] Figura 1. Quantificação de expressão de CLDN6 em tecidos normais e cancerosos por RT-PCR em tempo real. Com exceção da placenta, apenas vestígios de transcrições CLDN6 puderam ser detectados em tecidos normais. Uma alta expressão de CLDN6 é encontrada em amostras de câncer de ovário (adenocarcinomas) e de câncer de pulmão (adenocarcinoma).
[0302] Figura 2: Quantificação da expressão de CLDN6 em tecidos normais usando-se RT-PCR em tempo real. Tecidos de três indivíduos foram testados para cada tipo de tecido normal. Apenas vestígios de transcrições CLDN6 puderam ser detectados em tecidos normais após 40 ciclos de RT-PCR. O único tecido normal, ligeiramente superior ao corte de expressão (linha tracejada, a média de expressão de todos os tecidos normais DSTs + 3 (99% porcento)) foi a placenta. Barras de erro, STD, são apresentadas.
[0303] Figuras 3a -3h: Quantificação de expressão de CLDN6 em tecidos cancerosos e em linhagens de células usando- se RT-PCR em tempo real. Em contraste com os tecidos normais, encontrou-se alta expressão de CLDN6 em amostras de câncer de ovário (adenocarcinomas), câncer de pulmão (NSCLC, com maior frequência e níveis de expressão em adenocarcinomas), câncer gástrico, câncer de mama, câncer hepático, câncer pancreático, câncer de pele (carcinoma basocelular e carcinoma de células escamosas), melanoma maligno, câncer de cabeça e pescoço (adenoma pleomórfico maligno), sarcoma (sarcoma sinovial e carcinossarcoma), câncer do duto biliar, câncer de células renais (carcinoma de células claras e carcinoma papilar), câncer uterino, câncer de bexiga (carcinoma papilar) e linhas de células cancerígenas A2780 (câncer de ovário), NIH-OVCAR3 (câncer de ovário), HCT-116 (câncer de cólon), EFO-27 (câncer de ovário), CPC-N (SCLC), NCI-H552 (NSCLC), SNU-I (câncer gástrico), KATOIII (câncer gástrico), YAPC (câncer no pâncreas), AGS (câncer gástrico), FU97 (câncer gástrico), MKN7 (câncer gástrico). A fim de não superestimar a frequência expressão de CLDN6 em tecidos cancerosos e linhas de células, apenas os níveis de transcrição, pelo menos 10 vezes acima do limite normal de expressão em tecido foram classificados como positivos (linha pontilhada).
[0304] Figura 4: análise de Western blot de expressão de CLDN6 em tecidos normais. Lisados de tecido de até cinco indivíduos foram testados para cada tipo de tecido normal. A não-expressão da proteína CLDN6 foi detectada nos tecidos normais analisados. NIH-OVCAR3, foi o controle positivo.
[0305] Figura 5: análise de Western blot de expressão de CLDN6 em tecidos cancerígenos. Em contraste com os tecidos normais, uma alta expressão da proteína CLDN6 foi detectada em amostras de câncer de ovário e de câncer de pulmão. NIH- OVCAR3 foi o controle positivo.
[0306] Figura 6: análise de Western blot de expressão de CLDN6 em linhagens de células cancerosas. A expressão de CLDN6 foi detectada em células transfectadas com HEK293 plasmídeo de expressão CLDN6 (controle positivo), NIH-OVCAR3 (câncer de ovário), MKN7 (câncer gástrico), AGS (câncer gástrico), CPC-N (SCLC), HCT-116 (câncer de cólon), FU97 (câncer gástrico), NEC8 (carcinoma embrionário testicular), JAR (coriocarcinoma da placenta), JEG3 (coriocarcinoma da placenta), BEWO (coriocarcinoma da placenta) e PA-I (teratocarcinoma do ovário).
