CN115448985A - 新型抗栓抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新型抗栓抗体，该抗体以FIXa为靶点且具有独特性能，其特异性靶向凝血因子FIXa与FVIIIa的结合位点，减少FVIIIa‑FIXa复合物形成，阻断FX向FXa的转化，从而发挥抗栓作用。本发明的抗体具有合适的抗栓性能，有效治疗浓度窗口较大、但不增加出血风险；可实现临床应用中对于适度抗栓及有效避免过度作用导致出血问题的需求。本发明还揭示以FIXa‑FVIIIa结合位点为靶点的筛选药物的方法。

Description

新型抗栓抗体
技术领域
本发明属于免疫学和药学领域，更具体地，本发明涉及一种新型抗栓抗体，其靶向凝血因子FIXa-FVIIIa结合位点。
背景技术
血栓栓塞性疾病是一类以动静脉和微血管血栓形成或栓塞为特点的临床常见疾病，由于血栓形成后血流受阻，或栓子脱落导致下游血流中断，将会造成组织器官的缺血和坏死。全球约有1790万人死于心血管疾病，占全球死亡人数的31％。血栓形成是引发各类严重心脑血管疾病的重要因素，血栓性疾病已成为当今社会威胁人类健康和生命的首要原因。血栓栓塞性疾病的主要治疗手段是抗栓治疗，包括抗凝、抗血小板以及溶栓。其中，抗凝治疗主要针对凝血级联反应中不同的凝血因子，通过抑制凝血因子来阻断凝血过程。
凝血因子是参与血液凝固过程的各种蛋白质组分。它的生理作用是，在血管出血时被激活，和血小板粘连在一起并且补塞血管上的漏口。这个过程被称为凝血。整个凝血过程大致上可分为两个阶段，凝血酶原的激活及凝胶状纤维蛋白的形成。为统一命名，世界卫生组织按其被发现的先后次序用罗马数字编号，有凝血因子(F)I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII等。一些凝血因子的编号后加上“a”则为其活化形式；例如，凝血因子IX(FIX)的活化形式为FIXa，凝血因子VIII(FVIII)的活化形式为FVIIIa。
目前临床上使用的抗凝药物有肝素及其衍生物、维生素K拮抗剂(如华法林)、小分子抑制剂利伐沙班、达比加群等，均可作用于凝血瀑布的共同凝血途径(凝血因子IIa、Xa)，难以避免对生理性止血功能产生影响，因而存在严重的出血危险，特别是脑出血。由于内源性凝血途径与病理性血栓形成密切相关而非止血功能所必须，内源性凝血因子的选择性抑制剂已成为新型抗凝血药物研究的热点。
FIXa是内源性凝血途径中关键的凝血因子，是唯一的可溶形式的凝血蛋白。FIXa能够有效地从组织因子承载细胞扩散到血小板，成为凝血链起始和放大阶段之间的关键环节。FⅨ也可以在聚集的血小板上由FⅪa直接激活。FIXa通过形成FIXa-FVIIIa复合物激活FX。然而，本领域目前仍未明确FVIIIa与FIXa结合位点及其结合作用。
发明内容
本发明的目的在于提供靶向凝血因子FIXa-FVIIIa结合位点的新型抗栓抗体及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种用于抗栓的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，CDR3的氨基酸序列如SEQID NO:8所示。
在一个优选例中，所述的单克隆抗体包括：(a)重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的抗体；或，(b))重链可变区氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示序列具有80％以上(如85％、90％、93％、95％、97％或99％以上)相同性、轻链可变区氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示具有80％以上(如85％、90％、93％、95％、97％或99％以上)相同性且具有(a)抗体功能的抗体。
在另一优选例中，所述的单克隆抗体包括：鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体；或，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包括：单链抗体(scFV)、结构域抗体、Fab片段、F ab′片段、Fd片段、F(ab’)2片段。
在另一优选例中，所述用于抗栓的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性靶向凝血因子FIXa与FVIIIa的结合位点，减少FVIIIa-FIXa复合物形成，阻断FX向FXa的转化，发挥抗栓作用。
在另一优选例中，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段将活化的部分凝血活酶时间(APTT)延长2～4倍(如2.5、3、3.5倍；较佳地以自然机体中活化的部分凝血活酶时间正常时间为对照，所述正常时间例如20-40秒，更佳地如25-36秒)；或，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段将活化的部分凝血活酶时间(APTT)延长至75秒以上，较佳地80秒以上(如80～120秒，更具体如82、85、88、90、95、100、110秒)。
在另一优选例中，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段作用于FIXa上的FIXa与FVIIIa结合位点或邻近位点，减少FVIIIa-FIXa复合物形成；较佳地，FIXa上的FIXa与FVIIIa结合位点或邻近位点包括：Asn93、Lys132、Arg165、Thr175，更佳地还包括：Ala95、Lys98、Asp164、Lys173、Tyr177，更佳地还包括：Lys126、Asn129、Asn178、Lys230、Arg233、Asn236。
在另一优选例中，各个位点的氨基酸残基的编号按照胰凝乳蛋白酶编号。
在另一优选例中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段不影响FIXa的催化活性。
在另一优选例中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段不结合的FIXa的催化活性位点，所述FIXa的催化活性位点例如His57-Asp102-Ser195位点。
在另一优选例中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段不影响PT时间。
在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸或含有该多核苷酸的构建体，所述多核苷酸编码权前面任一所述的用于抗栓的单克隆抗体或其抗原结合片段；较佳地，所述的构建体为表达载体。
在本发明的另一方面，提供一种抗体表达系统，所述表达系统含有所述的构建体或基因组中整合有外源的所述的多核苷酸；较佳地所述表达系统为细胞表达系统。
在本发明的另一方面，提供一种制备前面任一所述的用于抗栓的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，包括：在适合表达所述抗体的条件下，利用所述的抗体表达系统进行表达，从而表达出所述的抗体；较佳地，还包括纯化分离出所述抗体。
在本发明的另一方面，提供一种融合蛋白，其包括前面任一所述的用于抗栓的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及与之操作性连接的融合伴侣；较佳地，所述的融合伴侣包括(但不限于)：具有延长体内半衰期作用的蛋白或活性结构域，或对效应分子具有增效功能或结合作用的蛋白或活性结构域(发挥另一种或多种功能)；更佳地，所述具有延长体内半衰期作用的蛋白或活性结构域包括(但不限于)：免疫球蛋白Fc区、优选人免疫球蛋白Fc区，血清白蛋白(如人源的HSA)或其片段。
在一个优选例中，所述免疫球蛋白为选自IgG、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM中的一种或多种的组合，所述IgG选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型中的一种或多种的组合。
在另一优选例中，所述的用于抗栓的单克隆抗体或其抗原结合片段以及与之操作性连接的融合伴侣之间设有连接肽；所述连接肽优选选自由丙氨酸和/或丝氨酸和/或甘氨酸组成的柔性多肽链，连接肽的长度优选为3～30个氨基酸。
