FI119734B - Veren hyytymistä estävä aine ja von Willebrand-tekijän vastainen monoklonaalinen vasta-aine - Google Patents
Veren hyytymistä estävä aine ja von Willebrand-tekijän vastainen monoklonaalinen vasta-aine Download PDFInfo
- Publication number
- FI119734B FI119734B FI972279A FI972279A FI119734B FI 119734 B FI119734 B FI 119734B FI 972279 A FI972279 A FI 972279A FI 972279 A FI972279 A FI 972279A FI 119734 B FI119734 B FI 119734B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- antibody
- monoclonal antibody
- vwf
- human
- ajvw
- Prior art date
Links
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 title claims description 60
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 title description 60
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 title description 11
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 title description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 33
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 claims abstract description 32
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 53
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 claims description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 33
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 claims description 17
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 15
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 15
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 12
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 claims description 8
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 claims description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 6
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 claims description 6
- 241000700198 Cavia Species 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 claims description 2
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 claims 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims 1
- 208000019585 progressive encephalomyelitis with rigidity and myoclonus Diseases 0.000 claims 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 claims 1
- 101000782195 Homo sapiens von Willebrand factor Proteins 0.000 abstract description 32
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 abstract description 8
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 abstract description 6
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 abstract description 6
- 229940034998 human von willebrand factor Drugs 0.000 abstract description 3
- 108010081391 Ristocetin Proteins 0.000 abstract 1
- BGTFCAQCKWKTRL-YDEUACAXSA-N chembl1095986 Chemical compound C1[C@@H](N)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]([C@H]1C(N[C@H](C2=CC(O)=CC(O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)=C2C=2C(O)=CC=C(C=2)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2NC(=O)[C@@H]3C=4C=C(C(=C(O)C=4)C)OC=4C(O)=CC=C(C=4)[C@@H](N)C(=O)N[C@@H](C(=O)N3)[C@H](O)C=3C=CC(O4)=CC=3)C(=O)N1)C(O)=O)=O)C(C=C1)=CC=C1OC1=C(O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO[C@@H]5[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O5)O)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)C4=CC2=C1 BGTFCAQCKWKTRL-YDEUACAXSA-N 0.000 abstract 1
- 229950004257 ristocetin Drugs 0.000 abstract 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 38
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 34
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 33
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 29
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 27
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 26
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 16
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 229940127090 anticoagulant agent Drugs 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 9
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 101100435109 Homo sapiens PRNP gene Proteins 0.000 description 7
- 101710149643 Integrin alpha-IIb Proteins 0.000 description 7
- 102100025306 Integrin alpha-IIb Human genes 0.000 description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 6
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 6
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 6
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 6
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 208000027276 Von Willebrand disease Diseases 0.000 description 5
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 208000012137 von Willebrand disease (hereditary or acquired) Diseases 0.000 description 5
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 4
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 4
- 101100298543 Sus scrofa PRNP gene Proteins 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010062713 Haemorrhagic diathesis Diseases 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 3
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 3
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005508 8-azaguanine Drugs 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108010010336 Platelet Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000015795 Platelet Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 101000782192 Rattus norvegicus von Willebrand factor Proteins 0.000 description 2
- 101000782193 Sus scrofa von Willebrand factor Proteins 0.000 description 2
- 208000007814 Unstable Angina Diseases 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 2
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 2
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- DWZAJFZEYZIHPO-UHFFFAOYSA-N santin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C1=C(OC)C(=O)C2=C(O)C(OC)=C(O)C=C2O1 DWZAJFZEYZIHPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical class O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HIYAVKIYRIFSCZ-CYEMHPAKSA-N 5-(methylamino)-2-[[(2S,3R,5R,6S,8R,9R)-3,5,9-trimethyl-2-[(2S)-1-oxo-1-(1H-pyrrol-2-yl)propan-2-yl]-1,7-dioxaspiro[5.5]undecan-8-yl]methyl]-1,3-benzoxazole-4-carboxylic acid Chemical compound O=C([C@@H](C)[C@H]1O[C@@]2([C@@H](C[C@H]1C)C)O[C@@H]([C@@H](CC2)C)CC=1OC2=CC=C(C(=C2N=1)C(O)=O)NC)C1=CC=CN1 HIYAVKIYRIFSCZ-CYEMHPAKSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001495482 Aeonium arboreum Species 0.000 description 1
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000271517 Bothrops jararaca Species 0.000 description 1
- 206010008190 Cerebrovascular accident Diseases 0.000 description 1
- 238000011891 EIA kit Methods 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 208000032371 Glanzmann thrombasthenia 1 Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101000782194 Mus musculus von Willebrand factor Proteins 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-O PAF Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCOC[C@@H](OC(C)=O)COP(O)(=O)OCC[N+](C)(C)C HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-O 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 206010072564 Peripheral artery thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108010045766 Platelet Glycoprotein GPIb-IX Complex Proteins 0.000 description 1
- 102000023159 Platelet Glycoprotein GPIb-IX Complex Human genes 0.000 description 1
- 108010035030 Platelet Membrane Glycoprotein IIb Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 206010038460 Renal haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 208000000392 Thrombasthenia Diseases 0.000 description 1
- 208000001435 Thromboembolism Diseases 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012084 abdominal surgery Methods 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 1
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002364 anti-haemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000702 anti-platelet effect Effects 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 239000003472 antidiabetic agent Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 210000000702 aorta abdominal Anatomy 0.000 description 1
- 210000001742 aqueous humor Anatomy 0.000 description 1
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 210000001168 carotid artery common Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000006266 etherification reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006552 photochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002165 photosensitisation Effects 0.000 description 1
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 108700021367 rat Prl7d1 Proteins 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 235000015067 sauces Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- DSNBHJFQCNUKMA-SCKDECHMSA-N thromboxane A2 Chemical compound OC(=O)CCC\C=C/C[C@@H]1[C@@H](/C=C/[C@@H](O)CCCCC)O[C@@H]2O[C@H]1C2 DSNBHJFQCNUKMA-SCKDECHMSA-N 0.000 description 1
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 1
- 150000003627 tricarboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Veren hyytymistä estävä aine ja von Willebrand-teki jän vas tainen monoklonaalinen vasta-aine - Antitrombotiskt medel och anti-von Willebrand-faktor monoklonalisk antikropp 5 Tekniikan ala
Esillä oleva keksintö kohdistuu uuteen von Willebrand -tekijän vastaiseen monoklonaaliseen aineeseen, joka ei aiheuta verenvuotoja lääketieteellisesti tehokkaana annoksena ja jossa on veren hyytymistä estävää aktiivisuutta. Esillä oleva keksintö 10 kohdistuu myös hybridoomaan, joka tuottaa edellä mainittua mo-noklonaalista vasta-ainetta, ja veren hyytymistä estävään aineeseen, joka sisältää edellä mainittua monoklonaalista vasta-ainetta aktiivisena aineosana.
Tekniikan tausta 15 Kun subendoteeli paljastuu verisuonen seinämien vaurion aikana, verivirran kautta virtaavat verihiutaleet tarttuvat välittömästi subendoteeliin. Tämä laukaisee verihiutaleiden akti-vointiprosesseja, joihin kuuluvat verihiutaleiden kasautuminen ;*·*; ja solunsisäisten granuloiden vapautuminen, minkä jälkeen muo- ;·. 20 dostuu veritulppa ja täten verenvuoto lakkaa. Näin ollen veri- • · · .·. ; tulpan muodostuminen on tarpeellista ja välttämätöntä fysiolo- * · · I I giselle verenvuotoa tyrehdyttävälle mekanismille. Toisaalta • · · .* ’ veritulppa kuitenkin aiheuttaa verisuonitukostauteja, kuten • · sydänlihaskuolio, angina pectoris, aivokudoskuolio ja aivove- • · · ’·* 25 ritulppa, jotka ovat suurimpia ikääntyvän väestön kuoleman ai heuttajia. Tätä tilannetta pidetään vakavana ongelmana.
• · • · · • · · • · .···. Tähän mennessä on kehitetty monia veren hyytymistä estäviä ai- • · • neita verisuonitukostautien parantamiseksi ja estämiseksi.
• · · • · · *.* * Kuitenkin ongelmat, jotka on vielä ratkaistava, ovat siinä, • · · 30 että monien konventionaalisten veren hyytymistä estävien ai-neiden parantava teho on heikko kliinisessä käytössä, niiden • · · · verenvuototaipumusta sivuvaikutuksena. Yksi syistä on seuraava. Nimittäin melkein kaikki veren hyytymistä estävät .···. veritulppaspesifisyys on heikko ja ne aiheuttavat • · 2 aineet on suunniteltu vain verihiutaleita aktivoivan prosessin estämiseen. Menetelmä verihiutaleiden kasautumisen mittaamiseksi in vitro, joka tuottaa aktiivisuusindeksin, ei ole riittävä kuvaamaan monimutkaista veritulpanmuodostumisprosessia in 5 vivo.
Veritulpan muodostuminen etenee verihiutalekalvolla olevan glykoproteiinin ja subendoteelin tai plasmassa olevien proteiinien välisen spesifisen sitoumisen mukaisesti. Erityisesti plasmakalvolla oleva glykoproteiini Ilb/IIIa (lyhennetään tä-10 män jälkeen GPIIb/IIIa:ksi) toimii fibrinogeenin reseptorina veritulpan muodostumisen viimeisessä vaiheessa. Näin ollen arvellaan, että GPIIb/IIIa-antagonisteja voidaan käyttää tehokkaana veren hyytymistä estävänä aineena. GPIIb/IIIa:ssa oleva fibrinogeeniin sitoutuva kohta sisältää aminohappojen RGD-15 primaarisen sekvenssin. Monien RGD-johdannaisten synteesin ja arvioinnin tuloksena on vahvistettu, että GPIIb/IIIa-anta-gonisteissa on veren hyytymistä estävää tehoa siten, että ne inhiboivat voimakkaasti verihiutaleiden kasautumista in vivo eläinmallien ja kliinisten tutkimusten mukaisesti (Thrombosis 20 and Haemostasis, voi. 69, s. 560, 1993). Kuitenkin ongelmana on se, että GPIIb/IIIa-antagonistit tukahduttavat normaalin • · · · verenvuotoa tyrehdyttävän mekanismin ja näin ollen sivuvaiku- • · : tuksena esiintyy verenvuototaipumus voimakkaammin kuin konven- :*·.· tionaalisten verenvuotoa estävien aineiden tapauksessa (The • · 25 Lancet, voi. 343, s. 881, 1994, The New England Journal of Me- • · dicine, voi. 330, s. 956, 1994).
• · · • · · • · · *.* * Toisaalta ne proteiinit, jotka tiedetään tärkeiksi proteii neiksi ja jotka toimivat veritulpan muodostumisen varhaisessa • · vaiheessa, käsittävät verihiutalekalvolla olevan glykopro- : 30 teiini Ib:n (lyhennetään tämän jälkeen GPIbrksi) ja veriplas- • · · massa olevan von Willebrand -tekijän (lyhennetään tämän jäi- • · · *.. keen vWF:ksi). vWF:n kvalitatiiviseen ja kvantitatiiviseen • · *”** muutokseen liittyvät verenvuototaudit käsittävät von Wille- brandin taudin (nimitetään tämän jälkeen vWD:ksi) . On saatu 35 kliinistä tietoa, että vWD-potilaissa esiintyy vähän vakavaa ·«· verenvuotoa verrattuna potilaisiin, joilla on trombastenia 3 (GIIb/IIIa:n puutoksesta johtuva verenvuototauti) . Näin ollen on keksitty mahdollisuus, että voidaan saada voimakasta verenvuotoa estävää toimintaa ilman verenvuototaipumusta inhiboimalla GPIb:n ja vWF:n välinen vuorovaikutus. Kuitenkin vain 5 yksi monoklonaalinen vasta-aine ja molekyylipainoltaan pieni yhdiste ATA (auriinitrikarboksyylihappo; Blood, voi 72, s. 1898, 1988) on tiedetty substansseiksi, jotka inhiboivat spesifisesti GPIb:n ja vWF:n välistä vuorovaikutusta. Mitään GPIb:n vastaista monoklonaalista vasta-ainetta in vivo ei ole 10 vahvistettu. Sen sijaan sivuvaikutukset korostuvat siinä, että GPIb:n vastainen monoklonaalinen vasta-aine aiheuttaa veri-hiutaleniukkuutta ja pidentää verenvuotoaikaa (Blood, voi. 70, 344a, 1987, Jpn. J. Clin. Pathol., voi. 40, s. 266, 1992). Lisäksi on raportoitu niiden osalta, jotka antagonisoivat vWF:-15 ää, että edellä kuvattu ATA ja hiiren sian vWF:n vastaisessa monoklonaalisessa vasta-aineessa BB3-BD5 on veren hyytymistä estäviä tehoja in vivo -eläinkokeissa (Circulation, voi. 81, s. 1106, 1990) . Kuitenkaan sivuvaikutuksia ei voida olla ottamatta huomioon sekä ATA:n että BB3-BD5:n tapauksessa. Nimit-20 täin ATA vaikuttaa veren hyytymistä estävästi inhiboiden GPIb:n ja vWF:n välisen vuorovaikutuksen, kun taas ATAan liit-tyy täysin vastakkaisia sivuvaikutuksia siten, että se tehos- • · · taa verihiutaleiden kasaantumis- ja vapautumisreaktiota, jota • · · *. . avustaa koilakeeni, arakidonihappo, A23187, PAF ja TXA2 • · · *| 25 (Thrombosis and Haemostasis, voi 68, s. 189, 1992). Toisaalta • · · ’· *· BB3-BD5:ssä on voimakasta tendenssiä verenvuotoon veren hyyty- • · : *** mistä estävänä annoksena (Proc. natl. Acad. Sei. USA, voi. 84, 0: s. 8100, 1987, SURGERY, voi. 112, s. 433, 1992).
Kuten edellä kuvataan, olemassa olevien veren hyytymistä estä- • · · I.I 30 vien aineiden vaikeana ongelmana on se, että veren hyytymistä φ · ·;*’ estävää vaikutusta lääketieteellisenä vaikutuksena ei voida • · · ·/· ί erottaa verenvuoto taipumuksesta, joka on sivuvaikutus (lääke- tieteellisesti tehokkaan määrän ja määrän, joka aiheuttaa si- • · · vuvaikutuksen, välistä eroa ei ole).