[0307] Figura 7: Análise (IHC) imuno-histoquímica de expressão de CLDN6 em tecidos normais. A não-expressão da proteína CLDN6 foi detectável nos tecidos analisados. As marcas escuras visíveis no duodeno, pâncreas e rins representam corante precipitado e não se associam a estruturas celulares.
[0308] Figuras 8a-8h: análise (IHC) imuno- histoquímica de expressão de CLDN6 em tecidos cancerígenos. Em contraste com os tecidos normais, coloração forte ou, pelo menos, coloração significativa foi observada em cortes de tecidos a partir de (a) câncer de ovário, (b) câncer de pulmão, (c) câncer de pele, (d) câncer pancreático, câncer gástrico, (e) o câncer de mama, o câncer de bexiga (carcinoma de células de transição), (f) câncer cervical, câncer testicular (seminoma), (g) câncer de útero, câncer de intestino delgado e (h) câncer testicular (embrionário e teratoma). A coloração foi claramente acentuada na membrana plasmática de populações de células epiteliais malignas, enquanto que ao lado do estroma e células epiteliais não- malignas esta foi negativa. Estes resultados indicam que a proteína CLDN6 é localizada na membrana plasmática de células malignas.
[0309] Figura 9: Análise de citometria de fluxo de expressão de CLDN6 em células cancerosas. Células nativas foram coradas utilizando-se um anticorpo monoclonal comercial visando um domínio extracelular de CLDN6 (aCLDNó). Como controle, células HEK293 transfectadas com um plasmídeo de expressão CLDN6 e células HEK293 não-transfectadas foram usadas. Nenhuma marcação das células controle não- transfectadas foi observada, no entanto, forte marcação foi observada em células de controle CLDN6 transfectadas e em células cancerosas CLDN6 endogenamente expressando AGS (câncer gástrico), NIH-OVCAR3 (câncer de ovário), HCT-116 (câncer de cólon) e CPC- N (SCLC). Estes resultados mostram claramente que a CLDN6 está localizada na membrana plasmática das células cancerosas e pode ser alvo de anticorpos monoclonais dirigidos contra um domínio extracelular de proteínas.
[0310] Exemplos:
[0311] As técnicas e métodos utilizados neste documento são aqui descritos ou realizadas por uma maneira conhecida per se e são tal como descrito, por exemplo, em Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Todos os métodos, incluindo o uso de kits e reagentes, são realizados de acordo com informações do fabricante, salvo se especificamente indicado.
[0312] Exemplo 1: CLDN6 é um marcador que é específico para tumores do ovário e tumores de pulmão
[0313] A expressão de CLDN6 (sequência de ácido nucléico de acordo com a SEQ ID NO: 1, sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 2) foi quantificada em tecidos normais e amostras de câncer de ovário e câncer de pulmão (adenocarcinoma) usando RT-PCR em tempo real.
[0314] Para extração de RNA, realizou-se síntese de cDNA de primeira-fita transcrição reversa por PCR em tempo real (RT-PCR) conforme descrito anteriormente (Koslowski et al, 2006; Koslowski et al, 2007). Análise em tempo real de expressão quantitativa foi realizada em três exemplares, num ciclo de 40 RT-PCR. Após a normalização para HPRT (senso 5'- TGA CAC TGG CAA AAC AAT GCA-3'; anti-senso 5'-GGT CCT TTT CAC CAG CAA GCT-3', anelamento em 62oC) a expressão de CLDN6 (senso 5'- CTT ATC TCC TTC GCA GTG CAG-3'; anti-senso GAG 5'-AAG GAG GGC GAC GAT GAC ACA GAG-3', anelamento em 60oC) foi quantificada pelo método de cálculo ΔΔCT. Tecidos de até três indivíduos foram testados para cada tipo de tecido normal.
[0315] Com exceção da placenta, apenas vestígios de transcrições CLDN6 puderam ser detectados em tecidos normais. Em contraste, encontrou-se alta expressão de CLDN6 em amostras de câncer de ovário (adenocarcinomas) e de câncer de pulmão (adenocarcinoma), ver figura 1.