在本发明的另一方面，提供一种免疫缀合物，其包括前面任一所述的用于抗栓的单克隆抗体或其抗原结合片段，或前面所述的融合蛋白；以及与之连接(包括但不限于共价连接、偶联、附着、吸附)的功能性分子；较佳地，所述功能性分子包括(但不限于)：靶向血液细胞(如血小板)表面标志物的分子，亲水性聚合物(如聚乙二醇，聚乙二醇-脂质体复合体等)或可检测标记物(例如包括但不限于：荧光标记物、显色标记物)。
在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包括所述的用于抗栓的单克隆抗体或其抗原结合片段、所述的融合蛋白、或所述的免疫缀合物；较佳地，所述的药物组合物中还包括药学上可接受的载体。
在本发明的另一方面，提供前面任一所述的用于抗栓的单克隆抗体或其抗原结合片段、所述的融合蛋白、或所述的免疫缀合物或含有它们的药物组合物在制备用于缓解或治疗血栓栓塞性疾病的制剂、试剂盒或药盒中的用途；
在一个优选例中，所述的血栓栓塞性疾病包括(但可能不限于)：静脉、动脉或毛细血管血栓形成，心脏中的血栓形成，血液与人工表面接触的过程中和/或之后的血栓形成，间质性肺病(如纤维增生性和/或特发性肺纤维化)，炎症，神经炎性疾病，补体激活，纤维蛋白溶解，血管生成，FVIIIa-FIXa复合物形成诱导的凝血生成，FX被激活导致的凝血生成，FIIa扩增导致的凝血生成，视网膜血管通透性相关疾病(如栓塞)；较佳地，动脉或毛细血管血栓形成相关疾病包括(但可能不限于)：心肌梗塞、中风、深静脉血栓形成、门静脉血栓形成、肾静脉血栓形成、颈静脉血栓形成、脑静脉窦血栓形成、Budd-Chiari综合征或Paget-Schroetter病。
在本发明的另一方面，提供一种试剂盒或药盒，包括所述的用于抗栓的单克隆抗体或其抗原结合片段、所述的融合蛋白、或所述的免疫缀合物或含有它们的药物组合物。
在本发明的另一方面，提供一种筛选具有抗栓功能的物质(包括潜在物质)的方法，包括：
(1)将候选物质加入到含有FIXa与FVIIIa且两者相互作用(如形成FVIIIa-FIXa复合物)的体系中；
(2)检测体系中FIXa与FVIIIa的相互作用；若所述候选物质与FVIIIa竞争性结合FIXa，减少FVIIIa-FIXa复合物的形成，则表明该候选物质是具有抗栓功能的物质(包括潜在物质)；较佳地，通过测定FIXa与FVIIIa蛋白对接的方法预测候选物质与FIXa复合物的结合位点，更佳地，通过观测候选物质作用于FIXa上的FIXa与FVIIIa结合位点或邻近位点的情况来确定候选物质的功能(竞争性结合能力)，所述结合位点或邻近位点包括位点：Asn93、Lys132、Arg165、Thr175，更佳地还包括位点：Ala95、Lys98、Asp164、Lys173、Tyr177，更佳地还包括位点：Lys126、Asn129、Asn178、Lys230、Arg233、Asn236；较佳地，所述位点的氨基酸残基形成一个簇，占据位于FIXa蛋白c170-螺旋和c131-螺旋之间的共同表面。
在一个优选例中，观测候选物质作用于FIXa上的FIXa与FVIIIa结合位点或邻近位点的情况来确定候选物质的功能时，若候选物质在所述位点上表现出较强(具有显著性)的结合，则其是具有抗栓功能的物质(包括潜在物质)。
在另一优选例中，所述“减少”(也可称为减弱、弱化等)是具有统计学意义的减少或显著减少，如FVIIIa-FIXa复合物减少5％、10％、15％、20％、30％、50％、60％、80％、90％、95％以上。
在另一优选例中，还包括设置对照组，从而明确分辨测试组中FIXa与FVIIIa的相互作用与对照组的差异。
在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对FIXa或其上游或下游蛋白或基因设计的调控分子，如抗体、干扰分子(如干扰性RNA)、小分子化合物、基因改造或基因编辑构建物等。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1A、FIXa-4抗体对FIXa的亲和力。
图1B、FIXa-4抗体的活化的部分凝血活酶时间。
图1C、FIXa-4抗体的凝血酶原时间。
图2、FIXa-4抗体对FIXa酶活性的影响。
图3、FIXa-4抗体与FIXa的结合面。
(A)FIXa(蓝色；左侧部结构)的催化三联体His57-Asp102-Ser195(绿色；箭头所示)不会被FIXa-4抗体(红色；右侧部结构)的结合阻碍。
(B)FIXa-4抗体(红色；右侧部结构)和FIXa(蓝色；左侧部结构)之间的接触面覆盖了部分FIXa和FVIIIa之间的预测结合位点(黄色显示；箭头所示)。
(C)相对图B的背侧视角，图中左侧部为FIXa-4抗体结构、右侧部为FIXa结构；箭头所示处为部分FIXa和FVIIIa之间的预测结合位点。
图4A、FIXa-4抗体对FXa生成的抑制作用。
图4B、FVIIIa纠正FIXa-4抗体的抑制效果。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，揭示了一种以FIXa为靶点的、具有独特性能的高亲和抗FIXa抗体(FIXa-4)，其不直接与FIXa的底物催化位点结合、而是特异性靶向凝血因子FIXa与FVIIIa的结合位点，减少FVIIIa-FIXa复合物形成，阻断FX向FXa的转化，发挥抗栓作用。本发明的抗体具有合适的抗栓性能，有效治疗浓度窗口较大、但不增加出血风险；此外，本发明的抗体靶向于不直接结合FIXa的酶活性位点，一旦出现过度抗凝作用可外源性补充FVIII进行挽救，可实现临床应用中对于适度抗栓及有效避免过度作用导致出血问题的需求。
术语
如本文所用，凝血因子IX(序列：GenBnak登录号：2158)又称为凝血第九因子、凝血九因子、因子IX、FIX、F9等；FIXa为FIX的激活形式。例如，FⅪa在Ca2+参与下裂解FIX，使其变成活化的FIX(FIXa)。在一些方式中，也涵盖其变体形式，例如经过1个或更多个(1-20个；更具体如2个、3个、4个、5个或10个)氨基酸替换、缺失或插入后得到的变体蛋白，同时保留FIX或FIXa的活性。
如本文所用，“抗体”或“免疫球蛋白”在本文中用作一般术语，包括全长抗体、单链抗体以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原结合结构域或片段)。此外，本文所用的术语“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“单一可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等的术语中)一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本文需要更限定的解释。
如本文所用，“单克隆抗体”指单分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体显示对特定表位的单结合特异性和亲和性。
如本文所用，“融合伴侣”即FP、Fusion Partner，是指与目标多肽进行融合的另一个多肽，所述融合伴侣能够通过多种不同的机制影响融合蛋白的功能特性，例如延长目标多肽的体内半衰期。所述融合伴侣例如包括但不限于具有延长体内半衰期作用的蛋白或活性结构域，或对效应分子具有增效功能或结合作用的蛋白或活性结构域，其发挥另一种或多种功能。
如本文所用，“缀合物”是指功能性分子(包括多肽、小分子化合物、亲水聚合物、标记物)与本文所述的单克隆抗体共价或非共价连接后形成的产物，其中亲水聚合物与多肽可以在任意位置连接，例如多肽的N端、C端或者中部的合适位置。所述亲水聚合物如多糖、聚亚烷基二醇，如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚氧化乙烯(PEO)、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚乙烯醇等。
如本文所用，“抗栓”也可解释为“增加血管通透性”或“抗凝”。
两个多肽序列之间的“序列相同性”指示序列之间相同氨基酸的百分比。“序列相似性”指示相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列相同性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列相同性通常使用序列分析软件来测量。例如，可使用NCBI数据库的BLAST程序来确定相同性。