• · · • · · · • · · 35 Äskettäin on kiinnitetty huomiota leikkausjännityksen indusoimaan verihiutaleiden kasautumaan (nimitetään tämän jälkeen SI- 4 PAksi) veritulppaan läheisesti liittyvänä patologisena tilana. Verisuonen halkaisija on pieni ja verivirran nopeus on suuri valtimonkovetustautivainmoissa ja pienissä valtimoissa. Siten tällaisilla alueilla esiintyy suuri leikkausjännitys verisuo-5 nen seinämän ja veren välisestä vuorovaikutuksesta johtuen. Tällaisessa tilanteessa veressä oleva vWF aktivoituu ja sen tertiaarinen rakenne muuttuu. Sen tulokseksena vWF:llä on ratkaiseva merkitys veritulpan muodostumisessa. Nimittäin seuraa-va prosessi tunnetaan. Ensiksikin subsendoteelillä oleva vWF 10 sitoutuu verihiutalekalvolla olevaan GPIb:hen ja siten verihiutaleet takertuvat verisuonen seinään. Toiseksi veriplasmassa oleva vWF ristikytkeytyy verihiutalekalvossa olevaan glykoproteiini IIb/IIIa:han ja siten verihiutaleiden kasaantu-misreaktio voi edetä. Näin ollen muodostuu lopulta veritulppa.
15 Tiedetään yleisesti, että antibioottiristosetiini tai käär-meenmyrkkybotrosetiini mahdollistaa sen, että vWF aiheuttaa tertiaarisen rakenteen muutoksen in vitro, joka on ekviva-lenttinen muutokselle, joka tapahtuu suuren leikkausjännityksen alaisena. Nimittäin ristosetiinin tai botrosetiinin läsnä-20 ollessa vWF saavuttaa GPIb:hen sitoutumiskyvyn. Menetelmät vWF:n fysiologisen aktiivisuuden mittaamiseksi in vitro käyt- • · · ·.* * tämällä edellä mainittua karasteristiikkaa käsittävät ris- ·· • *·· tosetiinillä indusoidun verihiutaleiden kasaantumisen (lyhen- • · netty tästä lähtien RIPAksi) ja botrosetiinillä indusoidun ve-25 rihiutaleiden kasaantumisen (nimitetään tästä lähtien BIPAksi) • · ί*· sekä menetelmän vWF:n GPIb:hen sitoutumisen mittaamiseksi ris- • · · tosetiinin tai botrosetiinin läsnäollessa. Edellä mainittuja menetelmiä käytetään yleisesti. Koetekniikoiden edistyksen . johdosta on kehitetty laite, jossa SIPA mitataan in vitro • · · 30 käyttämällä itse asiassa leikkausjännitystä. Tultiin tulok- • · **;·* seen, että vWF:ssä oleva identtinen domeeni osallistuu GPIb:- hen sitoutumiseen kaikissa reaktioissa.
• · · • · • · Tähän mennessä on valmistettu useita vWF:n vastaisia vasta-aineita, jotka inhiboivat vWF:n aktiivisuuden in vitro. Kui- • · · 35 tenkin monet niistä ovat heikkoja reaktiospesifisyydeltään ja useimmat niistä eivät inhiboi botrosetiinistä riippuvaista re- 5 aktiota vaikka ne inhiboivat ristosetiinistä riippuvaisen reaktion. Kuten edellä kuvattiin, katsottiin, että ristosetiinin indusoima vWF:ssä oleva GPIb-sitoutumiskohta on homologinen sen kanssa, jonka botrosetiini indusoi. Siten edellä mainitut 5 vasta-aineet tunnistavat mahdollisesti vWF:ssä olevan ristosetiinin tai botrosetiinin sitoutumiskohdan. Lyhyesti sanoen on mahdollista sanoa, että ne eivät inhiboi vWF:n fysiologista aktiivisuutta ja siten niiden reaktiospesifisyydet ovat heikot. Näissä olosuhteissa on raportoitu, että kaksi vasta-10 ainetta, so. Fujimura et ai:n valmistama NMC-4 (J. Nara Med. Assoc., voi 36, s. 662, 1985) ja Tuddenhan et ai:n valmistama RFF-VIIIRAG:1 inhiboivat in vitro sekä ristosetiinistä että botrosetiinistä riippuvaa reaktiota (Blood, voi. 177, No 1, s. 113, 1992).
15 On raportoitu, että näiden kahden vasta-aineen epitoopit ovat vWF-molekyylin GPIb:hen sitoutuvassa kohdassa ja ne sijaitsevat vWF-molekyylin aminohapposekvenssin 449:nnen ja 728:nnen aminohappotähteen välissä. Lisäksi RFF-VIIIRAG:1 inhiboi osittain jodilla merkityn NMC-4:n sitoutumisen vWF:ään. Tämän sei-20 kan mukaisesti katsottiin, että kumpikin epitooppi sijaitsee asemissa, jotka ovat merkittävän lähellä toisiaan. Lisäksi • · · *.· * RFF-VIIRAG:1 inhiboi BIPAn vain osittain, kun taas NMC-4 inhi- • · •’·· boi BIPAn täysin. Tästä syystä tehtiin uutteria tieteellisiä ί#*.: tutkimuksia vWF:stä käyttäen NMC-4 :ää ja joitakin tuloksia :*·.· 25 saatiin. Ihmisen lisäksi NMC-4: llä on reaktiivisuutta muissa • · eläimissä vain rotan vWF:ssä.
• · · • · · • · · *·* ’ Kun ihmisen vWF:n vastainen monoklonaalinen vasta-aine val mistetaan tiedon saamiseksi ihmisen vWF:n GPIbrhen sitoutu- • · ·.·.· miskohdasta tai monoklonaalisen vasta-aineen käyttämiseksi eh- • · · 30 käisevänä aineena ja terapeuttisena aineena sairauksiin, jotka ovat relevantteja vWF:ään, katsottiin toivottavaksi valmistaa • · · monoklonaalinen vasta-aine sellaisenaan, että siinä on suuri • · *;* spesifisyys ihmisen vWF:ään.
··· ···· .*··. Toisaalta kun uutta lääkettä kehitetään tavanomaisella ta- • ·
• M
35 valla, ei ole sallittua suorittaa mitään kokeita ihmisillä ilman että testejä on suoritettu aiemmin eläimillä. Kun vWF:n ja 6 vWF:n vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden fysiologisia aktiivisuuksia testataan in vivo, on käytettävä mono-klonaalista vasta-ainetta, joka mahdollistaa testin suorittamisen eläimillä, so. monoklonaalista vasta-ainetta, jolla on 5 samanaikaisesti reaktiivisuutta muun eläimen kuin ihmisen vWF:n kanssa. GPIIb/IIIa-antagonistit, jotka tukahduttavat voimakkaasti ihmisen verihiutaleiden kasautumisen fibrinogee-nin avulla, eivät ole tehokkaita rotassa (Thrombosis and Haemostasis , bol. 70, s. 531, 1993) . Lisäksi rotta ei aiheuta 10 ristosetiinin indusoimaa kasautumista. Näiden seikkojen mukaisesti katsotaan yleisesti, että veritulpan muodostumismekanis-mi eroaa suuresti ihmisessä ja rotassa. Siten on melkein merkityksetöntä arvioida minkään vWF:n vastaisen vasta-aineen veren hyytymistä estävää vaikutusta käyttämällä rottaa. Sen si-15 jaan marsun tapauksessa verihiutaleiden kasautuminen tukahdutetaan GPIIb/IIIa-antagonisteilla. Lisäksi ristosetiinillä indusoitu kasautuminen indusoituu samalla tavalla kuin ihmisessä. Näin ollen katsotaan, että marsu on sopivin eläin veri-tulppamalliksi in vivo -kokeissa, kun arvioidaan veritulpan 20 vastaista vaikutusta.
Edellä mainittujen näkökantojen mukaisesti mikä tahansa mono- • · · *.* * klonaalinen vasta-aine, jossa on reaktiivisuutta vain ihmisen • · • *·· vWF:n kanssa, ja monoklonaalinen vasta-aine, jossa on reaktii- • · _ J#*.i visuutta sekä ihmisen vWF:n että marsun vWF:n kanssa, on käyt- :*·.· 25 tökelpoinen. Kuitenkaan tällaisia anti-humaani-vWF-monoklonaa- • · ·'· lisiä vasta-aineita ei tunneta.
• · · • · · • · · *·' * Lisäksi ihmisen vWF:n vastaista monoklonaalista vasta-ainetta, jossa on vahvistettu olevan veren hyytymistä estävää vaikutus- • · ta in vivo, ei tunneta.
• · · • · • · • 30 Keksinnön kuvaus • · · • · · • · ·
Esillä oleva keksintö on tehty ottaen huomioon edellä mainitut ··· *. näkökohdat ja keksinnön kohteena on saada aikaan ihmisen von
Ml *”* Willebrand -tekijän vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita, • · *···* erityisesti monoklonaalinen vasta-aine, jossa on reaktiivi- 35 suutta sekä ihmisen vWF:n että marsun vWF:n kanssa, ja joissa 7 ei ole verenvuotovaikutusta lääketieteellisesti tehokkaana annoksena, joka on riittävä saamaan veren hyytymistä estävän vaikutuksen, hybridoomia edellä mainittujen monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi ja veren hyytymistä estävän ai-5 neen, joka sisältää aktiivisena aineosana jotakin edellä mainittua monoklonaalista vasta-ainetta.
Keksijät ovat onnistuneet saamaan aikaan monoklonaalisen vasta-aineen, jossa on reaktiivisuutta ihmisen von Willebrand -tekijän kanssa ja joka vaikuttaa inhiboiden ihmisen veri-10 hiutaleiden RIPAn, BIPAn ja SIPAn, immunisoimalla hiiri ihmisen vWF:llä ja fuusioimalla immunisoidun hiiren pernasolut hiiren myeloomasoluihin hybridooman valmistamiseksi. Lisäksi keksijät ovat havainneet, että monoklonaalisessa vasta-aineessa on voimakasta veren hyytymistä estävää vaikutusta ilman et-15 tä se aiheuttaa verenvuotoa in vivo -veritulppamallissa. Täten esillä oleva keksintö on tehty.
Esillä oleva keksintö koskee nimenomaan oheisten vaatimusten mukaista veren hyytymistä estävää ainetta.
Toisessa kohteessaan esillä oleva keksintö saa aikaan oheisten 20 vaatimusten mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen.
• ♦ · • · : ’*· Vielä eräässä kohteessa esillä oleva keksintö saa aikaan hyb- • · \*·· ridooman monoklonaalisen vasta-aineen, jolla on edellä • * l mainitut ominaisuudet, valmistamiseksi, joka vasta-aine muo- ·**.. dostetaan fuusiomalla hiiren von Willebrand -tekijällä immuno- 25 soitu pernasolu Sp2/0-Agl4-hiiren myeloomasoluun.
«
Esillä olevaa keksintöä selostetaan yksityiskohtaisesti jäl- *.*.* jempänä.
• · · • · • · ··* ··· • · · • · · ··· • · • · • · · ··· ···· *·· • ♦ • ♦ ··· 8 1. Esillä olevan keksinnön mukainen monoklonaalinen vasta-aine
Esillä olevan keksinnön mukainen monoklonaalinen vasta-aine on oheisten vaatimusten mukainen vasta-aine. Tässä kuvataan monoklonaalinen vasta-aine, jolla on seuraavat ominaisuudet: 5 a) monoklonaalinen vasta-aine on reaktiivinen ihmisen von Willebrand -tekijän kanssa, b) monoklonaalinen vasta-aine inhiboi ihmisen verihiutaleiden RIPAn (ristosetiinin indusoiman verihiutaleiden kasautuman), BIPAn (botrosetiinin indusoiman verihiutaleiden kasautuman) ja 10 SIPAn (leikkausjännityksen indusoiman verihiutaleiden kasautuman) , c) monoklonaalinen vasta-aine, joka inhiboi marsun verihiutaleiden RIPAn (ristosetiinin indusoiman verihiutaleiden kasautuman) ja BIPAn (botrosetiinin indusoiman verihiutaleiden 15 kasautuman) , ja d) monoklonaalinen vasta-aine, jossa on voimakasta veren hyytymistä estävää vaikutusta in vivo marsussa, mutta joka ei aiheuta verenvuotoa.
··· • · · ,· Edellä kuvatun monoklonaalisen vasta-aineen spesifioitu suori- • · • 20 tusmuoto esitetään monoklonaalisella vasta-aineella, jolla on *J lisäksi seuraavat ominaisuudet edellä olevien ominaisuuksien • · ·.*·: lisäksi: ·· • · • ·· ,···, e) monoklonaalinen vasta-aine inhiboi rotan verihiutaleiden • · · BIPAn (botrosetiinin indusoima verihiutaleiden kasaantuminen), .. 25 ja • · · • · · • · f) monoklonaalinen vasta-aine inhiboi kanin verihiutaleiden ··· BIPAn (botrosetiinin indusoima verihiutaleiden kasaantuminen).
• · · ···
Nimittäin esillä olevan keksinnön mukainen monoklonaalinen vasta-aine on erittäin reaktiospesifinen siten, että se on re- ·· · .···, 30 aktiivinen ihmisen vWF:n kanssa, sillä on suuri affiniteetti • · siihen ja se inhiboi voimakkaasti RIPAn, BIPAn ja SIPAn in vitro. Toisaalta esillä olevaan keksinnön mukainen mono- 9 klonaalinen vasta-aine inhiboi ainakin marsun RIPAn ja BIPAn. Jäljempänä kuvatuissa esimerkeissä saatu monoklonaalinen vasta-aine inhiboi lisäksi rotan ja kanin BIPAn in vitro. Kokeen mukaan, jossa marsulle annettiin kerran suonensisäisesti mono-5 klonaalista vasta-ainetta, se inhiboi RIPAn ja BIPAn ex vivo vaikuttamatta hematologisiin parametreihin ja koagulaatiopara-metreihin. Monoklonaalinen vasta-aine pidentää aikaa, jota tarvitaan reisivaltimotukokseen valokemiallisella reaktiolla indusoidussa veritulppamallissa, joka perustuu marsun käytit) töön, ja se pidentää aikaa, jota tarvitaan tukokseen valtimo-laskimo-ohituksen muodostusmallissa. Lisäksi monoklonaalista vasta-ainetta käytetään lääketieteellisesti tehokkaana annoksena, sen vaikutus jatkuu pitkän ajan ilman että veren-vuotoaika pitenee.