[0316] Exemplo 2: Quantificação da expressão de CLDN6 em tecidos normais, tecidos cancerosos e linhagens de células usando RT-PCR em tempo real
[0317] Utilizou-se total celular de RNA que foi extraído de amostras de tecido congelado e linhas celulares de câncer RNeasy Mini Kit (Qiagen), preparadas com um oligonucleotídeo dT18 e reversamente-transcritas com Superscript II (GIBCO/Lifetech), de acordo com as instruções do fabricante. A integridade do cDNA obtido foi testada pela amplificação de transcritos p53 em um ciclo de 30 PCR (senso 5'-CGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCG-3'; anti-senso, 5'- CCTAACCAGCTGCCCAACTGTAG-3'; anelamento em 67oC). Após a normalização para HPRT (sentido 5'- TGA CAC TGG CAA AAC AAT GCA-3'; anti-senso 5'-GGT CCT TTT CAC CAG CAA GCT-3', anelamento em 62oC) a expressão de CLDN6 (senso 5'-CTT ATC TCC TTC GCA GTG CAG-3'; anti-senso 5'- AAG GAG GGC GAT GAC ACA GAG-3', anelamento em 60oC) foi quantificada pelo método de cálculo ΔΔCT.
[0318] Tecidos de três indivíduos foram testados para cada tipo de tecido normal. Apenas traços de transcrições de CLDN6 puderam ser detectados em tecidos normais após 40 ciclos de RT-PCR; ver figura 2. O único tecido normal, ligeiramente superior ao corte de expressão (linha tracejada, média de expressão de todos os tecidos normais + 3 DSTs (99% percentual)) foi placenta. Barras de erro apresentadas como STD.
[0319] Em contraste com os tecidos normais, encontrou-se alta expressão de CLDN6 em amostras de câncer de ovário (adenocarcinomas), câncer de pulmão (NSCLC, com maior frequência e níveis de expressão em adenocarcinomas), câncer gástrico, câncer de mama, câncer hepático, câncer pancreático, câncer de pele (carcinoma basocelular e carcinoma de células escamosas), melanoma maligno de cabeça e pescoço (adenoma pleomórfico maligno), sarcoma (sarcoma sinovial e carcinossarcoma), câncer do duto biliar, câncer de células renais (carcinoma de células claras e carcinoma papilar), câncer uterino, câncer de bexiga (carcinoma papilar) e linhas de células cancerígenas A2780 (câncer de ovário), NIH-OVCAR3 (câncer de ovário), HCT-116 (câncer de cólon), EFO-27 (câncer de ovário), CPC-N (SCLC), NCI-H552 (NSCLC), SNU-I (câncer gástrico), KATOIII (câncer gástrico), YAPC (câncer no pâncreas), AGS (câncer gástrico), FU97 (câncer gástrico), MKN7 (câncer gástrico); ver figuras 3a a 3g. A fim de não superestimar a frequência de expressão de CLDN6 em tecidos cancerosos e linhas de células, apenas os níveis de transcrição pelo menos 10 vezes acima do limite normal de expressão em tecido foram classificados como positivos (linha pontilhada).
[0320] Exemplo 3: Quantificação de expressão de CLDN6 em tecidos normais, tecidos cancerosos e linhagens de células usando análise de Western blot
[0321] Western blot foi utilizado para análise de 20 μg de proteína total extraída de células lisadas com tampão de lise Laemmli. Extratos foram diluídos em tampão de amostra reduzido (Roth), submetidos a SDS-PAGE e, posteriormente, eletro-transferidos em membrana PVDF (Pall). Imunocoloração foi realizada com anticorpos policlonais reativos para CLDN6 (ARP) e beta-actina (Abcam) seguida por detecção de anticorpos primários com peroxidase conjugada de cabra anti-rato e anticorpos secundários de cabra anti-coelho (Dako).