药剂的“有效量”指引起接受其施用的细胞或组织中的生理学变化所必需的量。
药剂例如药物组合物的“治疗有效量”指在必需的剂量和时间段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、降低、延迟、最小化或预防疾病的不良效果。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，驯养的动物(例如母牛、羊、猫、犬和马)、灵长类(例如人和非人灵长类如猴)、家兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。优选地，所述个体或受试者是人。
术语“药物组合物”指其形式使得其中含有的活性成分的生物学活性有效，且不含对会接受该组合物施用的受试者有不可接受的毒性的别的成分的制剂。
“药学可接受载体”指药物组合物中活性成分以外对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
术语“治疗/预防”指改变治疗个体中疾病的自然进程，并且可以是为了预防或在临床病理学的过程期间实施的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、降低疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。
术语“人源化抗体”指具有基本来自非人物种免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，其中所述分子其余的免疫球蛋白结构是基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。所述抗原结合位点可包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域，或者仅包含移植到可变结构域中适当构架区的互补性决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型的，或者通过一个或多个氨基酸替换进行修饰，例如进行修饰以与人免疫球蛋白更为相近。某些形式的人源化抗体保留了全部CDR序列。其他形式具有一个或多个相对于原始抗体而言发生了改变的CDR。
术语“可检测标记物”是指可连接于抗体上的，用于确定待待测对象中特定靶标的存在与否以及存在的量的标志物。所述“可检测标记物”可以是，但不限于：酶、荧光标记、核素、量子点、胶体金等。更具体地例如可选自：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。
抗体
本发明中，以凝血因子FIXa为靶点筛选单克隆抗体并研究其抗栓功能及作用机制。经过广泛研究筛选，提供了一种抗FIXa抗体，其特异性靶向凝血因子FIXa与FVIIIa的结合位点，减少FVIIIa-FIXa复合物形成，阻断FX向FXa的转化，发挥抗栓作用。本发明也包括所述抗FIXa抗体的抗原结合片段。
本发明人通过杂交瘤技术、单克隆抗体细胞表达纯化技术制备出高纯度的单抗，利用活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)评估单抗的抗栓效果，发色底物法检测其对FIXa酶活性的影响，采用蛋白-蛋白对接的方法预测FIXa与抗体相互作用结合位点，并通过竞争实验(间接通过发色底物法)对这一结合位点进行验证。结果显示，获得一种高亲和抗FIXa的单克隆抗体FIXa-4，FIXa-4明显延长APTT，并具有浓度依赖性。机制研究发现，FIXa-4不直接与FIXa的底物催化位点结合，而是占据了FIXa和FVIIIa的结合区域。因此，本发明获得了一种独特的单克隆抗体FIXa-4，其与FVIIIa竞争性结合FIXa阻碍了FVIIIa-FIXa复合物形成，阻断FX向FXa的转化而发挥抗栓作用。
在本发明的优选方式中，所述抗FIXa抗体所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
本发明所提供的抗FIXa抗体，可以包括框架区FR，例如后文表1中所列举的。但是，所述的框架区不限于表1中所列举的序列，进行框架区的部分序列或全部序列的改造后的抗体也包含在本发明中，例如，经由改造形成嵌合抗体或人源化抗体。
抗体的抗原结合特性通常由互补决定区CDR来决定，所述的CDR区与FR区有序排列，FR区不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，构成了抗体的抗原结合位点。CDR区是免疫学感兴趣的蛋白质的序列，本发明的抗体的CDR区是全新的。
本发明的抗体可以是完整的免疫球蛋白分子，也可以是抗原结合片段，包括但不限于Fab片段，Fd片段，Fv片段，F(ab’)2片段、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、结构域抗体，二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体。
在本发明的优选方式中，所述抗FIXa抗体具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链可变区，SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的轻链可变区。本发明也包括了：重链可变区氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示序列具有85％以上相同性、轻链可变区氨基酸序列与SEQ IDNO:2所示序列具有85％以上相同性的抗体，且其具有本发明实施例所述抗体相同功能的抗体；较佳地，该抗体的重链可变区/轻链可变区中，CDR区的氨基酸是保守的。
本发明的包括所述抗体的功能变体。所述变体能与亲代抗体竞争特异性结合FIXa，且其识别FIXa的能力及作用位置接近于本发明实施例中提供的具体的抗体(靶向凝血因子FIXa-FVIIIa结合位点)。所述功能变体可以具有保守序列修饰，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域己知的标准技术导入，例如定向诱变和随机PCR介导的诱变，并且可包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。较佳地，序列的修饰发生在所述抗体的CDR区以外的区域上。
根据本发明的实施例，本发明所述的抗体或其抗原结合片段将活化的部分凝血活酶时间(APTT)延长约3.5倍，具有合适的抗栓性能，有效治疗浓度窗口较大、但不增加出血风险。
构建体及抗体表达系统
本发明也提供了一种构建体，所述构建体含有本发明所述的分离的多核苷酸。所述构建体的构建方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，所述构建体可以通过体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等方法构建获得，更具体的，可以由所述的分离的多核苷酸插入到表达载体的多克隆位点构建而成。本发明中的表达载体通常指本领域熟知的各种市售表达载体等，例如可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。所述载体还可以包括与这所述多核苷酸序列操作性连接的一个或多个调控序列，所述调控序列可以包括合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达氨基酸序列的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。调控序列还可以包括合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端相连，在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。