15 Tähän mennessä ei ole tunnettu mitään monoklonaalista vasta-ainetta, jossa on edellä kuvatut ominaisuudet. Esillä olevan keksinnön mukainen monoklonaalinen vasta-aine on uusi monoklonaalinen vasta-aine. Esillä olevan keksinnön mukainen monoklonaalinen vasta-aine eroaa selvästi epitoopiltaan edellä kuva-20 tusta NMC-4:stä sen lisäksi, että se reagoi eläimen vWF:n kanssa, myös siinä, ettei se inhiboi ollenkaan NMC-4:n sitou- • · · · tumista vWF:ään (katso jäljempänä esitetyt esimerkit). Se seikka, että esillä olevan keksinnön mukaisessa monoklo- • ·*·.· naalisessa vasta-aineessa on voimakkaasti tukahtunut veri- • · : 25 tulpan muodostuminen ilman, että se aiheuttaa verenvuototaipu- • · ;·. musta in vivo -tromboosimallissa, osoittaa mahdollisuuteen, • · · *... että esillä olevan keksinnön mukaista monoklonaalista vasta- • · · • · · ainetta voidaan myös käyttää ideaalisena terapeuttisena aineena veritulppasairauksiin. Esillä olevan keksinnön mukainen mo- • · · *·*·* 30 noklonaalinen vasta-aine on uusi sekä teollisesti käytet- • · · '...* tävissä.
• · · • · · • · · *.. Esillä olevan keksinnön mukainen monoklonaalinen vasta-aine ei • · *·;·’ ole pelkästään käyttökelpoinen vWF:n GPIbrhen sitoutuvan koh- *:* dan spesifioimiseen. Esillä olevan keksinnön mukaista monoklo- • · · · 35 naalista vasta-ainetta voidaan odottaa käytettävän myös keino- ··« na vWF:n leviämisen ja olemassa olevien muotojen analysoimi- 10 seksi in vivo ja ja vWD:n (von Willebrandin sairauden) syyn tutkimiseksi ja käytettäväksi ehkäisevänä aineena ja terapeuttisena aineena, joka tehoaa veritulppasairauksiin. Lisäksi esillä olevan keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta 5 voidaan käyttää edullisesti in vivo -kokeisiin, jotka perustuvat marsun käyttöön arvioitaessa veren hyytymistä estävää vaikutusta .
Monoklonaaliset vasta-aineet myös inhiboivat ihmisen verihiutaleiden leikkausjännityksen aiheuttamaa verihiutaleiden 10 takertumista (nimitetään tämän jälkeen SIPADiksi). SIPAD liittyy myös veritulpan muodostumiseen patologisessa tilassa. Normaalin ihmisveren käyttöön perustuvan kokeen perusteella vahvistettiin, että monoklonaaliset vasta-aineet inhiboivat SI-PADia annoksesta riippuvalla tavalla. Tällaista inhibointia ei 15 ole havaittu Gllb/IIIa-antagonistien osalta, joita otaksutaan käytettävän veren hyytymistä estävinä aineina nykyisin.
Monoklonaalista vasta-ainetta, jossa on edellä kuvatut ominaisuudet, voidaan käyttää farmaseuttisena aineena. Farmaseuttinen aine käsittää spesifisesti esimerkiksi veren hyy-20 tyrnistä estävän aineen, joka on kuvattu jäljempänä.
• · · *.* * 2. Esillä olevan keksinnön mukaisen hybridooman ja monoklo- • · * 1 naalisen vasta-aineen valmistaminen • · • · · • · · • · .·. j Esillä olevan keksinnön mukainen monoklonaalinen vasta-aine • · · ’ saadaan suorittamalla solufuusio ihmisen vWF:llä immunisoi- • · • · · *... 25 tujen vasta-ainetta tuottavien solujen ja myeloomasolujen vä- • · · *·* * Iillä hybridoomien muodostamiseksi, klonaamalla hybridooma, joka kykenee tuottamaan monoklonaalista vasta-ainetta, jossa • · on reaktiospesifisyyttä ihmisen vWF:ään ja inhiboimalla ihmi- M· ·...· sen verihiutaleiden RIPA, ΒΙΡΑ ja SIPA ja viljelemällä hybri- 30 dooma tai sen variantti.
• · · ·»· • «
Monoklonaalinen vasta-aine saadaan kloonaamalla hybridooma, joka kykenee tuottamaan monoklonaalisen vasta-aineen, joka in- «··» .*·*. hiboi marsun verihiutaleiden RIPAn ja BIPAn, ja viljelemällä ··· hybridooma tai sen variantti.
11
Hybridooma voidaan valmistaa Köhlerin ja Milsteinin menetelmän mukaisesti (Nature, s. 495-492, 1975). Menetelmä hybridoomien valmistamiseksi ja menetelmä hybridooman, joka kykenee tuottamaan kohteena olevaa monoklonaalista vasta-ainetta, valikoimi-5 seksi on selitetty jäljempänä.
Vasta-ainetta tuottavat solut saadaan immunisoimalla eläin, esimerkiksi Balb/c-hiiri ihmisen vWF:llä ja valmistamalla eläimestä vasta-ainetta tuottavia soluja, kuten pernasolut, imusolmukesolut ja periferaaliveri. Ihmisen vWF voidaan saada 10 puhdistamalla ihmisen veriplasma esimerkiksi geelisuodattamalla .
Vasta-ainetta tuottavat solut kerätään ihmisen vWF:llä immunisoidusta eläimestä solufuusion suorittamiseksi myeloo-masolujen kanssa. Erilaisista nisäkkäistä peräisin olevia so-15 lukantoja voidaan käyttää myeloomasoluina solufuusioon. Kuitenkin on edullista käyttää solukantoja, jotka ovat peräisin saman kannan eläimistä kuin se eläin, jota käytetään vasta-ainetta tuottavien solujen valmistamiseen. Fuusioitujen solujen erottamiseksi fuusioitumattomista soluista solufuusion 20 jälkeen on edullisesti käyttää myeloomasolukantaa, jossa on merkitsin siten, että fuusioi tumattomat myeloomasolut eivät • · · ;·. voi säilyä hengissä ja että vain hybridoomat voivat prolife- # «· *. . roida. Esimerkiksi hybridooma, joka on muodostettu 8-atsagu- • ♦· * * aniinille resistentin myeloomasolun ja vasta-ainetta tuottavan ♦ ♦ « φ· ** 25 solun normaalina soluna välisellä solufuusiolla, kykenee pro- ♦ ♦ • ’* liferoimaan väliaineessa (HAT-väliaine), joka sisältää hypok- • · · *.· * santiinia, aminopteriiniä ja tymidiiniä, kun taas myeloo- masolulinja, joka on resistentti 8-atsaguaniinille, kuolee • ♦ : : : HAT-väliaineessa, eikä normaalia vasta-ainetta tuottavaa solua ♦ · :***; 30 voida viljellä pitkää aikaa. Siten vain hybridooma voidaan ··· .h viljellä selektiivisesti (Science, voi. 145, s. 709, 1964).
• « « • · ·
Myeloomasoluna on edullista käyttää kantaa, joka ei eritä in- • « *·♦·’ herenttiä immunoglobuliinia siksi, että kohteena oleva vasta- aine saadaan helposti hybridooman viljelysupernatantista.
··· ♦ · • · ’** 35 Solufuusio suoritetaan esimerkiksi seuraavasti. Ihmisen vWF:llä immunisoidut pernasolut sekoitetaan hiiren myeloo- 12 masoluihin, esimerkiksi Sp2/0-Agl4 (8-atsaguaniiniresistentti, ei eritä IgG:tä) logaritmisessa kasvufaasissa siten, että pernasolujen suhde myeloomasoluihin on noin 10:1-1:1. Sentri-fugoinnin jälkeen jäännössakkaan lisätään polyety-5 leeniglykolia, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 1000-6000 lopullisen konsentraation 30-50 % saamiseksi siten, että solut fuusioituvat. Fuusiointi voidaan suorittaa käyttämällä sähköpulssia solujen sekoitettuun liuokseen sen sijaan, että lisättäisiin polyetyleeniglykolia.
10 Solut, jotka on alistettu fuusiokäsittelyyn, suspendoidaan HAT-väliaineessa, esimerkiksi Dalbeccon modifioidussa Eaglen minimaalisessa olennaisessa väliaineessa (nimitetään tämän jälkneen DMEM-väliaineeksi), joka sisältää hypoksantiinia, aminopteriiniä, tymidiiniä 10-%:ista fetaalista naudan see-15 rumia. Suspensio valmistetaan ja kaadetaan 96-koloiselle mik-rotitterilevylle tai sen kaltaisella ja soluja viljellään 37 °C:ssa 5-%:isessa hiilidioksidissa siten, että vain hyb-ridoomien annetaan kasvaa.
Edellä kuvatusti saadut hybridoomat tehdään sekaviljelmäksi, 20 joka sisältää hybridooman, joka tuottaa kohteena olevaa mono-klonaalista vasta-ainetta hybridoomien lisäksi, jotka tuotta- • · · m ;·. vat muiden monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat muita • ·· \m . proteiineja vasaan, joita sisältyy ihmisen vWf-valmisteeseen • · · * l sekoitetulla tavalla, tai monoklonaalisia vasta-aineita, jotka • · · ,· ’* 25 ovat ihmisen vWF:n kohtia vastaan, ja jotka ovat irrelevantte- • · : ’* ja RIPAan, BIPAan ja SIPAan. Näin ollen kanta, joka tuottaa • · · • · · *.* * kohteena olevan monoklonaalisen vasta-aineen, valitaan edellä mainituista hybridoomista.
• · • · · • · · • · .···. Hybridooma, joka tuottaa monoklonaalisen vasta-aineen, jossa • · *1’ 30 on reaktiivisuutta ihmisen vWF:n kanssa, voidaan valita ihmi- • · · ·.· * sen vWF:än antigeeninä käyttöön perustuvan entsyymi-immunotes- • · · :...ϊ tin mukaisesti. Kanta, joka tuottaa monoklonaalisen vasta- aineen, joka inhiboi sekä RIPAn että BIPAn, jota välittää ih- 35 ja BIPAan käyttämällä osa väliaineesta kuhunkin koloon.
·.. misen vWF, valitaan mittaamalla inhiboiva aktiivisuus RIPAan • · • · 13
Hybridooma, joka tuottaa esillä olevan keksinnön mukaisen mo-noklonaalisen vasta-aineen, saadaan valikoimalla hybridooma, joka tuottaa monoklonaalisen vasta-aineen, joka sitoutuu eläimen, kuten marsun, rotan ja kanin, vWF:ään, tai monoklonaali-5 sen vasta-aineen, joka inhiboi eläimen BIPAn tai RIPAn edellä kuvatusti, etsyymi-immunotestimenetelmän, kuten ELISA- (enzy-me-Linked Immunosorbent Assay)menetelmän, mukaisesti.
Sen jälkeen kun on vahvistettu, että hybridooma monoklonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi sisältyy viljelmään, viljelmä 10 siirretään HT-väliaineeseen, jonka koostumus on sama kuin HAT-väliaineen paitsi että aminopteriini poistetaan HAT-väliai-neesta. Hybridoomaa viljellään edelleen kloonauksen suorittamiseksi esimerkiksi rajoittavan laimennusmenetelmän mukaisesti .
15 Täten saatiin hybridoomat AJvW-2 ja AJvW-4 kuten selitetään jäljempänä esitetyissä esimerkeissä. Ne kaikki talletettiin 24. elokuuta vuonna 1994 National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (postiosoi-20 te: 305, 1-3 Higashi-Icchome, Tsubaku-shi, Ibaraki-ken, Japa-ni) talletusnumeroilla FERM P-14487 ja FERM P-14489 vastaavas- :·. ti tässä järjestyksessä ja ne on siirretty kansainväliseen • · · [·. : talletukseen, joka perustuu Budapestin sopimukseen 29. syys- • · · I I kuuta vuonna 1995 ja talletetut talletusnumeroilla FERM BP- • · · .* * 25 5248 ja FERM BP-5250 vastaavasti.
• · • · ·
Kuten esimerkeissä kuvataan, monoklonaalinen vasta-aine, jonka tuottaa AJvW-2, kuuluu alaluokkaan IgG2, ja AJvW-4:n tuottama monoklonaalinen vasta-aine kuuluu alaluokkaan IgG2b. NMC-4 • · .···. kuuluu IgGl:een, kuten on raportoitu.
• « :*·*; 30 Esillä olevan keksinnön mukainen vasta-aine saadaan vilje- lemällä sopivassa väliaineessa tai hiiren vesivatsanesteessä ««· ·. hybridooma, joka on saatu kuten edellä kuvattiin, tai variant- «·· •••| ti, joka on valittu kloonaamalla hybridooma rajoittavan lai- • · *·..* mennusmenetelmän mukaisesti, esimerkiksi hybridooman variant- 35 ti, jossa on suuri vasta-aineproduktiivisuus. Vaihtoehtoisesti 14 esillä olevan keksinnön mukainen vasta-aine saadaan myös eristämällä geeni, johon kuuluu vasta-aine tuotanto, saadusta hyb-ridoomasta, sisällyttämällä geeni ilmennysvektoriin, viemällä saatu vektori mikro-organismiin, kuten Escherichia coliin, ja 5 viljelemällä saatua vasta-ainetta tuottavaa mikro-organismia. Hybridooma käsittää AJvW-2:n ja AJvW-4:n, jotka on kuvattu edellä ja niiden variantit.