[0322] Lisados de tecido de até cinco indivíduos foram testados para cada tipo de tecido normal. A não- expressão da proteína CLDN6 foi detectada em tecidos normais analisados; ver figura 4. NIH-OVCAR3 foi o controle positivo.
[0323] Em contraste com os tecidos normais, alta expressão da proteína CLDN6 foi detectada em amostras de câncer de ovário e de câncer de pulmão; ver figura 5. NIH- OVCAR3 foi o controle positivo.
[0324] Expressão de CLDN6 foi detectada em células HEK293 transfectadas com plasmídeo de expressão CLDN6 (controle positivo), NIH-OVCAR3 (câncer de ovário), MKN7 (câncer gástrico), AGS (câncer gástrico), CPC-N (SCLC), HCT- 116 (câncer em dois pontos), FU97 (câncer gástrico), NEC8 (carcinoma embrionário testicular), JAR (coriocarcinoma da placenta), JEG3 (coriocarcinoma da placenta), BEWO (coriocarcinoma da placenta) e PA-1 (teratocarcinoma ovário); ver figura 6.
[0325] Exemplo 4: Análise (IHC) imuno-histoquímica de expressão de CLDN6 em tecidos normais e tecidos cancerosos
[0326] Seções de parafina do tecido (4 mm) foram incubadas por 1 hora a 580C em uma placa de aquecimento (HI 1220, Leica). A parafina foi removida das seções pela incubação das lâminas em Roticlear (Roth) por 2 x 10 minutos em temperatura ambiente. Posteriormente, os cortes foram reidratados em álcool (99%, 2 x 96%, 80% e 70%, 5 minutos cada). A recuperação antigênica foi realizada por slides de ebulição a 120°C (15 psi) por 15 minutos em tampão citrato 10mM (pH 6,0) + 0,05% Tween-20. Imediatamente após, os slides de ebulição foram incubados em PBS por 5 minutos. A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada com peróxido de hidrogênio 0,3% em MeOH por 15 minutos em temperatura ambiente. Para evitar inespecificidade, as lâminas foram bloqueadas com soro de cabra 10% em PBS por 30 minutos em temperatura ambiente. Posteriormente, as lâminas foram incubadas com anticorpo policlonal CLDN6 específico (lμg/ml) (ARP) durante a noite a 4°C. No dia seguinte, as lâminas foram lavadas com PBS em temperatura ambiente (3 x 5 minutos) e incubadas com 100μl dos anticorpos secundários (Power Vision poli HRP-IgG anti-coelho pronto para uso (imunológico)) durante uma hora em temperatura ambiente. Posteriormente, as lâminas foram lavadas com PBS em temperatura ambiente (3 x 5 minutos). Uma coloração final foi realizada por meio de VECTOR NovaRED Substrato Kit SK- 4800 de Vector Laboratories (Burlingame). Cortes foram feitos contra hematoxilina por 90 segundos em temperatura ambiente. Após a desidratação com álcool (70%, 80%, 2x 96% e 99%, 5 minutos cada) e 10 minutos de incubação, lâminas foram montadas com xilol X-tra Kit (Medite Histotechnic).
[0327] A não-expressão da proteína CLDN6 foi detectável nos tecidos analisados; ver figura 7. As marcas escuras visíveis no duodeno, pâncreas e rins representam corante precipitado e não são associadas a estruturas celulares.
[0328] Em contraste com os tecidos normais, coloração forte, ou pelo menos coloração significativa, foi observada em cortes de tecidos a partir de (a) câncer de ovário, (b) câncer de pulmão, (c) câncer de pele, (d) câncer pancreático, câncer gástrico, (e) câncer de mama, câncer de bexiga (carcinoma de células de transição), (f) câncer cervical , câncer testicular (seminoma), (g) câncer de útero, câncer de intestino delgado e (h) câncer testicular (embrionário e teratoma); ver figuras 8a a 8h. A coloração foi claramente acentuada na membrana plasmática de populações de células epiteliais malignas, enquanto que ao lado do estroma e de células epiteliais não-malignas esta foi negativa. Estes resultados indicam que a proteína CLDN6 é localizada na membrana plasmática de células malignas.