通常来说，合适的载体可以包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。例如，这些启动子可以是包括但不限于大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、毕赤酵母的甲醇氧化酶启动子和其它一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。标记基因可用于提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，例如，可以是包括但不限于真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。当所述的多核苷酸被表达时，表达载体中还可以包括增强子序列，如果在载体中插入增强子序列，则将会使转录得到增强，增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本发明也提供了一种抗体的表达系统，所述表达系统含有本发明所述的构建体或基因组中整合有外源的本发明所述的多核苷酸。任何适用于表达载体进行表达的细胞都可以作为宿主细胞，例如，所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，具体可以是包括但不限于大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、丝状真菌、植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、HEK293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等中的一种或多种的组合。构建所述表达系统的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是包括但不限于显微注射法、基因枪法、电穿孔法、病毒介导的转化法、电子轰击法、磷酸钙沉淀法等中的一种或多种的组合。
融合蛋白/免疫缀合物
本发明也包括一种融合蛋白，包括如本发明所述的抗体的第一结构域和用于延长体内半衰期和/或对效应分子或效应细胞具有结合作用的第二结构域。
所述第二结构域中，用于延长体内半衰期的片段可以包括血清白蛋白或其片段、结合血清白蛋白的结构域(如抗血清白蛋白的抗体)等。
所述第二结构域中，对效应分子或效应细胞具有结合作用的片段可以包括免疫球蛋白Fc区等，优选选自人免疫球蛋白Fc区。所述人免疫球蛋白Fc区中包括用于改变Fc介导的效应功能的突变，所述效应功能包括CDC活性、ADCC活性、ADCP活性中的一种或多种的组合。所述免疫球蛋白可以选自IgG、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM等中的一种或多种的组合，所述IgG具体可以选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型等中的一种或多种的组合。抗体融合蛋白中包含的免疫球蛋白Fc区可以使所述融合蛋白形成二聚体，同时延长所述融合蛋白的体内半衰期和增加Fc介导的相关活性。在本发明一具体实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区可以是人IgG1的Fc区，更具体可以是野生型IgG1 Fc序列，所述序列可以被引入用于改变Fc介导的效应功能的突变，例如，a)改变Fc介导的CDC活性的突变；b).改变Fc介导的ADCC活性的突变；或c).改变Fc介导的ADCP活性的突变。此类突变描述于下列文献中：Leonard G Presta，Current Opinion in Immunology 2008，20:460-470；Esohe E.Idusogie et al.，JImmunol 2000，164:4178-4184；RAPHAEL A.CLYNES et al.，Nature Medicine，2000，Volume 6，Number 4:443-446；Paul R.Hinton et al.，J Immunol，2006，176:346-356。
本发明所提供的抗FIXa抗体的融合蛋白中，所述第一结构域和第二结构域之间可以设有连接肽。所述连接肽可以是通过由丙氨酸(A)和/或丝氨酸(S)和/或甘氨酸(G)组成的柔性多肽链，连接肽的长度可以为3～30个氨基酸，优选为3-9个、9-12个、12-16个、16～20个，在本发明另一具体实施方式中，连接肽的长度可以为8个或15个。
本发明也提供了一种分离的多核苷酸，编码本发明的抗体、或编码所述的融合蛋白，所述多核苷酸可以是RNA、DNA或cDNA等。提供所述分离的多核苷酸的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以通过自动DNA合成和/或重组DNA技术等制备获得，也可以从适合的天然来源加以分离。
本发明也提供了一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包括本发明所述的抗体、或本发明所述的融合蛋白。所述免疫缀合物通常还包括与所述抗体活融合蛋白连接(包括但不限于共价连接、偶联、附着、吸附)的功能性分子，所述功能性分子可以是包括但不限于亲水性聚合物、可检测标记物、放射性同位素、生物活性蛋白质、靶向血细胞(如血小板)表面标志物的分子等，或它们的组合。
所述的亲水性聚合物包括但不限于：聚乙二醇、聚乙二醇-脂质体复合体、多糖、聚亚烷基二醇，聚丙二醇(PPG)、聚氧化乙烯(PEO)、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚乙烯醇等或者其任何组合。
制备所述免疫缀合物的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以将所述抗体和/或融合蛋白与功能性分子直接或通过合适长度的间隔物进行连接，连接方式可以是化学交联或基因工程融合表达，从而获得所述免疫缀合物。
所述免疫缀合物可包含本发明的抗体或融合蛋白以及可检测标记物。所述的可检测标记物包括但不限于：荧光标记物、显色标记物、蛋白标签；如：酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。也可包含一个以上的标记物。为了检测和/或分析和/或诊断目的用于标记抗体的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。
本发明的抗体或融合蛋白可以与标记基团(标记的多肽)偶联，然后可以使用其例如用于诊断目的。合适的标记基团可以选自放射性同位素(例如上文提到的那些)或含有放射性同位素、放射性核素的基团、荧光基团(例如荧光蛋白例如GFP、RFP等、染料、罗丹明、荧光素及其衍生物例如FITC、花青染料)、酶基团(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶)、化学发光基团、生物素基团、金属颗粒(例如金颗粒)、磁性颗粒(例如具有含有磁铁矿(Fe3O4)和/或磁赤铁矿(Fe2O3)的核心)、预定的多肽基团等。
所述免疫缀合物可包含本发明的抗体或融合蛋白以及靶向血细胞如血小板的表面标志物的分子。所述靶向血细胞的表面标志物的分子可识别血细胞，其促进本发明的抗体达到血细胞。
药物组合物及试剂盒
本发明也提供了一种药物组合物，包括本发明的抗FIXa抗体、或本发明的抗FIXa抗体的融合蛋白、或本发明的免疫缀合物。
所述药物组合物中还可以包括各种本领域药学上可接受的载体。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，具体可以是包括但不限于：缓冲剂，如乙酸盐、Tris、磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯己双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烃基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；蛋白质，如血清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；张力调节剂，诸如海藻糖和氯化钠；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；表面活性剂，如聚山梨醇酯；成盐抗衡离子，如钠；金属复合物(如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，如
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或聚乙二醇(PEG)。用于体内施用的药物制剂一般是无菌的，实现药物制剂无菌的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以通过无菌滤膜过滤等方法来实现。本领域技术人员还可以根据药物组合物所需的剂型选择合适的药学上可接受的载体，以将其制备成不同的剂型，例如，本发明的药物组合物可以是包括但不限于片剂、注射剂、冻干剂等各种剂型。