Väliaine hybridooman viljelemiseksi käsittää esimerkiksi väliaineen, joka perustuu DMEM-väliaineeseen ja sisältää lisäksi 10 fetaalista naudan seerumia, L-glutamiinia, glukoosia, natrium-pyruvaattia, 2-merkaptoetanolia ja antibioottia (esimerkiksi penisilliini G, streptomysiini ja gentamisiini). Esillä olevan keksinnön mukaista hybridoomaa viljellään tavallisesti väliaineessa 37 °C:ssa 2-4 päivää kaasufaasin kanssa, joka käsittää 15 5 % hiilidioksidia ja 95 % ilmaa. Vaihtoehtoisesti hybridoomaa viljellään noin 10-15 päivää Balb/c-hiiren vatsaontelossa, jota on esikäsitelty 2,6,10,15-tetrametyylipentadekaanilla (esimerkiksi Pristane (kauppanimi), jota tuottaa Sigma). Täten mo-noklonaalista vasta-ainetta tuotetaan määränä, joka kyetään 20 alistamaan puhdistukseen.
Täten tuotettu monoklonaalinen vasta-aine voidaan erottaa ja • · · ;·. puhdistaa minkä tahansa tavanomaisen menetelmän mukaisesti, • · · . joka sopii proteiinien eristämiseen ja puhdistamiseen vilje- • · · I I lysupernatantista tai vesivatsanesteestä. Tällainen menetelmä • · · .1 2 3 4 1 25 käsittää esimerkiksi sentrifugoinnin, dialysoinnin, poissuo- • · : “ lauksen, joka perustuu ammoniumsulfaatin käyttöön ja pylväs- • · · • · » *.1 ' kromatografoinnin, joka perustuu esimerkiksi DEAE-selluloosan, hydroksiapatiitin, proteiini-A-agaroosin ja proteiini-G-aga- • · roosin käyttöön.
• · · • · * · 11 30 3. Esillä olevan keksinnön mukainen veren hyytymistä estävä 2 ··· ·.· · aine 3 • · · • · • · • · ·
Esillä olevan keksinnön mukainen veren hyytymistä estävä aine • · · 4 sisältää aktiivisena aineena monoklonaalisen vasta-aineen.
• · · • · • · • · · 15
Kun hiirestä peräisin olevaa monoklonaalista vasta-ainetta käytetään veren hyytymistä estävänä aineena ihmiseen, on edullista, että monoklonaalinen vasta-aine modifioidaan joksikin ihmistyyppiseksi antigeenisyys- ja veressä puo-5 liintumisongelmien takia. Vasta-aineen muuttuvat alueet voidaan muuttaa ihmistyyppisiksi Jones et al:n (Nature, voi. 321, s. 522, 1986) ja Queen et ai. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, voi. 86,s. 10029, 1989) kuvaamien menetelmien mukaan ilman että kadotetaan reaktiospesifisyys. Winter et ai:n kuvaama kloo-10 nausmenetelmäluettelo on myöskin käytettävissä (J. Mol. Biol., voi 222, s. 581, 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, voi 88, s. 2432, 1991).
Fragmentteja F(ab')2, Fab' ja Fab, jotka voidaan saada hajottamalla edellä mainittu monoklonaalinen vasta-aine proteolyyt-15 tisellä entsyymillä, kuten trypsiinillä, papaiinilla ja pep-siinillä, mitä seuraa pyhdistaminen, voidaan myös käyttää veren hyytymistä estävinä aineina edellyttäen, että fragmenttien ominaisuudet ovat ekvivalenttiset edellä mainitun mono-klonaalisen vasta-aineen ominaisuuksien kanssa.
20 Esillä olevan keksinnön mukaisen veren hyytymistä estävän ai- neen tyyppi tai muoto käsittää esimerkiksi injektion, kielen ;·. alle pantavan tabletin, ihohauteen, tabletin tai pillerin, • ·· t·' . kapselin, granulan, siirapin, peräpuikon, voiteen ja tiputuk- • · ♦ * l sen. Näistä ovat edullisia injektio, kielen alle pantava tab- • ♦ ♦ φ* 25 letti ja ihohaude. Aineen tyypistä riippuen voidaan veren hyy- • · * ** tyrnistä estävään aineeseen sekoittaa farmaseuttisesti hyväk- • · · *.* * syttäviä täyteaineita, esimerkiksi laktoosia, perunatärk kelystä ja natriumalginaattia. Injektion tapauksessa käytetyt • · ϊ,ί,ί liuottimet käsittävät esimerkiksi injektointiveden, fysiologi- : *: 30 sen suolaliuoksen ja Ringerin liuoksen. Liuotin voidaan lisätä ··· .1. dispergointiaineen kanssa. Lisäksi voidaan käyttää yhdessä • · · l.. muuta veren hyytymistä estävää komponenttia kuin vWF:n vastai- • · *···* siä monoklonaalisia vasta-aineita.
··· ···· #···φ Esillä olevan keksinnön mukaisen veren hyytymistä estävän ai- • * 35 neen antoannos riippuu esimerkiksi potilaan iästä ja kunnosta.
Kuitenkin yleensä kun kyseessä on suonensisäinen antaminen 16 voidaan odottaa, että ennalta määritetty vaikutus saavutetaan käyttämällä esillä olevan keksinnön mukaista veren hyytymistä estävää ainetta 0,1 - 100 mg/kg, edullisemmin 1 μg/kg - 100 mg/kg päivässä aikuisen ollessa kyseessä, kun esitetään 5 monoklonaalisen vasta-aineen määränä, joka on aktiivisena aineosana .
Esillä olevan keksinnön mukaista veren hyytymistä estävää ainetta voidaan käyttää yleisiin veren hyytymistä estävien aineiden sovellutuksiin. Nimittäin esillä olevan keksinnön mu-10 kaista veren hyytymistä estävää ainetta voidaan käyttää estettäessä tai hoidettaessa sairauksia, joihin liittyy verihiutaleiden takertuminen ja kasautuminen. Esillä olevan keksinnön mukainen veren hyytymistä estävä aine on esimerkiksi spesifisesti tehokasta hoidettaessa lyhytaikaistata aivon is-15 keemistä kohtausta, epävakaata angina pectorista ja sydänli-haskuoliota ja perifeeristä vaitimontukostautuia, se on tehokasta estettäessä uudelleentukkeumaa PTCA:n jälkeen ja sepelvaltimon ohituksen tukkeumaa ja se on tehokasta hoidettaessa sepelvaltimon läpän korvausta ja olennaista verihiutalerun-20 sautta.
Kuvioiden lyhyt selitys • · • · * ** Kuvio 1 esittää esillä olevan keksinnön esimerkkien mukaisen • · • · · *· *: vasta-aineen 2 ja vasta-aineen 4 inhiboivia aktiivisuuksia ja • · ·.**: NMC-4:n verrokkina inhiboivaa vaikutusta mitattuna RIPAssa pe- ·· • '·· 25 rustuen ihmisen PRP:n käyttöön.
• · · • · · • · ·
Kuvio 2 esittää esillä olevan keksinnön esimerkkien mukaisen . . vasta-aineen 1 ja vasta-aineen 3 inhiboivia aktiivisuuksia ja • · · ·*·’ NMC-4:n verrokkina inhiboivia vaikutuksia mitattuna RIPAssa ··· • · ’···* perustuen ihmisen PRP:n käyttöön.
• · · • · · • · · I.. 30 Kuvio 3 esittää vasta-aineen 2, vasta-aineen 4 ja NMC-4:n ver- • · • · *·* rokkina inhiboivia aktiivisuuksia ja mitattuna RIPAssa perus- tuen marsun PRP:n käyttöön.
• · · • · • · • · · 17
Kuvio 4 esittää vasta-aineen 2, vasta-aineen 4 ja NMC-4:n verrokkina inhibitorisia aktiivisuuksia ja mitattuna BIPAssa perustuen marsun PRP:n käyttöön.
Kuvio 5 esittää vasta-aineen 1, vasta-aineen 3 ja NMC-4:n ver-5 rokkina inhiboivia aktiivisuuksia ja mitattuna BIPAssa perustuen ihmisen PRP:n käyttöön.
Kuvio 6 esittää vasta-aineen 2, vasta-aineen 4 ja NMC-4:n verrokkina inhiboivia aktiivisuuksia ja mitattuna BIPAssa perustuen marsun PRP:n käyttöön.
10 Kuvio 7 esittää vasta-aineen 2, vasta-aineen 4 ja NMC-4:n verrokkina inhiboivia aktiivisuuksia ja mitattuna BIPAssa perustuen rotan PRP:n käyttöön.
Kuvio 8 esittää vasta-aineen 2, vasta-aineen 4 ja NMC-4:n verrokkina inhiboivia aktiivisuuksia ja mitattuna BIPAssa perus-15 tuen kanin PRP:n käyttöön.
Kuvio 9 esittää vasta-aineen 1, vasta-aineen 3 ja NMC-4:n verrokkina inhiboivia aktiivisuuksia ja mitattuna BIPAssa perustuen kanin PRP:n käyttöön.
• · · • · · • · · ,* Kuvio 10 esittää vasta-aineen 2, vasta-aineen 4 ja NMC-4:n • · \ 20 verrokkina inhiboivia aktiivisuuksia ja mitattuna BIPAssa pe- • · · *· *J rustuen ihmisen PRP:n käyttöön.
• · • · · • · · • ·
Kuvio 11 esittää vasta-aineen 1, vasta-aineen 1 ja NMC-4:n verrokkina inhiboivia aktiivisuuksia ja mitattuna SIPAssa pe- • · · rustuen ihmisen PRP:n käyttöön.
• · V.* 25 Kuvio 12 esittää vasta-aineen 2, vasta-aineen 4 ja NMC-4:n ♦ ·· vaikutuksia vWF:n sitoutumiseen immobi li soituun ihmisen veri- .···. hiutaleeseen (ristosetiinin läsnäollessa) .
• · · ··· :...· Kuvio 13 esittää vasta-aineen 1, vasta-aineen 3 ja NMC-4:n vaikutuksia vWF:n sitoutumiseen immobilisoituun ihmisen veri- ···· .···. 30 hiutaleeseen (ristosetiinin läsnäollessa) .
• · ··· 18
Kuvio 14 esittää vasta-aineen 2, vasta-aineen 4 ja NMC-4:n vaikutuksia vWF:n sitoutumiseen immobilisoituun ihmisen verihiutaleeseen (botrosetiinin läsnäollessa).
Kuvio 15 esittää vasta-aineen 1, vasta-aineen 3 ja NMC-4:n 5 vaikutuksia vWF:n sitoutumiseen immobilisoituun ihmisen verihiutaleeseen (botrosetiinin läsnäollessa).
Kuvio 16 esittää vastaavien monoklonaalisten vasta-aineiden vaikutuksia biotinoidun AJvW-l:n sitoutumiseen immobilisoituun vWF:ään.
10 Kuvio 17 esittää vastaavien monoklonaalisten vasta-aineiden vaikutuksia biotinoidun AJvW-2:n sitoutumiseen immobilisoituun vWF:ään.
Kuvio 18 esittää vastaavien monoklonaalisten vasta-aineiden vaikutuksia biotinoidun AJvW-3:n sitoutumiseen immobilisoituun 15 vWF : ään.
Kuvio 19 esittää vastaavien monoklonaalisten vasta-aineiden vaikutuksia biotinoidun AJvW-4:n sitoutumiseen immobilisoituun vWF:ään.
··· • · · ml * Kuvio 20 esittää vastaavien monoklonaalisten vasta-aineiden • ♦ • ** 20 vaikutuksia biotinoidun NMC-4:n sitoutumiseen immobilisoituun • · *. *: vWF:ään.
• · • ♦ · • ·· • ·
Kuvio 21 esittää vasta-aineen 2 ja vasta-aineen 4 inhiboivia • ♦· .•j·. vaikutuksia mitattuna ex vivo -marsun RIPAssa.
· ♦
Kuvio 22 esittää vasta-aineen 4 inhiboivaa vaikutusta mitattu- • · ϊ.ϊφί 25 na ex vivo -marsun BIPAssa.
··· • · • ♦ *·* Kuvio 23 esittää vasta-aineen 2 vaikutusta tukkeuma-aikaan ··· V * marsu-PIT-mallissa.
··· • · • · ··· ·, Kuvio 24 esittää vasta-aineen 4 vaikutusta tukkeuma-aikaan ··· marsu-PIT-mallissa.
··· • ♦ • · • · · 19
Kuvio 25 esittää vasta-aineen 2 vaikutusta tukkeuma-aikaan marsu-A-V-ohitusmallissa.
Kuvio 26 esittää vasta-aineen 2 vaikutusta verenvuotoaikaan marsun verenvuotoaikamallissa.
5 Kuvio 27 esittää vasta-aineen 4 vaikutusta verenvuotoaikaan marsun verenvuotoaikamallissa.
Paras tapa keksinnön suorittamiseksi
Esillä olevaa keksintöä selostetaan nyt spesifisemmin seuraa-vissa esimerkeissä. Esillä oleva keksintö ei kuitenkaan rajoi-10 tu jäljempänä esitettyihin esimerkkeihin.
Esimerkit 1. Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistaminen (1) Immuuniherkistys ja solufuusio
Puhdistettuun ihmisen vWF:ään sekoitettiin yhtäläinen määrä 15 apuainetta (MPL+TDM EMULSION: Ribin kauppanimi) ja saatua seosta annettiin ihonalaisesti urospuolisille Balb/c-hiirille ·*:*: (8 viikkoa vanhoja aloitettaessa immunisointi) määränä, joka vastaa vWF-määrää 100 μρ per 1 hiiri (herätysimmunisointi) . 21 .·. : päivän kuluttua immunisointi suoritettiin antamalla ihonalai- • · · • * 20 sesti samalla tavalla kuten edellä kuvattiin (tehosteimmuni- • · · ' • · · .1 ’ sointi). 19 päivän tai 30 päivän kuluttua tehosteesta hiirille • · • · · *... annettiin häntälaskimoiden kautta 200 μΐ valmistetta, joka • · · *·* saatiin laimentamalla ihmisen vWF PBS:llä (fosfaattipuskuroitu fysiologinen suolaliuos, valmistaja Nissui) konsentraatioon • · ·.·.· 25 250 μ3/ιη1 (lopullinen immunisointi) .