[0329] Exemplo 5: Análise de citometria de fluxo de expressão de CLDN6 em células de câncer
[0330] Células foram colhidas com 5 mM EDTA/PBS e ressuspendidas em PBS/2% NaAcid FCS/0,1%. 2x105 células foram incubadas com um anticorpo monoclonal visando um domínio extracelular de CLDN6 (R & D) a 4°C por 30 minutos. Após a lavagem, as células foram incubadas com um anticorpo secundário APC-rotulado anti-cabra de camundongo (Jackson ImmunoResearch Laboratories) a 4°C por 30 minutos. Após a lavagem, as células foram coradas com iodeto de propídio (PI). A análise foi feita após gating on live (células Pi- negativas) usando o sistema BD FACSArray System Bioanalyzer.
[0331] Células nativas foram coradas utilizando-se um anticorpo monoclonal comercial visando um domínio extracelular de CLDN6 (αCLDN6). Como controle células HEK293 transfectadas com um plasmídeo de expressão CLDN6 e células não-transfectadas HEK293 foram usadas. Nenhuma marcação das células controle não-transfectadas foi observada, no entanto, forte marcação foi observada em células controles transfectadas CLDN6 e em CLDN6 expressando AGS endogenamente (câncer gástrico), NIH-OVC AR3 (câncer de ovário), HCT-116 (Câncer de cólon) e CPC-N (SCLC) células cancerosas; ver figura 9. Estes resultados mostram claramente que a CLDN6 está localizada na membrana plasmática das células cancerosas e pode ser alvo de anticorpos monoclonais dirigidos contra um domínio extracelular de proteínas.

Claims (6)

1. Método para detecção, diagnóstico ou monitoramento de uma doença tumoral caracterizado pelo fato de a expressão do antígeno tumoral Claudin-6 (CLDN6) ser aumentada, em que o referido método compreende a detecção e/ou a determinação da quantidade de um ou mais parâmetros selecionados do grupo que consiste de: (i) um ácido nucleico que codifica um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um antígeno tumoral, e (ii) um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de um antígeno tumoral, em uma amostra biológica isolada de um paciente, em que o referido antígeno tumoral compreende uma sequência de aminoácidos codificada por um ácido nucleico que compreende a sequência de ácido nucleico conforme definida na SEQ ID NO: 1 da listagem de sequências, em que a doença tumoral é selecionada do grupo que consiste em câncer gástrico, câncer hepático, câncer pancreático, câncer de cabeça/pescoço, câncer do ducto biliar e câncer da bexiga urinária.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a amostra biológica ser de um tecido ou órgão no qual as células, quando o tecido ou órgão é livre de tumores, não expressa o referido antígeno tumoral e/ou uma codificação de ácidos nucleicos do referido antígeno tumoral.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de a detecção e / ou determinação da quantidade compreender: (i) contatar a amostra biológica com um agente que se liga especificamente ao ácido nucleico ou ao peptídeo que deve ser detectado e/ou com a quantidade de que deve ser determinada, e (ii) detectar a formação e/ou determinar a quantidade de um complexo entre o agente e o ácido nucleico ou o peptídeo que deve ser detectado ou com a quantidade de que deve ser determinada.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de: (i) o agente que se liga especificamente ao ácido nucleico compreender um oligonucleotídeo que hibridiza especificamente este ácido nucleico, (ii) o agente que se liga especificamente ao peptídeo compreender uma ligação do anticorpo especificamente para o referido peptídeo.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de o agente compreender ainda um marcador detectável.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de o antígeno tumoral compreender a sequência de aminoácidos conforme definida na SEQ ID NO: 2 da listagem de sequências.
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