所述药物组合物中，所述单克隆抗体、融合蛋白或免疫缀合物的含量通常是有效量的，所述有效量所对应的活性成分的含量可以根据所治疗的对象和特定给药方式来确定。例如，以药物组合物的总质量计，所述单克隆抗体、融合蛋白和免疫缀合物的含量范围可以是大约0.01～99％、0.1～70％、1～30％、0.01～0.05％、0.05～0.1％、0.1～0.3％、0.3～0.5％、0.5～1％、1～3％、3～5％、5～10％、10～20％、20～30％、30～50％、50～70％、或70～99％。
本发明的单克隆抗体、融合蛋白、免疫缀合物可以作为单一有效成分施用，也可以在联合治疗中施用，即与其他药剂联用。例如，所述联合治疗可以是所述单克隆抗体、融合蛋白、免疫缀合物联合其他至少一种抗血栓药物。再例如，所述联合治疗可以是所述单克隆抗体、融合蛋白、免疫缀合物与靶向其它血细胞特异性抗原的抗体联合使用。
本发明也提供了一种检测试剂盒，包括本发明所述的抗体、融合蛋白或免疫缀合物。所述试剂盒中还可根据需要包括：容器、对照物(阴性或阳性对照)、缓冲剂、助剂等，本领域技术人员可根据具体情况对其进行选择。所述试剂盒中也可包括使用说明书，以便于本领域技术人员操作。
用途
本发明也提供了本发明的抗体、融合蛋白、免疫缀合物或药物组合物在制备用于缓解或治疗血栓栓塞性疾病的制剂、试剂盒或药盒中的用途。
本发明中，所述“血栓栓塞性疾病”包括：静脉、动脉或毛细血管血栓形成，心脏中的血栓形成，血液与人工表面接触的过程中和/或之后的血栓形成，间质性肺病(如纤维增生性和/或特发性肺纤维化)，炎症，神经炎性疾病，补体激活，纤维蛋白溶解，血管生成，FVIIIa-FIXa复合物形成诱导的凝血生成，FX被激活导致的凝血生成，FIIa扩增导致的凝血生成，视网膜血管通透性相关疾病(如栓塞)等。
其中，动脉或毛细血管血栓形成相关疾病可包括：心肌梗塞、中风、深静脉血栓形成、门静脉血栓形成、肾静脉血栓形成、颈静脉血栓形成、脑静脉窦血栓形成、Budd-Chiari综合征或Paget-Schroetter病等。
本发明所提供的融合蛋白、免疫缀合物、药物组合物的“治疗有效量”优选地导致疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。例如，对于血栓性疾病的治疗，相对于未接受治疗的对象或同一对象的非患病期，“治疗有效量”优选地将血栓的形成减少(或血管通透性增加)至少约10％，优选至少约20％，更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％。抑制血栓形成的能力可以在体外反应体系、细胞模型或动物模型系统中评价。本领域技术人员可以根据实际情况选择合适的治疗有效量，例如，可以是对象的大小、对象症状的严重性和选择的特定组合物或给药途径。治疗的处方(例如，对剂量的决定等)可以是由医生确定的，通常考虑的因素包括但不限于所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及其它因素等。预防有效量指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此“预防有效量”通常低于“治疗有效量”。
本发明还进一步提供利用所述的抗体检测FIXA抗原的检测方法，包括但不限于定性检测、定量检测和定位检测。具体地，所述检测方法包括但不限于免疫荧光测定、免疫组化和放射免疫测定等。
一种检测样品中是否存在FIXa抗原的方法可以包括：将样品与本发明的抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在FIXa抗原。所述的样品可以是细胞和/或组织样品；可以将样品固定或溶解在介质中；检测在所述固定或溶解的样品中FIXA抗原的水平。在一些实施方式中，检测对象可以是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。在另一些实施方式中，所述抗体还缀合有可用于检测或可被其他试剂检测到的荧光染料、化学物质、多肽、酶、同位素、标签等。
本发明中，所述FIXa-4抗体与之前报道的FIXa抑制剂不同，它并不直接作用于FIXa的酶催化活性位点，而是占据了FIXa和FVIIIa之间的大部分结合区域，阻断了FIXa-FVIIIa复合物形成，进而影响其催化FX向FXa的转化而引发抗凝作用。本发明人也观察到，FIXa-4抗体基本可阻断体外FXa的产生，而补充FVIIIa可使这一抑制作用得到纠正。也就是说FIX-4抗体的抗栓作用随着FVIIIa浓度的增加得到部分逆转。与现有抗栓药物相比，抗栓作用可逆是现今开发新型安全有效抗栓药物需要考虑的，在临床用药过程中可利用这一特性预防或治疗过度抗凝而引起的不可控出血副反应。因此，本发明人的这一发现是尤其有意义的，可参考FIXa-4抗体与的FIXa作用方式，来筛选或设计同样可实现这种竞争性结合的一类药物，其潜在地可能成为兼具凝血调节作用及安全性的药物。
因此，基于本发明人的新发现，提供了一种筛选具有抗栓功能的物质的方法，包括：(1)将候选物质加入到含有FIXa与FVIIIa且两者相互作用(如形成FVIIIa-FIXa复合物)的体系中；(2)检测(1)的体系中FIXa与FVIIIa的相互作用；若所述候选物质与FVIIIa竞争性结合FIXa，减少FVIIIa-FIXa复合物的形成，则表明该候选物质是具有抗栓功能的物质；较佳地，通过观测候选物质作用于FIXa上的FIXa与FVIIIa结合位点或邻近位点的情况来确定候选物质的功能，所述结合位点或邻近位点包括位点：Asn93、Lys132、Arg165、Thr175，更佳地还包括位点：Ala95、Lys98、Asp164、Lys173、Tyr177，更佳地还包括位点：Lys126、Asn129、Asn178、Lys230、Arg233、Asn236。所述位点的氨基酸残基或其部分可形成一个簇，占据位于FIXa蛋白c170-螺旋和c131-螺旋之间的共同表面。
进一步地，观测候选物质作用于FIXa上的FIXa与FVIIIa结合位点或邻近位点的情况来确定候选物质的功能时，若候选物质在所述位点上表现出增强的结合，则其是具有抗栓功能的物质。
以蛋白或基因或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。一些相对具体的方案中，所述的候选物质可包括但不限于：针对FIXa或其上游或下游蛋白或基因设计的调控分子，如抗体、干扰分子(如干扰性RNA)、小分子化合物、基因改造或基因编辑构建物等。
经过大规模的筛选，可以获得一类特异性作用于的上述感兴趣的位点，具有调控作用的潜在物质。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
1材料与方法
1.1制备以FIXa为靶点的单克隆抗体
1.1.1免疫小鼠及细胞融合
免疫SPF级BALB/c雄性小鼠(购自上海交通大学医学院动物科学部)，6-8周龄4只。初次免疫将购买的全长46KD FIXa抗原(Enzyme Research Laboratories公司)与弗氏完全佐剂(Sigma公司)混合至FIXa终浓度为100μg/100μl，两只脚垫各注射50μg/50μl。第二次免疫，将弗氏完全佐剂替换为弗氏不完全佐剂(Sigma公司)。第三次免疫，FIXa抗原用PBS稀释至100μg/100μl，进行腹腔注射。第四次免疫即加强免疫，进行尾静脉注射。共进行4次免疫，每次免疫间隔2周。
加强免疫后的第3天取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(实验室细胞系SP2/0)在PEG作用下进行细胞融合，获得杂交瘤细胞。
1.1.2抗体阳性细胞株筛选和克隆化
杂交瘤细胞培养7天后，采用ELISA法进行抗体阳性检测。在ELISA板(CORNING公司)中包被抗原FIXa 0.1μg/100μl，37℃孵育1.5h；再用2％BSA，37℃封闭1h；然后加入一抗即培养细胞的上清，37℃孵育1.5h；接着加入鼠源二抗，37℃孵育30min；最后加入显色底物TMB(Thermo公司)室温避光5min后，加入终止液2MH2SO4，终止反应。根据在分光光度计(Thermo Fisher scientific公司)450nm处测量的吸光度值，筛选抗体阳性细胞株。然后在半固体培养基(STEMCELL公司)中进行克隆化培养，7天后挑选出单克隆到96孔板中，按上述ELISA法再次进行筛选，最终获得抗体阳性的单克隆。