M· • · • · • · ·
Pernat poistettiin hiiristä 3 päivää lopullisen immunisoinnin • · i *·’ jälkeen ja ne erotettiin yksittäisiksi soluiksi. Sitten per-
fM
!...* nasolut pestiin DMEM-väliaineella. Toisaalta kerättiin hiiren ··· myeloomasoluja Sp2/0-Agl4 logaritmisessa faasissa ja ne pes- ···· .···. 30 tiin DMEM-väliaineella. Pernasolut ja hiiren myeloomasolut se koitettiin muoviputkessa solumääräsuhteessa 10:1, mitä seurasi 50 % (paino/til.) polyetyleeniglykolia lisääminen (valmistaja 20
Boehringer Mannheim, keskimääräinen molekyylipaino: 4000) so-lufuusion suorittamiseksi 37 °C:ssa 7 minuuttia.
Supernatanttiliuos poistettiin sentrifugoimalla ja jäännökseen lisättiin HAT-väliainetta (DMEM-väliaine, joka sisältää 10 % 5 fetaalista naudan seerumia, johon on lisätty hypoksantiinia, aminopteriiniä ja tymidiiniä). Jäännös suspendoitiin siten, että pernasolujen konsentraatio oli 5 x 106 solua/ml. Tämä so-lususpensio jaettiin ja kaadettiin 96-koloisille muovilevyille siten, että yksi kolo sisälsi 100 μΐ suspensiota, mitä seurasi 10 viljely 37 °C:ssa 5-prosenttisessa hiilidioksidissa. HAT-väliainetta täydennettiin määrässä 50 μΐ/kolo toisena ja viidentenä päivänä. Sen jälkeen puolet väliaineen tilavuudesta vaihdettiin joka kolmas tai neljäs päivä hybridoomien proliferation mukaisesti.
15 (2) Hybridoomien seulonta ja kloonaus
Hybridoomat, jotka tuottavat esillä olevan keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta, seulottiin käyttämällä indeksinä monoklonaalisen vasta-aineen vWF:n fysiologista aktiivisuutta inhiboivaa aktiivisuutta. Osa kussakin kolossa olevasta 20 vasta-aineesta kerättiin hybridoomien proliferaation päättymi- • · · /. sen jälkeen ja RIPAa ja BIPAa inhiboivat vaikutukset mitat- *, ” ti in. Hybridoomakloonit, jotka inhiboivat voimakkaasti kummat- • · · ’· ’· kin reaktiot, valittiin.
• · • · · • ·· • s
Hybridoomat, jotka tuottivat vasta-aineita, jotka ovat reak-25 tiivisia marsun vWF:n kanssa, valittiin valikoiduista kloo- • · · neista. Saadut hybridoomat siirrettiin HT-väliaineeseen, joka t. . oli sama kuin HAT-väliaine paitsi että aminopteriini poistet- • · · tiin HAT-väliaineesta, ja niitä viljeltiin edelleen. Kloonaus *···* suoritettiin kahdesti rajoittavalla laimennusmenetelmällä. Si- :T: 30 ten saatiin stabiileja hybridoomia. Lopuksi saadut kaksi hyb- ridoomaa nimettiin AJvW-2:ksi ja AJvW-4:ksi.
···
Toisaalta hybridoomat, jotka tuottivat monoklonaalisia vasta- • · · aineita, jotka eivät olleet reaktiivisia marsun, kanin ja rotan vWF:n kanssa, valikoitiin klooneista, jotka inhiboivat 21 voimakkaasti edellä kuvatut RIPAn ja BlPAn reaktiot. Saadut hybridoomat siirrettiin HT-väliaineeseen, joka oli sama kuin HAT-väliaine paitsi että aminopteriini poistettiin HAT-väli-aineesta, ja niitä viljeltiin edelleen. Kloonaus suoritettiin 5 kahdesti rajoittavalla laimennusmenetelmällä. Siten saatiin stabiileja hybridoomia. Lopuksi saadut kaksi hybridoomaa nimettiin AJvW-l:ksi ja AJvW-3:ksi.
AJvW-2 ja AJvW-4 tuottivat esillä olevan keksinnön mukaisen vasta-aineen ja AJvW-l ja AJvW-3 tuottivat esillä olevan kek-10 sinnön ulkopuolella olevan vasta-aineen.
2. Monoklonaalisten vasta-aineiden tuottaminen ja puhdistaminen (1) Monoklonaalisten vasta-aineiden tuottaminen 2,6,10,14-tetrametyylipentadekaania (kauppanimi: Pristane, 15 valmistanut Sigma, 0,5 ml) injektoitiin intraperitoneaalisesti naaraspuolisiin Balb/c-hiiriin, jotka olivat 6-8 viikon ikäisiä. 10-20 päivän kuluttua AjvW-l-, AJvW-2-, AJvW-3- ja AJvW-4-soluja (1 xl06-107 solua) suspendoitiin PBS:ään ja ne inoku-loitiin intraperitoneaalisesti hiiriin. 7-10 päivän kuluttua • · · *·* 20 hiiret tapettiin ja alistettiin vatsaleikkaukseen, josta saatu ·· • · : *· vesivatsaneste kerätim. Vesivatsanestettä sentnfugoitnn • · %*·· liukenemattomien materiaalien poistamisek ja supernatantti i otettiin talteen ja varastoitiin -20 °C:een.
te e ♦ • et (2) Monoklonaalisten vasta-aineiden puhdistaminen ett ett • 25 IgG puhdistettiin edellä kuvatusta vesivatsanestesupernatan-tista käyttämällä Hi-Trap Protein A -vasta-ainepuhdistusvä- • · ·**· linesarjaa (kauppanimi, valmistaja Pharmacia) . Vesivatsanes- ··· .1. tettä (2 ml) lisättiin liuokseen A (1,5 M glysiiiä, 3 M NaCl, ett pH 8,9, 8 ml) ja suodatettiin suodattimena, jonka huokoskoko e e *···* 30 on 45 μπι (valmistaja Millipore) . Sen jälkeen saatu suodos le- ··· vitettiin pylvääseen (pylvästilavuus: 1 ml), joka on panos- «··· oli tasapainotettu riittävästi liuoksella A, ja pylväs pestiin liuoksella A määränä 10-kertainen pylvästilavuus. Sitten IgG- ·***. tettu Protein Sepharose HP:llä (valmistaja Pharmacia), joka e·· 22 fraktio eluoitiin liuoksellla B (0,1 M glysiiniä, pH 2,8) määränä 10-kertainen pylvästilavuus. Eluoitu IgG-fraktio dialy-soitiin vasten PBSrää, jotka käytettiin puhdistettuna näytteenä.
5 AjvW-l:n, AJvW-2:n, AJvW_3:n ja AJvW-4:n tuottamia monoklonaa-lisia vasta-aineita nimitetään tämän jälkeen vasta-aineeksi 1, vasta-aineeksi 2, vasta-aineeksi 3 ja vasta-aineeksi 4.
NMC-4 puhdistettiin hiiren vesivatsanesteestä, joka sisälsi NMC-4:ää, samalla tavalla kuin edellä kuvattiin verrokkina 10 käytettävän näytteen saamiseksi.
3. Monoklonaalisten vasta-aineiden alaluokkien määrittäminen
Esillä olevan keksinnön mukaisista monoklonaalisista vasta-aineista määritettiin niiden IgG-alaluokat käyttämällä edellä olevassa kohdassa 2. saatuja puhdistettuja vasta-aineita käyt-15 täen kaupallisesti saatavissa olevaa alaluokan määritysvä-linesarjaa (kauppanimi: Mono Ab-ID EIA Kit A, valmistaja Zy-med). Tämä menetelmä perustuu ELISA-menetelmään. Jokainen vasta-aine 1, vasta-aine 2, vasta-aine 3 ja vasta-aine 4 kuului IgG:n luokkaan. Määritettiin, että vasta-aineen 1 ja vasta-ai- ··· V · 20 neen 3 alaluokka oli IgG2 a-iso tyyppi ja vasta-aineen 2 ala- • e j ·.. luokka oli IgGl-isotyyppi ja vasta-aineen 4 alaluokka oli
IgG2b-iso tyyppi. NMC-4 kuului IgGl:een, kuten aiemmin on ra- • · •'•J portoitu.
• · ·· • · • 4. Esillä olevan keksinnön mukaisten monoklonaalisten vasta-
• M
• · · '.* * 25 aineiden verihiutaleiden kasautumista inhiboivat vaikutukset (1) RIPAa inhiboivat vaikutukset • · · • · ··· • · '···* Normaalista ihmisluovuttajasta saatuun vereen sekoitettiin 3,8 % natriumsitraattia suhteessa 9:1, jota sentrifugoitiin .**·. sitten 1100 rpmrssä 10 minuuttia verihiutalerikkaan plasman \ 30 (PRP) saamiseksi. PRP:n (3 x 108 verihiutaletta/ml, 225 μΐ) ··· ···· annettiin reagoida 37 °C:ssa 3 minuuttia monoklonaalisen vas- ··· • · *...· ta-aineen (2 μΐ) kanssa erilaisissa konsentraatioissa. Sen jälkeen siihen lisättiin ristosetiiniä (valmistaja Sigma) lo- 23 pullisen konsentraation 1,5 mg/ml saamiseksi. Verihiutaleiden kasautumista tarkkailtiin 37 °C:ssa 10 minuuttia käyttämällä laitetta verihiutaleiden kasautumiskyvyn mittaamiseksi (kauppanimi: HEMATRCER, valmistaja Niko Bioscience). Verihiutalei-5 den kasautumisen laajuus ilmaistiin optisen läpäisykyvyn muutoksena. Verihiutaleiden kasautumista inhiboiva vaikutus määritettiin käyttämällä verrokkina maksimaalista kasautumista, joka saatiin lisäämällä DMEM:ä tai puskuria näytteen liuottamiseksi .
10 Tulokset on esitetty kuviossa 1 (vasta-aineet 2,4) ja kuviossa 2 (vasta-aineet 1,3). Vasta-aine 1, vasta-aine 2, vasta-aine 3, vasta-aine 4 ja NMC-4 inhiboivat ihmisen RIPAa annoksesta riippuvalla tavalla. IC50-arvot olivat 0,8 pg/ml vasta-aineelle 1, 3,5 pg/ml vasta-aineelle 2, 1,0 pg/ml vasta- 15 aineelle 3, 2,0 μg/ml vasta-aineelle 4 ja 0,7 pg/ml NMC-4:lie.
Marsun PRP valmistettiin samalla tavalla kuin edellä kuvattiin ja siihen lisättiin ristosetiiniä lopulliseen konsentraatioon 1,75 mg/ml ja mittaus suoritettiin samalla tavalla kuin edellä kuvattiin. Vasta-aine 1 (lopullinen konsentraatio: 80 μg/ml), 20 vasta-aine 3 (lopullinen konsentraatio 80 μg/ml) ja NMC-4 (Ιοί’·*; pullinen konsentraatio 27 μg/ml) eivät inhiboineet marsun Rl- PAa ollenkaan, kun taas vasta-aine 2 ja vasta-aine 4 inhi- • ·· .·. ; boivat marsun RIPAa annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 3).
• · · j IC50-arvot olivat 0,4 μg/ml vasta-aineelle 2 ja 1 μg/ml vasta- .* * 25 aineelle 4.
• · • · · (2) BIPAa inhiboivat vaikutukset . . Ennen BIPAn mittaamista käärmeen myrkky, so. botrosetiini, • · · puhdistettiin raa'asta käärmeen myrkkyvalmisteesta (valmistaja • · *···* Sigma), joka saatiin Bothorops jararacasta. 1 g Raakaa rnyrkky- 30 valmistetta liuotettiin 20 mM:iin Tris-HCl-puskuria (pH 7,4), • :***· joka sisälsi 0,15 M NaCl, ja liukenemattomat materiaalit pois- ··· *. tettiin sitten sentrifugoimalla 3000 rpm:ssä Saatu super- • · · •••j natantti alistettiin geeli suodatukseen käyttämällä Sephadex G- • · ’···’ 75 (5 x 90 cm, valmistaja Pharmacia) . Fraktiot, jotka vastasi- 35 vat eluointitilavuutta 480-570 ml kerättiin ja saatu liuos 24 konsentroitiin tilavuuteen 20 ml käyttämällä ultrasuodatuskon-sentrointilaitetta (DIAFLO, valmistaja Amicon). Sen jälkeen konsentroitu liuos levitettiin ioninvaihtopylvääseen perustuen DEAE-TOYOPEARL-650:n käyttöön (1,6 x 32 cm, valmistaja Pharma-5 cia), mitä seurasi eluointi käyttämällä konsentraatiogradient-tia 0-0,3 M NaCl. 600-640 minuutissa eluoituneet fraktiot kerättiin ja saatu liuos konsentroitiin tilavuuteen 4 ml samalla tavalla kuin edellä kuvattiin. Sen jälkeen konsentraatio levitettiin geelisuodatuspylvääseen (Sephadex G-75, 2,6 x 90 cm, 10 valmistaja Pharmacia) käyttämällä liuottimena 20 mM Tris-HCl-puskuira (pH 7,4), joka sisälsi 0,15 M NaCl. Fraktiot, joissa oli voimakasta verihiutaleita kasauttavaa vaikutusta, otettiin talteen ja yhdistettyä liuosta käytettiin puhdistettuna näytteenä .
15 Ihmisen PRP:n (3 x 108 verihiutaletta/ml, 225 μΐ) annettiin reagoida 37 °C:ssa 3 minuuttia monoklonaalisen vasta-aineen (2 μΐ) kanssa vastaavissa konsentraatioissa. Sen jälkeen reak-tioseokseen lisättiin botrosetiiniä, joka oli saatu edellä ku-vatusti, lopullisen konsentraation 5 μg/ml saamiseksi ja veri-20 hiutaleiden kasautuminen mitattiin samalla tavalla kuin edellisessä kohdassa (1). Tulokset on esitetty kuviossa 4 (vasta- • · · : aineet 2, 4) ja kuviossa 5 (vasta-aineet 1, 3) . Vasta-aine 1, • · j vasta-aine 2, vasta-aine 3, vasta-aine 4 ja NMC-4 inhiboivat BIPAa annoksesta riippuvalla tavalla. ICso-arvot olivat • · 25 0,8 μg/ml vasta-aineelle 1, 2,0 μg/ml vasta-aineelle 2, • · :·. 1,0 μg/ml vasta-aineelle 3, 5,6 μg/ml vasta-aineelle 4 ja • · · 2,0 μg/ml NMC-4: lie.
• · ·
Marsun PRP valmistettiin samalla tavalla kuin edellä kuvattiin • · ϊ.ί,ί ja siihen lisättiin botrosetiiniä lopulliseen konsentraatioon 30 2 pg/ml ja mittaus suoritettiin samalla tavalla kuin edellä #.I. kuvattiin. Vasta-aine 1 (lopullinen konsentraatio: 80 μg/ml) , • · · I.. vasta-aine 3 (lopullinen konsentraatio 80 pg/ml) ja NMC-4 (lo- • · •y* pullinen konsentraatio 27 μg/ml) eivät inhiboineet BIPAa oi- *i* lenkaan, kun taas vasta-aine 2 ja vasta-aine 4 inhiboivat BI- 35 PAa annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 6) . ICso-arvot oli- • · · vat 3,1 μg/ml vasta-aineelle 2 ja 3,5 pg/ml vasta-aineelle 4.
25 PRP valmistettiin sentrifugoimalla rotan sitrattua verta 1300 rpm:ssä 10 minuuttia. Botrosetiiniä lisättiin PRP:hen (5 x 108 verihiutaletta/ml) lopullisen konsentraation 0,08 yg/ml saamiseksi ja mittaus suoritettiin samalla tavalla kuin edellä 5 kuvattiin. Vasta-aine 1 (lopullinen konsentraatio: 80 pg/ml) ja vasta-aine 3 (lopullinen konsentraatio 80 pg/ml) eivät inhiboineet rotan BIPAa ollenkaan, kun taas vasta-aine 2, vasta-aine 4 ja NMC-4 inhiboivat BIPAa annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 7). IC5o-arvot olivat 1,2 yg/ml vasta-aineelle 2, 10 5,0 ug/ml vasta-aineelle 4 ja 2,2 pg/ml NMC-4:lie.
PRP valmistettiin sentrifugoimalla kanin sitrattua verta 1200 rpmrssä 10 minuuttia. Botrosetiiniä lisättiin PRP:hen (3 x 108 verihiutaletta/ml) lopullisen konsentraation 0,075 ug/ml saamiseksi ja mittaus suoritettiin samalla tavalla kuin edellä 15 kuvattiin. Tulokset on esitetty kuviossa 8 (vasta-aineet 2, 4) ja kuviossa 9 (vasta-aineet 1, 3) . Vasta-aine 1 (lopullinen konsentraatio: 80 μg/ml), vasta-aine 3 (lopullinen konsen traatio 80 μg/ml) ja NMC-4 (lopullinen konsentraatio 27 pg/mk) eivät inhiboineet kanin BIPAa ollenkaan, kun taas vasta-aine 2 20 ja vasta-aine 4 inhiboivat BIPAa annoksesta riippuvalla tavalla. IC50-arvot olivat 5,0 pg/ml vasta-aineelle 2 ja 1,8 μg/ml • · · ’.· · vasta-aineelle 4.
• · • · • ·· .·. ; (3) SIPAa inhiboivat aktiivisuudet • ·· • · # · ·
Ihmisen PRP:n (2,5 x 108 verihiutaletta/ml, 360 μΐ) annettiin • · • *·· 25 reagoida huoneenlämpötilassa 10 minuuttia monoklonaalisen vas- • · · : ta-aineen (40 μΐ) kanssa vastaavissa konsentraatioissa. Sen jälkeen leikkausjännityksen indusoima verihiutaleiden kasautu- ;*·*; minen mitattiin käyttämällä laitetta solutoiminnan mittaami- • · .···. seksi (valmistaja Toray) . Reaktioseos levitettiin vakioleik- • · #· 30 kauksella 6 dyymi/cm2 0-15 sekunnin aikan, alhaisella leik- • · · *·* * kausgradientilla 6->12 dyymiä 15-105 sekunnin aikana, suurella • · · leikkausgradientilla 12->1080 dyymiä/cm2 105-225 sekunnin ai-kana ja vakioleikkauksella 108 dyymiä/cm2 korkeintaan 350 se- • · · · .···. kunnin aikana. Verihiutaleiden kasautumisaktiivisuuden laajuus • · 35 esitettiin optisen läpäisykyvyn muutoksena. Verihiutaleiden kasautumista inhiboiva aktiivisuus määritettiin käyttämällä 26 verrokkina maksimaalista kasautumista, joka saatiin lisäämällä DME tai puskuria näytteen liuottamiseksi.
Tulokset on esitetty kuviossa 10 (vasta-aineet 2, 4) ja kuviossa 11 (vasta-aineet 1, 3). Vasta-aine 1, vasta-aine 2, vas-5 ta-aine 3, vasta-aine 4 ja NMC-4 inhiboivat ihmisen SIPAa annoksesta riippuvalla tavalla. ICso-arvot olivat 0,7 pg/ml vasta-aineelle 1, 1,1 pg/ml vasta-aineelle 2, 0,9 pg/ml vasta- aineelle 3, 1,5 pg/ml vasta-aineelle 4 ja 1,5 pg/ml NMC-4:lie.
5. Esillä olevan keksinnön mukaisten monoklonaalisten vasta-10 aineiden a££initeetti ihmisen vWF:ään (1) Ihmisen vWFsn 125I-merkitseminen
Jogeeniä (valmistaja Pierce, 1 mg/ml) ja dikloorimetaaniliuos-ta (1 ml) lisättiin polypropeeniputkeen, josta liuotin poistettiin käyttämällä typpivirtaa. Liuosta, jossa oli ihmisen 15 vWF:ää (0,43 mg/ml) kaadettiin polypropeeniputkeen, johon lisättiin liuosta, jossa oli Na1225I:tä (15,9 MBq, 8,6 μΐ) reaktion suorittamiseksi huoneenlämpötilassa 2 minuuttia. Reaktion jälkeen reaktioliuos levitettiin PD10-pylvääseen (valmistaja Pharmacia), joka oli suojattu aiemmin TBS-liuoksella (Trisillä • · · * 20 puskuroitu suolaliuos) , joka sisältsi 2 ml 10 % BSA (naudan • · • seerumin albumiini) ja pestiin 100 ml:11a TBS. Eluointia suo- :*·.· ritettiin TBS:llä. Eluoitu liuos fraktionoitiin fraktioiksi, • · :\· joiden kunkin tilavuss oli 500 μΐ. Kunkin eluoidun fraktion • · :*. alikvootista (2 μΐ) mitattiin radiaktiivisuus käyttämällä gam- • · · 25 ma-laskijaa (laskenta-aika: 1 minuutti) . Fraktiot, joiden las- « · · ketut arvot olivat suuretl, kerättiin ja yhdistetty fraktio (1
. . ml) nimettiin liuokseksi, jossa on 125-merkittyä ihmisen vWF
• · · *·[·* (125I-vWF) (0,3 mg/ml ihmisen vWF, 220630 cpm/μΐ) .
• · • * .•h (2) Immobilisoitujen verihiutaleiden valmistaminen • · · m • · · 30 Ihmisen PRP kerättiin samalla tavalla kuin edellä kohdassa 4* kuvattiin ja siihen sekoitettiin yhtäläinen tilavuus 2 % para- ···· .···. formaldehydiliuosta, minkä jälkeen sen annettiin seisoa • · 4 °C:ssa yön ajan. Seuraavana päivä immobilisoidut verihiutaleet otettiin talteen ja pestiin kolmesti PBS:llä sent- 27 rifugointitoiminnan avulla. Sen jälkeen immobilisoidut verihiutaleet suspendoitiin uudelleen PBSrään, jonka tilavuus oli yhtäläinen kuin PRP:n tilavuus keräämisen jälkeen, ja saatua suspensiota käytetiin immobilisoituun verihiutalesuspensioon.
5 (3) Esillä olevan keksinnön mukaisten monoklonaalisten vasta- aineiden vaikutus VWF:n verihiutaleita sitovaan ominaisuuteen
Immobilisoitujen verihiutaleiden suspensio, liuos, jossa oli vasta-ainetta erilaisissa konsentraatioissa, ja ristosetii-niliuos tai botrosetiiniliuos valmistettiin ja kaadettiin 96-10 koloiselle suodatussuodatinlevylle, joka oli suojattu sitä ennen PBS:llä, joka sisälsi 1 % BSA, johon lisättiin 125-vWF-liuosta, minkä jälkeen sen annettiin seisoa huoneenlämpötilassa 30 minuuttia. Sen jälkeen levyn annettiin asettua, immobi-lisoituihin verihiutaleisiin sitoutumaton 1225I-vWF poistet-15 tiin suodattamalla imun avulla ja suodatin pestiin PBS:llä, joka sisälsi 0,05 % Tween-20. Suodattimelle jäänyt 125I mitattiin käyttämällä gamma-laskijaa (lisäysaika: 1 minuutti) ihmisen vWF:n immobilisoituihin levyihin sitoutumismäärän määrittämiseksi. Suhde, missä määrässä ihmisen vWF sitoutui veri-20 hiutaleisiin vasta-aineen läsnäollessa, siihen, missä määrässä ihmisen vWF sitoutui verihiutaleisiin vasta-aineen puuttuessa, ·*·.. nimettiin sitoutumissuhteeksi (%) .
• · • » · *| Tulokset, jotka saatiin ristosetiinin läsnäollessa, on esi- • · · ’· tetty kuviossa 12 (vasta-aineet 2, 4) ja kuviossa 13 (vasta- • · : ** 25 aineet 1, 3) . Tulokset, jotka saatiin botrosetiinin läsnäol- • · · V · lessa, on esitetty kuviossa 14 (vasta-aineet 2, 4) ja kuviossa 15 (vasta-aineet 1, 3). Vasta-aine 1, vasta-aine 2, vasta-aine :V; 3, vasta-aine 4 ja NMC-4 inhiboivat vWF:n ristosetiinistä • · :***. riippuvaa sitoutumista ja botrosetiinistä riippuvaa sitoutu- ··· 30 mistä verihiutaleisiin annoksesta riippuvalla tavalla. IC50- • · · *·]/ arvot olivat ristosetiinistä riippuvassa reaktiossa 0,37 yg/ml • · *···* vasta-aineelle 1, 1,1 μg/ml vasta-aineelle 2, 20,0 pg/ml vas- ··· ta-aineelle 3, 0,95 ug/ml vasta-aineelle 4 ja 0,35 yg/ml NMC- ···· ·'”· 4:lie. IC5o~arvot olivat botrosetiinistä riippuvassa reak- • · · 35 tiossa 1,2 yg/ml vasta-aineelle 1, 0,9 μg/ml vasta-aineelle 2, 2,1 yg/ml vasta-aineelle 3, 0,9 yg/ml vasta-aineelle 4 ja 0,3 pg/ml NMC-4:lle.
28 6. Vasta-aineen 1, vasta-aineen 2, vasta-aineen 3 ja vasta-aineen 4 epitooppien vertailu NMC-4:n epitooppiin 5 Vasta-aineen 1, vasta-aineen 2, vasta-aineen 3 ja vasta-aineen 4 epitooppien vertaamiseksi NMC-4:n epitooppiin tutkittiin vasta-aineen 1, vasta-aineen 2, vasta-aineen 3 ja vasta-aineen 4 ja NMC-4:n immobilisoituun ihmisen vWF:ään sitoutumista inhiboivat vaikutukset.
10 Puhdistettu vasta-aine 1, vasta-aine 2, vasta-aine 3, vasta-aine 4 ja NMC-4 biotinoitiin käyttämällä Biotinylation -vä-linesarjaa (Amershamin kauppanimi) biotinoidun vasta-aineen 1, biotinoidun vasta-aineen 2, biotinoidun vasta-aineen 3 ja biotinoidun vasta-aineen 4 sekä biotinoidun NMC-4:n vastaavien 15 näytteiden valmistamiseksi. Liuosta, jossa oli kutakin mono-klonaalista vasta-ainetta, joka oli dialysoitu vasten PBS-liuosta, lisättiin liuokseen, jossa oli biotiinivälikehaara-N-hydroksisukkinimidiesteri, reaktion suorittamiseksi huoneenlämpötilassa 1 tunti, mitä seurasi puhdistaminen käyttämällä ,*j·, 20 Sephadex G25 -pylvästä (valmistaja Pharmacia) .
• · · *· : *·· Ihmisen vWF:ää (5 pg/ml) , joka oli liuotettu PBS-liuokseen, • · i/.ϊ lisättiin määränä 50 μΐ kuhunkin E.I.A. Microtitration -levyn :*·.· (valmistaja Lindbro/Titertetek) koloon, minkä jälkeen sen an- • · ·*·.. nettiin seisoa 4 °C:ssa yön ajan. Ihmisen vWF immobilisoitiin 25 täten. Seuraavana päivänä kukin koloista pestiin kolmesti pe- suliuoksella (PBS, joka sisältää 0,05 % Tween 20), johon li- .. sättiin PBS-liuosta, joka sisälsi 0,5 % BSA, minkä jälkeen an- • · · • · · nettiin seisoa huoneenlämpötilassa 1,5 tuntia. Täten suojat- • · *;·’ tiin osuudet, joihin ei ollut absorboitunut mitään proteiinia.
··· • · · *·* * ··· 30 Kuhunkin biotinoiduista vasta-aineista sekoitettiin ei-bio- • · • · *!* tinoitua vasta-ainetta 1, vasta-ainetta 2, vasta-ainetta 3, vasta-ainetta 4 tai NMC-4 ;ää Eppendorf-putkessa ja kutakin ··· ϊ saatua liuosta lisättiin edellä kuvattuihin ihmisen vWF-immo- • · · bilisoituihin koloihin määränä 50 μΐ inkuboinnin suorittami- 29 seksi 37 °C:ssa 1 tunnin ajan. Kolojen pesemisen jälkeen kuhiinkin niistä lisättiin 50 μΐ liuosta, jossa oli strepta-vidiini-alkalifosfataasia (valmistaja Amersham) laimennettuna 500-kertaisesti 0,05 M: 11a TBS, joka sisälsi 0,05 % Tween 20 5 ja 1 % BSA, minkä jälkeen reaktiota suoritettiin 37 °C:ssa 1 tunti.