1.1.3抗体测序
收取足量细胞沉淀，提取RNA，然后逆转录为cDNA，接着选择合适的引物进行PCR，最后将PCR产物送公司测序。
1.1.4腹水制备及抗体纯化
选择雄性裸鼠(在上海交通大学医学院动物科学部购得)，6-8周龄4只。提前7天注射pristane(Sigma公司)0.5ml/只，然后在小鼠腹腔注射杂交瘤细胞0.5-1×106/0.5ml。7-10天后可见裸鼠腹部胀大，左下腹腔刺入针头，收集腹水至EP管中，5000rpm离心10min，收集上清，加入叠氮钠至终浓度为0.02％。
按照蛋白G琼脂糖纯化树脂(YEASEN公司)的说明书流程，将上述收集的腹水依次进行平衡，上样，洗杂，洗脱。最后用30KD的超滤管对洗脱液进行超滤浓缩，得到高纯度的单克隆抗体。
1.2抗体亚型及亲和力检测
根据Sigma公司的亚型检测试剂盒说明书，依次进行抗原包被，封闭，一抗孵育(0.1μg/100μl)，同型特异性试剂室温孵育30min，二抗(R-antiGoat-HRP)孵育，显色和终止液终止反应，最后测量其在450nm处吸光度。抗体的亲和力检测同上述ELISA法。
1.3凝血测定
抗体的凝血作用通过活化的部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)进行评估。
1.3.1活化部分凝血活酶时间(APTT)
首先将仪器及相关试剂预热至37℃。然后将抗体用OVB buffer(SIEMENS公司)稀释，再选定APTT程序，放置反应杯。依次加入50μl APTT试剂，50μl正混血浆和磁珠，按启动键使磁珠开始振荡。然后加入25μl抗体，按下计时键开始计时，180s后加入25μl 50mMCaCl2(SIEMENS公司)，同时按手柄上的测量键。观察磁珠振荡直至血浆凝固，记录仪器上的秒数。最后根据血浆中抗体终浓度的log值和凝血时间的秒数绘制曲线。
1.3.2凝血酶原时间(PT)
首先将仪器和试剂预热至37℃。然后将抗体稀释于正混血浆中再选定PT程序，放置反应杯。加入磁珠，按启动键使磁珠开始振荡，然后加入50μl含抗体的正混血浆，并按下计时键开始计时。60s后加入100μl PT试剂，同时按手柄上的测量键。观察磁珠震荡直至血浆凝固，记录仪器上的秒数。根据血浆中抗体终浓度的log值和秒数绘制曲线。
1.4 FIXa的发色底物法检测抗体对酶活性的影响
首先将分光光度计设置为37℃，选择动力学循环设置总时间为10min，间隔5s，循环次数为121次。然后参考FIXa发色底物SPECTROZYME(IMMBIOMED公司)的说明书，在96孔板中依次加入100μl Tris Buffer(50mM TRIS，100mM NaCl，5mM CaCl2，pH7.4 33％乙二醇)，10μl 2μM的FIXa蛋白，2.5μl抗体(终浓度为1000、10、1、0.1、0.01μg/ml)及对照TBS；最后加入12.5μl 10mM的FIXa发色底物，触发反应。测量其在405nm处吸光值的变化量△OD/min。
1.5 FIXa与FIXa-4单克隆抗体相互作用结合位点的预测
1.5.1 FIXa模型的建立
FIXa的三维模型基于一个FIXa催化结构域的抑制剂复合物(PDBentry:3LC3)的晶体结构构建而成。
1.5.2 FIXa-4单克隆抗体模型的建立
通过SabPred(Venkateswarlu D.Structural insights into the interactionof blood coagulation co-factor VIIIa with factor IXa:a computational protein-protein docking and molecular dynamics refinement study.Biochem Biophys ResCommun.2014 Sep26；452(3):408-14.)的Abody Builder来预测抗体可变区的三维结构。
1.5.3抗体-FIXa的对接
通过ClusPro进行抗体与FIXa的对接，在对接的过程中，使用的抗体模式，屏蔽抗体的非CDR区域(Dunbar J et al，SAbPred:a structure-based antibody predictionserver.Nucleic Acids Res.2016Jul 8；44(W1):W474-8)。
1.5.4抗体-FIXa相互作用的描述
描述FIXa与抗体相互作用的图表利用open-source PyMOL(2.5.0版)制作。
1.6 FIXa-4抗体与FVIIIa竞争结合FIXa
1.6.1 FVIII的激活
在125μl Buffer(20mM Hepes，300mM NaCl，2.5mM CaCl2)中加入100μl 10U/ml凝血酶和25μl 4mg/ml的FVIII，37℃孵育10min，得到FVIIIa(终浓度约为0.4mg/ml)。最后加入1U Hirudin，防止FVIIIa崩解。
1.6.2抗体抑制FIXa-FVIIIa复合物激活FX
首先将50ng/2μl的磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)混合物，5μl 20nM的FIXa，10μl 3μM的FX混合，然后加入预先混合好的8μl 80μg/ml的FVIIIa和5μl抗体，37℃孵育15min。再加入20μl 20mM的EDTA终止反应，最后加入150μl含0.1％PEG8000的TBS-Ca2+buffer稀释反应产物。
然后将酶标仪设置为37℃，选择动力学循环设置总时间为5min，间隔10s，循环次数为31次。在96孔板中加入40μl反应产物，再加入40μl发色底物S2765(1mM)，触发反应。测量其在405nm处吸光值的变化量△OD/min。
1.6.3 FVIIIa纠正抗体对FIXa-FVIIIa复合物激活FX的抑制作用
选取反应1.6.2中合适的抗体作用浓度，按照同样的方法，将上述反应体系中的5μl抗体换为2.5μl FVIIIa和2.5μl抗体(终浓度不变)，测量其在405nm处吸光值的变化量△OD/min。
1.6.4建立FXa生成量与裂解底物速率的标准曲线
首先将25μl FX(200nM)，25μl罗素毒蛇毒液(Russell Viper Venom，RVV)(42nM)，50μl TBS-Ca2+buffer(20mM Tris-HCl，100mM NaCl，5mM CaCl2，BSA0.1％)混合，37℃孵育30min后，FX被激活为FXa(终浓度为10nM)。
然后将分光光度计设置为37℃，选择动力学循环设置总时间为5min，间隔10s，循环次数为31次。在96孔板中加入40μl浓度梯度FXa和40μl发色底物S2765(1mM)，触发反应。测量其在405nm处吸光值的变化量△OD/min，即为裂解底物速率。根据FXa的终浓度和对应的反应速率绘制标准曲线。
实施例1、抗体的获得
本发明人先后通过免疫小鼠、杂交瘤融合、抗体测序、细胞表达与纯化技术，经过大量的研究筛选工作，获得1株与人FIXa高亲和的单克隆抗体。
测定该抗体的半最大效应浓度(EC50)，结果如图1A，EC50＝94.67ng/ml。
本发明人将该单克隆抗体命名为FIXa-4抗体。
FIXa-4抗体的重链可变区的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1)：
QVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLNTPGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSQLTISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCARSDDVSYALDYWGQGTSVTVSS
FIXa-4抗体的轻链可变区的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:2)：
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIDSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQFSLKIDSLQPEDFGSHYCQHHDGTTWTFGGGTKLEIK
其中，CDR区及其附近的框架区序列列于表1中。
表1
Figure BDA0003106965600000181
实施例2、APTT、PT评估单抗的抗凝作用