Kolojen pesemisen jälkeen kuhunkin niistä lisättiin 100 μΐ väriä kehittävää substraattia, so. p-nitrofenyylifosfaattia (valmistaja Sigma, minkä jälkeen annettiin seisoa paikallaan 10 20 minuuttia. Ihmisen vWF:ään sitoutunut biotinoitu vasta-aine mitattiin 450 nm:n absorbanssiin perustuen. Ei-spesifinen sitoutuminen mitattiin liiallisen määrän (100-kertainen) bio-tinoimatonta vasta-ainetta läsnäollessa samalla tavalla kuin edellä kuvattiin. Viimeksi mainitussa mittauksessa mitattu ar-15 vo vähennettiin aiemmin mitatusta arvosta arvon saamiseksi, joka nimettiin spesifiseksi absorptioksi.
Tulokset on esitetty kuvioissa 16-20. Vasta-aine 1, vasta-aine 2, vasta-aine 3 ja vasta-aine 4 eivät inhiboineet biotinoidun NMC-4:n sitoutumista immobilisoituun vWF:ään kun taas ne inhi-20 hoivat biotinoidun vasta-aineen 1, biotinoidun vasta-aineen 2, :*·*; biotinoidun vasta-aineen 3 ja biotinoidun vasta-aineen 4 si- toutumista immobilisoituun vWF:ään toistensa kanssa. Toisaalta • ·· .·. ; NMC-ei inhiboinut biotinoidun vasta-aineen 1, biotinoidun vas- • ·· I l ta-aineen 2, biotinoidun vasta-aineen 3 ja biotinoidun vasta- • · · * 25 aineen 4 sitoutumista immobi li soituun vWF:ään ollenkaan. Edel- • · lä esitettyjen tulosten mukaisesti osoitettiin, että vasta- • 9 · ’·* * aineen 1, vasta-aineen 2, vasta-aineen 3 ja vasta-aineen 4 epitooppeja on läsnä molemminpuolisesti vierekkäisissä asemis- • · V.: sa vWF:ssä mutta ne ovat kuitenkin erilaisia kuin NMC-4:n epi- 30 tooppi.
♦ ♦♦ • · · V * 7. Marsiin verihiutaleiden kasautumista inhiboiva vaikutus (ex ··· vivo) ··· ***| Vasta-aine 2 ja vasta-aine 4, jotka oli puhdistettu edel- • ♦ *···* lisessä kohdassa 2., säädettiin siten, että niissä oli eri- 35 laisia konsentraatioita PBS:ää, ja ne injektoitiin intraper- 30 itoneaalisesti marsuihin (naaraita, 430-600 g) annoksena 100 μg/kg tai 300 pg/kg (yksi ryhmä: 4 marsua). PBS:ää käytettiin plaseboverrokkina. 5 minuutin kuluttua veri kerättiin sitruunahapon kanssa vatsa-aortasta eetteröinnin alaisena, josta 5 valmistettiin PRP (verihiutaleiden lukumäärä: 3,0 x 108 veri-hiutaletta/ml) RIPAn tai BIPAn mittaamiseksi samalla menetelmällä kuin kohdassa 4. kuvataan. Kunkin vasta-aineen verihiutaleiden kasautumista inhiboivan vaikutuksen prosenttimäärä laskettiin ehdolla, että maksimaalinen kasautumissuhde ryhmäs-10 sä, jolle annettiin PBS:ään, katsottiin 100 %:ksi.
Tulokset on esitetty kuvioissa 21 ja 22. Vasta-aine 2 ja vasta-aine 3 inhiboivat RIPAn annoksesta riippuvalla tavalla. EDso-arvot (arvot, jolloin verihiutaleiden kasautuminen 50-prosenttisesti) olivat 70 pg/kg vasta-aineelle 2 ja 90 pg/kg 15 vasta-aineelle 4. BIPAssa vasta-aineen 4 ED50-arvo oli 55 pg/kg. Vasta-aineen 2 ja vasta-aineen 4 voimakkaat vaikutukset inhiboitaessa RIPAa ja BIPAa havaittiin jatkuvasti 6 tuntiin saakka antamisesta ja ne katosivat 48 tunnin kuluttua.
Erillään edellä mainitusta testistä mitattiin kokoveren, joka 20 oli kerätty sitruunahapon avulla 5 minuuttia vasta-aineen an- tamisen jälkeen, hematologiset parametrit käyttämällä automa- ϊ*.β tisoitua hematologia-analysoijaa (Sysmex E-2000, valmistaja .·. : Toa Medical ElectronicsI. Vasta-ainetta 2 tai vasta-ainetta 4 • ·· /•m j annettiin antoannoksena 100 pg/kg/tai 300 pg/kg. Missään tapa- • · · .1 25 uksessa ei huomattu mitään merkittävää variaatiota verihiuta- • · *../ leiden kokonaismäärässä, punaisten verisolujen kokonaismääräs- • · · *·* * sä, hemoglobiinikonsentraatiossa, hematokriittivarvossa, kes kimääräisessä verisoluhemoglobiinissa, keskimääräisessä ve- • · V.· risoluhemoglobiinikonsentraatiossa, punaisten verisolujen ja- ··· 30 kaumalaajuudessa, keskimääräisessä verihiutaleiden tilavuudes- .···. sa, valkoisten verisolujen suursolusuhteessa eikä hematokriit- • · · tiarvossa.
• · • · ···
Veriplasma erotettiin sentrifugoimalla verestä, joka saatiin 5 ···· 35 edellä kuvataan. Aktivoitu osittainen tromboplastiiniaika, protrombiiniaika ja fibrinogeenikonsentraatio mitattiin veri- .···. minuuttia vasta-aineen antamisen jälkeen, samalla tavalla kuin • · 31 plasmasta käyttämällä koagluloitumisparametriä mittaavaa laitetta (Sysmex, valmistaja Toa Medical Electronics). Tuloksena ei havaittu mitään merkittävää vastaavien parametrien vaihtelua silloinkaan kun vasta-ainetta 2 tai vasta-ainetta 4 annet-5 tiin annoksena 1000 pg/kg.
8. Esillä olevan keksinnön mukaisten monoklonaalisten vasta-aineiden veritulppien muodostumista estävät vaikutukset marsussa (in vivo) 1) Veritulpan muodostumista estävien vaikutusten arviointi va-10 lokemiallisesti indusoidussa mallissa marsun yhteisessä pään-valtimossa (PIT-malli)
Okklusiivisten tulppien annettiin muodostua marsun yhteiseen päänvaltimoon Nakajima et ai:n menetelmän mukaisesti (Thrombosis Research, voi 67, s. 435, 1992) siten, että veritulpan 15 muodostumisaika mitattiin, kun oli annettu vasta-ainetta 2 tai vasta-ainetta 4 tai niitä ei ollut annettu.
Marsun yhteinen päänvaltimo paljastettiin ja hilseitettiin uretaanianestesian alaisena, ja siihen asennettiin pulssi-Doppler-verenvirtauksenmittarin koetin, tai fysiologista suo- ··· *.* * 20 laliuosta annettiin määränä 30, 100 tai 300 pg/kg yhteiseen ·· • *·· päänvaltimoon kiinnitetyn kanyylin kautta. 5 minuutin kuluttua ίφ*.ί annettiin valolle herkistävää substanssia, so. ruusubengalia, :*·.· määränä 10 mg/kg saman kanyylin kautta. Samanaikaisesti ve- • · risuonta, joka sijaitsee ylävirtaan kohdasta, johon koetin oli 25 asetettu (sijaitsee sydämen puolella) säteilytettiin ärsyttä- • · · väliä vihreällä valolla 540 nm:ssä käyttämällä veritulppia . . tuottavaa valonlähdettä (valmistaja Hamatsu Photonics) ajan • · · • · · *.* (okkluusioaika) mittaamiseksi verisuonen okkluusioon ja veri- • ♦ *···* tulpan muodostuksen aiheuttamaan verivirran pysähtymiseen.
··· • · · • ♦ · l.. 30 Tulokset on esitetty kuvioissa 23 ja 24. Vasta-aine 2 ja vas- • · *!* ta-aine 4 pidensivät merkittävästi okkluusioaikaa annoksena ..*·* vähintään 100 pg/kg. Statistinen käsittely suoritettiin käyt- tämällä Mann-Whiteney U -testiä. Kuvioissa 23 ja 24 symboli * osoittaa p <0,05 ja symboli ** osoittaa p <0,01.
32 (2) Veritulppien muodostusta estävän vaikutuksen arviointi perustuen A-V-ohitusmalliin
Marsun vasempaan kaulalaskimoon insertoitiin uretaanianes-tesian alaisena polyetyleeniputki, jonka kautta annettiin vas-5 ta-ainetta 2 tai fysiologista suolaliuosta annoksena 30, 100 tai 300 5 minuutin kuluttua putken vastakkainen pää in sertoitiin oikeaan kaulalaskimoon ohituksen muodostamiseksi ja verivirta avattiin jälleen. Aika, jona veri ei virrannut (ok-kluusioaika) mitattiin käyttämällä pulssi-Doppler- 10 verenvirtausmittaria.
Tulokset on esitetty kuviossa 25. Vasta-aine 2 pidensi merkittävästi okkluusioaikaa annoksena, joka oli vähintään 100 Statistinen käsittely suoritettiin käyttämällä
Mann-Whiteney U -testiä. Kuviossa 25 symboli * osoittaa p 15 <0,05 ja symboli ** osoittaa p <0,01.
(3) Verenvuodon keston pidentymisen arviointi
Vasta-ainetta 2, vasta-ainetta 4 tai fysiologista suolaliuosta annettiin marsulle suonensisäisesti annoksena 100 tai 300 μg/kg pentobarbitaalianestesian alaisena. 5 minuutin kuluttua ··· ·.*· 20 jalkapohjan valtimo kerättiin 5 mm matkalta. Veren vuotaminen ·· • *·· tai vuotamattomuus haavasta vahvistettiin joka 15. sekunti käyttämällä indeksinä suodatinpaperiin tarttunutta :*·.· veriläiskää. Aika, joka tarvittiin haavan leikkaamisesta ve- • · J*. renvuodon lakkaamiseen, mitattiin.
• ·· ··« • · · *·' ’ 25 Tulokset on esitetty kuvioissa 26 ja 27. Vasta-aine 2 ja vas ta-aine 4 pidensivät verenvuotoaikaa annoksena 1000 μg/kg.
• · ·.·.· Vasta-aine 2 ja vasta-aine 4 eivät vaikuttaneet ve- ··· renvuotoaikaan ollenkaan annoksena 300 \igik.g, jolloin niillä .···, oli okkluusioaikaa pidentävä vaikutus edellä kuvatussa PIT- • · · l·. 30 mallissa ja A-V-ohitusmallissa. Statistinen käsittely suori- • · T tettiin käyttämällä Mann-Whiteney U -testiä. Kuvioissa 26 ja ..*·* 27 symboli * osoittaa p <0,05 ja symboli ** osoittaa p <0,01.
»·· • · • ·
Edellä kuvattujen koetulosten mukaisesti osoitettiin, että sekä vasta-aineella 2 että vasta-aineella 4 on voimakasta veri 33 tulppien muodostumista inhiboivaa vaikutusta ilman että esiintyy verenvuototaipumusta, joka aiheuttaisi kliinisiä ongelmia, kun niitä annetaan elävään kehoon.
Teollinen käyttö 5 Esillä olevan keksinnön mukaisesti saadulla monoklonaalisella vasta-aineella on voimakas affiniteetti ja korkea reaktiospe-sifisyys vWF:ään, sen epitooppi on eroaa tähän menessä tunnettujen vWF:n vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden epitoo-peista ja sitä voidaan käyttää aktiisena aineosana veren hyy-10 tymustä estävässä aineessa. Odotetaan, että esillä olevan keksinnön mukaista veren hyytymistä estävää ainetta voidaan käyttää ehkäisevänä aineena ja terapeuttisena aineena, joka on tehokasta sairauksissa, joka on relevantti vWF:lle (esimerkiksi veritulppasairaudet ja epävakaa angina pectoris). Lisäksi voi-15 daan saa erittäin käyttökelpoista informaatiota vWF:n GPIb:hen sitoutuvasta kohdasta käyttämällä esillä olevan keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta.
Lisäksi esillä olevan keksinnön mukaisella ensimmäisellä monoklonaalisella vasta-aineella on reaktiivisuutta marsun vWF:n ... 20 kanssa ja näin ollen on mahdolillista suorittaa esimerkiksi
i · I
,* fysiologisten aktiivisuuksien testejä ja sivuvaikutusten tes- • 9 • ** tejä käyttämällä marsua.