接着本发明人检测了该单抗对活化的部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)的影响，用来评估其在内源性凝血途径和外源性凝血途径中的作用。本发明人分别将不同浓度的单克隆抗体(终浓度为200，100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.56，0.78μg/ml)加入到APTT或PT反应体系中。
实验结果显示，与对照组相比，FIXa-4抗体使APTT显著延长。并且随着FIXa-4抗体浓度的增加，其对APTT的延长效应也增强，最大可使APTT延长至88.8s，相当于对照组25.5s的3.5倍，如图1B，IC50＝7.705μg/ml。这一延长效应明显高于目前抗栓药物要求的2.5倍APTT延长效应。进一步增加抗体浓度时，并未使APTT不受控制的延长，而是将APTT延长比例限定在3.5倍的范围内。这一结果表明FIXa-4有效治疗浓度窗口较大，不易增加出血风险，这非常符合临床实际所需。
同时，凝血酶原时间(PT)的测定显示，FIXa-4抗体基本不影响PT，如图1C。
以上实验数据表明，FIXa-4抗体特异性地抑制了内源性凝血途径，而不作用于FX、FII等外源凝血途径和共同凝血途径中的凝血因子。
实施例3、FIXa-4抗体不直接结合FIXa的酶催化活性位点
在内源性凝血途径中，FIXa是作为酶催化FX形成FXa来介导凝血瀑布反应的。因此，为了研究FIXa-4抗体的抗凝机制，本发明人首先检测了其对FIXa催化活性的影响。酶催化底物裂解的速率用来反映酶的催化活性。本发明人分别将不同浓度的FIXa-4抗体(终浓度为1000、10、1、0.1、0.01μg/ml)与FIXa蛋白混合孵育3分钟，再将其加入到FIXa发色底物反应体系中进行反应，实时监测OD405nm。ΔOD405/min反应了酶的催化活性。
实验结果显示，FIXa-4抗体对FIXa的酶催化活性无明显影响，如图2。
此实验结果表明，FIXa-4抗体并不是通过直接结合FIXa的催化活性位点发挥抗凝活性。
实施例4、FIXa-4抗体与FIXa作用位点的预测
为了进一步研究FIXa-4抗体的抗凝作用机制，本发明人利用蛋白对接的方法对FIXa-4抗体与FIXa的结合位点进行预测。蛋白质数据库(PDB)中没有经实验测定的FIXa全长蛋白的完整结构。考虑到本发明主要关注抗体对于FIXa催化活性的影响，故此基于一个FIXa催化结构域的抑制剂复合物结构(PDBentry:3LC3)建立了FIXa催化结构域的3D模型。同时利用抗体结构预测工具建立了FIXa-4抗体结合区域的3D模型，通过蛋白-蛋白对接预测了两者结合的最优构象集合。该构象集中，总共979个对接构象形成了30个聚类。对每个聚类的代表构象观察发现，大多数FIXa与FIXa-4抗体的结合构象共享一个结合表面，其中接触频率较高的残基列于表2中。在所有的构象中，FIXa-4抗体与FIXa之间的结合都不阻碍FIXa催化位点(由His57-Asp102-Ser195形成的催化三联体)的底物进出(图3A)。同时，虽然对接过程中并未考虑FIXa与抗体本身的构象变化，但考虑到结合位点与催化位点相距较远，且催化结构域三维结构比较稳定，受结合影响产生较大形变的可能性不高，因此可以初步确认FIXa-4抗体结合并不直接影响FIXa的催化。
另一方面，这些接触残基与之前预测的FIXa-FVIIIa结合面[DeLano WL(2002)ThePyMOL molecular graphics system]有相当部分重叠(图3B、3C)。例如，表1中FIXa的Asn-c93、Lys-c132、Arg-c165和Thr-c175等残基也与FVIIIa结合，并且Ala-c95、Lys-c98、Asp-c164、Lys-c173、Tyr-c177残基在序列上与预测的FIXa-FVIIIa结合残基也很接近，均少于2个残基位点。在3D结构中这些残基占据了位于FIXa蛋白c170-螺旋和c131-螺旋之间的共同表面，这恰恰是FIXa与FVIIIa的558-螺旋相结合的关键区域，因此FIXa-4抗体的结合可能与FVIIIa对FIXa的结合形成竞争。总之，对于FIXa-4抗体与FIXa催化结构域结合位点的预测表明FIXa-4抗体并不是通过直接结合FIXa的催化活性位点而降低其活性，而是与FVIIIa竞争性结合FIXa，阻碍FVIIIa-FIXa复合物的形成，从而抑制内源性凝血途径中FVIIIa对于FIXa的激活，进而降低FIXa的催化活性。
表2、FIXa最常与FIXa-4抗体接触的残基
Figure BDA0003106965600000201
表中所有的残基按照胰凝乳蛋白酶编号。考虑FIXa到抗体
Figure BDA0003106965600000202
以内的残基，频率为
Figure BDA0003106965600000203
其中∑为求和符号，s*表示包含接近抗体残基的对接集群的成员数量，s表示每个集群的成员数量，a残基：与FIXa和FVIIIa结合的预测位点相同。b残基：在结合残基附近的少于两个残基长度的。
实施例5、FIXa-4与FVIIIa竞争结合FIXa
如前所述，FIXa-4与FVIIIa竞争结合FIXa，那么随着FVIIIa浓度的增加，FIXa-4抗体的作用会减弱。首先本发明人建立了模拟体内FIXa-FVIIIa复合物产生FXa的体外模型。在此体系中加入PS/PC、FIXa、FVIIIa与FX，反应产生FXa，然后向此反应体系中加入FXa发色底物法来确定FXa的产生量。
本发明人发现，将不同浓度的FIXa-4抗体(终浓度为1560，780，390，156，78，39，15.6，7.8pM)加入到此体系中，FIXa-4抗体以剂量依赖的方式抑制了FXa的生成(图4A)。FIXa-4抗体的浓度达到400pM就使FXa的生成几乎完全被抑制。在此体系中增加FVIIIa的量至不同浓度(终浓度为1.1，1.6，2.5，3.7，5.6，8.3，12.5nM)，结果显示随着所加FVIIIa浓度的升高，抗体的抑制作用逐渐被纠正，纠正率达到近50％(图4B)。
该实验结果证明，FIXa-4与FVIIIa竞争结合FIXa发挥抗凝作用。
综上所述，本发明人得到的以FIXa为靶点的单克隆抗体FIXa-4，具有明显的抗凝作用。其作用机制为通过与FVIIIa竞争结合FIXa上的位点，抑制FVIIla-FIXa复合物的形成进而发挥抗凝作用。
该研究成果，为治疗血栓提供了新的靶点，也为FVIIIa与FIXa相互作用的结合位点提供间接证据。
讨论
目前使用的抗凝剂有多种局限性，包括不可预测的药代动力学、缺乏可逆性，在某些情况下，还有免疫原性。开发安全有效的抗栓药物仍是当代医药领域的研究热点。在选择靶向的凝血因子时，有2个重要的考虑因素。首先，在凝血瀑布反应显著放大发生之前阻断该通路。第二，以限速步骤为目标，应在最宽的治疗范围内提供有效的抗凝作用。FIXa是内源性凝血途径中关键的凝血因子，是唯一的可溶形式的凝血蛋白。FIXa能够从组织因子承载细胞扩散到血小板，成为凝血链起始和放大阶段之间的关键环节。
单克隆抗体具有结合抗原特异性强，半衰期长等特性。随着单克隆抗体技术的不断发展，抗体药物在疾病预防、诊断和治疗方面发挥着举足轻重的作用。本发明中先后通过杂交瘤技术、抗体测序、细胞表达与纯化技术得到了一种新型的抗FIXa单克隆抗体，并通过APTT、PT功能检测，描述了FIXa-4的抗栓特性。虽然FIXa-4延长APTT的作用是剂量依赖性的，但大量增加抗体浓度并未使APTT不受控制的延长，而是将APTT延长比例限定在约3.5倍的范围。这一结果表明FIXa-4有效治疗浓度窗口较大，不易增加出血风险，符合临床应用需求。
在探究其抗栓活性的作用机制时本发明人发现，FIXa-4与之前报道的FIXa抑制剂不同，它并不直接作用于FIXa的酶催化活性位点，而是占据了FIXa和FVIIIa之间的大部分结合区域，阻断了FIXa-FVIIIa复合物形成，进而影响其催化FX向FXa的转化而引发抗凝作用。更有意思的是，FIXa-4抗体基本可阻断体外FXa的产生，而补充FVIIIa可使这一抑制作用得到纠正。也就是说FIX-4抗体的抗栓作用随着FVIIIa浓度的增加得到部分逆转。与现有抗栓药物相比，抗栓作用可逆是现今开发新型安全有效抗栓药物需要考虑的，因为在临床用药过程中可利用这一特性预防或治疗过度抗凝而引起的不可控出血副反应。
综上所述，本发明人制备了一种以FIXa-FVIIIa结合位点为靶点的新型抗栓抗体，不仅为治疗血栓提供了新的思路，也为目前仍未非常明确的FVIIIa与FIXa结合位点提供了其作用方式的新证据。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海循曜生物科技有限公司