• · • · · • ·· • · • · • · · • · · • 9 99 9 9 • ·· ··· • · ·
• · I
• · • 99 • 99 9 9 999 9 9 9 9 • 99 9 • 99 • 99 • 99 9 • 99 • 9 • 9 • 99 9 9 • 99 9 • 999 999 • 9 • 9 • 99
Claims (6)
1. Monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että sillä on s euraava t omina i suude t: a) monoklonaalinen vasta-aine tunnistaa ihmisen ja marsun von 5 Willebrand tekijöiden epitoopin, jolloin epitooppi tunnistetaan vasta-aineilla, jotka on tuotettu PERM BP-5248 (AJvW-2) tai FERM BP-5250 (AJvW-4) hybridoomalla, b) monoklonaalinen vasta-aine inhiboi ihmisen verihiutaleiden RIPAn (ristosetiinin indusoiman verihiutaleiden kasautuman),
10 BIPAn (botrosetiinin indusoiman verihiutaleiden kasautuman) ja SIPAn (leikkausjännityksen indusoiman verihiutaleiden kasautuman) , c) monoklonaalinen vasta-aine, joka inhiboi marsun verihiutaleiden RIPAn (ristosetiinin indusoiman verihiutaleiden kasau- 15 tuman) ja BIPAn (botrosetiinin indusoiman verihiutaleiden kasautuman) , ja d) monoklonaalinen vasta-aine, jossa on voimakasta veren hyytymistä estävää vaikutusta in vivo marsussa, mutta joka ei ai-heuta verenvuotoa. • · · • · • · : 20
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, · · ·.**: tunnettu siitä, että se on valmistettu hybridoomalla, joka on • · ·.’·· muodostettu hiiren myeloomasolun ja ihmisen von Willebrand - • · j tekijällä immunisoidun hiiren pernasolun välisellä fuusiolla. • · · • · · • · ·
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, . e 25 tunnettu siitä, että hybridooma on FERM BP-5248 (AJvW-2) tai • · · ·.*.* FERM BP-5250 (AJvW-4) . ··· • · • · ···
4. Hybridooma patenttivaatimuksen 2 mukaisen monoklonaalisen • · · vasta-aineen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se on muo- • » **·* dostettu Sp2/0-Agl4-hiiren myeloomasolun ja von Willebrand - >φ*ί* 30 tekijällä immunisoidun pernasolun välisellä fuusiolla. ··· • ♦ • ♦
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen hybridooma, tunnettu siitä, että se on FERM BP-5248 (AJvW-2) tai FERM BP-5250 (AJvW-4). 35
6. Antitromboottinen aine, joka sisältää aktiivisena aineena, jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaisesti määriteltyä mono-klonaalista vasta-ainetta.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29707094 | 1994-11-30 | ||
| JP29707094 | 1994-11-30 | ||
| JP9502435 | 1995-11-29 | ||
| PCT/JP1995/002435 WO1996017078A1 (fr) | 1994-11-30 | 1995-11-29 | Agent antithrombotique et anticorps monoclonaux contre le facteur de von willebrand |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI972279A0 FI972279A0 (fi) | 1997-05-29 |
| FI972279A FI972279A (fi) | 1997-07-29 |
| FI119734B true FI119734B (fi) | 2009-02-27 |
Family
ID=17841828
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI972279A FI119734B (fi) | 1994-11-30 | 1997-05-29 | Veren hyytymistä estävä aine ja von Willebrand-tekijän vastainen monoklonaalinen vasta-aine |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5916805A (fi) |
| EP (1) | EP0795608B1 (fi) |
| JP (1) | JP3331377B2 (fi) |
| KR (1) | KR100406072B1 (fi) |
| CN (1) | CN1254275C (fi) |
| AT (1) | ATE236993T1 (fi) |
| DE (1) | DE69530316T2 (fi) |
| DK (1) | DK0795608T3 (fi) |
| ES (1) | ES2197210T3 (fi) |
| FI (1) | FI119734B (fi) |
| NO (1) | NO319738B1 (fi) |
| PT (1) | PT795608E (fi) |
| WO (1) | WO1996017078A1 (fi) |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PT795608E (pt) | 1994-11-30 | 2003-08-29 | Ajinomoto Kk | Agente antitrombotico e anticorpos monoclonais anti-factor de von willebrand |
| EP0852951A1 (de) | 1996-11-19 | 1998-07-15 | Roche Diagnostics GmbH | Stabile lyophilisierte pharmazeutische Zubereitungen von mono- oder polyklonalen Antikörpern |
| US6228360B1 (en) | 1998-08-19 | 2001-05-08 | Ajinomoto Co., Inc. | Antithrombotic agent and humanized anti-von Willebrand factor monoclonal antibody |
| EP1124856A1 (en) | 1998-10-23 | 2001-08-22 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Conformation-specific anti-von willebrand factor antibodies |
| CN1198198C (zh) * | 2001-02-27 | 2005-04-20 | 索尼公司 | 字符输入方法及字符输入装置 |
| JP2005298336A (ja) * | 2002-01-29 | 2005-10-27 | Ajinomoto Co Inc | 炎症性疾患治療用薬剤 |
| WO2004011030A1 (ja) * | 2002-07-29 | 2004-02-05 | Ajinomoto Co., Inc. | 血小板減少症治療用医薬組成物 |
| US20050136056A1 (en) * | 2002-07-29 | 2005-06-23 | Shunsuke Kageyama | Pharmaceutical composition for the treatment of thrombocytopenia |
| WO2004015425A1 (en) * | 2002-08-07 | 2004-02-19 | Umc Utrecht Holding B.V. | Modulation of platelet adhesion based on the surface exposed beta-switch loop of platelet glycoprotein ib-alpha |
| US20060034845A1 (en) * | 2002-11-08 | 2006-02-16 | Karen Silence | Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor |
| PT2316852E (pt) * | 2002-11-08 | 2014-06-23 | Ablynx Nv | Anticorpos de domínio único estáveis |
| EP1558645B1 (en) * | 2002-11-08 | 2011-07-27 | Ablynx N.V. | Stabilized single domain antibodies in pharmaceutical composition adapted for inhalation |
| US9320792B2 (en) | 2002-11-08 | 2016-04-26 | Ablynx N.V. | Pulmonary administration of immunoglobulin single variable domains and constructs thereof |
| US20100003253A1 (en) * | 2002-11-08 | 2010-01-07 | Ablynx N.V. | Single domain antibodies directed against epidermal growth factor receptor and uses therefor |
| CA2505326A1 (en) * | 2002-11-08 | 2004-05-21 | Ablynx N.V. | Camelidae antibodies against immunoglobulin e and use thereof for the treatment of allergic disorders |
| NZ576284A (en) * | 2003-01-10 | 2010-07-30 | Ablynx Nv | Therapeutic polypeptides, homologues thereof, fragments thereof and for use in modulating platelet-mediated aggregation |
| MXPA05006043A (es) | 2003-01-10 | 2006-01-30 | Ablynx Nv | Polipeptidos terapeuticos, homologos de los mismos, fragmentos de los mismos y para uso al modular la agregacion mediada de plaquetas. |
| CN1323713C (zh) * | 2003-07-07 | 2007-07-04 | 张新侯 | 可溶性p－选择素及炭疽致死毒素的新用途 |
| CA2579374A1 (en) | 2004-09-07 | 2006-03-30 | Archemix Corp. | Aptamers to von willebrand factor and their use as thrombotic disease therapeutics |
| JP2008512097A (ja) * | 2004-09-07 | 2008-04-24 | アーケミックス コーポレイション | アプタマー医薬品化学 |
| US7566701B2 (en) * | 2004-09-07 | 2009-07-28 | Archemix Corp. | Aptamers to von Willebrand Factor and their use as thrombotic disease therapeutics |
| ATE473446T1 (de) * | 2005-01-14 | 2010-07-15 | Ablynx Nv | Verfahren und testvorrichtungen zur unterscheidung verschiedener formen von krankheiten und leiden, die durch thrombocytopenia und/oder durch spontane interaktionen zwischen dem von-willebrand-faktor und plättchen gekennzeichnet sind |
| SI2444424T1 (sl) * | 2005-05-20 | 2018-10-30 | Ablynx N.V. | Izboljšana protitelesa (TM) za zdravljenje z agregacijo posredovanih motenj |
| EP1918302A3 (en) * | 2006-05-18 | 2009-11-18 | AvantGen, Inc. | Methods for the identification and the isolation of epitope specific antibodies |
| EP1958626B1 (en) | 2007-02-13 | 2014-07-23 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for inactivating viruses by addition of slightly acidic arginine |
| US20090203766A1 (en) * | 2007-06-01 | 2009-08-13 | Archemix Corp. | vWF aptamer formulations and methods for use |
| AR070141A1 (es) * | 2008-01-23 | 2010-03-17 | Glenmark Pharmaceuticals Sa | Anticuerpos humanizados especificos para el factor von willebrand |
| US20110158996A1 (en) * | 2008-03-21 | 2011-06-30 | Ablynx N.V. | Von willebrand factor specific binders and methods of use therefor |
| EP2281827B1 (en) | 2008-05-08 | 2013-08-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Protein refolding method |
| CN102532316B (zh) * | 2010-12-24 | 2014-06-18 | 神州细胞工程有限公司 | 一种抗vWF单克隆抗体及其应用 |
| WO2012176919A1 (ja) | 2011-06-23 | 2012-12-27 | 味の素株式会社 | 免疫グロブリン折りたたみ構造を持つタンパク質と、サブユニット構造となりうるタンパク質とを融合させた単量体タンパク質からなる多量体タンパク質の調製方法 |
| EP3084437B1 (en) * | 2013-12-18 | 2018-02-28 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Detection of endothelial disease |
| US10544231B2 (en) * | 2014-04-16 | 2020-01-28 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Antibodies for the prevention or the treatment of bleeding episodes |
| US20220380478A1 (en) | 2019-07-01 | 2022-12-01 | Tonix Pharma Holdings Limited | Anti-cd154 antibodies and uses thereof |
| MX2023008055A (es) | 2021-01-06 | 2023-08-22 | Tonix Pharma Ltd | Métodos para inducir tolerancia inmune con anticuerpos anti-cd154 modificados. |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5202264A (en) * | 1989-10-27 | 1993-04-13 | Health Research, Incorporated | ELISA using multi-species antibodies for detection of von Willebrand factor in multiple species |
| US5342830A (en) * | 1990-11-16 | 1994-08-30 | Cor Therapeutics, Inc. | Antithrombosis agents |
| PT795608E (pt) * | 1994-11-30 | 2003-08-29 | Ajinomoto Kk | Agente antitrombotico e anticorpos monoclonais anti-factor de von willebrand |
| AU724579B2 (en) | 1996-04-01 | 2000-09-28 | Sankyo Company Limited | Anti-Fas recombinant antibodies and DNA therefor |
-
1995
- 1995-11-29 PT PT95938608T patent/PT795608E/pt unknown
- 1995-11-29 ES ES95938608T patent/ES2197210T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-29 DE DE69530316T patent/DE69530316T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-29 WO PCT/JP1995/002435 patent/WO1996017078A1/ja active IP Right Grant
- 1995-11-29 DK DK95938608T patent/DK0795608T3/da active
- 1995-11-29 KR KR1019970703619A patent/KR100406072B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-11-29 JP JP51858396A patent/JP3331377B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-11-29 AT AT95938608T patent/ATE236993T1/de active
- 1995-11-29 US US08/836,982 patent/US5916805A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-29 CN CNB951974742A patent/CN1254275C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-11-29 EP EP95938608A patent/EP0795608B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-05-16 NO NO19972253A patent/NO319738B1/no not_active IP Right Cessation
- 1997-05-29 FI FI972279A patent/FI119734B/fi not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-04-26 US US09/299,016 patent/US6280731B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-08-08 US US09/923,952 patent/US6793920B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE236993T1 (de) | 2003-04-15 |
| DE69530316D1 (de) | 2003-05-15 |
| WO1996017078A1 (fr) | 1996-06-06 |
| DK0795608T3 (da) | 2003-07-21 |
| PT795608E (pt) | 2003-08-29 |
| FI972279A (fi) | 1997-07-29 |
| KR100406072B1 (ko) | 2004-03-30 |
| CN1174575A (zh) | 1998-02-25 |
| ES2197210T3 (es) | 2004-01-01 |
| NO972253L (no) | 1997-07-29 |
| US6793920B2 (en) | 2004-09-21 |
| FI972279A0 (fi) | 1997-05-29 |
| US5916805A (en) | 1999-06-29 |
| DE69530316T2 (de) | 2004-02-12 |
| NO319738B1 (no) | 2005-09-12 |
| EP0795608A4 (en) | 2001-11-28 |
| CN1254275C (zh) | 2006-05-03 |
| US6280731B1 (en) | 2001-08-28 |
| JP3331377B2 (ja) | 2002-10-07 |
| EP0795608A1 (en) | 1997-09-17 |
| EP0795608B1 (en) | 2003-04-09 |
| US20020028204A1 (en) | 2002-03-07 |
| NO972253D0 (no) | 1997-05-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI119734B (fi) | Veren hyytymistä estävä aine ja von Willebrand-tekijän vastainen monoklonaalinen vasta-aine | |
| US5284751A (en) | Antibodies that bind to a ligand-induced binding site on GPIIIa | |
| AU2005243193A1 (en) | Antibodies specific for glycoprotein VI and methods of producing these antibodies | |
| CN109153726A (zh) | 抗因子xi的活性位点的单克隆抗体及其用途 | |
| JPS6410000B2 (fi) | ||
| UA116531C2 (uk) | Виділена молекула антитіла, яка специфічно зв'язується з ділянкою екзосайта 1 тромбіну, та її застосування | |
| AU665783B2 (en) | Anti-alpha6-integrin-antibodies | |
| JPH08503360A (ja) | Ｐ−セレクチンに対する抗体及びその利用 | |
| CA1297816C (en) | Platelet function inhibiting monoclonal antibody fragment | |
| US5231025A (en) | Anti-platelet monoclonal antibody | |
| EP1942116B1 (de) | Monoklonale Antikörper zur selektiven immunologischen Bestimmung von hochmolekularen, intakten Lamininformen in Körperflüssigkeiten | |
| CA2689726C (en) | Antibodies against gpi.alpha. | |
| CA2206423C (en) | Antithrombotic agent and anti-von willebrand factor monoclonal antibodies | |
| EP0447489A1 (en) | Human platelet-specific antibodies | |
| EP0437547B1 (en) | Monoclonal antibodies against receptor-induced binding sites on ligands binding to proteins of the cytoadhesin super family | |
| JP2996526B2 (ja) | モノクローナル抗体の新用途 | |
| US5332670A (en) | Monoclonal antibody against human platelets | |
| Akiyama et al. | Four monoclonal antibodies, AMH-1,-2,-3, and-4, give varied reactivities with monocytes, alveolar macrophages, and epithelioid-cell granulomas | |
| AU748841B2 (en) | Ancrod specific monoclonal antibodies, antibody fragments, mixtures or derivatives thereof and use of the same | |
| DK173362B1 (da) | Monoklonalt antistof, hybridoma, som udskiller antistoffet, cellekulturpræparat indeholdende et sådant hybridoma, diagnosti | |
| JP3336033B2 (ja) | 抗ヒト精液γ−グルタミルトランスペプチダーゼモノクローナル抗体、ハイブリドーマおよび前立腺疾患検出方法 | |
| JPH02167097A (ja) | 抗トロンビン結合性物質モノクローナル抗体、これを産生するハイブリドーマ並びに該モノクローナル抗体を利用するトロンビン結合性物質の精製法及び測定法 | |
| EP2789631A1 (en) | Compounds and methods for inhibition of binding of ICAM-4 to platelet integrin alphaIIbbeta3 | |
| JPS63230700A (ja) | Ｃ４ｂ結合蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 119734 Country of ref document: FI |
|
| MM | Patent lapsed |