<120> 新型抗栓抗体
<130> 211750
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 鼠(Mus musculus)
<400> 1
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys Pro Ser Gln
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn Thr Pro
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
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Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser
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Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val
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Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
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Cys Ala Arg Ser Asp Asp Val Ser Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 鼠(Mus musculus)
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Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asp Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
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Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asp Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Phe Gly Ser His Tyr Cys Gln His His Asp Gly Thr Thr Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<213> 鼠(Mus musculus)
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<213> 鼠(Mus musculus)
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<213> 鼠(Mus musculus)
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Tyr
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<213> 鼠(Mus musculus)
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<213> 鼠(Mus musculus)
<400> 19
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 鼠(Mus musculus)
<400> 20
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10

Claims (10)

1.一种用于抗栓的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
2.如权利要求1所述的用于抗栓的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的单克隆抗体包括：
(a)重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的抗体；或
(b))重链可变区氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示序列具有80％以上相同性、轻链可变区氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示具有80％以上相同性且具有(a)抗体功能的抗体；
较佳地，所述的单克隆抗体包括：鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体；或，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包括：单链抗体、结构域抗体、Fab片段、Fab′片段、Fd片段、F(ab’)2片段。
3.一种分离的多核苷酸或含有该多核苷酸的构建体，所述多核苷酸编码权利要求1～2任一所述的用于抗栓的单克隆抗体或其抗原结合片段；较佳地，所述的构建体为表达载体。
4.一种抗体表达系统，所述表达系统含有权利要求3所述的构建体或基因组中整合有外源的权利要求3所述的多核苷酸；较佳地所述表达系统为细胞表达系统。
5.一种制备权利要求1～2任一所述的用于抗栓的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，包括：在适合表达所述抗体的条件下，利用权利要求5所述的抗体表达系统进行表达，从而表达出所述的抗体；较佳地，还包括纯化分离出所述抗体。
6.一种融合蛋白，其包括权利要求1～2任一所述的用于抗栓的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及与之操作性连接的融合伴侣；较佳地，所述的融合伴侣包括：具有延长体内半衰期作用的蛋白或活性结构域，或对效应分子具有增效功能或结合作用的蛋白或活性结构域；更佳地，所述具有延长体内半衰期作用的蛋白或活性结构域包括：免疫球蛋白Fc区、优选人免疫球蛋白Fc区，血清白蛋白或其片段。
7.一种免疫缀合物，其包括权利要求1～2任一所述的用于抗栓的单克隆抗体或其抗原结合片段，或权利要求6所述的融合蛋白；以及与之连接的功能性分子；较佳地，所述功能性分子包括：靶向血液细胞表面标志物的分子，亲水性聚合物或可检测标记物。
8.一种药物组合物，所述药物组合物包括权利要求1～2任一所述的用于抗栓的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求6所述的融合蛋白、或权利要求7所述的免疫缀合物；较佳地，所述的药物组合物中还包括药学上可接受的载体。
9.权利要求1～2任一所述的用于抗栓的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求6所述的融合蛋白、或权利要求7所述的免疫缀合物或含有它们的药物组合物在制备用于缓解或治疗血栓栓塞性疾病的制剂、试剂盒或药盒中的用途；
较佳地，所述的血栓栓塞性疾病包括：静脉、动脉或毛细血管血栓形成，心脏中的血栓形成，血液与人工表面接触的过程中和/或之后的血栓形成，间质性肺病，炎症，神经炎性疾病，补体激活，纤维蛋白溶解，血管生成，FVIIIa-FIXa复合物形成诱导的凝血生成，FX被激活导致的凝血生成，FIIa扩增导致的凝血生成，视网膜血管通透性相关疾病；较佳地，动脉或毛细血管血栓形成相关疾病包括：心肌梗塞、中风、深静脉血栓形成、门静脉血栓形成、肾静脉血栓形成、颈静脉血栓形成、脑静脉窦血栓形成、Budd-Chiari综合征或Paget-Schroetter病。
10.一种试剂盒或药盒，包括权利要求1～2任一所述的用于抗栓的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求6所述的融合蛋白、或权利要求7所述的免疫缀合物或含有它们的药物组合物。
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